ES2815224T3 - Un método para cuantificar anticuerpos terapéuticos - Google Patents
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Abstract
Un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en una muestra de un individuo humano, que comprende las etapas de: a) añadir a una muestra de ensayo que puede contener anticuerpos terapéuticos a cuantificar una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis, b) someter la muestra preproteólisis a una proteólisis enzimática, para proporcionar una muestra de proteólisis que comprende (i) péptidos marcados de proteólisis derivados de los anticuerpos terapéuticos marcados y (ii) péptidos de proteólisis derivados del anticuerpo terapéutico contenido en la muestra de ensayo, c) determinar por análisis espectrométrico de masas la relación entre (i) uno o más péptidos marcados de proteólisis seleccionados y (ii) uno o más péptidos de proteólisis correspondientes derivados de dicho anticuerpo terapéutico, d) calcular, a partir de la relación determinada en la etapa c), la cantidad de dicho anticuerpo terapéutico en la muestra de ensayo; en el que la muestra de ensayo es una muestra de plasma humano o una muestra de suero humano, y los dos o más anticuerpos se seleccionan en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para cuantificar anticuerpos terapéuticos
Campo de la invención
Esta invención se refiere al campo de cuantificación de anticuerpos. De manera más precisa, se refiere a la cuantificación de anticuerpos terapéuticos en una muestra biológica.
Antecedentes de la invención
El análisis de muestras de plasma/suero generadas a partir de estudios in vivo de proteínas terapéuticas, especialmente de anticuerpos terapéuticos, es de interés en la industria biofarmacéutica.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) son un grupo inminente de compuestos terapéuticos usados para tratar diversos tipos de enfermedades. Los anticuerpos monoclonales (mAb) constituyen una clase terapéutica que conoce la tasa actual más fuerte de desarrollo en el campo de la biotecnología farmacéutica. Hasta la fecha hay más de 50 mAb comercializados en diversos campos tales como oncología, inmunología, oftalmología y cardiología. Los anticuerpos monoclonales han proporcionado resultados médicos importantes en el tratamiento de varias enfermedades importantes incluyendo ensayos clínicos de enfermedades autoinmunitarias, cardiovasculares e infecciosas, cáncer e inflamación.
El tratamiento basado en anticuerpos para el cáncer ha llegado a establecerse durante los últimos 15 años y ahora es una de las estrategias más exitosas e importantes para tratar a pacientes con neoplasias hemáticas y tumores sólidos. El uso de anticuerpos monoclonales para el tratamiento contra el cáncer ha conseguido éxito considerable en los últimos años. De forma destacable, los conjugados de anticuerpo-fármaco son nuevas opciones de tratamiento potentes para linfomas y tumores sólidos, y los anticuerpos inmunomoduladores también han conseguido recientemente éxito clínico destacable. El desarrollo de anticuerpos terapéuticos requiere una profunda comprensión de la serología cancerosa, técnicas de manipulación de proteínas, mecanismos de acción y resistencia, y la interacción entre el sistema inmunitario y las células cancerosas.
Entre ellos, los anticuerpos anti-TNF que bloquean la acción de TNF alfa revolucionaron el tratamiento de enfermedades relacionadas con TNF tales como enfermedad inflamatoria del intestino, lupus, colitis ulcerosa, espondilitis anquilosante, artritis psoriásica y artritis reumatoide. Al neutralizar la actividad de TNF, los anticuerpos anti-TNF promueven la cicatrización de la mucosa e inducen remisiones a largo plazo en los pacientes. Los anticuerpos anti-TNF principales que está actualmente autorizados abarcan Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
Dada la naturaleza polipeptídica de los mAb terapéuticos, su alto grado de homología con las IgG humanas endógenas y las bajas concentraciones a las que se esperan en el entorno plasmático, la determinación de las concentraciones de anticuerpos monoclonales terapéuticos en plasma humano y muestras derivadas de suero humano es difícil. Para establecer las propiedades farmacocinéticas (PK) de los mAb en muestras humanas, se ejecutan muchos estudios clínicos. Las muestras de estos estudios muy a menudo se analizan usando inmunoensayos. Aunque los inmunoensayos son muy rápidos y sensibles, también hay algunas limitaciones.
La estrategia ELISA convencional se ha usado durante más de 25 años y tiene varias limitaciones. Los métodos ELISA requieren reactivos personalizados de alta calidad que pueden tardar varios meses en generarse y la optimización del ensayo puede tardar varios meses adicionales. Por tanto, ELISA tiene un tiempo de desarrollo de ensayo largo que es una limitación tanto en la fase de descubrimiento temprana como la fase de desarrollo de fármacos basados en proteína. Los reactivos de ELISA y condiciones de ensayo adecuados pueden no ser posibles en algunos casos debido a los requisitos de unión altamente personalizados para cada proteína terapéutica. Otra limitación de ELISA es que los reactivos pueden unirse no específicamente a proteínas del plasma/suero y la interferencia de la matriz es un fenómeno común. La cuantificación de proteínas por espectrometría de masas, por otros lado, es muy específica y, por lo tanto, la interferencia de la matriz es infrecuente en comparación con ELISA. Los métodos de espectrometría de masas de cuantificación de proteínas, CL-EM/EM en particular, no requieren reactivos personalizados y, en general, producen un desarrollo de ensayo más rápido. Además, la espectrometría de masas está menos sujeta a interferencias de la matriz y proporciona condiciones de ensayo genéricas que son muy específicas y pueden combinarse y automatizarse. La alta especificidad de la espectrometría de masas mide la concentración de analito usando las propiedades fisicoquímicas intrínsecas del analito, es decir, la masa y el patrón de fragmentación. El formato robusto permite la trasferencia lista de un laboratorio a otro, una ventaja significativa para tratamientos de anticuerpo aprobados. Una metodología general para cuantificar las proteínas por espectrometría de masas es digestión con tripsina de la proteína intacta. Los péptidos resultantes se analizan por espectrometría de masas introduciendo los patrones internos marcados con isótopo estable correspondientes a una concentración fija.
Lebert et al. ("Absolute and multiplex quantification of antibodies in serum using PSAQ™ standards and LC-MS/MS"; Bioanalysis; 2015) se refiere a una cuantificación múltiple de anticuerpos en un suero de rata usando formas marcadas con isótopo de dichos anticuerpos como patrones.
Heudi et al. ("Towards Absolute Quantification of Therapeutic Monoclonal Antibody in Serum by LC-MS/MS Usando Isotope-Labeled Antibody Standard and Protein Cleavage Isotope Dilution Mass Spectrometry"; Anal. Chem.; 2008) se refiere a una cuantificación de solamente un anticuerpos terapéutico en un suero de primate («tití») usando solamente un anticuerpos marcado con isótopo como patrón interno.
Xu et al. ("A multiplexed hybrid LC-MS/MS pharmacokinetic assay to measure two co-administered monoclonal antibodies in a clinical study"; Bioanalysis; 2014) se refiere a una cuantificación de anticuerpos en un estudio clínico usando péptidos equivalentes.
La cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem es una herramienta potente para el análisis y cuantificación de proteínas en matrices muy complejas como muestras de plasma/suero. Como los péptidos resultantes de la digestión de la proteína de interés y otras proteínas de plasma/suero pueden tener la misma masa nominal o similar, la segunda dimensión de la fragmentación por EM a menudo proporciona un fragmento único de un péptido de interés.
Como puede comprenderse fácilmente, los métodos para controlar la concentración en suero de anticuerpos terapéuticos serán muy específicos, sensibles, precisos y reproducibles, para definir los ajustes de dosificación apropiados que deben ser beneficiosos para un paciente.
Los autores de la presente invención ahora han identificado que hay una necesidad en la técnica de métodos de cuantificación de anticuerpos terapéuticos que permitan una cuantificación precisa de estos anticuerpos en muestras recogidas de pacientes sometidos a tratamientos con anticuerpo, que sean métodos de cuantificación útiles independientemente del tipo de anticuerpo terapéutico que se haya administrado a esos pacientes y, además, no sean sensibles a la posible presencia de otros anticuerpos terapéuticos administrados previamente. De forma destacable, los autores de la presente invención han identificado que hay una necesidad de métodos simples todo en uno que permitan cuantificar anticuerpos terapéuticos en muestras de pacientes tratados, que sean métodos que no requieran que los facultativos médicos seleccionen un kit o método específico de acuerdo con el anticuerpo terapéutico específico que se espera que esté contenido en las muestras de los pacientes.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en una muestra de un individuo humano, que comprende las etapas de:
a) añadir a una muestra de ensayo que puede contener anticuerpos terapéuticos una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis, b) someter la muestra preproteólisis a una proteólisis enzimática, para proporcionar una muestra de proteólisis que comprende (i) péptidos marcados de proteólisis derivados de los anticuerpos terapéuticos marcados y (ii) péptidos de proteólisis derivados del anticuerpo terapéutico contenido en la muestra de ensayo,
c) determinar por análisis espectrométrico de masas la relación entre (i) uno o más péptidos marcados de proteólisis seleccionados y (ii) uno o más péptidos de proteólisis correspondientes derivados de dicho anticuerpo terapéutico, d) calcular, a partir de la relación determinada en la etapa c), la cantidad de dicho anticuerpo terapéutico en la muestra de ensayo;
en el que la muestra de ensayo es una muestra de plasma humano o una muestra de suero humano, y los dos o más anticuerpos se seleccionan en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones, los dos o más anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos terapéuticos anti-TNF seleccionados en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas realizaciones, los dos o más anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos terapéuticos antineoplásicos seleccionados en un grupo que consiste en: Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones del método, la etapa b) comprende las siguientes etapas:
b1) una etapa de proteólisis enzimática en condiciones desnaturalizantes, y
b2) una etapa de proteólisis enzimática en condiciones no desnaturalizantes.
En algunas realizaciones del método, la proteólisis enzimática se realiza en la etapa b) usando tripsina.
De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones del método, el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que comprende:
para Infliximab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 1 a 8,
para Etanercept, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 9 a 15,
para Adalimumab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 16 a 23,
para Certolizumab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 24 a 30, y
para Golimumab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 31 a 37,
para Trastuzumab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 47-53,
para Rituximab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 54-64, y
para Bevacizumab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 65-72.
En algunas otras realizaciones del método, la proteólisis enzimática se realiza en la etapa b) incubando la muestra preproteólisis con una proteasa dirigida a la bisagra, tal como una enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus (ideS).
De acuerdo con algunos otros aspectos de estas realizaciones del método, el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que comprende:
para Infliximab, péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 38 y 39,
para Etanercept, un péptido de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 40,
para Adalimumab, los péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 41 y 42,
para Certolizumab, los péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 43 y 44, y
para Golimumab, los péptidos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 45 y 46.
De acuerdo con algunas realizaciones del método, la etapa a) comprende las siguientes etapas:
a1) añadir a una muestra de ensayo que puede contener anticuerpos terapéuticos a cuantificar una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis no concentrada, y
a2) enriquecer la muestra preproteólisis no concentrada en anticuerpos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis.
En algunas realizaciones de la etapa a1), dichos anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos terapéuticos anti-TNF. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, dichos anticuerpos anti-TNF se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas realizaciones preferidas del método, la muestra de ensayo es una muestra humana de un individuo al que se ha administrado un anticuerpo anti-TNF seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas otras realizaciones de la etapa a1), dichos anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos antineoplásicos. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, dichos anticuerpos antineoplásicos se seleccionan en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones preferidas del método, la muestra de ensayo es una muestra humana de un individuo al que se ha administrado un anticuerpo antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
La presente invención también se refiere a un kit para cuantificar anticuerpos terapéuticos, que comprende dos o más anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables, seleccionados en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
La presente invención también se refiere a kits que son útiles para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF que se describe en este documento.
De acuerdo con una realización particular, la invención se refiere a un kit para cuantificar anticuerpos terapéuticos, que comprende dos o más anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables, seleccionados en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab.
De acuerdo con una realización particular, la invención se refiere a un kit para cuantificar anticuerpos terapéuticos, que comprende dos o más anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables, seleccionados en un grupo que consiste en: Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
Descripción de las figuras
Figura 1: Curva valoración obtenida para Infliximab, medida en presencia de otros dos anticuerpos anti-TNF en una muestra de ensayo.
Ordenadas: Concentración medida de Infliximab expresada en pg/ml. Abscisas: concentración esperada de Infliximab expresada en pg/ml.
Figura 2: Evaluación de la concentración máxima de anticuerpos anti-TF que puede estar presente en una muestra de ensayo sin afectar a la captura de antígeno cuando se usa el método MSIA. Ordenadas: Concentración medida de Infliximab expresada en pg/ml. Abscisas: concentración esperada de Infliximab expresada en pg/ml.
Figura 3: Curva de valoración obtenida para Trastuzumab en suero humano, medida en presencia de dos anticuerpos terapéuticos distintos, concretamente Rituximab y Bevacizumab. Ordenadas: Concentración medida de Trastuzumab expresada en pg/ml. Abscisas: concentración esperada de Trastuzumab expresada en pg/ml.
Descripción detallada de la invención
Esta invención proporciona un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en muestras de individuos sanos que se tratan con anticuerpos terapéuticos, que es un método que permite una cuantificación precisa de estos anticuerpos terapéuticos, independientemente de la identidad del anticuerpo terapéutico que esté contenido en dicha muestra a ensayar.
La disponibilidad del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos que se describe en este documento proporciona ahora a los facultativos un solo método que puede usarse en general con muestras de cualquier individuo humano que recibe un tratamiento terapéutico con anticuerpos, sin tener en cuenta el tipo de anticuerpo terapéutico que se ha administrado a dicho individuo humano.
De forma destacable, en unidades de cuidados médicos donde algunos pacientes reciben un tratamiento con un primer anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, Infliximab) y donde algunos otros pacientes reciben un tratamiento con un segundo anticuerpo anti-TNF (por ejemplo, Etanercept), el uso del método de cuantificación de anticuerpos descrito en este documento ya no requiere una selección de un método de cuantificación específico de anticuerpo anti-TNF como es el caso de acuerdo con la presente práctica habitual.
Además, en unidades de cuidados médicos especializadas, por ejemplo, en unidades de cuidados especializadas en cáncer, donde se realiza una pluralidad de tratamientos con anticuerpos antineoplásicos, dependiendo del tipo de cánceres que se tratan, el uso del método cuantificación de anticuerpos descrito en este documento no requiere una selección de un método de cuantificación específico de anticuerpo antineoplásico, ni una selección de un protocolo de preparación de muestra específico de anticuerpo como es el caso de acuerdo con la práctica habitual.
Además, en situaciones en las que el tratamiento de un paciente se documenta erróneamente, por ejemplo, en situaciones en las que dicho paciente se considera que ha recibido un primer anticuerpo terapéutico (por ejemplo, (i) Infliximab o (ii) Trastuzumab) pero realmente ha recibido un segundo anticuerpo (por ejemplo, (i) Golimumab o (ii) Rituximab), el método de cuantificación de anticuerpos descrito en este documento, no obstante, permite (i) determinar el anticuerpo terapéutico (por ejemplo, (i) el anticuerpo anti-TNF específico usado o (ii) el antineoplásico específico usado) que el paciente realmente ha recibido y (ii) cuantificar el anticuerpo terapéutico que se ha administrado a dicho paciente, a pesar de la información errónea proporcionada al laboratorio de ensayo con respecto al anticuerpo terapéutico realmente usado.
Además, en situaciones en las que el paciente se somete a una politerapia que se administra con más de un anticuerpo terapéutico, la determinación de la cantidad en circulación global de anticuerpos terapéuticos, independientemente de la identidad y del número de anticuerpos terapéuticos que se usen, puede realizarse globalmente usando el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos que se describe en este documento.
Además, en situaciones en las que el paciente recibió un primer tratamiento basado en un primer anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un primer anticuerpo anti-TNF) y después un segundo tratamiento basado en un segundo anticuerpo terapéutico (por ejemplo, un segundo anticuerpo anti-TNF), se deduce que durante un periodo de tiempo posterior a dicho cambio de tratamiento, ambos anticuerpos terapéuticos estarán presentes en los líquidos corporales del paciente, principalmente en el plasma del paciente. En estas situaciones, el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento permite la cuantificación de los anticuerpos terapéuticos al completo en dicho paciente y también permite la cuantificación de las cantidades respectivas (por ejemplo, concentración en plasma) de cada uno de los anticuerpos terapéuticos administrados.
La presente invención proporciona un método de cuantificación de uno o más anticuerpos terapéuticos en muestras de ensayo humanas, permitiendo dicho método la cuantificación de dichos anticuerpos terapéuticos, incluso cuando la naturaleza de los anticuerpos que se administraron a los pacientes ensayados no se conoce de forma precisa.
Para realizar el método de cuantificación descrito en este documento, las formas marcadas de dos o más anticuerpos terapéuticos, es decir, los dos anticuerpos terapéuticos marcados, son formas marcadas de anticuerpos terapéuticos que son susceptibles a estar presentes en la muestra humana a ensayar.
De forma ilustrativa, para cuantificar anticuerpos terapéuticos susceptibles a estar contenidos en muestras humanas originarias de unidades de cuidados médicos que alojan a pacientes tratados con anticuerpos anti-TNF y en las que se usa actualmente una pluralidad de anticuerpos terapéuticos anti-TNF para diversos tratamientos, entonces dos o más de las formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos anti-TNF se añaden en la etapa a) del método de cuantificación. De forma ilustrativa, para cuantificar anticuerpos terapéuticos anti-TNF en muestras humanas originarias de unidades de cuidados médicos que hacen uso de Infliximab, Etanercept y Adalimumab, entonces las
formas marcadas de Infliximab, Etanercept y Adalimumab se añaden en la etapa a) del método de cuantificación. De hecho, puede añadirse un número mayor de anticuerpos terapéuticos marcados, por ejemplo, un número mayor de anticuerpos terapéuticos anti-TNF marcados, en la etapa a) del método, por ejemplo, los cinco anticuerpos terapéuticos anti-TNF Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab. Dichas realizaciones del método de cuantificación posibilitan realizar la misma realización del método de cuantificación descrito en este documento, por ejemplo, con la adición de cinco anticuerpos terapéuticos anti-TNF, para cuantificar anticuerpos anti-TNF en muestras humanas proporcionadas por una pluralidad de unidades de cuidados médicos que hacen uso de distintos anticuerpos anti-TNF, tales como (i) una primera unidad de cuidados médicos que realiza tratamientos con Infliximab o Adalimumab, (ii) una segunda unidad de cuidados médicos que realiza tratamientos con Etanercept, Adalimumab o Golimumab y (iii) una tercera unidad de cuidados médicos que realiza tratamientos con Infliximab, Certolizumab y Golimumab. Como se ilustra, el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento puede realizarse dentro de las premisas de una unidad de plataforma de ensayo que centraliza el ensayo de muestras humanas originarias de una pluralidad de unidades de cuidados médicos.
De forma más ilustrativa, para cuantificar anticuerpos terapéuticos susceptibles a estar contenidos en muestras humanas originarias de unidades de cuidados médicos que alojan a pacientes tratados con anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa actualmente una pluralidad de anticuerpos antineoplásicos terapéuticos para diversos tratamientos, entonces dos o más de las formas marcadas de dichos anticuerpos antineoplásicos terapéuticos se añaden en la etapa a) del método de cuantificación. De forma ilustrativa, para cuantificar anticuerpos antineoplásicos terapéuticos en muestras humanas originarias de unidades de cuidados médicos que hacen uso de Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, entonces las formas marcadas de Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab se añaden en la etapa a) del método de cuantificación. De hecho, puede añadirse un número mayor de anticuerpos terapéuticos marcados, por ejemplo, un número mayor de anticuerpos antineoplásicos terapéuticos marcados, en la etapa a) del método, por ejemplo, los tres anticuerpos antineoplásicos terapéuticos Trastuzumab, Rituximab and Bevacizumab.
De forma más ilustrativa, para cuantificar anticuerpos terapéuticos susceptibles a estar contenidos en muestras humanas originarias de unidades de cuidados médicos que alojan a pacientes tratados con anticuerpos anti-TNF y anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa actualmente una pluralidad de anticuerpos terapéuticos anti-TNF y anticuerpos antineoplásicos terapéuticos para diversos tratamientos (por ejemplo, para tratamientos contra el cáncer y artritis reumatoide, por ejemplo), entonces dos o más de las formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos se añaden en la etapa a) del método de cuantificación. De forma ilustrativa, para cuantificar anticuerpos terapéuticos en muestras humanas originarias de unidades de cuidados médicos que hacen uso de Trastuzumab, Rituximab e Infliximab, entonces las formas marcadas de Trastuzumab, Rituximab e Infliximab se añaden en la etapa a) del método de cuantificación. De hecho, puede añadirse un número mayor de anticuerpos terapéuticos marcados, por ejemplo, un número mayor de anticuerpos terapéuticos anti-TNF y de anticuerpos antineoplásicos marcados, en la etapa a) del método, por ejemplo, los ocho anticuerpos terapéuticos Trastuzumab, Rituximab, Bevacizumab, Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
Por tanto, de acuerdo con el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, una muestra de ensayo "que puede contener anticuerpos terapéuticos" significa una muestra humana que se espera que comprenda al menos un anticuerpo terapéutico a cuantificar por una realización del método de cuantificación en el que dichos o más anticuerpos terapéuticos marcados se añaden en la etapa a) y en el que al menos una forma marcada de dicho al menos un anticuerpo terapéutico, incluido en dichos dos o más anticuerpos terapéuticos marcados, se añaden en la etapa a). Por tanto, la etapa a) comprende añadir una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de anticuerpos terapéuticos a una muestra de ensayo que es sospechosa de contener uno o más anticuerpos terapéuticos y en la que una o más de dichas formas marcadas de anticuerpos terapéuticos incluyen una forma marcada del uno o más anticuerpos terapéuticos que se espera que estén contenidos en dicha muestra de ensayo.
Como se usa en este documento, la expresión "comprende" o "que comprende" abarca también "consiste en" o "que consiste en".
Como se usa en este documento, un "anticuerpo terapéutico" se refiere a un anticuerpo que es adecuado para su uso como medicamento, y que puede consistir en un anticuerpo completo o un fragmento del mismo; que incluye cualquier fragmento seleccionado de un grupo que comprende: anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos y anticuerpos quiméricos. La mayoría de anticuerpos terapéuticos son anticuerpos monoclonales, en particular del tipo IgG. Los fragmentos de los mismos pueden seleccionarse del grupo que consiste en: Fab, F(ab')2, scFv, Fc, pFc, cadena pesada y cadena ligera.
En algunas realizaciones específicas, esta invención se refiere a un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en una muestra de un individuo humano que ha recibido un tratamiento terapéutico con un anticuerpo terapéutico, incluyendo un anticuerpo terapéutico anti-TNF y/o antineoplásico, seleccionándose dichos anticuerpos terapéuticos de: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, dichos dos o más anticuerpos terapéuticos anti-TNF se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas otras realizaciones específicas, se refiere a un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en una muestra de un individuo humano que ha recibido un tratamiento terapéutico con un anticuerpo terapéutico antineoplásico. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, dichos dos o más anticuerpos terapéuticos antineoplásicos se seleccionan en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
El método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento puede realizarse para dos o más anticuerpos seleccionados en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones, el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento puede realizarse para dos o más anticuerpos seleccionados en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas realizaciones, el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento puede realizarse para dos o más anticuerpos seleccionados en un grupo que consiste en: Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
Infliximab Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab son polipéptidos, cuyas secuencias respectivas se describen posteriormente en este documento.
