ES2811093T3

ES2811093T3 - Arenavirus trisegmentados como vectores de vacunas

Info

Publication number: ES2811093T3
Application number: ES15794900T
Authority: ES
Inventors: Daniel David Pinschewer; Doron Merkler; Sandra Margarete Kallert; Mario Kreutzfeldt; Abdelrahman Stephanie Gabrielle Darbre; Nicolas Jean Page
Original assignee: University of Geneva
Current assignee: University of Geneva
Priority date: 2014-11-13
Filing date: 2015-11-12
Publication date: 2021-03-10
Anticipated expiration: 2035-11-12
Also published as: JP7796680B2; JP2023036933A; PT3218504T; DK3218504T3; AU2015345080B2; LT3218504T; PT3778903T; US20240082376A1; RS60937B1; HRP20201684T1; CN107223130A; FI3778903T3; ES3067019T3; EP3218504B1; EP3778903B1; US10722564B2; CA2967720A1; HK1244034A1; CA2967720C; AU2015345080A1

Abstract

Una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde uno de los dos segmentos S se selecciona del grupo que consiste en: (i) un segmento S, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (ii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; (v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y (vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus, en donde la partícula de virus trisegmentada comprende dos ORF heterólogos.

Description

DESCRIPCIÓN

Arenavirus trisegmentados como vectores de vacunas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. no. 62/079,493 presentada el 13 de noviembre, 2014.

1. Introducción

La presente solicitud se refiere a arenavirus con reordenamientos de sus marcos de lectura abiertos (''ORF'') en sus genomas. En particular, en la presente memoria se describe un segmento genómico de arenavirus modificado, en donde el segmento genómico de arenavirus está preparado por ingeniería para transportar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En la presente memoria también se describen partículas de arenavirus trisegmentadas que comprenden un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S. El arenavirus, en la presente memoria, puede ser adecuado para vacunas y/o tratamiento de enfermedades y/o para el uso en inmunoterapias.

2. Antecedentes

2.1 Investigación del virus de la coriomeningitis linfocítica y enfermedad humana

El virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), miembro de la familia arenaviridae, es un virus modelo de ratón prototípico en investigación sobre infecciones virales. Desde su aislamiento en la década de 1930 (Rivers y McNair Scott, 1935, Science, 81 (2105): 439-440), los estudios que usan este virus han descubierto muchos conceptos clave en inmunología y patogénesis viral (resumidos en Zinkemagel, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263: 1 -5; Oldstone, 2002, Curr Top Microbiol Immunol, 263: 83-117). El LCMV se ha utilizado ampliamente para investigar la biología molecular viral y las respuestas inmunes, particularmente en el contexto de una infección persistente. El huésped natural del LCMV son los ratones, sin embargo, varios informes revelaron que el LCMV también podría ser un patógeno humano ignorado (Barton, 1996, Clin. Infectar. Dis, 22 (1):197; Wright et al., 1997, Pediatrics 100 (1): E9) Además, se han encontrado muchos otros miembros de la familia arenavirus en poblaciones de roedores de todo el mundo. Además del virus Arenavirus Lassa del Viejo Mundo (LASV), que se puede encontrar en África, varios arenavirus del Nuevo Mundo como Junin (JUNV), Guanarito o Machupo prevalecen en diversas poblaciones de roedores de América del Sur (Johnson et al., 1966, Am J Trop Med Hyg, 15 (1): 103-106; Tesh et al., 1993, Am J Trop Med Hyg 49 (2): 227 235; Mills et al., 1994, Trop Med Hyg 51 (5): 554-562). Tras la transmisión a los seres humanos, muchos de esos virus pueden causar fiebre hemorrágica viral asociada con alta mortalidad (Geisbert y Jahrling, 2004, Nat Med 10 (12 Supl): S110-121).

2.2 Organización genómica del virus de la coriomeningitis linfocítica

Los arenavirus son virus con cubierta. Su genoma consiste en dos segmentos de ARN monocatenario de sentido negativo (L: 7,2 kb, S: 3,4 kb). Cada segmento codifica dos genes virales en orientaciones opuestas. El segmento corto (segmento S) codifica el precursor de la glucoproteína viral (GP) (GP-C; 75 kDa) y la nucleoproteína (NP; 63 kDa) (Salvato et al., 1988, Virology 164 (2): 517-522). El segmento largo (segmento L) expresa la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp; proteína L; aproximadamente 200 kDa) y la proteína de matriz Z (proteína Z), una proteína de dedo RING (11 kDa) (Fig. 1A) (Salvato et al., 1988, Virology 164 (2): 517-522). El precursor de GP GP-C se escinde después de la traducción en GP-1 y GP-2, que permanecen asociados no covalentemente (Buchmeier y Oldstone 1979, Virology 99 (1): 111-120). Los trímeros de GP-1 y GP-2 se ensamblan como espinas en la superficie de los viriones y son esenciales para mediar la entrada en las células huésped mediante la interacción con los receptores de la superficie celular. Durante mucho tiempo se afirmó que la unión y la entrada del virus en las células huésped están mediadas por la interacción del GP de LCMV con el receptor celular a-Distroglicano como el único receptor celular para LCMV (Cao et al., 1998, Science, 282 (5396): 2079-2081). Solo muy recientemente, se postularon tres moléculas humanas adicionales (Axl y Tyro3 de la familia TAM y el ligante de la molécula de adhesión intracelular específica de células dendríticas 3 no integrina) como receptores adicionales para LCMV y LASV, un pariente cercano de LCMV, que permite la entrada de LCMV en células independientemente de a-Distroglicano (Shimojima y Kawaoka 2012, J Vet Med, 74 (10): 1363-1366; Shimojima et al., 2012, J Virol 86 (4): 2067-2078). NP se une al ARN viral, formando la nucleocápside, que sirve como molde para la proteína L viral. La nucleocápside asociada con la proteína L viral forma el llamado complejo de ribonucleoproteína, que es activo tanto en la replicación como en la transcripción y representa la unidad mínima de infectividad viral. Se ha mostrado que NP y la proteína L son los factores de transacción mínimos necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral (Lee et al., 2000, J Virol 74 (8): 3470-3477). Los dos genes en cada segmento están separados por una región intergénica no codificante (IGR) y flanqueados por regiones no traducidas (UTR) 5' y 3'. La IGR forma una estructura de horquilla estable y se ha mostrado que está implicada en la terminación dependiente de la estructura de la transcripción del ARNm viral (Pinschewer et al., 2005, J Virol 79 (7): 4519-4526). Los nucleótidos terminales de la UTR muestran un alto grado de complementariedad, lo que da lugar a la formación de estructuras secundarias. Se sabe que estas estructuras de mango de sartén (panhandle) sirven como el promotor viral para la transcripción y la replicación, y su análisis por mutagénesis dirigida al sitio ha revelado una dependencia de la secuencia y la estructura, no tolerando cambios de secuencia ni siquiera menores (Pérez y de la Torre, 2003, Virol 77 (2): 1184-1194).

2.3 Sistema genético inverso

Los ARN aislados y purificados de virus de cadena negativa como LCMV no pueden servir directamente como ARNm, es decir, no se pueden traducir cuando se introducen en las células. En consecuencia, la transfección de células con ARN viral no conduce a la producción de partículas virales infecciosas. Para generar partículas virales infecciosas de virus de ARN de cadena negativa a partir de ADNc en células permisivas cultivadas, el o los segmentos de ARN viral se deben transcomplementar con los factores mínimos necesarios para la transcripción y replicación. Con la ayuda de un sistema de minigenoma que se publicó hace varios años, finalmente se pudieron analizar los elementos que actúan en cis virales y los factores que actúan en trans implicados en la transcripción, replicación y formación de partículas virales (Lee et a l, 2000, J Virol 74 (8): 3470-3477; Lee et a l, 2002, J Virol 76 (12): 6393-6397; Pérez y de la Torre 2003, J Virol 77 (2): 1184-1194; Pinschewer et a l, 2003, J Virol 77 (6): 3882-3887; Pinschewer et a l, 2005, J Virol 79 (7): 4519-4526.). También para otros arenavirus como LASV y el virus Tacaribe se han establecido sistemas genéticos inversos (Lopez et a l, 2001, J Virol 75 (24): 12241-12251; Hass et al., 2004, J Virol 78 (24): 13793-13803). Dos publicaciones mostraron la recuperación de LCMV infeccioso completamente de ADNc utilizando plásmidos dirigidos por pol-I/-II o T7/pol-II, respectivamente (denominado "rescate viral") (Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci U S A 103 (12): 4663-4668; Sánchez y de la Torre, 2006, Virología 350 (2): 370-380).

2.4 LCMV recombinante que expresa genes de interés

La generación de virus de ARN de cadena negativa recombinantes que expresan genes extraños de interés se ha buscado durante mucho tiempo. Se han publicado diferentes estrategias para otros virus (Garcia-Sastre et al., 1994, J Virol 68 (10): 6254-6261; Percy et al., 1994, J Virol 68 (7): 4486-4492; Flick y Hobom, 1999, Virology 262 (1): 93 103; Machado et al., 2003, Virology 313 (1): 235-249). En el pasado, se ha mostrado que es posible introducir genes extraños adicionales en el genoma de partículas de LCMV bisegmentadas (Emonet et al., 2009, PNAS, 106 (9): 3473 3478). Se insertaron dos genes extraños de interés en el genoma bisegmentado de LCMV, dando lugar a partículas de LCMV trisegmentadas (r3LCMV) con dos segmentos S y un segmento L. En el virus trisegmentado, publicado por Emonet et al. (2009), tanto NP como GP se mantuvieron en su respectiva posición natural en el segmento S y, por lo tanto, se expresaron bajo sus promotores naturales en la UTR flanqueante (Fig. 1B). Sin embargo, la presente solicitud revela que la partícula de LCMV trisegmentada descrita por Emonet et al., ensambla partículas predominantemente bisegmentadas (es decir, el arenavirus solo empaqueta uno en lugar de dos segmentos S), lo que da lugar a un crecimiento atenuado y una fuerte presión de selección para recombinar los dos segmentos S. Como se muestra adicionalmente en la presente solicitud, dicha recombinación se encuentra de forma reproducible y da lugar a una reversión fenotípica a virus de tipo salvaje y pérdida de transgenes.

2.5 Arenavirus deficiente en la replicación

Recientemente, se ha mostrado que una partícula de arenavirus infecciosa se puede preparar por ingeniería para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su material genético en células infectadas pero incapaz de producir más progenie en células normales, no preparadas por ingeniería genética (es decir, una partícula de arenavirus infecciosa deficiente en la replicación) (Publicación Internacional No.: WO 2009/083210 A1 y Publicación Internacional No.: WO 2014/140301 A1).

3. Resumen de la invención

La presente solicitud se refiere a arenavirus con reordenamientos de sus ORF en sus genomas. En particular, la presente solicitud se refiere a un segmento genómico de arenavirus que ha sido preparado por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. La presente solicitud también proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S que no se recombinan en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. La presente solicitud demuestra que la partícula de arenavirus trisegmentada puede prepararse por ingeniería para mejorar la estabilidad genética y asegurar una expresión transgénica duradera.

La invención proporciona una partícula de arenavirus infecciosa trisegmentada y competente para la replicación que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde uno de los dos segmentos S se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un segmento S, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica el L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus,

en donde la partícula de virus trisegmentada comprende dos ORF heterólogos.

La invención proporciona una partícula de arenavirus infecciosa trisegmentada y competente para la replicación que comprende dos segmentos L y un segmento S, en donde uno de los dos segmentos L se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iv) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(vi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus, en donde la partícula de virus trisegmentada comprende dos ORF heterólogos.

Además, la invención proporciona un ADNc del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada de la invención. La invención también proporciona un vector de expresión de ADN que comprende el ADNc.

Además, la invención proporciona una célula huésped que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada, el ADNc o el vector de la invención.

Además, la invención proporciona un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada de la invención, en donde el método comprende:

(i) transfectar en una célula huésped uno o más ADNc de un segmento L y dos segmentos S;

(ii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

(i) transfectar en una célula huésped uno o más ADNc de los dos segmentos L y un segmento S;

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

Además, la invención proporciona una vacuna que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Finalmente, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de entrar en o inyectar su material genético en una célula huésped. En ciertas realizaciones más específicas, un vector viral como se proporciona en la presente memoria es infeccioso, es decir, es capaz de entrar en o inyectar su material genético en una célula huésped, seguido de la amplificación y expresión de su información genética dentro de la célula huésped. En ciertos ejemplos, el vector viral es un vector viral de arenavirus infeccioso y deficiente para la replicación preparado por ingeniería para contener un genoma con la capacidad de amplificar y expresar su información genética en células infectadas pero incapaz de producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no preparadas por ingeniería genética. En ciertas realizaciones, el vector viral de arenavirus infeccioso es competente para la replicación y puede producir más partículas de progenie infecciosas en células normales, no preparadas por ingeniería genética. En ciertas realizaciones más específicas, dicho vector viral competente para la replicación se atenúa en relación con el virus de tipo salvaje del que se deriva el vector viral competente para la replicación.

3.1 Marco de lectura abierto no natural

En ciertas realizaciones, el segmento genómico se prepara por ingeniería para portar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En algunas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus se selecciona del grupo que consiste en:

(ii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR arenavirus; (iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR arenavirus;

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR arenavirus;

(vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR arenavirus;

(vii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 5' UTR arenavirus;

(viii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR arenavirus;

(ix) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR arenavirus;

(x) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR arenavirus;

(xi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 3' UTR arenavirus; y

(xii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR arenavirus.

En algunas realizaciones, la 3' UTR de arenavirus es la 3' UTR del segmento S arenavirus o el segmento L arenavirus. En ciertas realizaciones, la 5' UTR arenavirus es la 5' UTR del segmento S arenavirus o el segmento L arenavirus. También se proporciona en la presente memoria un ADNc aislado de un segmento genómico de arenavirus proporcionado en la presente memoria. También se proporciona en la presente memoria, un vector de expresión de ADN que comprende un ADNc del segmento genómico de arenavirus.

También se proporciona en la presente memoria, una célula huésped que comprende el segmento genómico de arenavirus, un ADNc del segmento genómico de arenavirus, o el vector que comprende un ADNc del segmento genómico de arenavirus.

También se describe en la presente memoria, una partícula de arenavirus que comprende el segmento genómico de arenavirus y un segundo segmento genómico de arenavirus de modo que la partícula de arenavirus comprende un segmento S y un segmento L.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es infecciosa y competente para la replicación. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus está atenuada. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus es infecciosa pero no puede producir más progenie infecciosa en células que no se complementan.

En ciertas realizaciones, al menos uno de los cuatro ORF que codifican la proteína GP, NP, Z y proteína L se elimina o se inactiva funcionalmente.

En ciertas realizaciones, al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En otras realizaciones, solo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En una realización más específica, el ORF que codifica GP se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En otras realizaciones, el ORF que codifica NP se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En algunas realizaciones, el ORF que codifica la proteína Z se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En otras realizaciones, el ORF que codifica la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus.

En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo codifica una proteína informadora. En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno. En otras realizaciones, el ORF heterólogo que codifica un antígeno se selecciona de antígenos de virus de inmunodeficiencia humana, antígenos de virus de hepatitis C, antígeno de superficie de hepatitis B, antígenos de virus varicela zóster, antígenos de citomegalovirus, antígenos de mycobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores.

En ciertas realizaciones, el crecimiento o la infectividad de la partícula de arenavirus no se ve afectado por el ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus.

También se proporciona en la presente memoria un método para producir el segmento genómico de arenavirus. En ciertas realizaciones, el método comprende transcribir el ADNc del segmento genómico de arenavirus.

También se proporciona en la presente memoria un método para generar la partícula de arenavirus. En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus comprende:

(i) transfectar en una célula huésped el ADNc del segmento genómico de arenavirus;

(ii) transfectar en la célula huésped un plásmido que comprende el ADNc del segundo segmento genómico de arenavirus;

(iii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y

(iv) recoger la partícula de arenavirus.

En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento L y el segmento S se realiza usando un promotor bidireccional.

En ciertas realizaciones, el método comprende además transfectar en una célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican una polimerasa de arenavirus. En realizaciones aún más específicas, la polimerasa es la proteína L. En otras realizaciones, el método comprende además transfectar en la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican la NP.

En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento L y el segmento S están cada uno bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un promotor de ARN polimerasa I;

(ii) un promotor de ARN polimerasa II; y

(iii) un promotor T7.

En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una vacuna que comprende una partícula de arenavirus, en donde al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina o se inactiva funcionalmente; o en donde al menos un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus; o en donde solo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En realizaciones más específicas, la vacuna comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro ejemplo, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus, en la que al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina o se inactiva funcionalmente; o en donde al menos un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus; o en donde solo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En realizaciones más específicas, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus se deriva de LCMV. En algunas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus se deriva de la cepa LCMV MP, la cepa Armstrong o la cepa Armstrong Clon 13. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus se deriva de la vacuna del virus Junin Candid # 1, o la cepa de la vacuna del virus Junin XJ Clon 3.

3.2 Arenavirus trisegmentado

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En algunas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de 70 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación 1 (RAG1 ), y que han sido infectados con 104 UFP de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, la recombinación entre segmentos de los dos segmentos S, que une dos ORF de arenavirus en solo uno en lugar de dos segmentos separados, anula la actividad del promotor viral.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada no da lugar a una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de 70 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación 1 (RAG1 ), y que han sido infectados con 104 UFP de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, la recombinación entre segmentos de los dos segmentos L, que une dos ORF de arenavirus en solo uno en lugar de dos segmentos separados, suprime la actividad del promotor viral.

En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un segmento S, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus

(iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y (vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus. En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos L se selecciona del grupo que consiste en:

(vi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus. En ciertas realizaciones, la partícula 3' UTR de arenavirus trisegmentada es la 3' UTR del segmento S de arenavirus o el segmento L de arenavirus. En otras realizaciones, la partícula 5' UTR de arenavirus trisegmentada es la 5' UTR del segmento S de arenavirus o el segmento L de arenavirus.

En ciertas realizaciones, los dos segmentos S comprenden uno o dos ORF heterólogos de un organismo distinto de un arenavirus.

En ciertas realizaciones, los dos segmentos L comprenden uno o dos ORF heterólogos de un organismo distinto de un arenavirus.

En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno. En otras realizaciones, el ORF heterólogo que codifica un antígeno se selecciona de antígenos de virus de inmunodeficiencia humana, antígenos de virus de hepatitis C, antígeno de superficie de hepatitis B, antígenos de virus varicela zóster, antígenos de citomegalovirus, antígenos de mycobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores.

En ciertas realizaciones, al menos un ORF heterólogo codifica una proteína fluorescente. En otras realizaciones, la proteína fluorescente es una proteína fluorescente verde (GFP) o proteína fluorescente roja (RFP).

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende los cuatro ORF de arenavirus. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa y competente para la replicación. En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno o más de los cuatro ORF de arenavirus. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero no puede producir más progenie infecciosa en células que no se complementan.

En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno de los cuatro ORF de arenavirus, en donde la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero no puede producir más progenie infecciosa en células que no se complementan.

En algunos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece del ORF de GP.

En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, un primer segmento S está preparado por ingeniería para portar un ORF que codifica GP en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus y un ORF que codifica un primer gen de interés en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus. En algunas realizaciones, un segundo segmento S está preparado por ingeniería para portar un ORF que codifica la NP en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus y un ORF que codifica un segundo gen de interés en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus.

En otro aspecto más, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, un primer segmento S está preparado por ingeniería para portar un o Rf que codifica GPen una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus y un ORF que codifica un primer gen de interés en una posición bajo el control de una 3' UTR arenavirus. En algunas realizaciones, un segundo segmento S está preparado por ingeniería para portar un ORF que codifica NP en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus y un ORF que codifica un segundo gen de interés en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertas realizaciones, el gen de interés codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno. En otras realizaciones, el gen de interés codifica un antígeno seleccionado de antígenos de virus de inmunodeficiencia humana, antígenos de virus de hepatitis C, antígeno de superficie de hepatitis B, antígenos de virus varicela zóster, antígenos de citomegalovirus, antígenos de mycobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores. En otra realización más, al menos un gen de interés codifica una proteína fluorescente. En una realización específica, la proteína fluorescente es GFP o RFP.

También se proporciona en la presente memoria un ADNc aislado del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada. También se proporciona en la presente memoria, un vector de expresión de ADN que comprende un ADNc del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada. También se proporciona en la presente memoria uno o más vectores de expresión de ADN que comprenden individualmente o en su totalidad el ADNc del arenavirus trisegmentado.

También se proporciona en la presente memoria, una célula huésped que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada, el ADNc del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada, o el vector que comprende el ADNc del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se atenúa.

También se proporciona en la presente memoria un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus comprende:

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

También se proporciona en la presente memoria un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada comprende:

(i) transfectar en una célula huésped uno o más ADNc de dos segmentos L y un segmento S;

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

En ciertas realizaciones, la transcripción de un segmento L y dos segmentos S se realiza usando un promotor bidireccional. En algunas realizaciones, la transcripción de los dos segmentos L y un segmento S se realiza usando un promotor bidireccional.

En ciertas realizaciones, el método comprende además transfectar en una célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican una polimerasa de arenavirus. En realizaciones aún más específicas, la polimerasa es la proteína L. En otras realizaciones, el método comprende además transfectar en la célula huésped uno o más ácidos nucleicos que codifican la proteína NP.

En ciertas realizaciones, la transcripción de un segmento L y dos segmentos S están cada uno bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un promotor de ARN polimerasa I;

(ii) un promotor de ARN polimerasa II; y

(iii) un promotor T7.

En ciertas realizaciones, la transcripción de los dos segmentos L y un segmento S están cada uno bajo el control de un promotor seleccionado del grupo que consiste en:

(i) un promotor de ARN polimerasa I;

(ii) un promotor de ARN polimerasa II; y

(iii) un promotor T7.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada tiene el mismo tropismo que la partícula de arenavirus bisegmentada. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada es deficiente para la replicación. En otra realización, en la presente memoria se proporciona una vacuna que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, en la presente memoria se proporciona una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se deriva de LCMV. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se deriva de la cepa MP de LCMV, la cepa Armstrong o la cepa Armstrong Clon 13. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada se deriva de la vacuna de virus Junin Candid #1, o la vacuna de virus Junin cepa XJ Clon 3.

3.3 Convenciones y abreviaturas

4. Breve descripción de las figuras

Figura 1: Los virus trisegmentados recombinantes muestran un crecimiento alterado en comparación con el LCMV de tipo salvaje independientemente de la posición del ORF de GP en el genoma. (A-C) Representación esquemática de la organización genómica de LCMV bisegmentados y trisegmentados. El genoma bisegmentado del LCMV de tipo salvaje consiste en un segmento S que codifica GP y NP y un segmento L que codifica la proteína Z y la proteína L (A). Ambos segmentos están flanqueados por las respectivas UTR en 5' y 3'. El genoma de los LCMV trisegmentados recombinantes (r3LCMV) consiste en un segmento L y dos segmentos S con una posición donde insertar un gen de interés (aquí GFP) en cada uno de los segmentos S. (B) r3LCMV-GFPnatural (nat) tiene todos los genes virales en su posición natural, mientras que el ORF de GP en r3LCMV-GFPartificial (art) se yuxtapone artificialmente y se expresa bajo el control de la 3' UTR (C). (D) Cinética de crecimiento de los virus indicados en células BHK-21, infectadas a una multiplicidad de infección (moi) de 0,01 (LCMV de tipo salvaje: triángulos grises; r3LCMV-GFPnat: círculos negros; r3LCMV-GFart: cuadrados blancos). El sobrenadante se tomó en los puntos de tiempo indicados después de la infección y las titulaciones virales se determinaron mediante un ensayo de formación de foco. Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de tres réplicas por grupo. Las barras de error están ocultas en el tamaño del símbolo.

Figura 2: Las preparaciones de virus trisegmentados contienen una mayoría de partículas bisegmentadas deficientes para la replicación (r2LCMV). (A) r2LCMV (barras blancas), r3LCMV-GFPIRFPart (barras negras, GFP-GP, RFP-NP) y r3LCMV-GFP/RFPnat (barras grises, GP-GFP, RFP-NP) se crecieron en células BHK-21 de tipo salvaje y se determinó la infectividad del sobrenadante en células BHK-21 no complementarias de tipo salvaje (BHK21), células BHK-21 que expresan GP (BHK- GP) o que expresan NP (BHK-NP). Las titulaciones en las células BHK-21 y BHK-GP se determinaron mediante tinción de focos virales positivos para NP. Las titulaciones en células BHK-21 que complementan NP se determinaron contando focos positivos para GP. Las titulaciones se normalizaron respecto a la titulación promedio obtenida cuando se evaluaron en células BHK-21, y por lo tanto se expresan como un múltiplo de las mismas. Las barras representan la media ± SEM de seis réplicas por grupo. ns.: no estadísticamente significativo (p > 0,05); **: p <0,01 por ANOVA de 1 vía seguido por la prueba posterior de Dunnett usando r2LCMV como referencia. (B) r2LCMV (gráfico izquierdo) o r3LCMV-GFP/RFPart (gráfico medio y derecho) se crecieron en células BHK-21 de tipo salvaje (BHK21; gráfico izquierdo y medio) o células BHK-21 que expresan NP (BHK-NP, gráfico derecho) y se evaluó la fluorescencia 12 horas después de la infección por citometría de flujo. Las células infectadas con r2LCMV se usaron como control de activación. Se muestra un gráfico representativo por condición. (C) Cuantificación de células GFP , RFP o positivas dobles GFP RFP 12 horas después de la infección con r3LCMV-GFP/RFPart en células BHK-21 o BHK-NP. Las barras representan la media ± SEM de tres réplicas por grupo. ns.: no estadísticamente significativo (p > 0,05); ***: p <0,001 por ensayo de la t de student de dos colas no emparejado.

Figura 3: Diseño y cinética de crecimiento de virus trisegmentados recombinantes que portan un ORF de GP parcialmente optimizado por codones o una etiqueta genética en la IGR del segmento S. (A) Esquema del segmento S preparado por ingeniería genética en donde los 255 pares de bases C-terminales de GP están optimizados por codones y NP se reemplaza por GFP (ORF de GP denominado "WE/WET"). Se realizó la cinética de crecimiento del r3LCMV-WEWET/GFPnat trisegmentado que consiste en dos segmentos S y uno L como se detalla en la Fig. 1B, con modificación del segmento S que contiene GP como se muestra en (A) en células BHK-21. El sobrenadante se tomó en los puntos de tiempo indicados después de la infección a moi = 0,01 y las titulaciones virales se determinaron por ensayo de formación de foco (B). Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de tres réplicas por grupo. Las barras de error están ocultas en el tamaño del símbolo. (C) Esquema del segmento S que codifica NP en donde se ha eliminado un par de bases de la IGR para "etiquetar" genéticamente este elemento de ARN no codificante. El residuo G eliminado (indicado por una flecha) se encuentra fuera de la estructura crítica de bucle-tallo de la IGR. Se realizó cinética de crecimiento comparativa de virus trisegmentados con o sin etiqueta genética en la IGR del segmento S que codifica NP (r3LCMV-GFPnat: círculos negros; r3LCMV-GFPnat IGR*: círculos blancos) en células BHK-21 a un moi de 0,01. El sobrenadante se recogió en los puntos de tiempo indicados después de la infección y las titulaciones virales se determinaron mediante un ensayo de formación de foco. Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de tres réplicas por grupo. Se muestran datos representativos de uno de los dos experimentos independientes.

