ES2804845T3

ES2804845T3 - Métodos para detectar un contaminante biológico

Info

Publication number: ES2804845T3
Application number: ES16734060T
Authority: ES
Inventors: Serge Monpoeho; Sheldon Mink; Paul VESCIO
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-25
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2036-03-25
Also published as: AR104110A1; IL281579B; JP6670847B2; EP4361290A2; TWI867535B; ZA201706797B; EP3274469A1; EP4647513A2; IL289447A; EA201792155A1; CN120249559A; IL302434A; JP2018509174A; JP2025105635A; JP7385623B2; DK3274469T3; EA037740B1; CN107960108A; SG10202006108RA; AU2025204933A1

Abstract

Un método para detectar un contaminante biológico en una muestra de ensayo que comprende las etapas de: a) combinar ingredientes para preparar una mezcla de reacción, en donde los ingredientes comprenden (i) una muestra de ácido nucleico derivada de una muestra de ensayo, (ii) oligonucleótidos y (iii) una ADN polimerasa, en donde los oligonucleótidos comprenden: - un cebador oligonucleotídico directo específico para amplificar una secuencia polinucleotídica de amplificación de la diana (TAP) del contaminante biológico; - un cebador oligonucleotídico inverso específico para amplificar la secuencia de TAP del contaminante biológico; - una sonda oligonucleotídica de detección específica para la secuencia de TAP del contaminante biológico; - una sonda de detección única (UDP) para una secuencia polinucleotídica de control de amplificación de plásmido (PACP) de un plásmido de control positivo de amplificación (PAC), conteniendo el plásmido la secuencia de TAP y una secuencia de PACP; y - un conjunto de cebadores y una sonda para detectar polinucleótidos de control de extracción de ácidos nucleicos (NACP); b) someter a la mezcla de reacción a reacción en cadena de la polimerasa (PCR); c) durante la PCR, monitorizar la producción de (i) TAP), (ii) polinucleótidos de control de extracción de ácido nucleico (NACP) y PACP; y d) comparar la producción de TAP con la producción de NACP y PACP, en donde la presencia de TAP, la presencia de NACP y la ausencia de PACP producidos durante la PCR significa que la muestra de ensayo contiene un contaminante biológico y no contiene un plásmido de control positivo de amplificación, en donde se lleva a cabo una reacción PCR de control positivo en paralelo por separado con parámetros idénticos y con componentes idénticos, excepto por que está presente el plásmido de PAC en lugar de una muestra de ácido nucleico procedente de una muestra de ensayo, en donde la presencia de TAP, NACP y PACP producidos durante la reacción PCR de control positivo significa que la PCR está funcionando adecuadamente y la ausencia de uno cualquiera o más de TAP, NACP o PACP significa que el control positivo ha fallado.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para detectar un contaminante biológico

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica los derechos de prioridad conforme a lo dispuesto en el 35 USC §119(e) de la Solicitud Provisional de Patente de los Estados Unidos n.° 62/139.321, presentada el 27 de marzo de 2015.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para detectar contaminantes biológicos, tal como, por ejemplo, en cultivo celular.

Antecedentes de la invención

Los fármacos biofarmacéuticos, especialmente los anticuerpos terapéuticos, se producen mediante cultivo de células de mamífero. Las células de ovario de hámster chino (CHO) son las células hospedadoras más comúnmente usadas. Estos sistemas de producción son propensos a infecciones víricas adventicias y endógenas, lo que presenta un potencial problema de seguridad para el fármaco biofarmacéutico. Por tanto, se usan procedimientos de eliminación vírica y mediciones de la carga vírica para promover la seguridad del fármaco. Las etapas empleadas para reducir la carga vírica incluyen nanofiltración, inactivación del virus mediante calor o retención de pH y cromatografía. Pueden monitorizarse la carga vírica y la eficacia de la eliminación del virus mediante laboriosos ensayos de infectividad o mediante ensayos cuantitativos rápidos, tales como PCR en tiempo real o reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR).

La Q-PCR requiere que los controles positivos y negativos adecuados sean fiables. Se añaden controles de extracción de ácido nucleico a las muestras de ensayo para controlar la extracción adecuada de ácidos nucleicos. En caso de que el control de extracción de ácidos nucleicos sea negativo o se encuentre fuera del intervalo de recuperación esperado durante la Q-PCR, se rechaza la muestra. Por el contrario, en caso de que el control de extracción de ácidos nucleicos sea positivo o se encuentre dentro del intervalo de recuperación esperado durante la Q-PCR, se considera que la extracción de ácido nucleico de la muestra de ensayo es fiable. Normalmente se incluye un control negativo en el ensayo de Q-PCR, tal como un tampón sin muestra. La presencia de una señal positiva en el control negativo podría significar la contaminación de la Q-PCr o los reactivos de extracción de ácido nucleico con material vírico.

También puede incluirse un control positivo de amplificación en un ensayo de carga vírica de Q-PCR. Dicho control positivo puede incluir secuencias de ácido nucleico vírico conservadas que se amplifican usando cebadores que amplifican los contaminantes víricos genuinos. La incapacidad de la Q-PCR para detectar el control positivo puede indicar que el procedimiento de amplificación puede haber sido incapaz de detectar un contaminante vírico en caso de que hubiese uno presente en la muestra de ensayo. El documento EP2098599 A1, por ejemplo, divulga composiciones y métodos para la detección de contaminantes en cultivos celulares usando un control interno positivo de amplificación.

El uso de controles positivos de contaminación, que emulan al contaminante diana, crea sus propios problemas. En caso de que la muestra de ensayo esté contaminada incluso con una pequeña cantidad de control positivo, dada la extrema sensibilidad de la Q-PCR, la muestra de ensayo puede mostrar un falso positivo. Pueden mitigarse hasta cierto punto los falsos positivos usando un bajo nivel de control positivo de amplificación, usando habitaciones separadas para trabajar con el control positivo, usando el sistema de UNG/dUTP para degradar de manera selectiva los productos de la PCR que contienen dUTP, usando recipientes de un solo uso y pipetas de desplazamiento y lavando exhaustivamente las áreas de trabajo y los equipos. Independientemente del uso laborioso de estos mitigadores, se siguen produciendo resultados falsos positivos durante las pruebas PCR.

En la fabricación de productos biofarmacéuticos, el riesgo de obtener un falso positivo para un contaminante no es despreciable y puede dar como resultado acciones correctivas costosas. Hay una gran necesidad de sistemas y métodos para determinar si un resultado de la PCR positivo dado es un auténtico positivo o un falso positivo resultante de la contaminación cruzada del control positivo. Los solicitantes han desarrollado y ahora divulgan composiciones, sistemas y métodos de control positivo que permiten la determinación en tiempo real de señales de la Q-PCr de falso positivo.

Sumario de la invención

Los métodos de acuerdo con la presente invención se definen en las reivindicaciones 1 a 7 adjuntas. Los solicitantes han resuelto el problema de identificar en tiempo real si una señal positiva de la Q-PCR para un contaminante diana en una muestra de ensayo es un auténtico positivo o un falso positivo a causa de la contaminación cruzada. Los solicitantes han creado un plásmido de control positivo de amplificación (PAC) que incluye una secuencia de contaminante biológico (es decir, la secuencia de control positivo) y una secuencia específica para el plásmido artificial única. Esta secuencia específica para el plásmido artificial única permite al técnico a cargo del ensayo identificar específicamente el plásmido cuando se encuentra en una muestra. Por lo tanto, cuando se detecta una señal de contaminante positiva y se determina que no está presente la secuencia específica del plásmido artificial, el técnico puede confiar en que el resultado es un resultado auténtico positivo. Por el contrario, en caso de un falso positivo, la presencia de la secuencia de plásmido artificial única permite al técnico descartar rápidamente el resultado positivo ostensible como un falso positivo.

En algunas realizaciones, la secuencia específica de plásmido artificial única de control positivo ("secuencia única"; también conocida como PACP o polinucleótido de control positivo de amplificación) se detecta usando una sonda de detección oligonucleotídica artificial marcada fluorescentemente ("sonda de detección única" o "UDP") incluida en la mezcla de reacción de Q-PCR. La sonda de detección única comprende un polímero de ácido nucleico unido covalentemente a un fluoróforo y un inactivador. El polímero de ácido nucleico "único" está diseñado para hibridar específicamente con la secuencia única e incorporarse en copias de amplicón de la secuencia única durante la PCR. El polímero de ácido nucleico "único" se diseña para que no reconozca o se hibride con cualquier parvovirus de origen natural en las condiciones de hibridación empleadas en la ejecución del presente ensayo. En una realización, el polímero de ácido nucleico "único" comprende de 17 a 20 nucleótidos, en donde no más de siete (7) a 10 nucleótidos consecutivos internos y no más de seis (6) nucleótidos tres prima consecutivos son idénticos a cualquier secuencia de parvovirus. En una realización, el polímero de nucleótido "único" comprende de 17 a 20 nucleótidos, en donde no más de 7 a 10 nucleótidos consecutivos y no más de seis (6) nucleótidos tres prima consecutivos son idénticos a cualquier secuencia de parvovirus expuesta en las SEQ ID NO: 9 y 12-37. Cuando el polímero de ácido nucleico de la sonda de detección única no se incorpora en copias de amplicón, el inactivador permanece en estrecha proximidad con el fluoróforo. En caso de que se excite el fluoróforo, el inactivador absorbe la luz emitida e impide que se detecte la luz (mediante FRET o inactivación de contacto). Cuando se incorpora el polímero de ácido nucleico en las copias de amplicón (es decir, cuando la secuencia única está presente en la muestra), se liberan el fluoróforo y el inactivador de la sonda de detección única y por tanto, están separados espacialmente. En ese caso, cuando se excita el fluoróforo, el inactivador está lo suficientemente lejos como para no inactivar eficientemente la luz emitida. Por tanto, la luz emitida puede detectarse. Por lo tanto, cuando la secuencia única está presente en la muestra, aumenta la intensidad de la longitud de onda de emisión a medida que avanza la PCR. Cuando la secuencia única está ausente, el inactivador hace su trabajo y no se detecta la longitud de onda de emisión a medida que avanza la PCR. En una realización, el fluoróforo se acopla en o próximo al extremo 5 prima del polímero de ácido nucleico y al inactivador en o próximo al extremo 3 prima. En una realización alternativa, el fluoróforo se acopla en o próximo al extremo 3 prima del polímero de ácido nucleico y al inactivador en o próximo al extremo 5 prima.

Puede usarse en la práctica de la presente invención cualquier par de fluoróforo-inactivador conocido o que se descubra en el futuro. (Véase, por ejemplo, S.A. Marras, "Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes", Methods Mol. Biol. 2006; 335: 3-16). En algunas realizaciones, el fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de 495 nm, 538 nm o 646 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm, 554 nm o 669 nm, respectivamente. En algunas realizaciones, el inactivador es un colorante con un pico de absorbancia de 430 nm a 672 nm. En algunas realizaciones, el inactivador se selecciona entre el grupo que consiste en DDQ-I, Dabcyl, Eclipse, Iowa Black FQ, BHQ-1, QSY-7, BHQ-2, DDQ-II, Iowa Black RQ, QSY-21 y ^{D h Q - 3 .}En una realización, el fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de 495 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm, por ejemplo, FAM y el inactivador es BHQ-1. En una realización, el polímero de ácido nucleico comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 (5'-TGTCGATGGCGAATGGCTA-3').

Un aspecto de la presente divulgación es la sonda de detección única en sí, como se ha descrito anteriormente, que contiene el polímero de ácido nucleico y el fluoróforo y el inactivador enlazados. Otros aspectos incluyen el plásmido de control positivo de la amplificación (PAC) en sí, que contiene una secuencia diana del contaminante biológico y la secuencia específica del plásmido artificial única y el uso de ese plásmido como control positivo para evaluar la presencia de un contaminante biológico diana en un cultivo celular. El plásmido de PAC se usa para controlar la reacción de amplificación por la PCR exitosa diseñada para amplificar secuencias del contaminante biológico diana. Por ejemplo, se ejecuta una reacción PCR separada y paralela que contiene los componentes idénticos y se ejecuta con parámetros idénticos a los de la muestra de ensayo, pero que contiene el plásmido de control positivo en lugar de una muestra de ensayo. En caso de que la muestra que contiene plásmido de control positivo proporcione una señal "contaminante" positiva, pero la muestra de ensayo no, se podría llegar a la conclusión de que la muestra de ensayo está desprovista del contaminante biológico diana. En algunas realizaciones, la muestra de ensayo se obtiene de un cultivo de células de mamífero, tal como un cultivo en biorreactor que contiene células CHO modificadas por ingeniería genética para producir una proteína terapéutica de interés.

En una realización, el plásmido de PAC contiene (a) una secuencia de polinucleótido de amplificación de la diana (TAP), tal como, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de parvovirus o una secuencia de otro contaminante diana y (b) un plásmido de secuencia de polinucleótido de control de amplificación (PACP). La secuencia de PACP (hebra sentido o de Crick) es complementaria al polímero de ácido nucleico de la sonda de secuencia única (hebra antisentido o de Watson).