Para Infliximab:
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSK SINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDY W GQGTTLT V S S AS TKGPS VFPLAPS S KS TS GGT A ALGCL VKD YFPEP VT VS WN S G ALT S G VHTFP A VLQS S GLY S LS S V VT VPS S S LGTQT YICN VNHKPS NTK YDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LP APIEKTIS K AKGQPREPQ V YTLPPS RDELTKN Q VS LTCL VKGFYPS DI A VE WES N GQPENN YKTTPP VLD S DGS FFLY S KLT VDKS RW QQGN VF S C S VMHE ALHNHYTQ KSLSLSPGK (Heavy chain, SEQ ID NO. 73)
DILLTQSP AILS V S PGERV S FS CR AS QFVGS SIHW Y QQRTN GS PRLLIK Y AS ES MS GI PSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPSV FIFPPS DEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV QWKVDN ALQS GNS QES VTEQDS KD S T Y S LS S TLTLS KAD YEKHKV Y ACE VTHQGLS S P VTKS FNRGEC (Light chain, SEQ
ID NO. 74)
Para Adalimumab:
E V QL VES GGGL V QPGRS LRLS C A AS GFTFDD Y AMHW VRQ APGKGLEW V S AITWN S GHID Y ADS VEGRFTISRDN AKN S LYLQMN S LRAEDT A V Y Y C AKV S YLS T AS S LD YW GQGTL VT V S S ASTKGPS VFPLAPS S KS TS GGT A ALGCL VKD YFPEP VTVSWN S G ALT S G VHTFP A VLQS S GLY S LS S V VT VPS S S LGT QT YICN VNHKPS NTKVDKKVE PKSCDKTHT CPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKDTLMIS RTPE VT C V V VD V S HEDPE V KFNW Y VD G VE VHN AKTKPREEQ YN S T YRV V S VLT VLHQD WLN GKE YKCK V S NK ALP APIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES N GQPENN YKTTPP VLDS DGS FFLY S KLT VDKS RW QQGN VF S CS VMHE ALHNHYT QKSLSLSPGK (Heavy chain, SEQ ID NO. 75)
DIQMTQS PS S LS AS V GDRVTITCR AS QGIRN YL AW Y QQKPGK APKLLIY A AS TLQS G VPSRFS GS GS GTDFTLTIS S LQPED V AT Y Y C QRYNR AP YTF GQGTKVEIKRT V A A PS VFIFPPS DEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV QWK VDN ALQS GN S QES VTEQDS KDS T Y S LS S TLTLS KAD YEKHKV Y ACE VTHQGLS S PVTKS FNRGEC (Light chain, SEQ ID NO. 76)
Para Etanercept:
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDS CEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQE GCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVV AIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPM GPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL N GKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPS DIA VE WES N GQPENN YKTTPP VLDS DGS FFL Y S KLT VDKS RW QQGN VF S C S VMHE ALHNH YTQKS LS LS PGK (SEQ ID NO. 77)
Para Certolizumab:
E V QL VES GGGL V QPGGS LRLS C A AS G Y VFTD Y GMNW VRQ APGKGLE WMG WINT YIGEPIY ADS VKGRFTF S LDT S KS T A YLQMN S LR AEDT A V Y Y C ARG YRS Y AMD Y W GQGTLVT VSS ASTKGPS VFPL APS S KSTS GGT AALGCLVKD YFPEPVT VS WN S G ALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCAA (Heavy chain, SEQ ID NO. 78)
DIQMTQS PS S LS AS VGDRVTITCKAS QN VGTN V A W Y QQKPGKAPK ALIYS AS FL Y S G VPYRFS GS GS GTDFTLTIS S LQPEDFAT Y Y C QQ YNIYPLTF GQGTKVEIKRT V A A PS VFIFPPS DEQLKS GT AS V V CLLNNF YPRE AKV QWK VDN ALQS GN S QES VTEQDS KDS T Y S LS S TLTLS KAD YEKHKV Y ACE VTHQGLS S PVTKS FNRGEC (Light chain, SEQ ID NO. 79)
Para Golimumab:
Q V QL VES GGG V V QPGRS LRLS C A AS GFIFS S Y AMHW VRQ APGN GLE WV AFMS YD GSNKKY ADS VKGRFTISRDN S KNTL YLQMNSLRAEDT A V YY C ARDRGIA AGGNY Y Y Y GMD VIS S QGTT VT V S S AS TKGPS VFPL APS S KS TS GGT AALGCLVKD YFPEPV T VS WNS G ALTS G VHTFP A VLQS S GL YS LS S V VT VPS S S LGTQT YICN VNHKPS NTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPGK (Heavy chain, SEQ ID NO. 80) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASOSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRAT GIP ARF S GS GS GTDFTLTIS S LEPEDF A V Y Y C QQRS NWPPFTF GPGTKVDIKRT V A A PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDS
Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab son polipéptidos, cuyas secuencias respectivas se describen posteriormente en este documento.
Para Trastuzumab:
E V QL VES GGGL V QPGGS LRLS C A AS GFNIKDT YIHW VRQ APGKGLEW V ARIYPTN G YTRY ADS VKGRFTIS ADT S KNT A YLQMN S LR AEDT A V Y Y C S RW GGDGF Y AMD YW GQGTLVT V S S ASTKGPS VFPLAPS S KSTSGGT AALGCLVKD YFPEPVT VS WN S G ALT S G VHTFP A VLQS S GLY S LS S V VT VPS S S LGTQT YICN VNHKPS NTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNW Y VDG VE VHN AKTKPREEQ YN S T YRV V S VLT VLHQD WLN GKE YKCK V S NK ALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKN QV SLTCLVKGFYPSDIAVEWES N GQPENN YKTTPP VLDS DGS FFLY S KLT VDKS RW QQGN VF S C S VMHE ALHNH YT QKSLSLSPG (Heavy chain, SEQ ID NO. 82)
DIQMTQS PS S LS AS VGDRVTITCRAS QD VNT A V A W Y QQKPGKAPKLLIY S AS FLYS GVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAP S VFIFPPS DEQLKS GT AS V VCLLNNFYPRE AKV QWKVDN ALQS GN S QES VTEQDS KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Light chain,
SEQ ID NO. 83)
Para Rituximab:
QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPG N GDT S YN QKFKGK ATLT ADKS S S T A YMQLS S LTS ED S A V YY C ARS T Y Y GGDW YF N VW G AGTT VT VS A AS TKGPS VFPLAPS S KS TS GGT AALGCLVKD YFPEPVT VSWN S G ALT S G VHTFP A VLQS S GLY S LS S V VT VPS S S LGTQT YICN VNHKPS NTKVDKKV EPKS CD KTHT CPPCP APELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPE VTC V V VD V S HEDPE VKFN W Y VDG VE VHN AKTKPREEQ YN S T YR V V S VLT VLHQD WLNGKEYKCKV S N KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE S N GQPENN YKTTPP VLDS DGS FFLY S KLT VD KS RW QQGN VFS C S VMHE ALHNH Y TQKSLSLSPGK (Heavy chain, SEQ ID NO. 84) QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGV P VRF SGSGSGTSYS LTIS R VE AED A AT Y YCQQWTS NPPTFGGGTKLEIKRT V A APS VFIFPPS DEQLKS GT AS V VCLLNNFYPRE AKV QWKVDN ALQS GNS QES VTEQD S K DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Light chain,
SEQ ID NO. 85)
Para Bevacizumab:
E V Q L VES GGGL V QPGGS LRLS C A AS G YTFTN Y G M N W VRQ APG KG LE W V G W INT
YTGEPT Y A ADFKRRFTF S LD T S KS T A Y L Q M N S LR AEDT A V Y Y C A K Y P H Y Y GS S H
W YFD V W G QG TFVT V S S AS TKGPS VFPF APS S KSTS GGT AA FG C F V K D YFPEP V T V
SW NSGAFTSGVHTFPAVFQSSGFYSFSSVVTVPSSSFGTQTYICNVNHKPSNTKVD
DPE V K F N W Y VD G VE V H N AKTKPREEQ Y N S T YR V V S V F T VFH Q D W FN GKE Y K C K
VSN KAFPAPIEKTISKAKG Q PREPQ VYTFPPSREEM TKNQ VSFTCFVKG FYPSDIAV
EW ESNG QPENNYKTTPPVFDSDGSFFFYSKFTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEAFH
NHYTQKSFSFSPGK (Heavy chain, SEQ ID NO. 86)
DIQMTQS PS S LS AS V GDRVTITCS AS QDIS N Y LN W Y QQKPGK A P K V LIY FTS S LHS G
VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPW TFGQGTKVEIKRTVAAPS
VFIFPPS DEQLKS GT AS V VC LLN N FYPR E A K V Q W K V D N ALQS GNS QES VTEQ D S K
DST YSLS STLTLS K A D Y E K H K V Y ACE VTHQGLS SP VTKSFNRGEC (L igh t chain,
SEQ ID NO. 87).
Esta invención se refiere a dicho método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos, que hace uso de una técnica de cuantificación de CL-EM/EM.
En general, para realizar el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, dos o más anticuerpos terapéuticos de referencia (también denominados "compuestos de patrón interno" en este documento) se añaden a una muestra de ensayo, antes de someter la muestra resultante (también denominada "muestra preproteólisis" a protolisis enzimática, para proporcionar una "muestra de proteólisis" que comprende (i) péptidos de proteólisis derivados de los anticuerpos terapéuticos de referencia y (ii) péptidos de proteólisis derivados del anticuerpo terapéutico contenido en la muestra de ensayo. En una etapa adicional del método, la cantidad de los anticuerpos terapéuticos que estaban contenidos inicialmente en la muestra de ensayo se determina mediante un método de espectrometría de masas, que incluye el cálculo de una relación entre (i) uno o más péptidos de proteólisis seleccionados derivados de los anticuerpos terapéuticos de referencia y (ii) uno o más péptidos de proteólisis correspondientes derivados de dichos anticuerpos terapéuticos susceptibles a estar contenidos inicialmente en la muestra de ensayo.
De hecho, para realizar el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, es esencial que (i) un péptido de proteólisis dado derivado de un anticuerpo terapéutico de referencia (compuesto de patrón interno) y (ii) el péptido de proteólisis correspondiente derivado del anticuerpo terapéutico inicialmente contenido en la muestra de ensayo se distingan por las señales de espectrometría respectivas que se generan por estos péptidos, para posibilitar el cálculo de una relación entre (i) dicho péptido de proteólisis derivado de dicho anticuerpo terapéutico de referencia y (ii) dicho péptido de proteólisis correspondiente derivado del anticuerpo terapéutico inicialmente contenido en la muestra de ensayo.
En realizaciones preferidas del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, estos péptidos de proteólisis pueden distinguirse por espectrometría de masas usando un compuesto de patrón interno que consiste en un anticuerpo terapéutico marcado, y muy preferiblemente un anticuerpo terapéutico marcado isotópicamente estable (SIL).
De hecho, el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se diseña específicamente para cuantificar la cantidad (por ejemplo, la concentración) de anticuerpos terapéuticos contenidos en líquidos corporales de un paciente tratado con dichos anticuerpos terapéuticos, es decir, anticuerpos terapéuticos no marcados, de modo que los anticuerpos terapéuticos de referencia son muy preferiblemente anticuerpos terapéuticos marcados, y muy preferiblemente anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables (SIL), como se ilustra completamente a lo largo de toda la presente memoria descriptiva.
La presente invención se refiere a un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en una muestra de un individuo humano, que comprende las etapas de:
a) añadir a una muestra de ensayo que puede contener anticuerpos terapéuticos a cuantificar una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis,
b) someter la muestra preproteólisis a una proteólisis enzimática, para proporcionar una muestra de proteólisis que comprende (i) péptidos marcados de proteólisis derivados de los anticuerpos terapéuticos marcados y (ii) péptidos de proteólisis derivados del anticuerpo terapéutico contenido en la muestra de ensayo,
c) determinar por análisis espectrométrico de masas la relación entre (i) uno o más péptidos marcados de proteólisis seleccionados y (ii) uno o más péptidos de proteólisis correspondientes derivados de dicho anticuerpo terapéutico, d) calcular, a partir de la relación determinada en la etapa c), la cantidad de dicho anticuerpo terapéutico en la muestra de ensayo;
en el que la muestra de ensayo es una muestra de plasma humano o una muestra de suero humano, y los dos o más anticuerpos se seleccionan en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones de la etapa a), dichos anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos terapéuticos anti-TNF. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, dichos anticuerpos anti-TNF se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas realizaciones preferidas del método, la muestra de ensayo es una muestra humana de un individuo al que se ha administrado un anticuerpo anti-TNF seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas otras realizaciones de la etapa a), dichos anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos antineoplásicos. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, dichos anticuerpos antineoplásicos se seleccionan en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones preferidas del método, la muestra de ensayo es una muestra humana de un individuo al que se ha administrado un anticuerpo antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
Los autores de la invención han demostrado que una cuantificación precisa de anticuerpos terapéuticos en una muestra humana, que también puede denominarse "muestra de ensayo" en este documento, puede permitirse a través del diseño de un método en el que la cantidad de anticuerpos terapéuticos, si están presentes en dicha muestra, se determina por un análisis de espectrometría de masas que hace uso de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos como patrones internos de un método de cuantificación de CL-EM/EM. Esto se ilustra de forma destacable en los ejemplos en este documento, mediante la cuantificación de anticuerpos anti-TNF y de anticuerpos antineoplásicos en muestras humanas, especialmente en muestras de suero humano.
Los autores de la invención han demostrado en este documento que el método que han concebido permite una cuantificación sensible, específica y reproducible de anticuerpos terapéuticos en muestras humanas, que abarcan muestras de plasma humano y muestras de suero humano. Estas ventajas del método de cuantificación descrito en este documento son muy destacables ya que la mayoría de los anticuerpos terapéuticos a cuantificar consisten en anticuerpos humanizados o anticuerpos "humanos completos" que comparten la mayoría de sus secuencias de aminoácidos con los anticuerpos que se encuentran de forma natural en los líquidos corporales humanos, incluyendo los anticuerpos que se encuentran en el suero humano o el plasma humano. Esta situación representaba una gran dificultad técnica para seleccionar péptidos derivados de anticuerpo específicos y únicos pertinentes a controlar por espectrometría, que no se encuentran de lo contrario de forma natural en líquidos corporales humanos, incluyendo suero humano o plasma humano.
De forma ilustrativa, Infliximab es un anticuerpo quimérico murino-humano anti-TNF y, por tanto, contiene secuencias de aminoácidos principalmente humanas que se encuentran en anticuerpos humanos. Infliximab es un anticuerpo monoclonal quimérico murino/humano genomanipulado dirigido contra el antígeno TNF-alfa. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgG1 kappa que contiene secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada murinas y secuencias de la región constante humanas. Significa que la secuencias de aminoácidos encontradas en las regiones constantes son comunes a las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de IgG humana.
Etanercept es una proteína de fusión dimérica recombinante que consiste en la parte extracelular de unión a ligando del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR) humano de 75 kilodalton (p75) ligada a la parte Fc de IgG1 humana. El componente Fc de Etanercept contiene el dominio CH2, el dominio CH3 y la región de bisagra, pero no el dominio CH1 de IgG1. Las únicas secuencias de aminoácidos que difieren de las secuencias proteínicas humanas se encuentran en la región conectora.
Adalimumab es un anticuerpo monoclonal humano contra TNF-alfa, producido por tecnología de ADN recombinante usando un sistema de expresión en células de mamífero. Se encuentran pequeñas diferencias de aminoácidos en la región variable en comparación con secuencias de IgG humana.
Certolizumab pegol es un fragmento de anticuerpo Fab' recombinante contra el factor de necrosis tumoral alfa que está conjugado con un polietilenglicol de aproximadamente 40kDa. Se encuentran pequeñas diferencias de aminoácidos en la región variable del Fab' en comparación con secuencias de IgG humana.
Golimumab es un anticuerpo monoclonal IgG1 k humano derivado de inmunización de ratones genomanipulados con TNFa humano. Se encuentran pequeñas diferencias de aminoácidos en la región variable en comparación con secuencias de IgG humana.
Trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado del isotipo IgG1 dirigido contra el receptor humano HER2/Neu.
Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimérico murino-humano dirigido contra el receptor de CD20 y, por tanto, contiene secuencias de aminoácidos principalmente humanas que se encuentran en anticuerpos humanos. El anticuerpo es una inmunoglobulina IgG 1 kappa que contiene secuencias de la región variable de la cadena ligera y pesada murinas y secuencias de la región constante humanas. Significa que la secuencias de aminoácidos encontradas en las regiones constantes son comunes a las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de IgG humana.
Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante del isotipo IgG 1 dirigido contra VEGF humano.
Como se entenderá fácilmente a partir de la presente memoria descriptiva, el método de cuantificación descrito en este documento es útil tanto (i) en situaciones en las que un paciente ensayado ha recibido un tratamiento terapéutico mediante la administración de un anticuerpo terapéutico único como (ii) en situaciones en las que un paciente ensayado ha recibido, simultánea o secuencialmente, más de un anticuerpo terapéutico.
Como se muestra en los ejemplos en este documento, los autores de la invención han demostrado que puede realizarse una cuantificación precisa de anticuerpos terapéuticos en una muestra humana a través del diseño de un método en el que la cantidad de anticuerpos terapéuticos, si están presentes en dicha muestra, se determina por un método de espectrometría de masas haciendo uso de (i) uno o más péptidos de proteólisis derivados de dos o más anticuerpos terapéuticos contenidos en dicha muestra humana y (ii) uno o más péptidos de proteólisis derivados de una forma marcada de dichos dos o más anticuerpos terapéuticos después de:
(A) calcular una relación entre:
(i) la señal de espectrometría generada por uno o más péptidos de proteólisis derivados de anticuerpo terapéutico seleccionados de cada uno de dos o más anticuerpos terapéuticos
y
(ii) la señal de espectrometría generada por uno o más péptidos de proteólisis derivados de anticuerpo terapéutico marcados seleccionados de cada uno de las dos o más formas marcadas de dichos dos o más anticuerpos anti-TNF usados como uno o más compuestos de patrón interno, y
(B) determinar la cantidad de anticuerpos terapéuticos, si están presentes, en dicha muestra humana presentando el valor de la relación calculado en la etapa (A) para cada uno del uno o más péptidos de proteólisis en una curva de calibración de valores de relación.
El tipo del uno o más compuestos de patrón interno que se usan, concretamente anticuerpos terapéuticos marcados completos, contribuye fuertemente a la exactitud y precisión del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos que se describe en este documento como se explica en otra parte en la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, dichos anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos anti-TNF, especialmente anticuerpos anti-TNF seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas otras realizaciones, dichos anticuerpos terapéuticos consisten en anticuerpos antineoplásicos, especialmente anticuerpos antineoplásicos seleccionados en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
Compuestos de patrón interno para cuantificar anticuerpos terapéuticos
Como se muestra en los ejemplos en este documento, (1) la alta especificidad de los péptidos de proteólisis derivados de estos compuestos de patrón interno y de los anticuerpos terapéuticos contra proteínas plasmáticas humanas endógenas, así como (2) la alta homología fisicoquímica de (i) los péptidos de proteólisis derivados de estos compuestos de patrón interno, y de (ii) la proteólisis derivada de los anticuerpos terapéuticos, permite una cuantificación muy precisa de dichos anticuerpos terapéuticos en una muestra.
Para realizar el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, dos o más anticuerpos terapéuticos marcados distintos se añaden a la muestra de ensayo. Los péptidos de proteólisis marcados específicos (también denominados "péptidos equivalentes marcados") se generan en la etapa b), junto con los correspondientes péptidos de proteólisis no marcados (también denominados "péptidos equivalentes" o "péptidos equivalentes no marcados") de los correspondientes anticuerpos terapéuticos no marcados a cuantificar que estaban inicialmente presentes en dicha muestra de ensayo. Entonces, como se describe con mayor detalle en la presente memoria descriptiva, el uno o más anticuerpos terapéuticos presentes en la muestra de ensayo se cuantifican por un método de espectrometría de masas en el que las señales generadas por las parejas marcadas y no marcadas de
péptidos equivalentes se miden para determinar una relación entre las dos señales generadas (es decir, la señal generada por un péptido equivalente marcado específico y la señal generada por el péptido equivalente no marcado específico complementario). Entonces, los valores de relación se usan para determinar la concentración del uno o más anticuerpos terapéuticos inicialmente contenidos en la muestra de ensayo. Más preferiblemente, dichos valores de relación se usan para determinar la concentración del uno o más anticuerpos terapéuticos inicialmente contenidos en la muestra de ensayo presentando estos valores de relación en una curva de calibración de valores de relación. Por consiguiente, dichos "valores" consisten en las señales de espectrometría generadas por los péptidos de proteólisis controlados.
Entonces, el uno o más valores de relación se presentan en una curva de calibración para determinar la cantidad (por ejemplo, la concentración) de uno o más anticuerpos terapéuticos en la muestra de ensayo.
En algunas realizaciones, una curva de calibración representa (i) la cantidad medida de un anticuerpo terapéutico de interés (por ejemplo, en las ordenadas) frente a (ii) la cantidad esperada de dicho anticuerpo terapéutico (por ejemplo, en las abscisas).
En algunas otras realizaciones, una curva de calibración representa (i) los valores de relación entre el área de la señal de espectrometría de un anticuerpo terapéutico de interés y el área de la señal de espectrometría del correspondiente anticuerpo terapéutico marcado (compuestos de patrón interno) (por ejemplo, en las ordenadas) frente a (ii) la cantidad esperada de dicho anticuerpo terapéutico (por ejemplo, en las abscisas).
Cuanto mayor sea el número de anticuerpos terapéuticos marcados distintos añadidos en la muestra de ensayo en la etapa a) del método, mayor será el número de anticuerpos terapéuticos distintos que pueden cuantificarse en una muestra de ensayo usando el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, estos uno o más anticuerpos terapéuticos marcados corresponden a (i) la una o más formas marcadas de uno o más anticuerpos terapéuticos que se han administrado a dicho individuo, y/o (ii) la una o más formas marcadas de uno o más anticuerpos terapéuticos que pueden estar presentes dentro de dicha muestra de ensayo.
En algunas realizaciones, estos anticuerpos terapéuticos marcados pueden consistir en uno o más anticuerpos terapéuticos que comprenden uno o más péptidos distintivos presentes dentro de los anticuerpos terapéuticos que (i) se han administrado a dicho individuo, y/o que (ii) pueden estar presentes dentro de dicha muestra de ensayo, y que deben cuantificarse.
En algunas realizaciones, estos anticuerpos terapéuticos y anticuerpos terapéuticos marcados pueden consistir en uno o más anticuerpos IgG humanizados, y fragmentos de los mismos.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, el número de anticuerpos terapéuticos marcados que se usan como compuestos de patrón interno varían de dos a cinco anticuerpos marcados distintos, que abarca dos, tres, cuatro y cinco anticuerpos marcados distintos.
