ES2806773T3 - Composiciones que comprenden tolerógenos y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 5 6, 7, 8, 9, 10 y 11 o una formulación de las mismas para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno alérgico, donde dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígeno de H. pylori.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden tolerógenos y usos de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la prevención o el tratamiento de trastornos alérgicos, en particular, asma y alergia a alimentos y, en particular, a composiciones útiles para la prevención de la hipersensibilidad a alérgenos, en particular, los trastornos de asma y/o la desensibilización a los alérgenos.

Antecedentes de la invención

La prevalencia del asma alérgica y las enfermedades alérgicas ha alcanzado proporciones epidémicas tanto en poblaciones adultas como pediátricas, desarrolladas y en desarrollo (Eder y col., 2006, N. Engl. J. Med. 355:2226-2235). Se ha propuesto alternativamente que la falta de infecciones o exposición a microbios en la infancia, debido a condiciones de salubridad mejoradas, y la pérdida gradual de la microbiota indígena son responsables de esta tendencia principal de la salud pública (Blaser, 2009, Nat. Rev. Microbiol., 7:887-894). En 2011, entre 235 y 300 millones de personas alrededor del mundo fueron diagnosticadas con asma, y se produjeron 250.000 muertes.

Se sabe que el asma es la enfermedad crónica más prevalente en la infancia en los países desarrollados; aproximadamente 300 millones de personas padecen esta enfermedad en todo el mundo. El asma es provocada por una combinación de factores genéticos y ambientales. La Iniciativa Global del Asma define el asma como un trastorno inflamatorio crónico de las vías respiratorias. La inflamación pulmonar crónica se asocia con la hiperresponsividad de las vías respiratorias, lo que lleva a los síntomas clásicos del asma: episodios recurrentes de jadeos, falta de aire, opresión en el pecho y tos. El fenotipo clínico más común es el asma alérgica. En la infancia, más del 90% de los pacientes con asma grave son alérgicos; entre los adultos asmáticos, el 60% son sensibles a los aeroalérgenos comunes (Holgate y col., 2003, Eur. Respir. J. 2003; 22:470-477). En el asma alérgica, la inflamación y la obstrucción de las vías respiratorias son disparadas por la exposición a alérgenos en individuos atópicos. La patofisiología subyacente a la enfermedad es más bien compleja. Los procedimientos inflamatorios subyacentes al desarrollo de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas han sido investigados tanto en modelos humanos como animales de la enfermedad. El entendimiento de los diferentes tipos celulares y mediadores involucrados en el desarrollo del asma ha aumentado en la última década. En efecto, los hallazgos apoyan un rol importante de las células Th2 y las citocinas Th2 (IL-4, IL-5 y IL-13) en el desarrollo de la inflamación inducida por alérgenos y la hiperresponsividad de las vías respiratorias (AHR).

El tratamiento inmunomodulador del estado de la técnica de los síntomas agudos del asma involucra corticoesteroides inhalables u orales. Los pacientes con asma generalmente responden a los agonistas de los receptores adrenérgicos p2 (como el salbutamol) y las leucotrienes, que relajan las células musculares lisas. En casos muy graves, podría requerirse la administración intravenosa de corticoesteroides o fármacos inmunomoduladores, tales como anticuerpos neutralizadores de interleucinas, así como también la hospitalización. Los anticuerpos monoclonales anti-IL-13, anti-IL-5 y anti-IL-9 están todos actualmente en ensayos clínicos para el asma.

El Helicobacter pylori es un patógeno bacteriano persistente que coloniza la mucosa gástrica de los humanos. Típicamente se adquiere en la infancia temprana, y, al no haber una terapia con antibióticos, puede persistir durante toda la vida del huésped. La capacidad extraordinaria de H. pylori de resistir una respuesta inmune de adaptación impulsada en gran medida por células T efectoras polarizadas de Th1 y/o Th17 se ha atribuido a su adaptación a, y manipulación de, los sistemas inmunes humanos innatos y de adaptación. El H. pylori ha colonizado a su huésped humano durante al menos 60.000 años y, durante este largo período de evolución conjunta, ha evolucionado maneras elaboradas de manipular sistémicamente respuestas inmunes de adaptación y de promover su persistencia a través de la inducción preferencial de las células T regulatorias (Treg) sobre la respuesta de las células T inmunogénicas a través de las respuestas de células T efectoras. Las respuestas predominantes de Treg son características en vehículos fuertemente colonizados pero asintomáticos.

Se ha mostrado que la infección por H. pylori vivo experimental, especialmente cuando se inicia durante el período neonatal, protege efectivamente contra el asma inducida por alérgenos que se induce mediante la sensibilización a y la provocación de alérgenos (Arnold y col., 2011, The Journal of Clinical Investigation, 121:3088-3093). De manera mecánica, la protección contra el asma se debe al desarrollo de tolerancia inmune (mediada por Treg) a H. pylori, que protege de manera cruzada contra las respuestas de Th2 específicas para el alérgeno. Los efectos protectores de1 H. pylori vivo son abrogados por la terapia de erradicación con antibióticos que elimina las bacterias (Arnold y col., 2011, supra). De manera similar, la inducción de Tregs protectoras requería bacterias vivas in vivo y no pudo lograrse con el extracto muerto.

Aparte de las T regs, las células dendríticas (DC) han surgido como un tipo de célula crucial requerido para la tolerancia inmune. Las DC que experimentaron H. pylori se reprograman para un fenotipo que promueve la tolerancia in vitro e in vivo (Oertli y col., 2013, PNAS, 110(8), 3047-3052). Se ha observado que la reprogramación de DC requiere dos proteínas secretadas por H. pylori (determinantes de virulencia o factores), la citotoxina de vacuolación (VacA) y la yglutamil-transpeptidasa (GGT) (Oertli y col., 2013, supra), ya que los mutantes de H. pylori que carecen de uno de los dos factores de virulencia (pero que son, de otro modo, del tipo salvaje) no reprograman las DC in vivo e in vitro, y, por lo tanto, no pueden inducir Tregs con actividad supresora en los ratones (Oertli y col., 2013, supra). Como consecuencia, ambas cepas mutantes de H. pylori son efectivamente eliminadas por los ratones (Oertli y col., 2013, supra). Además, tanto GGT como VacA han sido usados o se informó que se usaron para disparar la inmunidad protectora inducida por vacuna contra H. pylori, es decir, con el objetivo opuesto (fuerte efector T en lugar de respuestas Treg) del presente objetivo de la invención (Malfertheiner y col., 2008, Gastroenterology 135(3):787-95).

El uso de H. pylori vivo como una intervención terapéutica o medida preventiva no ha sido atractivo debido al potencial carcinogénico bien documentado de la infección crónica con un organismo, ya que e1 H. pylori induce úlceras gástricas y duodenales (Marsahll y col., 1984, Lancet 1:1311-1315), y también hay una amplia aceptación de que sea la causa principal del adenocarcinoma gástrico (Parsonnet y col., 1991, N. Engl. J. Med., 325:1127-1131). Además, es importante observar que aquellas estrategias de vacunación usando H. pylori están apuntando a inducir una respuesta inmune que protegería al sujeto contra la infección de H. pylori y contrarrestaría la capacidad de H. pylori de evitar o desviar la respuesta del sistema inmune.

Como todos los tratamientos actuales del asma inducen efectos secundarios más o menos graves, se necesitan de manera desesperada estrategias de tratamientos alternativos. Por lo tanto, existen necesidades importantes de nuevas estrategias para la prevención o el desarrollo de asma, particularmente para niños y personas jóvenes que presentan una predisposición hacia el desarrollo de reacciones de hipersensibilidad y para el tratamiento de las causas y síntomas del asma.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al hallazgo inesperado de que la administración oral, intranasal o intraperitoneal (es decir, sistémica) de una composición que comprende VacA de H. pylori (administrada ya sea en la forma de un extracto de células muertas según se prepara con la alteración mecánica de H. pylori logarítmicamente creciente usando una « prensa francesa » celular de presión francesa o en la forma de proteína purificada o recombinante), al ser administrada en intervalos regulares, es capaz de inducir la protección contra el asma inducida por alérgenos. Si bien se halló que la presencia de este determinante o factor de virulencia se requería para la persistencia e inducción de Treg, era en combinación con el determinante de virulencia GGT y en el contexto de las bacterias vivas y no se pudo anticipar si hubiese sido suficiente por sí solo para la protección contra el asma. Además, el hecho de que la VacA se haya incluido exitosamente en ensayos humanos preclínicas y de fase 1 de la vacunación específica contra H. pylori argumenta que es inmunogénica (al menos en combinación con un adyuvante adecuado) y dispara la inmunidad mediada por células T y/o anticuerpos. Dado que las propiedades de fuerte inmunogenicidad y fuerte inmunomodulación, según son requeridas para la supresión de respuestas inmunes específicas de alérgenos, generalmente son exclusivas de manera mutua y no se encuentra típicamente en la misma proteína, las propiedades tolerogénicas de las composiciones según la invención son particularmente sorprendentes. La presente invención se refiere además al hallazgo inesperado de que es posible inducir una tolerancia periférica evitando una respuesta inmune a la infección de H. pylori a través del uso de una VacA y, por lo tanto, logrando una forma más bien no específica de inmunomodulación tolerogénica.

Un primer aspecto de la invención proporciona un polipéptido de una proteína Vac A, seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 o una formulación de las mismas para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno alérgico, en particular, asma atópica o inducida por alérgenos, en la que dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígeno de H. pylori. Según un aspecto de la invención, un polipéptido de la invención es útil para inducir una respuesta de tolerización a un alérgeno.

Otro aspecto según la invención se refiere a la formulación tolerogénica farmacéutica que comprende una proteína Vac A que consiste en una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, un diluyente o un excipiente del mismo, donde dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígeno de H. pylori.