En una realización, el plásmido de PAC se emplea en una reacción de Q-PCR separada en paralelo con una reacción de Q-PCR que contiene una muestra de ensayo. La secuencia de TAP se diseña para que sea representativa del contaminante biológico diana. Por ejemplo, en caso de que la reacción de Q-PCR de la muestra diana no logre producir amplicones de TAP y la Q-PCR del control positivo (es decir, muestra que contiene plásmido de PAC) no logre producido amplicones de TAP, se puede asumir que la reacción de Q-PCR ha fracasado. En una realización, el contaminante biológico diana es un parvovirus de roedor y la secuencia TAP comprende una secuencia de parvovirus de roedor. En una realización, la secuencia de TAP comprende la totalidad o parte de la secuencia NS1 de parvovirus, que está conservada entre varias cepas de parvovirus de roedor. Véase Cotmore, et al., "Replication Initiator Protein NS1 of the parvovirus Minute Virus of Mice Binds to Modular Divergent Sites Distributed throughout Duplex Viral DNA", J. Virol. diciembre de 2007; 81(23):13015-13027. En algunas realizaciones, las varias cepas de parvovirus de roedor incluyen la cepa prototipo del virus diminuto de ratón (MVMp), la cepa inmunosupresora del virus diminuto de ratón (MVMi), la cepa Cutter del virus diminuto de ratón (MVMc), parvovirus de ratón 1b (MPV-1b), parvovirus de ratón 1a (MPV-1a), parvovirus de ratón 1c (MVP-1c), parvovirus de hámster (HaPV), parvovirus de Toolan (H-1), virus de rata de Kilham (KRV), parvovirus de rata 1a (RPV-1a), virus diminuto de rata (MRV) y la cepa de la University of Massachusetts de rativirus L (RV-Umass). Véase O.-W. Merten, "Virus Contaminations of Cell Cultures - A Biotechnological View", Cytotechnology. julio de 2002; 39(2):91-116. En una realización, la secuencia TAP comprende la secuencia de ácido nucleico de la Se Q ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y el complemento de la SEQ ID NO: 4.

En otros aspectos, la divulgación se refiere a una composición de cóctel de PCR y a un método de uso del cóctel de PCR para detectar un contaminante diana en una muestra de ensayo y descartar un falso positivo debido a la contaminación de la muestra de ensayo con el PAC.

En una realización, el cóctel de PCR contiene, entre otras cosas, un cebador oligonucleotídico directo específico para el contaminante diana, una sonda oligonucleotídica de detección específica para el contaminante diana, una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como la sonda de detección única (UDP) descrita anteriormente y un cebador oligonucleotídico inverso específico para el contaminante diana. En una realización en la que el contaminante diana es un parvovirus de roedor, el cóctel de PCR contiene, entre otras cosas, un cebador oligonucleotídico directo específico para el parvovirus de roedor, una sonda oligonucleotídica de detección específica para el parvovirus de roedor, una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como la sonda de detección única (UDP) descrita anteriormente y un cebador oligonucleotídico inverso específico para el parvovirus de roedor. Cada sonda de detección (es decir, sonda oligonucleotídica de detección específica para el contaminante diana, tal como la sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus de roedor y la sonda oligonucleotídica de detección artificial) contiene una secuencia de ácido nucleico ligada a un fluoróforo en un extremo (ya sea el 5 prima o el 3 prima) y un inactivador en el otro extremo (ya sea el 3 prima o el 5 prima, respectivamente).

En el presente documento, el cebador oligonucleotídico directo específico para parvovirus y la secuencia de ácido nucleico de la sonda oligonucleotídica de detección específica para el parvovirus de roedor se hibridan con la hebra antisentido del parvovirus. El cebador oligonucleotídico inverso específico para el parvovirus de roedor se hibrida con la hebra sentido del parvovirus. En una realización, la secuencia de parvovirus con la que se hibridan los cebadores y la sonda oligonucleotídica específica para parvovirus es una secuencia de parvovirus de roedor conservada. En un caso, la secuencia de parvovirus conservada es una secuencia NS1 de parvovirus, tal como, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEQ ID NO: 9. Mediante el uso de una secuencia conservada, una sola sonda será eficaz para detectar múltiples cepas de parvovirus de ratón.

En una realización, la sonda oligonucleotídica artificial de detección no se hibrida con un ácido nucleico de parvovirus o cualquier secuencia contaminante biológica. El ácido nucleico de la sonda oligonucleotídica artificial de detección es sintética y no se hibridará en ninguna condición de rigurosidad con cualquier secuencia de ácido nucleico de contaminante biológico. En una realización, el ácido nucleico de la sonda oligonucleotídica artificial de detección (también conocida como polímero de ácido nucleico "único" o secuencia única) se diseña para que no reconozca o se hibride con cualquier parvovirus de origen natural en condiciones de hibridación empleadas en la ejecución del presente ensayo. En una realización, el polímero de ácido nucleico "único" comprende de 17 a 20 nucleótidos, en donde no más de siete (7) a 10 nucleótidos consecutivos internos y no más de seis (6) nucleótidos tres prima consecutivos son idénticos a cualquier secuencia de parvovirus. En una realización, el polímero de nucleótido "único" comprende de 17 a 20 nucleótidos, en donde no más de 7 a 10 nucleótidos consecutivos y no más de seis (6) nucleótidos tres prima consecutivos son idénticos a cualquier secuencia de parvovirus expuesta en las SEQ ID NO: 9 y 12-37. Sin embargo, el ácido nucleico de la sonda oligonucleotídica artificial de detección (es decir, la secuencia única) se hibrida con la secuencia de PACP del plásmido de PAC. Por lo tanto, la sonda oligonucleotídica artificial de detección detecta el plásmido de PAC, pero no una secuencia de parvovirus o de otro contaminante biológico.

En una realización, puede usarse el cóctel de PCR para determinar si el plásmido de PAC está presente en la muestra biológica de ensayo, proporcionando un resultado falso positivo. En el presente documento, en caso de que la muestra de ensayo muestre una señal de Q-PCR positiva para la sonda oligonucleotídica específica de parvovirus y una señal de Q-PCR negativa para la sonda oligonucleotídica artificial de detección, se presume que la muestra de ensayo está libre de contaminación por PAC (es decir, auténtico positivo).

En una realización, el cebador oligonucleotídico directo específico para el contaminante diana comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1; el ácido nucleico de la sonda oligonucleotídica de detección específica para el contaminante diana comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2; el ácido nucleico de la sonda oligonucleotídica artificial de detección (es decir, el UDP) comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3; y el cebador oligonucleotídico inverso específico para el contaminante diana comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

En otros aspectos, la invención proporciona un método para detectar un contaminante biológico en una muestra de ensayo. En el presente documento, la muestra de ensayo es un cultivo celular, tal como, por ejemplo, un cultivo de células de mamífero a escala industrial para la producción de una proteína terapéutica. Las células de mamífero útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, células CHO, células CHO-K1 y células EESYR (véase la Patente de los Estados Unidos n.° 7.771.997). El método incluye, además de los cebadores, sondas, cócteles y el plásmido de PAC como se ha descrito anteriormente, el uso de un control de extracción de ácidos nucleicos (NEC). En una realización, el NEC es un fago M13K07, que se incluye en la muestra de ensayo antes de la extracción de ácido nucleico. En caso de que la extracción de ácido nucleico sea adecuada a efectos de detección de ADN o ARN contaminante, el ácido nucleico de NEC (por ejemplo, ácido nucleico de M13K07) se detecta mediante Q-PCR en la muestra de ensayo en la que se añadió. En una realización particular, la mezcla de reacción de Q-PCR contiene un cebador oligonucleotídico directo específico para el contaminante diana, una sonda oligonucleotídica de detección específica para el contaminante diana, una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como la sonda de detección única (UDP) descrita anteriormente, un cebador oligonucleotídico inverso específico para el contaminante diana, un cebador oligonucleotídico directo específico para el NEC, una sonda oligonucleotídica de detección específica para el NEC y un cebador oligonucleotídico inverso específico para el NEC. En una realización, la muestra de ensayo se toma de un cultivo celular de producción de proteína terapéutica, a la que se añade un NEC (por ejemplo, un fago M13K07) antes de la extracción de ácidos nucleicos y el posterior análisis por Q-PCR.

En una realización específica, el contaminante diana es un parvovirus de roedor, en cuyo caso (1) el cebador oligonucleotídico directo específico para el contaminante diana es un cebador oligonucleotídico directo específico para parvovirus de roedor, más específicamente que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1; (2) el cebador oligonucleotídico de detección específico para el contaminante diana es una sonda oligonucleotídica de detección específica para el parvovirus de roedor, más específicamente que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2; (3) la sonda oligonucleotídica artificial de detección es la sonda de detección única (UDP), más específicamente que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3; (4) el cebador oligonucleotídico inverso específico para el contaminante diana es un cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor, más específicamente que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4; (5) el cebador oligonucleótido específico para el NEC es un cebador oligonucleotídico directo de M13, más específicamente que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; (6) la sonda oligonucleotídica de detección específica para el NEC es una sonda de detección de M13, más específicamente que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6; y (7) el cebador oligonucleotídico inverso específico para el NEC es un cebador oligonucleotídico inverso de M13, más específicamente que comprende el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 8. En una realización del método, en caso de que se detecte una señal de Q-PCR de NEC (es decir, la señal se encuentra dentro del intervalo de recuperación esperado), se puede asumir que la extracción de ácido nucleico de la muestra de ensayo ha tenido éxito. Por otra parte, en caso de que no se detecte señal de NEC (es decir, la señal se encuentra fuera del intervalo de recuperación esperado), se puede asumir que fracasó la extracción de ácido nucleico de la muestra de ensayo y se considera inválida cualquier señal de contaminante diana de la Q-PCR (es decir, falso negativo).

Descripción detallada de la invención

Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Otras realizaciones resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.

Para que pueda entenderse completamente la invención descrita en el presente documento, se expone la siguiente descripción detallada.

La invención se refiere a métodos mejorados para detectar cualquier contaminante biológico en cualquier cultivo celular que produce una proteína terapéutica. Específicamente, la invención se refiere a métodos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR) que incorporan un elemento o etapa de control positivo de la amplificación que se detecta fácilmente para eliminar falsos positivos.

PCR Y PCR CUANTITATIVA

Como se usa en el presente documento, la frase "reacción en cadena de la polimerasa" ("PCR") significa un método para producir copias de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) empleando múltiples ciclos de desnaturalización (la separación de las hebras del ADN molde), hibridación (la hibridación de oligonucleótidos monocatenarios a las hebras de ADN molde monocatenario) y síntesis de ADN (la ADN polimerasa cataliza la síntesis de una nueva hebra de ADN cebada a partir del extremo 3 prima del oligonucleótido hibridado, usando la hebra de ADN molde como molde). Para que se produzca la amplificación, se usan al menos dos cebadores oligonucleotídicos diferentes (conocidos como "cebador" de manera abreviada) en la reacción PCR. Un cebador, que generalmente se denomina cebador directo, se hibrida con la hebra antisentido del ADN molde y forma el extremo 5 prima de la hebra sentido recién sintetizada. El otro cebador, que generalmente se denomina el cebador inverso, se hibrida con la hebra sentido del ADN molde y forma el extremo 5 prima de la hebra antisentido recién sintetizada. En cada ciclo, se copia cada hebra molde para formar una nueva molécula de ADN bicatenario, que también se conoce como un "amplicón". Por lo tanto, con cantidades no limitantes de cebadores oligonucleotídicos, ADN polimerasa (es decir, polimerasa Taq u otro ADN polimerasa termoestable; véase Innis et al., DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA, 85(24) Proc Natl Acad Sci USA. 9436-40 (1988)) y nucleótidos trifosfato, se duplica el número de moléculas de ADN (moldes y amplicones) en cada ciclo. La PCR se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 4.683.202 (concedida el 28 de julio de 1987). Véase también PCR Primer: A Laboratory Manual (Carl W. Dieffenbach y Gabriela S. Dveksler eds., 1995).

Como se usa en el presente documento, el término "ciclo" significa una sola ronda de (1) fusión de la hebra de ADN denominada "desnaturalización", seguida de (2) hibridación de cebadores oligonucleotídicos al ADN monocatenario resultante según las reglas de emparejamiento de bases, un proceso denominado "hibridación" y (3) polimerización de una nueva hebra de ADN comenzando en el extremo 3 prima del cebador oligonucleotídico y que se mueve en una dirección de 5 prima a 3 prima, un proceso denominado "amplificación" o "extensión". En general, la polimerización usa una enzima ADN polimerasa, tal como la polimerasa Taq, para catalizar la formación de enlaces fosfodiéster entre desoxinucleótidos trifosfato adyacentes ("dNTP"), que se disponen a lo largo del ADN molde monocatenario expuesto mediante formación de enlaces de hidrógeno según las reglas de emparejamiento de bases. La desnaturalización, la hibridación y la amplificación se llevan a cabo a temperaturas concretas basándose, en parte, en el contenido de GC del molde de ADN y los cebadores oligonucleotídicos y la longitud de la hebra de ADN que se vaya a copiar. La temperatura de desnaturalización e hibridación, así como la fuerza iónica del tampón de reacción, controlan la rigurosidad de la hibridación y la fidelidad de la copia de ADN.

