ES2818097T3 - Bebidas energéticas y otras ayudas nutricionales derivadas de licores a base de agave - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende compuestos inhibidores de monoamino oxidasa (MAO), cuya composición se prepara mediante la eliminación de etanol de una bebida alcohólica destilada derivada del agave, dicha eliminación de etanol se produce mediante un proceso que retiene compuestos volátiles distintos del etanol, cuyo proceso es por ósmosis inversa o por columnas de cono giratorio.
Description
DESCRIPCIÓN
Bebidas energéticas y otras ayudas nutricionales derivadas de licores a base de agave
Campo técnico
La invención se refiere a versiones no alcohólicas de licores a base de agave destilado, en particular diversos tequilas, que son útiles para tratar una variedad de condiciones en virtud de los inhibidores de la monoamino oxidasa (MAO) contenida en ellos.
Antecedentes de la Técnica
Existe una extensa literatura relacionada con la preparación de licores destilados a partir de agave. Por ejemplo, se proporciona una descripción detallada de la preparación de tequila a partir de cactus de agave en Tequila Processing and Flavor, Pedro A. Vazquez-Landaverde y Miriam G. Rodriguez-Olvera, Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada del Instituto Politécnico Nacional Unidad. Querretaro, Cerro Blanco 141 Colinas del Cimatario, Querretaro, Qro., México 76090; 2012 Sociedad Química Estadounidense; en la World Wide Web en //pubs.acs.org, Fecha de publicación (Web): 16 de julio de 2012 I doi: 10.1021/bk-2012-1104.ch015 Flavor Chemistry of Wine and Other Alcoholic Beverages; Qian, M., et al.; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC, 2012, que incluye una descripción del tratamiento de los materiales de partida del agave, fermentación, destilación y añejamiento. En resumen, los tallos del cactus de agave se calientan para hidrolizar los azúcares complejos y se pican y se trituran para liberar un jarabe. Luego, el jarabe se diluye con agua para proporcionar una dilución adecuada para la inoculación con levadura. Después de fermentar, el cultivo de fermentación se destila para obtener un destilado. El destilado se vende como diversas marcas de tequila de las cuales hay muchas. Sin embargo, el destilado puede añejarse antes de envasarse y venderse.
La descripción específica establecida en la fuente mencionada anteriormente es como sigue:
El agave maduro despojado de hojas (denominado como la "pifia") se corta en mitades, cuartos o más, para que sea más fácil de hornear (48 h) o autoclave (12 h) a 106-116°C. Este tratamiento térmico tiene como objetivo hidrolizar azúcares complejos como la inulina y el almidón, para obtener glucosa y fructosa para una fermentación más fácil. Los azúcares dan como resultado principalmente la formación de etanol, muchos otros compuestos surgen de la fermentación de este sustrato. Como resultado del tratamiento térmico de las pifias, se forman compuestos, principalmente relacionados con Maillard, tales como furanos, piranos, aldehídos, compuestos nitrogenados y azufrados. Los compuestos de Maillard más abundantes son metil-2-furoato, 2,3-dihidroxi-3,5-dihidro-6-metil-4(H)-piran-4-ona y 5-hidroximetilfurfural. Las pirazinas también son un grupo importante de compuestos químicos derivados de las reacciones de Maillard. Las pirazinas más abundantes que se encuentran son 2,5-dimetilpirazina y trimetilpirazina.
Otros productos de degradación relacionados térmicamente surgen durante la etapa de horneado. Se han encontrado ácidos grasos libres de cadena de carbono larga y corta en pifias horneadas, probablemente debido a la hidrólisis de acilgliceroles; El p-ciclocitral y el p-damascenona son probablemente productos de degradación de los carotenoides, mientras que el 4-metil-5- (2-hidroxietil)-tiazol es un producto de degradación del aminoácido, tiamina. Los fenoles como el p-cresol y el 4-etilfenol son un producto de degradación de los ácidos fenólicos.
Una vez horneadas las pifias, se llevan a un molino picador y a una trituradora donde sueltan todo el jarabe que contiene alta concentración de azúcares y la mayoría de los compuestos. La pulpa de agave resultante a menudo se lava para mejorar la extracción de azúcar.
