ES2806054T3 - Terapias de aumento génico de la degeneración retiniana causada por mutaciones en el gen PRPF31 - Google Patents

Abstract

Un vector de virus adeno-asociado de tipo 2 (AAV2) que comprende una secuencia que codifica PRPF31 humano, operativamente enlazado a un promotor que dirige la expresión en células de epitelio pigmentario retiniano (RPE), donde la secuencia de PRPF31 es o comprende, o codifica la misma proteína que nts 1319-2818 de SEQ ID NO:34.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias de aumento génico de la degeneración retiniana causada por mutaciones en el gen PRPF31

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a los métodos y composiciones para la terapia génica de la retinitis pigmentosa relacionada con mutaciones en el factor de procesamiento 31 del pre-ARNm (PRPF31).

Antecedentes

Las mutaciones en el factor de procesamiento 31 del pre-ARNm (PRPF31) provocan retinitis pigmentosa (RP) no sindrómica en humanos, una distrofia hereditaria de retina (IRD). Actualmente no está claro qué mecanismos, o qué tejidos, se ven afectados en presencia de mutaciones en estas proteínas expresadas de forma ubicua.

Resumen

La invención se define en las reivindicaciones. En el presente documento se describen los métodos y composiciones para la terapia génica de la retinitis pigmentosa relacionada con mutaciones en el factor de procesamiento 31 del pre-ARNm (PRPF31).

Así, se proporcionan en el presente documento vectores y composiciones para el uso en el tratamiento de la retinitis pigmentosa provocada por mutaciones en el PRPF31 en un sujeto humano, o para aumentar la expresión de PRPF31 en el ojo de un sujeto humano. Los métodos, que forman parte de la presente divulgación, incluyen la administración en el ojo del sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector viral adeno-asociado, por ejemplo, un vector de virus adeno-asociado de tipo 2 (AAV2), que comprende una secuencia que codifica el PRPF31 humano, operativamente enlazado a un promotor que dirige la expresión en células del epitelio pigmentario de la retina (RPE).

El promotor puede ser específico de R P E o puede ser un promotor general que dirige también la expresión en otros tipos celulares, por ejemplo, CASI o CAG. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de RPE65 o VMD2.

En algunas realizaciones, la secuencia de PRPF31 está optimizada por codones, por ejemplo, para la expresión en células humanas donde el sujeto es un humano. En algunas realizaciones, la secuencia de P r p F31 es o comprende, o codifica la misma proteína que, nts 1319-2818 de la SEQ ID NO:34.

En algunos aspectos de la divulgación, el vector se administra mediante inyección subretiniana.

En algunos aspectos de la divulgación, el vector comprende, o comprende una secuencia que codifica, un polipéptido de cápside de AAV descrito en el documento WO 2015054653.

En el presente documento también se proporcionan vectores virales adeno-asociados, por ejemplo, vectores de virus adeno-asociados de tipo 2 (AAV2) que comprenden una secuencia que codifica PRPF31 humano, operativamente enlazado a un promotor que dirige la expresión en células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). El promotor puede ser específico de R PE o puede ser un promotor general que dirige también la expresión en otros tipos celulares, por ejemplo, CASI o CAG. En algunas realizaciones, el promotor es un promotor de RPE65 o VMD2. En algunas realizaciones, la secuencia de PRPF31 está optimizada por codones, por ejemplo, para la expresión en células humanas. También se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden el vector, preferentemente formuladas para la administración vía inyección subretiniana.

También se prevé aquí el uso de ácidos nucleicos, los vectores y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que comúnmente comprende un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Se describen los métodos y materiales para el uso en la presente invención; también pueden utilizarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no pretenden ser restrictivos. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluyendo las definiciones.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras, así como a partir de las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

Figuras 1A-F. Inhibición de fagocitosis en ratones mutantes de Prpf. Se establecieron cultivos primarios de epitelio pigmentario de la retina (R PE ) de ratones mutantes de Prpf de 9-10 días de edad y controles de sus camadas, después se expusieron con segmentos externos de fotorreceptores porcinos marcados con FITC y núcleos marcados con DAPI (azul). (A) Representación cualitativa de células de R PE primarias (tinción de DAPI azul de núcleos) de tipo salvaje (WT) o ratones mutantes (MUT) de Prpf3T494M/T494M, Prpf8H2309P/H2309P, Prpf31 /-. Se observó una diferencia en la captación de POS entre los mutantes y los controles. (B) El análisis cuantitativo de la ratio fagocítica demuestra una disminución significativa en la fagocitosis en los ratones mutantes (MUT) en comparación con la camada de tipo salvaje (WT) para las 3 cepas de ratón mutante tal como se indica (* P < 0.05, N = 3-5). (B) Se compararon las relaciones de unión e internalización de POS entre ratones de Prpf31+/- (MUT) comparados con controles de tipo salvaje (WT) mostrando una disminución significativa en la unión (Bind.), pero ningún cambio significativo en la internalización (Intern.) de POS en ratones mutantes (* P < 0.05, N = 2-5). (D) Una línea estable de atenuación mediada por ARNsh de PRPF31 en células ARPE-19. También se observó una diferencia en la captación de POS entre las células ARPE-19 transfectadas con ARNsh de control y las células ARPE-19 transfectadas con ARNsh de anti-PRPF31. (E) El ensayo de viabilidad celular para determinar el efecto de la atenuación de PRPF31 en células ARPE-19 muestra que no hay diferencias significativas en el crecimiento o viabilidad celular después de la atenuación de ARNsh de PRPF31 con respecto al control no focalizado (P > 0,05, N = 6). (F) La atenuación mediada por ARNsh de PRPF31 en la línea celular ARPE-19 humana también inhibe la fagocitosis significativamente tal como se muestra por el número disminuido de POS por célula en comparación con construcciones no focalizadas (NTC) (* P < 0,05, N = 3). Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figuras 2A-C. La ritmicidad diurna de la fagocitosis en ratones mutantes de Prpf se ve alterada. Se sometió a ensayo la fagocitosis in vivo a las 2 horas antes de la aparición de luz (-2), a la aparición de luz (0) y 2, 4 y 6 (+2, 4, 6 ) horas después de la aparición de luz. (A, B) Se muestran imágenes representativas a las 2 (pico fagocítico) y 8 (fuera del pico fagocítico) horas después de la aparición de luz tal como se indica. RPE : epitelio pigmentario de la retina, OS: segmentos externos de fotorreceptores, Ch: coroide. (A) Se realizó la detección de fagosomas tempranos en ratones mutantes de Prpf3 y Prpf8 utilizando microscopía de electrones y recuento de fagosomas que se encontraban 1) en el citoplasma del R PE y 2) contenidos en la estructura lamelar visible (puntas de flecha negras) Barra de escala de 2 mm. (B) Se determinó el ritmo diurno de los ratones Prpf31+/- utilizando tinción inmunofluorescente por rodopsina (Ig-AlexaFluor488) y la detección de fagosomas (puntas de flecha blancas) localizados en la capa celular del R PE (núcleos con tinción DAPI) por la totalidad de 100 mm de retina intacta. Barra de escala de 20 mm. (C) La cuantificación de fagosomas por todos los puntos de tiempo demuestra la significativa alteración uniforme del estallido fagocítico en todos los ratones mutantes de Prpf (* P < 0,05, N = 2 para mutantes de Prpf3 y Prpf8 y N = 3-5 para ratones mutantes de Prpf31). Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figuras 3A-B. Alteraciones en adhesión retiniana en ratones mutantes de Prpf en el punto de tiempo pico. Se determinó la resistencia adhesiva entre microvellosidades apicales de R PE y POS cuantificando la cantidad de pigmentos o proteínas de R PE que se adhieren a la retina neural, con respecto al control de WT. (A) La cuantificación de melanina demuestra que disminuye la adhesión en los tres ratones mutantes en el punto de tiempo pico 3,5 horas después de la aparición de luz y en ratones Prpf8H2309P/H2309P en el punto de tiempo fuera del pico (* P <0,05, N = 3-7). (B) Las mediciones cuantitativas de proteínas RPE65 en inmunotransferencias confirman los hallazgos de melanina en los tres ratones mutantes en el punto de tiempo pico, sin embargo, solo se observa una tendencia de disminución en la adhesión en los puntos fuera del pico en ratones mutantes de Prpf8 (* P <0,05, N = 4-7). Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figuras 4A-C. La localización y expresión de algunos marcadores de adhesión y fagocitosis se ven alterados en ratones mutantes de Prpf3 y Prpf8 Imágenes representativas de la expresión y localización de (A) subunidades de receptores de las integrinas av y p5 y ligando Mfg-E8 asociado, (B) proteína de señalización intracelular FAK y (C) receptores merTK y ligandos de Gas6 y Proteína S asociados en criosecciones retinianas de control de tipo salvaje (WT) así como mutantes de Prpf3 y Prpf8 tal como se indica. Las imágenes de las secciones sometidas a ensayo con IgG (IgG) no inmunológica se incluyen para cada antígeno. RPE : epitelio pigmentario de la retina, OS: segmentos externos de fotorreceptores, ONL: capa nuclear externa. Se observó la localización de integrina p5 en el lado basal del R PE tanto ratones mutantes de Prpf3 como de Prpf8. Además, no se localizó correctamente FAK en ratones mutantes de Prpf8 en el lado basal del RPE . Cada proteína de interés se tiñó con Ig-AlexaFluor488 y los núcleos se tiñeron con DAPI. Barra de escala de 40 mm.

Figuras 5A-C. La localización y expresión de algunos marcadores de adhesión y fagocitosis se ven alterados en ratones mutantes de Prpf31. Imágenes representativas de la expresión y localización de (A) subunidades de receptores de las integrinas av y p5 y ligando Mfg-E8 asociado, (B) proteína de señalización intracelular FAK y (C) receptores merTK y ligandos de Gas6 y Proteína S asociados o IgG (IgG) no inmunológica en secciones de parafina retiniana de control de tipo salvaje (WT) así como de mutante de Prpf31 como se indica. RPE : epitelio pigmentario de la retina, OS: segmentos externos de fotorreceptores, ONL: capa nuclear externa. El cambio más notable en ratones mutantes de Prpf31 es la incorrecta localización de integrina p5 en el lado basal del RPE , mientras que la localización de MerTK también se ve alterada. Cada proteína de interés se tiñó con IgG-AlexaFluor488 y los núcleos se tiñeron con DAPI. Barra de escala de 20 mm.

Figura 6. Secuencia de líneas celulares hiPSC de PRPF31+/' y ARPE-19 generadas por edición genómica. El modelo génico para PRPF31 se muestra anteriormente, con detalle de secuencia en los exones 6-7 para las tres líneas celulares de ejemplo que se muestran a continuación. La línea celular hiPSC desactivada tiene una supresión de 4pb heterocigótica (las bases suprimidas se muestran con superlíneas en la secuencia normal), lo cual da como resultado el desplazamiento del marco de lectura (aminoácidos subrayados) Las líneas celulares ARPE-19 desactivadas representadas tienen una supresión de 4pb o una sola inserción de base lo cual también da como resultado desplazamientos del marco y alelos nulos.

Figura 7. Captación de POS relativa después del tratamiento con AAV.CASI.PRPF31. Se transdujeron células ARPE-19 de PRPF 31 con genoma editado (GE31) con AAV.CASI.PRPF31 en MOI de 0, 10.000 y 15.000 durante 3 días. Posteriormente, se incubaron las células con FITC-POS durante 1 hora y se sometieron a recuento las células positivas de FITC mediante citometría de flujo. *P<0,05.

Descripción detallada

La invención se define en las reivindicaciones. Las mutaciones en genes que codifican factores de ayuste de ARN son la secunda causa más común de la forma dominante del trastorno de ceguera de la retinitis pigmentosa (RP) y, de este modo, son una causa importante de pérdida de visión (Hartong et al., Lancet. 2006;368:1795-809; Daiger et al., Archives Ophthalmology. 2007;125:151-8; Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science.

2013;54:6255-61. PMCID: 3778873). Los factores de ayuste afectados, factor de procesamiento de pre-ARNm (PRPF) 3, PRPF4, P R P F6 , P R P F8, PRPF31 y SNRNP200 son componentes altamente conservados del ayustosoma, el complejo que escinde intrones de transcripciones de ARN nacientes para generar ARNm maduros (McKie et al., Human Molecular Genetics. 2001;10:1555-62; Vithana et al., Molecular Cell. 2001;8:375-81; Chakarova et al., Human Molecular Genetics. 2002;11:87-92; Keen et al., European Journal Human Genetics. 2002;10:245-9; Nilsen, Bioessays.

