ES2808561T3 - Interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función - Google Patents

Abstract

Un agente de iARN para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada por una proteína mutante de ganancia de función, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz del agente de iARN que silencia un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica un proteína mutante de forma que ocurra la interferencia específica de secuencia de un gen dando como resultado un tratamiento eficaz de la enfermedad, en donde el agente de iARN silencia una región polimórfica que es distinta de la mutación de la región ampliada de CAG en el gen que codifica la proteína mutante, en donde la enfermedad es enfermedad de Huntington y la proteína mutante es la proteína huntingtina.

Description

DESCRIPCIÓN

Interferencia por ARN para el tratamiento de trastornos de ganancia de función

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. N° de serie 60/502.678, titulada "RNa Interference for the Treatment of Gain-of-Function Disorders", presentada el 12 de septiembre de 2003.

Antecedentes de la invención

La interferencia por ARN (iARN) es el mecanismo de silenciamiento génico postranscripcional específico de secuencia por ARN bicatenarios (ARNbc) homólogos al gen que se expresa. Los ARNbc se procesan por Dicer, una ribonucleasa III celular, para generar dúplex de aproximadamente 21 nt con nucleótidos protuberantes en 3' (ARN interferente pequeño, ARNip) que median en la degradación del ARNm específico de secuencia. En células de mamífero, las moléculas de ARNip son capaces de silenciar específicamente la expresión génica sin inducción de la vía de respuesta del interferón no específica. Así, los ARNip se han convertido en una alternativa nueva y poderosa a otras herramientas genéticas, tales como oligonucleótidos no codificantes y ribozimas para analizar la función génica. Además, se están desarrollando ARNip para fines terapéuticos con el objetivo de silenciar los genes de enfermedad en seres humanos.

Las enfermedades de repetición de trinucleótidos comprenden un grupo recientemente reconocido de trastornos heredados. La mutación genética común es un aumento en una serie de una repetición de trinucleótidos particular. Hasta la fecha, la repetición de trinucleótidos más frecuente es CAG, que codifica el aminoácido glutamina. Se conocen al menos 9 enfermedades de repetición de CAG y existen más de 20 variedades de estas enfermedades, que incluyen enfermedad de Huntington, enfermedad de Kennedy y muchas enfermedades espinocerebelosas. Estos trastornos comparten un componente neurodegenerativo en el cerebro y/o la médula espinal. Cada enfermedad tiene un patrón específico de neurodegeneración en el cerebro y la mayoría tiene una herencia dominante autosómica.

La aparición de las enfermedades ocurre, en general, de los 30 a 40 años, pero en enfermedad de Huntington las repeticiones de CAG en el gen huntingtina de >60 predicen una aparición juvenil.

La investigación reciente por los presentes inventores ha mostrado que la mutación genética (aumento en la longitud de repeticiones de CAG de normal <36 en el gen huntingtina a >36 en enfermedad) está asociada con la síntesis de una proteína huntingtina mutante, que tiene >36 poliglutaminas (Aronin et al., 1995). También se ha mostrado que la proteína forma agregados citoplásmicos e inclusiones nucleares (Difiglia et al., 1997) y se asocia con vesículas (Aronin et al., 1999). No se conocen vías patógenas precisas.

Se cree que la enfermedad de Huntington (y por implicación otras enfermedades de repetición de trinucleótidos) se provoca, al menos en parte, por interacciones aberrantes de proteína, que provocan la alteración de los procesos neuronales críticos, disfunción neuronal y por último lugar muerte neuronal (neurodegeneración en áreas del cerebro denominadas el cuerpo estriado y la corteza). En la búsqueda de un tratamiento eficaz para estas enfermedades, los investigadores en este campo enfatizaron el entendimiento de la patogénesis de la enfermedad e inicialmente buscaron mediar al nivel de las supuestas interacciones aberrantes de proteína. Sin embargo, no existe tratamiento eficaz para la enfermedad de Huntington u otras enfermedades de repetición de trinucleótidos. Además, se ha apreciado ahora que múltiples procesos anormales podrían ser activos en estos tipos de enfermedad.

Sumario de la divulgación

La invención presentemente reivindicada se define en y por las reivindicaciones adjuntas.

La presente divulgación se refiere a los métodos de tratamiento de una variedad de enfermedades de ganancia de función. En particular, la divulgación proporciona métodos para la destrucción selectiva de ARNm mutantes transcritos a partir de genes mutantes de ganancia de función, previniendo así la producción de proteínas mutantes codificadas por dichos genes. Se han propuesto otros métodos basados en iARN para la destrucción de genes mutantes en los que se silencian los ARNip, por ejemplo, una mutación puntual que ocurre en un único alelo en el gen mutante (por ejemplo, la mutación puntual en el gen superóxido dismutasa (SOD) asociado a esclerosis lateral amiotrófica (ELA)). Sin embargo, existe una diferencia clave entre ELA y enfermedades de repetición de trinucleótidos, tales como la enfermedad de Huntington. La ELA tiene una mutación puntual en un alelo como cambio genético, mientras que las enfermedades de repetición de trinucleótidos tienen una región ampliada de repeticiones de CAG en un alelo como cambio genético. El uso de iARN contra la región ampliada de repeticiones de CAG tiene posibles complicaciones. Se sabe que existen más de 80 genes normales con regiones de repeticiones CAG en células. Así, no se pueden usar los ARNip que silencian estas repeticiones de CAG sin arriesgar la destrucción generalizada de ARNm que contienen repeticiones de CAG normales. Asimismo, el silenciamiento de sitios específicos no alélicos daría como resultado la pérdida de tanto huntingtina normal como mutante que provoca la disfunción neuronal.

Los métodos de la divulgación utilizan tecnología de interferencia por ARN (iARN) contra regiones polimórficas seleccionadas (es decir, regiones que contienen polimorfismos específicos de alelo o alélicos) que son distintos del sitio de mutación en los genes que codifican proteínas mutantes. Las metodologías de la presente divulgación son tratamientos eficaces para enfermedades de ganancia de función resultantes de mutaciones de deleción, mutaciones de inserción, mutaciones puntuales y similares, a condición de que el gen mutante codifique una proteína que tiene una función normalmente no asociada a la proteína natural.

En un aspecto preferido, las metodologías de la presente divulgación proporcionan un tratamiento eficaz para la enfermedad de Huntington (EH). Las metodologías también proporcionan tratamientos eficaces para otros trastornos de poliglutamina y/o enfermedad de repetición de trinucleótidos, como se describe en detalle en el presente documento.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada por una proteína mutante de ganancia de función administrando al sujeto una cantidad eficaz de un agente de iARN que silencia un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica una proteína mutante, por ejemplo, la proteína huntingtina, de forma que la interferencia específica de secuencia de un gen ocurre dando como resultado un tratamiento eficaz para la enfermedad. En una realización, la proteína mutante contiene una región ampliada de poliglutamina. En otra realización, el gen que codifica la proteína mutante contiene una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos.

En otra realización más, el método de la divulgación se puede usar para tratar enfermedad de Huntington y una variedad de otras enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3, ataxia espinocerebelosa de tipo 6, ataxia espinocerebelosa de tipo 7, ataxia espinocerebelosa de tipo 8, ataxia espinocerebelosa de tipo 12, distrofia miotónica, enfermedad muscular espinobulbar y atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana.

El método de la divulgación usa agentes de iARN homólogos a un polimorfismo alélico dentro del gen que codifica, por ejemplo, una proteína huntingtina mutante para el tratamiento de enfermedad de Huntington. En una realización preferida, el agente de iARN silencia el polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P1-P5. En una realización preferida adicional, el agente de iARN silencia un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P6-P43.

En una realización adicional, la divulgación proporciona agentes de iARN que comprenden una primera y una segunda cadena que contienen cada una 16-25 nucleótidos. La primera cadena de la presente divulgación es homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en donde la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda cadena incluye 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena. El agente de iARN también puede tener una porción de bucle que comprende 4-11, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, nucleótidos que conecta las dos secuencias de nucleótidos. En otras realizaciones más, la región diana de la secuencia de ARNm se localiza en una región no traducida (UTR) 5' o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

En otra realización, la divulgación proporciona una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16-25 nucleótidos homóloga a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína huntingtina mutante. La construcción de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, vector retroviral, casete de expresión o plásmido. La construcción de expresión también puede tener una secuencia promotora de ARN polimerasa II o secuencia promotora de ARN polimerasa II, tal como el promotor de ARNnp U6 o promotor H1.

En aún otras realizaciones, la presente divulgación proporciona células hospedadoras, por ejemplo, células de mamífero, que comprenden moléculas de ácidos nucleicos y construcciones de expresión de la presente divulgación.

En otras realizaciones más, la presente divulgación proporciona composiciones terapéuticas que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Otras características y ventajas de la divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1a-k: Gen huntingtina humana, secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1)

Figura 2a-b: Proteína huntingtina humana, secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2)

Figura 3: Codificante (SEQ ID NO: 3) y no codificante (SEQ ID NO: 4) de la secuencia de ARN diana de huntingtina (htt)

Figura 4: Análisis termodinámico de los extremos 5' de la cadena de ARNip para el dúplex de ARNip

Figura 5a-c: Reacciones in vitro de iARN programadas con ARNip que silencia un polimorfismo dentro del ARNm de huntingtina (htt). (a) ARNip estándar. (b) ARNip mejorado por la reducción de la intensidad del apareamiento de bases del extremo 5' de la cadena no codificante del dúplex de ARNip. (c) ARNip mejorado por la reducción del desapareamiento del extremo 5' de la cadena no codificante del dúplex de ARNip.

Figura 6a-b. iARN de la proteína Htt endógena en células HeLa. (a) Inmunotransferencia de la proteína Htt humana. (b) Cuantificación de la misma.