No hay duda de que la fermentación es la etapa más importante y complicada del procesamiento del agave. Los jarabes 100% de agave o mixtos se diluyen con agua hasta alcanzar 12-14°BRIX (80-100 g/L de azúcar). La fermentación se realiza en tanques termostatizados a 30°C, aunque algunos procesos se llevan a cabo a temperatura ambiente, que puede ser variable de acuerdo con la época del año. La fermentación depende enteramente del metabolismo de las levaduras y, en menor medida, de las bacterias del ácido láctico y acético. En los mostos de agave se han encontrado muchas cepas de levaduras, siendo Saccharomyces cerevisiae y Kloeckera africana las más importantes. Las levaduras metabolizan carbohidratos, aminoácidos, ácidos grasos y otros compuestos orgánicos, transformándolos en etanol, glicerol, dióxido de carbono y, en menor medida, en aldehídos, cetonas, alcoholes superiores, ácidos orgánicos y ésteres, que se denominan "subproductos de fermentación" o "congéneres". Los alcoholes superiores, también llamados "alcoholes fusel" debido a su sabor a malta y quemado, se forman por degradación de aminoácidos a través de cetoácidos (2-oxoácidos). Los alcoholes superiores más importantes son 1-propanol, 2-metil-1-propanol, 2-metil-butanol, 3-metil-butanol y 2-feniletanol, teniendo estos últimos un aroma parecido a una rosa. La síntesis de ácidos grasos dentro de la célula de levadura forma principalmente ácidos grasos saturados de cadena lineal con un número par de 4 a 18 átomos de carbono, y la aparición de niveles bajos de ácidos grasos con un número de carbono impar e insaturaciones depende de las condiciones de fermentación. Los ácidos grasos se pueden combinar con alcoholes para formar ésteres.
La fermentación prosigue durante 18 a 24 horas de 30 a 35°C. Una temperatura de procesamiento de 35°C produce más compuestos volátiles que 30°C. Además, se ha observado que el complemento con una fuente de nitrógeno cambia la formación de compuestos por las levaduras durante la fermentación, aunque el efecto es diferente de acuerdo con la fuente de nitrógeno utilizada. Al agregar una mezcla de 20 aminoácidos, la cepa K1 de Kloeckera africana es capaz de producir y tolerar concentraciones más altas de etanol, mientras que aumenta la producción de algunos ésteres, alcoholes, acetaldehído y a-terpineol. Cuando se utiliza Saccharomyces cerevisiae en un mosto complementado con sulfato de sodio y aminoácidos, la concentración de alcoholes amílicos e isobutanol disminuye, mientras que el propanol y el acetaldehído aumentan.
Una vez finalizada la fermentación y el contenido de alcohol alcanza aproximadamente el 15% v/v, es el momento de la destilación. La pulpa fermentada se calienta en hervidores de cobre o acero inoxidable a 78-80°C para lograr la evaporación del alcohol. Los vapores se condensan en bobinas enfriadas y se recolecta un destilado. El primer destilado alcanza una concentración de alcohol de -25% v/v, y necesita una segunda destilación, también llamada rectificación, para alcanzar el -55% v/v de etanol. A continuación, el líquido se ajusta con agua a 38-40% v/v de alcohol. Dado que la mayoría de los compuestos son volátiles, se evaporan junto con el etanol durante la destilación. Es posible separar diferentes fracciones de volátiles o "cortes" durante la destilación. El corte de cabeza contiene compuestos altamente volátiles como acetaldehído y acetato de etilo, mientras que el corte de la cola tiene químicos de mayor punto de ebullición, tales como ésteres etílicos de ácidos grasos de cadena larga. Dado que ambas fracciones son indeseables, se pueden separar del corte de corazón. Se obtiene metanol en la cola, a pesar de su bajo punto de ebullición. El lactato de etilo, el ácido acético y el furfural también se destilan en la fracción de cola. Los alcoholes isobutílico e isoamílico se comportan como productos de la cabeza, el alcohol n-propílico se encuentra en el corazón y el alcohol fenetílico exhibe un comportamiento de producto de cola.
El calor juega un papel importante en la generación de compuestos durante la destilación. Debido a esto, es posible que se produzcan algunas reacciones de degradación y que se produzcan aldehídos, cetonas, furanos, compuestos de azufre, pirazinas y fenoles.
El destilado rectificado ajustado con agua al 40% de contenido de etanol puede añejarse de dos meses a tres años en toneles de roble. Los aldehídos se evaporan y/o forman acetales. Al añejarse en toneles de madera, los compuestos volátiles tales como la vainillina, guayacol, eugenol, cresol y otros fenólicos migran de la madera al destilado, redondeando el sabor. Los ésteres etílicos no solo se forman durante la fermentación, sino también durante el añejamiento. Se ha informado que los ésteres pueden formarse posteriormente durante el proceso de añejamiento por esterificación de ácidos grasos con etanol a altas concentraciones.
