RS60851B1 - Energetska pića i druga nutritivna pomoćna sredstva poreklom od alkoholnih napitaka na bazi agave - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Pronalazak se odnosi na bezalkoholne verzije destilovanih alkoholnih pića na bazi agave, posebno različitih tekila, koje su korisne za lečenje raznovrsnih stanja, zahvaljujući inhibitorima monoamino oksidaze (monoamine oxidase, MAO) koji se u njima nalaze.

Osnov pronalaska

[0002] U literaturi postoje opsežni podaci u vezi sa pripremanjem destilovanih alkoholnih pića od agave. Na primer, detaljan opis pripremanja tekile od kaktusa agava dat je u Tequila Processing and Flavor, Pedro A. Vazquez-Landaverde and Miriam G. Rodriguez-Olvera, Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnologia Avanzada del Instituto Politécnico Nacional Unidad Querretaro, Cerro Blanco 141 Colinas del Cimatario, Queretaro, Qro., Mexico 76090; 2012 American Chemical Society; na World Wide Web //pubs.acs.org, datum publikovanja (na mreži): 16. jul 2012 I doi: 10.1021/bk-2012-1104.ch015 U: Flavor Chemistry of Wine and Other Alcoholic Beverages; Qian, M., et al.; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC, 2012, gde su opisani obrada agave kao polaznog materijala, fermentacija, destilacija i zrenje. Ukratko, stabla kaktusa agava greju se da bi se hidrolizovali kompleksni šećeri, i usitnjavaju i gnječe da bi se oslobodio sirup. Sirup se zatim razblaži vodom kako bi se obezbedilo pogodno razblaženje za inokulaciju kvascem. Posle fermentisanja, fermentaciona kultura se destiluje da se dobije destilat. Destilat se prodaje u vidu tekila koje nose različita zaštićena imena, i kojih je veliki broj. Pre pakovanja i plasiranja na tržište, međutim, destilat može da se izloži zrenju.

[0003] Konkretan opis naveden u izvoru pomenutom gore je sledeći:

Odrasla agava sa koje su uklonjeni listovi (označena kao "pifija") iseče se na polovine, četvrtine ili sitnije, da bi se lakše stavila u pećnicu (48 h) ili autoklav (12 h) i peče se na 106-116 °C. Cilj ove termičke obrade je hidrolizovanje kompleksnih šećera kao što su inulin i skrob, da bi se dobile glukoza i fruktoza, radi lakše fermentacije. Šećeri uglavnom daju etanol, a fermentacijom ovog supstrata nastaju i mnoga druga jedinjenja. Kao rezultat termičke obrade pifia, formiraju se jedinjenja, uglavnom povezana sa Maillardovom reakcijom, kao što su furani, pirani, aldehidi, azotna i sumporna jedinjenja. Najčešća Maillardova jedinjenja su metil-2-furoat, 2,3-dihidroksi-3,5-dihidro-6-metil-4(H)-piran-4-on i 5-hidroksimetilfurfural. Pirazini predstavljaju isto tako važnu grupu hemijskih jedinjenja izvedenih iz Maillardovih reakcija. Najčešći nađeni pirazini su 2,5-dimetilpirazin i trimetilpirazin.

[0004] Drugi proizvodi povezani sa termičkom razgradnjom nastaju tokom koraka pečenja. Slobodne masne kiseline kratkog i dugog ugljeničnog lanca nađene su u pečenim pifijama, verovatno zbog hidrolize acilglicerola; β-ciklocitral i β-damascenon verovatno su razgradni proizvodi karotenoida, dok je 4-metil-5-(2-hidroksietil)-tiazol razgradni proizvod aminokiseline, tiamina. Fenolima slični p-krezol i 4-etil fenol, razgradni su proizvodi fenolnih kiselina.

[0005] Kada pifije budu pečene, prenose se u mlin za usitnjavanje i drobilicu gde oslobađaju sav sirup koji sadrži visoku koncentraciju šećera i većinu jedinjenja. Dobijena kaša agave se često ispira da bi se poboljšala ekstrakcija šećera.