"PCR cuantitativa" o "qPCR" (también conocida como "PCR en tiempo real") es un tipo de PCR que posibilita la monitorización de la formación del amplicón durante el proceso de ciclado de la PCR. La Q-PCR puede usarse para cuantificar la cantidad de un ADN molde específico en una muestra. La Q-PCR incorpora al menos una sonda oligonucleotídica de detección en la mezcla de reacción, además del cebador oligonucleotídico directo y el cebador oligonucleotídico inverso. La sonda de detección es un oligonucleótido monocatenario que se hibrida con la hebra sentido o antisentido del ADN molde diana en alguna parte entre el sitio de unión del cebador directo y el sitio de unión del cebador inverso. Durante la etapa de hibridación, la sonda oligonucleotídica de detección se hibrida con el molde monocatenario. A medida que se produce la polimerización, la sonda se escinde y se degrada por la actividad nucleasa 5 prima de la ADN polimerasa. Por lo tanto, a medida que se produce la amplificación de la secuencia molde específica, las sondas de detección se degradan a una velocidad exponencial.

Las sondas oligonucleotídicas de detección de Q-PCR generalmente se construyen con un fluoróforo unido (también conocido como colorante fluorescente o simplemente "indicador") y un inactivador unido. En la mayoría de los casos, el fluoróforo se une en o cerca del extremo 5 prima del oligonucleótido y el inactivador se une en o próximo al extremo 3 prima del oligonucleótido. Sin embargo, puede usarse cualquier arquitectura factible en la práctica de la presente invención. Cuando la sonda oligonucleotídica de detección está intacta, el fluoróforo y el inactivador se encuentran próximos, de tal forma que el inactivador absorbe la luz emitida por el fluoróforo excitado, reduciendo significativamente la emisión detectable del fluoróforo. Cuando la sonda oligonucleotídica de detección se escinde o degrada, el fluoróforo y el inactivador se liberan y por consiguiente, se separan espacialmente. El inactivador deja de estar lo suficientemente cerca para inactivar la emisión del fluoróforo. A medida que se forman amplicones más específicos, se escinden más sondas oligonucleotídicas de detección, se liberan más fluoróforos e inactivadores, de tal forma que se separan más pares de fluoróforo/inactivador y aumenta la amplitud de la emisión de fluorescencia. En otras palabras, un aumento en la señal de emisión del fluoróforo se correlaciona con la cantidad de ADN molde específico en la muestra. Para una revisión de la Q-PCR, véase lan M. Mackay et al., Survey and Summary: Real-Time PCR in Virology, 30(6) Nucleic Acids Research 1292-1305 (2002).

La inactivación de la fluorescencia puede producirse mediante contacto directo entre el indicador y el inactivador (también conocida como inactivación estática) o mediante transferencia de energía por resonancia (FRET) entre el indicador y el inactivador cuando tanto el indicador como el inactivador se encuentran dentro del radio de Forster entre sí. Puede excitarse un fluoróforo específico mediante una o más longitudes de onda de luz específicas o un intervalo de longitudes de onda con un máximo. Esta se denomina la longitud de onda de excitación. Después de que se excite un fluoróforo, este vuelve a un estado basal y emite luz a una longitud de onda mayor que la longitud de onda de excitación. Esta se denomina la longitud de onda de emisión. Durante la FRET, un segundo fluoróforo, colorante, molécula de la serie de los lantánidos o similares, que tiene un espectro de absorbancia que coincide o se solapa con el espectro de emisión del fluoróforo, absorbe la luz emitida por el fluoróforo excitado dentro del radio de Forster, inactivando o reduciendo de este modo la longitud de onda de la emisión del fluoróforo. La inactivación de contacto o estática resulta cuando el indicador y el inactivador forman un complejo ternario en el estado basal del fluoróforo. Este complejo ternario es no fluorescente, es decir, esencialmente no excitable y por lo tanto, no emite luz a una longitud de onda esperada.

Para una revisión de la inactivación estática y la FRET, véase Salvatore A. E. Marras et al., Efficiencies of Fluorescence Resonance Energy Transfer and Contact-Mediated Quenching in Oligonucleotide Probes, 30(21) Nucleic Acids Research e122, págs. 1-8 (2002). Marras et al. también analizan la selección de pares de indicador/inactivador para su uso en la aplicación de la Q-PCR.

ÁCIDOS NUCLEICOS

Los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", "sonda", "cebador" o "cebador nucleotídico" o "cebador oligonucleotídico", "molde" o "ácido nucleico molde" o "ADN molde" se usan en el presente documento de acuerdo con su significado habitual para un experto en la materia de la técnica de biología molecular. Para una explicación detallada de cada uno, véase, por ejemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual (Carl W. Dieffenbach y Gabriela S. Dveksler eds., 1995).

Como se usa en el presente documento, "amplicón" se refiere a un producto de ADN resultante de la amplificación de una secuencia de ácido nucleico molde mediante la PCR. A medida que avanza la PCR y se amplifica el molde, los amplicones de ADN recién formados sirven como moldes para rondas posteriores de síntesis de ADN.

CULTIVOS CELULARES

La invención también se refiere a un método de Q-PCR mejorado para detectar contaminantes biológicos en un cultivo celular. Normalmente se usan cultivos celulares para producir moléculas biológicas complejas para uso terapéutico, tales como anticuerpos, moléculas trampa y proteínas de fusión de Fc. Estos cultivos deben permanecer libres de contaminantes biológicos. La detección de contaminantes es importante para determinar si un lote particular ha de desecharse o someterse a remediación.

Los cultivos celulares incluyen medios de cultivo y células normalmente procedentes de una sola línea celular. En el presente documento, la línea celular comprende células capaces de producir una proteína bioterapéutica. Los ejemplos de líneas celulares que se usan rutinariamente para producir agentes bioterapéuticos proteicos incluyen, entre otros, células primarias, células BSC, células HeLa, células HepG2, células LLC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLCPK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK, células BHK-21, células CHO, células CHO-K1, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células 3T3, células 293, células Per.C6 células de embrión de pollo. Una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) o una o más de diversas variantes específicas de células CHO, tal como la línea celular CHO-K1 se optimizan para la producción de proteína a gran escala. La línea celular EESYR® es una línea celular CHO especializada optimizada para la producción potenciada de proteínas de interés. Para una descripción detallada de las células EESYR®, véase la Patente de los Estados Unidos n.° 7.771.997 (concedida el 10 de agosto de 2010).

"Cultivo celular" o "cultivo" significa el crecimiento y la propagación de células fuera de un organismo o tejido multicelular. Las condiciones de cultivo adecuadas para las células de mamífero son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Animal cell culture: A Practical Approach (D. Rickwood, ed., 1992). Las células de mamífero pueden cultivarse en suspensión o unidas a un sustrato sólido. Los biorreactores de lecho fluidizado, los biorreactores de fibra hueca, los matraces rotatorios, los matraces de agitación o los biorreactores de tanque agitado, con o sin microportadores y accionados en un modo discontinuo, discontinuo alimentado, continuo, semicontinuo o de perfusión se encuentran disponibles para el cultivo de células de mamífero. Pueden añadirse al cultivo medios de cultivo celular o medios de alimentación concentrados de manera continua o a intervalos durante el cultivo (es decir, discontinuo alimentado). Por ejemplo, un cultivo puede alimentarse una vez al día, cada dos días, cada tres días o puede alimentarse cuando la concentración de un componente específico del medio, que se está monitorizando directa o indirectamente, se encuentra fuera de un intervalo deseado.

Las células animales, tales como células CHO o células EESYR®, pueden cultivarse en cultivos a pequeña escala, tales como en recipientes de 125 ml que tienen aproximadamente 25 ml de medio, recipientes de 250 ml que tienen de aproximadamente 50 a 100 ml de medio, recipientes de 500 ml que tienen de aproximadamente 100 a 200 ml de medio. Como alternativa, los cultivos pueden ser a gran escala, tal como, por ejemplo, recipientes de 1000 ml que tienen de aproximadamente 300 a 1000 ml de medio, recipientes de 3000 ml que tienen de aproximadamente 500 ml a 3000 ml de medio, recipientes de 8000 ml que tienen de aproximadamente 2000 ml a 8000 ml de medio y recipientes de 15000 ml que tienen de aproximadamente 4000 ml a 15000 ml de medio. Las cultivos para la producción pueden contener 10.000 l de medio o más. Los cultivos celulares a gran escala, tales como la fabricación clínica de productos terapéuticos proteicos, se mantienen normalmente durante días o semanas mientras las células producen la o las proteínas deseadas. Durante este tiempo, pueden retirarse muestras del cultivo y ensayarse respecto de la presencia de contaminantes biológicos.

PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

El cultivo celular cuya contaminación biológica se monitoriza puede usarse para producir una proteína u otra molécula biológica de interés, tal como un anticuerpo terapéuticamente eficaz u otra sustancia farmacológica biofarmacéutica. El producto proteico (proteína de interés) puede ser, entre otras cosas, un anticuerpo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo biespecífico, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, triacuerpo o tetracuerpo, un fragmento Fab o un fragmento F(ab')2, un anticuerpo IgA, un anticuerpo IgD, un anticuerpo IgE, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG, un anticuerpo lgG1, un anticuerpo lgG2, un anticuerpo lgG3 o un anticuerpo IgG4. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG2. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4.

La proteína de interés puede ser una proteína recombinante que contiene un resto de Fc y otro dominio, (por ejemplo, una proteína de fusión de Fc). Una proteína de fusión de Fc puede ser una proteína de fusión de receptor de F, que contiene uno o más de uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplados a un resto de Fc. En algún caso, la fracción Fc comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una IgG. En algunos casos, la proteína de fusión de receptor de Fc contiene dos o más cadenas de receptor distintas que se unen o bien a un solo ligando o bien a múltiples ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc es una trampa, tal como, por ejemplo, una trampa de IL-1 (por ejemplo, rilonacept, que contiene la región de unión a ligando de IL-1RAcP fusionada a la región extracelular de I1-1R1 fusionada a un dominio Fc de hlgGI; véase la Patente de los Estados Unidos n.° 6.927.004) o una trampa de VEGF (por ejemplo, aflibercept, que contiene el dominio 2 de Ig del receptor de VEGF Flk1 fusionado al dominio 3 de Ig del receptor de VEGF Flk1 fusionado a un dominio Fc de hlgGI; véanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 7.087.411 y 7.279.159).

La presente divulgación no se limita a ningún tipo particular de célula o línea celular para la producción de proteína. Los ejemplos de tipos de células adecuados para la producción de proteínas incluyen células de mamífero, tales como la línea celular derivada de CHO, EESYR®, células de insecto, células aviares, células bacterianas y células de levadura. Las células pueden ser células madre o células recombinantes transformadas con un vector para la expresión génica recombinante o células transfectadas con un virus para producir productos víricos. Las células pueden contener una construcción de polinucleótido heterólogo recombinante que codifica una proteína de interés. Dicha construcción puede ser episómica (tal como un plásmido o fragmento extracromosómico) o puede integrarse físicamente en el genoma de la célula. Las células también pueden producir una proteína de interés sin tener esa proteína codificada en una construcción polipeptídica heteróloga. En otras palabras, la célula puede codificar de forma natural la proteína de interés, tal como un linfocito B productor de un anticuerpo. Los expertos en la materia conocen métodos y vectores para modificar por ingeniería genética células o líneas celulares para expresar una proteína de interés. Por ejemplo, se ilustran diversas técnicas en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. (Wiley & Sons, Nueva York, 1988 y actualizaciones trimestrales); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989); Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, págs. 15-69. Hay una amplia variedad de líneas celulares adecuadas para el crecimiento en cultivo disponible en la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) y en proveedores comerciales.

Las células también pueden ser células primarias, tales como células embrionarias de pollo o líneas celulares primarias. Los ejemplos de células útiles incluyen células BSC, células LLC-MK, células CV-1, células COS, células VERO, células MDBK, células MDCK, células CRFK, células RAF, células RK, células TCMK-1, células LLCPK, células PK15, células LLC-RK, células MDOK, células BHK-21, células embrionarias de pollo, células NS-1, células MRC-5, células WI-38, células BHK, células 293, células Per.C6 y células CHO. En diversas realizaciones, la línea celular es un derivado de célula CHO, tal como CHO-K1, CHO DUX B-11, CHO DG-44, Veggie-CHO, GS-CHO, S-CHO, líneas mutantes de lec de CHO o una línea celular EESYR®.

En un escenario particular, la célula es un derivado de células CHO, tal como una célula EESYR® que expresa de manera ectópica (de manera heteróloga) una proteína. Dicha proteína comprende una región de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como una región CH1, CH2 o CH3. En una realización, la proteína comprende una región CH2 y CH3 de inmunoglobulina humana o de roedor. En una realización, la proteína comprende una región CH1, CH2 y CH3 de inmunoglobulina humana o de roedor. En una realización, la proteína comprende una región bisagra y una región CH1, CH2 y CH3. En una realización específica, la proteína comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización específica, la proteína comprende un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En una realización específica, la proteína comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina y un dominio variable de cadena ligera de inmunoglobulina. En una realización específica, la proteína es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humano, un anticuerpo de roedor o un anticuerpo quimérico de humano/roedor (por ejemplo, humano/ratón, humano/rata o humano/hámster).