Descripción detallada de la divulgación

La presente divulgación se refiere a métodos y reactivos para tratar una variedad de enfermedades de ganancia de función. En un aspecto, la divulgación se refiere a métodos y reactivos para tratar una variedad de enfermedades caracterizadas por una mutación en un alelo o copia de un gen, codificando la mutación una proteína que es suficiente para contribuir a o provocar la enfermedad. Preferentemente, los métodos y reactivos se usan para tratar enfermedades causadas o caracterizadas por una mutación que se hereda en un modo dominante autosómico. En una realización, los métodos y reactivos se usan para tratar una variedad de enfermedades neurodegenerativas provocadas por una mutación de ganancia de función, por ejemplo, trastornos de poliglutamina y/o enfermedades de repetición de trinucleótidos, por ejemplo, enfermedad de Huntington. En otra realización, los métodos y reactivos se usan para tratar enfermedades provocadas por una ganancia de función en un oncogén, siendo el producto génico mutado una ganancia de función mutante, por ejemplo, cánceres provocados por una mutación en el oncogén ret (por ejemplo, ret-1), por ejemplo, tumores endocrinos, tumores medulares de tiroides, tumores de la hormona paratiroidea, neoplasia endocrina múltiple de tipo 2 y similares. En otra realización, los métodos y reactivos de la divulgación se pueden usar para tratar una variedad de cánceres gastrointestinales conocidos por ser provocados por mutaciones de ganancia de función autosómicamente heredadas.

La presente divulgación utiliza tecnología de interferencia por ARN (iARN) contra polimorfismos alélicos localizados dentro de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función. La iARN destruye el ARNm mutante correspondiente con especificidad y selectividad por nucleótidos. Los agentes de ARN de la presente divulgación se dirigen a regiones polimórficas de un gen mutante, dando como resultado la escisión de ARNm mutante. Estos agentes de ARN, mediante una serie de interacciones proteína-nucleótido, funcionan escindiendo los ARNm mutantes. Las células destruyen el ARNm escindido, previniendo así la síntesis de proteína mutante correspondiente, por ejemplo, la proteína huntingtina.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada por una proteína mutante de ganancia de función administrando al sujeto una cantidad eficaz de un agente de iARN que silencia un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica una proteína mutante, por ejemplo, la proteína huntingtina, de forma que la interferencia específica de secuencia de un gen ocurra dando como resultado un tratamiento eficaz para la enfermedad. En una realización, la proteína mutante contiene una región ampliada de poliglutamina. En otra realización, el gen que codifica la proteína mutante contiene una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos.

En otra realización más, el método de la divulgación se puede usar para tratar enfermedad de Huntington y una variedad de otras enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3, ataxia espinocerebelosa de tipo 6, ataxia espinocerebelosa de tipo 7, ataxia espinocerebelosa de tipo 8, ataxia espinocerebelosa de tipo 12, distrofia miotónica, enfermedad muscular espinobulbar y atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana.

El método de la divulgación usa agentes de iARN homólogos a un polimorfismo alélico dentro del gen que codifica, por ejemplo, una proteína huntingtina mutante para el tratamiento de enfermedad de Huntington. En una realización preferida, el agente de iARN silencia un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P1-P5. En una realización preferida adicional, el agente de iARN silencia un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P6-P43.

En una realización adicional, la divulgación proporciona agentes de iARN que comprenden una primera y una segunda cadena que contiene cada una 16-25 nucleótidos. La primera cadena de la presente divulgación es homóloga a una región de un gen que codifica una proteína mutante de ganancia de función, en donde la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico. La segunda cadena incluye 16-25 nucleótidos complementarios a la primera cadena. El agente de iARN también puede tener una porción de bucle que comprende 4-11, por ejemplo, 4, 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, nucleótidos que conectan las dos secuencias de nucleótidos. En otras realizaciones más, la región diana de la secuencia de ARNm se localiza en una región no traducida (UTR) 5' o una UTR 3' del ARNm de una proteína mutante.

En otra realización, la divulgación proporciona una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16-25 nucleótidos homóloga a un polimorfismo alélico dentro de, por ejemplo, el gen que codifica una proteína huntingtina mutante. La construcción de expresión puede ser, por ejemplo, un vector viral, vector retroviral, casete de expresión o plásmido. La construcción de expresión también puede tener una secuencia promotora de ARN polimerasa II o secuencia promotora de ARN polimerasa II, tal como el promotor de ARNnp U6 o promotor H1.

En aún otras realizaciones, la presente divulgación proporciona células hospedadoras, por ejemplo, células de mamífero, que comprenden moléculas de ácidos nucleicos y construcciones de expresión de la presente divulgación.

En otras realizaciones más, la presente divulgación proporciona composiciones terapéuticas que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De manera que la divulgación pueda ser más fácilmente entendida, se definen primero ciertos términos.

El término "nucleósido" se refiere a una molécula que tiene una base de purina o pirimidina ligada covalentemente a un azúcar de ribosa o desoxirribosa. Los nucleósidos a modo de ejemplo incluyen adenosina, guanosina, citidina, uridina y timidina. Los nucleósidos a modo de ejemplo adicionales incluyen inosina, 1 -metilinosina, pseudouridina, 5,6-dihidrouridina, ribotimidina, 2N-metilguanosina y 22NN-dimetilguanosina (también denominados nucleósidos "raros"). El término "nucleótido" se refiere a un nucleósido que tiene uno o más grupos fosfato unidos con enlaces éster al resto de azúcar. Los nucleótidos a modo de ejemplo incluyen monofosfatos, difosfatos y trifosfatos de nucleósido. Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un polímero de nucleótidos unidos juntos por un enlace fosfodiéster entre los átomos de carbono 5' y 3'.

El término "ARN" o "molécula de ARN" o "molécula de ácido ribonucleico" se refiere a un polímero de ribonucleótidos. El término "ADN" o "molécula de ADN" o "molécula de ácido desoxirribonucleico" se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos. Se pueden sintetizar ADN y ARN naturalmente (por ejemplo, por replicación de ADN o transcripción de ADN, respectivamente). El ARN se puede modificar postranscripcionalmente. El ADN y el ARN también se pueden sintetizar químicamente. El ADN y el ARN pueden ser monocatenarios (es decir, ARNmc y ADNmc, respectivamente) o de múltiples cadenas (por ejemplo, bicatenario, es decir, ARNbc y ADNbc, respectivamente). "ARNm" o "ARN mensajero" es ARN monocatenario que especifica la secuencia de aminoácidos de una o más cadenas de polipéptidos. Esta información se traduce durante la síntesis de proteínas cuando los ribosomas se unen al ARNm.

Como se usa en el presente documento, el término "ARN interferente pequeño" ("ARNip") (también denominado en la técnica "ARN interferentes pequeños") se refiere a un ARN (o análogo de ARN) que comprende entre aproximadamente 10-50 nucleótidos (o análogos de nucleótidos) que es capaz de dirigir o mediar en la interferencia por ARN. Preferentemente, un ARNip comprende entre aproximadamente 15-30 nucleótidos o análogos de nucleótidos, más preferentemente entre aproximadamente 16-25 nucleótidos (o análogos de nucleótidos), incluso más preferentemente entre aproximadamente 18-23 nucleótidos (o análogos de nucleótidos), e incluso más preferentemente entre aproximadamente 19-22 nucleótidos (o análogos de nucleótidos) (por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos o análogos de nucleótidos). El término ARNip "corto" se refiere a un ARNip que comprende ~21 nucleótidos (o análogos de nucleótidos), por ejemplo, 19, 20, 21 o 22 nucleótidos. El término ARNip "largo" se refiere a un ARNip que comprende ~24-25 nucleótidos, por ejemplo, 23, 24, 25 o 26 nucleótidos. Los ARNip cortos pueden incluir, en algunos casos, menos de 19 nucleótidos, por ejemplo, 16, 17 o 18 nucleótidos, a condición de que el ARNip más corto retenga la capacidad para mediar en iARN. Asimismo, los ARNip largos pueden incluir, en algunos casos, más de 26 nucleótidos, a condición de que el ARNip más largo retenga la capacidad para mediar en el procesamiento adicional ausente de iARN, por ejemplo, procesamiento enzimático, a un ARNip corto.

El término "análogo de nucleótidos" o "nucleótido alterado" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido no estándar, que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que no existen de forma natural. Los análogos preferidos de nucleótidos se modifican en cualquier posición para alterar ciertas propiedades químicas del nucleótido, aún retienen la capacidad del análogo de nucleótidos para realizar su función prevista. Los ejemplos de posiciones del nucleótido que pueden ser derivatizadas incluyen la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino)propiluridina, 5-bromouridina, 5-propinouridina, 5-propeniluridina, etc.; la posición 6, por ejemplo, 6-(2-amino)propiluridina; la posición 8 para adenosina y/o guanosinas, por ejemplo, 8-bromoguanosina, 8-cloroguanosina, 8-fluoroguanosina, etc. Los análogos de nucleótidos también incluyen nucleótidos deaza, por ejemplo, nucleótidos 7-deaza-adenosina; modificados en O y N (por ejemplo, alquilados, por ejemplo, N6-metiladenosina, o como se conoce de otro modo en la técnica); y otros análogos de nucleótidos heterocíclicamente modificados tales como los descritos en Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310.

Los análogos de nucleótidos también pueden comprender modificaciones en la porción de azúcar de los nucleótidos. Por ejemplo, el grupo 2' OH se puede sustituir por un grupo seleccionado de H, Or , R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR u OR, en donde R es alquilo C1-C6 sustituido o sin sustituir, alquenilo, alquinilo, arilo, etc. Otras posibles modificaciones incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. N° 5.858.988 y 6.291.438.

El grupo fosfato del nucleótido también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato con azufre (por ejemplo, fosforotioatos), o haciendo otras sustituciones que permitan al nucleótido realizar su función prevista, tal como se describe en, por ejemplo, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11 (5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11 (2):77-85, y la patente de EE. UU. N° 5.684.143. Ciertas de las modificaciones anteriormente referenciadas (por ejemplo, modificaciones de grupo fosfato) disminuyen preferentemente la tasa de hidrólisis de, por ejemplo, polinucleótidos que comprenden dichos análogos in vivo o in vitro.

El término "oligonucleótido" se refiere a un polímero corto de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos. El término "análogo de ARN" se refiere a un polinucleótido (por ejemplo, un polinucleótido químicamente sintetizado) que tiene al menos un nucleótido alterado o modificado en comparación con un ARN correspondiente sin alterar o sin modificar, pero que retiene la misma naturaleza o función o similar que el ARN sin alterar o sin modificar correspondiente. Como se trata anteriormente, los oligonucleótidos se pueden unir con enlaces que dan como resultado una tasa de hidrólisis más baja del análogo de ARN en comparación con una molécula de ARN con enlaces fosfodiéster. Por ejemplo, los nucleótidos del análogo pueden comprender enlaces metilenodiol, etilenodiol, oximetiltio, oxietiltio, oxicarboniloxi, fosforodiamidato, fosforoamidato y/o fosforotioato. Los análogos de ARN preferidos incluyen ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos modificados en el azúcar y/o esqueleto. Dichas alteraciones o modificaciones pueden incluir además la adición de material no de nucleótido, tal como al (a los) extremo(s) del ARN o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). Un análogo de ARN solo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad para mediar (media) en la interferencia por ARN.