[0006] Nema sumnje da je fermentacija najvažniji i najkomplikovaniji stupanj procesovanja agave. 100% agava ili mešani sirupi razblaže se vodom da se dostigne 12-14°BRIX (80-100 g/L šećera). Fermentacija se odvija u termostatisanim rezervoarima na 30 °C, mada neki procesi mogu da se odvijaju i na sobnoj temperaturi, koja može varirati u zavisnosti od godišnjeg doba. Fermentacija u potpunosti zavisi od metabolizma kvasaca i, u manjoj meri, od bakterija mlečnokiselinskog i sirćetnokiselinskog vrenja. U širi agave nađeni su sojevi mnogih kvasaca među kojima su najvažniji Saccharomyces cerevisiae i Kloeckera africana. Kvasci metabolišu ugljene hidrate, amino-kiseline, masne kiseline i druga organska jedinjenja, transformišući ih u etanol, glicerol, ugljen-dioksid i, u manjoj meri, u aldehide, ketone, više alkohole, organske kiseline i estre, koji se nazivaju "sporedni proizvodi fermentacije" ili "srodna jedinjenja". Viši alkoholi, nazvani i "fuzel alkoholi" zbog svog sladnog i "pregorelog" ukusa, formiraju se degradacijom amino-kiselina preko keto kiselina (2-okso kiseline). Najvažniji viši alkoholi su 1-propanol, 2-metil-1-propanol, 2-metil-butanol, 3-metil-butanol, i 2-feniletanol, poslednji ima aromu ruže. Sinteza masnih kiselina u ćeliji kvasca daje uglavnom zasićene masne kiseline linearnog lanca, sa parnim brojem ugljenikovih atoma, od 4 do 18, uz pojavu niskih nivoa masnih kiselina sa neparnim brojem ugljenikovih atoma i nezasićenjima zavisnim od uslova fermentacije. Masne kiseline mogu da se kombinuju sa alkoholima da bi se formirali estri.

[0007] Fermentacija se odvija 18 do 24 sata na 30 do 35 °C. Na temperaturi procesovanja od 35 °C proizvodi se više isparljivih jedinjenja nego 30 °C. Isto tako, zapaženo je da dodavanje izvora azota menja formiranje jedinjenja kvascima, tokom fermentisanja, mada se efekat razlikuje u zavisnosti od upotrebljenog izvora azota. Uz dodavanje mešavine 20 aminokiselina, Kloeckera africana soj K1 može da proizvede i toleriše više koncentracije etanola, uz povećanu proizvodnju nekih estara, alkohola, acetaldehida i α-terpineola. Kada se koristi Saccharomyces cerevisiae u širi dopunjenoj natrijum sulfatom i amino-kiselinama, koncentracije amil alkohola i izobutanola se smanjuju, dok koncentracije propanola i acetaldehida rastu.

[0008] Kada se fermentacija završi, i sadržaj alkohola dostigne oko 15% v/v, vreme je za destilaciju. Fermentisana kaša se greje u kazanima od bakra ili nerđajućeg čelika na 78-80 °C tako da dođe do isparavanja alkohola. Pare se kondenzuju u ohlađenim navojcima i destilat se sakuplja. U prvom destilatu alkohol dostiže koncentraciju -25% v/v, i potrebna je druga destilacija, nazvana još i rektifikacija, da bi se dostiglo -55% v/v etanola. Zatim se upotrebom vode, sadržaj alkohola podesi na 38-40% v/v. Pošto su jedinjenja većinom isparljiva, ona isparavaju sa etanolom tokom destilacije. Tokom destilacije moguće je razdvojiti različite frakcije isparljivih jedinjenja, ili "rezove". Vodeći rez sadrži visokoisparljiva jedinjenja kao što su acetaldehid i etil acetat, dok zadnji rez sadrži hemijska jedinjenja sa višom tačkom ključanja kao što su etil estri dugolančanih masnih kiselina. Kako su obe frakcije nepoželjne, mogu se odvojiti od središnjeg reza. Metanol se dobija pri kraju, uprkos svojoj niskoj tački ključanja. Etil laktat, sirćetna kiselina i furfural takođe se destiluju u zadnjoj frakciji. Izobutil i izoamil alkoholi ponašaju se kao vodeći proizvodi, n-propil alkohol se nalazi u središnjoj frakciji, a fenetil alkohol pokazuje ponašanje proizvoda zadnjeg reza.

[0009] Toplota ima važnu ulogu u stvaranju jedinjenja tokom destilacije. Zbog toga je moguće da dođe do nekih reakcija razgradnje i do formiranja aldehida, ketona, furana, sumpornih jedinjenja, pirazina i fenola.

[0010] Rektifikovani destilat u kojem je sadržaj etanola vodom podešen na 40%, može da zri dva meseca do tri godine u hrastovim bačvama. Aldehidi isparavaju i formiraju acetale. Zrenjem u drvenim bačvama, isparljiva jedinjenja kao što su vanilin, gvajakol, eugenol, krezol i druga fenolna jedinjenja migriraju iz drveta, dopunjavajući ukus. Etil estri se ne formiraju samo tokom fermentacije, nego i tokom zrenja. Saopšteno je da estri mogu da se formiraju naknadno tokom procesa zrenja, esterifikacijom masnih kiselina sa etanolom u visokim koncentracijama.

