ES2811139T3 - Sistema de expresión génica inducible por D-aminoácido para Rhodosporidium y Rhodotorula - Google Patents

Abstract

Un sistema de expresión génica inducible por D-aminoácido operable en una célula fúngica transgénica que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un promotor inducible por D-aminoácido ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo, en el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en: (a) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:94; (b) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:95; (c) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:96; (d) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:97; y (e) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:5 y en el que la construcción de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:7.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de expresión génica inducible por D-aminoácido para Rhodosporidium y Rhodotorula

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud está relacionada y reivindica prioridad a la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. de serie 62/142.788 presentada el 3 de abril de 2015.

Presentación de la lista de secuencias

La presente solicitud se está presentando junto con un Listado de Secuencias en formato electrónico. El Listado de secuencias se titula 2577248PCTSequenceListing.txt, creado el 12 de enero de 2016 y tiene un tamaño de 125 kb. La información en el formato electrónico del listado de secuencias se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología fúngica, más particularmente a un sistema de expresión génica inducible fuerte en especies fúngicas, tales como el género Rhodosporidium o Rhodotorula.

Las publicaciones y otros materiales utilizados en este documento para iluminar los antecedentes de la invención, y en particular, los casos para proporcionar detalles adicionales con respecto a la práctica, se mencionan por conveniencia en el siguiente texto por autor y fecha y se enumeran alfabéticamente por autor en la bibliografía adjunta.

Rhodosporidium y Rhodotorula son dos géneros de hongos estrechamente relacionados que pertenecen al subfilo Pucciniomycotina de la Basidiomycota. Ambos a menudo se aíslan como levadura productora de aceite o carotenoides (1). Debido a su capacidad para cultivarse a una densidad celular extremadamente alta (>100 g/l de masa de células secas) y acumular más del 60 % de biomasa como triglicéridos, Rhodosporidium y Rhodotorula son huéspedes fúngicos con gran potencial biotecnológico (2-4). Hacia este objetivo, hemos establecido sistemas eficientes para la transformación genética, el bloqueo de genes y la expresión de proteínas constitutivas fuertes (5-7). Sin embargo, no existen promotores efectivos para la expresión génica en Rhodosporidium y Rhodotorula hasta la fecha. Esto se convierte en un importante cuello de botella en la ingeniería metabólica en estos huéspedes (8-10).

La D-aminoácido oxidasa (DAAO, EC 1.4.3.3) es una flavoenzima que cataliza específicamente la desaminación oxidativa de D-aminoácidos a a-cetoácidos, amoníaco y peróxido de hidrógeno (Figura 1). La actividad DAAO ha sido ampliamente identificada, desde bacterias, hongos hasta animales [11]. DAAO es mejor conocido por su uso en la producción de cefalosporina, un antibiótico con un mercado global anual de ~200 millones de dólares estadounidenses (12).

El Rhodosporidium toruloides y el Rhodotorula gracilis DAAO es una proteína peroxisomal que ha sido bien documentada desde 1987 (13). Estudios recientes de R. toruloides Dao1 se centran principalmente en su expresión heteróloga (14), propiedades enzimáticas (15-18) e inmovilización (19-22). Se ha informado que las transcripciones del ARNm de DAO1 alcanzan su punto máximo dentro de las 12 horas posteriores a la inducción con D-alanina y la proteína Dao1 puede representar el 1.0 % de las proteínas intracelulares solubles (23), sin embargo, no hay información sobre cómo la propiedad inducible de D-aminoácidos del gen DAO1 puede ser explotado para solicitudes biotecnológicas. Los promotores inducibles de D-aminoácido se divulgan en “Rhodotorula gracilis mRNAfor D-amino acid oxidase”, EMBL, (19970701), No. de acceso a la base de datos. Z71657, URL: EBI, XP002778037; “Rhodosporidium toruloides D-amino acid oxidase encoding genomic DNA”, Geneseq, (19990604), No. de acceso a la base de datos. AAX19101, URL: EBI, XP002778038 y Alonso Jorge et al., “D-amino-acid oxidase gene from Rhodotorula gracilis (Rhodosporidium toruloides) ATCC 26217”, MICROBIOLOGY (READING), (199804), vol. 144, No. 4, ISSN 1350-0872, páginas 1095 - 1101. El documento US 6 187 574 B1 divulga un proceso para producir la enzima D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis en células huésped.

El ARN pequeño de interferencia (ARNsi) es una clase de moléculas de ARN de cadena doble, de 20-25 pares de bases de longitud. El ARNsi interfiere con la expresión de genes específicos con secuencias de nucleótidos complementarias que hacen que el ARNm se descomponga después de la transcripción, lo que no produce traducción. Los ARNsi se producen a partir de ARN de cadena doble, por ejemplo, a partir de una repetición invertida de una secuencia de ARN y típicamente los pares base perfectamente inducen la división del ARNm solo en un único objetivo de ARNm específico (24). Los microARN (miARN) son ARN no codificantes codificados genómicamente que ayudan a regular la expresión génica, particularmente durante el desarrollo. Los miARN maduros son estructuralmente similares a los ARNsi producidos a partir de ARNds exógeno, excepto que se expresan a partir de un gen codificador de ARN mucho más largo como una transcripción primaria conocida como pre-miARN que se procesa, en el núcleo celular, a una estructura tallo-bucle llamada un pre-miARN por el complejo microprocesador. Una región del pri-miARN es parcialmente autocomplementaria, lo que permite que la transcripción se pliegue sobre sí misma para formar una estructura de tallo bucle de ARNds imperfectamente. La tecnología de miARN artificial (ARNami) utiliza pri-miARN endógenos, en los que las secuencias de miARN y miARN* (cadena pasajera del dúplex de miARN) se han reemplazado por secuencias de amiARN/amiARN* correspondientes que dirigen el silenciamiento de ARN altamente eficiente del gen objetivo (25). Los miARN suelen tener un emparejamiento de bases incompleto con un objetivo e inhiben la traducción de múltiples ARNm diferentes con secuencias similares.

Se desea identificar promotores inducibles y crear construcciones de ácido nucleico que sean útiles para introducir en especies fúngicas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología fúngica, más particularmente a un sistema de expresión génica inducible fuerte en especies fúngicas, tales como el género Rhodosporidium o Rhodotorula.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un promotor inducible para la expresión de un polinucleótido heterólogo en una especie fúngica. En una realización, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 82 % de identidad con el nucleótido establecido en SEQ ID NO: 94. En otra realización, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 82 % de identidad con el nucleótido establecido en SEQ ID NO: 95. En una realización adicional, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 82 % de identidad con el nucleótido establecido en SEQ ID NO: 96. En otra realización, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 82 % de identidad con el nucleótido establecido en SEQ ID NO: 97. En una realización adicional, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 82 % de identidad con el nucleótido establecido en SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el promotor incluye un motivo de ADN, a veces denominado en el presente documento el motivo de ADN promotor. En una realización, el motivo de ADN promotor comprende la secuencia consenso AGGNNGNA GN11GANGANGG (SEQ ID NO: 6). En otra realización, el motivo de a Dn promotor tiene al menos un 75 % de identidad con los nucleótidos específicamente identificados de la secuencia consenso, es decir, los A y G especificados. En algunas realizaciones, el promotor inducible es inducible por un D-aminoácido. En otras realizaciones, el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D-serina, D-valina o D-prolina.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico. En una realización, la construcción de ácido nucleico comprende un promotor inducible, como se describe en el presente documento, unido operativamente a un polinucleótido heterólogo. En otra realización, el polinucleótido está operativamente unido a un terminador de transcripción. En una realización adicional, el terminador de transcripción es operable en una especie fúngica. De acuerdo con el primer aspecto, la construcción de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos rica en CT que tiene al menos un 75 % de identidad con la secuencia consenso T(T/C)TCCC(T/C)CTCC(T/C)CCCCA C(A/T)(C/T)CCGA (SEQ ID NO: 7).

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos rica en CT es un intrón. En una realización, el intrón se inserta, posiciona o localiza ascendente o dentro de la región de extremo 5' o región 5' del polinucleótido en la construcción de ácido nucleico. En otra realización, el intrón se inserta en el 5' UTR del promotor inducible. En otras realizaciones, el intrón incluye un motivo de ADN, a veces denominado en el presente documento el motivo de intrón de ADN. En una realización, el motivo del intrón de ADN comprende la secuencia de nucleótidos rica en CT. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos rica en CT está contenida dentro de la secuencia de codificación de un polinucleótido heterólogo en la construcción de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos rica en CT puede abarcar un intrón y los nucleótidos del promotor y/o polinucleótido heterólogo que rodea al intrón. En algunas realizaciones, el polinucleótido heterólogo codifica una proteína de interés. En otras realizaciones, el polinucleótido heterólogo codifica una molécula de ARN para regular negativamente un gen diana de interés.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula fúngica que comprende la construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, la célula fúngica es una célula de una especie del género Rhodosporidium. En otra realización, la célula fúngica es una célula de una especie del género Rhodotorula. En algunas realizaciones, la construcción de ácido nucleico está integrada de manera estable en el genoma de la célula fúngica. En otras realizaciones, la célula fúngica es parte de una composición que también comprende un medio de cultivo.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar y usar una especie fúngica que comprende la construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, un método para preparar la especie fúngica comprende introducir la construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento en una célula fúngica y seleccionar una célula fúngica que tenga el ácido nucleico integrado de manera estable en su genoma. En otra realización, un método para usar las especies fúngicas comprende cultivar las especies fúngicas que comprenden la construcción de ácido nucleico descrita en este documento en un medio que contiene un D-aminoácido. En algunas realizaciones, el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D-serina, D-valina o D-prolina.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un esquema que ilustra la reacción catalizada por la D-aminoácido oxidasa. La reacción reductora requiere cofactor FAD, que es oxidado de nuevo por el oxígeno molecular para dar peróxido de hidrógeno. El iminoácido se hidroliza espontáneamente al correspondiente cetoácido y amoníaco.

Las figuras 2A-2D muestran vectores binarios y la estructura promotora DAO1 utilizada en ciertas realizaciones de la presente invención. Figura 2A: región de ADN-T del plásmido reportero GFP pKC1, el plásmido reportero luciferasa pKCL2, y la estrategia de inserción del casete del gen reportero al alelo CAR2 de R. toruloides. Figura 2B: región de ADN-T de la serie de plásmidos pKCLDx con el gen reportero de luciferasa RtLUC-2. Figura 2C: secuencia promotora de DAO1 parcial que incluye el primer intrón (SEQ ID NO: 8). Se muestra la ubicación de la posición de inicio de la transcripción de ARNm (tsp), la región no traducida 5'(5'UTR), la región rica en CT (caja ct), el intrón 1 y la secuencia de péptido terminal N (SEQ ID NO: 87). La secuencia peptídica completa de la proteína Dao1 se establece en SEQ ID NO: 88. Figura 2D: Candidatos transformantes albinos seleccionados visualmente en los medios de selección. Las figuras 3A-3B muestran genes y proteínas DAO1 putativas del subfilo Pucciniomycotina y Ustilagiomycotina. Figura 3A: Diagramas esquemáticos obtenidos para los genes DAO1 (SEQ ID NOs: 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 y 29). Figura 3B: Análisis de árbol filogenético obtenido para proteínas Dao1 (SEQ ID NOs: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 y 30).

