KR102000862B1 - 질량 분석을 사용한 모노클로날 항체의 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

모노클로날 항체의 Fab 도메인의 가변 영역을 위치 선택적으로 소화하고, 한편 Fc 도메인의 소화를 억제함으로써, 단백질을 보다 간편하게 검출·정량하는 방법을 제공한다. 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 방법이며, 상기 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 검출하는 것인, 상기 방법을 제공한다.

Description

질량 분석을 사용한 모노클로날 항체의 검출 방법
본 발명은 질량 분석을 사용한 모노클로날 항체의 검출 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 모노클로날 항체의 특이적 서열을 포함하는 펩티드 단편을 선택적으로 소화하는 전처리 스텝과, 얻어진 펩티드 단편을 선택적으로 검출하는 스텝을 포함하는, 상기 방법에 관한 것이다.
창약 영역에서의 최대의 과제는, 부작용이 적고 높은 약효를 발휘하는 약의 개발이다. 그 때문에 현재 주목되고 있는 것이 약물 동태, 특히 농도 모니터링(therapeutic drug monitoring, TDM)이다. 처방한 약이 적정량인지 여부, 병변 부위에 도달했는지 여부를 지표로 시즈의 스크리닝이 행해짐으로써, 드롭아웃할 약을 조기에 발견하고, 이 정보를 조기 창약 개발이나 임상 시험에서 유효하게 이용할 수 있게 된다. 특히 암이나 자기 면역 질환 등의 분야에서는, 요즘에는 분자 표적약이라고 불리는 창약이 주류이다. 분자 표적약의 효과적인 약효는, 병변 부위에 축적되어 약효를 발휘하고 있는지 여부를 측정하여, 의사 자신이 판단할 수 있는 것이 중요하다.
분자 표적약으로서는 현재, 병원 단백질을 표적 항원으로 하는 항체 의약이 주목받고 있다. 항체는 본래 체내에 존재하는 단백질이기 때문에, 부작용이 낮을 것이 예상되고, 분자 표적 효과를 높이기 위하여 고농도로 투여하는 것도 가능하다. 또한 항체는 그 성질상, 극히 높은 분자 특이성을 나타내고, 표적이 되는 병변에 축적된다고 말해져 왔지만, 항체 의약 자체의 약값의 문제도 있고, 적정 사용에 의한 최적화 의료를 행하는 것이 중요하다고 논의되게 되었다. 그것을 위해서는 항체 의약의 국재나 농도를 측정함으로써, 최적의 투약량을 설정하는 것도 중요하다. 나아가, 투약한 약의 약효 지표를 제대로 관찰하기 위한, 항체 의약 농도의 정량에도 큰 수요가 있다.
항체 등의 단백질의 정량을 위한 가장 일반적인 기술은 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)이다. 이것은 측정 대상인 단백질에 대한 항체를 제작하고, 또한 검출용 항체로 샌드위치시킴으로써, 간편하게 측정 대상 분자를 정량하는 기술이다. ELISA는 매우 범용성이 높은 기술이며, 또한 자동화 지원 환경도 점점 좋아지고 있기 때문에, 앞으로도 진단 기술로서는 골든 스탠다드가 될 것으로 예상된다.
그러나, ELISA에는, 예를 들어, 측정 대상을 직접 측정하고 있지 않기 때문에, 이상값이 나오는 경우가 있는 것, 또한 측정 대상마다 항체를 제작할 필요가 있어, 시간이나 비용이 든다는 점, 복수의 해석 대상을 동시에 측정할 수 없다는 점 등, 많은 과제가 존재한다. 특히 항체 의약에 대해서는, 내재성 항체와의 교차 반응도 발생하여, 정확한 측정이 어렵다. 또한, 중화 항체와 항원이 결합한 상태에서는 항원 인식 부위가 가려져, ELISA로 측정할 수 없는 경우도 많다.
또한, 동물 시험 페이즈에서 채용된 ELISA의 분석 조건에서는, 종간 교차의 문제때문에 그대로 대형 동물이나 인간에게는 응용 가능하지 않은 경우도 종종 있다. 즉, 창약 개발 단계와 인간 임상 시험에서는, 각각의 측정 조건에서 비교하지 않을 수 없다. 병변 조직 중의 약제 농도의 ELISA에서는, 검출을 저해하는 매트릭스 성분이 상이하기 때문에, ELISA 베이스로 약물 동태를 행하기 위해서는, 복수의 항체의 제작이 필요해져버린다. 이것은, 방대한 비용이나 후기 개발에 있어서의 드롭아웃 등, 매우 큰 리스크를 내포하고 있다.
한편, 질량 분석을 사용한 단백질의 정량 및 구조 해석은, 질량 분석 기술이나 데이터 해석 서버·소프트웨어의 발전과 함께, 비약적으로 그 응용 범위를 확장하고 있다. 특히, 질량 분석을 사용한 절대 정량 기술은, 특이적 항체에 의존하지 않는 방법으로서, 인식도가 높아지고 있다.
예를 들어, 시판 항체가 없는 단백질을 정량하는 경우, 종래에는 단백질을 대량으로 정제할 필요가 있었으나, 질량 분석을 사용함으로써 이 스텝이 생략되기 때문에, 비약적으로 효율적으로 되었다. 의학의 분야에서도, 종래에는 병리 절편을 얇게 자르는 방법, 보존 방법 등 의사의 손 기술 등의 문제로, 면역 조직 염색에 차가 생겨버려, 양성, 위양성, 음성의 판정이 어려운 경우는 종종 일어날 수 있었다. 이에 비해 병리 절편 중의 목적 병원 단백질을 질량 분석으로 정량함으로써, 고발현 단백질인지 여부의 판정이 가능하다. 또한 요즘에는, 레이저 미세절제라고 불리는, 세포 1개를 잘라내 오는 장치를 범용적으로 사용할 수 있는 상황에 있다. 예를 들어, 암 세포만을 회수하고, 그 세포 내의 병원 단백질의 발현 변동 해석을, 질량 분석으로 직접 관찰하는 것이 가능하게 된다. 이것은 특히 병리나 임상의 현장에서 매우 획기적인 기술 혁신이며, 분석 기술의 표준화 등의 정비가 요망되고 있는 상황이다.
정밀도가 높은 분석 기술인 한편, 생체 시료 중의 단백질을 질량 분석에 의해 검출하는 경우에는, 측정 대상의 단백질을 프로테아제 소화하여 단편화하는 경우가 많기 때문에, 협잡물을 포함하는 다양한 펩티드 단편으로부터 목적으로 하는 펩티드 단편을 효율적으로 선택하는 것이 중요해지고 있다.
특허문헌 1에서는, 시료 중의 항체의 검출을 위해서, 펩신을 사용하여 비면역 글로불린 단백질의 분해와 함께 항체를 소화하여 F(ab')2 단편을 산생시킨 후에 추가로 트립신 소화를 행하는 것이 개시되어 있다. 또한 특허문헌 2는, 질량 분석에 선행하는 액체 크로마토그래피 단계에서 적절하게 분리된 펩티드만을 정량 대상으로서 선택한다는 것이다. 비특허문헌 1은 항 펩티드 항체를 사용하여 측정 대상 펩티드를 농축한다는 것이다.
또한 최근 들어, 프로테아제 소화의 고효율화 방법으로서, 나노 입자 등의 미소 환경(마이크로리액터) 내에서, 프로테아제 소화를 행하는 방법이 주목받고 있다. 예를 들어, 비특허문헌 2에서는, 세공 내에 트립신을 고정한 메소 다공 실리카를 사용함으로써 분자량이 작은 단백질을 선택적으로 트립신 소화할 수 있음이 보고되어 있다. 비특허문헌 3에서는, 나일론막에 트립신을 고정화하여, 단백질의 트립신 소화를 고효율화한 예가 보고되어 있다. 이들 방법은 모두, 다공질체의 세공 내에 프로테아제를 고정화하고, 고상 표면의 프로테아제와 액상 내의 기질 단백질을 반응시키는 것이다.
비특허문헌 4는 시료 중의 모노클로날 항체와 내재성 항체를 식별하기 위한 하이 스루풋법을 제안하는 것이다.
일본 특허 공표 제2010-515020호 일본 특허 공개 제2012-197258호
N. Leigh Anderson 등, Mass Spectrometric Quantitation of Peptides and Proteins Using Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies(SISCAPA), Journal of Proteome Research, 2004, 3(2), 235 Qianhao Min 등, Size-selective proteolysis on mesoporous silica-based trypsin nanoreactor for low-MW proteome analysis, Chemical Communications, 2010, 46, 6144 Fei Xu 등, Facile Trypsin Immobilization in Polymeric Membranes for Rapid, Efficient Protein Digestion, Analytical Chemistry, Analytical Chemistry, 2010, 82, 10045 Xiaotao Duan 등, High-Throughput Method Development for Sensitive, Accurate, and Reproducible Quantification of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Tissues Using Orthogonal Array Optimization and Nano Liquid Chromatography/Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry, Analytical Chemistry, 2012, 84, 4373
질량 분석법에 의해, 단백질을 간편하게 검출·정량하기 위해서는, 측정 대상의 단백질을 위치 선택적으로 절단하고, 그 단백질에 특이적인 펩티드 단편을 효율적으로 산생시켜, 다른 펩티드 단편의 산생량을 작게 할 것이 요구된다. 따라서, 항체의 경우에는, Fab 도메인, 특히 Fab 도메인의 가변 영역을 위치 선택적으로 소화하고, 한편 Fc 도메인의 소화를 억제할 필요가 있다.
