ES2789348T3 - Anticuerpos neutralizantes para GP120 y sus usos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal aislado, que comprende: una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR)1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR)1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente (CDR de N6); una VH que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y una VL que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente (CDR de N17); o una VH que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y una VL que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 17 y 18, respectivamente (CDR de F8); y en donde el anticuerpo se une específicamente a la gp120 del VIH-1 y neutraliza la infección por VIH-1.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos neutralizantes para GP120 y sus usos

Campo de la descripción

Esta se refiere a anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a la gp120 y su uso, por ejemplo, en métodos de tratamiento de un sujeto con infección por VIH-1.

Antecedentes

La infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1) y el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) resultante, aún son amenazas para la salud pública mundial, a pesar de los grandes esfuerzos para desarrollar agentes terapéuticos contra el VIH-1.

Un virus envuelto, el VIH-1, se esconde del reconocimiento humoral detrás de un amplio conjunto de mecanismos de protección. La principal proteína de la envoltura del VIH-1 (Env del VIH-1) es una glucoproteína de aproximadamente 160 kD (gp160). Durante la infección, las proteasas de la célula huésped escinden la gp160 en gp120 y gp41. gp41 es una proteína de membrana integral, mientras que gp120 sobresale del virus maduro. Juntas, gp120 y gp41 forman las espículas de la envoltura del VIH-1, que es un objetivo para anticuerpos neutralizantes. Se han identificado anticuerpos ampliamente neutralizantes que se unen a Env de VIH-1, lo que incluye el anticuerpo VRC01, que se une específicamente al sitio de unión a CD4 de la gp120 y puede neutralizar un alto porcentaje de cepas de VIH-1. Sin embargo, existe la necesidad de desarrollar anticuerpos neutralizantes adicionales para el VIH-1 con diferentes perfiles de reconocimiento y neutralización para la producción comercial.

Xueling y otros, 2010, describen tres anticuerpos monoclonales VRC01, VRC02 y VRC03 dirigidos al sitio de unión a CD4 de la gp120 del VIH-1 a partir de sueros de individuos infectados con VIH-1. Se muestra que VRC01 y VRC02, un par de variantes somáticas del mismo clon, neutralizaron más del 90 % de los aislados de VIH-1 circulantes.

El documento WO 2012/154312 describe anticuerpos neutralizantes monoclonales que se unen específicamente al sitio de unión a CD4 de la gp120 del VIH-1. Además, se describe la identificación de estos anticuerpos y el uso de los anticuerpos. Además, se proporcionan métodos para mejorar la actividad de unión y neutralización de cualquier anticuerpo mediante el uso de sondas de armazón de epítopos.

Resumen

La invención se define por las reivindicaciones.

La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, que comprende:

una región variable de cadena pesada (V^h) que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR)1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR)1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente (CDR de N6);

una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente (CDR de N17); o

una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 17 y 18, respectivamente (CDR de F8); y

en donde el anticuerpo se une específicamente a la gp120 del VIH-1 y neutraliza la infección por VIH-1.

En la presente descripción se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados y fragmentos de unión a antígeno de estos que se unen específicamente al sitio de unión a CD4 en la gp120 y neutralizan el VIH-1. Como se describe en la presente descripción, un nuevo anticuerpo denominado "N6" neutralizó el 98 % de los pseudovirus en un panel de 181 pseudovirus que representa una amplia variedad de cepas de VIH-1 con una IC⁵⁰ < 50 pg/ml, y el 96 % de los pseudovirus con una IC⁵⁰ < 1 pg/ml. La mediana de la IC⁵⁰ de los virus neutralizados fue 0,038 pg/ml, entre los más potentes descritos hasta ahora. Además, N6 neutralizó con éxito 16 de los 20 pseudovirus en el panel que son resistentes a la neutralización por VRC01, el anticuerpo canónico ampliamente neutralizante del sitio de unión a CD4. En consecuencia, las modalidades de la descripción incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno con la especificidad de unión del anticuerpo N6, así como también variantes de estos.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena pesada (V^h) que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 de la V^h expuesta como SEQ ID NO: 1 (V^h de n 6) y/o una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 de la V^l expuesta como SEQ ID NO: 2 (V^l de N6). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 de la V^h expuesta como SEQ ID NO: 3 (V^h de N17) y/o una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2, y una LCDR3 de la V^l expuesta como SEQ ID NO: 4 (V^h de N17). El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 de la V^h expuesta como SEQ ID NO: 5 (V^h de F8) y/o una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2, y una LCDR3 de la V^l expuesta como SEQ ID NO: 6 (F8 V^h). Los anticuerpos y el fragmento de unión a antígeno descritos pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una V^h y una V^l que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una V^h y una V^l que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una V^h y una V^l que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 5 y 6 respectivamente.

Además, se describen composiciones que incluyen los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno, los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno, los vectores de expresión que comprenden los ácidos nucleicos y las células huésped aisladas que comprenden los ácidos nucleicos. En varias modalidades, la molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descritos puede ser una molécula de ADNc que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. La molécula de ácido nucleico puede ser un constructo de expresión bicistrónica que codifica la V^h y la V^l del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos neutralizan potentemente el VIH-1 en un modelo in vitro aceptado de infección por VIH-1. En consecuencia, se describen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos para su uso en un método de tratamiento o inhibición de una infección por VIH-1 en un sujeto, que comprende administrar una cantidad eficaz terapéuticamente de uno o más de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, moléculas de ácido nucleico, vectores o composiciones descritos, al sujeto, tal como un sujeto en riesgo o que tiene una infección por VIH-1.

Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno, las moléculas de ácido nucleico, los vectores y las composiciones descritas en la presente descripción pueden usarse para una variedad de propósitos adicionales, tales como detectar una infección por VIH-1 o diagnosticar una infección por VIH-1 en un sujeto, o detectar el VIH-1 en una muestra.

Las características y ventajas anteriores y otras de esta descripción serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de varias modalidades que proceden con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1F muestran un conjunto de tablas y una alineación de secuencia que ilustra la secuencia y la actividad de neutralización del anticuerpo N6 y varias variantes de este. (Figura 1A) Se usaron huellas de neutralización que abarcaban diez especificidades de epítopos diferentes para examinar las especificidades de suero del paciente Z258 infectado con VIH. Se usaron como controles sueros de los pacientes 45 y 127/C, de los cuales se aislaron anticuerpos VRC01 y similares a VRC01. Los valores predicen la fracción de neutralización del suero que puede atribuirse a la especificidad de cada anticuerpo. Se observaron fuertes señales similares a VRC01 en los sueros (valores >0,3). Se usó un panel de 21 cepas de VIH-1 en el análisis de neutralización y para calcular la amplitud del suero. (Figura 1B) Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de N6, sus variantes N17 y F8, y los anticuerpos relacionados VRC01 y VRC27. Los residuos en negrita representan sustituciones de la secuencia de la línea germinal. Se usa la numeración de Kabat para identificar residuos específicos en las cadenas pesadas y ligeras de N6. Las secuencias que se muestran incluyen IGHV1-2* 02 (SEQ ID NO: 77), V^h de N6 (SEQ ID NO: 1), V^h de N17 (SEQ ID NO: 3), V^h de F8 (SEQ ID NO: 5), V^h de VRC01 (SEQ ID NO: 73), V^h de VRC27 (SEQ ID NO: 75), IGHV1-2* 02 (SEQ ID NO: 78), V^l de N6 (SEQ ID NO: 2), V^l de N17 (SEQ ID NO: 4), V^l de F8 (SEQ ID NO: 6), V^l de VRC01 (SEQ ID NO: 74) y V^l de VRC27 (Se Q ID NO: 76). (Figura 1C) Genes de la línea germinal de regiones variables de cadena pesada y ligera de N6. (Figura 1D) Potencia y amplitud neutralizante de anticuerpos contra un panel de 181 pseudovirus de Env aislados. Los datos muestran el número de virus probados, el porcentaje de virus neutralizados, la media geométrica y la mediana de la IC⁵⁰ para los virus neutralizados con una IC⁵⁰ < 50 pg/ml. (Figura 1E) Curvas de amplitud-potencia de neutralización por anticuerpos contra el panel de 181 pseudovirus. La línea continua muestra la mediana de la IC⁵⁰ de todos los virus, lo que incluye aquellos con una IC⁵⁰ > 50 pg/ml, a los que se les asignó un valor de 50. La línea discontinua muestra la mediana de la IC⁵⁰ de sólo los virus sensibles. Los números en la parte superior de los gráficos de puntos representan el porcentaje de virus resistentes a la neutralización. (Figura IF) Características de neutralización del anticuerpo N6, así como también varias variantes de N6 para un panel de 20 pseudovirus de VIH-1 que representan una variedad de cepas de VIH-1 que son resistentes a VRC01. Las variantes incluyen la variante 1 (V^h de N6 V^l de F8), la variante 2 (V^h de N6 V^l de N17), la variante 3 (V^h de N17 + V^l de F8), la variante 4 (V^h de N17 V^l de N6), variante 5 (V^h de F8 V^l de N6) y la variante 6 (V^h de F8 V^l de N17).

La Figura 2 es una tabla que muestra el perfil de neutralización de N6, VRC01, 3BNC117 y VRC07-523-LS contra 20 pseudovirus resistentes a VRC01. Los valores se muestran en pg/ml.

Las Figuras 3A-3C son un conjunto de gráficos y tablas que muestran las propiedades de autorreactividad de N6. (Figura 3A) Reactividad de N6 con células epiteliales HEP-2. Se usaron VRC07-G54W, VRC07-523-LS y 4E10 como controles positivos. Se usó VRC01-LS como control negativo. La concentración de anticuerpos fue de 25 pg/ml. Todas las imágenes se muestran con un aumento de 400X. (Figura 3B) Unión por ELISA de N6 a cardiolipina. Los controles son como en la Figura 3A. (Figura 3C) La reactividad de N6 con autoantígenos se detectó mediante el ensayo Luminex. Se usó 4E10 como control positivo. Synagis, un anticuerpo monoclonal anti-RSV, se usó como control negativo. SSA, antígeno A del síndrome de Sjogren; SSB, antígeno B del síndrome de Sjogren; Sm, antígeno Smith; RNP, ribonucleoproteína; Scl 70, esclerodermia 70; Jol, antígeno; CentrB, centrómero B.

Las Figuras 4A-4E son un conjunto de gráficos y una tabla que ilustran la especificidad de unión de N6 por gp120. (Figura 4A) Unión por ELISA de N6 a gp120^YU2 en competencia con CD4Ig-biotina, VRC01-biotina y VRC-pG04-biotina. Se usaron B12, VRC01 y CD4-Ig como controles positivos y 2G12 se usó como control negativo. (Figura 4B) Unión por ELISA de N6 a gp120^BaL, RSC3 y sus mutantes con anulación del gen del sitio de unión a CD4 gp120^BaL D368R y RSC3 A371I P363N. (Figura 4C) N6 y la variante N6-1 se unen a gpl40 foldon (una gp140 soluble trimérica unida a un dominio foldon) y gp120, pero no a gp41 o el péptido MPER. (Figura 4D) Unión de N6 a mutantes por barrido de alanina en el contexto de gp120^{JR C S F} monomérica por ELISA. La numeración de los aminoácidos de los mutantes se basa en la secuencia HXB2 del VIH-1. Las afinidades de unión a las gp120s capturadas se midieron en base a la concentración de anticuerpo a la unión semi-máxima. Se usó 2G12 como control para medir la cantidad de la gp120 capturada para estandarizar el efecto de cada mutación en la unión al anticuerpo. (Figura 4E) Neutralización de un panel de pseudovirus mutantes de alanina gp120^{J R C S F} . El cambio en veces de la neutralización se calculó por la IC⁵⁰ del mutante JRCSF/ IC⁵⁰ de JRCSF WT.

Las Figuras 5A-5E son un conjunto de tablas que proporcionan resultados que ilustran el mecanismo de neutralización de N6. (Figura 5A) Virus resistentes a N6 y perfil de neutralización de virus autólogos de Z258. Se muestran las secuencias de aminoácidos del bucle D, la región CD4 BLP y la región p23-V5 de los virus sensibles a N6 y VRC01 HXB2, JRCSF y 93TH057, varios virus sensibles a N6 pero resistentes a VRC01 y virus resistentes a N6 y VRC01. La variación de secuencia de la gp120 mostrada por virus resistentes a N6 y virus autólogos de Z258 en comparación con las secuencias de referencia se enumeran en negritas. La numeración de secuencias se basa en HXB2. (Figuras 5B-5C) Neutralización por N6 de virus resistentes a N6 y virus autólogos de Z258 y sus mutantes con mutaciones inversas en el bucle D, CD4 BLP y región P23-V5. Los anticuerpos del sitio de unión a CD4Ig y CD4, VRC01, 3BNC117, VRC-PG04, 12A21 y VRc 27, se usaron como controles positivos y 2G12 se usó como control negativo. Se muestra la variación de secuencia de la gp120 mostrada por virus resistentes a N6 y virus autólogos de Z258 en comparación con las secuencias de referencia. (Figuras 5D-5E) Neutralización de N6 a virus resistentes a N6 y virus autólogos de Z258 con mutaciones inversas en el bucle D. Las mutaciones inversas en el bucle D se resaltaron en negritas y se subrayaron.

Las Figuras 6A-6F son un conjunto de tablas que muestran los valores de IC⁵⁰ e IC⁸⁰ de los ensayos de neutralización de pseudovirus para las variantes de barrido de alanina de N6 (Figuras 6A-6B), VRC27 (Figuras 6C-6D) y VRC01 (Figuras 6E-6F) contra seis virus sensibles a VRC01. Los valores de neutralización se muestran en pg/ml. El cambio en veces se define como IC⁵⁰ del anticuerpo mutante/ IC⁵⁰ del anticuerpo WT.

La Figura 7 es una tabla que muestra los valores de IC⁵⁰ de los ensayos de neutralización de pseudovirus que usan variantes de alanina de N6 contra seis virus resistentes a VRC01 y dos virus sensibles a VRC01. Los valores de neutralización se muestran en pg/ml. La mediana de la IC⁵⁰ se calcula en base a los virus resistentes a VRC01. Los valores de neutralización se muestran en pg/ml. El cambio en veces se define como IC⁵⁰ del anticuerpo mutante/ IC⁵⁰ del anticuerpo WT.

Las Figuras 8A-8C son un conjunto de tablas que ilustran la unión y neutralización del VIH-1 por el anticuerpo N6 y sus variantes. (Figura 8A) Neutralización de anticuerpos de complementación cruzada, lo que incluye las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos N6, VRC01, VRC27 y 12A21. El cambio en veces de la neutralización se calculó por la IC⁵⁰ del anticuerpo original/ IC⁵⁰ de la combinación de anticuerpos. La mediana de la IC⁵⁰ se basa en todos los virus probados, lo que incluye los virus resistentes, a los que se les asignó un valor de 50. (Figuras 8B-8C) Neutralización por mutantes de anticuerpos con sustituciones de diversos residuos de contacto de N6 con los de VRC01, VRC27 o la variante N17 de N6. N6 y VRC01 se usaron como controles. La mediana de la IC⁵⁰ se calcula en función de todos los virus resistentes a VRC01. Para aquellas IC⁵⁰ > 50, se asignó un valor de 50. El cambio en veces de la neutralización se calcula por la IC⁵⁰ de anticuerpo mutante/ IC⁵⁰ de anticuerpo WT.

La Figura 9 muestra un conjunto de diagramas que ilustran la estructura tridimensional del anticuerpo N6 en complejo con gp120, y que N6 es un anticuerpo de la clase VRC01 con una CDR H2 que interactúa con el bucle de unión a CD4 en la gpl20 del VIH-1 y una firma de 5 aminoácidos LCDR3.

Las Figuras 10 y 11 muestran que cuando se superponen en la gp120 del VIH-1, la cadena ligera de N6 asume una orientación diferente con relación a la de otros anticuerpos de la clase VRC01, y esta orientación permite que la cadena ligera de N6 evite posibles choques con gp120 V5 y bucle D de VIH-1.

La Figura 11 muestra que, al igual que otros anticuerpos de la clase VRC01, N6 también usa el motivo flexible GxG en LCDR1 para evitar choques con el bucle D.

Las Figuras 12A y 12B son un conjunto de diagramas que ilustran que las HCDR2 y LCDR3 de N6 contribuyen a la tolerancia de variación en la gp120 V5 observada para N6.

La Figura 13 muestra que la LCDR3 de N6 Gln96 activa el bucle V5 indirectamente para acomodar variaciones en V5, y muestra que la LCDR3 de VRC01 Gln96 activa el bucle V5 con un enlace de hidrógeno y es sensible a una cadena lateral más voluminosa en V5.

Las Figuras 14, 15A y 15B son un conjunto de gráficos y una tabla que ilustra el desarrollo de N6 dentro del linaje VRC27 en el donante Z258. (Figura 14) Gráficos de identidad-divergencia de cadenas pesadas y ligeras de muestras del donante Z258 en 2012, 2014 y 2015. Las secuencias se representan en función de la identidad de secuencia con N6 (arriba) y VRC27 (abajo) y de la divergencia de secuencia a partir de la cadena pesada IGHV1-2* 02 (izquierda) o la cadena ligera IGKV1-33* 01 (derecha) de genes V de la línea germinal. (Figura 15A) Árbol filogenético emparejado del linaje N6. El árbol filogenético de la cadena pesada se basa en la identidad de secuencia en CDR H3 con respecto a la de N6, VRC27 F8 o N17. El árbol filogenético de la cadena ligera se basa en las lecturas derivadas de IGKV1-33* 01 y la firma CDRL3 de 5 aminoácidos de los anticuerpos de clase VRC01. (Figura 15B) Secuencias de aminoácidos de la región variable de intermediarios inferidos por NGS en comparación con N6. Los residuos en gris claro representan sustituciones de las secuencias I1 de las cadenas pesadas y ligeras. Se usa la numeración de Kabat para identificar residuos específicos en las cadenas pesadas y ligeras de N6. Las secuencias que se muestran incluyen IGHV1-2* 02 (SEQ ID NO: 77), V^h de I1 (SEQ ID NO: 79), V^h de I2 (SEQ ID NO: 80), V^h de I3 (SEQ ID NO: 81), V^h I4 (SEQ ID NO: 82), V^h de N6 (SEQ ID NO: 1), V^h de I5 (SEQ ID NO: 83), V^h de VRC27 (SEQ ID NO: 75), IGHV1-2* 02 (SEQ ID NO: 78), V^l de I1 (SEQ ID NO: 84), V^l de I2 (SEQ ID NO: 85), V^l de I3 (SEQ ID NO: 86), V^l de I4 (SEQ ID NO: 87), V^l de I5 (SEQ ID NO: 88), V^l de I6 (SEQ ID NO: 89), V^l de N6 (SEQ ID NO: 2), V^l de I7 (SEQ ID NO: 90), V^l de I8 (SEQ ID NO: 91), V^l de I9 (SEQ ID NO: 92), V^l de I10 (SEQ ID NO: 93) y V^l de VRC27 (SEQ ID NO: 76).

Las Figuras 16 y 17 son tablas de neutralización de pseudovirus resistentes a VRC01 mediante diversas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras similares a N6 derivadas por secuenciación NGS a partir de los puntos temporales de 2014 y 2015 (Figura 16, secuencias variantes mostradas en la Figura 18) o precursores imputados de N6 (Figura 17, secuencias variantes mostradas en la Figura 15B).

La Figura 18 muestra una alineación de las secuencias de cadena pesada y ligera de variantes de N6.

Secuencias

Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos enumeradas en la lista de secuencias adjuntas se muestran mediante el uso de abreviaturas de letras estándar para las bases nucleotídicas, y un código de tres letras para los aminoácidos, como se define en 37 C.F.R. 1.822. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero la cadena complementaria se entiende incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. El Listado de Secuencias se envía como un archivo de texto ASCII en la forma del archivo llamado "Sequence.txt" (~100 kb), que se creó el 17 de marzo de 2016. En la lista de secuencias adjunta:

SEQ ID NO: 1 es la secuencia de aminoácidos de la V^h del AcM N6.

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTWVSA SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de la V^l del AcM N6.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK SEQ ID NO: 3 es la secuencia de aminoácidos de la V^h del AcM N17.

RAHLVQSGTAVKRPGASVRVSCETSGYTFTAHILYWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRGRVTL TRDIYRDTAYMDISGLRFDDTAVYYCARDRSYDDSSWALDAWGQGTTWVSA SEQ ID NO: 4 es la secuencia de aminoácidos de la V^l del AcM N17.

YIHVTQSPSSLSVSAGDRVTINCQTSQGVGRDLHWYQHKPGRAPKLLIRHASSVEDGVPSRFSGTGFHTS FNLTINDLQSDDIATYYCQVLESFGRGSRLDFK

SEQ ID NO: 5 es la secuencia de aminoácidos de la V^h del AcM F8.

QVQLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDIYREIAYMDIRGLKLDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTWASA

SEQ ID NO: 6 es la secuencia de aminoácidos de la V^l del AcM F8.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHASSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTINDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK

SEQ ID NO: 7-18 son secuencias de aminoácidos de las CDR por kabat de los anticuerpos N6, N17 y F8.

SEQ ID NO: 19-24 son secuencias de aminoácidos consenso de las CDR por kabat de los anticuerpos N6, N17 y F8.

SEQ ID NO: 25-34 son secuencias de aminoácidos relacionadas con los receptores de antígeno quimérico.

SEQ ID NO: 35 es la secuencia de aminoácidos de Env VIH-1 de la cepa HXB2 de VIH-1.

SEQ ID NO: 36 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica la Vh del AcM N6.

CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGA CCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTG GGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACGTATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACCTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCG SEQ ID NO: 37 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica la V^l del AcM N6.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTT GATCCACCATACCTCTTCTGTGGAAGACGGTGTCCCCTCAAGATTCAGCGGCTCTGGATTTCACACATCT TTTAATCTGACCATCAGCGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAAGTTTTACAATTTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA SEQ ID NO: 38 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica la V^h del AcM N17.

CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGGTGAAGAGACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCGAGA CTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATACTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTTGAGTG GGTGGGGTGGATCAAGCCACAATACGGTGCCGTGAACTTTGGGGGTGGTTTTCGGGGCAGGGTCACATTG ACGCGAGACATATATAGAGATACTGCATATATGGACATCAGTGGCCTGAGATTTGACGACACGGCCGTCT ACTATTGTGCGAGAGACCGTTCTTATGACGACTCTTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGCCAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCG SEQ ID NO: 39 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica la V^l del AcM N17.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTGCTGGGGACAGAGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCCGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCCT GATCCGCCACGCCTCTTCTGTGGAGGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCACTGGATTTCACACATCT TTTAATTTGACCATCAACGACCTGCAGTCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTGTTAGAATCTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTGGATTTTAAA

SEQ ID NO: 40 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica la V^h del AcM F8.

CAGGTGCAGCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCCAGA CTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTTGAGTG GGTGGGATGGATCAAGCCACAATACGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCATACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGCCTCCGCG SEQ ID NO: 41 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica la Vl del AcM F8.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTT GATCCACCATGCCTCTTCTGTGGAGGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCTCTGGATTTCACACATCT TTTAATCTGACCATCAACGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTTTTACAATTTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA SEQ ID NO: 42-64 son las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo modificado.

SEQ ID NO: 65-71 son cebadores de oligonucleótidos.

SEQ ID NO: 72 es una secuencia peptídica.

SEQ ID NO: 73 es la V ^h de VRC01.

QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTM TRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSS SEQ ID NO: 74 es la V ^l de VRC01.

EIVLTQSPGTLSLSPGETAIISCRTSQYGSLAWYQQRPGQAPRLVIYSGSTRAAGIPDRFSGSRWGPDYN LTISNLESGDFGVYYCOOYEFFGOGTKVOVDIKR SEQ ID NO: 75 es la Vh de VRC27.

QRLVQSGPQVRKPGSSVRISCETSGYTFNAYILHWFRQAPGRSFEWMGWIKPKFGAVNYAHSFQGRITLT RDIYRETAFLDLTGLRFDDTAVYYCARDRLYDGSSWRLDPWGQGTRVWSS SEQ ID NO: 76 es la VLde VRC27.

FALMTQSPATLAVSVGDRVTITCRASQGIGSDLHWYQQKPGRPPKIL1HHASAREEGVPSRFGGSGSHTS FIFTINDLQLDDVATYYCQVLESFGQGTRLDIN

SEQ ID NO: 77 es la secuencia IGHV1-2*02.

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTM TRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARAYCGGDCYNWFDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 78 es la secuencia IGKV1-33*01.

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTD FTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPITFGQGTRLEIK SEQ ID NO: 79-93 son secuencias de aminoácidos de las variantes V^h y V^l de N6.

SEQ ID NO: 94 es una secuencia de la cadena pesada ilustrativa que incluye la V^h de N6.

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSAASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 95 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica una cadena pesada que incluye la V^h de N6.

CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGA CCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTG GGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACGTATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACCTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCGGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGG TCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA SEQ ID NO: 96 es una secuencia de cadena ligera ilustrativa que incluye la V^l de N6.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 97 es una secuencia de ácido nucleico ilustrativa que codifica una cadena ligera que incluye la V^h de N6. TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTT GATCCACCATACCTCTTCTGTGGAAGACGGTGTCCCCTCAAGATTCAGCGGCTCTGGATTTCACACATCT TTTAATCTGACCATCAGCGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAAGTTTTACAATTTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATC TGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTACCCCAGAGAAGCC AAAGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGAAACAGCCAGGAAAGCGTGACAGAGCAGGATT CCAAGGATTCCACATACAGCCTGAGCAGCACACTGACACTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGT GTACGCCTGCGAAGTGACACACCAGGGACTGTCCTCCCCTGTGACAAAGAGCTTCAACAGAGGAGAATGC

SEQ ID NO: 98 es la secuencia de la cadena pesada que incluye la V^h de N6 aislada del donante humano, que incluye el polimorfismo en comparación con la SEQ ID NO: 94.

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSAASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGEEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

SEQ ID NO: 99 es la secuencia de la molécula de ácido nucleico que codifica la V^h de N6 aislada del donante humano. CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGA CCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTG GGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACGTATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACCTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCGGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGA ACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCT CAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAG CCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGT

GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCAT GATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCGAGGAGTACAAGTGCAA GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAA CCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTTG TCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAA GACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

SEQ ID NO: 100 es una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica el intermediario V^h I1 de N6.

CGAGGGCACTTGGTGCAGTCAGGGACTGAGGTGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTGAGAGTCTCCTGCGAGA CTTCTGGATACACCTTCACCGCCTACATTTTACATTGGTTCCGACAGGCCCCCGGACGAGGGCTTGAGTG GATGGGGTGGATCAAGCCAAAATATGGAGCCGTCAATTATGCTCATGCATTTCAGGGCAGGGTCACCCTG ACCAGAGACATATATAGAGACACTGCATACATGGACTTGAGTGGCCTAAGATTCGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGATCGCGTTTATGACGATTCGTCTTGGCAATTGGATCCCTGGGGCCAGGGAACTTC GGTCATCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 101 es una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica el intermediario Vh I2 de N6.

CGAGGGCACTTGGTGCAGTCAGGGACTGAGGTGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTGAGAGTCTCCTGCGAGA CTTCTGGATACACCTTCACCGCCCACATTTTACATTGGTTCCGACAGGCCCCCGGACGAGGGCTTGAGTG GATGGGGTGGATCAAGCCAAAATATGGAGCCGTCAATTATGCTCATGCATTTCAGGGCAGGGTCACCCTG ACCAGAGACATATATAGAGACACTGCATACATGGACTTGAGTGGCCTAAGATTCGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGATCGCGTTTATGACGATTCGTCTTGGCAATTGGATCCCTGGGGCCAGGGAACTTC GGTCATCGTCTCCTCA

SEQ ID NO: 102 es una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica el intermediario V^h I3 de N6.

CGAGCGCACTTGGTGCAGTCAGGGACTGCGGTGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTGAGAGTCTCCTGCGAGA CTTCTGGATACACCTTCACCGCCCACATTTTATATTGGTTCCGACAGGCCCCCGGACGAGGGCTTGAGTG GGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGGCAGGGTCACCCTG ACCAGAGACATATATAGAGACACTGCATACATGGACATCAGTGGCCTAAGATTCGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGATCGCTCCTATGACGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCG

SEQ ID NO: 103 es una secuencia de nucleótidos ilustrativa que codifica el intermediario V^h I4 de N6.

CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGAGTCTCCTGCCAGA CCTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGACTTGAGTG GGTGGGGTGGATCAAGCCACAATATGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCGTACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCG

SEQ ID NO: 104 es la secuencia de aminoácidos de la Vl 1_2015_00106641_L.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRDPKLLIRHTTSVEDGVPSRVSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK SEQ ID NO: 105 es una secuencia de ADN ilustrativa que codifica la V ^l 1_2015_00106641_L.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGAGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGACCCTAAACTCTT GATCCGCCATACCACTTCTGTGGAAGACGGTGTCCCCTCAAGAGTCAGCGGCTCTGGATTTCACACATCT TTTAATCTGACCATCAGCGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAAGTTTTACAATTTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA

SEQ ID NO: 106 es la secuencia de aminoácidos de la V^l 1_2015_00065970_L.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHASSVDDGVPSRFSGSGFHTS FNLTINDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK SEQ ID NO: 107 es una secuencia de ADN ilustrativa que codifica V^l 1_2015_00065970_L.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGGGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAGCCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTT GATTCATCATGCCTCTTCTGTGGACGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCTCTGGATTTCACACATCT TTTAATCTGACCATCAACGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTTTTACAATTTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA SEQ ID NO: 108 es la secuencia de aminoácidos de la Vl 1_2014_00019094_L.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHASSVEDGVPSRFSGTGFHTS FNLTINDLQADDIGTYYCQVLQSFGRGSRLDTK SEQ ID NO: 109 es una secuencia de ADN ilustrativa que codifica la V^l 1_2014_00019094_L.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATAGGGGACAGAGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTGTTGGCAGTGACCTACATTGGTATCAACACAAACCGGGGAGAGCCCCTAAACTCCT GATCCACCATGCCTCTTCTGTGGAGGACGGTGTCCCGTCAAGATTCAGTGGCACTGGATTTCACACATCT TTTAATTTGACCATCAACGACCTGCAGGCTGACGACATTGGCACTTATTACTGTCAGGTGTTACAATCTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTGGATACTAAA SEQ ID NO: 110 es la secuencia de aminoácidos de la Vl 1_2015_00217585_L.

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGFGRDLHWYQHKPGRAPKLL1HHAPYVDDGVPSRFSGSGFHTS FNLTINDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK

SEQ ID NO: 111 es una secuencia de ADN ilustrativa que codifica la V^l 1_2015_00217585_L.

TACATCCACGTGACCCAGTCTCCGTCCTCCCTGTCTGTGTCTATTGGAGACAGGGTCACCATCAATTGCC AGACGAGTCAGGGTTTTGGCAGGGACCTACATTGGTATCAACACAAGCCGGGGAGAGCCCCTAAACTCTT GATTCATCATGCCCCTTATGTGGACGACGGTGTCCCTTCAAGATTCAGTGGCTCTGGATTTCACACATCT TTTAATCTGACCATCAACGACCTACAGGCTGACGACATTGCCACATATTACTGTCAGGTTTTACAATTTT TCGGCCGAGGGAGTCGACTCCATATTAAA SEQ ID NO: 112 es la secuencia de aminoácidos de la V ^h 2_2014_00173626_H.

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL

TRDIYREIAYMDIRGLKLDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWS SEQ ID NO: 113 es una secuencia de ADN ilustrativa que codifica la V^h 2_2014_00173626_H.

CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCCAGA CTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTGGAGTG GGTGGGATGGATCAAGCCACAATACGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCATACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCC SEQ ID NO: 114 es la secuencia de aminoácidos de la V^h 2_2014_00173626_Hmut.

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDIYREIAYMDIRGLKLDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTWVSA SEQ ID NO: 115 es una secuencia de ADN ilustrativa que codifica la V ^h 2_2014_00173626_Hmut.

CGAGCGCACCTGGTACAATCAGGGACTGCGATGAAGAAACCGGGGGCCTCAGTAAGGGTCTCCTGCCAGA CTTCTGGATACACCTTTACCGCCCACATATTATTTTGGTTCCGACAGGCCCCCGGGCGAGGGCTGGAGTG GGTGGGATGGATCAAGCCACAATACGGGGCCGTGAATTTTGGTGGTGGTTTTCGGGACAGGGTCACATTG ACTCGAGACATATATAGAGAGATTGCATACATGGACATCAGAGGCCTTAAACTTGACGACACGGCCGTCT ATTACTGTGCGAGAGACCGTTCCTATGGCGACTCCTCTTGGGCCTTAGATGCCTGGGGACAGGGAACGAC GGTCGTCGTCTCCGCG

Descripción detallada

I. Resumen de términos

A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes X, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2009; y Meyers y otros (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Wiley-VCH en 16 volúmenes, 2008; y otras referencias similares.

Como se usa en la presente descripción, las formas singulares "un", "una" y "el/la" se refieren tanto al singular como al plural, a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por ejemplo, el término "un antígeno" incluye antígenos simples o plurales y puede considerarse equivalente a la frase "al menos un antígeno". Como se usa en la presente descripción, el término "comprende" significa "incluye". Debe entenderse, además, que cualquiera y todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados, y se proporcionan con fines descriptivos, a menos que se indique de cualquier otra manera. Aunque pueden usarse muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción, se describen métodos y materiales adecuados particulares en la presente descripción. En caso de conflicto, la presente especificación, lo que incluye las explicaciones de términos, controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Para facilitar la revisión de las diversas modalidades, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos:

Administración: La introducción de una composición en un sujeto por una vía elegida. La administración puede ser local o sistémica. Por ejemplo, si la vía elegida es la intravenosa, la composición se administra mediante la introducción de la composición en una vena del sujeto. Las vías de administración ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, vías oral, inyección (tal como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e intravenosa), sublingual, rectal, transdérmica (por ejemplo, tópica), intranasal, vaginal e inhalatoria.