[0011] Gornji opis je onakav kakav se može naći u dokumentu navedenom ranije u ovom tekstu. Identifikovan je veliki broj veoma raznovrsnih jedinjenja koja su komponente ekstrakata agave i/ili od njih pripremljenih alkoholnih pića; međutim, koliko je podnosiocu poznato, nije se znalo da pića koja se uobičajeno prodaju kao tekila, ili druga pića poreklom od agave, poseduju aktivnost inhibicije MAO. Pošto se zna da inhibitori MAO mogu da se koriste kao sredstva za popravljanje raspoloženja, antidepresivi i kao načini lečenja različitih drugih oboljenja, uključujući Parkinsonovu bolest, bezalkoholno "energetsko piće" sačinjeno od komponenti ovih napitaka, koje ne sadrže alkohol, korisno je u ovom kontekstu.

[0012] WO 2014/015417 Objavljuje proces pripremanja napitka ili prehrambenog proizvoda sa smanjenom kalorijskom vrednošću. Proces obuhvata najpre konvertovanje bar nešto šećera iz soka poreklom iz biljke, fermentisanjem soka sa kvascem da se proizvede fermentacioni proizvod koji sadrži etanol i zatim uklanjanje bar nešto etanola, uz zadržavanje fermentacionog proizvoda na temperaturi ispod 55 °C da se prouzvede napitak ili prehrambeni proizvod sa smanjenom kalorijskom vrednošću. EP 0531155 A1 objavljuje upotrebu soka crne ribizle (Ribes nigrum L.) ili njegovog koncentrata ili suvog ekstrakta za inhibiciju monoamino oksidaze i za aktivaciju mozga i centralnog nervnog sistema kod žive životinje kojoj je to potrebno, čime se povećavaju opšte cerebralne performanse, i preveniraju, leče i ublažavaju neurodegenerativna oboljenja udružena sa smanjenim cerebralnim performansama, na primer Parkinsonova bolest, demencija i poremećaji raspoloženja.

[0013] US 2010/0178411 A1 objavljuje kompoziciju na bazi biljke agava, koja sadrži nektar izveden iz biljke agava, pomešan u malim, zasebnim proporcijama sa destilovanim alkoholnim napicima koji se uglavnom sastoje od proizvoda fermentacije i destilacije soka iz srži jedne ili više biljaka agava.

Objava pronalaska

[0014] Kako je napomenuto gore, pronalazak koristi pogodnost prisustva inhibitora MAO u alkoholnim pićima pripremljenim od ekstrakata agave. Inhibitori MAO mogu inicijalno biti prisutni u ekstraktu ili se formirati tokom fermentacije ili se formirati tokom destilacije ili zrenja, i kombinacije gore navedenog. Konkretno, podnosilac je pokazao da uklanjanje alkohola iz ovih komercijalno raspoloživih alkoholnih pića primenom vakuuma uništava bar nešto njihove aktivnosti u inhibiciji MAO. Prema tome, kompozicije predmetnog pronalaska moraju se pripremati od ovih alkoholnih pića procesima koji čuvaju ove isparljive komponente. Ovi procesi uključuju reverznu osmozu i tehnologiju kolone sa rotirajućim konusom.

[0015] Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju koja uključuje jedinjenja koja su inhibitori monoamino oksidaze (MAO), kompozicija se priprema uklanjanjem etanola iz destilovanog alkoholnog pića poreklom iz agave, pomenuto uklanjanje alkohola dešava se procesom koji obezbeđuje zadržavanje isparljivih jedinjenja različitih od etanola, proces je reverzna osmoza ili tehnologija kolone sa rotirajućim konusom. U jednom primeru izvođenja, alkoholno piće izvedeno iz agave priprema se grejanjem stabala kaktusa agava da bi se hidrolizovali kompleksni šećeri; usitnjavanjem i drobljenjem zagrejanih stabala da bi se oslobodio sirup; razblaživanjem pomenutog sirupa vodom do nivoa 12-14 BRIX i inokulisanja kvascem; fermentisanjem inokuliranog razblaženog sirupa da se dobije proizvod fermentacije; i destilovanjem proizvoda fermentacije da se dobije destilat.

[0016] U sledećem aspektu pronalaska, goreopisana kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju stanja koja se karakterišu povećanom aktivnošću MAO. Ovo je posebno relevantno u slučaju depresije ili Parkinsonove bolesti.

[0017] U ovom tekstu opisan je metod testiranja aktivnosti inhibicije MAO u prisustvu etanola. Etanol u značajnim količinama interferira sa testom. Prema tome, standardni testovi koji ne uzimaju u obzir prisustvo etanola dovešće do lažnih rezultata.