Las figuras 4A-4C muestran los perfiles de transcripción de DAO1 en R. toruloides. Figura 4A: Análisis de transferencia Southern de copias del gen DAO1 en R. toruloides. La sonda de ADN marcada con digoxigenina se amplificó utilizando la plantilla de ADN genómico y oligos DAO1f y DAO1r (Tabla 1), y se mostró en la Figura 2A. Figura 4B: niveles de ARNm de DAO1 a las 3 y 6 horas después de la inducción con 70 mM de D o L-alanina. Fuentes de carbono y nitrógeno utilizadas: CTL - glucosa y sulfato de amonio; L-ala - glucosa y L-alanina; D-ala - glucosa y D-alanina; solo D-ala - D-alanina solamente. Figura 4C: niveles de ARNm de DAO1 en células de R. toruloides cultivadas en medio YPD bajo diversas condiciones de estrés durante 6 horas. CTL - cultivado en caldo YPD a 28 °C; Estrés oxidativo: cultivado en caldo YPD suplementado con H2O2 al 1 % (p/v) a 28 °C; Estrés en frío - cultivado en caldo YPD a 4 °C; Estrés térmico: cultivado en caldo YPD a 37 °C; Estrés osmático: cultivado en caldo YPD suplementado con 1 M KC1 a 28 °C; Glicerol - cultivado en caldo YPG (fuente de carbono de glucosa en YPD reemplazada por la misma concentración de glicerol) a 28 °C.

Las figuras 5A-5C muestran el análisis de secuencias ascendentes de 1.0 kb de DAO1 de especies de Pucciniomycotina. Figura 5A: Localización de tres motivos altamente conservados en las secuencias ascendentes de DAO1. Secuencias examinadas: Rt1 - R. toruloides ATCC 10657 (SEQ ID NO: 31); Rt3 - R. toruloides MTCC 457 (SEQ ID NO: 32); Rt4 - R. toruloides NP11 (SEQ ID NO: 33); Rg2 - R. glutinis ATCC 204091 (SEQ ID NO: 34); Rg3 -R. graminis WP1 (SEQ ID NO: 35); Sr - S. roseus (SEQ ID NO: 36); Pt - P. tritartic (SEQ ID NO: 37); Pg - P. graminis (SEQ ID NO: 38); Rm - R. minuta (SEQ ID NO: 39); S1 - S. linerdae (SEQ ID NO: 40); Um - U. maydis (SEQ ID NO: 41); Sr2 - S. reilianum (SEQ ID NO: 42); M1 - Melampsora laricis-populina (SEQ ID n O: 43) se usó para la alineación de secuencias múltiples pero no tiene los motivos de consenso como se muestra. Figura 5B: Logos de secuencia de nucleótidos de los motivos examinados (motivo 1: SEQ ID NO: 91; motivo 2: SEQ ID NO: 92; motivo 3: SEQ ID NO: 93). Figura 5C: Alineación de las secuencias del motivo 1 entre las secuencias ascendentes de DAO1. Las secuencias se establecen de la siguiente manera: Rg3 - SEQ ID NO: 44; Um - SEQ ID NO: 45; Sr2 - SEQ ID NO: 46; Sr - SEQ ID NO: 47; Rg2 - SEQ ID NO: 48; Rt1 - SEQ ID NO: 49; S1 - SEQ ID NO: 50; Consenso - SEQ ID NO: 6

Las figuras 6A-6C muestran la disección funcional del promotor DAO1. Figura 6A: Diagrama esquemático de eliminaciones en serie del promotor DAO1. Todos los promotores se clonaron en pKCLDx (Figura 2B), donde x indica diferentes versiones de la secuencia ascendente de DAO1. P^{d a o i}: secuencia ascendente de 2021 pb de DAO1 sin intrón 1; PDAoiin: secuencia ascendente de 2175 pb DAO1 incluyendo intrón 1 (SEQ ID NO: 1 sin sitio NcoI); PDAoiint: igual que PDAoiin excepto que el motivo 1 se elimina. PDAOlin2 a PDAoiin6 son eliminaciones en serie del 5', con una longitud de 1655, 1157, 953, 663 y 354 pb, respectivamente. Se usó un gen de luciferasa adaptado al codón (RtLUC-2, SEQ ID NO: 51) como el reportero para la actividad promotora. Figura 6B: Efecto del intrón 1 y el motivo 1 sobre la actividad del promotor DAO1. Las células se cultivaron durante 21 horas en medio MinAB suplementado con D-alanina o L-alanina. Figura 6C: Efectos de las supresiones de la secuencia 5' sobre la actividad PDAoiin. RPA: actividad promotora relativa; GPD1: promotor endógeno de 795 pb de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; Sin P: construcción de control negativo donde el RtLUC-2: T35S no está fusionado con ningún promotor; D-ala y L-ala: las células se cultivaron en medio con D- y L-alanina, respectivamente.

Las figuras 7A-7D muestran los efectos de fuentes adicionales de carbono o nitrógeno en las actividades del promotor DAO1. Figura 7A: Efectos de diferentes medios. El medio basal MinAB se suplementó con la fuente de carbono o nitrógeno designada y el extracto de proteína se hizo a partir de cultivos de 21 horas. Abreviaturas: G - Glucosa (10 g/l); AS - Sulfato de amonio (70 mM); D - D-alanina (70 mM); L - L-alanina (70 mM). Figura 7B: Efectos de las concentraciones de D-alanina. Se suplementaron 10 g/l de glucosa y diferentes concentraciones de D-alanina en el medio basal MinAB. Figura 7C: Efectos de las concentraciones de glucosa. 70 mM de D-alanina y diferentes concentraciones de D-alanina se supleplementaron con el medio basal MinAB. Figura 7D: Efectos de las concentraciones de sulfato de amonio. 10 g/l de glucosa, 70 mM de D-alanina y diferentes concentraciones de sulfato de amonio fueron suplementados al medio basal MinAB. Todos los experimentos se realizaron por triplicado biológico y RPA representa la lectura relativa de la actividad luciferasa.

La figura 8 muestra los efectos de diferentes D-aminoácidos sobre la inducción del promotor DAO1. Todas las actividades del promotor se ensayaron después de la inducción de 21 h y cada aminoácido se suplementó como la única fuente de carbono y nitrógeno para el medio MinAB con la misma concentración de 70 mM.

Las figuras 9A-9C muestran el análisis de las primeras secuencias de intrones de DAO1 de la especie de Rhodosporidium/Rhodotorula. Figura 9A: Alineamiento del intrón 1 secuencias parciales 5'. Las secuencias utilizadas son: Rg2 - R. glutinis ATCC 204091 (SEQ ID NO: 52); R. toruloides MTCC 457 (SEQ ID NO: 53); R. toruloides NP11 (SEQ ID NO: 54); R. graminis WP1 (SEQ ID NO: 55). Las secuencias de intrones completas se establecen en la SEQ ID NOs: 56-59, respectivamente. Figura 9B: Logos de la secuencia de nucleótidos del motivo 2. Figura 9C: mutantes PüAO1in de actividades promotoras. DAO1in: versión de 0,7 kb del promotor que contiene intrón 1; DAO1in2: como DAO1m, excepto que el codón de iniciación de la traducción se cambió a ATC para que no se traduzcan residuos N-terminales adicionales en la proteína a expresar; DAO1 in3: como DAO1 in2, excepto que todos los residuos de citosina en el motivo 2 se cambiaron a adenina; DAO1in4 DAO1in2 excepto que se eliminó el motivo 2 de 24 nt.

Las figuras 10A-C muestran los efectos del bloqueo de DAO1 sobre la actividad del promotor DAO1in. Figura 10A: Análisis de transferencia Southern de mutantes de supresión DAO1. El ADN genómico (2 |jg) se digirió con PstI y se hibridó contra la sonda marcada con digoxigenina de DAO1R (sonda 2 en la Figura 2A). Figura 10B: Crecimiento de mutante nulo DAO1 en medio YNB suplementado con D-alanina o L-alanina como única fuente de carbono. Figura 10C: Comparación de la actividad del promotor DAOlin en diversos medios en el mutante de bloqueo de Wt y DAO1 Adaol. Las células de inserción WT y Adaol con el reportero LUC2 del promotor DAO1 de 2.2 kb (PüAOiin) en el locus CAR2 se cultivaron en MinAB suplementados con (combinación de ) diversas combinaciones de glucosa (10g/l), sulfato de amonio (70 mM), D -alanina (D-ala) y L-alanina (70 mM). La inducción con menor concentración de D-alanina (10 mM y 1 mM) se muestra en el lado derecho de la Figura 10C.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología fúngica, más particularmente a un sistema de expresión génica inducible fuerte en especies fúngicas, tales como el género Rhodosporidium o Rhodotorula.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la invención.

El término “alrededor” o “aproximadamente” significa dentro de un rango estadísticamente significativo de un valor. Tal rango puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50 %, más preferiblemente dentro del 20 %, aún más preferiblemente dentro del 10 %, y aún más preferiblemente dentro del 5 % de un valor o rango dado. La variación permisible abarcada por el término “alrededor” o “aproximadamente” depende del sistema particular en estudio, y puede ser fácilmente apreciada por un experto en la materia.

Como se usa en el presente documento, “alelo” se refiere a cualquiera de una o más formas alternativas de un locus génico, todos cuyos alelos se relacionan con un rasgo o característica. En una célula u organismo diploide, los dos alelos de un gen dado ocupan los loci correspondientes en un par de cromosomas homólogos.

Los “niveles alterados” se refieren a la producción de producto(s) génico(s) en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las de los organismos normales, de control o no transformados.

La “secuencia de codificación” se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos específica.

Un “control” u “hongo de control” o “célula fúngica de control” proporciona un punto de referencia para medir cambios en el fenotipo de una célula de hongo o fúngica objeto en el que se ha efectuado alteración genética, tal como transformación, en un polinucleótido de interés. Una célula de hongo o fúngica objeto puede descender de una célula de hongo o fúngica así alterada y comprenderá la alteración.