En algunas realizaciones, estos anticuerpos marcados pueden consistir en anticuerpos anti-TNF. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, los anticuerpos anti-TNF pueden seleccionarse en un grupo que comprende Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado y Etanercept marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado y Adalimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Etanercept marcado y Adalimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Etanercept marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Etanercept marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Adalimumab marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Adalimumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado y Adalimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Etanercept marcado, Adalimumab marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Etanercept marcado, Adalimumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Certolizumab marcado, Adalimumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Adalimumab marcado, Infliximab marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Adalimumab marcado, Infliximab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Certolizumab marcado, Infliximab marcado y Adalimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Certolizumab marcado, Infliximab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado y Certolizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos anti-TNF marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En algunas realizaciones, estos anticuerpos marcados pueden consistir en anticuerpos antineoplásicos. De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, los anticuerpos antineoplásicos pueden seleccionarse en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos antineoplásicos marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Trastuzumab marcado y Rituximab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos antineoplásicos marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Trastuzumab marcado y Bevacizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos antineoplásicos marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Rituximab marcado y Bevacizumab marcado.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, los anticuerpos antineoplásicos marcados que se usan como compuestos de patrón interno comprenden Trastuzumab marcado, Rituximab marcado y Bevacizumab marcado.
Como se usa en este documento, un anticuerpo terapéutico "marcado", también denominado en este documento "forma marcada" de anticuerpos terapéuticos, consiste en un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo terapéutico o una combinación de anticuerpo a cuantificar, y que se ha obtenido por un método de acuerdo con el que uno o más aminoácidos marcados se han incorporado en la una o más cadenas polipeptídicas. Los métodos para marcar los anticuerpos terapéuticos (incluyendo anticuerpos anti-TNF y/o antineoplásicos) que se usan como compuestos de patrón interno en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se divulgan en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Por tanto, como se usa en este documento, un anticuerpo anti-TNF "marcado" seleccionado en un grupo que comprende Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado no significa que los anticuerpos terapéuticos Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab o Golimumab se hayan marcado. En su lugar, un anticuerpo anti-TNF "marcado" consiste en un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo terapéutico anti-TNF seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab y que se ha obtenido por un método de acuerdo con el que uno o más aminoácidos marcados se han introducido en la una o más cadenas polipeptídicas. Los métodos para marcar los anticuerpos anti-TNF que se usan como compuestos de patrón interno en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se divulgan en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Además, un anticuerpo antineoplásico "marcado" seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab marcado, Rituximab marcado y Bevacizumab marcado no significa que los anticuerpos terapéuticos Trastuzumab, Rituximab o Bevacizumab se hayan marcado. En su lugar, un anticuerpo antineoplásico "marcado" consiste en un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo terapéutico antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab y que se ha obtenido por un método de acuerdo con el que uno o más aminoácidos marcados se han introducido en la una o más cadenas polipeptídicas. Los métodos para marcar los anticuerpos antineoplásicos que se usan como compuestos de patrón interno en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se divulgan en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Como se usa en este documento, un anticuerpo terapéutico "marcado", también denominado en este documento "forma marcada" de anticuerpos terapéuticos, consiste en un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo terapéutico o una combinación de anticuerpo a cuantificar, y que se ha obtenido por un método de acuerdo con el que uno o más aminoácidos marcados se han incorporado en la una o más cadenas polipeptídicas. Los métodos para marcar los anticuerpos terapéuticos (incluyendo anticuerpos anti-TNF y/o antineoplásicos) que se usan como compuestos de patrón interno en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se divulgan en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Por tanto, como se usa en este documento, un anticuerpo anti-TNF "marcado" seleccionado en un grupo que comprende Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado no significa que los anticuerpos terapéuticos Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab o Golimumab se hayan marcado. En su lugar, un anticuerpo anti-TNF "marcado" consiste en un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo terapéutico anti-TNF seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab y que se ha obtenido por un método de acuerdo con el que uno o más aminoácidos marcados se han introducido en la una o más cadenas polipeptídicas. Los métodos para marcar los anticuerpos anti-TNF que se usan como compuestos de patrón interno en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se divulgan en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Además, un anticuerpo antineoplásico "marcado" seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab marcado, Rituximab marcado y Bevacizumab marcado no significa que los anticuerpos terapéuticos Trastuzumab, Rituximab o Bevacizumab se hayan marcado. En su lugar, un anticuerpo antineoplásico "marcado" consiste en un anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un anticuerpo terapéutico antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab y que se ha obtenido por un método de acuerdo con el que uno o más aminoácidos marcados se han introducido en la una o más cadenas polipeptídicas. Los métodos para marcar los anticuerpos antineoplásicos que se usan como compuestos de patrón interno en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se divulgan en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Selección de péptidos de proteólisis derivado de un anticuerpo terapéutico
Los péptidos de proteólisis derivados de un anticuerpo terapéutico a controlar por espectrometría de masas cuando se realiza el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento pueden seleccionarse de acuerdo con métodos de selección que son conocidos por los expertos en la materia.
De acuerdo con el presente método de cuantificación de anticuerpos que se realiza partiendo con una muestra humana, y especialmente una muestra de plasma humano o una muestra de plasma humano, los péptidos de proteólisis se seleccionarán para (i) que sean discriminantes con respecto a péptidos de proteólisis susceptibles a generarse sometiendo proteínas endógenas humanas a la acción de una proteasa, por ejemplo, tripsina o IdeS, y (ii) que sean discriminantes con respecto a péptidos de proteólisis susceptibles a generarse por la acción de una proteasa, por ejemplo, tripsina o IdeS, sobre otros anticuerpos terapéuticos exógenos que son susceptibles de estar presentes en dicha muestra humana, por ejemplo, dicha muestra de plasma humano o dicha muestra de suero humano.
La estrategia de péptidos equivalentes se basa en el análisis del péptido equivalente para la cuantificación de la proteína diana completa. Por lo tanto, la selección del péptido equivalente apropiado es crucial para garantizar la sensibilidad, especificidad y robustez del ensayo. Habitualmente, los péptidos "distintivos", que son péptidos únicos para la proteína diana específica, se eligen como péptidos equivalentes. La selección de los péptidos equivalentes apropiados debe: (1) evitar péptidos propensos a modificación química (por ejemplo, péptidos que contienen metionina, cisteína o triptófano); (2) evitar arginina-arginina y lisina-lisina en la secuencia peptídica para minimizar la digestión tríptica incompatible; y (3) seleccionar péptidos con longitud apropiada (~ 8-20 aminoácidos): que sean demasiado cortos puede provocar ausencia de selectividad, y demasiado largos puede afectar a la sensibilidad (Wu etal., Rapid Commun Mass Spectrom. 2011; Vol. 25:281-90).
Un procedimiento típico es realizar una digestión in silico del anticuerpo terapéutico dado para generar un conjunto de posibles péptidos equivalentes. Estos péptidos entonces se investigan frente a todas las proteínas existentes en las matrices biológicas usando bases de datos en línea (por ejemplo, Standard Protein BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi?PAGE =Proteins) para confirmar que los péptidos distintivos existen solamente en la proteína diana. La sensibilidad, especificidad y comportamiento cromatográfico de estos péptidos distintivos se evalúan entonces usando muestras de proteínas digeridas reales en matrices biológicas, y el o los mejores se elegirán como el o los péptidos equivalentes para dicho anticuerpo terapéutico dado.
Los péptidos de proteólisis se seleccionan basándose en herramientas de predicción in silico en línea (Kamiie et al., Pharmaceutical Research, vol. 25(6): 1469-1483, 2008). Todos los posibles péptidos trípticos se cribaron por alineación frente al proteoma humano.
Como se usa en este documento, los péptidos de proteólisis, que también pueden denominarse péptidos equivalentes en este documento, se seleccionan basándose en su singularidad entre los péptidos que pueden estar presentes
después de someter plasma humano o suero humano a una proteasa. Por consiguiente, cada péptido de proteólisis seleccionado consiste en una características distintiva única de la presencia de un anticuerpo terapéutico dado en una muestra.
Para un anticuerpo terapéutico dado a cuantificar con el método de cuantificación descrito en este documento, la selección de uno o más péptidos de proteólisis (es decir, "uno o más péptidos equivalentes") puede realizarse comparando (i) un conjunto de los péptidos de proteólisis esperados derivados de dicho anticuerpo terapéutico dado con (ii) un conjunto de los péptidos de proteólisis que se esperan obtener de la misma proteólisis de proteínas de plasma humano o suero humano, y especialmente un conjunto de los péptidos de proteólisis que se esperan obtener de la misma proteólisis de anticuerpos terapéuticos.
En algunas realizaciones, el conjunto de péptidos de proteólisis esperados puede obtenerse in silico usando la masa del péptido de consulta en la herramienta bioinformática en línea www.expasy.ch después de introducir en la herramienta (i) la secuencia de dicho anticuerpo terapéutico dado y (ii) las secuencias de las proteínas que se espera que estén contenidas en plasma humano o suero humano, y especialmente las secuencias de anticuerpos terapéuticos, tales como IgG humana. Entonces, se seleccionan los péptidos encontrados exclusivamente en el conjunto de péptidos de proteólisis derivados de dicho anticuerpo terapéutico dado y que, por tanto, no se encuentran en el conjunto de péptidos de proteólisis derivados de las proteínas que se espera que estén contenidas en plasma humano o suero humano, tales como IgG humana.
La selección de péptidos de proteólisis (péptidos equivalentes) derivados de dicho anticuerpo terapéutico dado también puede realizarse in silico, realizando una búsqueda de similitud mediante alineación de secuencias frente a una base de datos de proteínas humanas tales como la base de datos UniProtKB_HUMAN, y usando un programa bioinformático pertinente, por ejemplo, la herramienta bioinformática denominada BLAST 2.0 (Basic Local Alignment Search Tool). La selección del uno o más péptidos de proteólisis derivados de dicho anticuerpo terapéutico dado para cuantificación por CL-EM/EM en general tendrá en cuenta la puntuación resultante de BLAST que calcula la significación estadística de las coincidencias.
Entre el conjunto de uno o más péptidos proteolíticos posibles preseleccionados como se describe anteriormente, se excluyen aquellos péptidos proteolíticos posibles con sitios de escisión perdidos por la proteasa. Los sitios de escisión perdidos pueden predecirse usando el programa informático denominado MC:pred (Lawless etal., OMICS, Sep 2012, Vol. 16(9)).
Entonces, en algunas realizaciones, la singularidad de cada uno de los péptidos de proteólisis seleccionados se confirma muy preferiblemente de manera experimental, por ejemplo, frente a un subconjunto de la base de datos UniProt SwissProt de Homo sapiens incrementada por la secuencia de dicho anticuerpo terapéutico dado.
En otras realizaciones más, la singularidad de cada uno de los péptidos de proteólisis seleccionados se confirma muy preferiblemente de manera experimental además analizando una muestra que contiene una colección de solución terapéutica polivalente humana (es decir, IgG) de la misma manera para garantizar que los péptidos distintivos de dicho anticuerpo terapéutico dado están ausentes de la digestión con proteasa polivalente humana (es decir, IgG).
Realizaciones específicas de péptidos de proteólisis seleccionados
Para realizar el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, en el que la etapa de proteólisis b) hace uso de tripsina como única proteasa o de tripsina como proteasa contenida en una mezcla de proteasas, el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que comprende:
para Infliximab:
LEESGGGLVQPGGSMK (SEQ ID NO. 1),
GLEWVAEIR (SEQ ID NO. 2),
SINSATHYAESVK (SEQ ID NO. 3),
SAVYLQMTDLR (SEQ ID NO. 4),
TEDTGVYYCSR (SEQ ID NO. 5),
DILLTQSPAILSVSPGER (SEQ ID NO. 6),
ASQFVGSSIHWYQQR (SEQ ID NO. 7),
YASESMSGIPSR (SEQ ID NO.8),
para Etanercept:
LPAQVAFTPYAPEPGSTCR (SEQ ID NO. 9),
EYYDQTAQMCCSK (SEQ ID NO. 10),
CSSDQVETQACTR (SEQ ID NO. 11),
ICTCRPGWYCALSK (SEQ ID NO. 12),
LCAPLR (SEQ ID NO. 13),
SMAPGAVHLPQPVSTR (SEQ ID NO. 14),
SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPK (SEQ ID NO. 15),
para Adalimumab:
GLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGR (SEQ ID NO. 16),
VSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO.17),
QAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGR (SEQ ID NO.18),
ASQGIR (SEQ ID NO. 19),
NYLAWYQQKPGK (SEQ ID NO. 20),
LLIYAASTLQSGVPSR (SEQ ID NO. 21),
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQR (SEQ ID NO.22),
APYTFGQGTK (SEQ ID NO. 23),
para Certolizumab:
LSCAASGYVFTDYGMNWVR (SEQ ID NO. 24),
GLEWMGWINTYIGEPIYADSVK (SEQ ID NO.25),
FTFSLDTSK (SEQ ID NO. 26),
STAYLQMNSLR (SEQ ID NO. 27),
ASQNVGTNVAWYQQKPGK (SEQ ID NO. 28),
ALIYSASFLYSGVPYR (SEQ ID NO. 29
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTK (SEQ ID NO. 30),
para Golimumab:
LSCAASGFIFSSYAMHWVR (SEQ ID NO. 31),
QAPGNGLEWVAFMSYDGSNK (SEQ ID NO. 32),
GIAAGGNYYYYGMDVISSQGTTVTVSSASTK (SEQ ID NO. 33),
ASQSVYSYLAWYQQK (SEQ ID NO. 34),
LLIYDASNR (SEQ ID NO. 35),
FSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQR (SEQ ID NO. 36),
SNWPPFTFGPGTK (SEQ NO. 37),
para Trastuzumab:
LSCAASGFNIK (SEQ ID NO. 47)
DTYIHWVR (SEQ ID NO. 48)
IYPTNGYTR (SEQ ID NO. 49)
FTISADTSK (SEQ ID NO. 50)
ASQDVNTAVAWYQQKPGK (SEQ ID NO. 51)
LLIYSASFLYSGVPSR (SEQ ID NO. 52)
SGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTK (SEQ ID NO. 53)
para Rituximab:
QVQLQQPGAELVKPGASVK (SEQ ID NO. 54)
ASGYTFTSYNMHWVK (SEQ ID NO. 55)
GLEWIGAIYPGNGDTSYNQK (SEQ ID NO. 56)
ATLTADK (SEQ ID NO. 57)
SSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR (SEQ ID NO.58)
STYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTK (SEQ ID NO.59)
QIVLSQSPAILSASPGEK (SEQ ID NO. 60)
VTMTCR (SEQ ID NO. 61)
ASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVR (SEQ ID NO. 62)
FSGSGSGTSYSLTISR (SEQ ID NO63)
VEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTK (SEQ ID NO. 64)
para Bevacizumab:
LSCAASGYTFTNYGMNWVR (SEQ ID NO. 65)
GLEWVGWINTYTGEPTYAADFK (SEQ ID NO. 66)
FTFSLDTSK (SEQ ID NO. 67)
STAYLQMNSLR (SEQ ID NO. 68)
YPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTK (SEQ ID NO. 69)
VTITCSASQDISNYLNWYQQKPGK (SEQ ID NO. 70)
VLIYFTSSLHSGVPSR (SEQ ID NO. 71)
FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTK (SEQ ID NO. 72)
Para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF de la invención, en el que la etapa de proteólisis b) hace uso de una proteasa dirigida a la bisagra, el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que comprende:
para Infliximab:
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRS
KSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSAYYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGST
YDYWGQGTTLTYSSASTKGPSYFPLAPSSKSTSGGTAALGCLYKDYFPEPYTYS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV
DKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG fVH CH1] (SEQ ID NO. 38),
y
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESMS GIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESEDIADYYCQQSHSWPFTFGSGTNLEVKRTVA AP S YFIFPP SDEQEKS GT AS V VCLLNNF YPRE AKV Q WKYDN AEQ S GN S QE S YTE QDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[VL CL] (SEQ IDNO. 39),
para Etanercept:
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVC DSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCAL SKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPH QICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAP STSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG [Fmction P75 du récepteur soluble du TNF alpha] (SEQ ID NO. 40),
para Adalimumab:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAIT WNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTA SSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG fVH CH1] (SEQ ID NO. 41),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRT V AAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V VCLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[VL + CL] (SEQ ID N0.42)
para Certolizumab:
E V QL VE S GGGL VQPGG SLRL SC AAS G Y VFTD Y GMN WVRQ APGKGLE WMG WI NTYIGEPIYADSVKGRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYRSYA MD Y W GQGTL VT V S S ASTKGP S VFPL AP S SKST S GGT AALGCL VKD YFPEP VT V SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCAA [VH CH1] (SEQ ID NO. 43),
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVGTNVAWYQQKPGKAPKALIYSASFL YSGVPYRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNIYPLTFGQGTKVEIKRT V AAP S VFIFPP SDEQLKS GT AS V VCLLNNF YPRE AKV Q WKVDN ALQ S GN S QE S VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[VL CL] (SEQ ID NO. 44),
para Golimumab:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMS YDGSNKKY AD S VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YY C ARDRGIAA GGNYYYYGMDVISSQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCL VKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG [VH + CH1] (SEQ ID NO. 45),
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNR
ATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRT
VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSFSSTFTFSKADYEKHKVYACEVTHQGFSSPVTKSFNRGEC
[VL CL] (SEQ ID NO. 46)
La selección mencionada anteriormente de péptidos de proteólisis consiste en 73 péptidos distintos, que pueden considerarse individualmente y como una combinación de dos o más péptidos de proteólisis seleccionados, para realizar métodos de cuantificación de anticuerpos de la invención.
Por consiguiente, cuando la selección mencionada anteriormente de anticuerpos terapéuticos marcados, y péptidos sometidos de proteólisis de los mismos, se considera como una combinación de dos o más péptidos, dicha combinación puede incluir:
uno o más péptidos sometidos a proteólisis derivados de un mismo anticuerpo; y/o
uno o más péptidos sometidos a proteólisis derivados de una pluralidad de anticuerpos.
Por consiguiente, los anticuerpos terapéuticos que se usan como compuestos de patrón interno, pueden ser adecuados para generar dos o más péptidos de proteólisis seleccionados, que comprenden o que consisten en las SEQ ID NO. 1 a 72, incluyendo cualquier combinación de las mismas.
Por consiguiente, los dos o más péptidos de proteólisis seleccionados que se consideran explícitamente por la invención, incluyen cualquier combinación de dos péptidos de proteólisis seleccionados que comprenden o que consisten en las SEQ ID NO. 1 a 72 ue se marcan a continuación en este documento tabla 1 or un signo "X":
en la q u e .....en el eje de ordenadas marca uno o más péptidos de proteólisis seleccionados que incluyen al menos un péptido de proteólisis seleccionado correspondiente a la SEQ ID NO. de 1 a 72;
en la que (...) corresponde a cualquier SEQ ID NO. Y, siendo Y un número entero seleccionado de 18 a 71, que incluye 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 y 71;
en la que "X" marca una combinación de los dos péptidos de proteólisis seleccionados, seleccionados de las correspondientes SEQ ID seleccionadas de las SEQ ID 1 a 72.
Por consiguiente, cualquier combinación de las mismas se divulga expresamente en el sentido de la invención: cuando Z péptidos de proteólisis seleccionados se controlan (es decir, como péptidos marcados con isótopo estables), estos pueden seleccionarse, de una manera iterativa, de una cualquiera de las combinaciones de dos que se describen anteriormente. Por consiguiente, una mezcla que comprende (Z-1) péptidos de proteólisis seleccionados, incluyendo al menos un péptido de proteólisis seleccionado de la SEQ ID como se define en el eje de ordenadas se combina entonces con un péptido de proteólisis seleccionado adicional como se define en el eje de abscisas, proporcionando de ese modo los Z péptidos de proteólisis seleccionados a controlar.
Por consiguiente, los Z (dos o más) péptidos de proteólisis seleccionados pueden abarcar más de dos, que incluyen más dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez y más de diez péptidos de proteólisis seleccionados.
Los anticuerpos terapéuticos que se usan como compuestos de patrón interno se marcan con uno o más isótopos estables. Los isótopos estables pueden seleccionarse en un grupo que comprende 2H, 13C, 15N y 18O. Preferiblemente, los isótopos estables se seleccionan en un grupo que comprende 13C y 15N.
En algunas realizaciones, el marcaje isotópico se restringe únicamente a aminoácidos específicas, que son preferiblemente arginina, lisina y/o leucina.
Un péptido marcado con isótopo estable (SIL) generado por proteólisis de un anticuerpo terapéutico marcado (anticuerpo terapéutico SIL) usado como compuesto de patrón interno, debido a un incremento de masa suficiente con respecto al mismo péptido, pero sin marcar (es decir, un péptido sin marcar generado por proteólisis del correspondiente anticuerpo terapéutico sin marcar inicialmente presente en la muestra de ensayo), se discrimina, por tanto, de dicho péptido de proteólisis sin marcar por análisis de espectrometría de masas.
De forma ilustrativa, un péptido marcado con isótopo estable seleccionado en un grupo que comprende los péptidos equivalentes de la SEQ Id NO 1-8 (para Infliximab), la SEQ ID NO. 9-15 (para Etanercept), la SEQ ID NO. 16-23 (para Adalimumab), la SEQ ID NO. 24-30 (para Certolizumab), la SEQ ID NO. 31-37 (para Golimumab), la SEQ ID NO. 47 53 (para Trastuzumab), la SEQ ID NO. 54-64 (para Rituximab) o la SEQ iD NO. 65-72 (para Bevacizumab) se discrimina por análisis de espectrometría de masas, a partir de los péptidos equivalentes no marcados de las mismas secuencias de aminoácidos respectivas que se generan tras tratamiento con tripsina de Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab o Bevacizumab, respectivamente.
Además, un péptido marcado con isótopo estable seleccionado en un grupo que comprende los péptidos equivalentes de la SEQ iD NO 38-39 (para Infliximab), 40 (para Etanercept), 41-42 (para Adalimumab), 43-44 (para Certolizumab) o 45-46 (para Golimumab) se discrimina por análisis de espectrometría de masas, a partir de los péptidos equivalentes no marcados de las mismas secuencias de aminoácidos respectivas que se generan tras tratamiento con IdeS de Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab o Golimumab, respectivamente.
Los anticuerpos anti-TNF marcados con isótopo estables (SIL) están, de manera destacable, disponibles en el mercado.
De manera ilustrativa, los péptidos SIL pueden obtenerse de JPT Peptide Technologies GmbH (Berlín, Alemania) o de Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, Francia) con el nombre péptidos Aqua™.
En particular, los anticuerpos terapéuticos marcados con isótopo estables (SIL) están disponibles en la empresa francesa Promise Advanced Proteomics (Grenoble, Francia).
Generación de una curva de calibración
La cuantificación precisa de anticuerpos terapéuticos por análisis espectrométrico de masas se permite mediante el uso de al menos un compuesto de patrón interno por cada anticuerpo terapéutico de interés, cuya presencia en combinación con dicho anticuerpo de interés en una muestra humana permite el cálculo de valores de relación entre (i) la señal de espectrometría generada por un péptido equivalente de proteólisis seleccionado derivado de un anticuerpo terapéutico específico y (ii) la señal de espectrometría generada por un correspondiente péptido equivalente marcado seleccionado generado por tratamiento de proteólisis enzimática de una forma marcada de dicho anticuerpo terapéutico.
Como se detallará adicionalmente en la presente memoria descriptiva, la cuantificación de anticuerpos terapéuticos se realiza presentando el valor de relación calculado para cada péptido de proteólisis considerado en la muestra humana ensayada, o muestra de ensayo, en una curva de calibración de valores de relación generados, para cada anticuerpo terapéutico de interés, con cantidades conocidas de dicho anticuerpo terapéutico de interés y cantidades fijas y conocidas de una forma marcada de dicho anticuerpo terapéutico que se usa como compuesto de patrón interno.
