ES2824154T3

ES2824154T3 - Inductor de la respuesta inmunitaria

Info

Publication number: ES2824154T3
Application number: ES16202768T
Authority: ES
Inventors: Masaki Ishibashi; Fumiyoshi Okano
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2007-10-25
Filing date: 2008-10-23
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2028-10-23
Also published as: ES2660414T3; CA2990255A1; CN104922656A; CN104922656B; EP2213301A1; CA2703350A1; TR201802233T4; US20100297071A1; EP3192522B1; CA2990264A1; CN104906597A; CN104906597B; ES2824683T3; EP3192521B1; CN101842113B; KR20100085013A; EP3192521A1; KR20150065935A; KR20150065934A; US10493136B2

Abstract

Un agente para su uso en el tratamiento terapeutico y/o profilactico de un cancer/canceres, comprendiendo el agente, como principio activo, uno cualquiera de los polipeptidos (a) o (b) de abajo, teniendo dicho polipeptido actividad inductora de citotoxicidad de induccion de actividad citotoxica contra celulas tumorales in vitro en celulas T estimuladas con el polipeptido, o como principio activo, un vector recombinante que comprende un polinucleotido que codifica dicho polipeptido y que es capaz de expresar in vivo dicho polipeptido: (a) un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra en los SEQ ID NO: 16 o 18 del LISTADO DE SECUENCIAS; y (b) un polipeptido que tiene una identidad de secuencia de no menos del 90 % con el polipeptido (a).

Description

DESCRIPCIÓN

Inductor de la respuesta inmunitaria

Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un nuevo agente inductor de la inmunidad útil como agente terapéutico y/o profiláctico para un cáncer(es).

Técnica antecedente

Los cánceres son la causa más común de muerte entre todas las causas de muerte, y por lo tanto las terapias son principalmente el tratamiento quirúrgico en combinación con radioterapia y quimioterapia. Además de los desarrollos de nuevos métodos quirúrgicos y el descubrimiento de nuevos agentes anti-cáncer en años recientes, los resultados del tratamiento de cánceres no han mejorado mucho hasta ahora excepto en algunos cánceres. En años recientes, gracias al desarrollo de la biología molecular y la inmunología del cáncer, se identificaron los antígenos del cáncer reconocidos por células T reactivas con los cánceres, así como los genes que codifican los antígenos del cáncer, y han aumentado las expectativas para las inmunoterapias específicas de antígeno (véase la bibliografía no patente 1). En inmunoterapia, para reducir los efectos secundarios, es necesario que el péptido o proteína que se reconoce como un antígeno casi no exista en células normales y exista específicamente en células cancerosas. En 1991, Boon et al. del Instituto Ludwig de Bélgica aislaron el antígeno MAGE 1 del melanoma humano reconocido por células T positivas a CD8 por un método de clonación de expresión de ADNc utilizando una línea celular autóloga y células T reactivas contra el cáncer (véase la bibliografía no patente 2). A partir de entonces, se informó del método SEREX (identificaciones serológicas de antígenos por clonación de la expresión recombinante), en el que los antígenos tumorales reconocidos por anticuerpos producidos en el cuerpo vivo de un paciente con cáncer en respuesta al cáncer del propio paciente se identificaron mediante la aplicación de un método de clonación de la expresión genética (Bibliografía no patente 3; bibliografía patente 1), y se han aislado distintos antígenos cancerígenos (véase las bibliografías no patentes 4 a 9). Utilizando una parte de los mismos como dianas, se han iniciado ensayos clínicos para inmunoterapia del cáncer.

Por otra parte, como en los seres humanos, se conocen en perros y gatos varios tumores tales como el tumor de glándula mamaria y carcinoma de células escamosas, y también se clasifican como altos en las estadísticas de las enfermedades de perros y gatos. Sin embargo, hasta ahora, no existe ningún agente terapéutico, profiláctico o de diagnóstico que sea eficaz para los cánceres en perros y gatos. La mayoría de los tumores de los perros y gatos son descubiertos por los dueños solo después de que hayan avanzado a un crecimiento mayor, y en muchos casos, ya es demasiado tarde para visitar un hospital para someterse a la extirpación quirúrgica del tumor o recibir un fármaco humano (una preparación anticáncer o similar), de manera que los perros y gatos mueren poco después del tratamiento. En dichas circunstancias, si estuvieran disponibles los agentes terapéuticos, agentes profilácticos y agentes diagnósticos eficaces para los cánceres para perros y gatos, se espera que se desarrollaran sus usos para los cánceres caninos.

Bibliografía patente 1: Documento US 5698396 B

Bibliografía no patente 1: Tsuyoshi Akiyoshi, Cancer and Chemotherapy, 24, 551-519 (1997)

Bibliografía no patente 2: Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991)

Bibliografía no patente 3: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995)

Bibliografía no patente 4: Int. J. Cancer, 72:965-971 (1997)

Bibliografía no patente 5: Cancer Res., 58:1034-1041 (1998)

Bibliografía no patente 6: Int. J. Cancer, 29:652-658 (1998)

Bibliografía no patente 7: Int. J. Oncol., 14:703-708 (1999)

Bibliografía no patente 8: Cancer Res., 56:4766-4772 (1996)

Bibliografía no patente 9: Hum. Mol. Genet 6:33-39, 1997

Bibliografía no patente 10: Naokazu Inoue, Ryo Yamaguchi y Masahito Ikawa, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 50, No. 11, 1405-1412

Bibliografía no patente 11: J Cell Sci. 115:1825-35

Bibliografía no patente 12: Blood. 95:1788-96

Bibliografía no patente 13: Mol Endocrinol. 9:243-54 (1995)

Bibliografía no patente 14: J Cell Biol. 145: 83-98 (1999)

En los documentos W003/009814 y W02004/076614 se desvela que la calmegina está sobreexpresada en el carcinoma de próstata humano.