Figura 4: La infección persistente por r3LCMV-GFPnat pero no r3LCMV-GFPart en ratones inmunodeficientes alcanza niveles de viremia equivalentes al virus bisegmentado de tipo salvaje y da como resultado la pérdida de la expresión de GFP. (A) Los ratones AGRAG se infectaron por vía intravenosa con 1x104 PFU de r3LCMV-GFPnat (círculos negros), r3LCMV-GFPart (cuadrados blancos) o r2LCMV control bisegmentado (triángulos grises) y la viremia se monitorizó en el tiempo. Los símbolos representan la media ± SEM de 3-7 ratones por grupo. (B) Se muestra la viremia por LCMV el día 127 después de la infección intravenosa de ratones AGRAG con 1 x104 PFU de r3LCMV-GFPnat o r3LCMV-GFParte. Se realizaron ensayos de inmunofo

(círculos blancos). Los símbolos representan ratones individuales. ns.: no estadísticamente significativo (p > 0,05); ***: p <0,001 (ensayo de la t de student de dos colas no emparejado). (C-E) Se analizó la sangre de ratones AGRAG infectados con r3LCMV-GFPnat, r3LCMV-GFPart o r2LCMV en el día 120 después de la infección por citometría de flujo para detectar la presencia de células GFP+. Los monocitos y los macrófagos se identificaron utilizando la estrategia de activación descrita en (C). Un gráfico representativo de FACS para cada grupo y una superposición de histograma representativo de la expresión de GFP se muestra en (D). (E) Cuantificación de la población de GFP+ dentro de la población de monocitos/macrófagos CD11b+ GR1. Los símbolos representan ratones individuales.

Figura 5: La infección persistente por r3LCMV-GFPnat de ratones da como resultado la recombinación del segmento S y la pérdida de transgenes funcionales de longitud completa. El ARN viral se aisló del suero de ratones AGRAG el día 127 después de la infección intravenosa con 1x104 PFU de r3LCMV-GFPnat o r3LCMV-GFPart. El ARN viral se transcribió inversamente y el ADNc que portaba tanto secuencias NP como GP se amplificó por PCR con cebadores específicos de gen apropiados. (A) Electroforesis de ADN de productos de PCR obtenidos después de (+ RT, carriles 1-8) o sin transcripción inversa previa del molde de ARN (-RT, control negativo, carriles 9-12). El suero de un animal sin tratar se usó como un control negativo separado (n, carril 8) y un ADN plasmídico que codifica un segmento S de LCMV de tipo salvaje como control positivo (p, carril 17). Los amplicones de los carriles 1-3 se sometieron a la secuenciación de Sanger. (B) Secuencia representativa de ADNc obtenida del animal n° 3 (r3LCMV-GFPnat # 3) revelando un segmento S recombinado que combina secuencias de NP y GP, dos IGR (negrita) y una porción de GFP C-terminal (resaltado en gris) (SEQ ID NO: 17). (C) Esquema de tres secuencias del segmento S viral recombinadas aisladas el día 127 después de la infección, cada una de las cuales domina la población viral en un ratón AGRAG representativo. La IGR etiquetada que se origina del segmento S portador de NP está marcada con una estrella (*). La cadena que se ha secuenciado se indica mediante una flecha doble (<-->). Las indicaciones de longitud de pares de bases (pb) describen los elementos IGR remanentes y truncados (acortados) anteriores de GFP.

Figura 6: La cinética de crecimiento del virus recombinado con dos IGR en el segmento S es similar al virus bisegmentado. Las células BHK-21 se infectaron a una moi de 0,01 con LCMV bisegmentado (triángulos grises) que portaba un segmento S de tipo salvaje, con r3LCMV-GFPnat trisegmentado (círculos negros) o con r2LCMV_2IGR (diamantes blancos) que porta un segmento S correspondiente al producto de recombinación recuperado de un ratón AGRAG infectado (compárese con la Fig. 5). El sobrenadante se tomó en los puntos de tiempo indicados y las titulaciones virales se determinaron por ensayo de formación de foco. Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de tres réplicas por grupo. Las barras de error y están ocultas en el tamaño del símbolo. ns.: no estadísticamente significativo (p > 0,05); ***: p <0,001 (ANOVA de 1 vía seguido de la prueba posterior de Bonferroni para comparaciones múltiples).

Figura 7: Modelo para los eventos de recombinación responsables de la pérdida transgénica de r3LCMV-GPnat y mecanismo postulado de la estabilidad genética de r3LCMV-GPart . Este modelo se basa en los datos de secuencia de la terminación de la transcripción de LCMV (Meyer y Southern, 1993, J Virol, 67 (5): 2621-2627) combinado con evidencia genética inversa para la IGR como señal de terminación de la transcripción (Pinschewer etal., 2005, J Virol, 79 (7): 4519-4526). Conjuntamente, estos hallazgos sugirieron una pausa de polimerasa dependiente de la estructura al completar la estructura de horquilla de la IGR. Se encontró que el remanente de GFP entre los dos IGR en segmentos S recombinados se originó a partir de uno o ambos segmentos S, fomentando el modelo de que el cambio de molde de la polimerasa (también conocido como elección de copia) ocurrió cuando la polimerasa se detuvo, ya sea durante la síntesis del genoma o del antigenoma (debajo los escenarios A y B, respectivamente). (A) Durante la síntesis de antigenoma, la ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) se inicia en la 3'UTR de un molde de segmento S genómico y luego lee a través de ORF de NP e IGR. Al final de la IGR, la polimerasa se detiene debido a la estructura secundaria ("pausa de polimerasa dependiente de la estructura"). El bloqueo de la polimerasa facilita la elección de copia y la continuación de la replicación de ARN en un molde alternativo (aquí: genoma del segmento S que codifica GP). El cambio de molde debe ocurrir en 5' del codón de parada GP, y aparentemente es más probable que apunte a secuencias cercanas a o en la base de la horquilla IGR. Continuando su lectura a través del extremo C de la segunda GFP del molde, la polimerasa sintetiza una segunda IGR, el ORF de GP y la 5'UTR. (B) Durante la síntesis del genoma, la RdRp inicia la síntesis del ARN en el extremo 3' de un molde de segmento S antigenómico que contiene GP, sintetiza la 5'UTR, GP y la mayoría o la totalidad de la IGR, seguido de una pausa de la polimerasa dependiente de la estructura. Se produce la elección de copia, cambiando en la porción C-terminal del ORF de GFP cerca de la IGR de un segmento S que contiene NP. Por lo tanto, la replicación añade un fragmento de GFP, seguido de un IGR de longitud completa, la NP y 3'UTR. (C - D) El cambio de molde de manera análoga a los escenarios (A) y (B) también puede ocurrir durante la síntesis del genoma o antigenoma de r3LCMV-GFPart. Este proceso también puede combinar los ORF de NP y GP en un segmento de ARN. Sin embargo, este último está compuesto por dos 3' UTR en lugar de una 3'UTR y una 5'UTR, que solo juntos forman un promotor viral funcional. Por lo tanto, tales moléculas no pueden ser amplificadas por la RdRp y, por lo tanto, no forman virus recombinados competentes para la replicación.

Figura 8: Se generó un vector de vacuna de r3LCMV-OVAart con una organización del genoma análoga a r3LCMV-GFPart (ver Fig. 1C) pero con dos genes de ovoalbúmina (OVA) en lugar de los genes GFP respectivos en el último virus. Los ratones C57BL/6 se inmunizaron por vía intramuscular (i.m.) con 104 PFU de r3LCMV-OVAart o con 108 partículas de un vector basado en adenovirus 5 delecionado en E1 deficiente para la replicación que expresa OVA. 8 días después, los animales fueron sacrificados y se analizó la respuesta de células T incitada en respuesta a la vacunación. A: La frecuencia de células T CD8+ específicas de OVA en el bazo se determinó usando tetrámeros MHC clase I cargados con péptido SIINFEKL. Las frecuencias celulares específicas del epítopo se determinaron entre linfocitos CD8+ negativos para B220. B: La funcionalidad de las células T CD8+ específicas de OVA se analizó mediante ensayos de citoquinas intracelulares utilizando el péptido SIINFEKL para la reestimulación. Las barras representan la media /- SEM de cinco ratones por grupo. *: p <0,05; **: p> 0,01 por el ensayo de la t de Student de dos colas sin emparejar.

Figura 9: LCMV trisegmentado induce a las células T CD8+ de memoria polifuncionales. Se infectaron ratones C57BL/6 i.v. con 1 x105 PFU de r3LCMV-OVA o 1x108 PFU de rAd-OVA. Se tomaron los bazos 25 días después de la infección y se analizó la funcionalidad de las células T CD8+ específicas de OVA mediante tinción intracelular de citoquinas. El perfil de citoquinas (IFN-y, TNF-a e IL-2) de las células T específicas de OVA inducidas por r3LCMV-OVA (barras negras) o rAd-OVA (barras blancas) se muestra como porcentaje de células T CD8+ (A) o como números absolutos por bazo (B). Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de cinco ratones por grupo. Se usó el ensayo de la t de student de dos colas sin emparejar para el análisis estadístico, los valores de p resultantes se corrigieron para comparaciones múltiples por multiplicación con el número de comparaciones (n = 7). Se muestra un experimento representativo de dos experimentos similares.

Figura 10: El LCMV que codifica el antígeno induce respuestas específicas de células T frente a antígenos extraños y autoantígenos. Se infectaron ratones C57BL/6 i.v. con 1x105 PFU de r3LCMV que codifica péptido Her2 de rata, humano o ratón (A, B y C, respectivamente). Se tomaron los bazos nueve días después de la infección y se analizó la inducción de células T CD8+ específicas de antígeno funcionales mediante tinción de citoquinas intracelulares y citometría de flujo. El perfil de citoquinas (IFN-y, TNF-a e IL-2) de células T CD8+ específicas de Her2 inducidas por r3LCMV se muestra en % de células T CD8+. Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de tres ratones por grupo.

Figura 11: El interferón-a se induce después de la infección por r3LCMV pero no después de la infección con Adenovirus o Vacciniavirus recombinante. Se infectaron ratones C57BL/6 i.v. con 1x105 PFU de r3LCMV-OVA, 1x108 PFU de rAd-OVA o 1x106 de PFU rVacc-OVA. Se recogió sangre en los puntos de tiempo indicados después de la infección y se determinaron los niveles de interferón-a en el suero mediante ELISA. Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de cuatro ratones por grupo. ***: p <0,001 (ANOVA de 2 vías seguido de la prueba posterior de Bonferroni para comparaciones múltiples). Se muestran datos representativos de uno de dos experimentos independientes.

Figura 12: Crecimiento del cultivo celular de r3JUNV-GFPart en comparación con r3JUNV-GFPnat y r2JUNV-wt. r3JUNV-GFPart y r3JUNV-GFPnat se construyeron de forma análoga a los respectivos vectores de r3LCMV mostrados esquemáticamente en la Figura 1. Para comparar sus propiedades en el crecimiento del cultivo celular, se infectaron células 293T a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 con r2LCMV-wt, r3JUNV-GFParty r3JUNV-GFPnat, y el sobrenadante se recogió en los puntos de tiempo indicados. Las unidades infecciosas (FFU) en el sobrenadante se determinaron por ensayo de inmunofoco. Los símbolos y las barras representan la media ± SEM de tres réplicas por grupo y están ocultos en el tamaño del símbolo.

Figura 13: Los JUNV trisegmentados se atenúan dramáticamente in vivo y solo conducen a una viremia detectable tras la pérdida de GFP. (A) Los ratones AGRAG se infectaron i.v. con 7x104 PFU de r3JUNV-GFPnat (cuadrados grises), r3JUNV-GFPart (triángulos blancos) o cepa r2JUNV bisegmentada control Candid# 1 (círculos negros), y la viremia se monitorizó con el tiempo. Los símbolos representan ratones individuales (n = 3-7 por grupo). (B) La viremia de JUNV se determinó el día 120 después de la infección intravenosa de ratones AGRAG con 7x104 PFU de r3JUNV-GFPnat o r3JUNV-GFPart. Se realizaron ensayos de inmunofo

GFP (círculos blancos). Las preparaciones madre virales usadas para inocular los ratones se usaron como control de tinción en el ensayo. Los símbolos representan ratones e inóculos individuales, respectivamente.

Figura 14: Las combinaciones homólogas y heterólogas de sensibilización y refuerzo de vectores de vacunas basados en LCMV y JUNV trisegmentados inducen fuertes respuestas de células T CD8+ específicas de autoantígeno P1A. (A) El día 0 y 35 del experimento, los ratones BALB/c fueron inmunizados con 8,5x104 PFU de r3JUNV-P1Aart (r3JUNV-P1A) y r3LCMV-P1Aart (r3LCMV-P1A) por vía intravenosa en las combinaciones homólogas o heterólogas indicadas en la gráfica. Las células T CD8+ específicas de epítopo se tiñeron usando tetrámeros MHC clase I cargados con epítopo P1A en combinación con anticuerpo anti-CD8a. Se calculó la frecuencia de células que se unen a tetrámero P1A dentro del compartimento de células T CD8+ en sangre periférica (A) y el número absoluto de células T CD8+ que se unen a tetrámero P1A por microlitro de sangre periférica (B). Los símbolos representan la media /- SEM de 3-5 ratones por grupo y punto de tiempo.

Descripción detallada de la invención

(ii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iii) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (iv) un segmento S, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vi) un segmento S, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus, en donde la partícula de virus trisegmentada comprende dos ORF heterólogos.

(ii) un segmento L, en donde el ORF que codifica el NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

4.1 Arenavirus con un marco de lectura abierto en una posición no natural

En la presente memoria se proporcionan arenavirus con reordenamientos de sus ORF. En ciertas realizaciones, tales arenavirus son competentes para la replicación e infecciosos. Las secuencias genómicas de tales arenavirus se proporcionan en la presente memoria. En un aspecto, en la presente memoria se proporciona un segmento genómico de arenavirus, en donde el segmento genómico de arenavirus está preparado por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición en la que se encuentra el gen respectivo en virus aislados de la naturaleza, tales como LCMV-MP (véanse las SEQ ID NO: 4 y 5) (denominado en la presente memoria "posición de tipo salvaje") del ORF (es decir, una posición no natural). En una realización, la partícula de arenavirus es un LCMV. Los segmentos genómicos de arenavirus de tipo salvaje y los ORF se conocen en la técnica. En particular, el genoma del arenavirus consiste en un segmento S y un segmento L. El segmento S porta los ORF que codifican la GP y la NP. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Ambos segmentos están flanqueados por las respectivas UTR en 5' y 3' (véase la Figura 1A). Los segmentos genómicos de arenavirus de tipo salvaje ilustrativos se proporcionan en las SEQ ID NO: 1-10.

En ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus se puede preparar por ingeniería para portar dos o más ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus se puede preparar por ingeniería para portar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje.

En ciertas realizaciones, un segmento genómico de arenavirus puede ser:

(i) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica el NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (ii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento S de arenavirus S, en donde el ORF que codifica el GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S de arenavirus S, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vi) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vii) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica el GP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (viii) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica el NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus; (ix) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(x) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica el GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; (xi) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica el NP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(xii) un segmento L de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertas realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus descrito en la presente memoria puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus o una 5' UTR de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 3' UTR de arenavirus es la 3' UTR del segmento S de arenavirus. En otra realización específica, la 3' UTR de arenavirus es la 3'UTR del segmento L de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR de arenavirus es la 5' UTR del segmento S de arenavirus. En otras realizaciones específicas, la 5' UTR es la 5' UTR del segmento L.

En otras realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus descrito en la presente memoria puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservado de arenavirus (las regiones 5' y 3' terminales de 19-20-nt) (véase, p. ej., Pérez y de la Torre, 2003, J Virol. 77 (2): 1184-1194).

En ciertas realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control del elemento promotor de la 5' u Tr (véase, p. ej., Albarino etal., 2011, J Virol., 85 (8): 4020-4). En otra realización, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control del elemento promotor de la 3'UTR (véase, p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85 (8): 4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la 5' UTR es el elemento promotor 5' UTR del segmento S o el segmento L. En otra realización específica, el elemento promotor de la 3' UTR es el elemento promotor 3' UTR del segmento S o el segmento L.

En ciertas realizaciones, el ORF que está en la posición no natural del segmento genómico de arenavirus puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus truncada o una 5' UTR de arenavirus truncada (véase, p. ej., Pérez y de la Torre, 2003, J Virol. 77 (2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85 (8): 4020-4). En realizaciones más específicas, la 3' UTR truncada es la 3' UTR del segmento S o segmento L de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 5' UTR truncada es la 5' UTR del segmento S o segmento L de arenavirus.

También se describe en la presente memoria, una partícula de arenavirus que comprende un primer segmento genómico que ha sido preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF y un segundo segmento genómico de arenavirus de modo que la partícula de arenavirus comprenda un segmento S y un segmento L. En ejemplos específicos, el ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF es uno de los ORF de arenavirus.

En ciertos ejemplos específicos, la partícula de arenavirus puede comprender un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. En ejemplos específicos, el segundo segmento genómico de arenavirus ha sido preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En otros ejemplos específicos, el segundo segmento genómico de arenavirus puede ser el segmento genómico de tipo salvaje (es decir, comprende los ORF en el segmento en la posición de tipo salvaje).

En ciertos ejemplos, el primer segmento genómico de arenavirus es un segmento L y el segundo segmento genómico de arenavirus es un segmento S. En otros ejemplos, el primer segmento genómico de arenavirus es un segmento S y el segundo segmento genómico de arenavirus es un segmento L.

En la Tabla 1 se ilustran ejemplos no limitantes de la partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico con un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF y un segundo segmento genómico. Tabla 1

Partícula de arenavirus

* La posición 1 está bajo el control de una 5' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 2 está bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 3 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; La posición 4 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus.

También se describe en la presente memoria, un ADNc del segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En ejemplos más específicos, se describe en la presente memoria un ADNc o un conjunto de ADNc de un genoma de arenavirus como se expone en la Tabla 1.

En ciertas realizaciones, un ADNc del segmento genómico de arenavirus que está preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF forma parte o está incorporado en un vector de expresión de ADN. En una realización específica, un ADNc del segmento genómico de arenavirus que está preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF forma parte o está incorporado en un vector de expresión de ADN que facilita la producción de un segmento genómico de arenavirus como se describe en la presente memoria. En otra realización, un ADNc descrito en la presente memoria puede incorporarse en un plásmido. Se proporciona una descripción más detallada de los ADNc o ácidos nucleicos y sistemas de expresión en la Sección 4.5.1. Las técnicas para la producción de un ADNc son técnicas rutinarias y convencionales de biología molecular y manipulación y producción de ADN. Se puede usar cualquier técnica de clonación conocida por el experto en la técnica. Tales técnicas son bien conocidas y están disponibles para el experto en la técnica en manuales de laboratorio tales como, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001)).

En ciertas realizaciones, se introduce (p.ej., se transfecta) el ADNc del segmento genómico de arenavirus que está preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF en una célula huésped. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria, es una célula huésped que comprende un ADNc del segmento genómico de arenavirus que está preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF (es decir, un ADNc del segmento genómico). En otras realizaciones, el ADNc descrito en la presente memoria forma parte o puede incorporarse en un vector de expresión de ADN e introducirse en una célula huésped. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria es una célula huésped que comprende un ADNc descrito en la presente memoria que se incorpora en un vector. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus descrito en la presente memoria se introduce en una célula huésped.

En ciertas realizaciones, en la presente memoria se describe un método para producir el segmento genómico de arenavirus, en donde el método comprende transcribir el ADNc del segmento genómico de arenavirus. En ciertas realizaciones, una proteína polimerasa viral puede estar presente durante la transcripción del segmento genómico de arenavirus in vitro o en vivo.

En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza usando un promotor bidireccional. En otras realizaciones, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza usando un casete de expresión bidireccional (véase, p. ej., Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94 (Pt 6): 1175-1188). En realizaciones más específicas, el casete de expresión bidireccional comprende tanto un promotor de polimerasa I como de polimerasa II que leen desde lados opuestos en los dos extremos del segmento genómico de arenavirus insertado, respectivamente. En realizaciones aún más específicas, el casete de expresión bidireccional con promotores de pol-I y pol-II lee desde lados opuestos en el segmento L y el segmento S.

En otras realizaciones, la transcripción del ADNc del segmento genómico de arenavirus descrito en la presente memoria comprende un promotor. Los ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de ARN polimerasa I, un promotor de ARN polimerasa II, un promotor de ARN polimerasa III, un promotor T7, un promotor SP6 o un promotor T3.

En ciertas realizaciones, el método para producir el segmento genómico de arenavirus puede comprender además introducir en una célula huésped el ADNc del segmento genómico de arenavirus. En ciertas realizaciones, el método para producir el segmento genómico de arenavirus puede comprender además introducir en una célula huésped el ADNc del segmento genómico de arenavirus, en donde la célula huésped expresa todos los demás componentes para la producción del segmento genómico de arenavirus; y purificar el segmento genómico de arenavirus del sobrenadante de la célula huésped. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En la presente memoria se proporcionan líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionadas en la presente memoria. Una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares descritas en la presente memoria se proporciona en la Sección 4.5.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus como se describe en la presente memoria da como resultado una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus se atenúa de manera que el virus permanece, al menos parcialmente, capaz de diseminarse y puede replicarse in vivo, pero solo puede generar bajas cargas virales que dan lugar a niveles subclínicos de infección que no son patógenos. Tales virus atenuados pueden usarse como una composición inmunogénica. En la presente memoria, se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden un arenavirus con un ORF en una posición no natural como se describe en la Sección 4.7.

4.1.1 Partículas de Arenavirus deficientes para la replicación con un marco de lectura abierto en una posición no natural

En ciertos ejemplos, en la presente memoria se describe una partícula de arenavirus en la que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z y la proteína L se ha eliminado o se ha inactivado funcionalmente de manera que el virus resultante no puede producir más partículas de virus de la progenie infecciosas. Una partícula de arenavirus que comprende un genoma modificado genéticamente en donde uno o más ORF se ha eliminado o inactivado funcionalmente se puede producir en células complementarias (es decir, células que expresan el arenavirus ORF que ha sido eliminado o inactivado funcionalmente). El material genético de la partícula de arenavirus resultante puede transferirse tras la infección de una célula huésped en la célula huésped, en donde el material genético puede expresarse y amplificarse. Además, el genoma de la partícula de arenavirus modificada genéticamente descrita en la presente memoria puede codificar un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus.

En ciertos ejemplos, al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otro ejemplo, al menos un ORF, al menos dos ORF, al menos tres ORF, o al menos cuatro ORF que codifican GP, NP, proteína Z y proteína L pueden eliminarse y reemplazarse con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En ejemplos específicos, solo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea una partícula de arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica GP del segmento genómico de arenavirus. En otro ejemplo específico, se elimina el ORF que codifica la NP del segmento genómico de arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica la proteína Z del segmento genómico de arenavirus. En otro ejemplo específico más, se elimina el ORF que codifica la proteína L.

Por lo tanto, en ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria comprende un segmento genómico que (i) está preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición no natural; (ii) se elimina un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L; (iii) el ORF que se elimina se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus.

En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo tiene una longitud de 8 a 100 nucleótidos, una longitud de 15 a 100 nucleótidos, una longitud de 25 a 100 nucleótidos, una longitud de 50 a 200 nucleótidos, una longitud de 50 a 400 nucleótidos, una longitud de 200 a 500 nucleótidos, o una longitud de 400 a 600 , una longitud de 500 a 800 nucleótidos. En otros ejemplos, el ORF heterólogo tiene una longitud de 750 a 900 nucleótidos, una longitud de 800 a 100 nucleótidos, una longitud de 850 a 1.000 nucleótidos, una longitud de 900 a 1.200 nucleótidos, una longitud de 1.000 a 1.200 nucleótidos, una longitud de 1.000 a 1.500 nucleótidos o una longitud de 10 a 1.500 nucleótidos, una longitud de 1.500 a 2.000 nucleótidos, una longitud de 1.700 a 2.000 nucleótidos, una longitud de 2.000 a 2.300 nucleótidos, una longitud de 2.200 a 2.500 nucleótidos, una longitud de 2.500 a 3.000 nucleótidos, una longitud de 3.000 a 3.200 nucleótidos, una longitud de 3.000 a 3.500 nucleótidos, una longitud de 3.200 a 3.600 nucleótidos, una longitud de 3.300 a 3.800 nucleótidos, una longitud de 4.000 nucleótidos a 4.400 nucleótidos, una longitud de 4.200 a 4.700 nucleótidos, una longitud de 4.800 a 5.000 nucleótidos, una longitud de 5.000 a 5.200 nucleótidos, una longitud de 5.200 a 5.500 nucleótidos, una longitud de 5.500 a 5.800 nucleótidos, una longitud de 5.800 a 6.000 nucleótidos, una longitud de 6.000 a 6.400 nucleótidos, una longitud de 6.200 a 6.800 nucleótidos, una longitud de 6.600 a 7.000 nucleótidos, una longitud de 7.000 a 7.200 nucleótidos, una longitud de 7.200 a 7.500 nucleótidos, o una longitud de 7.500 nucleótidos. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un péptido o polipéptido que tiene una longitud de 5 a 10 aminoácidos, una longitud de 10 a 25 aminoácidos, una longitud de 25 a 50 aminoácidos, una longitud de 50 a 100 aminoácidos, una longitud de 100 a 150 aminoácidos, una longitud de 150 a 200 aminoácidos, una longitud de 200 a 250 aminoácidos, una longitud de 250 a 300 aminoácidos, una longitud de 300 a 400 aminoácidos, una longitud de 400 a 500 aminoácidos, una longitud de 500 a 750 aminoácidos, una longitud de 750 a 1.000 aminoácidos, una longitud de 1.000 a 1.250 aminoácidos, una longitud de 1.250 a 1.500 aminoácidos, una longitud de 1.500 a 1.750 aminoácidos, una longitud de 1.750 a 2.000 aminoácidos, una longitud de 2.000 a 2.500 aminoácidos, o una longitud de más de 2.500 o más aminoácidos. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un polipéptido que no excede una longitud de 2.500 aminoácidos. En ejemplos específicos, el ORF heterólogo no contiene un codón de parada. En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo está optimizado por codones. En ciertos ejemplos, la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas pueden optimizarse. Las técnicas para tales optimizaciones son conocidas en la técnica y pueden aplicarse para optimizar un ORF heterólogo.