Puede llevarse a cabo una fase de producción de proteína de un cultivo celular en cualquier escala de cultivo, desde matraces individuales y matraces de agitación o bolsas de olas, a biorreactores de un litro y a biorreactores industriales a gran escala. Se puede realizar un proceso a gran escala en un volumen de aproximadamente 100 litros a 20.000 litros o más. Se pueden usar uno o más de varios medios para controlar la producción de proteína, tal como el cambio de temperatura o la inducción química. La fase de crecimiento de la célula puede producirse a una temperatura mayor que la fase de producción, durante la cual se expresa y/o secreta la proteína. Por ejemplo, la fase de crecimiento puede producirse a una primera temperatura de aproximadamente 35 °C a 38 °C y la fase de producción puede producirse a una segunda temperatura de aproximadamente 29 °C a 37 °C, opcionalmente de aproximadamente 30 °C a 36 °C o de aproximadamente 30 °C a 34 °C. Además, se pueden añadir de manera concurrente inductores químicos de la producción de proteínas, tales como cafeína, butirato, tamoxifeno, estrógeno, tetraciclina, doxiciclina y hexametilen-bisacetamida (HMBA), antes o después de un cambio de temperatura. Si se añaden inductores después de un cambio de temperatura, se pueden añadir de una hora a cinco días después del cambio de temperatura, tal como de uno a dos días después del cambio de temperatura. Los cultivos celulares de producción pueden realizarse como un sistema de cultivo de alimentación continua, como en un quimiostato (véase C. Altamirano et al., Biotechnol Prog. nov-dic de 2001; 17(6): 1032-41) o de acuerdo con un proceso alimentado-discontinuo (o discontinuoalimentado) (Huang, 2010).

PRODUCTOS DE PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS

Como se usa en el presente documento, "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente a lo largo del presente documento, y se refieren a una molécula que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. Los péptidos, los polipéptidos y las proteínas también pueden incluir modificaciones tales como glucosilación, unión de lípidos, sulfatación, gamma-carboxilación de restos de ácido glutámico, alquilación, hidroxilación y ribosilación de ADP. Los péptidos, los polipéptidos y las proteínas pueden ser de interés científico o comercial, incluyendo los fármacos a base de proteínas. Los péptidos, los polipéptidos y las proteínas incluyen, entre otras cosas, anticuerpos y proteínas quiméricas o de fusión. Los péptidos, los polipéptidos y las proteínas son producidos por líneas celulares animales recombinantes usando métodos de cultivo celular.

"Anticuerpo" se refiere a una molécula de inmunoglobulina que consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene una región variable de cadena pesada (HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada contiene tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera tiene una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste en un dominio (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, c DR2, FR3, CDR3, FR4. El término "anticuerpo" incluye la referencia a inmunoglobulinas tanto glucosiladas como no glucosiladas de cualquier isotipo o subclase. El término "anticuerpo" incluye moléculas de anticuerpo preparadas, expresadas, creadas o aisladas por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de una célula hospedadora transfectada para expresar el anticuerpo. El término anticuerpo también incluye un anticuerpo biespecífico, que incluye una inmunoglobulina heterotetramérica que puede unirse a más de un epítopo. Los anticuerpos biespecíficos se definen en líneas generales en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos n.° 2010/0331527.

La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o "fragmento del anticuerpo"), se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno). Los ejemplos de los fragmentos de unión abarcados en la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 241:544-546), que consiste en un dominio VH, (vi) una CDR aislada y (vii) un scFv, que consiste en los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, unidos por un enlazador sintético para formar una sola cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes. Otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como los diacuerpos, también están abarcadas por el término "anticuerpo" (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo puede formar parte de una molécula de inmunoadhesión de mayor tamaño, formadas mediante la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o una porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos diferentes. Los ejemplos de dichas moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región del núcleo de estreptavidina para formar una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov et al., (1995) "Human Antibodies and Hybridomas" 6:93-101) y el uso de un resto de cisteína, un péptido marcador y un marcador de polihistidina C-terminal para producir moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov et al., (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tal como mediante digestión con papaína o pepsina de anticuerpos completos. Además, pueden producirse anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN recombinante convencionales (véase Sambrook et al., 1989).

La expresión "anticuerpo humano" pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no incluye anticuerpos en los que se han injertado en una secuencia marco humana secuencias de CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpo recombinante humano, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylos et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias de VH y VL de línea germinal humanas, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Las "proteínas de fusión de Fc" comprenden parte o la totalidad de dos o más proteínas, una de las cuales es una porción Fc de una molécula de inmunoglobulina, que de otro modo no se encuentran juntas en la naturaleza. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a diversas partes de polipéptidos derivados de anticuerpos (que incluyen el dominio Fc) se ha descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; y Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", en Current Protocols in Immunology, Supl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11, 1992. Las "proteínas de fusión de receptor de Fc" comprenden uno o más dominios extracelulares de un receptor acoplado a un resto de Fc, que, en algunas realizaciones, comprende una región bisagra seguida de un dominio CH2 y CH3 de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión de Fc contiene dos o más cadenas de receptor distintas que se unen a uno o más ligandos. Por ejemplo, una proteína de fusión de Fc es una trampa, tal como, por ejemplo, una trampa de IL-1 (por ejemplo, rilonacept, que contiene la región de unión a ligando de IL-1RAcP fusionada a la región extracelular de IL-1R1 fusionada al Fc de hlgG1; véase la Patente de los Estados Unidos n.° 6.927.004) o una trampa de VEGF (por ejemplo, aflibercept, que contiene el dominio 2 de Ig del receptor de VEGF Flk1 fusionado al dominio 3 de Ig del receptor de VEGF Flk1 fusionado al Fc de hlgG1; véanse las Patentes de los Estados Unidos n.° 7.087.411 y 7.279.159).

CONTAMINANTES BIOLÓGICOS

Como se usa en el presente documento, la expresión "contaminante biológico" significa cualquier entidad biológica no deseada, no deseable, nociva o potencialmente nociva. Estas entidades incluyen, entre otras cosas, priones (la causa etiológica de la encefalopatía espongiforme bovina/transmisible), viriones, virus, micoplasma, otras bacterias, células de metazoos contaminantes, ADN, ARN, transposones, otros elementos transponibles, levaduras, otros hongos, algas, protistas y otros agentes adventicios y endógenos. Son particularmente preocupantes para los procesos de producción de agentes bioterapéuticos que usan células de roedor (tales como células CHO y derivados de células CHO) los virus adventicios asociados con células o medios o las materias primas de producción. La contaminación de los materiales del proceso a granel de cultivo celular y el producto farmacológico resultante representa un riesgo directo para el paciente, así como el riesgo indirecto de interrumpir el suministro de medicamento.

Una lista no exhaustiva de agentes adventicios y/o endógenos que pueden infectar a cultivos de células CHO incluye: virus de ARN (-) monocatenarios, tales como el virus del valle de Cache, virus de la gripe A/B, parainfluenza 1/2/3, virus de simio 5, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio bovino y virus de la estomatitis vesicular; virus de ARN (-) monocatenarios, tales como coronavirus bovinos, vesivirus 2117, virus de la encefalomiocarditis, virus coxsackie B-3, virus del bosque de Semliki y virus de Sindbis; virus de ARN bicatenarios, tales como el virus de la lengua azul, virus de la enfermedad hemorrágica epizoótica y reovirus 1/2/3; virus de ADN monocatenarios, tales como circovirus porcino 1 y los parvovirus particularmente problemáticos que incluyen el virus diminuto de ratón; y virus de ADN bicatenario, tales como adenovirus y virus de la seudorrabia. De estos agentes adventicios potenciales, cuatro virus dominan las muestras de cosecha en bruto de cultivos de células CHO de diversos fabricantes. Estos virus son el reovirus tipo 2, virus del valle de Cache, virus hemorrágico de enfermedad epizoótica y el virus diminuto de ratón de parvovirus de roedor. Para una revisión detallada de los contaminantes víricos adventicios de cultivos de células CHO, véase Andreas Berting et al., Virus Susceptibility of Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells and Detection of Viral Contaminations by Adventitious Agent Testing, 106(4) Biotechnology and Bioengineering 598-607 (2010), y Andrew Kerr y Raymond Nims, Adventitious Viruses Detected in Biopharmaceutical Bulk Harvest Samples over a 10 Year Period, 64(5) PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 481-485 (2010).

Las pruebas para agentes adventicios se encuentran en dos categorías generales. La primera es una estrategia virológica clásica usando un ensayo de virus in vitro. En el presente documento, la muestra de ensayo se aplica a una línea celular indicadora, las células se incuban y se pasan durante 14 a 28 días y después se miden criterios de valoración, tales como el efecto citopático o la hemaglutinación (Berting, 2010). El segundo es un ensayo basado en la PCR, que mide en tiempo real la presencia de ácidos nucleicos asociados con agentes adventicios o endógenos. Por ejemplo, véase Zhan et al., Detection of Minute Virus of Mice Using Real Time Quantitative PCR in Assessment of Virus Clearance during the Purification of Mammalian Cell Substrate Derived Biotherapeutics, 30(4) Biologicals 259 270 (2002).

El virus diminuto de ratón (también conocido como MMV, virus diminuto de ratón o MVM) representa un problema especial para la fabricación de agentes bioterapéuticos. Tanto la Food and Drug Administration de los Estados Unidos (FDA) y los medicamentos europeos requieren ensayos específicos para MVM. Este virus es un miembro de la familia parvoviridae (parvovirus) y es común en ratones. Se excreta en la orina y las heces, es robusto y es persistente en el ambiente. Puede introducirse fácilmente en procesos de fabricación de agentes bioterapéuticos. Véase Moody et al., Mouse Minute Virus (MMV) Contamination - A Case Study: Detection, Root Cause Determination, and Corrective Actions, 65(6) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 580-288 (2011). Otros parvovirus de roedor pueden tener un impacto negativo en la producción de agentes biofarmacéuticos basada en cultivo celular. Además de la cepa MVM prototípica, estos parvovirus de ratón incluyen, entre otras cosas, la cepa inmunosupresora y la cepa Cutter de MVM, parvovirus de ratón 1a (MPV-1a), MPV-1b, MPV-1c, parvovirus de hámster, parvovirus de Toolan (parvovirus H-1), virus de rata de Kilham, parvovirus de rata 1a, virus diminuto de rata y la cepa Umass del virus de rata L. Véase S.F. Cotmore y P. Tattersal, The Autonomously Replicating Parvoviruses of Vertebrates, 33 Advances in Virus Research 91-174 (1987) y Jacoby et al., Rodent Parvovirus Infections, 46(4) Lab Anim Sci. 370-80 (1996).

Estos parvovirus comparten una secuencia de ácido nucleico conservada denominada NS-1 (NS1) que codifica una proteína no estructural grande implicada en la amplificación del genoma vírico. La secuencia de nucleótidos conservada de NS1 de MVM se representa en la SEQ ID NO: 9. Los nucleótidos 875-956 de dicha secuencia están conservados en al menos un 97 % a lo largo de una amplia serie de secuencias de NS1 de parvovirus de roedor y por lo tanto, sirven como buenas secuencias diana para pruebas de agentes adventicios y endógenos basadas en la PCr . Las pruebas basadas en la PCR para parvovirus de roedor (y otros agentes adventicios y endógenos) pueden llevarse a cabo en materias primas, medio de cultivo previamente recogido, en varios puntos a lo largo del proceso de purificación en bruto de la molécula bioterapéutica y en las etapas de formulación y empaquetado. La detección de un contaminante puede requerir etapas de remediación, tales como el desechado del material contaminado, el reemplazo de las materias primas y la descontaminación de las instalaciones.

Además de las pruebas para agentes adventicios, agentes endógenos y otros contaminantes biológicos, que permiten acciones correctivas y preventivas (CAPA) durante la fabricación, pueden emplearse etapas de proceso de fabricación y a granel (es decir, operaciones unitarias) especiales para eliminar, reducir o inactivar los contaminantes víricos. La inactivación química, la filtración retenedora de virus y la cromatografía han demostrado ser eficaces para reducir el herpesvirus, retrovirus y parvovirus en fluido de cultivo celular recogido o parcialmente purificado. La etapa de inactivación química más frecuentemente usada es un tratamiento a bajo pH, que algunos expertos en la materia creen se debe a la desnaturalización de las proteínas de la envuelta vírica. Se ha demostrado que las etapas de cromatografía de proteína A, hidroxiapatita, intercambio catiónico e intercambio aniónico retiran el virus hasta cierto punto. Véase, por ejemplo, Miesegaes et al., Analysis of Viral Clearance Unit Operations for Monoclonal Antibodies, 106(2) Biotechnology and Bioengineering 238-246 (2010) y Liu et al., Recovery and Purification Process Development for Monoclonal Antibody production, 2(5) mAbs 480-499 (2010).

