ES2821441T3 - Inhibidores de cinasa 1 asociada con adaptador, composiciones que los comprenden y métodos para usarlos - Google Patents

Abstract

Un compuesto, que es 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3- metiloxetan-3-ilo: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de cinasa 1 asociada con adaptador, composiciones que los comprenden y métodos para usarlos

1. CAMPO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a un compuesto a base de pirazolo[1,5-a]pirimidina útil como un inhibidor de cinasa 1 asociada con adaptador (AAK1), y composiciones que la comprenden.

2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La cinasa 1 asociada con adaptador (AAK1) es un miembro de la familia Ark1/Prk1 de serina/treonina cinasas. El ARNm de AAK1 existe en dos formas de corte y empalme denominadas corta y larga. La forma predominante es la larga y se expresa abundantemente en el cerebro y el corazón (Henderson y Conner, Mol. Biol. Cell. 2007, 18, 2698­ 2706). AAK1 se enriquece en preparaciones sinaptosómicas y se localiza junto con estructuras endocíticas en células cultivadas. AAK1 modula la endocitosis recubierta de clatrina, un proceso que es importante en el reciclaje de vesículas sinápticas y en la endocitosis mediada por receptor. AAK1 se asocia con el complejo AP2, un heterotetrámero que une la carga del receptor al recubrimiento de clatrina. La unión de la clatrina a AAK1 estimula la actividad cinasa de AAK1 (Conner et al., Traffic 2003, 4, 885-890; Jackson et. al., J. Cell. Biol. 2003, 163, 231-236). AAK1 fosforila la subunidad mu-2 de AP-2, que promueve la unión de mu-2 a los motivos de clasificación que contienen tirosina en los receptores de carga (Ricotta et al., J. Cell Bio. 2002, 156, 791-795; Conner y Schmid, J. Cell Bio. 2002, 156, 921-929). No es necesaria la fosforilación de Mu2 para la captación por el receptor, pero su fosforilación potencia la eficacia de la internalización (Motely et. al., Mol. Biol. Cell. 2006, 17, 5298-5308).

Se ha identificado a AAK1 como un inhibidor de la señalización de neurregulina-1/ERbB4 en células PC12. La pérdida de expresión de AAK1 mediante silenciamiento génico mediado por interferencia de ARN o tratamiento con el inhibidor de cinasa K252a (que inhibe la actividad cinasa de AAK1) da como resultado la potenciación del recrecimiento de neuritas inducido por neurregulina-1. Estos tratamientos dan como resultado una expresión aumentada de ErbB4 y una acumulación de ErbB4 en o próxima a la membrana plasmática (Kuai et. al., Chemistry and Biology 2011, 18, 891­ 906). NRG1 y ErbB4 son supuestos genes de susceptibilidad a la esquizofrenia (Buonanno, Brain Res. Bull. 2010, 83, 122-131). Se han asociado SNP en ambos genes con múltiples endofenotipos de esquizofrenia (Greenwood et. al., Am. J. Psychiatry 2011, 168, 930-946). Algunos modelos de ratón KO para neurregulina 1 y ErbB4 han demostrado cambios morfológicos para la esquizofrenia y fenotipos conductuales relevantes (Jaaro-Peled et. al., Schizophrenia Bulletin 2010, 36, 301-313; Wen et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107, 1211-1216). Además, se ha asociado un polimorfismo de un único nucleótido en un intrón del gen AAK1 con la edad de aparición de la enfermedad de Parkinson (Latourelle et. al., BMC Med. Genet. 2009, 10, 98). Estos resultados sugieren que la inhibición de la actividad de AAK1 puede tener utilidad en el tratamiento de la esquizofrenia, los déficits cognitivos en la esquizofrenia, enfermedad de Parkinson, trastorno bipolar y enfermedad de Alzheimer. El documento WO2013/134228 divulga 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de oxetan-3-ilo útil como un inhibidor de cinasa 1 asociada con adaptador.

3. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Esta invención incluye 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo:

y sales farmacéuticamente aceptables y formas sólidas (por ejemplo, formas cristalinas) del mismo. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto también están incluidas en la invención.

Los compuestos y composiciones de la invención también se proporcionan para su uso en el tratamiento y gestión de enfermedades y trastornos mediados por la actividad de AAK1. Se cree que ejemplos de dichas enfermedades y trastornos incluyen enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson y esquizofrenia (incluyendo los déficits cognitivos en la esquizofrenia).

4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

En las figuras se ilustran algunos aspectos de la invención.

La figura 1 muestra los resultados obtenidos a partir de un modelo de dolor con formalina usando ratones knockout AAK1 homocigotos (-/-) y sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+). Los ratones knockout AAK1 homocigotos (-/-) muestran una clara reducción tanto en la respuesta al dolor agudo como tónico en comparación con sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+).

La figura 2 proporciona un espectro de difracción de rayos X de 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo cristalino. El difractograma se obtuvo utilizando un PANalytical X'Pert PRO (radiación Cu Ka) con un detector PIXcel Medipix2 (40 mA, 45 kV; tamaño de etapa de 0,0260 °20). La figura 3 muestra los datos de la fase de formalina 1 obtenidos para 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo en ratones C57 macho, con dosis de 1,3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo.

La figura 4 muestra datos de fase de formalina 2 obtenidos para el compuesto en ratones C57 macho, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo.

La figura 5 proporciona una representación de un gráfico de barras de los datos que se muestran en la figura 4. La figura 6 muestra el efecto dependiente de la dosis del compuesto en el ensayo de Chung de ratón.

5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los ratones con supresión génica de AAK1 muestran una elevada resistencia al dolor. Este descubrimiento propició una investigación que en última instancia, dio lugar al descubrimiento de inhibidores de AAK1, composiciones que los comprenden y métodos para usarlos.

5.1. DEFINICIONES

A menos que se indique otra cosa, las expresiones "compuestos de la invención", "compuestos de la presente divulgación", y similares se refieren a compuestos divulgados en el presente documento.

A menos que se indique otra cosa, el término "incluir" tiene el mismo significado que "incluyen, pero sin limitación", y el término "incluye" tiene el mismo significado que "incluye, pero sin limitación". De forma similar, la expresión "tal como" tiene el mismo significado que el término "tal como, pero sin limitación".

A menos que se indique otra cosa, los términos "gestionar", "que gestiona" y "gestión" incluyen la prevención de la recurrencia de la enfermedad o trastorno especificado en un paciente que ya ha padecido la enfermedad o trastorno, y/o la prolongación del tiempo que un paciente que ha padecido la enfermedad o trastorno permanece en remisión. Los términos incluyen la modulación del umbral, el desarrollo y/o la duración de la enfermedad o trastorno, o cambiar la forma en que un paciente responde a la enfermedad o trastorno.