본 발명자들의 그룹은, 기질이 되는 항체와 프로테아제 효소의 양쪽을 고상으로 고정화함으로써, 모노클로날 항체의 위치 선택적인 프로테아제 소화를 실현할 수 있었다(N. Iwamoto 등, Selective detection of complementarity determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate: nano-surface and molecular-orientation limited proteolysis, Analyst, 2014, 139, 576). 이 방법은, 측정 대상인 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 것이다. 프로테아제로서는 트립신과 리실 엔도펩티다아제(Lys-C)를 9:1의 비율로 사용하는 이중 소화가 가장 효율적이라고 보고되었다.
상기 방법은, 고상-고상 반응을 사용하여 모노클로날 항체의 선택적인 프로테아제 소화를 행하는 획기적인 방법이지만, 실제로 사용하기 위해서는 추가로 검토할 여지를 남기고 있다.
따라서 본 발명은
·항체의 고차 구조에 기초하여, 항체에 포함되는 특이적 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 보다 간편하게 조제하는 것,
·프로테오믹스에서 사용되고 있는 전처리 공정(변성, 환원 알킬화)을 생략하고, 생리 조건 하에서 분해함으로써, 에너지 절약화를 도모함과 함께, 범용화를 가능하게 하는 것,
·해석 펩티드의 모집단수를 저감시키면서, 샘플의 특이성을 유지하는 것,
·항체 의약의 다양성에 대응하여, 종간의 교차 반응이나 유래 샘플의 공존 매트릭스를 극복할 수 있는, 범용적인 분석 방법을 확립하는 것, 및
·혈액이나 조직 등의 매트릭스 성분이 공존하고 있는 샘플에서도, 특이성의 담보를 가능하게 하는 것
등을 과제로 한다.
본 발명자 등은 상기 과제를 염두에 두고 예의 검토한 결과, 본 발명의 제한적인 프로테아제 소화를 사용한 항체의 검출을 위해서는, 모노클로날 항체의 가변 영역 중에서, 특히 CDR2 영역에 포함되는 프로테아제 소화 단편을 검출하는 것이 가장 유효함을 알아내고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.
(1) 측정 대상인 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 방법이며, 상기 다공질체의 평균 세공 직경이 10nm 내지 200nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 50nm 내지 500nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 다공질체의 평균 세공 직경보다도 크고, 검출 대상인 펩티드 단편이 상기 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 방법.
(2) 상기 모노클로날 항체가 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-DM1이며, 검출 대상이 서열 번호 1, 3, 6 및/또는 7에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, (1)에 기재된 방법.
(3) 표 2 또는 3에 기재된 조건을 사용하여 다중 반응 모니터링에 의해 검출하는, (2)에 기재된 방법.
(4) 상기 모노클로날 항체가 베바시주맙이며, 검출 대상이 서열 번호 9 내지 11에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, (1)에 기재된 방법.
(5) 표 4에 기재된 조건을 사용하여 다중 반응 모니터링에 의해 검출하는, (4)에 기재된 방법.
(6) 상기 모노클로날 항체가 리툭시맙이며, 검출 대상이 서열 번호 13, 15 및/또는 16에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드인, (1)에 기재된 방법.
(7) 표 5에 기재된 조건을 사용하여 다중 반응 모니터링에 의해 검출하는, (6)에 기재된 방법.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 번호 2015-046059호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명의 방법은, 제한적인 프로테아제 반응장이기 때문에, 항체의 가변 영역, 특히 CDR2 영역을 선택적으로 분해하고, 회수할 수 있다. CDR2 영역은 항체에 있어서 가장 표면 가까이에 노출되어 있는 부위이기 때문에 우선적으로 분해된다. 이것을 이용함으로써, 질량 분석에 있어서의 모노클로날 항체의 검출을 보다 효율적으로 행하는 것이 가능하게 된다. 항체 의약의 CDR2 영역을 선택적으로 회수할 수 있다는 점에서, 그 영역을 포함하는 펩티드를 정량함으로써, 생체 시료로부터 직접적으로, 항체 의약의 농도를 측정하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 싱글 이온 모니터링(SIM)에 의한 해석 방법을 모식적으로 도시한다.
도 2는 다중 반응 모니터링(MRM)에 의한 해석 방법을 모식적으로 도시한다.
도 3은 일렉트로 스프레이 이온화법의 원리를 도시한다.
도 4는 항체의 모식도를 도시한다.
도 5는 본 발명의 방법의 원리를 도시한다.
도 6은 혈장 중에 첨가한 베바시주맙 CDR 펩티드의 정량 분석을 위한 검량선을 도시한다. (A) FTFSLDTSK(서열 번호 10), (B) VLIYFTSSLHSGVPSR(서열 번호 11)
본 발명은 측정 대상인 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 방법이며, 상기 다공질체의 평균 세공 직경이 10nm 내지 200nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 50nm 내지 500nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 다공질체의 평균 세공 직경보다도 크고, 검출 대상인 펩티드 단편이 상기 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것인, 상기 방법에 관한 것이다.
「CDR 영역」이란, 항체에 있어서 아미노산 치환 빈도가 특히 많은 영역을 표현하는 말이며, DNA 편집의 위치(엑손과 인트론 구성)로 규정되어 있다. 본 발명의 방법에 있어서 검출 대상으로서 정량하는 펩티드는, 이 CDR 영역을 지표로 전후 근방의 영역을 보고 선택하고, 서열 얼라인먼트 해석을 거쳐서 특이성이 있는 펩티드를 사용하고, 또한 혈중 내재성 항체와 교차가 없는지, 실측값에 의해 검증을 행할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「CDR2(영역)」란, 항체의 1차 구조에 있어서의 특정한 연속 아미노산 잔기에서 CDR2로서 규정되는 영역에 추가로, 항체의 입체 구조에 있어서 이 영역과 근접하고, 전체적으로 항체의 특이성을 규정하고 있는 영역을 포함하는 것으로 한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「CDR1(영역)」 및 「CDR3(영역)」에 관한 언급도, 상기와 마찬가지로, 입체 구조적으로 항체의 특이성을 규정하고 있는 영역을 포함하는 것으로 한다. 일반적으로 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 영역이어도, 항체에 따라서 서열에 상이가 있는 것은 알려져 있다. FR 영역의 서열은 항체 단백질의 유래, 제작 공정 등에도 의존할 수 있다. 당업자라면 목적으로 하는 항체와 다른 항체의 아미노산 서열의 멀티플 얼라인먼트, 및 목적으로 하는 항체와 내재성 항체의 교차 반응성 등을 확인함으로써, 목적으로 하는 항체의 특이성을 효율적으로 검출하기 위한 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 결정하고, 검출 대상인 펩티드 단편을 선택할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서, 「CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열」이란, 목적으로 하는 항체에 특이적인 CDR2 영역 유래의 아미노산을 1개 이상 포함하는 아미노산 서열인 것을 의미하고, 바꾸어 말하면, CDR2 영역의 일부를 포함하는 아미노산 서열이라 할 수도 있다. 질량 분석을 사용한 분석에서는, 특이성을 규정하는 아미노산 잔기가 1개 이상 있으면, 그 특이성을 확실하게 검출하는 것이 가능하다. 또한, 「CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열」이란, 「CDR2 영역 유래의 아미노산」을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 의도하는 것은 아니며, 당해 아미노산 서열이 전체로서 목적으로 하는 항체의 아미노산 서열의 일부의 연속적 서열을 구성하고 있는 것을 의도하는 것이다.
이하, 본 발명의 방법을 구체적으로 설명한다.
<질량 분석의 개요>
질량 분석을 사용한 정량 기술은, 최근에는 주로 삼련 사중극이라고 불리는 하이브리드형 질량 분석 장치에 의해 행하여진다. 구체적으로는, 이온화된 생체 분자는 먼저, 옥토폴이라고 불리는 부분을 통과함으로써, 그 이온 분자 진동 반경을 작게 한다. 다음으로 제1 사중극 중에서, 특정한 질량수를 갖는 이온을 공진시킴으로써 선택하고, 다른 이온을 배제한다. 이 스텝은 싱글 이온 모니터링(single ion monitoring, SIM)이라고도 불린다(도 1).
선택된 이온은 제2 사중극에 운반되고, 아르곤과 충돌함으로써 개열이 행하여진다. 이 반응은 충돌 유기 해리(collision-induced dissociation, CID)라고 한다. 이 개열 반응의 결과, 생성한 특이적인 단편을 제3 사중극에서 선택함으로써, 매우 고감도이며, 또한 고선택적인 정량이 가능하게 된다. 이 일련의 분석을 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM)이라 칭한다(도 2).
질량 분석을 사용한 생체 시료의 정량은, 생체 분자의 구조 특이적인 이온을 지표로 정량할 수 있다고 하는 최대의 이점이 있고, 이것을 고속 액체 크로마토그래프로 연결함으로써, 연속적 해석을 가능하게 할 수 있다. 현존하는 분석 기기 중에서, 거의 유일하다고 할 수도 있는 이점을 갖는 기술이다.