ENSAYOS DE Q-PCR: CONTROLES POSITIVOS Y NEGATIVOS

Las pruebas de contaminantes biológicos deben controlarse adecuadamente para asegurar la precisión, fiabilidad y credibilidad. Como se usa en el presente documento, un "control negativo" incorpora la mayoría o todos los reactivos y condiciones experimentales, pero sin la muestra de ensayo. La muestra de ensayo puede reemplazarse con un tampón o medio de cultivo simulado que se sabe que no contiene el contaminante biológico de interés. Además, como se usa en el presente documento, el "control negativo" ha de generar un resultado negativo para el contaminante biológico. En caso de que el control negativo genere un resultado positivo para el contaminante biológico, el técnico o científico experto puede asumir que un resultado positivo de la muestra de ensayo en paralelo podría no reflejar con precisión si la muestra de ensayo contiene el contaminante biológico.

Como se usa en el presente documento, se emplean uno o más "controles positivos" para evaluar si las condiciones experimentales son adecuadamente operativas para detectar el contaminante biológico. Pueden usarse controles positivos en cualquier etapa a lo largo del proceso experimental para garantizar que cada etapa es operativa y para determinar en qué etapa falla el proceso.

En algunas realizaciones, se emplea un control positivo en la etapa de extracción de ácido nucleico para evaluar si la extracción prevista de cualquier ácido nucleico contaminante biológico era lo suficientemente eficiente para detectar el contaminante biológico. Dicho control positivo se denomina un "control de extracción de ácido nucleico" o "NEC". En algunos casos, el NEC se selecciona para imitar al contaminante biológico diana en términos de estructura de proteína-ácido nucleico. En caso de que el NEC se extraiga de un modo suficiente para detectarse, el técnico puede asumir que también se ha extraído el ácido nucleico biológico diana de un modo suficiente para ser detectado. En una realización, el NEC es un fago de ADN monocatenario, no del todo a diferencia de los parvovirus.

En una realización específica, el NEC es un bacteriófago M13, que está compuesto de un ADN monocatenario circular de aproximadamente 6407 nucleótidos. En una realización más específica, el NEC es la cepa M13K07, que es un reactivo de biología molecular generalmente disponible para clonación y otros fines de laboratorio. Véase van Wezenbeek et al., Nucleotide Sequence of the Filamentous Bacteriophage M13 DNA Genome: Comparison with Phage fd, 11(1-2) Gene 129-148 (1980). Se representa una secuencia de nucleótidos del fago M13K07 en la SEQ ID NO: 8. Aunque en realizaciones específicas puede usarse el bacteriófago M13 o la cepa M13K07 de bacteriófago como el NEC, la invención no se limita en modo alguno al uso de dicho reactivo particular como un NEC. Un experto habitual en la materia puede sustituir otro reactivo como un NEC en la práctica de la presente invención sin desviarse del alcance de la invención definida en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, fago MS2 para ensayos de PCR de retrotranscriptasa; véase Kothapalli et al., Problems associated with product enhancement reverse transcriptase assay using bacteriophage MS2 RNA as a template, 109(2) J. Virol. Methods 203-207 (2003)).

En el método de la invención, se emplea un control positivo en la etapa de amplificación por la PCR para evaluar si los reactivos de la PCR (incluyendo los cebadores) y las etapas de la PCR son/eran suficientes para detectar los ácidos nucleicos molde de contaminante biológico. Dicho control positivo se denomina "control de amplificación de plásmido" o "PAC". El PAC se selecciona o diseña para que coincida con la secuencia de ácido nucleico del contaminante biológico diana y para que coincida exactamente con los cebadores oligonucleotídicos directo e inverso de la muestra de ensayo. El pAc contiene adicionalmente una "secuencia única" que no se encuentra en el ácido nucleico contaminante biológico diana. En una realización más específica, la secuencia única no se encuentra en la naturaleza. Un polímero de ácido nucleico "único" está diseñado para hibridar específicamente con esta secuencia única e incorporarse en copias de amplicón de la secuencia única durante la PCR. El polímero de ácido nucleico "único" se diseña para que no reconozca o se hibride con cualquier parvovirus de origen natural en las condiciones de hibridación empleadas en la ejecución del presente ensayo. En una realización, el polímero de ácido nucleico "único" comprende de 17 a 20 nucleótidos, en donde no más de siete (7) a 10 nucleótidos consecutivos internos y no más de seis (6) nucleótidos tres prima consecutivos son idénticos a cualquier secuencia de parvovirus. En una realización, el polímero de nucleótido "único" comprende de 17 a 20 nucleótidos, en donde no más de 7 a 10 nucleótidos consecutivos y no más de seis (6) nucleótidos tres prima consecutivos son idénticos a cualquier secuencia de parvovirus expuesta en las SEQ ID NO: 9 y 12-37.

Esta secuencia única permite al técnico experto distinguir entre una secuencia de contaminante biológico diana auténtica y la contaminación cruzada de la reacción de Q-PCR de ensayo con el plásmido de PAC.

En el método de la invención, el PAC (en forma de un plásmido, también conocido como plásmido de PAC) se incluye en una reacción de Q-PCR idéntica pero separada para controlar la amplificación por la PCR. La reacción de PAC usa exactamente los mismos cebadores y sondas oligonucleotídicos a los empleados en la reacción de Q-PCR de la muestra de ensayo para reflejar con precisión la amplificación de un ácido nucleico de contaminante biológico diana real. La reacción Q-PCR de la muestra de ensayo y la reacción Q-PCR del plásmido de PAC incluyen una sonda de detección de la diana y una sonda de la secuencia única. La reacción de PAC, en caso de funcionar adecuadamente, se espera que genere una señal diana positiva y una señal de secuencia única positiva. La obtención de una señal positiva de la diana y de una señal positiva de la secuencia única en la reacción que contiene plásmido de PAC indica que los reactivos y las condiciones de la Q-PCR de la muestra de ensayo funcionan adecuadamente para producir una señal diana positiva en la muestra de ensayo siempre que está presente un ácido nucleico de contaminante biológico diana.

Por tanto, el PAC actúa como control para la amplificación adecuada por la PCR. En caso de que se obtenga una señal diana negativa en la muestra de ensayo, pero el PAC muestra una señal diana positiva, el técnico experto puede asumir que no hay presencia de ADN contaminante diana detectable en la muestra de ensayo. Por el contrario, en caso de que se obtengan una señal positiva de la secuencia diana y una señal positiva de la secuencia única en la muestra de ensayo, el técnico puede asumir que el plásmido de PAC contaminó de manera cruzada la muestra de ensayo y por lo tanto, la señal positiva de la secuencia diana puede ser un falso positivo.

Descripción detallada de varias realizaciones

En algunas realizaciones, se proporciona un sistema de control positivo mejorado (es decir, composiciones y métodos) para detectar contaminantes biológicos mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa, más específicamente, Q-PCR.

En un aspecto, la divulgación proporciona una sonda de secuencia única (USP) para detectar el plásmido de control positivo de amplificación (plásmido de PAC). El USP contiene una secuencia de nucleótidos artificial capaz de hibridar con la secuencia específica de plásmido artificial única (también conocida como secuencia única o secuencia única de PACP o UAPS), un fluoróforo y un inactivador. En una realización específica, la secuencia de nucleótidos artificial capaz de hibridar con la UAPs comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3 (5'-t Gt CGATGGCGAATGGCTA-3'), que es la antisentido con respecto a la secuencia de la hebra sentido de UAPS (por ejemplo, es decir, la SEQ ID NO: 10 - 5'-TAGCCATTCGCC ATCGACA-3').

Como se ha descrito anteriormente, las sondas de detección de Q-PCR contienen un fluoróforo y un inactivador. La inactivación puede ser mediante inactivación de contacto o mediante FRET, dependiendo del par de fluoróforo/inactivador. En el presente documento, se unen covalentemente un fluoróforo y un inactivador al oligonucleótido de USP. En una realización, el fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de 495 nm a 680 nm y una longitud de onda de emisión de 515 nm a 710 nm. En algunas realizaciones, el fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación de 495 nm, 538 nm o 646 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm, 554 nm o 669 nm, respectivamente. En algunas realizaciones, el inactivador es un colorante con un pico de absorbancia de 430 nm a 672 nm. Los ejemplos de inactivadores útiles incluyen DDQ®-I, Dabcyl, Eclipse®, Iowa Black FQ®, BHQ®-1, QSY®-7, BHQ®-2, DDQ®-II, Iowa Black RQ®, QSY®-21 y DHQ®-3. En una realización específica, el fluoróforo es amidita de fluoresceína (FAM; descrita en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.583.236 (concedida el 10 de diciembre de 1996), que tiene un máximo de absorbancia de aproximadamente 495 nm y un máximo de emisión de aproximadamente 520 nm y el inactivador es Black Hole Quencher®-1 (BHQ®-1, Biosearch Technologies, Inc., Petaluma, CA), que absorbe a de 480 nm a 580 nm. BHQ®-1 inactiva mediante FRET e inactivación de contacto. En general, pero no siempre, el inactivador se acopla mediante un enlace éter al grupo hidroxilo 3 prima del oligonucleótido y el fluoróforo se acopla mediante un enlace éster al grupo fosfato 5 prima del oligonucleótido.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una mezcla de reactivos de Q-PCR que comprende múltiples oligonucleótidos y sondas, útiles para la detección de un contaminante biológico en cultivos celulares, materias primas, moléculas biológicas parcialmente purificadas y purificadas y similares. En una realización, el contaminante biológico es un virus de ADN, más específicamente un parvovirus y aún más específicamente, un parvovirus de roedor, tal como MVM. El parvovirus contiene un gen NS1 que tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 88 % idéntica a cualquier secuencia listada en la tabla 1. En otra realización, el parvovirus contiene un gen NS1 que tiene una secuencia de ácido nucleico que es al menos un 97 % idéntica a la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 9 (es decir, el gen NS1 del virus diminuto de ratón (MVM). En otra realización más, el parvovirus contiene un gen NS1 que comprende la secuencia consenso de SEQ ID NO: 37.

TABLA 1: n i N 1 rv viri

continuación

En una realización específica, la mezcla contiene (1) un cebador oligonucleotídico directo específico para el parvovirus de roedor; (2) una sonda oligonucleotídica de detección específica para el parvovirus de roedor; (3) una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como el USP; y (4) un cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor. Dicha mezcla puede usarse tanto en la muestra de ensayo como en la muestra de control positivo. En una realización más específica, los cebadores oligonucleotídicos y la sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus hibridan con una secuencia de NS1, tal como, por ejemplo, la secuencia de NS1 expuesta en la SEQ ID NO: 9. En una realización más específica, el (1) cebador directo comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1; (2) la sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2; (3) la sonda artificial es un USP y comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3; y (4) el cebador inverso comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4.

Como se ha descrito anteriormente, el USP comprende un fluoróforo y un inactivador, de tal forma que los amplicones que contienen dicha secuencia, es decir, ADN de PAC, pueden detectarse en tiempo real a medida que avanza la Q-PCR. De manera similar, la sonda de detección específica para parvovirus contiene un oligonucleótido con un fluoróforo y un inactivador unidos covalentemente. En la práctica, la longitud de onda de emisión del fluoróforo de la sonda de detección de parvovirus ha de ser diferente a la longitud de onda de emisión del USP para diferenciar entre una auténtica señal positiva de parvovirus y un falso positivo debido a la contaminación de la muestra de ensayo con un plásmido de PAC u otra PACP (por ejemplo, un amplicón de PACP contaminante). Por lo tanto, en aquellas realizaciones en las que el fluoróforo de u Sp es FAM, el fluoróforo unido al oligonucleótido de la sonda de detección de parvovirus debe tener una longitud de emisión distinta de aproximadamente 520 nm. En una realización específica, el fluoróforo unido a la sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus es el colorante VIC® (Life Technologies, Inc., Carlsbad, CA), que tiene un máximo de absorbancia a 538 nm y un máximo de emisión de aproximadamente 554 nm. En el presente documento, el inactivador puede ser un inactivador de FRET o un inactivador de contacto. En una realización, el inactivador es un inactivador no fluorescente de unión al surco menor (MGBNFQ) (véase Sylvain et al., Rapid Screening for HLA-B27 by a Taqman-PCR Assay Using Sequence-Specific Primers and a Minor Groove Binder Probe, a Novel Type of TaqMan™ Probe, 287(1-2) Journal of Immunological Methods 179-186 (2004)).

La mezcla de cebadores y sondas descrita anteriormente se usa para ensayar y distinguir una construcción de control positivo de amplificación de un auténtico contaminante de parvovirus. En algunas realizaciones, la mezcla de cebadores también incluye un conjunto de cebadores y una sonda para detectar un control de extracción de ácido nucleico (NEC). En una realización particular, el NEC es un bacteriófago M13, por ejemplo, la cepa M13K07 (SEQ ID NO: 8). Por lo tanto, en algunas realizaciones, además de los cebadores y la sonda para parvovirus y la sonda UPS, la mezcla de cebadores y sondas contiene (5) un cebador oligonucleotídico directo específico para M13; (6) una sonda oligonucleotídica de detección específica para M13; y (7) un cebador oligonucleotídico inverso específico para M13.