[0018] Metod testiranja inhibitora MAO u prisustvu etanola, pomenut gore, uključuje dodavanje u test nikotinamid adenin dinukleotida (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD) i alkoholne dehidrogenaze. Preciznije, metod testiranja uključuje dodavanje, u uzorak koji će se analizirati, supstrat-efektivne količine kinuramin dihidrobromida, zajedno sa nikotinamid adenin dinukleotidom i alkoholnom dehidrogenazom; dodavanje MAO A ili MAO B; inkubiranje na 37 °C; zaustavljanje reakcije jakom bazom i procenu rezultata uz talasnu dužinu ekscitacije 310 nm i talasnu dužinu emisije 405 nm.

Kratak opis crteža

[0019]

Slika 1 prikazuje rezultate procene aktivnosti inhibicije MAO za tekilu na različitim stupnjevima zrenja, uz upotrebu standardnog komercijalnog testnog kita.

Slika 2 prikazuje rezultate procene aktivnosti inhibicije MAO za tekilu različitih marki i stupnjevima zrenja, uz upotrebu kinuramina kao supstrata.

Slika 3 prikazuje rezultate testa inhibicije MAO u prisustvu kinuramina kao supstrata posle separacije tekile u različite frakcije.

Slika 4 predstavlja grafik koji prikazuje aktivnost inhibicije MAO za različite frakcije sa kolonena bazi kinuraminskog testa.

Slika 5 prikazuje rezultate testa inhibicije MAO u uzorku tekile koja je bila izložena reverznoj osmozi i upoređuje aktivnost u koncentratu sa aktivnošću u filtratu.

Načini izvođenja pronalaska

[0020] Bezalkoholne forme alkoholnih napitaka napravljenih od ekstrakata biljke agava predmet su ovog pronalaska, kako je opisano ranije u ovom tekstu. Ova alkoholna pića uključuju pulke, tekilu, meskal, sotol, bakanoru ili druge proizvode fermentacije napravljene od šećera poreklom iz biljke agava. U skladu sa predmetnim pronalaskom, alkohol (etanol) se iz destilovanog alkoholnog pića poreklom od agave uklanja reverznom osmozom ili tehnologijom kolone sa rotirajućim konusom, procesi obezbeđuju zadržavanje drugih isparljivih jedinjenja.

[0021] Ove kompozicije odlikuju se aktivnošću inhibicije monoamino oksidaze (MAO) tako da se mogu koristiti kao poboljšivači raspoloženja, antidepresivi ili kao sredstva za lečenje određenih bolesti kao što je Parkinsonova bolest. U ovom tekstu opisan je metod gradiranja i pripreme ili mešanja različitih ekstrakata da bi se odabrao željeni fiziološki stimulativni ili antidepresivni efekat, za upotrebu u vidu energetskog pića i/ili poboljšivača raspoloženja, koji uključuje procenu aktivnosti MAO u prisustvu alkohola. U gorepomenutom alatu za gradiranje/evaluaciju, različita pića na bazi agave dobijaju ocene za inhibiciju monoamino oksidaze (MAO), i to za svaku od formi MAO, tj., MAO A i MAO B, koje se izražavaju kao procenat inhibicije u odnosu na kontrolu bez inhibitora. Primeri ocena za meskal, tekilu, bakanoru, sotol i pulke prikazani su u Primeru 6. Primer 7 prikazuje slične rezultate kada se analiziraju frakcije dobijene reverznom osmozom.

[0022] Kako je pokazano u ovom tekstu, različita pića na bazi agave mogu da se analiziraju direktno u pogledu svog sadržaja inhibitora MAO A i MAO B. Ovo omogućava uspostavljanje sistema rangiranja u kojem rezultati dobijeni za određeno piće mogu da se nađu na etiketi. Različita pića mogu, na primer, da se rangiraju na skali, na osnovu svog sadržaja u poređenju sa istim pićem drugih marki. Rangiranje može da se odnosi na kombinacije inhibitora za MAO A i MAO B ili za svaki pojedinačno. Prema tome, za skalu od 1 do 10, na kojoj je 10 najbolja ocena, a 1 najlošija, napitku koji pokazuje 80% inhibicije MAO A u poređenju sa 40% inhibicije koju je u istom testu pokazala konkurentska marka, može se dati ocena 9 prema oceni 5 za piće sa nižom aktivnošću. Korelacija inhibicije sa određenom skalom može da se dizajnira na način koji će potrošaču dati korisnu informaciju. Skala ili rangiranje koji će se upotrebiti, naravno, ne moraju biti u formatu 1-10, već se arbitrarno može odabrati bilo koja druga skala, na primer A-F.