La descripción anterior se encuentra en el documento mencionado anteriormente. Se ha identificado una amplia variedad y multiplicidad de compuestos que son componentes de extractos de agave y/o licores preparados a partir de ellos; sin embargo, según el conocimiento del solicitante, no se ha entendido que las bebidas comúnmente comercializadas como tequila u otras derivadas del agave contengan actividad inhibidora de MAO. Como se sabe que los inhibidores de MAO pueden usarse como elevadores del estado de ánimo, antidepresivos y tratamientos para diversas otras enfermedades, incluida la enfermedad de Parkinson, la "bebida energética" no alcohólica que se compone de los componentes libres de alcohol de estas bebidas es útil en estos contextos.
El documento WO 2014/015417 divulga un proceso para la preparación de una bebida o producto alimenticio reducido en calorías. El proceso implica primero convertir al menos parte del azúcar en un jugo derivado de plantas fermentándolo con levadura para producir un producto de fermentación que contenga etanol y, posteriormente, eliminar al menos parte del etanol, mientras se mantiene el producto de fermentación a menos de 55°C. para producir una bebida o un producto alimenticio reducido en calorías. El documento EP 0531155 A1 divulga el uso de zumo de grosella negra (Ribes nigum L.) o concentrado o extracto seco del mismo para inhibir la monoamino oxidasa y activar el cerebro y el sistema nervioso central en un animal vivo que lo necesite y, de este modo, aumentar el rendimiento cerebral general y para la prevención, tratamiento y alivio de enfermedades neurodegenerativas asociadas con un rendimiento cerebral reducido, tal como enfermedad de Parkinson, demencia y los trastornos del estado de ánimo.
El documento US 2010/0178411 A1 divulga una composición a base de plantas de agave que incorpora un néctar derivado de la planta de agave y se mezcla en pequeñas proporciones discretas con licores destilados que se componen principalmente del producto de fermentación y destilación del zumo del nucleo de una o más plantas de agave.
Divulgación de la invención
Como se indicó anteriormente, la invención aprovecha la presencia de inhibidores de MAO en licores preparados a partir de extractos de agave. Los inhibidores de MAO pueden estar presentes inicialmente en el extracto o formarse durante la fermentación o formarse durante la destilación o el añejamiento, y combinaciones de los anteriores. En particular, el solicitante ha demostrado que eliminar el alcohol de estos licores disponibles comercialmente mediante la aplicación de vacío destruye al menos parte de la actividad inhibidora de MAO. Por tanto, las composiciones de la presente invención deben prepararse a partir de estos licores mediante procesos que conserven estos componentes volátiles. Estos procesos incluyen ósmosis inversa y columnas de cono giratorio.
En consecuencia, en un aspecto, la invención se dirige a una composición que comprende compuestos inhibidores de la monoamino oxidasa (MAO), cuya composición se prepara eliminando el etanol de una bebida alcohólica destilada derivada del agave, sucediendo dicha eliminación mediante un proceso que retiene compuestos volátiles. además del etanol, cuyo proceso es la ósmosis inversa o columnas de cono giratorio. En una realización, la bebida alcohólica derivada de agave ha sido preparada calentando los tallos del cactus de agave para hidrolizar azúcares complejos; picar y triturar los tallos calientes para liberar un jarabe; diluir dicho jarabe con agua a un nivel BRIX 12-14 e inocular con levadura; fermentar el jarabe diluido inoculado para obtener un producto de fermentación; y destilar el producto de fermentación para obtener un destilado.
En un aspecto adicional de la invención, la composición de la invención descrita anteriormente es para uso en el tratamiento de condiciones caracterizadas por exceso de actividad de MAO. Esto es particularmente relevante en el caso de depresión o enfermedad de Parkinson.
En el presente documento se describe un método para analizar la actividad de inhibición de MAO en presencia de etanol. El etanol en cantidades significativas interfiere con el análisis. Por consiguiente, los análisis estándar que no tengan en cuenta la presencia de alcohol proporcionarán resultados engañosos.
El método mencionado anteriormente para analizar los inhibidores de MAO en presencia de etanol comprende añadir al análisis dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) y alcohol deshidrogenasa. Más detalladamente, el método de ensayo comprende añadir a la muestra que se va a analizar una cantidad eficaz de sustrato de dihidrobromuro de quinuramina, junto con dinucleótido de nicotinamida adenina y alcohol deshidrogenasa; añadir MAO A o MAO B; incubar a 37°C; detener la reacción con una base fuerte y evaluar los resultados con una longitud de onda de excitación de 310 nm y una longitud de onda de emisión de 405 nm.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra los resultados de la evaluación de la actividad de inhibición de MAO en un tequila con diversos añejamientos según lo evaluado por un kit de ensayo comercial estándar.