Cualquier ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus puede incluirse en un segmento genómico de arenavirus. En un ejemplo, el ORF heterólogo codifica una proteína informadora. Una descripción más detallada de las proteínas informadoras se describe en la Sección 4.3. En otro ejemplo, el ORF heterólogo codifica un antígeno para un patógeno infeccioso o un antígeno asociado con cualquier enfermedad que sea capaz de incitar una respuesta inmune. En ejemplos específicos, el antígeno se deriva de un organismo infeccioso, un tumor (es decir, cáncer) o un alergeno. Una descripción más detallada sobre los ORF heterólogos se describe en la Sección 4.3.

En ciertos ejemplos, el crecimiento y la infectividad de la partícula de arenavirus no se ven afectados por el ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus.

Las técnicas conocidas por un experto en la técnica pueden usarse para producir una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de genética inversa para generar dicha partícula de arenavirus. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus deficiente para la replicación (es decir, el segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje, en la que se ha delecionado un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z, la proteína L) en una célula complementaria.

En ciertos ejemplos, el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus que se usa de acuerdo con la presente solicitud puede ser Virus del Viejo Mundo, por ejemplo, LCMV.

En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus como se describe en la presente memoria adecuada para uso como una vacuna y a métodos para usar dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones o cánceres. En la Sección 4.6 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria.

En ciertos ejemplos, en la presente memoria se proporciona un kit que comprende, en uno o más contenedores, uno o más ADNc descritos en la presente memoria. En un ejemplo específico, un kit comprende, en uno o dos o más contenedores, un segmento genómico de arenavirus o una partícula de arenavirus como se describe en la presente memoria. El kit puede comprender además uno o más de los siguientes: una célula huésped adecuada para el rescate del segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus, reactivos adecuados para transfectar el ADNc del plásmido en una célula huésped, un virus auxiliar, plásmidos que codifican proteínas virales y/o uno o más cebadores específicos para un segmento genómico de arenavirus modificado o una partícula de arenavirus o ADNc del mismo.

En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus como se describe en la presente memoria adecuada para su uso como una composición farmacéutica y métodos para usar dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones y cánceres. En la Sección 4.7 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria.

4.2 Partícula de arenavirus trisegmentada

En la presente memoria se proporcionan partículas de arenavirus trisegmentadas con reordenamientos de sus ORF. En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada no se recombina en una partícula de arenavirus bisegmentada competente para la replicación. Más específicamente, en ciertas realizaciones, dos de los segmentos genómicos (p. ej., los dos segmentos S o los dos segmentos L, respectivamente) no pueden recombinarse de una manera que produzca un solo segmento viral que pueda reemplazar a los dos segmentos parentales. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En otra realización específica más, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es competente para la replicación y es infecciosa. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada carece de uno de los cuatro ORF de arenavirus. Por lo tanto, en ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada es infecciosa pero no puede producir más progenie infecciosa en células no complementarias.

En ciertas realizaciones, el ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus o una 5' UTR de arenavirus. En realizaciones más específicas, la 3' UTR de arenavirus trisegmentado es la 3' UTR de un segmento o segmentos S de arenavirus. En otra realización específica, la 3'UTR de arenavirus trisegmentado es la 3'UTR de un segmento o segmentos L de arenavirus trisegmentado. En realizaciones más específicas, la 5'UTR del arenavirus trisegmentado es la 5' UTR de un segmento o segmentos S de arenavirus. En otras realizaciones específicas, la 5' UTR es la 5' UTR del o de los segmentos L.

En otras realizaciones, el ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria puede estar bajo el control del elemento de secuencia terminal conservado por arenavirus (las regiones de 19-20 nt 45' y 3' terminales) (véase, p. ej., Pérez y de la Torre, 2003, J Virol. 77 (2): 1184-1194).

En ciertas realizaciones, el ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la 5' UTR (véase, p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85 (8): 4020-4). En otra realización, el ORF que codifica GP, NP, la proteína Z, la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control del elemento promotor de la 3' UTR (véase, p. ej., Albarino et al., 2011, J Virol., 85 (8): 4020-4). En realizaciones más específicas, el elemento promotor de la 5' UTR es el elemento promotor 5' UTR del segmento o segmentos S o el segmento o segmentos L. En otra realización específica, el elemento promotor de la 3' UTR es la 3' UTR, el elemento promotor del segmento o segmentos S o el segmento o segmentos L.

En ciertas realizaciones, el ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L de la partícula de arenavirus trisegmentada puede estar bajo el control de una 3' UTR de arenavirus truncada o una 5'UTR de arenavirus truncada (véase, p. ej., Pérez y de la Torre, 2003, J Virol. 77 (2): 1184-1194; Albarino et al., 2011, J Virol., 85 (8): 4020-4). En realizaciones más específicas, la 3' UTR truncada es la 3' UTR del segmento S o segmento L de arenavirus . En realizaciones más específicas, la 5' UTR truncada es la 5' UTR del segmento o segmentos S o segmento o segmentos L de arenavirus.

También se proporciona en la presente memoria, un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada. En realizaciones más específicas, en la presente memoria se proporciona una secuencia de nucleótidos de ADN o un conjunto de secuencias de nucleótidos de ADN que codifican una partícula de arenavirus trisegmentada como se muestra en la Tabla 2 o la Tabla 3.

En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican el genoma del arenavirus trisegmentado forman parte de o están incorporados en uno o más vectores de expresión de ADN. En una realización específica, los ácidos nucleicos que codifican el genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada forman parte de o están incorporados en uno o más vectores de expresión de ADN que facilitan la producción de una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria. En otra realización, un ADNc descrito en la presente memoria puede incorporarse en un plásmido. En la Sección 4.5.1 se proporciona una descripción más detallada de los ADNc y los sistemas de expresión. Técnicas para la producción de un ADNc técnicas rutinarias y convencionales de biología molecular y manipulación y producción de ADN. Se puede usar cualquier técnica de clonación conocida por el experto en la técnica. Dichas técnicas son bien conocidas y están disponibles para el experto en la técnica en manuales de laboratorio tales como, Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (2001).

En ciertas realizaciones, el ADNc del arenavirus trisegmentado se introduce (p. ej., se transfecta) en una célula huésped. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria, es una célula huésped que comprende un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, un ADNc de los segmentos genómicos de la partícula de arenavirus trisegmentada). En otras realizaciones, el ADNc descrito en la presente memoria que forma parte de o puede incorporarse en un vector de expresión de ADN e introducirse en una célula huésped. Por lo tanto, en algunas realizaciones proporcionadas en la presente memoria es una célula huésped que comprende un ADNc descrito en la presente memoria que se incorpora en un vector. En otras realizaciones, los segmentos genómicos de arenavirus trisegmentados (es decir, el segmento L y/o el segmento o segmentos S) descritos en la presente memoria se introducen en una célula huésped.

En ciertas realizaciones, en la presente memoria se describe un método para producir la partícula de arenavirus trisegmentada, en donde el método comprende transcribir el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, una proteína polimerasa viral puede estar presente durante la transcripción de la partícula de arenavirus trisegmentada in vitro o in vivo. En ciertas realizaciones, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza usando un promotor bidireccional.

En otras realizaciones, la transcripción del segmento genómico de arenavirus se realiza usando un casete de expresión bidireccional (véase, p. ej., Ortiz-Riaño et al., 2013, J Gen Virol., 94 (Pt 6): 1175-1188). En realizaciones más específicas, el casete de expresión bidireccional comprende tanto un promotor de polimerasa I como de polimerasa II que leen desde lados opuestos en los dos extremos del segmento genómico de arenavirus insertado, respectivamente.

En ciertas realizaciones, el método para producir la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender además introducir en una célula huésped el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada. En ciertas realizaciones, el método para producir la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender además introducir en una célula huésped el ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada, en donde la célula huésped expresa todos los demás componentes para la producción de la partícula de arenavirus trisegmentada; y purificar la partícula de arenavirus trisegmentada del sobrenadante de la célula huésped. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En la presente memoria se proporcionan líneas celulares, cultivos y métodos de cultivo de células infectadas con ácidos nucleicos, vectores y composiciones proporcionadas en la presente memoria. En la Sección 4.5 se proporciona una descripción más detallada de los ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares descritas en la presente memoria.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria da como resultado una partícula de arenavirus infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria está atenuada. En una realización particular, la partícula de arenavirus trisegmentada se atenúa de manera que el virus sigue siendo, al menos parcialmente, competente para la replicación y puede replicarse in vivo, pero solo puede generar bajas cargas virales que dan lugar a niveles subclínicos de infección que no son patógenos. Tales virus atenuados pueden usarse como una composición inmunogénica.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada tiene el mismo tropismo que la partícula de arenavirus bisegmentada.

También se proporciona en la presente memoria un kit que comprende, en uno o más contenedores, uno o más ADNc descritos en la presente memoria. En una realización específica, un kit comprende, en uno o dos o más contenedores, una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria. El kit puede comprender además uno o más de los siguientes: una célula huésped adecuada para el rescate de la partícula de arenavirus trisegmentada, reactivos adecuados para transfectar el ADNc del plásmido en una célula huésped, un virus auxiliar, plásmidos que codifican proteínas virales y/o uno o más cebadores oligonucleotídicos específicos para un segmento genómico de arenavirus o partícula de arenavirus modificados o ácidos nucleicos que codifican el mismo.

También se proporcionan en la presente memoria composiciones inmunogénicas que comprenden la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en las Sección 4.6 y 4.7.

4.2.1 Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, a al menos 40 días, al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días o al menos 100 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación (RAG1), y que han sido infectados con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada (véase la Sección 4.8.13). En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 subcultivos, al menos 20 subcultivos, al menos 30 subcultivos, al menos 40 subcultivos, o al menos 50 subcultivos.

La partícula de arenavirus trisegmentada con todos los genes virales en sus respectivas posiciones de tipo salvaje es conocida en la técnica (p. ej., Emonet etal., 2011 J. Virol., 85 (4):1473; Popkin et al., 2011, J. Virol, 85 (15):7928). En particular, el genoma del arenavirus trisegmentado consiste en un segmento L y dos segmentos S, en los que un ORF heterólogo (p. ej., un GFP) se inserta en una posición en cada segmento S. Más específicamente, un segmento S codifica GP y g Fp , respectivamente. El otro segmento S codifica GFP y NP, respectivamente. El segmento L codifica la proteína L y la proteína Z. Todos los segmentos están flanqueados por las respectivas UTR en 5' y 3'.

En ciertas realizaciones, la recombinación entre segmentos de los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada, proporcionada en la presente memoria, que une los dos ORF arenavirales en uno en lugar de dos segmentos separados da como resultado un promotor no funcional (es decir, un segmento genómico de la estructura: 5' U TR .............5' UTR o 3' U TR ................3' UTR), en donde cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia de repetición invertida del otro extremo del mismo genoma.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S ha sido preparada por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. La partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender un segmento L y dos segmentos S y ha sido preparada por ingeniería para portar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Así, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, los dos segmentos S de la partícula de arenavirus trisegmentada se han preparado por ingeniería para portar uno de sus ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. En realizaciones más específicas, los dos segmentos S comprenden un complemento completo de los ORF del segmento S. En ciertas realizaciones específicas, el segmento L se ha preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje o el segmento L puede ser el segmento genómico de tipo salvaje.

En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos S puede ser:

(i) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(ii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(v) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

(vi) un segmento S de arenavirus, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (es decir, dos ORF de segmento S de tipo salvaje, p. ej., GP o NP). En ejemplos específicos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (p. ej., (GP, GP)) o dos ORF duplicados (p. ej., (GP, GP) y (NP, NP)).

La Tabla 2A, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación entre segmentos de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante está formado por dos 3' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).

Tabla 2A

Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S

La posición 1 está bajo el control de una 5' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 2 está bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 3 está bajo el control de una 5' UTR del segmento S de arenavirus; La Posición 4 está bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus; La posición 5 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; La posición 6 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus.

* ORF indica que se ha insertado un ORF heterólogo.

En ciertas realizaciones, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus; la IGR entre las posiciones dos y tres puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus; y la IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser una IGR del segmento L de arenavirus. En una realización específica, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR del segmento S de arenavirus; la IGR entre las posiciones dos y tres puede ser una IGR del segmento S de arenavirus; y la IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser una iGr del segmento L de arenavirus. En ciertas realizaciones, también son posibles otras combinaciones. Por ejemplo, una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación entre segmentos de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad de promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante está formado por dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).

En ciertas realizaciones, la recombinación entre segmentos de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, restaura un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación entre segmentos de un segmento S y un segmento L en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.

La Tabla 2B, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación entre segmentos de un segmento S y un segmento L en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral, es decir, el segmento S recombinado resultante está formado por dos 3' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).

Tabla 2B

* ORF indica que se ha insertado un ORF heterólogo.

En ciertas realizaciones, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus; la IGR entre las posiciones dos y tres puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus; y la IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser una IGR del segmento L de arenavirus. En una realización específica, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR del segmento S de arenavirus; la IGR entre las posiciones dos y tres puede ser una IGR del segmento S de arenavirus; y la IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser una iGr del segmento L de arenavirus. En ciertas realizaciones, también son posibles otras combinaciones. Por ejemplo, una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde la recombinación entre segmentos de los dos segmentos S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante está formado por dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).

En ciertas realizaciones, un experto en la técnica podría construir un genoma de arenavirus con una organización como se ilustra en la Tabla 2A o 2B y como se describe en la presente memoria, y luego usar un ensayo como se describe en la Sección 4.8 para determinar si la partícula de arenavirus trisegmentada es genéticamente estable, es decir, no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación como se discute en la presente memoria.

4.2.2 Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S

En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S. En ciertas realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación. En realizaciones específicas, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 días, al menos 20 días, al menos 30 días, al menos 40 días, o al menos 50 días, al menos 60 días, al menos 70 días, al menos 80 días, al menos 90 días, al menos 100 días de persistencia en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de la recombinación (RAG1), y que han sido infectados con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada (véase la Sección 4.8.13). En otras realizaciones, la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de al menos 10 subcultivos, 20 subcultivos, 30 subcultivos, 40 subcultivos, o 50 subcultivos.

En ciertas realizaciones, la recombinación entre segmentos de los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada, proporcionada en la presente memoria, que une los dos ORF arenavirales en uno en lugar de dos segmentos separados da como resultado un promotor no funcional (es decir, un segmento genómico de la estructura: 5' U TR .............5' UTR o 3' U TR ................3' UTR), en donde cada UTR que forma un extremo del genoma es una secuencia de repetición invertida del otro extremo del mismo genoma.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S ha sido preparada por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. La partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender dos segmentos L y un segmento S y ha sido preparada por ingeniería para portar dos ORF de arenavirus, o tres ORF de arenavirus, o cuatro ORF de arenavirus, o cinco ORF de arenavirus, o seis ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. En realizaciones específicas, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S comprende un complemento completo de los cuatro ORF de arenavirus. Así, en algunas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada es una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación. En realizaciones específicas, los dos segmentos L de la partícula de arenavirus trisegmentada se han preparado por ingeniería para portar uno de sus ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. En realizaciones más específicas, los dos segmentos L comprenden un complemento completo de los ORF del segmento L. En ciertas realizaciones específicas, el segmento S ha sido preparado por ingeniería para portar uno de sus ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje o el segmento S puede ser el segmento genómico de tipo salvaje.

En ciertas realizaciones, uno de los dos segmentos L puede ser:

(ii) un segmento L, en donde el ORF que codifica NP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iii) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína L está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

(iv) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus;

(vi) un segmento L, en donde el ORF que codifica la proteína Z está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S puede comprender un ORF duplicado (es decir, dos ORF de segmento L de tipo salvaje, p. ej., proteína Z o proteína L). En ejemplos específicos, la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S puede comprender un ORF duplicado (p. ej., (proteína Z, proteína Z)) o dos ORF duplicados (p. ej., (proteína Z, proteína Z) y (proteína L, proteína L)).

La Tabla 3, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S, en donde la recombinación entre segmentos de los dos segmentos L en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el supuesto segmento L recombinante resultante estaría compuesto por dos 3' UTR o dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR). Sobre la base de la Tabla 3, se podrían predecir combinaciones similares para generar una partícula de arenavirus compuesta por dos 5' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR.

Tabla 3

Partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S

* La posición 1 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 2 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 3 está bajo el control de una 5' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 4 está bajo el control de una 3' UTR del segmento L de arenavirus; la posición 5 está bajo el control de una 5' UTR del segmento S de arenavirus; la posición 6 está bajo el control de una 3' UTR del segmento S de arenavirus.

* ORF indica que se ha insertado un ORF heterólogo.

En ciertas realizaciones, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus; la IGR entre las posiciones dos y tres puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus; y la IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser una IGR del segmento S o segmento L de arenavirus. En una realización específica, la IGR entre la posición uno y la posición dos puede ser una IGR del segmento L de arenavirus; la IGR entre las posiciones dos y tres puede ser una IGR del segmento L de arenavirus; y la IGR entre las posiciones cinco y seis puede ser una IGR del segmento S de arenavirus. En ciertas realizaciones, también son posibles otras combinaciones.

En ciertas realizaciones, la recombinación entre segmentos de un segmento L y un segmento S de la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S restaura un segmento funcional con dos genes virales en un solo segmento en lugar de dos segmentos separados. En otras realizaciones, la recombinación entre segmentos de un segmento L y un segmento S en la partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.

La Tabla 3B, a continuación, es una ilustración de la organización del genoma de una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S, en donde la recombinación entre segmentos de un segmento L y un segmento S en el genoma de arenavirus trisegmentado no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación y anula la actividad del promotor arenaviral (es decir, el segmento S recombinado resultante está formado por dos 3' UTR en lugar de una 3' UTR y una 5' UTR).

Tabla 3B

* ORF indica que se ha insertado un ORF heterólogo.

En ciertas realizaciones, un experto en la técnica podría construir un genoma de arenavirus con una organización como se ilustra en la Tabla 3A o 3B y como se describe en la presente memoria, y luego usar un ensayo como se describe en la Sección 4.8 para determinar si la partícula de arenavirus trisegmentada es genéticamente estable, es decir, no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación como se discute en la presente memoria.

4.2.3 Partícula de arenavirus trisegmentada deficiente para la replicación

En ciertos ejemplos, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada en la que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) un ORF que codifica GP, Np , la proteína Z o la proteína L se ha eliminado o se ha inactivado funcionalmente de modo que el virus resultante no pueda producir más partículas infecciosas del virus de la progenie (es decir, es deficiente para la replicación). En ciertos ejemplos, el tercer segmento de arenavirus puede ser un segmento S. En otros ejemplos, el tercer segmento de arenavirus puede ser un segmento L. En ejemplos más específicos, el tercer segmento de arenavirus se puede preparar por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF o el tercer segmento de arenavirus puede ser el segmento genómico de arenavirus de tipo salvaje. En ejemplos aún más específicos, el tercer segmento de arenavirus carece de un ORF de arenavirus que codifique GP, NP, la proteína Z o la proteína L.

En ciertas realizaciones, un segmento genómico trisegmentado podría ser un híbrido de segmento S o L (es decir, un segmento genómico que puede ser una combinación del segmento S y el segmento L). En otras realizaciones, el segmento híbrido es un segmento S que comprende una IGR del segmento L. En otra realización, el segmento híbrido es un segmento L que comprende una IGR del segmento S. En otras realizaciones, el segmento híbrido es una UTR del segmento S con una IGR del segmento L. En otra realización, el segmento híbrido es una UTR del segmento L con una IGR del segmento S. En realizaciones específicas, el segmento híbrido es una 5' UTR del segmento S con una IGR del segmento L o una 3' UTR del segmento S con una IGR del segmento L. En otras realizaciones específicas, el segmento híbrido es una 5' UTR del segmento L con una IGR del segmento S o una 3' UTR del segmento L con una IGR del segmento S.

Una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un genoma modificado genéticamente en donde uno o más ORF se han eliminado o inactivado funcionalmente puede producirse en células complementarias (es decir, células que expresan el ORF de arenavirus que ha sido eliminado o inactivado funcionalmente). El material genético de la partícula de arenavirus resultante puede transferirse tras la infección de una célula huésped en la célula huésped, en donde el material genético puede expresarse y amplificarse. Además, el genoma de la partícula de arenavirus modificada genéticamente descrita en la presente memoria puede codificar un ORF heterólogo de un organismo distinto de una partícula de arenavirus.

En ciertos ejemplos, al menos uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otro ejemplo, al menos un ORF, al menos dos ORF, al menos tres ORF, o al menos cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L pueden eliminarse y reemplazarse con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En ejemplos específicos, solo uno de los cuatro ORF que codifican GP, NP, la proteína Z y la proteína L se elimina y reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea una partícula de arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica GP del segmento genómico de arenavirus. En otro ejemplo específico, se elimina el ORF que codifica la NP del segmento genómico de arenavirus. En ejemplos más específicos, se elimina el ORF que codifica la proteína Z del segmento genómico de arenavirus. En otro ejemplo específico más, se elimina el ORF que codifica la proteína L.

En ciertos ejemplos, en la presente memoria se describe una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende un segmento L y dos segmentos S en los que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) se ha eliminado o inactivado funcionalmente un ORF que codifica GP o NP, de modo que el virus resultante es deficiente para la replicación y no es infeccioso. En un ejemplo específico, se elimina un ORF y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otro ejemplo específico, se eliminan dos ORF y se reemplazan con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otros ejemplos específicos, se eliminan tres ORF y se reemplazan con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En ejemplos específicos, el ORF que codifica la GP se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otros ejemplos específicos, el ORF que codifica NP se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En ejemplos aún más específicos, el ORF que codifica NP y el ORF que codifica GP se eliminan y se reemplazan con uno o dos ORF heterólogos de un organismo distinto de una partícula de arenavirus. Así, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) un segmento L y dos segmentos S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; (iii) uno o más ORF heterólogos de un organismo que no sea un arenavirus.

En ciertos ejemplos, en la presente memoria se proporciona una partícula de arenavirus trisegmentada que comprende dos segmentos L y un segmento S en los que (i) un ORF está en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) un ORF que codifica la proteína Z, y/o la proteína L ha sido eliminado inactivado funcionalmente, de modo que el virus resultante es deficiente para la replicación y no es infeccioso. En un ejemplo específico, se elimina un ORF y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otro ejemplo específico, se eliminan dos ORF y se reemplazan con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus. En ejemplos específicos, el ORF que codifica la proteína Z se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En otros ejemplos específicos, el ORF que codifica la proteína L se elimina y se reemplaza con un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus. En ejemplos aún más específicos, el ORF que codifica la proteína Z y el ORF que codifica la proteína L se eliminan y se reemplazan con un ORF heterólogo de un organismo que no sea una partícula de arenavirus. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) dos segmentos L y un segmento S; (ii) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; (iii) un ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus.

Por lo tanto, en ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria comprende una partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S) que i) está preparada por ingeniería para portar un ORF en una posición no natural; ii) se elimina un ORF que codifica Gp , NP, la proteína Z o la proteína L); iii) el ORF que se elimina se reemplaza con uno o más ORF heterólogos de un organismo que no sea un arenavirus.

En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo tiene una longitud de 8 a 100 nucleótidos, una longitud de 15 a 100 nucleótidos, una longitud de 25 a 100 nucleótidos, una longitud de 50 a 200 nucleótidos, una longitud de 50 a 400 nucleótidos, una longitud de 200 a 500 nucleótidos, o una longitud de 400 a 600 nucleótidos, una longitud de 500 a 800 nucleótidos. En otros ejemplos, el ORF heterólogo tiene una longitud de 750 a 900 nucleótidos, una longitud de 800 a 100 nucleótidos, 850 a 1.000 nucleótidos, una longitud de 900 a 1.200 nucleótidos, una longitud de 1.000 a 1.200 nucleótidos, una longitud de 1.000 a 1.500 nucleótidos o una longitud de 10 a 1.500 nucleótidos, una longitud de 1.500 a 2.000 nucleótidos, una longitud de 1.700 a 2.000 nucleótidos, una longitud de 2.000 a 2.300 nucleótidos, una longitud de 2.200 a 2.500 nucleótidos, una longitud de 2.500 a 3.000 nucleótidos, una longitud de 3.000 a 3.200 nucleótidos, una longitud de 3.000 a 3.500 nucleótidos, una longitud de 3.200 a 3.600 nucleótidos, una longitud de 3.300 a 3.800 nucleótidos, una longitud de 4.000 nucleótidos a 4.400 nucleótidos, una longitud de 4.200 a 4.700 nucleótidos, una longitud de 4.800 a 5.000 nucleótidos, una longitud de 5.000 a 5.200 nucleótidos, una longitud de 5.200 a 5.500 nucleótidos, una longitud de 5.500 a 5.800 nucleótidos, una longitud de 5.800 a 6.000 nucleótidos, una longitud de 6.000 a 6.400 nucleótidos, una longitud de 6.200 a 6.800 nucleótidos, una longitud de 6.600 a 7.000 nucleótidos, una longitud de 7.000 a 7.200 nucleótidos, una longitud de 7.200 a 7.500 nucleótidos, o una longitud de 7.500 nucleótidos. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un péptido o polipéptido que tiene una longitud de 5 a 10 aminoácidos, una longitud de 10 a 25 aminoácidos, una longitud de 25 a 50 aminoácidos, una longitud de 50 a 100 aminoácidos, una longitud de 100 a 150 aminoácidos , una longitud de 150 a 200 aminoácidos, una longitud de 200 a 250 aminoácidos, una longitud de 250 a 300 aminoácidos, una longitud de 300 a 400 aminoácidos, una longitud de 400 a 500 aminoácidos, una longitud de 500 a 750, una longitud de 750 a 1.000 aminoácidos, una longitud de 1.000 a 1.250 aminoácidos, una longitud de 1.250 a 1.500 aminoácidos, una longitud de 1.500 a 1.750 aminoácidos, una longitud de 1.750 a 2.000 aminoácidos, una longitud de 2.000 a 2.500 aminoácidos, o una longitud de más de 2.500 o más aminoácidos. En algunos ejemplos, el ORF heterólogo codifica un polipéptido que no excede una longitud de 2.500 aminoácidos. En ejemplos específicos, el ORF heterólogo no contiene un codón de parada. En ciertos ejemplos, el ORF heterólogo está optimizado para codones. En ciertos ejemplos, la composición de nucleótidos, la composición de pares de nucleótidos o ambas pueden optimizarse. Las técnicas para tales optimizaciones son conocidas en la técnica y pueden aplicarse para optimizar un ORF heterólogo.

