ES2817933T3 - Microorganismo de producción de L-glutamina y procedimiento de producción de L-glutamina utilizando el mismo - Google Patents

Microorganismo de producción de L-glutamina y procedimiento de producción de L-glutamina utilizando el mismo Download PDF

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Abstract

Mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11553P o KCCM11554P que produce L-glutamina y que tiene resistencia a L-glutamina, en el que el mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11553P o KCCM11554P es capaz de sobrevivir en un medio de cultivo que contiene de 15 g/L a 25 g/L de L-glutamina durante 6 días o más.

Description

DESCRIPCIÓN
Microorganismo de producción de L-glutamina y procedimiento de producción de L-glutamina utilizando el mismo
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a un microorganismo que produce L-glutamina, y a un procedimiento de producción de L-glutamina utilizando el microorganismo.
Técnica anterior
La L-glutamina, como un aminoácido ampliamente utilizado en medicinas, cosméticos, y alimentos para la salud, ha sido producida principalmente utilizando microorganismos resistentes o sensibles a compuestos. Por ejemplo, una cepa resistente a la sulfaguanidina (documento JP 1978-017675), un microorganismo resistente a la azaserina (documento JP 1980-148094), un microorganismo sensible a la penicilina (documento JP1992-088994), una cepa resistente a fármacos de sulfamida (documento US 3.886.039) y una cepa resistente a tirosina-ácido glutámico (penicilina JP 1990-186994) han sido utilizados para estos fines.
En esas circunstancias, durante la investigación para el desarrollo de cepas con una mayor productividad de L-glutamina, los inventores de la presente han descubierto mutantes con resistencia a altas concentraciones de L-glutamina y un procedimiento de producción de un alto rendimiento de L-glutamina utilizando los mutantes, completando así la presente divulgación.
Descripción detallada de la invención
Problema técnico
La presente revelación proporciona un mutante de Corynebacterium glutamicum con una mejor productividad de L-glutamina.
La presente divulgación proporciona un procedimiento de producción de L-glutamina utilizando el mutante de Corynebacterium glutamicum.
Solución técnica
De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, es proporcionado un mutante de Corynebacterium glutamicum productor de L-glutamina que es resistente a L-glutamina.
Como se usa en la presente memoria, el término "L-glutamina" se refiere a la monoamida de ácido glutámico, que es un aminoácido que constituye las proteínas y un L-aminoácido que tiene la fórmula de H2NCO-CH2CH2CH(NH2)COOH.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "resistente a L-glutamina" se refiere a un microorganismo que tiene propiedades para poder crecer, o poder mantener o aumentar la actividad para producir L-glutamina, en un entorno con una alta concentración de L-glutamina.
Cuando la L-glutamina es acumulada en las células a una cierta concentración o a una concentración mayor, esto puede inducir una inhibición por regulación de la retroalimentación, conducir a la inhibición o supresión de la actividad de la glutamina sintetasa y, en consecuencia, inhibir la biosíntesis de la L-glutamina. La regulación de la retroalimentación por la L-glutamina es liberada y la inhibición de la síntesis de L-glutamina no funciona en una cepa resistente a la L-glutamina, de modo que la cepa resistente a la L-glutamina puede producir L-glutamina en condiciones de altas concentraciones de L-glutamina.
El mutante puede ser Corynebacterium glutamicum KCCM 11553P o Corynebacterium glutamicum KCCM 11554P.
El mutante puede tener resistencia a altas concentraciones de L-glutamina. Por ejemplo, el mutante puede tener resistencia a aproximadamente 5 g/L a aproximadamente 30 g/L de L-glutamina, y en algunas realizaciones, aproximadamente 15 g/L a aproximadamente 30 g/L de L-glutamina, y en algunas otras realizaciones, aproximadamente 20 g/L a aproximadamente 25 g/L de L-glutamina.
El mutante puede sobrevivir en un medio mínimo que contenga aproximadamente 15 g/L a aproximadamente 25 g/L de L-glutamina durante aproximadamente 6 días o más. Por ejemplo, el mutante puede sobrevivir durante aproximadamente 6 días o más en un medio mínimo (pH 7,0) que contenga de aproximadamente 15 g/L a aproximadamente 25 g/L de L-glutamina, 0,1% de glucosa, 0,04% de sulfato de magnesio (MgSO4'7H2O), 0,1% de dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4), 0,0001% de tiamina-HCl, 200 pg/L de biotina, y agar bajo incubación a aproximadamente 30°C.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "microorganismo productor de L-glutamina" puede referirse a un microorganismo que tiene intrínsecamente la capacidad de producir L-glutamina o a un microorganismo con una productividad de glutamina adquirida a pesar de que su cepa madre carezca de capacidad de producción de L-glutamina.