Como se usa en el presente documento, el término "interferencia por ARN" ("iARN") se refiere a una degradación intracelular selectiva de ARN. La iARN ocurre en las células naturalmente para retirar ARN extraños (por ejemplo, ARN virales). La iARN natural avanza por fragmentos escindidos del ARNbc libre que dirigen el mecanismo degradativo a otras secuencias de ARN similares. Alternativamente, la iARN se puede iniciar por la mano del hombre, por ejemplo, para silenciar la expresión de genes diana.

Un agente de iARN que tiene una cadena que tiene "secuencia suficientemente complementaria a una secuencia de ARNm diana para dirigir la interferencia por ARN (iARN) específica de diana" significa que la cadena tiene una secuencia suficiente para desencadenar la destrucción del ARNm diana por la maquinaria o proceso de iARN.

Como se usa en el presente documento, el término "ARN aislado" (por ejemplo, "ARNip aislado" o "precursor de ARNip aislado") se refiere a moléculas de ARN que están sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente.

El término "in vitro" tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica reactivos o extractos purificados, por ejemplo, extractos de células. El término "in vivo" también tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica células vivas, por ejemplo, células inmortalizadas, células primarias, líneas celulares y/o células en un organismo.

Como se usa en el presente documento, el término "transgén" se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que se inserta por artificio en una célula, y llega a ser parte del genoma del organismo que se desarrolla de la célula. Dicho transgén puede incluir un gen que es parcial o completamente heterólogo (es decir, extraño) al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo. El término "transgén" también significa una molécula de ácido nucleico que incluye una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas, por ejemplo, ADN, que codifican uno o más precursores de ARN manipulados, para expresión en un organismo transgénico, por ejemplo, animal, que es parcialmente o completamente heterólogo, es decir, extraño, al animal transgénico, u homólogo a un gen endógeno del animal transgénico, pero que se diseña para ser insertado en el genoma del animal en una localización que se diferencia de la del gen natural. Un transgén incluye uno o más promotores y cualquier otro ADN, tales como intrones, necesarios para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos seleccionada, todos operativamente unidos a la secuencia seleccionada, y puede incluir una secuencia potenciadora.

Un gen "implicado" en una enfermedad o trastorno incluye un gen, cuya expresión o función normal o aberrante afecta o provoca la enfermedad o trastorno o al menos un síntoma de dicha enfermedad o trastorno

El término "mutación de ganancia de función", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier mutación en un gen en que la proteína codificada por dicho gen (es decir, la proteína mutante) adquiere una función normalmente no asociada a la proteína (es decir, la proteína natural) que provoca o contribuye a una enfermedad o trastorno. La mutación de ganancia de función puede ser una deleción, adición o sustitución de un nucleótido o nucleótidos en el gen que da lugar al cambio en la función de la proteína codificada. En una realización, la mutación de ganancia de función cambia la función de la proteína mutante o provoca interacciones con otras proteínas. En otra realización, la mutación de ganancia de función provoca una disminución o retirada de la proteína natural normal, por ejemplo, por interacción de la proteína mutante alterada con dicha proteína natural normal.

El término "polimorfismo", como se usa en el presente documento, se refiere a una variación (por ejemplo, una deleción, inserción o sustitución) en una secuencia de gen que se identifica o detecta cuando se compara la misma secuencia génica de sujetos de fuentes diferentes (pero del mismo organismo). Por ejemplo, se puede identificar un polimorfismo cuando se compara la misma secuencia de genes de diferentes sujetos (pero del mismo organismo). La identificación de dichos polimorfismos es rutinaria en la técnica, siendo las metodologías similares a las usadas para detectar, por ejemplo, mutaciones puntuales de cáncer de mama. La identificación se puede hacer, por ejemplo, de ADN extraído de linfocitos de un sujeto, seguido por amplificación de regiones polimórficas usando cebadores específicos para dicha región polimórfica. Alternativamente, el polimorfismo se puede identificar cuando se comparan dos alelos del mismo gen. Una variación en secuencia entre dos alelos del mismo gen dentro de un organismo se denomina en el presente documento un "polimorfismo alélico". El polimorfismo puede ser un nucleótido dentro de una región codificante, pero, debido a la degeneración del código genético, no codifica cambio en la secuencia de aminoácidos. Alternativamente, las secuencias polimórficas pueden codificar un aminoácido diferente en una posición particular, pero el cambio en el aminoácido no afecta la función de la proteína. También se pueden encontrar regiones polimórficas en regiones no codificantes del gen.

El término "dominio de poliglutamina", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento o dominio de una proteína que consiste en restos consecutivos de glutamina unidos por enlaces peptídicos. En una realización, la región consecutiva incluye al menos 5 restos de glutamina.

El término "dominio ampliado de poliglutamina" o "segmento ampliado de poliglutamina", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento o dominio de una proteína que incluye al menos 35 restos consecutivos de glutamina unidos por enlaces peptídicos. Dichos segmentos ampliados se encuentran en sujetos afectados por un trastorno por poliglutaminas, como se describe en el presente documento, tanto si se ha mostrado como si no que el sujeto manifiesta síntomas.

El término "repetición de trinucleótidos" o "región de repetición de trinucleótidos", como se usa en el presente documento, se refiere a un segmento de una secuencia de ácidos nucleicos, por ejemplo, que consiste en repeticiones consecutivas de una secuencia de trinucleótidos particular. En una realización, la repetición de trinucleótidos incluye al menos 5 secuencias de trinucleótidos consecutivas. Las secuencias de trinucleótidos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, CAG, CGG, GCC, GAA, CTG y/o CGG.

El término "enfermedades de repetición de trinucleótidos", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos localizada dentro de un gen, siendo la región ampliada de repeticiones de trinucleótidos la causante de la enfermedad o trastorno. Los ejemplos de enfermedades de repetición de trinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ataxia espinocerebelosa de tipo 12, ataxia espinocerebelosa de tipo 8, síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental del cromosoma XE frágil, ataxia de Friedreich y distrofia miotónica. Las enfermedades de repetición de trinucleótidos preferidas para el tratamiento según la presente divulgación son las caracterizadas o provocadas por una región ampliada de repeticiones de trinucleótidos en el extremo 5' de la región codificante de un gen, el gen que codifica una proteína mutante que provoca o es causante de la enfermedad o trastorno. Ciertas enfermedades de trinucleótidos, por ejemplo, síndrome del cromosoma X frágil, donde la mutación no está asociada a una región codificante, pueden no ser adecuadas para el tratamiento según las metodologías de la presente divulgación, no hay ARNm adecuado para ser silenciado por iARN. Por el contrario, la enfermedad tal como ataxia de Friedreich puede ser adecuada para el tratamiento según las metodologías de la divulgación debido a que, aunque la mutación causante no está dentro de una región codificante (es decir, se encuentra dentro de un intrón), la mutación puede estar dentro de, por ejemplo, un precursor de ARNm (por ejemplo, un precursor de ARNm previamente cortado y empalmado).

El término "trastorno de las poliglutaminas", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por una expansión de repeticiones de (CAG)ⁿ en el extremo 5' de la región codificante (codificando así una región ampliada de poliglutamina en la proteína codificada). En una realización, los trastornos de poliglutamina se caracterizan por una degeneración progresiva de las células nerviosas. Los ejemplos de trastornos de poliglutamina incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de Huntington, ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3 (también conocida como enfermedad de Machado-Joseph) y ataxia espinocerebelosa de tipo 6, ataxia espinocerebelosa de tipo 7 y atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana.

La expresión "examinar la función de un gen en una célula u organismo" se refiere a examinar o estudiar la expresión, actividad, función o fenotipo que surge del mismo.

Diversas metodologías de la presente divulgación incluyen la etapa que implica comparar un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., con un "control adecuado", denominado indistintamente en el presente documento un "control apropiado". Un "control adecuado" o "control apropiado" es cualquier control o patrón conocido por un experto habitual en la técnica útil para fines de comparación. En una realización, un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., determinado antes de la realización de una metodología de iARN, como se describe en el presente documento. Por ejemplo, se pueden determinar una tasa de transcripción, nivel de ARNm, tasa de traducción, nivel de proteína, actividad biológica, característica o propiedad celular, genotipo, fenotipo, etc., antes de introducir un agente de iARN de la divulgación en una célula u organismo. En otra realización, un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc., determinado en una célula u organismo, por ejemplo, un control o célula normal u organismo, que presenta, por ejemplo, rasgos normales. En otra realización más, un "control adecuado" o "control apropiado" es un valor predefinido, nivel, rasgo, característica, propiedad, etc.

Diversos aspectos de la divulgación se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

I. Trastornos de poliglutamina

Los trastornos de poliglutamina son una clase de enfermedad o trastornos caracterizados por una mutación genética común. En particular, la enfermedad o los trastornos se caracterizan por una repetición ampliada del trinucleótido CAG que da lugar, en la proteína codificada, a un tramo ampliado de restos de glutamina. Los trastornos de poliglutamina son similares en que las enfermedades se caracterizan por una degeneración progresiva de células nerviosas. A pesar de sus similitudes, los trastornos de poliglutamina ocurren en diferentes cromosomas y así ocurren en segmentos de ADN completamente diferentes. Los ejemplos de trastornos de poliglutamina incluyen enfermedad de Huntington, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana, atrofia muscular espinobulbar, ataxia espinocerebelosa de tipo 1, ataxia espinocerebelosa de tipo 2, ataxia espinocerebelosa de tipo 3, ataxia espinocerebelosa de tipo 6 y ataxia espinocerebelosa de tipo 7 (Tabla 3).

Tabla 1. Trastornos de poliglutamina

Los trastornos de poliglutamina de la divulgación se caracterizan por (por ejemplo, dominios que tienen entre aproximadamente 30 y 35 restos de glutamina, entre aproximadamente 35 y 40 restos de glutamina, entre aproximadamente 40 y 45 restos de glutamina y que tienen aproximadamente 45 o más restos de glutamina. El dominio de poliglutamina contiene normalmente restos de glutamina consecutivos (Q n>36).