Una célula de hongo o fúngica de control puede comprender, por ejemplo: (a) un hongo de tipo silvestre o célula fúngica, es decir, del mismo genotipo que el material de partida para la alteración genética que resultó en la célula de hongo o fúngica objeto; (b) un hongo o célula fúngica del mismo genotipo que el material de partida pero que se ha transformado con una construcción nula (es decir, con una construcción que no tiene ningún efecto conocido sobre el rasgo de interés, tal como una construcción que comprende un gen marcador); (c) una célula de hongo o fúngica que es un segregante no transformado entre la progenie de una célula de hongo o fúngica objeto; (d) un hongo o célula fúngica genéticamente idéntico a la célula de hongo o fúngica objeto pero que no está expuesto a condiciones o estímulos que inducirían la expresión del polinucleótido de interés o (e) la célula de hongo o fúngica objeto en sí, bajo condiciones en que el polinucleótido de interés no se expresa.

“D-Aminoácido oxidasa” (DAAO, EC 1.4.3.3), “Dao1”, “polipéptido Dao1” y “proteína Dao1” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a una flavoenzima que cataliza específicamente la desaminación oxidativa de D-aminoácidos a a-cetoácidos, amoníaco y peróxido de hidrógeno.

“DAO1” y “gen DAO1” se usan indistintamente aquí para referirse a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido Dao1.

El “promotor DAO1” se refiere a una porción del gen DAO1 ascenente del sitio de inicio de la traducción que controla la transcripción del polipéptido Dao1 o cualquier ácido nucleico unido operativamente al promotor DAO1. En algunas realizaciones, el promotor DAO1 incluye la secuencia consenso AGGNNGNAGN11GANGANGG (SEQ ID NO: 6) donde N es cualquier desoxirribonucleótido. En otras realizaciones, el promotor DAO1 puede incluir nucleótidos aguas abajo del sitio de inicio de la traducción.

Un “ARNds” o “molécula de ARNi”, como se usa en el presente documento en el contexto de ARNi, se refiere a un compuesto, que es capaz de regular hacia abajo o reducir la expresión de un gen o la actividad del producto de dicho gen en un grado suficiente para lograr un efecto biológico o fisiológico deseado. El término “ARNds” o “molécula de ARNi”, como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más de un ARNds, ARNsi, ARNsh, ARNihp, ARNsh sintético, miARN.

El término “regulado hacia abajo” o de “regulación hacia abajo”, ya que se refiere a genes inhibidos por el método ARNi objeto, se refiere a una disminución en el nivel de expresión de uno o más genes en presencia de una o más construcción(es) de ARNi en comparación con el nivel en ausencia de dicha construcción(es) de ARNi. El término “regulado hacia abajo” se usa en el presente documento para indicar que la expresión del gen diana se reduce en 1­ 100 %. Por ejemplo, la expresión puede reducirse en aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 %.

“Expresión” se refiere a la producción de un producto funcional. Por ejemplo, la expresión de un fragmento de ácido nucleico puede referirse a la transcripción del fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, la transcripción que resulta en ARNm, ARN funcional, ARNds y similares) y/o la traducción de ARNm en un precursor o proteína madura.

Como se usa en el presente documento, “gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que abarca una región promotora 5' asociada con la expresión del producto génico, cualquier región de intrón y exón y regiones 3' o 5' no traducidas asociadas con la expresión del producto génico.

El término “silenciamiento génico” se refiere a la supresión de la expresión génica, por ejemplo, transgén, gen heterólogo y/o expresión génica endógena. El silenciamiento génico puede estar mediado por procesos que afectan la transcripción y/o por procesos que afectan los mecanismos postranscripcionales. El silenciamiento génico puede ser específico de un alelo en el que se produce el silenciamiento específico de un alelo de un gen.

“Heterólogo” con respecto a la secuencia significa una secuencia que se origina de una especie extraña, o, si es de la misma especie, se modifica sustancialmente de su forma nativa en composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada.

“ Introducido” en el contexto de insertar un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de ADN recombinante) en una célula, significa “transfección” o “transformación” o “transducción” e incluye referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula eucariota o procariota donde el fragmento de ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (p. ej., cromosoma, plásmido, plastidio o ADN mitocondrial), convertirse en un replicón autónomo o expresarse de forma transitoria (p. ej., ARNm transfectado).

“ Intron”, como se usa en el presente documento, se refiere a un intrón que se inserta, posiciona o localiza ascendente o dentro del extremo 5' de un polinucleótido en una construcción de ácido nucleico como se describe en el presente documento. El intrón puede aislarse de un gen, como un gen fúngico o puede sintetizarse en base a intrones conocidos.

El término “unido operablemente” o “unido operativamente” se define en el presente documento como una configuración en la que una secuencia reguladora o de control se coloca apropiadamente en una posición relativa a la secuencia de polinucleótidos de la construcción de ácido nucleico de tal manera que la secuencia de control dirige la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Las secuencias reguladoras o de control pueden colocarse en el lado 5' de la secuencia de nucleótidos o en el lado 3' de la secuencia de nucleótidos, como es bien conocido en la técnica.

La “sobre-expresión” o “sobreexpresión” se refiere a la producción de un producto génico en organismos transgénicos que excede los niveles de producción en organismos normales, de control o no transformados.

Los términos “polinucleótido,” ácido nucleico “y” molécula de ácido nucleico se usan indistintamente en la presente memoria para referirse a un polímero de nucleótidos que puede ser una matriz lineal o sintética natural y secuencial de nucleótidos y/o nucleósidos, incluyendo ácido desoxirribonucleico, ácido ribonucleico y derivados del mismo. Éste incluye ADN cromosómico, plásmidos autorreplicantes, polímeros infecciosos de ADN o ARN y ADN o ARN que desempeñan un papel principalmente estructural. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos o el polinucleótido se escriben de izquierda a derecha en una orientación de 5' a 3', se hace referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. El “ácido nucleico” también puede contener opcionalmente bases de nucleótidos no naturales o alteradas que permiten la lectura correcta por una polimerasa y no reducen la expresión del ácido nucleico.

Los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales. Los aminoácidos pueden ser referidos por sus símbolos de tres letras o de una letra comúnmente conocidos. Las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación de amino a carboxilo, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango.

La “progenie” comprende cualquier generación posterior de un hongo.

“Promotor” se refiere a un fragmento de ácido nucleico capaz de controlar la transcripción de otro fragmento de ácido nucleico.

“Recombinante” se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otra manera, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. “Recombinante” también incluye referencia a una célula o vector, que ha sido modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o una célula derivada de una célula así modificada, pero no abarca la alteración de la célula o el vector por eventos naturales (p. ej., mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) como las que ocurren sin intervención humana deliberada.

La “construcción de ADN recombinante” se refiere a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que normalmente no se encuentran juntos en la naturaleza. En consecuencia, una construcción de ADN recombinante puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que normalmente se encuentra en la naturaleza. Los términos “construcción de ADN recombinante”, “construcción recombinante” y “construcción de ácido nucleico” se usan indistintamente en el presente documento.

Las “secuencias reguladoras” se refieren a secuencias de nucleótidos ubicadas en la dirección de ascenso (secuencias no codificantes 5'), dentro o aguas abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y que influencian en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN, o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líderes de traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de poliadenilación. Los términos “secuencia reguladora” y “elemento regulador” se usan indistintamente en el presente documento.

Una “célula transformada” es cualquier célula en la que se ha introducido un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de ADN recombinante).

La “transformación” como se usa en el presente documento se refiere tanto a la transformación estable como a la transformación transitoria.

La “transformación estable” se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo huésped que da como resultado una herencia genéticamente estable. Una vez transformado de manera estable, el fragmento de ácido nucleico se integra de manera estable en el genoma del organismo huésped y en cualquier generación posterior.

El término “expresión fuerte” como se usa en el presente documento significa la expresión de una proteína marcadora, ARNm, ARNsi (ARN de pequeña interferencia) o miARN (microARN) a un nivel detectable usando métodos de detección conocidos, por ejemplo, fluorescencia para GFP y luciferasa, ensayo de actividad para GUS y lacZ, transferencias Northern o transferencias Western.

La “transformación transitoria” se refiere a la introducción de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo, u orgánulo que contiene ADN, de un organismo huésped que da como resultado la expresión génica sin herencia genéticamente estable.

El “hongo transgénico” incluye la referencia a un hongo que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Por ejemplo, el polinucleótido heterólogo se integra de manera estable dentro del genoma de manera que el polinucleótido se pasa a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede integrarse en el genoma solo o como parte de una construcción de ADN recombinante.

Como se usa en el presente documento, el término “ identidad de secuencia”, “similitud de secuencia” u “homología” se usa para describir relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos. El porcentaje de “ identidad de secuencia” entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, como la longitud completa de una SEQ ID NO: referenciada, en la que la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que se produce una base de ácido nucleico o residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se dice que una secuencia que es idéntica en cada posición en comparación con una secuencia de referencia es idéntica a la secuencia de referencia y viceversa. Se dice que una primera secuencia de nucleótidos cuando se observa en la dirección 5' a 3' es un “complemento” de, o complementaria a, una segunda o secuencia de nucleótidos de referencia observada en la dirección 3' a 5' si la primera secuencia de nucleótidos muestra completa complementariedad con la segunda secuencia de referencia. Como se usa en el presente documento, se dice que las moléculas de secuencia de ácido nucleico exhiben “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las secuencias leídas 5' a 3' es complementaria a cada nucleótido de la otra secuencia cuando se leen 3' a 5'. Una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de referencia exhibirá una secuencia idéntica a la secuencia del complemento inverso de la secuencia de nucleótidos de referencia. Estos términos y descripciones están bien definidos en la técnica y los expertos en la materia los entienden fácilmente.

Las alineaciones de secuencia y los cálculos de porcentaje de identidad pueden determinarse usando una variedad de métodos de comparación diseñados para detectar secuencias homólogas que incluyen, pero no se limitan a, el programa Megalign® del paquete de computación bioinformático LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, WI) a menos que se indique lo contrario, la alineación múltiple de las secuencias proporcionadas en el presente documento se realizó utilizando el método de alineación Clustal V (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) con los parámetros predeterminados (PENALIZACIÓN DE ESPACIO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE ESPACIO = 10). Los parámetros predeterminados para las alineaciones por pares y el cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas utilizando el método Clustal V son Kt UPLE = 1, PENALIZACIÓN DE ESPACIO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos estos parámetros son KTUPLE = 2, PENALIZACIÓN DE ESPACIO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después de la alineación de las secuencias, utilizando el programa Clustal V, es posible obtener valores de “porcentaje de identidad” y “divergencia” al ver la tabla de “distancias de secuencia” en el mismo programa; a menos que se indique lo contrario, el porcentaje de identidades y divergencias proporcionadas y reivindicadas en este documento se calcularon de esta manera.