Cualquier ORF heterólogo de un organismo que no sea un arenavirus puede incluirse en la partícula de arenavirus trisegmentada. En un ejemplo, el ORF heterólogo codifica una proteína informadora. En la Sección 4.3 se describe una descripción más detallada de las proteínas informadoras. En otro ejemplo, el ORF heterólogo codifica un antígeno para un patógeno infeccioso o un antígeno asociado con cualquier enfermedad y donde el antígeno es capaz de incitar una respuesta inmune. En ejemplos específicos, el antígeno se deriva de un organismo infeccioso, un tumor (es decir, cáncer) o un alergeno. En la Sección 4.3 se describe una descripción más detallada sobre los ORF heterólogos.

Las técnicas conocidas por un experto en la técnica pueden usarse para producir una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de genética inversa para generar dicha partícula de arenavirus. En otros ejemplos, la partícula de arenavirus deficiente para la replicación (es decir, el segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje, en la que se ha delecionado un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z, la proteína L) puede producirse en una célula complementaria.

En ciertos ejemplos, la partícula de arenavirus trisegmentada que se usa de acuerdo con la presente solicitud puede ser virus del Viejo Mundo, por ejemplo, LCMV.

En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus como se describe en la presente memoria adecuada para su uso como vacuna y a métodos para usar dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones y cánceres. En la Sección 4.6 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria.

En ciertos ejemplos, la presente solicitud se refiere a la partícula de arenavirus como se describe en la presente memoria adecuada para su uso como una composición farmacéutica y a métodos para usar dicha partícula de arenavirus en una vacunación y tratamiento o prevención de, por ejemplo, infecciones o cánceres. En la Sección 4.6 se proporciona una descripción más detallada de los métodos de uso de la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria.

4.3 Partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo

En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus y la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada respectiva pueden comprender un ORF heterólogo. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus y la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada respectiva pueden comprender un gen de interés. En realizaciones más específicas, el ORF heterólogo o el gen de interés codifica un antígeno. En realizaciones más específicas, el ORF heterólogo o el gen o interés codifica una proteína informadora o una proteína fluorescente.

El segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender uno o más ORF heterólogos o uno o más genes de interés. El segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada pueden comprender al menos un ORF heterólogo, al menos dos ORF heterólogos, al menos tres ORF heterólogos, o más ORF heterólogos. La partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada puede comprender al menos un gen de interés, al menos dos genes de interés, al menos tres genes de interés o más genes de interés.

El segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada de la presente solicitud pueden expresar una amplia variedad de antígenos. En una realización, el ORF heterólogo codifica un antígeno de un patógeno infeccioso o un antígeno asociado con cualquier enfermedad que sea capaz de incitar una respuesta inmune. En ciertas realizaciones, el ORF heterólogo puede codificar un antígeno derivado de un virus, una bacteria, un hongo, un parásito o puede expresarse en un tumor o enfermedad asociada a un tumor (es decir, cáncer), una enfermedad autoinmune, una enfermedad degenerativa, una enfermedad hereditaria, dependencia de sustancias, obesidad o una enfermedad alérgica.

En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno viral. Los ejemplos no limitantes de antígenos virales incluyen antígenos de adenoviridae (p. ej., mastadenovirus y aviadenovirus), herpesviridae (p. ej., virus del herpes simple 1, virus del herpes simple 2, virus del herpes simple 5, virus del herpes simple 6, virus de Epstein-Barr, HHV6-HHV8 y citomegalovirus), leviviridae (p. ej., levivirus, enterobacterias fase MS2, alolevirus), poxyiridae (p. ej., cordopoxyirinae, parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporiipoxvirus, suipoxvirus, molluscipoxvirus y entomopoxyirinae), papovaviridae (p. ej., polyomavirus y papilomavirus), paramyxoviridae (p. ej., paramyxovirus, virus de parainfluenza 1, mobillivirus (p. ej., virus del sarampión), rubulavirus (p. ej., virus de las paperas), pneumonovirinae (p. ej., neumovirus, virus sincitial respiratorio humano), virus sincitial respiratorio humano y metapneumovirus (p. ej., neumovirus aviar y metapneumovirus humano), picornaviridae (p. ej., enterovirus, rinovirus, hepatovirus (p. ej., virus de la hepatitis A humana), cardiovirus y apthovirus), reoviridae (p. ej., orthoreovirus, orbivirus, rotavirus, cypovirus, fijivirus, phyitoreovirus y oryzavirus), retroviridae (p. ej., retrovirus de mamífero tipo B, retrovirus de mamífero tipo C, retrovirus aviar tipo C, grupo de retrovirus tipo D, retrovirus BLV-HTLV, lentivirus (p. ej. virus de inmunodeficiencia humana (VIH) 1 y VIH-2 (p. ej., VIH gp160), spumavirus), flaviviridae (p. ej., virus de la hepatitis C, virus del dengue, virus del Nilo Occidental), hepadnaviridae (p. ej., virus de la hepatitis B), togaviridae (p. ej., alfavirus (p. ej., virus sindbis) y rubivirus (p. ej., virus de la rubéola)), rabdoviridae (p. ej., vesiculovirus, lyssavirus, ephemerovirus, cytorhabdovirus y necleorhabdovirus), arenaviridae (p. ej., arenavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus Ippy y virus lassa) y coronaviridae (p. ej., coronavirus y torovirus). En una realización específica, el antígeno viral es VIH gp120, gp41, Nef de VIH, glucoproteína F de RSV, glucoproteína G de RSV, tax de HTLV, glucoproteína del virus del herpes simple (p. ej., gB, gC, gD y gE) o antígeno de superficie de la hepatitis B, la proteína E del virus de la hepatitis C o la proteína de espina de coronavirus. En una realización, el antígeno viral no es un antígeno de VIH.

En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno bacteriano (p. ej., proteína de la cubierta bacteriana). En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno parasitario (p. ej., un antígeno protozoario). En otras realizaciones más, una secuencia de nucleótidos heteróloga codifica un antígeno fúngico.

Los ejemplos no limitantes de antígenos bacterianos incluyen antígenos de bacterias de la familia Aquaspirillum, familia Azospirillum, familia Azotobacteraceae, familia Bacteroidaceae, especies de Bartonella, familia Bdellovibrio, especies de Campylobacter, especies de Clamidia (p. ej., Chlamydia pneumoniae), Clostridium, familia Enterobacteriaceae (p. ej., especies de Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter aerogenes, especies de Envinia, Escherichia coli, especies de Hafnia, especies de Klebsiella, especies de Morganella, Proteus vulgaris, Providencia, especies de Salmonella, Serratia marcescens, y Shigella flexneri), familia Gardinella, Haemophilus influenzae, familia Halobacteriaceae, familia Helicobacter, familia Legionallaceae, especies de Listeria , familia Methylococcaceae, micobacterias (p. ej., Mycobacterium tuberculosis), familia Neisseriaceae, familia Oceanospirillum, familia Pasteurellaceae, especies de Pneumococcus, especies de Pseudomonas, familia Rhizobiaceae, familia Spirillum, familia Spirosomaceae, Staphylococcus (p. ej., Staphylococcus aureus y Staphylococcus pyrogenes resistente a la meticilina), Streptococcus (p. ej., Streptococcus enteritidis, Streptococcus fasciae y Streptococcus pneumoniae), familia Vampirovibr Helicobacter, familia Yersinia, Bacillus antracis y familia Vampirovibrio.

Los ejemplos no limitantes de antígenos de parásitos incluyen antígenos de un parásito tal como una ameba, un parásito de la malaria, Plasmodium, Trypanosoma cruzi. Los ejemplos no limitantes de antígenos fúngicos incluyen antígenos de hongos de la especie Absidia (p. ej., Absidia corymbifera y Absidia ramosa), especies de Aspergillus, (p. ej., Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, y Aspergillus terreus), Basidiobolus ranarum, Blastomyces dermatitidis, especies de Candida (p. ej., Candida albicans, Candida glabrata, Candida kern, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida pseudotropicalis, Candida quillermondii, Candida rugosa, Candida stellatoidea, y Candida tropicalis), Coccidioides immitis, especies de Conidiobolus, Cryptococcus neoforms, especies de Cunninghamella, dermatofitos, Histoplasma capsulatum, Microsporum gypseum, Mucor pusillus, Paracoccidioides brasiliensis, Pseudallescheria boydii, Rhinosporidium seeberi, Pneumocystis carinii, especies de Rhizopus (p. ej., Rhizopus arrhizus, Rhizopus oryzae y Rhizopus microsporus), especies de Saccharomyces, Sporothrix schenckii, zigomycetos, y clases tales como Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes y Oomycetes.

En algunas realizaciones, un ORF heterólogo codifica un antígeno tumoral o un antígeno asociado a tumor. En algunas realizaciones, el antígeno tumoral o el antígeno asociado a tumor incluye antígenos de enfermedades asociadas a tumor que incluyen leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, carcinoma adrenocortical infantil, cánceres relacionados con el SIDA, sarcoma de Kaposi, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitomas, tumor teratoideo/rabdoideo atípico, carcinoma de células basales, cáncer de conducto biliar, extrahepático (véase colangiocarcinoma), cáncer de vejiga, osteosarcoma óseo/histiocitoma fibroso maligno, glioma del tronco encefálico, cáncer cerebral, tumor cerebral, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/tumor de cerebro glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de vía visual e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide, tumor gastrointestinal carcinoide, carcinoma de primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, primario, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, bronquitis crónica, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células pequeñas y redondas, enfisema, cáncer endometrial, ependimoma, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing en el familia de tumores de Ewing, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer extrahepático de las vías biliares, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal, tumor de células germinales: extracraneal, extragonadal, o tumor trofoblástico gestacional ovárico, glioma del tronco encefálico, glioma, astrocitoma cerebral infantil, vía visual infantil e hipotálamo, carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cardíaco, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma de la vía hipotalámica y visual, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, linfoma linfoblástico agudo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielógena aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, cáncer de labio y cavidad oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón, células no pequeñas, células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma, sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenstrom, cáncer mama masculinao, histiocitoma fibroso maligno de hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, intraocular (ojo), cáncer de células de Merkel, mesotelioma maligno del adulto, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasma de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, leucemia mieloide aguda del adulto, aguda infantil, mieloma múltiple (cáncer de la médula ósea), trastornos mieloproliferativos, crónica, cáncer de la cavidad nasal y de seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, oligodendroglioma, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario (tumor epitelialestromal de superficie), tumor de células germinales de ovario, tumor ovárico de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, células de los islotes, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma pituitario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), pelvis renal y uréter, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, infancia, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de células merkel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas - véase cáncer de piel (no melanoma), cáncer de cuello escamoso con cáncer primario oculto, metastásico, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, linfoma de células T, cutáneo - véase Micosis fungoide y síndrome de Sézary, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células transicionales infantiles de la pelvis renal y el uréter, tumor trofoblástico gestacional, sitio primario desconocido, carcinoma de, sitio primario desconocido del adulto, cáncer de la infancia, uréter y pelvis renal, cáncer de células de transición, cáncer de recto, cáncer uterino, sarcoma uterino endometrial, tumor bronquial, tumor embrionario del sistema nervioso central; cordoma infantil, cáncer colorrectal, craneofaringioma, ependimoblastoma, histiocitosis de células de Langerhans, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda (adulto/infancia), cáncer de pulmón de células pequeñas, meduloepitelioma, cáncer de cavidad oral, papilomatosis, tumores parenquimatosos pineales de diferenciación intermedia, tumor pituitario, carcinoma del tracto respiratorio que implica el gen NUT en el cromosoma 15, tumor de la médula espinal, timoma, cáncer de tiroides, cáncer vaginal; cáncer vulvar y tumor de Wilms.

Los ejemplos no limitantes de antígeno de tumor o asociados a tumor incluyen Adipofilina, AIM-2, ALDH1A1, BCLX (L), BING-4, CALCA, CD45, CPSF, ciclina D1, DKK1, ENAH (hMena), EpCAM, EphA3, EZH2, FGF5, glipicano-3, G250/MN/CAIX, HER-2/neu, IDO1, IGF2B3, IL13Ralpha2, carboxil esterasa intestinal, alfa-fetoproteína, Calicreína 4, KIF20A, Lengsina, M-CSF, MCSP, mdm-2, Meloe, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, p53, PAX5, PBF, PRAME, PSMA, RAGE-1, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, secernina 1, SOX10, STEAP1, survivina, Telomerasa, V eGf o WT1, EGF-R, CEA, CD52, proteína gp 100, MELANA/MART1, nY-ESO-1, p53 Ma Ge 1, MAGE3 y CDK4, alfa-actinina-4, ARTC1, proteína de fusión BCR-ABL (b3a2), B-RAF, CASP-5, CASP-8, beta-catenina, Cdc27, CDK4, CDKN2A, CLPP, COA-1, proteína de fusión dek-can, EFTUD2, Factor de elongación 2, proteína de fusión ETV6-AML1, FLT3-ITD, FN1, GPNMB, proteína de fusión LDLR-fucosiltransferasaAS, NFYC, OGT, OS-9, proteína de fusión pm1-RARalfa, PRDX5, PTPRK, K-ras, N-ras, RBAF600, SIRT2, SNRPD1, proteína de fusión SYT-SSX1 o SSX2, TGF-betaRII, Triosefosfato isomerasa, Lengsina, M-CSF, MCSP o mdm-2.

En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno de un patógeno respiratorio. En una realización específica, el patógeno respiratorio es un virus tal como RSV, coronavirus, metapneumovirus humano, virus de parainfluenza, virus hendra, virus nipah, adenovirus, rinovirus o PRRSV. Los ejemplos no limitantes de antígenos virales respiratorios incluyen las proteínas F, G y M2 del virus sincitial respiratorio, las proteínas de la espina (S) del coronavirus (SARS, HuCoV), las proteínas de fusión del metapneumovirus humano, la fusión del virus de parainfluenza y las proteínas de hemaglutinina (F,HN), el virus de Hendra (HeV) y glucoproteínas de unión del virus de Nipah (NiV) (G y F), proteínas de la cápside de adenovirus, proteínas de rinovirus y proteínas de tipo salvaje PR5V o GP5 y M modificadas.

En una realización específica, el patógeno respiratorio es una bacteria tal como Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Bórdetela pertussis, Streptococcus pneumoniae, Yersinia pestis, Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitides y Haemophilus influenza. Los ejemplos no limitantes de antígenos bacterianos respiratorios incluyen antígeno protector PA de Bacillus anthracis, antígeno micobacteriano 85A y proteína de choque térmico (Hsp65)de Mycobacterium tuberculosis , toxoide pertussis de Bordetella pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA), sortasa A y adhesina de superficie A de Streptococcus pneumoniae (PsaA), subunidades F1 y V de Yersinia pestis, y proteínas de Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Chlamydia pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitides y Haemophilus influenzae.

En algunas realizaciones, el ORF heterólogo codifica un epítopo de células T. En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica una citoquina o factor de crecimiento.

En otras realizaciones, el ORF heterólogo codifica un antígeno expresado en una enfermedad autoinmune. En realizaciones más específicas, la enfermedad autoinmune puede ser diabetes tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso y psoriasis. Los ejemplos no limitantes de antígenos de enfermedades autoinmunes incluyen Ro60, ADNds o RNP.

En otras realizaciones, el ORF codifica un antígeno expresado en una enfermedad alérgica. En realizaciones más específicas, la enfermedad alérgica puede incluir, pero no está limitada a, rinoconjuntivitis estacional y perenne, asma y eccema. Los ejemplos no limitantes de antígenos de alergia incluyen Bet v 1 y Fel d 1.

En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada comprenden además una proteína informadora. La proteína informadora es capaz de expresarse al mismo tiempo que el antígeno descrito en la presente memoria. Idealmente, la expresión es visible en luz normal u otras longitudes de onda de luz. En ciertas realizaciones, la intensidad del efecto creado por la proteína informadora se puede usar para medir y monitorizar directamente la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada.

Los genes informadores serían fácilmente reconocidos por un experto en la técnica. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus es una proteína fluorescente. En otras realizaciones, el gen informador es GFP. GFP emite luz verde brillante cuando se expone a rayos UV o azules.

Los ejemplos no limitantes de proteínas informadoras incluyen diversas enzimas, tales como, pero no limitado a, pgalactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa, neomicina fosfotransferasa, luciferasa o RFP.

En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo tiene propiedades deseables para su uso como un vector para la vacunación (véase. p. ej., la Sección 4.6). En otra realización, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo es capaz de inducir una respuesta inmune en un huésped (p. ej., ratón conejo, cabra, burro, ser humano). En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo descrito en la presente memoria induce una respuesta inmune innata. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo induce una respuesta inmune adaptativa. En realizaciones más específicas, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo, tanto una respuesta inmune innata como adaptativa.

En otra realización, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo induce una respuesta de células T. En realizaciones aún más específicas, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo induce una respuesta de células T CD8+. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus que porta un gen extraño de interés induce una potente respuesta de células T CD8+ de alta frecuencia y funcionalidad. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno induce células T CD8+ específicas para uno o múltiples epítopos del gen extraño de interés correspondiente.

En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo puede inducir la diferenciación de T auxiliar 1, formación de de células T CD4+ de memoria y/o incitar respuestas de anticuerpos duraderas. Estos anticuerpos pueden ser neutralizantes, opsonizantes, tóxicos para las células tumorales o tener otras características biológicas favorables. En otras realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un ORF heterólogo tiene un fuerte tropismo por las células dendríticas y las activa tras la infección. Esto potencia la presentación del antígeno por las células presentadoras de antígeno.

En ciertas realizaciones, el segmento genómico de arenavirus, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno induce titulaciones de anticuerpos neutralizantes bajas o indetectables frente a LCMV y altas respuestas de anticuerpos neutralizantes protectores frente al transgén extraño respectivo. En algunas realizaciones, el esqueleto de arenavirus que forma la partícula o partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno tiene una baja capacidad para inducir inmunidad frente a los componentes del esqueleto arenaviral.

4.4 Generación de una partícula de arenavirus y una partícula de arenavirus trisegmentada

En general, las partículas de arenavirus se pueden producir de forma recombinante mediante técnicas genéticas inversas estándar como se describe para Lc Mv (véase, Flatz et al., 2006, Proc Natl Acad Sci USA 103: 4663-4668; Sanchez et al., 2006, Virology 350:370; Ortiz-Riano et al., 2013, J Gen Virol. 94: 1175-88). Para generar las partículas de arenavirus proporcionadas en la presente memoria, estas técnicas se pueden aplicar como se describe a continuación. El genoma de los virus se puede modificar como se describe en la Sección 4.1 y la Sección 4.2, respectivamente.

4.4.1 Marco de lectura abierto en una posición no natural

La generación de una partícula de arenavirus que comprende un segmento genómico que ha sido preparado por ingeniería para portar un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF puede producirse de forma recombinante mediante cualquier técnica genética inversa conocida por un experto en la técnica.

(i) Partículas de arenavirus infecciosas y competentes para la replicación

En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus comprende (i) transfectar en una célula huésped el ADNc del primer segmento genómico de arenavirus; (ii) transfectar en una célula huésped el ADNc del segundo segmento genómico de arenavirus; (iii) transfectar en una célula huésped plásmidos que expresan los factores que actúan en trans mínimos del arenavirus NP y L; (iv) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y (v) recoger la partícula de arenavirus. En ciertas realizaciones más específicas, el ADNc está comprendido en un plásmido.

Una vez generadas a partir del ADNc, las partículas de arenavirus (es decir, infecciosas y competente para la replicación) se pueden propagar. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus puede propagarse en cualquier célula huésped que permita que el virus crezca hasta titulaciones que permitan los usos del virus como se describe en la presente memoria. En una realización, la célula huésped permite que la partícula de arenavirus crezca hasta titulaciones comparables a las determinados para el tipo salvaje correspondiente.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus puede propagarse en células huésped. Los ejemplos específicos de células huésped que pueden usarse incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus puede propagarse en una línea celular.

En ciertas realizaciones, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmidos. El o los plásmidos expresan el o los segmentos genómicos de arenavirus que se generarán bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos, p. ej., que consiste en un promotor y terminador de polimerasa I.

Los plásmidos que pueden usarse para la generación de la partícula de arenavirus pueden incluir: i) un plásmido que codifica el segmento genómico S, p. ej., pol-I S, ii) un plásmido que codifica el segmento genómico L, p. ej., pol-I L. En ciertas realizaciones, el plásmido que codifica una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos virales L y S puede incorporarse en la mezcla de transfección. Por ejemplo, puede estar presente un plásmido que codifica la proteína L y/o un plásmido que codifica NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y NP son los factores que actúan en trans mínimos necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos L y S virales, junto con NP y la proteína L, puede realizarse usando un casete de expresión con promotores pol-I y pol-II que leen desde lados opuestos en los ADNc de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.

En ciertas realizaciones, los segmentos genómicos de arenavirus están bajo el control de un promotor. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa I, casetes dirigidos por la ARN polimerasa II o casetes dirigidos por la ARN polimerasa del bacteriófago T7. En ciertas realizaciones, el o los plásmidos que codifican los segmentos genómicos de arenavirus pueden ser los mismos, es decir, la secuencia del genoma y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por un promotor de un plásmido. Los ejemplos específicos de promotores incluyen un promotor de ARN polimerasa I, un promotor de ARN polimerasa II, un promotor de ARN polimerasa III, un promotor T7, un promotor SP6 o un promotor T3.

Además, el o los plásmido pueden presentar un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., el casete de expresión de polimerasa II como anteriormente, o el o los transcritos génicos virales están seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a ampicilina.

La transfección de una célula huésped con un o unos plásmidos puede realizarse usando cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación. Unos días después, se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y se subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones con alta expresión, se identifican usando procedimientos de citometría de flujo o transferencia Western con anticuerpos dirigidos frente a la o las proteínas virales de interés.

Para recuperar la partícula de arenavirus descrita en la presente memoria, se prevén los siguientes procedimientos. Primer día: las células, típicamente 80 % confluentes en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los plásmidos, como se describió anteriormente. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación.

3-5 días después: el sobrenadante cultivado (preparación del vector arenavirus) se recoge, se divide en alícuotas y se almacena a 4 ° C, -20 ° C o -80 ° C, dependiendo de cuánto tiempo se debe almacenar el vector arenavirus antes de su uso. La titulación infecciosa de la preparación del vector arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunofoco. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden subcultivarse en un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) en el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante de cultivo se recoge hasta cinco días después del subcultivo.

La presente solicitud se refiere además a la expresión de un ORF heterólogo, en donde un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar un ORF heterólogo. El ORF heterólogo puede incorporarse en el plásmido usando enzimas de restricción.

(ii) Partículas de arenavirus infecciosas, deficientes para la replicación

Las partículas de arenavirus infecciosas, deficientes para la replicación, pueden rescatarse como se describió anteriormente. Sin embargo, una vez generados a partir de ADNc, los arenavirus infecciosos, deficientes para la replicación descritos en la presente memoria pueden propagarse en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus deficiente para la replicación mediante la modificación de su genoma (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se deleciona o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP).

Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los ORF en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la deleción de la glucoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan en trans el o los genes virales delecionados, p. ej., GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular complementaria, en adelante denominada células C, se genera transfectando una línea celular tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra con uno o más plásmidos para la expresión del o de los genes virales de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El o los plásmidos C expresan el o los genes virales delecionados en el vector de arenavirus que se generarán bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos, p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamífero tal como el promotor EF1alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamíferos, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., el casete de expresión de polimerasa II como anteriormente, o el o los transcritos génicos virales están seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta adicionalmente un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a ampicilina.

Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el o los plásmidosde complementación utilizando cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación. Unos días después, se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C con alta expresión, se identifican usando procedimientos de citometría de flujo o transferencia Western con anticuerpos dirigidos frente a la o las proteínas virales de interés. Como alternativa al uso de células C transfectadas de manera estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el o los genes virales ausentes en cada uno de los pasos en los que las células C se utilizarán a continuación. Además, se puede usar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad ausente en trans.

Los plásmidos pueden ser de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en células C los factores que actúan en trans mínimos del arenavirus, se derivan de, p. ej., proteínas NP y L de LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos genómicos del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones diseñadas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del vector de arenavirus respectivo bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamíferos, típicamente, p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamífero tal como el promotor CMV o EF1 alfa, cualquiera de ellos preferentemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos genómicos pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por la polimerasa I o casetes de expresión dirigidos por la ARN polimerasa de bacteriófago T7 (T7-), este último preferentemente con una ribozima 3' terminal para procesar el transcrito primario para rendir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en las células C debe proporcionarse incluyendo en el proceso de recuperación un plásmido de expresión adicional, construido de forma análoga a los plásmidos TF, que proporcionan T7, o las células C se construyen para expresar adicionalmente T7 de manera estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia genómica y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, polI y polII de un plásmido.

Para la recuperación del vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, típicamente 80 % confluentes en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia genómica y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, polI y polII de un plásmido. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación.

3-5 días después: el sobrenadante del cultivo (preparación de vectores de arenavirus) se recoge, se divide en partes alícuotas y se almacena a 4 ° C, -20 ° C o -80 ° C, dependiendo de cuánto tiempo se debe almacenar el vector de arenavirus antes de su uso. Luego, la titulación infecciosa de la preparación del vector arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunofoco en células C. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden subcultivarse en un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) en el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del subcultivo.

La descripción se refiere además a la expresión de un antígeno en un cultivo celular en donde el cultivo celular está infectado con un arenavirus infeccioso, deficiente para la replicación, que expresa un antígeno. Cuando se usa para la expresión de un antígeno en células cultivadas, se pueden usar los siguientes dos procedimientos:

i) El tipo de célula de interés se infecta con la preparación del vector de arenavirus descrita en la presente memoria a una multiplicidad de infección (MOI) de uno o más, p. ej., dos, tres o cuatro, lo que resulta en la producción del antígeno en todas las células, ya poco después de la infección.

ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión de antígeno dirigida por virus. Posteriormente, los clones individuales pueden expandirse infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente de la estrategia, el antígeno se puede recoger (y purificar) posteriormente bien del sobrenadante del cultivo o de las células mismas, dependiendo de las propiedades del antígeno producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y pueden considerarse otras formas de dirigir la expresión del antígeno usando arenavirus infecciosos, deficientes para la replicación como vectores.

