KR20200077343A

KR20200077343A - L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 l-트립토판의 생산 방법

Info

Publication number: KR20200077343A
Application number: KR1020180166755A
Authority: KR
Inventors: 김현호; 이선희; 김용수; 양철민; 조영일
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2018-12-20
Filing date: 2018-12-20
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2038-12-20
Also published as: KR102141210B1

Abstract

본 발명은 L-트립토판 생산능이 우수한 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-트립토판의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 기존 모균주에 비해 향상된 L-트립토판 생산능을 발휘할 수 있으며, 당원으로 포도당, 당밀을 사용하여, 당원 이용성이 개선되고 당소모 속도 또한 향상될 수 있어 고농도의 L-트립토판을 높은 수율로 생산할 수 있다.

Description

L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-트립토판의 생산 방법{Mutant of Corynebacterium glutamicum for Producing L-tryptophan and Method for Producing L-tryptophan Using the Same}

본 발명은 L-트립토판 생산능이 우수한 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-트립토판의 생산 방법에 관한 것이다.

L-트립토판(L-tryptophan)은 필수아미노산 중 하나로서 생체 내에서 단백질을 중합하거나 니코틴산아마이드 등의 비타민을 합성하는데 요구되며, 아미노산류 강화제, 사료첨가제, 수액제 등의 의약 원료 및 건강식품소재 등으로 널리 사용되고 있다. 이러한 L-트립토판은 화학합성법, 효소반응법, 미생물을 이용한 발효법 등을 통해 생산되어 왔다.

화학합성법은 고온, 고압의 조건이 필요하며, 그 산물에 D형과 L형이 혼재하기 때문에 L형만을 분리하는 정제과정이 쉽지 않다. 또한, 효소반응법은 효소의 반응을 유지하는데 조건을 맞추기가 까다롭다. 이러한 문제들로 인해, 현재는 주로 미생물을 이용한 발효법을 이용하고 있다.

발효법에서는 대장균, 코리네박테리움속 등 여러 미생물에 대한 영양 요구주(auxotroph)나 조절부위 변이주와 같은 변이주를 이용한다. 일반적으로 L-트립토판 생산은 대장균의 발효를 통해 이루어지는데, 대장균에 의한 L-트립토판 생산성이 높은 반면 아세트산 등의 부산물도 함께 생산되고 대장균이 발효 환경에 민감하여 안정적인 발효가 보장되지 않는다는 문제가 있다. 한편, 코리네박테리움속 미생물은 글루탐산, 라이신 등의 아미노산 생산성이 높고, GRAS(generally recognized as safe) 미생물로서 대장균에 비해 독성 및 부산물 생성이 적다는 면에서 보다 안전한 것으로 알려져 있다. 또한, 산소 부족이나 당 고갈과 같은 문제에서도 코리네박테리움속 미생물이 더 안정적인 편이다.

따라서, 본 발명자들은 코리네박테리움속 미생물을 이용하여 우수한 L-트립토판 생산능을 발휘하는 신규 L-트립토판 생산 균주를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-1830001호 대한민국 등록특허공보 제10-1830002호

상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 안트라닐산에 대한 내성을 가지며, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주를 L-트립토판 생산 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 변이주 또는 배양액으로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 안트라닐산(anthranilate)에 대한 내성을 획득한 균주(수탁번호 KCTC13769BP)일 수 있다.

L-트립토판은 방향족 아미노산의 공통 중간물질인 코리스믹산(chorismic acid)으로부터 생합성 된다. 포스포에놀피루브산(phosphoenolpyruvate)과 D-에리트리오스-4-인산(D-erythrose-4-phosphate)으로부터 시작되는 공동의 시킴산 (shikimic acid) 경로를 거쳐 생성된 코리스믹산(chorismic acid)에 트립토판 오페론인 trpEDCBA가 합성하는 5가지의 효소들이 작용하여 L-트립토판이 생합성 된다. 먼저 안트라닐산 합성효소(anthranilate synthase)가 코리스믹산에 작용하여 안트라닐산을 합성하고, 이어서 안트라닐산 포스포리보실 전이효소(anthranilate phosphoribosyltransferase)가 작용하여 포스포리보실 안트라닐산을 합성한다. 이어서 포스포리보실 안트라닐산 이성화효소(phosphoribosylanthranilate isomerase)와 인돌-3-글리세롤 인산합성 효소(indole-3-glycerol phosphate synthase)가 작용하여 인돌-3-글리세롤 인산(indole-3-glycerol-phosphate)을 합성하고, 여기에 트립토판 합성효소(tryptophan synthase)가 작용하여 L-트립토판을 합성하게 된다. 본 발명에서는 L-트립토판의 생산을 증가시키기 위하여 전구체로서 안트라닐산을 사용하였으며, 이에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미컴 균주를 선별하였다.