En algunas realizaciones, el mutante Corynebacterium glutamicum con capacidad mejorada de producción de L-glutamina puede ser un mutante obtenido por la mutación de una cepa madre. La mutación de microorganismos puede ser realizada por cualquiera de los diversos procedimientos ampliamente conocidos en la técnica, por ejemplo, uno de mutagénesis física o química. Por ejemplo, en la presente divulgación, los factores apropiados para inducir una mutación química pueden incluir la N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), el diepoxibutano, el metansulfonato de etilo, los compuestos de mostaza, la hidracina y el nitrito. Sin embargo, las realizaciones no están limitadas a estos. Los ejemplos no limitantes de factores que inducen mutaciones físicas pueden incluir rayos ultravioleta y rayos gamma radiactivos.
En algunas realizaciones, para construir un mutante con una capacidad mejorada de producción de L-glutamina, puede ser utilizada como cepa madre una cepa convencional productora de glutamina, KFCC 10680 de Corynebacterium glutamicum (desvelada en el documento KR 10-0048440). Tras inducir una mutación aleatoria en la cepa madre KFCC 10680 de Corynebacterium glutamicum con NTG, la cepa resultante fue cultivada en un medio que contenía L-glutamina, y fueron comparadas las capacidades productoras de L-glutamina de las diferentes cepas entre sí para examinar dos mutantes que tuvieran resistencia a L-glutamina. Estos dos mutantes fueron denominados Gln096 (KCCM 11553P) y Gln265 (KCCM 11554P), respectivamente. Fue descubierto que estos mutantes Gln096 y Gln265 de Corynebacterium glutamicum tenían una capacidad mejorada de producción de L-glutamina con un rendimiento superior de aproximadamente 10% o más que el de la cepa madre.
De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, es proporcionado un procedimiento de producción de L-glutamina, que incluye cultivar un mutante de Corynebacterium glutamicum de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones descritas con anterioridad en un medio.
El mutante de Corynebacterium glutamicum puede ser igual al descrito con anterioridad, y será descrito en la presente memoria.
El cultivo puede ser realizado con un medio de cultivo adecuado en condiciones de cultivo adecuadas que son bien conocidas en la técnica. El medio de cultivo y las condiciones de cultivo pueden ser variados por un experto en la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo puede ser un medio líquido. Sin embargo, las realizaciones no están limitadas a estos. Los procedimientos de cultivo de ejemplo pueden incluir el cultivo por lotes, el cultivo continuo, el cultivo por alimentación de lotes, o una combinación de los mismos. Sin embargo, las realizaciones no están limitadas a estos.
Se requiere que el medio de cultivo tenga las condiciones apropiadas para una cepa específica y seleccionada, y también puede ser variado apropiadamente por un experto en la técnica. Por ejemplo, el medio de cultivo puede ser seleccionado entre varios medios de cultivo para las cepas de Corynebacterium divulgadas, por ejemplo, en el "Manual of Methods for General Bacteriology" (American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Sin embargo, las realizaciones no están limitadas a esto. El medio de cultivo puede incluir diversas fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. Los ejemplos no limitantes de fuentes de carbono disponibles para el medio de cultivo pueden incluir azúcares y carbohidratos, tal como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; aceites y grasas, tal como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos, tal como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes, tal como glicol y etanol; y ácidos orgánicos, tal como ácido acético, en los que estas fuentes de carbono pueden ser utilizadas individualmente o en combinación. Los ejemplos no limitantes de fuentes de nitrógeno disponibles para el medio de cultivo son compuestos orgánicos, tal como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de remojo de maíz (CSL), harina de soja y urea; y compuestos inorgánicos, tal como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio, en los que estas fuentes de nitrógeno pueden ser utilizadas individualmente o en combinación. Los ejemplos no limitantes de fuentes de fósforo disponibles para los medios de cultivo pueden incluir dihidrogenofosfato potásico, hidrogenofosfato dipotásico y las sales que contienen sodio correspondientes. En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede incluir sales metálicas esenciales para el crecimiento, tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Sin embargo, las realizaciones no están limitan a estas. En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede incluir además aminoácidos y vitaminas, que son esenciales para el crecimiento, además de los ingredientes mencionados anteriormente. En algunas realizaciones, el medio de cultivo puede incluir también los precursores apropiados. El medio de cultivo o los ingredientes individuales pueden ser añadidos a una solución de cultivo de manera apropiada, por ejemplo, en forma discontinua o continua. Sin embargo, las realizaciones no están limitadas a esto.