2003;25:1147-9; Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006;47:4579-88; Zhao et al., American Journal Human Genetics. 2009;85:617-27; Tanackovic et al., American Journa1Human Genetics. 2011;88:643-9; Chen et al., Human Molecular Genetics. 2014;23:2926-39.). Las mutaciones en el gen de PRPF31 son la causa más común de factor de ayuste de ARN de RP, y se estima en 2.400 a 8.500 individuos afectados en los EE.UU . y de 55.000 a 193.000 personas en todo el mundo (Daiger et al., Archives Ophthalmology. 2007;125:151-8; Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6255-61. PMCID: 3778873). Puesto que el ayuste de ARN se requiere en todas las células, no queda claro cómo las mutaciones en estas proteínas ubicuas llevan a la enfermedad específica de la retina.

Para comprender el mecanismo(s) mediante el cual cuales las mutaciones en los factores de ayuste de ARN provocan degeneración retiniana, se estudiaron los fenotipos de ratones mutantes de Prpf3, Prpf8 y Prpf31 Se identificaron defectos autónomos de células en la función celular del epitelio pigmentario de la retina (R PE ) en ratones focalizados en genes; sin embargo, las diferencias génicas y fenotípicas en la enfermedad entre los modelos de ratón y la afección humana hace que las conclusiones extraídas en ratones dificulten potencialmente traducirlo a los humanos.

Hay pruebas de que las mutaciones en el PRPF31 causan la enfermedad por medio de haploinsuficiencia y, por tanto, que esta forma de RP dominante es susceptible de tratamiento con terapia de aumento génico. Muchas de las mutaciones identificadas en PRPF31 son o bien grandes supresiones cromosómicas o son mutaciones sin sentido y desplazamiento del marco de lectura que llevan a codones de terminación prematuros que experimentan la desintegración de ARNm mediado por sin sentido y dan como resultado alelos nulos (Vithana et al., Molecular Cell.

2001;8:375-81; Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006;47:4579-88.; Wang et al., American Journal Medical Genetics A. 2003;121A:235-9; Xia et al., Molecular Vision. 2004;10:361-5; Sato et al., American Journal Ophthalmology. 2005;140:537-40; Abu-Safieh et al., MolVis. 2006;12:384-8; Rivolta et al., Human Mutation.

2006;27:644-53; Waseem et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2007;48:1330-4; Rio Frio et al., Human Mutation. 2009;30:1340-7. PMCID: 2753193; Rose et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science.

2011;52:6597-603; Saini et al., Experimental Eye Research. 2012;104:82-8). De este modo, se piensa que la degeneración retiniana asociada a PRPF31 está provocada por haploinsuficiencia. Acorde con esta hipótesis, el nivel de expresión de PRPF31 del alelo de tipo salvaje se corresponde con la gravedad de la enfermedad en pacientes con mutaciones en el PRPF31 (Rio et al., Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31; Vithana et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4204-9; McGee et al., American Journa1Human Genetics. 1997;61:1059-66). Se ha informado de dos mecanismos para contribuir a la regulación de la expresión del alelo de PRPF31 de tipo salvaje. Primero, CNOT3 regula la expresión de PRPF31 vía represión transcripcional; en portadores asintomáticos de mutaciones de PRPF31, CNOT3 se expresa a bajos niveles, permitiendo producir cantidades mayores de transcripciones de PRPF31 de tipo salvaje y evitando la manifestación de degeneración retiniana (Venturini et al., PLoS genetics. 2012;8:e1003040. PMCID: 3493449; Rose et al., Annals Human Genetics. 2013). En segundo lugar, MSR1 se ha identificado como un elemento regulador de cis en sentido ascendente del PRPF31. De este modo, la variación genética ha demostrado que el aumento de la expresión genética de PRPF31 puede reducir o eliminar la pérdida de visión en este trastorno.

Tal como se describe aquí, los presentes inventores han identificado las células de R PE como las células primarias afectadas en el factor de ayuste de ARN de RP; esto genera una oportunidad para avanzar en el desarrollo de la terapia de aumento génico para enfermedades causadas por mutaciones en el PRPF31 (ver Ejemplo 1). Para conseguir este objetivo, aquí se describen vectores de AAV para expresar PRPF31 humano, que pueden utilizarse para mejorar el fenotipo en sujetos humanos.

La secuencia de PRPF31 humano, también conocida como ribonucleoproteína pequeña nuclear U4/U6 de Prp31, está disponible en el GenBank con los N.° de acceso NM_015629.3 (ácido nucleico) y NP_056444.3 (Proteína). Los sujetos que tienen RP asociada con mutaciones en el PRPF31 pueden ser identificados mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por secuenciación del gen de PRPF31 (NG_009759.1, Rango: 5001 a 21361) o NC_000019.10 Referencia GRCh38.p2 Conjunto Primario, Rango 54115376 a 54131719). Se ha identificado una gran cantidad de mutaciones en individuos afectados; ver, por ejemplo, Villanueva et al. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2014; Dong et al. Mol Vis, 2013; Lu F, et al. PLoS One, 2013; Utz et al. Ophthalmic Genet, 2013; and Xu F, et al. Mol Vis, 2012; Saini et al., Exp Eye Res. 2012 Nov;104:82-8; Rose et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Aug 22;52(9):6597-603; Audo et al., BMC Med Genet. 2010 Oct 12;11:145; and Tanackovic and Rivolta, Ophthalmic Genet. 2009 Jun;30(2):76-83.

De este modo, en el presente documento se describen vectores de expresión dirigidos para la transfección y expresión in vivo de un polinucleótido que codifica un polipéptido de PPF31 tal como se describe aquí, en células de RPE , por ejemplo, primariamente o solo en células de RPE. Las construcciones de expresiones de tales componentes pueden administrarse en cualquier vehículo efectivo, por ejemplo, cualquier formulación o composición capaz de suministrar eficazmente el gen del componente en células in vivo. Entre los enfoques se incluye la inserción del gen en vectores virales, incluyendo retrovirus recombinantes, adenovirus, virus adeno-asociados, lentivirus y virus del herpes simple 1, alfavirus, virus, vacuna o plásmidos bacterianos recombinantes o eucariotas; los vectores virales preferentes son el virus adeno-asociado de tipo 2 (AAV2). Los vectores virales transfectan células directamente; se puede administrar ADN de plásmido desnudo o con la ayuda de, por ejemplo, liposomas catiónicos (lipofectamina) o derivatizado (por ejemplo, anticuerpo conjugado), dendrímeros catiónicos, vectores inorgánicos (por ejemplo, magnetofección de óxido de hierro), lipidoides, péptidos penetrantes celulares, polímeros de ciclodextrina (CDP), conjugados de polilisina, gramacidina S, envolturas virales artificiales u otros de tales como vehículos intracelulares, así como inyección directa de la construcción genética o precipitación con CaPO4 realizada in vivo.

Un enfoque ejemplar para la introducción in vivo de ácido nucleico en una célula es mediante el uso de un vector viral que contiene ácido nucleico, por ejemplo, un ADNc. La infección de células con un vector viral tiene la ventaja de que una gran proporción de las células focalizadas puede recibir el ácido nucleico. Además, las moléculas codificadas dentro del vector viral, por ejemplo, por ADNc contenido en el vector viral, se expresan eficientemente en células que han recogido ácido nucleico del vector viral.

Los vectores virales pueden utilizarse como un sistema de suministro génico recombinante para la transferencia de genes exógenos in vivo, particularmente en seres humanos. Estos vectores proporcionan un suministro eficiente de genes en las células y, en algunos casos, los ácidos nucleicos transfectados se integran de forma estable en el ADN cromosómico del huésped. Los protocolos para producir virus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con tales virus pueden encontrarse en Ausubel, et al., eds., Gene Therapy Protocols Volume 1: Production and In Vivo Applications of Gene Transfer Vectors, Humana Press, (2008), págs. 1-32 y otros manuales de laboratorio estándar.

Un sistema de vector viral preferente útil para el suministro de ácidos nucleicos es el virus adeno-asociado (AAV). El virus adeno-asociado es un virus defectivo de origen natural que requiere otro virus, como un adenovirus o un virus del herpes, como virus asistente para su eficaz replicación y un ciclo de vida productivo. (Para una revisión, véase Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro and Immunol. 158:97-129 (1992)). Los vectores de AAV transducen eficientemente diversos tipos de células y pueden producir la expresión a largo plazo de transgenes in vivo. Aunque los genomas de vector de AAV pueden persistir dentro de células como episomas, se ha observado la integración del vector (por ejemplo, Deyle and Russell, Curr Opin Mol Ther. agosto de 2009; 11(4): 442-447; Asokan et al., Mol Ther. abril de 2012; 20(4): 699-708; Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992); Samulski et al., J . Virol.

63:3822-3828 (1989); and McLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973 (1989)). Los vectores de AAV, en particular, AAV2, se han utilizado ampliamente para el aumento o sustitución génica y han demostrado eficacia terapéutica en una serie de modelos animales, así como en la clínica; ver por ej., Mingozzi and High, Nature Reviews Genetics 12, 341-355 (2011); Deyle and Russell, Curr Opin Mol Ther. agosto de 2009; 11(4): 442-447; Asokan et al., Mol Ther. abril de 2012; 20(4): 699-708. Los vectores de AAV que contienen unos escasos 300 pares base de AAV pueden empaquetarse y pueden producir la expresión de proteínas recombinantes. El espacio para ADN exógeno se ve limitado a aproximadamente 4,5 kb. Por ejemplo, un vector de AAV1, 2, 4, 5, o 8 puede utilizarse para introducir ADN en células de PE (como las descritas en Maguire et al. (2008). Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2240-2248. Maguire et al. (2009). Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 374: 1597-1605; Bainbridge et al. (2008). Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 358: 2231-2239; Hauswirth et al. (2008). Treatment of leber congenital amaurosis due to RPE65 mutations by ocular subretinal injection of adenoassociated virus gene vector: short-term results of a phase I trial. Hum Gene Ther 19: 979-990; Cideciyan et al. (2008). Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proc Natl Acad Sci USA 105: 15112-15117. Cideciyan et al. (2009). Vision 1 year after gene therapy for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med 361: 725-727; Simonelli et al. (2010). Gene therapy for Leber's congenital amaurosis is safe and effective through 1.5 years after vector administration. Mol Ther 18: 643-650; Acland, et al. (2005). Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Mol Ther 12: 1072-1082; Le Meur et al. (2007). Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther 14: 292-303; Stieger et al. (2008). Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Mol Ther 16: 916-923; and Vandenberghe et al. (2011). Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Sci Transl Med 3: 88ra54). En algunas realizaciones, el vector de AAV puede incluir (o incluye una secuencia que codifica) un polipéptido de cápside de AAV descrito en el documento WO 2015054653; por ejemplo, una partícula de virus que comprende un polipéptido de cápside de AAV que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 y 17 del documento WO 2015054653 y una secuencia que codifica PRPF31 como en el presente documento. En algunas realizaciones, el polipéptido de cápside de AAV es como se muestra en la Tabla 1 del documento WO 2015054653, reproducida aquí:

En algunas realizaciones, el polipéptido de cápside de AAV es un polipéptido de Anc80, por ej., un polipéptido ejemplar que se muestra en la SEQ ID NO: 19 (Anc80L27); SEQ ID NO: 20 (Anc80L59); SEQ ID NO: 21 (Anc80L60); SEQ ID NO: 22 (Anc80L62); SEQ ID NO: 23 (Anc80L65); SEQ ID NO: 24 (Anc80L33); SEQ ID NO: 25 (Anc80L36) y SEQ ID NO:26 (Anc80L44).

Se ha introducido una variedad de ácidos nucleicos en distintos tipos de células utilizando vectores de AAV (ver por ejemplo, las referencias citadas anteriormente y las citadas en Asokan et al., Molecular Therapy (2012); 204, 699-708; y Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984); Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985); Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988); Tratschin et al., J . Virol. 51:611-619 (1984); y Flotte et al., J . Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993).

También se pueden utilizar retrovirus. El desarrollo de líneas celulares especializadas (denominadas "células empaquetadoras") que producen solo retrovirus sin capacidad de replicación ha aumentado la utilidad de retrovirus para la terapia génica y se caracterizan retrovirus defectivos para el uso en la trasferencia genética para fines de terapia génica (para una revisión, ver Katz et al., Human Gene Therapy 24:914 (2013)). Un retrovirus sin capacidad de replicación puede empaquetarse en viriones, que pueden utilizarse para infectar células diana a través del uso de un virus asistente por técnicas estándar. Ejemplos de retrovirus adecuados incluyen pLJ, pZIP, pWE y pEM que son conocidos para los expertos en la técnica. Ejemplos de líneas de virus empaquetadores adecuadas para preparar tanto sistemas retrovirales ecotrópicos como anfotrópicos incluyen fC rip , fC re , f 2 y fA m . Se han utilizado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células distintos, incluyendo células epiteliales, in vitro y/o in vivo (ver por ejemplo, Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398; Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805; van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644; Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115; Patente americana N.° 4,868,116; Patente americana N.° 4,980,286; Solicitud PCT WO 89/07136; Solicitud PCT WO 89/02468; Solicitud PCT WO 89/05345; y Solicitud PCT WO 92/07573).