코리네박테리움속 균주(Corynebacterium sp.)는 글루탐산, 라이신 등의 아미노산 생산성이 높은 반면 부산물의 생성이 적다는 장점이 있으며, 산소 부족이나 당 고갈과 같은 제한된 환경에서도 안정적으로 아미노산의 생산이 가능하다. 따라서, 본 발명에서는 코리네박테리움속 균주를 모균주(parent strain)로 선택하였다. 상기 모균주는 코리네박테리움속 균주일 수 있으며, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032인 것이 바람직하다.

본 명세서에서, "L-트립토판을 생산하는 변이주"는 모균주에 비하여 L-트립토판을 고농도로 생산할 수 있도록 돌연변이 시킨 미생물을 의미한다. 이때, 미생물의 돌연변이 유발은 해당 분야에서 널리 알려진 다양한 수단에 의해 수행될 수 있으며, 물리적 혹은 화학적 돌연변이 유발 방법 중 하나의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 화학적 돌연변이 유발 요인으로 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,NTG), 디에폭시부탄(diepoxybutane), 에틸메탄 설폰에이트(ethylmethane sulfonate), 머스타드(mustard) 화합물, 히드라진(hydrazine) 및 아질산(nitrous acid)을 사용할 수 있으나, 이러한 화합물들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 물리적 돌연변이 유발 요인은 자외선 및 감마 방사선을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 돌연변이 유발 시에 모균주는 특정 크기의 생존 개체군을 남겨둘 정도의 농도에서 돌연변이 유발 인자에 의해 영향을 받는다. 상기 크기는 돌연변이 유발 인자들 종류에 따라 다를 수 있으며, 돌연변이 인자가 일정한 살생율로 생존 개체군내에 유발하는 돌연변이의 양에 의존한다. 예를 들어, NTG의 경우 살생율은 출발 개체군의 10% 내지 50%이고, 아질산에 의한 돌연변이 발생은 출발 개체군의 0.01% 내지 0.1%일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 모균주에 NTG를 처리하고 안트라닐산 함유 배지에서 성장시켜 변이주를 분리하고, 균주 간의 L-트립토판 생산능력을 비교 선별함으로써 안트라닐산에 대한 내성을 가지며 모균주에 비해 L-트립토판 생산능이 향상된 변이주를 얻었다.

이러한 변이주를 이용하여 고농도의 L-트립토판을 높은 수율로 생산할 수 있다. 구체적으로, L-트립토판의 생산 방법은 상기 변이주를 L-트립토판 생산 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 변이주 또는 배양액으로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명의 미생물을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batchculture)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "L-트립토판 생산 배지"는 본 발명의 코리네박테리움 글루타미컴 변이주의 배양에 사용되는 것으로서, 상기 균주가 높은 수율의 L-트립토판을 생산할 수 있도록 탄소원, 질소원 및 무기염류를 포함하는 배지를 의미한다.

상기 배지에서 탄소원은 예를 들어, 포도당, 설탕, 구연산염, 과당, 젖당, 엿당 또는 당밀과 같은 당 및 탄수화물; 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방; 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산; 글리세롤; 에탄올과 같은 알코올; 아세트산과 같은 유기산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 L-트립토판 생산 배지는 포도당, 당밀 또는 포도당 및 당밀을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 배지는 탄소원으로 포도당 100 중량부에 대하여, 15 내지 60 중량부의 당밀을 포함할 수 있다.

상기 배지에서 질소원은 예를 들어, 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 옥수수 침지액, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 질산염 및 기타 유기 또는 무기 질소를 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 배지에 포함되는 무기염류는 마그네슘, 망간, 칼륨, 칼슘, 철, 아연, 코발트 등을 포함하는 화합물이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

한편, 상기 배지에 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 상기 화합물들은 개별적으로 또는 혼합물로써 사용될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 탄소원, 질소원 및 무기염류의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 본 발명의 배지에 추가적으로 첨가될 수 있다. 상기 원료들은 배양과정에서 배지에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

한편, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배지의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배지 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 배양은 원하는 L-트립토판의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 생성된 L-트립토판은 배양 배지 중으로 배출되거나, 상기 변이주 내에 포함되어 있을 수 있다.