4.4.2 Generación de una partícula de arenavirus trisegmentada

Una partícula de arenavirus trisegmentada se puede producir de forma recombinante mediante técnicas genéticas inversas conocidas en la técnica, por ejemplo, como se describe por Emonet et al., 2008, PNAS, 106 (9): 3473-3478; Popkin et al., 2011, J. Virol., 85 (15): 7928-7932. La generación de la partícula de arenavirus trisegmentada proporcionada en la presente memoria puede modificarse como se describe en la Sección 4.2.

(i) Partículas de arenavirus trisegmentadas infecciosas y competentes para la replicación

En ciertas realizaciones, el método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada comprende (i) transfectar en una célula huésped los ADNc de un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S; (ii) transfectar en una célula huésped plásmidos que expresan los factores que actúan en trans mínimos del arenavirus NP y L; (iii) mantener la célula huésped en condiciones adecuadas para la formación de virus; y (iv) recoger la partícula de arenavirus.

Una vez generada a partir del ADNc, la partícula de arenavirus trisegmentada (es decir, infecciosa y competente para la replicación) se puede propagar. En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en cualquier célula huésped que permita que el virus crezca hasta titulaciones que permitan los usos del virus como se describe en la presente memoria. En una realización, la célula huésped permite que la partícula de arenavirus trisegmentada crezca hasta titulaciones comparables a las determinadas para el tipo salvaje correspondiente.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en células huésped. Los ejemplos específicos de células huésped que pueden usarse incluyen BHK-21, HEK 293, VERO u otras. En una realización específica, la partícula de arenavirus trisegmentada puede propagarse en una línea celular.

En realizaciones específicas, las células huésped se mantienen en cultivo y se transfectan con uno o más plásmidos. El o los plásmidos expresan el o los genes virales que se generarán bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos, p. ej., que consiste en un promotor y terminador de polimerasa I.

Los plásmidos que pueden usarse para generar el arenavirus trisegmentado que comprende un segmento L y dos segmentos S pueden incluir: i) dos plásmidos que codifican cada uno el segmento del genoma S, p. ej., pol-I S, ii) un plásmido que codifica el segmento del genoma L, p. ej., pol-I L. Los plásmidos necesarios para el arenavirus trisegmentado que comprende dos segmentos L y un segmento S son: i) dos plásmidos que codifican cada uno el segmento del genoma L, p. ej., pol-L, ii) un plásmido que codifica el segmento del genoma S, p. ej., pol-I S.

En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican una polimerasa de arenavirus que dirige la síntesis intracelular de los segmentos virales L y S pueden incorporarse en la mezcla de transfección. Por ejemplo, un plásmido que codifica la proteína L y un plásmido que codifica NP (pC-L y pC-NP, respectivamente). La proteína L y NP son los factores que actúan en trans mínimos necesarios para la transcripción y replicación del ARN viral. Alternativamente, la síntesis intracelular de los segmentos virales L y S, junto con NP y la proteína L, puede realizarse usando un casete de expresión con promotores pol-I y pol-II que leen desde lados opuestos en los ADNc de los segmentos L y S de dos plásmidos separados, respectivamente.

Además, el o los plásmidos presentan un marcador de selección de mamífero, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamífero, p. ej., el casete de expresión de polimerasa II como se indicó anteriormente, o el o los transcritos del gen viral están seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamíferos. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta además un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a ampicilina.

La transfección de células BHK-21 con un o unos plásmidos se puede realizar utilizando cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación. Unos días después, se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y se subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones con alta expresión, se identifican usando procedimientos de citometría de flujo o transferencia Western con anticuerpos dirigidos frente a la o las proteínas virales de interés.

Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por ARN polimerasa I, casetes dirigidos por ARN polimerasa II o casetes dirigidos por ARN polimerasa del bacteriófago T7, este último preferiblemente con una ribozima 3' terminal para el procesamiento del transcrito primario para rendir el extremo correcto. En ciertas realizaciones, los plásmidos que codifican los segmentos genómicos de arenavirus pueden ser los mismos, es decir, la secuencia genómica y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, polI y polII de un plásmido.

Para recuperar el arenavirus, el vector de arenavirus trisegmentado, se prevén los siguientes procedimientos. Primer día: las células, típicamente 80 % confluentes en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los plásmidos, como se describió anteriormente. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación.

3-5 días después: el sobrenadante cultivado (preparación del vector de arenavirus) se recoge, se divide en partes alícuotas y se almacena a 4 ° C, -20 ° C o -80 ° C, dependiendo de cuánto tiempo se debe almacenar el vector de arenavirus antes de su uso. La titulación infecciosa de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunofoco. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden subcultivarse en un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) en el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del subcultivo.

La presente solicitud se refiere además a la expresión de un ORF heterólogo y/o un gen de interés, en donde un plásmido que codifica el segmento genómico se modifica para incorporar un ORF heterólogo y/o un gen de interés. El ORF heterólogo y/o el gen de interés pueden incorporarse en el plásmido usando enzimas de restricción.

(ii) Partículas de arenavirus trisegmentadas infecciosas, deficientes para la replicación

Las partículas de arenavirus trisegmentadas infecciosas, deficientes para la replicación pueden rescatarse como se describió anteriormente. Sin embargo, una vez generados a partir de ADNc, los arenavirus infecciosos, deficientes para la replicación descritos en la presente memoria pueden propagarse en células complementarias. Las células complementarias son células que proporcionan la funcionalidad que se ha eliminado del arenavirus deficiente para la replicación mediante la modificación de su genoma (p. ej., si el ORF que codifica la proteína GP se deleciona o se inactiva funcionalmente, una célula complementaria proporciona la proteína GP).

Debido a la eliminación o inactivación funcional de uno o más de los ORF en vectores de arenavirus (aquí se tomará como ejemplo la deleción de la glucoproteína, GP), los vectores de arenavirus pueden generarse y expandirse en células que proporcionan en trans el o los genes virales delecionados, p. ej., la GP en el presente ejemplo. Dicha línea celular complementaria, en lo sucesivo denominada células C, se genera transfectando una línea celular de mamífero tal como BHK-21, HEK 293, VERO u otra (aquí se tomará BHK-21 como ejemplo) con uno o más plásmidos para la expresión del o de los genes virales de interés (plásmido de complementación, denominado plásmido C). El o los plásmidos C expresan el o los genes virales delecionados en el vector de arenavirus que se generará bajo el control de uno o más casetes de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos, p. ej., un promotor de polimerasa II de mamífero tal como el promotor CMV o EF1 alfa con una señal de poliadenilación. Además, el plásmido de complementación presenta un marcador de selección de mamíferos, p. ej., resistencia a la puromicina, bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión génica en células de mamíferos, p. ej., el casete de expresión de polimerasa II como anteriormente, o el o los transcritos génicos virales están seguidos por un sitio interno de entrada al ribosoma, tal como el del virus de la encefalomiocarditis, seguido por el marcador de resistencia de mamífero. Para la producción en E. coli, el plásmido presenta adicionalmente un marcador de selección bacteriana, tal como un casete de resistencia a ampicilina.

Las células que se pueden usar, p. ej., BHK-21, HEK 293, MC57G u otras, se mantienen en cultivo y se transfectan con el o los plásmidos de complementación utilizando cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación. Unos pocos días después, se añade el agente de selección adecuado, p. ej., puromicina, en concentraciones tituladas. Los clones supervivientes se aíslan y subclonan siguiendo procedimientos estándar, y los clones de células C con alta expresión, se identifican usando procedimientos de citometría de flujo o transferencia Western con anticuerpos dirigidos frente a la o las proteínas virales de interés. Como una alternativa al uso de células C transfectadas de manera estable, la transfección transitoria de células normales puede complementar el o los genes virales ausentes en cada uno de los pasos en los que las células C se utilizarán a continuación. Además, se puede usar un virus auxiliar para proporcionar la funcionalidad ausente en trans.

Se pueden usar plásmidos de dos tipos: i) dos plásmidos, denominados plásmidos TF para expresar intracelularmente en células C los factores que actúan en trans mínimos del arenavirus, se derivan de, p. ej., NP y proteínas L de LCMV en el presente ejemplo; y ii) plásmidos, denominados plásmidos GS, para expresar intracelularmente en células C los segmentos genómicos del vector de arenavirus, p. ej., los segmentos con modificaciones diseñadas. Los plásmidos TF expresan las proteínas NP y L del vector de arenavirus respectivo bajo el control de un casete de expresión adecuado para la expresión de proteínas en células de mamíferos, típicamente, p. ej., un promotor de la polimerasa II de mamífero tal como el promotor CMV o EF1 alfa, cualquiera de ellos preferentemente en combinación con una señal de poliadenilación. Los plásmidos GS expresan los segmentos del genoma pequeño (S) y grande (L) del vector. Típicamente, se pueden usar casetes de expresión dirigidos por polimerasa I o casetes de expresión dirigidos por ARN polimerasa de bacteriófago T7 (T7-), este último preferentemente con una ribozima 3' terminal para procesar el transcrito primario para rendir el extremo correcto. En el caso de utilizar un sistema basado en T7, la expresión de T7 en las células C debe proporcionarse bien incluyendo en el proceso de recuperación un plásmido de expresión adicional, construido de forma análoga a los plásmidos TF, que proporciona T7, o las células C se construyen para expresar adicionalmente T7 de manera estable. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia del genoma y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, polI y polII de un plásmido.

Para la recuperación del vector de arenavirus, se pueden usar los siguientes procedimientos. Primer día: las células C, típicamente 80 % confluentes en placas de pocillos M6, se transfectan con una mezcla de los dos plásmidos TF más los dos plásmidos GS. En ciertas realizaciones, los plásmidos TF y GS pueden ser iguales, es decir, la secuencia del genoma y los factores que actúan en trans pueden ser transcritos por los promotores T7, polI y poliI de un plásmido. Para esto, se puede explotar cualquiera de las estrategias usadas comúnmente, tales como fosfato de calcio, protocolos basados en liposomas o electroporación.

3-5 días después: el sobrenadante del cultivo (preparación de vectores de arenavirus) se recoge, se divide en partes alícuotas y se almacena a 4 ° C, -20 ° C o -80 ° C, dependiendo de cuánto tiempo se debe almacenar el vector de arenavirus antes de su uso. Luego, la titulación infecciosa de la preparación del vector de arenavirus se evalúa mediante un ensayo de inmunofoco en células C. Alternativamente, las células transfectadas y el sobrenadante pueden subcultivarse en un recipiente más grande (p. ej., un matraz de cultivo de tejidos T75) en el día 3-5 después de la transfección, y el sobrenadante del cultivo se recoge hasta cinco días después del subcultivo.

La descripción se refiere además a la expresión de un antígeno en un cultivo celular en donde el cultivo celular se infecta con un arenavirus trisegmentado infeccioso, deficiente para la replicación, que expresa un antígeno. Cuando se usa para la expresión de un antígeno CMV en células cultivadas, se pueden usar los siguientes dos procedimientos:

ii) Alternativamente, se puede usar una MOI más baja y se pueden seleccionar clones de células individuales por su nivel de expresión de antígeno dirigida por virus. Posteriormente, los clones individuales pueden expandirse infinitamente debido a la naturaleza no citolítica de los vectores de arenavirus. Independientemente de la estrategia, el antígeno se puede recoger (y purificar) posteriormente del sobrenadante del cultivo o de las células mismas, dependiendo de las propiedades del antígeno producido. Sin embargo, la invención no se limita a estas dos estrategias, y pueden considerarse otras formas de dirigir la expresión del antígeno CMV usando arenavirus infecciosos, deficientes para la replicación, como vectores.

4.5 Ácidos nucleicos, sistemas de vectores y líneas celulares

En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan ADNc que comprenden o consisten en el segmento genómico de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la Sección 4.1 y la Sección 4.2, respectivamente.

4.5.1 Marco de lectura abierto en una posición no natural

En una realización, en la presente memoria se proporcionan ácidos nucleicos que codifican un segmento genómico de arenavirus como se describe en la Sección 4.1. En ejemplos más específicos, en la presente memoria se describe una secuencia de nucleótidos de ADN o un conjunto de secuencias de nucleótidos de ADN como se muestra en la Tabla 1. Las células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos también se proporcionan en la Sección 4.1.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un ADNc del segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF, en donde el segmento genómico de arenavirus codifica un ORF heterólogo como se describe en la Sección 4.1.

En una realización, en la presente memoria se proporciona un sistema de vector de expresión de ADN que codifica el segmento genómico de arenavirus preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. Específicamente, en la presente memoria se describe un sistema de vector de expresión de ADN en donde uno o más vectores codifican dos segmentos genómicos de arenavirus, a saber, un segmento L y un segmento S, de una partícula de arenavirus descrita en la presente memoria. Dicho sistema de vectores puede codificar (una o más moléculas de ADN separadas).

En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ADNc del segmento S de arenavirus que se ha preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje que forma parte de o está incorporado en un sistema de expresión de ADN. En otras realizaciones, un ADNc del segmento L de arenavirus que ha sido preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje forma parte de o está incorporado en un sistema de expresión de ADN. En ciertos ejemplos, es un ADNc del segmento genómico de arenavirus que ha sido preparado por ingeniería para portar (i) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) y el ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L se ha eliminado y reemplazado con un ORF heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus.

En ciertas realizaciones, el ADNc proporcionado en la presente memoria puede derivarse de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el ADNc deriva del LCMV Clon 13. En otras realizaciones específicas, el ADNc deriva de la cepa MP de LCMV.

En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria puede basarse en el Clon 13 de LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria es la cepa MP de LCMV. La secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV es la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1. La secuencia del segmento L del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 5. La secuencia del segmento S de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 53. La secuencia del segmento L de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 4.

En otra realización, en la presente memoria se proporciona una célula, en la que la célula comprende un ADNc o un sistema de vector descrito anteriormente en esta sección. Las líneas celulares derivadas de tales células, los cultivos que comprenden tales células, los métodos de cultivo de tales células infectadas también se proporcionan en la presente memoria. En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una célula, en la que la célula comprende un ADNc del segmento genómico de arenavirus que se ha preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En algunas realizaciones, la célula comprende el segmento S y/o el segmento L.

4.5.2 Partícula de arenavirus trisegmentada

En una realización, en la presente memoria se proporcionan ácidos nucleicos que codifican una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la Sección 4.2. En realizaciones más específicas, en la presente memoria se proporciona una secuencia de nucleótidos de ADN o un conjunto de secuencias de nucleótidos de ADN, por ejemplo, como se muestra en la Tabla 2 o la Tabla 3. Las células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos también se proporcionan en la Sección 4.2.

En realizaciones específicas, en la presente memoria se proporciona un ADNc que consiste en un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada que se ha preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF. En otras realizaciones, es un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada que se ha preparado por ingeniería para (i) portar un ORF de arenavirus en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) en donde la partícula de arenavirus trisegmentada codifica un ORF heterólogo como se describe en la Sección 4.2.

En una realización, en la presente memoria se proporciona un sistema de vector de expresión de ADN que codifica conjuntamente la partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria. Específicamente, en la presente memoria se proporciona un sistema de vector de expresión de ADN en donde uno o más vectores codifican tres segmentos genómicos de arenavirus, a saber, un segmento L y dos segmentos S o dos segmentos L y un segmento S de una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria. Dicho sistema de vector puede codificar (una o más moléculas de ADN separadas).

En otra realización, en la presente memoria se proporciona un ADNc de o de los segmentos S de arenavirus que se ha preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje, y forma parte de o está incorporado en un sistema de expresión de ADN. En otras realizaciones, un ADNc del o de los segmentos L de arenavirus que se preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje forma parte de o está incorporado en un sistema de expresión de ADN. En ciertos ejemplos, es un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada que ha sido preparado por ingeniería para portar (i) un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF; y (ii) un ORF que codifica GP, NP, la proteína Z o la proteína L se ha eliminado y reemplazado con un o Rf heterólogo de otro organismo que no sea un arenavirus.

En ciertas realizaciones, el ADNc proporcionado en la presente memoria puede derivarse de una cepa particular de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa MP, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En realizaciones específicas, el ADNc se deriva del Clon 13 de LCMV. En otras realizaciones específicas, el ADNc se deriva de la cepa MP de LCMV.

En ciertas realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria puede basarse en una cepa específica de LCMV. Las cepas de LCMV incluyen Clon 13, cepa m P, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN y sus derivados. En ciertas realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria puede basarse en el Clon 13 de LCMV. En otras realizaciones, el vector generado para codificar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria es la cepa MP de LCMV. La secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, la secuencia del segmento S del Clon 13 de LCMV es la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1. La secuencia del segmento L del Clon 13 de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 5. La secuencia del segmento S de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 53. La secuencia del segmento L de la cepa MP de LCMV se enumera como SEQ ID NO: 4.

En otra realización, en la presente memoria se proporciona una célula, en la que la célula comprende un ADNc o un sistema de vector descrito anteriormente en esta sección. Las líneas celulares derivadas de tales células, los cultivos que comprenden tales células, los métodos de cultivo de tales células infectadas también se proporcionan en la presente memoria. En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporciona una célula, en la que la célula comprende un ADNc de la partícula de arenavirus trisegmentada. En algunas realizaciones, la célula comprende el segmento S y/o el segmento L.

4.6 Métodos de uso

Las vacunas han tenido éxito para prevenir y/o tratar enfermedades infecciosas, tales como las del virus de la polio y el sarampión. Sin embargo, la inmunización terapéutica en el contexto de una enfermedad crónica establecida, que incluye tanto infecciones crónicas como cáncer, ha tenido menos éxito. La capacidad de generar una partícula de arenavirus y/o una partícula de arenavirus trisegmentada representa una nueva estrategia de vacuna novedosa.

En una realización, los métodos para tratar una infección y/o cáncer en un sujeto comprenden administrar al sujeto uno o más tipos de partículas de arenavirus o partículas de arenavirus trisegmentadas, como se describe en la presente memoria o una composición de las mismas. En una realización específica, un método para tratar una infección y/o cáncer descrito en la presente memoria comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de una o más partículas de arenavirus o partículas de arenavirus trisegmentadas, descritas en la presente memoria o una composición de las mismas. El sujeto puede ser un mamífero, tal como, pero no limitado a, un ser humano, un ratón, una rata, un conejillo de indias, un animal domesticado, tal como, pero no limitado a, una vaca, un caballo, una oveja, un cerdo, una cabra, un gato, un perro, un hámster, un burro. En una realización específica, el sujeto es un ser humano. El sujeto humano podría ser hombre, mujer, adultos, niños, personas mayores (65 años o más) y personas con múltiples enfermedades (es decir, un sujeto polimórbido). En ciertas realizaciones, los sujetos son aquellos cuya enfermedad ha progresado después del tratamiento con quimioterapia, radioterapia, cirugía y/o agentes biológicos.

En otra realización, los métodos para inducir una respuesta inmune frente a un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alérgeno en un sujeto comprenden administrar al sujeto una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno o una composición del mismo.

En otra realización, los sujetos a quienes se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma, son susceptibles o están en riesgo de sufrir un infección, desarrollo de cáncer o alergia, o exhiben una lesión de tejido precancerosa. En otra realización específica, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma están infectados con, son susceptibles de, están en riesgo de, o han sido diagnosticados con, una infección, cáncer, lesión de tejido precancerosa o alergia.

En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma, padecen, son susceptibles de o están en riesgo de, una infección, un cáncer, una lesión precancerosa o una alergia en el sistema pulmonar, el sistema nervioso central, el sistema linfático, el sistema gastrointestinal o el sistema circulatorio, entre otros. En una realización específica, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma padecen, son susceptibles a o están en riesgo de, una infección, un cáncer o una alergia en uno o más órganos del cuerpo, incluidos, pero no limitado a, el cerebro, el hígado, los pulmones, los ojos, los oídos, los intestinos, el esófago, el útero, la nasofaringe o las glándulas salivares.

En otra realización, los sujetos a los que se administra una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma a un sujeto que padece síntomas que incluyen, pero no se limitan a, fiebre, sudores nocturnos, cansancio, malestar, inquietud, dolor de garganta, glándulas inflamadas, dolor en las articulaciones, dolor muscular, pérdida de apetito, pérdida de peso, diarrea, úlceras gastrointestinales, sangrado gastrointestinal, dificultad para respirar, neumonía, úlceras bucales, problemas de visión, hepatitis, ictericia, encefalitis, convulsiones, coma, prurito, eritema, hiperpigmentación, cambios en los ganglios linfáticos o pérdida auditiva.

En otra realización, un arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto de cualquier grupo de edad que padece, es susceptible a, o está en riesgo de, contraer una infección, un cáncer o una alergia. En una realización específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto con un sistema inmune comprometido, una embarazada, un sujeto sometido a un trasplante de órgano o médula ósea, un sujeto que toma medicamentos inmunosupresores, un sujeto sometido a hemodiálisis, un sujeto que tiene cáncer o un sujeto que padece, es susceptible a o está en riesgo de contraer una infección, un cáncer o una alergia. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que es un niño de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 años de edad que padece, es susceptible a o está en riesgo de contraer, una infección, un cáncer o una alergia. En otra realización específica más, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que padece, es susceptible a o está en riesgo de contraer una infección, cáncer o una alergia. En otra realización específica más, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que es un bebé de 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses de edad que padece, es susceptible a o está en riesgo de, contraer una infección, cáncer o alergia. En otra realización específica más, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto anciano que padece, es susceptible a, o está en riesgo de, contraer una infección, cáncer o una alergia. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que es un sujeto mayor de 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 o 90 años de edad.

En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a sujetos con un mayor riesgo de infección diseminada, un cáncer o una alergia. En una realización específica, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a sujetos en el período neonatal con un sistema inmune neonatal y, por lo tanto, inmaduro.

En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que tiene una infección latente, cáncer o alergia. En una realización específica, una partícula de arenavirus o un arenavirus trisegmentado que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que tiene una infección latente, un cáncer latente o una alergia latente que puede reactivarse al comprometer el sistema inmunitario. Por lo tanto, en la presente memoria se proporciona un método para prevenir la reactivación de una infección, un cáncer o una alergia.

En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto que tiene una infección recurrente, un cáncer o un alergia.

En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto con una predisposición genética para una infección, un cáncer o alergia. En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma se administra a un sujeto. En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno se administra a un sujeto con factores de riesgo. Los factores de riesgo ejemplares incluyen envejecimiento, tabaco, exposición al sol, exposición a la radiación, exposición química, antecedentes familiares, alcohol, mala alimentación, falta de actividad física o sobrepeso.

En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno reduce una infección sintomática, cáncer o alergia. En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno reduce una infección asintomática, cáncer o alergia.

En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a sujetos o animales infectados con una o más cepas de virus de la gripe, virus de la enfermedad de la bolsa infecciosa, rotavirus, virus de la bronquitis infecciosa, virus de la laringotraqueitis infecciosa, virus de la anemia del pollo, virus de la enfermedad de Marek, virus de la leucosis aviar, adenovirus aviar o neumovirus aviar, virus causante del SARS, virus sincitial respiratorio humano, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, poliovirus, virus de la rabia, virus Hendra, virus Nipah, virus de la parainfluenza humana 3,

virus del sarampión, virus de las paperas, virus del Ébola, virus de Marburg, virus de la enfermedad del Nilo Occidental,

virus de la encefalitis japonesa, virus del dengue, hantavirus, virus de la fiebre del Valle del Rift, virus de la fiebre de

Lassa, virus del herpes simple y virus de la fiebre amarilla.

En otra realización, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno

derivado de un cáncer descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a sujetos que

padecen uno o más tipos de cánceres. En otras realizaciones, cualquier tipo de cáncer susceptible de tratamiento con

las vacunas descritas en la presente memoria podría ser un objetivo. En una realización más específica, una partícula

de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un cáncer descrito

en la presente memoria o una composición de la misma se administra a sujetos que padecen, por ejemplo, melanoma,

carcinoma de próstata, carcinoma de mama, carcinoma de pulmón, neuroblastoma, carcinoma hepatocelular,

carcinoma de cuello uterino y carcinoma de estómago, linfoma de Burkitt; linfoma no de Hodgkin; linfoma de Hodgkin;

carcinoma nasofaríngeo (cáncer de la parte superior de la garganta detrás de la nariz), leucemia, linfoma de tejido

linfoide asociado a la mucosa.

derivado de un alergeno descrito en la presente memoria o una composición de la misma se administra a sujetos que

padecen una o más alergias. En una realización más específica, una partícula de arenavirus o una partícula de

arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un alergeno descrito en la presente memoria o una

composición de la misma se administra a sujetos que padecen, por ejemplo, una alergia estacional, una alergia

perenne, rinoconjuntivitis, asma, eczema, una alergia alimentaria.

En otra realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que

expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno como se describe en la presente

memoria o una composición de la misma a sujetos que confiere inmunidad mediada por células (CMI) frente a una

infección, un cáncer o un alergeno. Sin estar limitado por la teoría, en otra realización, una partícula de arenavirus o

una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer,

un alergeno como se describe en la presente memoria o una composición de la misma infecta y expresa antígenos de

interés en las células presentadoras de antígenos (APC) del huésped (p. ej., macrófagos, células dendríticas o células

B) para la presentación directa de antígenos en el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y II. En otra

realización, la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa

un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alergeno como se describe en la presente memoria

o una composición de la misma a sujetos induce respuestas de células T CD4+ y CD8+ citolíticas plurifuncionales, así

como específicas de CMV que coproducen IFN-y y TNF-a de gran magnitud para tratar o prevenir una infección, un

cáncer o una alergia.

expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno o una composición de la misma

reduce el riesgo de que un individuo desarrolle una infección, un cáncer o una alergia. en al menos aproximadamente

un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un

30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un

50 %, al menos aproximadamente un 60 %, a al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un

80 %, al menos aproximadamente un 90 % o más, en comparación con el riesgo de desarrollar una infección, un

cáncer o una alergia en ausencia de dicho tratamiento.

reduce los síntomas de una infección, un cáncer o una alergia al menos aproximadamente un 10 %, al menos

aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 90 % o más, en comparación con la manifestación de los síntomas de una infección, un cáncer,

una alergia en ausencia de dicho tratamiento.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno

derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno se administra preferiblemente en inyecciones múltiples

(p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 45 o 50 inyecciones) o por infusión continua (p.

ej., usando una bomba) en múltiples sitios (p. ej., al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 o 14 sitios). En ciertas

realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado

de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno se administra en dos o más inyecciones separadas durante un

período de 6 meses, un período de 12 meses, un período de 24 meses, o un período de 48 meses. En ciertas

de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno se administra con una primera dosis en una fecha elegida, una

segunda dosis al menos 2 meses después de la primera dosis, y una tercera dosis 6 meses después de la primera

dosis.