A menos que se indique otra cosa, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de una enfermedad o afección o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados con la enfermedad o afección. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto se refiere a una cantidad de agente terapéutico, en solitario o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de la enfermedad o afección. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" puede incluir una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita síntomas o causas de una enfermedad o afección o mejora la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.

A menos que se indique otra cosa, los términos "tratar", "que trata" y "tratamiento" contemplan una acción que se produce mientras un paciente padece la enfermedad o trastorno especificado, que reduce la gravedad de la enfermedad o trastorno, o retarda o ralentiza la progresión de la enfermedad o trastorno.

5.2. COMPUESTOS

Esta invención incluye 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo:

y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Esta invención incluye además formas cristalinas de 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo. En una realización, una forma cristalina tiene un punto de fusión de aproximadamente 182,5 °C según se determina mediante calorimetría diferencial de barrido. En este contexto, el término "aproximadamente" significa ± 2,0 grados centígrados.

En una realización, una forma cristalina del compuesto proporciona un patrón de difracción de polvo de rayos X (XRPD) que contiene picos en uno o más de aproximadamente 12,7, 14,8, 18,7, 19,0, 19,7 y/o 25,1 grados 20 cuando se obtiene utilizando radiación Cu Ka. En este contexto, el término "aproximadamente" significa ± 0,2 grados 20. Como conocen los expertos en la técnica, las intensidades relativas de los picos en un patrón de XRPD pueden variar dependiendo de cómo se prepara la muestra y cómo se recopilan los datos. Con esto en mente, en la figura 2 se proporciona un ejemplo de un patrón de XRPD de esta forma.

Los compuestos de la invención pueden existir en diferentes formas conformacionales estables, que pueden ser separables. La asimetría de torsión debida a rotación restringida alrededor de un enlace simple asimétrico, por ejemplo debida a impedimento estérico o tensión en el anillo, puede permitir la separación de los diferentes confórmeros. La presente divulgación incluye cada isómero conformacional de estos compuestos y sus mezclas.

Esta invención incluye isotopómeros, o isómeros isotópicos, de los compuestos divulgados en el presente documento, en los que los isótopos de uno o más átomos dentro de un compuesto son diferentes de los que se encuentran de forma natural o general. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio y tritio. Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos de la invención marcados isotópicamente se pueden preparar mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica (por ejemplo, utilizando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado empleado de otro modo). Dichos compuestos pueden tener una diversidad de usos potenciales, por ejemplo, como patrones y reactivos para determinar la actividad biológica. En el caso de los isótopos estables, dichos compuestos pueden tener el potencial de modificar favorablemente las propiedades biológicas, farmacológicas o farmacocinéticas.

Los compuestos de esta invención pueden existir como sales farmacéuticamente aceptables. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, representa sales o formas de iones híbridos de los compuestos de la presente divulgación que son solubles o dispersables en agua o aceite, que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable y son eficaces para su uso previsto. Pueden prepararse las sales durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos o por separado haciendo reaccionar un átomo de nitrógeno adecuado con un ácido adecuado. Las sales de adición de ácido representativas incluyen acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato; digluconato, dibromidrato, diclorhidrato, diyodhidrato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, formiato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, mesitilensulfonato, metansulfonato, naftilensulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tricloroacetato, trifluoroacetato, fosfato, glutamato, bicarbonato, paratoluensulfonato y undecanoato. Los ejemplos de ácidos que se pueden emplear para formar sales de adición farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico, y ácidos orgánicos tales como ácido oxálico, maleico, succínico y cítrico.

Las sales de adición básicas pueden prepararse durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos haciendo reaccionar un grupo carboxi con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico o con amonio o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Los cationes de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, así como cationes de aminas cuaternarias tales como amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, tributilamina, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina, y N,N'-dibenciletilendiamina. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina y piperazina.

5.3. MÉTODOS DE USO

Esta invención se refiere a métodos para inhibir la cinasa 1 asociada con adaptador (AAK1) tanto in vitro como in vivo, que comprenden poner en contacto AAK1 con un compuesto de la invención.

La invención también se refiere a métodos para tratar y gestionar enfermedades y trastornos mediados por la actividad de AAK1. Las enfermedades y trastornos mediados por la actividad de AAK1 son enfermedades y trastornos que tienen al menos un síntoma, cuya gravedad o manifestación se ve afectada por la actividad de AAK1. Se cree que los ejemplos de dichas enfermedades y trastornos incluyen enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson y esquizofrenia (incluyendo los déficits cognitivos en la esquizofrenia). Los métodos particulares comprenden administrar a un paciente (un ser humano u otro mamífero) que lo necesite una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención.

Esta invención también se refiere a un método para tratar o controlar una enfermedad o trastorno, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención, en el que la enfermedad o trastorno es enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson o esquizofrenia (incluyendo los déficits cognitivos en la esquizofrenia). Los tipos particulares de dolor incluyen dolor crónico, dolor agudo y dolor neuropático. Los tipos particulares de dolor neuropático incluyen fibromialgia y neuropatía periférica (por ejemplo, neuropatía diabética).

Cuando se usan para tratar o gestionar una enfermedad o trastorno, los compuestos de la invención se administran preferiblemente como parte de una composición farmacéutica que comprende uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones, o formulaciones, farmacéuticas pueden presentarse en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de principio activo por dosis unitaria. Niveles de dosificación de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 250 miligramos ("mg/kg") de peso corporal por día, preferiblemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día de los compuestos de la presente divulgación son típicos en una monoterapia para la prevención y tratamiento de una enfermedad. Típicamente, las composiciones farmacéuticas de esta divulgación se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces al día o como alternativa, como una infusión continua. Dicha administración se puede utilizar como terapia crónica o aguda. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales vehículos para producir una forma farmacéutica unitaria variarán dependiendo de la afección que se esté tratando, la gravedad de la dolencia, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción del compuesto empleado, la duración del tratamiento y de la edad, el género, el peso y el estado del paciente. Las formulaciones farmacéuticas unitarias preferidas son las que contienen una dosis o una subdosis diaria, como se ha citado anteriormente en el presente documento o una fracción adecuada de la misma, de un principio activo. El tratamiento puede iniciarse con pequeñas dosis sustancialmente menores que la dosis óptima del compuesto. Posteriormente, se aumenta la dosis en aumentos pequeños hasta que se alcanza el efecto óptimo en las circunstancias dadas. En general, el compuesto se administra de forma más deseable a un nivel de concentración que proporcionará generalmente resultados eficaces sin producir ningún efecto secundario perjudicial o dañino.

Los compuestos de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales. Por ejemplo, cuando se usan para el tratamiento del dolor, los posibles agentes adicionales incluyen agentes inmunosupresores y antiinflamatorios.