질량 분석에 의해 항체를 검출하기 위해서는, 먼저 혈액이나 조직 등의 생체 시료로부터 항체를 추출하고, 적절한 용매에 용해시킬 필요가 있다. 또한, 항체는 그대로 분석하기에는 분자가 크기 때문에, 프로테아제에 의해 펩티드로 분해하고, 그 후 액체 크로마토그래프로 분리한 후에 질량 분석을 한다. 분석에 적합한 펩티드의 분자량은 약 1000 내지 3000Da 정도이다.
그러나, 일반적인 단백질 분자를 프로테아제 분해하면, 펩티드 단편이 약 100개 정도, 항체인 경우에는 200개를 훨씬 초과하는 펩티드 단편이 생성된다. 따라서, 단일의 단백질만으로도 측정 대상수는 방대해져, 복잡한 생체 시료를 대상으로 한 경우에는, 거대한 샘플 세트로 된다.
또한, 항체 분자에서는, CDR 영역 등의 극히 일부의 서열만이 상이하고, 나머지의 부분은 공통 서열이기 때문에, 상기 거대하고 복잡한 샘플로부터, 목적으로 하는 특이적 서열만을 분석, 정량하기 위해서는, 질량 분석 스텝 전에 고분리 능 및 재현성이 좋은 액체 크로마토그래프가 필수가 된다. 현재는, 초고속·고압 크로마토그래프 기기가 있고, 그것에 대응한, 입경이 균일하고 매우 미세한 칼럼 수지 등도 개발되어 있어, 이러한 고속, 고분리, 내고압 칼럼을 사용함으로써 비약적으로 분리능 향상이 도모되게 되었다. 그러나, 프로테오믹스 등, 단백질 세트를 대상으로 하는 연구 분야에 있어서는 아직 충분하다고는 할 수 없는 현 상황이 있다.
이어서, 도 3에 일렉트로 스프레이 이온화법의 개요를 도시한다. 고정밀도의 질량 분석에 의한 해석에 있어서의 과제로서, 「매트릭스 효과」라고 하는 것이 있다. 매트릭스 효과란, 동일한 액적 내에 이온화 저해 물질이 존재하거나, 또는 동시에 다종의 이온이 존재함으로써, 목적 물질의 이온화 효율이 저감되어버리는 현상이다. 이온화에 부여되는 에너지는 동등하므로, 이온화 대상 물질이 증가하면, 필연적으로 에너지가 분산되어, 이온량이 감소되어버린다.
해석 대상 펩티드의 개수가 증가하면, 칼럼 분리로 완전히 분리하기는 곤란하다. 따라서, 매트릭스 효과에 의한 이온화 효율의 저하, 결과적으로는 감도나 정량 재현성의 저하를 야기하는 요인이 된다. 이것을 개선하기 위하여 질량 분석측에서, 고속 채널 전환 기능 등을 만들어, 개선을 도모하고 있지만, 근본적으로는 모집단의 저감을 하지 않는 한, 이 매트릭스 효과를 극복할 수는 없다.
상기와 같은 여러가지 문제점을 고려하여, 본 발명의 방법은, 측정 대상의 특이성을 유지하면서, 해석 대상의 모집단을 저감시키는 것을 의도하는 것이다.
<항체>
본 발명의 방법에 있어서의 측정 대상은 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는, 면역 글로불린 IgG이며, 도 4에 도시한 바와 같이, 2개의 중쇄(분자량 50kDa)와 2개의 경쇄(분자량 25kDa)가 디술피드 결합으로 연결된 구조를 갖는 생체 고분자이다. Fab 도메인과 Fc 도메인이 힌지를 통하여 연결되어 있고, 또한 중쇄 및 경쇄는 각각 정상 영역과 가변 영역을 포함한다. 정상 영역은, 항체의 특징적인 Y자형의 형을 유지하는 구조(프레임워크 구조)를 갖고, 동일종 유래의 항체 대부분에서 공통되는 아미노산 서열을 갖고 있다. 한편, 가변 영역에는, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)이라 불리는 특이적인 서열을 갖는 부위가 각 3개씩 존재한다. 이 CDR(CDR1, CDR2, CDR3) 영역이 규정하는 입체 구조가 항원과의 특이적 결합에 관계되어 있고, 그것에 의하여 항체-항원 복합체가 형성된다.
항체의 고차 구조에서 더 특징적인 것은, 리지드한 구조를 갖는 정상 영역에 비하여 매우 플렉시블한 힌지, 및 가변 영역이다. 중쇄의 C 말단에는 Protein A나 Protein G라고 불리는 특정한 단백질이 결합하는 부위가 존재하는 것을 알고 있다.
최근에는, 여러가지 질환에 대하여 특이적으로 작용할 수 있는 항체 의약으로서, 수많은 모노클로날 항체가 개발되고 있다. 본 발명의 방법은, 그러한 모노클로날 항체의 검출을 위하여 매우 유효한 방법이며, 본 발명의 방법에 있어서 측정 대상으로 될 수 있는 모노클로날 항체로서는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 파니투무맙, 오파투무맙, 골리무맙, 이필리무맙 등의 인간 항체; 토실리주맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙, 오말리주맙, 메폴리주맙, 겜투주맙, 팔리비주맙, 라니비주맙, 세르톨리주맙, 오크렐리주맙, 모가물리주맙, 에쿨리주맙 등의 인간화 항체; 리툭시맙, 세툭시맙, 인플릭시맙, 바실릭시맙 등의 키메라 항체 등을 들 수 있다. 또한, 모노클로날 항체의 분자 직경은 약 14.5nm이다.
또한, 모노클로날 항체의 특이성을 유지하면서 더한층 기능을 부가한 복합체, 예를 들어 Fc 융합 단백질, 항체-약물 복합체(예를 들어 겜투주맙·오조가마이신, 트라스투주맙-엠탄신 등)도 본 발명의 방법에 있어서의 측정 대상인 모노클로날 항체에 포함하는 것으로 한다. 이 경우, 측정에 앞서 복합체의 결합을 해리시켜서 항체만을 LC-MS에 제공해도 되고, 또는 복합체의 형태 LC-MS에 제공할 수도 있다. 당업자라면 본 명세서의 기재에 기초하여, 측정 대상에 따라서 본 발명의 방법을 위한 최적의 조건을 설정할 수 있다.
본 발명의 방법에 의하면, 모노클로날 항체의 특히 CDR2 영역을 위치 선택적으로 프로테아제 소화할 수 있고, 얻어진 펩티드 단편의 질량 분석에 의해, 항체의 동정이나 정량을 행할 수 있다. 본 발명의 분석 방법은, 항체의 가변 영역 유래의 펩티드 단편, 특히 CDR2 영역의 단편을 검출함으로써, 항체의 검출이나 정량을 행하고, 항체 유래의 펩티드 단편을 직접 측정하는 방법이다. 본 발명의 분석 방법은, 항체의 종류에 관계 없이 적용 가능하기 때문에, 본 발명의 방법은, 상기 예시의 항체에 한정되지 않고, 신규로 개발된 모노클로날 항체 등에도 적용할 수 있다.
<다공질체>
본 발명의 방법에 사용하는 다공질체(도 5에 있어서는 「항체 Fc 고정화 수지」)는 다수의 세공을 갖는 것이기만 하면, 그 재료는 특별히 한정되지 않고 활성탄, 다공질막, 다공질 수지 비즈, 금속 입자 등을 사용할 수 있다. 이들 중에서도, 항체를 부위 특이적으로 결합 가능한 것이 특히 바람직하다.
도 5에서는, 반구 형상의 세공이 도시되어 있지만, 세공의 형상은 특별히 한정되지 않는다. 또한, 다공질막과 같이, 다공질체를 관통하는 세공이 형성된 것을 사용할 수도 있다. 다공질체의 세공의 크기는 특별히 한정되지 않고 항체를 고정화했을 때에, 세공의 표층 부근에 선택적으로 소화되어야 할 부위가 위치하도록, 항체의 분자 직경 등을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 다공질체의 평균 세공 직경 D2는, 10nm 내지 200nm 정도의 범위에서, 또한 나노 입자의 평균 입경 D1보다도 작은 범위에서 적절하게 설정된다. 다공질체의 평균 세공 직경 D2는, 예를 들어, 20nm 내지 200nm 정도가 바람직하고, 30nm 내지 150nm 정도가 보다 바람직하다. 항체의 Fc 도메인을 세공 내에 고정화하고, Fab 도메인을 위치 선택적으로 프로테아제 소화하기 위해서는, 다공질체의 세공 직경은, 30nm 내지 150nm가 바람직하고, 40nm 내지 120nm가 보다 바람직하고, 50nm 내지 100nm, 특히 약 100nm가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법은, 측정 대상인 모노클로날 항체를 다공질체의 세공 내에 고정화한다. 세공 내에 항체를 고정화하고, 고상과 액상의 계면이라고 하는 미세한 환경에 존재시킴으로써, 항체는 변성을 일으키기 쉽고, 분자의 요동이 섭동을 받고, 프로테아제의 어택을 받을 확률이 향상된다. 또한, 본 발명에서는, 후술하는 바와 같이 프로테아제가 나노 입자에 고정화됨으로써, 입체적으로 안정되고, 자기 소화가 발생하기 어려운 환경이 되기 때문에, 프로테아제의 안정성이 증가한다고 생각된다. 그 때문에, 본 발명의 방법에 의하면, 위치 선택적인 프로테아제 소화가 가능하게 되는 것에 추가하여, 프로테아제의 고활성을 유지할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 다공질체의 세공 내에, 항체와 부위 특이적으로 상호 작용하는 링커 분자가 고정화된 것이 바람직하게 사용된다. 항체와 링커 분자의 상호 작용으로서는, 화학 결합, 수소 결합, 이온 결합, 착체 형성, 소수적 상호 작용, 반데르발스 상호 작용, 정전적 상호 작용, 입체 선택적 상호 작용 등을 들 수 있다.