Como alternativa, se puede usar el método de alineación Clustal W. El método de alineación Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgins, DG et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)) se puede encontrar en el programa MegAlign™ v6.1 del paquete de computación bioinformático LASERGENE® (DNASTAR® Inc., Madison, Wis.). Los parámetros predeterminados para la alineación múltiple corresponden a PENALIZACIÓN DE ESPACIO = 10, PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE ESPACIO = 0.2, secuencias divergentes de demora = 30 %, peso de la transición de ADN = 0.5, Matriz de peso de la proteína = Gonnet Series, Matriz de peso de ADN = IUB. Para las alineaciones por pares, los parámetros predeterminados son Alineación = Precisión lenta, Penalización por espacio = 10.0, Longitud de espacio = 0.10, Matriz de peso de proteína = Gonnet 250 y Matriz de peso de ADN = iUb . Después de alinear las secuencias usando el programa Clustal W, es posible obtener valores de “porcentaje de identidad” y “divergencia” al ver la tabla de “distancias de secuencia” en el mismo programa.

Como se usa en el presente documento, el término “sustancialmente homólogo” u “homología sustancial”, con referencia a una secuencia de ácido nucleico, incluye una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones estrictas con una SEQ ID NO: referenciado o una porción o complemento de la misma, son aquellos que permiten que se produzca una alineación antiparalela entre las dos secuencias, y las dos secuencias pueden, en condiciones estrictas, formar enlaces de hidrógeno con las bases correspondientes en la cadena opuesta para formar una molécula dúplex que sea suficientemente estable en condiciones de rigurosidad apropiada, incluyendo alta rigurosidad, para ser detectable usando métodos bien conocidos en la técnica. Las secuencias sustancialmente homólogas pueden tener de aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 % de identidad de secuencia, o más preferiblemente de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 % de identidad de secuencia, o lo más preferible de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 % de identidad de secuencia, a aproximadamente 99 % de identidad de secuencia, a las secuencias de nucleótidos referentes como se establece en el listado de secuencias, o los complementos de las mismas. Alternativamente, las secuencias sustancialmente homólogas incluyen aquellas que hibridan en condiciones estrictas con las regiones objetivo de intrones de genes vegetales. Para condiciones rigurosas, vea la descripción en este documento y vea también las patentes estadounidenses números 8,455,716 y 8,536,403.

Se describen ahora realizaciones de la presente invención que incluyen promotores aislados, construcciones de ácido nucleico, composiciones (tales como hongos) que comprenden estas construcciones de ácido nucleico y métodos que utilizan estas construcciones de ácido nucleico.

Promotores aislados

La presente invención proporciona promotores aislados, inducibles para la expresión de un polinucleótido heterólogo en una especie fúngica:

En una realización, el promotor inducible comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basada en el método de alineación Clustal V o Clustal W, en comparación con la SEQ ID NO: 94.

En otra realización, el promotor inducible comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basado en el método de alineación Clustal V o Clustal W, en comparación con la SEQ ID NO: 95.

En una realización adicional, el promotor inducible comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basado en el método de alineación Clustal V o Clustal W, en comparación con la SEQ ID NO: 96.

En otra realización, el promotor inducible comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basado en el método de alineación Clustal V o Clustal W, en comparación con la SEQ ID NO: 97.

En otra realización, el promotor inducible comprende una secuencia de ácido nucleico de al menos 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, basado en el método de alineación Clustal V o Clustal W, en comparación con la SEQ ID NO: 5.

En una realización adicional, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos, en la que la secuencia de nucleótidos es hibridable en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que comprende el complemento completo de SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 o 5.

El término “bajo condiciones rigurosas” significa que dos secuencias hibridan bajo condiciones moderadamente o altamente rigurosas. Más específicamente, las condiciones moderadamente rigurosas pueden ser determinadas fácilmente por aquellos que tienen habilidades ordinarias en la técnica, por ejemplo, dependiendo de la longitud del ADN. Las condiciones básicas son establecidas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, capítulos 6 y 7, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001 e incluyen el uso de una solución de prelavado para filtros de nitrocelulosa 5xSSC, 0.5 % SDS , EDTA 1.0 mM (pH 8.0), condiciones de hibridación de aproximadamente 50 % de formamida, 2xSSC a 6xSSC a aproximadamente 40-50 °C (u otras soluciones de hibridación similares, como la solución de Stark, en aproximadamente 50 % de formamida a aproximadamente 42 °C) y condiciones de lavado de, por ejemplo, aproximadamente 40-60 °C, 0.5-6xSSC, 0.1 % SDS. Preferiblemente, las condiciones moderadamente rigurosas incluyen hibridación (y lavado) a aproximadamente 50 °C y 6xSSC. Los expertos en la técnica también pueden determinar fácilmente condiciones altamente rigurosas, por ejemplo, dependiendo de la longitud del ADN.

En general, tales condiciones incluyen hibridación y/o lavado a temperatura más alta y/o concentración de sal más baja (tal como hibridación a aproximadamente 65 °C, 6xSSC a 0.2xSSC, preferiblemente 6xSSC, más preferiblemente 2xSSC, lo más preferiblemente 0.2xSSC), en comparación con las condiciones moderadamente rigurosas. Por ejemplo, las condiciones altamente rigurosas pueden incluir hibridación como se definió anteriormente, y lavado a aproximadamente 65-68 °C, 0.2xSSC, 0.1 % SDS. El SSPE (1*SSPE es NaCl 0.15 M, NaH2PO410 mM y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) se puede sustituir por SSC (1*SSC es NaCl 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; el lavado se realiza durante 15 minutos después de que se completa la hibridación.

También es posible usar un kit de hibridación disponible comercialmente que no usa sustancia radiactiva como sonda. Ejemplos específicos incluyen la hibridación con un sistema de etiquetado directo y detección ECL (Amersham). Las condiciones rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación a 42 °C durante 4 horas usando el tampón de hibridación incluido en el kit, que se suplementa con reactivo de bloqueo al 5 % (p/v) y NaCl 0.5 M, y lavado dos veces en SDS al 0.4 %, 0.5xSSC a 55 °C durante 20 minutos y una vez en 2xSSC a temperatura ambiente durante 5 minutos.

En otra realización, el promotor inducible comprende una secuencia de nucleótidos, en la que la secuencia de nucleótidos se deriva de SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97 o 5 mediante la alteración de uno o más nucleótidos mediante al menos un método seleccionado del grupo que consiste de: supresión, sustitución, adición e inserción.

En algunas realizaciones, cada uno de los promotores inducibles anteriores incluye un motivo de ADN, a veces denominado en este documento como el motivo del ADN del promotor. En una realización, el motivo del ADN del promotor comprende la secuencia consenso AGGNNGNAGN11GANGANGG (SEQ ID NO: 6). En otra realización, el motivo de ADN promotor tiene al menos 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con los nucleótidos específicamente identificados de la secuencia consenso, es decir, los nucleótidos A y G especificados. En algunas realizaciones, el promotor inducible es inducible por un D-aminoácido. En otras realizaciones, el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D-serina, D-valina o D-prolina.

Las búsquedas en la base de datos y las búsquedas de homología de las bases de datos de genomas y nucleótidos se pueden usar para identificar promotores inducibles similares basados en la alineación de nucleótidos usando algoritmos o programas informáticos y estas técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.

Construcciones de ácido nucleico:

En un aspecto, la presente invención proporciona construcciones nucleicas.

En una realización, la construcción de ácido nucleico comprende un promotor inducible, como se describe en el presente documento, unido operativamente a un polinucleótido heterólogo. En otra realización, el polinucleótido está operativamente unido a un terminador de transcripción. En una realización adicional, el terminador de transcripción es operable en una especie fúngica. Los terminadores de la transcripción de genes que codifican proteínas se localizan típicamente aguas abajo (3') del gen, después del codón de parada (TGA, TAG o TAA). Los terminadores de la transcripción juegan un papel importante en el procesamiento y la estabilidad del ARN, así como en la traducción. La mayoría, pero no todos los terminadores de transcripción, contienen una secuencia de poliadenilación o un sitio de división.

De acuerdo con el primer aspecto, la construcción de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos rica en CT que tiene al menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia consenso T(T/C)TCCC(T/C)CTCC(T/C)CCCCAC(A/T)(C/T)CCGA(SEQ ID NO: 7).

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos rica en CT es un intrón. El intrón puede aislarse o derivarse de un gen, como un gen fúngico, o puede sintetizarse sobre la base de intrones conocidos. En algunas realizaciones, el intrón es el intrón 1 de un gen DAO1. En una realización, el gen DAO1 es un gen fúngico DAO1. En algunas realizaciones, el intrón incluye un motivo de ADN, a veces denominado en el presente documento el motivo de intrón de ADN. En una realización, el motivo de intrón ADN tiene al menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia consenso T(T/C)TCCC(T/C)CTCC(T/C)CCCCAC(A/T)(C/T)CCGA (SEQ ID NO: 7).

En una realización, el intrón se inserta, posiciona o localiza ascendente o dentro del extremo 5' de un polinucleótido en la construcción de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el intrón está operativamente unido al promotor inducible en su extremo 5' y está operativamente unido al polinucleótido heterólogo en su extremo 3'. En otra realización, el intrón se coloca dentro del extremo 5' o la región 5' del polinucleótido heterólogo. En una realización adicional, el intrón se inserta en el 5' UTR del promotor inducible.

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos rica en CT puede abarcar un intrón y los nucleótidos del promotor inducible y/o polinucleótido heterólogo que rodea el intrón.

En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos rica en CT está contenida dentro de la secuencia de codificación de un polinucleótido en la construcción de ácido nucleico. En una realización, la secuencia de nucleótidos rica en CT contenida dentro de la secuencia de codificación tiene al menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de consenso T(T/C)TCCC(T/C)CTCC(T/C)CCCCAC(A/T)(C/T)CCGA (SEQ ID NO: 7).

En algunas realizaciones, el polinucleótido heterólogo codifica una proteína de interés. Los ejemplos de proteínas de interés incluyen, pero no se limitan a, enzima de resistencia a antibióticos, enzima de resistencia a herbicida, GFP, GUS, lacZ, terpeno sintasa, ácido graso desaturasa, citocromo oxidasa P450, glucanasa, xilanasa, mananasa, manosidasa, glucosidasa, glucomananasa, xiluglucanasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa, hidroximetilglutaril-CoA reductasa, acetil-CoA C-acetiltransferasa, mevalonato quinasa, fosfomevalonato quinasa, difosfomevalonato decarboxilasa, isopentenil-difosfato delta-isomerasa, farnesil difosfato xintasa, geranilgeranil difosfato xintasa, metiltransferasa o glucosil transferasa, beta-carotenoide hidroxilasa y beta-carotenoide oxidasa.