La Figura 2 muestra los resultados de evaluar la actividad inhibidora de MAO de diversas marcas y añejamientos de tequila usando quinuramina como sustrato.
La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de MAO con quinuramina como sustrato después de la separación de tequilas en diversas fracciones.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la actividad de inhibición de MAO de diversas fracciones de columna con base en el ensayo de quinuramina.
La Figura 5 muestra los resultados de los ensayos de inhibición de MAO en una muestra de tequila que ha sido sometida a ósmosis inversa y compara la actividad en el concentrado con la actividad en el filtrado.
Modos de llevar a cabo la invención
Las formas no alcohólicas de bebidas alcohólicas preparadas a partir de extractos de plantas de agave son el objeto de la presente invención como se describe anteriormente en el presente documento. Estas bebidas alcohólicas incluyen pulque, tequila, mezcal, sotol, Bacanora u otros fermentos hechos de azúcares derivados de la planta de agave. De acuerdo con la presente invención, el alcohol (etanol) se ha eliminado mediante ósmosis inversa o columnas de cono giratorio de las bebidas alcohólicas destiladas derivadas del agave, procesos que permiten la retención de otros compuestos volátiles.
Estas composiciones tienen propiedades inhibidoras de la monoamino oxidasa (MAO) y, por tanto, son útiles para su uso como elevadores del estado de ánimo, antidepresivos o para tratamiento de determinadas enfermedades tal como enfermedad de Parkinson. En el presente documento se describe un método de clasificación y preparación o mezcla de diferentes extractos para seleccionar un efecto estimulante o antidepresivo fisiológico deseado para su uso como bebida energética y/o estimulante del estado de ánimo mediante la evaluación de la actividad de MAO en presencia de alcohol. En la herramienta de clasificación/evaluación mencionada anteriormente, diferentes bebidas a base de agave reciben calificaciones de inhibición de la monoamino oxidasa (MAO) para cada forma de MAO, es decir, MAO A y MAO B, que se expresan como porcentaje de inhibición en relación con un control sin inhibidor presente. En el Ejemplo 6 se muestran ejemplos de valoraciones para mezcal, tequila, Bacanora, sotol y pulque. El Ejemplo 7 muestra resultados similares cuando se analizan las fracciones obtenidas por ósmosis inversa.
Como se muestra en el presente documento, las diversas bebidas derivadas de agave se pueden analizar directamente para determinar su contenido de inhibidores de MAO A y MAO B. Esto hace posible un sistema de
clasificación en donde los resultados de una bebida en particular podrían incluirse en la etiqueta. Las diversas bebidas podrían, por ejemplo, clasificarse en una escala con base en su contenido en comparación con otras marcas de la misma bebida. Las calificaciones podrían ser para combinaciones de inhibidores tanto para MAO A como para MAO B o para cada uno individualmente. Por lo tanto, para una escala del 1 al 10, con 10 la mejor calificación y 1 la peor, una bebida que muestre un 80% de inhibición de la MAO A en comparación con un 40% de inhibición mostrada por una marca rival en los mismos ensayos, podría recibir una calificación. de 9 frente a 5 para la bebida de menor actividad. La correlación de la inhibición con una escala particular puede diseñarse para proporcionar información útil al consumidor. La escala utilizada o la calificación seleccionada no necesita, por supuesto, ser de 1 a 10, sino cualquier otra escala que pueda seleccionarse arbitrariamente, tal como A-F.
Los ensayos de MAO utilizados para medir el porcentaje de inhibición aceptan muestras con altas concentraciones de etanol. El método de ensayo descrito en el presente documento es necesario para medir con precisión la inhibición de la actividad MAO y debe tolerar muestras con más del 40% de etanol, que es el componente principal de las muestras de interés que se van a clasificar. El rango de alcohol que se encuentra típicamente con los licores de agave destilado es del 6% para el pulque a aproximadamente el 60% para algunos tequilas y mezcal, pero las muestras más comunes tendrán un 40% de alcohol (grado 80). Debido a la volatilidad de algunos (pero no todos) los inhibidores de MAO derivados de bebidas a base de agave, es particularmente importante no evaporar el etanol de la muestra a presión reducida o por destilación a presión atmosférica.