II. Enfermedad de Huntington

La enfermedad de Huntington, heredada como una enfermedad dominante autosómica, provoca alteración de la cognición y enfermedad motora. Los pacientes pueden vivir más de una década con una intensa debilitación, antes de la muerte prematura por inanición o infección. La enfermedad empieza en la cuarta o quinta década en la mayoría de los casos, pero un subconjunto de pacientes manifiesta la enfermedad en la adolescencia. La mutación genética para la enfermedad de Huntington es una repetición de CAG ampliada en el gen huntingtina. La repetición de CAG varía en número desde 8 hasta 35 en individuos normales (Kremer et al., 1994). La mutación genética, por ejemplo, un aumento en la longitud de las repeticiones de CAG desde normal inferior a 36 en el gen huntingtina hasta más de 36 en la enfermedad, está asociada con la síntesis de una proteína huntingtina mutante, que tiene más de 36 poliglutamatos (Aronin et al., 1995). En general, los individuos con 36 o más repeticiones de CAG tendrán enfermedad de Huntington. Prototípico de nada menos que veinte otras enfermedades con una CAG ampliada como mutación subyacente, la enfermedad de Huntington todavía no tiene terapia eficaz. Se han mostrado prometedoras una variedad de intervenciones -- tales como interrupción de las vías apoptósicas, adición de reactivos para reforzar la eficiencia de las mitocondrias y bloqueo de receptores de NMDA - en cultivos celulares y modelo de ratón de enfermedad de Huntington. Sin embargo, en el mejor de los casos, estos enfoques revelan una prolongación corta de la supervivencia celular o animal.

La enfermedad de Huntington obedece el dogma principal de la genética: un gen muíante sirve de molde para la producción de un ARNm mutante; el ARNm mutante dirige entonces la síntesis de una proteína mutante (Aronin et al., 1995; DiFiglia et al., 1997). La huntingtina mutante (proteína) se acumula probablemente en neuronas selectivas en el cuerpo estriado y la corteza, altera actividades celulares determinadas hasta ahora y provoca disfunción neuronal y muerte (Aronin et al., 1999; Laforet et al., 2001). Debido a que una única copia de un gen mutante es suficiente para provocar la enfermedad de Huntington, el tratamiento más parco sería volver ineficaz el gen mutante. Los enfoques teóricos podrían incluir detener la transcripción génica de la huntingtina mutante, destruyendo el ARNm mutante y bloqueando la traducción. Cada uno tiene el mismo resultado -- pérdida de huntingtina mutante.

III. Gen huntingtina

El gen de enfermedad ligado a la enfermedad de Huntington se llama Huntington o (htt). El sitio huntingtina es grande, que abarca 180 kb y que consiste en 67 exones. El gen huntingtina se expresa ampliamente y se requiere para el desarrollo normal. Se expresa como 2 formas alternativamente poliadeniladas que presentan diferente abundancia relativa en diversos tejidos fetales y adultos. El transcrito más grande tiene aproximadamente 13,7 kb y se expresa predominantemente en el cerebro adulto y fetal mientras que el transcrito más pequeño de aproximadamente 10,3 kb se expresa más ampliamente. Los dos transcritos se diferencian con respecto a sus regiones no traducidas 3' (Lin et al., 1993). Se predice que ambos mensajeros codifican una proteína de 348 kilodálton que contiene 3144 aminoácidos. Se cree que el defecto genético que conduce a la enfermedad de Huntington confiere una nueva propiedad al ARNm o altera la función de la proteína. La secuencia de aminoácidos de la proteína huntingtina humana se expone en la Figura 2 (SEQ ID NO: 2).

En la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) se expone una secuencia de nucleótidos consenso del gen huntingtina humano (ADNc). La región codificante consiste en los nucleótidos 316 a 9750 de SEQ ID NO: 1. Las dos señales de poliadenilación alternativas se encuentran en los nucleótidos 10326 a 10331 y los nucleótidos 13644 a 13649, respectivamente. Los dos sitios de poliadenilación correspondientes se encuentran en los nucleótidos 10348 y 13672, respectivamente. La primera señal de poliadenilación/sitio es la del transcrito de 10,3 kb. La segunda señal de poliadenilación/sitio es la del transcrito de 13,7 kb, el transcrito predominante en el cerebro.

Se identificaron cinco (5) polimorfismos en el gen htt humano como se describe en el Ejemplo I. Se han identificado 38 polimorfismos adicionales en la secuencia del gen huntingtina por análisis de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) (véase la Tabla 3). Los polimorfismos expuestos en las Tablas 2 y 3 representan sitios preferidos para silenciar mediante iARN específica de un único nucleótido, como se describe en el presente documento.

Tabla 2. Sitios polimórficos (P) en el gen htt de líneas celulares humanas.

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Tabla 3. Sitios polimórficos (P) en el gen htt humano identificado por análisis de SNP.

La presente divulgación silencia huntingtina muíante usando interferencia por ARN (Hutvagner et al., 2002). Una cadena de ARN bicatenario (ARNip) complementa una región polimórfica dentro del ARNm de huntingtina mutante. Después de la introducción de ARNip en neuronas, el ARNip se desenrolla parcialmente, se une a una región polimórfica dentro del ARNm de huntingtina en un modo específico de sitio, y activa una ARNm nucleasa. Esta nucleasa escinde el ARNm de huntingtina, deteniendo así la traducción de la huntingtina mutante. Las células se libran ellas mismas del ARNm parcialmente digerido, impidiendo así la traducción, o las células digieren proteínas parcialmente traducidas. Las neuronas sobreviven sobre la huntingtina no mutante (del alelo normal); este enfoque previene los deterioros de huntingtina mutante eliminando su producción.

IV. Diseño de ARNip

Se diseñan ARNip del siguiente modo. Primero, se selecciona una porción del gen diana (por ejemplo, el gen htt) que incluye el polimorfismo. Los polimorfismos a modo de ejemplo se seleccionan de la región no traducida 5' de un gen diana. La escisión de ARNm en estos sitios debe eliminar la traducción de proteína mutante correspondiente. Los polimorfismos de otras regiones del gen mutante también son adecuados para su direccionamiento. Se diseña una cadena codificante basándose en la secuencia de la porción seleccionada. Preferentemente, la porción (y la cadena codificante correspondiente) incluye aproximadamente 19 a 25 nucleótidos, por ejemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos. Más preferentemente, la porción (y cadena codificante correspondiente) incluye 21, 22 o 23 nucleótidos. El experto apreciará, sin embargo, que los ARNip que tienen una longitud inferior a 19 nucleótidos o superior a 25 nucleótidos también pueden funcionar para mediar en la iARN. Por consiguiente, los ARNip de dicha longitud también están dentro del alcance de la presente divulgación, a condición de que retengan la capacidad de mediar en iARN. Se ha demostrado que agentes de iARN más largos provocan una respuesta de interferón o PKR en ciertas células de mamífero que pueden ser no deseables. Preferentemente, los agentes de iARN de la divulgación no provocan una respuesta de PKR (es decir, son de una longitud suficientemente corta). Sin embargo, agentes de iARN más largos pueden ser útiles, por ejemplo, en tipos de células incapaces de generar una respuesta de PRK o en situaciones donde la respuesta de PKR se ha regulado por disminución o disminuido por medios alternativos.

La secuencia de la cadena codificante se diseña de forma que el polimorfismo esté esencialmente en el centro de la cadena. Por ejemplo, si se elige un ARNip de 21 nucleótidos, el polimorfismo está en, por ejemplo, el nucleótido 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 (es decir, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 nucleótidos desde el extremo 5' de la cadena codificante. Para un ARNip de 22 nucleótidos, el polimorfismo está en, por ejemplo, el nucleótido 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Para un ARNip de 23 nucleótidos, el polimorfismo está en, por ejemplo, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16. Para un ARNip de 24 nucleótidos, el polimorfismo está en, por ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 16. Para un ARNip de 25 nucleótidos, el polimorfismo está en, por ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17. El mover el polimorfismo hacia una posición descentrada puede reducir, en algunos casos, la eficiencia de escisión por el ARNip. Dichas composiciones, es decir, composiciones menos eficientes, pueden ser deseables para su uso si se detecta el silenciamiento del ARNm no mutante.

La cadena no codificante es rutinariamente de la misma longitud que la cadena codificante e incluye nucleótidos complementarios. En una realización, las cadenas son completamente complementarias, es decir, las cadenas son de extremos romos cuando se alinean o hibridan. En otra realización, las cadenas comprenden alinear o hibridar tal que se generen nucleótidos protuberantes de 1, 2 o 3 nucleótidos, es decir, el extremo 3' de la cadena codificante se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más que el extremo 5' de la cadena no codificante y/o el extremo 3' de la cadena no codificante se extiende 1, 2 o 3 nucleótidos más que el extremo 5' de la cadena codificante. Los nucleótidos protuberantes pueden comprender (o consistir en) nucleótidos correspondientes a la secuencia del gen diana (o complemento de la misma). Alternativamente, los nucleótidos protuberantes pueden comprender (o consistir en) desoxirribonucleótidos, por ejemplo, dTs, o análogos de nucleótidos, u otro material no de nucleótido adecuado.

Para facilitar la entrada de la cadena no codificante en RISC (y así aumentar o mejorar la eficiencia de la escisión y el silenciamiento diana), se puede alterar la intensidad del par de bases entre el extremo 5' de la cadena codificante y el extremo 3' de la cadena no codificante, por ejemplo, disminuir o reducir, como se describe en detalle en la solicitud de patente provisional de EE. UU. N° 60/475.386 titulada "Methods and Compositions for Controlling Efficacy o f RNA Silencing" (presentada el 2 de junio de 2003) y 60/475.331 titulada "Methods and Compositions for Enhancing the Efficacy and Specificity o f RNAi' (presentada el 2 de junio de 2003).