En algunas realizaciones, los cebadores y la sonda para M13 hibridan con la secuencia de la SEQ ID NO: 8. En una realización específica, el cebador oligonucleotídico directo específico para M13 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5; la sonda oligonucleotídica de detección específica para M13 comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6; y el cebador oligonucleotídico inverso específico para M13 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7. Como en el caso de los espectros de emisión de fluoróforos no solapantes para la sonda de parvovirus y el USP, la sonda de NEC contiene un fluoróforo que emite luz a un espectro no solapante. En una realización específica, el fluoróforo unido a la sonda oligonucleotídica de detección específica para M13 es Cy5, un colorante de cianina que tiene un máximo de absorbancia de aproximadamente 650 nm y un máximo de emisión de aproximadamente 670 nm (véase Southwick et al., Cyanine Dye Labeling Reagents: Carboxymethylindocyanine Succinimidyl Esters, 11 Cytometry, 418-430 (1990)). En el presente documento, el inactivador puede funcionar mediante FRET o inactivación de contacto. En una realización, el inactivador es Black Hole Quencher®-2 (BHQ®-2, Biosearch Technologies, Inc., Petaluma, CA), que absorbe a un máximo de aproximadamente 579 nm y se inactiva en el intervalo de aproximadamente 550 nm a aproximadamente 650 nm.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un contaminante biológico en un proceso de producción de moléculas biológicas. El contaminante comprende más específicamente un parvovirus, más específicamente, un parvovirus de roedor y lo más específicamente, aquellos parvovirus que comparten al menos un 97 % de identidad respecto del gen NS1 de MVM. En algunas realizaciones, el gen NS1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 9. En una realización, el proceso de producción de la molécula biológica es un proceso de cultivo de células de mamífero para fabricar un anticuerpo, una molécula trampa u otro anticuerpo terapéutico. Se toma una muestra de ensayo del cultivo celular (o los ingredientes a granel) y se extraen los ácidos nucleicos. En algunos casos, se añade a la muestra de ensayo un NEC, tal como M13 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 8) para que sirva como control para la extracción adecuada de ácidos nucleicos antes de la Q-PCR. El método comprende las etapas de (1) combinar (a) la muestra de ácido nucleico extraída de la muestra de ensayo, (b) cebadores y sondas oligonucleotídicos (como se ha descrito anteriormente) y (c) una ADN polimerasa, preferentemente una ADN polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 5', tal como la polimerasa Taq; (2) someter a dicha combinación a reacción en cadena de la polimerasa (PCR); y (3) monitorizar la producción de diversos amplicones mediante la amplitud de la emisión de fluorescencia.

La formación de amplicones específicos se correlaciona con la presencia y la cantidad de diversos ácidos nucleicos molde en la muestra de ensayo. Los amplicones específicos incluyen (1) polinucleótidos de amplificación de la diana (TAP), tales como, por ejemplo, secuencias de parvovirus de roedor (por ejemplo, aquellos contaminantes biológicos que contienen secuencias de NS1), (2) control de extracción de ácidos nucleicos (NEC), tal como, por ejemplo, polinucleótidos de M13 (por ejemplo, M13K07) (NECP) y (3) polinucleótidos de control de amplificación de plásmido (PACP), tal como la secuencia específica del plásmido artificial única (UAPS). En caso de que se produzcan TAP y NECP y que no se produzcan PACP, se puede concluir que la muestra de ensayo contiene un contaminante biológico y no contiene un plásmido de control positivo de la amplificación de contaminación cruzada. Sin embargo, en caso de que se produzcan tanto TAP como PACP (es decir, UAP) en la reacción Q-PCR de la muestra de ensayo, se puede concluir que la muestra de ensayo había sufrido contaminación cruzada con el plásmido de PAC y el resultado de TAP puede ser un falso positivo.

En una realización específica en la que los cebadores y las sondas comprenden (1) un cebador oligonucleotídico directo específico para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, (2) una sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2, un fluoróforo de VIC y un inactivador de MGBNFQ, (3) una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como el USP que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 y marcada con 6-FAM y BHQ®-1, (4) un cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4, (5) un cebador oligonucleotídico directo específico para M13 que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 5, (6) una sonda oligonucleotídica de detección específica para M13 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 6 y marcada con Cy5 y BHQ®-2 y (7) un cebador oligonucleotídico inverso específico para M13 que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7, se monitoriza la producción de TAP a de aproximadamente 533 nm a aproximadamente 580 nm, la producción de PACP se monitoriza a de aproximadamente 465 nm a aproximadamente 510 nm y se monitoriza la producción de NECP a de aproximadamente 618 nm a aproximadamente 660 nm.

En una realización, la muestra de ensayo se toma de un cultivo de células CHO de producción, por ejemplo, un cultivo de producción de células EESYR® transformadas con ácidos nucleicos que codifican una proteína de interés, 96 a 72 horas antes del tiempo de recogida del cultivo. En caso de que se detecte un TAP y un NECP en la muestra de ensayo, pero no se detecta PACP en la muestra de ensayo, puede llevarse a cabo una prueba de confirmación en una segunda muestra de ensayo obtenida del mismo cultivo celular de producción 48 horas después del tiempo de la recogida. En caso de que se detecten nuevamente un TAP y un NECP en la segunda muestra de ensayo, pero no se detecte PACP en la muestra de ensayo, se considera que el cultivo está contaminado y puede no procesarse adicionalmente. Como alternativa, puede no llevarse a cabo una segunda prueba, aunque el cultivo puede considerarse contaminado y el cultivo no se procesa adicionalmente.

En una realización, se extrae ácido nucleico de la muestra de ensayo tomada del cultivo celular de producción. En el presente documento, se somete a un mililitro de la muestra de ensayo a lisis celular, proteólisis y desnaturalización por calor, seguido de la combinación de la muestra con una muestra de control de extracción de ácidos nucleicos (NEC) y después se extraen los ácidos nucleicos de la muestra. En una realización, se extraen los ácidos nucleicos de la muestra de ensayo (o la muestra de ensayo a la que se ha añadido el NEC) usando un sistema de extracción de ácido nucleico automatizado, tal como un instrumento QIAsymphony® (Qiagen, Inc., Valencia, CA) (véase Lee et al., Comparative evaluation of the QIAGEN QIAsymphony® SP system and bioMérieux NucliSens easyMAG automated extraction platforms in a clinical virology laboratory, 52(4) J. Clin. Virol. 339-43 (2011)).

En una realización, se añade la enzima uracilo-N-glucosilasa (UNG) a la mezcla de reacción de Q-PCR antes de llevar a cabo la PCR para degradar selectivamente amplicones contaminantes (véase Taggart et al., Use of heat labile UNG in an RT-PCR assay for enterovirus detection, 105(1) J. Virol. Methods. 57-65 (2002)). La mezcla de reacción se incuba a 50 °C durante al menos 2 minutos, más específicamente, en algunos casos, durante 2 minutos o 5 minutos.

En una realización específica, después del tratamiento opcional con UNG, se incuba la mezcla de reacción a 95 °C durante 2 minutos, seguido de ocho ciclos de (1) desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos, seguido de (2) hibridación y extensión durante 30 segundos, de tal forma que la primera temperatura de hibridación es 70 °C, después se reduce la temperatura de hibridación en 1 °C en cada ciclo, de tal forma que la octava hibridación es 62 °C. Después de los ocho ciclos iniciales, se llevan a cabo 40 ciclos de amplificación de ADN que comprenden las etapas de (1) desnaturalización a 95 °C durante 10 segundos, seguido de (2) hibridación y extensión a 62 °C durante 30 segundos. En una realización particular, la velocidad de cambio de temperatura desde la temperatura de desnaturalización hasta la temperatura de hibridación es de aproximadamente 4,4 °C por segundo y desde la temperatura de hibridación hasta la temperatura de desnaturalización es de aproximadamente 2,2 °C por segundo.

En algunas realizaciones, el método para detectar un contaminante biológico en un medio de cultivo celular de producción o el producto del mismo incluye llevar a cabo un ensayo del control positivo de amplificación externo (PAC) ejecutado por separado del ensayo de la muestra de ensayo y llevar a cabo un ensayo del control negativo externo ejecutado por separado del ensayo de la muestra de ensayo y del ensayo de PAC. En caso de que fracase el control negativo o el control positivo, se rechaza el resultado obtenido del ensayo de la muestra de ensayo.

En una realización, el control positivo externo comprende las etapas de (1) combinar entre otras cosas y sin una muestra de ensayo (a) un plásmido de control positivo de la amplificación (PAC), que en una realización específica comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 11, (b) un cebador oligonucleotídico directo específico para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, (c) una sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 marcada con VIC y MGBNFQ, (d) una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como el USP que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 marcada con 6-FAM y BHQ®-1, (e) un cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 y (f) una ADN polimerasa, preferentemente una ADN polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 5', tal como la polimerasa Taq; (2) someter a la mezcla de control positivo a reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del control positivo; y (3) monitorizar la producción de (a) polinucleótidos de amplificación de la diana (TAP), (b) polinucleótidos de amplificación del control de extracción de ácido nucleico (NECP) y (c) polinucleótidos de control de amplificación del plásmido (PACP) durante la PCR. La producción de TAP se monitoriza a de aproximadamente 533 nm a aproximadamente 580 nm, la producción de PACP se monitoriza a de aproximadamente 465 nm a aproximadamente 510 nm y se monitoriza la producción de NECP a de aproximadamente 618 nm a aproximadamente 660 nm.

La reacción PCR del control positivo de amplificación se ejecuta de manera idéntica a la reacción PCR de la muestra de ensayo (como se ha descrito anteriormente). En caso de que se produzcan TAP y PACP en la reacción del control positivo, se puede concluir que el procedimiento de amplificación de la PCR está funcionando adecuadamente. En caso de que no se produzcan TAP en la reacción de control positivo de amplificación, puede descontarse cualquier TAP negativo en la muestra de ensayo como una reacción PCR fallida. En una realización, en NEC (es decir, por ejemplo, M13K07) se incluye en el control positivo de amplificación. Un control que funciona adecuadamente también debe revelar una señal de NECP positiva (véase la tabla 1).

En una realización, el control negativo externo comprende las etapas de (1) combinar, entre otras cosas y sin una muestra de ensayo y sin un plásmido de PAC (a) un blanco, que puede ser un tampón que imita el sistema tampón de la muestra de ensayo o simplemente agua, (b) un cebador oligonucleotídico directo específico para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, (c) una sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 marcada con VIC y MGBNFQ, (d) una sonda oligonucleotídica de detección artificial, tal como el USP que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3 marcada con 6-FAM y BHQ®-1, (e) un cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 4 y (f) una ADN polimerasa, preferentemente una ADN polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 5', tal como la polimerasa Taq; (2) someter a la mezcla de control positivo a reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del control positivo; y (3) monitorizar la producción de (a) polinucleótidos de amplificación de la diana (TAP), (b) polinucleótidos de amplificación del control de extracción de ácido nucleico (NECP) y (c) polinucleótidos de control de amplificación del plásmido (PACP) durante la PCR. La producción de TAP se monitoriza a de aproximadamente 533 nm a aproximadamente 580 nm y se monitoriza la producción de PACP a de aproximadamente 465 nm a aproximadamente 510 nm.

La reacción PCR del control negativo se ejecuta de manera idéntica a la reacción PCR de la muestra de ensayo (como se ha descrito anteriormente). En caso de que se produzcan TAP y PACP en la reacción del control negativo, se puede concluir que los reactivos de la PCR están contaminados con el plásmido de PAC. En caso de que se produzcan TAP pero no PACP en la reacción del control negativo, se puede concluir que los reactivos de la PCR están contaminados con un parvovirus. En ambos casos, se desechan los resultados de la muestra de ensayo. Sin embargo, si la producción tanto de TAP como de PACP es negativa en la reacción de control negativo, la producción de TAP y PACP es positiva en el control positivo de amplificación y la producción de TAP (y opcionalmente NECP) es positiva y la producción de PACP es negativa en la reacción de la muestra de ensayo, el técnico puede concluir que la muestra de ensayo está contaminada (véanse la tabla 2 y la tabla 3).

En otros aspectos, la divulgación proporciona un plásmido de control positivo de amplificación (plásmido de PAC) y una mezcla de reactivos de control positivo que incluye el plásmido de control positivo. En una realización, el plásmido de PAC comprende (1) una secuencia de ácido nucleico de parvovirus, (2) una secuencia de ácido nucleico de M13K07 y (3) una secuencia de ácido nucleico artificial única para el plásmido (también conocida como UAPS o secuencia "única"). En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de parvovirus comprende las secuencias de la SEQ ^{i D}NO: 1, la SEQ ID ^{n O :}2 y la SEQ ID NO: 4; la secuencia de ácido nucleico de M13K07 comprende las secuencias de la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 y la secuencia única comprende la secuencia antisentido de la SEQ ID NO: 3. En una realización más específica, la secuencia de nucleótidos del plásmido de PAC consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11.