Las composiciones de la invención pueden usarse como complemento alimenticio y/o incluirse en alimentos, bebidas o medicamentos, o, como se indicó anteriormente en el presente documento, pueden usarse en el tratamiento de condiciones caracterizadas por exceso de actividad de la monoamino oxidasa y, en particular, para el tratamiento de depresión, enfermedad de Parkinson o malestar general. La composición también se puede utilizar como complemento o sustituto del café o en productos descafeinados. Las composiciones se pueden mezclar con dos o más vehículos, excipientes y/o diluyentes que sean farmacéutica o nutricionalmente aceptables. Así, en general, las composiciones de la invención pueden incluirse en zumos u otros refrescos, tales como colas o refrescos con sabor a frutas, o pueden consumirse directamente. Las composiciones también pueden incluirse en productos alimenticios, tales como líquidos crudos, por ejemplo aderezos para ensaladas, y consumirse junto con los componentes sólidos de la ensalada. Las cantidades de composiciones que se van a consumir o administrar a los sujetos dependen en gran medida de la naturaleza de la condición que se va a tratar, así como de las concentraciones de los inhibidores de MAO que se determina que están en la propia composición. Los niveles de inhibidores de MAO útiles para diversas indicaciones médicas se conocen en la técnica y pueden seguir estas pautas. Para su uso como complementos alimenticios, esto depende del criterio del nutricionista u otro profesional.
Por tanto, la invención incluye productos alimenticos y bebidas que contienen la composición de la invención. La composición de la invención se incluye en el producto alimenticio o bebida en cantidades eficaces para tener el efecto fisiológico deseado.
Un método exitoso para eliminar el etanol del material de partida de la bebida alcohólica destilada es la ósmosis inversa (RO). Una membrana de RO con un límite de peso molecular de -100 g/mol (-100 Daltons) separa el etanol de los inhibidores de MAO formados por microorganismos o durante la destilación, o inhibidores que pueden ocurrir naturalmente en el material de partida. El aislamiento de los inhibidores de MAO se logra sin el uso de vacío o destilación. Por tanto, las composiciones de la presente invención pueden prepararse, por ejemplo, diluyendo con agua destilada 0.75 litros de tequila (u otra bebida de agave destilada) hasta un volumen de 7.5-75 litros, dependiendo de la concentración final de etanol deseada. Por ejemplo, 0.75 litros de tequila a 80 grados (40% de alcohol por volumen) se diluyen a 7.5 litros, momento en el que el material diluido es 4% de alcohol por volumen. El tequila diluido se hace circular en una unidad de ósmosis inversa equipada con una membrana con un límite de peso molecular de -100 g/mol (-100 Daltons) (Tangent Membranes, Inc., RO MINI) en donde el material diluido se concentra de nuevo a un volumen de 0.75 litros. La reducción adicional de etanol se logra diluyendo el material nuevamente a 7.5 litros o más y continuando la circulación a través de la unidad de RO. Para la creación de la composición tal como una bebida energética de acuerdo con la invención, se puede continuar la dilución y la posterior circulación hasta que el producto se considere no alcohólico. Los inhibidores de MAO activos se encuentran entonces contenidos en la porción concentrada, no alcohólica y luego pueden suplementarse con vitaminas, minerales, aminoácidos, proteínas o cafeína, cuando se desee, y pueden incluirse en otras preparaciones de alimentos o bebidas como se indicó anteriormente.
Es un aspecto importante en la creación de las composiciones de la invención que algunos de los inhibidores de MAO son compuestos volátiles y, si la composición se crea por evaporación del etanol mediante destilación por calor o bajo presión reducida, por ejemplo, se produce la pérdida de inhibidores esenciales de MAO.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar, pero no limitan, la invención.
Ejemplo 1 (ejemplo de referencia)
Ensayo de diversos tequilas utilizando ensayos disponibles comercialmente
Se empleó un kit de actividad MAO comercial para analizar muestras de diferentes tequilas o mezcal disponibles comercialmente, S1, S1 DW, S2 y S3. El kit se adquirió de Sigma-Aldrich (Cat. No. MAK136 Monoamine oxidase activity kit) que incluye compuestos inhibidores de MAO conocidos, clorgilina y pargilina, como controles, y tiramina como sustrato enzimático. La peroxidasa de rábano picante también se incluye en este kit para interactuar con el peróxido de hidrógeno generado por la oxidación de la tiramina con el fin de reaccionar con la etiqueta incluida, rojo Amplex®. La acción de MAO A y/o B crea una cascada de eventos que resultan en la emisión de fluorescencia. S1 y S3 son tequilas, con S1 una versión añejada de S3 y S1 DW una muestra reconstituida en agua destilada de S1 después de secar bajo una corriente de argón. S2 es una muestra de mezcal, que se elabora a partir de versiones de agave distintas del agave azul. DW es agua destilada. Los datos de fluorescencia se calculan para el porcentaje de inhibición en relación con un regulador de control (sin inhibidor). Se incluyen como controles un inhibidor conocido de MAO A, clorgilina, y un inhibidor conocido de MAO B, pargilina. Como se muestra en la Figura 1, dependiendo de la muestra, se puede lograr la inhibición selectiva de MAO A o B.