상기 변이주를 배양한 배지(배양액) 또는 변이주로부터 L-트립토판을 회수하는 단계는 당업계에 널리 알려진 다양한 방법, 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주는 기존 모균주에 비해 향상된 L-트립토판 생산능을 발휘할 수 있으며, 당원으로 포도당, 당밀을 사용하여, 당원 이용성이 개선되고 당소모 속도 또한 향상될 수 있어 고농도의 L-트립토판을 높은 수율로 생산할 수 있다.

이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명에 따른 L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴 변이주 및 이를 이용한 L-트립토판의 생산 방법을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 안트라닐산에 대한 내성을 가지는 코리네박테리움속 변이주의 제조

안트라닐산에 대한 내성을 가지는 변이주를 제조하기 위해, 모균주로 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032를 선택하였다.

먼저, 모균주를 하기 표 1과 같은 조성의 종배양 배지 50 ㎖가 담긴 플라스크에 접종하고 돌연변이 유발물질인 N-메틸-N`-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N`-nitro-N-nitrosoguanidine)을 최종농도 300 ㎍/㎖로 첨가한 후 30℃에서 200 rpm으로 20시간 동안 진탕 배양하였다. 배양을 종료한 후 배양액을 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 식염수(saline)로 1회 세척하고 인산 완충액(phosphate buffer)으로 3회 더 세척하였다. 이를 인산 완충액 5 ㎖에 현탁한 후 안트라닐산(anthranilate) 2 g/ℓ를 함유하는 종배양 고체배지(한천 15 g/ℓ가 더 첨가된 하기 표 1의 조성을 갖는 배지)에 도말하고 30℃에서 30시간 동안 배양하였다. 그 결과, 안트라닐산에 대한 내성을 가지는 콜로니(colony) 110개를 분리하였다.

조성	농도 (g/ℓ)
폴리펩톤(polypeptone)	10
효모추출물(yeast extract)	10
sodium chloride (NaCl)	5
pH 7.0

실시예 2. L-트립토판 생산능력이 향상된 변이주의 선별

실시예 1에서 분리된 콜로니 110개를 하기 표 2와 같은 조성의 생산 배지 10 ㎖가 담긴 플라스크에 각각 5%씩 접종하고 30℃에서 200 rpm으로 30시간 동안 진탕 배양하였다. 각 배양액을 OD_610nm에서 흡광도를 측정하고 L-트립토판 생산량을 비교하여 하기 표 3과 같이 트립토판을 0.1 g/ℓ 이상 생산하는 콜로니 20개를 1차 선별하였다.

조성	농도
포도당	2%
효모엑기스	0.1%
황산암모늄	0.1%
일인산칼륨	0.05%
이인산칼륨	0.05%
L-티로신	150ppm
L- 페닐알라닌	150ppm
요소	0.2%
염화칼륨	0.04%
비오틴	0.75ppm
비타민 B1	2.5ppm
PABA	1ppm
칼슘판토테네이트	1ppm
FeSo₄	5ppm
MnSo₄	5ppm
CaCO₃	0.5%
pH	7.0

균주	OD _610nm (x100)	트립토판 (g/ℓ)
C. glutamicum ATCC 13032 (대조군)	22.4	0.002
DW6	26.0	0.105
DW15	25.5	0.170
DW24	20.8	0.110
DW28	26.3	0.607
DW39	22.1	0.324
DW40	22.4	0.118
DW48	21.4	0.129
DW49	22.8	0.173
DW57	25.0	0.208
DW60	20.1	0.107
DW64	23.4	0.218
DW68	21.6	0.134
DW75	27.2	0.214
DW76	23.6	0.352
DW82	22.6	0.140
DW83	21.8	0.177
DW89	26.7	0.447
DW94	27.6	0.105
DW98	26.1	0.225
DW106	25.9	0.140

상기 표 3과 같이, 안트라닐산 2 g/ℓ가 함유된 고체배지에서 24시간내 콜로니를 형성하며 L-트립토판 생산성이 높은 변이주 20주 중에서 트립토판 생산성이 가장 높은 변이주 DW28를 최종 선별하였다.

실시예 3. 변이주의 안트라닐산 내성 확인

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032 대신 실시예 2에서 선별된 변이주 DW28를 사용한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 변이주를 제조하였다. 여기서 안트라닐산 4 g/ℓ에 대해 콜로니 생성 속도가 빠른 콜로니 40개를 분리하였다.