Para generar una curva de calibración, se prepara una serie o conjunto de muestras de calibración (CS), en el que: cada muestra de calibración contiene una cantidad conocida del anticuerpo terapéutico seleccionado, muy preferiblemente una cantidad conocida de un anticuerpo anti-TNF seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab o muy preferiblemente una cantidad conocida de un anticuerpo antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab,
cada muestra de calibración contiene una cantidad fija y conocida de una forma marcada de dicho anticuerpo terapéutico usado como compuesto de patrón interno, muy preferiblemente una cantidad fija y conocida de una forma marcada de dicho anticuerpo terapéutico seleccionado usado como compuesto de patrón interno seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab, o muy preferiblemente una cantidad fija y conocida de una forma marcada de dicho anticuerpo terapéutico seleccionado usado como compuesto de patrón interno seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, y
la serie o conjunto de muestras de calibración se prepara para que cubra un intervalo de cantidades de los anticuerpos terapéuticos que abarca al menos el intervalo de cantidades del o de los anticuerpos terapéuticos que se espera que estén contenidos en una muestra de ensayo.
Por motivos de claridad, cada muestra de calibración comprende la misma cantidad fija y conocida del compuesto de patrón interno seleccionado.
De forma ilustrativa, el intervalo de cantidades del anticuerpo terapéutico seleccionado que está cubierto por la serie o conjunto de muestras de calibración, cuando se expresa como una concentración final en las muestras de calibración, puede variar de 0,1 pg/ml a 100 pg/ml. Por ejemplo, una serie o conjunto de muestras de calibración puede comprender ocho muestras de calibración que comprenden un anticuerpo terapéutico de interés a las concentraciones finales respectivas de 0,1 pg/ml, 0,5 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/ml, 10 pg/ml, 20 pg/ml, 25 pg/ml, 50 pg/ml, 75 pg/ml y 100 pg/ml.
Por tanto, de acuerdo con el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, puede generarse una curva de calibración por cada anticuerpo terapéutico de interés. En algunas realizaciones, puede generarse una curva de calibración por cada anticuerpo anti-TNF de interés, especialmente por cada anticuerpo anti-TNF de interés seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab. En algunas realizaciones, puede generarse una curva de calibración por cada anticuerpo antineoplásico de interés, especialmente por cada anticuerpo antineoplásico de interés seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
En otras realizaciones, puede generarse una curva de calibración simultáneamente para una pluralidad de anticuerpos terapéuticos, especialmente para una pluralidad de anticuerpos anti-TNF seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab, o especialmente para una pluralidad de anticuerpos antineoplásicos seleccionados en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab. De acuerdo con estas realizaciones, una serie de muestras de calibración, conteniendo cada muestra de calibración (i) una pluralidad de anticuerpos terapéuticos no marcados, especialmente para una pluralidad de anticuerpos anti-TNF seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab, o especialmente para una pluralidad de anticuerpos antineoplásicos seleccionados en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, estando cada anticuerpo terapéutico a una concentración dada, y (ii) la forma marcada correspondiente (muy preferiblemente anticuerpos SIL) de cada uno de dicho anticuerpo terapéutico a una concentración fija, y en la que la serie de muestras de calibración cubre un intervalo de concentraciones (por ejemplo, de 0,1 pg/ml a 100 pg/ml) de dichos anticuerpos terapéuticos no marcados, y en la que está presente la misma concentración fija de los correspondientes anticuerpos terapéuticos marcados en cada muestra de calibración (por ejemplo, una concentración fija de 20 pg/ml de cada anticuerpo terapéutico marcado).
De forma ilustrativa, la cantidad dada del anticuerpo terapéutico marcado seleccionado usado como compuesto de patrón interno, especialmente la cantidad dada de anticuerpo anti-TNF marcado seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab, o especialmente la cantidad dada de anticuerpo antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, es preferiblemente una cantidad que genera una señal de espectrometría de masas del mismo orden de magnitud que un patrón de calibración de intervalo medio del anticuerpo terapéutico correspondiente para limitar la diferencia en la intensidad de la señal de espectrometría de masas generada por las cantidades respectivas (i) de péptidos equivalentes marcados derivados de proteólisis enzimática de dicho anticuerpo terapéutico marcado usado como compuesto de patrón interno y (ii) de los correspondientes péptidos de proteólisis derivados de dicho anticuerpo terapéutico. De forma ilustrativa, las relaciones de cantidad (por ejemplo, que se expresa como cantidad en peso o como cantidades en peso/volumen) entre un anticuerpo terapéutico no marcado y el correspondiente anticuerpo terapéutico marcado puede variar de 1:10 a 10:1, que abarca relaciones de cantidad de 1:5 a 5:1.
De hecho, la cantidad de anticuerpos terapéuticos que pueden encontrarse en una muestra de ensayo, especialmente en una muestra de ensayo que consiste en una muestra de suero humano originaria de un paciente tratado por anticuerpos terapéuticos, puede variar, dependiendo de (i) la cantidad de anticuerpo o anticuerpos terapéuticos que se ha administrado a dicho paciente, (ii) el periodo de tiempo en que se ha recogido la muestra de suero desde el periodo de tiempo de inicio del tratamiento, (ii) el periodo de tiempo de recogida de la muestra de suero desde la última administración de anticuerpos terapéuticos, y (iv) parámetros fisiológicos que pueden ser específicos para dicho paciente, tal como la tasa de eliminación de dichos anticuerpos de la sangre.
En algunas realizaciones, la serie o conjunto de muestras de calibración puede comprender además una o más muestras de calibración de control que no contienen el anticuerpo terapéutico seleccionado o, como alternativa, que no contienen ningún anticuerpo terapéutico.
Más preferiblemente, una muestra de calibración se prepara partiendo de una muestra de líquido corporal inicialmente exenta del anticuerpo terapéutico seleccionado o del compuesto de patrón interno seleccionado, y preferiblemente suero o plasma de un mamífero no humano o de un individuo humano, y muy preferiblemente suero humano o plasma humano.
Entonces, cada muestra de calibración se somete a las mismas etapas del método que las descritas para las muestras de ensayo en otra parte en la presente memoria descriptiva, para proporcionar una serie o conjunto de muestras de ensayo de calibración (CAS).
Entonces, cada muestra de ensayo de calibración se somete a análisis espectrométrico, y muy preferiblemente a un análisis de CL-EM/EM, en las mismas condiciones que las descritas para las muestras de ensayo en otra parte en la presente memoria descriptiva y entonces se miden los valores de las señales de espectrometría generadas por (i) un péptido equivalente seleccionado generado por proteólisis enzimática del anticuerpo terapéutico seleccionado y por (ii) el correspondiente péptido marcado seleccionado (también denominado "péptido equivalente marcado") generado por proteólisis enzimática del anticuerpo terapéutico marcado seleccionado, especialmente por el correspondiente péptido seleccionado (también denominado "péptido equivalente marcado") generado por proteólisis enzimática del anticuerpo terapéutico marcado seleccionado, incluyendo un anticuerpo anti-TNF marcado seleccionado en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab o incluyendo un anticuerpo antineoplásico seleccionado en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, usando como compuesto de patrón interno.
Entonces, para cada muestra de ensayo de calibración (CAS), se calcula una relación de (i) el valor de señal de espectrometría generado por el péptido equivalente de anticuerpo terapéutico seleccionado a (ii) el valor de señal de espectrometría generado por el péptido equivalente marcado derivado de patrón interno seleccionado.
Como se detallará adicionalmente en la presente memoria descriptiva, un valor de señal espectrométrica pude consistir en el área del pico de SRM (control de reacción seleccionada - Selected Reaction Monitoring) específico, o de manera más precisa, en la media de las áreas de pico de SRM específico, generadas por un péptido seleccionado de interés, típicamente por un péptido tríptico equivalente seleccionado derivado del anticuerpo terapéutico marcado seleccionado usado como un patrón interno descrito en este documento.
Por tanto, se proporciona una serie o un conjunto de valores de relación, calculándose cada valor de relación a partir de una muestra de ensayo de calibración obtenida de una muestra de calibración de partida que comprende cantidades conocidas, por ejemplo, concentraciones finales conocidas, del anticuerpo terapéutico seleccionado y una cantidad fija y conocida del compuesto de patrón interno.
Entonces puede generarse una curva de calibración representando la serie o conjunto de valores de referencia calculados frente a las correspondientes cantidades teóricas del anticuerpo terapéutico seleccionado, por ejemplo, frente a las correspondientes concentraciones finales conocidas del anticuerpo terapéutico seleccionado.
Como se usa en este documento, una concentración "final" de un anticuerpo terapéutico seleccionado es la concentración de dicho anticuerpo terapéutico en una muestra de calibración (CS) inicial, comprendiendo dicha CS una cantidad añadida conocida de dicho anticuerpo terapéutico.
Preparación de muestra
En algunas realizaciones, la muestra que se usa en el método de cuantificación se origina a partir de una muestra de sangre humana completa que se ha recogido previamente de un individuo. En realizaciones preferidas, los glóbulos, y especialmente los eritrocitos, se retiran por centrifugación para obtener una muestra de plasma. En otras realizaciones preferidas, se permite que se produzca coagulación de la muestra de sangre completa y se obtiene una muestra de suero.
Al menos para determinar el perfil farmacocinético de anticuerpos terapéuticos en un individuo, dicha muestra es una muestra de plasma sanguíneo o una muestra de suero sanguíneo, o una muestra derivada de plasma sanguíneo o suero sanguíneo.
En algunas realizaciones, la muestra inicial puede someterse a dilución, por ejemplo, en un medio acuoso tal como en una solución salina o en una solución de tampón, antes de usarla como muestra de ensayo en el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de acuerdo con la invención.
Sin embargo, en las realizaciones más preferidas, la muestra inicial, tal como una muestra de plasma o una muestra de suero, se usa sin ningún pretratamiento y, en particular, se usa tal cual sin diluir.
Como se describirá adicionalmente en la presente memoria descriptiva, de acuerdo con el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, la muestra a ensayar se añade con una cantidad conocida de los dos o más anticuerpos terapéuticos marcados seleccionados usados como compuestos de patrón interno en la etapa a).
En estas realizaciones, por tanto, se proporciona una muestra que contiene una cantidad conocida de cada uno de los dos o más anticuerpos terapéuticos marcados seleccionados usados como compuestos de patrón interno y una cantidad desconocida de anticuerpos terapéuticos (por ejemplo, anticuerpos anti-TNF o anticuerpos antineoplásicos).
En algunas realizaciones, dicha muestra comprende solamente dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan entre anticuerpos anti-TNF de interés, y muy preferiblemente solamente dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado.
En otras realizaciones, dicha muestra comprende más de dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan entre anticuerpos anti-TNF de interés y muy preferiblemente más de dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado. Estas otras realizaciones abarcan aquellas en las que dicha muestra comprende 3, 4 o 5 compuestos de patrón interno, que se seleccionan entre anticuerpos anti-TNF de interés y muy preferiblemente 3, 4 o 5 compuestos de patrón interno, que se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab marcado, Etanercept marcado, Adalimumab marcado, Certolizumab marcado y Golimumab marcado. Las diversas combinaciones de compuestos de patrón interno que se añaden (o "incorporan") se describen en otra parte en la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, dicha muestra comprende solamente dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan entre anticuerpos antineoplásicos de interés, y muy preferiblemente solamente dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan en un grupo que comprende Trastuzumab marcado, Rituximab marcado y Bevacizumab marcado.
En otras realizaciones, dicha muestra comprende más de dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan entre anticuerpos antineoplásicos de interés y muy preferiblemente más de dos compuestos de patrón interno, que se seleccionan en un grupo que comprende Trastuzumab marcado, Rituximab marcado y Bevacizumab marcado. Estas otras realizaciones abarcan aquellas en las que dicha muestra comprende 3 compuestos de patrón interno, que se seleccionan entre anticuerpos antineoplásicos de interés.
Las diversas combinaciones de compuestos de patrón interno que se añaden (o "incorporan") se describen en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Los compuestos de patrón interno se someten a cada una de las etapas adicionales del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento.
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, la etapa a) comprende las siguientes etapas:
a1) añadir a una muestra de ensayo que puede contener anticuerpos terapéuticos una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos, tal como una cantidad conocida de dos o más anticuerpos anti-TNF marcados que se seleccionan en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab o tal como una cantidad conocida de anticuerpos antineoplásicos marcados que pueden seleccionarse en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis no concentrada, y
a2) enriquecer la muestra preproteólisis no concentrada en anticuerpos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis.
Preparación de mezcla preproteólisis
En la etapa a), o como alternativa en la etapa a2), por tanto, se proporciona una mezcla preproteólisis que contiene una cantidad conocida de compuestos de patrón interno y una cantidad desconocida de anticuerpos terapéuticos.
En realizaciones muy preferidas, dicha mezcla preproteólisis comprende dos o más anticuerpos terapéuticos marcados.
En algunas realizaciones muy preferidas, dicha mezcla preproteólisis comprende dos o más anticuerpos anti-TNF marcados, especialmente dos o más anticuerpos anti-TNF marcados seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab, como compuestos de patrón interno.
En algunas otras realizaciones muy preferidas, dicha mezcla preproteólisis comprende dos o más anticuerpos antineoplásicos marcados, especialmente dos o más anticuerpos antineoplásicos seleccionados en un grupo que comprende Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
Enriquecimiento de la muestra en anticuerpos terapéuticos
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, la etapa a) o, como alternativa, la etapa a2), puede consistir en una etapa en la que el enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos se realiza por inmunocaptura, es decir, formado complejos de los anticuerpos terapéuticos posiblemente presentes en la muestra de ensayo con los correspondientes ligandos de anticuerpos terapéuticos, y en el que los complejos reversibles formados entre los anticuerpos terapéuticos y dichos ligandos de anticuerpos terapéuticos pueden purificarse y los anticuerpos anti-TNF pueden disociarse y recogerse.
Estas realizaciones de la etapa a), o etapa a2), del método de cuantificación pueden realizarse por cualquier método conocido en la técnica, que incluye cromatografía de afinidad e inmunocaptura. La cromatografía de afinidad y la inmunocaptura se basan ambas en el mismo principio técnico de unión y elución de los anticuerpos terapéuticos usando un sustrato en el que se inmovilizan los ligandos de anticuerpos terapéuticos, preferiblemente un sustrato en el que se inmovilizan las correspondientes moléculas diana.
Por tanto, de acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones de la etapa a) o, como alternativa, la etapa a2), del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos, la inmunocaptura puede realizarse usando un sustrato en que se inmovilizan moléculas dina (por ejemplo, moléculas de TNF alfa humano, moléculas de Her2/Neu humano, moléculas de VEGF humano o moléculas de CD20 humano).
Además, de acuerdo con algunos otros aspectos de estas realizaciones de la etapa a) o, como alternativa, la etapa a2), del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos, la inmunocaptura puede realizarse usando un sustrato en que se inmovilizan moléculas de unión a Fc (por ejemplo, moléculas de proteína A o moléculas de proteína G).
Enriquecimiento de la muestra en anticuerpos terapéuticos por inmunocaptura
Esta realización se ilustra a continuación en este documento, cuando el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento se usa para cuantificar anticuerpos anti-TNF. De hecho, un experto en la materia puede aplicar la misma técnica para cuantificar anticuerpos terapéuticos dirigidos contra otras dianas de interés.
En algunas realizaciones ilustradas en los ejemplos en este documento, la muestra de ensayo se enriquece en anticuerpos anti-TNF usando un método de inmunocaptura. De acuerdo con estas realizaciones, el enriquecimiento en anticuerpos anti-TNF por reducción de proteínas que no son de anticuerpo se realiza usando un soporte de cromatografía de afinidad en que se inmovilizan moléculas de TNF alfa. De manera más precisa, de acuerdo con este método, se inmoviliza TNF alfa biotinilado en un soporte y el soporte resultante se pone en contacto con la muestra de ensayo añadida previamente para capturar las moléculas de unión a TNF que están presentes en la muestra de ensayo añadida, que incluye (i) los dos o más anticuerpos anti-TNF marcados con isótopo estables (SIL) usados como patrones internos y (ii) los otros anticuerpos anti-TNF que posiblemente están presentes en la muestra de ensay antes de añadir los anticuerpos anti-TNF SIL.
Entonces, los anticuerpos anti-TNF se eluyen del soporte cromatográfico y se recogen para procesamiento adicional.
En algunas realizaciones preferidas, se hace uso de un método de inmunoensayo por espectrometría de masas inversa (MSIA - Reverse Mass Spectrometry Immuno-Assay) tal como el que se denomina D.A.R.T.s que emplea reactivos, incluyendo sustrato recubierto con estreptavidina que se comercializa por la empresa Thermo Scientific (San Diego, EE. UU.).
En algunas otras realizaciones preferidas, la inmunocaptura puede realizarse usando las microesferas recubiertas con estreptavidina comercializadas con el nombre de Dynabeads™, tales como Dynabeads™ M-280 Streptavidin comercializadas por la empresa InVitrogen (Cergy-Pontoise, Francia).
Enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos por reducción de proteína que no es de anticuerpo
En algunas realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, la etapa a) o, como alternativa, la etapa a2), puede consistir en una etapa en la que el enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos se realiza por reducción de una parte sustancial de las proteínas, excepto las proteínas de anticuerpo, que están inicialmente contenidas en la muestra de ensayo.
Sin embargo, el enriquecimiento general en anticuerpos terapéuticos (tales como anticuerpos IgG) usando un método de precipitación de proteínas plasmáticas, tiene varios inconvenientes. Dicho método para la precipitación general de proteínas plasmáticas, aunque es simple, rápido, barato y permite acceso a la medición de la fracción de proteínas totales, la mezcla enriquecida con proteínas plasmáticas resultante no está suficientemente enriquecida en anticuerpos terapéuticos, lo que es perjudicial para la reproducibilidad de la posterior etapa de proteólisis con tripsina, y finalmente es perjudicial para la precisión del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos (es decir, anti-TNF y/o antineoplásicos). Por consiguiente, aunque dicho método de precipitación puede usarse para realizar el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento, dicha realización de preparación de muestra no es el más preferido.
De acuerdo con algunos aspectos de estas realizaciones, la reducción de proteínas que no son de anticuerpo puede realizarse usando resinas específicas que tienen afinidad por proteínas que son conocidas en la técnica, tales como la resina Cibacron-blue, que incluye la agarosa Cibacron-blue™ 3 GA comercializada de manera destacable por la empresa Sigma-Aldrich (Mi, EE. UU.).
De acuerdo con algunos aspecto de estas realizaciones, la reducción de proteínas que no son de anticuerpo puede realizarse por precipitación de una parte sustancial de las proteínas inicialmente contenidas en la muestra de ensayo, excepto las proteínas de anticuerpo.
En algunas realizaciones del método de cuantificación descrito en este documento, la muestra, que opcionalmente comprende el compuesto de patrón interno, se enriquece en anticuerpos terapéuticos, tales como anticuerpos IgG.
Diversos métodos para enriquecer una muestra en anticuerpos terapéuticos son conocidos en la técnica.
En algunas realizaciones, el enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos puede realizarse por precipitación con sulfato de amonio, usando métodos bien conocidos en la técnica, para obtener una composición enriquecida en anticuerpos, tal como una composición enriquecida en IgG.
De acuerdo con aspectos adicionales de estas realizaciones, la reducción de proteínas que no son de anticuerpo puede realizarse por precipitación de las proteínas de anticuerpo inicialmente contenidas en la muestra de ensayo, tal como realizando precipitación de anticuerpos con sulfato de amonio, por ejemplo, usando una solución saturada de sulfato de amonio (30 % v/v).
Cromatografía con proteína A
En algunas realizaciones del método de cuantificación descrito en este documento, la muestra, que opcionalmente comprende el compuesto de patrón interno, se enriquece en anticuerpos terapéuticos, en particular anticuerpos IgG.
En algunas realizaciones, el enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos puede realizarse por cromatografía de afinidad, que incluye el uso de sustratos de cromatografía en que se han inmovilizado ligandos pertinentes tales como proteína A, proteína G o, como alternativa, anticuerpos que se unen a la parte Fc de anticuerpos terapéuticos, así como aptámeros de ácido nucleico o peptídicos que se unen a la parte Fc de anticuerpos terapéuticos.
La etapa de enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos permite separar anticuerpos de otras proteínas plasmáticas abundantes y, por tanto, contribuye a mejorar la sensibilidad y reproducibilidad del método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF y antineoplásicos.
Preferiblemente en este documento, se prefiere el enriquecimiento en anticuerpos terapéuticos usando cromatografía con proteína A o proteína G.
En particular, el enriquecimiento en IgG sometiendo la muestra a cromatografía con proteína A o proteína G permite la reducción de casi la totalidad de proteínas plasmáticas mientras retiene la totalidad de anticuerpos IgG inicialmente contenidos en la misma, que incluye la totalidad de anticuerpos anti-TNF y antineoplásicos inicialmente contenidos en la misma.
Más preferiblemente, el enriquecimiento en anticuerpos IgG se realiza por cromatografía con proteína A.
En las realizaciones en las que se usa cromatografía con proteína A, se realiza de manera convencional la elución de los anticuerpos terapéuticos retenidos, en particular, anticuerpos IgG, a un pH ácido, en general a un pH en el intervalo de 2-3, preferiblemente a un pH de 2,8. Entonces, la fracción que contiene la mayor parte de los anticuerpos terapéuticos puede recogerse por elución usando una solución de ácido fórmico (0,5 %-1 % v/v) a un pH que varía de 1 a 3. Después de la evaporación del ácido fórmico, la muestra seca puede resuspenderse en un medio líquido que contiene bicarbonato de amonio a un pH que varía de 7 a 8, para procesamiento adicional.
En estas realizaciones, por tanto, se proporciona una composición enriquecida en anticuerpos, en particular, una composición enriquecida en IgG, que contiene una cantidad conocida de los compuestos de patrón interno y una cantidad desconocida de anticuerpos anti-TNF y/o antineoplásicos.
Concentración de la composición enriquecida en anticuerpos (es decir, enriquecida en IgG)
En algunas realizaciones, y especialmente en realizaciones en las que la composición enriquecida en anticuerpos se obtiene mediante una etapa de cromatografía en la que la dilución de la muestra es susceptible de producirse, dicha composición entonces se somete a una etapa de concentración, para proporcionar una composición enriquecida en anticuerpos concentrada.
En estas realizaciones, la etapa de concentración puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo diálisis y filtración, por ejemplo, microfiltración o ultrafiltración.
En realizaciones preferidas, la etapa de concentración es una etapa de ultrafiltración en la que se usa una membrana de filtro de un valor límite pertinente.
De forma ilustrativa, la etapa de ultrafiltración puede realizarse usando una membrana de ultrafiltración que tiene un valor límite de aproximadamente 100 kDa.
En las realizaciones en las que la etapa de concentración es una etapa de ultrafiltración, se realiza un intercambio de tampón durante la etapa de ultrafiltración para optimizar las condiciones de las etapas posteriores del método que se realizan. De forma destacable, el intercambio de tampón que puede realizarse durante la etapa de ultrafiltración permite obtener una composición enriquecida en IgG concentrada en que la etapa posterior de proteólisis mediante tripsina se conseguirá de forma óptima.