En algunas realizaciones, la mezcla de reactivos de control positivo incluye, entre otras cosas, el plásmido de PAC descrito anteriormente, un cebador oligonucleotídico directo específico para parvovirus de roedor, una sonda oligonucleotídica de detección específica para el parvovirus de roedor, una sonda oligonucleotídica de detección artificial (es decir, el USP), un cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor, un cebador oligonucleotídico directo específico para el M13, una sonda oligonucleotídica de detección específica para el M13 y un cebador oligonucleotídico inverso específico para el M13 y un tampón. La mezcla contiene opcionalmente dNTP y polimerasa Taq.

TABLA 2: Controles de ensa o estado de la sesión de ensa o

TABLA 3: Estado de la sesión de ensa o

En una realización específica, el cebador oligonucleotídico directo específico para el parvovirus de roedor comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, la sonda oligonucleotídica de detección específica para parvovirus de roedor comprende un fluoróforo de VIC, un inactivador de unión al surco menor (MGBNFQ) y la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 2, el USP comprende un fluoróforo de VIC, un inactivador no fluorescente BHQ y la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 3, el cebador oligonucleotídico inverso específico para parvovirus de roedor comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4, el cebador oligonucleotídico directo específico para M13 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5, la sonda oligonucleotídica de detección específica para M13 comprende un fluoróforo Cy5, un inactivador BHQ-2 y la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6 y el cebador oligonucleotídico inverso específico para M13 comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7.

Ejemplo 1: oligonucleótidos y reactivos de ácido nucleico

El parvovirus de roedor, M13K07 y los oligonucleótidos únicos artificiales (Oligos) se obtuvieron de diversos proveedores a diversas escalas y en diversos formatos, que se describen en la tabla 4. A todos los oligos se les asignó una fecha de caducidad de tres años tras su recepción por parte del proveedor.

Los oligonucleótidos se reconstituyeron en agua a una concentración de 100 mM para producir soluciones madre. Las soluciones madre se diluyeron para producir soluciones madre 10X antes de establecer las reacciones de qPCR. La tabla 5 representa las concentraciones 10X y 1X de los oligonucleótidos de qPCR (cebadores y sondas).

TABLA 4: r n r rv vir M1 l n i rifi i l ni

continuación

TABLA : n n r i n li n l i

Ejemplo 2: plásmido de control positivo de amplificación

El plásmido de control positivo de la amplificación parvo-M13 (PAC) se preparó en el plásmido pUC57-Kan (GeneWiz, Inc., South Plainfield, NJ). Este plásmido de PAC consiste en la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 11. El plásmido PAC de parvovirus-M13 contiene 2,1 x 108 copias/ng, lo que se calculó usando la siguiente fórmula: [número = (cantidad * número/mol) / (pb * ng/g * g/ moles de bp)]; donde cantidad = ng, número/mol = 6,022 x 1023, bp = 4372, ng/g = 1 x 109 y g/moles de bp = 650. Se calculó la concentración del plásmido y se expresó como ng/ml y se diluyó en serie hasta una concentración 10X de 102 copias/ml. A partir de la dilución de 102 copias/ml, se prepararon alícuotas de 50 ml y se almacenaron en tubos con tapa roscada estériles de 2 ml. Todas las alícuotas se almacenaron a < menos 60 °C.

Ejemplo 3: preparación de fago M13K07

Se prepararon diluciones seriadas de factor diez de fago M13K07 usando MEM como diluyente para obtener M13K07 con un título de 100 ufp/ml. Se prepararon alícuotas de 200 ml y se almacenaron a < menos 60 °C y se les asignó una fecha de caducidad de tres años.

Ejemplo 4: preparación de reactivos para la reacción de Q-PCR

El ensayo de detección por PCR en tiempo real de parvovirus de roedor es un proceso PCR TaqMan® totalmente automatizado que consiste en una purificación de ADN automatizada usando QlAsymphony® (Qiagen) seguida de amplificación de ácido nucleico y detección del producto por PCR en tiempo real en el instrumento LightCycler® 480 (Roche Diagnostic). A cada artículo de ensayo se le añadió automáticamente el fago M13K07 como control interno (CI) para evaluar la presencia de inhibidores de la PCR. Se diseñaron los oligonucleótidos de cebador de parvovirus de roedor para hibridar en una región altamente conservada del genoma de parvovirus de roedor (región de NS-1) para asegurar una detección de amplio espectro. El ensayo se llevó a cabo en un formato dúplex (es decir, dos dianas) y los cebadores para parvovirus de roedor y para M13K07, respectivamente, generaron productos de la PCR de aproximadamente 110 y 97 pb. El producto de la PCR se detectó en tiempo real mediante escisión de dos sondas marcadas con diferentes colorantes indicadores: fluoróforo VIC para parvovirus de roedor y fluoróforo Cy5 para fago M13K07. Se usó un plásmido de control positivo de amplificación (PAC) a una concentración de 100 copias/ul. Este plásmido contiene una secuencia única (Flag) (USP) que lo diferencia del parvovirus de tipo silvestre usando una sonda específica marcada con el fluoróforo FAM.

La mezcla maestra se ensambló en un tubo de 2 ml de acuerdo con la tabla 6, en cantidades suficientes con al menos tres veces el número de artículos de ensayo, incluyendo los controles. Los tubos se almacenaron a 2-8 °C. El vial de control negativo de amplificación (NAC) se preparó añadiendo 50 ul de agua a un tubo de 2 ml.

TABLA 6: Mezclas de reacción

Ejemplo 5: preparación de la muestra de ensayo

Ya que potencialmente todas las muestras contenían o estaban contaminadas con el agente adventicio, se siguieron estrictamente prácticas de asepsia para todas las etapas de procesado previo de las muestras. Se llevaron a cabo las siguientes etapas en una campana limpia de bioseguridad. Se obtuvieron artículos de ensayo (muestras) de cultivos de células EESYR® productoras de moléculas trampa y se congelaron o usaron directamente.

Se añadieron alícuotas 1000 ml de PBS en tubos de 2 ml adecuados para servir como controles negativos de extracción (NEC). Cuando la PCR se usa como un criterio de valoración para una etapa de cultivo celular, se usaron los controles positivos y negativos del cultivo celular como control positivo de extracción y control negativo de extracción, respectivamente.

Cada artículo de ensayo se descongeló a temperatura ambiente. Las muestras en bolsas de 60 ml se transfirieron a tubos Falcon de 50 ml y después se separaron en alícuotas. Se pipetearon 1000 ml de cada muestra en tubos de 2 ml para el procesamiento previo. Se añadieron 400 ml de tampón de lisis (Tampón de Lisis L13 ChargeSwitch®, (Invitrogen, n.° de cat. CS11202 o equivalente, Carlsbad, CA) en cada tubo y se agitaron vorticialmente durante al menos 10 segundos.

Después, se añadieron 20 ml de proteinasa K (>10 mg/ml, >800 unidades/ml en glicerol al 40 % (v/v) que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, con acetato de calcio 1 mM; SAFC, n.° de cat. P4850-5ML, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) en cada muestra y se agitó vorticialmente durante al menos 10 segundos. Después, las muestras se incubaron a 65 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, se agitaron vorticialmente las muestras y se centrifugaron a 17.000 x g durante 10 minutos.

De manera simultánea, se descongelaron el control positivo de amplificación (PAC; mínimo de 50 ul de 102 copias/ml de plásmido en tubo de 2 ml) y M13K07 (102 URP/ml), control interno (CI; mínimo de 150 ml/12 muestras).

Ejemplo 6: extracción de ácido nucleico

Se requiere un control interno (CI) para el protocolo de extracción programado en el instrumento QIASymphony® (Qiagen, Valencia, CA). El instrumento añadió automáticamente 120 ml de CI reconstituido a cada muestra. Por cada 12 muestras, se necesitaron 1,8 ml de CI (es decir, 1 vial) por el instrumento. Se prepararon viales de CI añadiendo 1650 ml de tampón AVE (agua libre de RNasa que contiene azida de sodio al 0,04 %) a 150 ml de CI de M13K07.

Cada muestra preparada se cargó en el portamuestras del instrumento dentro de la campana de bioseguridad (BSC). Los viales de CI se cargaron en un portamuestras separado (dedicado) en la BSC a una relación de un vial de CI por cada 12 muestras. Se cerraron todos los cajones y se accionó el instrumento de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (véase el manual de QIAsymphony DNA, 09/2010, disponible en http://www.algimed.by/download/EN-QIAsymphony-DNA-Handbool. pdf).

Se preparó el cartucho de preparación de reactivo con el kit de reactivo para virus/patógenos QIAsymphony® DSP, que contenía todos los reactivos necesarios para llevar a cabo una extracción (véanse las instrucciones de uso del kit para virus/patógenos QIAsymphony® DSP (Manual, abril de 2013, disponible en https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=f8bc0b3c-0aff-46ee-8807-5ed145f9e969&lang=en). El cartucho de preparación de reactivo contenía proteinasa K y tenía una vida útil de aproximadamente dos semanas.

La extracción de ácido nucleico se llevó a cabo en un formato de placa de reacción de 96 pocillos para facilitar la integración con la Q-PCR. Después de completarse el procedimiento de extracción automatizada de ácido nucleico y de pasar la comprobación de estado, se enfrió la placa de reacción y se selló con sello metálico LightCycler® 480 (Roche, Branchburg, NJ). La placa de 96 pocillos se colocó en un centrifugador de placas equilibrado con un contrapeso adecuado (por ejemplo, otra placa de 96 pocillos) y se centrifugó durante 30 a 60 segundos. Se comprobó la presencia de burbujas en los pocillos y se repitió la centrifugación en caso necesario.

Ejemplo 7: Q-PCR

La Q-PCR se llevó a cabo en el instrumento LightCycler® 480 (Roche, Branchburg, NJ) usando uno cualquiera de dos programas - TaqMan Triplex y/o Veriquest Triplex. El protocolo TaqMan Triplex usó la mezcla maestra personalizada TaqMan Fast Advance sin el colorante de referencia (ROX). Se seleccionaron tres canales de fluorescencia (FAM, VIC y CY5) y un tiempo de etapa de UNG de 2 minutos. Los parámetros de reacción que se usaron se exponen en la tabla 7.

Cuando se usó la mezcla maestra VeriQuest®, también sin ROX, se usó un tiempo de etapa de UNG de 5 minutos. Los parámetros de reacción que se usaron se exponen en la tabla 8.

TABLA 7: E l r r m T M n Tri l x r l P R rv vir r r

Se determinó la señal de fluorescencia de punto de intersección (Cp) para cada uno del control interno de M13, parvovirus de roedor y plásmido de control positivo de amplificación mediante uno o ambos de dos algoritmos. El primer algoritmo es el método de segunda derivada automatizada. Este método no requiere entrada de datos por el usuario y en general dio como resultado una mayor consistencia y por lo tanto, se consideró el método preferido. El segundo algoritmo es el método de punto de ajuste. Este método permite al usuario establecer la línea umbral, en los casos de fondo divergente. El punto donde la curva logarítmica-lineal atraviesa esa línea umbral se convierte en el punto de intersección. Se usaron los siguientes filtros de peine para monitorizar las señales fluorescentes: 533-580 nm (señal de VIC) para parvovirus de roedor (subconjunto "Muestra-Parvo"); 618-660 nm (señal de Cy5) para el control interno M13K07 (subconjunto "Muestra-M13"); y 465-510 nm (señal de FAM) para el plásmido de control positivo de amplificación (subconjunto "Muestra-FAM"). Se determinó el nivel de fondo de fluorescencia usando el análisis de punto de ajuste en caso de haber una señal de fluorescencia ambigua. Se consideró que una señal de fluorescencia de fondo aceptable era de < 1 unidad en la escala gráfica de amplificación. Cualquier señal de fluorescencia < 1 unidad se consideró dentro de un fondo aceptable y por lo tanto, negativa.

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Ejemplo 8: condiciones para una sesión de ensayo válida

Para que la sesión de ensayo se considere válida, han de cumplirse las siguientes condiciones. El control negativo de amplificación (NAC, es decir, agua) ha de ser negativo para la señal de fluorescencia en los tres canales. El control negativo de extracción (NEC, es decir, PBS) o el matraz de control negativo de cultivo ha de ser negativo para la señal de fluorescencia en el canal de [533 - 580] (es decir, la señal de VIC de la sonda de parvovirus de roedor), negativo para la señal de fluorescencia en el canal de [465-510] (es decir, señal de la sonda-FAM flag aintisentido del control positivo de amplificación [PAC]) y positivo para la señal de fluorescencia en el canal de [618 - 660] (es decir, señal de sonda-CY5 de M13K07). El pAc debe ser positivo para las señales de fluorescencia en los tres canales. El valor de Cp de M13K07 en el NEC se usó como referencia para evaluar la presencia de sustancia inhibidora en las muestras.

En caso de que la PCR se usase como un criterio de valoración para un artículo de ensayo de una etapa de cultivo celular con un control positivo de parvovirus de roedor, el control positivo ha de ser positivo para la señal de fluorescencia en el canal de [533-580] (es decir, señal de VIC de la sonda de parvovirus de roedor), positivo para la señal de fluorescencia en el canal de [618 - 660] (es decir, señal de sonda-CY5 de M13K07) y negativo para la señal de fluorescencia en el canal de [465-510] (es decir, sonda-FAM flag antisentido del PAC). Se espera que el valor de Cp de M13K07 en la muestra de control positivo del cultivo celular se encuentre a intervalos de 64 ciclos del valor de Cp de NEC-M13.