Otro sistema de suministro génico viral útil en los presentes métodos utiliza vectores derivados de adenovirus. El genoma de un adenovirus puede manipularse, de modo que codifica y expresa un producto fénico de interés, pero está inactivado en términos de su capacidad de replicación en un ciclo de vida viral lítico normal. Ver por ejemplo, Berkner et al., BioTechniques 6:616 (1988); Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); y Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992). Los expertos en la técnica conocen bien los vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus Ad tipo 5 dl324 o de otras cepas de adenovirus (por ej., Ad2, Ad3, Ad7 etc.). Los adenovirus recombinantes pueden ser ventajosos en determinadas circunstancias, ya que no son capaces de infectar células no divisorias y pueden utilizarse para infectar una amplia variedad de tipos de células, incluidas las células epiteliales (Rosenfeld et al., (1992) antes citado). Además, la partícula del virus es relativamente estable y susceptible de purificación y concentración y, como antes, puede modificarse para afectar el espectro de infectividad. Adicionalmente, ADN adenoviral introducido (y ADN extraño contenido en el mismo) no está integrado en el genoma de una célula huésped, sino que se mantiene episomal evitando, de este modo, potenciales problemas que se pueden producir como resultado de mutagénesis por inserción in situ, en situaciones en las que el ADN introducido llega a integrarse en el genoma huésped (por ej., ADN retroviral). Aún más, la capacidad de transporte del genoma adenoviral para el ADN extraño es grande (hasta 8 kilobases) con respecto a otros vectores suministro génico (Berkner et al., anteriormente citado; Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267 (1986).

En algunos aspectos de la divulgación, un gen que codifica PRPF31 está atrapado en liposomas que portan cargas positivas sobre su superficie (por ej., lipofectinas), que pueden marcarse con anticuerpos contra antígenos de superficie celular del tejido diana (Mizuno et al., No Shinkei Geka 20:547-551 (1992); publicación PCT WO91/06309; solicitud de patente japonesa 1047381; y publicación de patente europea EP-A-43075).

En contextos clínicos, los sistemas de suministro génico para el gen terapéutico se pueden introducir en un sujeto mediante cualquiera de un número de métodos, cada uno de los cuales resulta familiar en la técnica. Aunque se pueden utilizar otros métodos, en algunos aspectos de la divulgación, la ruta de elección de suministro de los vectores de terapia génica en la retina es vía inyección subretiniana. Esto proporciona acceso al R PE y a las células fotorreceptoras de la retina. Distintos serotipos de AAV han demostrado transducir estas poblaciones celulares eficazmente tras la inyección subretiniana en estudios con animales (Vandenberghe et al., PLoS One. 2013;8:e53463. PMCID: 3559681; Vandenberghe and Auricchio, Gene Therapy. 2012;19:162-8; Vandenberghe et al., Science translational medicine. 2011;3:88ra54; Dinculescu et al., HumGene Ther. 2005;16:649-63; Boye et al., Mol Ther.

2013;21:509-19; Alexander and Hauswirth, Adv Exp Med Biol. 2008;613:121-8). El enfoque de inyección subretiniana se está utilizando en los ensayos clínicos en curso de terapia de aumento fénico para la degeneración retiniana provocada por mutaciones en los genes RPE65 y CHM de enfermedad genética (Maguire et al., New England Journal of Medicine. 2008;358:2240-8; Bainbridge et al., New England Journal of Medicine. 2008;358:2231-9; Cideciyan et al., Proceedings National Academy Sciences USA. 2008;105:15112-7; Maguire et al., Lancet. 2009;374:1597-605; Jacobson et al., Archives Ophthalmology. 2012;130:9-24; Bennett et al., Science translational medicine.

2012;4:120ra15; MacLaren et al., Lancet. 2014;383:1129-37). Se pueden realizar inyecciones subretinianas utilizando un enfoque quirúrgico estándar (por ej., como se describe en Maguire et al., 2008 anteriormente citado; Bainbridge et al., 2008 antes citado; Cideciyan et al., 2008 supra; MacLaren et al., 2014 antes citado).

La preparación farmacéutica de la construcción de terapia génica puede consistir esencialmente en el sistema de suministro fénico (vector viral y cualquier agente asociado como virus asistentes, proteínas, lípidos y otros) en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la cual está incrustado el vehículo de suministro génico. De modo alternativo, cuando el sistema de suministro génico completo puede producirse de forma intacta a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede comprender una o más células, que producen el sistema de suministro génico.

Ejemplos

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplo 1. Mutaciones en factores de procesamiento 3, 8 y 31 de Pre-ARNm provocan disfunción del epitelio pigmentario de la retina

Introducción

El ayustosoma es una macromolécula de ribonucleoproteína dinámica y ubicua requerida para eliminar intrones de un ARN naciente1. Las mutaciones que provocan retinitis pigmentosa (RP) dominante autosómica han sido identificadas en 6 genes que codifican proteínas (PRPF3 , PRPF4, P R P F6 , P R P F8, PRPF31 y SNRNP200), que se encuentran en el U4/U6.U5 tri-snRNP2. Además, las mutaciones en estos genes son la segunda causa más común de RP dominante3' 5 Definida por una pérdida de visión progresiva y de tardía aparición, la RP es la forma más común de degeneración retiniana heredada, afectando aproximadamente a 1:3500 individuos en el mundo6. Es genéticamente heterogénea y muestra los tres modos de herencia Mendeliana7. Los tejidos afectados incluyen la retina neural, epitelio pigmentario retiniano (R PE ) y coroide4. Puesto que los componentes del ayustosoma se expresan de forma ubicua en cada tipo de célula, no está claro por qué las mutaciones en estos factores de ayuste provocan solo RP no sindrómica. Además, el tipo(s) de célula específica en la retina afectada por esta mutación aún no se ha identificado.

Hemos notificado previamente la caracterización de modelos de ratón del factor de ayuste de ARN de RP debido a mutaciones en los genes PRPF3, PRPF8 y PRPF31, incluyendo ratones desactivados de Prpf3, Prpf8 y Prpf31, así como ratones de desactivación de Prpf3-T494My Prpf8-H2309P8-9. En base a los resultados de los estudios de estos modelos de ratón y datos de estudios con seres humanos, se cree que las mutaciones en PRPF3 y PRPF8 provocan la enfermedad dominante mediante mecanismos de ganancia de función o de dominante negativo, mientras que las mutaciones en PRPF31 provocan enfermedad vía haploinsuficiencia9-11. Los cambios morfológicos en el R PE de envejecimiento, pero no la retina neural, de los ratones de desactivación de Prpf3-T494M y Prpf8-H2309P y ratones de Prpf31+/- fueron de particular interés, en los que observamos la pérdida de despliegues basales, la formación de depósitos basales por debajo del R PE y vacuolización en el citoplasma. Estos cambios degenerativos del R PE se observaron en ratones de Prpf3T494M/+, Prpf8H2309P/+ y Prpf31+/- heterocigóticos y fueron más pronunciados en ratones de desactivación de Prpf3T494M/T494M y Prpf8H2309P/H2309P homocigóticos8.

El R PE es vital para el bienestar general de la retina12. La eliminación diaria de extremidades de los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) utilizados es un proceso altamente coordinado y la fagocitosis de POS desprendidos se produce sobre una base rítmica13. Algunos receptores implicados en la fagocitosis de POS también participan en la adhesión retiniana general y su ritmo fisiológico14. La fagocitosis y adhesión retiniana pico se producen aproximadamente 2 y 3,5 horas después de la aparición de luz, respectivamente, y se encuentran a sus niveles mínimos aproximadamente 10 horas después13, 1514 El R PE es un macrófago profesional en el que la unión e intemalización de un sustrato está coordinada por receptores en la célula y ligandos del R PE en la matriz interfotorreceptora que une la célula del R PE y fosfatidilserinas en la superficie de los POS, respectivamente16. Algunos receptores son comunes entre la fagocitosis y la adhesión, aunque utilizan distintos ligandos13, 14, 15, 17 Una pérdida de regulación de cualquiera de estos componentes importantes de la fagocitosis lleva a la pérdida de visión en la enfermedad humana, así como en modelos de roedores13, 18-20.

Aquí damos a conocer resultados de estudios de fagocitosis y adhesión de R PE de los modelos de ratón de Prpf3T494M/T494M, Prpf8H2309P/H2309P y Prpf31+I-. Específicamente, hemos medido la fagocitosis en cultivos de RPE primarios a partir de ratones de 2 semanas de edad. Los resultados muestran una deficiencia en fagocitosis, lo cual también demostramos en la línea de células R PE humana, ARPE-19, después de la desactivación mediada por ARNsh de PRPF31. Además, se detectó in vivo una pérdida de la ritmicidad diurna de fagocitosis y adhesión. De forma interesante, se modifica la localización de los factores clave conocidos por estar implicados en la fagocitosis por células de RPE.

Concluimos que el R PE es probablemente el sitio primario de patogénesis en el factor de ayuste de ARN en RP.

Materiales y métodos

Animales

Se ha realizado una investigación en animales según los protocolos aprobados por los Comités Institucionales del Cuidado y Uso de Animales en la Eye and Ear Infirmary de Massachusetts y el Comité Ético de Experimentación Animal de Charles Darwin de la Université Pierre et Marie Curie-Paris. Se empleó un número igual de ratones macho y hembra en cada uno de los siguientes experimentos.

Cultivo de células de R PE primario

Se aislaron células de R PE de animales de 9-10 días de edad tal como se describe13. En resumen, se procesaron copas oculares con 2 mg/ml de hialuronidasa (Sigma) y la retina neural se desprendió de la copa ocular. Se desprendió el R PE de la membrana de Bruch tras su procesamiento con 1 mg/ml de tripsina (Invitrogen) y se cultivó sobre cubreobjetos de cristal de 5 mm. Las células se cultivaron en confluencia durante 5-10 en DMEM con un 10 de FBS a 37 °C, CO2 al 5%.

Cultivo celular de macrófagos peritoneales primarios

Se aislaron macrófagos peritoneales residentes tal como se ha descrito anteriormente21. Los ratones sometidos a eutanasia se fijaron sobre una tabla de disección y se humectó el pelaje utilizando etanol al 70% en una campana de flujo horizontal. Se separó la piel delicadamente de la pared peritoneal utilizando fórceps y tijeras. Se inyectaron 5 ml de PBS estéril en la cavidad abdominal y se masajeó el vientre o se agitó cuidadosamente el cuerpo entero durante 20-30 segundos. Se recogió PBS lentamente de la cavidad y se agruparon muestras de 2 a 3 animales distintos. Se centrifugaron las células durante 10 min a 300 g y se resuspendieron en 1 ml de RPMI con FBS al 10%. Se cultivaron las células en placas de 96 pocillos a 100.000-200.000 células por pocillo y se dejaron adherir durante 2 horas. Se agitaron las placas y se enjuagaron los pocillos una vez utilizando PBS estéril. Las células se mantuvieron en el medio durante 2-3 días a 37 °C, CO2 al 5%.

Generación de líneas celulares ARPE-19 y J774.1 de desactivación de ARNsh-PRPF31 y ensayo de viabilidad celular

Se diseñaron tres ARNsh a PRPF31 humano o Prpf31 de ratón y se clonaron en el vector pCAG-mir30 que contenía un gen de resistencia a la puromicina. Las secuencias para estos tres ARNsh son las siguientes: ARNsh1 humano -5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCAGATGAGCTCTTAGCTGATTAGTGAAGCCACAGATGTAATCAGCTAAGAGCTC ATCTGCCTGCCTACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:27), ARNsh2 humano - 5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGAACCCAACCTGTCCATCATTATTAGT GAAGCCACAGATGTAATAAT GAT GGACAGGT T GGGT G TG CCT ACT GCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:28) y ARNsh 3 humano - 5'-TG CTG TTGACAGTGAGCGAGCTGAGTTCCTCAAGGTCAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGACCTTGAGGAA CTCAGCCTGCCTACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:29); ARNsh1 de ratón - 5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCAGTCAAGAGCATTGCCAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGGCAATGCTCTT GACTGAATGCCTACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:30), ARNsh2 de ratón - 5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGACCTGTCTGGCTTCTCTTCTACTAGTGAAGCCACAGATGTAGTAGAAGAGAAGCCA GACAGGGTGCCTACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:31) y ARNsh3 de ratón - 5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCCGAGTTCCTCAAGGTCAAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTTGACCTTGAGGAA CTCGGCCTGCCTACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:32). También clonamos un ARNsh en proteína de fluorescencia verde en este vector como un control no dirigido (5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGCTCTCCGAACGTGTATCACGTTTAGTGAAGCCACAGATGTAAACGTGATACACGTTC GGAGATTGCCTACTGCCTCGGA-3' (SEQ ID NO:33)). Los vectores que contenían ARNsh se linealizaron con PstI y se transfectaron en cultivos ARPE-19 (línea celular de R PE humana, ATCC) o J774A.1 (línea celular de macrófagos de ratón, ATCC) utilizando el kit V de electroporación Amaxa (Amaxa). Las células transfectadas se transfirieron a placas de 6 pocillos y 2 ml de medio de cultivo (1:1 DMEM:F-12 con FBS al 10%). Las células transfectadas se cultivaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5%. Se seleccionaron las líneas celulares estables con la adición de 1 (ARPE-19) a 1,25 (J774A.1) mg/ml de puromicina (Sigma) 24 horas después de la transfección. El medio y la puromicina se refrescaron cada 2 días durante 10 días. Tras la selección, las cuatro líneas de desactivación de ARPE-19 y las cuatro de J774A.1 se cultivaron hasta confluencia. Para determinar la eficacia de desactivación, se transfectaron temporalmente líneas estables con PRPF31 marcado con V5 en células ARPE-19 o con Prpf31 marcado con V5 clonado en un vector Gateway Destination (Invitrogen). Se realizó una transferencia western y se cuantificó PRPF31 marcado con V5 utilizando un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (Li-Cor). Se realizaron ensayos de viabilidad celular utilizando el ensayo de viabilidad celular luminiscente Cell Titer-Glo (Promega) según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se cultivaron células ARPE-19 a una densidad de 1.000 células/pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos (Corning, Cat. n.° 3904). Las células se cultivaron durante 3 días en DMEM con un 10% de FBS a 37 °C, CO2 al 5%. Después de este período, se midió la viabilidad celular mediante luminiscencia y se determinó la significación estadística utilizando la prueba t de Student.