링커 분자로서는, 항체의 Fc 도메인과 부위 특이적으로 결합하는 Protein A나 Protein G 등이 바람직하게 사용된다. 세공 내에 이들의 링커 분자가 고정화된 다공질체를 사용함으로써, 세공 내에 항체의 Fc 도메인이 고정화되고, Fab 도메인이 세공의 표층 부근에 위치한다. 이와 같이, 세공 내에서의 항체의 배향이 제어됨으로써, 프로테아제에 의한 Fab 도메인의 위치 선택적 소화가 가능하게 된다.
링커 분자의 크기는, 항체의 선택적 절단 부위가 세공의 표층 부근에 위치하도록 선택된다. 링커 분자와 항체가 결합한 상태의 분자 사이즈는, 다공질체의 세공 직경의 0.5배 내지 1.5배 정도가 바람직하고, 0.6배 내지 1.2배 정도가 보다 바람직하고, 0.7배 내지 1.1배 정도가 더욱 바람직하고, 0.8배 내지 1배 정도가 특히 바람직하다. 또한, 다공질체에 링커 분자가 고정되어 있지 않고, 세공 내에 항체를 직접 결합시키는 경우에는, 항체의 분자 직경과 다공질체의 세공 직경이 상기 관계를 충족하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 바람직하게 사용 가능한 다공질체로서, 특별히 한정하는 것이 아니지만, 예를 들어 Protein G Ultralink 수지(Pierce사제), 토요펄, TSKgel(TOSOH사제) 등을 들 수 있다. 예를 들어 Protein G Ultralink 수지에서는, 수지에 결합한 Protein G의 95％는 세공 내에 있음을 알 수 있다.
<다공질체에의 항체의 고정화>
항체를 다공질체의 세공 내에 고정화하는 방법은 특별히 한정되지 않고 항체와 다공질체 또는 링커 분자의 특성 등에 따라서 적당한 방법을 채용할 수 있다. 예를 들어, 세공 내에 protein A나 protein G가 고정화된 다공질체에 항체를 고정화하는 경우에는, 다공질체의 현탁액과 항체를 포함하는 용액을 혼합함으로써, 세공 내에 항체를 용이하게 고정화할 수 있다.
다공질체와 항체의 양비는, 목적에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 정량 분석을 행하는 경우, 시료 중의 항체의 거의 전량이 다공질체에 고정화될 것이 요망된다. 그 때문에, 시료 중의 항체의 추정 함유량에 대하여 다공질체의 양이 과잉이 되도록 양비를 설정하는 것이 바람직하다.
<나노 입자>
본 발명의 방법에 있어서, 나노 입자는, 그 표면에 프로테아제를 고정화하고, 다공질체의 세공 내에 고정화된 항체에 대한 프로테아제의 액세스를 제어할 목적으로 사용된다. 그 때문에, 나노 입자는, 다공질체의 세공 깊은 곳까지 들어가지 않도록, 그 평균 입경 D1이, 다공질체의 평균 세공 직경 D2보다도 큰 것으로 한다(도 5).
나노 입자의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 다공질체의 세공에의 프로테아제의 액세스 균일화 관점에서, 구상의 나노 입자가 바람직하다. 또한, 나노 입자는, 분산성이 높고, 평균 입경이 균일한 것이 바람직하다.
나노 입자의 평균 입경 D1은, 50nm 내지 500nm의 범위이며, 다공질체의 평균 세공 직경 D2의 1.2배 이상이 보다 바람직하고, 1.5배 이상이 더욱 바람직하고, 1.8배 이상, 예를 들어 약 2배가 특히 바람직하다. 예를 들어 다공질체의 평균 세공 직경이 30 내지 150nm 정도인 경우, 나노 입자의 평균 입경 D1은 100nm 이상이 바람직하고, 150nm 이상이 보다 바람직하다. 다공질체의 평균 세공 직경이 50nm 내지 100nm 정도인 경우, 나노 입자의 평균 입경은, 120nm 이상이 바람직하고, 150nm 이상이 보다 바람직하고, 170nm 이상이 특히 바람직하다. 나노 입자의 평균 입경 D1의 상한은, 프로테아제에 의한 소화 효율을 높이는 관점에서 500nm 이하가 바람직하고, 300nm 이하가 더욱 바람직하다.
나노 입자는, 상기 프로테아제를 표면에 고정화할 수 있는 것이기만 하면, 그 재질은 특별히 한정되지 않고 금속이나 수지 등이 적절하게 사용된다. 또한, 금속 표면을 수지로 피복한 것이나, 수지 표면을 금속으로 피복한 것 등을 사용할 수도 있다.
나노 입자의 종류로서는, 수성 매체에 분산 또는 현탁할 수 있고, 분산액 또는 현탁액으로부터 자기 분리 또는 자성 침전 분리에 의해 용이하게 회수할 수 있는 자기 나노 입자가 바람직하다. 또한, 응집이 일어나기 어렵다고 하는 점에 있어서, 그 표면이 유기 폴리머로 피복된 자기 나노 입자가 보다 바람직하다. 자기 나노 입자의 기재로서는, 산화철(마그네타이트(Fe3O4), 마그헤마이트(γ-Fe2O3)), 페라이트(Fe/M)3O4 등의 강자성 합금을 들 수 있다. 페라이트(Fe/M)3O4에 있어서, M은, 철 이온과 함께 사용하여 자성 금속 산화물을 형성할 수 있는 금속 이온을 의미하고, 전형적으로는 Co2+, Ni2+, Mn2+, Mg2+, Cu2+, Ni2+ 등이 사용된다. 또한, 자기 나노 입자를 피복하는 유기 폴리머로서는, 폴리글리시딜메타크릴레이트(폴리GMA), GMA와 스티렌의 코폴리머, 폴리메타크릴산메틸(PMMA), 폴리아크릴산메틸(PMA) 등을 들 수 있다. 유기 폴리머로 피복된 자성 나노 비즈의 구체예로서는, FG 비즈, SG 비즈, Adembeads, nanomag 등을 들 수 있다. 시판품으로서는, 예를 들어, 타마가와 세이키 가부시키가이샤 제조의 FG beads(페라이트 입자를 폴리글리시딜메타크릴레이트(폴리GMA)로 피복한 입경 약 200nm의 폴리머 자성 나노 입자)가 바람직하게 사용된다.
상기 나노 입자는, 비특이적인 단백질의 흡착 억제와, 프로테아제의 선택적인 고정화를 위해서, 프로테아제와 결합 가능한 스페이서 분자로 수식되어 있는 것이 바람직하다. 스페이서 분자를 통하여 프로테아제를 고정화함으로써, 나노 입자 표면으로부터의 프로테아제의 탈리가 억제되고, 프로테아제 소화의 위치 선택성이 높아진다. 또한, 스페이서의 분자 사이즈를 조정함으로써, 항체의 원하는 위치에 프로테아제를 선택적으로 액세스시켜, 위치 선택성을 높일 수도 있다.
스페이서는, 프로테아제와 결합 가능하고, 또한 프로테아제를 실활시키지 않는 것이 바람직하다. 나노 입자 표면에 고정화된 프로테아제의 액세스 범위를 제어하는 관점에서, 스페이서는 분자 직경이 작은 것이 바람직하다. 스페이서의 분자 직경은, 5nm 이하가 바람직하고, 3nm 이하가 보다 바람직하고, 2nm 이하가 더욱 바람직하다. 또한, 스페이서의 분자량은 2000 이하가 바람직하고, 1500 이하가 보다 바람직하고, 1000 이하가 더욱 바람직하다.
상기 분자 직경으로, 프로테아제를 고정화할 수 있는 스페이서 분자는, 비단백질이 바람직하고, 말단에 아미노기, 카르복실기, 에스테르기, 에폭시기, 토실기, 히드록실기, 티올기, 알데히드기, 말레이미드기, 숙신이미드기, 아지드기, 비오틴, 아비딘, 킬레이트 등의 관능기를 갖는 분자가 바람직하다. 예를 들어, 트립신의 고정에는, 활성화된 에스테르기를 갖는 스페이서 분자가 바람직하다. 또한, 스페이서 분자 중, 상기 관능기 이외의 스페이서 아암 부분은, 폴리에틸렌글리콜 및 그의 유도체, 폴리프로필렌글리콜 및 그의 유도체, 폴리아크릴아미드 및 그의 유도체, 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 폴리(에틸렌옥시드) 및 그의 유도체, 폴리(에틸렌 테레프탈산) 및 그의 유도체 등의 친수성 분자가 사용된다.