Etapa de proteólisis
Esta etapa es la etapa b) del método general de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento. Como se describe adicionalmente en este documento, la etapa de proteólisis consiste en someter la mezcla preproteólisis, que contiene los anticuerpos terapéuticos marcados (usados como compuestos de patrón interno) y posiblemente los anticuerpos terapéuticos no marcados a cuantificar, a una proteólisis enzimática para generar, de forma destacable, péptidos de proteólisis derivados de anticuerpos terapéuticos, concretamente (i) péptidos de proteólisis derivados de anticuerpos terapéuticos marcados generados a partir de dos o más compuestos de patrón interno añadidos a la etapa a) y péptidos de proteólisis derivados de anticuerpos terapéuticos no marcados generados a partir de los anticuerpos terapéuticos no marcados a cuantificar, si estos anticuerpos terapéuticos no marcados están presentes inicialmente en la muestra de ensayo.
Puede realizarse una pluralidad de realizaciones de una etapa de proteólisis. En particular, las enzimas de proteólisis, que también pueden denominarse proteasas en este documento, pueden seleccionarse en un inmenso grupo de proteasas bien conocidas en la técnica. Como el sitio o sitios de escisión de cada proteasa conocida es parte del conocimiento técnico de los expertos en la materia, la selección de una proteasa específica en la etapa b) se correlaciona con el posterior control de los péptidos de proteólisis de anticuerpos terapéuticos resultantes esperados generados a partir de los mismos, por análisis espectrométrico de masas.
En algunas realizaciones de la etapa de proteólisis que se ilustran en los ejemplos en este documento, la proteasa seleccionada tiene actividad de tripsina.
En algunas otras realizaciones de la etapa de proteólisis que se ilustran en los ejemplos en este documento, la proteasa seleccionada tiene actividad dirigida a la bisagra.
Proteólisis con tripsina de una etapa
De acuerdo con estas realizaciones de la etapa de proteólisis, se añade tripsina a la mezcla preproteólisis, para generar (i) péptidos trípticos a partir del anticuerpo terapéutico inicialmente contenido en la muestra de ensayo y (ii) péptidos trípticos generados por proteólisis con tripsina de los anticuerpos terapéuticos marcados usados como compuestos de patrón interno. Los péptidos trípticos específicos derivados del anticuerpo monoclonal de patrón interno también pueden denominarse "péptidos equivalentes" en este documento.
En algunas realizaciones, la proteólisis con tripsina de una etapa se realiza usando tripsina como única proteasa añadida.
En algunas otras realizaciones que se ilustran en los ejemplos en este documento, la proteólisis con tripsina de una etapa se realiza usando una combinación de tripsina y endoproteinasa Lys-C (también denominada ''EndolysC'' en este documento) como "proteasa". De acuerdo con estas realizaciones, la combinación o mezcla de tripsina y endoproteinasa Lys-C contiene ventajosamente una relación de cantidad en peso de tripsina a EndolysC que varía de 0,1:1 a 20:1, que abarca una relación de cantidad en peso de 0,5:1 a 15:1, preferiblemente una relación de cantidad en peso que varía de 1:10:1. Como se conoce bien en la técnica, la tripsina escinde cadenas peptídicas principalmente en el lado carboxílico de los aminoácidos lisina y arginina, excepto cuando está seguido de prolina.
Como también se conoce bien en la técnica, la EndolysC escinde cadenas peptídicas en el lado carboxílico del aminoácido lisina.
La etapa de proteólisis se realiza preferiblemente en condiciones que son óptimas para:
(i) generar todos los péptidos trípticos equivalentes esperados, y
(ii) evitar la autólisis de tripsina.
Puede usarse una tripsina purificada que tiene una baja capacidad de autólisis. De forma ilustrativa, puede usarse una tripsina denominada Trypsin Gold® que se comercializa por la empresa Promega (Madison, WI, Estados Unidos). Las condiciones óptimas de proteólisis pueden alcanzarse usando una relación molar de tripsina/proteína total que varía de 1/100 a 1/1.
En realizaciones muy preferidas, la etapa de proteólisis se realiza en condiciones no desnaturalizantes, es decir, en condiciones que no provocan desnaturalización de las proteínas. De forma destacable, la etapa de proteólisis se realiza en ausencia de un agente de desnaturalización de proteínas tal como urea o clorhidrato de guanidio.
La proteólisis en presencia de tripsina se realiza durante un periodo de tiempo que puede adaptarlo de forma óptima un experto en la materia.
De forma ventajosa, la proteólisis se realiza a 37 °C durante un periodo de tiempo que varía de 0,5 horas a 15 horas, preferiblemente de 1 hora a 10 horas, y muy preferiblemente que varía de 2 horas a 4 horas. En algunas realizaciones, la proteólisis se realiza a 37 °C durante una noche.
La etapa de proteólisis de una etapa se realiza a un pH de 6 o más. Además, la etapa de proteólisis de una etapa se realiza ventajosamente a un pH de menos de 8,5, preferiblemente a un pH de 8 o menos, que incluye a un pH de 7,5 o menos, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.
En realizaciones muy preferidas, la etapa de proteólisis de una etapa se realiza en condiciones no desnaturalizantes, es decir, en condiciones en las que no hay desnaturalización de las proteínas inicialmente contenidas en la muestra preproteólisis.
En algunas realizaciones, la proteólisis se detiene mediante acidificación de la mezcla resultante, por ejemplo, añadiendo un ácido apropiado tal como ácido fórmico, para disminuir el pH de dicha mezcla resultante por debajo de pH 6.
Proteólisis con tripsina de dos etapas
En algunas realizaciones, la etapa b) puede realizarse mediante una proteólisis con tripsina de dos etapas. En estas realizaciones, la etapa b) comprende dos etapas de proteólisis enzimática, concretamente la etapa b1) de proteólisis enzimática en condiciones desnaturalizantes y la etapa b2) de proteólisis enzimática en condiciones no desnaturalizante, como se ilustra en los ejemplos en este documento.
La una o más enzimas que se usan en las etapas b1) y b2) pueden ser iguales a las divulgadas para realizar la "proteólisis con tripsina de una etapa" especificada anteriormente.
En algunas realizaciones, la una o más enzimas que se usan en la etapa b1) son las mismas que la o las que se usan en la etapa b2). En algunas otras realizaciones, la una o más enzimas que se usan en la etapa b1) son distintas de la o las que se usan en la etapa b2).
De acuerdo con el método de proteólisis de dos etapas, la etapa b1) consiste en una etapa de predigestión en la que el objetivo es aumentar la sensibilidad de las proteínas contenidas en la muestra preproteólisis, y principalmente la sensibilidad a tripsina de los anticuerpos (incluyendo los anticuerpos terapéuticos) contenidos en la muestra preproteólisis.
La etapa b1) se realiza en condiciones desnaturalizantes, tal como en presencia de urea, ventajosamente a una concentración final que varía de 4 M a 0,1 M, preferiblemente a una concentración final de aproximadamente 4 M.
En algunas realizaciones, la etapa b1) se realiza usando una mezcla de proteasas de EndolysC y tripsina en una cantidad como se describe de la realización de "proteólisis con tripsina de una etapa" anterior.
En algunas otras realizaciones, la etapa b1) se realiza usando EndolysC como única proteasa. De acuerdo con estas otras realizaciones, EndolysC está presente en la muestra resultante a una concentración final que varía de 0,01 pg/ml a 10 pg/ml.
En la etapa b1) la proteólisis se realiza durante un periodo de tiempo de 0,5 h a 6 h; ventajosamente de 0,75 h a 4 h, preferiblemente de 1 h a 3 h, y puede realizarse durante un periodo de tiempo de aproximadamente 2 h.
En la etapa b1) la proteólisis se realiza preferiblemente a 37 °C.
En la etapa b1) la proteólisis se realiza a un pH de 6 o más. Además, la etapa de proteólisis de una etapa se realiza ventajosamente a un pH de menos de 8,5, preferiblemente a un pH de 8 o menos, que incluye a un pH de 7,5 o menos, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.
Además, la etapa b2) se realiza usando una mezcla de proteasas que comprende tripsina.
En algunas realizaciones, la etapa b2) se realiza usando una mezcla de proteasas de EndolysC y tripsina en una cantidad como se describe de la realización de "proteólisis con tripsina de una etapa" anterior. En algunos aspectos
de estas realizaciones, la mezcla de proteasas de EndolysC y tripsina se añade en la etapa b1) y preferiblemente no hay adición de proteasa o mezcla de proteasas adicional en la etapa b2) ya que dicha proteasa o mezcla de proteasas ya está presente a la concentración final apropiada en la muestra predigestión obtenida al final de la etapa b1). De acuerdo con estas realizaciones, la etapa b1) puede realizarse en condiciones en las que EndolysC es activa y tripsina es inactiva, y en las que la tripsina se vuelve activa en la etapa b2) haciendo cambios en las condiciones fisicoquímicas de la muestra tal como añadiendo una composición de tampón apropiada al inicio de la etapa b2). De forma ilustrativa, puede añadirse solución de tampón de bicarbonato de amonio a una concentración final apropiada al inicio de la etapa b2).
En algunos otros aspectos de estas realizaciones en las que la etapa b1) se realiza usando EndolysC, se añade una cantidad apropiada de tripsina al inicio de la etapa b2), de modo que la muestra usada al inicio de la etapa b2) comprende una mezcla de proteasas de EndolysC y tripsina, a la relación y concentración final deseadas.
En algunas otras realizaciones, la etapa b1) se realiza usando tripsina como única proteasa añadida. De acuerdo con estas otras realizaciones, preferiblemente no hay adición adicional de tripsina en la etapa b2).
De forma ventajosa, la proteólisis en la etapa b2) se realiza a 37 °C durante un periodo de tiempo que varía de 0,5 horas a 15 horas, preferiblemente de 1 hora a 10 horas, y muy preferiblemente que varía de 2 horas a 4 horas. En algunas realizaciones, la proteólisis se realiza a 37 °C durante una noche.
La proteólisis de una etapa en la etapa b2) se realiza a un pH de 6 o más. Además, la etapa de proteólisis de una etapa se realiza ventajosamente a un pH de menos de 8,5, preferiblemente a un pH de 8 o menos, que incluye a un pH de 7,5 o menos, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 7.
Proteólisis con una proteasa dirigida a la bisagra
En algunas realizaciones de la etapa b), la proteólisis se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra. Las proteasas dirigidas a la bisagra son proteasas conocidas que logran una escisión en una proteína de anticuerpo en la región de bisagra para generar (i) dos regiones Fc de las cadenas pesadas y (ii) un resto F(ab')2, respectivamente. Los restos Fab entonces pueden obtenerse a partir del resto F(ab')2, por métodos bien conocidos por los expertos en la materia, tal como usando un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT).
En la etapa b), la proteasa dirigida a la bisagra se selecciona preferiblemente en un grupo que comprende gelatinasa A (MMP-2) (Tamerius et al., 1975, Int J Cancer, Vol. 16: 456-464), estromielisina (MMP-3) (Tamerius et al., 1975, Int J Cancer, Vol. 16: 456-464; Tamerius et al., 1976, J Immunol, Vol. 116: 724-730; Reichert et al., 2010, Mabs, Vol. 2: 84-100), matrilisina (MMP-7) (Tamerius et al., 1975, Int J Cancer, Vol. 16: 456-464; Tamerius et al., 1976, J Immunol, Vol. 116: 724-730; Reichert et al., 2010, Mabs, Vol. 2: 84-100), gelatinasa B (MMP-9) (Reichert et al., 2010, Mabs, Vol.
2: 84-100), metaloelastasa de macrófagos (MMP-12) (Tamerius et al., 1976, J Immunol, Vol. 116: 724-730; Reichert et al., 2010, Mabs, Vol. 2: 84-100), colagenasa-3 (MMp -13) (Tamerius et al., 1976, J Immunol, Vol. 116: 724-730), catepsina G (Reichert et al., 2010, Mabs, Vol. 2: 84-100), pseudolisina (Strohl et al., 2009, Curr Opinion Biotechnol, Vol. 20: 685-691), mirabilisina, glutamil endopeptidasa I (GluV8) (Tamerius et al., 1976, J Immunol, Vol. 116: 724-730; Reichert et al., 2010, Mabs, Vol. 2: 84-100), estreptopaína (SpeB) (Brezski et al., 2010, mAbs, Vol. 2:3: 212-220), trepolisina (Brezski et al., 2010, mAbs, Vol. 2:3: 212-220) y enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus (ideS) (Tamerius et al., 1976, J Immunol, Vol. 116: 724-730; Reichert et al., 2010, Mabs, Vol. 2: 84-100).
Más preferiblemente, estas realizaciones de la etapa b) se realizan usando enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus (ideS) como proteasa dirigida a la bisagra. En estas realizaciones, puede usarse ideS que se inmoviliza en un soporte sólido apropiado, por ejemplo, un soporte de agarosa, tal como en el kit FragIT™ comercializado por la empresa Genovis (Luna, Suecia) o la empresa Sigma-Aldrich (Saint Louis, Misuri, Estados Unidos).
En la etapa b) la muestra preproteólisis se somete a proteólisis con una proteasa ideS a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo que varía de 5 minutos a 96 horas, ventajosamente de 10 minutos a 50 horas, que incluye un periodo de tiempo que varía de 1 hora a 5 horas.
La mezcla de proteólisis resultante puede recogerse por centrifugación y/o precipitación de proteínas, antes de la suspensión, como se ilustra en los ejemplos en este documento.
Cuantificación de anticuerpos terapéuticos por análisis espectrométrico de masas
Esta etapa abarca las etapas c) y d) del método general de cuantificación de anticuerpos terapéuticos descrito en este documento.
La etapa c) se realiza por espectrometría de masas, de acuerdo con técnicas de cuantificación de proteínas por espectrometría de masas que son conocidas en la técnica.
Preferiblemente, la etapa c) se realiza de acuerdo con el método de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (CL-EM/EM), como se muestra en los ejemplos en este documento.
Preferiblemente, se usa un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QqQ) equipado con una fuente de IEN que funciona en modo de iones positivos y que usa el modo de control de reacción de múltiple (MRM) para la cuantificación.
En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos se realiza con un sustrato de cromatografía de fase inversa.
Entonces, en algunas realizaciones, el estado más abundante de carga de (i) péptidos proteolíticos equivalentes seleccionados derivados de los anticuerpos terapéuticos marcados usados como compuestos de patrón interno y de (ii) los péptidos proteolíticos derivados de los anticuerpos terapéuticos inicialmente presentes en la muestra de ensayo se observan preferiblemente entre 200 m/z y 2000 m/z en la fuente de ionización IEN y se seleccionan y fragmentan.
En la etapa de cuantificación por espectrometría de masas, se investigaron las transiciones de control de reacción seleccionada (SRM) específicas de
(i) el uno o más péptidos proteolíticos equivalentes seleccionados de un anticuerpo terapéutico y de
(ii) el correspondiente péptido proteolítico marcado derivado del correspondiente anticuerpo terapéutico marcado usado como uno de los compuestos de patrón interno.
Como ya se menciona en otra parte en la presente memoria descriptiva, realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF de la invención, en el que la etapa de proteólisis b) hace uso de tripsina como única proteasa o como proteasa contenida en una mezcla de proteasas, el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que comprende:
para Infliximab: péptidos de la SEQ ID NO. 1-8,
para Etanercept: péptidos de la SEQ ID NO. 9-15,
para Adalimumab: péptidos de la SEQ ID NO. 16-23,
para Certolizumab: péptidos de la SEQ ID NO. 24-30, y
para Golimumab: péptidos de la SEQ ID NO. 31-37.
para Trastuzumab: péptidos de la SEQ ID NO. 47-53.
para Rituximab: péptidos de la SEQ ID NO. 54-64.
para Bevacizumab: péptidos de la SEQ ID NO. 65-72.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de forma destacable de acuerdo con el número de péptidos de proteólisis disponibles. El número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 8 péptidos de proteólisis, dependiendo del número de péptidos de proteólisis que están disponibles, que abarca 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1 y 2; SEQ ID NO. 1 y 3; SEQ ID NO. 1 y 4; SEQ ID NO. 1 y 5; SEQ ID NO. 1 y 6; SEQ ID NO. 1 y 7; SEQ ID NO. 1 y 8; SEQ ID NO. 2 y 3; SEQ ID NO. 2 y 4; SEQ ID NO. 2 y 5; SEQ ID NO. 2 y 6; SEQ ID NO. 2 y 7; SEQ ID NO.
2 y 8; SEQ ID NO. 3 y 4; SEQ ID NO. 3 y 5; SEQ ID NO. 3 y 6; SEQ ID NO. 3 y 7; SEQ ID NO. 3 y 8; SEQ ID NO. 4 y 5; SEQ ID NO. 4 y 6; SEQ ID NO. 4 y 7; SEQ ID NO. 4 y 8; SEQ ID NO. 5 y 6; SEQ ID NO. 5 y 7; SEQ ID NO. 5 y 8; SEQ ID NO. 6 y 7; y SEQ ID NO. 7 y 8.
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1,2 y 3; SEQ ID NO. 1, 2 y 4; SEQ ID NO. 1,2 y 5; SEQ ID NO. 1,2 y 6; SEQ ID NO. 1,2 y 7; SEQ ID NO. 1, 2 y 8; SEQ ID NO. 1,3 y 4; SEQ ID NO. 1,3 y 5; SEQ ID NO. 1,3 y 6; SEQ ID NO. 1; 3 y 7; SEQ ID NO. 1,3 y 8; SEQ ID NO. 1,4 y 5; SEQ ID NO. 1,4 y 6; SEQ ID NO. 1,4 y 7; SEQ ID NO. 1; 4 y 8; SEQ ID NO. 1; 5 y 6; SEQ ID NO. 1, 5 y 7; SEQ ID NO. 1,5 y 8; SEQ ID NO. 1; 6 y 7; SEQ ID NO. 1,6 y 8; SEQ ID NO. 1,7 y 8; SEQ ID NO. 2, 3 y 4; SEQ ID NO. 2, 3 y 5; SEQ ID NO. 2, 3 y 6; SEQ ID NO. 2, 3 y 7; SEQ ID NO. 2, 3 y 8; SEQ ID NO. 2, 4 y 5; SEQ ID NO. 2, 4 y 6; SEQ ID NO. 2, 4 y 7; SEQ ID NO. 2, 4 y 8; SEQ ID NO. 2, 5 y 6; SEQ ID NO. 2, 5 y 7; SEQ ID NO. 2, 5 y 8; SEQ ID NO. 2, 6 y 7; SEQ ID NO. 2, 6 y 8; SEQ ID NO. 2, 7 y 8; SEQ ID NO. 3, 4, y 5; SEQ ID NO. 3, 4 y 6; SEQ ID NO. 3, 4 y 7; SEQ ID NO. 3, 4 y 8; SEQ ID NO. 3, 5 y 6, SEQ ID NO. 3, 5 y 7; SEQ ID NO. 3, 5 y 8; SEQ ID NO. 3, 6 y 7; SEQ ID NO. 3, 6 y 8, SEQ ID NO. 3, 7 y 8; SEQ ID NO. 4, 5 y 6; SEQ ID NO. 4, 5 y 7; SEQ ID NO. 4, 5 y 8; SEQ ID NO. 4, 6 y 7; SEQ ID NO. 4, 6 y 8; SEQ ID NO. 4, 7 y 8; SEQ ID NO. 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 5, 7 y 8; SEQ ID NO. 6, 7 y 8.
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan cuatro péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1,2, 3 y 4; SEQ ID NO. 1,2 3 y 5; SEQ ID NO. 1,2, 3, y 6; SEQ ID NO. 1,2, 3 y 7; SEQ ID NO. 1,2, 3 y 8; SEQ ID NO. 1,3, 4 y 5; SEQ ID NO. 1,3, 4 y 6; SEQ ID NO. 1,3, 4 y 7; SEQ ID NO. 1, 3, 4 y 8; SEQ ID NO. 1,4, 5 y 6; SEQ ID NO. 1,4, 5 y 7; SEQ ID NO. 1,4, 5 y 8; SEQ ID NO. 1,5, 6 y 7; SEQ ID NO. 1,5, 6 y 8; SEQ ID NO. 1, 5, 7 y 8; SEQ ID NO. 2, 3, 4 y 5; SEQ ID NO. 2, 3, 4 y 6; SEQ ID NO. 2, 3, 4 y 7; SEQ ID NO. 2, 3, 4 y 8; SEQ ID NO.
2, 4, 5 y 6; SEQ ID NO. 2, 4, 5 y 7; SEQ ID NO. 2, 4, 5 y 8; SEQ ID NO. 2, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 2, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 2, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 3, 4, 5 y 6; SEQ ID NO. 3, 4, 5 y 7; SEQ ID NO. 3, 4, 5 y 8; SEQ ID NO. 3, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 3, 5, 7 y 8; SEQ ID NO. 3, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 4, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 5, 6, 7 y 8.
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan cinco péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4 y 5; SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, y 6; SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4 y 7; SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4 y 8; SEQ ID NO. 1,3, 4, 5 y 6; SEQ ID NO. 1,3, 4, 5 y 7; SEQ ID NO. 1,3, 4, 5 y 8; SEQ ID NO. 1,4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 1,4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 1,5, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5 y 6; SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5 y 7; SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5 y 8; SEQ ID NO. 2, 4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 2, 4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 2, 5, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 3, 5, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 4, 5, 6, 7 y 8.
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan seis péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 y 6; SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 y 7, SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 y 8; SEQ ID NO. 1, 3, 4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 1,3, 4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 1,4, 5, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 2, 4, 5, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 3, 4, 5, 6, 7 y 8;
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan siete péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 5, 6 y 8; SEQ ID NO. 1, 3, 4, 5, 6, 7 y 8; SEQ ID NO. 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
En las realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos en el que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en el que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno y en el que se controlan ocho péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 7, que abarca 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 9 y 10; SEQ ID NO. 9 y 11; SEQ ID NO. 9 y 12; SEQ ID NO. 9 y 13; SEQ ID NO. 9 y 14; SEQ ID NO. 9 y 15; SEQ ID NO. 10 y 11; SEQ ID NO. 10 y 12; SEQ ID NO. 10 y 13; SEQ ID NO. 10 y 14; SEQ ID NO. 10 y 15; SEQ ID NO. 11 y 12; SEQ ID NO. 11 y 13; SEQ ID NO. 11 y 14; SEQ ID NO. 11 y 15; SEQ ID NO. 12 y 13; SEQ ID NO. 12 y 14; SEQ ID NO. 12 y 15; SEQ ID NO. 13 y 14; SEQ ID NO. 13 y 15; SEQ ID NO. 14 y 15.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, en las que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 9, 10 y 11; SEQ ID NO. 9, 10 y 12; SEQ ID NO. 9, 10 y 13; SEQ ID NO. 9, 10 y 14; SEQ ID NO. 9, 10 y 15; SEQ ID NO. 9, 11 y 12; SEQ ID NO. 9, 11 y 13; SEQ ID NO. 9, 11 y 14; SEQ ID NO. 9, 11 y 15; SEQ ID NO. 9, 12 y 13; SEQ ID NO. 9, 12 y 14; SEQ ID NO. 9, 12 y 15; SEQ ID NO. 9; 13 y 14; SEQ ID NO. 9, 13 y 15; SEQ ID NO. 9; 14 y 15; SEQ ID NO. 10, 11 y 12; SEQ ID NO. 10, 11 y 13; SEQ ID NO. 10, 11 y 14; SEQ ID NO. 10, 11 y 15; SEQ ID NO. 10, 12 y 13; SEQ ID NO. 10, 12 y 14; SEQ ID NO. 10, 12 y 15; SEQ ID NO. 10, 13 y 14; SEQ ID NO. 10, 13 y 15; SEQ ID NO. 10, 14 y 15; SEQ ID NO. 11, 12, y 13; SEQ ID NO. 11, 12 y 14; SEQ ID NO. 11, 12 y 15; SEQ ID NO. 11, 13 y 14; SEQ ID NO. 11, 13 y 15; SEQ ID NO. 11, 14 y 15; SEQ ID NO. 12, 13 y 14; SEQ ID NO. 12, 13 y 15; SEQ ID NO. 13, 14 y 15.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cuatro péptidos de proteólisis seleccionados,
estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 9, 10, 11 y 12; SEQ ID NO. 9, 10 11 y 13; SEQ ID NO. 9, 10, 11, y 14; SEQ ID NO. 9, 10, 11 y 15; SEQ ID NO. 9, 11, 12 y 13; SEQ ID NO. 9, 11, 12 y 14; SEQ ID NO. 9, 11, 12 y 15; SEQ ID NO. 9, 12, 13 y 14; SEQ ID NO. 9, 12, 13 y 15; SEQ ID NO. 9, 13, 14 y 15; SEQ ID NO.