Ejemplo 2 (ejemplo de referencia)
Prueba de diversos tequilas usando un ensayo de solo quinuramina
En este ejemplo se usa un ensayo diferente, en el que la quinuramina sola es el sustrato, y la etiqueta del ensayo. Este ensayo utiliza quinuramina como sustrato MAO y es un sustrato tanto para MAO A como para B. Por tanto, este ensayo es un método más deseable que el descrito en el Ejemplo 1 porque se eliminan los efectos sobre la peroxidasa o la interferencia espectral. La oxidación de quinuramina da como resultado un cambio de DO a 360 nm y 320 nm. El producto también es fluorescente y puede detectarse mediante un aumento en la intensidad de emisión a 400 ejecuciones con una longitud de onda de excitación a 320 nm.
El ensayo se preparó en placas de poliestireno transparente de 96 pozos de acuerdo con el siguiente protocolo: Se añadió regulador de fosfato (205 pl/100 mM/pH 7.2) a los pozos seguido de 20 pl de cada muestra de extracto y el inhibidor de control clorgilina (para MAO A) y pargilina (para MAO B) a 10 pM. MAO A y MAO B humanos recombinantes (0,5 mg/ml de proteína) se adquirieron de Corning® y cada ensayo se suministró con 3 pg de esta proteína. Algunos ensayos se ejecutaron con una proteína nula como control, también suministrada por Corning®. Se dejó que los inhibidores, el regulador y las proteínas se preincuben en un lector de placas de lectura de densidad óptica PowerWave™ ajustado a 37°C durante 10 minutos. A continuación, se añadió el sustrato de quinuramina a cada pozo y la placa se incubó adicionalmente a 37°C durante 30 minutos. La placa se leyó a DO360 nm y se calculó el cambio de absorbancia desde el tiempo cero hasta los 30 minutos y se transformó en % de inhibición. Las muestras S40, S41, S42 son blanco, reposado y añejo, respectivamente, y son tequilas del mismo fabricante en 0, 1 y 2 etapas de añejamiento. S1, S3 son tequilas como en el Ejemplo 1 y S2 es mezcal. El porcentaje de inhibición se calcula a partir del cambio de densidad óptica a 360 nm desde el tiempo 0 hasta 30 min.
Los resultados se muestran en la Figura 2.
(Se probó un tequila usado como muestra (DJ1942) que contenía 40% de etanol para determinar los efectos de interferencia en el ensayo sin alcohol deshidrogenasa y dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD) y se mostró interferencia).
Ejemplo 3 (ejemplo de referencia)
Efecto del añejamiento
El ensayo de quinuramina se utilizó para probar tres añejamientos diferentes de tequila, S40, S41, S42 y para comparar extracciones acuosas y de cloruro de metileno de estas muestras. Los tequilas añejos muestran una mayor actividad inhibidora de MAO en comparación con los destilados más jóvenes, como se muestra en la Figura 3.
Ejemplo 4 (ejemplo de referencia)
Fraccionamiento de la actividad inhibidora de MAO
Se diluyó tequila (1750 ml) hasta 5000 ml con agua desionizada y se separó en tres porciones, y cada porción se extrajo con diclorometano (4 x 100 ml). Los extractos se combinaron, se lavaron con agua desionizada (2 x 100 ml) y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. La muestra se redujo en volumen a 10 ml por evaporación del solvente usando un evaporador rotatorio, luego se añadió sílice seca y el solvente se eliminó a temperatura ambiente. La sílice adsorbida en la muestra se cargó en seco en una columna de sílice con un volumen de lecho de 50 ml y la columna se ejecutó con un gradiente escalonado usando hexano:acetato de etilo (100% hexano, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, acetato de etilo al 100%). Durante la ejecución de la columna, se recogieron fracciones de 7 ml. Las muestras se analizaron de la siguiente manera:
Los ensayos de MAO para A y B se configuran en placas Negras de 96 pozos de Thermo Scientific™ (#7205) con cada ensayo que contiene 1 pl de muestra disuelta en DMSO, 87 pl de regulador de fosfato de potasio 100 mM pH
7.4, 3 |jl de una solución de reserva de quinuramina 0.75 mM. Se añadió a cada placa un conjunto de controles con DMSO solo (inhibidor 0), 1 j l de clorgilina 50 jmolar en DMSO como control de inhibición de m Ao A y 1 j l de pargilina 50 jm olar en DMSO como control de inhibición de MAO B. Al optimizar los ensayos, a veces se incluía un conjunto sin proteínas en las placas.