Divulgación de la invención

Problemas a resolver por la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo agente inductor de la inmunidad que es útil como agente terapéutico y/o profiláctico para un cáncer(es).

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores estudiaron intensamente obtener un ADNc que codificase una proteína que se uniese a un anticuerpo existente en el suero derivado de un cuerpo vivo que alberga un cáncer por el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivada de testículos caninos y suero de un perro que alberga un cáncer, cuyo ADNc se utilizó para preparar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2, una proteína calmegina canina que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 16, una proteína centrosómica canina (que se puede abreviar de aquí en adelante como CEP) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 26 y la proteína de interacción con el receptor 11 de la hormona tiroidea canina (que se puede describir de aquí en adelante como “TRIP 11") que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 39. Además, basándose en un gen canino registrado que tiene una alta homología con la CEP canina del SEQ ID NO: 26 descrita anteriormente, se preparó una CEP canina que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 28. Además, basándose en un gen humano homólogo del gen obtenido se prepararon un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 4, una proteína calmegina humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 18, una CEP humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 30, y una TRIP11 humana que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 41. Los inventores descubrieron entonces que estos polipéptidos pueden inducir inmunocitos en un cuerpo vivo y producía la regresión de un tumor ya existente cuando se administraba al cuerpo vivo, completando de esta manera la presente invención.

Es decir, la presente invención proporciona un agente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o terapéutico de un cáncer(es), como se define en las reivindicaciones.

La presente invención también proporciona el uso de un polipéptido o vector recombinante en la fabricación de un agente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un cáncer(es), también como se define en las reivindicaciones.

Efecto de la invención

Mediante la presente invención, se proporciona un nuevo agente inductor de inmunidad útil como un agente terapéutico y/o profiláctico para un cáncer(es). Como se indica en el Ejemplo B posterior, el polipéptido utilizado en la presente invención puede inducir inmunocitos en un perro que alberga un cáncer y también puede producir la reducción o regresión de un tumor ya existente cuando se administra a un perro que alberga un cáncer. Por lo tanto el polipéptido es útil para la terapia y profilaxis de un cáncer(es).

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el patrón de expresión del gen identificado en el Ejemplo A-1 en líneas celulares de tejidos normales y tumorales. Referencia número 1: patrón de expresión del gen identificado; Referencia número 2: patrón de expresión del gen GAPDH.

La Fig. 2 muestra la detección por tinción de Coomasie de la proteína derivada de caninos producida en E. coli y purificada en el Ejemplo A, cuya proteína se identificó en la presente divulgación. Referencia número 3: la banda de la proteína derivada de caninos de la presente divulgación.

La Fig. 3 muestra el patrón de expresión del gen de la calmegina identificado en la presente divulgación en líneas celulares de tejidos normales y tumorales. Referencia número 1: patrón de expresión del gen de la calmegina; Referencia número 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.

La Fig. 4 muestra la detección por tinción de Coomasie de la proteína calmegina canina, que es un ejemplo del polipéptido utilizado en la presente invención, producida en E. coli y purificada en el Ejemplo B. Referencia número 3: la banda para la proteína calmegina canina.

La Fig. 5 muestra el patrón de expresión del gen que codifica la proteína CEP en líneas celulares de tejidos normales y tumorales. Referencia número 1: el patrón de expresión del gen que codifica la proteína CEP; Referencia número 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.

La Fig. 6 muestra la detección por tinción de Coomasie de la CEP canina del SEQ ID NO: 26, que es un ejemplo del polipéptido utilizado en la presente divulgación, producido en E. coli y purificada en el Ejemplo C. Referencia número 3: la banda para la proteína CEP canina.

La Fig. 7 muestra el patrón de expresión del gen que codifica la proteína TRIP11 en líneas celulares de tejidos normales y tumorales. Referencia número 1: el patrón de expresión del gen que codifica la proteína TRIP11; Referencia número 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.

La Fig. 8 muestra la detección por tinción de Coomasie de la proteína TRIP11 canina, que es uno de los polipéptidos utilizados en la presente divulgación, producido en E. coli y purificado en el Ejemplo D. Referencia número 3: la banda para la proteína TRIP11 canina.

Mejor modo para llevar a cabo la invención

Los polipéptidos contenidos en los agentes inductores de inmunidad de la presente invención como principios eficaces, son como se indica a continuación. Cabe señalar que, en la presente divulgación, el término "polipéptido" significa una molécula formada por la unión peptídica de una pluralidad de aminoácidos e incluye no solo moléculas polipeptídicas que tienen un gran número de aminoácidos que las constituyen, sino también moléculas de bajo peso molecular que tienen un pequeño número de aminoácidos (oligopéptidos) y proteínas de longitud completa. Por tanto, en la presente invención, en el término "polipéptido" también se incluyen proteínas que consisten en la longitud completa del SEQ ID NO: 16 o 18.

a) Un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 16 o 18, en el LISTADO dE SECUENCIAS y que tiene una actividad inductora de inmunidad.

b) Un polipéptido que tiene una homología de no menos del 90 % con el polipéptido (a) y que tiene una actividad inductora de inmunidad.