이러한 스페이서 분자로 표면 수식된 나노 입자도 또한 시판되고 있어, 그들을 이용하면 된다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드로 활성화된 에스테르기(활성 에스테르기)를 갖는 스페이서 분자로 수식된 나노 입자는, 상품명 「FG beads NHS」(타마가와 세이키 가부시키가이샤)로서 시판되고 있다. FG beads NHS의 입자 직경은 약 200nm±20nm이며, 나노 입자로서 매우 균질의 것이다.
<프로테아제>
본 발명의 방법은, 프로테아제가, 다공질체의 세공 내에 고정화된 항체를 특정한 아미노산 서열 부위에서 절단하여, CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편을 발생시키는 것이다.
본 발명에 있어서 나노 입자에 고정화시키는 프로테아제의 종류는, 질량 분석에 의한 정량 또는 동정의 대상으로 되는 단백질의 종류에 따라 적절히 선택하면 되고, 한정은 되지 않지만, 예를 들어, 트립신, 키모트리프신, 리실 엔도펩티다아제, V8 프로테아제, AspN 프로테아제(Asp-N), ArgC 프로테아제(Arg-C), 파파인, 펩신, 디펩티딜펩티다아제 등을 들 수 있다. 프로테아제는 2종 이상을 조합하여 사용할 수도 있다.
상기 프로테아제 중에서도, 본 발명에 있어서는, 트립신이 특히 바람직하게 사용된다. 트립신은 기질 특이성이 높고, 또한 절단 후의 펩티드의 C 말단에 Lys 또는 Arg가 있기 때문에 펩티드의 전하량 및 전하 국재를 균질하게 할 수 있어, 질량 분석을 위한 시료 제작을 위하여 특히 바람직하다. 또한 트립신은 분자 직경이 작고(약 3.8nm), 또한 활성 부위가 분자의 내부에 존재하고 있다. 그 때문에, 활성 부위가 항체에 액세스할 수 있는 영역이 제한되어, 프로테아제 소화의 위치 선택성을 높일 수 있다.
프로테아제 소화 후의 항체의 펩티드 단편을 측정 자료로서 질량 분석에 제공하는 경우에는, 자기 소화가 적고, 절단 서열의 선택성이 높은 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 시판하고 있는 프로테아제를 사용하는 경우, 질량 분석 그레이드나 서열 결정(시퀀스) 그레이드의 프로테아제를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 생체 유래의 네이티브 트립신은, 자기 소화에 의해 키모트리프신 타입의 활성을 나타내는 의사 트립신을 생성하기 때문에, 절단 부위의 특이성이 낮다는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 질량 분석 그레이드로서, 트립신의 리신 잔기를 환원 메틸화하여 자기 소화에 대한 저항성을 높인 것이 시판되고 있다.
본 발명의 방법에 있어서 바람직하게 사용할 수 있는 프로테아제로서, 예를 들어 Trypsin Gold(프로메가사제), Trypsin TPCK-treated(시그마사제) 등을 들 수 있다.
<나노 입자에의 프로테아제의 고정화>
프로테아제를 나노 입자의 표면에 고정화하는 방법은 특별히 한정되지 않고 프로테아제와 나노 입자(또는 나노 입자 표면을 수식하는 스페이서 분자)의 특성 등에 따라서 적당한 방법을 채용할 수 있고, 예를 들어, 프로테아제를 스페이서 수식된 나노 입자 표면에 고정화하는 경우에는, 나노 입자의 현탁액과 프로테아제를 포함하는 용액을 혼합함으로써, 나노 입자 표면에 프로테아제를 고정화할 수 있다. 상기 스페이서 분자의 관능기를 통한 나노 입자와 프로테아제의 아민 커플링법이 바람직하다. 예를 들어, 나노 입자에 표면 수식한 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드(NHS)로 에스테르화하여 활성화 에스테르기로 하고, 이것에, 프로테아제의 아미노기를 결합시킬 수 있다. 이 커플링 반응에는, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDAC), N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 비스(2,6-디이소프로필페닐)카르보디이미드(DIPC) 등의 카르보디이미드를 축합제의 존재 하에 행할 수 있다. 또한, 나노 입자에 표면 수식한 아미노기에, 글루타르알데히드, 2관능성 숙신이미드, 비스(술포숙신이미딜)수베레이트(BS3), 술포닐클로라이드, 말레이미드, 피리딜디술피드 등의 가교제를 사용하여 프로테아제의 아미노기를 결합시켜도 된다.
스페이서 분자의 관능기를 개재한 나노 입자와 프로테아제의 커플링법은, 나노 입자의 현탁액에 프로테아제 용액을 첨가하고, 일정한 조건 하에서 혼합 교반한다는 간편한 조작으로 행할 수 있다.
나노 입자 표면에 프로테아제를 고정화 후에, 나노 입자 표면의 프로테아제와 미결합된 활성 부분을 불활성화시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 나노 입자 표면에 프로테아제가 고정화되어 있지 않은 스페이서 분자가 존재하면, 미결합된 스페이서 분자가, 시료 중의 협잡물 등과 결합하여, 프로테아제 소화에 악영향을 미치거나, 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편이 나노 입자에 고정화되는 등의 문제를 발생시키는 경우가 있다. 프로테아제를 고정화 후에, 미결합된 스페이서 분자를 블록함으로써, 이러한 문제가 억제된다. 프로테아제와 미결합된 활성 부분을 불활성화하는 방법으로서는, 화학 수식이 바람직하다. 예를 들어, 활성화 에스테르기는, 1급 아민과의 반응에 의해 아미드 결합을 형성하여 불활성화시킬 수 있다.
<프로테아제 소화>
항체가 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 나노 입자를 액체 중에서 접촉시킴으로써, 항체가 프로테아제 소화되어, 펩티드 단편이 산생된다. 여기서, 「액체」란, 기질(고상) 및 효소(고상)가 액상 중에서 접촉하는 것을 의미하는 것이며, 또한 프로테아제 소화 반응에 적합한 수성 매체를 의도한다.
본 발명에 있어서의 프로테아제 소화의 조건은 특별히 한정되지 않고 일반적인 프로테아제 소화와 동일한 조건을 적절하게 채용할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 최적(조건) pH 근방으로 조정된 완충 용액 중에서, 통상 37℃ 정도의 온도에서, 1시간 내지 20시간 정도 인큐베이트하는 것이 바람직하다.
항체가 고정화된 다공질체와, 프로테아제가 표면에 고정화된 나노 입자와의 혼합량비도 특별히 제한되지 않고, 항체의 양에 따른 프로테아제량이 되도록 설정하면 된다. 또한, 일반적인 프로테아제 소화 조건은, 기질:프로테아제=100:1 내지 20:1(중량비) 정도이다. 이에 비해, 본 발명에서는, 다공질체와 나노 입자의 조합에 의해, 항체와 프로테아제의 액세스가 물리적으로 제한되기 때문에, 일반적인 프로테아제 소화에 비하여, 프로테아제량을 많게 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체:프로테아제=30:1 내지 3:1 정도가 바람직하고, 15:1 내지 4:1 정도가 보다 바람직하고, 10:1 내지 5:1 정도가 더욱 바람직하다.
본 발명의 방법에서는, 다공질체에 항체를 고정화시킨 채의 상태에서 프로테아제 소화가 행해진다. 프로테아제 소화에 의해 산생된 펩티드 단편은 액상 내에 존재하기 때문에, 항체의 용출이나 변성 조작을 행하지 않고, 위치 선택적으로 목적으로 하는 펩티드 단편이 얻어진다. 본 발명의 방법에 의하면, 종래법에 비하여 간편한 조작으로, 또한 위치 선택적으로 펩티드 단편의 회수를 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 예를 들어 세공 직경 100nm의 Protein G 수지 상에 항체의 C 말단측을 고정화하고, 항체의 가변 영역은 반드시 용액측으로 배향하도록 한다. 이어서, 입자 직경 200nm의 나노 입자 표면에 프로테아제를 고정화한다. 프로테아제의 항체에의 접촉을 제한함으로써, 가변 영역 선택적인 항체 분해 반응을 행하는 반응장을 형성하는 것이 가능하게 된다. 또한 상대 표면적이 매우 큰 나노 입자 표면을 프로테아제 반응장으로서 사용함으로써 항원과의 접촉 확률을 향상시키는 것이 가능하게 된다.
프로테아제 소화는, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 느린 회전에 의한 교반과 함께 정기적인 탭핑을 수반하는 탭핑 로테이션 하에서 행할 수 있다. 「느린 회전」은, 예를 들어 3 내지 10rpm 정도의 회전수를 가리키고, 또한, 「탭핑」은, 튕기는, 또는, 쇼크를 주는 순간 동작(빈도: 예를 들어, 1분간 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회)을 가리킨다. 이에 의해, 항체를 고정화한 다공질체와 프로테아제를 고정화한 나노 입자가 모두 분산 상태를 유지하면서 효과적으로 접촉하여, 프로테아제 소화 반응 효율을 높일 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 기질인 모노클로날 항체와 프로테아제의 접촉을 제한함으로써, 모노클로날 항체의 특이성을 나타내는 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 효율적으로 소화하여, 질량 분석에 제공할 수 있다.
<다공질체 및 나노 입자의 제거>
프로테아제 소화에 의해 얻어진 목적으로 하는 펩티드 단편을 질량 분석에 제공하기 위해서는, 다공질체 및 나노 입자를 제거할 필요가 있다. 이것은, 프로테아제 소화 후의 샘플에 대하여 여과, 원심 분리, 자기 분리, 투석 등의 조작을 행함으로써 달성할 수 있다.