En una realización de estos aspectos de la divulgación, la intensidad del par de bases es menos debido a pares de bases G:C menores entre el extremo 5' de la primera cadena o no codificante y el extremo 3' de la segunda cadena o codificante que entre el extremo 3' de la primera cadena o no codificante y el extremo 5' de la segunda cadena o codificante. En otra realización, la intensidad del par de bases es menos debido a al menos un par de bases desapareado entre el extremo 5' de la primera cadena o no codificante y el extremo 3' de la segunda cadena o codificante. Preferentemente, el par de bases desapareado se selecciona del grupo que consiste en G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C y U:U. En otra realización, la intensidad del par de bases es menos debido a al menos un par de bases de titubeo, por ejemplo, G:U, entre el extremo 5' de la primera cadena o no codificante y el extremo 3' de la segunda cadena o codificante. En otra realización, la intensidad del par de bases es menos debido a al menos un par de bases que comprende un nucleótido raro, por ejemplo, inosina (I). Preferentemente, el par de bases se selecciona del grupo que consiste en I:A, I:U y I:C. En otra realización más, la intensidad del par de bases es menos debido a al menos un par de bases que comprende un nucleótido modificado. En realizaciones preferidas, el nucleótido modificado se selecciona del grupo que consiste en 2-amino-G, 2-amino-A, 2,6-diamino-G y 2,6-diamino-A.

El diseño de ARNip adecuados para silenciar los polimorfismos de htt expuestos en la Tabla 2 se describe con detalle a continuación

ADN de P1 TGTGCT GACTC TGAGGAACAG (SEQ ID NO: 5)

codificante UGUGCUGACUCUGAGGAACAG (SEQ ID NO: 6)

no codificante ACACGACUGAGACUCCUUGUC (extremos romos, 21-mero) (SEQ ID NO: 7) (2 nucleótidos protuberantes) véase la Figura 5

ADN de P2 CAT ACCT CAAACTGCATGAT G (SEQ ID NO: 8)

codificante CAUACCUCAAACUGCAUGAUG (SEQ ID NO: 9)

no codificante GUAUGGAGUUUGACGUACUAC (extremos romos, 21-mero) (SEQ ID NO: 10)

ADN de P3 GCCTGCAGAGCCGGCGGCCTA (SEQ ID NO: 11)

codificante GCCUGCAGAGCCGGCGGCCUA (SEQ ID NO: 12)

no codificante CGGACGUCUCGGCCGCCGGAU (extremos romos, 21-mero) (SEQ ID NO: 13)

ADN de P4 ACAGAGTTT GTGACCCACGCC (SEQ ID NO: 14)

codificante ACAGAGUUUGUGACCCACGCC (SEQ ID NO: 15)

no codificante UGUCUCAAACACUGGGUGCGG (extremos romos, 21-mero) (SEQ ID NO: 16)

ADN de P5 TCCCTCATCTACTGTGTGCAC (SEQ ID NO: 17)

codificante UCCCUCAUCUACUGUGUGCAC (SEQ ID NO: 18)

no codificante AGGGAGUAGAUGACACACGUG (extremos romos, 21-mero) (SEQ ID NO: 19) Se pueden diseñar ARNip según las enseñanzas anteriores a modo de ejemplo para cualquier otro polimorfo encontrado en el gen htt. Además, la tecnología es aplicable a silenciar cualquier otro gen de enfermedad que tenga asociados polimorfismos, es decir, polimorfismos que no causan enfermedad.

Para validar la eficacia por la que los ARNip destruyen ARNm mutantes (por ejemplo, ARNm de huntingtina mutante), el ARNip se incuba con ADNc mutante (por ejemplo, ADNc de huntingtina mutante) en un sistema de expresión de ARNm in vitro basado en Drosophila. Radiomarcados con 32P, los ARNm mutantes recién sintetizados (por ejemplo, ARNm de huntingtina mutante) se detectan autorradiográficamente sobre un gel de agarosa. La presencia de ARNm mutante escindido indica actividad de ARNm nucleasa. Los controles adecuados incluyen la omisión de ARNip y el uso de ADNc de huntingtina no mutante. Alternativamente, se seleccionan ARNip de control que tienen la misma composición de nucleótidos que el ARNip seleccionado, pero sin complementariedad de secuencias significativa con el gen diana apropiado. Dichos controles negativos se pueden diseñar reordenando aleatoriamente la secuencia de nucleótidos del ARNip seleccionado; se puede realizar una búsqueda de homología para garantizar que el control negativo carezca de homología con cualquier otro gen en el genoma apropiado. Además, se pueden diseñar ARNip de control negativo introduciendo uno o más desapareamientos de bases en la secuencia.

Se seleccionan sitios de complementación ARNip-ARNm que dan como resultado la especificidad óptima de ARNm y la máxima escisión de ARNm.

Mientras que la presente divulgación caracteriza principalmente el silenciamiento de regiones polimórficas en el gen diana mutante (por ejemplo, en htt mutante) distinto de la mutación de la región ampliada de CAG, el experto apreciará que silenciar la región mutante puede tener aplicabilidad como estrategia terapéutica en ciertas situaciones. El silenciamiento de la región mutante se puede llevar a cabo usando ARNip que complementa CAG en serie. El ARNipcag se uniría a ARNm con complementación de CAG, pero cabría esperar tener mayor oportunidad de unirse a una serie ampliada de CAG. Se unirían múltiples ARNipcag al ARNm de huntingtina mutante (a diferencia de menos para el ARNm de huntingtina no mutante); así, es más probable que se escinda el ARNm de huntingtina mutante. La satisfactoria inactivación de ARNm usando este enfoque también eliminaría ARNm de huntingtina normal o no mutante. También inactivados, al menos de algún modo, podrían estar otros genes normales (aproximadamente 70) que también tienen repeticiones de CAG, donde sus ARNm podrían interaccionar con el ARNip. Este enfoque se basaría así en una de estrategia de desgaste -- se destruiría más del ARNm de huntingtina mutante que del ARNm de huntingtina no mutante o los otros aproximadamente 69 ARNm que codifican poliglutaminas.

V. Agentes de iARN

La presente divulgación incluye moléculas de ARNip diseñadas, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Las moléculas de ARNip de la divulgación pueden ser químicamente sintetizadas, o se pueden transcribir in vitro de un molde de ADN, o in vivo, de, por ejemplo, ARNhp, o, usando enzima DICER humana recombinante, para escindir moldes de ARNbc transcritos in vitro en conjuntos de ARN dúplex de 20, 21 o 23 pb que median en la iARN. Las moléculas de ARNip se pueden diseñar usando cualquier método conocido en la técnica.

En un aspecto, en lugar del agente de iARN que es un ácido ribonucleico interferente, por ejemplo, un ARNip o ARNhp como se ha descrito anteriormente, el agente de iARN puede codificar un ácido ribonucleico interferente, por ejemplo, un ARNhp, como se ha descrito anteriormente. En otras palabras, el agente de iARN puede ser un molde transcripcional del ácido ribonucleico interferente. Así, los agentes de iARN de la presente divulgación también pueden incluir ARN de horquilla pequeña (ARNhp), y construcciones de expresión manipuladas para expresar ARNhp. La transcripción de ARNhp se inicia en un promotor de la polimerasa III (pol III), y se cree que termina en la posición 2 de un sitio de terminación de 4-5-timina de la transcripción. Tras la expresión, se cree que los ARNhp se pliegan en una estructura de tallo-bucle con nucleótidos protuberantes UU de 3'; posteriormente, los extremos de estos ARNhp se procesan, convirtiendo los ARNhp en moléculas de tipo ARNip de aproximadamente 21 -23 nucleótidos (Brummelkamp et al., 2002; Lee et al., 2002. arriba; Miyagishi et al., 2002; Paddison et al., 2002, arriba; Paul et al., 2002, arriba; Sui et al., 2002 arriba; Yu et al., 2002, arriba. Se puede encontrar en internet más información sobre el diseño y uso de ARNhp en las siguientes direcciones: katahdin. cshl.org:9331/RNAi/docs/BseRI-BamHI_Strategy.pdf and katahdin. cshl.org:9331/RNAi/docs/Web_version_of_PCR-strategy1 .pdf.

Las construcciones de expresión de la presente divulgación incluyen cualquier construcción adecuada para su uso en el sistema de expresión apropiado e incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovirales, casetes de expresión lineal, plásmidos y vectores virales o derivados de virus, como se conoce en la técnica. Dichas construcciones de expresión pueden incluir uno o más promotores inducibles, sistemas de promotores de ARN Pol III tales como los promotores de ARNnp U6 o promotores de la ARN polimerasa III HI, u otros promotores conocidos en la técnica. Las construcciones pueden incluir una o ambas cadenas del ARNip. Las construcciones de expresión que expresan ambas cadenas también pueden incluir estructuras de bucle que unen ambas cadenas, o cada cadena se puede transcribir por separado de promotores separados dentro de la misma construcción. Cada cadena también se puede transcribir de una construcción de expresión separada (Tuschl, T., 2002, arriba).

Se pueden administrar ARNip sintéticos en células por métodos conocidos en la técnica, que incluyen transfección de liposomas catiónicos y electroporación. Sin embargo, estos ARNip exógenos muestran, en general, persistencia a corto plazo del efecto de silenciamiento (4~5 días en células cultivadas), que puede ser beneficioso en solo ciertas realizaciones. Para obtener la supresión a largo plazo de los genes diana (es decir, genes mutantes) y para facilitar la administración en ciertas circunstancias, se pueden expresar uno o más ARNip dentro de células de construcciones de ADN recombinante. Se conocen en la técnica dichos métodos para expresar dúplex de ARNip dentro de células de construcciones de ADN recombinante para permitir la supresión de genes de diana a largo plazo en células, que incluyen sistemas de promotores de mamífero Pol III (por ejemplo, sistemas de promotores HI o U6/ARNnp (Tuschl, T., 2002, arriba) capaces de expresar ARNip bicatenarios funcionales; (Bagella et al.,1998; Lee et al., 2002, arriba; Miyagishi et al., 2002, arriba; Paul et al., 2002, arriba; Yu et al., 2002), arriba; Sui et al., 2002, arriba). La terminación transcripcional por ARN Pol III ocurre en series de cuatro restos T consecutivos en el molde de ADN, que proporciona un mecanismo para terminar el transcrito de ARNip en una secuencia específica. El ARNip es complementario a la secuencia del gen diana en las orientaciones 5'-3' y 3'-5', y las dos cadenas del ARNip se pueden expresar en la misma construcción o en construcciones separadas. El ARNip de horquilla, conducido por el promotor HI o ARNnp U6 y expresado en células, puede inhibir la expresión de genes diana (Bagella et al., 1998; Lee et al., 2002, arriba; Miyagishi et al., 2002, arriba; Paul et al., 2002, arriba; Yu et al., 2002), arriba; Sui et al., 2002, arriba). Las construcciones que contienen secuencia de ARNip bajo el control del promotor T7 también hacen funcional el ARNip cuando se cotransfecta en las células con un vector que expresa ARN polimerasa T7 (Jacque et al., 2002, arriba). Una única construcción puede contener múltiples secuencias que codifican ARNip, tales como múltiples regiones del gen que codifican htt mutante, que silencia el mismo gen o múltiples genes, y se puede accionar, por ejemplo, por sitios de promotor Pol III separados.