[0023] Testovi MAO upotrebljeni za merenje procenta inhibicije prihvataju uzorke sa visokim koncentracijama etanola. Testni metod opisan u ovom tekstu mora da precizno izmeri inhibiciju MAO aktivnosti i mora da toleriše uzorke sa preko 40% etanola, koji je glavna komponenta uzoraka od interesa koji će se ocenjivati. Raspon alkohola koji se obično sreće u destilovanim pićima od agave iznosi 6% za pulke do oko 60% za neke tekile i meskal, ali češće se sreću uzorci koji imaju 40% alkohola (jačina alkohola 80). Zbog isparljivosti nekih (ali ne svih) inhibitora MAO poreklom iz napitaka na bazi agave, posebno je važno da se alkohol iz uzorka ne uklanja isparavanjem pod sniženim pritiskom ili destilacijom na atmosferskom pritisku.

[0024] Kompozicije pronalaska mogu da se koriste kao suplementi u ishrani i/ili da budu sadržane u hrani, piću ili lekovima, ili, kako je napomenuto ranije u ovom tekstu, da se upotrebljavaju u lečenju stanja koja se karakterišu povećanom aktivnošću monoamino oksidaza i, posebno, u lečenju depresije, Parkinsonove bolesti ili opšte slabosti. Kompozicija se moža koristiti i kao dodatak ili supstituent u kafi ili dekofeinisanim proizvodima. Kompozicije mogu da se mešaju sa dva ili više nosača, ekscipijenata i/ili razblaživača koji su farmaceutski i nutritivno prihvatljivi. Uopšteno, dakle, kompozicije pronalaska mogu ući u sastav sokova ili drugih bezalkoholnih pića kao što su kole ili gazirana pića sa ukusom voća, ili se mogu konzumirati direktno. Kompozicije mogu biti uključene i u prehrambene proizvode, kao što su nekuvane tečnosti, na primer začini za salatu, i konzumirati se zajedno sa čvrstim komponentama salate. Količine kompozicija koje će se konzumirati ili primeniti kod subjekta, u velikoj meri zavise od prirode stanja koje treba lečiti, kao i od utvrđenih koncentracija inhibitora MAO u samoj kompoziciji. Nivoi inhibitora MAO koji su korisni u različitim medicinskim indikacijama, poznate su u struci i te smernice se mogu pratiti. Upotreba u vidu suplemenata u ishrani, predmet je procene nutricioniste ili drugog stručnjaka.

[0025] Prema tome, pronalazak uključuje prehrambene proizvode i pića koji sadrže kompoziciju pronalaska. Kompozicija pronalaska uključena je u prehrambeni proizvod ili piće u količinama efikasnim za postizanje željenog fiziološkog efekta.

[0026] Jedan uspešan metod uklanjanja etanola iz destilovanog alkoholnog pića kao polaznog materijala je reverzna osmoza (reverse osmosis, RO). Membrana za RO sa pragom molekulske težine postavljenim na -100 g/mol (-100 Daltona) razdvaja etanol od inhibitora MAO formiranih mikroorganizmima ili tokom destilacije, ili inhibitora koji se mogu sretati prirodno u polaznom materijalu. Izolacija inhibitora MAO obavlja se bez upotrebe vakuuma ili destilacije. Prema tome, kompozicije predmetnog pronalaskam mogu se pripremiti, na primer, razblaživanjem destilovanom vodom 0.75 litara tekile (ili drugog napitka dobijenog iz agave destilacijom) do zapremine od 7.5-75 litara, zavisno od željene finalne koncentracije etanola. Na primer, 0.75 litara tekile sa jačinom alkohola 80 (40% alkohola po zapremini) razblaži se do 7.5 litara, pri čemu razblaženi materijal ima 4% alkohola po jedinici zapremine. Razblažena tekila cirkuliše u jedinici za reverznu osmozu opremljenoj membranom sa pragom molekulske težine od -100 g/mol (-100 Daltona) (Tangent Membranes, Inc., RO MINI) pri čemu se razblaženi materijal koncentruje nazad do zapremine od 0.75 litara. Dodatno smanjenje etanola postiže se ponovnim razblaživanjem materijala do 7.5 litara ili više i nastavljanjem cirkulacije kroz RO jedinicu. Da bi se napravila kompozicija kao što je energetsko piće prema pronalasku, razblaživanje i zatim cirkulacija mogu se nastaviti dok proizvod ne bude mogao da se smatra za bezalkoholan. Aktivni inhibitori MAO su tada prisutni u koncentrisanom, bezalkoholnom delu i mogu se dopuniti vitaminima, mineralima, amino-kiselinama, proteinom ili kofeinom, po želji, i mogu biti uključeni u druge prehrambene preparate ili pića, kako je napomenuto ranije u ovom tekstu.