Se debería señalar que la expresión “que tiene la secuencia de aminoácidos", en la presente invención, significa que los restos de aminoácidos se alinean en ese orden. En consecuencia, por ejemplo, “un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos se muestra en el SEQ ID NO: 2” significa un polipéptido que tiene un tamaño de 306 restos de aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos es Met Ala Ala Leu ...(corte)... Ile Thr Ser Pro como se muestra en SEQ ID NO: 2. Además, “un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2” se puede abreviar como “un polipéptido de SEQ ID NO: 2”. Esto se aplica también a la expresión “que tiene la secuencia de bases”.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “actividad inductora de inmunidad” significa la capacidad para inducir inmunocitos que secretan citocinas tales como interferones en un cuerpo vivo. Se puede confirmar si un polipéptido tiene una actividad inductora de inmunidad o no utilizando, por ejemplo, el conocido ensayo ELISPOT. Más particularmente, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos posteriores, se obtienen células tales como células mononucleares periféricas de un cuerpo vivo al que se ha administrado un polipéptido cuya actividad inductora de inmunidad se va a evaluar, cuyas células se co-cultivan entonces con el polipéptido seguido por la medición de la cantidad de una citocina producida por las células utilizando un anticuerpo específico, midiendo de esta manera el número de inmunocitos en las células, que hace posible la evaluación de la actividad inductora de inmunidad. Además, como se describe en los Ejemplos posteriores, un polipéptido preparado basándose en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 4, 16, 18, 26, 28, 30, 39 o 41 pueden producir regresión de un tumor por su actividad inductora de inmunidad cuando se administra a un cuerpo vivo que alberga un cáncer. Por lo tanto, la actividad inductora de inmunidad descrita anteriormente se puede evaluar también como la capacidad para inhibir las células cancerosas que expresan el polipéptido de SEQ ID NO: 2, 4, 16, 18, 26, 28, 30, 39 o 41 o para producir la reducción o desaparición de un tejido cancerosos (tumor) (al que se hace referencia de aquí en adelante como “actividad anti-tumoral”). La actividad anti-tumoral de un polipéptido se puede confirmar, por ejemplo, por observación de si se reduce o no el tumor cuando se administra el polipéptido a un cuerpo vivo que alberga un cáncer, como se describe más particularmente en los Ejemplos posteriores. Además, la actividad anti-tumoral de un polipéptido se puede evaluar también por la observación de si las células T estimuladas con el polipéptido (es decir, se pone en contacto las células T con células presentadoras de antígeno que presentan el polipéptido) muestran actividad citotóxica o no contra las células tumorales in vitro. El contacto entre las células T y las células presentadoras de antígeno se puede llevar a cabo por co-cultivo de ambos en un medio líquido como se menciona posteriormente. La medición de la actividad citotóxica se puede llevar a cabo, por ejemplo, por un método conocido llamado ensayo de liberación de 51Cr descrito en Int. J. Cancer, 58: p 317, 1994. En los casos en los que se utiliza un polipéptido para la terapia y/o profilaxis de un cáncer(es), la evaluación de la actividad inductora de inmunidad se lleva a cabo preferentemente utilizando la actividad anti-tumoral como un índice, aunque el índice no está restringido.

La secuencia de aminoácidos que se muestra en el SEQ ID NO: 2 del LISTADO DE SECUENCIAS es la secuencia de aminoácidos del polipéptido con función desconocida que se aísla como un polipéptido que se une a un anticuerpo que existe específicamente en el suero de un perro que alberga un cáncer, cuyo aislamiento se llevó a cabo por el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivada de testículos caninos y suero de un perro que alberga un cáncer (véase el Ejemplo A-1). Está registrado en la base de datos NCBI bajo el N° de registro Xp_535343 (proteína) y N° de registro Xm_535343 (gen codificante), pero su función no se ha desvelado. Además, la secuencia de aminoácidos se muestra en el SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos de un vector homólogo humano del polipéptido de SEQ ID NO: 2 asilado como se ha descrito anteriormente. Este factor homólogo humano también es una proteína cuya función es desconocida, que se registró en la base de datos del NCBI bajo el N° de registro NP_689873 (proteína) y N° de registro NM_152660 (gen codificante). La homología entre ellos es un 93 % en términos de secuencia de bases y un 99 % en términos de secuencia de aminoácidos.

Las secuencias de aminoácidos respectivas que se muestran en los SEQ ID NO: 16 y 18 son las de la proteína calmegina aislada como un polipéptido y un factor homólogo humano del mismo, cuyo polipéptido se une a un anticuerpo existente específicamente en el suero derivado de un perro que alberga un cáncer, cuyo aislamiento se lleva a cabo por el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivada de testículos caninos y suero de un perro que alberga un cáncer (véase el Ejemplo B-1). La calmegina se identificó como una proteína que se expresa específicamente en el momento de la diferenciación de una espermática, y tiene una actividad chaperona in vitro.

Como se expresa solo en los testículos y desaparece en el esperma maduro, la calmegina se considera que tiene la función de plegar las proteínas implicadas en la diferenciación de la espermátida (Bibliografía no patente 10, Naokazu Inoue, Ryo Yamaguchi y Masahito Ikawa, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 50, No. 11, 1405-1412). Sin embargo, no hay informes que demuestren que la proteína se exprese en un cáncer y sea útil para la terapia o profilaxis del mismo. La homología entre el gen de calmegina canina y el gen de la calmegina humana es de un 90 % en términos de secuencia de bases y de un 89 % en términos de secuencia de aminoácidos.