Las células de animales expresan una variedad de ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos denominados microARN (miARN) que pueden regular la expresión génica al nivel postranscripcional o traduccional durante el desarrollo animal. Una característica común de los miARN es que todos se escinden de un tallo-bucle de ARN de precursor de aproximadamente 70 nucleótidos, probablemente por Dicer, una enzima de tipo RNasa III, o un homólogo de la misma. Se puede usar la sustitución de las secuencias de tallo del precursor de miARN con secuencia complementaria al ARNm diana, una construcción de vector que expresa el precursor manipulado, para producir ARNip para iniciar la iARN contra dianas de ARNm específicas en células de mamífero (Zeng et al., 2002, arriba). Cuando se expresa por vectores de ADN que contienen promotores de polimerasa III, las horquillas diseñadas como micro-ARN pueden silenciar la expresión génica (McManus et al., 2002, arriba). Los micro-ARN que silencian polimorfismos también pueden ser útiles para bloquear la traducción de proteínas mutantes, en ausencia de silenciamiento génico mediado por ARNip. Dichas aplicaciones pueden ser útiles en situaciones, por ejemplo, donde un ARNip diseñado causó el silenciamiento inespecífico de la proteína natural.

También se pueden usar mecanismos de administración mediados por virus para inducir el silenciamiento específico de genes diana mediante la expresión de ARNip, por ejemplo, generando adenovirus recombinantes que alojan ARNip bajo el control de la transcripción del promotor de ARN Pol II (Xia et al., 2002, arriba). La infección de células HeLa por estos adenovirus recombinantes permite la reducida expresión de genes diana endógenos. La inyección de los vectores de adenovirus recombinante en ratones transgénicos que expresan los genes diana del ARNip da como resultado la reducción in vivo de la expresión del gen diana. Ídem. En un modelo animal, la electroporación de embrión completo puede suministrar eficientemente ARNip sintético en embriones de ratón después de la implantación (Calegari et al., 2002). En ratones adultos, se puede llevar a cabo la eficiente administración de ARNip por la técnica de administración de "alta presión", una inyección rápida (en el plazo de 5 segundos) de un gran volumen de ARNip que contiene disolución en el animal por la vena de la cola (Liu et al., 1999, arriba; McCaffrey et al., 2002, arriba; Lewis et al., 2002). También se pueden usar nanopartículas y liposomas para administrar ARNip en animales.

Las composiciones de ácido nucleico de la divulgación incluyen tanto ARNip sin modificar como ARNip modificados como se conoce en la técnica, tales como los derivados de ARNip reticulados o derivados que tienen restos no de nucleótido unidos, por ejemplo, a sus extremos 3' o 5'. La modificación de derivados de ARNip de esta forma puede mejorar la captación celular o potenciar las actividades de silenciamiento celular del derivado de ARNip resultante en comparación con el ARNip correspondiente, son útiles para rastrear el derivado de ARNip en la célula, o mejorar la estabilidad del derivado de ARNip en comparación con el ARNip correspondiente.

Los precursores de ARN manipulados, introducidos en células u organismos completos como se describe en el presente documento, conducirán a la producción de una molécula de ARNip deseada. Dicha molécula de ARNip se asociará entonces con componentes de proteína endógena de la vía de iARN para unirse a y silenciar una secuencia de ARNm específica para la escisión y destrucción. En este modo, el ARNm a ser silenciado por el ARNip generado a partir del precursor de ARN manipulado se agotará de la célula u organismo, que conduce a una disminución en la concentración de la proteína codificada por ese ARNm en la célula u organismo. Los precursores de ARN normalmente son moléculas de ácidos nucleicos que codifican individualmente una cadena de un ARNbc o codifican toda la secuencia de nucleótidos de una estructura de bucle de horquilla de ARN.

Las composiciones de ácido nucleico de la divulgación pueden estar sin conjugar o se pueden conjugar con otro resto, tal como una nanopartícula, para potenciar una propiedad de las composiciones, por ejemplo, un parámetro farmacocinético tal como absorción, eficacia, biodisponibilidad y/o semivida. La conjugación se puede llevar a cabo por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando los métodos de Lambert et al., Drug Deliv. Rev.:47(1), 99­ 112 (2001) (describe ácidos nucleicos cargados en nanopartículas de polialquilcianoacrilato (PACA)); Fattal et al., J. Control Release 53(1 -3):137-43 (1998) (describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas); Schwab et al., Ann. Oncol.

5 Suppl. 4:55-8 (1994) (describe ácidos nucleicos unidos a agentes intercalantes, grupos hidrófobos, policationes o nanopartículas de PACA); y Godard et al., Eur. J. Biochem. 232(2):404-10 (1995) (describe ácidos nucleicos unidos a nanopartículas).

Las moléculas de ácidos nucleicos de la presente divulgación también se pueden marcar usando cualquier método conocido en la técnica; por ejemplo, las composiciones de ácido nucleico se pueden marcar con un fluoróforo, por ejemplo, Cy3, fluoresceína o rodamina. El marcado se puede llevar a cabo usando un kit, por ejemplo, el kit de marcado de ARNip SILENCER™ (Ambion). Además, el ARNip se puede radiomarcar, por ejemplo, usando 3H, 32P, u otro isótopo apropiado.

Además, debido a que se cree que la iARN progresa por al menos un producto intermedio de ARN monocatenario, el experto apreciará que también se pueden diseñar ARNip-mc (por ejemplo, la cadena no codificante de un ARNip-bc) (por ejemplo, para síntesis química) generados (por ejemplo, generados enzimáticamente) o expresados (por ejemplo, a partir de un vector o plásmido) como se describe en el presente documento y utilizados según las metodologías reivindicadas. Además, en invertebrados, la iARN puede ser eficazmente desencadena por ARNbc largos (por ejemplo, ARNbc de aproximadamente 100 - 1000 nucleótidos de longitud, preferentemente aproximadamente 200 -500, por ejemplo, aproximadamente 250, 300, 350, 400 o 450 nucleótidos en longitud) que actúan como efectores de iARN (Brondani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001 Dec 4;98(25):14428-33. Epub 2001 Nov 27).

VI. Métodos de introducción de ARN, vectores y células hospedadoras

Los métodos físicos de introducción de ácidos nucleicos incluyen la inyección de una disolución que contiene el ARN, bombardeo por partículas cubiertas por el ARN, impregnación de la célula u organismo en una disolución del ARN, o electroporación de membranas celulares en presencia del ARN. Una construcción viral encapsidada en una partícula viral lograría tanto la eficiente introducción de una construcción de expresión en la célula como la transcripción de ARN codificado por la construcción de expresión. Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos en células, tales como el transporte de vehículos mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos, tal como fosfato de calcio, y similares. Así, el ARN se puede introducir junto con componentes que desempeñan una o más de las siguientes actividades: potenciar la captación de ARN por la célula, inhibir la hibridación de cadenas individuales, estabilizar las cadenas individuales o aumentar de otro modo la inhibición del gen diana.

El ARN puede ser directamente introducido en la célula (es decir, intracelularmente); o introducido extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, introducido por vía oral, o se puede introducir sumergiendo una célula u organismo en una disolución que contiene el ARN. La circulación vascular o extravascular, el sistema circulatorio o linfático y el líquido cefalorraquídeo son sitios donde se puede introducir el ARN.

La célula que tiene el gen diana puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o pluripotente, divisora o no divisora, parénquima o epitelio, inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de células que están diferenciados incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glía, glóbulos sanguíneos, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y células de las glándulas endocrinas o exocrinas.

Dependiendo del gen diana particular y la dosis de material de ARN bicatenario suministrado, este proceso puede proporcionar pérdida de función parcial o completa para el gen diana. Una reducción o pérdida de la expresión génica en al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % o más de células silenciadas es a modo de ejemplo. Inhibición de expresión génica se refiere a la ausencia (o disminución observable) al nivel de proteína y/o producto de ARNm de un gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin manifestar efectos sobre otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición se pueden confirmar por examen de las propiedades exteriores de la célula u organismo (como se presenta más adelante en los ejemplos) o por técnicas bioquímicas tales como hibridación en disolución de ARN, protección con nucleasa, hibridación Northern, transcripción inversa, monitorización de la expresión génica con una micromatriz, unión de anticuerpos, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos y análisis por citometría de flujo (FACS).

Para la inhibición mediada por ARN en una línea celular u organismo completo, la expresión génica se ensaya convenientemente usando un gen indicador o de resistencia a fármaco cuyo producto de proteína se ensaya fácilmente. Dichos genes indicadores incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), betagalactosidasa (LacZ), beta-glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS) y derivados de las mismas. Están disponibles múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Dependiendo del ensayo, la cuantificación de la cantidad de expresión génica permite determinar un grado de inhibición que es mayor que l0 %, 33 %, 50 %, 90 %, 95 % o 99 % en comparación con una célula no tratada según la presente divulgación. Dosis más bajas de material inyectado y tiempos más largos después de la administración de agente de iARN pueden dar como resultado la inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos 10 %, 20 %, 50 %, 75 %, 90 % o 95 % de células silenciadas). La cuantificación de la expresión génica en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición al nivel de acumulación de ARNm diana o la traducción de proteína diana. Como un ejemplo, la eficiencia de inhibición se puede determinar evaluando la cantidad de producto génico en la célula; se puede detectar ARNm con una sonda de hibridación que tiene una secuencia de nucleótidos fuera de la región usada para el ARN bicatenario inhibidor, o se puede detectar polipéptido traducido con un anticuerpo producido contra la secuencia de polipéptidos de esa región.

El ARN se puede introducir en una cantidad que permite la administración de al menos una copia por célula. Dosis más altas (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) de material pueden dar inhibición más eficaz; también puede ser útiles dosis más bajas para aplicaciones específicas.