[0027] Važan aspekt u pripremanju kompozicija pronalaska je to da su neki inhibitori MAO isparljivi i da, ako se kompozicija sprema isparavanjem etanola destilacijom uz zagrevanje ili pod sniženim pritiskom, na primer, dolazi do gubljenja esencijalnih inhibitora MAO.

[0028] Sledeći primeri ponuđeni su da bi ilustrovali pronalazak, a ne da bi ga ograničili.

Primer 1 (referentni primer)

Testiranje različitih tekila uz korišćenje komercijalno dostupnih testova

[0029] Komercijalni kit za utvrđivanje MAO aktivnosti upotrebljen je za testiranje različitih komercijalno dostupnih tekila ili meskala, S1, S1 DW, S2 i S3. Kit kupljen od Sigma-Aldrich (Cat. No. MAK136 Monoamine oxidase activity kit) uključuje klorgilin i pargilin, jedinjenja koja su poznata kao inhibitori MAO kao kontrole, i tiramin kao supstrat enzima. Peroksidaza rena takođe je uključena u ovaj kit, da bi interagovala sa vodonik-peroksidom nastalim oksidacijom tiramina, sa ciljem reagovanja sa sadržanim markerom, Amplex® crvenim. Reakcija MAO A i/ili B pokreće kaskadu događaja koji za rezultat imaju emitovanje fluorescencije. S1 i S3 su tekile, pri čemu je S1 sazrela verzija S3, i S1 DW uzorak S1 rekonstituisan u destilovanoj vodi posle sušenja pod strujom argona. S2 je uzorak meskala napravljen od verzije agave različite od plave agave. DW je destilovana voda (distilled water). Podaci o fluorescenciji korišćeni su za izračunavanje procenta inhibicije u odnosu na pufersku kontrolu (bez inhibitora). Poznati inhibitor MAO A, klorgilin, i poznati inhibitor MAO B, pargilin, korišćeni su kao kontrole. Kao što je pokazano na Slici 1, u zavisnosti od uzorka, može se postići selektivna inhibicija MAO A ili B.

Primer 2 (referentni primer)

Testiranje različitih tekila uz korišćenje testa sa kinuraminom

[0030] U ovom primeru upotrebljen je drugačiji test u kojem je kinuramin i supstrat i testni marker. U ovom testu koristi se kinuramin kao supstrat za MAO, i to kao supstrat i za MAO A i za B. Prema tome, ovaj test je poželjniji metod od onog koji je opisan u Primeru 1 jer su u njemu eliminisani efekti vezani za peroksidazu ili spektralna interferencija. Oksidacija kinuramina rezultuje promenom OD na 360 nm i 320 nm. Proizvod je takođe fluorescentan i može se detektovati porastom intenziteta emisije na 400 nm uz talasnu dužinu ekscitacije od 320 nm.

[0031] Ovaj test se postavlja na čistim polistirenskim pločama sa 96 bunarčića, prema sledećem protokolu: fosfatni pufer (205 μl / 100 mM / pH 7.2) dodaje se u bunarčiće, što je praćeno dodavanjem 20 μl uzorka svakog od ekstrakata i kontrolnog inhibitora klorgilina (za MAO A) i pargilina (za MAO B) u koncentraciji od 10 μM. Rekombinantne humane MAO A i MAO B (0.5 mg/ml proteina) kupljene su od Corning® i u svaki test je dodato po 3 μg ovog proteina. Neki testovi su izvedeni sa nultim proteinom kao kontrolom, takođe nabavljenim od Corning®. Inhibitor(i), pufer i proteini ostavljeni su da se preinkubiraju u PowerWave™ čitaču optičke gustine sa ploča, podešenom na 37°C, 10 minuta. Zatim se u svaki bunarčić doda kinuramin kao supstrat i ploča se inkubira na 37°C još 30 minuta. Ploča se očitava na OD360 nm, a promena apsorbance od nultog vremena do 30 minuta izračunava se i transformiše u % inhibicije. Uzorci S40, S41, S42 su blanco, reposado, odnosno añejo, i to su tekile istog proizvođača na stadijumima zrenja 0, 1 i 2. S1, S3 su tekile kao u Primeru 1, i S2 je meskal. Procenat inhibicije izračunat je na osnovu promena optičke gustine na 360 nm od vremena 0 do 30 min.

[0032] Rezultati su prikazani na Slici 2.

(Jedna tekila upotrebljena kao uzorak (DJ1942) koja sadrži 40% etanola testirana je u pogledu efekata interferencije u testu bez alkoholne dehidrogenaze i nikotinamid adenin dinukleotida (NAD) i interferencija je prikazana.)

Primer 3 (referentni primer)

Efekat zrenja

[0033] Test sa kinuraminom upotrebljen je za testiranje tri tekile različite starosti, S40, S41, S42, i za upoređivanje vodenih i metilen hloridnih ekstrakata ovih uzoraka. Zrele tekile

1

pokazuju porast aktivnosti inhibicije MAO u poređenju sa mlađim destilatima, kako je pokazano na Slici 3.