Las secuencias de aminoácidos respectivas que se muestran en los SEQ ID NO: 26, 28 y 30 son las de la CEP aislada como un polipéptido, un factor canino que tiene una alta homología con el polipéptido y un factor homólogo humano del polipéptido, cuyo polipéptido se une a un anticuerpo existente específicamente en el suero derivado de un perro que alberga un cáncer, cuyo aislamiento se llevó a cabo por el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivado de testículos caninos y suero de un perro que alberga un cáncer (véase Ejemplo C-1). La CEP es una proteína que es necesaria para que el centrosoma controle los microtúbulos y también está implicada en la maduración del centrosoma. Se sabe que se produce una translocalización cromosómica frecuentemente en algunos trastornos mieloproliferativos, y como el gen CEP existe en el punto donde se produce la translocalización, se considera que la CEP tiene cierta relación con los trastornos. Sin embargo, no hay informes que demuestren que la proteína se expresa en un cáncer y es útil para la terapia o profilaxis del mismo (Bibliografía no patente 11: J Cell Sci. 115:1825-35; Bibliografía no patente 12: Blood. 95:1788-96). La homología entre el gen CEP canino que codifica la CEP del SEQ ID NO: 26 y el gen CEP humano es de un 87 % en términos de secuencia de bases y de un 84 % en términos de secuencia de aminoácidos.

Las secuencias respectivas de aminoácidos que se muestran en los SEQ ID NO: 39 y 41 son las de la proteína TRIP11 aislada como un polipéptido y un factor homólogo humano del mismo, cuyo polipéptido se une a un anticuerpo existente específicamente en el suero derivado de un perro que alberga un cáncer, cuyo aislamiento se lleva a cabo por el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc derivada de testículos caninos y suero de un perro que alberga un cáncer (véase el Ejemplo D-1). La TRIP11 (proteína de interacción con el receptor 11 de la hormona tiroidea) se identificó por primera vez como un factor que interacciona con el receptor p de la hormona tiroidea, y su unión a los cuerpos de Golgi y los microtúbulos también se vuelven evidentes, de manera que se considera que la TRIP11 tiene un papel en el mantenimiento de la forma de estos orgánulos. Sin embargo, no hay ningún informe que demuestre que la proteína se exprese en un cáncer y sea útil para la terapia o profilaxis del mismo (Bibliografía no patente 13, Mol Endocrinol. 9:243-54 (1995); Bibliografía no patente 14, J Cell Biol. 145: 83 98 (1999)). La homología entre el gen TRIP11 canino y el gen TRIP11 humano es de un 88 % en términos de secuencia de bases y de un 86 % en términos de secuencia de aminoácidos.

Como un principio de la inducción inmunitaria por administración de un polipéptido antigénico, se conoce el siguiente procedimiento: el polipéptido se incorpora en una célula presentadora de antígeno y entonces se degrada en fragmentos más pequeños por las peptidasas de la célula, seguido por la presentación de los fragmentos en la superficie de la célula. Los fragmentos entonces son reconocidos por una célula T citotóxica o similar, lo que destruye selectivamente las células que presentan el antígeno.

Como se ha descrito anteriormente, como un polipéptido que se incorpora en una célula presentadora de antígeno es escindido en sitios aleatorios por las peptidasas de la célula para dar lugar a distintos fragmentos de polipéptido, que después se presentan en la superficie de las células presentadoras de antígeno, la administración de un gran polipéptido, tal como la región completa de SEQ ID NO: 16 o 18, ocasiona inevitablemente la producción de fragmentos de polipéptido por degradación del mismo en la célula presentadora de antígeno, cuyos fragmentos son eficaces para la inducción inmunitaria mediante la célula presentadora de antígeno.

El polipéptido (b) descrito anteriormente, es el mismo polipéptido que el polipéptido (a) descrito anteriormente, excepto en que se ha sustituido, eliminado y/o insertado un pequeño número de restos de aminoácidos, que tiene una homología de no menos de un 90 %, más preferente de no menos de un 95 %, incluso más preferentemente de no menos de un 98 % con la secuencia original, y que tiene una actividad inductora de inmunidad. Se sabe bien en la técnica que, en general, hay casos en el que un antígeno proteico mantiene sustancialmente la misma antigenicidad que el original incluso si se ha modificado la secuencia de aminoácidos de la proteína de manera que se han sustituido, eliminado y/o insertado un pequeño número de aminoácidos. Por lo tanto como el polipéptido descrito anteriormente (b) también puede ejercer una actividad inductora de inmunidad, se puede utilizar para la preparación del agente inductor de inmunidad de la presente divulgación. Además, el polipéptido (b) descrito anteriormente, también es preferentemente el mismo polipéptido que el que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 16 o 18excepto en que se han sustituido, eliminado y/o insertado uno o varios restos de aminoácidos.

Como se utiliza en el presente documento, el término “homología" de secuencias de aminoácidos significa un valor expresado en porcentaje que se calcula alineando dos secuencias de aminoácidos que se van a comparar de manera que el número de restos de aminoácidos coincidentes sea el máximo, y dividiendo el número de aminoácidos coincidentes por el número total de restos de aminoácidos. Cuando se lleva a cabo el alineamiento descrito anteriormente, se inserta(n) un hueco(s) en uno o ambas secuencias que se van a comparar si fuera necesario. Dicho alineamiento de secuencias se puede llevar a cabo utilizando un programa bien conocido tal como BLAST, FASTA o CLUSTAL W. Cuando se inserta(n) un hueco(s), el número descrito anteriormente de los restos de aminoácidos totales se calcula contando un hueco como un resto de aminoácido. Cuando el número de los restos de aminoácidos totales que se cuenta es diferente entre las dos secuencias que se comparan, la homología (%) se calcula dividiendo el número de restos de aminoácidos coincidentes por el número de restos de aminoácidos totales en la secuencia más larga.