여과에 의해 다공질체 및 나노 입자를 제거하는 경우, 사용하는 여과막의 구멍 직경은, 상기 다공질체 및 나노 입자를 통과할 수 없고, 또한 소화된 펩티드의 통과를 가능하게 하는 범위에서 선택된다. 예를 들어 폴리불화비닐리덴(PVDF)제의 여과막(Low-binding hydrophilic PVDF, 구멍 직경 0.2㎛, 밀리 포어사제), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)제의 여과막(Low-binding hydrophilic PTFE, 구멍 직경 0.2㎛, 밀리 포어사제) 등을 사용하여 여과함으로써, 다공질체 및 나노 입자를 간편하게 제거할 수 있다. 여과는, 원심 여과로 하면 신속하고 또한 간편한 여과가 가능하다.
<액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)>
상기에서 얻어진 펩티드 단편을 포함하는 시료를, LC-MS에 의해 분석함으로써, 항체의 동정이나 정량을 행할 수 있다.
펩티드 단편의 분리를 보다 확실하게 하여, 분석 정밀도를 높이는 등의 목적으로, 질량 분석에 제공하기 전의 시료를, 액체 크로마토그래프(LC)에 의해, 분리·농축한다. LC에 의해 시료의 분리를 행하는 경우, LC로부터의 용출액을 직접 이온화하여 질량 분석에 제공해도 된다. LC와 탠덤 질량 분석을 조합한 LC/MS/MS나 LC/MSn에 의해 분석을 행할 수도 있다. 또한, LC로부터의 용출액을 한번 분취하고 나서, 질량 분석에 제공해도 된다. LC의 칼럼은 특별히 한정되지 않고 펩티드의 분석에 일반적으로 사용되는 C30, C18, C8, C4 등의 소수 칼럼이나, 친수성 친화성 크로마토그래피용의 담체 등을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
질량 분석은, 아미노산 서열을 결정 가능하기 때문에, 펩티드 단편이 항체 등의 특정한 단백질에서 유래된 펩티드 단편인지 여부를 판별 가능하다. 또한, 피크 강도에 기초하여 시료 중의 펩티드 단편의 농도를 결정할 수 있다. 본 발명에서는, 항체가 위치 선택적으로 프로테아제 처리되기 때문에, 시료 중에 포함되는 펩티드 단편의 종류가 감소되어 있다. 그 때문에, 질량 분석 등에 의한 분석 조건의 설정을 용이하게 이룰 수 있다. 분석 시에는, 필요에 따라, 탈염, 가용화, 추출, 농축, 건조 등의 처리를 행한 후, 시료를 분석에 사용해도 된다.
질량 분석에 있어서의 이온화법은 특별히 한정되지 않고 전자 이온화(EI)법, 화학 이온화(CI)법, 전계 탈리(FD)법, 고속 원자 충돌(FAB)법, 매트릭스 지원 레이저 탈리 이온화(MALDI)법, 일렉트로 스프레이 이온화(ESI)법 등을 채용할 수 있다. 이온화된 시료의 분석 방법도 특별히 한정되지 않고 자장 편향형, 사중극(Q)형, 이온 트랩(IT)형, 비행 시간(TOF)형, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FT-ICR)형 등을, 이온화법에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 또한, 삼련 사중극형 질량 분석 장치 등을 사용하여, MS/MS 분석, 또는 MS3 이상의 다단계 질량 분석을 행할 수도 있다.
본 발명의 방법 사용에 있어서 특히 적합한 장치는, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 LCMS-8030, LCMS-8040, LCMS-8050, 및 LCMS-8080(모두 시마즈 세이사쿠쇼), LCMS-IT-TOF, LCMS-Q-TOF(시마즈 세이사쿠쇼)를 들 수 있다.
질량 분석 결과에 기초하여, 항체를 동정하기 위해서, 기존의 데이터베이스를 사용할 수도 있다. 본 발명에서는, 항체가 위치 특이적으로 프로테아제 소화된 펩티드 단편이 사용되기 때문에, 데이터베이스 검색에 의한 히트율이나 데이터의 확실도가 높여진다. 또한, 다단계의 질량 분석 등에 의해, 펩티드 단편의 아미노산 서열을 특정함으로써, 항체를 동정할 수도 있다. 항체에 특이적인 CDR2 영역의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 단편을 검출할 수 있다면, 목적으로 하는 항체를 동정·정량할 수 있다.
또한, 검출 결과에 기초하여, 항체의 동정이나 정량을 행하는 경우, 검출 대상의 펩티드는, 아미노산 잔기수가 5 내지 30 정도의 것이 바람직하고, 7 내지 25 정도가 보다 바람직하다. 아미노산 잔기수가 과도하게 작으면, 협잡물이나 동일 단백질이 다른 부위에서 유래되는 펩티드 단편과의 구별이 되기 어려워, 오검출 등의 원인이 될 수 있다. 또한, 아미노산 잔기수가 과도하게 크면, 이온화가 곤란해진다는 등의 이유에 의해, 검출이 곤란해지거나, 정량성이 저하하는 경우가 있다.
항체의 농도를 정량하는 경우, 검출된 펩티드 단편 이온(다단계 MS의 경우에는, 분자 이온의 개열에 의해 얻어진 프래그먼트 이온)의 피크 면적이나 피크 강도에 기초하여, 항체의 양을 산출할 수 있다. 예를 들어, 미리 구해진 검량선(교정 곡선)과 피크 면적의 관련 짓기나, 시료 중에 첨가된 내부 표준에서 유래되는 피크 면적과 시료 유래의 피크 면적의 관련 짓기 등에 의해, 시료 중의 펩티드 단편의 농도가 산출되고, 펩티드 단편 농도에 기초하여, 항체의 양이나 농도가 산출된다.
질량 분석에서 검출하는 펩티드 단편은, 측정 대상인 모노클로날 항체 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것이며, 검출은 1종의 펩티드를 사용하는 것이어도 되고, 2종 이상의 펩티드를 사용하는 것이어도 된다. 또한, 본 발명의 방법은, CDR2 영역 이외의 영역에서 유래되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 검출을 배제하는 것은 아니며, CDR2 영역 유래의 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 아울러, CDR1 영역, CDR3 영역 등에서 유래하는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 검출해도 된다.
또한, 질량 분석에서는, 1종의 펩티드의 검출에 있어서, 수 종의 프래그먼트 이온이 생성되는 것은 주지이다. 내부 표준 펩티드의 분석 결과나 미리 판명되어 있는 분석 결과와 참조하면, 1종의 펩티드에 1종의 이온만의 검출로 목적으로 하는 모노클로날 항체의 동정이 가능한데, 1종의 분자 이온으로부터 생성하는 복수의 프래그먼트 이온, 예를 들어 2종 이상, 3종 이상, 4종 이상의 프래그먼트 이온을 동시에 검출·정량함으로써, 보다 상세한 구조 정보를 얻을 수 있다. 그러나, 프래그먼트 정보량이 너무 많으면, 분석 시간이 길어져, 결과적으로 분석 정밀도의 저하로도 이어지기 때문에, 일반적으로는 1종의 분자 이온에 대하여 2 내지 5종 정도의 프래그먼트 이온을 동시 모니터하는 것이 바람직하다. 또한, 프래그먼트 이온은, 이온 계열로서 y 이온 계열을 선택하는 것이 바람직하지만, 그 우위 후보가 없으면, 다음으로 b 이온 계열을 선택해도 된다. 프래그먼트 이온 중에서 가장 이온 수율이 높은 이온을 정량용, 기타를 구조 확인용 이온으로 함으로써, 구조 특이성을 확보할 수 있다.
<CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드>
본 발명의 방법에 있어서의 검출 대상인 펩티드 단편은, 항체 의약 등의 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 항체의 입체 구조상, CDR2 영역이 가장 외측 또한 상방에 존재하기 때문에, 본 발명의 방법에 있어서의 제한적인 프로테아제 소화에 있어서, 프로테아제의 액세스라는 의미에서 이 영역의 펩티드가 가장 높은 효율로 검출될 수 있다.
항체 의약으로서 사용하는 것이 의도되는 모노클로날 항체는, 그 아미노산 서열 정보 등이 공개되어 있고, 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열, Fab 및 Fc 도메인, CDR 영역, 디술피드 결합 등의 정보를 입수하는 것이 가능하다. 본 발명의 방법을 사용하여 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 베바시주맙, 및 리툭시맙를 트립신 소화하여 얻어지는 펩티드의 예를 표 1에 나타내었다.
Figure 112017094430822-pct00001
표 1에 있어서, CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드 서열을 굵은 글씨로 나타낸다. 본 발명의 방법에 있어서, 이들 CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, 질량 분석에 의한 항체의 동정·정량을 위하여 특히 적합하다.
따라서, 측정 대상으로 되는 모노클로날 항체가 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-DM1일 경우, 서열 번호 1, 3, 6 및/또는 7에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 검출 대상으로서 선택하는 것이 바람직하다. 이 경우, 예를 들어 표 2 또는 3에 기재된 조건을 지표로 하여, 삼련 사중극형 질량 분석 장치(예를 들어 LCMS-8050, 시마즈 세이사쿠쇼)에 의한 다중 반응 모니터링에 의해 검출할 수 있다.