Ensayos de fagocitosis in vitro

Se aislaron segmentos externos de fotorreceptores de ojos porcinos obtenidos frescos del matadero y se marcaron de forma covalente con tinte FITC (Invitrogen) para ensayos de fagocitosis in vitro tal como se ha descrito anteriormente13. Se expusieron células de R PE cultivadas confluentes con ~10 de FITC-POS por célula durante 1,5 horas. Se retiraron exhaustivamente POS no específicamente unidos con tres lavados en PBS con 1 mM de MgCb y 0,2 mM de CaCb. Para medir los POS internalizados, algunos pocillos se incubaron con azul de tripano durante 10 min para inactivar la fluorescencia de POS marcados con FITC unidos a la superficie tal como se ha descrito anteriormente26. Se fijaron las células con metanol enfriado en hielo y se contratiñeron los núcleos con Hoechst 33258 (Invitrogen) o DAPI (Euromedex). Se sometieron a formación de imágenes las células utilizando un microscopio fluorescente de Nikon Ti2 o Leica DM6000 a 20X. Para los cultivos primarios de RPE, se calcularon las relaciones FITC/DAPI sobre todos los campos de imágenes, correspondiéndose con el número de POS por célula. Se sometieron a recuento los FITC-POS sobre una base celular de 100 células y se determinó el promedio de los tres pocillos para ARPE-19. Para macrófagos peritoneales, se cuantificaron los FITC-POS y los núcleos marcados con DAPI mediante lectura de placas de fluorescencia (Infinite M1000, Magellan 6 software, Tecan). Se calcularon los ratios de unión restando los resultados obtenidos en los pocillos de internalización (tratados con azul de tripano) de los pocillos de fagocitosis (no tratados) totales. Esto se realizó para tres a seis ensayos independientes y se determinó la significación utilizando la prueba t de Student (P < 0,05).

Antes de la fagocitosis, se opsonizaron cultivos confluentes de las líneas de J774A.1 de desactivación estable utilizando reactivo de opsonización de biopartículas de zymosan A (Life Technologies) según el protocolo del fabricante. T ras la opsonización, se aplicó 1 mg de biopartículas de zymosan A reconstituidas en el medio de cultivo a cada pocillo de cultivo de una placa de 96 pocillos. Los cultivos se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 1 hora. La fijación y determinación de los niveles de fagocitosis se realizó tal como se ha descrito anteriormente.

Ensayos de ritmo diurno in vivo

Los ratones fueron sometidos a eutanasia 2 horas antes de la aparición de luz (-2), a la aparición de luz (0), y 2, 4 y 8 horas (+2, 4, 8) después de la aparición de luz, y se procesaron para la microscopía de electrones o la inclusión de parafina tal como se ha descrito antes13, 15 Para la microscopía de electrones se adquirieron todos los reactivos de Electron Microscopy Sciences. Los ratones se perfundieron con glutaraldehído al 2% paraformaldehído al 2%, y las copas oculares se transfirieron a un tampón de perfusión con la adición de 0,2 M de tampón de cacodilato de sodio. Se tiñeron secciones ultrafinas de sesenta a ochenta nanómetros con citrato de plomo/acetato de uranilo y se sometieron a recuento de fagosomas tempranos de 200 nm fuera del nervio óptico. Un fagosoma temprano se recuenta si cumple los siguientes criterios: 1) está contenido dentro del citoplasma del R PE y 2) tiene una estructura lamelar visible. Para la microscopía de luz, se fijaron las copas oculares en formaldehído/etanol/ácido acético y se sometieron a inclusión en parafina utilizando el sustituto de disolvente Ottix Plus (DiaPath). Se cortaron secciones de cinco micrómetros y se retiró la parafina utilizando el sustituto de disolvente SafeSolv. Las secciones se rehidrataron e incubaron en H2O2 al 5 % en SSC de 1X durante 10 minutos bajo iluminación para blanquear los pigmentos. Después de bloquear señales no específicas utilizando BSA al 10% en TB S de 1X, las secciones se tiñeron con un anticuerpo de anti-rodopsina (Millipore) y AlexaFluor 488 de anti-IgG de ratón (Invitrogen). Se tiñeron los núcleos con DAPIE y los portaobjetos se montaron con Mowiol (preparado según los procedimientos estándar). Se adquirieron pilas de imágenes sobre un microscopio confocal invertido Olympus FV1000 con un objetivo de aceite 60x, un zoom de 4 tiempos y escaneos de 0,41-mm de ancho de paso y se procesaron utilizando el software Adobe Photoshop C S 6. Las zonas de al menos 100 mm de retina/RPE ininterrumpidos se sometieron a recuento sobre pilas de 10 escaneos. En cada serie de experimento, los recuentos de fagosomas se normalizaron a la longitud de la retina y se ponderaron. La significación se determinó utilizando la prueba t de Student (P < 0,05) y N = 2-5 para todos los experimentos.

Ensayos de adhesión retiniana in vivo

Se realizaron ensayos de adhesión retiniana in vivo tal como se ha descrito14. Brevemente, se retiró el cristalino y la córnea de las copas oculares inmediatamente post mortem en tampón salino Hanks con calcio y magnesio. Se realizó un corte radial al nervio óptico y se desprendió la retina neural cuidadosamente de la copa ocular aplanada. Se sometieron a lisis las muestras de retina neural en 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM de EDTA, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 0,1% de SD S y 1% de Nonidet P-40, con la adición de un cóctel de inhibidores de la proteasa (Sigma) y 1 mM de PMSF. Se cuantificaron las proteínas de sobrenadantes aclarados utilizando el ensayo de Bradford y se sometieron a inmunotransferencia concentraciones iguales para RPE65 (Abcam o Millipore) y beta-actina (Abcam o Sigma). Se extrajeron pigmentos de melanina del sedimento de retina neural insoluble con DMSO al 20%, 2N de NaOH. Se cuantificaron las muestras y estándares de melanina comercial (Sigma) midiendo la absorbancia a 490 nM. Se normalizó la abundancia pigmentaria a la concentración de proteínas en cada muestra para contabilizar distintas producciones de tejido. Se cuantificaron las bandas de inmunotransferencias utilizando el programa Image J v1.46r utilizando una muestra común en todos los blots como referencia, después se ponderaron las señales. La significación se determinó utilizando la prueba t de Student (P < 0,05) y N = 3-6 para todos los experimentos.

Microscopía de inmunofluorescencia

Para las criosecciones, se fijaron las copas oculares en formaldehído al 2% y se incubaron en sacarosa al 30% durante la noche a 4 °C. Se incrustaron las copas oculares en O.C.T. Se cortó el compuesto (Sakura) y secciones de 10-pm. Las secciones se incubaron individualmente en anticuerpos primarios frente a av integrina (BD Biosciences), p5 integrina (Santa Cruz Biotechnology), MerTK (FabGennix), Mfg-E8 y Gas6 (R&D Systems), FAK clon 2A7 (Millipore) y Proteína S (Sigma) seguido por IgG-AlexaFluor 488 (Invitrogen). Se tiñeron núcleos con DAPI, y se montaron con Fluoromount (Electron Microscopy Sciences). Se tomaron las imágenes con un microscopio de fluorescencia invertido Nikon Eclipse Ti utilizando un objetivo de aceite de inmersión 60x. Se procesaron las imágenes con el software NIS-Elements AR (Nikon).

Para las secciones de parafina, se sacrificaron animales en el momento del pico fagocítico y se fijaron los ojos en fijador Davidson durante tres horas a 4 °C, a continuación, se retiró el cristalino y la córnea. Se sometieron a inclusión en parafina las copas oculares y se cortaron secciones de 5-mm. Se trataron las secciones como se describe en la sección Ensayos del ritmo diurno in vivo y se incubaron individualmente con anticuerpos primarios frente a av integrina (Covance), p5 integrina (Santa Cruz Biotechnology), Mfg-E8 , MerTK y Gas6 (R&D Systems), clon FAK 2A7 (Millipore) y Proteína S (Novus Biologicals), seguido por incubación secundaria con IgG-AlexaFluor 488 (Invitrogen). Se tiñeron los núcleos con DAPIE y los portaobjetos se montaron con Mowiol. Se tomaron imágenes con un microscopio de Epifluorescencia Leica DM6000 B utilizando un objetivo de inmersión de aceite 40x. Se procesaron las imágenes con los programas ImageJ v1.46r y Photoshop C S6

Resultados

La fagocitosis de R PE se vio reducida en ratones mutantes de Prpf

En nuestra caracterización original de los ratones mutantes de Prpf, la microscopía de electrones identificó cambios morfológicos en el R PE de mutantes de 1 a 2 años de edad8. Aquí, nos propusimos determinar si los cambios funcionales preceden los cambios morfológicos observados. Puesto que el R PE mantiene su actividad fagocítica en cultivo, establecimos cultivos de R PE primario independientes de ratones de Prpf3 T494M/T494M, Prpf^ 2309™ 2309^ Prpf31 +/- de 9-10 días de edad, así como sus correspondientes controles de camada. Una vez los resultados fueron confluentes, utilizamos POS porcinos marcados con FITC y medimos la fagocitosis después de una incubación de 1,5 horas. La Figura 1A (paneles 1-3) muestra imágenes representativas de cultivos primarios que ilustran la unión/captación de POS de las células de R PE de los ratones mutantes de Prpf y sus controles de camada, y que demuestra la deficiencia cualitativa en fagocitosis por los ratones mutantes. En los tres modelos mutantes, se observó una disminución del 37-48% de fagocitosis (N = 3-5, P < 0,05) (Figura 1B). Para justificar la unión no específica de POS a los portaobjetos, realizamos un control negativo, en el cual el ensayo de fagocitosis se realizó sobre cubreobjetos que no contenían células. No observamos ninguna adhesión no específica de los POS a los cubreobjetos (no se muestran los datos).

Investigamos si una etapa específica de la fagocitosis entre la unión e internalización se ve preferentemente alterada en cultivos primarios de R PE de Prpf31+/-. Después de realizar una exposición fagocítica de 1,5 horas, tratamos las células para inactivar la fluorescencia de superficie (POS enlazados) para cuantificar únicamente los POS internalizados. La unión de POS se vio significativamente reducida por 53+11% en células mutantes (N = 2-5, P < 0,05), mientras que no hubo diferencia significativa en las tasas de internalización de POS entre cultivos de tipo salvaje y de R PE mutante (Figura 1C).

Actualmente, existen 64 mutaciones patogénicas conocidas en PRPF31, de las cuales muchas resultan en un desplazamiento de marco de lectura y se degradan a través de la vía de desintegración mediada por antisentido2, 10, 11, 22. ARPE-19 es una línea celular de R PE humanos espontáneamente inmortalizados que es susceptible de transfección y retiene la capacidad de fagocitarse23. Para analizar si las mutaciones en los factores de ayuste también afectan la fagocitosis en un modelo de R PE humano, creamos tres líneas celulares de ARPE-19 estables con desactivación mediada por ARNsh de PRPF31 utilizando 3 ARNsh distintos dirigidos contra las regiones 5', 3' y media de la transcripción (Figura 1D). También generamos una cuarta línea celular con un ARNsh dirigido contra la proteína fluorescente verde para utilizarla como control. En cada una de las tres líneas celulares estables de ARNsh de PRPF31 logramos aproximadamente un 60-95% de desactivación de PRPF31 (datos no mostrados). Los ensayos de viabilidad celular de la desactivación de ARNsh y células ARPE-19 de control no dirigidas mostraron que no se produjo una disminución significante en asociación con la desactivación de PRPF31 (Figura 1E). La fagocitosis disminuyó aproximadamente un 40% en cada línea sometida a ensayo, en comparación con la línea de ARNsh de control no dirigida (Figura IF). Como con el ensayo de fagocitosis realizado sobre R PE primario, también realizamos un ensayo negativo y no se observó ninguna adhesión no específica de los POS a los cubreobjetos (datos no mostrados).