En un ejemplo, las inyecciones cutáneas se realizan en múltiples sitios del cuerpo para reducir el alcance de las reacciones cutáneas locales. En un día de vacunación dado, el paciente recibe la dosis total asignada de células administrada de una jeringa en 3 a 5 inyecciones intradérmicas separadas de la dosis (p. ej., al menos 0,4 ml, 0,2 ml o 0,1 ml) cada una en una extremidad espaciada al menos aproximadamente 5 cm (p. ej., al menos 4,5, 5, 6, 7, 8, 9 o cm) en la entrada de la aguja desde la inyección vecina más cercana. En los días de vacunación posteriores, los sitios de inyección se rotan a diferentes extremidades en sentido horario o antihorario.

En otra realización, la administración de un arenavirus infeccioso, deficiente para la replicación, que expresa un antígeno CMV o una composición del mismo en sujetos con un sistema neonatal y por lo tanto inmaduro induce una respuesta inmune mediada por células (CMI) frente a una infección, un cáncer o una alergia, superior en al menos aproximadamente un 10 %, al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 % o más, de la respuesta de CMI frente a una infección, un cáncer o una alergia en ausencia de dicho tratamiento.

En ciertas realizaciones, la administración a un sujeto de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, como se describe en la presente memoria, induce una titulación de anticuerpo detectable durante un mínimo de al menos cuatro semanas. En otra realización, la administración a un sujeto de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno, como se describe en la presente memoria, aumenta la titulación de anticuerpos en al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 % o al menos un 1.000%.

En ciertas realizaciones, la exposición primaria al antígeno incita una titulación de anticuerpos funcional (neutralizante) y mínima de al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 %, o al menos un 1.000 % del suero de control medio de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la media geométrica de la titulación de anticuerpos primarios neutralizantes aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1.000 dentro de al menos 4 semanas después de inmunización. En otra realización, la inmunización con una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, produce titulaciones elevadas de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización después de una sola administración de la vacuna, o después de dos o más inmunizaciones secuenciales.

En otra realización más, la exposición secundaria al antígeno aumenta la titulación de anticuerpos en al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 % o al menos un 1.000 %. En otra realización, la exposición secundaria al antígeno incita una titulación de anticuerpos funcionales (neutralizantes) y mínima de al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 %, o al menos un 1.000 % del suero de control medio de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la media geométrica de la titulación de anticuerpos secundarios neutralizantes aumenta hasta un valor máximo de al menos 1:50, al menos 1:100, al menos 1:200 o al menos 1:1.000 dentro de al menos 4 semanas después de inmunización. En otra realización, una segunda inmunización con una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, produce altos titulaciones altas de anticuerpos que duran al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años o al menos 5 años después de la inmunización.

En otra realización más, una tercera inmunización de refuerzo aumenta la titulación de anticuerpos en al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 % o al menos un 1.000 %. En otra realización, la inmunización de refuerzo incita una titulación de anticuerpos funcionales (neutralizantes) y mínima de al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 %, o al menos un 1.000 % del suero control medio de sujetos humanos inmunes a la infección. En realizaciones más específicas, la tercera inmunización de refuerzo incita una titulación de anticuerpos funcionales (neutralizantes) y mínima de al menos un 50 %, al menos un 100 %, al menos un 200 %, al menos un 300 %, al menos un 400 %, al menos un 500 %, o al menos un 1.000 % del suero control medio de sujetos humanos inmunes a la infección. En otra realización, una tercera inmunización de refuerzo prolonga la titulación de anticuerpos en al menos 4 semanas, al menos 8 semanas, al menos 12 semanas, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 2 años, al menos 3 años, al menos 4 años, o al menos 5 años después de la inmunización

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, incita una respuesta independiente de células T o dependiente de células T. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, incita una respuesta de células T. En otras realizaciones, una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, incita una respuesta T auxiliar. En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, incita una respuesta orientada a Th1 o una respuesta orientada a Th2.

En realizaciones más específicas, la respuesta orientada a Th1 está indicada por un predominio de anticuerpos IgG1 frente a IgG2. En otras realizaciones, la proporción de IgG1 :IgG2 es mayor de 1:1, mayor de 2:1, mayor de 3:1 o mayor de 4:1. En otra realización, la partícula de arenavirus infecciosa o una arena de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, se indica mediante un predominio de anticuerpos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD o IgE.

En algunas realizaciones, el arenavirus infeccioso, deficiente para la replicación, que expresa un antígeno CMV o un fragmento del mismo incita una respuesta de células T CD8+. En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia incita respuestas tanto de células T CD4+ como CD8+, en combinación o no con anticuerpos.

En ciertas realizaciones, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, incita titulaciones altas de anticuerpos neutralizantes. En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia, como se describe en la presente memoria, incita titulaciones más altas de anticuerpos neutralizantes que la expresión de los componentes del complejo proteico individualmente.

En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa uno, dos, tres, cuatro, cinco o más antígenos derivados de un organismo infeccioso, un cáncer o una alergia incita titulaciones más altas de anticuerpos neutralizantes que una partícula de arenavirus. o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno.

En ciertas realizaciones, los métodos comprenden además la coadministración de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada y al menos una terapia adicional. En ciertas realizaciones, la coadministración es simultánea. En otra realización, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada se administra antes de la administración de la terapia adicional. En otras realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada se administra después de la administración de la terapia adicional. En ciertas realizaciones, la administración de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada y la terapia adicional es aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 8 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 11 horas o aproximadamente 12 horas. En ciertas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y dicha terapia adicional es aproximadamente 1 día, 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 7 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 9 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 11 semanas, aproximadamente 12 semanas. En ciertas realizaciones, el intervalo entre la administración de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y la terapia adicional es de aproximadamente 1 mes, aproximadamente 2 meses, aproximadamente 3 meses, aproximadamente 4 meses, aproximadamente 5 meses o aproximadamente 6 meses.

En ciertas realizaciones, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno o una composición de la misma reduce el número de anticuerpos detectados en una muestra de sangre o muestra de suero del paciente. En ciertas realizaciones, la administración de una partícula de arenavirus que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alergeno o composición de la misma reduce la cantidad de organismo infeccioso, cáncer o alergia detectada en orina, saliva, sangre, lágrimas, semen, muestra celular exfoliada o leche materna.

En otra realización, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo de infección, un cáncer o un alérgeno como se describe en la presente memoria o una composición puede comprender además una proteína informadora. En una realización más específica, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo de infección, un cáncer o un alergeno y una proteína informadora como se describe en la presente memoria o una composición se administra a sujetos para tratar y/o prevenir una infección, un cáncer o una alergia. En otra realización específica más, la proteína informadora puede usarse para monitorizar la expresión génica, la localización de proteínas y la administración de vacunas, in vivo, in situ y en tiempo real.

En otra realización, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo de infección, un cáncer o un alérgeno como se describe en la presente memoria o una composición puede comprender además una proteína fluorescente. En una realización más específica, la partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo de infección, un cáncer, o un alergeno y una proteína informadora como se describe en la presente memoria o una composición se administra a sujetos para tratar y/o prevenir una infección, un cáncer o una alergia. En otra realización específica más, la proteína fluorescente puede ser la proteína informadora que se puede usar para monitorizar la expresión génica, la localización de proteínas y la administración de vacunas, in vivo, in situ y en tiempo real.

Los cambios en la función de la respuesta de CMI frente a una infección, un cáncer o una alergia inducida por la administración de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alergeno o una composición de la misma en sujetos pueden medirse mediante cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica, que incluye, pero no se limita a citometría de flujo (véase, p. ej., Perfetto S.P. etal., 2004, Nat Rev Immun., 4 (8): 648-55), ensayos de proliferación de linfocitos (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., 2008, Ann Allergy Asthma Immunol, 101: 101-4; y Hicks M.J. et al., 1983, Am J Clin Pathol., 80: 159-63), ensayos para medir la activación de linfocitos, incluida la determinación de cambios en la expresión de marcadores de superficie después de la activación de la medición de citoquinas de linfocitos T (véase, p. ej., Caruso A. et al., Cytometry. 1997; 27: 71-6), ensayos ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., 1983, J Immunol Methods, 65: 109-121; y Hutchings P.R. et al., 1989, J Immunol Methods, 120: 1-8) o ensayos de citotoxicidad de células asesinas naturales (véase, p. ej., Bonilla F.A. et al., 2006, Ann Allergy Asthma Immunol., 94 (5 Supl 1): S1-63).

El tratamiento exitoso de un paciente con cáncer se puede evaluar como la prolongación de la supervivencia esperada, la inducción de una respuesta inmune antitumoral o la mejora de una característica particular de un cáncer. Los ejemplos de características de un cáncer que podrían mejorarse incluyen el tamaño del tumor (p. ej., T0, T es o T1-4), estado de metástasis (p. ej., M0, M1), número de tumores observables, afectación ganglionar (p. ej., N0, N1-4, Nx), grado (es decir, grados 1, 2, 3 o 4), estadio (p. ej., 0, I, II, III o IV), presencia o concentración de ciertos marcadores en las células o en los fluidos corporales (p. ej., AFP, B2M, beta-HCG, BTA, CA 15-3, CA 27.29, CA 125, CA 72.4, CA 19-9, calcitonina, CEA, cromgrainina A, EGFR, receptores hormonales, HER2, HCG, inmunoglobulinas, NSE, NMP22, PSA, PAP, PSMA, S-100, TA-90 y tiroglobulina), y/o patologías asociadas (p. ej., ascitis o edema) o síntomas (p. ej., caquexia, fiebre, anorexia o dolor). La mejora, si se puede medir por porcentaje, puede ser de al menos un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 % (p. ej., supervivencia, o volumen o dimensiones lineales de un tumor).

En otra realización, en la presente memoria se describe un método de uso con una partícula de arenavirus (p. ej., LCMV) que expresa un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer o un alérgeno como se describe en la presente memoria en donde el al menos uno de los ORF que codifica GP, NP, la proteína Z y la proteína L se sustituye con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de nucleótidos infecciosa que codifica un antígeno derivado de un organismo infeccioso, un cáncer, un alergeno o un fragmento antigénico del mismo.

4.7 Composiciones, administración y dosificación

La presente solicitud se refiere además a vacunas, composiciones inmunogénicas (p. ej., formulaciones de vacunas) y composiciones farmacéuticas que comprenden una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada como se describe en la presente memoria. Dichas vacunas, composiciones inmunogénicas y composiciones farmacéuticas pueden formularse de acuerdo con procedimientos estándar en la técnica.

Será evidente para un experto en las técnicas relevantes que las modificaciones y adaptaciones adecuadas a los métodos y aplicaciones descritos en la presente memoria pueden ser obvias y pueden realizarse sin apartarse del alcance del alcance o de cualquier realización del mismo.

En otra realización, en la presente memoria se proporcionan composiciones que comprenden una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria. Dichas composiciones pueden usarse en métodos de tratamiento y prevención de enfermedades. En una realización específica, las composiciones descritas en la presente memoria se usan en el tratamiento de sujetos infectados con, o susceptibles a, una infección. En otras realizaciones, las composiciones descritas en la presente memoria se usan en el tratamiento de sujetos susceptibles a, o que presentan síntomas característicos de, cáncer o tumorigénesis o se les ha diagnosticado cáncer. En otra realización específica, las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente memoria pueden usarse para inducir una respuesta inmune en un huésped al que se administra la composición. Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente memoria pueden usarse como vacunas y, en consecuencia, pueden formularse como composiciones farmacéuticas. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas descritas en la presente memoria se usan en la prevención de infección o cáncer de sujetos (p. ej., sujetos humanos). En otras realizaciones, la vacuna, la composición inmunogénica o la composición farmacéutica son adecuadas para la administración veterinaria y/o humana.

En ciertas realizaciones, en la presente memoria se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden un vector de arenavirus como se describe en la presente memoria. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, dicha composición inmunogénica comprende además un adyuvante. El adyuvante para administración en combinación con una composición descrita en la presente memoria puede administrarse antes de, concomitantemente con o después de, la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en la presente memoria aumenta, potencia y/o refuerza la respuesta inmune frente a una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada y, lo más importante, los productos genéticos que vectoriza, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmune frente a la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada y los productos génicos vectorizados por este último. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmune frente a la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada y frente a los productos génicos vectorizados por esta última y no produce una alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden potenciar una respuesta inmune mediante varios mecanismos que incluyen, p. ej., reclutamiento de linfocitos, estimulación de células B y/o T, y estimulación de macrófagos o células dendríticas. Cuando una vacuna o composición inmunogénica de la invención comprende adyuvantes o se administra junto con uno o más adyuvantes, los adyuvantes que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de sal mineral o adyuvantes de gel de sal mineral, adyuvantes particulados, adyuvantes microparticulados, adyuvantes mucosales y adyuvantes inmunoestimuladores. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A (MPL) 3 De-O-acilado (véase GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional No. PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional No. WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud internacional no. PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional No. WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase Kensil et al., 1995, en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, NY); Pat. de EE. UU. No. 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es el adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (tales como el escualeno o el aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunes, tales como el monofosforil lípido A (véase, Stoute et al., 1997, N. Engl. J. Med. 336, 86-91).

Las composiciones comprenden la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria sola o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se pueden usar suspensiones o dispersiones de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada, especialmente suspensiones o dispersiones acuosas isotónicas. Las composiciones farmacéuticas pueden esterilizarse y/o pueden comprender excipientes, p. ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes y/o emulsionantes, solubilizantes, sales para regular la presión osmótica y/o tampones y se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, por medios de dispersión convencional y procesos de suspensión. En ciertas realizaciones, tales dispersiones o suspensiones pueden comprender agentes reguladores de la viscosidad. Las suspensiones o dispersiones se mantienen a temperaturas de alrededor de 2° C a 8° C, o preferiblemente para un almacenamiento más prolongado pueden congelarse y luego descongelarse poco antes de su uso, o alternativamente pueden liofilizarse para su almacenamiento. Para inyección, la vacuna o las preparaciones inmunogénicas pueden formularse en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hanks, la solución de Ringer o el tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

En ciertas realizaciones, las composiciones descritas en la presente memoria comprenden adicionalmente un conservante, p. ej., el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria comprenden timerosal del 0,001 % al 0,01 %. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria no comprenden un conservante.

Las composiciones farmacéuticas comprenden de aproximadamente 103 a aproximadamente 1011 unidades formadoras de focos de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada.

En una realización, la administración de la composición farmacéutica es administración parenteral. La administración parenteral puede ser administración intravenosa o subcutánea. En consecuencia, las formas de dosis unitarias para administración parenteral son, por ejemplo, ampollas o viales, p. ej., viales que contienen aproximadamente 103 a 1010 unidades formadoras de focos o 105 a 1015 partículas físicas de la partícula arenavirus o partícula arenavirus trisegmentada.

En otra realización, una vacuna o composición inmunogénica proporcionada en la presente memoria se administra a un sujeto por las rutas, incluyendo, pero no limitado a, oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, tópica, subcutánea, percutánea, intranasal e inhalación, y mediante escarificación (rascado a través de las capas superiores de la piel, p. ej., utilizando una aguja bifurcada). Específicamente, se pueden usar las rutas subcutánea o intravenosa.

Para la administración por vía intranasal o por inhalación, la preparación para su uso de acuerdo con la presente invención puede administrarse convenientemente en la forma de una presentación de pulverización de aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para usar en un inhalador o insufladores que contienen una mezcla en polvo del compuesto y como una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La dosificación del ingrediente activo depende del tipo de vacunación y del sujeto, y su edad, peso, condición individual, los datos farmacocinéticos individuales y el modo de administración. En ciertas realizaciones, se emplea un ensayo in vitro para ayudar a identificar rangos de dosificación óptimos. Las dosis efectivas pueden extrapolarse a partir de las curvas de respuesta a la dosis, derivadas de sistemas de ensayo de modelos en animales in vitro.

En ciertas realizaciones, la vacuna, composición inmunogénica o composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada se puede usar como una vacuna viva. Las dosis ejemplares para una partícula de arenavirus viva pueden variar de 10 a 100, o más, PFU de virus vivo por dosis. En algunas realizaciones, las dosis adecuadas de una partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada son 102, 5x102, 103, 5x103, 104, 5x104, 105, 5x105, 106, 5x106, 107, 5x107, 108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 5x1010, 1x10” , 5x10” o 1012 pfu, y pueden administrarse a un sujeto una, dos, tres o más veces con intervalos tan a menudo como sea necesario. En otra realización, un arenavirus vivo se formula de tal manera que una dosis de 0,2 mL contiene 106’5-107’5 unidades focales fluorescentes de partícula de arenavirus vivo. En otra realización, una vacuna inactivada se formula de manera que contenga aproximadamente 15 pg a aproximadamente 100 pg, aproximadamente 15 pg a aproximadamente 75 pg, aproximadamente 15 pg a aproximadamente 50 pg, o aproximadamente 15 pg a aproximadamente 30 pg de un arenavirus.

En ciertas realizaciones, para la administración a niños, se administran a un niño dos dosis de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria o una composición de las mismas, administradas al menos con un mes de diferencia. En realizaciones específicas para la administración a adultos, se proporciona una dosis única de la partícula de arenavirus o partícula de arenavirus trisegmentada descritas en la presente memoria o una composición de las mismas. En otra realización, se administran a un adulto dos dosis de una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria o una composición de las mismas, administrada al menos con un mes de diferencia. En otra realización, a un niño pequeño (de seis meses a nueve años) se le puede administrar una partícula de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada descrita en la presente memoria o una composición de la misma por primera vez en dos dosis administradas con un mes de diferencia. En una realización particular, un niño que recibió solo una dosis en su primer año de vacunación debería recibir dos dosis en el año siguiente. En algunas realizaciones, se prefieren dos dosis administradas con 4 semanas de diferencia para niños de 2-8 años a los que se les administra por primera vez una composición inmunogénica descrita en la presente memoria. En ciertas realizaciones, para niños de 6-35 meses de edad, se puede preferir una media dosis (0,25 ml), en contraste con 0,5 ml que se puede preferir para sujetos mayores de tres años de edad.

En ciertas realizaciones, las composiciones pueden administrarse al paciente en una dosificación única que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de la partícula de arenavirus o de la partícula de arenavirus trisegmentada. En algunas realizaciones, la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada se puede administrar al paciente en una dosis única que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una partícula de arenavirus o de una partícula de arenavirus trisegmentada y, una o más composiciones farmacéuticas, cada una en una cantidad terapéutica efectiva

En ciertas realizaciones, la composición se administra al paciente como una dosis única seguida de una segunda dosis tres a seis semanas después. De acuerdo con estas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden administrarse a los sujetos a intervalos de seis a doce meses después de la segunda inoculación. En ciertas realizaciones, las inoculaciones de refuerzo pueden utilizar un arenavirus diferente o una composición del mismo. En algunas realizaciones, la administración de la misma composición que se describe en la presente memoria puede repetirse y separarse al menos 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.

También se proporcionan en la presente memoria procesos y el uso de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada para la fabricación de vacunas en la forma de preparaciones farmacéuticas, que comprenden la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada como ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de la presente solicitud se preparan de una manera conocida per se, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado y/o dispersión.

4.8 Ensayos

4.8.1 Ensayos de detección de arenavirus

El experto en la técnica podría detectar un segmento genómico de arenavirus o una partícula de arenavirus trisegmentada, como se describe en la presente memoria usando técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede usar RT-PCR con cebadores que son específicos de un arenavirus para detectar y cuantificar un segmento genómico de arenavirus que ha sido preparado por ingeniería para portar un ORF en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF o una partícula de arenavirus trisegmentada. Se pueden usar la transferencia Western, ELISA, radioinmunoensayo, inmunoprecipitación, inmunocitoquímica o inmunocitoquímica junto con FACS para cuantificar los productos génicos del segmento genómico de arenavirus o partículas de arenavirus trisegmentadas.

4.8.2 Ensayo para medir la infectividad

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede usarse para medir la infectividad de una preparación de vector de arenavirus. Por ejemplo, la determinación de la titulación de virus/vector puede realizarse mediante un "ensayo de unidad formadora focos" (ensayo FFU). Brevemente, se siembran en placas células complementarias, p. ej., las células MC57 y se inoculan con diferentes diluciones de una muestra de virus/vector. Después de un período de incubación, para permitir que las células formen una monocapa y que el virus se una a las células, la monocapa se cubre con metilcelulosa. Cuando las placas se incuban más, las células infectadas originales liberan la progenie viral. Debido a la superposición de metilcelulosa, la propagación de los nuevos virus está restringida a las células vecinas. En consecuencia, cada partícula infecciosa produce una zona circular de células infectadas llamada Foco. Dichos focos pueden hacerse visibles y, por lo tanto, contables, utilizando anticuerpos frente a NP de LCMV u otra proteína expresada por la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada y una reacción de color basada en HRP. La titulación de un virus/vector se puede calcular en unidades formadoras de focos por mililitro (FFU/mL).

4.8.3 Crecimiento de una partícula de arenavirus

El crecimiento de una partícula de arenavirus descrita en la presente memoria puede evaluarse mediante cualquier método conocido en la técnica o descrito en la presente memoria (p. ej., cultivo celular). El crecimiento viral se puede determinar inoculando diluciones en serie de una partícula de arenavirus descrita en la presente memoria en cultivos celulares (p. ej., células Vero o células BHK-21). Después de la incubación del virus durante un tiempo específico, el virus se aísla utilizando métodos estándar.

4.8.4 ELISA de suero

La determinación de la respuesta inmune humoral tras la vacunación de animales (p. ej., ratones, cobayas) puede realizarse mediante ELISA de suero específico de antígeno (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas). Brevemente, las placas se recubren con antígeno (p. ej., proteína recombinante), se bloquean para evitar la unión inespecífica de anticuerpos y se incuban con diluciones en serie de sueros. Después de la incubación, se pueden detectar los anticuerpos séricos unidos, p. ej., utilizando un anticuerpo específico antiespecie (p. ej., ratón, cobaya) acoplado a enzimas (que detecta las IgG totales o las subclases de IgG) y la posterior reacción de color. Las titulaciones de anticuerpos se pueden determinar, p. ej., como media geométrica de la titulación de punto final.

4.8.5 Ensayo para medir la actividad neutralizante de los anticuerpos inducidos

La determinación de los anticuerpos neutralizantes en suero se realiza con el siguiente ensayo celular usando células ARPE-19 de ATCC y un virus etiquetado con GFP. Además, se usa suero de cobaya suplementario como fuente de complemento exógeno. El ensayo se inicia con una siembra de 6.5x103 células/pocillo (50 pl/pocillo) en una placa de 384 pocillos uno o dos días antes de su uso para la neutralización. La neutralización se realiza en placas de cultivo de tejidos estériles de 96 pocillos sin células durante 1 h a 37° C. Después de la etapa de incubación de neutralización, la mezcla se añade a las células y se incuba durante 4 días adicionales para la detección de GFP con un lector de placas. Se utiliza un suero humano neutralizante positivo como control positivo del ensayo en cada placa para verificar la fiabilidad de todos los resultados. Las titulaciones (CE50) se determinan utilizando un ajuste de curva logístico de 4 parámetros. Como ensayo adicional, los pocillos se controlan con un microscopio de fluorescencia.

4.8.6 Ensayo de reducción de placa

Brevemente, los ensayos de reducción de placa (neutralización) para LCMV se pueden realizar mediante el uso de un LCMV competente o deficiente para la replicación que está etiquetado con proteína fluorescente verde, se puede usar suero de conejo al 5 % como una fuente de complemento exógeno, y las placas pueden enumerarse por microscopía de fluorescencia. Las titulaciones de neutralización pueden definirse como la dilución más alta de suero que da lugar a una reducción del 50 %, 75 %, 90 % o 95 % en las placas, en comparación con las muestras de suero control (preinmunes).

Los genomas de ARN de LCMV de qPCR se aíslan utilizando el mini kit de ARN viral QlAamp (QIAGEN), de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los equivalentes de genoma de ARN del LCMV se detectan mediante PCR cuantitativa realizada en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) con el kit qRT-PCR SuperScript® III Platinum® One-Step (Invitrogen) y cebadores y sondas (informador FAM y apantallador NFQ-MGB) específicos para parte de la región de codificación de NP de LCMV u otra cadena genómica de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada. El perfil de temperatura de la reacción puede ser: 30 minutos a 60° C, 2 minutos a 95° C, seguido de 45 ciclos de 15 segundos a 95° C, 30 segundos a 56° C. El ARN puede cuantificarse mediante la comparación de los resultados de la muestra con una curva estándar preparada a partir del log 10 de una serie de diluciones de un fragmento de ARN transcrito in vitro cuantificado espectrofotométricamente, correspondiente a un fragmento de la secuencia de codificación de NP de LCMV u otra cadena genómica de la partícula de arenavirus o la partícula de arenavirus trisegmentada que los sitios de unión del contiene el cebador y de la sonda.

4.8.7 Transferencia Western

Las células infectadas que crecen en matraces de cultivo de tejidos o en suspensión se lisan en los puntos de tiempo indicados después de la infección usando tampón RIPA (Thermo Scientific) o se usan directamente sin lisis celular. Las muestras se calientan a 99° C durante 10 minutos con agente reductor y tampón de muestra NuPage LDS (NOVEX) y se enfrían hasta temperatura ambiente antes de cargarlas en geles SDS al 4-12 % para electroforesis. Las proteínas se transfieren a membranas usando el dispositivo de transferencia de gel Invitrogens iBIot y se visualizan mediante tinción con Ponceau. Finalmente, las preparaciones se sondean con anticuerpos primarios dirigidos frente a proteínas de interés y anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina, seguidos de tinción con solución NBT/BCIP de 1 paso (INVITROGEN).

4.8.8 Ensayo de tinción de multímero de péptido MHC para la detección de la proliferación de células T CD8+ específicas de antígeno

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede usarse para ensayar las respuestas de células T CD8+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de tinción de tetrámero de péptido MHC (véase, p. ej., Altman J.D. et al., Science. 1996; 274: 94-96; y Murali-Krishna K. et al., Immunity. 1998; 8: 177-187). Brevemente, el ensayo comprende los siguientes pasos, se usa un ensayo de tetrámero para detectar la presencia de células T específicas de antígeno. Para que una célula T detecte el péptido frente al que es específica, debe reconocer tanto el péptido como el tetrámero de las moléculas de MHC hechas a medida para una especificidad de antígeno definida y el haplotipo MHC de las células T (típicamente marcadas con fluorescencia). El tetrámero se detecta entonces por citometría de flujo a través del marcaje fluorescente.

4.8.9 Ensayo ELISPOT para la detección de la proliferación de células T CD4+ específicas de antígeno.

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede usarse para ensayar las respuestas de células T CD4+ específicas de antígeno. Por ejemplo, se puede usar el ensayo ELISPOT (véase, p. ej., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65: 109-121; y Hutchings P.R. et al., J Immunol Methods. 1989; 120: 1-8). Brevemente, el ensayo comprende los siguientes pasos: se recubre una placa de inmunospot con un anticuerpo anticitoquina. Las células se incuban en la placa de inmunospot. Las células secretan citoquinas y luego se lavan. Luego, las placas se recubren con un segundo anticuerpo biotinilado-anticitoquina y se visualizan con un sistema avidina-HRP.