En otras realizaciones, el polinucleótido heterólogo codifica una molécula de ARN para regular hacia abajo un gen diana de interés. La regulación hacia abajo de un gen diana se puede lograr mediante el uso de técnicas bien conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de ARNi, como ARNds, miARN, ARNsi, ARNsm, ARNhp o ARNihp (denominadas colectivamente moléculas de ARNi), supresión con sentido (cosupresión), antisentido y similares. Dichas técnicas se describen en la patente estadounidense número 7,312,323 y las referencias citadas en esta. Por ejemplo, la reducción podría lograrse, por ejemplo, con la transformación de una célula huésped fúngica para comprender un promotor y otras regiones reguladoras 5' y/o 3' descritas en el presente documento unidas a una secuencia de nucleótidos antisentido, horquilla, molécula interferente de ARN, ARN de cadena doble, microARN u otra molécula de ácido nucleico, de modo que la expresión de la molécula preferida por el tejido interfiera con la traducción del ARNm de la secuencia de ADN nativa o inhiba de otra forma la expresión de la secuencia de ADN nativo en células vegetales. Para obtener una descripción más detallada de las técnicas de ARNi o técnicas de microARN, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5,034,323; 6,326,527; 6,452,067; 6,573.099; 6,753,139; y 6,777,588. Véanse también las publicaciones internacionales Nos. WO 97/01952, WO 98/36083, WO 98/53083, WO 99/32619 y WO 01/75164; y las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE. UU. Nos. 2003/0175965, 2003/0175783, 2003/0180945, 2004/0214330, 2005/0244858, 2005/0277610, 2006/0130176, 2007/0265220, 2008/0313773, 2009/0094711, 2009/0215860, 2009/0308041, 2010/0058498 y 2011/0091975. Las moléculas de ARNi o las moléculas de microARN (denominadas colectivamente en el presente documento como moléculas de ARNi) pueden ser preparadas por un experto en la técnica utilizando técnicas bien conocidas en la técnica, incluidas técnicas para la selección y prueba de moléculas de ARNi y moléculas de microARN que son útiles para la regulación hacia abajo de un polinucleótido de la presente invención. Véase, por ejemplo, Wesley et al. (2001), Mysara et al. (2011) y Yan et al. (2012)

Por ejemplo, se puede preparar una construcción de ácido nucleico que incluye un polinucleótido que se transcribe en un a Rn que puede hibridarse a sí mismo, por ejemplo, un ARN de cadena doble que tiene una estructura de tallobucle. En algunas realizaciones, una cadena de la porción del tallo de un ARN de cadena doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de codificación con sentido, o un fragmento de la misma, de un gen diana, y que es de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 1.800 nucleótidos en longitud. La longitud de la secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de codificación con sentido puede ser de 10 nucleótidos a 1000 nucleótidos, de 15 nucleótidos a 600 nucleótidos, de 20 nucleótidos a 500 nucleótidos, o de 25 nucleótidos a 100 nucleótidos, o cualquier longitud dentro de los 10 nucleótidos a 2.500 nucleótidos. La otra cadena de la porción del tallo de un ARN de cadena doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la cadena antisentido, o un fragmento de la misma, de la secuencia codificante del gen diana, y puede tener una longitud que es más corta, la misma como, o más largo que la longitud correspondiente de la secuencia con sentido. En algunos casos, una cadena de la porción del tallo de un ARN de cadena doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la región no traducida 3' o 5', o un fragmento de la misma, del ARNm del gen diana, y la otra cadena de la porción del tallo del ARN de cadena doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la región no traducida 3' o 5', respectivamente, o un fragmento de la misma, del ARNm del gen diana. En otras realizaciones, una cadena de la porción del tallo de un ARN de cadena doble comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia de un intrón o un fragmento de la misma en el pre-ARNm transcrito del gen diana, y la otra cadena de la porción del tallo comprende una secuencia que es similar o idéntica a la secuencia que es complementaria a la secuencia del intrón o fragmento del mismo en el pre-ARNm.

La porción de bucle de un ARN de cadena doble puede ser de 3 nucleótidos a 5.000 nucleótidos, por ejemplo, de 3 nucleótidos a 2.500 nucleótidos, de 15 nucleótidos a 1.000 nucleótidos, de 20 nucleótidos a 500 nucleótidos, o de 25 nucleótidos a 200 nucleótidos, o cualquier longitud dentro de los 3 nucleótidos a 5.000 nucleótidos. La porción de bucle del ARN puede incluir un intrón o un fragmento del mismo. Un ARN de cadena doble puede tener cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más estructuras tallo-bucle.

La construcción de ácido nucleico puede incluir otras regiones reguladoras de la transcripción como se conocen bien en la técnica.

En algunas realizaciones, la construcción de ácido nucleico comprende además un marcador seleccionable. Los expertos en la técnica conocen bien los marcadores seleccionables, al igual que las construcciones de ácido nucleico que incorporan dichos marcadores y promotores seleccionables para impulsar su expresión, tal como se describe en la publicación de solicitud de patente internacional número WO 2012/169969. Cualquier promotor adecuado unido operativamente a cualquier marcador seleccionable adecuado puede usarse en la presente invención. En algunas realizaciones, los ejemplos de promotores adecuados para su uso con marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, promotores de los siguientes genes que codifican las siguientes proteínas: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GPD), proteína portadora de acil-CoA (ACP), ácido graso desaturasa, factor de elongación de traducción (TEF), piruvato descarboxilasa (PDC), enolasa (2-fosfoglicerato deshidratasa) (ENO), peptidilprolil isomerasa (PPI), acetil-CoA carboxilasa (ACC) o transaldolasa.

En una realización, la secuencia de codificación para el marcador seleccionable es una que existe de forma natural o creada artificialmente y contiene al menos aproximadamente 60 % de GC. En una segunda realización, la secuencia de codificación para el marcador seleccionable es una que existe de forma natural o creada artificialmente y contiene aproximadamente 70 % de GC. En una tercera realización, la secuencia de codificación para el marcador seleccionable es una que existe de forma natural o creada artificialmente y contiene aproximadamente 75 % de GC. En una realización, al menos aproximadamente el 70 % de los tripletes de codones de tales secuencias de codificación terminan con C o G. En otra realización, más de aproximadamente el 80 % de los tripletes de codones de tales secuencias de codificación terminan con C o G. En una realización, la secuencia de codificación para un marcador seleccionable es al menos 60 % de GC, preferiblemente aproximadamente 70 % de GC y lo más preferiblemente aproximadamente 75 % de GC en el que al menos el 70 % de los tripletes de codones terminan con C o G, preferiblemente más del 80 % de los tripletes de codón terminan con C o G. En una realización, tales secuencias de codificación están compuestas de codones UCG en al menos aproximadamente el 40 % del total de residuos de serina (Ser).

En algunas realizaciones, el marcador seleccionable es parte de un sistema libre de marcador de recombinación. En una realización, el sistema libre de marcador de recombinación es un sistema libre de marcador de recombinación Cre-lox, tal como se describe por Zuo et al. (2001). Tal sistema es útil para producir plantas transgénicas libres de marcadores de selección, incluyendo plantas transgénicas de Jatropha. En algunas realizaciones, el sistema libre de marcador de recombinación se coloca entre el promotor operable de la planta y el uno o más fragmentos de ácido nucleico. En esta realización, la eliminación del gen marcador por el evento de recombinación coloca al promotor operable de la planta en un enlace operable con el uno o más fragmentos de ácido nucleico como se describe aquí.

En la preparación de la construcción de ácido nucleico, los diversos fragmentos de ADN pueden manipularse, para proporcionar las secuencias de ADN en la orientación apropiada y, según sea apropiado, en el marco de lectura apropiado. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN u otras manipulaciones que pueden estar involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, eliminación de ADN superfluo, eliminación de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción, hibridación, restituciones, p. ej. transiciones y transversiones pueden estar involucradas.

Los ácidos nucleicos de la presente invención también se pueden sintetizar, total o parcialmente, especialmente cuando es deseable proporcionar secuencias preferidas por la planta, por métodos conocidos en la técnica. Por lo tanto, todos o una porción de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden sintetizarse usando codones preferidos por un huésped seleccionado. Los codones preferidos por especie pueden determinarse, por ejemplo, a partir de los codones utilizados con mayor frecuencia en las proteínas expresadas en una especie huésped particular. Otras modificaciones de las secuencias de nucleótidos pueden dar como resultados mutantes con actividad ligeramente alterada.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula fúngica que comprende la construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, la célula fúngica es una célula de una especie del género Rhodosporidium. En otra realización, la célula fúngica es una célula de una especie del género Rhodotorula. En algunas realizaciones, la construcción de ácido nucleico está integrada de manera estable en el genoma de la célula fúngica. En otras realizaciones, la célula fúngica es parte de una composición que también comprende un medio de cultivo.

Se pueden introducir una o más construcciones de ácido nucleico directamente en una célula fúngica usando técnicas tales como electroporación, bombardeo de partículas de ADN. Alternativamente, las construcciones de ácido nucleico pueden combinarse con regiones flanqueantes de ADN-T adecuadas e introducirse en un huésped de Agrobacterium tumefaciens, que entregará el casete génico en el genoma fúngico. Por lo tanto, se puede emplear cualquier método que proporcione una transformación/transfección efectiva de hongos. Véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,241,937, 7,273,966 y 7,291,765 y las Publicaciones de Solicitud de Patente de los Estados Unidos Nos. 2007/0231905 y 2008/0010704 y las referencias allí citadas. Véanse también, las solicitudes publicadas internacionales Nos. WO 2005/103271 y WO 2008/094127 y las referencias citadas en el mismo.

Puede ser útil generar un número de hongos transformados individuales con cualquier construcción recombinante para recuperar hongos libres de cualquier efecto posicional. También puede ser preferible seleccionar hongos que contengan más de una copia de la construcción nucleica introducida de manera que se obtengan altos niveles de expresión del polinucleótido.

Puede ser deseable producir líneas fúngicas que sean homocigóticas para un gen particular si es posible en la especie particular. En algunas especies, esto se logra mediante el uso de cultivos monoespora. Mediante el uso de estas técnicas, es posible producir una línea haploide que transporta el gen insertado y luego duplicar el número de cromosomas ya sea espontáneamente o mediante el uso de colchicina. Esto da lugar a un hongo que es homocigoto para el gen insertado, que puede analizarse fácilmente si el gen insertado lleva consigo un gen marcador de selección adecuado para la detección de hongos que llevan ese gen. Alternativamente, los hongos pueden autofertilizarse, lo que lleva a la producción de una mezcla de esporas que consta, en el caso más simple, de tres tipos, homocigotos (25 %), heterocigotos (50 %) y nulos (25 %) para el gen insertado. Aunque es relativamente fácil calificar los hongos nulos de aquellos que contienen el gen, es posible en la práctica calificar los hongos homocigotos de los heterocigóticos mediante análisis de transferencia Southern en el que se presta especial atención a la carga de cantidades exactamente equivalentes de ADN de la población mezclada y calificar de heterocigotos por la intensidad de la señal de una sonda específica para el gen insertado. Es aconsejable verificar los resultados del análisis de transferencia Southern permitiendo que cada transformante independiente se autofertilice, ya que se puede obtener evidencia adicional de homocigosidad por el simple hecho de que si los hongos eran homocigotos para el gen insertado, todas las líneas fúngicas posteriores del individuo mismo contendrán el gen, mientras que si el hongo era heterocigoto para el gen, la generación cultivada a partir de las semillas mismas contendrán líneas fúngicas nulas. Por lo tanto, con una misma simple, se pueden seleccionar líneas fúngicas homocigóticas que también se pueden confirmar mediante análisis de transferencia Southern.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para preparar y usar una especie fúngica que comprende la construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento. En una realización, un método para preparar la especie fúngica comprende introducir la construcción de ácido nucleico descrita en el presente documento en una célula fúngica y seleccionar una célula fúngica que tenga la construcción de ácido nucleico integrada de manera estable en su genoma. En otra realización, un método para usar las especies fúngicas comprende cultivar las especies fúngicas que comprenden la construcción de ácido nucleico descrita en este documento en un medio que contiene un D-aminoácido. En algunas realizaciones, el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D-serina, D-valina o D-prolina.