10, 11, 12 y 13; SEQ ID NO. 10, 11, 12 y 14; SEQ ID NO. 10, 11, 12 y 15; SEQ ID NO. 10, 12, 13 y 14; SEQ ID NO.
10, 12, 13 y 15; SEQ ID NO. 10, 13, 14 y 15; SEQ ID NO. 11, 12, 13 y 14; SEQ ID NO. 11, 12, 13 y 15; SEQ ID NO.
11, 13, 14 y 15; SEQ ID NO. 12, 13, 14 y 15.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cinco péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12 y 13; SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12, y 14; SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12 y 15; SEQ ID NO. 9, 11, 12, 13 y 14; SEQ ID NO. 9, 11, 12, 13 y 15; SEQ ID NO. 9, 12, 13, 14 y 15; SEQ ID NO. 10, 11, 12, 13 y 14; SEQ ID NO. 10, 11, 12, 13 y 15; SEQ ID NO. 10, 12, 13, 14 y 15; SEQ ID NO. 11, 12, 13, 14 y 15.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, en las que se controlan seis péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12, 13 y 14; SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12, 13 y 15, SEQ ID NO. 9, 11, 12, 13, 14 y 15; SEQ ID NO. 10, 11, 12, 13, 14 y 15.
En las realizaciones en las que se controlan siete péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 8, que abarca 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16 y 17; SEQ ID NO. 16 y 18; SEQ ID NO.
16 y 19; SEQ ID NO. 16 y 20; SEQ ID NO. 16 y 21; SEQ ID NO. 16 y 22; SEQ ID NO. 16 y 23; SEQ ID NO. 17 y 18; SEQ ID NO. 17 y 19; SEQ ID NO. 17 y 20; SEQ ID NO. 17 y 21; SEQ ID NO. 17 y 22; SEQ ID NO. 17 y 23; SEQ ID NO. 18 y 19; SEQ ID NO. 18 y 20; SEQ ID NO. 18 y 21; SEQ ID NO. 18 y 22; SEQ ID NO. 18 y 23; SEQ ID NO. 19 y 20; SEQ ID NO. 19 y 21; SEQ ID NO. 19 y 22; SEQ ID NO. 19 y 23; SEQ ID NO. 20 y 21; SEQ ID NO. 20 y 22; SEQ ID NO. 20 y 23; SEQ ID NO. 21 y 22; y SEQ ID NO. 22 y 23.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16, 17 y 18; SEQ ID NO. 16, 17 y 19; SEQ ID NO. 16, 17 y 20; SEQ ID NO. 16, 17 y 21; SEQ ID NO. 16, 17 y 22; SEQ ID NO. 16, 17 y 23; SEQ ID NO. 16, 18 y 19; SEQ ID NO. 16, 18 y 20; SEQ ID NO. 16, 18 y 21; SEQ ID NO. 16; 18 y 22; SEQ ID NO. 16, 18 y 23; SEQ ID NO.
16, 19 y 20; SEQ ID NO. 16, 19 y 21; SEQ ID NO. 16, 19 y 22; SEQ ID NO. 16; 19 y 23; SEQ ID NO. 16; 20 y 21; SEQ ID NO. 16, 20 y 22; SEQ ID NO. 16, 20 y 23; SEQ ID NO. 16; 21 y 22; SEQ ID NO. 16, 21 y 23; SEQ ID NO. 16, 22 y 23; SEQ ID NO. 17, 18 y 19; SEQ ID NO. 17, 18 y 20; SEQ ID NO. 17, 18 y 21; SEQ ID NO. 17, 18 y 22; SEQ ID NO.
17, 18 y 23; SEQ ID NO. 17, 19 y 20; SEQ ID NO. 17, 19 y 21; SEQ ID NO. 17, 19 y 22; SEQ ID NO. 17, 19 y 23; SEQ ID NO. 17, 20 y 21; SEQ ID NO. 17, 20 y 22; SEQ ID NO. 17, 20 y 23; SEQ ID NO. 17, 21 y 22; SEQ ID NO. 17, 21 y 23; SEQ ID NO. 17, 22 y 23; SEQ ID NO. 18, 19, y 20; SEQ ID NO. 18, 19 y 21; SEQ ID NO. 18, 19 y 22; SEQ ID NO.
18, 19 y 23; SEQ ID NO. 18, 20 y 21, SEQ ID NO. 18, 20 y 22; SEQ ID NO. 18, 20 y 23; SEQ ID NO. 18, 21 y 22; SEQ ID NO. 18, 21 y 23, SEQ ID NO. 18, 22 y 23; SEQ ID NO. 19, 20 y 21; SEQ ID NO. 19, 20 y 22; SEQ ID NO. 19, 20 y 23; SEQ ID NO. 19, 21 y 22; SEQ ID NO. 19, 21 y 23; SEQ ID NO. 19, 22 y 23; SEQ ID NO. 20, 21 y 22; SEQ ID NO.
20, 21 y 23; SEQ ID NO. 20, 22 y 23; SEQ ID NO. 21,22 y 23.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cuatro péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16, 17, 18 y 19; s Eq ID NO. 16, 1718 y 20; SEQ ID NO. 16, 17, 18, y 21; SEQ ID NO. 16, 17, 18 y 22; SEQ ID NO.16, 17, 18 y 23; SEQ ID NO. 16, 18, 19 y 20; SEQ ID NO. 16, 18, 19 y 21; SEQ ID NO. 16, 18, 19 y 22; SEQ ID NO.16, 18, 19 y 23; SEQ ID NO. 16, 19, 20 y 21; SEQ ID NO. 16, 19, 20 y 22; SEQ ID NO. 16, 19, 20 y 23; SEQ ID NO.16, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 16, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 16, 20, 22 y 23; SEQ ID NO. 17, 18, 19 y 20; SEQ ID NO.17, 18, 19 y 21; SEQ ID NO. 17, 18, 19 y 22; SEQ ID NO. 17, 18, 19 y 23; SEQ ID NO. 17, 19, 20 y 21; SEQ ID NO.17, 19, 20 y 22; SEQ ID NO. 17, 19, 20 y 23; SEQ ID NO. 17, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 17, 20, 21 y 23; SEQ ID NO.17, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 18, 19, 20 y 21; SEQ ID NO. 18, 19, 20 y 22; SEQ ID NO. 18, 19, 20 y 23; SEQ ID NO.18, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 18, 20, 22 y 23; SEQ ID NO. 18, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 19, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 20, 21,22 y 23.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cinco péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19 y 20; SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, y 21; SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19 y 22; SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19 y 23; SEQ ID NO. 16, 18, 19, 20 y 21; SEQ ID NO. 16, 18, 19, 20 y 22; SEQ ID NO. 16, 18, 19, 20 y 23; SEQ ID NO. 16, 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 16, 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 16, 20, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20 y 21; SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20 y 22; SEQ ID NO.
17, 18, 19, 20 y 23; SEQ ID NO. 17, 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 17, 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 17, 20, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 18, 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 18, 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 18, 20, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 19, 20, 21,22 y 23.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan seis péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, 20 y 21; SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, 20 y 22, SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, 20 y 23; SEQ ID NO. 16, 18, 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 16, 18, 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 16, 19, 20, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 17, 19, 20, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 18, 19, 20, 21,22 y 23;
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan siete péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22; SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 23; SEQ ID NO. 16, 18, 19, 20, 21,22 y 23; SEQ ID NO. 17, 18, 19, 20, 21,22 y 23.
En las realizaciones en las que se controlan ocho péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 y 23.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 7 abarca 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 24 y 25; SEQ ID NO. 24 y 26; SEQ ID NO.
24 y 27; SEQ ID NO. 24 y 28; SEQ ID NO. 24 y 29; SEQ ID NO. 24 y 30; SEQ ID NO. 25 y 26; SEQ ID NO. 25 y 27; SEQ ID NO. 25 y 28; SEQ ID NO. 25 y 29; SEQ ID NO. 25 y 30; SEQ ID NO. 26 y 27; SEQ ID NO. 26 y 28; SEQ ID NO. 26 y 29; SEQ ID NO. 26 y 30; SEQ ID NO. 27 y 28; SEQ ID NO. 27 y 29; SEQ ID NO. 27 y 30; SEQ ID NO. 28 y 29; SEQ ID NO. 28 y 30; SEQ ID NO. 29 y 30.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 24, 25 y 26; SEQ ID NO. 24, 25 y 27; SEQ ID NO. 24, 25 y 28; SEQ ID NO. 24, 25 y 29; SEQ ID NO. 24, 25 y 30; SEQ ID NO. 24, 26 y 27; SEQ ID NO. 24, 26 y 28; SEQ ID NO. 24, 26 y 29; SEQ ID NO. 24, 26 y 30; SEQ ID NO. 24, 27 y 28; SEQ ID NO. 24, 27 y 29; SEQ ID NO.
24, 27 y 30; SEQ ID NO. 24; 28 y 29; SEQ ID NO. 24, 28 y 30; SEQ ID NO. 24; 29 y 30; SEQ ID NO. 25, 26 y 27; SEQ ID NO. 25, 26 y 28; SEQ ID NO. 25, 26 y 29; SEQ ID NO. 25, 26 y 30; SEQ ID NO. 25, 27 y 28; SEQ ID NO. 25, 27 y 29; SEQ ID NO. 25, 27 y 30; SEQ ID NO. 25, 28 y 29; SEQ ID NO. 25, 28 y 30; SEQ ID NO. 25, 29 y 30; SEQ ID NO.
26, 27, y 28; SEQ ID NO. 26, 27 y 29; SEQ ID NO. 26, 27 y 30; SEQ ID NO. 26, 28 y 29; SEQ ID NO. 26, 28 y 30; SEQ ID NO. 26, 29 y 30; SEQ ID NO. 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 27, 28 y 30; SEQ ID NO. 28, 29 y 30.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cuatro péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 24, 25, 26 y 27; s Eq ID NO. 24, 2526 y 28; SEQ ID NO. 24, 25, 26, y 29; SEQ ID NO. 24, 25, 26 y 30; SEQ ID NO. 24, 26, 27 y 28; SEQ ID NO. 24, 26, 27 y 29; SEQ ID NO. 24, 26, 27 y 30; SEQ ID NO. 24, 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 24, 27, 28 y 30; SEQ ID NO. 24, 28, 29 y 30; SEQ ID NO. 25, 26, 27 y 28; SEQ ID NO. 25, 26, 27 y 29; SEQ ID NO. 25, 26, 27 y 30; SEQ ID NO. 25, 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 25, 27, 28 y 30; SEQ ID NO. 25, 28, 29 y 30; SEQ ID NO. 26, 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 26, 27, 28 y 30; SEQ ID NO. 26, 28, 29 y 30; SEQ ID NO. 27, 28, 29 y 30.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cinco péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 24, 25, 26, 27 y 28; SEQ ID NO. 24, 25, 26, 27, y 29; SEQ ID NO. 24, 25, 26, 27 y 30; SEQ ID NO. 24, 26, 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 24, 26, 27, 28 y 30; SEQ ID NO. 24, 27, 28, 29 y 30; SEQ ID NO. 25, 26, 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 25, 26, 27, 28 y 30; SEQ ID NO. 25, 27, 28, 29 y 30; SEQ ID NO. 26, 27, 28, 29 y 30.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan seis péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 24, 25, 26, 27, 28 y 29; SEQ ID NO. 24, 25, 26, 27, 28 y 30, SEQ ID NO. 24, 26, 27, 28, 29 y 30; SEQ ID NO. 25, 26, 27, 28, 29 y 30.
En las realizaciones en las que se controlan siete péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 7 abarca 1,2, 3, 4, 5, 6 y 7 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 31 y 32; SEQ ID NO. 31 y 33; SEQ ID NO.
31 y 34; SEQ ID NO. 31 y 35; SEQ ID NO. 31 y 36; SEQ ID NO. 31 y 37; SEQ ID NO. 32 y 33; SEQ ID NO. 32 y 34; SEQ ID NO. 32 y 35; SEQ ID NO. 32 y 36; SEQ ID NO. 32 y 37; SEQ ID NO. 33 y 34; SEQ ID NO. 33 y 35; SEQ ID NO. 33 y 36; SEQ ID NO. 33 y 37; SEQ ID NO. 34 y 35; SEQ ID NO. 34 y 36; SEQ ID NO. 34 y 37; SEQ ID NO. 35 y 36; SEQ ID NO. 35 y 37; SEQ ID NO. 36 y 37.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 31, 32 y 33; SEQ ID NO. 31, 32 y 34; SEQ ID NO. 31,32 y 35; SEQ ID NO. 31,32 y 36; SEQ ID NO. 31,32 y 37; SEQ ID NO. 31,33 y 34; SEQ ID NO. 31,33 y 35; SEQ ID NO. 31,33 y 36; SEQ ID NO. 31,33 y 37; SEQ ID NO. 31,34 y 35; SEQ ID NO. 31,34 y 36; SEQ ID NO.
31,34 y 37; SEQ ID NO. 31; 35 y 36; SEQ ID NO. 31,35 y 37; SEQ ID NO. 31; 36 y 37; SEQ ID NO. 32, 33 y 34; SEQ ID NO. 32, 33 y 35; SEQ ID NO. 32, 33 y 36; SEQ ID NO. 32, 33 y 37; SEQ ID NO. 32, 34 y 35; SEQ ID NO. 32, 34 y 36; SEQ ID NO. 32, 34 y 37; SEQ ID NO. 32, 35 y 36; SEQ ID NO. 32, 35 y 37; SEQ ID NO. 32, 36 y 37; SEQ ID NO.
33, 34, y 35; SEQ ID NO. 33, 34 y 36; SEQ ID NO. 33, 34 y 37; SEQ ID NO. 33, 35 y 36; SEQ ID NO. 33, 35 y 37; SEQ ID NO. 33, 36 y 37; SEQ ID NO. 34, 35 y 36; SEQ ID NO. 34, 35 y 37; SEQ ID NO. 35, 36 y 37.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cuatro péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 31,32, 33 y 34; s Eq ID NO. 31,32 33 y 35; SEQ ID NO. 31, 32, 33, y 36; SEQ ID NO.31, 32, 33 y 37; SEQ ID NO.31,33, 34 y 35; SEQ ID NO. 31, 33, 34 y 36; SEQ ID NO. 31, 33, 34 y 37; SEQ ID NO.31, 34, 35 y 36; SEQ ID NO.31, 34, 35 y 37; SEQ ID NO. 31, 35, 36 y 37; SEQ ID NO. 32, 33, 34 y 35; SEQ ID NO.32, 33, 34 y 36; SEQ ID NO.32, 33, 34 y 37; SEQ ID NO. 32, 34, 35 y 36; SEQ ID NO. 32, 34, 35 y 37; SEQ ID NO.32, 35, 36 y 37; SEQ ID NO.33, 34, 35 y 36; SEQ ID NO. 33, 34, 35 y 37; SEQ ID NO. 33, 35, 36 y 37; SEQ ID NO. 34, 35, 36 y 37.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan cinco péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 31, 32, 33, 34 y 35; SEQ ID NO. 31, 32, 33, 34, y 36; SEQ ID NO. 31, 32, 33, 34 y 37; SEQ ID NO. 31, 33, 34, 35 y 36; SEQ ID NO. 31, 33, 34, 35 y 37; SEQ ID NO. 31,34, 35, 36 y 37; SEQ ID NO. 32, 33, 34, 35 y 36; SEQ ID NO. 32, 33, 34, 35 y 37; SEQ ID NO. 32, 34, 35, 36 y 37; SEQ ID NO. 33, 34, 35, 36 y 37.
En las realizaciones en las que se cuantifican anticuerpos anti-TNF y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, en las que se controlan seis péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 31, 32, 33, 34, 35 y 36; SEQ ID NO. 31, 32, 33, 34, 35 y 37, SEQ ID NO. 31,33, 34, 35, 36 y 37; SEQ ID NO. 32, 33, 34, 35, 36 y 37.
En las realizaciones en las que se controlan siete péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 31,32, 33, 34, 35, 36 y 37.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Trastuzumab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de forma destacable de acuerdo con el número de péptidos de proteólisis disponibles. El número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 7 péptidos de proteólisis, dependiendo del número de péptidos de proteólisis que están disponibles, que abarca 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Trastuzumab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 48 y 49, SEQ ID NO.48 y 50, SEQ ID NO.48 y 51, SEQ ID NO.48 y 52, SEQ ID NO.48 y 53, SEQ ID NO.49 y 50, SEQ ID NO.49 y 51, SEQ ID NO.49 y 52, SEQ ID NO.49 y 53, SEQ ID NO.50 y 51, SEQ ID NO.50 y 52, SEQ ID NO.50 y 53, SEQ ID NO.51 y 52, SEQ ID NO.51 y 53, y SEQ ID NO.52 y 53.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Trastuzumab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 48, 49 y 50; SEQ ID NO. 48, 49 y 51; SEQ ID NO. 48, 49 y 52; SEQ ID NO. 48, 49 y 53; SEQ ID NO. 48, 50 y 51; SEQ ID NO. 48, 50 y 52; SEQ ID NO. 48, 50 y 53; SEQ ID NO. 48, 51 y 52; SEQ ID NO. 48, 51 y 53; SEQ ID NO. 48; 52 y 53; SEQ ID NO. 49, 50 y 51; SEQ ID NO.
49, 50 y 52; SEQ ID NO. 49, 50 y 53; SEQ ID NO. 49, 51 y 52; SEQ ID NO. 49, 51 y 53; SEQ ID NO. 49, 52 y 53; SEQ ID NO. 50, 51, y 52; SEQ ID NO. 50, 51 y 53; SEQ ID NO. 50, 52 y 53, SEQ ID NO. 51,52 y 53.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de T rastuzumab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan cuatro péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 48, 49, 50 y 51; SEQ ID NO. 48, 49, 50 y 52; SEQ ID NO. 48, 49, 50, y 53; SEQ ID NO. 48, 50, 51 y 52; SEQ ID NO. 48, 50, 51 y 53; SEQ ID NO. 48, 50, 52 y 53; SEQ ID NO. 48, 51,52 y 53; SEQ ID NO. 49, 50, 51 y 52; SEQ ID NO. 49, 50, 51 y 53; SEQ ID NO. 49, 50, 52 y 53; SEQ ID NO. 49, 51,52 y 53; SEQ ID NO. 50, 51,52 y 53.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de T rastuzumab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan cinco péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 48, 49, 50, 51 y 52; SEQ ID NO. 48, 49, 50, 51 y 53; SEQ ID NO 48, 49, 50, 52 y 53; SEQ ID NO 48, 49, 51,52 y 53; SEQ ID NO. 48, 50, 51,52 y 53; SEQ ID NO 49, 50, 51, 52, y 53.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Rituximab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de forma destacable de acuerdo con el número de péptidos de proteólisis disponibles. El número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 10 péptidos de proteólisis, dependiendo del número de péptidos de proteólisis que están disponibles, que abarca 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Rituximab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 54 y 55, SEQ ID NO.54 y 56, SEQ ID NO.54 y 57, SEQ ID NO.54 y 58, SEQ ID NO.54 y 59, SEQ ID NO.54 y 60, SEQ ID NO.54 y 61, SEQ ID NO.54 y 62, SEQ ID NO.54 y 63, SEQ ID NO.54 y 64, SEQ ID NO.55 y 56, SEQ ID NO.55 y 57, SEQ ID NO.55 y 58, SEQ ID NO.55 y 59, SEQ ID NO.55 y 60, SEQ ID NO.55 y 61, SEQ ID NO.55 y 62, SEQ ID NO.55 y 63, SEQ ID NO.55 y 64, SEQ ID NO.56 y 57, SEQ ID NO.56 y 58, SEQ ID NO.56 y 59, SEQ ID NO.56 y 59, SEQ ID NO.56 y 60, SEQ ID NO.56 y 61, SEQ ID NO.56 y 62, SEQ ID NO.56 y 63, SEQ ID NO.56 y 64, SEQ ID NO.57 y 58, SEQ ID NO. 57 y 59, SEQ ID NO.57 y 60, SEQ ID NO.57 y 61, SEQ ID NO.57 y 62, SEQ ID NO.57 y 63, SEQ ID NO.57 y 64, SEQ ID NO.58 y 59, SEQ ID NO.58 y 60, SEQ ID NO.58 y 61, SEQ ID NO.58 y 62, SEQ ID NO.58 y 63, SEQ ID NO.58 y 64, SEQ ID NO.59 y 60, SEQ ID NO.59 y 61, SEQ ID NO.59 y 62, SEQ ID NO.59 y 63, SEQ ID NO.59 y 64, SEQ ID NO.60 y 61, SEQ ID NO.60 y 62, SEQ ID NO.60 y 63, SEQ ID NO.60 y 64, SEQ ID NO.61 y 62, SEQ ID NO.61 y 63, SEQ ID NO.61 y 64, SEQ ID NO.62 y 63, SEQ ID NO.63 y 64.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o un composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Rituximab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan tres péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 54, 55 y 56; SEQ ID NO. 54, 55 y 57; SEQ ID NO. 54, 55 y 58; SEQ ID NO. 54, 55 y 59; SEQ ID NO. 54, 55 y 60; SEQ ID NO. 54, 55 y 61; SEQ ID NO. 54, 55 y 62; SEQ ID NO. 54, 55 y 63; SEQ ID NO. 54, 55 y 64; SEQ ID NO. 54, 56 y 57; SEQ ID NO. 54, 56 y 58; SEQ ID NO.
54, 56 y 59; SEQ ID NO. 54; 56 y 60; SEQ ID NO. 54, 56 y 61; SEQ ID NO. 54, 56 y 62; SEQ ID NO. 54, 56 y 63; SEQ ID NO. 54, 56 y 64; SEQ ID NO. 54, 57 y 58; SEQ ID NO. 54, 57 y 59; SEQ ID NO. 54, 57 y 60; SEQ ID NO. 54; 57 y 61; SEQ ID NO. 54; 57 y 62; SEQ ID NO. 54; 57 y 63; SEQ ID NO. 54; 57 y 64; SEQ ID NO. 54; 58 y 59; SEQ ID NO.
54, 58 y 60; SEQ ID NO. 54, 58 y 61; SEQ ID NO. 54, 58 y 62; SEQ ID NO. 54, 58 y 63; SEQ ID NO. 54, 58 y 64; SEQ
ID NO. 54; 59 y 60; SEQ ID NO. 54, 59 y 61; SEQ ID NO. 54, 59 y 62; SEQ ID NO. 54, 59 y 63; SEQ ID NO. 54, 59 y 64; SEQ ID NO. 54, 60 y 61; SEQ ID NO. 54, 60 y 62; SEQ ID NO. 54, 60 y 63; SEQ ID NO. 54, 60 y 64; SEQ ID NO.