Se añadieron MAO A y MAO B humanos recombinantes (Corning®, SUPERSOMES™) a los pozos para cada ensayo respectivo a 750 ng de proteína en 9 j l de regulador.
La placa se incubó a 37°C durante 30 minutos y luego se añadieron 100 j l de NaOH 2N a cada pozo. La placa se leyó en un espectrofotómetro de fluorescencia a una longitud de onda de excitación 310 y una longitud de onda de emisión 405.
Para identificar la actividad inhibidora en las fracciones de columna, se colocaron 25 j l de cada fracción en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml y se evaporaron hasta sequedad en un Savant™ SpeedVac™. Se añadió DMSO (5 j l ) a cada tubo y se analizó 1 j l para determinar la actividad inhibidora de MAO A y B de acuerdo con el método anterior. La Figura 4 muestra la actividad inhibidora de MAO A y B a través de las fracciones recolectadas.
Se observa una inhibición significativa de MAO en las fracciones 6 hasta la 13.
Ejemplo 5 (ejemplo de referencia)
Preparación de aceites que contienen inhibidores de MAO
Se diluyó tequila (100 ml) a 200 ml con agua desionizada y se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Los extractos se combinaron y se pasaron por una columna de sulfato de sodio anhidro. Se evaporó el solvente usando un evapodor giratorio y se obtuvieron 30 mg de aceite. Las muestras de este aceite inhibieron MAO A en un 75% y MAO B en un 87%.
Se diluyó tequila (100 ml) a 200 ml con agua desionizada y se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml). Los extractos se combinaron y se pasaron por una columna de sulfato de sodio anhidro. El solvente se eliminó por evaporación en un aparato Kuderna Danish calentado sobre un baño de agua a 70°C dando como resultado 17 mg de un aceite. Las muestras del aceite mostraron una inhibición de MAO A del 55% y una inhibición de MAO B del 88%.
Ejemplo 6 (ejemplo de referencia)
Ensayo de diversas muestras de tequila, per se
Como se discutió anteriormente, las muestras con actividad inhibidora de MAO no deben evaporarse a presión reducida o los compuestos se coevaporan con etanol. Por lo tanto, las muestras deben analizarse sin evaporación del etanol para eliminar las pérdidas de compuestos inhibidores de MAO y para clasificar con precisión la actividad inhibidora de MAO del producto analizado. Los ensayos se configuraron en placas negras de 96 pozos Thermo Scientific™ (#7205) de la siguiente manera:
Cada ensayo incluyó 5 j l de muestra, de dihidrobromuro de quinuramina 0.975 jg , dinucleótido nicotinamida adenina (NAD) 0.75 jmoles en un volumen total de 93 j l con solución salina regulada con fosfato 100 mM, pH 7.4.
Se diluyó alcohol deshidrogenasa a 0.25 unidades/ml y se añadieron 3 j l a los pozos. Las placas se incubaron de 25 a 37°C durante 15 minutos.
La MAO A y B humana recombinante (Corning®) suministrada a 5 mg/ml se dividió en alícuotas en viales de 20 j l cada uno y se diluyó para el ensayo con 246 j l de regulador, luego se añadieron 4 j l de cada MAO a sus respectivos pozos.
Las placas se incubaron a 37°C durante 30 minutos y se añadió NaOH 2N (100 j l) y las placas se leyeron a una longitud de onda de excitación 310 y una longitud de onda de emisión 405. Usando este ensayo, se analizaron diversas muestras de tequila con los resultados mostrados. en la Tabla 1.
Tabla 1.