En algunas realizaciones, durante el cultivo, el pH de la solución de cultivo puede ser ajustado añadiendo un compuesto, por ejemplo, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico o ácido sulfúrico, a la solución de cultivo para el microorganismo seleccionado de manera apropiada. En algunas realizaciones, durante el cultivo, la espuma en la solución de cultivo puede ser suprimida utilizando un agente antiespumante, tal como un éster de poliglicol de ácidos grasos. Para mantener la solución de cultivo en condiciones aeróbicas, puede ser suministrado oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) a la solución de cultivo. Por ejemplo, la temperatura de la solución de cultivo puede ser mantenida en un intervalo de temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 45°C, y en algunas realizaciones, a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C. Por ejemplo, el cultivo puede ser realizado hasta obtener una cantidad objetivo de L-glutamina, por ejemplo, para una duración de cultivo de aproximadamente 10 a 160 horas.
El cultivo puede ser realizado en un medio de cultivo que contenga una alta concentración de L-glutamina, por ejemplo, de aproximadamente 15 g/L a aproximadamente 25 g/L de L-glutamina, y en algunas realizaciones, de aproximadamente 20 g/L a aproximadamente 25 g/L de L-glutamina.
El procedimiento de producción de L-glutamina puede incluir recuperar L-glutamina del microorganismo cultivado o del medio de cultivo. La recuperación de L-glutamina del microorganismo o del medio de cultivo puede ser realizada utilizando un procedimiento apropiado conocido en la técnica de acuerdo con el procedimiento de cultivo utilizado, para así recoger o recuperar la L-glutamina producida del medio. Los ejemplos no limitantes del procedimiento de recuperación de la L-glutamina producida pueden incluir centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio de aniones, cristalización y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC).
Efectos ventajosos de la invención
Como ha sido descrito anteriormente, de acuerdo con una o más realizaciones, la L-glutamina puede ser producida por un mutante de Corynebacterium glutamicum incluso en un medio que contenga una alta concentración de L-glutamina. Por lo tanto, puede ser producido un alto rendimiento de L-glutamina con gran eficacia a escala de producción industrial.
Modo de la invención
A continuación serán descritas en detalle una o más realizaciones de la presente divulgación con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos sólo tienen fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de las una o más realizaciones de la presente divulgación.
Ejemplo 1: Cribado de mutantes productores de L-glutamina
Para obtener microorganismos mutantes con una mayor capacidad de producción de glutamina, fue inducida la mutación en un microorganismo de la siguiente manera.