Sustitución de aminoácidos: el reemplazo de un aminoácido en una proteína con un aminoácido diferente.

Agente antirretroviral: un agente que inhibe específicamente que un retrovirus se replique o infecte células. Los ejemplos no limitantes de fármacos antirretrovirales incluyen inhibidores de entrada (por ejemplo, Enfuvirtida), antagonistas de los receptores CCR5 (por ejemplo, aplaviroc, vicriviroc, maraviroc), inhibidores de la transcriptasa inversa (por ejemplo, lamivudina, zidovudina, abacavir, tenofovir, emtricitabina, efavirenz), inhibidores de la proteasa (por ejemplo, lopivar, ritonavir, raltegravir, darunavir, atazanavir), inhibidores de la maduración (por ejemplo, interferón alfa, bevirimat y vivecon).

Terapia antirretroviral (ART): un tratamiento terapéutico para la infección por VIH-1 que implica la administración de al menos un agente antirretroviral (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro agentes antirretrovirales) a un individuo infectado con VIH-1. Un ejemplo de un régimen ART incluye el tratamiento con una combinación de tenofovir, emtricitabina y efavirenz. En algunos ejemplos, ART incluye terapia antirretroviral altamente activa (HAART). Un ejemplo de un régimen HAART incluye el tratamiento con una combinación de tenofovir, emtricitabina y efavirenz.

Anticuerpo: una inmunoglobulina, un fragmento de unión a antígeno, o un derivado de estos, que se une y reconoce específicamente un analito (antígeno) tal como la gp120 del VIH-1. El término "anticuerpo" se usa en la presente descripción en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpos, lo que incluye, pero no se limita a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad de unión a antígeno deseada.

Los ejemplos no limitantes de anticuerpos incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas intactas y variantes y fragmentos de estas conocidas en la técnica que retienen la afinidad de unión por el antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de unión a antígeno ya sea producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o aquellos sintetizados de novo mediante el uso de metodologías de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Kontermann y Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vol. 1-2, 2a Ed., Springer Press, 2010).

Un anticuerpo monocatenario (scFv) es una molécula modificada genéticamente que contiene los dominios V^h y V^l de uno o más anticuerpos unidos por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada genéticamente (ver, por ejemplo, Bird y otros, Science, 242:423-426, 1988; Huston y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:5879-5883, 1988; Ahmad y otros, Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). La orientación intramolecular del dominio V^h y el dominio V^l en un scFv, no es decisiva típicamente para los scFv. Por lo tanto, pueden usarse scFv con ambas posibles organizaciones (V^h -dominio-enlazador dominio-VL -dominio; V^l -dominio-enlazador dominio-VH -dominio).

En un dsFv, la V^h y la V^l se han mutado para introducir un enlace disulfuro para estabilizar la asociación de las cadenas. Además, se incluyen los diacuerpos, que son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios V^h y V^l se expresan en una sola cadena de polipéptidos, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que fuerza de esta manera a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448, 1993; Poljak y otros, Structure, 2:1121-1123, 1994).

Los anticuerpos incluyen, además, formas modificadas genéticamente, tales como los anticuerpos quiméricos (tales como los anticuerpos murinos humanizados) y los anticuerpos heteroconjugados (tales como los anticuerpos biespecíficos). Ver, además, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a Ed., W.H. Freeman & Co., Nueva York, 1997.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en un 50 % o más, y por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en un 50 % o más. Se conocen los ensayos de competencia de anticuerpos, y en la presente descripción se proporciona un ensayo de competencia ilustrativo.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si existe más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o un fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo biespecífico o bifuncional tiene dos sitios de unión diferentes.

Típicamente, una inmunoglobulina tiene cadenas pesadas (H) y ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Los genes de inmunoglobulina incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como también la miríada de genes de dominio variable de inmunoglobulina. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (A) y kappa (k). Existen cinco clases principales de cadena pesada (o isotipos) que determinan la actividad funcional de una molécula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE.

Cada cadena pesada y ligera contiene una región constante (o dominio constante) y una región variable (o dominio variable; ver, por ejemplo, Kindt y otros, Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). En varias modalidades, la V^h y la V^l se combinan para unirse específicamente al antígeno. En modalidades adicionales, solo se requiere la V^h. Por ejemplo, los anticuerpos camélidos de origen natural que consisten en solo una cadena pesada son funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera (ver, por ejemplo, Hamers-Casterman y otros, Nature, 363:446-448, 1993; Sheriff y otros, Nat. Struct. Biol., 3:733-736, 1996). Cualquiera de los anticuerpos descritos puede incluir un dominio constante heterólogo. Por ejemplo, el anticuerpo puede incluir un dominio constante que es diferente de un dominio constante nativo, tal como un dominio constante que incluye una o más modificaciones (tales como las mutaciones "LS") para aumentar la vida media.

Las referencias a "V^h" o "VH" se refieren a la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo, lo que incluye la de un fragmento de unión a antígeno, tales como Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "V^l" o "VL" se refieren al dominio variable de una cadena ligera de anticuerpos, lo que incluye el de un Fv, scFv, dsFv o Fab.

La V^h y la V^l contienen una región "marco" interrumpida por tres regiones hipervariables, también llamadas "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" (ver, por ejemplo, Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de las regiones marco de diferentes cadenas ligeras o pesadas se conservan relativamente dentro de una especie. La región marco de un anticuerpo, es decir, las regiones marco combinadas de las cadenas ligeras y pesadas constituyentes, sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

Las CDR son las principales responsables de la unión a un epítopo de un antígeno. Los límites de la secuencia de aminoácidos de una c Dr dada pueden determinarse fácilmente mediante el uso de cualquiera de varios esquemas bien conocidos, lo que incluye los descritos por Kabat y otros ("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991; Esquema de numeración "Kabat"), Al-Lazikani y otros, (JMB 273,927-948, 1997; Esquema de numeración "Chothia") y Lefranc y otros ("IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains", Dev. Comp. Immunol., 27:55-77, 2003; esquema de numeración "IMGT"). Las CDR de cada cadena se denominan típicamente CDR1, CDR2 y CDR3 (desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal) y, además, se identifican típicamente por la cadena en la que se encuentra la CDR en particular. Por lo tanto, una V^h CDR3 es la CDR3 de la V^h del anticuerpo en el que se encuentra, mientras que una V^l CDR1 es la CDR1 de la V^l del anticuerpo en el que se encuentra. Las CDR de cadena ligera a veces se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las CDR de cadena pesada a veces se denominan HCDR1, HCDR2 y HCDR3.

Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles variantes de anticuerpos, por ejemplo, que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, dichas variantes se presentan generalmente en cantidades menores. A diferencia de las preparaciones de anticuerpos policlonales, que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiere la producción del anticuerpo por ningún método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, lo que incluye, pero no se limita al método de hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación de fagos y métodos que usan animales transgénicos que contienen todo o parte de los loci de inmunoglobulina humana, dichos métodos y otros métodos ilustrativos para preparar anticuerpos monoclonales se describen en la presente descripción. En algunos ejemplos, los anticuerpos monoclonales se aíslan a partir de un sujeto. Los anticuerpos monoclonales pueden tener sustituciones conservadoras de aminoácidos que no tienen sustancialmente ningún efecto sobre la unión al antígeno u otras funciones de la inmunoglobulina. (Ver, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (2013)).

Un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo "humanizado" incluye una región marco humana y una o más CDR de un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo no humano (tal como de ratón, rata o sintético). El fragmento de unión a antígeno o anticuerpo no humano que proporciona las CDR se denomina "donante", y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno humano que proporciona el marco se denomina "aceptor". En una modalidad, todas las CDR son de la inmunoglobulina donante en una inmunoglobulina humanizada. Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, pueden ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, tal como al menos aproximadamente 85-90 %, tal como aproximadamente 95 % o más idénticas. Por lo tanto, todas las partes de un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de anticuerpos humanos naturales.

Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que incluye secuencias derivadas de dos anticuerpos diferentes, que típicamente son de especies diferentes. En algunos ejemplos, un anticuerpo quimérico incluye una o más CDR y/o regiones marco de un anticuerpo humano y CDR y/o regiones marco de otro anticuerpo humano.

Un "anticuerpo completamente humano" o "anticuerpo humano" es un anticuerpo que incluye secuencias del genoma humano (o derivadas de este), y no incluye secuencias de otra especie. En algunas modalidades, un anticuerpo humano incluye CDR, regiones marco y (si está presente) una región Fc del genoma humano (o derivada de este). Los anticuerpos humanos pueden identificarse y aislarse mediante el uso de tecnologías para crear anticuerpos basados en secuencias derivadas del genoma humano, por ejemplo, mediante presentación de fagos o mediante el uso de animales transgénicos (ver, por ejemplo, Barbas y otros, Phage display: A Laboratory Manual. 1a ed. Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2O04. Print.; Lonberg, Nat. Biotech., 23:1117-1125, 2005; Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008)

Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que neutraliza el VIH-1: un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a Env del VlH-1 (por ejemplo, que se une a gp120) de manera que inhibe una función biológica asociada con Env del VIH-1 (tal como la unión a su receptor objetivo). En varias modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que neutraliza el VIH-1 reduce el título infeccioso del VIH-1.

Los anticuerpos ampliamente neutralizantes contra el VIH-1 son distintos de otros anticuerpos contra el VIH-1 en que neutralizan un alto porcentaje de los muchos tipos de VIH-1 en circulación. En algunas modalidades, los anticuerpos ampliamente neutralizantes contra el VIH-1 son distintos de otros anticuerpos contra el VIH-1 en que neutralizan un alto porcentaje (tal como al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %) de los muchos tipos de VIH-1 en circulación. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH-1 incluyen N6, 2G12, PGT122, VRC01 y 35022.

Reactividad contra lo propio o autorreactividad de anticuerpos: una propiedad de un anticuerpo, por la cual el anticuerpo reacciona contra epítopos propios, que son epítopos de proteínas y/o lípidos producidos por el sujeto. Un anticuerpo que no tiene reactividad contra lo propio no se une sustancialmente a los epítopos o lípidos presentes en la membrana de una célula de un sujeto. Los expertos en la técnica conocen métodos para determinar si un anticuerpo reacciona con los epítopos propios. En un ejemplo, la reactividad contra lo propio de los anticuerpos se evalúa mediante la tinción de células HEp-2, un ensayo de unión a cardiolipina o un ensayo de antígeno antinuclear (ANA). El ensayo anti-ANA puede incluir un ensayo anti-ANA LUMINEX® o un ensayo de tinción de células ANA, por ejemplo. En varias modalidades de la descripción, un anticuerpo descrito no es reactivo contra lo propio (o autorreactivo), o es mínimamente reactivo contra lo propio. En un ejemplo no limitante, un anticuerpo descrito no tiene reactivo contra lo propio por encima de los niveles de fondo, por ejemplo, según se mide mediante el uso de un ensayo anti-ANA LUMINEX® o un ensayo de tinción de células ANA.

Muestra biológica: Una muestra obtenida a partir de un sujeto. Las muestras biológicas incluyen todas las muestras clínicas útiles para la detección de una enfermedad o infección (por ejemplo, infección por VIH-1) en sujetos, lo que incluye, pero no se limita a, células, tejidos y fluidos corporales, tales como sangre, derivados y fracciones de sangre (tal como suero), líquido cefalorraquídeo; así como también tejido obtenido por biopsia o extirpado quirúrgicamente, por ejemplo tejidos que no se fijan, se congelan o se fijan en formalina o parafina. En un ejemplo particular, se obtiene una muestra biológica a partir de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una infección por VIH-1.

Anticuerpo biespecífico: Una molécula recombinante compuesta de dos dominios de unión a antígeno diferentes que, en consecuencia, se une a dos epítopos antigénicos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos incluyen moléculas unidas química o genéticamente de dos dominios de unión a antígeno. Los dominios de unión a antígeno pueden unirse mediante el uso de un enlazador. Los dominios de unión a antígeno pueden ser anticuerpos monoclonales, fragmentos de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, scFv) o sus combinaciones. Un anticuerpo biespecífico puede incluir uno o más dominios constantes, pero no necesariamente incluye un dominio constante.

CD3 (Grupo de diferenciación 3 del correceptor de células T): Un complejo proteico específico que incluye al menos cuatro cadenas polipeptídicas, que se asocian de forma no covalente con los receptores de células T en la superficie de las células T. Las cuatro cadenas polipeptídicas incluyen dos cadenas CD3-épsilon, una cadena CD3-delta y una cadena CD3-gamma. CD3 se presenta tanto en las células T auxiliares como en las células T citotóxicas.

CD4: polipéptido grupo de diferenciación factor 4; una proteína de superficie de células T que media la interacción con la molécula MHC de clase II. CD4 sirve, además, como el sitio receptor primario para el VIH-1 en las células T durante la infección por VIH-1. Se sabe que CD4 se une a la gp120 del VIH-1. La secuencia conocida del precursor CD4 tiene un péptido señal hidrófobo, una región extracelular de aproximadamente 370 aminoácidos, una región altamente hidrófoba con identidad significativa con respecto al dominio que abarca la membrana de la cadena beta del MHC de clase II y una secuencia intracelular altamente cargada de 40 residuos (Maddon, Cell 42:93, 1985).

Receptor de antígeno quimérico (CAR): un receptor de células T modificado genéticamente que tiene un dominio de direccionamiento derivado de anticuerpos extracelulares (tal como un scFv) unido a uno o más dominios de señalización intracelular de un receptor de células T. Una "célula T con receptor de antígeno quimérico" es una célula T que expresa un CAR, y tiene especificidad de antígeno determinada por el dominio de direccionamiento derivado de anticuerpo del CAR. Los métodos para hacer CAR están disponibles (ver, por ejemplo, Park y otros, Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp y otros, N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013; Han y otros, J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; Publicaciones PCT WO2012/079000, WO2013/059593; y publicación de los Estados Unidos 2012/0213783).

Condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario: Condiciones que permiten que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se una a su epítopo afín en un grado detectablemente mayor que, y/o con la exclusión sustancial de, la unión a sustancialmente todos los otros epítopos. Las condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario dependen del formato de la reacción de unión y típicamente son las usadas en los protocolos de inmunoensayo o aquellas condiciones encontradas in vivo. Ver Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (2013), para una descripción de los formatos y condiciones del inmunoensayo. Las condiciones empleadas en los métodos son "condiciones fisiológicas" lo que incluye referencias a condiciones (por ejemplo, temperatura, osmolaridad, pH) que son típicas dentro de un mamífero vivo o una célula de mamífero. Si bien se reconoce que algunos órganos se someten a condiciones extremas, el ambiente dentro del organismo e intracelular se encuentra normalmente alrededor del pH 7 (por ejemplo, de pH 6,0 a pH 8,0, más típicamente de pH 6,5 a 7,5), contiene agua como solvente predominante, y existe a una temperatura superior a 0 °C e inferior a 50 °C. La osmolaridad está dentro del intervalo que respalda la viabilidad y la proliferación celular.

La formación de un complejo inmunitario puede detectarse mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, ELISA, inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia de Western), resonancia magnética, exploraciones por tomografía computarizada, rayos-X y cromatografía de afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los anticuerpos seleccionados pueden cuantificarse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.

Conjugado: Un complejo de dos moléculas unidas entre sí, por ejemplo, unidas entre sí mediante un enlace covalente. En una modalidad de la descripción, un anticuerpo se une a una molécula efectora; por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a Env del VIH-1 unido covalentemente a una molécula efectora. El enlace puede ser por medios químicos o recombinantes. En una modalidad de la descripción, el enlace es químico, en donde una reacción entre el resto de anticuerpo y la molécula efectora ha producido un enlace covalente formado entre las dos moléculas para formar una molécula. Puede incluirse opcionalmente un enlazador peptídico (secuencia peptídica corta) entre el anticuerpo y la molécula efectora. Debido a que los conjugados pueden prepararse a partir de dos moléculas con funcionalidades separadas, tales como un anticuerpo y una molécula efectora, a veces también se les conoce como "moléculas quiméricas".

Variantes conservadoras: Las sustituciones de aminoácidos "conservadoras" son aquellas sustituciones que no afectan o disminuyen sustancialmente la función de una proteína, tal como la capacidad de la proteína para interactuar con una proteína objetivo. Por ejemplo, en algunas modalidades de la descripción, un anticuerpo específico contra el VIH puede incluir hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o hasta 10 sustituciones conservadoras en comparación con una secuencia de anticuerpo de referencia y retener la actividad de unión específica para el antígeno del VIH-1 y/o la actividad de neutralización del VIH-1. El término variación conservadora incluye, además, el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido.

Además, un experto reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (por ejemplo, menos del 5 %, en algunas modalidades de la descripción, menos del 1 %) en una secuencia codificada son variaciones conservadoras donde las alteraciones resultan en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar.

Las tablas de sustituciones de aminoácidos conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares se conocen bien por un experto en la técnica. Los siguientes seis grupos son ejemplos de aminoácidos que se consideran sustituciones conservadoras entre sí:

1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).

Las sustituciones no conservadoras son aquellas que reducen una actividad o función del anticuerpo específico contra el VIH, tal como la capacidad de unirse específicamente a la gp120. Por ejemplo, si un residuo de aminoácido es esencial para una función de la proteína, incluso una de cualquier otra manera sustitución conservadora puede interrumpir esa actividad. Por lo tanto, una sustitución conservadora no altera la función básica de una proteína de interés.

Puesta en contacto: Colocación en asociación física directa; incluye tanto en forma sólida como líquida, que puede tener lugar ya sea in vivo o in vitro. La puesta en contacto incluye el contacto entre una molécula y otra molécula, por ejemplo, el aminoácido en la superficie de un polipéptido, tal como un antígeno, que se pone en contacto con otro polipéptido, tal como un anticuerpo. La puesta en contacto puede incluir, además, la puesta en contacto con una célula, por ejemplo, al colocar un anticuerpo en asociación física directa con una célula.

Control: Un estándar de referencia. En algunas modalidades, el control es un control negativo, tal como una muestra obtenida a partir de un paciente sano no infectado con VIH-1. En otras modalidades, el control es un control positivo, tal como una muestra de tejido obtenida a partir de un paciente diagnosticado con infección por VIH-1. En aún otras modalidades, el control es un control histórico o un valor de referencia estándar o un intervalo de valores (tal como una muestra control probada previamente, tal como un grupo de pacientes con VIH-1 con pronóstico o resultado conocido, o un grupo de muestras que representan la línea de base o los valores normales).

Una diferencia entre una muestra de prueba y un control puede ser un aumento o, a la inversa, una disminución. La diferencia puede ser una diferencia cualitativa o una diferencia cuantitativa, por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa. En algunos ejemplos, una diferencia es un aumento o disminución, con relación a un control, de al menos aproximadamente 5 %, tal como al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 100 %, al menos aproximadamente 150 %, al menos aproximadamente 200 %, al menos aproximadamente 250 %, al menos aproximadamente 300 %, al menos aproximadamente 350 %, al menos aproximadamente 400 % o al menos aproximadamente 500 %.

Variante degenerada: En el contexto de la presente descripción, una "variante degenerada" se refiere a un polinucleótido que codifica una proteína (por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a gp120 o una región variable de este) que incluye una secuencia que se degenera como resultado del código genético. Existen veinte aminoácidos naturales, la mayoría de los cuales se especifican por más de un codón. Por lo tanto, todas las secuencias de nucleótidos degeneradas se incluyen siempre que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo que se une a gp120 codificada por la secuencia de nucleótidos no cambie.

Marcador detectable: Una molécula detectable (también conocida como un marcador) que se conjuga directa o indirectamente a una segunda molécula, tal como un anticuerpo, para facilitar la detección de la segunda molécula. Por ejemplo, el marcador detectable puede ser capaz de detectarse por ELISA, espectrofotometría, citometría de flujo, microscopía o técnicas de diagnóstico por obtención de imágenes (tales como exploraciones por tomografía computarizada, resonancias magnéticas, ultrasonido, examen de fibra óptica y examen laparoscópico). Los ejemplos específicos y no limitantes de marcadores detectables incluyen fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enlaces enzimáticos, isótopos radiactivos y metales pesados o compuestos (por ejemplo, nanocristales de óxido de hierro superparamagnéticos para detección por MRI). En un ejemplo, un "anticuerpo marcado" se refiere a la incorporación de otra molécula en el anticuerpo. Por ejemplo, el marcador es un marcador detectable, tal como la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse por métodos ópticos o colorimétricos). Se conocen en la técnica diversos métodos para marcar polipéptidos y glucoproteínas y pueden usarse. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (tales como 35S o 131I), marcadores fluorescentes (tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos de lantánidos), marcadores enzimáticos (tales como peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (tal como secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo), o agentes magnéticos, tales como los quelatos de gadolinio. En algunas modalidades de la descripción, los marcadores se unen por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Los métodos para usar marcadores detectables y orientación en la selección de marcadores detectables apropiados para diversos propósitos se analizan, por ejemplo, en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2012) y Ausubel y otros (En Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, en todo el suplemento 104, 2013).

Detección: Identificar la existencia, presencia o hecho de algo. Los expertos en la técnica conocen métodos generales de detección y pueden complementarse con los protocolos y reactivos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, en la presente descripción se incluyen métodos para detectar una célula que expresa gp120 en un sujeto.

Molécula efectora: Una molécula destinada a tener o producir un efecto deseado; por ejemplo, un efecto deseado en una célula a la que se dirige la molécula efectora. Las moléculas efectoras pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos y moléculas pequeñas. En un ejemplo no limitante, la molécula efectora es una toxina. El experto en la técnica comprenderá que algunas moléculas efectoras pueden tener o producir más de un efecto deseado.

Epítopo: Un determinante antigénico. Estos son grupos químicos particulares o secuencias peptídicas en una molécula que son antigénicas, es decir, que provocan una respuesta inmunitaria específica. Un anticuerpo se une específicamente a un epítopo antigénico particular en un polipéptido. En algunos ejemplos, un anticuerpo descrito se une específicamente a un epítopo en la gp120.

Expresión: Transcripción o traducción de una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico codificante (tal como un gen) puede expresarse cuando su ADN se transcribe en un ARN o fragmento de ARN, que en algunos ejemplos se procesa para convertirse en ARNm. Una secuencia de ácido nucleico codificante (tal como un gen) puede expresarse, además, cuando su ARNm se traduce en una secuencia de aminoácidos, tal como una proteína o un fragmento de proteína. En un ejemplo particular, un gen heterólogo se expresa cuando se transcribe en un ARN. En otro ejemplo, un gen heterólogo se expresa cuando su ARN se traduce en una secuencia de aminoácidos. La regulación de la expresión puede incluir controles sobre la transcripción, traducción, transporte y procesamiento de ARN, degradación de moléculas intermediarias tales como ARNm, o mediante activación, inactivación, compartimentalización o degradación de moléculas de proteínas específicas después de que se producen.

Secuencias de control de la expresión: secuencias de ácido nucleico que regulan la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo a la que se une operativamente. Las secuencias de control de la expresión se unen operativamente a una secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias de control de la expresión controlan y regulan la transcripción y, según sea apropiado, la traducción de la secuencia de ácido nucleico. Por lo tanto, las secuencias de control de la expresión pueden incluir promotores, potenciadores, terminadores de transcripción apropiados, un codón de inicio (ATG) frente a un gen que codifica proteínas, señal de empalme para intrones, mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción adecuada de ARNm, y codones de parada. El término "secuencias de control" pretende incluir, como mínimo, componentes cuya presencia puede influir en la expresión, y puede incluir, además, componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias asociadas a la fusión. Las secuencias de control de la expresión pueden incluir un promotor.

Un promotor es una secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. Además, se incluyen aquellos elementos promotores que son suficientes para hacer la expresión génica dependiente del promotor controlable por señales o agentes externos específicos del tipo celular, específicas de tejido o inducibles; dichos elementos pueden ubicarse en las regiones 5' o 3' del gen. Se incluyen tanto promotores constitutivos como inducibles (ver, por ejemplo, Bitter y otros, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL del bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) y similares. En una modalidad de la descripción, cuando se clona en sistemas de células de mamíferos, pueden usarse los promotores derivados del genoma de células de mamíferos (tal como el promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (tal como la repetición terminal larga del retrovirus; el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus vaccinia 7,5 K). Los promotores producidos por ADN recombinante o técnicas sintéticas pueden usarse, además, para proporcionar la transcripción de las secuencias de ácido nucleico.

Puede insertarse un polinucleótido en un vector de expresión que contiene una secuencia promotora que facilita la transcripción eficiente de la secuencia genética insertada del huésped. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación, un promotor, así como también secuencias específicas de ácido nucleico que permiten la selección fenotípica de las células transformadas.

Vector de expresión: Un vector que comprende un polinucleótido recombinante que comprende secuencias de control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que se va a expresar. Un vector de expresión comprende suficientes elementos de acción en cis para la expresión; otros elementos para la expresión pueden suministrarse por la célula huésped o en un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos los conocidos en la técnica, tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus (por ejemplo, lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan el polinucleótido recombinante.

Polipéptido Fc: El polipéptido que incluye la región constante de un anticuerpo, y excluye el primer dominio de inmunoglobulina de la región constante. La región Fc se refiere generalmente a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, y los últimos tres dominios de inmunoglobulina de la región constante de IgE e IgM. Una región Fc puede incluir, además, parte o la totalidad de la bisagra N-terminal flexible a estos dominios. Para la IgA e IgM, una región Fc puede incluir o no la pieza de cola, y puede o no unirse por la cadena J. Para la IgG, la región Fc incluye los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la parte inferior de la bisagra entre Cgammal (Cy1) y Cy2. Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana se define generalmente para incluir los residuos C226 o P230 en su extremo terminal carboxilo, en donde la numeración está de acuerdo con el índice de la UE como en Kabat. Para la IgA, la región Fc incluye los dominios de inmunoglobulina Calfa2 y Calfa3 (Ca2 y Ca3) y la parte inferior de la bisagra entre Calphal (C a l) y Ca2.

Proteína de envoltura del VIH-1 (Env): La proteína de la envoltura del VIH-1 se sintetiza inicialmente como una proteína precursora de 845-870 aminoácidos de tamaño, denominada gpl60. Los polipéptidos gpl60 individuales forman un homotrímero y experimentan glicosilación dentro del aparato de Golgi, así como también procesamiento para eliminar el péptido señal, y escisión por una proteasa celular entre aproximadamente las posiciones 511/512 para generar cadenas polipeptídicas gp120 y gp41 separadas, que permanecen asociadas como protómeros gp120/gp41 dentro del homotrímero. El ectodominio (es decir, la porción extracelular) del trímero Env del VIH-1 experimenta varias reorganizaciones estructurales desde una conformación cerrada madura (escindida) previa a la fusión que evade el reconocimiento de anticuerpos, hasta conformaciones intermedias que se unen a receptores CD4 y correceptor (CCR5 o CXCR4), hasta una conformación posterior a la fusión.

La numeración usada en las proteínas Env del VIH-1 descritas y fragmentos de estas se refiere al esquema de numeración de HXB2 como se expone en Numbering Positions in HIV Relative to HXB2CG Bette Korber y otros, Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber y otros, Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM.

gp120 del VIH-1 : Un polipéptido que forma parte de la proteína Env del VIH-1. La gp120 madura incluye aproximadamente los residuos de Env del VIH-1 31-511, contiene la mayoría de los dominios externos expuestos a la superficie del trímero Env del VIH-1, y es la gp120 que se une tanto a los receptores de CD4 celulares como a los receptores de quimocinas celulares (tales como CCR5). Un polipéptido gp120 maduro es un polipéptido extracelular que interactúa con el ectodominio gp41 para formar un protómero Env del VIH-1 que se trimeriza para formar el trímero Env del VIH-1.

gp140 del VIH-1 : Un polipéptido del Env del VIH-1 recombinante que incluye gp120 y el ectodominio gp41, pero no los dominios transmembrana o citosólicos gp41. Los polipéptidos gp140 del VIH-1 pueden trimerizarse para formar un trímero de ectodominio Env del VIH-1 soluble.

gp41 del VIH-1 : Un polipéptido que forma parte de la proteína Env del VIH-1. La gp41 madura incluye aproximadamente los residuos 512-860 de Env del VIH-1 e incluye dominios citosólicos, transmembrana y ectodominios. El ectodominio de gp41 (lo que incluye aproximadamente los residuos 512-644 de Env del VIH-1) puede interactuar con gp120 para formar un protómero de Env del VIH-1 que se trimeriza para formar el trímero Env del VIH-1.

Virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1): Un retrovirus que provoca inmunosupresión en humanos (enfermedad del VIH-1) y conduce a una compleja enfermedad conocida como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La "enfermedad del VIH-1" se refiere a una constelación bien reconocida de signos y síntomas (lo que incluye el desarrollo de infecciones oportunistas) en personas infectadas por el virus del VIH-1, según lo determinado por estudios de anticuerpos o transferencia de Western. Los hallazgos de laboratorio asociados con esta enfermedad incluyen una disminución progresiva de las células T. Los virus relacionados que se usan como modelos animales incluyen el virus de inmunodeficiencia de los simios (SIV) y el virus de inmunodeficiencia felina (FIV). El tratamiento del VIH-1 con HAART ha sido eficaz para reducir la carga viral y mejorar los efectos de la infección por VIH-1 en individuos infectados.

Sistema de numeración HXB2: Un sistema de numeración de referencia para las secuencias de proteínas y ácidos nucleicos del VIH-1, mediante el uso de secuencias de la cepa HXB2 del VIH-1 como referencia para todas las demás secuencias de cepas del VIH-1. El experto en la técnica está familiarizado con el sistema de numeración HXB2, y este sistema se expone en "Numbering Positions in HIV Relative to HXB2CG", Bette Korber y otros, Human Retroviruses and AIDS 1998: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences. Korber B, Kuiken CL, Foley B, Hahn B, McCutchan F, Mellors JW y Sodroski J, Eds. Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. HXB2 también se conoce como: HXBc2, para el clon 2 de HXB; HXB2R, en la base de datos de VIH de Los Alamos, con la R de revisada, ya que fue ligeramente revisada con relación a la secuencia HXB2 original; y HXB2CG en GENBANK™, para el genoma completo de HXB2. La numeración usada en los polipéptidos gp120 descritos en la presente descripción se refiere al esquema de numeración HXB2. Como referencia, la secuencia de aminoácidos de Env del VIH-1 de HXB2 se expone a continuación:

MRVKEKYQHLWRWGWRWGTMLLGMLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATTTLFCASDAKAYDTEVHNVWA THACVPTDPNPQEWLVNVTENFNMWKNDMVEQMHEDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNT NSSSGRM IMEKGEIKNCSFNISTSIRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDNDTTSYKLTSCNTSVITQACPKVSF EPIP1HYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNVSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVIRSVNFTDN AKTIIVQLNTSVEINCTRPNNNTRKRIRIQRGPGRAFVTIGKIGNMRQAHCNISRAKWNNTLKQIASKLR EQFGNNKTIIFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQLFNSTWFNSTWSTEGSNNTEGSDTITLPCRI KQIINMWQKVGKAMYAPPISGQIRCSSNITGLLLTRDGGNSNNESEIFRPGGGDMRDNWRSELYKYKWK IEPLGVAPTKAKRRWQREKRAVGIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIE AQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNHTTWME WDREINNYTSL1HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKLFIMIVGGLVGLRIVFA VLSIVNRVRQGYSPLSFQTHLPTPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHR LRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGACRAI RHIPRRIRQGLERILL (SEQ ID NO: 35; GENBANK® Núm. Acceso K03455 tal como estaba presente en la base de datos el 15 de marzo de 2015).

IgA: Un polipéptido que pertenece a la clase de anticuerpos que se codifican sustancialmente por un gen de inmunoglobulina alfa reconocido. En humanos, esta clase o isotipo comprende IgA¹ e IgA². Los anticuerpos IgA pueden existir como monómeros, polímeros (denominados como pIgA) de forma predominantemente dimérica, e IgA secretora. La cadena constante de la IgA de tipo silvestre contiene una extensión de 18 aminoácidos en su extremo C terminal llamada pieza de cola (pc). La IgA polimérica se secreta por las células plasmáticas con un péptido de 15 kDa llamado cadena J que une dos monómeros de IgA a través del residuo de cisteína conservado en la pieza de la cola.

IgG: Un polipéptido que pertenece a la clase o isotipo de anticuerpos que se codifican sustancialmente por un gen de inmunoglobulina gamma reconocido. En humanos, esta clase comprende IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, esta clase comprende IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3.

Complejo inmunitario: La unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno (tal como un scFv) a un antígeno soluble forma un complejo inmunitario. La formación de un complejo inmunitario puede detectarse mediante métodos convencionales conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, citometría de flujo, microscopía de inmunofluorescencia, ELISA, inmunotransferencia (por ejemplo, transferencia de Western), resonancia magnética, exploraciones por tomografía computarizada, rayos-X y cromatografía de afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los anticuerpos seleccionados pueden cuantificarse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.

Aislado: Un componente biológico (tal como un ácido nucleico, un péptido, una proteína o un complejo de proteínas, por ejemplo, un anticuerpo) que se ha separado sustancialmente, producido aparte o purificado a partir de otros componentes biológicos en la célula del organismo en el que el componente se produce naturalmente, es decir, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, y proteínas. Por lo tanto, los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas aislados incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas por métodos de purificación estándar. El término abarca, además, los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas preparados por expresión recombinante en una célula huésped, así como también ácidos nucleicos sintetizados químicamente. Un ácido nucleico, péptido o proteína aislado, por ejemplo un anticuerpo, puede ser al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % puro.

Enlazador: Una molécula bi-funcional que puede usarse para unir dos moléculas en una molécula contigua, por ejemplo, para unir una molécula efectora a un anticuerpo. En algunas modalidades de la descripción, los conjugados proporcionados incluyen un enlazador entre la molécula efectora o marcador detectable y un anticuerpo. En algunos casos, un enlazador es un péptido dentro de un fragmento de unión a antígeno (tal como un fragmento Fv) que sirve para unir indirectamente la V^h y la V^l. Los ejemplos no limitantes de enlazadores peptídicos incluyen enlazadores de glicina y enlazadores de glicina-serina.