Los 20 tipos de aminoácidos que constituyen las proteína de origen natural se pueden clasificar en grupos cada uno de los cuales tienen propiedades similares, por ejemplo, en aminoácidos neutros con cadenas laterales que tienen una baja polaridad (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), aminoácidos neutros que tienen cadenas laterales hidrófilas (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), aminoácidos ácidos (Asp, Glu), aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) y aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp). Se sabe que, en la mayoría de los casos, las sustituciones de aminoácidos con el mismo grupo no cambian las propiedades del polipéptido. Por lo tanto, en los casos en los que se sustituyen restos de aminoácidos en el polipéptido (a) descrito anteriormente en la presente invención, la probabilidad de que se pueda mantener la actividad inductora de inmunidad puede ser alta llevando a cabo la sustitución con el mismo grupo.

Por ejemplo, los polipéptidos descritos anteriormente se pueden sintetizar por un método de síntesis química tal como el método Fmoc (método fluoroenilmetilcarbonilo) o el método tBoc (método í-butiloxicarbonilo). Además, se pueden sintetizar por métodos convencionales utilizando distintos sintetizadores de péptidos disponibles en el mercado. Además, el polipéptido de interés se puede obtener por un método de modificación genética conocido en el que el polinucleótido que codifica el polipéptido descrito anteriormente se prepara e incorpora en un vector de expresión, que se introduce entonces en una célula huésped, en la que se produce el polipéptido.

El polinucleótido que codifica el polipéptido descrito anteriormente, se puede preparar fácilmente por un método de modificación genética conocido o un método convencional utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos disponible en el mercado. Por ejemplo, se puede preparar el ADN que tiene la secuencia de bases de SEQ ID NO: 15 llevando a cabo una PCR utilizando el ADN cromosómico o una biblioteca de ADNc de un perro como matriz y utilizando un par de cebadores diseñados de manera que los cebadores puedan amplificar la secuencia de bases descrita en el SEQ ID NO: 15, respectivamente. El ADN que tiene la secuencia de bases de SEQ ID NO: 17 se puede preparar de manera similar utilizando como la matriz que se ha descrito anteriormente el ADN cromosómico o una biblioteca de ADNc humanos. Las condiciones para la reacción de PCR se puede seleccionar como sea apropiado, y los ejemplos de las condiciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas en las que se repite un ciclo que comprende las etapas de reacción de 94 °C durante 30 segundos (desnaturalización), 55 °C durante 30 segundos a 1 minuto (hibridación), y 72 °C durante 2 minutos (extensión), por ejemplo 30 veces, seguido por permitir que la reacción se produzca a 72 °C durante 7 minutos. Además, se puede aislar un ADN deseado preparando una sonda o cebador apropiados basándose en la información de la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos que se muestran en los SEQ ID NO: 15a 18 del LISTADO de SECUENCIAS de la presente memoria descriptiva y después utilizando la sonda o el cebador para explorar una biblioteca de ADNc humanos o de perro. La biblioteca de ADNc se prepara preferentemente a partir de células, un órgano o un tejido que exprese la proteína de los SEQ ID NO: 16 o 18. Las operaciones tales como la preparación de una sonda o un cebador descrito anteriormente, la construcción de una biblioteca de ADNc, la exploración de una biblioteca de ADNc y la clonación de un gen de interés, son conocidas por los expertos en la técnica, y se pueden llevar a cabo de acuerdo con, por ejemplo, Molecular Cloning, 2a Ed. o Current Protocols in Molecular Biology. A partir del ADN obtenido de esa manera, se puede obtener el ADN que codifica el polipéptido (a) descrito anteriormente. Además, como se conocen los codones que codifican cada aminoácido, la secuencia de bases de un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos específica se puede especificar fácilmente. Por lo tanto, las secuencias de bases de polinucleótidos que codifican el polipéptido (b) y el polipéptido (c) descritos anteriormente también se pueden especificar fácilmente, de manera que dichos polinucleótidos también se pueden sintetizar fácilmente utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos disponible en el mercado de acuerdo con un método convencional.

Las células huésped descritas anteriormente no están restringida a condición de que puedan expresar el polipéptido descrito anteriormente, y ejemplos de las mismas incluyen, pero no se limitan a, células procariotas tales como E. coli; y células eucariotas tales como células de mamífero cultivadas que incluyen células de riñón de mono COS1 y células ováricas de hámster chino CHO, levaduras germinadas, levaduras fusionadas, células de gusano de seda, y células de huevos de Xenopus laevis.

En los casos en los que se utilizan células procariotas como células huésped, se utiliza un vector de expresión que tiene el origen que hace posible su replicación en una célula procariota, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de clonación de ADN, un terminador y similares como vector de expresión. Ejemplos del vector de expresión para E. coli incluyen el sistema pUC, pBluescript II, el sistema de expresión pET y el sistema de expresión de pGEX. Incorporando el ADN que codifica el polipéptido descrito anteriormente en dicho vector de expresión y transformando las células huésped procariotas con el vector, seguido por el cultivo los transformantes obtenidos, se puede expresar el polipéptido codificado por el ADN descrito anteriormente en las células huésped procariotas. En este caso, el polipéptido también se puede expresar como una proteína de fusión con otra proteína.

En los casos en los que se utilizan células eucariotas como células huésped, un vector de expresión para células eucariotas que tienen un promotor, un sitio de corte y empalme, un sitio de adición de poli(A) y similares se utiliza como vector de expresión. Ejemplos de dicho vector de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, el vector EBV, pRS, pcDNA3, pMSG y pYES2. De la misma manera que se ha descrito anteriormente, incorporando el ADN que codifica el polipéptido descrito anteriormente en dicho vector de expresión y transformando células huésped eucariotas con el vector, seguido por el cultivo de los transformantes obtenidos, se puede expresar el polipéptido codificado por el ADN descrito anteriormente en las células huésped eucariotas. En los casos en los que se utilizó pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 o pEGFP-C1 como vector de expresión, se puede expresar el polipéptido descrito anteriormente como una proteína de fusión que tiene añadidos distintos marcadores tales como un marcador His, marcador FLAG, marcador myc, marcador HA o GFP.