Para todas las reacciones de control que contienen plásmido PAC, las señales de fluorescencia han de ser positivas en los tres canales.

Ejemplo 9: condiciones para una sesión de ensayo inválida

Un ensayo se consideró inválido cuando se cumplen una cualquiera o más de las siguientes condiciones: (1) una curva de amplificación muy baja (< 1 unidad en la escala de fluorescencia) para el PAC, (2) se confirma un error determinante (error de la máquina, informático o humano), (3) el NAC era positivo para la amplificación en cualquiera de los tres canales, (4) el NEC era positivo para la amplificación en el canal de VIC [533-580], positivo para la amplificación en el canal de FAN [465-510] o negativo para la amplificación en el canal de Cy5 [618-660] y (5) el PAC era negativo para la señal de amplificación en cualquiera de los tres canales. Se llevó a cabo la investigación y reensayo de la muestra de ensayo siempre que se determine que el ensayo era inválido.

Ejemplo 10: condiciones para que una muestra negativa dé como resultado un ensayo válido

Han de cumplirse las siguientes condiciones para que un resultado de ensayo negativo para parvovirus sea válido. La muestra ha de ser positiva para la señal de amplificación de ADN de M13K07 en el canal de M13 [618 -660] dentro de un intervalo de valor de Cp esperado de Cp de NEC-M13 de 64 ciclos, lo que sugiere la ausencia de inhibidores de la PCR. La muestra ha de ser negativa para la señal de amplificación de ADN de parvovirus en el canal [533 - 580] de parvovirus. Una señal de fluorescencia por debajo de 1 unidad en la escala de fluorescencia, independientemente del valor de Cp se consideró dentro del nivel de fondo de fluorescencia aceptable y se comunicó como negativa para amplificación de ADN de parvovirus. La muestra ha de ser negativa para la señal de amplificación de PAC en el canal de [465-510] de Flag antisentido. Obsérvese que una señal de fluorescencia por debajo de 1 unidad en la escala de fluorescencia, independientemente del valor de Cp (generado automáticamente por el instrumento), se consideró dentro del nivel de fondo de fluorescencia aceptable y se comunicó como negativo para la amplificación de ADN de PAC-plásmido.

Ejemplo 11: condiciones para un resultado "sin muestra" en una sesión de ensayo válida

Se produce un resultado "sin muestra" cuando se cumplen una cualquiera o más de las siguientes condiciones. Siempre que la muestra sea negativa para la señal de amplificación de ADN de M13K07 en el canal de Cy5 [618 -660], negativa para la señal de amplificación de ADN de parvovirus en el canal de parvovirus de [533 - 580] y negativa para la amplificación de PAC en el canal de Flag FAM [465-510], se investigan la muestra o los reactivos de la PCR según el procedimiento operativo estándar. Esta condición sugiere la presencia de inhibidores de la PCR o la incapacidad de extraer adecuadamente los ácidos nucleicos. Pueden diluirse las muestras (1:2, 1:5, 1:10) para superar la inhibición. Un valor de Cp para la señal de fluorescencia en el canal de M13 [618660] que se encontrase fuera del intervalo (NEC M13 Cp 64 ciclos), indicó una inhibición parcial de la PCR o un error en la adición de fago y justifican la repetición del ensayo. La dilución de la muestra (1:2, 1:5, 1:10) puede tomarse en consideración para superar cualquier inhibición de la PCR. Cualquier evidencia de un error determinante o una señal de fluorescencia muy baja inesperada (< 1 unidad en la escala de fluorescencia) observada en el canal de M13 [618 - 660] que no permitiese una evaluación concluyente de la idoneidad de la muestra se consideró un "resultado sin muestra" y sugirió el fracaso durante la amplificación o extracción del ADN. Esto justifica la repetición del ensayo.

Ejemplo 12: condiciones para que una muestra fuera de especificación inicial (ioos) dé como resultado una sesión de ensayo válida

Una muestra se consideró iOOS cuando era (i) positiva para la señal de amplificación de ADN de parvovirus en el canal de parvovirus [533 - 580] (es decir, señal de VIC de la sonda de parvovirus de roedor) con una señal de fluorescencia por encima de 1 unidad en la escala de fluorescencia (para al menos uno de los dos pocilios replicados) y (ii) negativa para la amplificación de PAC en el canal de Flag FAM antisentido [465-510], lo que indica que no hay contaminación cruzada del PAC. Como resultado, el técnico tiene que (i) iniciar un GLIF (Formulario General de Investigación de Laboratorio), (ii) notificar al departamento que remitió la muestra a QC de virología para ensayo, (iii) iniciar un NOE, (iv) conservar el tubo de amplificación (congelación a -20 °C) para investigación adicional (por ejemplo, exploración o secuenciación de la secuencia de Flag) y (v) repetir el ensayo y reensayar la muestra.

Ejemplo 13: plan de repetición y reensayo

Siempre que el ensayo fuese inválido o un resultado de la muestra se considerase "sin resultado" se inició un ensayo repetido. Se llevó a cabo un reensayo para confirmar un evento de iOOS (es decir, la primera vez que un resultado de la muestra fue positivo para la señal de amplificación de ADN en el canal de parvovirus [533 - 580]). Los reensayos o los ensayos repetidos han de ejecutarse usando alícuotas de reactivo frescas (es decir, reactivos de la mezcla maestra, kit de extracción).

En caso de que NAC fuese positivo para fluorescencia en cualquier canal; se repetiría la sesión completa partiendo de la etapa de amplificación (PCR) usando las muestras de ADN ya purificadas con mezcla maestra recién preparada. En caso de que la NEC fuese negativa para la fluorescencia en el canal de M13 [618 - 660], se repite la sesión de ensayo completa partiendo de la etapa de extracción de ADN. En caso de que NEC fuese positivo para fluorescencia en el canal de parvovirus [533 - 580] o el canal de Flag antisentido [465-510], se repite la sesión de ensayo completa partiendo de la etapa de extracción de ADN. En caso de que PAC fuese negativo para fluorescencia en cualquier canal, se repite la sesión de ensayo desde la amplificación (etapa de PCR), usando las mismas muestras de ADN purificadas con mezcla maestra recién preparada.

Para aquellas muestras con un resultado "sin muestra", se repite la sesión de ensayo para la muestra afectada a partir de la etapa de extracción de ADN. Pueden diluirse las muestras (1:2, 1:5 o 1:10) (además de la muestra no diluida) antes de la extracción de ADN como parte de la investigación y emitir un proceso de resolución para demostrar la presencia de inhibidores.

Se lleva a cabo el reensayo para confirmar un resultado positivo inicial (iOOS) usando cuatro alícuotas separadas del siguiente modo: dos alícuotas del artículo de ensayo del evento de muestreo original (por ejemplo, un día después de la alimentación final) y dos alícuotas del artículo de ensayo de un evento de muestreo diferente (por ejemplo, dos días después de la alimentación final, en caso de ser posible) o de una bolsa de muestra diferente. En caso de que cualquier ensayo adicional de las 4 alícuotas diese como resultado una señal positiva sin evidencias de un error determinado (demostrado por medio de la investigación), se considera que el lote no cumple con el requisito de ausencia de parvovirus de roedor con material genómico del virus. Un ensayo de infectividad estaría justificado para la disposición final para dicho resultado positivo de la Q-PCR. Se usan células CHO-K1 como línea celular indicadora para determinar el estado de infección del ácido nucleico detectado.

Siempre que los resultados del reensayo sean negativos, se requiere un ensayo confirmatorio en un evento de muestreo diferente (por ejemplo, tres días después de la alimentación final) para confirmar la ausencia de material genómico de parvovirus de roedor.

Ejemplo 14: plan de reensayo para otros tipos de muestra con ioos

Otros tipos de muestra que incluyen, por ejemplo, material a granel no procesado, células al final de la producción, células al límite de edad in vitro y material de soja, que tienen un resultado positivo inicial (iOOS), se reensayan del siguiente modo usando cuatro alícuotas separadas:

Se reensayaron dos alícuotas del artículo de ensayo del contenedor de muestra original (es decir, por ejemplo, bolsa) y se reensayaron dos alícuotas de un contenedor de muestra diferente de acuerdo con procedimientos operativos estándar. Se inocularon células indicadoras CHO-K1 con una muestra alícuota del artículo de ensayo del contenedor de muestra original. Las células CHO-K1 indicadoras inoculadas se recogieron después de 1-3 días en cultivo según el procedimiento operativo estándar para determinar el estado infeccioso del ácido nucleico detectado. Puede usarse una curva patrón para la cuantificación del ácido nucleico reensayado.

Siempre que cualquiera de las pruebas PCR adicionales de las cuatro alícuotas sean positivas sin evidencias de un error determinado (demostrado mediante la investigación), el ensayo de infectividad determina la disposición final del artículo. Tras confirmarse el OOS inicial, pueden tomarse en consideración la secuenciación del ácido nucleico y la microscopia electrónica de transmisión (TEM) para identificar el microorganismo y descartar cualquier error de laboratorio.

Es necesario el ensayo de infectividad usando CHO-K1 como célula indicadora para el material sospechoso de estar contaminado para determinar el estado infeccioso del ácido nucleico detectado. Siempre que la investigación no logre soportar la posibilidad de infección por el virus parvovirus y las pruebas PCR adicionales de las cuatro alícuotas de artículo de ensayo y el cultivo de CHOK1 sean todas negativas, se considera que el lote cumple el requisito de ausencia

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un contaminante biológico en una muestra de ensayo que comprende las etapas de:

a) combinar ingredientes para preparar una mezcla de reacción, en donde los ingredientes comprenden (i) una muestra de ácido nucleico derivada de una muestra de ensayo, (ii) oligonucleótidos y (iii) una ADN polimerasa, en donde los oligonucleótidos comprenden:

- un cebador oligonucleotídico directo específico para amplificar una secuencia polinucleotídica de amplificación de la diana (TAP) del contaminante biológico;

- un cebador oligonucleotídico inverso específico para amplificar la secuencia de TAP del contaminante biológico;

- una sonda oligonucleotídica de detección específica para la secuencia de TAP del contaminante biológico; - una sonda de detección única (UDP) para una secuencia polinucleotídica de control de amplificación de plásmido (PACP) de un plásmido de control positivo de amplificación (PAC), conteniendo el plásmido la secuencia de TAP y una secuencia de PACP; y

- un conjunto de cebadores y una sonda para detectar polinucleótidos de control de extracción de ácidos nucleicos (NACP);

b) someter a la mezcla de reacción a reacción en cadena de la polimerasa (PCR);

c) durante la PCR, monitorizar la producción de (i) TAP), (ii) polinucleótidos de control de extracción de ácido nucleico (NACP) y PACP; y

d) comparar la producción de TAP con la producción de NACP y PACP, en donde la presencia de TAP, la presencia de NACP y la ausencia de PACP producidos durante la PCR significa que la muestra de ensayo contiene un contaminante biológico y no contiene un plásmido de control positivo de amplificación,

en donde se lleva a cabo una reacción PCR de control positivo en paralelo por separado con parámetros idénticos y con componentes idénticos, excepto por que está presente el plásmido de PAC en lugar de una muestra de ácido nucleico procedente de una muestra de ensayo,

en donde la presencia de TAP, NACP y PACP producidos durante la reacción PCR de control positivo significa que la PCR está funcionando adecuadamente y la ausencia de uno cualquiera o más de TAP, NACP o PACP significa que el control positivo ha fallado.

2. El método de la reivindicación 1, en donde se añade a la muestra fago M13K07.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho UDP comprende además un fluoróforo y un inactivador.

4. El método de la reivindicación 3, en donde dicho fluoróforo tiene una longitud de onda de excitación en cualquier punto entre 495 nm a 680 nm, inclusive y una longitud de onda de emisión en cualquier punto entre 515 nm a 710 nm, inclusive.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho NACP es un polinucleótido de bacteriófago M13.

6. El método de la reivindicación 4, en donde la sonda oligonucleotídica de detección específica para NACP comprende un colorante de cianina que tiene un máximo de absorbancia de aproximadamente 650 nm y un máximo de emisión de aproximadamente 670 nm.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende ejecutar una reacción PCR de control negativo idéntica, en donde el control negativo no comprende la muestra de ensayo y en donde

- en caso de que se produzcan TAP y PACP en la reacción del control negativo, se puede concluir que los reactivos de la PCR están contaminados con el plásmido de PAC,

- en caso de que se produzcan TAP pero no PACP, se puede concluir que los reactivos de la PCR están contaminados con un parvovirus,

- si la producción tanto de TAP como de PACP es negativa en la reacción de control negativo, la producción de TAP y PACP es positiva en la reacción de control positivo y la producción de TAP y opcionalmente la de NACP es positiva y la producción de PACP es negativa en la reacción de la muestra de ensayo, la muestra de ensayo está contaminada.