Los términos "conjugar", "ensamblar", "enlazar" o "unir" pueden referirse a hacer dos moléculas en una molécula contigua; por ejemplo, unir dos polipéptidos en un polipéptido contiguo, o unir covalentemente una molécula efectora o un radionúclido marcador detectable u otra molécula a un polipéptido, tal como un scFv. En el contexto específico, los términos incluyen referencia a ensamblar un ligando, tal como un resto de anticuerpo, a una molécula efectora. El enlace puede ser ya sea por medios químicos o por medios recombinantes. "Medios químicos" se refiere a una reacción entre el resto de anticuerpo y la molécula efectora de manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una molécula.

Ácido nucleico: Un polímero compuesto por unidades de nucleótidos (ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, variantes estructurales relacionadas de origen natural y análogos sintéticos de origen no natural de estos) unidos mediante enlaces fosfodiéster, variantes estructurales relacionadas de origen natural y análogos sintéticos de origen no natural de estos. Por lo tanto, el término incluye polímeros nucleotídicos en los que los nucleótidos y los enlaces entre ellos incluyen análogos sintéticos de origen no natural, tales como, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, quiral-metilfosfonatos, 2-O-metilo ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y similares. Dichos polinucleótidos pueden sintetizarse, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado. El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de aproximadamente 50 nucleótidos. Se entenderá que cuando una secuencia de nucleótidos se representa por una secuencia de ADN (es decir, A, T, G, C), esto también incluye una secuencia de ARN (es decir, A, U, G, C) en la que "U" reemplaza "T" .

Se usa en la presente descripción la notación convencional para describir secuencias de nucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia de nucleótidos monocatenaria es el extremo 5'; la dirección izquierda de una secuencia de nucleótidos bicatenaria se denomina como la dirección 5'. La dirección de adición de 5' a 3' de nucleótidos a transcritos de ARN nacientes se denomina dirección de transcripción. La cadena de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm se denomina "cadena codificante"; las secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que se ubican en dirección 5' con respecto al extremo 5' del transcrito de ARN se denominan como "secuencias aguas arriba"; las secuencias en la cadena de ADN que tienen la misma secuencia que el ARN y que están en dirección 3' con respecto al extremo 3' del transcrito de ARN codificado se denominan "secuencias aguas abajo".

"ADNc" se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos (es decir, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas resultantes de estos. Por lo tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológico. Tanto la cadena codificante, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de ARNm y se proporciona generalmente en listados de secuencias, y la cadena no codificante, usada como plantilla para la transcripción, de un gen o ADNc puede denominarse como que codifica la proteína u otro producto de ese gen o ADNc. A menos que se especifique de cualquier otra manera, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas entre sí y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.

Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o formas modificadas de cualquiera de los nucleótidos. El término incluye formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.

Unida operativamente: Una primera secuencia de ácido nucleico se une operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, tal como el promotor CMV, se une operativamente a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN unidas operativamente son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, en el mismo marco de lectura.

Portadores aceptables farmacéuticamente: Los portadores aceptables farmacéuticamente de uso son convencionales. Remington's Pharmaceutical Science, 22a ed., Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido (2012), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de los agentes descritos.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales incluyen usualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se administrarán pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes añadidos (tales como conservantes no naturales) y agentes tampón de pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán. En ejemplos particulares, el portador aceptable farmacéuticamente es estéril y adecuado para la administración parenteral a un sujeto, por ejemplo, por inyección. En algunas modalidades, el agente activo y el portador aceptable farmacéuticamente se proporcionan en una forma de dosificación unitaria tal como una píldora o en una cantidad seleccionada en un vial. Las formas de dosificación unitarias pueden incluir una dosificación o dosificaciones múltiples (por ejemplo, en un vial a partir del cual pueden dispensarse selectivamente dosificaciones medidas de los agentes).

Polipéptido: Un polímero en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que se unen a través de enlaces amida. Cuando los aminoácidos son alfa-aminoácidos, puede usarse ya sea el isómero óptico L o el isómero óptico D, y se prefieren los isómeros L. Los términos "polipéptido" o "proteína", como se usan en la presente descripción, pretenden abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluir secuencias modificadas tales como glucoproteínas. Un polipéptido incluye tanto proteínas de origen natural como las que se producen de forma recombinante o sintéticamente. Un polipéptido tiene un extremo amino terminal (N-terminal) y un extremo carboxi-terminal. En algunas modalidades, el polipéptido es un anticuerpo descrito o un fragmento de este.

Modificaciones de polipéptidos: Los polipéptidos pueden modificarse mediante una variedad de técnicas químicas para producir derivados que tienen esencialmente la misma actividad y conformación que los péptidos no modificados, y que, opcionalmente, tienen otras propiedades convenientes. Por ejemplo, los grupos de ácido carboxílico de la proteína, ya sea un carboxilo terminal o de cadena lateral, pueden proporcionarse en forma de una sal de un catión aceptable farmacéuticamente o esterificarse para formar un éster Cⁱ -C ^{i 6} , o convertirse en una amida de fórmula NRⁱ R² en donde Rⁱ y R² son cado uno independientemente H o alquilo C ⁱ -C ^{i 6} , o se combinan para formar un anillo heterocíclico, tal como un anillo de 5 o 6 miembros. Los grupos amino del péptido, ya sea de cadena terminal o lateral, pueden estar en forma de una sal de adición de ácido aceptable farmacéuticamente, tal como e1HCl, HBr, acético, benzoico, toluenosulfónico, maleico, tartárico y otras sales orgánicas, o pueden modificarse para alquilo o diaquilamino Cⁱ -C ^{i 6} o convertirse después en una amida.

Los grupos hidroxilo de las cadenas laterales del péptido pueden convertirse en alcoxi Cⁱ -C ^{i 6} o en un éster Cⁱ -C ^{i 6} mediante el uso de técnicas bien reconocidas. El fenilo y anillos fenólicos de las cadenas laterales del péptido pueden sustituirse con uno o más átomos de halógeno, tales como F, Cl, Br o I, o con alquilo Cⁱ -C ^{i 6} , alcoxi Cⁱ -C ^{i 6} , ácidos carboxílicos y ésteres de estos, o amidas de dichos ácidos carboxílicos. Los grupos metileno de las cadenas laterales del péptido pueden extenderse a los alquilenos C² -C⁴ homólogos. Los tioles pueden protegerse con uno cualquiera de varios grupos protectores bien reconocidos, tales como los grupos acetamida.

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Recombinante: Un ácido nucleico recombinante es aquel que tiene una secuencia que no es de origen natural o que tiene una secuencia que se crea por una combinación artificial de dos de cualquier otra manera segmentos de secuencia separados. Esta combinación artificial puede lograrse mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. Una proteína recombinante es aquella que tiene una secuencia que no es de origen natural o que tiene una secuencia que se crea por una combinación artificial de dos de cualquier otra manera segmentos de secuencia separados. En varias modalidades, una proteína recombinante se codifica por un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, recombinante) que se ha introducido en una célula huésped, tal como una célula bacteriana o eucariota. El ácido nucleico puede introducirse, por ejemplo, en un vector de expresión que tiene señales capaces de expresar la proteína codificada por el ácido nucleico introducido o el ácido nucleico puede integrarse en el cromosoma de la célula huésped.

Identidad de secuencia: La similitud entre las secuencias de aminoácidos se expresa en términos de la similitud entre las secuencias, denominada de cualquier otra manera como identidad de secuencia. La identidad de secuencia se mide con frecuencia en términos de porcentaje de identidad (o similitud u homología); cuanto mayor es el porcentaje, más similares son las dos secuencias. Los homólogos o variantes de un polipéptido poseerán un grado relativamente alto de identidad de secuencia cuando se alinean mediante el uso de métodos estándar.

Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. Diversos programas y algoritmos de alineamiento se describen en: Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444, 1988; Higgins y Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins y Sharp, Ca B iOS 5:151, 1989; Corpet y otros, Nucleic Acids Research 16:10881, 1988; y Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444, 1988. Altschul y otros, Nature Genet. 6:119, 1994, presentan una consideración detallada de los métodos de alineamiento de secuencias y los cálculos de homología.

La herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST) de NCBI (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403, 1990) está disponible en varias fuentes, lo que incluye el National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) y en Internet, para su uso en conexión con los programas de análisis de secuencia blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx. Una descripción de cómo determinar la identidad de secuencia mediante el uso de este programa está disponible en el sitio web de NCBI en Internet.

Los homólogos y variantes de una V^l o una V^h de un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido se caracterizan típicamente por la posesión de al menos aproximadamente 75 %, por ejemplo, al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia contada sobre el alineamiento de longitud completa con la secuencia de aminoácidos de interés. Las proteínas con una similitud aún mayor con respecto a las secuencias de referencia mostrarán identidades de porcentaje crecientes cuando se evalúen por este método, tales como al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia. Cuando se compara menos de la secuencia completa para la identidad de secuencia, los homólogos y variantes poseerán típicamente al menos un 80 % de identidad de secuencia sobre las ventanas cortas de 10-20 aminoácidos, y pueden poseer identidades de secuencia de al menos 85 % o al menos 90 % o 95 % en dependencia de su similitud con la secuencia de referencia. Los métodos para determinar la identidad de secuencia en dichas ventanas cortas están disponibles en el sitio web de NCBI en Internet. Un experto en la técnica apreciará que estos intervalos de identidad de secuencia se proporcionan solo como guía; es completamente posible que puedan obtenerse homólogos muy significativos que se encuentren fuera de los intervalos provistos.

Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos incluyen "secuencia de referencia", "seleccionado de", "ventana de comparación", "idéntica", "porcentaje de identidad de secuencia", "sustancialmente idéntica", "complementaria" y " sustancialmente complementaria".

Para la comparación de secuencias de secuencias de ácido nucleico, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de prueba y referencia se ingresan en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Se usan los parámetros predeterminados del programa. Los métodos de alineamiento de secuencias para comparación se conocen bien en la técnica. El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970, mediante el método de búsqueda de la similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444, 1988, mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante alineamiento manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2012) y Ausubel y otros (En Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, en todo el suplemento 104, 2013). Un ejemplo de un algoritmo útil es PILEUP. PILEUP usa una simplificación del método de alineamiento progresivo de Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987. El método usado es similar al método descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989. Mediante el uso de PILEUP, se compara una secuencia de referencia con otras secuencias de prueba para determinar la relación de identidad de secuencia en por ciento mediante el uso de los siguientes parámetros: peso de huecos por defecto (3,00), peso por longitud de hueco por defecto (0,10) y huecos de extremos ponderados. PILEUP puede obtenerse del paquete de programa informático de análisis de secuencia GCG, por ejemplo, la versión 7.0 (Devereaux y otros, Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984.

Otro ejemplo de algoritmos que son adecuados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990 y Altschul y otros, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1977. El programa informático para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih.gov). El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 11, alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. El programa BLASTP (para secuencias de aminoácidos) usa como valores predeterminados una longitud de palabra (W) de 3 y una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.

89:10915, 1989). Un oligonucleótido es una secuencia polinucleotídica lineal de hasta aproximadamente 100 bases de nucleótidos de longitud.

Une específicamente: Cuando se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, se refiere a una reacción de unión que determina la presencia de una proteína, péptido o polisacárido objetivo en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. Por lo tanto, en condiciones designadas, un anticuerpo se une, preferentemente, a una proteína, péptido o polisacárido objetivo particular (tal como un antígeno presente en la superficie de un patógeno, por ejemplo Env del VIH-1) y no se une en una cantidad significativa a otras proteínas o polisacáridos presentes en la muestra o sujeto. La unión específica puede determinarse por métodos conocidos en la técnica. Con referencia a un complejo anticuerpo-antígeno, la unión específica del antígeno y el anticuerpo tiene una Kd de menos de aproximadamente 10'7 Molar, tal como menos de aproximadamente 10'8 Molar, 10'9, o incluso menos de aproximadamente 10'10 Molar.

Kd se refiere a la constante de disociación para una interacción dada, tal como una interacción de ligando-polipéptido 0 una interacción antígeno-anticuerpo. Por ejemplo, para la interacción bimolecular de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y un antígeno, es la concentración de los componentes individuales de la interacción bimolecular dividida por la concentración del complejo.

Los anticuerpos descritos en la presente descripción se unen específicamente a un objetivo definido (u objetivos múltiples, en el caso de un anticuerpo biespecífico). Por lo tanto, un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo en la gp120 es un anticuerpo que se une sustancialmente a gp120, lo que incluye células o tejidos que expresan gp120, sustrato al que se une gp120, o a gp120 en una muestra biológica. Por supuesto, se reconoce que puede producirse un cierto grado de interacción no específica entre un anticuerpo o conjugado que incluye un anticuerpo (tal como un anticuerpo que se une específicamente a gp120 o un conjugado que incluye dicho anticuerpo) y un no objetivo (tal como una célula que no expresa gp120). Típicamente, la unión específica resulta en una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y la proteína o las células que portan el antígeno que entre el anticuerpo y la proteína o las células que carecen del antígeno. La unión específica produce generalmente un aumento de más de 2 veces, tal como un aumento de más de 5 veces, más de 10 veces o más de 100 veces en la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una proteína que incluye el epítopo o la célula o tejido que expresa el epítopo objetivo en comparación con una proteína o célula o tejido que carece de este epítopo. La unión específica a una proteína en dichas condiciones requiere un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína en particular. Una variedad de formatos de inmunoensayo son apropiados para seleccionar anticuerpos u otros ligandos específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Ver Harlow y Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (2013), para obtener una descripción de los formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad específica.

Sujeto: Organismos vertebrados multicelulares vivos, una categoría que incluye mamíferos humanos y no humanos. En un ejemplo, un sujeto es un ser humano. En un ejemplo particular, el sujeto es un lactante recién nacido. En un ejemplo adicional, se selecciona un sujeto que necesita inhibir una infección por VIH-1. Por ejemplo, el sujeto o bien no está infectado y en riesgo de infección por VIH-1 o está infectado y necesita tratamiento.

Cantidad eficaz terapéuticamente: La cantidad de agente, tal como un fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de la gp120 descrito que es suficiente para prevenir, tratar (lo que incluye la profilaxis), reducir y/o mejorar los síntomas o las causas subyacentes de un trastorno o enfermedad, tal como la infección por VIH-1. En algunas modalidades, una cantidad eficaz terapéuticamente es suficiente para reducir o eliminar un síntoma de infección por VIH-1, tal como el SIDA. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad necesaria para inhibir o evitar la replicación del VIH-1 o para alterar de manera medible los síntomas externos de la infección por VIH-1. Idealmente, una cantidad eficaz terapéuticamente proporciona un efecto terapéutico sin provocar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto.

En algunas modalidades, la administración de una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito que se une a gp120 puede reducir o inhibir una infección por VIH-1 (por ejemplo, medida por infección de células, o por número o porcentaje de sujetos infectados por VIH-1, o por un aumento en el tiempo de supervivencia de los sujetos infectados) en una cantidad deseada, por ejemplo, en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 % o incluso al menos 100 % (eliminación o prevención de infección por VIH-1 detectable), en comparación con un control adecuado.

Varias preparaciones descritas en la presente descripción se administran en cantidades eficaces terapéuticamente. Una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a gp120 que se administra a un sujeto variará en dependencia de una serie de factores asociados con ese sujeto, por ejemplo, la salud general y/o el peso del sujeto. Puede determinarse una cantidad eficaz terapéuticamente al variar la dosis y medir la respuesta terapéutica resultante, tal como, por ejemplo, una reducción en el título viral. Las cantidades eficaces terapéuticamente pueden determinarse, además, mediante diversos inmunoensayos in vitro, in vivo o in situ.

Una cantidad eficaz terapéuticamente abarca una dosis fraccional que contribuye en combinación con administraciones anteriores o posteriores a lograr una respuesta terapéutica. Por ejemplo, una cantidad eficaz terapéuticamente de un agente puede administrarse en una dosis única, o en varias dosis, por ejemplo, diariamente, durante un transcurso de tratamiento que dura varios días o semanas. Sin embargo, la cantidad eficaz terapéuticamente puede depender del sujeto a tratar, la gravedad y el tipo de la afección a tratar, y la forma de administración. Puede empaquetarse una forma de dosificación unitaria del agente en una cantidad terapéutica, o en múltiplos de la cantidad terapéutica, por ejemplo, en un vial (por ejemplo, con una tapa perforable) o una jeringa que tiene componentes estériles.

Transformada: Una célula transformada es una célula en la que se ha introducido una molécula de ácido nucleico mediante técnicas de biología molecular. Como se usa en la presente descripción, el término transformación abarca todas las técnicas mediante las cuales una molécula de ácido nucleico podría introducirse en dicha célula, lo que incluye la transfección con vectores virales, la transformación con vectores plasmídicos y la introducción de ADN por electroporación, lipofección y aceleración con pistola de partículas.

Tratamiento o prevención de una enfermedad: Inhibir el desarrollo completo de una enfermedad o condición, por ejemplo, en un sujeto que está en riesgo o tiene una infección por VIH-1. "Tratamiento" se refiere a una intervención terapéutica que mejora un signo o síntoma de una enfermedad o condición patológica después de que ha comenzado a desarrollarse. El término "mejora", con referencia a una enfermedad o condición patológica, se refiere a cualquier efecto beneficioso observable del tratamiento. El efecto beneficioso puede evidenciarse, por ejemplo, por un inicio tardío de los síntomas clínicos de la enfermedad en un sujeto susceptible, una reducción en la gravedad de algunos o todos los síntomas clínicos de la enfermedad, una progresión más lenta de la enfermedad, una reducción en la carga viral, una mejora en la salud general o el bienestar del sujeto, o por otros parámetros que se conocen bien en la técnica que son específicos de la enfermedad en particular. Un tratamiento "profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad con el propósito de reducir el riesgo de desarrollar la patología.

Vector: Los vectores de ADN recombinante son vectores que tienen ADN recombinante. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector puede incluir, además, uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Los vectores virales son vectores de ácido nucleico recombinante que tienen al menos algunas secuencias de ácido nucleico derivadas de uno o más virus. En algunas modalidades, se proporciona un vector viral que comprende una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito que se une específicamente a gp120 del VIH-1 y neutraliza el VIH-1. En algunas modalidades, el vector viral puede ser un vector de virus adenoasociado (AAV). Un vector viral deficiente para la replicación es un vector que requiere la complementación de una o más regiones del genoma viral requeridas para la replicación debido a una deficiencia en al menos una función genética esencial para la replicación. Por ejemplo, de manera que el vector viral no se replique en las células huésped típicas, especialmente aquellas en un paciente humano que podrían infectarse por el vector viral en el transcurso de un método terapéutico.

Anticuerpo, cadena pesada o cadena ligera de la clase VRC01: Una clase de anticuerpos que se unen al sitio de unión a CD4 en la gp120 y pueden neutralizar el VIH-1, así como también sus cadenas pesadas y ligeras. El miembro prototípico de la clase de anticuerpos VRC01, VRC01, puede neutralizar más del 90 % de los aislados de VIH-1 circulantes con una concentración inhibitoria promedio del 50 % (IC⁵⁰) de ~0,3 pg/ml. A pesar de las diferencias generales de secuencia entre los anticuerpos de la clase VRC01, las estructuras de co-cristales de anticuerpo-gp120 revelaron que el reconocimiento de la gp120 de la clase VRC01 es consistente en toda la clase. De hecho, el análisis de estructura tridimensional de la gp120 del VIH-1 de diferentes clados de VIH-1 en complejos con diferentes anticuerpos de clase VRC01 de múltiples donantes muestra que los anticuerpos de clase VRC01 comparten una sorprendente similitud en la estructura física, y revelaron varias características de los anticuerpos que contribuyen a la unión a gp120 y la neutralización del VIH-1. La caracterización estructural y ontogenética sustancial de la clase de anticuerpos VRC01 permite el reconocimiento de los miembros de esta clase mediante la examinación de la secuencia de anticuerpos.

Por ejemplo, la V^h de un anticuerpo de la clase VRC01 tiene un origen de línea germinal V^h1-2, en donde la secuencia que codifica la V^h de la clase VRC01 es del 20-35 % (tal como 25-30 %) divergente de la secuencia génica de la línea germinal correspondiente. La V^h de la clase VRC01 incluye un residuo de triptófano en la posición kabat 50 (V^h Trp50), un residuo de asparagina en la posición kabat 58 (V^h Asn58) y un residuo de arginina en la posición kabat 71 (V^h Argy i). Estos residuos forman interacciones específicas con aminoácidos en la gp120 que contribuyen a la especificidad de la clase VRC01 y a las propiedades de neutralización. Cuando un anticuerpo de la clase VRC01 se une a gp120, V^h Trp50 forma un enlace de hidrógeno con Asn280 de la gp120, V^h Asp58 forma enlaces de hidrógeno con Arg456 y Gly458 de la gp120, V^h Arg71 forma puentes salinos con Asp368 de la gp120, y V^h Trp100B forma un enlace de hidrógeno con Asn279 de la gp120.

Además, la V^l de un anticuerpo de la clase VRC01 tiene un origen de línea germinal IGKV1-33, IGKV3-11, IGKV3-15, IGKV3-20, IGLV2-14, en donde la secuencia codificante V^l de la clase VRC01 es de 15-35 % (tal como 25-30 %) divergente de la secuencia génica de la línea germinal correspondiente. La V^l de la clase VRC01 incluye una LCDR1 (posicionamiento de kabat) con una deleción de 2-6 aminoácidos, o una LCDR1 con residuos de glicina en las posiciones kabat 28 y 30. La deleción o la presencia de los residuos de glicina proporciona una flexibilidad que permite que la LCDR1 evite el choque estructural con el bucle D de la gp120 cuando el anticuerpo se une al sitio de unión a CD4. Además, la V^l de clase VRC01 incluye una LCDR3 que tiene cinco aminoácidos de longitud (de acuerdo con el posicionamiento de kabat) e incluye un residuo hidrófobo (tal como leucina o tirosina) en la posición kabat 91, deleción de las posiciones kabat 92-95, y un glutamato o residuo de glutamina en la posición kabat 96. El residuo hidrófobo en la posición 91 se empaca contra la cadena principal del bucle D de la gp120, y el residuo de glutamato o glutamina en la posición kabat 96 interactúa con una región electropositiva conservada en la base del dominio V5 de la gp120.

Los ejemplos no limitantes de anticuerpos que pertenecen a la clase VRC01 incluyen los anticuerpos VRC01, VRC03, VRC07, VRC07-523, VRC13, 3BCN117, 12A12, 12A21, VRC-PG04, NIH45-46, VRC23, VRC-CH30, VRC-CH31 y VRC-PG20. La descripción, caracterización y producción de estos anticuerpos, así como también la clase de anticuerpos VRC01, está disponible y es familiar para el experto en la técnica (ver, por ejemplo, Diskin y otros, Science, 334 (6060):1289-93, 2011; Kwong y Mascola, Immunity, 37, 412-425, 2012; Li y otros, J. Virol., 85, 8954-8967, 2011; Rudicell y otros, J. Virol., 88, 12669-12682, 2012; Scheid y otros, Science, 333(6049):1633-1637, 2011; West y otros, PNAS, 109:E2083-2090, 2012; Wu y otros, Science, 329(5993):856-861, 2010; Wu y otros, Science, 333(6049):1593-1602, 2011; Zhou y otros, Immunity, 39:245-258, 2013; Georgiev y otros, Science, 340:751-756, 2013; Zhu y otros, PNAS, 110, E4088-E4097, 2013; y Publicaciones WIPO Núms. WO 2012/158948, WO2011038290, WO2012154312, WO2013142324 y WO2013016468).

II. Descripción de varias modalidades

Se proporcionan anticuerpos monoclonales aislados y fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a un epítopo en la gp120. Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno pueden ser completamente humanos. En varias modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno pueden usarse para neutralizar el VIH-1. Además, se describen en la presente descripción composiciones que incluyen los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno y un portador aceptable farmacéuticamente. Además, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, y vectores de expresión (tales como vectores virales de virus adenoasociados (AAV)) que incluyen estos ácidos nucleicos.

Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno, las moléculas de ácido nucleico, las células huésped y las composiciones pueden usarse con fines de investigación, diagnósticos y terapéuticos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales y los fragmentos de unión a antígeno pueden usarse para diagnosticar o tratar a un sujeto con una infección por VIH-1, o para administrar profilácticamente para prevenir la infección por VIH-1 en un sujeto. En algunas modalidades, los anticuerpos pueden usarse para determinar el título de VIH-1 en un sujeto.

A. Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno

Esta descripción proporciona los nuevos anticuerpos N6, N17 o F8 y sus variantes (lo que incluye fragmentos de unión a antígeno). Los estudios de mapeo de epítopos y de unión competitiva muestran que los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos se unen específicamente a Env del VIH-1 en un epítopo que se superpone con el sitio de unión a CD4 en la gp120.

Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos son sorprendentemente eficaces para la neutralización del VIH-1. Por ejemplo, como se analiza en el Ejemplo 1, el anticuerpo N6 neutralizó el 98 % de los pseudovirus de VIH-1 en un ensayo de neutralización estandarizado con una IC50 de menos de 50 pg/ml, y el 96 % de los pseudovirus con un valor de IC50 de menos de 1 pg/ml. Además, el anticuerpo N6 neutralizó numerosas cepas virales de VIH-1 que son resistentes al anticuerpo VRC01.

En algunas modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno incluyen una V^h y una V^l y se unen específicamente a gp120 y neutralizan el VIH-1. En varias modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno incluyen una V^h que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR)1, una HCDR2 y una HCDR3, y una cadena ligera que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR)1, una LCDR2, y una LCDR3 y se unen específicamente a gp120 y neutralizan el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una o más (es decir, una, dos o las tres) HCDr de uno de los anticuerpos N6, N17 o F8. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una o más (es decir, una, dos o las tres) LCDR de uno de los anticuerpos N6, N17 o F8. En varias modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que incluyen la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3, respectivamente, de uno de los anticuerpos N6, N17 o F8, y se une específicamente a gp120 y neutraliza el VIH-1.

El análisis de los anticuerpos monoclonales más abajo se refiere a los anticuerpos monoclonales que incluyen una V^h y una V^l que incluyen CDR con referencia al esquema de numeración de Kabat (a menos que el contexto lo indique de cualquier otra manera). El experto en la técnica comprenderá que pueden usarse diversos esquemas de numeración de CDR (tales como los esquemas de numeración de Kabat, Chothia o IMGT) para determinar las posiciones de la CDR. La secuencia de aminoácidos y las posiciones de CDR de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos N6, N17 o F8 de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de CDR Kabat de N6 y variantes de anticuerpos.

N6

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede basarse en o derivarse del anticuerpo N6, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h y una V^l que comprenden la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3, respectivamente (por ejemplo, de acuerdo con IMGT o kabat), del anticuerpo N6, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h de N6 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^l que comprende la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l de N6 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h y una V^l que comprenden la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^h y la V^l de N6 como se establece en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye al menos una CDR (tal como una HCDR3) con una secuencia que tiene al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 %) de identidad de secuencia con cualquiera de las CDR de cadena pesada o ligera de la V^h o la V^l de N6 como se muestra en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-111, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-93, respectivamente, de la SEQ ID NO: 2, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En modalidades adicionales de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-111, respectivamente, de la SEQ ID NO: 1, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-93, respectivamente, de la SEQ ID NO: 2, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V ^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En más modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 2, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que comprenden independientemente secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como una de la SEQ ID NO: 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En más modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 2, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

N17

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede basarse en o derivarse del anticuerpo N17, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h y una V^l que comprenden la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3, respectivamente (por ejemplo, de acuerdo con IMGT o kabat), del anticuerpo N17, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h de N17 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^l que comprende la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l de N17 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h y una V^l que comprenden la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^h y la V^l de N17 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye al menos una CDR (tal como una HCDR3) con una secuencia que tiene al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 %) de identidad de secuencia con una cualquiera de las CDR de cadena pesada o ligera de la V^h o la V^l de N17 como se muestra en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una VH que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-111, respectivamente, de la SEQ ID NO: 3, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-93, respectivamente, de la SEQ ID NO: 4, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En modalidades adicionales de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-111, respectivamente, de la SEQ ID NO: 3, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-93, respectivamente, de la SEQ ID NO: 4, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 3, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En más modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 4, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que comprenden independientemente secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como una de las SEQ ID NO: 3, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En más modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 4, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

F8

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede basarse en o derivarse del anticuerpo F8, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h y una V^l que comprenden la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3, respectivamente (por ejemplo, de acuerdo con IMGT o kabat), del anticuerpo F8, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h de F8 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^l que comprende la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l de F8 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h y una V^l que comprenden la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^h y la V^l de F8 como se expone en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye al menos una CDR (tal como una HCDR3) con una secuencia que tiene al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 %, o incluso 100 %) de identidad de secuencia con una cualquiera de las CDR de cadena pesada o ligera de la V^h o la V^l de F8 como se muestra en la Tabla 1, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-111, respectivamente, de la SEQ ID NO: 5, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-93, respectivamente, de la SEQ ID NO: 6, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En modalidades adicionales de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y 99-111, respectivamente, de la SEQ ID NO: 5, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y 89-93, respectivamente, de la SEQ ID NO: 6, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 5, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En más modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 6, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que comprenden independientemente secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticas a las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como una de SEQ ID NO: 5, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En más modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 6, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

Variantes de N6 adicionales

Variantes adicionales de V^h y V^l de N6 se identificaron por los estudios de secuenciación de próxima generación. Las secuencias de cadena pesada y ligera de estas variantes de secuencias se muestran en la Figura 18 e incluyen las secuencias de V^h 2_2014_00173626_H y 2_2014_00173626_Hmut, y las secuencias de V^l 1_2015_00106641_L, 1_2015_00065970_L, 1_2014_00019094_L y 1_2015_00217585_L. En varias modalidades, las secuencias V^h y V^l, o las secuencias CDR, de estos anticuerpos pueden "mezclarse y emparejarse" para formar un anticuerpo que se une específicamente a gp120 y neutraliza el VIH.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDr 2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2015_00106641_L (SEQ ID NO: 104) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2015_00065970_L (SEQ ID NO: 106) como se expone en la Figura18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2014_00019094_L (SEQ ID NO: 108) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2015_00217585_L (SEQ ID NO: 110) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2015_00106641_L (SEQ ID NO: 104) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2015_00065970_L (SEQ ID NO: 106) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2014_00019094_L (SEQ ID NO: 108) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2015_00217585_L (SEQ ID NO: 110) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l l_2015_00106641_L (SEQ ID NO: 104) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l l_2015_00065970_L (SEQ ID NO: 106) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l 1_2014_00019094_L (SEQ ID NO: 108) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_H (SEQ ID NO: 112) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l 1_2015_00217585_L (SEQ ID NO: 110) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2015_00106641_L (SEQ ID NO: 104) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2015_00065970_L (SEQ ID NO: 106) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2014_00019094_L (SEQ ID NO: 108) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de la V^l 1_2015_00217585_L (SEQ ID NO: 110) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2015_00106641_L (SEQ ID NO: 104) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2015_00065970_L (SEQ ID NO: 106) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2014_00019094_L (SEQ ID NO: 108) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y la V^l 1_2015_00217585_L (SEQ ID NO: 110) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l 1_2015_00106641_L (SEQ ID NO: 104) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l 1_2015_00065970_L (SEQ ID NO: 106) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l 1_2014_00019094_L (SEQ ID NO: 108) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^h 2_2014_00173626_Hmut (SEQ ID NO: 114) como se expone en la Figura 18, y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 %) idéntica a la secuencia de la V^l 1_2015_00217585_L (SEQ ID NO: 110) como se expone en la Figura 18, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

1. Descripción adicional de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno

Los anticuerpos N6, N17 o F8 son variantes clónales entre sí e incluyen CDR de cadena pesada y ligera similares que derivan de estos genes de la línea germinal de cadena pesada y ligera. En consecuencia, las secuencias de CDR de estos anticuerpos pueden usarse para generar secuencias de CDR consenso para un género de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a gp120 y neutralizan el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que incluye una HCDR1, una HCDR2 y/o una HCDR3 que incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (AHILX1, en donde X1 es F o Y), SEQ ID NO: 20 (WIKPQYGAVNFGGGFRX1, en donde X1 es D o G), y/o SEQ ID NO: 21 (ARDRSYX1DSSWALDAW, en donde X1 es G o D), respectivamente. En algunas modalidades de la descripción, el fragmento de unión a antígeno de anticuerpo incluye una V^l que incluye una LCDR1, una LCDR2 y/o una LCDR3 que incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (QTSQGVGX1DLH, en donde X1 es G o S), SEQ ID NO: 23 (HX1SSVED, en donde X1 es A o T), y/o SEQ ID NO: 24 (QVLX1 X2 F, en donde X1 es E o Q, y X2 es S o F), respectivamente. En algunas modalidades de la descripción, el fragmento de unión a antígeno de anticuerpo incluye una V^h que incluye una HCDR1, una HCDR2 y/o una Hc Dr 3 que incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21, respectivamente, e incluye, además, una V^l que incluye una LCDR1, una LCDR2 y/o una LCDR3 que incluyen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, Se Q ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24, respectivamente.

En algunas modalidades de la descripción, los segmentos V^h y V^l de los anticuerpos descritos pueden "mezclarse y emparejarse", en los que diferentes pares de segmentos V^l y V^h se combinan y se tamizan para la unión a gp120 para seleccionar combinaciones de pares V^l/V^h de interés.

En aún otra modalidad de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una HCDR1 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 7, 13 o 19, una HCDR2 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 8, 14 o 20, y una HCDR3 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 9, 15 o 21. En aún otra modalidad de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una LCDR1 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 10, 16 o 22, una LCDR2 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 11, 17 o 23, y una LCDR3 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 12, 18 o 24. En más modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una HCDR1 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 7, 13 o 19, una HCDR2 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 8, 14 o 20, una HCDR3 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 9, 15 o 21, una LCDR1 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 10, 16 o 22, una LCDR2 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 11, 17 o 23, y una LCDR3 con la secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NO: 12, 18 o 23.