Para determinar si el trastorno de la maquinaria fagocítica es un mecanismo específico de RPE , o puede observarse en otras células fagocíticas, desactivamos Prpf31 en la línea celular de macrófagos de ratón, J774A.1. Similar a los estudios de desactivación en la línea celular de ARPE-19, se dirigieron tres ARNsh distintos al extremo 5', 3' y medio de la transcripción. Utilizamos el mismo ARNsh de control que los estudios anteriores. En cada una de las líneas celulares de Prpf31 estables, logramos aproximadamente un 45-70% de desactivación de Prpf31 (Figura 1A complementaria). No observamos ninguna deficiencia de fagocitosis en ninguna de las líneas sometidas a ensayo (Figura 1B complementaria). Para asegurar que no observamos ninguna adhesión de POS no específica, realizamos un ensayo de control negativo como para la serie de experimentos anteriores (datos no mostrados). Se repitieron experimentos idénticos en macrófagos peritoneales primarios de ratón aislados de ratones de Prpf31+/~. De forma interesante, ninguna etapa de fagocitosis, es decir, unión o internalización, ni la fagocitosis total se vio afectada en mutante de Prpf31 en comparación con macrófagos de tipo salvaje (Figura 1C complementaria).

La ritmicidad diurna de la fagocitosis se vio alterada.

La fagocitosis de POS desprendidos por el R PE le sigue un fuerte pico de ritmo diurno sincronizado a las 2 horas después de la aparición de luz y se mantiene relativamente inactivo durante el resto del día13. Medimos la fagocitosis in vivo en 5 puntos de tiempo por todo el ciclo de luz utilizando o bien microscopía de electrones Figura 2A, mutantes de Prpf3 y Prpf8) o bien inmunofluorescencia (Figura 2B, mutante de Prpf31), ambas técnicas reconocidas para evaluar el ritmo fagocítico de R P E 13, 15 Para ratones de control y mutantes de Prpf3 y Prpf8 sometimos a recuento fagosomas tempranos que contenían estructuras lamelares en micrografías de electrones (Figura 2A, puntas de flecha, las inserciones muestran estructuras lamelares). Se determinó la ritmicidad de la fagocitosis en ratones de Prpf31+I-utilizando inclusión de parafina y tinción de rodopsina, y sometimos a recuento los fagosomas presentes en la capa celular de R PE (Figura 2B, puntas de flecha). Observamos un estallido de fagocitosis a las 2 horas después de la aparición de luz en todos los ratones de control, identificando 22-26 fagosomas por 100 mm de sección retiniana (Figura 2C, punto de tiempo 2 ). En contraste, los ratones mutantes solo mostraron 10-14 fagosomas en el mismo punto de tiempo pico. Durante el resto del ciclo luz:oscuridad, los niveles de fagocitosis se mantienen relativamente bajos en los ratones de control ("horas fuera del pico", 2-12 fagosomas/100 mm de retina), y estos niveles aumentan generalmente en ratones mutantes 6-14 fagosomas/100 mm de retina). Estos resultados muestran una disminución en la intensidad pico fagocítica en los tres tipos de ratones mutantes, con una extensión del tiempo del pico que dura más en mutantes de Prpf3 y Prpf8 y empieza antes en mutantes de Prpf31. Además, los mutantes de Prpf8 tiene significativamente más fagosomas en el punto de tiempo fuera del pico (+ 8 h), con respecto a los controles de WT.

Se observa adhesión retiniana reducida en el punto de tiempo pico

La adhesión entre las microvellosidades apicales del R PE y las puntas distales de los POS es conocida por seguir un ritmo sincronizado con la resistencia máxima que se produce 3,5 horas después de la aparición de luz, ligeramente después del pico fagocítico14, 15 Se puede determinar la adhesión desprendiendo la retina de una copa ocular aplanada inmediatamente después de la eutanasia cuantificando, a continuación, tanto el contenido de melanina de R PE como los marcadores de proteína de R PE apicales, como RPE65, transferidos a la retina. Utilizando este método, evaluamos la adhesión en ratones mutantes de Prpf y controles de camada a las 3,5 y 8,5 horas después de la aparición de luz (adhesión pico y adhesión fuera de pico, respectivamente). Se cuantificó la adhesión de R P E utilizando en primer lugar un procedimiento14 de cuantificación de melanina estándar, después transferencia western para la presencia de RPE65 para confirmar los resultados de melanina. Observamos una disminución del 56+16% (N = 6 , p<0,05, la variación es igual a la desviación estándar) del contenido de melanina en el Prpf3 T494M/T494M en el tiempo pico y ningún cambio significativo en la adhesión en el punto de tiempo fuera de pico (Figura 3A). El análisis de transferencia western confirmó esta observación con una disminución de 30+2% en la adhesión pico (Figura 3B). La cuantificación de melanina en ratones de Prpf8H2309P/H2309P mostró que la adhesión se redujo significativamente en 61+28% en el punto de tiempo pico y 51 16% en el punto de tiempo fuera de pico (N = 6 , P < 0,05 para ambos puntos de tiempo) (Figura 3A). El análisis de la transferencia western confirmó una disminución significativa del 36+11% solo en el punto de tiempo pico (Figura 3B). En los ratones de Prpf31+/-, la disminución se observó en el punto de tiempo pico (Figura 3A) y se confirmó mediante análisis de inmunotransferencia (N = 3-7, P < 0,05 para ambos paneles) (Figura 3B, 14+1%).

Localización de fagocitosis y marcadores de adhesión

Las células de R PE están altamente polarizadas y su función depende de su polaridad24. La localización específica de muchas proteínas expresadas en el R PE resulta importante y las irregularidades en la localización pueden provocar distrofias retinianas tales como RP o enfermedad de Best25’ 26. Dado el trastorno del ritmo diurno de tanto la fagocitosis como la adhesión en los tres modelos de ratón mutantes de Prpf, nos propusimos caracterizar la localización de las proteínas que son conocidas por ser importantes para estos procesos. Se sometió a ensayo la localización de proteínas sobre criosecciones de ratones mutantes de Prpf3 y Prpf8 (Figura 4) y sobre secciones de parafina para ratones mutantes de Prpf31 (Figura 5).

Tal como se ha mostrado anteriormente, los principales receptores fagocíticos (avp5 integrina y MerTK) se localizan en la superficie27 apical del R PE mientras que sus ligandos pueden expresarse por todos los POS y R P E28. De forma interesante, los ligandos extracelulares expresados en la matriz interfotorreceptora pueden sintetizarse tanto por RPE como por células fotorreceptoras.

Se ha demostrado que la avp5-integrina con su ligando asociado Mfg-E8 (glóbulo graso de la leche-EGF8) son importantes para la fagocitosis y son los responsables de la ritmicidad diurna de esta función 13’ 15 Además, la avp5-integrina participa en la adhesión de la retina y su ritmo, aunque con un ligando distinto de Mfg-E814’ 15’ 17 Las subunidades de la av integrina se asocian en complejos con varias unidades de p integrina en células de R P E 14, por lo tanto, es más relevante analizar la expresión de subunidades de p5 integrina. Así, analizados las subunidades de av y p5 del receptor de la avp5 integrina por separado. En tejidos de tipo salvaje, cada integrina se localizó primariamente en el lado apical del RPE , con alguna expresión a través de las células de RPE . En los tres tejidos mutantes de Prpf, no se observó ningún cambio en la localización de av-integrina (Figuras 4A, 5A). En contraste, la p5 integrina se localizó principalmente en el lado basal del R PE en los tejidos mutantes de Prpf3 y Prpf31, mientras que mostró expresión igualmente por todas las células de R PE mutantes de Prpf8. No observamos ningún cambio en la localización de Mfg-E8 en el R PE ni en los POS, pero parece que se expresa más tanto en mutantes de Prpf8 como de 31.

La proteína de señalización en dirección descendente FAK (quinasa de adhesión focal) proporciona un enlace de activación secuencial entre los receptores de avp5 integrina y MerTK tanto in vitro como in vivo29, 30, 13. La FAK se encuentra por todo el R PE y no se observó ningún cambio en este patrón en los ratones mutantes de Prpf3 o Prpf31 (Figura 4B, 5B). Sin embargo, los ratones mutantes de Prpf8, mostraron una localización de FAK en el lado basal del RPE .

La fagocitosis está dirigida por la activación a tiempo del MerTK mediante fosforilación en el momento del pico de actividad13, 31, 32. Gas6 y Proteína S son ligandos de MerTK que pueden estimular la captación de segmentos externos desprendidos in vitro33. Ambos ligandos son necesarios para la internalización de POS ya que los animales de doble desactivación recapitulan la rápida degeneración retiniana que se produce en ratas en cuyos receptores MerTK están ausentes34. La expresión de MerTK en tejidos de tipo salvaje se localiza en ambas membranas apicales y basales del RPE , mientras que el MerTK se localiza únicamente en el lado apical de las células de R PE mutantes de Prpf31 (Figuras 4C, 5C). El primer ligando de MerTK, Gas 6 se localiza en los POS y la capa apical del R PE en tejidos de tipo salvaje. Se observa una disminución de la expresión en los POS de ratones mutantes de Prpf3, con expresión difusa observada por todo el RPE . Los ratones mutantes de Prpf8 mantienen la expresión de Gas6 en los POS, pero parece perder localización apical en el RPE, también mostrando una expresión difusa por todo el RPE. No se pueden observar cambios de localización en ratones mutantes de Prpf31. La expresión del segundo ligando de MerTK, Proteína S se localiza específicamente en los POS en ratones de tipo salvaje y mutantes de Prpf (Figuras 4C, 5C).

Debate

Aquí, damos a conocer la primera caracterizaron funcional del R PE en ratones con mutaciones en los factores Prpf3, 8 y 31 de ayuste de ARN. Tal como hemos dado a conocer anteriormente, los ratones mutantes no experimentan degeneración de fotorreceptores, aunque sí cambios morfológicos en el R P E8. Puesto que el factor de ayuste de ARN de RP es una enfermedad de aparición tardía, estos resultados no son sorprendentes y los modelos nos permiten la capacidad de estudiar los mecanismos que llevan a la aparición de la enfermedad. Nuestros resultados demuestran que el R PE es probable que sea el tipo de célula primaria afectada por mutaciones en estos 3 factores de ayuste de ARN en el ratón, y en humanos dada la similar deficiencia fagocítica observada en células ARPE-19 humanas de desactivación de PRPF31. Mientras que el mecanismo exacto de la patogénesis de la enfermedad está por identificar, estos datos permiten que la investigación se centre en el RPE . Por ejemplo, la identificación del R PE como el tipo de célula primaria afectada en estos trastornos hará posible extender estos estudios a células humanas, tal como ahora es posible generar células de R PE a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) de pacientes con enfermedades retinianas heredadas42-45.

Referencias para Ejemplo 1

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Ejemplo 2. Desarrollo y caracterización funcional de células ARPE-19 desactivadas de PRPF31 utilizando técnicas de edición genómica

Tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, se identificó el epitelio pigmentario retiniano (R PE ) como el sitio de patogénesis en los tres modelos de ratón mutantes de ayuste de ARN de retinitis pigmentosa (RP). Sin embargo, estos resultados necesitaban confirmarse en R PE humano. Con la aparición de las técnicas de edición genómica de CRISPR/Cas9, se desarrollaron modelos de líneas celulares humanas para estas formas de enfermedad. Este ejemplo presenta el uso de la edición genómica de CRISPR/Cas9 para la desactivación de PRPF31 por primera vez en líneas celulares humanas y para la caracterización del efecto sobre la función del RPE.

Se diseñó un ARN guía (ARNg) de 20 pb al exón 7 de PRPF31 y se clonó en un vector pCAG que contenía la secuencia de armazón de ARNg. El vector de ARNg se co-transfectó con un vector pCAG-Cas9-GFP en células ARPE-19. Se clasificaron células positivas de G PF en una sola célula en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos y se cultivaron hasta confluencia. Se aisló ADN de cada clon y la región alrededor del sitio de corte pronosticado fue secuenciado por Sanger para identificar aquellos que mostraban el corte correcto y unión de extremos no homólogos (NHEJ). Se seleccionaron cinco líneas de NHEJ para su caracterización adicional utilizando ensayos tanto de qRT-PCR como de fagocitosis para cuantificar la captación de segmento externo de fotorreceptor marcado con FITC con citometría de flujo. Estas líneas se mantuvieron como cultivos confluentes durante 3 semanas para garantizar la polarización y expresión máxima de genes específicos de RPE.