En algunas realizaciones, los hongos transformados se transfieren a medios de cultivo estándar (por ejemplo, medios nutrientes sólidos o líquidos, grano, vermiculita, compost, turba, madera, aserrín de madera, paja, etc.) y se hacen crecer o cultivan de una manera conocida por el experto. En una realización, el medio es medio minAB o medio minAB modificado para omitir la fuente de carbono y NH4NO3. En otras realizaciones, la expresión del polinucleótido de la construcción de ácido nucleico es inducida por la presencia de un D-aminoácido en los medios de crecimiento. En una realización, el D-aminoácido se agrega a los medios de cultivo antes de cultivar los hongos transformados. En otra realización, el D-aminoácido se agrega a los medios de cultivo después de que los hongos transformados se hayan agregado a los medios de cultivo. En algunas realizaciones, la cantidad de D-aminoácido en los medios de cultivo es de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 100 mM, preferiblemente de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 70 mM, más preferiblemente de aproximadamente 1.0 mM a aproximadamente 20 mM.

En una realización, los medios de hongos tradicionales se usan para cultivar los hongos transformados en los que los medios se han modificado para no contener o contener una cantidad baja de una fuente de carbono diferente o una cantidad baja de esta que no sea el D-aminoácido. En otra realización, los medios de hongos tradicionales se usan para cultivar los hongos transformados en los que los medios se han modificado para que no contengan o contengan una cantidad baja de una fuente de nitrógeno diferente del D-aminoácido. En algunas realizaciones, el cultivo celular se realiza preferiblemente a una temperatura de 25 °C a 35 °C.

En una realización, las construcciones inducibles DAO1 se introducen en una cepa de levadura con actividad reducida o nula (cero) de D-aminoácido oxidasa.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, genética, inmunología, biología celular, cultivo celular y biología transgénica, que están dentro de la habilidad de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, incluidas actualizaciones periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Russell, 1984, Molecular Biology of plants a laboratory course manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.); Anand, Techniques forthe Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, Nueva York, 1992); Guthrie y Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology (Academic Press, Nueva York, 1991); Harlow y Lane, 1988, Antibodies (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York); Nucleic Ácid Hybridization (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and translation (B. D. Hames y S. J. Higgins eds. 1984); Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Fire et al., RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development, Cambridge University Press, Cambridge, 2005; Schepers, RNA Interference in Practice, Wiley-VCH, 2005; Engelke, RNA Interference (RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology, DNA Press, 2003; Gott, RNA Interference, Editing, and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, Totowa, NJ, 2004; Sohail, Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application, CRC, 2004.

EJEMPLOS

La presente invención se describe mediante referencia a los siguientes Ejemplos, que se ofrecen a modo de ilustración y no pretenden limitar la invención de ninguna manera. Se utilizaron técnicas estándar bien conocidas en el arte de las técnicas específicamente descritas a continuación.

Ejemplo 1

Cepas, medio, y condiciones de cultivo

La cepa de R. toruloides ATCC 10657 se obtuvo de ATCC (EE.UU.). La Rhodotorula graminis WP1 se obtuvo del Fungal Genetics Stock Center (Universidad de Missouri, EE.UU.). R. toruloides se cultivó a 28 °C en caldo YPD (1 % de extracto de levadura, 2 % de peptona, 2 % de glucosa, p/v) o sobre agar de papa-dextrosa (PDA). Se utilizó la cepa de A. tumefaciens AGL1 (26) o Ag L2 (27) para el donante de T-ADN y se cultivó a 28 °C en medio 2YT líquido o sólido (1.6 % de triptona, 1 % de extracto de levadura, 0.5 % de NaCl). Escherichia coli XL1-Blue se cultivó en caldo Luria-Bertani (LB) o sobre agar LB y se utilizó para manipulaciones de ADN rutinarias.

Para los estudios de inducción génica, se utilizó MinAB modificado (MinAB) (28) con fuente de carbono y fuente de nitrógeno (NH4NO3) omitida como medio basal. La fuente de carbono (10 g/L de glucosa, L-alanina o D-alanina 70 mM) y la fuente de nitrógeno (sulfato de amonio 70 mM, L-alanina o D-alanina) se complementaron según se requirió. Para los tratamientos de estrés, el caldo YPD se utilizó como medio basal y se cultivó después de la suplementación de varios productos químicos, o en condiciones difíciles. A menos que se indique lo contrario, los cultivos celulares se realizaron en un agitador rotatorio a menos de 28 °C y 250 rpm.

Ejemplo 2

Construcciones de plásmidos

Los oligonucleótidos que se utilizaron se enumeran en la Tabla 1. Todas las enzimas de restricción y modificación se obtuvieron de New England Biolabs (NEB, Massachusetts, EE.UU.).

El plásmido pKC1 es un derivado de pPZP200 (29) que consiste en un casete resistente a higromicina (P GPDi-3.:hpt-3 ::Tsv40) y un casete indicador GFP (PGPDi::RtGFP::35T), en el que Pgpdi-3 y Pgpdi es el promotor de gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa de Rhodotorula graminis WP1 y R. toruloides ATCC 10657, respectivamente (Nos. de Acceso GenBank JQ806386 y JN208861, respectivamente) (30); hpt-3 (No. de Acceso GenBank JQ806387) y RtGFP (No. de Acceso Gen-Bank JQ806388) es el gen con codón optimizado que codifica la higromicina fosfotransferasa (Hpt) y eGFP, respectivamente (30); Tsv40 y T35s son el terminador del virus de simio 40 y del gen del virus del mosaico de coliflor 35S, respectivamente (Figura 2A).

El plásmido pKCL2 se derivó de pKC1 en el que el gen indicador RtGFP se reemplazó por un gen indicador de luciferasa con codón optimizado sintético RtLUC-2 que codifica la luciferasa de Photinus pyralis (No. de acceso de GenBank ACH53166). El fragmento de ADN SpeI-NcoI de 2.0 kb derivado de las regiones ascendentes de la secuencia de codificación DAO1 se obtuvo mediante amplificación por PCR utilizando la plantilla de ADN genómico de R. toruloides y oligos Rt290Sf y Rt309Nr (Tabla 1). Los productos de PCR se digirieron doblemente con SpeI-NcoI y se ligaron con el vector pKCL2 linealizado con SpeI-NcoI para crear el plásmido pKCLD1 (Figura 2B).

El promotor que contiene intrón de DAO1 (Pdaoir, 2.2 kb) se amplificó utilizando la misma plantilla y oligos Rt290Sf y Rt287Nr. El Pdaoir contiene la primera secuencia que codifica Daol de 40 nt del exón 1, intrón 1 de 108 nt y los primeros 6 nt del exón 2, dando lugar a residuos adicionales de 16 aa (MHSQKRVVVLGSGVIA; SEQ ID NO: 86) a cualquier proteína expresada por el promotor, el último aminoácido se cambió del 17avo residuo (G17) a alanina debido a la introducción de un sitio Ncol para la clonación de genes de interés (Figura 2C). Los productos de PCR tratados con SpeI-NcoI de Pdaoir se ligaron con el vector pKCL2 digerido de manera similar para crear el plásmido pKCLD2.

Para elaborar el promotor mutante suprimido con el motivo 1 (PDAoiint, 2.2 kb, Figura 5A y 6A), se realizó una PCR de fusión de las secuencias de ADN ascendentes y descendentes adyacentes al motivo 1 de consenso DAO1. La secuencia ascendente se amplificó utilizando pKCLD2 como plantilla y par de oligo SFGFPSEQ/Rt312 mientras que la secuencia de ADN descendente utilizó Rt311/35STer como los cebadores. Posteriormente, los dos fragmentos de PCR se fusionaron mediante PCR utilizando oligos Rt290Sf y Rt287Nr como se describió anteriormente (31). Los productos de PCR de 2.2 kb resultantes se digirieron con SpeI-NcoI y se ligaron con el vector pKCL2 digerido de forma similar para crear el plásmido pKCLD3.

Se elaboró un vector de control negativo RtLUC-2 sin promotor, pKCL20, mediante autoligación del vector SpeI-NcoI-cortado y pKCL2 de extremo romo. Para la construcción de plásmidos indicadores de promotores truncados en serie, se amplificó Pdaoir con 1.7 kb, 1.2 kb, 1.0 kb, 0.7 kb y 0.4 kb utilizando pKCLD2 como la plantilla, Rt287Nr como cebador inverso y Rt315S, Rt314S, Rt120S, Rt313S y Rt117S como cebador directo, respectivamente. Los productos de PCR se trataron como anteriormente para construir los plásmidos pKCLD4 a pKCLD8, que contenían el promotor PDAoiin de aproximadamente 1.7 kb, 1.2 kb, 1.0 kb, 0.7 kb y 0.4 kb de longitud, respectivamente (Figura 5A).

Pdaoim² es mutante del Pdaoi que contiene intrón 1 de 0.7 kb con el codón de inicio de traducción original cambiado a ATC mediante mutagénesis de sitio dirigida por oligo. Pdaoim3 se elaboró al convertir todos los residuos de citosina en el motivo 2 de PDAonn² a adenina, mientras que Pdaoim4 es un mutante con el motivo 2 de 24 nt eliminado. Todas las mutaciones se elaboraron mediante PCR de fusión de dos etapas. El plásmido pKCLD7 se utilizó como la plantilla para PCR de fragmentos del promotor DAO1. Para el promotor Pdaoim² , los pares de oligo SFGFPSEQ/Rt327r y Rt328f/LUC2U se utilizaron para elaborar el fragmento de ADN de 0.8 kb y 0.4 kb, respectivamente. La PCR de fusión de los fragmentos de ADN anteriores se realizó utilizando oligos de Rt313S y Rt287Nr, y los productos de PCR de 0.7 kb resultantes se digirieron con SpeI-NcoI y se ligaron con el vector pKCL2 linealizado con SpeI-NcoI para crear el plásmido pKCLD71.