En alguna modalidad de la descripción, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo incluye al menos una CDR con una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-18, en donde el anticuerpo se une específicamente a gp120 y neutraliza la infección por VIH-1. En modalidades adicionales de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^h que incluye una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que incluyen secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 31-35, 50-66 y/o 99-111, respectivamente, de una de las SEQ ID NO: 1, 3 o 5. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye una V^l que incluye una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3 que incluyen secuencias de aminoácidos al menos 90 % (tal como al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 %) idénticos a los aminoácidos 24-34, 50-56 y/o 89-93, respectivamente, de una de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6.

Los estudios estructurales proporcionados en la presente descripción ilustran varias características de la interacción del anticuerpo N6 con gp120, lo que incluye (1) un residuo de tirosina en la posición kabat 54 de la V^h de N6 (ubicado en la HCDR2), (2) tres residuos de glicina en las posiciones kabat 61- 63 de la V^h de N6 (también ubicados en la HCDR2), (3) un residuo de glicina en la posición kabat 28 de la V^l de N6 (ubicado en la LCDR1), (4) un motivo GXG en las posiciones kabat 28-30 de la V^l de N6 (también ubicado en la LCDR1) y (5) una LCDR3 de cinco residuos. Como se ilustra en la Figura 1, estas características se conservan en los anticuerpos N6, N17 o F8. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos que incluyen las CDR de los anticuerpos N6, N17 o F8 (o variantes de estos) pueden incluir además una o más de las características (1)-(5) enumeradas anteriormente (tales como las características (1) y (2); (1) y (3); (1) y (4); (1) y (5); (2) y (3); (2) y (4); (2) y (5); (3) y (4); (3) y (5); (4) y (5); (1), (2) y (3) ; (1), (2) y (4); (1), (2) y (5); (1), (3) y (4); (1), (3) y (5); (1), (4) y (5); (2), (3) y (4); (2), (3) y (5); (2), (4) y (5); (3), (4), y (5); (1), (2), (3) y (4); (1), (2), (3) y (5); (1), (3), (4) y (5); (2), (3), (4) y (5); o (1), (2), (3), (4) y (5)) y se unen específicamente a gp120 y neutralizan el VIH-1.

Además, debido a la similitud de los anticuerpos N6, N17 o F8 con ciertos anticuerpos conocidos de la clase VRC01, las características indicadas (1)-(5) enumeradas anteriormente (tales como las características (1) y (2); (1) y (3); (1) y (4) ; (1) y (5); (2) y (3); (2) y (4); (2) y (5); (3) y (4); (3) y (5); (4) y (5); (1), (2) y (3); (1), (2) y (4); (1), (2) y (5); (1), (3) y (4); (1), (3) y (5); (1), (4) y (5); (2), (3) y (4); (2), (3) y (5); (2), (4) y (5); (3), (4) y (5); (1), (2), (3) y (4); (1), (2), (3) y (5); (1), (3), (4) y (5); (2), (3), (4) y (5); o (1), (2), (3), (4) y (5)) pueden incluirse en los anticuerpos de la clase VRC01 para aumentar la amplitud y potencia con la que estos anticuerpos se unen específicamente a gp120 y neutralizan el VIH-1. Los ejemplos no limitantes de anticuerpos de la clase VRC01 que pueden modificarse para incluir una o más de las características (1)-(5) incluyen los anticuerpos VRC01, VRC03, VRC07, VRC07-523, 3BCN117, 12A12, 12A21, VRC-PG04, NIH45-46, VRC18, VRC23, VRC27, VRC-CH30, VRC-CH31, VRC-PG04 y VRC-PG20.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede ser un anticuerpo humano o fragmento de este. Además, se proporcionan anticuerpos quiméricos. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede incluir cualquier región marco adecuada, tal como (pero no se limita a) una región marco humana. Las regiones marco humanas, y las mutaciones que pueden hacerse en las regiones marco de un anticuerpo humano, se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos núm. 5,585,089). Alternativamente, una región marco heteróloga, tal como, pero no se limita a, una región marco de ratón o mono, puede incluirse en la cadena pesada o ligera de los anticuerpos. (Ver, por ejemplo, Jones y otros, Nature 321:522, 1986; Riechmann y otros, Nature 332:323, 1988; Verhoeyen y otros, Science 239:1534, 1988; Carter y otros, Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech.

12:437, 1992; y Singer y otros, J. Immunol. 150:2844, 1993).

El anticuerpo puede ser de cualquier isotipo. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo IgM o IgG, tal como IgG¹ , IgG² , IgG^s o IgG4. La clase de un anticuerpo que se une específicamente a gp120 puede cambiarse por otra. En un aspecto, una molécula de ácido nucleico que codifica V^l o V^h se aísla mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica, de manera que no incluye ninguna secuencia de ácido nucleico que codifique la región constante de la cadena ligera o pesada, respectivamente. Una molécula de ácido nucleico que codifica V^l o V^h se une operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un CL o CH de una clase diferente de molécula de inmunoglobulina. Esto puede lograrse mediante el uso de un vector o una molécula de ácido nucleico que comprende una cadena CL o CH, como se conoce en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a gp120, que originalmente era IgG, puede cambiarse de clase a una IgM. El cambio de clase puede usarse para convertir una subclase de IgG a otra, tal como de IgG¹ a IgG² , IgG3 o IgG4.

En algunos ejemplos, los anticuerpos descritos son oligómeros de anticuerpos, tales como dímeros, trímeros, tetrámeros, pentámeros, hexámeros, septámeros, octámeros, etcétera.

(a) Afinidad de unión

En varias modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede unirse específicamente a la gp120 con una afinidad (por ejemplo, medida por K^d) de no más de 1,0 x 10-8 M, no más de 5,0 x 10-8 M, no más de 1,0 x 10-9 M, no más de 5,0 x 10-9 M, no más de 1,0 x 10-10 M, no más de 5,0 x 10-10 M, o no más de 1,0 x 10-11 M. La K^d puede medirse, por ejemplo, mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno mediante el uso de métodos conocidos. En un ensayo, la afinidad de unión de Fab por el antígeno se mide al equilibrar Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, y después capturar el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer las condiciones para el ensayo, las placas multipocillo MICROTITER® (Thermo Scientific) se recubren durante toda la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab capturador (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9,6), y posteriormente se bloquean con albúmina de suero bovino al 2 % (p/v) en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C). En una placa no adsorbente (Nunc # 269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [125I]-antígeno con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta y otros, Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés se incuba durante toda la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un período más largo (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Después se retira la solución y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 al 0,1 % (TWEEN-20®) en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 pl/pocillo de centelleador (MICROSCINT-20™; Packard), y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos o igual al 20 % de unión máxima se eligen para su uso en ensayos de unión competitiva.

En otro ensayo, la K^d puede medirse mediante el uso de ensayos de resonancia de plasmón de superficie mediante el uso de un B iACORE ®-2000 o un BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25 °C con virutas de antígeno CM5 inmovilizado a ~10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, las virutas de biosensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE®, Inc.) se activan con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 pM) antes de la inyección a una tasa de flujo de 5 l/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con tensioactivo polisorbato 20 (TWEEN-20™) al 0,05 % (PBST) a 25 °C a una tasa de flujo de aproximadamente 25 l/min. Las tasas de asociación (k^on) y las tasas de disociación (k^off) se calculan mediante el uso de un modelo de unión Langmuir simple uno a uno (programa informático de evaluación BIACORE® versión 3.2) al ajustar simultáneamente los sensogramas de asociación y disociación. La constante de equilibrio de disociación (K^d) se calcula como la relación k^off/k^on. Ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la constante de asociación excede 106 M'1 s_1 por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie, entonces la constante de asociación puede determinarse mediante el uso de una técnica de desactivación fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25 °C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

(b) Neutralización

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno también puede distinguirse por la amplitud de neutralización. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede neutralizar al menos 70 % (tal como al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 %) de los aislados de VIH-1 incluidos en un panel estandarizado de pseudovirus VIH-1 (lo que incluye, por ejemplo, gp120 de los aislados de Clado A KER2018, RWO20.2, Q168.a2, Q769.d22 y Q769.h5, los aislados de Clado B JRFL.JB, BaL.01, YU2.DG, PVO.04, TRO.11, CAAN.A2, TRJO.58, THRO.18, BG1168.1 y 6101.1, y los aislados de Clado C ZA012.29, DU156.12, DU422.01, ZM106. 9, y ZM55.28a) con una IC⁵⁰ de menos de 50 pg/ml. Ensayos de neutralización de pseudovirus ilustrativos y paneles de pseudovirus VIH-1 se describen, por ejemplo, en Li y otros, J Virol 79, 10108-10125. En algunas modalidades, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito se une específicamente al sitio de unión a CD4 de la gp120 y puede neutralizar al menos el 50 % de los aislados de VIH-1 enumerados en la Figura 2B (a saber, el 6540.v4.cl, 620345.c1, T278-50, 6322.V4.C1, DU422.01, X2088.c9, 6545.V4.C1, 242-14, T250-4, 7165.18, BL01.DG, HO86.8, 6471.V1.C16, 6631.V3.C10, TVI.29, TZA125.17, CAP210.E8, DU172.17) con una concentración inhibitoria (IC⁵⁰) de <50 pg/ml. El experto en la técnica está familiarizado con los métodos para medir la amplitud y la potencia de neutralización, por ejemplo, dichos métodos incluyen la infección por pseudovirus Env del VIH-1 de una sola ronda de células TZM-bl (ver, por ejemplo, Li y otros, J Virol 79, 10108-10125; ver, además, la publicación PCT Núm. WO2011/038290).

Un método adicional para analizar la actividad de neutralización incluye un análisis de infección de ciclo único como se describe en Martin y otros (2003) Nature Biotechnology 21:71-76. En este ensayo, el nivel de actividad viral se mide a través de un marcador seleccionable cuya actividad es un reflejo de la cantidad de virus viable en la muestra, y se determina la IC⁵⁰. En otros ensayos, la infección aguda puede monitorearse en la línea celular PM1 o en células primarias (PBMC normales). En este ensayo, el nivel de actividad viral puede monitorearse al determinar las concentraciones de p24 mediante el uso de ELISA. Ver, por ejemplo, Martin y otros (2003) Nature Biotechnology 21:71-76.

(c) Anticuerpos multiespecíficos

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se incluye en un anticuerpo multiespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico. Dichos anticuerpos multiespecíficos pueden producirse mediante métodos conocidos, tales como la reticulación de dos o más anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno (tales como scFv) del mismo tipo o de tipos diferentes. Los métodos ilustrativos de fabricación de anticuerpos multiespecíficos incluyen los descritos en la Publicación PCT Núm. WO2013/163427. Los reticuladores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos claramente reactivos separados por un espaciador apropiado (tal como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (tal como suberato de disuccinimidilo). Dichos enlazadores están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se incluye en un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a gp120 y se une específicamente, además, a CD3. Se conocen ejemplos de dominios de unión a CD3 que pueden incluirse en el anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno e incluyen los descritos en la publicación PCT Núm. WO2013/163427.

Se conocen diversos tipos de anticuerpos multiespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos monocatenarios pueden codificarse por una sola molécula de ácido nucleico. En la técnica se conocen ejemplos de anticuerpos biespecíficos monocatenarios, así como también los métodos para construir dichos anticuerpos (ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 8,076,459, 8,017,748, 8,007,796, 7,919,089, 7,820,166, 7,635,472, 7,575,923, 7,435,549, 7,332,168, 7,323,440, 7,235,641, 7,229,760, 7,112,324, 6,723,538). Pueden encontrarse ejemplos adicionales de anticuerpos biespecíficos monocatenarios en la solicitud PCT núm. WO 99/54440; Mack, J. Immunol., 158:3965-3970, 1997; Mack, PNAS, 92:7021-7025, 1995; Kufer, Cancer Immunol. Immunother., 45:193-197, 1997; Loffler, Blood, 95:2098-2103, 2000; y Bruhl, J. Immunol., 166:2420-2426, 2001. La producción de moléculas biespecíficas Fab-scFv ("bicuerpos") se describe, por ejemplo, en Schoonjans y otros. (J. Immunol. 165:7050-57, 2000) y Willems y otros (J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 786:161-76, 2003). Para bicuerpos, una molécula scFv puede fusionarse a una de las cadenas VL-CL (L) o VH-CH1, por ejemplo, para producir un bicuerpo un scFv se fusiona al extremo C de una cadena Fab.

(d) Fragmentos

La presente descripción abarca los fragmentos de unión a antígeno, tales como Fab, F(ab')² y Fv que incluyen una cadena pesada y V^l y se unen específicamente a gp120. Estos fragmentos de anticuerpos conservan la capacidad de unirse selectivamente con el antígeno y son fragmentos de "unión a antígeno". Los ejemplos no limitantes de dichos fragmentos incluyen:

(1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de unión a antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, puede producirse por digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada;

(2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo puede obtenerse al tratar el anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos Fab' por molécula de anticuerpo;

(3) (Fab')2, el fragmento del anticuerpo que puede obtenerse al tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción posterior; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' unidos por dos enlaces disulfuro;

(4) Fv, un fragmento modificado genéticamente que contiene las V^h y V^l expresadas como dos cadenas; y

(5) anticuerpo monocatenario (tal como scFv), definido como una molécula modificada genéticamente que contiene la V^h y la V^l unidas por un enlazador polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria fusionada genéticamente (ver, por ejemplo, Ahmad y otros, Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). La orientación intramolecular del dominio de V^h y el dominio de V^l en un scFv no es decisivo para los anticuerpos proporcionados (por ejemplo, para los anticuerpos multiespecíficos proporcionados). Por lo tanto, pueden usarse scFv con ambas posibles organizaciones (V^h -dominio-enlazador dominio-VL -dominio; V^l -dominioenlazador dominio-VH -dominio).

(6) Un dímero de un anticuerpo monocatenario (scFV2), definido como un dímero de un scFV. Esto también se ha denominado un "minianticuerpo".

Los métodos para elaborar estos fragmentos se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 2013).

En algunas modalidades, el fragmento de unión a antígeno puede ser un anticuerpo Fv, que es típicamente de aproximadamente 25 kDa y contiene un sitio de unión a antígeno completo con tres CDR por cada cadena pesada y cada cadena ligera. Para producir anticuerpos FV, la V^h y la V^l pueden expresarse a partir de dos constructos de ácido nucleico individuales en una célula huésped. Si la V^h y la V^l se expresan de manera no contigua, las cadenas del anticuerpo Fv se mantienen unidas típicamente por interacciones no covalentes. Sin embargo, estas cadenas tienden a disociarse tras la dilución, por lo que se han desarrollado métodos para reticular las cadenas mediante glutaraldehído, disulfuros intermoleculares o un enlazador peptídico. De esta forma, en un ejemplo, el Fv puede ser un Fv estabilizado por disulfuro (dsFv), en donde la V^h y la V^l se unen químicamente por enlaces disulfuro. En un ejemplo adicional, los fragmentos Fv incluyen cadenas V^h y V^l conectadas por un enlazador peptídico. Estas proteínas de unión a antígeno monocatenarias (scFv) pueden prepararse mediante la construcción de una molécula de ácido nucleico que codifica los dominios V^h y V^l conectados por un oligonucleótido. La molécula de ácido nucleico se inserta en un vector de expresión, que posteriormente se introduce en una célula huésped tal como una célula de mamífero. Las células huésped recombinantes sintetizan una sola cadena de polipéptidos con un enlazador peptídico que une los dos dominios V. Los métodos para producir scFv se conocen en la técnica (ver Whitlow y otros, Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, página 97, 1991; Bird y otros, Science 242:423, 1988; Patente de Estados Unidos núm. 4,946,778; Pack y otros, Bio/Technology 11:1271, 1993; Ahmad y otros, Clin. Dev. Immunol., 2012, doi:10.1155/2012/980250; Marbry, IDrugs, 13:543-549, 2010). Además, se contemplan los dímeros de un anticuerpo monocatenario (scFV2).

Los fragmentos de unión a antígeno pueden prepararse por hidrólisis proteolítica del anticuerpo o por expresión en una célula huésped (tal como una célula de E. coli) de ADN que codifica el fragmento. Los fragmentos de unión a antígeno pueden obtenerse, además, mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos mediante métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno pueden producirse mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse posteriormente mediante el uso de un agente reductor de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de los enlaces disulfuro, para producir fragmentos monovalentes Fab' 3.5S. Alternativamente, una escisión enzimática que usa pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fc directamente (ver la Patente de Estados Unidos núm. 4,036,945 y la Patente de Estados Unidos núm.

4,331,647, y las referencias contenidas en ellas; Nisonhoff y otros, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman y otros, Methods in Enzymology, vol. 1, página 422, Academic Press, 1967; y Coligan y otros en las secciones 2.8.1-2.8.10 y 2.10.1-2.10.4).

Además, pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadenas ligeras y pesadas, la escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que se reconoce por el anticuerpo intacto.

Además, se han identificado dominios V^h de unión a antígeno, denominados anticuerpos de dominio (dAc), a partir de una biblioteca de genes de V^h murinos amplificados a partir de ADN genómico de ratones inmunizados (Ward y otros, Nature 341:544-546, 1989). Además, se han descrito polipéptidos de dominio variable de inmunoglobulina única humana capaces de unirse al antígeno con alta afinidad (ver, por ejemplo, las publicaciones PCT núms. WO 2005/035572 y WO 2003/002609). Las CDR descritas en la presente descripción también pueden incluirse en un dAc.

En algunas modalidades, una o más de las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y/o ligera (CDR) de un anticuerpo descrito (tal como el anticuerpo N6, N17 o F8) se expresa en la superficie de otra proteína, tal como una proteína de andamiaje. La expresión de dominios de anticuerpos en la superficie de una proteína de andamiaje se conoce en la técnica (ver, por ejemplo, Liu y otros, J. Virology 85(17):8467-8476, 2011). Dicha expresión crea una proteína quimérica que retiene la unión a gp120. En algunas modalidades específicas de la descripción, una o más de las CDR de la cadena pesada se injertan en una proteína de andamiaje, tal como una o más de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de cadena pesada. Además, pueden incluirse una o más CDR en un diacuerpo u otro tipo de molécula de anticuerpo monocatenario.

(e) Anticuerpos adicionales que se unen al epítopo de N6, N17 o F8 en la gp120.

Además, se incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo en la gp120 al que se une el anticuerpo N6, N17 o F8. Los anticuerpos que se unen a dicho epítopo pueden identificarse en función de su capacidad de competir de manera cruzada (por ejemplo, para inhibir competitivamente la unión de, de una manera estadísticamente significativa) con los anticuerpos N6, N17 o F8 proporcionados en la presente descripción en los ensayos de unión a gp120 (tal como los descritos en los Ejemplos). Un anticuerpo "compite" por la unión cuando el anticuerpo competidor inhibe la unión a gp120 del anticuerpo N6, N17 o F8 en más del 50 %, en presencia de concentraciones de anticuerpos competidores superiores a 106 x Kd del anticuerpo competidor. En una determinada modalidad, el anticuerpo que se une al mismo epítopo en la gp120 que el anticuerpo N6, N17 o F8 es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en la presente descripción.

Los anticuerpos humanos que se unen al mismo epítopo en la gp120 al que se une el anticuerpo N6, N17 o F8 pueden producirse mediante el uso de diversas técnicas conocidas en la técnica. Los anticuerpos humanos se describen generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol 20:450-459 (2008). Dichos anticuerpos pueden prepararse, por ejemplo, mediante la administración de un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al desafío antigénico. Dichos animales contienen típicamente todos o una parte de los loci de inmunoglobulina humana, que reemplazan los loci de inmunoglobulina endógena, o que están presentes extracromosómicamente o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los loci de inmunoglobulina endógena generalmente se han desactivado. Para una revisión de los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,075,181 y 6,150,584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; la patente de Estados Unidos 5,770,429 que describe la tecnología HUMAB®; la patente de Estados Unidos núm. 7,041,870 que describe la tecnología KM MOUSE®, y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. US 2007/0061900, que describe la tecnología Ve Lo CIMOUSE®). Las regiones variables humanas a partir de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden modificarse posteriormente, por ejemplo, al combinarlas con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos que se unen al mismo epítopo en la gp120 al que se une el anticuerpo N6, N17 o F8 también pueden fabricarse por métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano de ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Ver, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur y otros, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs.

51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner y otros, J. Immunol., 147: 86 (1991)). Los anticuerpos humanos generados mediante la tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen los descritos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm. 7,189,826 (que describe la producción de anticuerpos monoclonales IgM humanos a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humano-humano). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005). Los anticuerpos humanos pueden generarse, además, al aislar secuencias de dominio variable de clon Fv seleccionadas de bibliotecas de presentación de fagos derivadas de humanos. Dichas secuencias de dominio variable pueden combinarse después con un dominio constante humano deseado.

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente al mismo epítopo en la gp120 que N6, N17 o F8 pueden aislarse, además, al seleccionar bibliotecas combinatorias de anticuerpos con las características de unión deseadas. Por ejemplo, se conocen una variedad de métodos en la técnica para generar bibliotecas de presentación de fagos y tamizar dichas bibliotecas en busca de anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos métodos se revisan, por ejemplo, en Hoogenboom y otros en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y otros, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2001) y se describen, además, por ejemplo, en McCafferty y otros, Nature 348:552-554; Clackson y otros, Nature 352:624-628 (1991); Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu y otros, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee y otros, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 101(34):12467-12472 (2004); y Lee y otros, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004).

En ciertos métodos de presentación de fagos, los repertorios de genes de V^h y V^l se clonan por separado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se recombinan aleatoriamente en bibliotecas de fagos, que después pueden tamizarse para detectar fagos de unión a antígeno como se describe en Winter y otros, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Los fagos muestran típicamente fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv monocatenarios (scFv) o como fragmentos Fab. Las bibliotecas a partir de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad para el inmunógeno sin el requisito de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio virgen puede clonarse (por ejemplo, a partir de humanos) para proporcionar una única fuente de anticuerpos contra una amplia gama de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths y otros, EMBO J, 12:725-734 (1993). Finalmente, las bibliotecas vírgenes pueden hacerse, además, sintéticamente al clonar segmentos de genes V no reorganizados a partir de células madre, y mediante el uso de cebadores de PCR que contienen una secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr la reorganización in vitro, como lo describen Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen bibliotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: Patente de Estados Unidos núm. 5,750,373, y las publicaciones de patente de Estados Unidos núms. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 y 2009/0002360.

(f) Descripción adicional de variantes de anticuerpos

En algunas modalidades de la descripción, se contemplan variantes de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Puede hacerse cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución para llegar al constructo final, siempre y cuando el constructo final posea las características deseadas, por ejemplo, unión a antígeno.

En algunas modalidades de la descripción, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para la mutagénesis por sustitución incluyen las CDR y las regiones marco. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo de interés y los productos se tamizan para una actividad deseada, por ejemplo, unión a antígeno retenida/mejorada, mayor amplitud o potencia de neutralización del VIH-1, inmunogenicidad disminuida o ADCC o CDC mejoradas.

Las variantes retienen típicamente los residuos de aminoácidos necesarios para el correcto plegamiento y estabilización entre las regiones V^h y V^l, y retendrán las características de carga de los residuos para preservar el pI bajo y la baja toxicidad de las moléculas. En algunas modalidades de la descripción, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos en las regiones V^h y V^l para aumentar el rendimiento.

En algunas modalidades de la descripción, la V^h del anticuerpo puede comprender hasta 10 (tal como hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta a 8, o hasta 9) sustituciones de aminoácidos (tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos) en comparación con la secuencia de aminoácidos V^h expuesta como una de las SEQ ID NO: 1, 3 o 5, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, la V^l del anticuerpo puede comprender hasta 10 (tal como hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta a 8, o hasta 9) sustituciones de aminoácidos (tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos) en comparación con la secuencia de aminoácidos V^l expuesta como una de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede incluir hasta 10 (tal como hasta 1, hasta 2, hasta 3, hasta 4, hasta 5, hasta 6, hasta 7, hasta a 8, o hasta 9) sustituciones de aminoácidos (tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos) en la región marco de la V^h del anticuerpo o la región marco de la V^l del anticuerpo en comparación con una región marco conocida, o en comparación con las regiones marco del anticuerpo N6, N17 o F8, y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender hasta 10 sustituciones de aminoácidos (tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos) en la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3, en comparación a las secuencias CDR nativas correspondientes de uno de los anticuerpos N6, N17 o F8 (por ejemplo, como se expone en la Tabla 1), y puede unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1.

En algunas modalidades de la descripción, las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden, en agregado, comprender juntas hasta 10 sustituciones de aminoácidos (tal como hasta 8, hasta 6, hasta 5, hasta 4 o hasta 2 sustituciones de aminoácidos) en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo N6 que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas de dichas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender no más de una sustitución de aminoácidos en cada CDR en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo N6 que comprende las V^h y V^l expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En algunas modalidades de la descripción, las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden, en agregado, comprender juntas hasta 10 sustituciones de aminoácidos (tal como hasta 8, hasta 6, hasta 5, hasta 4 o hasta 2 sustituciones de aminoácidos) en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo que comprende las V^h y V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 104, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas de dichas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender no más de una sustitución de aminoácidos en cada CDR en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo N6 que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 104, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En algunas modalidades de la descripción, las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden, en agregado, comprender juntas hasta 10 sustituciones de aminoácidos (tal como hasta 8, hasta 6, hasta 5, hasta 4 o hasta 2 sustituciones de aminoácidos) en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 106, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas de dichas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender no más de una sustitución de aminoácidos en cada CDR en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo N6 que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 106, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En algunas modalidades de la descripción, las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden, en agregado, comprender juntas hasta 10 sustituciones de aminoácidos (tal como hasta 8, hasta 6, hasta 5, hasta 4 o hasta 2 sustituciones de aminoácidos) en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 106, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas de dichas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender no más de una sustitución de aminoácidos en cada CDR en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo N6 que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 108, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En algunas modalidades de la descripción, las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2, la HCDR3, la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno pueden, en agregado, comprender juntas hasta 10 sustituciones de aminoácidos (tal como hasta 8, hasta 6, hasta 5, hasta 4 o hasta 2 sustituciones de aminoácidos) en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 106, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas de dichas modalidades de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede comprender no más de una sustitución de aminoácidos en cada CDR en comparación con las secuencias de CDR correspondientes de un anticuerpo N6 que comprende la V^h y la V^l expuestas como las SEQ ID NO: 114 y 110, respectivamente, y pueden unirse específicamente a la gp120 y neutralizar el VIH-1. En algunas modalidades de la descripción, las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservadoras.

En ciertas modalidades de la descripción, pueden producirse sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más CDR siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para unirse al antígeno. Por ejemplo, pueden realizarse alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como se proporcionan en la presente descripción) que no reducen sustancialmente la afinidad de unión en las CDR. En ciertos aspectos de las variantes de secuencias de V^h y V^l proporcionadas anteriormente, cada CDR no se altera o no contiene más de una, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Para aumentar la afinidad de unión del anticuerpo, los segmentos V^l y V^h pueden mutarse aleatoriamente, tal como dentro de la región HCDR3 o la región LCDR3, en un proceso análogo al proceso de mutación somática in vivo responsable de la maduración por afinidad de los anticuerpos durante una respuesta inmunitaria natural. Por lo tanto, la maduración de afinidad in vitro puede lograrse al amplificar las regiones V^h y V^l mediante el uso de cebadores de PCR complementarios a la HCDR3 o LCDR3, respectivamente. En este proceso, los cebadores se han "enriquecido" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótidos en ciertas posiciones, de manera que los productos de PCR resultantes codifican segmentos V^h y V^l en los que se han introducido mutaciones aleatorias en las regiones CDR3 de V^h y/o V^l. Estos segmentos V^h y V^l mutados aleatoriamente pueden analizarse para determinar la afinidad de unión para gp120. En ejemplos particulares, la secuencia de aminoácidos de V^h es una de las SEQ ID NO: 1, 3 o 5. En otros ejemplos, la secuencia de aminoácidos de V^l es una de las SEQ ID NO: 2, 4 o 6. Se conocen métodos de maduración por afinidad in vitro (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) y Hoogenboom y otros en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien y otros, ed., Human Press, Totowa, N.J., (2001)).

En ciertas modalidades de la descripción, se altera un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para aumentar o disminuir el grado al cual el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se glicosila. La adición o eliminación de sitios de glicosilación puede realizarse convenientemente al alterar la secuencia de aminoácidos de manera que se creen o eliminen uno o más sitios de glicosilación.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato unido a la misma puede alterarse. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero comprenden típicamente un oligosacárido biantenario ramificado que generalmente se une por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fc. Ver, por ejemplo, Wright y otros, TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo, manosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactosa y ácido siálico, así como también una fucosa unida a una GlcNAc en el "tallo" de la estructura del oligosacárido biantenario. En algunas modalidades de la descripción, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo para crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En una modalidad de la descripción, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fc. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser del 1 % al 80 %, del 1 % al 65 %, del 5 % al 65 % o del 20 % al 40 %. La cantidad de fucosa se determina al calcular la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con relación a la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y con alto contenido de manosa) según se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en el documento WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo de asparagina ubicado aproximadamente en la posición 297 en la región Fc; sin embargo, Asn297 puede ubicarse, además, aproximadamente ±3 aminoácidos aguas arriba o aguas abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a pequeñas variaciones de secuencia en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos núms. Us 2003/0157108 (Presta, L. ); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con las variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki y otros, J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki y otros, Biotech. Bioeng. 87:614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec 13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka y otros, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Solicitud de Patente de Estados Unidos núm. u S 2003/0157108 A1, Presta, L; y documento W o 2004/056312 A1, Adams y otros , especialmente en el Ejemplo 11), y líneas celulares con genes anulados, tales como el gen de alfa-1,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO con genes anulados (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki y otros, Biotech. Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y. y otros, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y documento WO2003/085107).

Las variantes de anticuerpos se proporcionan, además, con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en los que GlcNAc biseca un oligosacárido biantenario unido a la región Fc del anticuerpo. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilación reducida y/o función ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpos, por ejemplo, en el documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet y otros); Patente de Estados Unidos núm. 6,602,684 (Umana y otros); y documento US 2005/0123546 (Umana y otros). Además, se proporcionan variantes de anticuerpos con al menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento WO 1997/30087 (Patel y otros); documento WO 1998/58964 (Raju, S.); y documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

En varias modalidades de la descripción, la región constante del anticuerpo incluye una o más sustituciones de aminoácidos para optimizar la vida media in vivo del anticuerpo. La vida media en suero de los Ac IgG se regula por el receptor Fc neonatal (FcRn). Por lo tanto, en varias modalidades de la descripción, el anticuerpo incluye una sustitución de aminoácidos que aumenta la unión al FcRn. El experto en la técnica conoce varias de dichas sustituciones, tales como las sustituciones en las regiones constantes de IgG T250Q y M428L (ver, por ejemplo, Hinton y otros, J Immunol., 176:346-356, 2006); M428L y N434S (la mutación "LS", ver, por ejemplo, Zalevsky, y otros, Nature Biotechnology, 28:157-159, 2010); N434A (ver, por ejemplo, Petkova y otros, Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006); T307A, E380A y N434A (ver, por ejemplo, Petkova y otros, Int. Immunol., 18:1759-1769, 2006); y M252Y, S254T y T256E (ver, por ejemplo, Dall'Acqua y otros, J. Biol. Chem., 281:23514-23524, 2006). Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos pueden unirse a un polipéptido Fc que incluye cualquiera de las sustituciones enumeradas anteriormente, por ejemplo, el polipéptido Fc puede incluir las sustituciones M428L y N434S.

En algunas modalidades de la descripción, la región constante del anticuerpo incluye una o más sustituciones de aminoácidos para optimizar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). La ADCC se media principalmente a través de un conjunto de receptores Fcy estrechamente relacionados. En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo incluye una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la unión a FcyRIIIa. El experto en la técnica conoce varias de dichas sustituciones, tales como las sustituciones en las regiones constantes de IgG S239D e I332E (ver, por ejemplo, Lazar y otros, Proc. Natl., Acad. Sci. EE.UU., 103:4005-4010, 2006); y S239D, A330L e I332E (ver, por ejemplo, Lazar y otros, Proc. Natl., Acad. Sci. EE.UU., 103:4005-4010, 2006).

Además, se incluyen combinaciones de las sustituciones anteriores, para generar una región constante de IgG con una mayor unión a FcRn y FcyRIIIa. Las combinaciones aumentan la vida media de anticuerpos y la ADCC. Por ejemplo, dicha combinación incluye anticuerpos con la siguiente sustitución de aminoácidos en la región Fc: (1) S239D/I332E y T250Q/M428L; (2) S239D/I332E y M428L/N434S; (3) S239D/I332E y N434A; (4) S239D/I332E y T307A/E380A/N434A; (5) S239D/I332E y M252Y/S254T/T256E; (6) S239D/A330L/I332E y 250Q/M428L; (7) S239D/A330L/I332E y M428L/N434S; (8) S239D/A330L/I332E y N434A; (9) S239D/A330L/I332E y T307A/E380A/N434A; o (10) S239D/A330L/I332E y M252Y/S254T/T256E. En algunos ejemplos, los anticuerpos, o un fragmento de unión a antígeno de estos, se modifica de manera que sea directamente citotóxico para las células infectadas, o use defensas naturales como el complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o fagocitosis por macrófagos.

En ciertas modalidades de la descripción, un anticuerpo proporcionado en la presente descripción puede modificarse adicionalmente para contener restos no proteicos adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para la derivatización del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, polímeros solubles en agua. Los ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) y dextrano o poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico y sus mezclas. El polietilenglicol propionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en el agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se une más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o tipo de polímeros usados para la derivatización puede determinarse en función de consideraciones lo que incluye, pero no se limita a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo que se va a mejorar, si el derivado del anticuerpo se usará en una terapia bajo condiciones definidas, etcétera.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede derivatizarse o unirse a otra molécula (tal como otro péptido o proteína). En general, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se derivatiza de manera que la unión a gp120 no se ve afectada negativamente por la derivatización o el marcado. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede unirse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente u otras) a una o más entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un marcador detectable, una molécula efectora o una proteína o péptido que puede mediar la asociación del anticuerpo o la porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

B. Conjugados

Los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a un epítopo en la gp120 pueden conjugarse a un agente, tal como una molécula efectora o un marcador detectable, mediante el uso de cualquier cantidad de medios conocidos por los expertos en la técnica. Pueden usarse medios de unión tanto covalentes como no covalentes. Un experto en la técnica apreciará que pueden usarse diversas moléculas efectoras y marcadores detectables, lo que incluye (pero no se limita a) toxinas y agentes radiactivos tales como 125I, 32P, 14C, 3H y 35S y otros marcadores, restos objetivo y ligandos, etcétera. La elección de una molécula efectora en particular o marcador detectable depende de la molécula o célula objetivo en particular y del efecto biológico deseado.