Otro aspecto de la invención se refiere a una formulación farmacéutica de la invención, en la que dicha proteína Vac A se combina con al menos un coagente útil en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno alérgico, en particular, el asma atópica y/o para inducir una respuesta de tolerización a un alérgeno.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el alivio del asma inducida experimentalmente mediante el tratamiento con una composición según la invención, como se describe en el Ejemplo 1, para el grupo sometido al extracto de H. pylori (-▲-) en comparación con los controles positivos (ratones sensibilizados, pero sin tratamiento) (-■-) y los controles negativos (ratones con sensibilización simulada) (-•-). A, B: La hiperresponsividad de las vías respiratorias en la respuesta (cambio en % de los niveles de base, que se determinan individualmente para cada ratón) a las dosis en aumento de metacolina ([C] en mg/ml) y la dosis más alta de 100 mg/ml, respectivamente; C, D: Células y eosinófilos totales contenidos en 1 ml de BALF; E-G: La inflamación tisular y la metaplasia de células calciformes, según la puntuación mediante dos experimentadores ciegos en las secciones de tejido teñidas con H&E y PAS; micrografías representativas tomadas en ampliaciones originales de 100x (H&E) y 400x (PAS), se muestran en el grupo de datos G. de 5 estudios independientes, en A-F; H, I: La secreción de IL-5 y IL-13 mediante las preparaciones pulmonares de células únicas reestimuladas con ovoalbúmina, según la evaluación con ELISA, como se describe en el Ejemplo 1. Se muestra el grupo de datos de dos estudios.

La Figura 2 muestra que, para la protección contra el asma inducida con el extracto de células muertas, se requiere la señalización de IL-10. A , B: La secreción de IL-10 mediante DC derivadas de la médula ósea murina y DC derivadas de monocitos humanos de seis voluntarios saludables, después de la exposición a las cantidades indicadas de extracto de célula muerta de H. pylori ([C]) de la invención, como se describe en el Ejemplo 2. A: Un experimento representativo de tres; B: El grupo de datos de todos los seis donantes se muestra en B. C-F: Los ratones tratados como se describe en la Figura 1; los grupos indicados recibieron 3 dosis de anticuerpo anti-IL-10R durante la fase de provocación del protocolo, como se describió en el Ejemplo 2; C, D: Células y eosinófilos totales contenidos en 1 ml de BALF; E, F: Inflamación del tejido y metaplasia de células calciformes. En los diagramas de dispersión, cada símbolo representa un ratón; las líneas horizontales indican las medianas.

La Figura 3 muestra que la VacA es tanto requerida como suficiente para la protección contra la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas en el modelo de asma inducida por alérgenos. El extracto de un mutante de H. pylori sin el gen VacA ("extr. AvacA") fue consistentemente menos eficiente que el extracto de tipo salvaje ("extr. ts") a la hora de proteger a ratones sensibles a y desafiados por alérgenos contra la inflamación broncoalveolar y pulmonar, la eosinofilia y la metaplasia de células calciformes (Fig. 3A-D). A fin de examinar si la VacA sola es suficiente para proporcionar protección, la VacA oligomérica purificada de sobrenadantes de cultivo de H. pylori, como se describe en el ejemplo 1, se administró intraperitonealmente, una vez a la semana, desde el día 7 de edad en adelante. No se observó ningún efecto adverso en ninguno de los ratones, a pesar de su joven edad al momento de las primeras dosis. Sorprendentemente, la VacA proporcionó un nivel de protección contra el asma que era comparable con la protección otorgada por el tratamiento con el extracto (Fig. 3A-D). Una proteína VacA de control negativo a la que le falta la región hidrofóbica aminoterminal de tres repeticiones en tándem que han sido descritas como esenciales para la actividad citotóxica de VacA (Vinion-Dubiel y col., 1999, supra), es decir, de la SEQ ID NO: 3 (Figura 5) no ofreció protección contra el asma (Fig. 3A-D).

La Figura 4 muestra los efectos beneficiosos de varias concentraciones, vías de administración y regímenes de dosificación de VacA purificada en el asma alérgica. La VacA se preparó como se describió anteriormente y se administró por vía intraperitoneal o intragástrica en varias concentraciones e intervalos en ratones. 5 mg de VacA administrados intraperitonealmente en intervalos semanales desde la edad del día 7 en adelante hasta 2 semanas antes de la provocación (según se indica mediante el subíndice "a") resultaron tan efectivos como 20 mg de VacA a la hora de impedir la inflamación broncoalveolar y la eosinofilia (Figura 4 A,B). La VacA administrada intragástricamente (per os, p.o.) (de nuevo, suministrada semanalmente desde el día 7 hasta 2 semanas antes de la provocación) también proporcionó una protección significativa (Figura 4 A,B). Tres dosis de VacA suministrada intraperitonealmente (suministrada en las semanas 1,2 y 3 de vida, denotadas con el subíndice "b" en la Figura 4) fueron insuficientes a fin de proporcionar protección total (Figura 4 A,B). El bloqueo de la señalización de IL-10 con dos dosis de un anticuerpo neutralizante administradas intraperitonealmente durante la provocación de ovoalbúmina anuló la protección (Figura 4 A,B). Estos datos apoyan que, de manera inesperada, la administración de VacA sola en forma purificada es capaz de inducir una protección contra el asma que es comparable con todo el extracto celular y, por lo tanto, pueden administrarse en forma purificada a fin de impedir el asma alérgica,

La Figura 5 muestra ejemplos de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos Vac A descritos en esta invención. A: VacA s1m1 (Q48245 cepa de H. pylori ATCC 49503/60190) de la SEQ ID NO: 1; B: VacA s2m2 de la SEQ ID NO: 2; C: VacA mutante de control negativo (A6-27) de la SEQ ID NO: 3; D- K: SEQ ID NO 4 a SEQ ID NO: 11.

La Figura 6 muestra los efectos beneficiosos del extracto de H. pylori y la HpVacA en función de una puntuación clínica (A) y de parámetros sistémicos de alergia alimentaria (C a F), como se describe en el Ejemplo 5. Estos datos apoyan que, de manera inesperada, la administración de VacA sola en forma purificada es capaz de inducir una protección contra alergias a los alimentos que es comparable con todo el extracto celular y, por lo tanto, pueden administrarse en forma purificada a fin de impedir el asma alérgica.

Descripción detallada

El término "trastorno alérgico" se refiere a las configuraciones alérgicas y la hipersensibilidad a alérgenos tales como el asma atópica o inducida con alérgenos, la dermatitis atópica (eccema), rinitis atópica (fiebre del heno), conjuntivitis alérgica, alergia alimentaria, alergia ocupacional, aspergilosis broncopulmonar alérgica y neumonitis por hipersensibilidad.

El término "asma" se refiere a un trastorno de las vías respiratorias caracterizado por la inflamación de las vías respiratorias, la hiperresponsividad y la obstrucción, que a menudo causa espasmos del sistema del músculo liso bronquial, y afecta tanto al tracto respiratorio superior como inferior. Hay varias formas de asma, caracterizadas por los variados grados de gravedad.

El asma leve, por ejemplo, se define como episodios breves de jadeos, con o sin disnea o tos. De manera moderada, el asma grave se define como jadeos y disnea y puede ser con o sin tos y expectoración, pero generalmente interfiere con actividades cotidianas y/o el sueño. El asma grave se caracteriza por la inhabilitación debido a la disnea, y el paciente afectado típicamente no puede comer o dormir de manera normal, está muy ansioso y, a menudo, está agotado. Una condición conocida como estado asmático es la forma más grave de asma, y, en general, requiere cuidados intensivos en el hospital e incluso puede ser fatal. Esta enfermedad puede producirse como resultado tanto de mecanismos alérgicos como no alérgicos.

El término "asma inducida por alérgenos" o "asma atópica" se refiere al asma que resulta de una hipersensibilidad a un antígeno/alérgeno. Esto incluye, entre otros, todos los alérgenos inhalables que incluyen polen de los árboles, pasto, maleza o hierbas u otro grupo de alérgenos tales como los ácaros del polvo, la caspa de animales, cucarachas, hongos y mohos. Además, se incluyen los alérgenos ocupacionales, como la harina, la leche de soja, el látex y diferentes ácaros (Tyrophagus putrescentiae; Lepidoglyphus destructor; Acarus siro). La hipersensibilidad a alérgenos, en particular, el asma inducida por antígenos/alérgenos se diagnostica generalmente en función del patrón de síntomas tales como tos, estornudos, irritación/comezón en la nariz o los ojos, aumento del lagrimeo y la congestión nasal, comezón en la piel con la formación de un eccema, así como también náuseas, vómitos, dolor abdominal, malestar y diarrea en la alergia alimentaria. El asma atópica se clasifica clínicamente según la frecuencia de los síntomas, el volumen espiratorio forzado reducido en un segundo (FEV1), o la velocidad de flujo espiratorio pico (Flujo pico), la variabilidad del Flujo pico, la hiperresponsividad de las vías respiratorias y el aumento en los niveles de IgE específica de alérgenos.

El término "alergia alimentaria" se refiere a una respuesta anormal del sistema inmune humano a alimentos dañinos, causada por la reacción del sistema inmune a algunas proteínas alimentarias, que generalmente involucran anticuerpos humanos producidos contra alérgenos específicos que se encuentran en los alimentos. Los ejemplos de alérgenos alimentarios comunes incluyen componentes de la leche, soja, pescado y mariscos, frutos secos, maní, trigo (gluten) y huevos.

Como se usa en esta invención, el término "polipéptido" se usa en su significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica del producto; por consiguiente, los péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido, y dichos términos pueden usarse de manera indistinta en esta invención, a menos que se indique específicamente lo contrario. Este término tampoco se refiere ni excluye las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como también otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto de ocurrencia natural como no natural. Un polipéptido puede ser una proteína completa o una subsecuencia de la misma. Los polipéptidos particulares de interés en el contexto de esta invención son secuencias de aminoácidos que comprenden fragmentos tolerogénicos.

El término "fragmentos" se refiere a polipéptidos que comprenden una porción de una secuencia de péptidos que corresponde a aminoácidos contiguos de un polipéptido establecido en esta invención, incluyendo las longitudes intermedias y sus variantes.