Primer 4 (referentni primer)

Frakcionisanje aktivnosti inhibicije MAO

[0034] Tekila (1750 ml) razblaži se dejonizovanom vodom do 5000 ml, razdeli u tri porcije i svaka porcija se ekstrahuje dihlorometanom (4 x 100 ml). Ekstrakti se kombinuju, ispiraju dejonizovanom vodom (2 x 100 ml) i suše preko anhidrovanog natrijum sulfata. Zapremina uzorka se redukuje na 10 ml isparavanjem rastvarača uz korišćenje rotacionog isparivača, zatim se doda suvi silicijum i rastvarač se ukloni na sobnoj temperaturi. Silicijum natopljen uzorkom nanese se suvo na silicijumsku kolonu sa zapreminom ležišta od 50 ml i kolona se pušta sa postepenim gradijentom heksana:etil acetata (100% heksan, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80, 10:90, 100% etil acetat). Tokom propuštanja na koloni, sakupi se 7 ml frakcija. Uzorci se testiraju na sledeći način:

[0035] Testovi MAO A i B postavljaju se na crnim Thermo Scientific™ pločama sa 96 bunarčića (#7205) pri čemu svaki test sadrži 1 μl uzorka rastvorenog u DMSO, 87 μl 100 mM kalijum fosfatnog pufer pH 7.4, 3 μl stok rastvora 0.75 mM kinuramina. Set kontrola sa DMSO samim (0 inhibitora), 1 μl 50 μmolarnog klorgilina u DMSO kao kontrola inhibicije MAO A, i 1 μl 50 μmolarnog pargilina u DMSO kao kontrola inhibicije MAO B dodaju se na svaku ploču. Kada se testovi optimizuju, na ploče se ponekad uključi neproteinski set.

[0036] Rekombinantne humane MAO A i MAO B (Corning®, SUPERSOMES™) dodaju se u bunarčiće za svaki respektivni test pri 750 ng proteina u 9 μl pufera.

[0037] Ploča se inkubira na 37°C 30 minuta i zatim se u svaki bunarčić doda 100 μl 2 N NaOH. Ploča se očitava na fluorescentnom spektrofotometru pri talasnoj dužini ekscitacije od 310 i talasnoj dužini emisije 405.

[0038] Da bi se identifikovala inhibitorna aktivnost frakcija sa kolone, po 25 μl svake frakcije stavi se u epruvete za mikrocentrifugiranje zapremine 1.5 ml i izloži se isparavanju do suvog u Savant™ SpeedVac™. U svaku epruvetu se doda DMSO (5 μl) i 1 μl se testira u pogledu aktivnosti inhibixije MAO A i B u skladu sa gornjim metodom. Slika 4 prikazuje aktivnost sakupljenih frakcija u inhibiciji MAO A i B.

[0039] Značajna inhibicija MAO viđena je u frakcijama 6 do 13.

Primer 5 (referentni primer)

Pripremanje ulja koja sadrže inhibitor MAO

[0040] Tekila (100 ml) se dejonizovanom vodom razblaži do 200 ml i ekstrahuje dihlorometanom (3 x 50 ml). Ekstrakti se kombinuju i puštaju preko kolone od anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač isparava uz korišćenje rotacionog isparivača i dobija se 30 mg ulja. Uzorci ovog ulja su inhibirali MAO A za 75% i MAO B za 87%.

[0041] Tekila (100 ml) se dejonizovanom vodom razblaži do 200 ml i ekstrahuje dihlorometanom (3 x 50 ml). Ekstrakti se kombinuju i puštaju preko kolone od anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač se ukloni isparavanjem u Kuderna Danish uređaju, zagrejanom u vodenom kupatilu na 70 °C što rezultuje dobijanjem 17 mg ulja. Uzorci ulja pokazuju 55% inhibicije MAO A i 88% inhibicije MAO B.

Primer 6 (referentni primer)

Testiranje uzoraka različitih tekila, po sebi

[0042] Kako je gore bilo reči, uzorci sa aktivnošću inhibicije MAO ne smeju biti izloženi isparavanju pod sniženim pritiskom kako jedinjenja ne bi isparila zajedno sa etanolom. Prema tome, uzorci treba da budu testirani bez isparavanja etanola kako bi se eliminisao gubitak jedinjenja sa aktivnošću inhibicije MAO i sa ciljem pouzdanog gradiranja aktivnosti inhibicije MAO analiziranog proizvoda. Testovi su postavljeni na crnim Thermo Scientific™ pločama sa 96 bunarčića (#7205) na sledeći način:

[0043] Svaki test uključuje 5 μl uzorka, 0.975 μg kinuramin dihidrobromida, 0.75 μmol nikotinamid adenin dinukleotida (NAD) u ukupnoj zapremini od 93 μl, uz 100 mM fosfatom puferisani slani rastvor, pH 7.4.