Aproximadamente el 25% de los clones individualmente validados después de su transfección mostraron NHEJ con supresiones entre 2 y 11 bases y un clon tenía 1 inserción de base (Figura 6). Solo se identificaron indeles heterocigóticos, consistentes con los informes anteriores de que las mutaciones en el PRPF31 provocan la enfermedad por medio de haploinsuficiencia. La expresión de PRPF31 en 4 de los 5 clones editados de genoma se redujo significativamente (P < 0,05) por un 50-80%, en comparación con el control de tipo salvaje. Para confirmar que estos cambios fueron un resultado de edición genómica, se determinaron los niveles de expresión del modificador de PRPF31, CNOT3. Una línea tuvo un doble aumento en la expresión, lo cual puede explicar los niveles reducidos de PRPF31 en esa línea. El análisis de citometría de flujo de captación de POS demostró que la fagocitosis se vio reducida por 10-60 veces en las líneas editadas de genomas.

Actualmente, resulta complicado estudiar el mecanismo de la enfermedad del factor de ayuste de ARN en RP en modelos humanos. Hemos creado un modelo de línea celular humana para la enfermedad asociada a PRPF31 que imita los hallazgos en los modelos de ratón. Estas líneas nos permitirán estudiar la enfermedad en un modelo más relevante, permitiéndonos la capacidad de examinar el ayuste más profundamente. Además, también podemos estudiar el efecto del aumentó génico mediado por AAV de PRPF31 en la patogénesis de la enfermedad y el rescate de deficiencias funcionales

Por ejemplo, tal como se indica en el Ejemplo 1, los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se renuevan completamente cada 10 días por un crecimiento continuo en sus bases regulado por el desprendimiento de discos en sus puntas distales (Young rW. The renewal of photoreceptor cell outer segments. Journal of Cell Biology. 1967;33:61-72; Young RW. Shedding of discs from rod outer segments in the rhesus monkey. JUltrastructRes. 1971;34:190-203). La fagocitosis del material de POS utilizado por el R PE es esencial para la adecuada función retiniana, ya que su ausencia o retraso lleva a la pérdida de visión (Dowling JE , Sidman RL. Inherited retinal dystrophy in the rat. Journal Cell Biology. 1962;14:73-109; Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE , Huang X, Sheppard D, Finnemann SC . Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45). La fagocitosis de POS se redujo en cultivos de células de R PE primarias en ratones mutantes de 10 días de edad, y esto se replicó por la desactivación mediada por ARNsh de PRPF31 en células ARPE-19 humanas (Ejemplo 1, Figura 1). La ritmicidad diurna de fagocitosis in vivo también se perdió, y la resistencia de la adhesión entre microvellosidades apicales de R PE y POS disminuyeron en el momento de adhesión pico en los 3 modelos mutantes (Nandrot EF , Kim Y, Brodie SE , Huang X, Sheppard D, Finnemann SC . Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45; Nandrot EF, Finnemann SC . Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8 : distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research. 2008;40:120-3).

Ejemplo 3. Desarrollo y caracterización funcional de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) desactivadas de PRPF31 utilizando técnicas de edición genómica

Se utilizó la edición genómica de CRISPR/Cas9 para desactivar PRPF31 en hiPSC normales (Hou Z, Zhang Y, Propson NE, Howden SE , Chu LF, Sontheimer E J, Thomson JA. Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2013;110:15644-9; Xue H, Wu J, Li S, Rao MS, Liu Y. Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System. Methods Molecular Biology. 2014Peters DT, Cowan CA, Musunuru K. Genome editing in human pluripotent stem cells. StemBook. Cambridge (Ma ) 2013; Ding Q, Regan SN, Xia Y, Oostrom LA, Cowan CA, Musunuru K. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with C R ISPRs. Cell Stem Cell. 2013;12:393-4. PMCID: 3925309) tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2.

El desarrollo de la tecnología de hiPSC hace posible ahora determinar si las células de R PE humanas se ven afectadas de forma similar por mutaciones en los genes de factor de ayuste de ARN, ya que las hiPSC pueden diferenciarse fácilmente en células de R P E (ver Ejemplo 1, Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer JT , Martin J, Smith M, Shen W, Perez ET, Wallace KA, Capowski EE , Wright L, Gamm DM. Functional analysis of serially expanded human iPS cellderived R PE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6767-78; Buchholz DE, Hikita ST, Rowland TJ, Friedrich AM, Hinman CR, Johnson lV, Clegg DO. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 2009;27:2427-34; Okamoto S, Takahashi M. Induction of retinal pigment epithelial cells from monkey iPS cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011;52:8785-90; Ukrohne TU, Westenskow PD, Kurihara T, Friedlander DF, Lehmann M, Dorsey AL, Li W, Zhu S, Schultz A, Wang J, Siuzdak G, Ding S, Friedlander M. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem cells translational medicine. 2012;1:96-109; Westenskow pD, Moreno SK, Krohne TU, Kurihara T, Zhu S, Zhang ZN, Zhao T, Xu Y, Ding S, Friedlander M. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived R PE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2012;53:6282-90; Buchholz De , Pennington BO, Croze RH, Hinman CR, Coffey PJ, Clegg DO. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem cells translational medicine. 2013;2:384-93). Las células de R PE derivadas de hiPSC comparten muchas características con las células de R PE nativas, incluyendo uniones estrechas funcionales, fagocitosis de POS y polarización (lbid).

Para obtener R PE de hiPSC, se generan cuerpos embrioides (EB), adheridos a placas recubiertas de laminina y cultivados en medio de diferenciación retiniano (RDM) durante 60-90 días. Las regiones de células pigmentadas después se microdiseccionarán, disociarán y se pasarán sobre insertos de transwell según los protocolos establecidos (Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer JT , Martin J, Smith M, Shen W, Perez ET, Wallace KA, Capowski EE , Wright L, Gamm DM. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived R PE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6767-78; Phillips MJ, Wallace KA, Dickerson S J, Miller MJ, Verhoeven a D, Martin JM, Wright LS, Shen W, Capowski EE , Percin Ef , Perez ET, Zhong X, Canto-Soler MV, Gamm DM. Blood-derived human iPS cells generate optic vesicle-like structures with the capacity to form retinal laminae and develop synapses. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2012;53:2007-19). A continuación, se cultivarán células durante unos 30-60 días adicionales, cuando se reformen las monocapas pigmentadas. Antes del uso en experimentos, se medirá la resistencia transepitelial (TER ) de las monocapas de hiPSC-RPE cultivadas sobre insertos de Transwell; solo aquellos cultivados con TER > 150Qcm2 se seleccionarán para el estudio adicional. Para cada experimento, incluiremos duplicados para cada mutación de interés y células de control de tipo salvaje, que se cultivarán y analizarán en paralelo. La estructura y función de las células de R PE derivadas de hiPSC se caracterizará utilizando varios métodos:

Estructura. Se utiliza microscopía de luz y microscopía de electrones para evaluar la polarización, incluyendo la formación de procesos apicales y despliegues basolaterales (Ejemplo 1, Garland DL, Fernandez-Godino R, Kaur I, Speicher KD, Harnly JM, Lambris JD, Speicher DW, Pierce EA. Mouse genetics and proteomic analyses demonstrate a critical role for complement in a model of DHRD/ML, an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics.

2013;Sept. 4. [Epub ahead of print]; Liu Q, Lyubarsky A, Skalet JH, Pugh EN, Jr., Pierce EA. RP1 is required for the correct stacking of outer segment discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4171-83).

Fagocitosis. Tal como se ha descrito anteriormente, los cultivos primarios de células de R PE de los ratones de Prpf3T494M/T494M, Prpf8H2309P/H2309P y Prpf31+/- tienen una capacidad significativamente disminuida para fagocitar POS (Figura 1). Evaluaremos la función fagocítica de células de R PE derivadas de hiPSC utilizando técnicas establecidas (ver Ejemplo 1; Finnemann SC , Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez-Boulan E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alpha(v)beta5 integrin for binding but not for internalization. ProcNatlAcadSciUSA. 1997;94:12932-7; Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE , Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-60.)

Para evaluar la polaridad de las células de R P E derivadas de hiPSC se inmunotiñen secciones de vibratome de células transfectadas de forma estable cultivadas en Transwells con anticuerpos contra marcadores de células de RPE establecidas utilizando técnicas establecidas (Nandrot EF , Kim Y, Brodie SE , Huang X, Sheppard D, Finnemann SC . Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45; Nandrot EF, Finnemann SC . Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8 : distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research. 2008;40:120-3; Finnemann SC, Nandrot EF. MerTK activation during R PE phagocytosis in vivo requires alphaVbeta5 integrin. Advances Experimental Medicine Biology. 2006;572:499-503). Las células teñidas se evaluarán mediante microscopía confocal y la distribución y cantidades relativas de las proteínas de marcador se compararán en células de R PE derivadas de hiPSC mutantes y de control. Los niveles de estos marcadores de células de R PE también se evaluarán en células diferenciadas mediante transferencia western (Nandrot EF , Kim Y, Brodie SE , Huang X, Sheppard D, Finnemann SC . Loss of synchronized retinal phagocytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45).

Los cambios en el fenotipo del R PE observados en los hiPSC editados del genoma se confirmaron utilizando hiPSC de pacientes con factor de ayuste de ARN de RP. Se han identificado pacientes y familias con RP debido a mutaciones en el gen PRPF31 y se han generado hiPSC utilizando fibroblastos de un miembro de la familia afectado o no afectado de cada una de las 3 familias. En resumen, los fibroblastos se reprograman utilizando vectores de plásmidos no integradores, que contienen oriP que codifican siente factores reprogramadores (OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, c-Myc, KLF4 y SV40 antígeno T grande), tal como se ha descrito ( Yu J, Hu K, Smuga- Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 2009;324:797-801). Las líneas de hiPSC con cariotipos normales y que están confirmadas que son pluripotentes por estudios de teratoma y expresión de los marcadores de pluripotencia OCT4, SSEA4, NANOG y TRA-1-81 se seleccionarían para un estudio adicional (Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE , Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-607; Singh R, Phillips MJ, Kuai D, Meyer JT , Martin J, Smith M, Shen W, Perez ET, Wallace KA, Capowski EE , Wright L, Gamm DM. Functional analysis of serially expanded human iPS cell-derived RPE cultures. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2013;54:6767-78; Meyer JS , Howden SE , Wallace KA, Verhoeven AD, Wright LS, Capowski EE , Pinilla I, Martin JM, Tian S, Stewart R, Pattnaik B, Thomson JA, Gamm DM. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 2011;29:1206-18). Después de confirmar que cada línea de hiPSC porta la mutación esperada, se caracteriza la función del R PE derivado de hiPSC en células de pacientes y se compara con miembros de la familia no afectados utilizando las técnicas descritas anteriormente.

Ejemplo 4. Vectores de AAV para terapia de aumento génico.

La identificación de células de R PE que es probable que sean las células primarias afectadas en el factor de ayuste de ARN en RP (ver Ejemplo 1) crea una oportunidad de utilizar la terapia de aumento génico para enfermedades provocadas por mutaciones en el PRPF31. Para conseguir este objetivo, hemos desarrollado vectores de AAV para expresar PRPF31 humano en células de RPE , y hemos sometido a ensayo la capacidad del PRPF31 derivado de AAV en mejorar el fenotipo en células de R PE cultivadas y, a continuación, en ratones de Prpf31+/- in vivo. El AVV es el vector de suministro génico preferente para trastornos retinianos en base al éxito de los ensayos clínicos de la terapia génica para RPE65 LCA y coroideremia, así como otros estudios clínicos y preclínicos (Maguire AM, Simonelli F, Pierce Ea , Pugh EN, Jr., Mingozzi F, Bennicelli J , Banfi S, Marshall KA, Testa F, Surace Em , Rossi S, Lyubarsky A, Arruda VR, Konkle B, Stone E, Sun J, Jacobs J, Dell'Osso L, Hertle R, Ma JX , Redmond TM, Zhu X, Hauck B, Zelenaia O, Shindler KS, Maguire MG, Wright JF , Volpe NJ, McDonnell JW, Auricchio A, High KA, Bennett J. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine. 2008;358:2240-8. PMCID: 2829748; Bainbridge JW , Smith AJ, Barker SS , Robbie S, Henderson R, Balaggan K, Viswanathan A, Holder GE, Stockman A, Tyler N, Petersen-Jones S, Bhattacharya SS , Thrasher AJ, Fitzke FW, Carter BJ, Rubin GS, Moore AT, Ali RR. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. New England Journal of Medicine.