El término "VacA" incluye la VacA s1m1 (SEQ ID NO: 1, 4-11) y VacA s2m2 (SEQ ID NO: 2). Como se describe en Cover y col., 1992, J. Biol. Chem., 267:10570-1057 y Cover y col., 1997, J. Cell. Biol., 138:759-769. Según una realización particular, Vac A es VacA s1m1 de la SEQ ID NO: 1. Según otra realización, Vac A es VacA s2m2 de la SEQ ID NO: 2. Según otra realización, Vac A es VacA s1m1 de la SEQ ID NO: 9.

El término "variante" se aplica tanto a un polinucleótido como a un polipéptido. Una "variante" de polipéptido, según cómo se usa dicho término en esta invención, es un péptido o polipéptido sustancialmente homólogo a la secuencia de péptidos a la que se hace referencia, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente de aquella a la que se hace referencia. Dichas variantes pueden ser de ocurrencia natural o pueden generarse de manera sintética, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias de polipéptidos anteriores de la invención, que se describen en esta solicitud, usando cualquier número de técnicas bien conocidas en la técnica. En muchos casos, una variante contendrá sustituciones conservadoras. Sustancialmente homólogo significa una secuencia de aminoácidos variante que es idéntica a la secuencia peptídica de referencia, excepto por la eliminación, inserción y/o sustitución de algunos aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos. Sustancialmente homólogo significa una secuencia de aminoácidos variante que es al menos un 80, un 85, un 90, un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de referencia. Una secuencia de ácido nucleico variante puede ser al menos un 80, un 85, un 90, un 95, un 96, un 97, un 98 o un 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de referencia. La identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico se puede determinar mediante inspección visual y/o cálculo matemático, o más fácilmente comparando información de secuencia usando un programa informático conocido utilizado para la comparación de secuencias, tal como el paquete Clustal versión 1.83.

Una variante puede comprender una secuencia que tiene al menos un aminoácido sustituido de manera conservadora. Una "sustitución conservadora" es una en la que un aminoácido se sustituye con otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo tal que un experto en la materia de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido sustancialmente no cambien (por ejemplo, que tenga características fisioquímicas similares). Es posible hacer modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención y aun así obtener una molécula funcional que codifica una variante o un polipéptido derivado con características deseables, por ejemplo, con características tolerogénicas. Cuando se desea alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente, o incluso una variante tolerogénica mejorada o una porción de un polipéptido de la invención, un experto en la materia típicamente cambiaría uno o más de los codones de la secuencia de ADN de codificación. Al hacer esos cambios, se considera el índice hidropático, la polaridad, la carga, la solubilidad, la hidrofobicidad, la hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los aminoácidos. La importancia del índice de aminoácidos hidropáticos en otorgar la función biológica interactiva en una proteína se entiende generalmente en la técnica (Kyte, y col., 1982, J. Mol. Biol., 157: 105- 131). Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo alifático por otro, tal como Ile, Val, Leu o Ala por otro, o sustituciones de un residuo polar por otro, tal como entre Lys y Arg; Glu y Asp; o Gln y Asn. Se conocen bien otras sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen características de hidrofobicidad similares (Kyte, y col., 1982, supra). Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácidos nativo con un residuo no nativo de tal manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácidos en esa posición. Los expertos en la materia pueden determinar las sustituciones de aminoácidos deseadas (ya sean conservadoras o no conservadoras) en el momento en que se deseen dichas sustituciones. En la Tabla 1, a continuación, se presentan sustituciones de aminoácidos ejemplares. El término "variante" también incluye un péptido o polipéptido sustancialmente homólogo a la secuencia peptídica de referencia, pero que tiene una secuencia de aminoácidos diferente a la de la secuencia de referencia porque uno o más aminoácidos se han modificado químicamente o se han sustituido por análogos de aminoácidos. Este término también incluye polipéptidos glicosilados.

Tabla 1

En general, las sustituciones para uno o más aminoácidos presentes en el polipéptido original deben hacerse de manera conservadora. Los polipéptidos de la invención, los fragmentos de polipéptidos y sus variantes son capaces de inducir tolerancia a un antígeno/alérgeno cuando se los administra in vivo.

Mediante "fragmento tolerogénico" se hace referencia a un fragmento que puede inducir tolerancia a los antígenos/alérgenos descritos en la presente solicitud. En ciertas realizaciones, un fragmento tolerogénico puede inducir tolerancia a antígenos/alérgenos, al menos, así como también puede hacerlo el polipéptido VacA de longitud completa y, en ciertas realizaciones, puede ser más efectivo que el polipéptido VacA de longitud completa a la hora de inducir tolerancia. Sin embargo, en ciertas realizaciones, un fragmento tolerogénico induce la tolerancia a antígenos/alérgenos, pero podría no inducir tolerancia tan efectivamente como lo haría el polipéptido VacA de longitud completa. Dichos fragmentos tolerogénicos incluso pueden ser útiles en la presente invención, particularmente donde dichos fragmentos tolerogénicos tienen otras propiedades ventajosas, tales como, entre otras, facilidad de preparación o purificación, en comparación con el polipéptido VacA de longitud completa. Como lo reconocerá un experto en la materia, se puede usar una variedad de ensayos conocidos para evaluar la inducción de tolerancia, incluyendo la medición de respuestas de hipersensibilidad de tipo demorado (DTH), la medición de producciones de citocinas mediante ELISA u otros procedimientos, la proliferación de células T o ensayos de citotoxicidad, ensayos de proliferación de células, la producción de anticuerpos y similares. Dichos ensayos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Current Protocols in Immunology, Editado por: Coligan y col., 2001 John Wiley & Sons, NY, N.Y.; Ausubel y col., 2001, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y.).

Los polipéptidos de la invención se preparan usando cualquiera de una variedad de técnicas sintéticas y/o recombinantes bien conocidas, siendo estas últimas descritas adicionalmente a continuación. Los polipéptidos, porciones y otras variantes generalmente de menos de 150 aminoácidos pueden generarse por medios sintéticos, usando técnicas bien conocidas para aquellos con un conocimiento ordinario en la técnica. En un ejemplo ilustrativo, dichos polipéptidos se sintetizan usando cualquiera de las técnicas de fase sólida comercialmente disponibles, como el procedimiento de síntesis de fase sólida de Merrifield, donde los aminoácidos se agregan secuencialmente a una cadena de aminoácidos creciente (Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2146).

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo compuesto por un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable.

El término "vehículo" se refiere a cualquier componente presente en una formulación farmacéutica que no sea el agente activo y, por lo tanto, incluye diluyentes, aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, cargas, agentes colorantes, agentes humectantes o agentes emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, conservantes y similares.

Como se usa en el presente documento, "tratamiento" y "tratar" y similares generalmente significan obtener un efecto farmacológico y fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir o prevenir parcialmente una enfermedad, síntoma o afección de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa de una enfermedad, afección, síntoma o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término "tratamiento" como se usa en esta invención cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, en particular un humano, y no necesariamente significa que implica la cura o la abolición completa de los síntomas, sino que se refiere a cualquier tipo de tratamiento que imparte un beneficio a un paciente e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no se ha diagnosticado que la tiene, por ejemplo, basándose en los antecedentes familiares; estado de sobrepeso o edad; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o aliviar la enfermedad, es decir, causar una regresión de la enfermedad y/o sus síntomas o afecciones, tal como la mejora o reparación del daño.

En particular, la prevención y/o el tratamiento de trastornos alérgicos según la invención comprende la normalización o la disminución de la sensibilidad al antígeno/alérgeno de la persona. El término "tratamiento" hace referencia a cualquier tipo de tratamiento o prevención que imparte un beneficio a un sujeto afectado por o en riesgo de desarrollar una respuesta inmune de hipersensibilidad a un alérgeno/alérgeno de interés, incluyendo la mejora en la condición del sujeto (por ejemplo, en uno o más síntomas), la demora en la aparición de los síntomas o la ralentización de la progresión de los síntomas, etc. Según un aspecto particular, la prevención y/o el tratamiento de trastornos alérgicos según la invención comprende la inducción de tolerancia periférica a alérgenos.

Según un aspecto, los efectos de un tratamiento según la invención se pueden observar a través de uno o más de los siguientes: prevención o reducción de la hiperresponsividad de las vías respiratorias, prevención o reducción de la penetración celular en los tubos bronquiales (típicamente a través de los mecanismos funcionales para inhibir la producción de IL-4 que es una citocina secretada por células Th2 y que está involucrada en mecanismos inflamatorios de reacción alérgica), prevención o reducción de la inflamación pulmonar, de la eosinofilia broncoalveolar, de la metaplasia de células calciformes, de la producción de mucosa y la producción de citocinas Th2 que son sellos distintivos del asma inducida por alérgenos. El éxito del tratamiento también puede ser evidente mediante la observación de la generación de IL-10 en linfocitos regulatorios u otras células o en los pulmones completos (BALF, septo) o en el suero, lo que puede evaluarse mediante un ELISA. El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos contemplados por la presente invención incluyen seres humanos, primates, animales domésticos tales como ganado bovino, ganado ovino, cerdos, caballos, roedores de laboratorio y similares.

El término "sujetos o personas de alto riesgo" se refiere a sujetos que están en riesgo de desarrollar hipersensibilidad a alérgenos/antígenos, en particular de desarrollar asma atópica o inducida por alérgenos. Aquellos incluyen la predisposición genética, tal como una historia familiar de enfermedades atópicas en parientes cercanos, una madre que fumaba durante el embarazo, y un entorno de fumadores después de nacer, infecciones respiratorias virales, como por el virus sincitial respiratorio y el rinovirus, así como también exposición ocupacional a alérgenos ocupacionales conocidos (por ejemplo, harina). El riesgo de predisposición a desarrollar hipersensibilidad a alérgenos/antígenos, en particular, de desarrollar asma atópica o inducida por alérgenos, se puede evaluar mediante el registro de la historia completa, incluyendo la historia familiar del paciente, una prueba cutánea, la evaluación de la IgE en suero, los niveles de IgE en suero específicos y la medición de la hiperreactividad de las vías respiratorias. El término "eficacia" de un tratamiento o procedimiento según la invención puede medirse basándose en cambios en el transcurso de la enfermedad o afección en respuesta a un uso o un procedimiento según la invención. Por ejemplo, la eficacia de un tratamiento o procedimiento según la invención puede medirse mediante la medición del nivel de tolerancia de un sujeto antes y después del tratamiento, por ejemplo, como se describe a continuación.