콜로니 40개를 실시예 2 (포도당 농도가 40 g/ℓ로 제조된 상기 표 2의 조성을 갖는 배지)와 동일한 방법으로 배양하였다. 이후 각 배양액을 OD_610nm에서 흡광도를 측정하고 L-트립토판 생산량을 비교하여 L-트립토판을 0.2 g/ℓ 이상 생산하는 콜로니 14개를 선별하였고, 그 결과는 하기 표 4와 같다.

균주	OD _610nm (x100)	트립토판 (g/ℓ)	안트라닐산 (4 g/ℓ)
C. glutamicum ATCC 13032 (대조군)	23.2	<0.001	-
DW28	24.8	2.640	+++
DW89	27.0	1.573	++
DW28-03	21.9	0.606	+
DW28-05	25.9	0.643	+
DW28-09	26.4	0.852	+
DW28-16	25.1	1.121	++
DW28-20	24.8	0.739	+
DW28-21	26.3	0.428	-
DW28-26	21.9	0.676	+
DW28-29	25.7	0.913	+
DW28-33	24.1	1.635	++
DW28-35	23.8	0.618	+
DW28-37	28.9	0.924	++
DW28-40	22.5	0.423	+
DW28-45	24.6	0.592	+
DW28-49	22.1	0.241	-

상기 표 4와 같이, 안트라닐산에 대한 내성을 가지는 변이주 14주는 모두 L-트립토판을 생산하는 반면, 변이주 DW28에 비해 L-트립토판 생산성이 향상된 새로운 균주가 없는 것으로 확인되었다.

실험예 1. 변이주의 L-트립토판 생산성 비교

실시예 2 및 3에서 제조된 변이주 중 L-트립토판 생산성이 높은 균주 6개에 대해, 고농도 포도당 조건에서의 트립토판 생산성을 비교하였다.

균주 6개를 생산 배지(포도당 농도가 80 g/ℓ로 제조된 상기 표 2의 조성을 갖는 배지) 10 ㎖가 담긴 플라스크에 각각 10%씩 접종하여 30℃에서 200 rpm으로 36시간 동안 진탕 배양하였다. 각 배양액을 OD_610nm에서 흡광도를 측정하고 L-트립토판 생산량을 비교하였고, 그 결과는 하기 표 5와 같다.

균주	OD _610nm (x100)	트립토판 (g/ℓ)
DW28	21.6	10.27
DW89	25.4	7.43
DW28-26	22.1	8.30
DW28-33	23.7	9.51
DW28-35	23.6	9.16
DW28-37	23.8	7.50

상기 표 5와 같이, 안트라닐산에 대한 내성을 가지는 변이주 DW28는 트립토판 생산성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

실험예 2. 당원 조성에 따른 변이주의 L-트립토판 생산성 비교

안트라닐산에 대한 내성을 가지는 변이주 DW28에 대해, 당원의 조성 비율에 따른 트립토판 생산성을 비교하였다.

균주 DW28를 생산 배지(옥수수 침지액 1 g/ℓ이 더 첨가되고, 포도당 농도가 80 g/ℓ로 제조된 상기 표 2의 조성을 갖는 배지) 10 ㎖가 담긴 플라스크에 각각 10%씩 접종하여 31℃에서 200 rpm으로 36시간 동안 진탕 배양하였다. 이때, 배지 내 포도당과 당밀의 비율은 하기 표 6과 같다. 각 배양액을 OD_610nm에서 흡광도를 측정하고 L-트립토판 생산량을 비교하였고, 그 결과는 하기 표 6과 같다.

당밀 비율 (당밀/포도당)	OD _610nm (x100)	트립토판 (g/ℓ)
0%	22.0	9.69
15%	23.5	10.39
30%	24.9	12.65
45%	26.6	14.63
60%	27.8	13.42
75%	27.4	8.82

상기 표 6과 같이, 안트라닐산에 대한 내성을 가지는 변이주 DW28는 포도당과 당밀의 비율에 따라 트립토판 생산량이 다르며, 특히 당밀이 포도당 대비 45%인 경우가 트립토판 생산성이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

안트라닐산에 대한 내성을 가지며, L-트립토판을 생산하는 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 변이주(수탁번호 KCTC13769BP).
제1항의 변이주를 L-트립토판 생산 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 변이주 또는 배양액으로부터 L-트립토판을 회수하는 단계를 포함하는 L-트립토판의 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 L-트립토판 생산 배지는 포도당, 당밀 또는 포도당 및 당밀을 포함하는 것인 L-트립토판의 생산 방법.
제2항에 있어서,
상기 L-트립토판 생산 배지는 포도당 100 중량부에 대하여, 15 내지 60 중량부의 당밀을 포함하는 것인 L-트립토판의 생산 방법.