4.8.10 Ensayo de citoquinas intracelulares para la detección de la funcionalidad de las respuestas de las células T CD8+ y CD4+.

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede usarse para ensayar la funcionalidad de las respuestas de las células T CD8+ y CD4+. Por ejemplo, se puede usar el ensayo de citoquinas intracelulares combinado con citometría de flujo (véase, p. ej., Suni M.A. et al., J Immunol Methods. 1998; 212: 89-98; Nomura L.E. et al., Cytometry.

2000; 40: 60-68; y Ghanekar S.A. et al., Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8: 628-63). Brevemente, el ensayo comprende los siguientes pasos: activación de células a través de péptidos o proteínas específicos, se añade una inhibición del transporte de proteínas (p. ej., brefeldina A) para retener las citoquinas dentro de la célula. Después de un período definido de incubación, típicamente 5 horas, sigue una etapa de lavado y se pueden añadir a las células anticuerpos frente a otros marcadores celulares. Las células se fijan y se permeabilizan. Se añaden los anticuerpos anticitoquinas conjugados con fluorocromo y las células pueden analizarse mediante citometría de flujo.

4.8.11 Ensayo para confirmar la deficiencia para la replicación de vectores virales

Cualquier ensayo conocido por el experto en la materia que determine la concentración de partículas virales infecciosas y competentes para la replicación también se puede usar para medir las partículas virales deficientes para la replicación en una muestra. Por ejemplo, los ensayos de FFU con células no complementarias pueden usarse para este propósito.

Además, los ensayos basados en placa son el método estándar utilizado para determinar la concentración de virus en términos de unidades formadoras de placa (PFU) en una muestra de virus. Específicamente, una monocapa confluente de células huésped no complementarias se infecta con el virus a diferentes diluciones y se cubre con un medio semisólido, tal como el agar, para evitar que la infección del virus se propague indiscriminadamente. Una placa viral se forma cuando un virus se infecta con éxito y se replica en una célula dentro de la monocapa celular fijada, y se disemina en las células circundantes (véase, p. ej., Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32: Immunology of Infection. Academic Press ISBN 0-12-521532-0). La formación de placas puede tardar 2-14 días, dependiendo del virus que se esté analizando. Las placas generalmente se cuentan manualmente y los resultados, en combinación con el factor de dilución utilizado para preparar la placa, se utilizan para calcular el número de unidades formadoras de placa por volumen de unidad de muestra (PFU/mL). El resultado de PFU/mL representa el número de partículas infectivas competentes para la replicación dentro de la muestra. Cuando se usan células C, se puede usar el mismo ensayo para titular las partículas de arenavirus o partículas de arenavirus trisegmentadas deficientes para la replicación.

4.8.12 Ensayo para la expresión del antígeno viral

Cualquier ensayo conocido por el experto en la técnica puede usarse para medir la expresión de antígenos virales. Por ejemplo, se pueden realizar ensayos de FFU. Para la detección, se usan preparaciones de anticuerpos mono o policlonales frente a los respectivos antígenos virales (FFU específico de transgén).

4.8.13 Modelos animales

Para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus descrita en la presente memoria, se pueden usar modelos animales en vivo. En ciertas realizaciones, los modelos animales que pueden usarse para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus trisegmentada incluyen ratón, cobaya, conejo y monos. En una realización preferida, los modelos animales que pueden usarse para investigar la recombinación y la infectividad de un arenavirus incluyen ratón. En una realización más específica, los ratones que pueden usarse para investigar la recombinación y la infectividad de una partícula de arenavirus son triplemente deficientes para el receptor de interferón tipo I, el receptor de interferón tipo II y el gen activador de recombinación 1 (RAG1).

En ciertas realizaciones, los modelos animales pueden usarse para determinar la infectividad del arenavirus y la estabilidad transgénica. En algunas realizaciones, el ARN viral puede aislarse del suero del modelo animal. Los expertos en la materia conocen fácilmente las técnicas. El ARN viral se puede transcribir inversamente y el ADNc que porta los ORF de arenavirus se puede amplificar por PCR con cebadores específicos de gen. La citometría de flujo también se puede usar para investigar la infectividad del arenavirus y la estabilidad transgénica.

5. EJEMPLOS

Estos ejemplos demuestran que la tecnología de vectores basada en virus LCMV puede usarse para desarrollar con éxito (1) un segmento genómico de arenavirus con un ORF viral en una posición distinta de la posición de tipo salvaje del ORF, y (2) una partícula de arenavirus trisegmentada que no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación.

5.1 Materiales y métodos

5.1.1 Células

Las células BHK-21 se cultivaron en medio Eagle de Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM; Sigma) suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10 % (FCS; Biochrom), HEPES 10 mM (Gibco), piruvato sódico 1 mM (Gibco) y 1x caldo de fosfato de triptosa. Las células MC57 se mantuvieron en Medio Esencial Mínimo (MEM; Sigma) complementado con FCS inactivado por calor al 5 %, L-glutamina 2 mM (Gibco) y penicilinaestreptomicina (100.000 U/ml de penicilina y 50 mg/l de estreptomicina; Gibco). Ambas líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5 %.

Las células BHK-21 que expresan NP se generaron transfectando células BHK-21 con un plásmido que expresa NP bajo el control del promotor eucariota EF1 -alfa y que codifica el gen de resistencia a la puromicina de acuerdo con el protocolo del fabricante. 48 horas después de la transfección, se añadieron 4 pg/ml de puromicina al medio. Otras 48 horas después, las células se subcultivaron en matraces T150. Una vez que los clones separados se hicieron visibles, las células se recogieron y se diluyeron de forma seriada en una placa de 96 pocillos para obtener clones individuales. Los pocillos se verificaron ópticamente para el crecimiento de poblaciones celulares a partir de clones individuales y las células respectivas se subcultivaron en placas de 6 pocillos una vez que formaron una monocapa confluente. Las células BHK-21 que expresan NP se cultivaron en medio BHK-21 en presencia de 4 pg/ml de puromicina.

Las células BHK-21 que expresan GP se han descrito previamente. Brevemente, las células BHK-21 se transfectaron de manera estable con un plásmido que expresa un ADNc de GP de LCMV con optimización de codones y el casete de resistencia a la puromicina. Los clones que expresan GP se seleccionaron mediante la adición de 4 pg/ml de puromicina al medio y los clones individuales se obtuvieron mediante diluciones seriadas como se describe para las células BHK-21 que expresan NP.

5.1.2 Plásmidos

Los plásmidos pol-I L, pC-NP y pC-L se han descrito previamente. Para la generación de plásmidos pol-I S que codifican GFP o RFP como genes informadores y NP o GP, utilizamos un plásmido de clonación pol-I Bbs/Bsm como base (pol-I 5'-BsmBI_IGR_BbsI_3'). Este plásmido codifica para la región no traducida en 5' (5' UTR) del segmento S viral seguido de dos sitios de restricción BsmBI, la región intergénica (IGR), un NP de descanso y el narco de lectura abierto CAT (ORF) flanqueado por sitios de restricción BbsI y la 3' UTR del segmento S. Los plásmidos pol-I S que codifican GP en su orientación 5' natural y GFP en orientación antisentido en la posición 3' (pol-I 5'-GP_IGR_GfP-3') se clonaron insertando GP mediante restricción específica de sitio de BsmBI y ligación en el plásmido pol-I Bbs/Bsm. En un segundo paso, se insertó GFP por digestión con BbsI y ligación. Para obtener plásmidos pol-I S que codifican GP en la orientación artificial 3' (pol-I 5'-GFP_IGR_GP-3'), GP se insertó mediante digestión con BbsI en la posición 3' en el plásmido pol-I Bbs/Bsm y GFP con restricción con BsmBI/ligación en la posición 5'. El pol-I S que codifica GFP o RFP y NP (pol-I 5 '-GFP_IGR_NP-3' o pol-I 5'RFP_IGR_NP-3') se clonaron insertando NP por digestión con BbsI y ligación en el plásmido de clonación pol-I Bbs/Bsm y GFP o RFP por clonación con BsmBI. El plásmido pol-I con GP de la cepa de LCMV WE y NP de la cepa de LCMV Clon 13 (Cl13) se clonaron insertando los genes respectivos mediante restricción específica de sitio con Bbs y Bsm/ligación en los sitios respectivos en el plásmido de clonación pol-I Bbs/Bsm.

El segmento S que codifica el GP de fusión WE/WET se obtuvo reemplazando los últimos 255 pares de bases del ORF de WE con una secuencia optimizada por codones llamada "WET". Esto se logró amplificando por PCR en un primer paso un fragmento de GP de WE con un cebador específico de WE (SEQ ID NO: 11) y un cebador de fusión específico de WE que portaba un saliente complementario a la secuencia de WET (SEQ ID NO: 12). Paralelamente, la secuencia de WET se amplificó por PCR usando un cebador específico de WET (SEQ ID NO: 13) y un cebador de fusión específico de WET complementario a la secuencia de WE (SEQ ID NO: 14). En una tercera reacción de PCR, los dos productos de PCR se fusionaron mediante fusión por PCR usando los dos cebadores de fusión mencionados. El fragmento de fusión WE/WET resultante se digirió con BsmBI y se ligó en un plásmido pol-I BsmBI_IGR_GFP-3' que se había digerido con la misma enzima de restricción.

El plásmido pol-I que codifica el segmento S recombinado del virus recombinado in vivo r3LCMV-GFPnat #3 se clonó insertando el fragmento de ADN sintetizado (síntesis génica por GenScript) mediante restricción/ligación específica del sitio con SacI y XmaI en un plásmido que codifica un segmento S de tipo salvaje bajo el control de un promotor pol-I (pol-I GP_IGR_NP) dando lugar a pol-I GP_IGR_GFPrest_IGR_NP.

5.1.3 Transfección de ADN de células y rescate de virus recombinantes.

Las células BHK-21 se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 4x105 células/pocillo y se transfectaron 24 horas después con diferentes cantidades de ADN utilizando lipofectamina (3 gl/gg de ADN; Invitrogen) o jetPRIME (2 gl/gg de ADN; Polyplus) según las instrucciones del fabricante. Para el rescate de virus bisegmentados recombinantes completamente a partir del ADN plasmídico, los dos factores que actúan en trans mínimos virales NP y L se administraron a partir de plásmidos dirigidos por pol-II (0,8 gg de pC-NP, 1 gg de pC-L) y se cotransfectaron con 1,4 gg de pol-I L y 0,8 gg de pol-I S. En el caso del rescate de r3LCMV trisegmentado que consiste en un segmento L y dos segmentos S, se incluyeron 0,8 gg de ambos segmentos S dirigidos por pol-I en la mezcla de transfección. 72 horas después de la transfección, el sobrenadante se recogió y se pasó sobre células BHK-21 para una mayor amplificación del virus. Las titulaciones virales en el sobrenadante se determinaron por ensayo de formación de focos.

5.1.4 Virus y cinética de crecimiento de los virus.

El Cl13 LCMV de tipo salvaje, originalmente derivado del LCMV de tipo salvaje Armstrong, se ha descrito previamente. Se produjeron preparaciones madre de virus de tipo salvaje y recombinante infectando células BHK-21 a una multiplicidad de infección (moi) de 0,01 y el sobrenadante se recogió 48 horas después de la infección. Las curvas de crecimiento de los virus se realizaron in vitro en un formato de 6 pocillos. Las células BHK-21 se sembraron a una densidad de 6 x 105 células/pocillo y se infectaron 24 horas después incubando las células junto con 500 gl del inóculo del virus a una moi de 0,01 durante 90 minutos en una placa basculante a 37 °C y 5 % de CO2. Se añadió medio nuevo y las células se incubaron a 37 °C/5 % de CO2 durante 72 a 96 horas. El sobrenadante se tomó en puntos de tiempo dados (normalmente 18, 24, 48, 72 horas) y las titulaciones virales se analizaron mediante un ensayo de formación de focos.

5.1.5 Ensayo de formación de focos

A continuación, las titulaciones de LCMV se determinan por el ensayo de formación de focos. El LCMV es un virus no citolítico que no lisa sus células huésped y, como tal, no crea placas. Sin embargo, las unidades en este trabajo se expresarán en el término unidades de formación de placa (PFU) más comúnmente utilizado en lugar del término correcto de unidades de formación de focos (FFU). Las células MC57 se usaron para el ensayo de formación de focos si no se indica lo contrario. Las células se sembraron a una densidad de 1,6x105 células por pocillo en una placa de 24 pocillos y se mezclaron con 200 gl de diluciones seriadas de 10 veces de virus preparadas en MEM/FCS al 2 %. Después de 2-4 horas de incubación a 37 °C, se añadieron 200 gl de un medio viscoso (metilcelulosa al 2 % en 2x DMEM suplementado) por pocillo para asegurar la propagación de las partículas virales solo a las células vecinas. Después de 48 horas a 37 °C, el sobrenadante se retiró y las células se fijaron añadiendo 200 gl de paraformaldehído al 4 % (PFA) en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (todos los pasos siguientes se realizan a temperatura ambiente). Las células se permeabilizaron con 200 gl por pocillo de BSS/Triton X-100 al 1 % (Merck Millipore) durante 20 minutos y posteriormente se bloquearon durante 60 minutos con PBS/FCS al 5 %. Para la tinción anti-NP se usó un anticuerpo monoclonal anti-LCMV-NP de rata como anticuerpo de tinción primario a una dilución de 1:30 en PBS/FCS al 2,5 % durante 60 minutos. Para la tinción anti-GFP, se usó anticuerpo de rata anti-GFP purificado (Biolegend 338002) a una dilución de 1:2.000 en PBS/FCS al 2,5 %. Las placas se lavaron tres veces con agua del grifo y se añadió la IgG secundaria anti-IgG de rata de cabra conjugada con HRP a una dilución de 1:100 en PBS/FCS al 2,5 % y se incubó durante 1 hora. La placa se lavó nuevamente tres veces con agua del grifo. Se añadió la reacción de color (0,5 g/l de DAB (Sigma D-5637), 0,5 g/l de sulfato de níquel de amonio en PBS/H2O2 al 0,015 %) y la reacción se detuvo después de 10 minutos con agua del grifo. Los focos teñidos se contaron manualmente y la titulación final se calculó de acuerdo con la dilución.

Para la tinción anti-GP de las células, las placas se fijaron con MeOH al 50 %/Acetona al 50 % durante 5 minutos y se lavaron con PBS. El bloqueo se realizó como se describe. Como anticuerpo primario, el GP83.4 anti-GP (producido a partir de hibridomas) se diluyó 1:10 en PBS/FCS al 2,5 % y se incubó durante 60 minutos. Después de tres lavados con agua del grifo, se añadió el anticuerpo IgG secundario anti-ratón de conejo conjugado con HRP- a una dilución de 1:50 en PBS/FCS al 2,5 % y se incubó durante 60 minutos. Después de otros tres lavados con agua del grifo, se añadió la reacción de color como se describió anteriormente.

Para determinar la viremia de los ratones en sangre, se recogió una gota de sangre (correspondiente a un volumen de 50 gl) en 950 gl de heparina BSS (heparina Na, Braun, 1 lE/ml final), se mezcló por inversión y se almacenó. a -80 °C hasta su uso posterior.

5.1.6 Ratones

Los ratones AGRAG (IFNa/pR-/-, IFNyR-/-, RAG-/-) se han descrito previamente y fueron criados y estabulados en condiciones específicas libres de patógenos (SPF). Fueron criados en el Institut für Labortierkunde de la Universidad de Zúrich, Suiza. Todos los experimentos con animales se realizaron en las Universidades de Ginebra y Basilea de acuerdo con la ley suiza para la protección de los animales y el permiso de las autoridades cantonales responsables respectivas de Ginebra y Basilea. La infección de los ratones se realizó por vía intravenosa a una dosis de 1 x 104 PFU por ratón.

5.1.7 Preparación de ARN viral y secuenciación

El ARN viral se extrajo del sobrenadante del cultivo celular o del suero de ratones infectados utilizando el Mini Kit de ARN viral QlAamp (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reacción de transcripción inversa se realizó con el sistema de RT-PCR ThermoScript (Invitrogen) y un cebador específico para NP de LCMV (SEQ ID NO: 15) siguiendo el protocolo del fabricante. La amplificación por PCR se realizó mediante el uso de 2 gl del ADNc de la etapa RT y cebadores específicos de NP y GP (SEQ ID NO: 16). La reacción de PCR se realizó usando ADN polimerasa Phusion High-Fidelity (NEB). Los productos amplificados se analizaron y se escindieron de un gel de agarosa al 2 %, se purificaron usando el kit de extracción de gel QIAquick (QIAGEN) y se enviaron para la secuenciación de ADN de Sanger (Microsynth) usando los cebadores específicos de NP y GP.

5.1.8 Citometría de flujo

La sangre se tiñó con anticuerpos frente a CD11c (N418), CD11b (M1/70), CD19 (6D5), NK1.1 (PK136), CD90.2 (30-H12) y GR-1 (RB6-8C5). La expresión de moléculas de superficie teñidas con anticuerpos específicos, así como la expresión de GFP y RFP, se analizó en un citómetro de flujo BD LSR Fortessa usando el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR).

5.1.9 Análisis estadístico

La significancia estadística se determinó mediante el ensayo de la t no emparejada de dos colas o el ANOVA de 1 vía seguido de la prueba posterior de Dunnett o Bonferroni para comparaciones múltiples utilizando el software Graphpad Prism (versión 6.0d). los valores de p de p > 0,5 se consideraron no significativos (ns), mientras que los valores de p de p < 0,5 se consideraron significativos (*) con gradaciones de p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***) siendo altamente significativas.

5.2 Resultados

5.2.1 Los virus trisegmentados recombinantes crecen a titulaciones más bajas que el LCMV de tipo salvaje

El genoma del LCMV de tipo salvaje consiste en dos segmentos de ARN monocatenario de polaridad negativa (un segmento L, uno S) (Fig. 1A). En los últimos años, se ha mostrado que es posible introducir genes extraños adicionales en el genoma normalmente bisegmentado que se encuentra en las partículas de LCMV. Los genes NP y GP se segregan en dos análogos del segmento S, y los genes de interés se insertan en cada segmento S resultante de LCMV, lo que da como resultado partículas virales competentes para la replicación con tres segmentos de ARN (dos S uno L). La única estrategia publicada actualmente mantiene tanto NP como GP en su posición natural en el segmento S, colocando así a GFP u otros transgenes en los respectivos sitios libres (r3LCMV-GFPnat) (Fig. 1B). Esta fue la estrategia intuitiva destinada a minimizar el riesgo probable de que la reorganización genética del segmento S anule la viabilidad del genoma resultante. Sin embargo, este estudio planteó la hipótesis de que también debería ser posible yuxtaponer la GP al 3'UTR, expresándolo desde el elemento promotor que normalmente dirige la NP (r3LCMV-GFPart; Fig. 1C). Los plásmidos de expresión respectivos se generaron mediante clonación de ADNc recombinante y las tres construcciones virales se rescataron completamente a partir del ADN plasmídico. Se realizaron curvas de crecimiento comparativas con los tres virus (Fig. 1D). Los tres virus mostraron las titulaciones más altas 48 horas después de la infección, con titulaciones máximas de virus trisegmentados 10-100 veces más bajas que el virus de tipo salvaje. El LCMV de tipo salvaje alcanzó 3,4 x 106 PFU/ml, r3LCMV-GFPnat alcanzó su punto máximo a 2,7 x 104 PFU/ml y r3LCMV-GFPart a 2,2 x 105 PFU/ml. Independientemente de sus titulaciones máximas reducidas de forma similar, r3LCMV-GFPnat exhibió una infectividad libre de células algo mayor durante los puntos de tiempo tempranos que r3LCMV-GFPart.

5.2.2 El empaquetamiento de partículas virales segmentadas es menos eficiente que el del virus bisegmentado

Estas observaciones sugirieron que la adición de un segundo segmento S alteraba y retrasaba el crecimiento viral. Se planteó la hipótesis de que esta reducción en la aptitud viral podría deberse al empaquetamiento ineficiente de los tres segmentos de ARN en partículas virales, y que se formaba un exceso de partículas bisegmentadas, que no se replicaron productivamente al infectar células frescas. Para estos experimentos, se usaron r3LCMV con dos genes informadores diferentes, es decir, GFP junto con GP en un segmento S, y NP cerca de RFP en el segundo segmento S. Esto dio lugar a dos virus llamados r3LCMV-GFP/RFPnat y r3LCMV-GFP/RFPart, que solo difieren en la organización de GFP y GP en el segmento S respectivo. Las células BHK-21 se infectaron con r3LCMV-GFP-RFPnat o r2LCMV bisegmentado y se realizaron ensayos de formación de focos en células BHK-21 normales o, en paralelo, con células BHK-21 transfectadas de forma estable que expresan bien GP (BHK-GP) o NP (BHK-NP) como sustrato celular para transcomplementar los genomas virales que carecen de los genes respectivos. Las células de tipo salvaje y complementarias para GP se tiñeron para focos virales que expresan nucleoproteína, mientras que las células complementarias para NP se tiñeron para focos positivos para GP. De este modo, la formación de inmunofocos en células BHK-21 de tipo salvaje detectó solo viriones trisegmentados. Sin estar limitados por la teoría, las células BHK-GP deberían replicar viriones trisegmentados, así como los bisegmentados que contienen el segmento L en combinación con el segmento S que expresa NP (pero sin el S que expresa GP). Por el contrario, las células BHK-NP deberían replicar LCMV trisegmentado y adicionalmente viriones deficientes para NP que consisten en el segmento L y S que expresa GP (pero que carecen del segmento S que expresa NP). Las titulaciones infecciosas de ambos r3LCMV-GFP/RFPnat y r3LCMV-GFP/RFPart, fueron consistentemente más altas cuando se evaluaron en células BHK-GP o BHK-NP que cuando se evaluó la infectividad en células BHK-21 de tipo salvaje. Por el contrario, las titulaciones de r2LCMV fueron similares, independientemente del sustrato celular utilizado para evaluar su infectividad. Con el fin de corregir las posibles diferencias intrínsecas en la permisividad de cada línea celular al LCMV, la titulación de cada virus en las células BHK-21 se normalizó a uno, para la visualización y las titulaciones de BHK-GP, así como de BHK-NP se expresaron como un múltiplo de los mismos. Por lo tanto, se reflejan las diferencias en las titulaciones relacionadas con los clones de células respecto a las posibles diferencias intrínsecas en los clones en la permisividad viral (Fig. 2A). En cualquiera de las células complementarias, se observó una diferencia en la titulación de aproximadamente cinco a diez veces para r3LCMV-GFP/RFPnat y r3LCMV-GFP/RFPart, que fue significativamente mayor que para r2LCMV. Esto sugirió que una mayoría de las partículas virales, que estaban formadas por los dos virus trisegmentados, contenían solo uno de los dos segmentos S, que codificaba solo el segmento S que expresa NP (partículas solo NP) o que expresa GP (partículas solo GP), respectivamente. La diferencia de 5 veces o más en la titulación sugirió que tanto las partículas solo NP como las solo GP superaron en número a las partículas trisegmentadas aproximadamente cinco veces cada una, y que las partículas trisegmentadas constituían menos del 10 por ciento de los viriones solamente, lo que era compatible con un retraso en el crecimiento y una reducción en las titulaciones máximas virales cuando se cultivaba en células no complementarias (Fig. 1D). Estos hallazgos fueron validados además por citometría de flujo. Las células BHK-21 no complementarias o las células BHK-NP se infectaron con r3LCMV-GFP/RFPart o r2LCMV como control de activación y las intensidades de fluorescencia de GFP y RFP se evaluaron con un citómetro de flujo (Fig. 2B). Dado que las células BHK-21 de tipo salvaje no proporcionan los factores que actúan en trans mínimos, solo los viriones que contienen al menos un segmento L junto con el segmento S que expresa NP pueden iniciar un ciclo infeccioso después de la entrada en la célula, dando lugar a una señal de fluorescencia (RFP). De acuerdo con esto, se observó una población de células RFP+GFP- tras la infección de las células BHK-21, lo que refleja partículas solo NP. Las células doble positivas RFP+GFP+ fueron la evidencia de partículas trisegmentadas genuinas. De acuerdo con la selección, también se observaron células RFP-GFP+, pero tenían una MFI de RFF más alta que las células RFP-GFP-, lo que sugiere que representaban estadios tempranos de infección por partículas trisegmentadas, una interpretación que también está respaldada por la continuidad de esta población y la doble positiva RFP+GFP+. Sin embargo, cuando se cultiva r3LCMV-GFP/RFPart trisegmentado en células BHK-NP, sustituyendo así este factor que actúa en trans mínimo, observamos un número de células RFP-GFP+ más de 10 veces mayor en comparación con la infección de células BHK-21 no complementarias. Por el contrario, se detectaron células RFP+ GFP- (evidencia de partículas solo NP) y células doble positivas GFP+RFP+ (partículas trisegmentadas) en abundancia comparable (Fig. 2C). Estos resultados confirmaron a nivel de célula individual los hallazgos obtenidos mediante el ensayo de formación de focos, corroborando así que las preparaciones de virus trisegmentadas contienen una mayoría de partículas bisegmentadas deficientes para la replicación. Estos hallazgos ofrecieron una explicación probable para el crecimiento atenuado de r3LCMV-GFP/RFPnat y r3LCMV-GFP/RFPart proporcionando información sobre un empaquetamiento aleatorio aparentemente bastante ineficiente de los virus trisegmentados.