De manera similar, los pares de oligo SFGFPSEQ/Rt329r y Rt330f/LUC2U se utilizaron para la amplificación del fragmento de ADN de 0.8 kb ascendente y 0.3 kb descendente de Pdaoim3, respectivamente. Y los pares de oligo SFGFPSEQ/Rt329r y Rt331f/LUC2U se utilizaron para el fragmento de ADN de 0.8 kb ascendente y 0.3 kb descendente de Pdaoim4, respectivamente. El plásmido pKCLD72 y pKCLD73 se generaron utilizando el mismo procedimiento de PCR de fusión y construcción de plásmido como pKCLD71.

Ejemplo 3

Análisis de la actividad del promotor.

Las construcciones de T-ADN se transformaron en células de agrobacterium por electroporación (2.5 kV, 25 pF, 400 O) y se seleccionaron sobre medio de agar 2YT suplementado con estreptomicina (100 pg/ml). La transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT) de R. toruloides se realizó como se describió previamente (30). Para evitar efectos posicionales, todas las construcciones se les realizó “konck-in” en el locus c AR2 utilizando la cepa mutante KU70 (Ku70e) (7), que se realizó convenientemente al seleccionar transformantes albinos (Figura 2C).

Las cepas de levadura transformadas con casetes PDAo¡nx.:RtLUC2 se cultivaron en caldo YPD hasta la fase exponencial media. Las células se lavaron con agua dos veces y se resuspendieron en MinABs más 70 mM de ya sea D-alanina o L-alanina a una densidad óptica de la célula a 600 nm (OD600) de 0.5 y continuaron el cultivo a 30 °C, 250 rpm durante 21 h. Las células se cosecharon, lavaron y resuspendieron en tampón PBS suplementado con DTT 1 mM, p-mercaptoetanol 3 mM y PMSF 1 mM (pH 7.4) suplementado con un volumen igual de perlas de vidrio de 0.5 mm (Sigma-Aldrich, EE.UU.) y se lisaron con FastPrep 24™ 5G (MP Biomedicals, Irvine, c A, EE.UU.) durante 40 segundos. La concentración de proteína y la actividad de luciferasa se determinaron utilizando el método de Bradford y un kit de ensayo de luciferasa comercial (Promega, EE.UU.) bajo el protocolo del proveedor, respectivamente. Todos los datos se midieron y adquirieron con el lector de placas Infinite M200 acoplado con el software iCycler (versión 3.0, Tecan, Salzburg, Austria). Todos los experimentos se realizaron en triplicados tanto biológico como estadístico. Para la determinación de la actividad promotora relativa (RPA), el valor de luminiscencia se sustrajo contra el control blanco o negativo (cepa sin promotor), se normalizó contra la concentración de proteína, luego se normalizó contra cualquiera de los valores de Pgpdi o la lectura máxima.

Ejemplo 4

Extracción de ADN genómico y ARN total

El ADN genómico de R. toruloides se extrajo utilizando los Kits de Purificación de ADN y ARN MasterPure-Yeast, respectivamente (Epicenter, Singapur). Las concentraciones de muestras de ADN o ARN se determinaron con el espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, EE.UU.) y la integridad de los ácidos nucleicos extraídos se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa.

Ejemplo 5

Análisis de transferencia Southern

Para el análisis de transferencia Southern, el ADN genómico (10 |jg) se digirió con PstI y se separó por electroforesis en gel de agarosa al 0.8 %. La hibridación Southern se realizó utilizando el Kit de Inicio de Detección y Etiquetado de ADN DIG High Prime de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Indiana, EE.Uu .), y la sonda marcada con DIG fue un fragmento de ADN parcial de hpt-3 amplificado utilizando oligos HptRU y HptRSL2 (Tabla 1).

Ejemplo 6

PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR)

El ARN total se trató con DNasa I (Roche Diagnostics) y se recuperó mediante precipitación con etanol para eliminar la traza de ADN. El ADNc se sintetizó utilizando la Supermezcla de Transcripción Inversa iScript™ para RT (Bio-Rad, EE.UU.) y se realizó PCR en tiempo real en el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7900HT (Life Technologies, EE.UU.) utilizando la Mezcla Maestra ABI SYBR® Select (Life Technologies, EE.UU.). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: una etapa inicial de desnaturalización de 50 °C durante 2 min y 95 °C durante 10 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, hibridación a 60 °C durante 1 min. Se utilizaron triplicados para todos los análisis de qRT-PCR. Los datos se obtuvieron utilizando el software SDS 2.4 (Applied Biosystems, Life Technologies, EE.UU.) y se calculó la expresión génica relativa contra el gen de referencia ACT1 (secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO: 89; secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO: 90) con el método 2-AACt a través del software RQ Manager v1.2.1 (Applied Biosystems, EE.UU.).

Ejemplo 7

Identificación de DAO1 en R. toruloides ATCC 10657

Se obtuvieron dos secuencias DAO1 de especies de Rhodotorula con los Nos. de Acceso GenBank DM380716 y Z71657 (32), y se identificó su homólogo en R. glutinis ATCC 204091 mediante la búsqueda BLASTn en NCBI. El gen DAO1 (No. de Acceso GenBank EGU13479.1) en la cepa objetivo se encuentra en el armazón proteínico de secuenciación #23. Para lograr la secuencia de ADNc de longitud completa, se realizó RACE 5' y 3' y se obtuvieron dos fragmentos de ADNc de aproximadamente 0.5 kb (datos no mostrados). Utilizando el par de oligo Rt332f y Rt333r (Tabla 1), el ADNc de longitud completa de DAO1 se amplificó con éxito por RT-PCR (datos no mostrados). La transcripción de ARNm de longitud completa de 1183 nt contiene un ORF de 1107 nt, 5' UTR de 29 nt (región no traducida) y 3' UTR de 47 nt. El ORF es rico en GC con un contenido de GC del 63.0 %. La comparación entre el ADNc y las secuencias genómicas reveló 6 exones separados por 5 intrones (Figura 2A). Todas las uniones de empalme y las secuencias de puntos de ramificación putativos son muy similares a otros hongos. La proteína 368-aa contiene un motivo DAO conservado (pfam01266, valor E = 4.2E-27), que exhibe una alta homología con DAAO de otras especies, con aquel de R. toruloides ATCC 26217 que muestra la identidad más alta (UniProtKB/Swiss-Prot acc. No. P80324.1, 94 % de identidad) (datos no mostrados).

Con base en la búsqueda BLAST, se identificaron varios genes de codificación Dao1 putativos de los subfilos Pucciniomycotina y Ustilagiomycotina y sus patrones de empalme de ARNm se anotaron manualmente. Los genes contienen 4-7 intrones, aunque el gen DAO putativo de U. maydis está libre de intrón y el homólogo de S. reilianum contiene 2 intrones cortos (Figura 3A). El análisis del árbol filogenético no enraizado reveló que Dao1 de los subfilos Pucciniomycotina se puede separar en dos ciados: los géneros Rhodosporidium/Rhodotorula y Sporobolomyces reseus se agruparon en un ciado, y los miembros de Puccinia y Melampsora laricis-populina se agruparon en el otro ciado. Aquellos miembros de Ustilagiomycotina están más relacionados con aquellos del primer ciado (Figura 3B).

Ejemplo 8

Número de copias de DAO1 y sus transcripciones de ARNm

El análisis de transferencia Southern reveló una sola banda cuando se digirió con HindlII o PstI, confirmando que un solo gen DAO1 se codifica en el genoma de R. toruloides (Figura 4A). Para investigar la expresión del gen DAO1 de regulación, el nivel de ARNm en células cultivadas en medio YPD suplementado con niveles de D-alanina o L-alanina se cuantificó mediante qRT-PCR utilizando el ARNm de Actina (ACT1) como referencia. Como se esperaba, la expresión de ARNm de DAO1 fue insignificante cuando las células se cultivaron en medio MinAB suplementado con L-alanina o sulfato de amonio como la única fuente de nitrógeno (Figura 4B). Notablemente, el nivel de ARNm aumentó los cultivos 12-18 veces en presencia de D-alanina 70 mM y se aumentó adicionalmente a -100 veces del medio de control a las 6 horas después de la suplementación con D-alanina si se omitieron tanto la glucosa como el sulfato de amonio en el medio (Figura 4B). Estos resultados confirman que la transcripción de la transcripción DAO1 es inducida específicamente por D-alanina y la presencia de una fuente de carbono adicional inhibe fuertemente la inducción. La qRT-PCR de células cultivadas bajo diversos estímulos de estrés mostró que la transcripción de DAO1 se reprimió significativamente por todos los estímulos de estrés probados, mientras que el glicerol como la única fuente de carbono parecía mejorar la transcripción de DAO1 en comparación con aquella de lA glucosa (Figura 4C).

Ejemplo 9

Identificación de elementos con acción en cis potenciales en el promotor DAO1

Para entender la regulación de la transcripción de DAO1, se enviaron secuencias ascendentes (~ 1.0 kb) de genes DAO1 de varios hongos basidiomicetosos al servidor MEME (http://meme.nbcr.net/meme/) para buscar elementos con acción en cis potenciales para la regulación génica. Los resultados revelaron tres motivos conservados. El motivo 1 tiene una secuencia consenso de AGGNNGNAGN11GANGANGG (SEQ ID NO: 6), localizada más cercanamente al inicio de la transcripción (Figuras 5A y 5C).

Ejemplo 10

Ensayo de indicador de luciferasa de promotores DAO1

Para investigar los efectos del motivo 1 local del intrón en la transcripción de DAO1, se utilizaron varios mutantes del promotor DAO1 para impulsar la expresión de LUC-2, que es un gen de luciferasa sintetizado por Genescript de acuerdo con la preferencia de codón de Rhodosporidium y Rhodotorula. En particular, el promotor sin intrón de 2.0 kb (P^{d a o} 1), un promotor que contiene 1 intrón de 2.2 kb (PDAO¹in) y un promotor mutante deficiente en el motivo 1 de 2.2 kb PDAOUnt que se elaboró mediante PCR de fusión de dos fragmentos de PCR divididos del promotor, se clonó en pKCL2 individualmente. Los casetes indicadores (Figura 6A) se integraron en el locus CAR2 para evitar efectos posicionales. Como CAR2 codifica la enzima bifuncional fitoeno sintasa y la licopeno ciclasa que está funcionalmente involucrada en la biosíntesis de carotenoides en R. toruloides, las cepas con un casete indicador LUC-2 “konck-in” se pueden identificar fácilmente por la pérdida de pigmento carotenoide rojo (7). El análisis de transferencia Southern se utilizó para verificar adicionalmente las cepas de inserción utilizadas. Las células se cultivaron durante 21 horas en medio MinAB suplementado con D-alanina o L-alanina. Los resultados mostraron que el promotor PoAoun que contenía el intrón 1 era aproximadamente 5 veces más fuerte que el Pdao¹ sin intrón cuando se utilizó D-alanina como inductor. Adicionalmente, el Pdao¹m mutante deficiente en el motivo 1 mostró una severa desrepresión de la actividad del promotor porque el medio MinABs con L-alanina como la única fuente de carbono y nitrógeno exhibía un nivel de expresión de luciferasa mucho más alto (Figura 6B). Estos datos confirman que tanto el intrón 1 como el motivo 1 cumplen una función importante en la regulación de la transcripción de DAO1 mediante D-alanina.