[0044] Alkoholna dehidrogenaza se razblaži do 0.25 jedinica/ml i po 3 μl se doda u svaki bunarčić. Ploče se inkubiraju na 25 do 37 °C, 15 minuta.

[0045] Humane rekombinantne MAO A i B (Corning®) nabavljene u koncentraciji od 5 mg/ml alikvotiraju se u fiolama, 20 μl svaka, i razblaže za test korišćenjem 246 μl pufera, zatim se 4 μl svake MAO doda u odgovarajuće bunarčiće.

[0046] Ploče se inkubiraju na 37 °C 30 minuta, doda se 2 N NaOH (100 μl) i ploče se očitavaju pri talasnoj dužini ekscitacije 310 i talasnoj dužini emisije 405. Korišćenjem ovog testa, ispitivani su različiti uzorci tekila, a rezultati su prikazani u Tabeli 1.

Tabela 1

Ocene različitih pića poreklom od agave

Primer 7

Efekat reverzne osmoze (RO)

1

[0047] RO Mini proizvod Tangent Membranes, Inc. sa -100 mwco filterom upotrebljava se za izdvajanje etanola iz tekile, dok se jedinjenja koja inhibiraju MAO zadržavaju. Ovde se 1.5 litara añejo tekile (DJA) razblaži destilovanom vodom do 15 litara i cirkuliše u RO Mini dok se zapremina ne smanji ponovo na 1.5 litara. Aktivnost inhibicije MAO procenjuje se u 10, 20, 30 i 40 μl koncentrovanog uzorka i filtrata (Slika 5).

[0048] Kako je pokazano na Slici 5, inhibitori MAO A i B zadržali su se u koncentratu, dok nisu bili prisutni u filtratu koji je sadržao samo etanol i vodu iz razblaženog uzorka.

[0049] Tabela 2 prikazuje rezultate dobijene za različita pića, kao i za razblažene tekile kao polazne materijale (obeleženo kao razblažena RO kontrola), 1. RO koncentrat, 2. RO koncentrat, 1. RO filtrat i 2. RO filtrat. Za filtrate je u testovima inhibicije MAO prikazano da imaju manju inhibitornu aktivnost, dok se većina aktivnosti zadržava u koncentratu.

Tabela 2

Claims (9)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Kompozicija, naznačena time, što uključuje jedinjenja koja su inhibitori monoamino oksidaze (MAO), kompozicija se priprema uklanjanjem etanola iz destilovanog alkoholnog napitka dobijenog od agave, pomenuto uklanjanje etanola dešava se procesom kojim se zadržavaju isparljiva jedinjenja različita od etanola, proces je reverzna osmoza ili tehnologija kolone sa rotirajućim konusom.

2. Kompozicija iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što je destilovano alkoholno piće destilat pripremljen:

a) grejanjem stabala kaktusa agave da bi se hidrolizovali kompleksni šećeri; b) sečenjem i drobljenjem zagrejanih stabala da bi se oslobodio sirup;

c) razblaživanjem pomenutog sirupa vodom do nivoa 12-14 BRIX i inokulisanjem kavascem;

d) fermentisanjem inokulisanog razblaženog sirupa da se dobije proizvod fermentacije; i

e) destilovanjem proizvoda fermentacije da se dobije destilat.

3. Kompozicija iz patentnog zahteva 2, naznačena time, što se korak a) izvodi autoklaviranjem.

4. Kompozicija iz patentnog zahteva 2, naznačena time, što se korak b) izvodi u mlinu za sečenje i drobilici.

5. Kompozicija iz patentnog zahteva 2, naznačena time, što korak d) uključuje fermentaciju na temperaturi između sobne i 30 °C u prisustvu S. cerevisiae i K. africana.

6. Kompozicija iz patentnog zahteva 2, naznačena time, što se korak e) izvodi dok koncentracija alkohola u destilatu ne bude najmanje 38-40% v/v.

7. Prehrambeni proizvod ili piće, naznačeni time, što uključuju kompoziciju iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2.

8. Kompozicija definisana u patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, ili prehrambeni proizvod ili piće definisani u patentnom zahtevu 7 za upotrebu u lečenju stanja koja se karakterišu povećanom aktivnošću monoamino oksidaze (MAO).

9. Kompozicija, prehrambeni proizvod ili piće za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, naznačeni time, što su pomenuta stanja depresija ili Parkinsonova bolest.

1