5.2.3 Clonación y rescate de virus recombinantes para rastrear la recombinación in vivo

Dado que los virus trisegmentados muestran una cinética de crecimiento alterada como se ve en la Fig. 1, se planteó la hipótesis de que debería haber una alta presión de selección en los virus para recombinar su información genética para NP y GP en un solo segmento S. Se postula que la recombinación entre segmentos de arenavirus condujo a la evolución filogenética del grupo norteamericano, y por lo tanto parecía un mecanismo potencial por el cual los virus trisegmentados podrían restablecer un genoma bisegmentado funcional. Sin estar limitado por la teoría, al observar la organización genómica de los dos virus trisegmentados, se postuló que la presión de selección sobre r3LCMV-GFPnat podría favorecer los eventos de recombinación en el área de la iGr , para unir GP y NP en el mismo segmento, mientras se elimina la GFP. En la población de r3LCMV-GFPart la presión de selección debería ser igualmente alta, sin embargo, la reorganización de GP y su posicionamiento cerca de la 3'UTR debería hacer que sea muy difícil, si no imposible, que este virus combine sus dos segmentos S en un segmento funcional (véase la Fig. 7 a continuación). Debido a las advertencias para la identificación de la recombinación de ARN y para discriminarla firmemente de la potencial contaminación con ADNc, clonamos un segmento S que portaba GFP junto con un ORF de GP recombinante en donde los 255 nucleótidos terminales estaban optimizados por codones. La GP resultante tenía una secuencia de nucleótidos diferente pero un producto de traducción idéntico a la GP de la cepa WE de tipo salvaje (WE/WET-GP, Fig. 3A). Sin embargo, este ORF de WE/WET GP recombinante no existía como un virus bisegmentado infeccioso ni el laboratorio poseía una construcción de ADNc en donde estaba asociado con NP. Por lo tanto, cualquier virus bisegmentado potencial que contenga WE/WET en el mismo segmento que NP se consideró una clara evidencia de recombinación entre segmentos, diferenciando dichos virus de ADNc o ARN potencialmente contaminantes en los ensayos respectivos. Para ensayar si la GP quimérica tenía un efecto sobre la aptitud viral, se realizaron curvas de crecimiento del cultivo celular del virus trisegmentado recombinante que porta la GP de fusión WE/WET (r3LCMV-WEWET/GFPnat) en comparación con un virus trisegmentado que portaba la GP de WE de tipo salvaje (r3LCMV-WE/GFPnat) (Fig. 3B). La cinética de crecimiento y las titulaciones máximas de los dos virus fueron comparables (r3LCMV-WE/GFPnat: 1,7x106 PFU/ml, r3LCMV-WEWET/GFPnat: 2,3x106 PFU/ml). Por lo tanto, la glucoproteína WEWET quimérica no tuvo un impacto detectable en el crecimiento viral.

Para ensayar si los potenciales eventos de recombinación podrían ocurrir entre los genes NP y GP del segmento S que involucrarían a la IGR. Por lo tanto, se introdujo una deleción de un único nucleótido en la región intergénica del segmento S que codifica NP, para servir como una etiqueta genética. La elección de esta deleción de nucleótido se realizó porque está situada en una cadena que, a diferencia de la mayoría de las IGR del segmento S, no se conserva entre cepas, ni en secuencia ni en longitud. En el caso de un evento de recombinación, esta región intergénica "etiquetada" (marcada como * en todo, tanto en las figuras como en el texto) debería permitir la identificación del origen genético de las secuencias de IGR del segmento S. La Figura 3C muestra la posición de la citosina delecionada (marcada con una flecha) y un esquema del segmento S que porta NP resultante. Para ensayar si la deleción introducida en la IGR tenía un impacto en el crecimiento viral, se rescató r3LCMV-GFPnat recombinante con o sin la deleción de un único nucleótido. Se realizaron experimentos de curva de crecimiento en células BHK-21 (moi = 0,01). Un virus trisegmentado con una IGR de tipo salvaje (r3LCMV-GFPnat) y su comparador con la IGR mutada (r3LCMV-GFPnat IGR*) creció a un ritmo similar y alcanzó titulaciones máximas indistinguibles (Figura 3D). En consecuencia, la etiqueta de la IGR en el segmento S portador de NP no tuvo un impacto detectable en la aptitud viral, validando así su uso para la experimentación posterior in vivo.

5.2.4 La infección persistente en ratones con r3LCMV-GFPnat pero no r3LCMV-GFPart alcanza niveles de viremia equivalentes al virus bisegmentado de tipo salvaje y da como resultado la pérdida de la expresión de GFP

Tras el rescate del r3LCMV-GFPnat recombinante, un objetivo fue investigar si los virus trisegmentados se recombinaban in vivo. Para este propósito, los ratones AGRAG se infectaron con r3LCMV-GFPnat, r3LCMV-GFPart o un r2LCMV bisegmentado como control. Los ratones AGRAG portan deleciones dirigidas en los genes que codifican el receptor de interferón a/p, el receptor de interferón y y RAG1, lo que conduce a un fenotipo inmunodeficiente y al establecimiento de viremia crónica después de la infección con LCMV trisegmentado. Se tomaron muestras de sangre con el tiempo y las titulaciones virales se evaluaron mediante un ensayo de formación de focos (Fig. 4A). Los portadores de LCMV bisegmentados mostraron viremia de alto titulación en el rango de 5 x 105 PFU/ml de sangre en los 5 días posteriores a la infección, con viremia estable posteriormente en el rango de 104-105 de PFU/ml hasta al menos el día 50 después de la infección. Los ratones infectados con LCMV trisegmentado mostraron cargas virales de aproximadamente 5 x 103 PFU/ml de sangre hasta el día 20, en línea con el crecimiento atenuado en cultivo celular (en comparación con la Fig. 1D). Desde el día 30 en adelante, los portadores de r3LCMV-GFPnat mostraron un aumento en las cargas virales, lo que no se observó en animales infectados con r3LCMV-GFPart, lo que resulta en una diferencia de más de 10 veces en la viremia en el día 50. Para determinar si la población de virus dominante todavía portaba el gen informador de GFP, lo que resultaba así en la expresión de GFP en las células infectadas, se realizaron ensayos de formación de focos virales con muestras de sangre de portadores de r3LCMV-GFPnat y r3LCMV-GFPart tomadas el día 127 después de la infección y se tiñeron para la nucleoproteína o el gen informador GFP (Fig. 4B). Mientras que la tinción de sangre aislada de portadores de r3LCMV-GFPart dio como resultado cantidades iguales de focos con detección de anticuerpos anti-NP y anti-GFP (ambas evaluaciones indican independientemente titulaciones virales en el rango de 103 PFU/ml), fueron evidentes números al menos 100 veces más altos de focos totales (NP+) r3LCMV-GFPnat que los focos que expresan GFP. Las titulaciones virales de al menos 104 PFU/ml se midieron en base a la detección anti-NP, mientras que dos de cada tres ratones no mostraron ninguna infectividad positiva para GFP detectable y un ratón tenía una fracción residual de focos positivos para GFP en el rango de 100 PFU/ml, correspondiente al límite inferior de detección de nuestros ensayos. La expresión de GFP de células infectadas también se evaluó mediante microscopía de fluorescencia (datos no mostrados). Los focos fluorescentes de GFP eran prácticamente indetectables cuando se analizaba sangre de portadores de r3LCMV-GFPnat, mientras que los recuentos manuales de focos positivos para GFP de sangre de portadores de r3LCMV-GFPart concordaron con los resultados de las titulaciones obtenidos con el ensayo de formación de focos anti-NP. La expresión del gen informador se verificó adicionalmente mediante análisis de citometría de flujo de PBMC de ratones infectados en el día 120 después de la infección. Encontramos que más del 10 % de los monocitos/macrófagos CD11b+GR1- fueron positivos para GFP en animales infectados con r3LCMV-GFPart mientras que la sangre de r3LCMV-GFPnat evidenció solo niveles de fondo de GFP, que fue comparable a los animales infectados con r2LCMV no fluorescente (Fig. 4C-E). Este hallazgo apoyó aún más la hipótesis de que los virus trisegmentados con GP en su posición natural pierden la expresión del gen informador con el tiempo, mientras que la transposición de la GP en la yuxtaposición artificial 3'UTR previno la pérdida del transgén.

5.2.5 Los virus trisegmentados con GP en la posición natural pueden recombinar sus dos segmentos S dando lugar a un solo segmento S con duplicaciones de IGR parciales o completas que flanquean un rudimento de secuencia transgénica

La Figura 4 mostró viremia elevada y pérdida de la expresión del gen informador en ratones infectados con r3LCMV-GFPnat. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que un evento de recombinación podría explicar este resultado experimental. La recombinación entre segmentos debe combinar GP y NP en el mismo segmento S, evitando la necesidad de un segundo segmento S en el ciclo de replicación viral. Tal evento podría haber explicado la viremia a nivel del virus de tipo salvaje, en combinación con la pérdida de la expresión del gen informador. Para ensayar esta posibilidad, se aisló el ARN viral del suero de ratones infectados y se usó un par de cebadores que se unían a las secuencias NP y GP, respectivamente, para amplificar selectivamente por RT-PCR solo las moléculas de ARN recombinadas supuestamente, que portan ORF de NP y GP en orientación ambisentido en un segmento de ARN. Los fragmentos de PCR resultantes se analizaron por electroforesis en gel (Fig. 5A). Los sueros de todos los portadores de r3LCMV-GFPnat dieron lugar a productos de PCR dependientes de Rt , mientras que los portadores de r3LCMV-GFPart y los controles sin tratar no mostraron bandas específicas. Las reacciones de PCR de control se realizaron en muestras de ARN tratadas con simulación de RT para descartar contaminaciones de ADNc como fuente de producto de PCR. Los resultados de la secuenciación de tres portadores individuales de r3LCMV-GFPnat se representan esquemáticamente en la Fig. 5C. Los tres ratones contenían segmentos de ARN viral de secuencias distintas, pero con un patrón similar: las porciones C-terminales de GP y NP se encontraron en orientación ambisentido en un segmento de ARN. Entre ellas, ambas regiones intergénicas, es decir, la del segmento que expresa NP y la del segmento original que expresa GP fueron retenidas al menos parcialmente, separadas por un fragmento de uno o ambos genes informadores de GFP en los segmentos S parentales del virus trisegmentado. La dirección y la longitud del fragmento de GFP variaron entre las tres especies de ARN recuperadas de ratones individuales, lo que era indicativo de eventos de recombinación independientes. En apoyo adicional de esta noción, se recuperó exactamente la misma secuencia de ARN recombinada de dos muestras consecutivas tomadas del mismo ratón con un intervalo de más de tres semanas entre el muestreo. En base a las secuencias del segmento S recombinadas obtenidas, propusimos un mecanismo molecular, como se describe esquemáticamente en la Fig. 7 y se describe en la leyenda de la figura, mediante el cual r3LCMV-GFPnat recombina sus dos segmentos S, lo que da lugar a la pérdida transgénica y a la reversión fenotípica al virus de tipo salvaje. Los esquemas de la Fig. 7 también explican por qué, de acuerdo con el mecanismo propuesto de recombinación del segmento S, r3LCMV-GFPart no puede recombinarse y reunir sus ORF de NP y GP en un segmento S funcional.

5.2.6 El r2LCMV recombinante con dos IGR en el segmento S es viable y crece a titulaciones similares a las del LCMV bisegmentado con solo una IGR en el segmento S.

Los datos de secuenciación anteriores revelaron un patrón consistente de elementos genéticos virales en segmentos S recombinados entre los cuales la duplicación (al menos parcial) de la IGR fue particularmente notable y característica. Sin embargo, los arenavirus con repeticiones de regiones intergénicas en un segmento S no se conocían. Sin embargo, un bucle de doble tallo se encuentra naturalmente en el arenavirus Mopeia del Viejo Mundo. Por lo tanto, clonamos el segmento S reordenado del portador #3 de r3LCMV-GFPnat con las dos IGR y el remanente de GFP en un plásmido de expresión del segmento S dirigido por pol-I y rescatamos el virus respectivo. La cinética de crecimiento de este virus (r2LCMV_2IGRs) en las células BHK-21 se comparó con r3LCMV-GFPnat trisegmentado y r2LCMV bisegmentado (Fig. 6). Las titulaciones infecciosas sin células de r2LCMV_2IGR excedieron las de r3LCMV-GFPnat ya en los puntos de tiempo tempranos y alcanzó titulaciones máximas idénticas como r2LCMV (1,7 x 107 PFU/ml frente a 1,6 x 107 PFU/ml, respectivamente). Es importante destacar que r2LCMV_2IGRs creció a titulaciones máximas considerablemente más altas que su r3LCMV-GFPnat trisegmentado parental, atestiguando la ventaja selectiva de la recombinación entre segmentos a pesar de la duplicación de la IGR durante este proceso.

5.2.7 El r3LCMV recombinante que expresa ovoalbúmina (OVA) induce una respuesta rápida, fuerte y polifuncional de células T CD8+ específicas de OVA.

Para ensayar la utilidad de la tecnología de administración del vector r3LCMVart para fines de vacunación, generamos el vector de vacuna r3LCMV-OVAart con una organización genómica análoga a r3LCMV-GFPart (Fig. 1C), pero con dos genes de ovoalbúmina (OVA) en lugar de los genes de GFP respectivos en el último virus. Inmunizamos ratones C57BL/6 por vía intramuscular (i.m.) con 104 PFU de r3LCMV-OVAart y ocho días después analizamos la respuesta de las células T en el bazo. Para comparar con una plataforma de vector ampliamente utilizada, inmunizamos un segundo grupo de ratones C57BL/6 con 108 partículas de un vector basado en adenovirus 5 con E1 delecionado deficiente para la replicación que también expresa OVA (rAd5-OVA). La frecuencia de las células T CD8+ específicas de OVA que reconocen el epítopo SIINFEKL derivado de OVA inmunodominante estaba en el rango del 10 % de las células T CD8+ en el grupo de vacuna de r3LCMV-OVAart, que fue significativamente mayor que en el grupo rAd5-OVA (Fig. 8A). Las respuestas de las células T CD8+ inducidas por r3LCMV-OVAart no solo fueron de gran magnitud sino también altamente funcionales, según lo determinado por los ensayos de citoquinas intracelulares, lo que revela que la mayoría de las células T CD8+ inducidas por r3LCMV-OVAart reactivas para SIINFEKL produjeron IFN-y en respuesta a la estimulación peptídica, y que una proporción considerable coprodujo TNF-a y/o IL-2. Esto demostró la utilidad de la tecnología del vector r3LCMV-OVAart para la administración de vacunas.

5.2.8 El LCMV trisegmentado induce células T CD8+ de memoria polifuncionales.

Para abordar la cuestión de si los vectores r3LCMV inducen células T CD8+ de memoria funcionales, inmunizamos ratones C57BL/6 con 10e5 PFU de r3LCMV-OVAart i.v. y analizamos las respuestas de células T CD8+ específicas de OVA (específicas de SIINFEKL) en el bazo en el día 25. Un grupo control de referencia de ratones se vacunó con 10e8 partículas virales (vp) de vector adenoviral (rAd) recombinante con E1 delecionado que expresaba OVA por la misma ruta. Las células T CD8+ específicas de OVA que producen IFN-y, TNF-a y/o IL-2 tras la estimulación peptídica se evaluaron en ensayos de citoquinas intracelulares estándar tras la estimulación con péptidos SIINFEKL. Se determinó la frecuencia (Figura 9A) y el número absoluto (Figura 9B) de células productoras de citoquinas como se indica en el gráfico. Los ratones inmunes r3LCMV-OVAart exhibieron frecuencias y números significativamente más altos de células T CD8+ específicas de OVA polifuncionales que coproducían IFN-Y/TNF-a e IFN-Y/TNF-a/IL-2 que los ratones inmunes rAd-OVA.

5.2.9 El LCMV que codifica el antígeno induce respuestas de células T específicas frente a antígenos extraños y propios.

Para investigar si los vectores r3LCMVart pueden ser explotados para inducir respuestas de células T CD8 frente a autoantígenos expresados en tumores, inmunizamos ratones BALB/c con vectores r3LCMVart que expresan epítopos de células T Cd 8+ derivadas de Her2 de rata (TYVPANASL), humanos (TYLPTNASL) o de ratón (TYLpAn ASL) (Figura 10). Nueve días después, medimos las células T CD8 específicas que producían IFN-y, TNF-a y/o IL-2 tras la estimulación con los péptidos respectivos en ensayos de citoquinas intracelulares. La Figura 10 muestra las frecuencias de células T CD8+ específicas de epítopo como el porcentaje de células T CD8+ que producían la combinación de citoquinas indicada tras la estimulación con el péptido cognado. Las frecuencias de las células T CD8+ productoras de citoquinas tras la reestimulación con medio solo fueron insignificantes. Los resultados documentan que los vectores r3LCMVart tienen la capacidad de inducir frecuencias sustanciales de respuestas de células T CD8+ reactivas con antígenos propios de tumor.

5.2.10 El interferón-a es inducido después de la infección con r3LCMVart, pero no después de la infección con vectores recombinantes de adenovirus o vaccinia.

Los interferones tipo I pueden tener múltiples efectos inmunoestimuladores y antitumorales. Por lo tanto, la inducción del interferón tipo I puede representar una característica favorable de una vacuna viralmente vectorizada. Realizamos mediciones de ELISA para determinar las concentraciones de interferón alfa en el suero de ratones inmunizados con r3LCMV-OVAart, rAd-OVA o virus vaccinia recombinante que expresa OVA (rVacc) 24, 48 o 72 horas antes (Figura 11). r3LCMVart, pero no rAd ni rVacc, indujeron una respuesta sistémica de interferón alfa detectable y sostenida (al menos 48 horas). Esto atestigua la capacidad de los vectores r3LCMVart para inducir fuertes respuestas inmunes innatas.

5.2.11 Crecimiento del cultivo celular de r3JUNV-GFPart en comparación con r3JUNV-GFPnat y la cepa parental de Junin, Candid #1.

Por analogía con los vectores r3LCMV-GFPnat y r3LCMV-GFPart, portadores de un genoma como se muestra en la Fig. 1B, preparamos por ingeniería r3JUNV-GFPnat y r3JUNV-GFPart, que consisten en vectores basados en la cepa de la vacuna Junin trisegmentado Cándida #1 que portan los genes de GFP en cada uno de sus dos segmentos S respectivos (r3JUNV-GFPnat y r3JUNV-GFPart). Ensayamos sus propiedades de crecimiento en células 293T, que infectamos a una multiplicidad de infección de 0,01 y recogimos el sobrenadante con el tiempo (Fig. 12). Encontramos que r3JUNV-GFPart creció más lentamente que su cepa vacunal Junin bisegmentada parental Candid #1 (Fig. 12). Sin embargo, creció más rápido que r3JUNV-GFPnat, (Fig. 12). Este comportamiento de crecimiento diferencial de los vectores basados en el virus Junin trisegmentado fue paralelo a las tasas de crecimiento de los vectores r3LCMV-GFPnat y r3LCMV-GFPart (Fig. 1D).

5.2.12 JUNV trisegmentados son dramáticamente atenuados in vivo, y r3JUNV-GFPnat, pero no r3JUNV-GFPart, pierde la expresión de GFP después de una replicación prolongada in vivo.

Para investigar la estabilidad genética de r3JLJNV-GFPnat y r3JUNV-GFPart, infectamos ratones AGRAG (IFNa/pR-/-, IFNyR-/-, RAG-/-) con 7x10e4 PFU de cualquiera de estos vectores que expresan GFP. Para fines de comparación, un tercer grupo se infectó con el virus Candid #1 bisegmentado de tipo salvaje. El último virus se detectó fácilmente en la sangre de todos los ratones infectados sobre el día 20 después de la infección (Figura 13A), mientras que los virus trisegmentados permanecieron indetectables durante al menos 40 días. Este hallazgo documentó el crecimiento atenuado in vivo como resultado de la reorganización del genoma, extendiendo nuestros hallazgos con los vectores r3LCMV-GFP en la Fig. 4A a los vectores basados en Junin. Después del día 40, r3JUNV-GFPnat y r3JUNV-GFPart también fueron detectables en varios animales en cada grupo (Figura 13A). Sin embargo, es importante destacar que algunos de los ratones infectados con r3JUNV-GFPnat alcanzaron cargas virales en el rango de los ratones infectados con Candid #1 de tipo salvaje, mientras que los ratones infectados con r3JUNV-GFPart virémicos retuvieron una carga viral más baja que los controles infectados con Candid #1.

Para determinar si la población de virus dominante en estos animales virémicos todavía portaba el gen informador de GFP, dando lugar así a la expresión de GFP en las células infectadas, realizamos ensayos de formación de focos virales con muestras de sangre de portadores de r3JUNV-GFPnat y r3JUNV-GFPart tomadas en el día 120 después de la infección. Comparamos las titulaciones infecciosas de virus que retienen la expresión de GFP (anti-GFP, Fig. 13B) y la infectividad total del virus Junin (anti-NP, Fig. 13B). Las titulaciones de r3JUNV-GFPart estaban en rangos similares cuando se determinaron mediante un ensayo de inmunofoco anti-GFP o anti-NP, documentando que la mayoría de la población de virus retuvo la expresión de GFP. Por el contrario, en la sangre de los cuatro animales infectados con r3JUNV-GFPnat con la viremia más alta (comparable a Candid #1 tipo salvaje), la titulación infecciosa anti-GFP fue al menos 10 veces menor que la titulación infecciosa total según se determinó mediante tinción de NP. Esto documentó que r3JUNV-GFPart, pero no r3JUNV-GFPnat, retuvo de forma estable el transgén de GFP in vivo.

5.2.13 Las combinaciones homólogas y heterólogas de cebado-refuerzo de vectores de vacuna basados en LCMV y JUNV trisegmentados inducen fuertes respuestas de células T CD8+ específicas de autoantígeno P1A.

A continuación investigamos si los vectores basados en r3LCMVart y r3JUNVart pueden usarse en combinaciones homólogas y heterólogas de cebado-refuerzo para inducir respuestas de células T CD8+ específicas de autoantígeno tumoral. Construimos vectores basados en r3LCMVart y r3JUNVart que expresan el autoantígeno P1A derivado de mastocitoma de ratón P815 (SEQ ID NO: 24) (r3LCMV-P1Aart (SEQ ID NO: 18, 19, 20) y r3JUNV-P1Aart (SEQ ID NO: 21, 22, 23)). Estas construcciones de vacunas se usaron para inmunizar ratones BALB/c i.v. en combinaciones homólogas y heterólogas de cebado-refuerzo como se muestra en la Figura 14. Tanto r3LCMV-P1Aart como r3JUNV-P1Aart indujeron células T CD8+ específicas del epítopo P1A cuando se administraron en vacunación homóloga de cebado-refuerzo, según se determinó a partir de sangre usando tetrámeros H-2Ld cargados con el péptido LPYLGWLVF (epítopo P1A 35-43). Las frecuencias medias de las células T CD8+ específicas del epítopo en el día 63 del experimento fueron del 1,2 % (r3JUNV-P1Aart) y 3,9 % (r3LCMV-P1Aart), respectivamente. Además, los animales cebados con r3JUNV-P1Aart y reforzados con r3LCMV-P1Aart de manera heteróloga, produjeron respuestas aún más altas con frecuencias promedio de células T CD8+ específicas del epítopo del 19,5 % en el día 63. Las frecuencias de animales cebados con r3LCMV-P1Aart y reforzados con r3JUNV-P1Aart (3,1%) fueron comparables a aquellos sometidos a vacunación homóloga de cebado-refuerzo con r3LCMV-P1Aart.

7. Listado de secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación que comprende un segmento L y dos segmentos S, en donde uno de los dos segmentos S se selecciona del grupo que consiste en:

(v) un segmento S, en donde el ORF que codifica la L está bajo el control de una 3' UTR de arenavirus; y

2. Una partícula de arenavirus trisegmentada infecciosa y competente para la replicación que comprende dos segmentos L y un segmento S, en donde uno de los dos segmentos L se selecciona del grupo que consiste en: (i) un segmento L, en donde el ORF que codifica la GP está bajo el control de una 5' UTR de arenavirus;

3. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 1, en donde la recombinación entre segmentos de los dos segmentos S, que une dos ORF de arenavirus en solo uno en lugar de dos segmentos separados, suprime la actividad del promotor viral.

4. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 2, en donde la recombinación entre segmentos de los dos segmentos L, que une dos ORF de arenavirus en solo uno en lugar de dos segmentos separados, suprime la actividad del promotor viral.

5. La partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la propagación de la partícula de arenavirus trisegmentada no da como resultado una partícula viral bisegmentada competente para la replicación después de 70 días de infección persistente en ratones que carecen de receptor de interferón tipo I, receptor de interferón tipo II y gen activador de recombinación 1 (RAG1) y que han sido infectados con 104 PFU de la partícula de arenavirus trisegmentada.

6. La partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la 3' UTR de arenavirus es la 3' UTR del segmento S de arenavirus o del segmento L arenavirus, y en donde la 5' UTR de arenavirus es la 5' UTR del segmento S de arenavirus o del segmento L de arenavirus.

7. La partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 5 y 6, en donde los dos segmentos S comprenden dos ORF heterólogos.

8. La partícula de arenavirus tri segmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5 y 6, en donde los dos segmentos L comprenden dos ORF heterólogos.

9. La partícula de arenavirus tri segmentada de la reivindicación 7 u 8, en donde al menos un ORF heterólogo codifica un antígeno (i) derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno; o (ii) seleccionados de antígenos del virus de inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígenos del virus de la varicela zóster, antígenos del citomegalovirus, antígenos de mycobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores.

10. La partícula de arenavirus tri segmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde al menos un ORF heterólogo codifica una proteína fluorescente.

11. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 10, en donde la proteína fluorescente es proteína verde fluorescente (GFP) o proteína roja fluorescente (RFP).

12. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 11, en donde los dos ORF heterólogos codifican cada uno g Fp .

13. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 11, en donde un ORF heterólogo codifica GFP y un ORF heterólogo codifica RFP.

14. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 1, en donde un primer segmento S está preparado por ingeniería para portar un ORF que codifica GP en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus y un ORF heterólogo que codifica un primer gen de interés en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus y un segundo segmento S está preparado por ingeniería para portar un o Rf que codifica NP en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus y un ORF heterólogo que codifica un segundo gen de interés en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus.

15. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 1, en donde un primer segmento S está preparado por ingeniería para portar un ORF que codifica GP en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus y un ORF heterólogo que codifica un primer gen de interés en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus y un segundo segmento S está preparado por ingeniería para portar un ORF que codifica NP en una posición bajo el control de una 5' UTR de arenavirus y un ORF heterólogo que codifica un segundo gen de interés en una posición bajo el control de una 3' UTR de arenavirus.

16. La partícula de arenavirus trisegmentada de la reivindicación 14 o 15, en donde el gen de interés codifica un antígeno (i) derivado de un organismo infeccioso, tumor o alergeno; o (ii) seleccionados de antígenos del virus de inmunodeficiencia humana, antígenos del virus de la hepatitis C, antígenos del virus de la varicela zóster, antígenos del citomegalovirus, antígenos de mycobacterium tuberculosis y antígenos asociados a tumores.

17. La partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la partícula de arenavirus trisegmentada deriva de LCMV.

18. Un ADNc del genoma de la partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Un vector de expresión de ADN que comprende el ADNc de la reivindicación 18.

20. Una célula huésped que comprende la partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, el ADNc de la reivindicación 18 o el vector de la reivindicación 19.

21. Un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1,3 y 5, en donde el método comprende:

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

22. Un método para generar la partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 y 5, en donde el método comprende:

(iii) recoger la partícula de arenavirus.

23. Una vacuna que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

24. Una composición farmacéutica que comprende una partícula de arenavirus trisegmentada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.