Los inmunosupresores adecuados para su uso en los métodos y composiciones de esta invención incluyen los conocidos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen aminopterina, azatioprina, ciclosporina A, D-penicilamina, sales de oro, hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato, minociclina, rapamicina, sulfasalazina, tacrolimus (FK506) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un inmunosupresor particular es el metotrexato.

Ejemplos adicionales incluyen anticuerpos anti-TNF, tales como adalimumab, certolizumab pegol, etanercept e infliximab. Otros incluyen bloqueantes de interleucina-1, tales como anakinra. Otros incluyen anticuerpos anti-linfocitos B (CD20), tales como rituximab. Otros incluyen bloqueadores de la activación de linfocitos T, tales como abatacept.

Ejemplos adicionales incluyen los inhibidores de la inosina monofosfato deshidrogenasa, tales como micofenolato mofetilo (CellCept®) y ácido micofenólico (Myfortic®).

Los fármacos antiinflamatorios adecuados para su uso en los métodos y composiciones de esta invención incluyen los conocidos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen glucocorticoides y AINE.

Ejemplos de glucocorticoides incluyen aldosterona, beclometasona, betametasona, cortisona, desoxicorticosterona, dexametasona, fludrocortisonas, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Ejemplos de AINE incluyen salicilatos (por ejemplo, aspirina, amoxiprina, benorilato, salicilato de magnesio y colina, diflunisal, faislamina, salicilato de metilo, salicilato de magnesio, salicilato de salicilo y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), ácidos arilalcanoicos (por ejemplo, diclofenaco, aceclofenaco, acemetacina, bromfenaco, etodolaco, indometacina, nabumetona, sulindaco, tolmentina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), ácidos arilpropiónicos (por ejemplo, ibuprofeno, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, ketorolaco, loxoprofeno, naproxeno, oxaprozina, ácido tiaprofénico, suprofeno y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), ácidos arilantranílicos (por ejemplo, ácido meclofenámico, ácido mefenámico y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), derivados de pirazolidina (por ejemplo, azapropazona, metamizol, oxifenbutazona, fenilbutazona, sulfinprazona y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), oxicams (por ejemplo, lornoxicam, meloxicam, piroxicam, tenoxicam y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, parecoxib, rofecoxib, valdecoxib y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), y sulfonanilidas (por ejemplo, nimesulida y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos).

Otros agentes usados en el tratamiento del dolor (incluyendo, pero sin limitación, dolor neuropático y dolor inflamatorio) incluyen agentes tales como pregabalina, lidocaína, duloxetina, gabapentina, carbamazepina, capsaicina y otros inhibidores de la recaptación de serotonina/norepinefrina/dopamina y opiáceos (tales como oxicontina, morfina y codeína).

En el tratamiento del dolor provocado por una enfermedad o afección conocida, tal como diabetes, infección (por ejemplo, herpes zóster o infección por VIH) o cáncer, los compuestos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales dirigidos a la enfermedad o afección subyacente. Por ejemplo, cuando se usan para tratar la neuropatía diabética, los compuestos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes antidiabéticos, agentes antihiperglucemiantes, agentes hipolipidémicos/reductores de lípidos, agentes antiobesidad, agentes antihipertensivos y supresores del apetito. Algunos ejemplos de agentes antidiabéticos incluyen biguanidas (por ejemplo, metformina, fenformina), inhibidores de glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol), insulinas (incluyendo secretagogos de la insulina y sensibilizantes de la insulina), meglitinidas (por ejemplo, repaglinida), sulfonilureas (por ejemplo, glimepirida, gliburida, gliclazida, clorpropamida y glipizida), combinaciones de biguanida/gliburida (por ejemplo, glucovance), tiazolidinadionas (por ejemplo, troglitazona, rosiglitazona y pioglitazona), agonistas PPAR-alfa, agonistas de PPAR-gamma, agonistas de PPAR alfa/gamma duales, inhibidores de glucógeno fosforilasa, inhibidores de proteína de unión a ácidos grasos (aP2), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) u otros agonistas del receptor de GLP-1, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DPP4), e inhibidores del cotransportador 2 de sodio-glucosa (SGLT2) (por ejemplo, dapagliflozina, canagliflozina y LX-4211).

5.4. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

Las formulaciones farmacéuticas pueden adaptarse para su administración por cualquier vía adecuada, por ejemplo, mediante la ruta oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual, o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intracutánea, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, intravenosa, o inyecciones o infusiones intradérmicas). Dichas formulaciones pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, asociando el principio activo con los vehículos o excipientes. Se prefieren la administración oral o la administración por inyección.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración oral pueden presentarse como unidades individuales, tales como cápsulas o comprimidos; polvos o gránulos; soluciones o suspensiones en líquidos acuosos o no acuosos; espumas o batidos comestibles; o emulsiones líquidas de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula, el componente de fármaco activo puede combinarse con un vehículo inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable, tal como etanol, glicerol, agua y similares. Los polvos se prepararon triturando el compuesto hasta un tamaño fino adecuado y mezclándolo con un vehículo farmacéutico triturado de forma similar tal como un hidrato de carbono comestible, tal como, por ejemplo, almidón o manitol. Puede estar también presente un agente saporífero, conservante, dispersante, y colorante.

Las cápsulas se producen preparando una mezcla en polvo, como se ha descrito anteriormente y rellenando vainas de gelatina formadas. Se pueden añadir agentes deslizantes y lubricantes tales como sílice coloidal, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio, o polietilenglicol sólido a la mezcla de polvo antes de la operación de relleno. Se puede añadir también un agente disgregante o solubilizante tal como agar-agar, carbonato de calcio, o carbonato de sodio para mejorar la disponibilidad del medicamento cuando se ingiere la cápsula.

Además, cuando se desee o sea necesario, se pueden incorporar también aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados en la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y similares. Los lubricantes usados en estas formas de dosificación incluyen oleato sódico, cloruro de sodio y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma de xantano y similares. Los comprimidos se formulan, por ejemplo, preparando una mezcla de polvo, granulando o aglomerando, añadiendo un lubricante y disgregante y prensando para formar comprimidos. Se preparó una mezcla pulverulenta mezclando el compuesto, triturado de forma adecuada, con un diluyente o base como se ha descrito anteriormente, y opcionalmente, con un aglutinante tal como una carboximetilcelulosa, un alginato, gelatina, o polivinilpirrolidona, una solución retardante tal como parafina, un acelerador de la resorción tal como una sal cuaternaria y/o un agente de absorción tal como bentonita, caolín, o fosfato dicálcico. La mezcla en polvo puede granularse humedeciéndola con un aglutinante, tal como un jarabe, pasta de almidón, mucílago de acacia o soluciones de materiales celulósicos o poliméricos y forzándola a pasar a través de un tamiz. Como una alternativa a la granulación, la mezcla pulverulenta se puede procesar a través de la empastilladora y el resultado son piezas brutas formadas imperfectamente rotas en gránulos. Los gránulos pueden lubricarse para impedir que se adhieran a los moldes para la formación de comprimidos mediante la adición de ácido esteárico, una sal de estearato, talco o aceite mineral. A continuación, la mezcla lubricada se comprime formando comprimidos. Los compuestos de la presente divulgación también pueden combinarse con un vehículo inerte de flujo libre y se comprimen en forma de comprimidos directamente sin pasar por los pasos de granulación o aglomeración. Se puede proporcionar un revestimiento protector transparente u opaco que consiste de un revestimiento sellador de goma laca, un revestimiento de azúcar o material polimérico, y un revestimiento de cera pulida. Se pueden añadir colorantes a estos revestimientos para distinguir diferentes dosificaciones unitarias.