54, 61 y 62; SEQ ID NO. 54, 51 y 63; SEQ ID NO. 54, 61 y 64; SEQ ID NO. 55, 56 y 57; SEQ ID NO. 55, 56 y 58; SEQ ID NO. 55, 56 y 59; SEQ ID NO. 55, 56 y 60; SEQ ID NO. 55, 56 y 61; SEQ ID NO. 55, 56 y 62; SEQ ID NO. 55, 56 y 63; SEQ ID NO. 55, 56 y 64; SEQ ID NO. 55, 57 y 58; SEQ ID NO. 55, 57 y 59; SEQ ID NO. 55, 57 y 60; SEQ ID NO.
55, 57 y 61; SEQ ID NO. 55, 58 y 59; SEQ ID NO. 55, 58 y 60; SEQ ID NO. 55, 58 y 61; SEQ ID NO. 55, 58 y 62; SEQ ID NO. 55, 58 y 63; SEQ ID NO. 55, 58 y 64; SEQ ID NO. 55, 58 y 59; SEQ ID NO. 55, 58 y 60; SEQ ID NO. 55, 58 y 61; SEQ ID NO. 55, 58 y 62; SEQ ID NO. 55, 58 y 63; SEQ ID NO. 55, 58 y 64; SEQ ID NO. 55, 59 y 60; SEQ ID NO.
55, 59 y 61; SEQ ID NO. 55, 59 y 62; SEQ ID NO. 55, 59 y 63; SEQ ID NO. 55, 59 y 64; SEQ ID NO. 55, 60 y 61; SEQ ID NO. 55, 60 y 62; SEQ ID NO. 55, 60 y 63; SEQ ID NO. 55, 60 y 64; SEQ ID NO. 55, 61 y 62; SEQ ID NO. 55, 61 y 63; SEQ ID NO. 55, 61 y 64; SEQ ID NO. 55, 62 y 63; SEQ ID NO. 55, 62 y 64; SEQ ID NO. 55, 63 y 64; SEQ ID NO.
56, 57, y 58; SEQ ID NO. 56, 57 y 59; SEQ ID NO. 56, 57 y 60; SEQ ID NO. 56, 57 y 61; SEQ ID NO. 56, 57 y 62; SEQ ID NO. 56, 57 y 63; SEQ ID NO. 56, 57 y 64; SEQ ID NO. 56, 58 y 59, SEQ ID NO. 56, 58 y 60; SEQ ID NO. 56, 58 y 61; SEQ ID NO. 56, 58 y 62; SEQ ID NO. 56, 58 y 63; SEQ ID NO. 56, 58 y 64; SEQ ID NO. 56, 59 y 60; SEQ ID NO. 56, 59 y 61; SEQ ID NO. 56, 59 y 62; SEQ ID NO. 56, 59 y 63; SEQ ID NO. 56, 59 y 64; SEQ ID NO. 56, 60 y 61; SEQ ID NO. 56, 60 y 62; SEQ ID NO. 56, 60 y 63; SEQ ID NO. 56, 60 y 64; SEQ ID NO. 56, 61 y 62; SEQ ID NO. 56, 61 y 63; SEQ ID NO. 56, 61 y 64; SEQ ID NO. 57, 58 y 59; SEQ ID NO. 57, 58 y 60; SEQ ID NO. 57, 58 y 61; SEQ ID NO. 57, 58 y 62; SEQ ID NO. 57, 58 y 63; SEQ ID NO. 57, 58 y 64; SEQ ID NO. 57, 59 y 60; SEQ ID NO. 57, 59 y 61; SEQ ID NO. 57, 59 y 62; SEQ ID NO. 57, 59 y 63; SEQ ID NO. 57, 59 y 64; SEQ ID NO. 57, 60 y 61; SEQ ID NO. 57, 60 y 62; SEQ ID NO. 57, 60 y 63; SEQ ID NO. 57, 60 y 64; SEQ ID NO. 57, 61 y 62; SEQ ID NO. 57, 61 y 63; SEQ ID NO. 57, 61 y 64; SEQ ID NO. 57, 62 y 63; SEQ ID NO. 57, 62 y 64; SEQ ID NO. 57, 63 y 64; SEQ ID NO. 58, 59 y 60; SEQ ID NO. 58, 59 y 61; SEQ ID NO. 58, 59 y 62; SEQ ID NO. 58, 59 y 63; SEQ ID NO. 58, 59 y 64; SEQ ID NO. 58, 60 y 61; SEQ ID NO. 59, 60 y 61; SEQ ID NO. 59, 60 y 62; SEQ ID NO. 59, 60 y 63; SEQ ID NO. 59, 60 y 64; SEQ ID NO. 58, 61 y 62; SEQ ID NO. 59, 61 y 63; SEQ ID NO. 59, 61 y 64; SEQ ID NO. 58, 62 y 63; SEQ ID NO. 59, 62 y 64; SEQ ID NO. 58, 63 y 64; SEQ ID NO. 59, 60 y 61; SEQ ID NO. 59, 60 y 62; SEQ ID NO. 59, 60 y 63; SEQ ID NO. 59, 60 y 64; SEQ ID NO. 59, 61 y 62; SEQ ID NO. 59, 61 y 63; SEQ ID NO. 59, 61 y 64; SEQ ID NO. 59, 62 y 63; SEQ ID NO. 59, 62 y 64; SEQ ID NO. 59, 63 y 64; SEQ ID NO. 60, 61 y 62; SEQ ID NO. 60, 61 y 63; SEQ ID NO. 60, 61 y 64; SEQ ID NO. 60, 62 y 63; SEQ ID NO. 60, 62 y 64; SEQ ID NO. 60, 63 y 64; SEQ ID NO. 61,62 y 63; SEQ ID NO. 61, 62 y 64; SEQ ID NO. 61,63 y 64; SEQ ID NO. 62, 63 y 64.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Bevacizumab como compuesto de patrón interno, el número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de forma destacable de acuerdo con el número de péptidos de proteólisis disponibles. El número de péptidos de proteólisis seleccionados para el que se determina una relación de señal espectrométrica de masas en la etapa c) puede variar de 1 a 8 péptidos de proteólisis, dependiendo del número de péptidos de proteólisis que están disponibles, que abarca 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 péptidos de proteólisis seleccionados.
En las realizaciones en las que la etapa de proteólisis se realiza usando tripsina o una composición de proteasas que contiene tripsina, en las que se cuantifican anticuerpos antineoplásicos y en las que se usa un homólogo marcado de Bevacizumab como compuesto de patrón interno y en las que se controlan dos péptidos de proteólisis seleccionados, estos pueden seleccionarse en un grupo que comprende la SEQ ID NO. 65 y 66, SEQ ID NO. 65 y 67, SEQ ID NO.
65 y 68, 65 y 69, 65 y 70, 65 y 71,65 y 72, 66 y 67, 66 y 68, 66 y 69, 66 y 70, SEQ ID NO. 66 y 71, SEQ ID NO. 66 y 72, SEQ ID NO. 67 y 68, SEQ ID NO. 67 y 69, SEQ ID NO. 67 y 70, SEQ ID NO. 67 y 71, SEQ ID NO. 67 y 72, SEQ ID NO. 68 y 69, SEQ ID NO. 68 y 70, SEQ ID NO. 68 y 71, SEQ ID NO. 68 y 72, SEQ ID NO. 69 y 70, SEQ ID NO. 69 y 71, SEQ ID NO. 69 y 72, SEQ ID NO. 70 y 71, SEQ ID NO. 71 y 72.
Para realizar el método de cuantificación de anticuerpos terapéuticos de la invención, en el que la etapa de proteólisis b) hace uso de una proteasa dirigida a la bisagra, el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que comprende:
para Infliximab: péptidos de la SEQ ID NO. 38-39,
para Etanercept: péptido de la SEQ IDNO. 40,
para Adalimumab: péptidos de la SEQ IDNO. 41-42,
para Certolizumab: péptidos de la SEQ ID NO. 43-44, y
para Golimumab: péptidos de la SEQ ID NO. 45-46
En algunas realizaciones, en las que la etapa de proteólisis se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra y en las que se usa un homólogo marcado de Infliximab como compuesto de patrón interno, las señales espectrométricas de uno o los dos péptidos de proteólisis seleccionados de la SEQ ID NO. 38-39 se determinan.
En algunas realizaciones, en las que la etapa de proteólisis se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra y en las que se usa un homólogo marcado de Etanercept como compuesto de patrón interno, las señales espectrométricas de los péptidos de proteólisis seleccionados de la SEQ ID NO. 40 se determinan.
En algunas realizaciones, en las que la etapa de proteólisis se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra y en las que se usa un homólogo marcado de Adalimumab como compuesto de patrón interno, las señales espectrométricas de uno o los dos péptidos de proteólisis seleccionados de la SEQ ID NO. 41-42 se determinan.
En algunas realizaciones, en las que la etapa de proteólisis se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra y en las que se usa un homólogo marcado de Certolizumab como compuesto de patrón interno, las señales espectrométricas de uno o los dos péptidos de proteólisis seleccionados de la SEQ ID NO. 43-44 se determinan.
En algunas realizaciones, en las que la etapa de proteólisis se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra y en las que se usa un homólogo marcado de Golimumab como compuesto de patrón interno, las señales espectrométricas de uno o los dos péptidos de proteólisis seleccionados de la SEQ ID NO. 45-46 se determinan.
Las transiciones de SRM de péptidos proteolíticos seleccionados de los anticuerpos anti-TNF ensayados, de péptidos proteolíticos marcados de los dos o más anticuerpos anti-TNF usados como compuestos de patrón interno se establecen preferiblemente después de comparar los espectros de fragmentación obtenidos de soluciones puras de cada uno de estos péptidos, con espectros de fragmentación in silico generados con una herramienta de programa informático disponible pertinente, tal como el programa informático comercializado con el nombre Skyline™ de MacCoss Lab Software (EE. UU.) y la herramienta bioinformática ESP Predictor disponible en Genepattern (Vincent A. Fusaro, D. R. Mani, Jill P. Mesirov y Steven A. Carr, Nature Biotechnology (2009) 27:190-198), disponible de forma destacable en el Broad Insitute (EE. Uu .)
Preferiblemente, en la etapa d), la cuantificación de anticuerpos anti-TNF se basa en la relación de la media de las áreas de pico de SRM específica de un anticuerpo anti-TNF seleccionado y la media de las áreas de pico del péptido marcado equivalente seleccionado de patrón interno.
De manera más precisa, la cantidad de anticuerpos anti-TNF en la muestra ensayada, por ejemplo, la concentración de dichos anticuerpos anti-TNF en la muestra de ensayo, se determina presentando el valor de relación que se calcula en la etapa d) para dicha muestra de ensayo en una curva de calibración que se generó como se describe previamente en otra parte en la presente memoria descriptiva.
Como se muestra en los ejemplos, la cuantificación descrita en este documento permite linealidad entre la cantidad medida (por ejemplo, concentración) de un anticuerpo anti-TNF y la cantidad esperada del mismo.
Cuantificar anticuerpos anti-TNF con el método de cuantificación descrito en este documento permite una alta precisión de cuantificación, una alta reproducibilidad de cuantificación, así como cuantificación de anticuerpos anti-TNF sobre un amplio intervalo de cantidades.
El método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF de acuerdo con la invención permite una linealidad de la medida de cuantificación de 1 pg/ml o menos a 1000 pg/ml o más.
De acuerdo con las directrices de la FDA para validación de métodos bioanalíticos, por tanto, se muestra en este documento que el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF de acuerdo con la invención es al mismo tiempo suficientemente sensible y reproducible para cuantificar anticuerpos anti-TNF en muestras de plasma humano. Puede hacerse referencia a las directrices "Guidance for Industry - Bioanalytical Method validation" del departamento de Estados Unidos de sanidad y servicios sociales - Food y Drug Administration (2001).
La presente invención también se refiere a kits para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF que se describe en toda la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, un kit de acuerdo con la invención comprende dos o más anticuerpos anti-TNF marcados isotópicamente estables, especialmente dos o más anticuerpos anti-TNF marcados isotópicamente estables seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab. Los anticuerpos SIL pueden estar contenidos en un kit de acuerdo con la invención en cualquier combinación, especialmente en cualquiera de las combinaciones que se describen en otra parte en la presente memoria descriptiva.
En algunas realizaciones, dicho kit comprende dos anticuerpos anti-TNF SIL seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab. En algunas realizaciones, dicho kit comprende tres anticuerpos anti-TNF SIL seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab. En algunas realizaciones, dicho kit comprende cuatro anticuerpos anti-TNF SIL seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab. En algunas realizaciones, dicho kit comprende cinco anticuerpos anti-TNF SIL seleccionados en un grupo que comprende Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab.
En algunas realizaciones, los anticuerpos SIL contenidos en un kit de acuerdo con la invención pueden estar en forma de una suspensión líquida. En algunas otras realizaciones, los anticuerpos SIL contenidos en un kit de acuerdo con la invención pueden estar en forma liofilizada.
En algunas realizaciones, dicho kit comprende además reactivos necesarios para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento, tal como una proteasa apropiada, especialmente una proteasa seleccionada en un grupo que comprende (i) tripsina o una composición que contiene tripsina y (ii) una proteasa dirigida a la bisagra.
En algunas realizaciones, dicho kit también comprende información que proporciona las curvas de calibración para cada uno de los anticuerpos terapéuticos contenidos en el mismo.
En algunas realizaciones, dicho kit también comprende información que proporciona las curvas de calibración para cada uno de los anticuerpos anti-TNF contenidos en el mismo.
En algunas realizaciones, dicho kit también comprende información que proporciona las curvas de calibración para cada uno de los anticuerpos antineoplásicos contenidos en el mismo.
En algunas realizaciones, dicho kit comprende además reactivos necesarios para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento, tal como una proteasa apropiada, especialmente una proteasa seleccionada en un grupo que comprende (i) tripsina o una composición que contiene tripsina y (ii) una proteasa dirigida a la bisagra.
La presente invención se ilustra adicionalmente, sin limitarse a los mismos, mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplos
A. Materiales y métodos (ejemplos 1 y 2)
A.1. Preparación de muestra de ensayo
La muestra de ensayo es una muestra de plasma o una muestra de suero que se recogió previamente de un paciente a ensayar.
El patrón de Infliximab mAb PSAQ se añade en la muestra de ensayo a una concentración final que está comprendida preferiblemente entre 5 pg/ml y 50 pg/ml, más preferiblemente entre 10 pg/ml y 25 pg/ml (idealmente 20 pg/ml). El volumen de muestra usado para los experimentos está comprendido entre 5 pl y 1000pl, más preferiblemente entre 10 pl y 100 pl, e idealmente es 10 pl.
A 10 pl de muestra de suero (hasta 50 pl), se le añade el patrón de Infliximab marcado a una concentración de 25 pg/ml (por ejemplo, se añade 1 pl de una solución [250 ng/pl]). Se añade PBS IX para obtener un volumen de muestra final de 100 pl.
A.2. Reducción de proteína que no es de anticuerpo por cromatografía de afinidad
De acuerdo con esta realización, la reducción en proteínas que no son de anticuerpo se realiza usando un soporte de cromatografía de afinidad en que se inmovilizó TNF alfa. De manera más precisa, de acuerdo con este método, se añade TNF alfa biotinilado a la muestra de ensayo añadida previamente para capturar las moléculas de unión a TNF que están presentes en la muestra de ensayo añadida, que incluye (i) los anticuerpos anti-TNF marcados con isótopo estables (SIL) usados como patrones internos y (ii) los otros anticuerpos anti-TNF que posiblemente están presentes en la muestra de ensay antes de añadir los anticuerpos anti-TNF SIL.
Entonces, la mezcla resultante se pone en contacto con un soporte cromatográfico en que se inmovilizó estreptavidina, para capturar el TNF alfa biotinilado que posiblemente ha formado complejo con anticuerpos anti-TNF marcados y posiblemente anticuerpos anti-TNF no marcados.
Entonces, los anticuerpos anti-TNF se eluyen del soporte cromatográfico para procesamiento adicional.
Este método puede denominarse MSIA (para inmunoafinidad por espectrometría de masas - Mass Spectrometry ImmunoAffinity).
Reactivos e instrumentos específicos
Novus I Finnpipette 12 canales, 20-300 pl (Thermo), DART de MSIA de estreptavidina (Thermo), TNF-a biotinilado (ACRO biosystems), Remicade (Janssen Biologics), solución salina tamponada con fosfato (Gibco LifeSciences), solución de hidróxido de amonio (SIGMA-Aldrich), CL-EM de acetonitrilo Chromasolv (Sigma-Aldrich), ácido fórmico Aristar (VWR), mezcla de EndoLysC/tripsina PROMEGA.
Preparación de la solución de TNF-alía biotinilado
Se disuelven 2,5 gg de TNF-alfa biotinilado en 100 gl de PBS.
Experimento de MSIA
Se programa la siguiente etapa en el programa de MSIA:
Se cargan puntas de MSIA de estreptavidina en la pipeta.
Para la siguiente etapa, es muy importante evitar burbujas de aire en la resina. Para evitar las burbujas, se ajusta el soporte y la pipeta para que las puntas siempre se sumerjan en solución a lo largo del experimento.
Se selecciona la etapa LAVAR y se lavan las puntas con PBS 1X (volumen de PBS requerido = 200 gl).
Se selecciona la etapa CAPTURA 1 y se aspira la solución de TNF-alfa biotinilado.
Se selecciona la etapa LAVAR y se aclaran las puntas con PBS 1X (volumen de PBS requerido = 200 gl).
Se repite esta etapa dos veces.
Se selecciona la etapa CAPTURA 2 y se aspira la solución de muestra de suero.
Se selecciona la etapa LAVAR y se aclaran las puntas con solución de hidróxido de amonio (volumen requerido = 200 gl). Se repite esta etapa y después LAVAR con agua ultrapura 200 mM. Se repite esta etapa dos veces.
Se selecciona la etapa ELUIR y se eluye con solución de acetonitrilo al 30 %/ácido fórmico al 0,05 % (volumen mínimo requerido = 100 gl).
Se recupera el eluido en un tubo de baja adsorción y se seca la muestra con vacío por velocidad.
A.3. Etapa de proteólisis enzimática
La etapa de proteólisis enzimática puede realizarse de acuerdo con una pluralidad de realizaciones. En algunas realizaciones, la proteólisis enzimática se realiza a través de un método que comprende dos etapas de digestión con tripsina, (i) una etapa de digestión con tripsina en condiciones desnaturalizantes seguida de (ii) una etapa de digestión con tripsina en condiciones no desnaturalizantes, que es el método denominado "opción 1" posteriormente en este documento. En algunas otras realizaciones, la proteólisis enzimática se realiza a través de un método que comprende una etapa de digestión con tripsina en condiciones no desnaturalizantes, que es el método denominado "opción 2" posteriormente en este documento. En otras realizaciones más, la proteólisis enzimática se realiza usando una proteasa dirigida a la bisagra tal como ideS (enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus), que es el método denominado "opción 3" posteriormente en este documento.
Opción 1: digestión con tripsina de dos etapas
Digestión con tripsina en condiciones desnaturalizantes
Después de completarse el secado, se añaden 10 gl de solución de urea 4 M en el tubo y se agita con vórtice. Se comprueba el pH de la muestra que debe ser > 6. Si no, se ajusta el pH hasta 7-8 con solución de base Tris 0,5 M. Se añaden 2 gg de EndolysC de la mezcla de ENdolysC/tripsina (la cantidad de EndolysC añadida puede variar entre 0,2 y 4 gg).
Se procesa para la predigestión a 37 °C durante 2 h.
Digestión con tripsina en condiciones no desnaturalizantes
Se añaden 190 gl de una solución de bicarbonato de amonio 25 mM en el tubo, se mezcla y se añaden 2 gg de tripsina de la mezcla de EndolysC/tripsina (de nuevo, la cantidad de EndolysC añadida puede variar entre 0,2 y 4 gg). Se procesa para la digestión a 37 °C durante 2-4 h o durante una noche si se prefiere.
Se desala y se concentra la muestra con C18-ziptip (Proteabio), se eluye ziptip, se seca el eluido.
Antes de la inyección, se resuspende la muestra en 20 gl de una solución de acetonitrilo al 2 %, ácido fórmico al 0,1 %. Se inyecta la muestra en el instrumento de CL-EM.
Opción 2: Digestión con tripsina de una etapa
Después de completarse el secado, se añaden 10 pl de solución de bicarbonato de amonio 25 mM en el tubo y se agita con vórtice. Se comprueba el pH de la muestra que debe ser > 6. Si no, se ajusta el pH hasta 7-8 con solución de base Tris 0,5 M. Se añaden 2 pg de tripsina de la mezcla de EndolysC/tripsina (de nuevo, la cantidad de EndolysC añadida puede variar entre 0,2 y 4 pg). Se procesa para la digestión a 37 °C durante 2-4 h o durante una noche si se prefiere.
Se añade ácido fórmico en la muestra para detener la digestión para obtener una concentración final de un 0,1 %. Se inyecta la muestra en el instrumento de CL-EM.
Opción 3: Digestión con proteasa con ideS
Después de completarse el secado, se resuspende la muestra en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 o similar con pH que varía de 6,0-8,0 y se comprueba el pH (se ajusta con base Tris si es necesario).
Se rompe el precinto inferior de la columna FraglT™ (se guarda el tapón) y se abre ligeramente la tapa ~90° en dirección contraria a las agujas del reloj.
Se coloca la columna en un tubo de recogida de 1,5-2 ml y se centrifuga la columna a 200xg durante 1 min para retirar la solución de almacenamiento.
Se equilibra la columna añadiendo 300 pl de tampón de escisión y se centrifuga la columna a 200xg durante 1 min. Se repiten las etapas 5 y 6 dos veces.
Se pone el tapón inferior en la columna.
Se añade inmediatamente la muestra a escindir en un volumen de 100 pl a una concentración máxima de 5 mg/ml de IgG en tampón de escisión. Se precinta la columna con la tapa superior. Se tiene cuidado de suspender completamente el medio manualmente y se garantiza que esté fluyendo en la columna. Se incuba la columna mezclando extremo sobre extremo durante 15 min en temperatura ambiente. El tiempo de incubación puede aumentarse sin sobredigestión de la IgG.
Se retira la tapa superior y el tapón inferior. Se coloca la columna en un tubo de recogida de 1,5-2 ml. Se centrifuga la columna a 1000xg durante 1 min para eluir la muestra. Para una recuperación máxima de la muestra, se repite dos veces esta etapa usando 100 pl de tampón de escisión. Se centrifuga la columna a 1000xg durante 1 min para eluir la muestra. Se combinan todas las fracciones de elución.
Si se requiere, se usa C4 ziptip para desalar la muestra o se precipita con acetona fría, se seca y se resuspende en ACN al 2 %, tampón FA al 0,1 %.
A.4. Análisis por CL-EM de muestras tratadas con opción 1 u opción 2 (digestión con tripsina)
Los siguientes péptidos de secuencias de la SEQ ID NO. 1 a 37 deben controlarse en el ensayo de CL-SRM.
Estos péptidos deben controlarse en sus formas marcadas y no marcadas (el incremento de masa se calculará de acuerdo con el aminoácido marcado isotópicamente estable presente en la secuencia peptídica). También deben tenerse en cuenta las posibles modificaciones químicas que afectan a los aminoácidos ya que estas modificaciones modificarán el m/z de los iones del péptido y los correspondientes fragmentos.