2008;358:2231-9; Cideci- yan AV, Aleman TS, Boye SL, Schwartz SB, Kaushal S, Roman AJ, Pang J J , Sumaroka A, Windsor EA, Wilson JM, Flotte TR, Fishman GA, Heon E, Stone EM, Byrne BJ, Jacobson SG, Hauswirth WW. Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics. Proceedings National Academy Sciences USA. 2008;105:15112-7. PMCID: 2567501; Maguire AM, High KA, Auricchio A, Wright JF , Pierce EA, Testa F, Mingozzi F, Bennicelli JL , Ying GS, Rossi S, Fulton A, Marshall KA, Banfi S, Chung DC, Morgan JI, Hauck B, Zelenaia O, Zhu X, Raffini L, Coppieters F, De Baere E, Shindler KS, Volpe NJ, Surace EM, Acerra C, Lyubarsky A, Redmond TM, Stone E, Sun J, McDonnell JW, Leroy BP, Simonelli F, Bennett J. Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet.

2009;374:1597-605; Jacobson SG, Cideciyan AV, Ratnakaram R, Heon E, Schwartz SB, Roman AJ, Peden MC, Aleman TS, Boye SL, Sumaroka A, Conlon T J, Calcedo R, Pang J J , Erger KE, Olivares MB, Mullins CL, Swider M, Kaushal S, Feuer WJ, Iannaccone A, Fishman GA, Stone EM, Byrne BJ, Hauswirth WW. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Archives Ophthalmology. 2012;130:9-24; Bennett J, Ashtari M, Wellman J, Marshall KA, Cyckowski LL, Chung DC, McCague S, Pierce EA, Chen Y, Bennicelli JL , Zhu X, Ying GS, Sun J, Wright JF , Auricchio A, Simonelli F, Shindler KS, Mingozzi F, High KA, Maguire AM. AAV2 gene therapy read- ministration in three adults with congenital blindness. Science translational medicine. 2012;4:120ra15; Bowles De , McPhee SW, Li C, Gray SJ, Samulski J J , Camp AS, Li J, Wang B, Monahan PE, Rabinowitz JE , Grieger JC , Govindasamy L, Agbandje-McKenna M, Xiao X, Samulski RJ. Phase 1 gene therapy for Duchenne muscular dystrophy using a translational optimized AAV vector. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2012;20:443-55. PMCID: 3277234; Maclachlan TK, Lukason M, Collins M, Munger R, Isenberger E, Rogers C, Malatos S, Dufresne E, Morris J , Calcedo R, Veres G, Scaria A, Andrews L, Wadsworth S. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 2011;19:326-34. PMCID: 3034852; Nathwani AC, Tuddenham EG, Rangarajan S, Rosales C, McIntosh J, Linch DC, Chowdary P, Riddell A, Pie AJ, Harrington C, O'Beirne J, Smith K, Pasi J , Glader B, Rustagi P, Ng CY, Kay MA, Zhou J, Spence Y, Morton CL, Allay J, Coleman J, Sleep S, Cunningham JM, Srivastava D, Basner-Tschakarjan E, Mingozzi F, High KA, Gray JT , Reiss UM, Nienhuis AW, Davidoff AM. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. New England Journal of Medicine. 2011;365:2357-65. PMCID: 3265081).

El AAV tiene un registro de seguridad excepcional en estudios clínicos de fase temprana y también presenta un menor riesgo de genotoxicidad en comparación con otros sistemas de vectores ya que los genomas de AAV son estables en una forma episómica en células terminalmente diferenciadas tales como células fotorreceptoras y de R PE (Yang GS, Schmidt M, Yan Z, Lindbloom JD, Harding TC, Donahue BA, Engelhardt JF , Kotin R, Davidson BL. Virus-mediated transduction of murine retina with adeno-associated virus: effects of viral capsid and genome size. Jvirol. 2002;76:7651-60; Acland GM, Aguirre GD, Bennett J, Aleman TS, Cideciyan AV, Bennicelli J , Dejneka NS, Pearce-Kelling SE , Maguire AM, Palczewski K, Hauswirth WW, Jacobson SG. Long-term restoration of rod and cone vision by single dose rAAV-mediated gene transfer to the retina in a canine model of childhood blindness. Molecular Therapy. 2005;12:1072-82).

Se desarrollan varios sistemas de vectores de AAV para PFPF31, con distintas elecciones de promotor y serotipos de cápside. Con respecto a los promotores, los vectores pueden incluir promotores que dirigen la expresión en muchos tipos de células (por ej., CAG o CASI), células de R PE (por ej., promotores de proteínas específicas de R PE tales como MD2, R P E65 , rLbP1, RGR o TIMP3) y células fotorreceptoras (RHO) (Esumi N, Oshima Y, Li Y, Campochiaro PA, Zack DJ. Analysis of the VMD2 promoter and implication of E-box binding factors in its regulation. Journal Biological Chemistry. 2004;279:19064-73; Guziewicz KE, Zangerl B, Komaromy AM, Iwabe S, Chiodo VA, Boye SL, Hauswirth WW, Beltran WA, Aguirre GD. Recombinant AAV-Mediated BEST1 Transfer to the Retinal Pigment Epithelium: Analysis of Serotype-Dependent Retinal Effects. PLoS One. 2013;8:e75666; Allocca M, Mussolino C, Garcia-Hoyos M, Sanges D, Iodice C, Petrillo M, Vandenberghe LH, Wilson JM, Marigo V, Surace EM, Auricchio A. Novel adenoassociated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 2007;81:11372-80). Los componentes de los vectores de AAV se sintetizan utilizando secuencias de PRPF31 optimizadas por codones para mejorar el nivel y duración de la expresión genética (I11 CR, Chiou HC. Gene therapy progress and prospects: recent progress in transgene and RNAi expression cassettes. Gene Therapy. 2005;12:795-802; Foster H, Sharp PS, Athanasopoulos T, Trollet C, Graham IR, Foster K, Wells DJ, Dickson G. Codon and mRNA sequence optimization of microdystrophin transgenes improves expression and physiological outcome in dystrophic mdx mice following AAV2/8 gene transfer. Molecular Therapy. 2008;16:1825-32; Sack BK, Merchant S, Markusic DM, Nathwani AC, Davidoff AM, Byrne BJ, Herzog RW. Transient B cell depletion or improved transgene expression by codon optimi- zation promote tolerance to factor VIII in gene therapy. PLoS One. 2012;7:e37671). En estudios preliminares, el PRPF31 optimizado por codones produjo proteína de PRPF31 de longitud completa en células ARPE-19. Los vectores preparados codifican el genoma de vector mínimo necesario para conseguir la expresión óptima. Dado que nos interesa principalmente transducir células de RPE , utilizaremos AAV2 como un serotipo de control, ya que este vector es conocido por transducir células monocapa cultivadas y transducir el R PE bien in vivo (Pang J J , Lauramore A, Deng WT, Li Q, Doyle TJ, Chiodo V, Li J , Hauswirth WW. Comparative analysis of in vivo and in vitro AAV vector transduction in the neonatal mouse retina: effects of serotype and site of administration. Vision Research. 2008;48:377-85; Vandenberghe LH, Bell P, Maguire AM, Cearley CN, Xiao R, Calcedo R, Wang L, Castle MJ, Maguire AC, Grant R, Wolfe JH, Wilson JM, Bennett J. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Science translational medicine. 2011;3:88ra54; Tolmachova T, Tolmachov Oe , Barnard AR, de Silva sR, Lipinski DM, Walker NJ, Maclaren RE, Seabra MC. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. Journal of Molecular Medicine. 2013;91:825-37. PMCID: 3695676). Se generan y purifican preparaciones de vectores utilizando técnicas establecidas (Vandenberghe LH, Bell P, Maguire AM, Cearley CN, Xiao R, Calcedo R, Wang L, Castle MJ, Maguire AC, Grant R, Wolfe JH, Wilson JM, Bennett J. Dosage thresholds for AAV2 and AAV8 photoreceptor gene therapy in monkey. Science translational medicine.

2011;3:88ra54, Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, Samanta A, Toelen J, Debyser Z, Wilson JM. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 2010;21:1259-71. PMCID: 2957274). Se realiza la titulación mediante qPCR de Taqman con conjuntos de cebador-sonda dirigidos hacia la señal de poliadenilación en el genoma del vector.

Para estudiar la expresión de PRPF31 en células cultivadas, las células de ARPE-19 mutantes de PRPF31 y de control se cultivan en filtros de Transwell, tal como se describe en el Ejemplo 1. Se tratan células con la cantidad deseada de vectores de AAV-PRPF31 y se cultivan durante 11-14 días adicionales. Las células de R PE de tipo salvaje tratadas con AAV-PRPF31 y las células PRFP31+/_ tratadas con AAV-EGFP se utilizan como controles. Los efectos del tratamiento de AAV-PRPF31 se evalúan utilizando varios enfoques. La producción de proteína de PRPF31 de longitud completa se evalúa mediante experimentos de microscopía de inmunofluorescencia y transferencia western 2-4 días después de la transducción (Liu Q, Zhou J, Daiger SP , Farber DB, Heckenlively JR , Smith JE , Sullivan LS, Zuo J, Milam AH, Pierce EA. Identification and subcellular localization of the RP1 protein in human and mouse photoreceptors. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2002;43:22-32; Liu Q, Zuo J, Pierce EA. The retinitis pigmentosa 1 protein is a photoreceptor microtubule-associated protein. Journal Neuroscience. 2004;24:6427-36; Falk MJ, Zhang Q, Nakamaru-Ogiso E, Kannabiran C, Fonseca-Kelly Z, Chakarova C, Audo I, Mackay DS, Zeitz C, Borman AD, Staniszewska M, Shukla R, Palavalli L, Mohand-Said S, Waseem NH, Jalali S, Perin JC , Place E, Ostrovsky J, Xiao R, Bhattacharya SS , Consugar M, Webster AR, Sahel JA, Moore AT, Berson EL, Liu Q, Gai X, Pierce EA. NMNAT1 mutations cause Leber congenital amaurosis. Nature Genetics. 2012;44:1040-5). La transferencia genética se somete a ensayo mediante 1PCR para genomas de vectores. La restauración de la actividad fagocítica normal de las células mutantes se mide mediante tratamiento con POR marcados con FITC , utilizando técnicas establecidas (Ejemplo 1, Finnemann SC , Bonilha VL, Marmorstein AD, Rodriguez- Boulan E. Phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelial cells requires alpha(v)beta5 integrin for binding but not for internalization. ProcNatlAcadSciUSA.

1997;94:12932-7; Singh R, Shen W, Kuai D, Martin JM, Guo X, Smith MA, Perez ET, Phillips MJ, Simonett JM, Wallace KA, Verhoeven AD, Capowski EE , Zhang X, Yin Y, Halbach PJ, Fishman GA, Wright LS, Pattnaik BR, Gamm DM. iPS cell modeling of Best disease: insights into the pathophysiology of an inherited macular degeneration. Human Molecular Genetics. 2013;22:593-607).

Para estudiar la expresión de PRPF31 y función en ratones mutantes de Prpf31+/- , se utiliza el suministro mediado por AAV de PRPF31 para tratar la fagocitosis defectiva en ratones Prpf31 +/-in vivo. Para estos estudios, las dosis óptimas de los vectores de AAV-PRPF31 identificados en estudios de cultivo celular se inyecta de modo subretiniano en un ojo de ratón de Prpf31+/-. Los ojos se recogen 1 mes después de la inyección y se evalúan para su expresión y localización de la proteína de PRPF31 de longitud completa utilizando ensayos de inmunofluorescencia y transferencia western (Liu Q, Lyubarsky A, Skalet JH, Pugh EN, Jr., Pierce EA. RP1 is required for the correct stacking of outer segment discs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4171-83; Liu Q, Saveliev A, Pierce EA. The severity of retinal degeneration in Rplh gene-targeted mice is dependent on genetic background. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2009;50:1566-74; Liu Q, Collin RW, Cremers FP, den Hollander AI, van den Born LI, Pierce Ea . Expression of Wild-Type Rp1 Protein in Rp1 Knock-in Mice Rescues the Retinal Degeneration Phenotype. PLoS One.

2012;7:e43251).