Se pueden preparar fluidos orales tales como soluciones, jarabes, y elixires en formas farmacéuticas unitarias de tal manera que una cantidad dada contiene una cantidad predeterminada del compuesto. Se pueden preparar jarabes disolviendo el compuesto en una solución acuosa aromatizada adecuada, mientras que los elixires se preparan mediante el uso de un vehículo no tóxico. Pueden añadirse también solubilizantes y emulsionantes tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados y éteres de sorbitol polioxietilenado, conservantes, aditivos saporíferos tales como aceite de menta piperita o edulcorantes naturales, o sacarina u otros edulcorantes artificiales, y similares.

Cuando sea adecuado, las formulaciones farmacéuticas unitarias para la administración oral pueden microencapsularse. La formulación también puede prepararse para prolongar o mantener la liberación, tal como, por ejemplo, recubriendo o incluyendo el material en partículas en polímeros, cera o similares.

Los compuestos de la invención pueden administrarse en forma de sistemas de administración de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden formarse a partir de una variedad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

Los compuestos de la invención también pueden administrarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los que se acoplan las moléculas compuestas. Los compuestos también pueden acoplarse con polímeros solubles como vehículos farmacológicos direccionables. Dichos polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamidafenol, polihidroxietilaspartamidafenol o polietilenoxidopolilisina sustituidos con restos de palmitoílo. Además, los compuestos pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr una liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloque de hidrogeles reticulados o anfipáticos.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden presentarse como parches individuales previstos para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo prolongado de tiempo. Por ejemplo, el principio activo puede suministrarse a través del parche mediante iontoforesis, tal como se describe de manera general en Pharmaceutical Research 1986, 3(6), 318.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica pueden formularse como pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles o aceites.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden presentarse como supositorios o como enemas.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal en las que el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrómetros, que se administra por aspiración por la nariz, es decir, mediante inhalación rápida a través de las fosas nasales a partir de un envase con el polvo sujetado cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en donde el vehículo es un líquido, para su administración como aerosol nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas o soluciones oleosas del principio activo.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para su administración por inhalación incluyen partículas finas de polvo o nebulizaciones, que se pueden generar por medio de diversos tipos de aerosoles presurizados de dosis medida, nebulizadores, o insufladores.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario previsto; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en contenedores monodosis o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados, y pueden almacenarse en un estado criodesecado (liofilizado) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.

Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, los adecuados para la administración oral pueden incluir agentes saporíferos.

5.5. EJEMPLOS

5.5.1. Ratones Knockout AAK1

Los ratones homocigotos (-/-) para la alteración del gen AAK1 se prepararon mediante dos métodos; captura génica y recombinación homóloga.

La captura génica es un método de mutagénesis de inserción aleatoria que utiliza un fragmento de ADN que codifica un gen informador o marcador seleccionable como mutágeno. Los vectores de captura génica se han diseñado para integrarse en intrones o genes de una manera que permite que la maquinaria de corte y empalme celular corte y empalme los exones codificados en vectores con los ARNm celulares. De manera habitual, los vectores de captura génica contienen secuencias de marcadores seleccionables que están precedidas por secuencias aceptoras de corte y empalme fuertes y no están precedidas por un promotor. Por lo tanto, cuando dichos vectores se integran en un gen, la maquinaria de corte y empalme celular corta y empalma los exones del gen atrapado en el extremo 5' de la secuencia del marcador seleccionable. Típicamente, dichos genes marcadores seleccionables solo pueden expresarse si el vector que codifica el gen se ha integrado en un intrón. Los eventos de captura génica resultantes se identifican posteriormente mediante la selección de células que pueden sobrevivir al cultivo selectivo.

Las células madre embrionarias (células Lex-1 de la cepa murina A129 derivada) se mutaron mediante un proceso que implica la inserción de al menos una porción de una secuencia de vector genéticamente modificada en el gen de interés, las células madre embrionarias mutadas se microinyectaron en blastocistos que posteriormente se introdujeron en huéspedes pseudopreñados femeninos y se llevaron a término utilizando métodos establecidos. Véase, por ejemplo, "Mouse Mutagenesis", 1998, Zambrowicz et al., eds., Lexicon Press, The Woodlands, TX. Los animales quiméricos resultantes se criaron posteriormente para producir descendientes capaces de la transmisión de la línea germinal de un alelo que contiene la mutación diseñada en el gen de interés.

Los ratones con alteración del gen AAK1 también se hicieron por recombinación homóloga. En este caso, el segundo exón codificante del gen AAK1 murino (véase Número de Acceso GenBank NM_177762) se eliminó mediante métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 5.487.992, 5.627.059, y 5.789.215.

Se estudiaron ratones homocigotos (-/-) para la alteración del gen AAK1 junto con ratones heterocigotos (+/-) para la alteración del gen AAK1 y compañeros de camada de tipo silvestre (+/+). Durante este análisis, los ratones se sometieron a un tratamiento médico utilizando un conjunto integrado de procedimientos de diagnóstico médico diseñados para evaluar la función de los principales sistemas de órganos en un sujeto mamífero. Se estudiaron ratones "knockout" homocigotos (-/-) junto con sus compañeros de camada heterocigotos (+/-) y de tipo silvestre (+/+). La alteración del gen AAK1 se confirmó por análisis Southern. La expresión del homólogo murino de AAK1 se detectó mediante RT-PCR en cerebro murino; médula espinal; ojo; timo; bazo; pulmón; riñón; hígado; músculo esquelético; hueso; estómago, intestino delgado y colon; corazón; tejido adiposo; pulmón asmático; hígado LPS; sangre; corazón con banda; árbol aórtico; próstata; y glándula mamaria (virgen de 5 semanas, virgen madura, 12 DPC, 3 días postparto (lactante), 3 días después del destete (involución temprana), y 7 días después del destete (involución tardía).

Los AAK1 homocigotos (-/-) y sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+) se probaron utilizando la prueba de la pata con formalina descrita a continuación en el Ejemplo 5.5.6 para evaluar sus respuestas nociceptivas agudas y tónicas.