El término "tolerancia" como se hace referencia en esta invención se define como la falta de respuesta inmune a un antígeno/alérgeno, generalmente un antígeno/alérgeno implicado en la causa de una enfermedad. Si bien la tolerancia se puede inducir mediante la administración de antígenos/alérgenos a través de diferentes vías, la tolerancia oral hace referencia a la administración por vía oral de la composición, que resulta en la inducción de la tolerancia a un antígeno/alérgenos, cuando se los administra in vivo. La inducción de tolerancia puede, por lo tanto, monitorizarse mediante varias técnicas, que incluyen: medir la respuesta al alérgeno en una prueba de pinchazo en la piel, la evaluación de la IgE específica del alérgeno y la evaluación de respuestas específicas de las células T para el alérgeno (proliferación y producción de citocinas).

El término "cantidad tolerogénicamente efectiva", como se usa en esta invención, se refiere a una cantidad de al menos un polipéptido seleccionado de entre VacA, un fragmento de VacA y una variante de VacA o una formulación farmacéutica de la misma, según la invención, que suscita una respuesta tolerogénica detectable en un sujeto al que se le está administrando el dicho sujeto.

Como se usa en esta invención, el término "antígeno" se refiere a una sustancia extraña que, al ser introducida en el cuerpo, dispara una respuesta del sistema inmune, que resulta en la producción de un anticuerpo como parte de la defensa del cuerpo contra la enfermedad.

El término "alérgeno" implica que designa un antígeno capaz de elucidar una respuesta inmune de hipersensibilidad (como se describe en esta invención) en un individuo, como en un animal o un humano. El alérgeno puede ser un alérgeno sensibilizante o un alérgeno de reacción cruzada.

El término "no desnaturalizado" hace referencia a la ausencia de desnaturalización observada en la proteína (por ejemplo, la estructura). Esto se puede verificar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica, tal como la electroforesis en gel, la filtración en gel o la espectrometría de masas.

Los polipéptidos de la invención y sus formulaciones tienen propiedades inmunomoduladoras que pueden ser útiles para las estrategias de tolerización, tales como en los trastornos alérgicos y, en particular, el asma alérgica. Los polipéptidos de la invención y las formulaciones del mismo pueden ser útiles, en particular, en tratamientos de tolerización para la prevención contra el asma en personas de alto riesgo.

Polipéptidos VacA de la invención en forma de extractos de células muertas o péptidos purificados los polipéptidos VacA de la invención incluyen las sustancias descritas en la descripción detallada y pueden administrarse en diferentes formas, incluyendo en una forma de un extracto celular (muerto) que contiene VacA o en una forma de un polipéptido sintético purificado (producido de manera recombinante u obtenido por síntesis).

En un aspecto, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un extracto de células muertas de bacterias de H. pylori.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un extracto de células bacterianas de H. pylori, en el que las células bacterianas son células bacterianas de H. pylori muertas y no desnaturalizadas.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un extracto de células muertas bacterianas de H. pylori, en el que la cepa bacteriana de H. pylori es PMSS1 (Arnold y col.

2011, Gastroenterology, 140, 199-209), o cualquier otro aislado de un paciente humano útil de H. pylori, o mutantes de dichos aislados que carecen de uno o más genes debido a la eliminación de genes o la mutagénesis de inserción o mutaciones de punto.

Los procedimientos que se pueden usar para preparar el extracto celular de H. pylori son conocidos para el experto en la materia e incluyen el uso de medios físicos que producen bacterias celulares muertas no desnaturalizadas, es decir, en condiciones no desnaturalizantes, como las descritas en Laemmli y col., 1970, Nature, 277, 680-, tales como, por ejemplo, el uso de la así llamada "prensa celular de presión francesa" (Kelemen y col., 1979, J. Cell Sci. 35:431-141;.

De manera alternativa, se puede aplicar la ultrasonicación y otros procedimientos, tal como la liofilización extendida, los ciclos repetidos de congelación y descongelación, liofilización, técnicas de homogeneización y otras técnicas de alteración celular que usan fuerzas físicas, siempre y cuando preserven las proteínas de H. pylori en forma nativa, como se describe en Bhaduri y col., 1983, Appl. Environ. Microbiol., 46 (4): 941-3).

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un extracto de células bacterianas de H. pylori que puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(i) cosechar un cultivo de células de bacterias vivas;

(ii) someter las bacterias cosechadas a varios ciclos de congelación/descongelación en agua o una solución acuosa de una sal;

(iii) alterar las células bacterianas bajo alta presión, por ejemplo, usando una prensa celular de presión francesa; (iv) recolectar el extracto celular.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un extracto de células bacterianas de H. pylori que pueden obtenerse mediante un procedimiento tal como se describió antes, el cual comprende una etapa adicional de eliminar el residuo celular después de o al recolectar el extracto celular.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un polipéptido VacA purificado.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de un polipéptido VacA purificado recombinante.

En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA de la invención en la forma de una composición de polipéptidos VacA esencialmente pura, es decir, esencialmente libres de otros componentes de antígenos de extracto nativo como CagA y/o NAP (proteína de activación de neutrófilos). Por ejemplo, dicha composición de polipéptidos VacA esencialmente pura puede obtenerse de cepas de H. pylori mutadas que tienen los otros genes de componentes desactivados, por ejemplo, donde el gen CagA está desactivado.

La preparación del polipéptido VacA, según la invención, de manera recombinante, se puede lograr mediante varias técnicas conocidas en la técnica.

La secuencia de codificación ácido nucleico para dicho polipéptido VacA, del mismo, puede insertarse en el vector de expresión recombinante mediante los procedimientos bien conocidos para un experto en la materia, tales como, por ejemplo, los que se describen en MOLECULAR CLONING: A LABo Ra TORY MANUAL, Sambrook y col., 4ta Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001.

La introducción del vector recombinante en una célula huésped puede realizarse según procedimientos que se conocen bien por un experto en la materia, tales como los descritos en BASIC METHODS IN MOLECULAR BIo Lo GY, Davis y col., 2a ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, y MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, supra, tal como transfección por fosfato de calcio, transfección por DEAE dextrano, transfección, microinyección, transfección por lípidos catiónicos, electroporación, transducción o infección.

La célula huésped puede ser, por ejemplo, células bacterianas tales como E. coli, células de hongos tal como las células de levaduras y células de Aspergillus, Streptomyces, células de insectos, células de ovario de hámster chino (CHO), la línea celular de ratón C127, la línea celular BHK de células de hámster sirio y células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293). En una realización particular, la célula huésped es una célula CHO o una célula HEK 293.

Las células huésped pueden usarse, por ejemplo, para expresar un polipéptido de la invención. Después de la purificación por procedimientos estándar, el polipéptido de la invención puede usarse en un procedimiento descrito posteriormente en el presente documento.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración. Después de la etapa de concentración, el concentrado se puede aplicar a una matriz de purificación tal como un medio de filtración en gel. Como alternativa, se puede emplear un intercambio aniónico y/o una resina de afinidad. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente empleados en la purificación de proteínas. Como alternativa, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico.

Algunas o todas las etapas de purificación anteriores, en diversas combinaciones, se conocen bien y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

Los polipéptidos recombinantes producidos en un cultivo bacteriano pueden aislarse mediante la alteración inicial de las células huésped, la centrifugación, la extracción de los gránulos celulares si se trata de un polipéptido insoluble, o del líquido sobrenadante si se trata de un polipéptido soluble, seguida de una o más etapas de concentración, desalado, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión por tamaño. Las células microbianas pueden interrumpirse por cualquier procedimiento conveniente, incluido el ciclo de congelacióndescongelación, sonicación, interrupción mecánica, o el uso de otros agentes de lisis celular química o física, incluyendo detergentes.

En otro aspecto, el polipéptido VacA de la invención se puede preparar de manera recombinante como una proteína de longitud completa, como se describe en McClain y col., 2003, J. Biol. Chem., 278:12101-12108, o a través de la reconstitución de sus dos dominios, p33 y p55, en la presencia de detergentes, como se describe en Gonzalez-Rivera y col., 2010, Biochemistry 49:5743-5752 y Gangwer y col., 2007, PNAS, 104(41 ):16293-8.

En otro aspecto, la presente invención proporciona los polipéptidos VacA descritos en esta invención. El polipéptido abarcado por la presente invención exhibirá típicamente al menos alrededor del 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% o más identidad (determinada como se describe a continuación), a lo largo de su longitud, con secuencias de polipéptidos establecidas en esta invención.

En otro aspecto, los polipéptidos VacA se pueden usar asociados con una sal farmacéuticamente aceptable o una combinación de sales farmacéuticamente aceptables.

Composiciones

La invención proporciona polipéptidos VacA, composiciones farmacéuticas de los mismos, que son útiles para tratar un sujeto, en particular, un mamífero, y, más particularmente, un paciente humano que sufre de una hipersensibilidad a un alérgeno/antígeno o que está en riesgo de desarrollar hipersensibilidad a un antígeno/alérgeno, en particular, asma atópica o inducida por alérgenos o una alergia alimentaria.