La elección de una molécula efectora o marcador detectable en particular depende de la molécula o célula objetivo en particular y del efecto biológico deseado. De esta forma, por ejemplo, la molécula efectora puede ser una citotoxina que se usa para provocar la muerte de una célula objetivo en particular (tal como una célula infectada por VIH-1). En otras modalidades de la descripción, la molécula efectora puede ser una citocina, tal como IL-15; pueden usarse conjugados que incluyen la citocina, por ejemplo, para estimular las células inmunitarias localmente.

El procedimiento para unir una molécula efectora o marcador detectable a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno varía de acuerdo con la estructura química del efector. Los polipéptidos contienen típicamente una variedad de grupos funcionales; tales como los grupos ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH2) o sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un polipéptido para resultar en la unión de la molécula efectora o marcador detectable. Alternativamente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se derivatiza para exponer o unir grupos funcionales reactivos adicionales. La derivatización puede implicar la unión de cualquiera de varias moléculas enlazadoras conocidas, tales como las disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL. El enlazador puede ser cualquier molécula usada para unir el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a la molécula efectora o marcador detectable. El enlazador es capaz de formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo o con el fragmento de unión a antígeno y con la molécula efectora o el marcador detectable. Los enlazadores adecuados se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, enlazadores de carbono de cadena lineal o ramificada, enlazadores de carbono heterocíclicos o enlazadores peptídicos. Cuando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y la molécula efectora o marcador detectable son polipéptidos, los enlazadores pueden unirse a los aminoácidos constituyentes a través de sus grupos laterales (tal como a través de un enlace disulfuro a la cisteína) o a los grupos alfa carbono amino y carboxilo de los aminoácidos terminales.

En vista de la gran cantidad de métodos que se han informado para unir una variedad de compuestos de radiodiagnóstico, compuestos radioterapéuticos, marcadores (tales como enzimas o moléculas fluorescentes), toxinas y otros agentes a anticuerpos, un experto en la técnica podrá determinar un método adecuado para unir un agente dado a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno u otro polipéptido. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede conjugarse con moléculas efectoras tales como fármacos de bajo peso molecular tales como monometil auristatina E (MMAE), monometil auristatina F (MMAF), maitansina, derivados de maitansina, lo que incluye el derivado de maitansina conocido como DM1 (también conocido como mertansina) u otros agentes para crear un conjugado fármaco-anticuerpo (ADC). En varias modalidades de la descripción, se proporcionan conjugados de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como calicheamicina, maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad toxina.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede conjugarse con un marcador detectable; por ejemplo, un marcador detectable capaz de detectarse por ELISA, espectrofotometría, citometría de flujo, microscopía o técnicas de diagnóstico por imágenes (tales como tomografía computarizada (CT), tomografía axial computarizada (CAT), obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), obtención de imágenes por resonancia magnética nuclear NMRI), tomografía por resonancia magnética (MTR), ultrasonido, examen de fibra óptica y examen laparoscópico). Los ejemplos específicos y no limitantes de marcadores detectables incluyen fluoróforos, agentes quimioluminiscentes, enlaces enzimáticos, isótopos radiactivos y metales pesados o compuestos (por ejemplo, nanocristales de óxido de hierro superparamagnéticos para detección por MRI). Por ejemplo, los marcadores detectables útiles incluyen compuestos fluorescentes, lo que incluye fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fosforo lantánido y similares. Además, se usan marcadores bioluminiscentes, tales como luciferasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente amarilla (YFP). Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede conjugarse, además, con enzimas que son útiles para la detección, tales como peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se conjuga con una enzima detectable, puede detectarse al añadir reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que puede discernirse. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado, que es visualmente detectable. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede conjugarse, además, con biotina, y detectarse mediante medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Cabe señalar que la avidina en sí misma puede conjugarse con una enzima o un marcador fluorescente.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede conjugarse con un agente paramagnético, tal como el gadolinio. Los agentes paramagnéticos tales como el óxido de hierro superparamagnético también se usan como marcadores. Además, los anticuerpos pueden conjugarse con lantánidos (tal como el europio y el disprosio) y el manganeso. Además, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede marcarse con epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (tales como secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo).

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede conjugarse, además, con un aminoácido radiomarcado. El radiomarcador puede usarse tanto para fines diagnósticos como terapéuticos. Por ejemplo, el radiomarcador puede usarse para detectar células que expresan gp120 y gp120 mediante rayos X, espectros de emisión u otras técnicas de diagnóstico. Los ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radionucleótidos: 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I.

Los expertos en la técnica conocen bien los medios para detectar dichos marcadores detectables. De esta forma, por ejemplo, los radiomarcadores pueden detectarse mediante el uso de película fotográfica o contadores de centelleo, los marcadores fluorescentes pueden detectarse mediante el uso de un fotodetector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan típicamente al proporcionar a la enzima un sustrato y detectar el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan simplemente al visualizar el marcador coloreado.

El número promedio de moléculas efectoras o restos marcadores detectables por anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en un conjugado puede variar, por ejemplo, de 1 a 20 restos por anticuerpo o fragmento de unión a antígeno.

En ciertas modalidades de la descripción, el número promedio de moléculas efectoras o restos marcadores detectables por anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en un conjugado varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 , de aproximadamente 1 a aproximadamente 3, de aproximadamente 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; de aproximadamente 3 a aproximadamente 5; o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4. La carga (por ejemplo, la relación molécula efectora/anticuerpo) de un conjugado puede controlarse de diferentes maneras, por ejemplo: (i) limitar el exceso molar del intermediario enlazador-molécula efectora o reactivo enlazador con relación al anticuerpo, (ii) limitar el tiempo o la temperatura de la reacción de conjugación, (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación de cisteína tiol, (iv) modificar genéticamente mediante técnicas recombinantes la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de manera que el número y la posición de los residuos de cisteína se modifique para el control del número o posición de las uniones enlazador-molécula efectora.

C. Receptores de antígeno quimérico (CAR)

Se describen en la presente descripción, además, receptores de antígeno quimérico (CAR) que son proteínas quiméricas construidas artificialmente que incluyen un dominio de unión a antígeno extracelular (por ejemplo, fragmento variable monocatenario (scFv)) que se une específicamente a gp120, unido a un dominio transmembrana, unido a uno o más dominios de señalización intracelular de células T. Las características de los CAR descritos incluyen su capacidad para redirigir la especificidad de las células T y la reactividad hacia las células que expresan gp120 de una manera no restringida por el MHC. El reconocimiento de la gp120 no restringido por MHC da a las células T que expresan un CAR descrito la capacidad de reconocer el antígeno independientemente del procesamiento del antígeno.

Los dominios de señalización de células T intracelulares pueden incluir, por ejemplo, un dominio de señalización del receptor de células T, un dominio de señalización coestimuladora de células T, o ambos. El dominio de señalización del receptor de células T se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de un receptor de células T, tal como la porción intracelular de la proteína CD3 zeta. El dominio de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora, que es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requieren para una respuesta eficiente de los linfocitos al antígeno.

1. Región extracelular

Varias modalidades proporcionan un CAR que incluye un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a gp120 como se describe en la presente descripción (ver, por ejemplo, sección II.A). Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede ser un scFv que incluye la V^h y la V^l de cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de estos descritos en la sección II.A.

En algunas modalidades, el dominio de unión a antígeno puede incluir una V^h y una V^l que incluyen las HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de V^h y V^l, respectivamente, de uno de los anticuerpos N6, N17 o F8 (por ejemplo, como se expone en la Tabla 1).

En algunas modalidades, el dominio de unión a antígeno incluye una V^h y una V^l que incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente; las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente; o las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente. En varias modalidades, el dominio de unión a antígeno puede ser un scFv. En algunas modalidades de la descripción, el scFv incluye una V^h y una V^l unidas por un enlazador peptídico, tal como un enlazador que incluye la secuencia de aminoácidos expuesta como GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 25).

El CAR puede incluir una secuencia de péptido señal, por ejemplo, en posición N-terminal con respecto al dominio de unión al antígeno. La secuencia de péptido señal puede comprender cualquier secuencia de péptido señal adecuada. En una modalidad, la secuencia del péptido señal es una secuencia del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos humanos (GM-CSF), tal como una secuencia de aminoácidos que incluye o consiste en LLVTSLLLCELPHPAFLLIPDT SEQ ID NO: 26. Si bien la secuencia del péptido señal puede facilitar la expresión del CAR en la superficie de la célula, la presencia de la secuencia del péptido señal en un CAR expresado no es necesaria para que el CAR funcione. Tras la expresión del CAR en la superficie celular, la secuencia del péptido señal puede separarse del CAR. En consecuencia, en algunas modalidades, el CAR carece de una secuencia de péptido señal.

Entre el dominio de unión al antígeno y el dominio transmembrana del CAR, puede haber un dominio espaciador, que incluye una secuencia polipeptídica. El dominio espaciador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente, de 10 a 100 aminoácidos y, con la máxima preferencia, de 25 a 50 aminoácidos. En algunas modalidades de la descripción, el dominio espaciador puede incluir un dominio de inmunoglobulina, tal como una secuencia de inmunoglobulina humana. En una modalidad de la descripción, el dominio de inmunoglobulina comprende una secuencia de dominio de inmunoglobulina G (IgGl) CH2 y CH3 (CH2CH3). A este respecto, el dominio espaciador puede incluir un dominio de inmunoglobulina que comprende o que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 27.

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK

Sin limitarse a una teoría en particular, se cree que el dominio CH2CH3 extiende el dominio de unión al antígeno del CAR lejos de la membrana de las células que expresan CAR y puede imitar con mayor precisión el tamaño y la estructura del dominio de un TCR nativo.

2. Dominio Transmembrana

Con respecto al dominio transmembrana, el CAR puede diseñarse para comprender un dominio transmembrana que se fusiona con el dominio extracelular del CAR. En una modalidad, se usa el dominio transmembrana que se asocia naturalmente con uno de los dominios en el CAR.

El dominio transmembrana puede derivarse ya sea de una fuente natural o de una sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio puede derivarse de cualquier proteína unida a la membrana o transmembrana. Los dominios transmembrana ilustrativos para su uso en los CAR descritos pueden incluir al menos la(s) región(es) transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, el dominio transmembrana puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina. En varias modalidades, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético.

Opcionalmente, un enlazador oligo o polipeptídico corto, preferentemente, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización de células T intracelulares y/o el dominio coestimulador de células T del CAR. Una secuencia enlazadora ilustrativa incluye uno o más dobletes de glicina-serina.

En algunas modalidades, el dominio transmembrana comprende el dominio transmembrana de un receptor de células T, tal como un dominio transmembrana CD8. Por lo tanto, el CAR puede incluir un dominio transmembrana CD8 que incluya o consista en la SEQ ID NO: 28:

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC. En otra modalidad, el dominio transmembrana comprende el dominio transmembrana de una molécula coestimuladora de células T, tal como CD137 o CD28. Por lo tanto, el CAR puede incluir un dominio transmembrana CD28 que incluye o consiste en SEQ ID NO: 29:

IEVMYPPPYLDNEKSNGTNHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLWVGGVLACYSLLVTVAFNFWVR

3. Región intracelular

La región intracelular del CAR incluye uno o más dominios de señalización de células T intracelulares responsables de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de una célula T en la que se expresa o se coloca el CAR. En la presente descripción se proporcionan dominios de señalización de células T ilustrativos, y se conocen por el experto en la técnica.

Si bien puede emplearse un dominio de señalización de células T intracelular completo en un CAR, en muchos casos no es necesario usar toda la cadena. En la medida en que se use una porción truncada del dominio de señalización intracelular de células T, dicha porción truncada puede usarse en lugar de la cadena intacta siempre que traduzca la señal de función efectora de células T relevante.

Los ejemplos de dominios de señalización de células T intracelulares para su uso en el CAR incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR) y las moléculas coestimuladoras que actúan en concierto para iniciar la transducción de señales después de la activación del receptor de antígeno, así como también cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

Los dominios de señalización del receptor de células T regulan la activación primaria del complejo del receptor de células T, ya sea de manera estimulante o de manera inhibitoria. Los CAR descritos pueden incluir secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que actúan de manera estimulante, que pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación de inmunorreceptores basados en tirosina o ITAM. Los ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias que pueden incluirse en un CAR descrito incluyen los de las proteínas CD3 zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En varias modalidades, la molécula de señalización citoplasmática en el CAR incluye un dominio de señalización de células T intracelular de CD3 zeta.

La región intracelular del CAR puede incluir el dominio de señalización citoplasmática primaria que contiene ITAM (tal como CD3-zeta) solo o combinado con cualquier otro dominio(s) citoplasmático(s) deseado(s) útil(es) en el contexto de un CAR. Por ejemplo, el dominio citoplasmático del CAR puede incluir una porción de cadena CD3 zeta y un dominio de señalización coestimuladora intracelular. El dominio de señalización coestimuladora se refiere a una porción del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta eficiente de los linfocitos a un antígeno. Los ejemplos de dichas moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno asociado a la función de linfocitos 1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C y B7-H3. Un ejemplo adicional de un dominio de señalización que puede incluirse en unos CAR descritos es un miembro 18 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF18; también conocido como dominio de señalización de la proteína relacionada con TNFR inducida por glucocorticoides, GITR).

En algunas modalidades, el CAR puede incluir un dominio de señalización CD3 zeta, un dominio de señalización CD8, un dominio de señalización CD28, un dominio de señalización CD137 o una combinación de dos o más de estos. En una modalidad, el dominio citoplasmático incluye el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28. En otra modalidad, el dominio citoplasmático incluye el dominio de señalización de CD3 zeta y el dominio de señalización de CD137. En aún otra modalidad, el dominio citoplasmático incluye el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de CD28 y CD137. El orden de uno o más dominios de señalización de células T en el CAR puede variar según lo necesite el experto en la técnica.

Se proporcionan secuencias de aminoácidos ilustrativas para dichos dominios de señalización de células T. Por ejemplo, el dominio de señalización de CD3 zeta puede incluir o consistir en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 30 (RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEA YSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR), el dominio de señalización de CD8 puede incluir o consistir en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 31 (FVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLL LSLVITLYCNHRNR), el dominio de señalización de CD28 puede incluir o consistir en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 32 (SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS), el dominio de señalización de CD137 puede incluir o consistir en la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 33 (KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL) o la SEQ ID NO: 34 (RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL).

Las secuencias de señalización citoplasmática dentro de la porción de señalización citoplasmática del CAR de la invención pueden unirse entre sí en un orden aleatorio o especificado. Opcionalmente, un conector polipeptídico corto, preferentemente, de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el enlace. Un doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado. Además, entre el dominio de señalización y el dominio transmembrana del CAR, puede haber un dominio espaciador, que incluye una secuencia polipeptídica. El dominio espaciador puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente, de 10 a 100 aminoácidos y, con la máxima preferencia, de 25 a 50 aminoácidos.

4. Descripción adicional de los CAR

Además, se proporcionan porciones funcionales de los CAR descritos en la presente descripción. El término "porción funcional" cuando se usa en referencia a un CAR se refiere a cualquier parte o fragmento del CAR, cuya parte o fragmento retiene la actividad biológica del CAR del cual es parte (el CAR parental). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que retienen la capacidad de reconocer células objetivo, o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, en un grado similar, el mismo grado, o en mayor grado, que el CAR parental. En referencia al CAR primario, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80%, 90 %, 95 % o más del C^a R parental.

El CAR, o la porción funcional de este, puede incluir aminoácidos adicionales en el extremo terminal amino o carboxilo, o en ambos extremos, cuyos aminoácidos adicionales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del CAR parental. Convenientemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica del CAR o la porción funcional, por ejemplo, reconocen las células objetivo, detectan el cáncer, tratan o previenen el cáncer, etcétera. Más convenientemente, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del CAR parental.

Además, se proporcionan variantes funcionales de los CAR descritos en la presente descripción, que tienen una similitud o identidad de secuencia sustancial o significativa con respecto a un CAR parental, cuya variante funcional retiene la actividad biológica del CAR del cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en la presente descripción (el CAR parental) que retienen la capacidad de reconocer las células objetivo en un grado similar, el mismo grado o en mayor grado que el CAR parental. En referencia al CAR parental, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente 30 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %), aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más idéntica en la secuencia de aminoácidos al CAR parental.

Una variante funcional puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos del CAR parental con al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR parental con al menos una sustitución de aminoácidos no conservadora. En este caso, se prefiere que la sustitución de aminoácidos no conservadora no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución de aminoácidos no conservadora puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el CAR parental.

Los CAR (lo que incluye las porciones funcionales y las variantes funcionales) pueden tener cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre y cuando los CAR (o porciones funcionales o variantes funcionales de estos) conserven su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente al antígeno, detectar células enfermas en un mamífero, o tratar o prevenir enfermedades en un mamífero, etcétera. Por ejemplo, el CAR puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud.

Los CAR (lo que incluye las porciones funcionales y variantes funcionales de la invención) pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Dichos aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido a-amino ndecanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, anaftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolino-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolino-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentano carboxílico, ácido a-aminociclohexano carboxílico, ácido ocaminocicloheptano carboxílico, ácido -(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido Y-diaminobutírico, ácido a,pdiaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.

Los CAR (lo que incluye las porciones funcionales y las variantes funcionales) pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse a través de, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/o opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.

Los métodos para generar receptores de antígenos quiméricos, células T que incluyen dichos receptores, y su uso (por ejemplo, para el tratamiento del cáncer) se conocen en la técnica y se describen con más detalle en la presente descripción (ver, por ejemplo, Brentjens y otros, 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan y otros, 2010, Molecular Therapy, publicado en línea el 23 de febrero de 2010, páginas 1-9; Till y otros, 2008, Blood, 112:2261 -2271; Park y otros, Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp y otros, N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013; Han y otros, J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; publicaciones PCT WO2012/079000, WO2013/126726; y publicación de los Estados Unidos 2012/0213783). Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de unión a antígeno quimérico descrito puede incluirse en un vector de expresión (tal como un vector lentiviral) para su expresión en una célula huésped, tal como una célula T, para producir el CAR descrito. En algunas modalidades de la descripción, los métodos para usar el receptor de antígeno quimérico incluyen aislar células T a partir de un sujeto, transformar las células T con un vector de expresión (tal como un vector lentiviral) que codifica el receptor de antígeno quimérico y administrar las células T modificadas que expresan el receptor de antígeno quimérico al sujeto para el tratamiento, por ejemplo, para el tratamiento de un tumor en el sujeto.

D. Polinucleótidos y Expresión

Se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de ADNc) que codifican las secuencias de aminoácidos de anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, CAR y conjugados que se unen específicamente a gp120. Los ácidos nucleicos que codifican estas moléculas pueden producirse fácilmente por un experto en la técnica, mediante el uso de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente descripción (tales como las secuencias CDR y las secuencias V^h y V^l), secuencias disponibles en la técnica (tales como secuencias de región marco o constante) y el código genético. En varias modalidades, una molécula de ácido nucleico puede codificar la V^h, la V^l o tanto la V^h y la V^l (por ejemplo, en un vector de expresión bicistrónico) de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito. En varias modalidades, las moléculas de ácido nucleico pueden expresarse en una célula huésped (tal como una célula de mamífero) para producir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito.

Un experto en la técnica puede usar fácilmente el código genético para construir una variedad de ácidos nucleicos funcionalmente equivalentes, tales como ácidos nucleicos que difieren en secuencia pero que codifican la misma secuencia de anticuerpos, o codifican una proteína conjugada o de fusión que incluye la secuencia de ácido nucleico de V^l y/o V^h.

En un ejemplo no limitante, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la V^h de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito e incluye la secuencia de ácido nucleico expuesta como una cualquiera de las SEQ ID NO: 36, 38 o 40. En un ejemplo no limitante, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la V^l de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito e incluye la secuencia de ácido nucleico expuesta como una cualquiera de las SEQ ID NO: 37, 39 o 41. En un ejemplo no limitante, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la V^h y la V^l de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito e incluye las secuencias de ácido nucleico expuestas como una cualquiera de las SEQ ID NO: 36 y 37, respectivamente, 38 y 39, respectivamente, o 40 y 41, respectivamente. En un ejemplo no limitante, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la V^h y la V^l de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito e incluye las secuencias de ácido nucleico expuestas como una cualquiera de las SEQ ID NO: 113 y 105, respectivamente, 113 y 107, respectivamente, 113 y 109, respectivamente, 113 y 111, respectivamente, 114 y 105, respectivamente, 114 y 107, respectivamente, 114 y 109, respectivamente, 114 y 111, respectivamente.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno, los CAR y los conjugados que se unen específicamente a gp120 pueden prepararse mediante cualquier método adecuado lo que incluye, por ejemplo, la clonación de secuencias apropiadas o por síntesis química directa mediante métodos tales como el método del fosfotriéster de Narang y otros, Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el método del fosfodiéster de Brown y otros, Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage y otros, Tetra. Lett.

22:1859-1862, 1981; el método del triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22(20):1859-1862, 1981, por ejemplo, mediante el uso de un sintetizador automático como se describe en, por ejemplo, Needham-VanDevanter y otros, Nucl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; y, el método de soporte sólido de la patente de Estados Unidos núm. 4,458,066. La síntesis química produce un oligonucleótido monocatenario. Este puede convertirse en ADN bicatenario por hibridación con una secuencia complementaria o por polimerización con una ADN polimerasa mediante el uso de la cadena sencilla como plantilla.

Pueden prepararse ácidos nucleicos ilustrativos mediante técnicas de clonación. Se conocen ejemplos de técnicas apropiadas de clonación y secuenciación, e instrucciones suficientes para dirigir a expertos a través de muchos ejercicios de clonación (ver, por ejemplo, Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2012) y Ausubel y otros (En Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, en todo el suplemento 104, 2013). La información del producto de los fabricantes de reactivos biológicos y equipos experimentales también proporciona información útil. Dichos fabricantes incluyen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen (Carlsbad, CA) y Applied Biosystems (Foster City, CA), así como también muchas otras fuentes comerciales conocidas por un experto.

Además, los ácidos nucleicos pueden prepararse por métodos de amplificación. Los métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación autosostenida de secuencias (3SR). Los expertos en la técnica conocen bien una amplia variedad de métodos de clonación, células huésped y metodologías de amplificación in vitro.

En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica un CAR como se proporciona en la presente descripción para la expresión en una célula T para generar una célula T con receptor de antígeno quimérico. La molécula de ácido nucleico que codifica el receptor de unión al antígeno quimérico puede incluirse en un vector (tal como un vector lentiviral) para su expresión en una célula huésped, tal como una célula T. Las células ilustrativas incluyen una célula T, una célula asesina natural (NK), un linfocito T citotóxico (CTL) y una célula T reguladora. Los métodos para generar moléculas de ácido nucleico que codifican receptores de antígeno quimérico y células T que incluyen dichos receptores se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Brentjens y otros, 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan y otros, 2010, Molecular Therapy, publicado en línea el 23 de febrero de 2010, páginas 1-9; Till y otros, 2008, Blood, 112:2261-2271; Park y otros, Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011; Grupp y otros, N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013; Han y otros, J. Hematol Oncol., 6:47, 2013; publicación PCT WO2012/079000, WO2013/126726; y publicación de los Estados Unidos 2012/0213783).

Las moléculas de ácido nucleico pueden expresarse en una célula modificada genéticamente de manera recombinante, tales como células de bacterias, plantas, levaduras, insectos y mamíferos. Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno y los conjugados pueden expresarse como una cadena V^h y/o V^l individual (unida a una molécula efectora o marcador detectable según sea necesario), o pueden expresarse como una proteína de fusión. Métodos de expresión y purificación de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno se conocen y se describen más a fondo en la presente descripción (ver, por ejemplo, Al-Rubeai (ed), Antibody Expression and Production, Springer Press, 2011). Además, puede expresarse una inmunoadhesina. Por lo tanto, en algunos ejemplos, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican una V^h y V^l, y la inmunoadhesina. Las secuencias de ácido nucleico pueden codificar opcionalmente una secuencia líder.

Para crear un scFv, los fragmentos de ADN que codifican la V^h y la V^l pueden unirse operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera que las secuencias de V^h y V^l pueden expresarse como una proteína monocatenaria contigua, con los dominios V^l y V^h unidos por el enlazador flexible (ver, por ejemplo, Bird y otros, Science 242:423-426, 1988; Huston y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883, 1988; McCafferty y otros, Nature 348:552-554, 1990; Kontermann y Dubel (Ed), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2a Ed., Springer Press, 2010; Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2a, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 2013). Opcionalmente, puede incluirse un sitio de escisión en un enlazador, tal como un sitio de escisión con furina.

El ácido nucleico que codifica una V^h y/o la V^l puede codificar, opcionalmente, un dominio Fc (inmunoadhesina). El dominio Fc puede ser un dominio Fc de IgA, IgM o IgG. El dominio Fc puede ser un dominio Fc optimizado, como se describe en la Solicitud de Patente Publicada de los Estados Unidos núm. 2010/093979. En un ejemplo, la inmunoadhesina es un Fc de IgG1.

El anticuerpo monocatenario puede ser monovalente, si se usa solo una V^h y V^l, bivalente, si se usan dos V^h y V^l, o polivalente, si se usan más de dos V^h y V^l. Pueden generarse anticuerpos biespecíficos o polivalentes que se unen específicamente a gp120 y a otro antígeno, tal como, pero no se limita a, CD3. La V^h y la V^l codificada pueden incluir, opcionalmente, un sitio de escisión de furina entre los dominios V^h y V^l.

Los expertos en la técnica conocen los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de proteínas, lo que incluye E. coli, otros huéspedes bacterianos, levaduras y diversas células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO, HeLa y mieloma.

Una o más secuencias de ADN que codifican los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, CAR o conjugados pueden expresarse in vitro mediante transferencia de ADN a una célula huésped adecuada. La célula puede ser procariota o eucariota. El término incluye, además, cualquier progenie de la célula huésped sujeto. Se entiende que toda la progenie puede no ser idéntica a la célula parental ya que puede haber mutaciones que se producen durante la replicación. Los métodos de transferencia estable, lo que significa que el ADN extraño se mantiene continuamente en el huésped, se conocen en la técnica. Los hibridomas que expresan los anticuerpos de interés también se abarcan por esta descripción.

La expresión de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos y los fragmentos de unión a antígeno descritos en la presente descripción puede lograrse al unir operativamente el ADN o el ADNc a un promotor (que es constitutivo o inducible), seguido de la incorporación en un casete de expresión. El promotor puede ser cualquier promotor de interés, lo que incluye un promotor de citomegalovirus y un promotor del virus linfotrófico de células T humanas (HTLV)-1. Opcionalmente, se incluye un potenciador, tal como un potenciador de citomegalovirus, en el constructo. Los casetes pueden ser adecuados para la replicación e integración en procariotas o eucariotas. Los casetes de expresión típicos contienen secuencias específicas útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica la proteína. Por ejemplo, los casetes de expresión pueden incluir promotores apropiados, potenciadores, terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación, un codón de inicio (es decir, ATG) frente a un gen que codifica proteínas, señal de empalme para intrones, secuencias para el mantenimiento del marco de lectura correcto de ese gen para permitir la traducción adecuada del ARNm y codones de parada. El vector puede codificar un marcador seleccionable, tal como un marcador que codifica resistencia a fármacos (por ejemplo, resistencia a ampicilina o tetraciclina).

Para obtener una expresión de alto nivel de un gen clonado, es conveniente construir casetes de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción (secuencias de unión al ribosoma internas) y un terminador de la transcripción/traducción. Para E. coli, esto puede incluir un promotor tal como los promotores T7, trp, lac o lambda, un sitio de unión a ribosomas y, preferentemente, una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucariotas, las secuencias de control pueden incluir un promotor y/o un potenciador derivado de, por ejemplo, un gen de inmunoglobulina, HTLV, SV40 o citomegalovirus, y una secuencia de poliadenilación, y pueden incluir, además, secuencias donantes y/o aceptoras de empalme (por ejemplo, secuencias de aceptor y donante de empalme de CMV y/o HTLV). Los casetes pueden transferirse a la célula huésped elegida por métodos bien conocidos tales como la transformación o electroporación para E. coli y tratamiento con fosfato de calcio, electroporación o lipofección para células de mamífero. Las células transformadas por los casetes pueden seleccionarse por resistencia a los antibióticos conferidos por genes contenidos en los casetes, tales como los genes amp, gpt, neo e hyg.

Cuando el huésped es un eucariota, pueden usarse métodos de transfección de ADN como coprecipitados con fosfato de calcio, procedimientos mecánicos convencionales tales como microinyección, electroporación, inserción de un plásmido encerrado en liposomas o vectores de virus. Las células eucariotas pueden cotransformarse, además, con secuencias de polinucleótidos que codifican el anticuerpo, anticuerpo marcado o fragmento de unión a antígeno, y una segunda molécula de ADN extraña que codifica un fenotipo seleccionable, tal como el gen de la timidina quinasa del herpes simple. Otro método es usar un vector viral eucariota, tal como el virus simio 40 (SV40) o el virus del papiloma bovino, para infectar o transformar transitoriamente las células eucariotas y expresar la proteína (ver, por ejemplo, Viral Expression Vectors, Springer Press, Muzyczka ed., 2011). Un experto en la técnica puede usar fácilmente sistemas de expresión tales como plásmidos y vectores de uso en la producción de proteínas en células, lo que incluye células eucariotas superiores tales como las líneas celulares COS, CHO, HeLa y mieloma.

Para los propósitos de producir un CAR recombinante, la célula huésped puede ser una célula de mamífero. La célula huésped puede ser una célula humana. En algunas modalidades, la célula huésped puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), o una célula T. La célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivadas, por ejemplo, Jurkat, SupTl, etcétera, o una célula T obtenida de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, la célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, lo que incluye, pero no se limita a, sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, timo u otros tejidos o fluidos. Además, las células T pueden enriquecerse o purificarse. La célula T puede ser una célula T humana. La célula T puede ser una célula T aislada de un humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede ser de cualquier etapa de desarrollo, lo que incluye, pero no se limita a, células T positivas dobles CD4+/CD8+, células T auxiliares CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, células T CD8+ (por ejemplo, células T citotóxicas), células infiltrantes de tumores, células T de memoria, células T vírgenes y similares. La célula T puede ser una célula T CD8+ o una célula T CD4+.

Además, se proporciona una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en la presente descripción. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etcétera. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población puede ser, además, una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula huésped que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una modalidad de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en la presente descripción.

Pueden hacerse modificaciones a un ácido nucleico que codifica un polipéptido descrito en la presente descripción sin disminuir su actividad biológica. Pueden hacerse algunas modificaciones para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula dirigida en una proteína de fusión. Dichas modificaciones se conocen bien por los expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, codones de terminación, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de inicio, aminoácidos adicionales colocados en cualquiera de los extremos para crear sitios de restricción convenientemente ubicados, o aminoácidos adicionales (tales como poli His) para ayudar en las etapas de purificación. Además de los métodos recombinantes, los inmunoconjugados, los restos efectores y los anticuerpos de la presente descripción pueden construirse, además, en su totalidad o en parte mediante el uso de síntesis de péptidos estándar bien conocida en la técnica.

Una vez expresados, los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno y los conjugados pueden purificarse de acuerdo con los procedimientos estándar en la técnica, lo que incluye precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna y similares (ver, en general, Ed. Simpson, Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008). Los anticuerpos, el fragmento de unión a antígeno y los conjugados no necesitan ser 100 % puros. Una vez purificados, parcialmente o con la homogeneidad deseada, si se usarán terapéuticamente, los polipéptidos deben estar sustancialmente libres de endotoxina.

Se han descrito métodos para la expresión de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno y conjugados, y/o replegamiento a una forma activa apropiada, de células de mamífero y bacterias tales como E. coli y se conocen bien y son aplicables a los anticuerpos descritos en la presente descripción. Ver, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2a, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 2013, Ed. Simpson, Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Cold Harbor Press, 2008 y Ward y otros, Nature 341:544, 1989.

Además de los métodos recombinantes, los anticuerpos, los fragmentos de unión al antígeno y/o los conjugados también pueden construirse en su totalidad o en parte mediante la síntesis estándar de péptidos. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos puede lograrse al unir el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia. Técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Basic methods in Protein Purification and Analysis: A laboratory Manual, Parte A. págs. 3-284; Merrifield y otros, J. Am. Chem Soc. 85:2149-2156, 1963, y Stewart y otros, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984. Las proteínas de mayor longitud pueden sintetizarse por condensación de los extremos amino y carboxilo de fragmentos más cortos. Los métodos para formar enlaces peptídicos mediante la activación de un extremo terminal carboxilo (tal como mediante el uso del reactivo de acoplamiento N,N'-dicilohexilcarbodimida) se conocen bien en la técnica.

E. Métodos y composiciones

1. Métodos terapéuticos

La presente invención proporciona una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica descrita para su uso en un método para prevenir o tratar una infección por VIH-1 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica, lo que previene o trata de esta manera la infección por VIH-1.