Como se muestra en la Figura 1, los datos de fase 1 y fase 2 se obtuvieron utilizando ratones homocigotos (-/-) hembra (n = 16), hembras de tipo silvestre (n = 15), ratones homocigotos (-/-) macho (n = 9) y machos de tipo silvestre (n = 18). En todos los grupos y en ambas fases, los ratones AAK1 homocigotos (-/-) mostraron un retroceso de pata registrado significativamente menor que sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+).

5.5.2. Síntesis de 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo

Parte A. 3-bromo-5-cloropirazolo[1,5-a1pirimidina. A una mezcla de 5-cloropirazolo[1,5-a]pirimidina (30 g, 195 mmol) en acetonitrilo (600 ml) se le añadió N-bromosuccinimida (38,3 g, 215 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El producto sólido se eliminó por filtración y se lavó con NaOH 1 N y agua. El filtrado de acetonitrilo y todos los lavados se concentraron al vacío y se suspendieron en NaOH 1 N. El producto sólido se filtró y se lavó con agua. Este producto se combinó con un sólido anterior y se secó durante una noche para obtener 44,2 g de 3-bromo-5-cloro-pirazolo[1,5-a]pirimidina. LRMS (ESI) m/z 232/234 [(M+H)]+, calc. para C⁶H³BrClN³ : 232,47. LCMS (M+1, patrón de bromo) = 233. 1H RMN (400 MHz, CDCh) 8: 6,82 (d, 1H), 8,15 (s ancho, 1H), 8,58 (d, 1H).

Parte B. 3-Bromo-5-Íp¡peraz¡n-1-¡l)p¡razolori.5-alp¡rim¡d¡na. A una solución de 3-bromo-5-cloropirazolo (1,5-a)pirimidina (25 g, 0,107 mol) en 1,4-dioxano (500 ml) se le añadió trietilamina (43 g, 0,43 mol), seguido de piperazina (28 g, 0,322 mol). La mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante 4 h. Después de la finalización de la reacción, se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua. La capa de agua se extrajo de nuevo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfate de sodio y se evaporó para obtener 35 g de 3-bromo-5-(piperazin-1-¡l)p¡razolo(1,5-a)p¡rim¡d¡na en bruto. El producto pudo recristalizarse en metanol pero generalmente se usó sin purificación adicional. 1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 82,74-2,81 (m, 4H), 3,55-3,69 (m, 4H), 6,75 (d, J=7,83 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 8,62 (d, J=7,83 Hz, 1H). 13C RMN (100 MHz, DMSO-cfe) 8 ppm 41,25, 42,16, 77,73, 97,78, 136,77, 144,01, 144,18, 155,53. LRMS (ESI) m/z 282,0/284,0 [(M+H)]+, calc. para CujH^BrNa: 282,14.

Parte C. 3-(2-metox¡p¡r¡d¡n-3-¡l)-5-(p¡peraz¡n-1-¡l)p¡razolo[1.5-alp¡r¡m¡d¡na. La 3-bromo-5-(piperazin-1-¡l)p¡razolo[1,5-a]pir¡m¡d¡na (3,00 g, 10,64 mmol), ácido (2-metoxip¡r¡d¡n-3-¡l)borónico (2,44 g, 15,96 mmol) y bis(di-terc-but¡l(4-dimet¡lam¡nofen¡l)fosf¡na)dicloropalad¡o (II) (0,23 g, 0,32 mmol) se pesaron en un matraz de fondo redondo de 200 ml. A continuación, se añadieron 60 ml de dioxano, seguido de la adición de 30 ml de agua y después trietilamina (7,40 ml, 53,19 mmol). La mezcla resultante se calentó a 85 °C, después de 1,5 h, la reacción se completó. A continuación, se concentró a sequedad en el evaporador rotatorio. El residuo sólido se suspendió en agua y el pH se ajustó a aproximadamente 2 usando HCI. Se hicieron tres extracciones con EtOAc para eliminar las impurezas. A continuación, el pH se ajustó a aproximadamente 8 usando NaOH. La suspensión se enfrió en un baño de hielo durante aproximadamente 1 h para mejorar la precipitación del producto deseado. El sólido se filtró y se secó para obtener 2,74 g (83 %) del compuesto del título en forma de un sólido de color amarillo pálido. 1H RMN (400 MHz, METANOL- d4) 5 ppm 2,92 - 3,07 (m, 4 H), 3,72 - 3,84 (m, 4 H), 4,08 (s, 3 H), 6,73 (d, J=8,03 Hz, 1 H), 7,04 (dd, J=7,53, 5,02 Hz, 1 H), 7,95 (dd, J=4,89, 1,88 Hz, 1 H), 8,46 (d, J=8,03 Hz, 1 H), 8,53 (s, 1 H), 8,89 (dd, J=7,53, 1,76 Hz, 1 H). LRMS (ESI) m/z 311,1 [(M+H)]+, calc. para C16H1sN6O:310,4.

Parte D. (4-N¡trofenil)carbonato de 3-metiloxetan-3-ilo. La 3-oxetanona (7,00 g, 97,22 mol) disuelta en 200 ml de THF en un matraz de fondo redondo de 500 ml se enfrió a -20 °C mientras se agitó sobre nitrógeno. A continuación, se añadieron lentamente 34,0 ml (105,08 mmol) de bromuro de metilmagnesio (solución en éter 3 M) durante un periodo de 15 minutos. (La reacción se vuelve espesa y es un poco difícil de agitar). Se eliminó el baño de enfriamiento, y la reacción se dejó agitar y calentar a ta. Después de 2,5 h, la reacción se enfrió a 0 °C, y se inactivó mediante la adición lenta de 100 ml de NH⁴Cl ac. saturado y posteriormente se añadieron algunas gotas de HCI 1 N para ajustar el pH a aproximadamente 6. Se extrajo dos veces con porciones de 200 ml de DCM. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴. Se filtró y se concentró en el evaporador rotatorio sin calor. Se obtuvo un aceite, 6,19 g, que contenía el 81 % del producto deseado y se obtuvo el 19 % de THF basándose en un análisis de RMN de protón. Se estimó que el rendimiento de la reacción era (5,14 gramos) del 60 %. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 1,58 (s, 3H), 4,49 (d, J=7,28 Hz, 2H), 4,63 (d, J=6,53 Hz, 2H).