En un aspecto preferido, se prueba la eficacia de un agente de iARN de la divulgación (por ejemplo, un ARNip que silencia un polimorfismo en un gen mutante) para su capacidad para degradar específicamente ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de htt mutante y/o la producción de la proteína huntingtina mutante) en células, en particular, en neuronas (por ejemplo, cuerpo estriado o líneas clonales neuronales corticales y/o neuronas primarias). También son adecuados para los ensayos de validación basados en células otras células fácilmente transfectables, por ejemplo, células HeLa o células COS. Las células se transfectan con ADNc humanos no mutantes o mutantes (por ejemplo, ADNc no mutante humano o de huntingtina mutante). Se co-transfectan los ARNip convencionales, ARNip modificados o vectores capaces de producir ARNip de ARNm en bucle en U. Se mide la reducción selectiva en ARNm mutante (por ejemplo, ARNm de huntingtina mutante) y/o proteína mutante (por ejemplo, huntingtina mutante). Se puede comparar la reducción de ARNm o proteína mutante con niveles de ARNm o proteína normal. Se puede ensayar ARNm o proteína normal exógenamente introducida (o ARNm o proteína normal endógena) para fines de comparación. Cuando se utilizan células neuronales, que se conocen por ser algo resistentes a las técnicas de transfección convencionales, se puede desear introducir agentes de iARN (por ejemplo, ARNip) por captación pasiva.

VII. Métodos de tratamiento:

La presente divulgación proporciona métodos profilácticos y terapéuticos para tratar un sujeto en riesgo de (o susceptible a) una enfermedad o trastorno causado, por completo o en parte, por una proteína mutante de ganancia de función. En una realización, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno de repetición de trinucleótidos. En otra realización, la enfermedad o trastorno es un trastorno de las poliglutaminas. En una realización preferida, la enfermedad o trastorno es un trastorno asociado a la expresión de huntingtina y en la que la alteración de huntingtina, especialmente la amplificación del número de copias de la repetición de CAG, conduce a un defecto en el gen huntingtina (estructura o función) o la proteína huntingtina (estructura o función o expresión), de forma que las manifestaciones clínicas incluyen las observadas en pacientes con enfermedad de Huntington.

"Tratamiento" o "tratar", como se usa en el presente documento, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente o vector o transgén de ARN que codifica el mismo) a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido o línea celular aislado de un paciente, que tiene la enfermedad o trastorno, un síntoma de enfermedad o trastorno o una predisposición hacia una enfermedad o trastorno, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperarse de, mejorar o afectar la enfermedad o trastorno, los síntomas de la enfermedad o el trastorno, o la predisposición hacia la enfermedad.

En un aspecto, la divulgación proporciona un método de prevención en un sujeto de una enfermedad o trastorno como se ha descrito anteriormente, administrando al sujeto un agente terapéutico (por ejemplo, un agente o vector o transgén de iARN que codifica el mismo). Los sujetos en riesgo de la enfermedad se pueden identificar, por ejemplo, por cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o de pronóstico como se describen en el presente documento. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la enfermedad o trastorno, de forma que la enfermedad o trastorno se prevenga o, alternativamente, se retrase en su progresión.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a métodos para tratar sujetos terapéuticamente, es decir, alterar la aparición de síntomas de la enfermedad o trastorno. En una realización a modo de ejemplo, el método modulador de la divulgación implica poner en contacto una célula que expresa una ganancia de función mutante con un agente terapéutico (por ejemplo, un agente de iARN o vector o transgén que codifica el mismo) que es específico para un polimorfismo dentro del gen, de forma que se logre la interferencia específica de secuencia con el gen. Estos métodos se pueden realizar in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente a un sujeto).

Con respecto a tanto métodos profilácticos como terapéuticos de tratamiento, dichos tratamientos se pueden adaptar o modificar específicamente, basándose en el conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica. "Farmacogenómica", como se usa en el presente documento, se refiere a la aplicación de tecnologías de genómica, tales como secuenciación génica, genética estadística y análisis de expresión génica a fármacos en desarrollo clínico y a la venta. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un fármaco (por ejemplo, "fenotipo de respuesta del fármaco" o "genotipo de respuesta del fármaco" de un paciente). Así, otro aspecto de la divulgación proporciona métodos para adaptar el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo con cualquiera de las moléculas de gen diana de la presente divulgación o moduladores de gen diana según el genotipo de respuesta del fármaco individual. La farmacogenómica permite que un profesional clínico o médico dirija los tratamientos profilácticos o terapéuticos a los pacientes que se beneficiarán más del tratamiento y para evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios relacionados con fármacos tóxicos.

Se pueden probar agentes terapéuticos en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, se puede usar un agente de iARN (o vector de expresión o transgén que codifica el mismo) como se describe en el presente documento en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad o los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede usar un agente terapéutico en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Por ejemplo, se puede usar un agente en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad o los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede usar un agente en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente.

VIII. Composiciones farmacéuticas

La divulgación se refiere al uso de los agentes anteriormente descritos para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos como se describe más adelante. Por consiguiente, los moduladores (por ejemplo, agentes de iARN) de la presente divulgación se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Dichas composiciones normalmente comprenden la molécula de ácido nucleico, proteína, anticuerpo o compuesto modulador y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Excepto en la medida de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.

Se formula una composición farmacéutica de la divulgación para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de las vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. Las disoluciones o suspensiones usadas para administración parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles (solubles en agua) y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones inyectables estériles o dispersión. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida hasta el punto de que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de dispersión y usando tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración de la misma.

Las composiciones orales incluyen, en general, un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en cápsulas de gelatina o comprimir en comprimidos. Con el fin de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo líquido para su uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se enjuaga y expectora o traga. Se pueden incluir aglutinantes y/o materiales de adyuvante farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza simular: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Para administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de un espray en aerosol de un recipiente o dispensador a presión que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para que atraviesen la barrera. Dichos penetrantes se conocen, en general, en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede llevar a cabo mediante el uso de esprays nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas, como se conoce, en general, en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto de la rápida eliminación del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones liposomales (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. N° 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parentales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Forma unitaria de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas aptas como administraciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La memoria descriptiva para las formas unitarias de dosificación de la divulgación viene dictada por y es directamente dependiente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinar dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que presentan grandes índices terapéuticos. Aunque se pueden usar compuestos que presentan efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado en el diseño de un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio de tejido afectado para minimizar el posible daño a células no infectadas y, así, reducir los efectos secundarios.

Se pueden usar los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y se pueden usar estudios en animales en la formulación de un intervalo de administración para su uso en seres humanos. La administración de dichos compuestos radica preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La administración puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluye la CE50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una respuesta) como se determina en cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar con más exactitud dosis útiles en los seres humanos. Se pueden medir niveles en plasma, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador, junto con instrucciones para administración.

La presente divulgación se ilustra además por los siguientes ejemplos que no se debe interpretar como limitantes.

EJEMPLOS

A diferencia de otros tipos de enfermedades autosómicas dominantes, la enfermedad de Huntington no contiene una mutación puntual, por ejemplo, cambio de un único nucleótido. Por tanto, no se puede implementar la estrategia para diseñar ARNip dirigidos contra una mutación puntual en el alelo de enfermedad. En su lugar, la presente divulgación se dirige a ARNip diseñado contra polimorfismos en el gen huntingtina, de los que hay aproximadamente 30 disponibles en GenBank. La presente divulgación también identifica el polimorfismo en el alelo de la enfermedad de Huntington que se diferencia del alelo no mutante, de manera que el ARNip destruye solo el ARNm de la enfermedad y deja intacto el ARNm del alelo no mutante (normal). Así, solo se destruye la proteína huntingtina mutante y la proteína normal está intacta.

Ejemplo I: Prueba de agentes de iARN (por ejemplo, ARNip) contra htt mutante en lisados de D rosophila

Se diseñó una posición 2886 que silencia ARNip en el ARNm de htt como se describe arriba. La secuencia del ARNip se representa en la Figura 5a (SEQ ID NO: 24 codificante; 25 no codificante). Se desprotegió ARN sintético (Dharmacon) según el protocolo del fabricante. Se hibridaron cadenas de ARNip (Elbashir et al., 2001a).

Se prepararon ARN diana del siguiente modo. Se transcribieron ARN diana con T7 ARN polimerasa recombinante, marcada con histidina, de productos de PCR como se ha descrito (Nykanen et al., 2001; Hutvágner et al., 2002). Se generaron moldes de PCR para codificante y no codificante de htt amplificando 0,1 ng/mL (concentración final) de molde de plásmido que codifica ADNc de htt usando los siguientes pares de cebadores: diana codificante de htt, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAA CAG TAT GTCTCA GAC ATC-3' (SEQ ID NO: 30) y 5'-UUCG AAG UAU UCC GCG UAC GU-3' (SEQ ID NO: 31); diana no codificante de htt, 5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GAC AAG CCT AAT TAG TGA TGC-3' (SEQ ID NO: 32) y 5'-GAA CAG TAT GTC TCA GAC ATC-3' (SEQ ID NO: 33).

Se probó el ARNip usando un ensayo de iARN in vitro, que caracteriza los lisados de embrión de Drosophila. Se llevaron a cabo las reacciones y los análisis de iARN in vitro como se ha descrito previamente (Tuschl et al., 1999; Zamore et al., 2000; Haley et al., 2003). Se usaron dianas de ARN a concentración de ~ 5 nM de manera que las reacciones estuvieran principalmente en condiciones de reemplazo único. La escisión diana en estas condiciones es proporcional a la concentración de ARNip.

La Figura 5a muestra la eficacia del ARNip dirigido contra la posición 2886 en el htt mutante. Los datos demuestran claramente que el ARNip dirige la escisión de la diana codificante a un mayor grado que la observada para la diana no codificante. Sin embargo, se reconoce que este ARNip diseñado en primer lugar no produjo una molécula muy activa, al menos en este ensayo in vitro. El análisis termodinámico de la intensidad del par de bases en los dos extremos del dúplex de ARNip indicó intensidades de pares de bases aproximadamente equivalentes. La Figura 4 representa el análisis termodinámico de extremos 5' de cadenas codificantes (SEQ ID NO: 20; 22 respectivamente) y no codificantes (SEQ ID NO: 21; 23 respectivamente) de ARNip para el dúplex de ARNip en 5a. Se calculó a G (kcal/mol) en NaCl 1 M a 37 °C.