En la presente descripción se describen métodos para la prevención o el tratamiento de una infección por VIH-1. La prevención puede incluir la inhibición de la infección con VIH-1. Los métodos incluyen poner en contacto una célula con una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR o célula T que expresa un CAR que se une específicamente a gp120 o un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado o CAR. El método puede incluir, además, administrar a un sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR o célula T que expresa un CAR que se une específicamente a gp120 o un ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, o CAR, a un sujeto. En algunos ejemplos, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado, el CAR, las células T que expresan un CAR o una molécula de ácido nucleico, pueden usarse antes de la exposición (por ejemplo, para prevenir o inhibir la infección por VIH-1). En algunos ejemplos, el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR, o molécula de ácido nucleico, puede usarse en la profilaxis posterior a la exposición. En algunos ejemplos, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado o la molécula de ácido nucleico pueden usarse para eliminar o reducir la carga viral del VIH-1 en un sujeto. Por ejemplo, una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, c Ar , célula T que expresa un CAR o molécula de ácido nucleico, puede administrarse a un sujeto con VIH-1, tal como un sujeto que se trata con terapia antiviral. En algunos ejemplos, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado o la molécula de ácido nucleico se modifica de manera que sea directamente citotóxico para las células infectadas (por ejemplo, por conjugación con una toxina), o use defensas naturales tales como el complemento, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), o fagocitosis por macrófagos.

La infección por VIH-1 no necesita eliminarse por completo para que el método sea eficaz. Por ejemplo, un método puede disminuir la infección por VIH-1 en una cantidad deseada, por ejemplo, en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o incluso al menos 100 % (eliminación de células infectadas por VIH-1 detectables), en comparación con la infección por VIH-1 en ausencia del tratamiento. En algunas modalidades de la descripción, la célula se pone en contacto, además, con una cantidad eficaz terapéuticamente de un agente adicional, tal como un agente antiviral. La célula puede estar in vivo o in vitro. Los métodos pueden incluir la administración de uno en más agentes adicionales conocidos en la técnica. En modalidades adicionales de la descripción, la replicación del VIH-1 puede reducirse o inhibirse mediante métodos similares. La replicación del VIH-1 no necesita eliminarse por completo para que el método sea eficaz. Por ejemplo, un método puede disminuir la replicación del VIH-1 en una cantidad deseada, por ejemplo, en al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 98 %, o incluso al menos 100 % (eliminación del VIH-1 detectable), en comparación con la replicación del VIH-1 en ausencia del tratamiento.

En una modalidad de la descripción, la administración de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR, o molécula de ácido nucleico, resulta en una reducción en el establecimiento de la infección por VIH-1 y/o la reducción de la progresión posterior de la enfermedad por VIH-1 en un sujeto. Una reducción en el establecimiento de la infección por VIH-1 y/o una reducción en la progresión posterior de la enfermedad por VIH-1 abarcan cualquier reducción estadísticamente significativa en la actividad del VIH-1. En algunas modalidades, se describen los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos para su uso en métodos de tratamiento de un sujeto con una infección por VIH-1. Estos métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR o molécula de ácido nucleico, lo que previene o trata de esta manera la infección por VIH-1.

Los estudios han demostrado que la tasa de transmisión del VIH-1 de madre a hijo se reduce significativamente cuando se administra zidovudina a mujeres infectadas con VIH durante el embarazo y el parto y a la descendencia después del nacimiento (Connor y otros, 1994 Pediatr Infect Dis J 14:536-541). Varios estudios sobre la transmisión de madre a hijo del VIH-1 han demostrado una correlación entre la carga del virus materno en el momento del parto y el riesgo de transmisión del VIH-1 al niño. La presente descripción proporciona anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, CAR, células T que expresan un CAR y molécula de ácido nucleico que son útiles para disminuir la transmisión del VIH de madre a lactante. Por lo tanto, en algunos ejemplos, se administra una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo específico de la gp120 o un fragmento de unión a antígeno de este o un ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de anticuerpo, para prevenir la transmisión del VIH-1 o disminuir el riesgo de transmisión del VIH-1, de una madre a un lactante. En algunos ejemplos, una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno o ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos o fragmento de unión a antígeno, se administra a la madre y/o al niño en el parto. En otros ejemplos, una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se administra a la madre y/o al bebé antes de amamantar para prevenir la transmisión viral al bebé o disminuir el riesgo de transmisión viral al lactante. En algunas modalidades, tanto una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno como una cantidad eficaz terapéuticamente de otro agente, tal como zidovudina, se administra a la madre y/o al lactante.

Para cualquier aplicación, el anticuerpo, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado, el CAR, la célula T que expresa un CAR o la molécula de ácido nucleico pueden combinarse con la terapia antirretroviral. Los fármacos antirretrovirales se clasifican en términos generales por la fase del ciclo de vida del retrovirus que inhibe el fármaco. Los anticuerpos descritos pueden administrarse junto con inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (tales como zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, entecavir y apricitabina), inhibidores de la transcriptasa inversa nucleótidos (tales como tenofovir y adefovir), inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos (tales como efavirenz, nevirapina, delavirdina, etravirina y rilpivirina), inhibidores de la proteasa (tales como saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir, fosamprenavir, atazanavir, tipranavir y darunavir) inhibidores de fusión (tales como maraviroc y enfuvirtida), inhibidores de la maduración (tales como bevirimat y vivecon) o inhibidores de amplio espectro, tales como los antivirales naturales. En algunos ejemplos, un anticuerpo o fragmento activo de este descrito o ácidos nucleicos que codifican estos se administra junto con IL-15, o se conjuga con IL-15.

Estudios han demostrado que los cocteles de anticuerpos neutralizantes del VIH-1 que se dirigen a diferentes epítopos de la gp120 pueden tratar macacos infectados crónicamente con SHIV (Shingai y otros, Nature, 503, 277-280, 2013; y Barouch y otros, Nature, 503, 224-228, 2013). En consecuencia, en algunos ejemplos, a un sujeto se le administra adicionalmente uno o más anticuerpos adicionales que se unen a Env del VIH-1 (por ejemplo, que se unen a gp120 o gp41), y que pueden neutralizar el VIH-1. Los anticuerpos adicionales pueden administrarse antes, durante o después de la administración de los nuevos anticuerpos descritos en la presente descripción (por ejemplo, el anticuerpo N6, N17 o F8). En algunas modalidades de la descripción, el anticuerpo adicional puede ser un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo en Env del VIH-1 tal como el sitio de unión a CD4 (por ejemplo, anticuerpo b12, 3BNC117, VRC01 o VRC07), la región externa proximal de la membrana (por ejemplo, anticuerpo 10E8), el dominio V1/V2 (por ejemplo, anticuerpo PG9, CAP256-VRC26), o el bucle V3 (por ejemplo, 10-1074, p Gt 121 o anticuerpo PGT128), o aquellos que se unen tanto a la subunidad gp120 como a la gp41 (por ejemplo 35022, PGT151 u 8ANC195). Los anticuerpos que se unen específicamente a estas regiones y neutralizan la infección por VIH-1 se conocen por el experto en la técnica. Pueden encontrarse ejemplos no limitantes, por ejemplo, en la publicación PCT núm. WO 2011/038290, WO/2013/086533, WO/2013/090644, WO/2012/158948.

En algunos ejemplos, a un sujeto se le administra el ADN que codifica el anticuerpo o los fragmentos de unión a antígeno de este, para proporcionar la producción de anticuerpos in vivo, por ejemplo, mediante el uso de la maquinaria celular del sujeto. La inmunización mediante constructos de ácido nucleico se conoce bien en la técnica y se enseña, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos núm. 5,643,578, y la Patente de Estados Unidos núm. 5,593,972 y la Patente de Estados Unidos núm. 5,817,637. La Patente de Estados Unidos núm. 5,880,103 describe varios métodos de suministro de ácidos nucleicos que codifican para un organismo. Un enfoque para la administración de ácidos nucleicos es la administración directa con ADN plasmídico, tal como con un plásmido de expresión de mamífero. La secuencia de nucleótidos que codifica el anticuerpo descrito, o los fragmentos de unión a antígeno de este, puede colocarse bajo el control de un promotor para aumentar la expresión. Los métodos incluyen el suministro liposomal de los ácidos nucleicos. Dichos métodos pueden aplicare a la producción de un anticuerpo, o fragmentos de unión a antígeno de este, por un experto en la técnica. En algunas modalidades de la descripción, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito se expresa en un sujeto mediante el uso del vector pVRC8400 (descrito en Barouch y otros, J. Virol, 79, 8828-8834, 2005).

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos descritos (tal como el anticuerpo N6) o los fragmentos de unión a antígeno pueden incluirse en un vector viral, por ejemplo, para la expresión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en una célula huésped, o un sujeto (tal como un sujeto con o en riesgo de infección por VIH-1). Se han construido varios vectores virales que pueden usarse para expresar los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos, tales como un vector retroviral, un vector adenoviral o un vector de virus adenoasociado (AAV). En varios ejemplos, el vector viral puede ser competente para la replicación. Por ejemplo, el vector viral puede tener una mutación en el genoma viral que no inhibe la replicación viral en las células huésped. El vector viral puede ser, además, condicionalmente competente para la replicación. En otros ejemplos, el vector viral es deficiente para la replicación en las células huésped.

En varias modalidades, a un sujeto (tal como un sujeto humano con o en riesgo de infección por VIH-1) puede administrársele una cantidad eficaz terapéuticamente de un vector viral de virus adenoasociado (AAV) que incluye una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito (tal como anticuerpo N6). El vector viral de AAV se diseña para la expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito, y la administración de la cantidad eficaz terapéuticamente del vector viral de AAV al sujeto conduce a la expresión de una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno en el sujeto. Los ejemplos no limitantes de vectores virales de AAV que pueden usarse para expresar un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en un sujeto incluyen los proporcionados en Johnson y otros ("Vector-mediated gene transfer engenders long-lived neutralizing activity and protection against SIV infection in monkeys", Nat. Med., 15(8):901-906, 2009) y Gardner y otros ("AAV-expressed eCD4-Ig provides durable protection from multiple SHIV challenges", Nature, 519(7541 ):87-91,2015).

En una modalidad, un ácido nucleico que codifica un anticuerpo descrito, o fragmentos de unión a antígeno de este, se introduce directamente en las células. Por ejemplo, el ácido nucleico puede cargarse en microesferas de oro mediante métodos estándar e introducirse en la piel mediante un dispositivo tal como la pistola de genes HELIOS™ de Bio-Rad. Los ácidos nucleicos pueden estar "desnudos", consistentes en plásmidos bajo el control de un promotor fuerte.

Típicamente, el ADN se inyecta en el músculo, aunque también puede inyectarse directamente en otros sitios. Las dosis para inyección son generalmente de aproximadamente 0,5 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, y son típicamente de aproximadamente 0,005 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos núm. 5,589,466).

2. Dosis

Una cantidad eficaz terapéuticamente de un anticuerpo específico de la gp120, un fragmento de unión a antígeno, un conjugado, CAR, una célula T que expresa un CAR o una molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, dependerá de la gravedad de la enfermedad y/o infección y del estado general de la salud del paciente. Una cantidad eficaz terapéuticamente es la que proporciona ya sea un alivio subjetivo de un(os) síntoma(s) o una mejoría identificable objetivamente según lo observado por el médico u otro observador calificado. El anticuerpo específico de la gp120, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado, el CAR, la célula T que expresa un CAR, o la molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, puede administrarse junto con otro agente terapéutico, ya sea simultánea o secuencialmente.

Pueden administrarse administraciones únicas o múltiples de una composición que incluye un anticuerpo específico de la gp120, un fragmento de unión a antígeno, un conjugado, un CAR, una célula T que expresa un CAR, o una molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, en dependencia de la dosis y frecuencia según sea necesario y tolerado por el paciente. Las composiciones que incluyen el anticuerpo específico de la gp120, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un c A r o molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, deben proporcionar una cantidad suficiente de al menos uno de anticuerpo específico de la gp120, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR, o molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas para tratar eficazmente al paciente. La dosis puede administrarse una vez, pero puede aplicarse periódicamente hasta que se alcance un resultado terapéutico o hasta que los efectos secundarios justifiquen la interrupción de la terapia. En un ejemplo, se infunde una dosis del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno durante treinta minutos cada dos días. En este ejemplo, pueden administrarse aproximadamente una a aproximadamente diez dosis, tales como pueden administrarse tres o seis dosis cada dos días. En otro ejemplo, se administra una infusión continua durante aproximadamente cinco a aproximadamente diez días. El sujeto puede tratarse a intervalos regulares, tal como mensualmente, hasta que se alcance el resultado terapéutico deseado. En general, la dosis es suficiente para tratar o mejorar los síntomas o signos de la enfermedad sin producir una toxicidad inaceptable para el paciente.

Los datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para su uso en humanos. La dosis se encuentra normalmente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50, con poca o mínima toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración usada. La dosis eficaz terapéuticamente puede determinarse a partir de ensayos de cultivo celular y estudios en animales.

En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a gp120, o un conjugado de este, o una molécula de ácido nucleico o vector que codifica dicha molécula, o una composición que incluye dichas moléculas, se administra a una dosis en el intervalo de aproximadamente 5 o 10 nmol/kg a aproximadamente 300 nmol/kg, o de aproximadamente 20 nmol/kg a aproximadamente 200 nmol/kg, o a una dosis de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 nmol/kg, o a una dosis de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o 1000 pg/kg, o aproximadamente 1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 o 10 mg/kg, u otra dosis que el médico tratante considere apropiada. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno puede administrarse a un sujeto a una dosis de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg/kg, tal como aproximadamente 1 a aproximadamente 30, aproximadamente 1 a aproximadamente 20, aproximadamente 1 a aproximadamente 15, aproximadamente 1 a aproximadamente 10, aproximadamente 1 a aproximadamente 5, aproximadamente 1 a aproximadamente 3, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 40 mg/kg, tal como aproximadamente 0,5 a aproximadamente 30, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 20, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 15, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5, aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3, aproximadamente 3 a aproximadamente 7, aproximadamente 8 a aproximadamente 12, aproximadamente 15 a aproximadamente 25, aproximadamente 18 a aproximadamente 22, aproximadamente 28 a aproximadamente 32, aproximadamente 10 a aproximadamente 20, aproximadamente 5 a aproximadamente 15, o aproximadamente 20 a aproximadamente 40 mg/kg. Las dosis descritas en la presente descripción pueden administrarse de acuerdo con la frecuencia de dosificación/frecuencia de administración descrita en la presente descripción, lo que incluye, sin limitación, diariamente, 2 o 3 veces por semana, semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas, mensualmente, cada dos meses, etcétera.

En algunas modalidades, un agente terapéutico descrito puede administrarse por vía intravenosa, subcutánea o por otro modo diariamente o varias veces por semana durante un período de tiempo, seguido de un período sin tratamiento, después se repite el ciclo. En algunas modalidades, el período inicial de tratamiento (por ejemplo, la administración del agente terapéutico diariamente o varias veces por semana) es de 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 11 semanas o 12 semanas. En una modalidad relacionada, el período sin tratamiento dura 3 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o 4 semanas. En ciertas modalidades, el régimen de dosificación del agente terapéutico es diario durante 3 días, seguido de 3 días de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 1 semana seguido de 3 días o 1 semana de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 2 semanas seguidas de 1 o 2 semanas de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 3 semanas seguidas de 1, 2 o 3 semanas de descanso; o diariamente o varias veces por semana durante 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 semanas seguidas de 1, 2, 3 o 4 semanas de descanso.

3. Modos de administración

El anticuerpo específico de la gp120, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado, el CAR, la célula T que expresa un CAR, o la molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, o una composición que incluye dichas moléculas, así como también agentes adicionales, pueden administrarse a los sujetos de diversas maneras, lo que incluye la administración local y sistémica, tal como, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o intratecal. En una modalidad, un agente terapéutico se administra mediante una única inyección subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica o intratecal una vez al día. El agente terapéutico puede administrarse, además, mediante inyección directa en o cerca del sitio de la enfermedad.

El anticuerpo específico de la gp120, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado o la molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, o una composición que incluye dichas moléculas puede administrarse, además, por vía oral en forma de microesferas, microcápsulas, liposomas (sin carga o con carga (por ejemplo, catiónico)), micropartículas poliméricas (por ejemplo, poliamidas, polilactida, poliglicólido, poli(lactida-glicólido)), microemulsiones y similares.

Otro método de administración es mediante una bomba osmótica (por ejemplo, una bomba Alzet) o una minibomba (por ejemplo, una minibomba osmótica Alzet), que permite el suministro controlado, continuo y/o de liberación lenta del agente terapéutico o composición farmacéutica durante un período predeterminado. La bomba osmótica o minibomba puede implantarse por vía subcutánea o cerca de un sitio objetivo.

Será evidente para un experto en la técnica que el anticuerpo específico de la gp120, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado o la molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, o una composición que incluye dichas moléculas puede administrarse, además, por otros modos. La determinación del modo de administración más eficaz está dentro de la habilidad del experto en la técnica. El anticuerpo específico de la gp120, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado o la molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, o una composición que incluye dichas moléculas puede administrarse como formulaciones farmacéuticas adecuadas para, por ejemplo, la administración oral (lo que incluye bucal y sublingual), rectal, nasal, tópica, pulmonar, vaginal o parenteral (lo que incluye la administración intramuscular, intraarterial, intratecal, subcutánea e intravenosa), o en una forma adecuada para la administración por inhalación o insuflación. En dependencia del modo de administración previsto, las formulaciones farmacéuticas pueden estar en forma de dosificación sólida, semisólida o líquida, tales como comprimidos, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, lociones, y similares. Las formulaciones pueden proporcionarse en forma de dosificación unitaria adecuada para la administración única de una dosificación precisa. Las formulaciones comprenden una cantidad eficaz de un agente terapéutico, y uno o más excipientes, portadores y/o diluyentes aceptables farmacéuticamente, y opcionalmente, uno o más de otros agentes biológicamente activos.

4. Composiciones

Se proporcionan composiciones que incluyen uno o más de anticuerpo específico de la gp120, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR, o molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, que se describen en la presente descripción, en un portador. Las composiciones son útiles, por ejemplo, para el tratamiento o detección de una infección por VIH-1. Las composiciones pueden prepararse en formas de dosificación unitarias para la administración a un sujeto. La cantidad y el momento de la administración quedan a discreción del médico tratante para lograr los fines deseados. El anticuerpo específico de la gp120, el fragmento de unión a antígeno, el conjugado, el CAR, la célula T que expresa un CAR o la molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas pueden formularse para la administración sistémica o local. En un ejemplo, el anticuerpo específico de la gp120, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR o molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, se formula para la administración parenteral, tal como la administración intravenosa.

En algunas modalidades de la descripción, las composiciones comprenden un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o conjugado de estos, en al menos 70 % (tal como al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de pureza). En ciertas modalidades de la descripción, las composiciones contienen menos del 10 % (tal como menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 %, menos del 1 %, menos del 0,5 %, o incluso menos) de contaminantes macromoleculares, tales como otras proteínas de mamíferos (por ejemplo, de humanos).

Las composiciones para la administración pueden incluir una solución del anticuerpo específico de la gp120, fragmento de unión a antígeno, conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR o molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, disuelto en un portador aceptable farmacéuticamente, tal como un portador acuoso. Puede usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de materias indeseables. Estas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables farmacéuticamente según se requiera para aproximar las condiciones fisiológicas tales como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de anticuerpo en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto.

Una composición típica para la administración intravenosa incluye aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno o conjugado por sujeto por día (o la dosis correspondiente de un conjugado que incluye el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno). Los métodos actuales para preparar composiciones administrables serán conocidos o evidentes para los expertos en la técnica y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 22a ed., Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido (2012). En algunas modalidades, la composición puede ser una formulación líquida que incluye uno o más anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno (tales como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a gp120), en un intervalo de concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, o de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, o de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, o de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml.

Los anticuerpos, o un fragmento de unión a antígeno de estos o un conjugado o un ácido nucleico que codifica dichas moléculas, pueden proporcionarse en forma liofilizada y rehidratarse con agua estéril antes de la administración, aunque también se proporcionan en soluciones estériles de concentración conocida. La solución de anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno o un ácido nucleico que codifica dichos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, puede añadirse a continuación a una bolsa de infusión que contiene cloruro de sodio al 0,9 %, USP, y administrarse típicamente a una dosis de 0,5 a 15 mg/kg de peso corporal. Se dispone de considerable experiencia en la técnica en la administración de fármacos de anticuerpos, que se han comercializado en los EE.UU. desde la aprobación del RITUXAN® en 1997. Los anticuerpos, los fragmentos de unión a antígeno, los conjugados o un ácido nucleico que codifica dichas moléculas, pueden administrarse mediante infusión lenta, en lugar de en un pulso o bolo intravenoso. En un ejemplo, se administra una dosis de carga más alta, y las dosis de mantenimiento posteriores se administran a un nivel más bajo. Por ejemplo, puede infundirse una dosis de carga inicial de 4 mg/kg durante un período de unos 90 minutos, seguido de dosis de mantenimiento semanales durante 4-8 semanas de 2 mg/kg infundidas durante un período de 30 minutos si la dosis anterior se toleró bien.

Las formulaciones parenterales de liberación controlada pueden hacerse como implantes, inyecciones oleosas o como sistemas de partículas. Para una visión general de los sistemas de administración de proteínas, ver Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA (1995). Los sistemas de partículas incluyen microesferas, micropartículas, microcápsulas, nanocápsulas, nanoesferas y nanopartículas. Las microcápsulas contienen la proteína terapéutica, tal como una citotoxina o un medicamento, como núcleo central. En las microesferas, la terapéutica se dispersa por toda la partícula. Las partículas, microesferas y microcápsulas más pequeñas que aproximadamente 1 |jm se denominan generalmente nanopartículas, nanoesferas y nanocápsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diámetro de aproximadamente 5 jm , de manera que solo se administran nanopartículas por vía intravenosa. Las micropartículas tienen típicamente alrededor de 100 jm de diámetro y se administran por vía subcutánea o intramuscular. Ver, por ejemplo, Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, págs. 219-342 (1994); y Tice y Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. Nueva York, NY, págs. 315-339 (1992).

Los polímeros pueden usarse para la liberación controlada por iones de las composiciones de anticuerpos descritas en la presente descripción. En la técnica se conocen diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en el suministro controlado de fármacos (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-542, 1993). Por ejemplo, el copolímero de bloque, polaxamer 407, existe como un líquido viscoso pero móvil a bajas temperaturas, pero forma un gel semisólido a temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehículo eficaz para la formulación y el suministro sostenido de interleucina-2 y ureasa recombinantes (Johnston y otros, Pharm. Res. 9:425-434, 1992; y Pec y otros, J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65, 1990). Alternativamente, la hidroxiapatita se ha usado como un microportador para la liberación controlada de proteínas (Ijntema y otros, Int. J. Pharm. 112:215-224, 1994). En aún otro aspecto, se usan liposomas para la liberación controlada, así como también para el direccionamiento del fármaco encapsulado en lípidos (Betageri y otros, Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para el suministro controlado de proteínas terapéuticas (ver la Patente de Estados Unidos núm. 5,055,303; Patente de Estados Unidos núm. 5,188,837; Patente de Estados Unidos núm.

4,235,871; Patente de Estados Unidos núm. 4,501,728; Patente de Estados Unidos núm. 5,019,369; Patente de Estados Unidos núm. 5,055,303; Patente de Estados Unidos núm. 5,514,670; Patente de Estados Unidos núm.

5,413,797; Patente de Estados Unidos núm. 5,268,164; Patente de Estados Unidos núm. 5,004,697; Patente de Estados Unidos núm. 4,902,505; Patente de Estados Unidos núm. 5,506,206; Patente de Estados Unidos núm.

5,271,961; Patente de Estados Unidos núm. 5,254,342 y Patente de Estados Unidos núm. 5,534,496).

5. Métodos de detección y diagnóstico

La presente invención proporciona un método para detectar una infección por VIH-1 en un sujeto, que comprende:

poner en contacto una muestra biológica del sujeto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito anteriormente en condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario; y

detectar la presencia del complejo inmunitario en la muestra, en donde la presencia del complejo inmunitario en la muestra indica que el sujeto tiene la infección por VIH-1.

Además, se proporcionan métodos para la detección de la expresión de la gp120 in vitro o in vivo. En un ejemplo, la expresión de la gp120 se detecta en una muestra biológica y puede usarse para detectar la infección por VIH-1 como la presencia de VIH-1 en una muestra. La muestra puede ser cualquier muestra, lo que incluye, pero no se limita a, tejidos de biopsias, autopsias y muestras de patología. Las muestras biológicas incluyen, además, secciones de tejidos, por ejemplo, secciones congeladas tomadas con fines histológicos. Las muestras biológicas incluyen además fluidos corporales, tales como sangre, suero, plasma, esputo, líquido cefalorraquídeo u orina. El método de detección puede incluir poner en contacto una célula o muestra, o administrar a un sujeto, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que se une específicamente a gp120 , o conjugado de estos (por ejemplo, un conjugado que incluye un marcador detectable) en condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario, y detectar el complejo inmunitario (por ejemplo, mediante la detección de un marcador detectable conjugado con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno).

En varias modalidades, se proporcionan el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito para su uso en un método de detección de SIDA y/o una infección por VIH-1 en un sujeto. La descripción proporciona un método para detectar el VIH-1 en una muestra biológica, en donde el método incluye poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en condiciones suficientes para la formación de un complejo inmunitario y detectar el complejo inmunitario, para detectar el gp120 en la muestra biológica. En un ejemplo, la detección de la gp120 en la muestra confirma un diagnóstico de SIDA y/o una infección por VIH-1 en el sujeto.

En algunas modalidades de la descripción, los anticuerpos descritos o los fragmentos de unión a antígeno de estos se usan para probar vacunas. Por ejemplo, para probar si una composición de vacuna que incluye gp120 asume una conformación que incluye el epítopo de N6, N17 o F8. Por lo tanto, en la presente descripción se proporciona un método para probar una vacuna, en donde el método incluye poner en contacto una muestra que contiene la vacuna, tal como un inmunógeno de la gp120, con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno descrito en condiciones suficientes para la formación de un complejo inmunitario y detectar el complejo inmunitario, para detectar la vacuna con un inmunógeno de VIH-1 lo que incluye el epítopo de N6, N17 o F8 en la muestra. En un ejemplo, la detección del complejo inmunitario en la muestra indica que el componente de la vacuna, tal como un inmunógeno Env del VIH-1, asume una conformación capaz de unirse al anticuerpo o al fragmento de unión a antígeno.

En una modalidad de la descripción, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se marca directamente con un marcador detectable. En otra modalidad de la descripción, el anticuerpo que se une a Env del VIH-1 (el primer anticuerpo) no se marca y se usa para la detección un segundo anticuerpo u otra molécula que puede unirse al anticuerpo que se une al primer anticuerpo. Como se conoce bien por un experto en la técnica, se elige un segundo anticuerpo que sea capaz de unirse específicamente a la especie y clase específicas del primer anticuerpo. Por ejemplo, si el primer anticuerpo es una IgG humana, entonces el anticuerpo secundario puede ser un anti-IgG humana. Otras moléculas que pueden unirse a los anticuerpos incluyen, sin limitación, la proteína A y la proteína G, que están ambos disponibles comercialmente.

Los marcadores adecuados para el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o anticuerpo secundario se describen anteriormente, e incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, agentes magnéticos y materiales radiactivos. Ejemplos no limitantes de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa. Ejemplos no limitantes de complejos de grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Ejemplos no limitantes de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, didorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un material luminiscente ilustrativo no limitante es el luminol; un agente magnético ilustrativo no limitante es el gadolinio, y los ejemplos de marcadores radiactivos no limitantes incluyen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S o ³H.

F. Kits

La presente invención proporciona un kit que comprende un contenedor que comprende el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica descrita anteriormente, e instrucciones para usar el kit.

Además, se proporcionan kits. Por ejemplo, kits para tratar a un sujeto con una infección por VIH-1, o para detectar el gp120 en una muestra o en un sujeto. Los kits incluirán típicamente un anticuerpo específico de la gp120 descrito, un fragmento de unión a antígeno, un conjugado, CAR, célula T que expresa un CAR, o una molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, o composiciones que incluyen dichas moléculas. Puede incluirse en el kit más de uno del anticuerpo descrito, fragmentos de unión a antígeno, conjugado, CAR, células T que expresan un CAR, o molécula de ácido nucleico que codifica dichas moléculas, o composiciones que incluyen dichas moléculas, o composiciones específicas que incluyen dichas moléculas.

En una modalidad, el kit es un kit de diagnóstico e incluye un inmunoensayo. Aunque los detalles de los inmunoensayos pueden variar con el formato particular empleado, el método de detección de la gp120 en una muestra biológica incluye generalmente las etapas de poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que reacciona específicamente, en condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario, con gp120. Se permite que el anticuerpo se una específicamente en condiciones inmunológicamente reactivas para formar un complejo inmunitario, y la presencia del complejo inmunitario (anticuerpo unido) se detecta directa o indirectamente.

El kit puede incluir un contenedor y una etiqueta o prospecto insertado en o asociado con el contenedor. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etcétera. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene típicamente una composición que incluye uno o más de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones descritos. En varias modalidades, el recipiente puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Una etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la afección particular.

La etiqueta o el prospecto incluirán típicamente, además, instrucciones para el uso de los anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno, conjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones incluidas en el kit. El prospecto incluye generalmente instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones y/o advertencias sobre el uso de dichos productos terapéuticos. Los materiales instructivos pueden escribirse, en forma electrónica (tal como un disquete de computadora o disco compacto) o pueden ser visuales (como archivos de video). Los kits pueden incluir, además, componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la cual se diseña el kit. De esta forma, por ejemplo, el kit puede contener adicionalmente medios para detectar un marcador (tal como sustratos enzimáticos para marcadores enzimáticos, conjuntos de filtros para detectar marcadores fluorescentes, marcadores secundarios apropiados tal como un anticuerpo secundario o similares). Los kits pueden incluir adicionalmente tampones y otros reactivos usados habitualmente para la práctica de un método particular. Dichos kits y contenidos apropiados se conocen bien por los expertos en la técnica.

III. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar características particulares de ciertas modalidades, pero el alcance de las reivindicaciones no debe limitarse a las características ejemplificadas. Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines comparativos.

Ejemplo 1

Amplia y potente neutralización del VIH-1 por un anticuerpo humano que se une al sitio de unión a CD4

Este ejemplo ilustra el aislamiento y la caracterización del anticuerpo N6, y varias variantes de este. El anticuerpo N6 es un AcM amplio y extremadamente potente específico de la gp120, que se une al sitio de unión a CD4 de Env del VIH-1 en la gp120. N6 neutralizó el 98 % de los pseudovirus en un panel de 181 pseudovirus que representan una amplia variedad de cepas de VIH-1 con una IC⁵⁰ <50 jg/ml. La mediana de la IC⁵⁰ de los virus neutralizados fue 0,038 |jg/ml, entre los más potentes descritos hasta ahora. Además, N6 neutralizó con éxito 16 de los 20 pseudovirus en el panel que son resistentes a la neutralización por VRC01, el anticuerpo canónico ampliamente neutralizante del sitio de unión a CD4.

Introducción

Entre los más amplios de los anticuerpos neutralizantes del VIH-1 se encuentran los miembros de un grupo que se une al sitio de unión a CD4. Varios de estos anticuerpos se han aislado de pacientes, la mayoría de los cuales se han caracterizado ampliamente con respecto a su estructura y función. La mayoría de estos anticuerpos comparten características notablemente similares con respecto a su uso y modo de unión de V^h, y por esta razón se han designado como "clase VRC01". Aunque estos anticuerpos se encuentran entre los más amplios, algunos anticuerpos menos amplios para otras áreas de Env son 10 a 20 veces más potentes, tales como los que se dirigen al glucano N332 o V 1V2. Además, aproximadamente el 12 % de los aislamientos son resistentes a los anticuerpos de clase VRC01.

Este ejemplo proporciona un nuevo anticuerpo monoclonal para el sitio de unión a CD4, denominado N6, que logra potencia y amplitud notables. N6 es un miembro de la clase VRC01 pero neutraliza la gran mayoría de los aislamientos resistentes a VRC01 de manera muy potente. Se proporcionan datos de neutralización, estructura y mutagénesis que indican que estas actividades se median por nuevas interacciones entre múltiples dominios de N6 y Env del VIH-1. Este mecanismo implica evitar choques estéricos que son el principal mecanismo de resistencia a los anticuerpos de clase VRC01. Además, implica una interacción única y crítica entre la CDRH3 de N6 y un tramo de bucle D altamente conservado de Env del VIH-1. La potencia y la amplitud de N6, y su ausencia de autorreactividad, lo convierten en un anticuerpo altamente conveniente para su uso en profilaxis o terapia.

Resultados

Aislamiento y propiedades neutralizantes de N6

Se realizaron ensayos para comprender las especificidades que subyacen al suero amplio y potentemente neutralizante del paciente Z258. El suero de este paciente fue potente y amplio en base a la neutralización de 20 pseudovirus Env del VIH-1 (Figura 1A). La potencia, la amplitud y el patrón de neutralización fueron similares a los del paciente 45, del que se clonó el bien conocido anticuerpo del sitio de unión a CD4 VRC01. Además, según la huella de neutralización (Georgiev y otros, Science, 340, 751-756, 2013) (Figura 1A), el suero de este paciente sugirió que un anticuerpo del sitio de unión a CD4 era una especificidad dominante. Para determinar las especificidades que median la neutralización específica del VIH en este paciente, se aplicó una técnica para aislar anticuerpos monoclonales de interés a partir de células B de sangre periférica sin conocimiento previo de la especificidad objetivo (Huang y otros, Nat. Protoc., 8, 1907-1915, 2013). Las células B de memoria periférica IgM-, IgA-, IgD- de Z258 se clasificaron y expandieron. Los sobrenadantes de los microcultivos de células B se tamizaron para detectar actividad neutralizante y los genes IgG de los pocillos con actividad neutralizante se clonaron y se volvieron a expresar. Se encontraron tres variantes de la familia clonal de un anticuerpo con actividad neutralizante, entre las cuales el anticuerpo denominado N6 (aislado como un AcM IgG1) fue el más potente y amplio (Figura 1B). Los anticuerpos identificados y los identificadores de secuencia correspondientes son los siguientes:

En consonancia con muchos otros anticuerpos monoclonales ampliamente neutralizantes específicos del VIH, N6 estaba mutado muy somáticamente, tanto en las cadenas pesadas (31 %) como en las ligeras (25 %). La secuencia del anticuerpo N6 también contenía características que eran consistentes con un anticuerpo de clase VRC01 (Zhou y otros, Science, 329, 811-817, 2010) tal como una cadena pesada derivada del gen de la línea germinal V^h1-2* 02, y una cadena ligera CDR3 (LCDR3) compuesta por 5 aminoácidos (Figura 1B y Figura 1C). Aunque se derivan del mismo ancestro de la célula B, N6 era bastante distinto de VRC27 y difería en el nivel de aminoácidos de la cadena pesada en un 38 %.