Según otro aspecto, la invención proporciona polipéptidos VacA, composiciones farmacéuticas de los mismos, que son útiles para controlar la hipersensibilidad a un antígeno/alérgeno en un sujeto, en particular, para inducir una tolerancia a dicho antígeno/alérgeno.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden contener al menos un polipéptido VacA según la invención en cualquier forma descrita en esta invención. Según un aspecto particular, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones tolerogénicas. En un aspecto particular, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones tolerogénicas capaces de inducir una tolerancia periférica y disminuir la respuesta inmune a los antígenos a través de la inmunoregulación en una realización particular, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden al menos un polipépitdo VacA, una variante o fragmento del mismo que se encuentra esencialmente libre de componentes inmunogénicos tales como el epítope o alérgeno inmunogénico.

En otro aspecto particular, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones tolerogénicas que comprenden al menos un polipéptido VacA, en combinación con alérgenos conocidos, tales como alérgenos alimentarios, como los que derivan de la leche, el maní, el pescado o los mariscos, el trigo (gluten), la soja, el huevo o similares.

En otro aspecto particular, las composiciones farmacéuticas de la invención son composiciones tolerogénicas que comprenden al menos un polipéptido VacA en combinación con alérgenos conocidos, tales como los alérgenos derivados del polen como los del polen del pasto, de los árboles, la maleza y similares. Según un aspecto particular, las composiciones tolerogénicas tienen la capacidad de inducir tolerancia inmune específicas de alérgenos y disminuir la respuesta inmune a través de la inmunoregulación (conocida como desensibilización o hiposensibilización, o inmunoterapia.

Según un aspecto particular, al menos un polipéptido VacA de la invención se administra en combinación con alérgenos conocidos, en particular, alérgenos alimentarios. La combinación puede lograrse mediante la administración concomitante de dicho al menos un polipéptido VacA y del alérgeno o la administración de dicho al menos un polipéptido VacA y el alérgeno dentro de la misma formulación simple o la administración de dicho al menos un polipéptido VacA cuando está covalentemente enlazado a algún componente inmunogénico de dicho alérgeno.

Las composiciones de esta invención pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales farmacéuticamente aceptables, tales como alumbre, estabilizantes, agentes antimicrobianos, tampones, agentes colorantes, agentes saporíferos, adyuvantes y similares.

Las composiciones según la invención, junto con un adyuvante, vehículo, diluyente o excipiente empleado convencionalmente, pueden colocarse en forma de composiciones farmacéuticas y dosis unitarias de los mismos, y en dicha forma pueden emplearse como sólidos, tales como comprimidos o cápsulas cargadas o líquidos tales como soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires o cápsulas cargadas con los mismos, todo para su uso oral, o en forma de soluciones inyectables estériles para uso parenteral (incluso subcutáneo) mediante inyección o infusión continua. Las composiciones inyectables se basan típicamente en una solución salina estéril inyectable o una solución salina tamponada con fosfato, u otros vehículos inyectables conocidos en la técnica. Dichas composiciones farmacéuticas y formas de dosificación unitarias de las mismas comprenden ingredientes en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios activos adicionales, y dichas formas de dosificación unitarias pueden contener cualquier cantidad eficaz adecuada del principio activo proporcional al intervalo de dosis diaria prevista que se va a emplear. Según una realización particular, las composiciones según la invención son inyectables.

Las composiciones de esta invención pueden ser formulaciones líquidas incluyendo, entre otras, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes y elixires. Las composiciones también pueden formularse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos incluyendo, entre otros, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Los agentes de suspensión incluyen, entre otros, jarabe de sorbitol, metil celulosa, jarabe de glucosa/azúcar, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetil celulosa, gel de estearato de aluminio y grasas comestibles hidrogenadas. Los agentes emulsionantes incluyen, entre otros, lecitina, monooleato de sorbitán y goma arábiga. Los conservantes incluyen, entre otros, p-hidroxibenzoato de metilo o propilo y ácido sórbico. Los agentes de dispersión o humectantes incluyen, entre otros, poli(etilen glicol), glicerol, albúmina de suero bovino, Tween®, Span®.

Materiales adicionales, así como técnicas de procesamiento de la formulación y similares, se exponen en la Parte 5, de Part 5 del documento de Remington “The Science and Practice of Pharmacy”, 22da Edición, 2012, Universidad de Ciencias de Filadelfia, Lippincott Williams & Wilkins.

Las composiciones de esta invención también se pueden formular como una preparación de liberación lenta, que se puede administrar por implante o mediante inyección intramuscular.

Las composiciones sólidas de esta invención pueden estar en forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional. Por ejemplo, los comprimidos y cápsulas para administración por vía oral pueden contener excipientes convencionales, incluyendo, entre otros, agentes de unión, cargas, lubricantes, disgregantes y agentes humectantes. Los agentes de unión incluyen, entre otros, jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucílago de almidón y polivinilpirrolidona. Las cargas incluyen, entre otras, lactosa, azúcar, celulosa microcristalina, almidón de maíz, fosfato de calcio y sorbitol. Los lubricantes incluyen, entre otros, estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, polietilenglicol y sílice. Los disgregantes incluyen, entre otros, almidón de patata y glicolato de almidón sódico. Los agentes humectantes incluyen, entre otros, laurilsulfato sódico. Los comprimidos pueden estar recubiertos según los procedimientos bien conocidos en la técnica.

Las composiciones de esta invención también se pueden formular para inhalación, que pueden estar en una forma que incluye, entre otras, una disolución, suspensión o emulsión que se pueden administrar como un polvo en seco o en forma de aerosol o rocío usando un propulsor. Los compuestos de esta invención también se pueden administrar en formas de liberación sostenida o de sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida.

En ciertas realizaciones, el o los compuestos terapéuticos se administran directamente como un aerosol presurizado o una formulación nebulizada para los pulmones del paciente mediante inhalación. Dichas formulaciones pueden contener cualquiera de una variedad de propulsores de aerosol conocidos útiles para la administración endopulmonar y/o inhalación intranasal. Además, pude haber agua presente, con o sin una variedad de cosolventes, tensoactivos, estabilizadores (por ejemplo, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y búferes). Para las composiciones a ser administradas desde múltiples contenedores de dosis, típicamente se añaden agentes antimicrobianos. Dichas composiciones también se filtran y esterilizan generalmente, y pueden liofilizarse para proporcionar una estabilidad realzada y mejorar la solubilidad.

La composición farmacéutica de la invención puede consistir en unidades de dosificación que se pueden administrar como un aerosol. El término aerosol se usaron para denotar una variedad de sistemas que van desde aquellos de naturaleza coloidal a sistemas que consisten en paquetes presurizados. El suministro puede ser mediante un gas licuado o comprimido o efectuarse mediante un sistema de bomba adecuado que dispensa los ingredientes activos. Los aerosoles de los compuestos de la invención se pueden suministrar en sistemas de una sola fase, bifásicos o trifásicos, a fin de suministrar el o los ingredientes activos. El suministro del aerosol incluye los contenedores, activadores, válvulas, subcontenedores y similares, que son necesarios y juntos forman un kit. Una persona con conocimientos ordinarios en la técnica, sin la experimentación indebida, puede determinar los aerosoles preferidos. Según un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica oral. Según un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica inyectable.

Según un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica inyectable.

Como se describe en otra parte de esta invención, en ciertas realizaciones, una dosis profiláctica/terapéuticamente efectiva de un polipéptido VacA, una composición farmacéutica de la misma, como se usa en esta invención, es una dosis suficiente para inducir tolerancia a un antígeno/alérgeno medido usando cualquiera de una variedad de procedimientos, como se describe en esta invención. En una realización adicional, la dosis profiláctica/terapéuticamente efectiva de un polipéptido VacA, una composición farmacéutica de la misma, como se usa en esta invención, es una dosis suficiente para inducir tolerancia de las células T a un antígeno/alérgeno según se haya medido usando cualquiera de una variedad de procedimientos como se describen en esta invención, como ensayos de liberación de citocinas, tinción de citocinas intracelulares y citometría de flujo, y similares. También se pueden usar ensayos de células T funcionales, ensayos de supresión de células T que miden la supresión de la proliferación o la secreción de citocinas mediante células T efectoras conjuntamente cultivadas.

Modo de administración

Los polipéptidos y composiciones de esta invención se pueden administrar de cualquier manera, incluyendo su inyección intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, por vía oral, administración intranasal, instilación intrapulmonar o mediante inhalación. En ciertas realizaciones, también se puede usar una composición de diferentes rutas.

La dosis exacta de polipéptidos y composiciones es determinada directamente por un experto en la materia en función de estas demostraciones, junto con la potencia del polipéptido y la composición específicos, la edad, el peso, el sexo y la condición fisiológica del sujeto.

A modo de ejemplo, en varias realizaciones, la dosificación de un polipéptido y composición tolerizantes requeridas para lograr (o mantener) la tolerancia en un sujeto es baja en relación con los regímenes de tolerización tradicional. Por ejemplo, tan poco como una o unas pocas dosis (por ejemplo, menos de alrededor de tres, menos de alrededor de cinco dosis) de agente pueden ser suficientes para inducir la tolerancia. A modo de ejemplo, una dosis semanal de alrededor de 5 a alrededor de 500 mg puede usarse para lograr los efectos de tolerización.

Según una realización, los polipéptidos y las composiciones de la invención se administran antes o al inicio de la aparición de los síntomas alérgicos o la exposición a la provocación de alérgenos. Por ejemplo, los polipéptidos y las composiciones de la invención son administrados antes de que el sujeto se someta al o los alérgenos, típicamente en el caso de pacientes en riesgo de sufrir un trastorno alérgico estacional, como alergia al polen, o antes de que el paciente ya haya desarrollado síntomas alérgicos, como en el caso de infantes en riesgo de sufrir un trastorno alérgico (por ejemplo, riesgo genético o ambiental), como el asma atópica. La administración durante la preñez (por vía oral, intranasal o cualquier otra vía) a madres preñadas en riesgo de atopia también se puede prever, ya sea sola o en combinación con el tratamiento continuado del infante recién nacido, como se describe en Pfefferie y col., 2013, J. Allergy Clin. Immunol., 131(6):1453-63.