Para mejorar la eficacia del dúplex de ARNip diseñado, el extremo 5' de la cadena codificante o la posición 19 de la cadena no codificante del ARNip de htt probado en la Figura 5a se alteró para producir dúplex de ARNip en los que el extremo 5' de la cadena codificante estaba completamente desapareado (Figura 5c; SEQ ID NO: 28 codificante; SEQ ID NO: 29 no codificante) o en un par de bases A:U (Figura 5b; SEQ ID NO: 26 codificante; SEQ ID NO: 27 no codificante). El desapareamiento del extremo 5' de una cadena de ARNip -la cadena codificante, en este caso-provoca que la cadena funcione con la exclusión de la otra cadena. Cuando el extremo 5' de la cadena codificante de htt estaba presente en un par de bases A:U y el extremo 5' de la cadena no codificante de htt estaba en un par G:C, la cadena codificante dominó la reacción (Figura 5b-c), pero la cadena no codificante de htt retuvo la actividad similar a la observada para el ARNip originalmente diseñado.

Ejemplo II: Inactivación de iARN de la proteína Htt en células cultivadas

En un primer experimento, se probaron ARNip que silencian un polimorfismo en el ARNm de htt (es decir, el polimorfismo en la posición 2886 en el ARNm de htt) para su capacidad para regular por disminución la proteína Htt endógena en células HeLa. Se cultivaron y transfectaron células HeLa del siguiente modo. Se mantuvieron células HeLa a 37 °C en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogen) complementado con 10 % de suero bovino fetal (FBS), 100 unidades/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina (Invitrogen). Las células se sometieron a pases regulares a sub-confluencia y se sembraron a 70 % de confluencia 16 horas antes de la transfección. Se realizó transfección transitoria mediada por Lipofectamine™ (Invitrogen) de ARNip en placas de 6 pocillos por duplicado (Falcon) como se describe para las líneas de células adherentes por el fabricante. Se añadió a cada pocillo una mezcla de transfección estándar que contenía ARNip 100-150 nM y 9-10 pL de Lipofectamine™ en 1 mL de OPTI-MEM® reducido en suero (Invitrogen). Las células se incubaron en mezcla de transfección a 37 °C durante 6 horas y se cultivaron adicionalmente en DMEM libre de antibiótico. Para el análisis de transferencia Western en diversos intervalos de tiempo, se recogieron las células transfectadas, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, Invitrogen), se ultracongelaron en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 °C para el análisis.

Se probaron tres ARNip contra una secuencia diana común en el exón 1 y se probaron cuatro ARNip para el polimorfismo de la posición 2886. Se realizó el análisis de transferencia Western del siguiente modo. Se recogieron células tratadas con ARNip como se ha descrito anteriormente y se lisaron en tampón de lisis indicador frío en hielo (Promega) que contenía inhibidor de la proteasa (completo, libre de EDTA, 1 comprimido/10 mL de tampón, Roche Molecular Biochemicals). Después de aclarar los lisados resultantes por centrifugación, se cuantificó la proteína en los lisados claros por el kit del ensayo de proteínas Dc (Bio-Rad). Se resolvieron proteínas en 60 pg de lisado celular total por 10 % de SDS-PAGE, se transfirieron sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF, Bio-Rad) y se inmunotransfirieron con anticuerpos contra CD80 (Santa Cruz). Se visualizó el contenido de proteína con un kit de inmunotransferencia BM Chemiluminescence (Roche Molecular Biochemicals). Las transferencias se expusieron a película de rayos X (Kodak MR-1) durante diversos tiempos (30 s a 5 min). La Figura 6a representa los resultados del análisis Western. La tubulina sirvió de control de carga. Se cuantifican los datos y se normalizaron en la Figura 6b. Del ARNip probado, 2886-4, mostró reproduciblemente eficacia potenciada en células HeLa cultivadas (Figura 6). Este ARNip también mostró reproduciblemente eficacia in vitro potenciada (no mostrada). ARNip de GFP es un ARNip de control que no comparte homología de secuencias con ARNm de htt.

Asimismo, se puede probar ARNip contra regiones polimórficas en el ARNm de htt en células transfectadas con ADNc de htt humano o en células transfectadas con construcciones indicadoras de htt. Las cotransfecciones transitorias mediadas por Lipofectamine™ (Invitrogen) de ADNcs o plásmidos indicadores y ARNip se realizan como se describe arriba. Para probar la capacidad de ARNip para silenciar las construcciones de htt informadas, se usó iARN para inhibir la expresión de GFP-htt en líneas celulares HeLa humanas cultivadas. Brevemente, se transfectaron células HeLa con dúplex de ARNip de GFP-htt, que silencia la secuencia de ARNm de GFP-htt. Para analizar los efectos de iARN contra GFP-htt, se prepararon lisados a partir de células tratadas con dúplex de ARNip en diversos momentos después de la transfección. Se llevaron a cabo experimentos de transferencia Western como se describe arriba. Brevemente, se recogieron las células HeLa en diversos momentos después de la transfección, se resolvió su contenido de proteína sobre 10 % de SDS-PAGE, se transfirió sobre membranas de PVDF y se inmunotransfirió con anticuerpos apropiados. Los resultados de este estudio indicaron que el ARNip contra GFP puede eliminar la expresión de la expresión de GFP-htt en células HeLa transfectadas con el gen GFP-htt. Para estudios que silencian htt exógenamente introducida, los procedimientos son como se describen, excepto que se usan anticuerpos anti-Htt para la inmunotransferencia.

También se puede usar iARN para inhibir la expresión de htt en células neuronales cultivadas. Las células a modo de ejemplo incluyen las líneas celulares PC12 (Scheitzer et al., Thompson et al.) y NT3293 (Tagle et al.) como se ha descrito previamente. Células adicionales a modo de ejemplo incluyen células establemente transfectadas, por ejemplo, células neuronales o células neuronalmente derivadas. Se pueden usar líneas celulares PC12 que expresan el exón 1 del gen huntingtina humana (Htt), aunque la expresión del exón 1 reduce la supervivencia celular. También se pueden usar células GFP-Htt PC12 que tienen un gen GFP-htt inducible para probar o validar la eficacia de ARNip. Ejemplo III: Administración de ARNip de Htt en un entorno in vivo

Los modelos de ratones R6/2 (que expresan el producto de ADNc de htt de R6/2 humano) son un modelo animal aceptado para estudiar la eficacia de la administración de ARNip en un entorno in vivo. Se usaron ratones R6/2 genéticamente manipulados para probar la eficacia de ARNip en el extremo 5' de ARNm de huntingtina. Se inyectó ARNip de Htt en el cuerpo estriado de ratones R6/2 mediante una bomba Alzet. Los ratones se trataron durante 14 días con el sistema de administración de bomba ARNip/Alzet.

Los resultados de este estudio indicaron que los dos ratones que recibieron el ARNip con Trans-IT TKO (Mirus) como una disolución 20 o 200 nM a 0,25 pL/hora no mostraron deterioro de la alteración motora desde el día 67 hasta el día 74. En general, se espera que estos R6/2 tengan una reducción continuada en la varilla giratoria más allá del día 60. Referencias

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Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un agente de iARN para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene o está en riesgo de tener una enfermedad caracterizada o provocada por una proteína mutante de ganancia de función, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz del agente de iARN que silencia un polimorfismo alélico dentro de un gen que codifica un proteína mutante de forma que ocurra la interferencia específica de secuencia de un gen dando como resultado un tratamiento eficaz de la enfermedad, en donde el agente de iARN silencia una región polimórfica que es distinta de la mutación de la región ampliada de CAG en el gen que codifica la proteína mutante, en donde la enfermedad es enfermedad de Huntington y la proteína mutante es la proteína huntingtina.

2. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 1, en donde el agente de iARN silencia un polimorfismo de un solo nucleótido.

3. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el agente de iARN silencia un polimorfismo alélico seleccionado del grupo que consiste en P1-P5 o del grupo que consiste en P6-P43.

4. El agente de iARN para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente de iARN silencia el polimorfismo alélico P27.

5. El agente de iARN para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente de iARN silencia el polimorfismo alélico P5.

6. El agente de iARN para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente de iARN silencia el polimorfismo alélico P17.

7. El agente de iARN para el uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el agente de iARN comprende una primera y una segunda cadena que contiene cada una 16-25 nucleótidos, en donde la primera cadena es homóloga a una región del gen que codifica la proteína mutante de ganancia de función y la secuencia de nucleótidos de la proteína mutante de ganancia de función comprende un polimorfismo alélico, y en donde la segunda cadena es complementaria a la primera cadena.

8. El agente de iARN para el uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el agente de iARN es una construcción de expresión manipulada para expresar ARNhp.

9. El agente de iARN para el uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el agente de iARN es una construcción de expresión seleccionada de vectores retrovirales, casetes de expresión lineal, plásmidos, vectores virales y vectores derivados de virus.

10. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 8 o 9, en donde la construcción de expresión comprende un promotor de la ARN polimerasa II o un promotor de la ARN polimerasa III.

11. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 10, en donde la secuencia promotora de ARN III es el promotor de ARNnp U6 o promotor H1.

12. El agente de iARN para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la construcción de expresión comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16­ 25 nucleótidos homóloga a un polimorfismo alélico dentro de la proteína huntingtina mutante.

13. El agente de iARN para el uso de cualquier reivindicación precedente, en donde el agente de iARN comprende una célula hospedadora.

14. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 13, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero.

15. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 13 o 14, en donde la célula hospedadora es una célula de mamífero no humana.

16. El agente de iARN para el uso de la reivindicación 13 o 14, en donde la célula hospedadora es una célula humana.

17. Una construcción de expresión que comprende un ácido nucleico aislado que codifica una molécula de ácido nucleico con una primera secuencia de 16-25 nucleótidos homóloga a un polimorfismo alélico dentro del gen que codifica una proteína huntingtina mutante, en donde el polimorfismo alélico se selecciona del grupo que consiste en P1-P5 o se selecciona del grupo que consiste en P6-P43.

18. La construcción de expresión de

reivindicación 17, en donde el polimorfismo alélico es P27.

19. La construcción de expresión de

reivindicación 17, en donde el polimorfismo alélico es P5.

20. La construcción de expresión de la reivindicación 17, en donde el polimorfismo alélico es P17.

21. La construcción de expresión de cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde la construcción de expresión se selecciona de vectores retrovirales, casetes de expresión lineal, plásmidos, vectores virales y vectores derivados de virus.