Figure 112017094430822-pct00002
Figure 112017094430822-pct00003
Figure 112017094430822-pct00004
Figure 112017094430822-pct00005
측정 대상으로 되는 모노클로날 항체가 베바시주맙일 경우, 서열 번호 9 내지 11에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 검출 대상으로서 선택하는 것이 바람직하다. 이 경우, 예를 들어 표 4에 기재된 조건을 지표로 하여, 삼련 사중극형 질량 분석 장치(예를 들어 LCMS-8050, 시마즈 세이사쿠쇼)에 의한 다중 반응 모니터링에 의해 검출할 수 있다.
Figure 112017094430822-pct00006
Figure 112017094430822-pct00007
측정 대상으로 되는 모노클로날 항체가 리툭시맙일 경우, 서열 번호 13, 15 및/또는 16에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 검출 대상으로서 선택하는 것이 바람직하다. 이 경우, 예를 들어 표 5에 기재된 조건을 지표로 하여, 삼련 사중극형 질량 분석 장치(예를 들어 LCMS-8050, 시마즈 세이사쿠쇼)에 의한 다중 반응 모니터링에 의해 검출할 수 있다.
Figure 112017094430822-pct00008
Figure 112017094430822-pct00009
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[프로테아제의 고정화]
이하의 스텝에 따라서 나노 입자에 프로테아제를 고정화하였다.
<1. FG 비즈 세정>
FG 비즈 NHS 200mg(타마가와 세이키사제)을 원심 분리(15,000g X 5분, 4℃)하여, 보존용 상청 이소프로판올을 제거한다. 상청은, 침전하지 않는 부유물도 포함하여, 신중하게 제거한다.
<2. 효소 준비>
Trypsin Gold 1mg, 5개(프로메가사제)를 개봉하고, 4℃로 냉각한 25mM HEPES-NaOH, pH 7.0에 용해한다. 용해 후, 50ml 원침관에 취하고, 얼음 상에 정치한다. 효소는 25mM HEPES-NaOH, pH 7.0을 사용하여 1회 프리워싱하고, 가능한 한 회수한다. 최종 완충액량은 25ml 정도가 된다.
<3. FG 비즈 세정>
각각 10ml의 빙냉한 메탄올을 첨가하고, 빙냉한 초음파 세정기 중에서, FG 비즈의 현탁을 확인하고 나서 원심 분리(15,000g X 5분, 4℃)하여, 상청 메탄올을 제거한다.
<4. 효소 고정화 반응>
FG 비즈의 침전 200mg에, 트립신 용액을 첨가한다. 빙냉한 초음파 세정기를 사용하여 FG 비즈의 현탁을 확인하고 나서, 현탁을 유지할 수 있는 최저한의 스피드로 30분간 연속하여 보르텍스를 행한다. 30분간 반응시킨 후, 원심 분리(15,000g X 5분, 4℃)를 행하여, 상청을 제거한다. 상청을 회수하고, BCA 분석에 의한 커플링 효율을 확인한다.
<5. 활성기 블록>
FG 비즈의 침전 200mg에, 각각 25ml의 1M 2-아미노 에탄올염산염, pH 8.0을 첨가하고, 빙냉한 초음파 세정기를 사용하여 FG 비즈의 현탁을 확인하고 나서, 현탁을 유지할 수 있는 최저한의 스피드로 연속 보르텍스를 행한다. 30분간 반응시켜서 블로킹한 후, 원심 분리를 행하여, 상청을 제거한다.
<6. 효소 비즈 세정>
FG 비즈의 침전 200mg에, 각각 25ml의 25mM HEPES-NaOH, 50mM NaCl, pH 7.0을 첨가하고, 빙냉한 초음파 세정기를 사용하여 FG 비즈의 현탁을 확인하고 나서, 현탁을 유지할 수 있는 최저한의 스피드로 연속 보르텍스를 행한다. 세정 5분 후, 원심 분리를 행하여, 상청을 제거한다.
<7. 보존>
프로테아제 최종 농도 0.5μg/μl가 되도록 25mM Tris-HCl, pH 8.0을 첨가하고, 빙냉한 초음파 세정기를 사용하여 FG 비즈의 현탁을 확인하고 나서, 각각 500μl로 분주한다. 그 후 -80℃에서 보존한다.
[프로테아제 소화]
이하의 스텝에 의해 혈장 시료 중의 모노클로날 항체를 프로테아제 소화하였다.
<1. 혈장으로부터의 모노클로날 항체의 회수>
모노클로날 항체는, 면역 글로불린 IgG의 패밀리이기 때문에, 혈장 중에 내재하는 면역 글로불린과 동일한 방법으로 회수가 가능하다. 혈장 20μl를 취하고, 180μl의 PBS +0.1％ n-옥틸-β-D-티오글리코시드(도진가가쿠)로 희석한다.
여기에 Protein G Ultralink 수지(Pierce사제)의 50％ 현탁액을 40μl 첨가한다. 실온에서 1 내지 2시간 천천히 보르텍스, 또는 로터리 믹서로 회전시킴으로써, 혈장 중의 항체 분자를 수지에 결합시킨다. 원심 분리에 의해 수지를 침전시키고, 상청을 버린다.
200μl의 PBS +0.1％ n-옥틸-β-D-티오 글리코시드를 첨가하여 3회 세정함으로써, 수지에 비특이적으로 결합한 혈장 중 단백질을 세정한다. 계속해서, 200μl의 PBS로 1회 세정하여, 계면 활성제를 제거한다.
<2. 프로테아제 반응>
Protein G Ultralink 수지가 남아있는 튜브에, 200 μl의 25mM Tris-HCl, pH 8.0을 첨가한다. 계속해서, 이것에 트립신을 고정화한 나노 입자를 80μl 첨가하고, 로테이터에 세트하고, 37℃에서 6시간 천천히 회전시킨다.
반응 후, 0.2 ㎛의 저결합성 친수성 PVDF막(밀리포어사제)으로 여과함으로써, Protein G 수지와 트립신을 고정화한 나노 입자를 모두 제거하고, 반응 용액을 회수한다.
[질량 분석]
시판하고 있는 혈장(시그마사제)에 항체 의약을 스파이크하고, 그 펩티드를 검출하였다. 모노클로날 항체로서, 트라스투주맙(의약품명 헤르셉틴, 추가이 세이야쿠), 트라스투주맙-DM1(의약품명 캐싸일라, 추가이 세이야쿠), 베바시주맙(의약품명 아바스틴, 로슈·제넨테크), 리툭시맙(의약품명 리툭산, 추가이 세이야쿠 및 젠야쿠 고교)의 4종을 사용하였다. 질량 분석의 조건은 이하와 같다.
<HPLC 조건(Nexera LC30A 액체 크로마토그래프 시스템)>
용매 A: 0.1％ 포름산, 용매 B: 0.1％ 포름산+아세토니트릴
유속: 0.5ml/분
구배 시간: 1％ B(1.5분), 1-40％ B 구배(5분), 95％ B(5분), 1％ B(5분)
칼럼: L-column2 ODS, 2 x 50 mm(가가쿠붓시츠 효카 겐큐 기코)
칼럼 온도: 50℃
<MS 인터페이스 조건(LCMS-8050(시마즈 세이사쿠쇼))>
네블라이저 가스: 3L/분
히팅 가스: 10L/분
드라잉 가스: 10L/분
인터페이스 온도: 300℃
DL 온도: 250℃
히트 블록 온도: 400℃
도 6에, 베바시주맙을 검출한 예를 든다. 도 6의 (A)는 중쇄의 CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드 FTFSLDTSK(서열 번호 10), 도 6의 (B)는 경쇄의 CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드 VLIYFTSSLHSGVPSR(서열 번호 11)을 검출 대상 펩티드로서 질량 분석을 한 결과이다. 이들의 검출을 위한 질량 분석 정보는, 상기 표 4를 참조함으로써 얻을 수 있다.
도 6의 결과로부터 명백해진 바와 같이, 질량 분석에 의한 상기 펩티드의 검출은 매우 정밀도가 높고, 취득한 데이터로부터 검량선을 작성하면, 베바시주맙 농도 100μg/ml까지의 범위에서 중상관 계수 R2=0.9999, R2=0.9998이었다.
[이온 강도의 비교]
상기와 동일한 조건에서 프로테아제 소화한 항체 의약의 펩티드를 질량 분석으로 검출하였다. 모노클로날 항체로서, 트라스투주맙(의약품명 헤르셉틴, 추가이 세이야쿠), 베바시주맙(의약품명 아바스틴, 로슈·제넨테크), 리툭시맙(의약품명 리툭산, 추가이 세이야쿠 및 젠야쿠 고교)의 3종을 사용하였다.
결과를 표 6 내지 8에 나타내었다.
Figure 112017094430822-pct00010
Figure 112017094430822-pct00011
Figure 112017094430822-pct00012
표 6 내지 8의 결과로부터 명백해진 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해, 트라스투주맙, 베바시주맙, 리툭시맙 중 어느 것이든, CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 펩티드 단편이, 다른 영역 유래의 펩티드 단편과 비교하여 높은 이온 강도로 검출되었다.