Según una realización adicional, los polipéptidos y composiciones de la invención se administran al menos dos semanas (por ejemplo, desde alrededor de dos a alrededor de 12 semanas) antes del período usual de exposición a alérgenos. Según una realización adicional, los polipéptidos y composiciones de la invención se administran mediante administraciones repetidas antes y/o hasta y/o a lo largo de la exposición a alérgenos, como, por ejemplo, desde alrededor de una o dos veces a la semana a alrededor de una dos veces al mes. En el caso de la administración a madres preñadas con el objetivo de reducir el asma y el riesgo alérgico en el recién nacido, la administración debería iniciarse temprano, idealmente ya en el primer trimestre (Pfefferie y col., 2013, supra).

Combinación

Según la invención, un polipéptido Vac A y las formulaciones farmacéuticas del mismo pueden administrarse solos o en combinación con un coagente útil en la prevención y/o el tratamiento de la hipersensibilidad, en particular, trastornos alérgicos tales como el asma atópica, por ejemplo, un coagente seleccionado de entre un broncodilatador, un alérgeno administrado de manera conjunta usado para la hiposensibilización con un coagente útil en la tolerización a un antígeno/alérgeno, por ejemplo, anticuerpos u otros reactivos que interfieren con la coestimulación o la inhibición conjunta (por ejemplo, mediante PD1, CTLA-4, CD28, CD40 y otros expresados en linfocitos y otras células inmunes.

La invención abarca la administración de un polipéptido Vac A y formulaciones farmacéuticas del mismo a un individuo antes de, de manera simultánea o secuencialmente con otros regímenes terapéuticos/profilácticos/inmunoterapéuticos o coagentes en la prevención o el tratamiento de la hipersensibilidad al antígeno/alérgeno, en particular, trastornos alérgicos tales como el asma atópica (por ejemplo, el régimen de tolerización combinado), en una cantidad terapéuticamente efectiva. Un polipéptido Vac A, la formulación farmacéutica del mismo que se administra simultáneamente con dichos coagentes, se puede administrar en la(s) misma(s) o en diferentes composiciones y mediante la(s) misma(s) o diferentes vías de administración.

Según otro aspecto, los polipéptidos Vac A según la invención se pueden usar en un régimen de inmunoterapia en el que los polipéptidos de Vac A según la invención se asocian con al menos un antígeno de una amplia variedad de antígenos (alérgenos). El extracto de H. pylori o los polipéptidos VacA podrían mezclarse y administrarse con alérgenos de ácaros del polvo del hogar, alérgenos derivados del polen o cualquiera de os alérgenos alimentarios antes enumerados (derivados de maní, leche, soja u otros) o cualquier otro alérgeno, a fin de promover la desensibilización (hiposensibilización) de una manera específica para los alérgenos (Khinchi y col., 2004, Allergy, 59(1):45-53).

Según una realización, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido Vac A combinado con al menos un coagente útil en la prevención y/o el tratamiento de la hipersensibilidad, en particular, trastornos alérgicos tales como el asma atópica, y al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo.

La dosis administrada, como dosis únicas o múltiples, a un individuo variará dependiendo de una diversidad de factores, incluyendo las propiedades farmacocinéticas, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), la magnitud de los síntomas, tratamientos simultáneos, frecuencia de tratamiento, y el efecto deseado.

Pacientes

En una realización, los pacientes según la invención son pacientes que sufren de un trastorno seleccionado de un trastorno alérgico tal como el asma inducida por alérgenos o atópica (eccema), la dermatitis atópica (fiebre del heno), la rinitis atópica, la conjuntivitis alérgica, alergia alimentaria, alergia ocupacional, aspergilosis broncopulmonar alérgica y la neumonitis por hipersensibilidad.

En otra realización, los pacientes según la invención son pacientes en riesgo de sufrir un trastorno alérgico.

En otra realización adicional, los pacientes según la invención sufren de asma atópica o inducida por alérgenos. En otra realización, los pacientes según la invención son pacientes en riesgo de sufrir un trastorno alérgico estacional tal como alergia al polen, incluyendo la alergia al polen de los alimentos.

En otra realización adicional, los pacientes según la invención son niños o infantes, por ejemplo, infantes antes de la edad de alrededor de tres años.

En otra realización adicional, los pacientes según la invención son madres preñadas con un alto riesgo de atopia o madres preñadas de niños con un alto riesgo de atopia, que pueden tratarse durante la preñez.

En otra realización adicional, los pacientes según la invención sufren un trastorno alérgico seleccionado de entre dermatitis atópica, rinitis atópica y conjuntivitis alérgica.

En otra realización adicional, los pacientes según la invención sufren una alergia alimentaria.

Uso según la invención

Según un aspecto de la presente invención, los polipéptidos de la invención son útiles en un procedimiento para tolerizar a un sujeto o inducir una respuesta de tolerización en dicho sujeto a al menos un antígeno/alérgeno mediante el uso de un polipéptido o una formulación o combinación como en esta invención. El polipéptido, la formulación o la combinación según la invención se puede administrar en una cantidad y según un régimen de dosificación efectivos para inducir tolerancia en un sujeto.

En una realización de la invención el trastorno alérgico es asma atópica.

En una realización adicional de la invención, los polipéptidos según la invención son útiles para un sujeto predispuesto o en riesgo de desarrollar un trastorno alérgico, en particular, asma atópica, por ejemplo, en función de una historia familiar, un estado de sobrepeso o la edad.

Según otra realización, la invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende un polipéptido seleccionado de entre una proteína Vac A, combinada con al menos un coagente útil en la prevención, represión y/o tratamiento de un trastorno alérgico, en particular, asma atópica y/o para inducir una respuesta de tolerización a un alérgeno, y al menos un vehículo, un diluyente o un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, se proporciona un uso o un procedimiento según la invención, en la que un polipéptido o una combinación de la invención se usarán en combinación con un alérgeno.

En otra realización, se proporciona un polipéptido o una composición según la invención, en la que un polipéptido o una composición del mismo se administrará por vía oral, intranasal, intrapulmonar, parenteral o sistémica. En otra realización, se proporciona un polipéptido o una composición según la invención, en la que VacA es VacA s1m1. En otra realización, se proporciona un polipéptido o una composición según la invención, en la que VacA es VacA s2m2.

En otra realización, se proporciona un polipéptido o una composición según la invención, en la que una proteína Vac A es una proteína Vac A que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11.

En otra realización, se proporciona un polipéptido o una composición según la invención, en la que una proteína Vac A tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 o que tiene al menos el 90% de identidad con la misma.

En otra realización, se proporciona un polipéptido o una composición según la invención, en la que una proteína Vac A tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o que tiene al menos el 90% de identidad con la misma.

Los ejemplos que ilustran la invención se describirán en lo sucesivo de manera más detallada y en referencia a las realizaciones representadas en las Figuras.

EJEMPLOS

Las siguientes abreviaturas se refieren respectivamente a las definiciones que se indican a continuación:

BALF (fluido de lavado broncoalveolar), BCA (ensayo ácido bicinconinico), EDTA (ácido etileno-diaminotetraacético), FCS (suero fetal bovino), GM-CSF (factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos), H&E (hematoxilina y eosina, i.p. (intraperitonealmente), MCTP1 (proteasa de mastocitos PI), MLN (nódulo linfático mesentérico), PAS (ácido peryódico de Schiff), PBS (tampón fosfato salino), RPMI (Royal Park Memorial Institute (medio de cultivo).

Ejemplo 1: Extracto de células muertas de H. pylori en asma inducida por alérgenos

Para evaluar si la administración regular de composiciones de la invención proporcionada en la forma de un extracto de células muertas de H. pylori protege contra respuestas inducidas por alérgenos, como el asma, se usó el siguiente modelo: a los ratones se les administraron dosis semanales por vía intragástrica de extracto de células muertas enteras (preparadas como se describe a continuación) a partir del día 7 de edad en adelante, antes de someterlos a la sensibilización con ovoalbúmina y a la provocación con ovoalbúmina con alumbre como adyuvante, como se describe a continuación. Los ratones de control que habían recibido ovoalbúmina, pero no el extracto de células muertas de H. pylori, desarrollaron hiporresponsividad de las vías respiratorias a la metacolina (Fig. 1A,B), infiltración celular inmune broncoalveolar y eosinofilia, según se midió mediante la tinción y la cuantificación de las células cosechadas por lavado broncoalveolar (Fig. 1C,D), así como también inflamación pulmonar histológicamente evidente y metaplasia de células calciformes, según se determinó mediante la evaluación histológica y la puntuación de las secciones de parafina teñidas con H&E y PAS (Fig. 1 E-G). La reestimulación de las preparaciones pulmonares de células individuales con ovoalbúmina indujo la producción de altos niveles de las citocinas Th2 IL-5 e IL-13, según se midió mediante un ELISA y una matriz de esferas citométricas (siguiendo las instrucciones del fabricante, R&D Biosystems; BD Biosciences) (Fig. 1H,I). En cambio, los ratones que recibieron el extracto de células muertas de H. pylori fueron protegidas contra la hiperresponsividad de las vías respiratorias (Fig. 1A,B), y mostraron niveles significativamente más bajos de inflamación broncoalveolar y pulmonar, eosinofilia y metaplasia de las células calciformes (Fig. 1C-G). La producción de citocinas Th2 tras la reestimulación de ELISA de las preparaciones pulmonares y la matriz de esferas citométricas también se redujeron (Fig. 1H,I). El hecho de que los ratones tratados con el extracto de células muertas no desarrollaran síntomas de asma inducida por alérgenos no se debió a una respuesta principal deteriorada al alérgeno, ya que los niveles IgE en suero específicos de ovoalbúmina, según la medición con ELISA, fue similar en todos los ratones sensibilizados.