Para caracterizar adicionalmente el promotor DAO1, se realizó una supresión anidada del PoAOlin de 2 kb (Figura 6A y Ejemplo 2). Las versiones de 1.7 y 0.7 kb parecían tener una actividad ligeramente mayor cuando se utilizó D-alanina como inductor. Sin embargo, el fragmento de 0.4 kb parecía ser el mejor promotor ya que mostraba una actividad similar a la versión de 2.2 kb mientras mantenía la actividad basal más baja en el medio que contenía L-alanina (Figura 6C). Por lo tanto, los fragmentos que contienen intrón 1 de 0.7 y 0.4 kb son los fragmentos más preferibles para utilizar como promotor del sistema de expresión génica inducible por D-alanina.

Ejemplo 11

Efectos de las fuentes de carbono y nitrógeno medio sobre la actividad del promotor DAO1

Para investigar los efectos de las fuentes de carbono y nitrógeno sobre la actividad del promotor, se cultivaron 3 cepas con el promotor DAO1 que contenía el intrón 1 de 2.2 kb (PDAOUn) al que se le realizó inserción en el locus CAR2 en el medio MinAB modificado (MinABs), que tenía glucosa y sulfato de amonio suplementado al medio basal MinAB cuando sea necesario. La mejor expresión de luciferasa se observó con MinAB suplementados con solo D-alanina 70 mM. La expresión se redujo aproximadamente 5 veces cuando se agregó el mismo nivel de L-alanina como competidor después de 21 h de cultivo (Figura 7A). El sulfato de amonio (70 mM) solo tuvo poco efecto, mientras que la glucosa a 10 g/L redujo la actividad a la mitad. Sorprendentemente, la suplementación de glucosa (10 g/L) y sulfato de amonio (70 mM) conduce a una actividad del promotor DAOlin de represión drástica. La D-alanina tan baja como 20 mM fue efectiva para impulsar la expresión del gen indicador, aunque las altas concentraciones continuaron para mejorar la actividad (Figura 7B). Las concentraciones de glucosa (10-100 g/L) y sulfato de amonio (5-50 mM) mostraron solo efectos marginales (Figuras 7C y 7D).

Ejemplo 12

Uso de diferentes D-aminoácidos como inductores

Se ha informado previamente que la D-aminoácido oxidasa de Rhodotorula gracilis exhibió una alta afinidad de sustrato a varios D-aminoácidos neutros (33). En este documento, la selectividad del sustrato de las cepas indicadoras del promotor DAO1 de 2.2 kb (Pdaoir) se investigó sobre su inducibilidad por diferentes D-aminoácidos. El ensayo de luciferasa de células cultivadas en MinAB suplementado con 70 mM de los D-aminoácidos como la única fuente de carbono y nitrógeno reveló que el promotor se indujo más preferentemente por D-alanina ya que mostró la mejor fuerza y la expresión de fondo más baja, aunque la D-treonina -serina, D-valina y D-prolina fueron igualmente efectivas. Otros D-aminoácidos tales como D-leucina, D-fenilalanina, D-triptófano y D-metionina fueron significativamente menos efectivos (Figura 8).

Ejemplo 13

Identificación de elementos de acción en cis en el intrón 1 del gen DAO1

Como el intrón 1 potenciaba fuertemente la actividad promotora (Figura 6B), buscamos identificar el elemento de acción en cis para esta actividad. El análisis de las secuencias del intrón 1 de los genes DAO1 de varias especies de Rhodosporidium/Rhodotorula en el servidor MEME (http://meme.nbcr.net/meme/) para posibles elementos de acción en cis reveló un motivo conservado rico en CT (Figura 9A) con una secuencia de consenso de T(T/C)TCCC(T/C)CTCC(T/C)CCCCAC(A/T)(C/T) CCGA (SEQ ID NO: 7), que se denominó motivo 2 (Figura 9B). Se ha encontrado un motivo similar en el promotor GPD1 y se sabe que es un elemento de acción en cis importante en hongos (30). Para demostrar la función de este motivo, se crearon 3 mutantes más del promotor DAOlin de 0.7 kb: DAO1 in² en el que el codón de iniciación de traducción original se cambió a ATC para que no se traduzcan los residuos N-terminales adicionales en la proteína que se va a expresar; DAO1n3 en el que todos los residuos de citosina en el motivo 2 de DAO1in2 se cambiaron a adenina y DAO1in4 en el que se suprimió el motivo 2 de 24 nt en DAO1in2. (Véase el ejemplo 2). DAO1in2 era esencialmente el mismo que DAOlin, lo que sugiere que la traducción de los 16 aa iniciales era prescindible para la actividad y regulación del promotor. Sin embargo, DAO1in3 y DAO1in4 mostraron una actividad severamente reducida en los medios MinAB complementados tanto con D como con L-alanina. Esto sugiere que el motivo 2 es un sitio de unión para el potenciadortranscripcional general.

Ejemplo 14

Efectos del bloqueo de DAO1 sobre la actividad del promotor DAOlin

Se crearon mutantes bloqueados DAO1 (Adao1) de acuerdo con el método de Koh et al (7). La supresión del gen DAO1 se confirmó mediante transferencia Southern (Figura 10A). Los mutantes se comprometieron significativamente en el crecimiento cuando se utilizó D-o L-alanina como única fuente de carbono (Figura 10B). Notablemente, Adao1 mostró un nivel de inducción significativamente mayor del indicador de luciferasa que las células Wt. Es importante destacar que se logró una fuerte expresión inducible del gen indicador incluso en presencia de altos niveles de carbono (glucosa 10 g/L) y fuente de nitrógeno (sulfato de amonio 70 mM). La actividad del promotor en Adao1 fue 7.8 y 4.2 veces mayor que en Wt cuando se suplementó con 10 g/L de glucosa) y sulfato de amonio 70 mM respectivamente. La diferencia se mejoró a 17 veces cuando se agregaron tanto 10 g/L de glucosa como sulfato de amonio 70 mM al medio (Figura 10C).

El uso de los términos “un” y “una” y “el” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significa “que incluye, pero no se limita a”), a menos que se indique lo contrario. La mención de los rangos de valores en el presente documento solo pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en este documento se pueden realizaren cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o frase ejemplar (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en este documento, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna frase en la especificación se debe interpretar como indicativo de algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

Las realizaciones de esta invención se describen en este documento, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de esas realizaciones pueden resultar evidentes para aquellos expertos comunes en la técnica al leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los artesanos expertos empleen dichas variaciones según sea apropiado, y los inventores tienen la intención de que la invención se practique de otra manera diferente a la descrita específicamente en este documento. De acuerdo con lo anterior, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto mencionada en las reivindicaciones adjuntas a este, según lo permitido por la ley aplicable. Más aún, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos está incluida en la invención a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de expresión génica inducible por D-aminoácido operable en una célula fúngica transgénica que comprende una construcción de ácido nucleico que comprende un promotor inducible por D-aminoácido ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo, en el que el promotor se selecciona del grupo que consiste en:

(a) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:94;

(b) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:95;

(c) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:96;

(d) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:97; y

(e) un promotor que tiene al menos 82 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:5

y en el que la construcción de ácido nucleico contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 75 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:7.

2. El sistema de expresión de la reivindicación 1, en el que la célula fúngica es una célula fúngica transgénica de una especie de género Rhodosporidium o género Rhodotorula.

3. El sistema de expresión de la reivindicación 1 o 2, en el que la célula fúngica transgénica comprende un gen de oxidasa de D-aminoácido mutante que no tiene o tiene actividad de D-aminoácido oxidasa reducida en comparación con una célula fúngica que comprende un gen D-aminoácido oxidasa de tipo silvestre.

4. El sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el promotor comprende una secuencia de nucleótidos dentro del promotor que tiene al menos 75 % de identidad con la secuencia de nucleótidos establecida en la SEQ ID NO:6, en el que dicho 75 % de identidad se basa en los nucleótidos A y G en la SEQ ID NO:6.

5. El sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el polinucleótido heterólogo se liga operativamente a un terminador de transcripción.

6. El sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la secuencia de nucleótidos es un intrón ligado operativamente al promotor inducible y ligado operativamente al polinucleótido heterólogo, en el que la secuencia de nucleótidos es un intrón insertado en la región 5' del polinucleótido heterólogo, o en el que la secuencia de nucleótidos es un intrón insertado en la 5' UTR del promotor inducible.

7. El sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la secuencia de nucleótidos es parte de la secuencia de codificación del polinucleótido heterólogo.

8. El sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en el que la secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID n O:58 y SEQ ID NO:59.

9. El sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el polinucleótido heterólogo codifica una proteína de interés, o en el que el polinucleótido heterólogo codifica una molécula de ARN para regular por disminución un gen objetivo de interés.

10. Una célula fúngica transgénica que comprende el sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. La célula fúngica transgénica de la reivindicación 10, en la que la célula se cultiva en un medio de cultivo que comprende un D-aminoácido, preferentemente en la que el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D-serina, D-valina o D-prolina, y preferentemente en la que la concentración del D-aminoácido en el medio de cultivo es desde aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 100 mM.

12. Una composición que comprende la célula fúngica transgénica de la reivindicación 10 y un medio de cultivo que comprende un D-aminoácido, preferentemente en la que el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D- serina, D-valina o D-prolina, y preferentemente en la que la concentración del D-aminoácido en el medio de cultivo es desde aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 100 mM.

13. Un método para preparar una célula fúngica transgénica que comprende:

(a) introducir el sistema de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en una célula fúngica y

(b) seleccionar una célula fúngica transgénica que comprende la construcción de ácido nucleico.

14. Un método de expresión inducible de un polinucleótido en una célula fúngica que comprende cultivar la célula fúngica transgénica de la reivindicación 10 en un medio de cultivo que comprende un D-aminoácido para inducir la expresión del polinucleótido heterólogo, preferentemente en el que el D-aminoácido es D-alanina, D-treonina, D-serina, D-valina o D-prolina, y preferentemente en el que la concentración del D-aminoácido en el medio de cultivo es desde aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 100 mM.