A.5. Análisis por CL-EM de muestras tratadas con opción 3 (digestión con IDES)
Los siguientes péptidos de secuencias de la SEQ ID NO. 38 a 46 deben controlarse en el ensayo de CL-SRM. Estos péptidos deben controlarse en sus formas marcadas y no marcadas (el incremento de masa se calculará de acuerdo con el aminoácido marcado isotópicamente estable presente en la secuencia peptídica). También deben tenerse en cuenta las posibles modificaciones químicas que afectan a los aminoácidos ya que estas modificaciones modificarán el m/z de los iones del péptido y los correspondientes fragmentos.
B. Materiales y métodos (ejemplo 3)
B.1. Preparación de muestra de ensayo
La muestra de ensayo es una muestra de plasma o una muestra de suero que se recogió previamente de un paciente a ensayar.
El patrón de Trastuzumab mAb PSAQ se añade en la muestra de ensayo a una concentración final que está comprendida preferiblemente entre 5 pg/ml y 50 pg/ml, más preferiblemente entre 10 pg/ml y 25 pg/ml (idealmente 20 pg/ml).
El volumen de muestra usado para los experimentos está comprendido entre 5 pl y 1000pl, más preferiblemente entre 10 pl y 100 pl, e idealmente es 10 pl.
A 10 pl de muestra de suero (hasta 50 pl), se le añade el patrón de Infliximab marcado a una concentración de 25 pg/ml (por ejemplo, se añade 1 pl de una solución [250 ng/pl]). Se añade PBS IX para obtener un volumen de muestra final de 500 pl.
B.2. Reducción de albúmina usando una resina de afinidad por albúmina
De acuerdo con esta realización, la muestra reduce de la albúmina usando una resina de afinidad por albúmina, que está disponible en el mercado (agarosa Cibacron-blue 3GA, Sigma-Aldrich). De manera más precisa, de acuerdo con este método, la albúmina presente en la muestra de ensayo se retira específicamente, mientras las otras proteínas permanecen en el sobrenadante, que incluye (i) los anticuerpos terapéuticos marcados con isótopo estables (SIL) usados como patrones internos y (ii) los otros anticuerpos terapéuticos que están finalmente presentes en la muestra de ensayo antes de añadir los anticuerpos terapéuticos SIL. El sobrenadante, reducido de albúmina, se recupera y se somete potencialmente a un tratamiento de reducción/alquilación (véase la sección B.3). Antes de continuar a la digestión, las proteínas restantes contenidas en la muestra se precipitan usando 10 volúmenes de acetona fría. B.3. Esta de reducción/alquilación
La muestra en primer lugar se somete a una etapa de reducción, que tiene como objetivo reducir los enlaces disulfuro. Se añade TCEP (Tris(2-carboxietil)fosfina) a la muestra a una concentración final de 10 mM. La muestra se incuba a temperatura ambiente durante 20 min. Entonces se añade yodoacetamida (preparada de manera improvisada) en la muestra a una concentración final de 100 mM. La muestra entonces se incuba en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 45 min. Entonces, la muestra se somete a precipitación con acetona. Si no, la yodoacetamida restante presente en la muestra puede inactivarse añadiendo TCEP.
Reactivos e instrumentos específicos
Resina de agarosa Cibacron-blue 3GA (Sigma-Aldrich), Herceptin (Roche), solución salina tamponada con fosfato (Gibco LifeSciences), Tris(2-carboxietil)fosfina (SIGMA-Aldrich), yodoacetamida (Sigma-Aldrich), acetona (Sigma-Aldrich), solución de urea 8 M (Sigma-Aldrich), CL-EM de acetonitrilo Chromasolv (Sigma-Aldrich), ácido fórmico Aristar (VWR), mezcla de EndoLysC/tripsina p Ro MEGA.
B.3. Etapa de proteólisis enzimática
La etapa de proteólisis enzimática puede realizarse de acuerdo con una pluralidad de realizaciones. En algunas realizaciones, la proteólisis enzimática se realiza a través de un método que comprende dos etapas de digestión con tripsina, (i) una etapa de digestión con tripsina en condiciones desnaturalizantes seguida de (ii) una etapa de digestión con tripsina en condiciones no desnaturalizantes, que es el método denominado "opción 1" posteriormente en este documento. En algunas otras realizaciones, la proteólisis enzimática se realiza a través de un método que comprende una etapa de digestión con tripsina en condiciones no desnaturalizantes, que es el método denominado "opción 2" posteriormente en este documento.
Opción 1: digestión con tripsina de dos etapas
Digestión con tripsina en condiciones desnaturalizantes
Después de completarse el secado, se añaden 10 pl de solución de urea 4 M en el tubo y se agita con vórtice. Se comprueba el pH de la muestra que debe ser > 6. Si no, se ajusta el pH hasta 7-8 con solución de base Tris 0,5 M. Se añaden 2 pg de EndolysC de la mezcla de ENdolysC/tripsina (la cantidad de EndolysC añadida puede variar entre 0,2 y 4 pg).
Se procesa para la predigestión a 37 °C durante 2 h.
Digestión con tripsina en condiciones no desnaturalizantes
Se añaden 190 gl de una solución de bicarbonato de amonio 25 mM en el tubo, se mezcla y se añaden 2 gg de tripsina de la mezcla de EndolysC/tripsina (de nuevo, la cantidad de EndolysC añadida puede variar entre 0,2 y 4 gg). Se procesa para la digestión a 37 °C durante 2-4 h o durante una noche si se prefiere.
Se desala y se concentra la muestra con C18-ziptip (Proteabio), se eluye ziptip, se seca el eluido.
Antes de la inyección, se resuspende la muestra en 20 gl de una solución de acetonitrilo al 2 %, ácido fórmico al 0,1 %. Se inyecta la muestra en el instrumento de CL-EM.
Opción 2: Digestión con tripsina de una etapa
Después de completarse el secado, se añaden 10 gl de solución de bicarbonato de amonio 25 mM en el tubo y se agita con vórtice. Se comprueba el pH de la muestra que debe ser > 6. Si no, se ajusta el pH hasta 7-8 con solución de base Tris 0,5 M. Se añaden 2 gg de tripsina de la mezcla de EndolysC/tripsina (de nuevo, la cantidad de EndolysC añadida puede variar entre 0,2 y 4 gg). Se procesa para la digestión a 37 °C durante 2-4 h o durante una noche si se prefiere.
Se añade ácido fórmico en la muestra para detener la digestión para obtener una concentración final de un 0,1 %. Se inyecta la muestra en el instrumento de CL-EM.
B.4. Análisis por CL-EM de muestras tratadas con opción 1 u opción 2 (digestión con tripsina)
Los siguientes péptidos de secuencias de la SEQ ID NO. 48 a 73 deben controlarse en el ensayo de CL-SRM. Estos péptidos deben controlarse en sus formas marcadas y no marcadas (el incremento de masa se calculará de acuerdo con el aminoácido marcado isotópicamente estable presente en la secuencia peptídica). También deben tenerse en cuenta las posibles modificaciones químicas que afectan a los aminoácidos ya que estas modificaciones modificarán el m/z de los iones del péptido y los correspondientes fragmentos.
Ejemplo 1: Evaluación de una curva de valoración para la cuantificación en muestras de suero humano del anticuerpo terapéutico Infliximab en presencia de otros dos anticuerpos anti-TNF, usando una preparación de muestra basada en inmunocaptura (tecnología MSIA)
El objetivo de este experimento fue realizar una curva de valoración para evaluar los rendimientos de los patrones de anticuerpos marcados isotópicamente estables (SIL) y del método de CL-EM/EM.
En el ejemplo 1, se realizó una curva de valoración usando (i) anticuerpos anti-TNF no marcados como compuestos de patrón interno y (ii) Infliximab SIL como anticuerpo anti-TNF a cuantificar. De hecho, puede realizarse el mismo experimento usando (i) anticuerpos anti-TNF SIL como compuestos de patrón interno y (ii) un Infliximab no marcado como anticuerpo anti-TNF a cuantificar.
A) Protocolo
Se generó una curva de valoración, de acuerdo con el siguiente protocolo 1) añadir a una muestra de suero una cantidad definida de anticuerpos terapéuticos anti-TNF, Infliximab, Adalimumab y Etanercept y 2) añadir una cantidad creciente de Infliximab SIL. Por tanto, se denomina curva de valoración inversa porque el Infliximab SIL se cuantifica usando el Infliximab terapéutico.
Dicho experimento imita una situación donde un paciente se habría tratado con Infliximab y cuyo suero se analizará usando nuestro método de CE-EM/EM y tres patrones anti-TNF.
Para realizar este experimento, los anticuerpos terapéuticos Adalimumab, Etanercept e Infliximab se obtuvieron de colaboradores. El Infliximab SIL se produjo y se purificó de acuerdo con el método descrito previamente (Lebert et al., Bioanalysis, 2015). Las muestras se trataron usando materiales y métodos descritos en la sección A. Las muestras se trataron siguiendo la opción 1 descrita en la sección A. Los péptidos de secuencias de la SEQ ID NO. 1 a 23 se controlaron en el ensayo de CL-SRM, en sus formas marcadas y no marcadas.
Tabla 1: Las muestras se constituyeron y analizaron para evaluar la exactitud y precisión de nuestro método de CL-EM/EM en un contexto donde están presentes múltiples anticuerpos anti-TNF en la muestra.
B) Resultados experimentales
Los rendimientos de cuantificación proporcionados por nuestra estrategia que combina el uso de patrones de mAb SIL y CL-EM/EM se evaluaron de una manera combinada, donde tres diferentes anticuerpos anti-TNF estaban presentes simultáneamente en las muestras de suero humano. Para estos ensayos, se ha producido una curva de valoración inversa que cubre un intervalo de concentración entre 1 gg/ml y 100 gg/ml. En este experimento, la exactitud obtenida para 10 gg/ml y 100 pg/ml estuvo por debajo de un 20 %. Los resultados se representan en la figura 1. La ecuación de regresión media fue Y = 1,19 x X con un coeficiente de correlación R2 de 0,999. Para cada punto de concentración, los datos obtenidos de los péptidos controlados fueron coherentes, lo que indica que nuestra estrategia es robusta. La exactitud estuvo por debajo de un 20 % y cumple los criterios de aceptación. La alta exactitud del método demuestra que es posible cuantificar con un alto grado de precisión un anticuerpo terapéutico anti-TNF presente en la sangre de un paciente usando una estrategia genérica y con enmascaramiento, combinando el uso de un patrón de anticuerpo SIL y CL-EM.
Por tanto, el método puede aplicarse para el seguimiento terapéutico personalizado de pacientes tratados con anticuerpos terapéuticos anti-TNF.
De manera más interesante, los resultados experimentales muestran que el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento no requiere una selección de un método de cuantificación específico de anticuerpo como es el caso en la presente práctica habitual. Además, el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF permite corregir situaciones en las que el tratamiento de un paciente está documentado erróneamente, y también permite determinar concentraciones de anticuerpos anti-TNF en muestras de ensayo de pacientes que han experimentado tratamientos de politerapia anti-TNF. Finalmente, el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF no se ve afectado si el paciente ha recibido un primer tratamiento con anticuerpo anti-TNF y posteriormente un segundo tratamiento con un segundo anticuerpo anti-TNF distinto del primer anticuerpo.
Ejemplo 2: Evaluación de la concentración máxima de anticuerpos anti-TNF que pueden estar presentes en la muestra sin afectar a la captura de antígeno usando MSIA
El objetivo de este experimento fue evaluar, usando un solo anticuerpo anti-TNF Infliximab, la concentración máxima que puede medirse con exactitud usando nuestra estrategia de cuantificación de anticuerpos anti-TNF.
A) Protocolo
Para realizar este experimento, el anticuerpo terapéutico Infliximab se obtuvo de colaboradores. El Infliximab SIL se produjo y se purificó de acuerdo con el método descrito previamente (Lebert et al., Bioanalysis, 2015). Las muestras se trataron usando materiales y métodos descritos en la sección A. Las muestras se trataron siguiendo la opción 1 descrita en la sección A. Los péptidos de secuencias de la SEQ ID NO. 1 a 8 se controlaron en el ensayo de CL-SRM, en sus formas marcadas y no marcadas.
Tabla 2: Las muestras se constituyeron y analizaron para evaluar la saturación del antígeno TNF alfa usando una estrategia de tecnolo ía MSIA.
B) Resultados experimentales
El experimento realizado en este caso tenía como objetivo evaluar la concentración máxima de anticuerpos anti-TNF que puede medirse con exactitud usando el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este
documento. Para limitar la complejidad, se evaluó usando un solo anticuerpo anti-TNF, Infliximab, que se añadió en suero humano a diferente concentración que cubría un intervalo entre 20 pg/ml y 200 pg/ml, mientras el patrón de Infliximab SIL se añadió en la misma muestra a una concentración relativamente elevada de 40 pg/ml. Los resultados se representan en la figura 2. Los resultados obtenidos muestran que la cuantificación de Infliximab en estas condiciones es exacta y permanece lineal cuando el Infliximab terapéutico está presente en la muestra a una concentración de 100 pg/ml y cuando se añade patrón de Infliximab SIL a una concentración de 40 pg/ml. Con la curva lineal obtenida, incluso se puede extrapolar que sería lineal y exacta cuando el Infliximab terapéutico está presente en la muestra a una concentración de 150 pg/ml y cuando el patrón de Infliximab SIL se añade a una concentración de 40 pg/ml. Sin embargo, aparece un fenómeno de saturación cuando el Infliximab terapéutico está presente en la muestra a una concentración de 200 pg/ml y cuando el patrón de Infliximab SIL se añade a una concentración de 40 pg/ml. Estos resultados permiten concluir que el protocolo de MSIA descrito para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento con una técnica MSIA permite medir con exactitud un anticuerpo terapéutico anti-TNF presente en una muestra de sangre humana a una concentración igual o por debajo de 40 pg/ml usando hasta 5 anticuerpos anti-TNF SIL, cada uno añadido a una concentración de 20 pg/ml (total = 100 pg/ml) e incluso hasta 30 pg/ml (total = 150 pg/ml). Los resultados también muestran que el protocolo de MSIA, cuando se usa para realizar el método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento, permite medir con exactitud un anticuerpo terapéutico anti-TNF presente en una muestra de sangre humana a una concentración igual o por debajo de 150 pg/ml usando hasta 2 anticuerpos anti-TNF SIL, cada uno añadido a una concentración de 20 pg/ml (concentración total de anticuerpos anti-TNF = 40 pg/ml).
Estos resultados muestran que el protocolo de inmunoafinidad por espectrometría de masas, que es una ilustración de realizaciones del método de cuantificación de anticuerpos anti-TNF descrito en este documento, puede usarse para la cuantificación de un anticuerpo anti-TNF usando múltiples patrones de anticuerpo anti-TNF SIL.
Ejemplo 3: Evaluación de una curva de valoración para la cuantificación en muestras de suero humano del anticuerpo terapéutico Trastuzumab en presencia de otros dos anticuerpos antineoplásicos (Rituximab y Bevacizumab), usando una preparación de muestra basada en reducción en proteínas que no son de anticuerpo Cibacron®
El objetivo de este experimento fue realizar una curva de valoración para evaluar los rendimientos de los patrones de anticuerpos marcados isotópicamente estables (SIL) y del método de CL-EM/EM.
En el ejemplo 3, se realizó una curva de valoración usando (i) los anticuerpos antineoplásicos no marcados Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab como compuestos de patrón interno y (ii) Trastuzumab SIL como anticuerpo antineoplásico a cuantificar. De hecho, puede realizarse el mismo experimento usando (i) anticuerpos antineoplásicos SIL como compuestos de patrón interno y (ii) un Trastuzumab no marcado como anticuerpo antineoplásico a cuantificar.
A) Protocolo
Se generó una curva de valoración, de acuerdo con el siguiente protocolo 1) añadir a una muestra de suero una cantidad definida de anticuerpos terapéuticos, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab y 2) añadir una cantidad creciente de Trastuzumab SIL. Por tanto, se denomina curva de valoración inversa porque el Trastuzumab SIL se cuantifica usando el Trastuzumab terapéutico.
Dicho experimento imita una situación donde un paciente se habría tratado con T rastuzumab y cuyo suero se analizará usando nuestro método de CE-EM/EM y tres patrones terapéuticos.
Para realizar este experimento, los anticuerpos terapéuticos Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab se obtuvieron de colaboradores. El Trastuzumab SIL se produjo y se purificó de acuerdo con el método descrito previamente (Lebert et al., Bioanalysis, 2015). Las muestras se trataron usando materiales y métodos descritos en la sección B. Las muestras se trataron siguiendo la opción 1 descrita en la sección B. Los péptidos de secuencias de la SEQ ID NO. 47 a 73 se controlaron en el ensayo de CL-SRM, en sus formas marcadas y no marcadas.
Tabla 3: Las muestras se constituyeron y analizaron para evaluar la exactitud y precisión de nuestro método de CL-EM/EM en un contexto donde están presentes múltiples anticuerpos terapéuticos en la muestra.
B) Resultados experimentales
Los rendimientos de cuantificación proporcionados por nuestra estrategia que combina el uso de patrones de mAb SIL y CL-EM/EM se evaluaron de una manera combinada, donde tres diferentes anticuerpos antineoplásicos estaban presentes simultáneamente en las muestras de suero humano. Para estos ensayos, se ha producido una curva de valoración inversa que cubre un intervalo de concentración entre 0,5 pg/ml y 50pg/ml.
Los resultados se representan en la figura 3. La ecuación de regresión media fue Y = 1,243 x X 2,05 con un coeficiente de correlación R2 de 0,996. Para cada punto de concentración, los datos obtenidos de los péptidos controlados fueron coherentes, lo que indica que nuestra estrategia es robusta. Para cada punto de concentración, los datos obtenidos de los péptidos controlados fueron coherentes, lo que indica que nuestra estrategia es robusta. La alta exactitud del método demuestra que es posible cuantificar con un alto grado de precisión un anticuerpo terapéutico antineoplásico presente en la sangre de un paciente usando una estrategia genérica y con enmascaramiento, combinando el uso de un patrón de anticuerpo SIL y CL-EM.
Por tanto, el método puede aplicarse para el seguimiento terapéutico personalizado de pacientes tratados con anticuerpos terapéuticos antineoplásicos.
De manera más interesante, los resultados experimentales muestran que el método de cuantificación de anticuerpos antineoplásicos descrito en este documento no requiere una selección de un método de cuantificación específico de anticuerpo como es el caso en la presente práctica habitual. Además, el método de cuantificación de anticuerpos antineoplásicos permite corregir situaciones en las que el tratamiento de un paciente está documentado erróneamente, y también permite determinar concentraciones de anticuerpos antineoplásicos en muestras de ensayo de pacientes que han experimentado tratamientos de politerapia antineoplásica. Finalmente, el método de cuantificación de anticuerpos antineoplásicos no se ve afectado si el paciente ha recibido un primer tratamiento con anticuerpo antineoplásico y posteriormente un segundo tratamiento con un segundo anticuerpo antineoplásico distinto del primer anticuerpo.
Tabla 3: n i
Claims (15)
1. Un método para cuantificar un anticuerpo terapéutico en una muestra de un individuo humano, que comprende las etapas de:
a) añadir a una muestra de ensayo que puede contener anticuerpos terapéuticos a cuantificar una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis,
b) someter la muestra preproteólisis a una proteólisis enzimática, para proporcionar una muestra de proteólisis que comprende (i) péptidos marcados de proteólisis derivados de los anticuerpos terapéuticos marcados y (ii) péptidos de proteólisis derivados del anticuerpo terapéutico contenido en la muestra de ensayo,
c) determinar por análisis espectrométrico de masas la relación entre (i) uno o más péptidos marcados de proteólisis seleccionados y (ii) uno o más péptidos de proteólisis correspondientes derivados de dicho anticuerpo terapéutico, d) calcular, a partir de la relación determinada en la etapa c), la cantidad de dicho anticuerpo terapéutico en la muestra de ensayo;
en el que la muestra de ensayo es una muestra de plasma humano o una muestra de suero humano, y los dos o más anticuerpos se seleccionan en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra es de un individuo humano que ha recibido un tratamiento terapéutico con el anticuerpo terapéutico.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los dos o más anticuerpos terapéuticos se seleccionan en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que los dos o más anticuerpos terapéuticos se seleccionan en un grupo que consiste en: Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la proteólisis enzimática se realiza en la etapa b) usando tripsina.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que consiste en:
- para Infliximab: péptidos de la SEQ ID NO. 1 -8,
- para Etanercept: péptidos de la SEQ ID NO. 9-15,
- para Adalimumab: péptidos de la SEQ ID NO. 16-23,
- para Certolizumab: péptidos de la SEQ ID NO. 24-30, y
- para Golimumab: péptidos de la SEQ ID NO. 31 -37,
- para Trastuzumab: péptidos de la SEQ ID NO. 47-53,
- para Rituximab: péptidos de la SEQ ID NO. 54-64,
- para Bevacizumab: péptidos de la SEQ ID NO. 65-73.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteólisis se realiza en la etapa b) incubando la muestra preproteólisis con una proteasa dirigida a la bisagra seleccionada en un grupo que consiste en gelatinasa A (MMP-2), estromielisina (MMP-3), matrilisina (MMP-7), gelatinasa B (MMP-9), metaloelastasa de macrófagos (Mm P-12), colagenasa-3 (MMP-13), catepsina G, pseudolisina, mirabilisina, glutamil endopeptidasa I (GluV8), estreptopaína (SpeB), trepolisina y enzima degradante de inmunoglobulina de Streptococcus (ideS).
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el uno o más péptidos de proteólisis seleccionados se seleccionan en un grupo que consiste en:
- para Infliximab: péptidos de la SEQ ID NO. 38-39,
- para Etanercept: péptido de la SEQ IDNO. 40,
- para Adalimumab: péptidos de la SEQ IDNO. 41 -42,
- para Certolizumab: péptidos de la SEQ ID NO. 43-44, y
- para Golimumab: péptidos de la SEQ ID NO. 45-46.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la etapa a) comprende las siguientes etapas:
a1) añadir a una muestra de ensayo una cantidad conocida de dos o más formas marcadas de dichos anticuerpos terapéuticos seleccionados en un grupo que consiste en Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab y Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis no concentrada, y
a2) enriquecer la muestra preproteólisis no concentrada en anticuerpos, por lo que se proporciona una muestra preproteólisis.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que en la etapa a2), la muestra de proteólisis no concentrada se somete a una etapa de reducción de proteínas, preferiblemente a una etapa de reducción de albúmina.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que en la etapa a2), la muestra de proteólisis no concentrada se somete a una etapa de inmunocaptura, preferiblemente a una etapa de inmunocaptura usando un sustrato de afinidad en que se inmoviliza una diana de anticuerpo terapéutico.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la muestra de ensayo es una muestra de plasma humano.
13. Un kit para cuantificar anticuerpos terapéuticos, que comprende dos o más anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables, seleccionados en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab, Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
14. El kit de acuerdo con péptidos de la reivindicación precedente, en el que los dos o más anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables se seleccionan en un grupo que consiste en: Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Certolizumab, Golimumab.
15. El kit de acuerdo con la reivindicación 14, en el que los dos o más anticuerpos terapéuticos marcados isotópicamente estables se seleccionan en un grupo que consiste en: Trastuzumab, Rituximab y Bevacizumab.
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