Para abordar la especificidad de los efectos observados y elucidar los requisitos previos claves de la protección, se investigaron varias vías y regímenes de administración, así como también las edades de aparición del tratamiento y extractos de otros patógenos gastrointestinales. De manera interesante, la administración sistémica (intraperitoneal) de extracto de células muertas de H. pylori fue eficiente como la vía intragástrica a la hora de otorgar protección contra el asma inducida por alérgenos. El tratamiento intragástrico fue menos efectivo cuando se inició en ratones adultos, en comparación con los neonatos. El extracto de H. pylori inactivado por calor, así como también cantidades idénticas de extractos generados a partir de los cultivos de E. coli o Salmonella typhimurium, no otorgaron protección contra las características examinadas de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas.

En conclusión, los efectos beneficiosos del tratamiento con extracto de células muertas son específicos para H. pylori y requieren un componente de las bacterias que es sensible al calor, y son más pronunciados si el tratamiento se inicia en ratones jóvenes.

Preparación del extracto de células muertas de H. pylori y purificación de GGT y VacA

La cepa de H. pylori PMSS1 (Arnold y col. 2011, supra) que secreta VacA s2m2 se cultivó en un caldo de Brucella complementado con un 10% de FCS, se granuló mediante centrifugación y se lavó una vez con PBS. Las bacterias se sometieron a ciclos de congelación/descongelación y se alteraron mediante tres pases a través de una prensa celular de presión francesa (Stansted Fluid Power, Homogeneizador de presión celular) a 30.000 bares. Los residuos celulares se eliminaron mediante centrifugación y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 2 mm que llevó a los extractos de células muertas usados en los presentes ejemplos. Las concentraciones de proteína se determinaron usando el Kit de proteína BCA (R&D systems).

La VacA de H. pylori se purificó de los sobrenadantes del cultivo de H. pylori usando los procedimientos previamente publicados (Cover y col., 1992, J. Biol. Chem., 267:10570-1057; Cover y col., 1997, J. Cell. Biol., 138:759-769), con las siguientes modificaciones ligeras. La cepa de H. pylori ATCC 49503/60190 que se describió por primera vez en 1990 (Cover y col., 1990, Infect. Immun. 58: 603-610,) se cultivó en un caldo de Brucella libre de sulfitos que contenía ya sea colesterol o carbón al 0,5%. Después de la centrifugación del cultivo, las proteínas sobrenadantes se precipitaron con un 50% de solución saturada de sulfato de amonio. La forma oligomérica de VacA se aisló mediante cromatografía de filtración en gel con una columna Superosa 6 HR 16/50 en una PBS que contenía un 0,02% de azida sódica y 1mM de EDTA.

Experimentación animal

Se infectó a ratones C57BL/6 y BL/6.BATF3-/-(Jackson Labs) oralmente con la cepa de H. pylori PMSS1 como se describió (Arnold y col., 2011, supra), o los mismos recibieron ya sea una dosis oral o i.p. una vez a la semana de 200 mg de extracto de células muertas (preparadas como se describió antes) del tipo salvaje de H. pylori PMSS1 o la cepa mutante, que carecía del gen Vac A (PMSS1AvacA) (descrita en Oertli y col., 2013, supra), Salmonella typhimurium, o E. coli o dosis i.p. una vez a la semana de 25 mg de VacA tipo s1m1 (SEQ ID NO: 1) -el tipo salvaje, producido como se explicó anteriormente, o la variante eliminada A6-27 purificada de la cepa de H. pylori ATCC 49503/0190 de la SEQ ID n O: 3 como se describe en Vinion-Dubiel y col., 1999, J. Biol. Chem., 274:37736-37742.

Los ratones se sensibilizaron mediante inyección intraperitoneal con ovoalbúmina con alumbre como adyuvante (20 mg de ovoalbúmina, Sigma-Aldrich, emulsionados en 2,25 mg de hidróxido de aluminio (Alum Imject; Pierce)) en las semanas 8 y 10 de edad y se desafió con un 1% de ovoalbúmina aerosolizada usando un nebulizador ultrasónico (NE-U17; Omron) durante 20 min a diario, los días 31, 32 y 33 después de la sensibilización inicial. Los ratones no sensibilizados se usaron como controles negativos. Un grupo recibió dosis una vez a la semana de 200 mg de extracto muerto de H. pylori intragástricamente desde el día 7 de edad hasta la segunda sensibilización.

Las mediciones de resistencia de las vías respiratorias se efectuaron en ratones bajo anestesia, intubados y con respiración mecánica y la resistencia de las vías respiratorias (según la medición usando el Sistema FinePointe de resistencia y conformidad, Buxco Electronics) se registró en respuesta a dosis en aumento de metacolina inhalada.

El bloqueo in vivo de la señalización de IL-10 según se describió en el Ejemplo 2 se logró mediante tres inyecciones i.p. de 250 mg de anticuerpo anti-IL-lOR (clon 1B1.3A, BioXCell) durante la fase de provocación. Los pulmones se lavaron mediante la tráquea con 1 ml de PBS. Las células del fluido de lavado broncoalveolar (BALF) se contaron usando la exclusión de tinte azul de tripano. Los conteos de células diferenciales de macrófagos, linfocitos, neutrófilos y eosinófilos se efectuaron en preparaciones citocentrifugadas teñidas con el Conjunto Microscopy Hemacolor® (Merck). Para la histopatología pulmonar, los pulmones se fijaron mediante la inflación e inmersión en un 10% de formalina y se incrustaron en parafina. Las secciones de tejido se tiñeron con H&E y ácido peryódico de Schiff y se examinaron a ciegas en un microscopio BX40 Olympus. La inflamación peribronquial se puntuó en una escala del 0 al 4. Las células calciformes positivas para PAS se cuantificaron por 1 mm de membrana basal.

Ejemplo 2: Rol de los extractos celulares en la producción IL-10

Se sabe que el H. pylori induce la producción de IL-10 en varios compartimentos de células inmunes (Sayi y col., 2011, J. Immunol., 186:878-890) y altos niveles gástricos de IL-10 aseguran la persistencia de1 H. pylori, así como también promueven la tolerancia inmune específica de H. pylori (Arnold y col., 2011, supra).

A fin de evaluar si las DC producen IL-10 en respuesta al extracto muerto de H. pylori, las DC derivadas de la médula ósea (MO) murina cultivadas se trataron con concentraciones crecientes de extracto de células muertas preparado como se describió anteriormente. En efecto, las DC de la MO produjeron y secretaron grandes cantidades de IL-10 y esto dependió de la señalización de TLR2 y MyD88 (Fig. 2A). Una clara secreción de IL-10 dependiente de la dosis también se pudo observar en DC derivadas de sangre humana de seis donantes independientes cultivadas con el extracto de células muertas de H. pylori (Fig. 2B). Para abordar si se requiere la IL-10 para la protección contra el asma otorgada por la tolerización con el extracto muerto, se administraron dos dosis de anticuerpo neutralizador del receptor de IL-10 (IL-10R) durante la fase de provocación del protocolo para ratones que recibían ya sea el extracto de células muertas desde el período neonatal en adelante y se mostró que la señalización de IL-10 era necesaria para la protección contra el asma (Fig. 2C-F)

En resumen, los extractos de células muertas de H. pylori son capaces de inducir la producción de IL-10 tanto el DC murinas como humanas y los efectos beneficiosos del tratamiento con el extracto de células muertas en el asma alérgica dependen de la competencia de señalización de IL-10 del huésped.

Preparación del ELISA de DC e IL-10 murinas y humanas

Para la generación de DC de la médula ósea murina, la médula ósea aislada de las patas traseras de ratones donantes (ratones BL/6.TLR2-/-, BL/6.TLR4-/-, BL/6.MyD88-/-, todos de Jackson Labs) se sembró en 50.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos en RPMI/10% de FCS y 4 ng/ml de GM-CSF y se procedió al cultivo durante 5 días. Las DC se estimularon con las cantidades indicadas del extracto de H. pylori PMSS1 como se describió anteriormente durante 16 h y los sobrenadantes se sometieron a un ELISA mIL-10 (BD Pharmigen). Las células dendríticas derivadas de monocitos humanos se generaron a partir de células mononucleares de sangre periférica, como se indica a continuación. Se extrajo sangre de las venas de 6 voluntarios saludables según los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional del Centro Médico de la Universidad Leiden. Las células se recolectaron después de la centrifugación de gradiente de densidad en Ficoll y los monocitos CD14+ se aislaron positivamente mediante clasificación celular activada magnéticamente (MACS) usando microesferas CD14 (Miltenyi Biotec). Las células se cultivaron en RPMI-1640 (Invitrogen) complementado con penicilina (100 U/ml, Astellas Pharma), estreptomicina (100 (mg/ml, Sigma), piruvato (1 mM, Sigma), glutamato (2 mM, Sigma), 10% de suero fetal bovino (FCS), 20 ng/ml de factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos recombinantes humanos (rGM-CSF, Invitrogen/Life Technologies) y 0,86 ng/ml de rIL-4 humana (R&D Systems) durante 6 días. El día 3, el medio y los complementos fueron renovados. Las DC derivadas de monocitos se estimularon con el extracto de células muertas de H. pylori durante 48 horas. La Secreción de IL-10 por las DC en el sobrenadante se midió mediante ELISA (Sanquin).

La susceptibilidad diferencial para la tolerización exitosa de neonatos y adultos puede atribuirse a la parcialidad tolerogénica general del sistema inmune neonatal inmaduro, con sus proporciones más altas de Treg/células efectoras y respuestas predominantes de Treg a antígenos extraños (Arnold y col., 2005, Trends Immunol 26:406-411). En humanos, se han informado observaciones paralelas: Los niños infectados con H. pylori, pero no los adultos, se caracterizan por respuestas de células T específicas de H. pylori gástrico predominante de Treg (Harris y col., 2008, Gastroenterology 134:491-4). Los niños se benefician más de hospedar H. pylori que los adultos en términos de su riesgo de asma (Chen y col., 2007, Arch Intern Med 167:821-827); de manera similar, el asma de aparición temprana en adolescentes y adultos jóvenes se correlaciona de manera inversa más fuertemente con la seropositividad de H. pylori que el asma de aparición en adultos (Chen y col., 2008, J. Infect. Dis., 198:553-560). Los datos epidemiológicos y experimentales disponibles, por consiguiente, sugieren que la adquisición en la niñez de H. pylori, y las respuestas inmunes predominantes de T reg asociadas a la adquisición en la vida temprana, median los riesgos reducidos de sufrir asma y otras manifestaciones de enfermedades alérgicas mediante la supresión de respuestas de las células T específicas de alérgenos.