En particular, KFCC 10680 de Corynebacterium glutamicum (KFCC 10680 de Corynebacterium glutamicum, véase el documento KR10-0048440) como cepa madre fue cultivada en un medio de activación durante aproximadamente 16 horas (el medio de activación contenía 1% de extracto de carne de vacuno, 1% de polipropileno, 0,5% de cloruro de sodio (NaCI), 0,5% de extracto de levadura y 2% de agar y con un pH de 7,2, en el que cada medio de activación utilizado en los ejemplos tenía la misma composición que el utilizado en este ejemplo, y la unidad porcentual (%) representa % p/v, que aplica a todos los ejemplos). La cepa activada resultante fue cultivada durante aproximadamente 14 horas en un cultivo de semillas previamente esterilizado a aproximadamente 121°C durante 15 minutos, el cultivo de semillas (pH 7,0) contenía 5,0% de glucosa, 1% de bactopeptona, 0,25% de cloruro de sodio (NaCI), 1% de extracto de levadura, 3 pg/L de biotina y 0,4% de urea, en el que cada "cultivo de semillas" utilizado en los ejemplos tenía la misma composición que el utilizado en este ejemplo. Fueron añadidos 5 ml de la solución de cultivo en un tubo de ensayo y centrifugados a aproximadamente 8.000 rpm durante aproximadamente 5 minutos, y fue eliminado el sobrenadante. Luego fue añadido un tampón de citrato de 100 mM en el tubo de ensayo para volver a suspender el sedimento celular, y el tubo de ensayo fue centrifugado en las mismas condiciones que en el ejemplo anterior y fue retirado el sobrenadante para de ese modo lavar las células. Fueron añadidos 5 ml de la solución reguladora de citrato de 100 mM en el tubo de ensayo para volver a suspender el sedimento celular, y luego fue añadida N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) a una concentración final de aproximadamente 200 mg/L y se dejó a temperatura ambiente durante aproximadamente 20 minutos. Después, las células tratadas con NTG fueron centrifugadas a aproximadamente 8.000 rpm durante aproximadamente 5 minutos, fue retirado el sobrenadante, fue añadida una solución tampón de fosfato de 100 mM para volver a suspender el sedimento celular, fue realizada la centrifugación en las mismas condiciones anteriores y fue retirado el sobrenadante para lavar las células. Después, fueron añadidos 5 ml de un cultivo de semillas al sedimento celular resultante tratado con NTG para volver a suspenderlo. Esta suspensión fue untada en una placa que contenía un medio mínimo, conteniendo el medio mínimo (pH 7,0) 0,1% de glucosa, 0,04% de sulfato de magnesio (MgSO4-7H2O), 0,1% de dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4), 0,0001% de tiamina-HCl, 200 pg/L de biotina y 1,5% de agar, en el que cada "medio mínimo" utilizado en los ejemplos tenía la misma composición que el utilizado en este ejemplo, y fue cultivada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 6 días. A continuación se midió un valor de OD600 de las células viables. Como resultado del recuento del número de células, fue descubierto que la tasa de muerte celular era de aproximadamente 85%.
La cepa tratada con NTG lavada fue untada en una placa que contenía un medio mínimo, conteniendo el medio mínimo L-glutamina (concentración final: 15 g/L), y cultivada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 6 días. Las colonias de células viables fueron seleccionadas para cribar los mutantes resistentes a la L-glutamina. Los mutantes seleccionados resistentes a la L-glutamina fueron inoculados con un lazo de inoculación en 25 ml de un medio de producción de glutamina (pH 6,8) (que contiene 4,0% de glucosa, 3,0% de cloruro de amonio (NH4Cl), 0,3% de hidrolizado ácido de proteína de soja, 5% de carbonato de calcio (CaCO3), 0,1% de cloruro de calcio (CaCh), 0,05% de sulfato de magnesio (MgSO4-7H2O), 0,15% de dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4), 0,3% de urea, 2 mg/L de tiamina (Tiamina-HCl), 5 pg/L de biotina, 20 mg/L de sulfato ferroso (FeSO4'7H2O), 20 mg/L de sulfato de manganeso (MnSO4 'H2O), y 12 mg/L de sulfato de cinc (ZnSO4'7H2O), en los que cada "medio de producción de glutamina" utilizado en los ejemplos tenía esta misma composición) en un matraz Erlenmeyer para agitación, y después fueron cultivados a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 48 horas con agitación a aproximadamente 200 rpm. Como un grupo de control, la cepa madre fue cultivó bajo las mismas condiciones. Dos tipos de mutantes resistentes a la L-glutamina que producían 10% o más de glutamina que la cepa madre KFCC-10680 de Corynebacterium glutamicum fueron seleccionadas del producto cultivado.
Los mutantes seleccionados fueron denominados Gln096 de Corynebacterium glutamicum y Gln265 de Corynebacterium glutamicum, respectivamente, y fueron depositados en el Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) el 3 de julio de 2014 con los números de acceso KCCM11553P y KCCM 11554P.
Ejemplo 2: Comparación de la resistencia a L-glutamina entre los mutantes productores de L-glutamina
Para comparar la resistencia a L-glutamina entre los mutantes seleccionados en el Ejemplo 1, cada una de las cepas madre (KFCC 10680), Gln096 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11553P) y Gln265 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11554P) fue untada en placas que contenían un medio mínimo que contenía respectivamente 2,5 g/L, 10 g/L, 15 g/L, 20 g/L y 25 g/L de L-glutamina (en base a la concentración final) e incubada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 6 días.