본 발명의 방법은, 특히, CDR2 영역의 아미노산을 포함하는 펩티드를 선택적으로 프로테아제 소화하여, 얻어진 펩티드 단편을 질량 분석함으로써, 그 펩티드 단편의 서열이나 양을 결정하고, 항체를 동정·정량할 수 있다. 본 발명의 방법은, 조작이 간편하고, 또한 재현성이나 정량성을 확보할 수 있음과 함께, 자동화도 이룰 수 있기 때문에, 약물 동태의 해석, 항원 항체 반응을 사용한 상호 작용의 해석, 각종 인터액톰 해석, 면역 침강 단백질의 동정 등의 기초 연구에도 적용할 수 있다. 기타, 항체 의약 등의 생체 분자 의약의 서열 해석, 품질 보증, 후발 의약품의 동일성 확인 등에 대한 응용도 기대할 수 있다.
현재, 항체 의약은 40품째가 출시되어 있고, 또한 전임상 시험은 300 정도, 동물 시험을 포함하는 전임상 시험에서는 2,000종 이상, 연구 단계나 시즈도 포함하면 5,000종을 초과한다고 말해지고 있다. 본 발명은 이러한 다종다양한 항체 의약에 대하여 극히 범용성이 높은 분석 방법을 제공할 수 있는 것이며, 앞으로의 항체 의약 개발의 가속에 기여할 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 그대로 인용에 의해 본 명세서에 원용되는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Shimadzu Corporation <120> Method for Detecting a Monoclonal Antibody by Mass Spectrometry <130> PH-6398-PCT <150> JP 2015-046059 <151> 2015-03-09 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 1 Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg 1 5 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 2 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 3 Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 4 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 5 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 6 Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg 1 5 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 7 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 8 Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 9 Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 10 Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 11 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg 1 5 10 15 <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 12 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 10 15 Trp Val Arg <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 13 Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 14 Val Thr Met Thr Cys Arg 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 15 Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 1 5 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 16 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg 1 5 10 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 17 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 18 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> antibody fragment <400> 19 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys 1 5 10

Claims (7)

  1. 측정 대상인 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 방법이며, 상기 다공질체의 평균 세공 직경이 10nm 내지 200nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 50nm 내지 500nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 다공질체의 평균 세공 직경보다도 크고, 검출 대상인 펩티드 단편이 상기 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖고,
    상기 모노클로날 항체가 트라스투주맙 또는 트라스투주맙-DM1이며, 검출 대상이 서열 번호 1(IYPTNGYTR), 3(FTISADTSK), 6(GLEWVAR) 및 7(NTAYLQMNSLR) 중 적어도 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고,
    상기 검출 대상이 하기 조건 중 하나를 사용하여 다중 반응 모니터링에 의해 검출하는, 방법.
    Figure 112017094695117-pct00019

    Figure 112017094695117-pct00020

    Figure 112017094695117-pct00021

    Figure 112017094695117-pct00022
  2. 측정 대상인 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 방법이며, 상기 다공질체의 평균 세공 직경이 10nm 내지 200nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 50nm 내지 500nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 다공질체의 평균 세공 직경보다도 크고, 검출 대상인 펩티드 단편이 상기 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖고,
    상기 모노클로날 항체가 베바시주맙이며, 검출 대상이 서열 번호 9(STAYLQMNSLR), 10(FTFSLDTSK) 및 11(VLIYFTSSLHSGVPSR) 중 적어도 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고,
    상기 검출 대상이 하기 조건 중 하나를 사용하여 다중 반응 모니터링에 의해 검출하는, 방법.
    Figure 112017094695117-pct00023

    Figure 112017094695117-pct00024
  3. 측정 대상인 모노클로날 항체를 세공 내에 고정화한 다공질체와, 프로테아제를 고정화한 나노 입자를 액체 중에서 접촉시켜서 모노클로날 항체의 선택적 프로테아제 소화를 행하고, 얻어진 펩티드 단편을 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC-MS)에 의해 검출하는 방법이며, 상기 다공질체의 평균 세공 직경이 10nm 내지 200nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 50nm 내지 500nm의 범위이며, 나노 입자의 평균 입경이 다공질체의 평균 세공 직경보다도 크고, 검출 대상인 펩티드 단편이 상기 모노클로날 항체의 중쇄 또는 경쇄의 CDR2 영역 유래의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 갖고,
    상기 모노클로날 항체가 리툭시맙이며, 검출 대상이 서열 번호 13(ATLTADK), 15(LASGVPVR) 및 16(ATSNLASGVPVR) 중 적어도 하나로 나타내는 아미노산 서열을 갖는 펩티드이고,
    상기 검출 대상이 하기 조건 중 하나를 사용하여 다중 반응 모니터링에 의해 검출하는, 방법.
    Figure 112017094695117-pct00025
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2702183T3 (es) 2013-03-15 2019-02-27 Mayo Found Medical Education & Res Identificación y monitorización de inmunoglobulinas monoclonales por masa molecular
EP3023777B1 (en) * 2013-09-09 2017-11-15 Shimadzu Corporation Method for preparing peptide fragments, kit for preparing peptide fragments to be used therein, and analysis method
WO2015154052A1 (en) 2014-04-04 2015-10-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Isotyping immunoglobulins using accurate molecular mass
CN108026164A (zh) 2015-09-24 2018-05-11 梅约医学教育与研究基金会 通过质谱鉴定免疫球蛋白游离轻链
AU2017325022B2 (en) 2016-09-07 2022-10-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Identification and monitoring of cleaved immunoglobulins by molecular mass
US11619616B2 (en) 2017-06-22 2023-04-04 Shimadzu Corporation Method for quantifying monoclonal antibody having antigen or anti-antibody bonded thereto
EP3681907A4 (en) 2017-09-13 2021-07-07 Mayo Foundation for Medical Education and Research IDENTIFICATION AND MONITORING OF IMMUNOGLOBULIN J-CHAINS
WO2019055634A1 (en) 2017-09-13 2019-03-21 Mayo Foundation For Medical Education And Research IDENTIFICATION AND MONITORING OF A MACROPHAGE APOPTOSIS INHIBITOR
US12188942B2 (en) 2017-12-28 2025-01-07 Shimadzu Corporation Method for improving result monoclonal antibody detection
JP6835260B2 (ja) 2017-12-28 2021-02-24 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の簡素化された定量方法
WO2019140320A1 (en) * 2018-01-12 2019-07-18 Genzyme Corporation Methods for the quantitation of polypeptides
JP7056675B2 (ja) * 2018-02-08 2022-04-19 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の検出結果を向上する方法
JP7165210B2 (ja) 2018-05-24 2022-11-02 シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー タンパク質の定量分析
JP7215467B2 (ja) * 2019-08-19 2023-01-31 株式会社島津製作所 ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料からの抗体の分離、検出及び／又は分析方法
CN110608981A (zh) * 2019-09-09 2019-12-24 中国科学院高能物理研究所 一种测定植物中硫化汞纳米颗粒的方法
CN111024862B (zh) * 2019-12-31 2022-09-13 上海博威生物医药有限公司 一种奥马珠单抗疏水性的检测方法
CN111735869A (zh) * 2020-05-29 2020-10-02 中山大学 一种蛋白质的检测试剂及检测方法
WO2022270126A1 (ja) 2021-06-23 2022-12-29 株式会社島津製作所 抗体を分析する方法
CN113804804A (zh) * 2021-09-08 2021-12-17 杭州佰辰医学检验所有限公司 一种超高效液相色谱串联质谱法快速测定血浆中单克隆抗体药物的监测方法
CN113899894B (zh) * 2021-09-14 2023-11-14 上海中科新生命生物科技有限公司 一种同时检测贝伐珠单抗和曲妥珠单抗药物浓度的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120315645A1 (en) 2011-05-12 2012-12-13 Surinder Kaur Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1495323A2 (en) * 2002-04-05 2005-01-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving and deglycosylating antibodies to promote ligand binding
DE102004021351A1 (de) * 2004-04-23 2005-11-17 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Funktionalisierter poröser Träger für Mikroarrays
WO2006081576A2 (en) * 2005-01-28 2006-08-03 Galenbio, Inc. Immunologically active compositions
JP5307013B2 (ja) * 2006-09-21 2013-10-02 ヴェレニウム コーポレイション フィターゼ、フィターゼをコードする核酸、並びにフィターゼを製造および使用する方法
US20100015652A1 (en) 2006-12-21 2010-01-21 Brian Walter Granda Antibody quantitation
JP2012197258A (ja) 2011-03-23 2012-10-18 Tohoku Univ 個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法
JP6148540B2 (ja) * 2013-06-07 2017-06-14 株式会社島津製作所 質量分析装置を用いたグラニュリンペプチドの定量分析方法、および分析用プログラム
EP3023777B1 (en) 2013-09-09 2017-11-15 Shimadzu Corporation Method for preparing peptide fragments, kit for preparing peptide fragments to be used therein, and analysis method
WO2016143227A1 (ja) * 2015-03-10 2016-09-15 株式会社島津製作所 モノクローナル抗体の検出のためのサンプル調製用キット
ES2815224T3 (es) * 2015-11-06 2021-03-29 Promise Proteomics Un método para cuantificar anticuerpos terapéuticos

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120315645A1 (en) 2011-05-12 2012-12-13 Surinder Kaur Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N Iwamoto, Selective detection of complementarity-determining regions of monoclonal antibody by limiting protease access to the substrate, Royal Society of Chemistry, Vol.139, 576-580.

Also Published As

Publication number Publication date
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