Para comparar la amplitud de neutralización y la potencia de N6 con otros anticuerpos anti-VIH-1 ampliamente neutralizantes, se probó N6 contra un panel de 181 pseudovirus en paralelo con VRC01, 3BNC117, VRC27, PG9, PGDM1400, PGT121, 10-1074, 10E8, 4E10 y 35O22. Como se muestra en las Figuras 1D e IE, N6 neutralizó el 98 % de los 181 pseudovirus a una IC⁵⁰ <50 pg/ml. Aunque la amplitud de muchos anticuerpos disminuye bruscamente a menos de 1 pg/ml, a este nivel N6 todavía neutralizó el 96 % de los aislamientos probados. La mediana de la IC⁵⁰ fue de 0,038 pg/ml, que se encuentra entre las más potentes descritas hasta ahora.

Además, se generaron anticuerpos complementarios cruzados lo que incluye las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos N6, F8 y se analizaron para determinar la neutralización del VIH-1 (Figura 1F). Los anticuerpos quiméricos incluyeron la variante 1 (V^h de N6 V^l de F8), la variante 2 (V^h de N6 V^l de N17), la variante 3 (V^h de ⁿ 17 V^l de F8), la variante 4 (V^h de N17 V^l de N6), la variante 5 (V^h de F8 V^l de N6) y la variante 6 (V^h de F8 V^l de N17).

Como se ilustra en la Figura 1F, todos los anticuerpos quiméricos probados neutralizaron el VIH-1 en el ensayo de pseudovirus.

Un resultado sorprendente fue que N6 neutralizó muchos aislamientos que eran altamente resistentes al VRC01. Cuando se examinó la actividad contra un panel de 20 virus formado por aislados resistentes a VRC01 y se comparó con la actividad de otros miembros de la clase VRC01 (VRC01, VRC07-523-LS y 3BNC117), N6 neutralizó 16 de 20 aislamientos (Figura 2). Quizás sea más notable que neutraliza estos aislamientos de manera muy potente. Esto sugirió que N6 podría tener un nuevo modo de reconocimiento que opera a través de diversos Env que le permiten evitar la resistencia común a otros miembros de la clase de anticuerpos VRC01.

La autorreactividad o polirreactividad es una propiedad de varios anticuerpos específicos contra el VIH que podrían limitar su uso en terapias o profilaxis. Sin embargo, N6 no se unió a las células epiteliales Hep-2 (Figura 3A), ni a la cardiolipina (Figura 3B) ni a un panel de autoantígenos (Figura 3C), lo que sugiere que la autorreactividad puede no limitar el uso potencial de N6 en la profilaxis, tratamiento y prevención del VIH-1.

Para comprender la especificidad de unión de N6, se examinó su capacidad para competir con otros anticuerpos o unirse a mutantes de la gp120 mediante ELISA. Consistente con un anticuerpo de la clase VRC01, N6 compitió con anticuerpos del sitio de unión a CD4 y CD4Ig biotinilado para unirse a la gp120 (Figura 4A). Para los ensayos de unión competitiva, como b12, VRC01 y CD-Ig (que se conoce que se unen al sitio de unión a CD4 en la gp120), N6 y la Variante 1 (cadena pesada de N6 en combinación con la cadena kappa de F8) compitieron por la unión a la gp120 (Figura 4A). Como se muestra en la Figura 4B, la unión de los anticuerpos N6 y la Variante 1 (cadena pesada de N6 en combinación con la cadena kappa de F8) a BaL gp120, RSC3 y RSC3A371I P363N fue similar a la de los anticuerpos VRC01 y b12 del sitio de unión a CD4. Sin embargo, a diferencia de VRC01 y b12, N6 y la Variante 1 (cadena pesada de N6 en combinación con la cadena kappa de F8) mantuvieron la unión a BaL gp120 D368R. Es interesante observar que el mutante D368R se usa para excluir los anticuerpos del sitio de unión no c D4 en estrategias de clasificación basadas en sondas. Por lo tanto, N6 probablemente se eliminó del análisis en esfuerzos previos para recuperar los anticuerpos del sitio de unión a CD4. Para confirmar además que los anticuerpos N6 y la Variante 1 (cadena pesada de N6 en combinación con la cadena kappa de F8) se unen al sitio de unión a CD4, se analizó por ELISA la unión de N6 a la gp120 (Figura 4C). Como se muestra en la Figura 4C, N6 y la Variante 1 de N6 se unieron específicamente a la gp140 trimérica (gp140 foldon) y gp120 monomérica, pero no se unieron al dominio gp120 V3, gp41 o péptido MPER.

Especificidad de unión de N6

Para mapear con mayor precisión el epítopo de N6 en la gp120 de VIH-1, se probó mediante ELISA la unión de N6 a mutantes de barrido de alanina en el contexto de gp120JRCSF monomérica. Basado en análisis estructurales previos y mutagénesis viral, se conoce que los miembros de la clase de anticuerpos VRC01 contactan con la gp120 en tres áreas principales; el bucle D, el bucle de unión a CD4 (CD4 BLP) y la región p23-V5. Las mutaciones en los residuos en el bucle D, CD4 BLP o la región p23-V5 de JRCSF resultaron en una disminución de la unión a la gp120 mediada por N6 (Figura 4D), consistente con otros anticuerpos del sitio de unión a CD4. En general, no se observaron diferencias entre la unión a N6 y otros anticuerpos de clase VRC01 en este contexto. Sin embargo, la conformación de la gp120 monomérica probada en un formato ELISA puede no reflejar con precisión la interacción entre N6 y el trímero funcional intacto. Para evaluar mejor esta interacción, se usó un panel de mutantes de barrido de alanina de pseudovirus Env JRCSF para examinar la potencia de neutralización de N6 en comparación con otros anticuerpos del sitio de unión a CD4 y 2G12 como control negativo. Como se muestra en la Figura 4E, una sola mutación en el bucle D de JRCSF, tal como D279A o K282A, resultó en resistencia a la neutralización por parte de la mayoría de los AcM del sitio de unión a CD4, consistente con resultados anteriores (Li y otros, J. Virol., 85, 8954-8967, 2011; Lynch y otros, J. Virol., 89, 4201-4213, 2015). Por el contrario, las mutaciones individuales en el bucle D, CD4 BLP o la región p23-V5 de JRCSF no mostraron resistencia a la neutralización por N6. Estos resultados, además de la unión a los mutantes RSC descritos anteriormente (Figura 4B), sugirieron que N6 podría unirse al sitio de unión a CD4 a través de un nuevo modo de reconocimiento.

Epítopo de N6

En trabajos previos, la resistencia a los anticuerpos de la clase VRC01 se ha mediado típicamente por mutaciones en áreas de contacto conocidas en el bucle D, c D4 BLP o p23-V5 de la gp120 (Lynch y otros, J Virol 89, 4201-4213, 2015). De 181 virus probados, solo 4 eran altamente resistentes a N6 con IC⁵⁰ >50 pg/ml y 2 eran menos sensibles a N6 con IC⁵⁰ >5 pg/ml (Figura 5A). Cada uno de los virus resistentes tiene mutaciones en el bucle D (residuos 276­ 283), CD4 BLP (residuos 362-374) y región p23-V5 (residuos 458-469) con relación a las secuencias de virus de referencia HXB2, JFCSF y 93TH057. Sin embargo, las secuencias de virus sensibles a N6 y virus resistentes dentro de un panel de 20 virus resistentes a VRC01 no tienen un patrón claro (Figura 5A). Además, hicimos clones de longitud completa de Env a partir de virus del plasma del paciente Z258, del que se aisló N6. En trabajos anteriores se ha observado que los virus autólogos son resistentes típicamente a la respuesta serológica contemporánea y pueden proporcionar información con respecto a los mecanismos de resistencia46,50-55. Consistente con estas observaciones anteriores, once pseudovirus que expresan estas Env autólogas también fueron resistentes a la neutralización mediada por N6 (Figura 5A). El análisis de las secuencias Env autólogas reveló que sus secuencias también tenían mutaciones en el bucle D, CD4 BLP y la región p23-V5 con relación a las secuencias de virus de referencia (Figura 5A). Para determinar las contribuciones relativas de estas mutaciones a la resistencia a N6, el bucle D, CD4 BLP y las regiones p23-V5 de T278-50, BL01 y TV1.29 se mutaron inversamente, y los pseudovirus Z258.2012.SGA5 del virus autólogo, a una secuencia viral sensible HIVJRCSF (Figuras 5B-5C). El reemplazo de p23-V5 con secuencias de HIVJRCSF aumentó la sensibilidad a N6 en 3-5 veces en dos pesudovirus, T278-50 y TV1.29, pero no en BL01 y Z258.2012.SGA5. El reemplazo de CD4 BLP con secuencias de HIVJRCSF no provocó ningún aumento en la sensibilidad a N6. Solo cuando las secuencias de HIVJRCSF se introdujeron en el bucle D, todos los pseudovirus se volvieron altamente sensibles a la neutralización por N6. Por el contrario a N6, se requirieron mutaciones inversas en el bucle D, CD4 BLP y la región p23-V5 para la sensibilidad completa de los anticuerpos del sitio de unión a CD4, VRC01, 3BNC117, VRC-PG04, 12A12 y VRC27. El ELISA también probó la unión de N6 a mutantes inversos de T278-50, BL01, TV1.29 y el virus autólogo Z258.2012.SGA5. De manera similar, las mutaciones inversas en los residuos en el bucle D resultaron en una fuerte unión a la gp120 mediada por N6, mientras que las mutaciones inversas en el bucle D, CD4 BLP y la región p23-V5 fueron necesarias para la unión de los anticuerpos del sitio de unión a CD4. Para confirmar que las mutaciones en el bucle D son esenciales para la resistencia a ⁿ 6, la secuencia del bucle D, CD4 BLP o la región p23-V5 de JRCSF se insertó en la secuencia del virus autólogo Z258.2012, SGA5. La sustitución de la secuencia del bucle D de JRCSF por el bucle D de Z258.2012.SGA5 disminuyó drásticamente la sensibilidad de neutralización de N6 en 11 veces, mientras que el intercambio de CD4 BLP y p23-V5 mostró una diferencia de 3 veces o ninguna diferencia significativa, respectivamente. Para investigar qué residuos en el bucle D podrían desempeñar un papel importante en el escape a N6, reemplazamos cada residuo que difería en virus resistentes con el residuo correspondiente de HIVJRCSF. Las mutaciones inversas de las posiciones 281,282 y 283 mostraron poco o ningún aumento en la sensibilidad a N6. Solo cuando el residuo conservado Asp de HIVJRCSF se introdujo en la posición 279, la mayoría de los pseudovirus se volvieron sensibles a la neutralización por N6 (Figuras 5D-5E). Es probable que la resistencia a N6 por estos virus se media por voluminosas cadenas laterales de residuos en la posición 279 en TV1.29, BL01 y el virus autólogo Z258 que provocan un choque directo con la CDRH3 de N6. Estos resultados sugieren que la resistencia a la neutralización de N6 requiere mutaciones en el bucle D. Sin embargo, a diferencia de otros anticuerpos del sitio de unión a CD4, N6 tolera las mutaciones de escape en CD4 BLP y la región p23-V5, lo que incluye las que pueden provocar un choque estérico con la CDRH2 y la CDRL3 de otros anticuerpos de la clase VRC01.

Paratopo de N6

Para comprender el paratopo de N6, se produjo un panel de mutantes de barrido de alanina de N6 para examinar la potencia de neutralización de N6 a seis virus sensibles a VRC01. VRC01 y VRC27 y sus mutantes de barrido de alanina también se usaron como controles. Varios cambios crearon una disminución de más de 5 veces en la potencia de neutralización promedio para VRC01 y VRC27 (Figuras 6C-6F). Las mutaciones de alanina Trp100b^{V R C o i} y Trp100c^{V R C27} dentro de la CDRH3 tuvieron grandes efectos presumiblemente debido a interrupciones de las interacciones con Asp279^{g p i2o}. Además, varios residuos en Trp47, Trp50, Asn58 y Arg71 de la cadena pesada de VRC27 y Gly28 e Ile91 de la cadena ligera de VRC27 también tuvieron grandes efectos (Figuras 6E-6F). Sorprendentemente, dicho efecto no se observó en las mutaciones puntuales de alanina de N6 (Figuras 6A-6B). Por lo tanto, N6 fue capaz de tolerar mutaciones individuales a lo largo de las cadenas pesada y ligera, presumiblemente porque había suficiente energía distribuida a través de los contactos restantes para mediar la unión.

Además, se examinó la potencia de neutralización de los mutantes de barrido de alanina de N6 a seis virus resistentes a VRC01, que contienen mutaciones en el bucle D, CD4 BLP y bucle V5. Los residuos en Ile33, Trp47, Trp50, Arg71 y Trp 100c de la cadena pesada de N6 e Ile91 de la cadena ligera de N6 también tuvieron grandes efectos sobre la disminución de la potencia de neutralización (Figura 7). Debido a que los residuos anteriores también aparecen en el anticuerpo VRC27, no es suficiente para explicar por qué N6 tiene una actividad de neutralización superior a VRC27.

A continuación, se examinaron las regiones de la cadena pesada o ligera de N6 que juegan un papel esencial en su amplitud y potencia de neutralización. Primero, las cadenas pesada y ligera de N6 se intercambiaron con otros anticuerpos neutralizantes del sitio de unión a CD4 VRC01, VRC27 y 12A21, y se analizaron sus actividades neutralizantes contra seis pseudovirus resistentes a VRC01 y dos sensibles a VRC01. Como se muestra en la Figura 8A, la combinación de la cadena pesada de N6 y la cadena ligera de VRC01, VRC27 o 12A21 aumentó la potencia neutralizante de anticuerpos y la amplitud con relación a VRC01, VRC27 o 12A21, respectivamente. Sin embargo, la combinación de la cadena ligera de N6 y la cadena pesada de VRC01, VRC27 o 12A21 no mostró cambios en la amplitud. Este resultado es potencialmente consistente con los datos estructurales que sugieren que la capacidad de N6 para unirse a los virus resistentes a VRC01, aunque mediada a través de la orientación de la cadena ligera, se media principalmente por la conformación adoptada por la cadena pesada.

En el N6, Tyr54^HC y GlyGlyGly60-62^HC dentro de la CDRH2, y la CDRH3 son áreas clave de interacción con gp120 basado en los análisis de la estructura cristalina. Sin embargo, la sustitución de estos residuos en las regiones correspondientes de VRC01) no aumentó su amplitud o potencia (Figura 8B). La CDRH3 de N6 se sustituyó, además, por otros anticuerpos de la clase VRC01, tales como VRC07 y VRC08 y no se observó aumento en la amplitud o potencia (Figura 8B). Esto sugirió que estas características no confieren individualmente una mayor actividad a otros miembros de la clase VRC01 contra virus resistentes.

A continuación se examinó si la actividad de N6 contra virus resistentes disminuye mediante la mutación de las FR y las CDR de N6 a las de otros miembros de la clase VRC01 (Figuras 8B y BC). La sustitución de Tyr54N6 con Gly54vRC0i y GlyGlyGly60-62N6 con los residuos correspondientes de AlaArgPro60-62VRC01 en CDRH2 dio cada uno una disminución de 32 y 14 veces en la neutralización. Sin embargo, la mayor disminución en la actividad contra estos virus la provocaron las sustituciones de las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 y la región marco (FR) FRH3 de N6 con las de VRC01, que provocaron una disminución de 2857, 2857, 304 y 60 veces en actividad de neutralización, respectivamente. Además, la CDRH3 de N6 se reemplazó por la de los anticuerpos similares a VRC01, tales como VRC07 y VRC08. Se observó una disminución de 2757 y 2857 veces en la actividad de neutralización, respectivamente. Además, estos anticuerpos perdieron actividades de neutralización contra la mayoría de los virus resistentes a VRC01. Esto no se debió a una gran interrupción de la función por las sustituciones dado que la neutralización de los aislamientos sensibles no se modificó. Las sustituciones de la CDRL1 de la cadena ligera y la FRL3 de N6 con las de VRC01 también disminuyeron drásticamente las actividades neutralizantes del anticuerpo en 2857 veces. Las sustituciones de CDRL3 y FRL1 tuvieron un impacto más modesto.

Para comprender mejor los dominios de N6 responsables de su amplitud y potencia, cada región de N6 se sustituyó por las de anticuerpos genética y estructuralmente similares, pero menos amplios y potentes de la misma clase VRC01. VRC27 es un pariente clonal aislado del mismo donante, con solo cinco residuos que difieren de N6 en la CDRH3. Sin embargo, la actividad neutralizante de VRC27 es menor que la de VRC01 con una mediana de IC50 de 0,217 Mg/ml, 78 % de amplitud, y no neutraliza los virus resistentes a VRC01. La sustitución de la CDRH3 de N6 con la de VRC27 (N6 VRC27 CDRH3) provocó una disminución de 10 veces en la neutralización de los virus resistentes a VRC01 (Figura 8). Esto podría esperarse dado que las CDRH3 de estos dos anticuerpos son bastante similares. Sin embargo, la sustitución de la CDRH2 y la CDRH1 de N6 con la de VRC27 condujo a una caída de 78 y 10 veces en la neutralización. La sustitución de ArgAsp64-65N6 con los residuos correspondientes de GlnGly64-65VRC27 en CDRH2 dio una disminución de 108 veces en la neutralización. Sorprendentemente, las sustituciones de FRH1, 2 y 3 provocaron una disminución de 21, 11 y 30 veces en la neutralización (Figura 8).

N17 es otra variante clonal estrechamente relacionada con N6 pero con menos actividad contra virus resistentes a VRC01. La cadena pesada de N17 tiene las mismos CDRH1, CDRH2, CDRH3 y FRH2 que N6, pero difiere en varios residuos dentro de FRH1 y FRH3. Su cadena ligera también es diferente de la de N6 en cada FR y CDR. Como se muestra en la Figura 8, la sustitución de la FRH1 y la FRH3 de N6 con los residuos correspondientes de N17 provocó una disminución de la potencia de 5 y 7 veces. No se observó ningún cambio en la potencia con las sustituciones en todas las FRL y CDRL. Estos resultados sugieren que, además de las CDRH1, CDRH2 y CDRH3 de N6, la FRH1 y la FRH3 también contribuyen a la potencia de N6 contra los virus resistentes a VRC01.

Tomados en conjunto, los intercambios de cadenas pesadas y ligeras, los análisis estructurales y la mutagénesis sugieren que la unión por N6 se media por múltiples contactos diseminados por las CDR y las FR de la cadena pesada. N6 mantiene sus contactos más críticos dentro del bucle D a través de interacciones con la cadena pesada y la ligera. Sin embargo, N6 puede tolerar mutaciones dentro de las regiones CD4BLP y p23-V5 que introducen residuos con cadenas laterales voluminosas que chocan estéricamente con otros anticuerpos de la clase VRC01. Esta propiedad la confiere una orientación única de la cadena ligera que la dicta la conformación general de la cadena pesada. Es esta propiedad la que resulta en la notable capacidad de N6 para evitar los principales mecanismos de resistencia a la clase de anticuerpos VRC01.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo modificado descritas anteriormente se proporcionan como sigue:

VRC01 G54Y^hc

QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRYGAVNYARPLQGRVTM TRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSS (SEQ ID NO: 42 )

VRC01 ARP60-62GGG^hc

QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYGGGLQGRVTM TRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCTRGKNCDYNWDFEHWGRGTPVIVSS (SEQ ID NO: 43 )

VRC01 N6CDRH3

QVQLVQSGGQMKKPGESMRISCRASGYEFIDCTLNWIRLAPGKRPEWMGWLKPRGGAVNYARPLQGRVTM TRDVYSDTAFLELRSLTVDDTAVYFCARDRSYGDSSWALDAWGRGTPVIVSS (SEQ ID NO: 44 )

VRC07N6CDRH3

QVRLSQSGGQMKKPGDSMRISCRASGYEFINCPINWIRLAPGKRPEWMGWMKPRHGAVSYARQLQGRVTM TRDMYSETAFLELRSLTSDDTAVYFCARDRSYGDSSWALDAWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO: 45 )

VRC08 N6CDRH3

QVQLVQSGTQMKEPGASVTISCVTSGYEFVEILINWVRQVPGRGLEWMGWMNPRGGGVNYARQFQGKVTM TRDVYRDTAYLTLSGLTSGDTAKYFCARDRSYGDSSWALDAWGQGTLVIVSP (SEQ ID NO: 46 )

N6 Y54G^hc

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQGGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 47 )

N6 GGG60-62ARP^hc

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFARPFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 48 )

N6 VRC07CDRH3

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARGKYCTARDYYNWALDAWGQGTTWVSA (SEQ ID NO: 4 9 )

N6 VRC08CDRH3

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARGRSCCGGRRHCNGADCFNWALDAWGQGTTWVSA (SEQ ID NO: 50 )

N6 VRC27CDRH2

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPKFGAVNYAHSFQGRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 51 )

N6 VRC27CDRH3

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRLYDGSSWRLDPWGQGTTWVSA (SEQ ID NO: 52 )

N6 VRC27FRH1

SQRLVQSGPQVRKPGSSVRISCETSGYTFNAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 53 )

N6 VRC27FRH2

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRSFEWMGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 54 )

N6 VRC27FRH3

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRITL TRDIYRETAFLDLTGLRFDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTWVSA (SEQ ID NO: 55 )

N6 N17FRH1

RAHLVQSGTAVKRPGASVRVSCETSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDVYREIAYMDIRGLKPDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 56 )

N6 N17FRH3

RAHLVQSGTAMKKPGASVRVSCQTSGYTFTAHILFWFRQAPGRGLEWVGWIKPQYGAVNFGGGFRDRVTL TRDIYRDTAYMDISGLRFDDTAVYYCARDRSYGDSSWALDAWGQGTTVWSA (SEQ ID NO: 57 )

N6 N17FRL1

Y1HVTQSPSSLSVSAGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK (SEQ ID NO: 58 )

N6 N17FRL2

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLLIRHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK (SEQ ID NO: 59 )

N6 N17FRL3

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGTGFHTS FNLTINDLQSDDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK (SEQ ID NO: 60)

N6 N17FRL4

YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLDFK (SEQ ID NO: 61)

N6 N17CDRL1

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGRDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK (SEQ ID NO: 62 )

N6 N17CDRL2

YIHVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHASSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLQFFGRGSRLHIK (SEQ ID NO: 63)

N6 N17CDRL3

Y1HVTQSPSSLSVSIGDRVTINCQTSQGVGSDLHWYQHKPGRAPKLL1HHTSSVEDGVPSRFSGSGFHTS FNLTISDLQADDIATYYCQVLESFGRGSRLHIK (SEQ ID NO: 64)

Estructura cristalina de N6 en complejo con gp120

Para definir los mecanismos estructurales por los cuales N6 podría mediar tal potencia y amplitud, se realizó un análisis estructural del fragmento de unión a antígeno de N6 (Fab) en complejo con las proteínas gp120 de VIH a partir de cepas con diferente sensibilidad a los anticuerpos de la clase VRC01 (ver las Figuras 9-13). Estos incluyen el clado AE 93TH057, una cepa sensible a la mayoría de los anticuerpos de la clase VRC01; DU172, una cepa resistente a VRC01, pero sensible a varios otros anticuerpos de la clase VRC01, lo que incluye N6; y X2088, una cepa solo sensible a N6.

El análisis de las estructuras reveló que N6 tenía varias características en común con otros miembros de la clase de anticuerpos VRC01. Estos incluyen contactos entre la CDRH3 y el bucle D, aunque estos contactos fueron más extensos que los de VRC01. N6 también tenía contactos entre la CDRH2 y CD4 BLP, puentes salinos entre Arg71^HC y Asp368^gp120. N6 también tenía un Tyr54^{H C} que rellena un bolsillo, que imita la interacción de Phe43^{C D 4} con gp120, una característica que también se encuentra en algunos de los anticuerpos de la clase VRC01, tales como VRC27 (también aislado del paciente Z258), VRC-PG20 y 12A21, que contienen un Phe54 o VRC03, que tiene un Trp54. La cadena ligera se deriva de IGKV1-33, similar a algunos otros anticuerpos tales como 12A21. En común con algunos otros anticuerpos de clase VRC01, N6 también contiene el motivo GlyXGly flexible (aa 28-30) dentro de la CDRL1 que le permite evitar choques estéricos con el bucle D. Aunque la CDRH3 de N6 tiene una conformación diferente de VRC01, la CDR H3 T rp100c (referencia de numeración Kabat) tiene una posición similar a la T rp100b de VRC01 que interactúa con el Asp279^gp120.

Además, se descubrió que N6 tenía varias características estructurales que eran distintas de otros anticuerpos de la clase VRC01. Por ejemplo, la cadena pesada de N6 contiene una poliglicina 60-62 que no se encuentra en ningún otro anticuerpo del sitio de unión a CD4 aislado. Además, la cadena ligera de N6 tiene una orientación única, ya que se rotó de manera que la CDRL3 se alejó de P23-V5 en comparación con VRC01. La adición de residuos con cadenas laterales grandes en este dominio es un mecanismo de resistencia previamente descrito a los anticuerpos de clase VRC01. La mayor distancia entre CDRL3 y esta área puede permitir que N6 tolere mejor dichos cambios en V5 en comparación con otros anticuerpos de la clase VRC01. Consistente con esta interpretación, la estructura del cocristal del N6-X2088.c9^gp120 reveló que la rotación de la cadena ligera N6 acomodaba los residuos adicionales entre la hélice alfa 2 y CD4BLP de este Env que sobresale en la dirección de la cadena ligera y probablemente chocan con otros anticuerpos de este tipo. Es importante tener en cuenta que la orientación única de la cadena ligera de N6 no se debió a características especiales de la cadena ligera, ni a la interfaz de la cadena ligera y la pesada, dado que estas se superponen con las de VRC27. Más bien aún es posible que el modo de unión u orientación de la cadena pesada de N6 permitiera esta rotación de la cadena ligera. En general, N6 tiene una orientación única de la cadena ligera en comparación con otros anticuerpos de la clase VRC01, ya que permite que la cadena ligera evite posibles choques con p23-V5 y el bucle D.

Vía de desarrollo de N6

Para comprender cómo N6 desarrolló una potencia y amplitud tan sobresalientes en comparación con otros anticuerpos de la clase VRC01, se realizó la secuenciación de próxima generación (NGS) de células B de memoria de sangre periférica del donante Z258 en tres puntos temporales (2012, 2014 y 2015) para identificar miembros del linaje adicionales. Brevemente, el ADNc del receptor de células B se preparó a partir de cada punto temporal y se secuenciaron mediante el uso de Illumina MiSeq, con una profundidad de secuenciación promedio de ~40x. Los transcritos de la cadena pesada relacionados con el linaje se identificaron en base a la identidad de secuencia en CDRH3 con la de N6, VRC27, F8 o N17. Las transcritos de la cadena ligera relacionados se identificaron como lecturas derivadas de IGKV1-33 y mediante el uso de la firma de CDRL3 de cinco aminoácidos de la clase VRC01 (Zhou y otros, Immunity 39, 245-258, 2013). Después de eliminar duplicados y transcritos que contienen codones de parada o uniones fuera de marco, las lecturas restantes se agruparon para tener cuenta el error de secuenciación. Finalmente, las secuencias agrupadas se curaron manualmente para producir conjuntos finales de miembros de linaje de cadena pesada y ligera para cada punto temporal.

Los transcritos curados de las cadenas pesadas y ligeras mostraron altos niveles de hipermutación somática (> 20 %), con más transcritos muy similares a VRC27 que a N6 (Figura 14). No obstante, se observaron transcritos de cadena pesada que muestran menos mutación somática (~23 %) que N6 o VRC27 en los puntos temporales de 2012 y 2014. De manera similar, también se observaron algunos transcritos de la cadena ligera con ~20 % de hipermutación somática, en comparación con ~25 % para la ligera de N6 y VRC27. Se observaron más transcritos relacionados con el linaje desde el punto temporal de 2012 que en 2014 o 2015, probablemente porque se usaron más células B para el experimento ⁿ G^s . Se observaron transcritos de cadena ligera similares a N6 en los tres puntos temporales (figura 14), pero no se observaron transcritos de cadena pesada con alta similitud con N6 en los datos de 2012 o 2015. Si bien la gran mayoría de las secuencias de cadena pesada curadas se relacionan estrechamente con VRC27 en el árbol filogenético (Figura 15), es probable que esto no refleje una expansión biológica del clado VRC27 con relación al clado N6. En cambio, esta diversidad puede haberse generado artificialmente por una baja calidad de secuencia en la superposición entre las lecturas MiSeq directas e inversas.

Para investigar la estructura filogenética del linaje, se construyeron árboles de máxima verosimilitud para la cadena pesada y la cadena ligera (Figura 15). Los árboles filogenéticos mostraron consistentemente que N6 y VRC27 formaron dos grupos altamente divergentes. Sin embargo, además de usar los mismos elementos genéticos, ambos grupos tienen uniones similares de cadena pesada y cadena ligera, así como también comparten 15 y 14 mutaciones en las cadenas pesada y ligera respectivamente, lo que confirma que representan dos clados de un solo linaje clonal.

El árbol filogenético mostró además que los dos clados divergieron temprano en el desarrollo del linaje. Aunque 3 transcritos del punto temporal 2014 se encuentran entre las ramas N6 y VRC27 (Figura 15), el análisis no recuperó un número suficiente de secuencias tempranas de miembros de linaje para definir el punto en el que los dos clados divergieron. Parece que el motivo GlyGlyGly60-62^N6 de cadena pesada y el motivo RD63-64n6 aparecieron después de los clados dos y tres, respectivamente. En la cadena ligera, el motivo GlyXGly en CDRL1 apareció antes de la divergencia de los dos clados, mientras que Gln96 en CDRL3 apareció tarde en el desarrollo del clado N6.

Emparejamos el árbol filogenético del linaje N6 y clonamos los transcritos de la cadena pesada y la ligera de Z258 relacionadas con N6. Dos cadenas pesadas se derivaron de 2015 y cuatro cadenas ligeras se derivaron de 2014 y 2015. Encontramos que tres de los ocho anticuerpos emparejados tenían una potencia similar con N6 (Figura 16). Curiosamente, los tres anticuerpos podrían neutralizar el virus TV1.29 resistente a N6, lo que sugiere que el paciente Z258 desarrollaba anticuerpos con mayor amplitud durante este período de tiempo.

Discusión

Estos resultados tienen varias implicaciones importantes en los esfuerzos de estimular una respuesta de anticuerpos ampliamente neutralizadora y los esfuerzos para utilizar anticuerpos ampliamente neutralizantes bnAc en profilaxis o terapias. De los anticuerpos que se consideran para el desarrollo clínico, ha habido una tendencia general de que son extremadamente amplios (tales como 10E8 o VRC01) o extremadamente potentes y menos amplios (PGT121, PGDM1400). Sin embargo, el descubrimiento del anticuerpo N6 demuestra que este nuevo anticuerpo de la clase VRC01 puede mediar una amplitud y potencia extraordinarias incluso contra aislados tradicionalmente resistentes a los anticuerpos de esta clase. El análisis de secuencia de aislamientos resistentes, mutagénesis y datos estructurales confirma que N6 tiene muchas de las características y contactos característicos de la clase VRC01. Sin embargo, es capaz de alcanzar su amplitud y potencia muy por encima de otros anticuerpos de la clase VRC01 a través de una combinación compleja de cambios en múltiples dominios dentro de las cadenas pesadas y ligeras.

El aumento de la potencia, en comparación con otros anticuerpos de la clase VRC01, se media en gran medida por una serie de contactos entre la cadena pesada y gp120. Un intercambio de cadenas pesadas y ligeras de N6 con las de otros anticuerpos de la clase VRC01 indicó que la actividad de N6 se media en gran medida por las interacciones de la cadena pesada. Esto se produce principalmente a través de contactos en CDRH2, CDRH3 y Tyr54^N6Heavy. Aunque la sustitución de cualquiera de estas secuencias en otros anticuerpos de la clase VRC01 no confirió una mayor actividad, la mutación de cada uno de estos redujo la actividad de N6. Sin embargo, la más dominante de estas interacciones se produjo entre la CDR H3 de N6 y el bucle D. Este grado de dependencia de la interacción CDRH3-bucle D es sorprendente dado que se encontró los anticuerpos de la clase VRC01 descritos anteriormente que usan V^h1-2* 02 dependían en gran medida de las interacciones de CDR H243. Es quizás esta interacción, junto con las de CDRH2 y Y54ⁿ6, lo que en combinación le da a N6 su potencia adicional en comparación con otros anticuerpos de la clase VRC01.

Es particularmente interesante notar que a través de la selección natural in vivo, N6 tiene características que se han modificado genéticamente en otros anticuerpos para aumentar la potencia o amplitud, o para reducir la posibilidad de escape de anticuerpos. Aunque los anticuerpos de la clase VRC01 derivados de la V^h1-2* 02 de origen natural hasta ahora descritos imitan la interacción de CD4 con gp120, la gran mayoría no llena un bolsillo hidrófobo en la gp120 típicamente rellenada por Phe43^{oD 4}. Las sustituciones de residuos hidrofóbicos para Gly54 en los anticuerpos NIH45-4658 y VRC0759 han resultado en grandes aumentos en la potencia y algunos aumentos en la amplitud. El anticuerpo N6, a través de la selección natural in vivo, tiene un Tyr54^N6 que se une en este bolsillo y contribuye a la potencia de N6. Además, las cadenas ligeras de VRC07 y NIH 45-46 se han modificado genéticamente para evitar choques estéricos con el bucle p-23 V5495960. El anticuerpo N6 evita estos mismos choques estéricos a través de cambios en la orientación de la cadena ligera que le permiten tolerar cadenas laterales voluminosas dentro del dominio p-23 V5. Sin embargo, muchos de estos cambios por modificación genética en los anticuerpos de la clase VRC01 que condujeron a mejoras en la potencia y la amplitud han tenido un costo de aumento de la autorreactividad (59 y revisado en 61). Aunque pueden producirse anticuerpos autorreactivos naturales, especialmente entre bNabs62 ; sorprendentemente, no se observó autorreactividad para el anticuerpo N6. La expansión de las células B que expresan parientes clonales de N6 con una fuerte autorreactividad se excluyeron probablemente in vivo. Estos datos indican que el desarrollo de la amplitud y la potencia en anticuerpos tales como N6 no se acompaña necesariamente de autorreactividad.