La introducción del vector de expresión en las células huésped se puede llevar a cabo utilizando un método bien conocido tal como la electroporación, el método de fosfato de calcio, el método de liposomas o el método de DEAE dextrano.

El aislamiento y la purificación de un polipéptido de interés de las células huésped se pueden llevar a cabo por una combinación de operaciones de separación conocidas. Ejemplos de las operaciones incluyen, pero no se limitan al, tratamiento con un desnaturalizante tal como la urea o mediante un tensioactivo; tratamiento por ultrasonicación; precipitación proteica por adición de sal y precipitación fraccional en disolvente; diálisis; centrifugación; ultrafiltración; filtración en gel; SDS-PAGE; enfoque isoeléctrico; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía hidrófoba; cromatografía de afinidad; y cromatografía de fase inversa.

Los polipéptidos obtenidos por el método anterior incluyen, como se ha mencionado anteriormente, aquellos en forma de una proteína de fusión con otra proteína arbitraria. Ejemplos de los mismos incluyen proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) y con un marcador His. Dicho polipéptido en forma de una proteína de fusión también está incluido en el alcance de la presente invención como el polipéptido (c) descrito anteriormente. Además, en algunos casos, un polipéptido que se expresa en una célula transformada se modifica de distintas maneras en la célula después de la traducción del mismo. Dicho polipéptido que tienen una modificación post-traduccional también está incluido en el alcance de la presente invención a condición de que tenga actividad inductora de inmunidad. Ejemplos de dicha modificación post-traduccional incluye la eliminación de la metionina del extremo N, acetilación del extremo N, glicosilación, degradación limitada por una proteasa intracelular, miristoilación, isoprenilación y fosforilación.

Como se describe concretamente en los siguientes Ejemplos, el polipéptido descrito anteriormente que tiene actividad inductora de inmunidad puede producir regresión de un tumor ya existente cuando se administra en un cuerpo vivo que albergaba un cáncer. Por lo tanto, el agente inductor de inmunidad de la presente invención se puede utilizar como un agente terapéutico y/o profiláctico para un cáncer(es). En este caso, los cánceres que se van a tratar son los que expresan el gen que codifica el polipéptido del SEQ ID NO: 2 o 4, y ejemplos de los mismos incluyen, pero no se libera a, tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón, mama y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; épulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de sacos anales; carcinoma apocrino de sacos anales; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer tiroideo; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de la glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; leiomioma cutáneo; leiomioma intra-abdominal; leiomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células medias o células pequeñas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurativa; tumor hepático intraabdominal; cáncer de hígado; plasmacitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de sacos anales; cáncer oral; melanoma metastático maligno; melanoma maligno amelanótico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de bajo grado; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino pobremente diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor mesenquimático maligno; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor celular del huso); sarcoma diferenciado pobremente; sarcoma sinovial; angiosarcoma; angiosarcoma; epitelioma maligno metastático; adenocarcinoma tubular mamario; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medias; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (Patnaik tipo II); mastocitoma (Grado II); y leiomiosarcoma. Los animales que se van a tratar son mamíferos, especialmente preferentemente seres humanos, perros y gatos.

La vía de administración del agente inductor de inmunidad de la presente invención a un cuerpo vivo puede ser la administración oral o la administración parenteral, y es preferentemente la administración parenteral tal como la administración intramuscular, administración subcutánea, administración intravenosa o administración intra-arterial. En los casos en los que el agente inductor de inmunidad se utiliza para la terapia de un cáncer, se puede administrar en un ganglio linfático en la vecindad del tumor que se va a tratar, como se describe en los Ejemplos posteriormente, con el fin de aumentar su actividad anticáncer. La dosis puede ser una dosis tan grande como la dosis que sea eficaz para la inducción inmunitaria, y en los casos en los que se utiliza el agente para la terapia y/o profilaxis de un cáncer, la dosis puede ser la que sea eficaz para la terapia y/o profilaxis del cáncer. La dosis eficaz para la terapia y/o profilaxis de un cáncer se selecciona apropiadamente dependiendo del tamaño del tumor, el síntoma y similares, y habitualmente, se pueden administrar de 0,0001 |jg a 1000 |jg, preferentemente de 0,001 |jg a 1000 |jg del agente en términos de principio activo, una vez o varias veces por día por animal a tratarse. El agente se administra preferentemente en varias veces, cada varios días a varios meses, Como se muestra concretamente en los Ejemplos posteriores, el agente inductor de la inmunidad de la presente invención puede producir la regresión de un tumor ya existente. Por lo tanto, como el agente puede ejercer su actividad anticáncer también contra un pequeño número de células cancerosas en estado temprano, el desarrollo o recurrencia del cáncer se puede evitar utilizando el agente antes del desarrollo de un cáncer o después de la terapia para un cáncer. Es decir, el agente inductor de inmunidad de la presente invención es eficaz tanto para la terapia y profilaxis de un cáncer.