4,32 g de 3-metil-oxetan-3-ol (81 % p/p en THF, 39,77 mmol) disuelto en 40 ml de DCM se enfrió a 0 °C. Se añadió la piridina, seguido de la adición del cloroformiato de 4-nitrofenilo en pequeñas porciones durante un periodo de 10 minutos. La solución se volvió turbia y se eliminó el baño de hielo, y se dejó que continuara la agitación en una atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. Después de 1 h, se obtuvo una solución de color amarillo transparente. La reacción se interrumpió con agua y se extrajo dos veces con DCM. La capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre MgSO⁴, y se concentró. Se cargó en una columna 330 usando un pequeño volumen de DCM y se sometió a separación en la ISCO usando solo DCM como disolvente para obtener 6,2 g (61 %) del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 81,86 (s, 3H), 4,57 (d, J=8,03 Hz, 2H), 4,90 (d, J=7,53 Hz, 2H), 7,41 (d, J=6,51 Hz, 2H), 8,31 (d, J=6,42 Hz, 2H).

Parte E. 4-(3-(2-Metox¡r¡d¡n-3-¡l)p¡razolo[1.5-alp¡r¡m¡d¡n-5-¡l)p¡peraz¡n-1-carbox¡lato de 3-metiloxetan-3-ilo. A una mezcla de metox¡-p¡r¡d¡n-3-¡l)-5-p¡peraz¡n-1-¡l-p¡razolo[1,5-a]p¡r¡m¡d¡na (1 g, 3,22 mmol) y (4-nitrofenil)carbonato de 3-metiloxetan-3-ilo (979 mg, 3,87 mmol) en acetonitrilo se le añadió DIEA (2,24 ml, 12,9 mmol). La mezcla se agitó a temp. ambiente durante 6 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 50 ml de NaOH 1 N y se filtró. El sólido se lavó con NaOH 1 N, agua y heptano. El producto se recristalizó en dioxano: agua y después se recristalizó de nuevo en acetonitrilo para proporcionar 950 mg de 4-(3-(2-metox¡p¡r¡d¡n-3-¡l)p¡razolo[1,5-a]p¡r¡mid¡n-5-¡l)p¡peraz¡n-1-carbox¡lato de 3-metiloxetan-3-ilo. 1H RMN (700 MHz, DMSO-d6) 81,67 (s, 3H), 3,52 (s a, 2H), 3,58 (s a, 2H), 3,80 (s a, 4H), 4,01 (s, 3H), 4,43 (d, J=7,06 Hz, 2H), 4,67 (d, J=7,06 Hz, 2H), 6,84 (d, J=7,82 Hz, 1H), 7,09 (dd, J=7,34, 4,86 Hz, 1H), 7,99 (d, J=3,43 Hz, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,77 (d, J=7,82 Hz, 1H), 8,82 (d, J=7,91 Hz, 1H). LRMS (ESI) m/z 425 [(M+H)]+, calc. para C21H24N6O4:424,46.

5.5.3. Ensayo de placa de filtro P81

Los compuestos se diluyeron en serie en una placa Labcyte LDV (Labcyte, cat. N.° LP-0200) usando un Mutiprobe (PerkinElmer) y Biomek FX (Beckman Coulter) de modo que la concentración más alta de compuesto fue de 96 pM. A continuación, se introdujeron los compuestos (75 nl por pocillo) en una placa de reacción Greiner de 384 pocillos (Greiner, N.° 781076) utilizando un manipulador de líquidos ECHO 550 (Labcyte). A continuación, se añadió un total de 12 pl de tampón de reacción (tampón IMAP que contiene Tween y DTT, de Molecular Devices) a cada pocillo de las columnas 1 y 13 para los controles negativos y se añadieron 12 pl de 2X AAK1 (proteína humana de longitud completa 0,2 nM, NCBi N.° de acceso NP_055726.2) a los pocillos restantes. A continuación, se preincubó la enzima con el compuesto durante 10 minutos a TA. Las reacciones se iniciaron tras la adición de Minitrak (PerkinElmer) de 12 |jl de mezcla de sustrato que contenía 2X Mu2 (0,2 jM , proteína humana de longitud completa), 2x ATP frío (2 jM), y 1,3 jC i de 33P-ATP caliente. Las reacciones prosiguieron durante una hora a TA. Por otra parte, se colocaron placas de filtro P81 de 384 pocillos Millipore (Millipore, catálogo N.° MZPHNOW10) en un lavador de placas (Zoom ZW, de Titertek) y se humedecieron previamente con 50 j l de ácido fosfórico al 1 %. A continuación, las reacciones de cinasa se detuvieron tras la adición de 24 j l de ácido fosfórico al 2 % a cada pocillo y a continuación se usó el Minitrak para transferir 40 j l de cada pocillo a las placas de filtro P81 de 384 pocillos Millipore previamente humedecidas. Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 minutos a TA en las placas P81, seguido de lavado cinco veces con 100 jl/pocillo de ácido fosfórico al 1 % usando el lavador de filtros Zoom. Se selló la parte inferior de cada placa de filtro seguido de la adición de 20 j l de Microscint 40 a cada pocillo, sellando la parte superior de las placas con la cubierta Flashplate y a continuación se esperó una hora hasta leer en el TopCount (PerkinElmer).

5.5.4. Ensayos basados en células HEK281

Se cultivaron células HEK293F en medio que contenía DMEM (Gibco, cat. N.° 11965), FBS al 10% (SAFC Biosciences, cat. N.° 12103C), GPS 1X (glutamina, penicilina y estreptomicina). El día uno, las células se colocaron en una placa de 10 cm, de tal forma que alcanzaron una confluencia de ~80 % en el momento de la transfección. Había aproximadamente 12 millones de células en una placa de 10 cm en el momento de la transfección. El día dos, se transfectó cada placa con 48 ug de ADN y 144 ul de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat. N.° 11668-019). El ADN estaba compuesto por una mezcla (por cada placa de 10 cm) que contenía 3 ug de AAK1/HA/pIRES (humano de longitud completa, Nc BI N.° de acceso NP_055726.2), 45 jg de Flag/AP2MI/pcDNA (humano de longitud completa) y 1,5 ml de OPTI-MEM. La Lipofectamine 2000 está formada por una mezcla (por cada placa de 10 cm) que contiene 144 j l de Lipofectamine 2000 y 1,5 ml de OPTI-MEM. Cada mezcla se transfirió a tubos individuales de 15 ml y se incubó a TA durante 5 minutos y después, se combinaron las dos mezclas y se incubaron a TA durante 20 minutos. Después, se aspiró el medio de cultivo de cada placa de 10 cm y se reemplazó por 10 ml de DMEM+SFB al 10 % (sin GPS). Finalmente, se añadieron 3 ml de mezcla de ADN/Lipofectamine a cada placa de 10 cm y se mezcló suavemente, seguido de la incubación de la placa durante una noche a 37 °C y CO² al 5 %.