El anticuerpo N6 tiene varias características que lo convierten en un candidato conveniente para su uso en profilaxis y terapia. La ausencia de autorreactividad sugiere que N6 tendrá una vida media más larga in vivo en comparación con otros anticuerpos que son reactivos en dichos ensayos. La potencia de N6 puede aumentar, además, la durabilidad de un beneficio profiláctico o terapéutico en el caso de la administración pasiva porque se requiere menos anticuerpo para persistir para mediar un efecto. Este efecto podría extenderse, además, mediante la introducción de mutaciones en N6 que pueden extender su vida media in vivo. Además de su potencia, el uso de un anticuerpo con esta amplitud podría limitar drásticamente la probabilidad de transmisión cuando se usa en la profilaxis o la selección de mutaciones de escape en el contexto de la terapia.

La rara aparición de mutaciones de resistencia a N6 puede sugerir que dichas mutaciones tienen un alto costo de aptitud que representa una barrera para la selección de mutantes resistentes. El virus autólogo de Z258 contenía cambios raros en la secuencia del bucle D en las posiciones 279^{g pi20} y 281^{g p i20}. La resistencia a N6 parece requerir que estas posiciones del bucle D se muten. Se han observado cambios en estas posiciones en pacientes o ratones humanizados en respuesta a la selección de anticuerpos de la clase VRC0150⁶⁰. El virus autólogo del paciente 45, del que se clonaron VRC01 y NIH45-46, contenía mutaciones Asp279Glu^{g pi20} y Ala281His^{g p i20}. En este caso, Ala281His^{g pi20} restableció la aptitud viral en aislamientos que contienen Asp279Glu^gp120. En un esfuerzo reciente para obtener por modificación genética anticuerpos similares a VRC01 para restringir el escape viral, se administró un anticuerpo NIH45-46 modificado genéticamente como terapia a ratones humanizados infectados con HIVYU-2. Esta terapia seleccionó un mutante Ala281Thr^{g pi20} que resultó en una reducción de la aptitud viral, potencialmente a través de la introducción de un glucano en Asn279gpi20 mediante la generación de la secuencia de glucosilación Asn-X-Thr/Ser. El impacto de las mutaciones individuales en la conformación y la aptitud replicativa del virus autólogo Z258 aún no se han definido. Sin embargo, estos cambios solo se produce en <0,01 % de 5132 virus en una gran base de datos (www.hiv.lanl.gov), lo que sugiere que dichas mutaciones probablemente se desfavorecen fuertemente. Por lo tanto, además de su potencia y amplitud, el anticuerpo N6 puede ser particularmente eficaz para uso terapéutico debido a los costos de aptitud viral asociados con la generación de resistencia a N6.

Procedimientos experimentales

Pacientes del estudio. El plasma y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se seleccionaron de los pacientes infectados con VIH-1 inscritos en el National Institutes of Health bajo un protocolo clínico aprobado por la Investigational Review Board en el National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID-IRB). Todos los participantes firmaron el consentimiento informado aprobado por el NIAID-IRB. Los criterios para la inscripción fueron los siguientes: tener una carga viral detectable, un recuento estable de células T CD4 por encima de 400 células/pl, ser diagnosticado con infección por VIH-1 durante al menos 4 años, y sin tratamiento antirretroviral durante al menos 5 años. El donante Z258 se seleccionó para la clasificación de células B y la generación de anticuerpos porque su actividad neutralizadora del suero se encuentra entre las más potentes y amplias de la cohorte. En el momento de la leucaféresis, había estado infectado con VIH-1 durante 21 años, con recuentos de células T CD4 de 733 células/pl, valores de ARN de VIH-1 en plasma de 996 copias/ml y no estaba en tratamiento antirretroviral.

Tinción de células B de memoria, clasificación y clonación de anticuerpos. La tinción y la clasificación de células individuales de células B de memoria se realizaron mediante un protocolo detallado publicado recientemente (Huang y otros, Nat. Protoc., 8, 1907-1915, 2013). Brevemente, un total de 75000 células B de memoria IgA' IgD- IgM' CD19+ se clasificaron y resuspendieron en medio con IL-2, IL-21 y células alimentadoras 3T3-msCD40L irradiadas, y se sembraron en placas de microtitulación de 384 pocillos a una densidad de 4 celdas por pocillo. Después de 13 días de incubación, los sobrenadantes de cada pocillo se tamizaron para determinar la actividad de neutralización mediante el uso de un ensayo de micro-neutralización de alto rendimiento contra HIV-1MN3 y HIV-1Bal26 De los pocillos que obtuvieron resultados positivos tanto en el ensayo de neutralización de HIV-1MN 3 como en el de HIV-1Bal26, la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera del gen de inmunoglobulina se amplificaron por RT-PCR y se volvieron a expresar como se describió anteriormente (Tiller y otros, J. Immunol. Methods, 329, 112-124, 2008; Georgiev y otros, Science, 340:751-756, 2013). La IgG de longitud completa se purificó mediante el uso de una columna de proteína A recombinante (GE Healthcare).

Generación de pseudovirus. Los pseudovirus Env del VIH-1 se generaron mediante la co-transfección de células 293T con una cadena principal deficiente en Env (pSG3AEnv) y un segundo plásmido que expresaba Env del VIH-1 en una relación de 2:1. 72 h después de la transfección, los sobrenadantes que contenían pseudovirus se cosecharon y congelaron a -80 °C hasta su uso posterior. Los mutantes JRCSF se produjeron al alterar el plásmido JRCSF Env con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange Lightning de acuerdo con el protocolo del fabricante (Agilent).

Ensayos de neutralización. La actividad de neutralización de anticuerpos monoclonales o suero se midió mediante el uso de una infección de pseudovirus Env del VIH-1 de una sola ronda de células TZM-bl como se describió previamente (Li y otros, J. Virol., 79, 10108-10125, 2005. El suero del paciente inactivado por calor o el anticuerpo monoclonal (AcM) se diluyeron en serie cinco veces con medio Eagle modificado por Dulbecco, FCS al 10 % (Gibco), y se incubaron 10 pl de suero o AcM con 40 pl de pseudovirus en una placa de 96 pocillos a 37 °C durante 30 min. Después se añadieron células TZM-bl y las placas se incubaron durante 48 h. A continuación, se desarrollaron los ensayos con un sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Finnboda Varvsvag, Suecia), y las unidades de luz relativas (RLU) se leyeron en un luminómetro (Perkin Elmer).

Ensayos de unión. Los monómeros HIVBAL26 gp120, los núcleos estabilizados con superficie acondicionada de la gp120 (RSC3) y sus mutantes con anulación de Cd 4 gp120D368R y RSC3 A371I P363N a 2 pg/ml se recubrieron en placas de 96 pocillos durante toda la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con tampón BLOTTO (PBS, FBS al 1 %, leche descremada al 5 %) durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido de incubación con anticuerpo diluido en serie en tampón de interrupción (PBS, FBS al 5 %, BSA al 2 %, Tween-20 al 1 %) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se añadió una dilución 1:10 000 de anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entre cada etapa con Tween 20 al 0,2 % en PBS. Las placas se desarrollaron mediante el uso de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Sigma -Aldrich) y se leyeron a 450 nm.

ELISA de competencia cruzada. El ELISA de competencia cruzada se realizó mediante el método publicado previamente (Wu y otros, Science, 329, 856-861, 2010). HIVYU2 gp120 a 2 pg/ml se sembró en placas de 96 pocillos durante toda la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con tampón B3T (PBS, FBS al 3,3 %, b Sa al 2 %, Tween-20 al 0,07 %, timerosal al 0,02 %, NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM y EDTA 1 mM) durante 1 hora a 37 °C. Se añadieron 50 pl de anticuerpos competidores no biotinilados diluidos en serie a la placa en tampón B3T, seguido de la adición de 50 pl de anticuerpo biotinilado o CD4-Ig a una concentración fija: 250 ng/ml de VRC01-biotina, 5 pg/ml de VRC23-biotina, 1 pg/ml de VRC-PG04-biotina o 150 ng/ml de CD4-Ig-biotina. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 °C. Se añadió una dilución 1:200 de estreptavidina conjugada con HRP (BD) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron entre cada etapa con Tween-20 al 0,2 % en PBS. Las placas se desarrollaron mediante el uso de TMB y se leyeron a 450 nm.

ELISA de captura viral. La capacidad de unión relativa de la gp120 monomérica y N6 se determinó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de captura de la gp120 como se describió previamente (Moore y otros, J. Virol., 69, 101-109, 1995). 100 |jl de anti-gp120 D7324 (Aalto Bioreagent, Dublín, Irlanda) a 1 jg/m l en Pb S se recubrieron en placas de 96 pocillos durante toda la noche a 4 °C. Se añadieron reservas de pseudovirus JRCSF tratados con Triton X-100 (0,5 %) y se incubaron durante 2 h a 37 °C. Las placas se bloquearon con tampón B3T durante 1 hora a 37 °C, seguido de incubación con anticuerpo diluido en serie en tampón B3T durante 1 hora a 37 °C. Se añadió una dilución 1:10000 de anticuerpo anti-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) durante 1 h a 37 °C. Las placas se lavaron entre cada etapa con Tween-20 al 0,2 % en PBS, se desarrollaron mediante el uso de TMB y se leyeron a 450 nm.

Ensayos de autorreactividad. La reactividad a las células epiteliales humanas VIH-1 negativas (HEp-2) se determinó por inmunofluorescencia indirecta en láminas portaobjetos mediante el uso de azul de Evans como contratinción y anti-IgG humana de cabra conjugada con FITC (Zeus Scientific) (Haynes y otros, Science, 308, 1906-1908, 2005). Las láminas portaobjetos se fotografiaron en un microscopio de fluorescencia Nikon Optiphot. Se tomaron diapositivas Kodachrome de cada anticuerpo monoclonal que se une a las células HEp-2 con una exposición de 10 s, y las diapositivas se escanearon en formato digital. Se usó la prueba Luminex AtheNA Multi-Lyte ANA (Wampole Laboratories) para evaluar la reactividad de anticuerpos monoclonales a SSA/Ro, SS-B/La, Sm, ribonucleoproteína (RNP), Jo-1, ADN bicatenario, centrómero B e histona y se realizó según las especificaciones del fabricante y como se describió anteriormente (Haynes y otros, Science, 308, 1906-1908, 2005). Las concentraciones de anticuerpos monoclonales ensayados fueron de 50 jg/ml. Se incubaron 10 j l de cada concentración con las perlas fluorescentes Luminex y la prueba se realizó según las especificaciones del fabricante.

Extracción de ARN viral y síntesis de ADNc. La extracción de ARN viral y la síntesis de ADNc se realizaron como se describió previamente (Wu y otros, J. Virol., 86, 5844-5856, 2012). Brevemente, el ARN viral del paciente Z258 se extrajo de 280 j l de muestra de suero de dos puntos temporales diferentes mediante el uso del mini kit de ARN viral QlAamp (Qiagen) y se eluyó en 50 j l de tampón de elución. La síntesis de ADNc de primera cadena se realizó mediante el uso de la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen Life Technologies). El volumen de reacción final de 100 ul se compuso de 50 j l de ARN viral, 5 j l de una mezcla de trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) (cada uno a 10 mM), 1,25 j l de cebador antisentido envB3out (5'-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3', SEQ ID NO: 65) a 20 jM , 20 j l de tampón de primera cadena 5*, 5 j l de ditiotreitol a 100 mM, 5 j l de RNaseOUT y 5 j l de transcriptasa inversa SuperScript III. El ARN, los cebadores y los dNTP se calentaron a 65 °C durante 5 min y después se enfriaron en hielo durante 1 min, y a continuación toda la mezcla de reacción se incubó a 50 °C durante 60 min, seguido de 55 °C durante 60 min adicionales. Finalmente, la reacción se inactivó por calor a 70 °C durante 15 min y después se trató con 1 j l de ARNasa H a 37 °C durante 20 minutos. El ADNc resultante se usó inmediatamente para PCR o se congeló a -80 °C para esperar un análisis posterior.

SGA. La PCR anidada de SGA de Env del VIH-1 se describió previamente (Wu y otros, J. Virol., 86, 5844-5856, 2012). Brevemente, el ADNc se diluyó en serie y se distribuyó en réplicas de 12 reacciones de PCR en placas ThermoGrid de 96 pocillos (Denville Scientific) para identificar una dilución donde los pocillos positivos para PCR constituían aproximadamente el 30 % del número total de reacciones. En esta dilución, la mayoría de los pocillos contienen amplicones derivados de una sola molécula de ADNc. Se realizaron amplificaciones de PCR adicionales mediante el uso de esta dilución en placas completas de 96 pocillos. La amplificación por PCR se llevó a cabo mediante el uso del sistema de PCR Platinum Taq High Fidelity (Invitrogen Life Technologies). El volumen de reacción final de 20 j l se compuso por 2 j l de tampón 10 *, 0,8 j l de MgSO4, 0,4 j l de mezcla de dNTP (cada uno a 10 mM), 0,2 j l de cada cebador a 20 jM , 0,1 j l de polimerasa Platinum Taq High Fidelity y 1 j l de plantilla de ADN. Los cebadores para la primera ronda de PCR fueron envB5out (5'-TAGA^g C^c CTGGA^a GC^a TCC^a G^g AAG-3', SEQ ID NO: 66) y envB3out (5'-TTGCTACTTGTGATTGCTCCATGT-3', SEQ ID NO: 67). Los cebadores para la segunda ronda de Pc R fueron envB5in (5'-CACCTTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG-3', SEQ ID NO: 68) y envB3in (5'-GTCTCGa Ga TACTGCTCCCACCC-3', SEQ ID NO: 69). Los parámetros del ciclador fueron 94 °C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de 94 °C durante 15 s, 55 °C durante 30 s y 68 °C durante 4 min y una extensión final de 68 °C durante 10 min. El producto de la primera ronda de PCR (1 j l ) se usó posteriormente como plantilla en la segunda ronda de PCR en las mismas condiciones, pero con un total de 45 ciclos. Los amplicones se inspeccionaron en un gel de agarosa al 1 % prepreparado (Embi Tec). Todos los procedimientos de PCR se llevaron a cabo en una campana limpia de PCR designada mediante el uso de medidas de seguridad contra la contaminación de las muestras.

Secuenciación de ADN. Los amplicones se secuenciaron directamente por la química BigDye Terminator por ACGT, Inc. (Wheeling, IL). Ambas cadenas de ADN se secuenciaron mediante el uso de fragmentos parcialmente superpuestos. Se ensamblaron y editaron fragmentos de secuencia individuales para cada amplicón mediante el uso del Sequencher 5.0 (Gene Codes, Ann Arbor, MI). Todos los cromatogramas se inspeccionaron para determinar los sitios de bases mixtas (picos dobles), lo que sería evidencia de cebado de más de una plantilla o la introducción de error de PCR en los primeros ciclos. Cualquier secuencia con evidencia de picos dobles se excluyó de un análisis posterior.

Información del donante Z258. El donante Z258 se seleccionó para la clasificación de células B y la generación de anticuerpos porque su actividad neutralizante del suero se encuentra entre las más potentes y amplias de nuestra cohorte. En el momento de la leucaféresis, había estado infectado con VIH-1 durante 21 años, con recuentos de células T CD4 de 733 células/l, valores de ARN de VIH-1 en plasma de 996 copias/ml y no estaba en tratamiento antirretroviral.

Clonación de los genes env del HIV-1 del donante Z258. Se seleccionaron secuencias env representativas del donante Z258 para la clonación. Los productos de PCR de env de segunda ronda que contenían genes rev y env de longitud completa se amplificaron mediante el uso de Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent Technologies), cebadores HIV RevS (CACCATGGCAGGAAGAAG, SEQ ID NO: 70) y envB3in (5'-GTCTCGAGATACTGCTCCCACCC-3', SEQ ID NO: 71) con las mismas condiciones de la segunda ronda de p Cr como se describió anteriormente. Los amplicones de PCR se purificaron en gel y se ligaron en el vector de expresión pcDNA3.1D (Invitrogen Life Technologies) bajo el control del promotor T7. Después de la transfección en E. coli químicamente competente TOP10 (Invitrogen Life Technologies), cada plásmido de expresión de rev y env se maxipreparó (Qiagen), y se verificó su secuencia. De un total de siete secuencias env clonadas del donante Z258, siete (100 %) fueron funcionales en la mediación de la entrada del virus.

Análisis estadístico. La prueba de Spearman evaluó las correlaciones de las potencias de neutralización entre los anticuerpos N6 y VRC01, 10E8, PGT121 o PG9 contra 181 pseudovirus.

Secuenciación de próxima generación (NGS) de las células B de memoria PBMC:

Procesamiento de datos de NGS. Las lecturas primarias de 2x300 se ensamblaron en transcritos de un solo extremo mediante el uso de USEARCH75. Se excluyeron los transcritos que contenían más de 10 errores de secuencia estimados mediante el uso de Usearch. A continuación, los transcritos se procesaron mediante el uso de nuestro flujo de trabajo de bioinformática implementado internamente 76. Brevemente, se eliminaron los transcritos de menos de 300 nucleótidos. Se usó BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) para asignar los genes de línea germinal V, D y J a cada transcrito con parámetros personalizados. Se eliminaron las secuencias distintas de la región V(D)J de un transcrito y se excluyeron los transcritos que contenían desplazamiento de marco o un codón de parada. Las identidades de secuencia de cada transcrito al gen V de la línea germinal, N6, F8, N17 y VRC27 se calcularon mediante el uso de ClustalO77 y se mostraron en mapas de calor en 2D trazados mediante el uso de ggplot2 en R.

Identificación de transcritos relacionados con el linaje N6 de NGS. Para encontrar transcritos de cadena pesada relacionados con el linaje, usamos ClustalO77 para calcular la identidad de secuencia de CDR3 de cada transcrito en cada conjunto de datos con la de N6, F8, N17 y VRC27. Los transcritos con asignación de genes de la línea germinal V a IGHV1-2, identidad de secuencia de CD^r 3 superior al 60 % con respecto a N6, F8, N17 o VRC27, y la longitud de CDR3 en el intervalo de 10-20 aminoácidos, se tamizaron para análisis adicionales. Para eliminar duplicados de PCR y transcritos que contenían errores de secuenciación, se realizaron dos etapas de agrupamiento mediante el uso de USEARCH. Los transcritos se agruparon en primer lugar al 100 % de identidad de secuencia y los transcritos se clasificaron por cobertura de secuenciación. Después, los transcritos con alta cobertura se usaron como semillas o centros para la segunda etapa de agrupamiento con una identidad de secuencia del 97 %. Se seleccionó una secuencia representativa de cada grupo que contenía más de un transcrito y después se generó un conjunto de datos único curado para cada punto de tiempo. Después, eliminamos manualmente los transcritos no relacionadas del conjunto de datos curado.

Para encontrar transcritos de cadena ligera relacionados con el linaje, primero identificamos los transcritos que contenían las firmas CDR3 (X-X-[AFILMYWV, SEQ ID NO: 72]-[EQ]-X) de la clase VRC01 57. A continuación se realizaron dos etapas de agrupamiento para eliminar duplicados de PCR y transcritos que contienen errores de secuenciación (ver procesamiento de datos de la cadena pesada). Finalmente, se generó un conjunto de datos de cadena ligera único curado para cada punto temporal y los transcritos no relacionados se eliminaron manualmente.

Análisis filogenéticos e inferencia de intermediarios. Los transcritos relacionados con el linaje de cadenas pesadas y ligeras se alinearon por separado mediante el uso de Muscle y se ajustaron manualmente. Los árboles filogenéticos de máxima verosimilitud para cadenas pesadas y ligeras se construyeron mediante el uso de MEGA678. El modelo de sustitución GTR+G+I, seleccionado mediante el uso de MEGA6 como el mejor modelo general para ajustarse a los conjuntos de datos de secuencia78, se usó para estimar la distancia genética. Se usaron cinco categorías cuando se modeló la tasa de heterogeneidad por distribución r. Los árboles filogenéticos de las cadenas pesadas y ligeras se enraizaron mediante el uso de IGHV1-2* 02 e IGKV1-33* 01 respectivamente. Los árboles filogenéticos enraizados y las secuencias alineadas se introdujeron en MEGA6 para inferir los intermediarios mediante el uso del método de máxima verosimilitud 78. J. Virol., 86, 5844-5856, 2012.

Ejemplo 2

Detectar el VIH-1 en una muestra o un sujeto mediante el uso de un anticuerpo específico de la gp120

Este ejemplo describe el uso de anticuerpos neutralizantes monoclonales de VIH-1 específicos para la gp120 para la detección de VIH-1 en una muestra o un sujeto. Este ejemplo describe, además, el uso de estos anticuerpos para confirmar el diagnóstico de infección por VIH-1 en un sujeto.

Se obtiene una muestra biológica, tal como una muestra de sangre del paciente diagnosticado con, sometido a un examen de tamizaje o sospechoso de tener una infección por VIH-1. Una muestra de sangre tomada de un paciente no infectado se usa como control, aunque un resultado estándar también puede usarse como control. Se realiza un ELISA para detectar la presencia de la gp120 en la muestra de sangre. Las proteínas presentes en las muestras de sangre (la muestra del paciente y la muestra de control) se inmovilizan sobre un soporte sólido, tal como una placa de 96 pocillos, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Robinson y otros, Lancet 362:1612-1616, 2003). Después de la inmovilización, los anticuerpos monoclonales neutralizantes del VIH-1 específicos para la gp120 que se marcan directamente con un marcador fluorescente se aplican a la placa con proteínas inmovilizadas. La placa se lava en un tampón apropiado, tal como PBS, para eliminar cualquier anticuerpo no unido y minimizar la unión no específica del anticuerpo. La fluorescencia puede detectarse mediante el uso de un lector de placa fluorométrico de acuerdo con los métodos estándar. Un aumento en la intensidad de fluorescencia de la muestra del paciente, con relación a la muestra control, indica que el anticuerpo para la gp120 se unió específicamente a proteínas de la muestra de sangre, lo que detecta de esta manera la presencia de la proteína gp120 en la muestra. La detección de la proteína gp120 en la muestra del paciente indica que el paciente tiene una infección por VIH-1 o confirma el diagnóstico de infección por VIH-1 en el sujeto.

Ejemplo 3

Tratamiento del VIH-1 mediante el uso de un anticuerpo monoclonal específico de la gp120

Este ejemplo describe un método particular que puede usarse para tratar la infección por VIH-1 en un sujeto humano mediante la administración de uno o más AcM neutralizantes humanos específicos de la gp120. Aunque se proporcionan métodos, dosis y modos de administración particulares, un experto en la técnica apreciará que pueden hacerse variaciones sin afectar sustancialmente el tratamiento.

En base a las enseñanzas descritas en la presente descripción, la infección por VIH-1 puede tratarse mediante la administración de una cantidad eficaz terapéuticamente de uno o más de los AcM neutralizantes descritos en la presente descripción, lo que reduce o elimina de esta manera la infección por VIH-1.

Tamizaje de sujetos

En ejemplos particulares, los sujetos se tamizan primero para determinar si tienen una infección por VIH-1. Los ejemplos de métodos que pueden usarse para detectar la infección por VIH-1 incluyen una combinación de medir el recuento de células T CD4+ de un sujeto y el nivel de virus VIH-1 en los niveles sanguíneos en suero. Los métodos adicionales que usan los AcM específicos de la gp120 descritos en la presente descripción también pueden usarse para detectar la infección por VIH-1.

En algunos ejemplos, las pruebas de VIH-1 consisten en un tamizaje inicial con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para detectar anticuerpos contra el VIH-1. Las muestras con un resultado no reactivo del ELISA inicial se consideran VIH-1 negativas a menos que se haya producido una nueva exposición a una pareja infectada o una pareja con un estado desconocido de VIH-1. Las muestras con un resultado ELISA reactivo vuelven a analizarse por duplicado. Si el resultado de cualquiera de las pruebas duplicadas es reactivo, la muestra se informa como repetidamente reactiva y se somete a pruebas de confirmación con una prueba complementaria más específica (por ejemplo, transferencia de Western o un ensayo de inmunofluorescencia (IFA)). Las muestras que son reactivas repetidamente por ELISA y positivas por IFA o reactivas por transferencia de Western se consideran VIH positivas e indicativas de infección por VIH-1. Las muestras que son reactivas a ELISA repetidamente ocasionalmente proporcionan un resultado de transferencia de Western indeterminado, que puede ser una respuesta de anticuerpos incompleta al VIH-1 en una persona infectada o reacciones inespecíficas en una persona no infectada. El IFA puede usarse para confirmar la infección en estos casos ambiguos. En algunos casos, se recolectará un segundo espécimen más de un mes más tarde y volverá a analizarse para sujetos con resultados de transferencia de Western indeterminados. En ejemplos adicionales, las pruebas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN viral o método de amplificación de ADN proviral) también pueden ayudar al diagnóstico en ciertas situaciones.

La detección del VIH-1 en la sangre de un sujeto indica que el sujeto está infectado con VIH-1 y es un candidato para recibir las composiciones terapéuticas descritas en la presente descripción. Además, la detección de un recuento de células T CD4+ por debajo de 350 por microlitro, tal como 200 células por microlitro, también indica que es probable que el sujeto tenga una infección por VIH-1.

No se requiere un tamizaje previo antes de la administración de las composiciones terapéuticas descritas en la presente descripción.

Pretratamiento de sujetos

En ejemplos particulares, el sujeto se trata antes de la administración de un agente terapéutico que incluye una o más terapias antirretrovirales conocidas por los expertos en la técnica. Sin embargo, dicho tratamiento previo no siempre es necesario y puede determinarse por un médico experto.

Administración de composiciones terapéuticas

Después de la selección del sujeto, se administra una dosis eficaz terapéuticamente de un AcM neutralizante específico de la gp120 descrito en la presente descripción (tal como el anticuerpo N6) al sujeto (tal como un humano adulto o un recién nacido con riesgo de contraer VIH-1 o conocido por estar infectado con VIH-1). Agentes adicionales, tales como agentes antivirales, también pueden administrarse al sujeto simultáneamente o antes o después de la administración de los agentes descritos. La administración puede lograrse mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como administración oral, inhalación, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.

La cantidad de la composición administrada para prevenir, reducir, inhibir y/o tratar el VIH-1 o una afección asociada con este depende del sujeto a tratar, la gravedad del trastorno y la forma de administración de la composición terapéutica. Idealmente, una cantidad eficaz terapéuticamente de un agente es la cantidad suficiente para prevenir, reducir y/o inhibir, y/o tratar la afección (por ejemplo, VIH-1) en un sujeto sin provocar un efecto citotóxico sustancial en el sujeto. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad eficaz, por ejemplo, mediante el uso de ensayos de rutina que establecen curvas de respuesta a la dosis. Como tal, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un portador aceptable farmacéuticamente.

En un ejemplo específico, los anticuerpos se administran a 5 mg por kg cada dos semanas o 10 mg por kg cada dos semanas, en dependencia de la etapa particular del VIH-1. En un ejemplo, los anticuerpos se administran continuamente. En otro ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se administran a 50 |jg por kg administrados dos veces por semana durante 2 a 3 semanas.

La administración de las composiciones terapéuticas puede tomarse a largo plazo (por ejemplo, durante un período de meses o años).

Evaluación

Después de la administración de una o más terapias, los sujetos con VIH-1 pueden monitorearse para detectar reducciones en los niveles de VIH-1, aumentos en el recuento de células T CD4+ en un sujeto o reducciones en uno o más síntomas clínicos asociados con la enfermedad por VIH-1. En ejemplos particulares, los sujetos se analizan una o más veces, con el inicio 7 días después del tratamiento. Los sujetos pueden monitorizarse mediante el uso de cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden obtenerse muestras biológicas del sujeto, lo que incluye la sangre, y evaluar las alteraciones en los niveles de células T CD4+ o VIH-1.

Tratamientos adicionales

En ejemplos particulares, si los sujetos son estables o tienen una respuesta menor, mixta o parcial al tratamiento, pueden volverse a tratar después de la reevaluación con el mismo programa y la preparación de los agentes que recibieron previamente durante el tiempo deseado, lo que incluye la duración de la vida de un sujeto. Una respuesta parcial es una reducción, tal como al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 % o al menos un 70 % en la infección por VIH-1, replicación del VIH-1 o sus combinaciones. Una respuesta parcial puede ser, además, un aumento en el recuento de células T CD4+, tal como al menos 350 células T por microlitro.

Será evidente que los detalles precisos de los métodos o composiciones descritos pueden variar o modificarse sin apartarse del alcance de las modalidades descritas. Reivindicamos todas las modificaciones y variaciones que se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones más abajo.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, que comprende:

una región variable de cadena pesada (V^h) que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR)1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR)1, una LCDR2 y una LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente (Cd R de N6);

una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente (c Dr de N17); o

una V^h que comprende una HCDR1, una HCDR2 y una HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y una V^l que comprende una LCDR1, una LCDR2 y una LCDR3, que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 17 y 18, respectivamente (c Dr de F8); y

en donde el anticuerpo se une específicamente a la gp120 del VIH-1 y neutraliza la infección por VIH-1.

2. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 1, que comprende la región variable de la cadena pesada (VH) que comprende la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR)1, la HCDR2 y la HCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 7, 8 y 9, respectivamente, y la región variable de la cadena ligera (VL) que comprende la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR)1, la LCDR2 y la LCDR3 que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 10, 11 y 12, respectivamente (CDR de N6).

3. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 2, en donde la VH y la VL comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente (AcM N6).

4. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 3, en donde la V^h y la V^l comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente (AcM N6).

5. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la V^h y la V^l comprenden secuencias de aminoácidos al menos 90 % idénticas a las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente (AcM N17), o las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente (AcM F8).

6. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con la reivindicación 5, en donde

la V^h y la V^l comprenden secuencias de aminoácidos expuestas como las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente (AcM N17), o las SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente (AcM F8).

7. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la VH comprende un residuo de arginina en la posición kabat 71,

la V^h comprende un origen de la línea germinal V^h1-2 que es del 20-35 % divergente del gen de la línea germinal; y

la V^l comprende un origen de línea germinal IGKV3-11, IGKV3-20, IGKV1-33 o IGLV2 que es del 15-35 % divergente del gen de la línea germinal correspondiente.

8. El anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una región marco humana,

y/o en donde el anticuerpo es una IgG, IgM o IgA, particularmente en donde el anticuerpo es una IgG y comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 94, y/o que comprende un dominio constante recombinante que comprende una modificación que aumenta la unión al receptor Fc neonatal,

particularmente, en donde el dominio constante recombinante es un dominio constante de IgG1 que comprende las mutaciones M428L y N434S.

9. Un fragmento de unión a antígeno que comprende la V^h y la V^l del anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el fragmento de unión a antígeno es un Fv, Fab, F(ab')2, scFv o un fragmento scFV2.

10. El fragmento de unión a antígeno o anticuerpo monoclonal aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente a un sitio de unión a CD4 en la gp120,

y/o en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno neutraliza al menos el 50 % de los aislados de VIH-1 expuestos como 6540.v4.c1, 620345.c1, T278-50, 6322.V4.C1, DU422.01, X2088.c9, 6545.V4.C1, 242 14, T250-4, 7165.18, BL01.DG, HO86.8, 6471.V1.C16, 6631.V3.C10, TVI.29, TZA125.17, CAP210.E8, DU172.17 con una concentración inhibitoria (IC⁵⁰) de <50 |jg/ml.

11. Un anticuerpo biespecífico aislado que comprende el anticuerpo monoclonal humano aislado o el fragmento de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores,

particularmente, en donde el anticuerpo se une específicamente a gp120 y a CD3.

12. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11.

13. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 12, en donde la V^h y la V^l del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno son codificadas por las secuencias de ácido nucleico expuestas como las SEQ ID NO: 36 y 37, respectivamente (AcM N6), o variantes degeneradas de estas.

14. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que codifica un receptor de antígeno quimérico que comprende un dominio extracelular, en donde el dominio extracelular comprende el fragmento de unión a antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico, y en donde el ácido nucleico codifica adicionalmente el receptor de antígeno quimérico.

15. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 12-14, particularmente, en donde el vector de expresión es un vector viral, particularmente, en donde el vector viral es un vector viral adenoasociado.

16. Una célula huésped aislada transformada con la molécula de ácido nucleico o el vector de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 - 15.

17. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una infección por VIH-1, que comprende:

una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión o célula huésped de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16; y un portador aceptable farmacéuticamente.

18. Un método para producir un anticuerpo que se une específicamente a la gp120 del VIH-1, que comprende:

expresar una molécula de ácido nucleico heterólogo que comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 en una célula huésped para producir el anticuerpo, particularmente, en donde la célula huésped es una célula huésped de mamífero, y/o que comprende, además, purificar el anticuerpo que se une específicamente a la gp120 del VIH-1.

19. Un método para detectar una infección por VIH-1 en un sujeto, que comprende:

poner en contacto una muestra biológica del sujeto con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11 en condiciones suficientes para formar un complejo inmunitario; y

detectar la presencia del complejo inmunitario en la muestra, en donde la presencia del complejo inmunitario en la muestra indica que el sujeto tiene la infección por VIH-1.

20. Una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para su uso en un método para prevenir o tratar una infección por VIH-1 en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz terapéuticamente del anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, lo que previene o trata de esta manera la infección por VIH-1.

21. Un kit que comprende un recipiente que comprende el anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, e instrucciones para usar el kit.

22. El anticuerpo, fragmento de unión a antígeno, molécula de ácido nucleico, vector de expresión, célula huésped o composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 para su uso en la inhibición o el tratamiento de la infección por VIH-1 en un sujeto.