El agente inductor de inmunidad de la presente invención puede contener solo un polipéptido o se puede formular mezclando como sea apropiado con un aditivo tal como un vehículo, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, adecuado para cada modo de administración. Los métodos de formulación y los aditivos que se pueden utilizar son bien conocidos en el campo de la formulación de agentes farmacéuticos, y se pueden utilizar cualquiera de los métodos y aditivos. Ejemplos específicos de los aditivos incluyen, pero no se limitan a, diluyentes tales como soluciones tampón fisiológicas; vehículos tales como la sacarosa, lactosa, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol y glicina; aglutinantes tales como el jarabe, gelatina, goma arábiga, sorbitol, cloruro de polivinilo, y tragacanto; y lubricantes tales como el estearato magnésico, polietilenglicol, talco y sílice. Ejemplos de la formulación incluyen preparaciones orales tales como comprimidos, cápsulas, gránulos, polvos y jarabes; y preparaciones parenterales tales como inhalantes, soluciones para inyección, supositorios y soluciones. Estas formulaciones se pueden preparar por métodos de producción conocidos comúnmente.

El agente inductor de inmunidad de la presente invención se puede utilizar en combinación con un inmunopotenciador capaz de aumentar la respuesta inmunitaria en un cuerpo vivo. El inmunopotenciador puede estar contenido en el agente inductor de inmunidad de la presente invención o administrarse como una composición separada a un paciente en combinación con el agente inductor de la inmunidad de la presente invención.

Ejemplos de los inmunopotenciadores descritos anteriormente incluyen adyuvantes. Los adyuvantes pueden aumentar la respuesta inmunitaria proporcionando un reservorio de antígeno (extracelularmente o en los macrófagos), activando los macrófagos y estimulando conjuntos específicos de linfocitos, aumentando de esta manera la actividad anticáncer, Por lo tanto, especialmente en los casos en los que el agente inductor de la inmunidad de la presente invención se utiliza para la terapia y/o profilaxis de un cáncer, el agente inductor de la inmunidad preferentemente comprende un adyuvante, además del polipéptido descrito anteriormente como principio activo. Se conocen bien muchos tipos de adyuvantes en la técnica, y se puede utilizar cualquiera de estos adyuvantes. Ejemplos específicos de los adyuvantes incluyen MPL (SmithKline Beecham) y homólogos de lipopolisacárido Re 595 de Salmonella minnesota obtenido tras purificación e hidrólisis ácida del lipopolisacárido; QS21 (SmithKline Beecham) saponina QA-221 pura purificada de extracto de Quillja saponaria; DQS21 descrita en el documento WO96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 y QS-L1(So y otros 10, "Molecules and cells", 1997, Vol. 7, p. 178-186); adyuvante incompleto de Freund; adyuvante completo de Freund; vitamina E; Montanida; aluminio; oligonucleótidos CpG (véase, por ejemplo, Kreig y otros 7, "Nature", Vol. 374, p. 546-549); poli-I:C y derivados del mismo (por ejemplo, poli ICLC); y distintas emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biodegradables tales como el escualeno y/o tocoferol. Entre estos, se prefieren el adyuvante incompleto de Freund, Montanida, poli I:C y derivados de los mismos, y oligonucleótidos CpG. La relación de mezcla entere el adyuvante descrito anteriormente y el polipéptido es normalmente aproximadamente de 1:10 a 10:1, preferentemente aproximadamente de 1:5 a 5:1, más preferentemente aproximadamente de 1:1. Sin embargo, el adyuvante no se limita a los ejemplos descritos anteriormente, y se pueden utilizar otros adyuvantes conocidos en la técnica distintos a los descritos anteriormente (por ejemplo, véase Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", 2a edición, 1986) cuando se administra el agente inductor de inmunidad de la presente invención. Los métodos de preparación para las mezclas y emulsiones de un polipéptido y un adyuvante son bien conocidos para los expertos en la técnica de la vacunación.

Adicionalmente, además de los adyuvantes descritos anteriormente, se pueden utilizar factores que estimulan la respuesta inmunitaria del sujeto como el inmunopotenciador descrito anteriormente. Por ejemplo, se pueden utilizar distintas citocinas que tiene la propiedad para estimular linfocitos y/o células presentadoras de antígeno como inmunopotenciador en combinación con el agente inductor de inmunidad de la presente invención. Varias de dichas citocinas capaces de aumentar la respuesta inmunitaria son conocidas por los expertos en la técnica, y los ejemplos de las mimas incluyen, pero no se limitan a, interleucina-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, interferón-a, interferón-p, interferón-w, interferón-Y y ligando FIt3, que han demostrado que promueven la acción profiláctica de las vacunas. Dichos factores se pueden utilizar también como el inmunopotenciador descrito anteriormente, y pueden estar contenidos en el agente inductor de inmunidad de la presente invención, o se pueden preparar como una composición separada para administrarse a un paciente en combinación con el agente inductor de inmunidad de la presente invención.

Además, poniendo en contacto el polipéptido descrito anteriormente con las células presentadoras de antígeno in vitro, se puede hacer que las células presentadoras de antígeno presenten el polipéptido. Es decir, los polipéptidos (a) y (b) descritos anteriormente se pueden utilizar como agentes para tratar las células presentadoras de antígeno. Como las células presentadoras de antígeno, se pueden emplear preferentemente células dendríticas o células B, que tengan moléculas de MHC clase I. Se han identificado distintas moléculas de MHC clase I y son bien conocidas. Las moléculas del MHC en seres humanos se llaman HLA. Ejemplo de moléculas de HLA clase I incluyen HLA-A, HLA-B y HLA-C, más específicamente HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 y HLA-Cw0602.