El día tres, se diluyeron los compuestos en DMSO al 100 % a una concentración final de 1000X, seguido de diluciones seriadas de factor 3 para obtener un total de 5 concentraciones analizadas. Se probaron cuatro compuestos por placa de 10 cm. Después, se añadió por pipeteo un ul de cada dilución de compuesto en una placa de 96 pocillos, de pocillos profundos, seguido de la adición de 500 j l de DMEM SFB al 0,5 % en cada pocillo, hasta una concentración final de 2X de cada compuesto. Las células se resuspendieron en una placa de 10 cm mediante simple pipeteo (las células HEK293 se desprenden de la placa fácilmente en este punto) y después se transfirieron a un tubo cónico de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Después, se resuspendieron los sedimentos celulares en 2,75 ml de DMEM SFB al 0,5 % por cada placa de 10 cm, y se transfirieron 100 j l de suspensión de células a cada pocillo de una placa TC de 96 pocillos. Finalmente, se añadieron 100 j l de compuesto diluido a 2X en DMEM SFB al 0,5 % en pocillos que contenían suspensión de células, para obtener una concentración final de 1X. Después, las placas se incubaron a 37 °C y CO² al 5 % durante 3 horas, seguido de la transferencia de las suspensiones de células de cada pocillo a tiras para PCR de 12 tubos. Las tiras para PCR se centrifugaron en una gradilla para puntas a 1000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células y después se retiró el medio por pipeteo sin alterar el sedimento celular.

Para preparar el análisis por transferencia de Western (Western Blot), se resuspendieron los sedimentos celulares en 40 ul de tampón de muestra de LDS-PAGE 1X (Invitrogen, cat. N.° Np 0008) fosfatasa Halt 2X y cóctel inhibidor de proteasas (Thermo Scientific, cat. N.° 1861284), seguido de tratamiento con ultrasonidos con un emisor de ultrasonidos de micropunta ajustado a 5 durante 8-10 segundos. Se añadieron cinco ul de agente reductor de muestras NuPage 10X (con TDT 50 mM) a cada muestra, seguido de desnaturalización térmica a 70 °C durante 10 min en la máquina de PCR. Se cargaron un total de 10 j l por muestra en cada carril de un gel de 26 pocillos Criterion de Tris-glicina al 4­ 20 % (Biorad, cat. N.° 345-0034) para la transferencia de fosfo-mu2 y 10 j l por carril en un gel de 26 pocillos NuPAGE de Bis-Tris al 4-12% (+ tampón MES) (Invitrogen, cat. N.° WG1403BX10) para la transferencia de mu2. Para los controles, se cargaron 2 ng de fosfo-mu2 o 20 ng de proteínas mu2/Flag en el último pocillo de cada gel. Después de la SDS-PAGE, se transfirieron las muestras en cada gel a una membrana de PVDF usando un iBlot y se bloquearon las membranas durante una hora en TBST leche al 5 %, seguido de lavado 3X durante 5-10 min con TBSt . Los geles Criterion se sondaron con anti-fosfo-mu2 (1:5000; un anticuerpo policlonal de conejo producido por New England Peptide y purificado por afinidad en Lexicon) en TBST BSA al 5 %, mientras tanto, los geles NuPAGE se sondaron con anti-Flag de ratón (1:500; Sigma, cat. N.° F1804) en TBST leche al 5% y estos anticuerpos primarios se incubaron durante una noche a 4 °C en un agitador.

El día cuatro, se lavaron las transferencias de Western 3X durante 5-10 minutos con TBST, se sondaron con anticonejo-HRP (1:2000; BioRad, cat. N.° 170-6515) o anti-ratón-HRP (1:2000; Biorad, cat. N.° 170-6516) en TBST leche al 5% durante 1 hora a TA, se lavaron 3X durante 10 minutos con TBST y se revelaron con reactivo ECL (GE Healthcare, cat. N.° RPN2132) en un Versadoc. Finalmente, se configuró la cámara para tomar una fotografía cada 30 segundos durante 10 minutos y se conservó la mejor imagen con señal no saturada (cuando se satura la señal, las bandas se resaltarán en rojo) para cada transferencia. Se llevó a cabo un análisis de volumen en cada banda para obtener valores de densidad. Se calculó el porcentaje de inhibición para cada muestra normalizando en primer lugar con respecto a los niveles totales de expresión de Mu2 y después, se comparó con los controles del 0 % y 100 %. Después, se calcularon los valores de CI⁵⁰ usando el programa informático de ajuste Excel.

5.5.5. Datos in vitro

Se obtuvieron los datos in vitro para 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo usando los métodos descritos anteriormente. En el ensayo P81, el compuesto midió 0,9 nM. En el ensayo basado en células HEK281, el compuesto midió 4,7 nM.

5.5.6. Ensayo de formalina

Se analizó la nocicepción de los ratones con analizadores automáticos de nocicepción (adquiridos en el laboratorio Ozaki de la Universidad de California, San Diego). Se colocó una banda de metal alrededor de la pata trasera izquierda de cada ratón con superglue 30 minutos antes de la prueba. Después del periodo de aclimatación de 30 minutos, se inyectaron por vía subcutánea 20 pl de formalina al 5 % en la superficie dorsal de la pata trasera izquierda. Los ratones se alojaron individualmente en cámaras cilindricas durante 45 minutos. Se preparó una solución de formalina al 5 % fresca diluyendo formaldehído (Formalde-fresh al 20 %, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) con agua destilada. Los compuestos de investigación se administraron 30 minutos antes de la inyección de formalina.

Un programa informático registró los retrocesos por minuto, retrocesos totales para la Fase I (fase aguda = primeros 8 minutos), y los retrocesos totales para la Fase II (fase tónica entre 20 - 40 minutos) a través de un campo electromagnético. Véanse Yaksh TL, Ozaki G, McCumber D, Rathbun M, Svensson C, Malkmus S, Yaksh MC. An automated flinch detecting system for use en the formalin nociceptive bioassay. J Appl Physiol., 2001; 90:2386-402.

La figura 3 muestra los datos de la fase 1 obtenidos para 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo en ratones C57 macho, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo.

La figura 4 muestra datos de la fase 2 obtenidos para el compuesto en ratones C57 macho, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo, en la que las estadísticas proporcionadas son un efecto de la dosis por ANOVA unidireccional P <0,01, Dunnett post-hoc: *P <0,05, **P<0,01 frente a vehículo. El efecto drástico del compuesto es fácilmente evidente en el gráfico de barras de los datos proporcionados en la figura 5.

5.5.7. Ensayo de Chung de ratón

El compuesto 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo se estudió en el ensayo de Chung. Véanse Chaplan s R, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw, J Neurosci Methods 1994;53:55-63; Chung JM, Kim HK, Chung K., Segmental spinal nerve ligation model of neuropathic pain, Methods Mol Med. 2004;99:35-45.