Calificaciones de diversas bebidas derivadas del agave
Marca % Inhibición MAO A % Inhibición MAO B
Suerte Blanco 5 6
Suerte Reposado 7 12
Suerte Anejo 14 19
Calificaciones de diversas bebidas derivadas del agave
Marca % Inhibición MAO A % Inhibición MAO B
Qui blanco 33 7
Don Julio 70th Anniversary 12 6
Grand Patron Piedra 32 49
Don Julio Blanco 9 8
Don Julio Repesado 18 22
Don Julio Anejo 10 26
Don Julio 1942 18 35
Patron Silver Roca 39 11
Patron Roca Anejo 21 40
Patron Grand Platinum 38 9
Esperanto 36 4
Avion Silver 31 7
1800 silver 11 11
Cuervo Silver -1 4
Cuervo Gold 4 40
Mezcal “barato” 43 2
Mezcal “costoso” 40 8
Ketel One Vodka -2 -2
Jaegermeister 49 55
Tres Generacion 15 41
Clorgiline/Pargilina (control positivo) 97 82
DMSO (control negativo) 2 1
DMSO (control negativo) -2 -1
Inhibir (control positivo) 98 96
Inhibir (control positivo) 98 95
Ejemplo 7
Efecto de la ósmosis inversa (RO)
Se usó un RO Mini de Tangent Membranes, Inc. equipado con un filtro de -100 mwco para separar el etanol del tequila, mientras que retenía los compuestos inhibidores de MAO. Aquí, 1.5 litros de tequila añejo (DJA) se diluyó a 15 litros con agua destilada y se hizo circular en el RO Mini hasta que el volumen se redujo de nuevo a 1.5 litros. Se evaluó la actividad inhibidora de MAO de 10, 20, 30 y 40 pl de la muestra concentrada y el filtrado (Figura 5).
Como se muestra en la Figura 5, el concentrado retiene los inhibidores de MAO A y B mientras que los inhibidores de MAO no están presentes en el filtrado que contiene solo etanol y agua de la muestra diluida.
La Tabla 2 muestra los resultados para diversas bebidas, así como el material de partida de tequila diluido (etiquetado como Control de RO diluido), 1er Concentrado de RO, 2do Concentrado de RO, 1er Filtrado de RO y 2do Filtrado de RO. Se muestra en el ensayo de inhibición de MAO que los filtrados tienen menos actividad inhibidora, mientras que la mayor parte de la actividad permanece con el concentrado.
Tabla 2
Muestra % Inhibición de MAO A % Inhibición de MAO B
Kirkland Anejo (Costco brand) 23 32
Milagro Anejo 26 23
Don Julio Anejo 17 32
Don Julio 1942 19 35
Muestra % Inhibición de MAO A % Inhibición de MAO B Pulque 14 26
Sotol 71 58
Milagro Barrel Res Anejo 27 15
Control de RO diluido 17 35
1er concentrado de RO 23 52
Segundo concentrado de RO 34 49
1er filtrado RO 10 7
Segundo filtrado de RO 3 8 Clorgilina/Pargilina 97 83
DMSO 1 1
Claims (9)
1. Una composición que comprende compuestos inhibidores de monoamino oxidasa (MAO), cuya composición se prepara mediante la eliminación de etanol de una bebida alcohólica destilada derivada del agave, dicha eliminación de etanol se produce mediante un proceso que retiene compuestos volátiles distintos del etanol, cuyo proceso es por ósmosis inversa o por columnas de cono giratorio.
2. La composición de la reivindicación 1, en donde la bebida alcohólica destilada es un destilado que se ha preparado mediante:
a) calentar los tallos de cactus de agave para hidrolizar azúcares complejos;
b) picar y triturar los tallos calientes para liberar un jarabe;
c) diluir dicho jarabe con agua a un nivel BRIX 12-14 e inocular con levadura;
d) fermentar el jarabe diluido inoculado para obtener un producto de fermentación; y
e) Destilar el producto de fermentación para obtener un destilado.
3. La composición de la reivindicación 2, en donde la etapa a) se lleva a cabo mediante autoclave.
4. La composición de la reivindicación 2, en donde etapa b) se realiza en un molino picador y un triturador.
5. La composición de la reivindicación 2, en donde el proceso de la etapa d) incluye la fermentación entre temperatura ambiente y 30°C en presencia de S. cerevisiae y K. africana.
6. La composición de la reivindicación 2, en donde la etapa e) se lleva a cabo hasta que el destilado alcanza una concentración de etanol de al menos 38-40% v/v.
7. Un producto alimenticio o bebida que comprende la composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
8. Una composición como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2 o un producto alimenticio o bebida como se define en la reivindicación 7 para uso en el tratamiento de condiciones caracterizadas por exceso de actividad de la monoamino oxidasa (MAO).
9. Composición, producto alimenticio o bebida para su uso según la reivindicación 8, en donde dicha condición es depresión o enfermedad de Parkinson.
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