Como resultado, como se muestra en la Tabla 1, la cepa madre mostró un crecimiento deficiente a una concentración de L-glutamina de 15 g/L y no creció a una concentración de L-glutamina de 20 g/L o mayor, mientras que los mutantes Gln096 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11553P) y Gln265 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11554P) seguían exhibiendo un alto crecimiento a una concentración de L-glutamina de 15 g/L y crecían incluso a una concentración de L-glutamina de 20 g/L o mayor, lo que indica la resistencia de los mutantes a las altas concentraciones de L-glutamina.
[Tabla 1] Comparación de la resistencia a L-glutamina
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Ejemplo 3: Evaluación de la productividad de los mutantes productores de L-glutamina
Para evaluar las productividades de L-glutamina de los mutantes Gln265 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11554P) y Gln096 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11553P) obtenidos en el Ejemplo 1, estos mutantes fueron cultivados de la siguiente manera para producir L-glutamina.
20 ml de un medio de fermentación (pH 6,8) (que contenía 10% de glucosa, 4,5% de cloruro de amonio (NH4Cl), 0,5% de hidrolizado ácido de proteína de soja, 5% de carbonato de calcio (CaCO3), 0,1% de cloruro de calcio (CaCh), 0,05% de sulfato de magnesio (MgSO4'7H2O), 0,15% de dihidrogenofosfato de potasio (K2HPO4), 0,3% de urea, 2 mg/L de tiamina (tiamina-HCl), 5 pg/L de biotina, 20 mg/L de sulfato ferroso (FeSO4'7H2O), 20 mg/L de sulfato de manganeso (MnSO4 'H2O), y 12 mg/L de sulfato de cinc (ZnSO4'7H2O), en los que cada "medio de fermentación" utilizado en los ejemplos tenía la misma composición) fueron añadidos a un matraz Erlenmeyer de 250 ml para su agitación, y fueron esterilizados a aproximadamente 121°C durante aproximadamente 15 minutos. La cepa madre KFCC10680 de Corynebacterium glutamicum, y los mutantes Gln265 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11554P) y Gln096 de Corynebacterium glutamicum (KCCM11553P) fueron cultivados en un medio de activación a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 16 horas, respectivamente. Cada una de las cepas activadas resultantes (KFCC10680, Gln096 y Gln265) fue inoculada en el medio de fermentación con un lazo de inoculación y cultivada a aproximadamente 30°C durante aproximadamente 48 horas con agitación a aproximadamente 200 rpm. Una vez finalizado el cultivo, fue medida la concentración de L-glutamina presente en el sobrenadante de cada uno de los medios de los que habían sido extraídas las células, utilizando un Sistema Bioanalítico Multiparámetro YSI 7100 (disponible en YSI Inc.). Los resultados son mostrados en la Tabla 2.
[Tabla 2]
Figure imgf000006_0001
Con referencia a la Tabla 2, la cepa madre KFCC10680 de Corynebacterium glutamicum produjo aproximadamente 12,6 g/L de L-glutamina, mientras que el mutante Gln096 de Corynebacterium glutamicum produjo aproximadamente 13,8 g/L de L-glutamina, de acuerdo con una realización, con una mayor productividad de L-glutamina de aproximadamente de 9,5% o más, en comparación con la de la cepa madre. El mutante Gln265 de Corynebacterium glutamicum produjo aproximadamente 14,1 g/l de L-glutamina, de acuerdo con una realización, con una mayor productividad de L-glutamina de aproximadamente 11% o más, en comparación con la de la cepa madre.
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Debe entenderse que las realizaciones descritas en la presente memoria deben ser consideradas sólo en sentido descriptivo y no con fines de limitación. Las descripciones de las características o aspectos de cada realización deben ser consideradas típicamente disponibles para otras características o aspectos similares en otras realizaciones.

Claims (2)

REIVINDICACIONES
1. Mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11553P o KCCM11554P que produce L-glutamina y que tiene resistencia a L-glutamina, en el que el mutante de Corynebacterium glutamicum KCCM11553P o KCCM11554P es capaz de sobrevivir en un medio de cultivo que contiene de 15 g/L a 25 g/L de L-glutamina durante 6 días o más.
2. Un procedimiento de producción de L-glutamina, comprendiendo el método: cultivar el mutante de Corynebacterium glutamicum de la reivindicación 1 en un medio, y recuperar L-glutamina del mutante o del medio.
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