Los datos presentados en esta invención implican que los niños con alto riesgo de desarrollar asma tienen mayor probabilidad que los adultos de beneficiarse a partir de las estrategias de tolerización de la invención.

Ejemplo 3: Rol del polipéptido Vac A y la variante truncada del mismo en la forma purificada de la invención

A fin de apoyar que la VacA en la forma de un polipéptido purificado pueda contribuir por sí sola a la protección contra el asma otorgada por la tolerización con el extracto, se compararon las propiedades protectoras de los extractos bacterianos (preparados como se describió anteriormente) de las bacterias de tipo salvaje y los mutantes isogénicos deficientes de VacA (como se describió anteriormente). Lo que resulta interesante es que los extractos mutantes fueron consistentemente menos eficientes que el extracto de tipo salvaje a la hora de proteger a ratones sensibles a y desafiados por alérgenos contra la inflamación broncoalveolar y pulmonar, la eosinofilia y la metaplasia de células calciformes (Fig. 3A-D). A fin de examinar si la VacA sola es suficiente para proporcionar protección, la VacA oligomérica purificada de sobrenadantes de cultivo de H. pylori, como se describió antes, se administró intraperitonealmente, una vez a la semana, desde el día 7 de edad en adelante. No se observó ningún efecto adverso en ninguno de los ratones, a pesar de su joven edad al momento de las primeras dosis. Sorprendentemente, la VacA proporcionó un nivel de protección contra el asma que era comparable con la protección otorgada por el tratamiento con el extracto (Fig. 3A-D).

Una proteína VacA de control negativo eliminada a la que le falta la región hidrofóbica aminoterminal de tres tándems que se describen como esenciales para la actividad citotóxica de VacA (Vinion-Dubiel y col., 1999, supra), es decir, de la SEQ ID NO: 3 (Figura 5) no ofrece protección contra el asma (Fig. 3A-D).

Ejemplo 4: Rol del polipéptido Vac A en la forma purificada de la invención en varias concentraciones y vías de administración

A fin de dilucidar la dosis mínima efectiva, el número de dosis requeridas y la vía de administración óptima, la VacA purificada según se prescribió anteriormente se administró ya sea intraperitonealmente o intragástricamente en varias concentraciones e intervalos en ratones, como se describió antes. 5 mg de VacA administrados intraperitonealmente en intervalos semanales desde la edad del día 7 en adelante hasta 2 semanas antes de la provocación (según se indica mediante el subíndice "a" en la Figura 4) resultaron tan efectivos como 20 mg de VacA a la hora de impedir la inflamación broncoalveolar y la eosinofilia (Figura 4 A,B). La VacA administrada intragástricamente (per os, p.o.) (de nuevo, suministrada semanalmente desde el día 7 hasta 2 semanas antes de la provocación) también proporcionó una protección significativa (Figura 4A,B). Tres dosis de VacA suministrada intraperitonealmente (suministrada en las semanas 1, 2 y 3 de vida, denotadas con el subíndice "b" en la Figura 4) fueron insuficientes a fin de proporcionar protección total (Figura 4A,B). El bloqueo de la señalización de IL-10 con dos dosis de un anticuerpo neutralizante administradas intraperitonealmente durante la provocación de ovoalbúmina anuló la protección (Figura 4A,B).

Esos datos apoyan que, de manera inesperada, la administración de VacA sola en forma purificada es capaz de inducir una protección contra el asma que es comparable con todo el extracto celular y, por lo tanto, pueden administrarse en forma purificada a fin de impedir el asma alérgica,

Estos hallazgos son particularmente inesperados, ya que se creía que solo los extractos de H. pylori vivos exhibían la capacidad de inducir Tregs y no se esperaba que la VacA sola fuese suficiente para la protección contra el asma, ya que, en particular, se ha observado que los mutantes que carecen del gen ggt son incapaces de colonizar ratones de manera persistente y este fenotipo ha sido atribuido a la tolerización de DC mediante GGT in vitro e in vivo (Oertli y col., 2013, supra).

Todos juntos, estos datos muestran que la protección contra el asma de las composiciones de la invención fue altamente específica y no fue otorgada por el extracto de otros enteropatógenos gram-negativos como E. coli o Salmonella typhimurium. El tratamiento fue particularmente exitoso cuando se inició en ratones jóvenes en relación con ratones adultos. Por lo tanto, la VacA y las composiciones de la misma pueden explotarse para fines terapéuticos como una estrategia de tolerización viable para la prevención y el tratamiento del asma en individuos con alto riesgo.

Ejemplo 5: Rol del extracto de células muertas de H. pylori y del polipéptido VacA de la invención en la forma purificada en un modelo preclínico de alergia alimentaria

A fin de evaluar un efecto protector del extracto de célula completa de H. pylori o de la VacA purificada en el desarrollo de la alergia alimentaria, se sensibilizaron ratones con dos dosis intraperitoneales de ovoalbúmina con alumbre como adyuvante antes de la inyección intragástrica de ovoalbúmina, como se describirá a continuación. Los síntomas de alergia alimentaria se midieron mediante puntuación clínica en un suero mediante un ELISA de proteasa de mastocitos y un ELISA de IgG1 e IgE específico de ovoalbúmina. Las citocinas Th2 se cuantificaron en MLN reestimulado con ovoalbúmina o cultivos celulares individuales del bazo.

Los ratones se sensibilizaron dos veces i.p. en 2 intervalos semanales con ovoalbúmina con alumbre como adyuvante y se desafiaron con ovoalbúmina suministrada intragástricamente en tres días consecutivos comenzando 2 semanas después de la última sensibilización. Un grupo de ratones recibió dosis una vez a la semana de 200 mg de extracto del tipo salvaje de la cepa de H. pylori PMSS1 intragástricamente a partir del día 7 de edad en adelante ("extracto per os"). Otro grupo recibió dosis una vez a la semana de 20 mg de HpVacA purificada de la cepa de H. pylori ATCC 49503/60190. Todos los ratones se observaron durante 40 min después de la última provocación y se puntuaron con respecto a rascarse, hinchazón de ojos, boca y nariz, así como también otros síntomas de anafilaxis, tal como los descritos en Sun y col., 2007, J. Immunol., 179:6696-6703. Las puntuaciones obtenidas se representan en la Figura 6A. La IgE e IgG1 específicas de ovoalbúmina, y la proteasa de mastocitos MCPT1 se cuantificaron en el suero mediante un ELISA y los niveles correspondientes se representan en las Figuras 6B a D. Los esplenocitos se reestimularon con el alérgeno anterior durante tres días y la producción y secreción de las citocinas Th2 IL-5 e IL-13 se midieron con ELISA y los niveles correspondientes se representan en las Figuras

6E y F). Los datos de MCPT1 están normalizados para los controles negativos. El grupo de datos de tres estudios se muestra para todos los grupos, excepto para el grupo tratado con VacA.

Todos juntos, aquellos datos obtenidos en un modelo de alergia alimentaria sugieren fuertemente los efectos protectores del extracto de H. pylori, así como también el tratamiento con proteínas VacA.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos de una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 o una formulación de las mismas para su uso en la prevención y/o el tratamiento de un trastorno alérgico, donde dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígeno de H. pylori.

2. Un polipéptido para su uso según la reivindicación 1, donde el polipéptido se encuentra en la forma de extracto de células muertas de bacterias de H. pylori y la cepa de bacterias de H. pylori es la ATCC 49503/60190 y donde dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígeno de H. pylori.

3. Un polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde la proteína VacA se purifica de los extractos de células bacterianas de H. pylori muertas no desnaturalizadas y donde dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígenos de H. pylori.

4. Un polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, donde el extracto de células muertas de bacterias de H. pylori puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

(i) cosechar un cultivo de células de bacterias vivas;

(ii) someter las bacterias cosechadas a varios ciclos de congelación/descongelación en agua o una solución acuosa de una sal;

(iii) alterar las células bacterianas bajo alta presión;

(iv) recolectar el extracto celular.

5. Un polipéptido para su uso según la reivindicación 1, donde la VacA es una VacA recombinante.

6. Un polipéptido que consiste en una secuencia de una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 o una formulación de las mismas para su uso en la inducción de una respuesta de tolerización a un alérgeno.

7. Un polipéptido que consiste en una secuencia de una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1,2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 o una formulación de las mismas para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el polipéptido debe administrarse en una forma esencialmente libre de cualquier componente inmunogénico.

8. Un polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el trastorno alérgico es asma atópica.

9. Un polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el trastorno alérgico es una alergia alimentaria.

10. Un polipéptido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde la composición debe administrarse por vía oral, intranasal, parenteral, intrapulmonar o sistémica.

11. Una formulación tolerogénica farmacéutica que comprende una proteína VacA que consiste en una secuencia seleccionada de entre las SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, o una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una proteína VacA seleccionada de entre las SEQ iD NO: 1,2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11 y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, un diluyente o un excipiente del mismo, donde dicha proteína VacA se encuentra esencialmente libre de un componente inmunogénico, en particular, de otros componentes de antígeno de H. pylori.

12. Una formulación farmacéutica según la reivindicación 11, donde dicha proteína VacA se combina con al menos un coagente útil en la prevención y/o tratamiento de un trastorno alérgico o una respuesta alérgica o para inducir una respuesta de tolerización a un alérgeno.

13. Una composición según la reivindicación 12, donde la composición es una composición farmacéutica oral o una composición farmacéutica inyectable.

14. Una composición según la reivindicación 11 o 13, que comprende además un alérgeno, en particular, al menos un alérgeno alimenticio.

15. Una formulación para su uso según la reivindicación 1, donde la formulación es una formulación farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.