Los ratones macho híbridos de tipo silvestre (C57BL/6J-Tyr^{° ' Brd} * 129S5/SvEvBrd) tenían entre 5-7 semanas de edad en el momento de la ligadura del nervio espinal mediante el protocolo de Chung convencional. La ligadura del nervio espinal se realizó de acuerdo con el procedimiento ideado por Kim y Chung con modificaciones. Brevemente, se anestesió a los ratones con isoflurano (2 % al caudal de oxígeno de 1 ml/min). Se hizo una incisión en la piel (1 cm) 1 mm a la izquierda de la línea media dorsal, utilizando el nivel de las crestas ilíacas como punto medio de la incisión. Los músculos paraespinales se separaron de forma roma mediales a la cresta ilíaca para revelar las apófisis transversas entre el borde caudal de L4 y el borde rostral de L6 (o unión sacroilíaca en ratones que tenían solo cinco LV). Este enfoque facilitó la identificación de los nervios espinales L4, L5, y/o L6. En un experimento inicial con ratones híbridos, se determinaron las presuntas ubicaciones del nervio espinal L5 y L6 utilizando la unión sacroilíaca como punto de referencia para localizar L6, como se ha descrito previamente en modelos SNL en ratas y ratones. En experimentos de prueba de compuestos con ratones C57, se utilizó la posición de las dos últimas apófisis transversas lumbares en relación con la cresta ilíaca para diferenciar ratones con cinco LV de aquellos con seis. Usando estos puntos de referencia óseos, el número de Lv que posee un ratón se identificó con precisión en la mayoría de los casos. La identificación de los nervios espinales L4 y L5 se hizo no solo de acuerdo con su posición relevante con respecto a las apófisis transversas, sino también mediante la observación general de los nervios: los nervios espinales l 3 y L4 se unieron exclusivamente entre sí en el campo quirúrgico mientras que L5 permaneció solo. Los nervios espinales izquierdos L4 y/o L5 se aislaron y se ligaron firmemente con sutura de seda 7-0. Para ligar L4, L4 se separó de L3 y se usó un gancho de vidrio para tirar de la sutura por debajo de L4. La ligadura de L5 se realizó pasando la sutura por debajo de L5 con un par de pinzas finas y tirando de la sutura desde el otro lado con otro par de pinzas finas. En casos muy raros, cuando l 3 y L4 se fusionaron bajo la apófisis transversa L5, la ligadura de L4 se puede realizar en el nivel proximal al borde rostral de la apófisis transversa L5. Por lo tanto, no hubo necesidad de extirpar la apófisis transversa. En animales operados de forma simulada, el procedimiento quirúrgico fue idéntico al descrito anteriormente, excepto que no se ligaron los nervios espinales. En las transecciones del nervio espinal realizadas en una cuarta cohorte de ratones, se cortaron los nervios espinales L4 o L5 utilizando unas tijeras microquirúrgicas finas al mismo nivel donde normalmente se colocarían las ligaduras. Una vez confirmada la hemostasia, la incisión se cerró en dos capas, con sutura vicryl 5-0 para la fascia dorsolumbar y grapas para la piel. Los ratones recibieron una inyección de solución salina (1 ml) y buprenorfina (0,05-0,1 mg/kgratón) inmediatamente después de la cirugía y buprenorfina de nuevo aproximadamente 12 y 24 horas posteriores a la cirugía (para un total de 3 dosis) para aliviar el dolor inducido por la cirugía. Se utilizaron una almohadilla térmica y una lámpara térmica para mantener la temperatura corporal normal del animal durante toda la cirugía. Los ratones se alojaron individualmente después del procedimiento y se monitorizaron hasta que se recuperaron por completo de la anestesia.

Se evaluó la alodinia táctil de Von Frey probando la respuesta de retirada de la pata trasera (retirada, retroceso, lamido) con respecto a un conjunto de filamentos de von Frey (numerados 2,44, 2,83, 3,22, 3,61,4,08 y 4,31 correspondientes aproximadamente a una fuerza de 0,04, 0,07, 0,16, 0,4, 1 y 2 g, Stoelting Co. Wood Dale, IL) en un procedimiento ascendente-descendente como describen Chaplan et al. Las pruebas de von Frey de referencia se realizaron antes de la cirugía y se repitieron una vez a la semana durante 3 a 6 semanas después de la cirugía, según el diseño experimental. Para las pruebas de von Frey, los ratones se colocaron en cilindros transparentes de tereftalato de polietileno (10'' de altura/4,25'' de diámetro) con un suelo de malla de alambre de 1/4'' para permitir que el experimentador aplicara el filamento de von Frey a la superficie plantar del ratón. Se probaron ambas patas. El primer filamento de von Frey aplicado fue 3,61. Si no se obtuvo respuesta, se presentó el siguiente filamento más fuerte. Si hubo una respuesta, se presentó el siguiente filamento más débil. Hubo un total de seis presentaciones de filamentos de von Frey (cuando el animal no respondió al filamento más fuerte, 4,31, la prueba finalizó). El umbral de retirada del 50 % se calculó para cada pata utilizando el método ascendente-descendente. Los ratones que exhibieron un umbral de retirada del 50 % por debajo de 2 en cualquier pata durante la prueba de referencia se excluyeron de la cirugía y la evaluación adicional. Los experimentadores de la prueba de Von Frey siempre fueron ciegos a la naturaleza de la cirugía y el tratamiento.

Con el fin de reducir la actividad locomotora exploratoria, los ratones se habituaron a las cámaras de prueba durante 60 minutos el día antes de la prueba de referencia previa a la cirugía y durante 30 minutos en las cámaras antes de la prueba de von Frey en la que se administró un compuesto. El ruido blanco estuvo encendido en la sala de pruebas durante todo el experimento.

Como se muestra en la figura 6, el compuesto 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo mostró un efecto significativo dependiente de la dosis en el ensayo de Chung. En general, P<0,0001 en RM ANOVA; Dunnett post-hoc: **P <0,01, ***P<0,001 frente a vehículo.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto, que es 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato de 3-metiloxetan-3-ilo:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El compuesto de la reivindicación 1, que es cristalino.

3. El compuesto de la reivindicación 2, que tiene un punto de fusión de aproximadamente 182,5 °C.

4. El compuesto cristalino de la reivindicación 2, que tiene un patrón de difracción de polvo de rayos X con picos a aproximadamente 12,7, 14,8, 18,7, 19,0, 19,7 y/o 25,1 grados 20.

5. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

6. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso como medicamento.

7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso como medicamento para tratar o controlar una enfermedad o trastorno mediado por la actividad de AAK1.

8. El compuesto para su uso, o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en los que la enfermedad o trastorno es enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson, o esquizofrenia.

9. El compuesto para su uso, o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en los que el dolor es un dolor neuropático.

10. El compuesto para su uso, o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en los que el dolor neuropático es fibromialgia o neuropatía periférica.

11. El compuesto para su uso, o la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en los que el dolor neuropático es neuropatía diabética.