La capacidad de PRPF31 suministrado por AAV de evitar y/o rescatar la pérdida de ritmicidad de la fagocitosis de RPE se evalúa a las 2 horas antes de la aparición de luz (-2), a la aparición de luz (0) y a las 2, 4 y 6 (+2, 4, 6 ) horas después de la aparición de luz utilizando técnicas establecidas para la tinción inmunofluorescente de rodopsina y detección de fagosomas emplazados en la capa de células de R PE (Nandrot EF, Kim Y, Brodie SE , Huang X, Sheppard D, Finnemann SC . Loss of synchronized retinal phago- cytosis and age-related blindness in mice lacking alphavbeta5 integrin. Journal Experimental Medicine. 2004;200:1539-45; Nandrot EF, Finnemann SC. Lack of alphavbeta5 integrin receptor or its ligand MFG-E8: distinct effects on retinal function. Ophthalmic Research. 2008;40:120-3). Evaluamos las retinas tratadas para probar el rescate de fenotipos inicialmente al 1 mes y 2 meses después de la inyección de AAV-PRPF31 en estos animales. Para evaluar la evidencia de la prevención de la degeneración de RPE , se tratan ratones de 1 mes de edad y la ultraestructura del R PE se evalúa para su rescate fenotípico a los 5, 8 y 11 meses después de la inyección de AAV-PRPF31 (Graziotto J J , Farkas MH, Bujakowska K, Deramaudt BM, Zhang Q, Nandrot EF, Inglehearn Cf , Bhattacharya SS , Pierce EA. Three gene-targeted mouse models of RNA splicing factor RP show late-onset R PE and retinal degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2011;52:190-8). En base a los datos de portadores asintomáticos de mutaciones de PRPF31, prevemos que incluso un modesto aumento en el nivel de PRPF31 en las células de R PE tratadas resultará terapéutico (Rio FT, Wade NM, Ransijn A, Berson EL, Beckmann JS , Rivolta C. Premature termination codons in PRPF31 cause retinitis pigmentosa via haploinsufficiency due to nonsense-mediated mRNA decay. Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31; Vithana EN, Abu- Safieh L, Pelosini L, Winchester E, Hornan D, Bird AC, Hunt DM, Bustin SA, Bhattacharya SS . Expression of PRPF31 mRNA in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa: a molecular clue for incomplete penetrance? Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2003;44:4204-9).

Ejemplo 5. Terapia de aumento génico mediada por AAV para mejorar el fenotipo de la fagocitosis defectiva en células de RPE cultivadas

Como se ha descrito anteriormente, hay buenas pruebas que las mutaciones en PRPF31 provocan enfermedad vía haploinsuficiencia y, de este modo, esta forma de RP dominante es susceptible de tratamiento con terapia de aumento génico (Wang et al., American Journal Medical Genetics A. 2003;121A:235-9; Xia et al., Molecular Vision. 2004;10:361-5; Abu-Safieh et al., MolVis. 2006;12:384-8; Rivolta et al., Human Mutation. 2006;27:644-53; Sullivan et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006;47:4579-88; Rio et al., Human Mutation. 2009;30:1340-7). Acorde con esta hipótesis, el nivel de expresión de PRPF31 del alelo de tipo salvaje se corresponde con la gravedad de la enfermedad en pacientes con mutaciones en el PRPF31 (Rio et al., Journal Clinical Investigation. 2008;118:1519-31; Venturini et al., PLoS genetics. 2012;8:e1003040; Rose et al., Scientific reports. 2016;6:19450). Para evaluar esta hipótesis, utilizamos terapia de aumento génico mediado por AAV para mejorar el fenotipo en células de RPE cultivadas.

Para estos estudios, generamos un vector viral AAV.CASI.PRPF31 , y se demostró que este puede producir proteínas de PRPF31 de longitud completa en células cultivadas. La secuencia de este vector es la siguiente: CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCr.GGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCG CCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCÜC'GCAGAGAGGGAGTÜGC'CAACnXATCACTAGGGGTTCC TTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCGGAAT TCGGAC.TTCCGCC.TTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGC.CTC.ACCC.CCCAACC.ACCCCCG CCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTC AATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGT ACGCXCCCTATTGACXjTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTT ATGGG ACTTTCCT ACTTGGC AGT ACATCT ACGTATT AGTC ATCGCT ATT AC'C ATGGTCG AGGTG A GCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCTTTTTTTTCCTT'ACCCCCAATTTTGTATTTATTTAT TTTTTAATTATTTTGTGCAOCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCG GGGCGCiGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGC GCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCG CGCGGCGGGCCiGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCXj C CGCCCGCCCCGGCTCTG ACTG ACCGCGTT ACT AA A AC AGGT A AGTCCGGCCTCCGCGCCGGGTTT TGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCXTCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCGCAG CG AGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGG ACGCTC AGG AC AGCGGCCCGCTGCTC AT AAG ACTCGGCCT TAGAACCCCAGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACITGGGTGACTCrAGGGCACTGGT TTTCTTTCCAGAGAGCGGAACAGGCGAGGAAAAGTAGTCXl'CTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGAT CTCXl’GTGGGGCGGTG A ACX3CCG ATG ATGCCTCT ACT AACC ATGTTC ATGTTTTCTTTTTTTTTCT A (A(K¡T(XTGGGTCiACGAACACK¡CTAC;CG(('ACCAT(KiCiTAA(KXTATCX:CTAACCX'T(T((TC(iC] TCTCGATTCTACGGCCGCCACCATGTCTCTOGCAGATGAGCTCTTAGCTGATCTCGAAGAGGCAG CAGAAGAC1GAGGAAGGAC.GAAGCTATGGGC.AC.GAAGAAGAGGAGCCAGCGATCC1AGGATGTG CAGGAGGAGACACAGCTGGATCTTTCCGGGGATTCAGTCAAGACCAICGCCAAGCTATGGGATA GTAAGATGTTTGCTGAGATTATGATGAAGATTGAGGAGTATATCAGCAAGCAAGCCAAAGCTTC AC¡AA(¡TGATGCKiACX AC¡1 GC¡AC¡C, ( XX,(X¡CX I ( ¡AA 1 ACX GC C i 1C A 1C G IGGA 1GC X AAC ’AAC C"IX i ACCGTGGAGATCGAAAACGAGCTGAACATCATCCATAAGTTCATCCGGGATAAGTACTCAAAGA GATTCCCTGAACTGGAGTCCTTGGTCCCCAATGCACTGGATTACATCCGCACGGTCAAGGAGCTG GGCAACAGCCTGG ACAAGTGCA AGAACAATGAGAACCTGC’AGC AGATCCTCACXl’AATGCCACCA TCATGGTCGTCAGCGTCACCGCCTCCACCACCCAGGGGCAGCAGCTGTCGGAGGAGGAGCTGGA GCGGCTGGAGGAGGCCTGCGACATGGCXj CTGGAGCTGAACXj CCTCCAAGCACCGCATCTACGAG TAT( ¡IX ¡( i Ai }IX X X X KJATC i IX X TTX ’ ATC XKACXXAAC X IX JTC X ’ ATC 'AITAIC X K ¡C JGCATÍX’AC X i( K ’ CGCCAAGATCATGGGTGTGGCCGGCGGCCTGACCAACCTCTCCAAGATGCCCGCCTGCAACATCA TGCTGCTCGGGGCXXAGCGCAAGACGCTGTCGGGCTrCTCGTCTACCTCAGTGCTGCCCCACACC C.GCT ACATCT ACCACAGTGACATCGTGCAGTCCCTGCCACCGGATCTGCC.GCGGAAAGCGGCCC GGCTGGTGGCCGCCAAGTGCACACrGGCAGCCCGTGlGGACAGTTTCCACGAGAGCACAGAAGG GAAC1C1TC1GGCTACC1AACTGAAGC1ATGAGATCGAGCGCAAATTCC1ACAAC1TC1GCAGGAGCCGCC GCCTGTGAAGCAGGTGAAGCCGCTOCCTOCGCCCCTGGATGGACAGCGGAAGAAGCGAOGCGGC CGCAGG1ACCGCAAG A 1GAAGG AGCGGCIGGGGC1G ACGG AG A TCCGGA AGCAGGCC AACCG1 AlGAGCrrCGGAGAGATCXjAGGAGGACGCCTACCAGGAGGACCTGGGATTCAGCCTGGGCCACC TGGGCAAGTCGGGCAGTGGGCGTGTGCGGCAGACACAGGTAAACGAGGCCACCAAGGCCAGGA IX XX X AAC i AC X ¡C TC K' AC iCGGACCX’TCK' AC i AAC K ’ AC ¡ AC ¡C X ÍTC ’GTATATC ¡C ¡C X K iC ¡AAC ¡IX X' AC X A I CCGCGACCGCTCCTCGGGCACGGCCTCCAGCGTGGCCTTCACCCCACTCCAGGGCCTGGAGATTG TGAACCCACACiGCGGCAGAGAAGAAGGTGGCTGAGGCCAACCAGAAGTATTTCTCCAGCATGGC TGAGTTCCTCAAGGTCAAGGGCC.AGAAGAGTGGCCTTATGTCCACCTGAACCC.GTTC.GCTAATAA AGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGCiAAGGACATAT GGG AGGGC'A AA IC A IT IA AA ACA I CAGA A1GAG1A1TIGG1TI AG AG ITT GGC AACA1A1GCCCA TATGCTGGCTGCCATGAACAAAGGTTGGCTATAAAGAGCiTCATCAGTATATGAAACAGCCCCCTG CTGTCCATTCCTTATTCCATAGAAAAGCCTTGACTTGAGGTTAGATTTTTnTATATmGTTTTGT G TTA TTTTnTCrTTAACATCCCTAAAATTTTCCTTACATGTTTTACTAGC'CAG A IT’I I IC C TC'CTCT CCTGACTACTCCCAGTC’ATAGCTGTCCCTCTTC_1-CTTATGGAGATCGGATCCGAATTCCCGATAAG G A T C n CCTAGAÜCATGGCTACGTAG ATAAGTAGCATGGCGGG IT AATCATTAACTACA AGGAAC CX X’TAGTGATCKJACiTTGCiCX'ACTCXC’TCTCTCKXKXKTCXK’TCCKTCACTCiACKiCXXiCKK XiACX'A AAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCC1AC1CGCC1CAGCCTTA ATTAACCTAATTCACTC1GCCGTCGTTTTACAACC1TCGTC1ACTGGGAAAACCCTGC1CGTTACCCAA CTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCC_1-CACCGA TCGCCCTTCCCA AC AGTTGCGC AGCCTG A ATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGC ATTAA GCGCGGCGGGTGTGGTGGTrACGCGCAGCGTGACCGCrACACriGCCAGCGCCCl'AGCGCCCGC:”! CCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCC'GGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGG GGCTCCCTTTAGGGTTCCG ATTTAGTGCTTTACGGC ACCTCGACCCC AAAAAACTTGATTAGGGT GAIGG IX’CACG IAG I’GGGt'CA l'CGCCCIGA rA G A C G G lT rn CGCCCITTG ACGIT GGAGICCAC GTTCTTT AAT AGTGGACTCTTGTTCC A AACTGGAACAAC ACTCAACCCT ATCTCGGTCTATTCTTT

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un vector de virus adeno-asociado de tipo 2 (AAV2) que comprende una secuencia que codifica PRPF31 humano, operativamente enlazado a un promotor que dirige la expresión en células de epitelio pigmentario retiniano (RPE), donde la secuencia de PRPF31 es o comprende, o codifica la misma proteína que nts 1319-2818 de SEQ ID NO:34.

2. El vector de la reivindicación 1, donde el promotor es un promotor de CAG, CASI, RPE65 o VMD2.

3. El vector de la reivindicación 1, donde la secuencia de PRPF31 está optimizada por codones.

4. El vector de cualquiera una de las reivindicaciones anteriores que comprende, adicionalmente, un polipéptido de cápside de AAV que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO: 1, 3, 5. 7, 9, 11, 13, 15, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26.

5. Una composición farmacéutica que comprende el vector de cualquiera una de las reivindicaciones 1-4, formulada para su administración mediante inyección subretinal.

6. Una composición farmacéutica que consiste esencialmente en un sistema de suministro genético que comprende el vector de cualquiera una de las reivindicaciones 1 a 4 en un diluyente.

7. Una composición farmacéutica que consiste esencialmente en un sistema de suministro genético que comprende el vector de cualquiera una de las reivindicaciones 1 a 4 integrado en una matriz de liberación lenta.

8. La composición farmacéutica de cualquiera una de las reivindicaciones 6 y 7, en donde el sistema de suministro genético comprende adicionalmente virus asistentes, proteínas y/o lípidos.

9. La composición farmacéutica comprende una o más células recombinantes que comprenden el vector de las reivindicaciones de cualquiera una de las reivindicaciones 1 a 4.

10. El vector de las reivindicaciones 1-4, para el uso en el tratamiento de la retinitis pigmentosa provocada por mutaciones en el PRPF31 en el ojo de un sujeto humano.

11. El vector de las reivindicaciones 1-4, para el uso en el aumento de la expresión de PRPF31 en el ojo de un sujeto humano.

12. La composición farmacéutica de cualquiera una de las reivindicaciones 5 a 9, para el uso en el tratamiento de retinitis pigmentosa provocada por mutaciones en el PRPF31 en el ojo de un sujeto humano.

13. La composición farmacéutica de cualquiera una de las reivindicaciones 5 a 9, para el uso en el aumento de la expresión de PRPF31 en el ojo de un sujeto humano.