Las células dendríticas o células B que tienen moléculas del MHC clase I se pueden preparar a partir de la sangre periférica por un método bien conocido. Por ejemplo, las células dendríticas especificas del tumor se pueden inducir por células dendríticas inductoras de la médula ósea, sangre del cordón umbilical o sangre periférica del paciente utilizando un factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) e IL-3 (o iL-4), y después añadir un péptido relacionado con el tumor en el sistema de cultivo. Administrando una cantidad eficaz de dichas células dendríticas, se puede inducir una respuesta deseada para la terapia de un cáncer. Como células que sean útiles, se pueden utilizar las de médula ósea o sangre de cordón umbilical donadas por un individuo sano, o de la médula ósea, sangre periférica, o similares del propio paciente. Cuando se utilizan células autólogas el paciente, se puede alcanzar una alta seguridad y se espera que se eviten efectos secundarios graves. La sangre periférica o la médula ósea pueden ser una muestra reciente, una muestra almacenada en frío o una muestra congelada. En cuanto a la sangre periférica, se puede cultivar la sangre completa o se pueden separar y cultivar los componentes leucocitarios solos. Además, entre los componentes leucocitarios, se pueden separar las células mononucleares. En los casos en los que las células se originan de médula ósea o sangre de cordón umbilical, se pueden cultivar todas las células que constituyen la médula ósea, o se pueden separar de las mismas las células mononucleares y cultivarse. La sangre periférica, los componentes leucocitarios de la misma y las células de médula ósea contienen células mononucleares, células madre hematopoyéticas y células dendríticas inmaduras, de las que se originan las células dendríticas, y también células positivas a CD4, y similares. En cuanto a las citocinas que se van a utilizar, el método de producción no está restringido y se pueden emplear citocinas de origen natural o recombinantes, o similares a condición de que se haya confirmado su seguridad y actividad fisiológica. Preferentemente, se utiliza una preparación con una calidad asegurada para su uso médico en una cantidad mínima necesaria. La concentración de las citocinas que se van a añadir no está restringida a condición de que si induzcan las células dendríticas, y habitualmente, la concentración total de la citocina(s) es preferentemente aproximadamente de 10 a 1000 ng/ml, más preferentemente aproximadamente de 20 a 500 ng/ml. El cultivo se puede llevar a cabo utilizando un medio bien conocido utilizado habitualmente para el cultivo de leucocitos. La temperatura del cultivo no está restringida a condición de que se consiga la proliferación de los leucocitos, y la más preferida es la de aproximadamente 370C que es la temperatura corporal del ser humano. El ambiente atmosférico durante el cultivo no está restringido a condición de que se consiga la proliferación de los leucocitos, y se prefiere un flujo de CO²de un 5 %. El periodo de cultivo no está restringido a condición de que se induzca el número de células necesario, y es habitualmente de 3 días a 2 semanas. En cuanto a los aparatos que se utilizan para la separación y el cultivo de las células se pueden emplear los aparatos apropiados, preferentemente en los que cuya seguridad cuando se aplica a usos médicos se ha confirmado, y cuyas operaciones son estables y simples. Particularmente en cuanto a los aparatos de cultivo celular, no solo se pueden utilizar recipientes generales tales como palcas de Petri, matraces y botellas, sino también recipientes tipo capa, recipientes multiestadio, botellas giratorias, botellas tipo centrífuga, recipientes de cultivo tipo bolsa, columnas de fibra perforada y similares.

Poner en contacto el péptido descrito anteriormente de la presente invención con las células presentadoras de antígeno in vitro se puede llevar a cabo por un método bien conocido. Por ejemplo, se puede llevar a cabo cultivando las células presentadoras de antígeno en un medio de cultivo que tiene el polipéptido descrito anteriormente. La concentración del péptido en el medio no está restringida, y habitualmente es de aproximadamente 1 |jg/ml a 100 |jg/ml, preferentemente de 5 jg/ml a 20 jg/ml. La densidad celular durante el cultivo no está restringida y es habitualmente de aproximadamente 103 células/ml a 107 células/ml preferentemente de aproximadamente 5 x 104 células/ml a 5 x 106 células/ml. El cultivo se puede llevar a cabo de acuerdo con un método convencional, y se lleva a cabo preferentemente a 37 °C bajo una atmósfera de un 5 % de CO². La longitud máxima del péptido que se puede presentar en la superficie de las células presentadoras de antígeno es habitualmente de 30 restos de aminoácidos. Por lo tanto, en los casos en los que las células presentadoras de antígeno se ponen en contacto con el polipéptido in vitro, el polipéptido se puede preparar de manera que su longitud no sea mayor de aproximadamente 30 restos de aminoácido.

Cultivando las células presentadoras de antígeno en coexistencia con el polipéptido descrito anteriormente, el polipéptido se incorpora en las moléculas del MHC de las células presentadoras de antígeno y se presenta en la superficie de las células presentadoras de antígeno. Por lo tanto, utilizando el polipéptido descrito anteriormente, se pueden preparar células presentadoras de antígeno aisladas que contienen el complejo entre el polipéptido y la molécula del MHC. Dichas células presentadoras de antígeno pueden presentar el polipéptido a las células T in vivo o in vitro, e inducir, y permitir la proliferación de, células T citotóxicas específicas para la polipéptido.

Al poner en contacto las cellas presentadoras de antígeno preparadas como se ha descrito anteriormente que tengan el complejo entre el polipéptido descrito anteriormente y la molécula del MHC con las células T in vitro, se pueden inducir células T citotóxicas específicas para el polipéptido y permitir que proliferen. Esto se puede llevar a cabo co-cultivando las células presentadoras de antígeno descritas anteriormente y las células T en un medio líquido. Por ejemplo, se puede conseguir suspendiendo las células presentadoras de antígeno en un medio líquido, colocando la suspensión en recipientes tales como pocillos de una microplaca, añadiendo células T a los mismos y después cultivando las células. La relación de mezcla de las células presentadoras de antígeno respecto a las células T en el co-cultivo no está restringida, y es habitualmente de 1:1 a 1:100, preferentemente aproximadamente de 1:5 a 1:20 en términos de número de células. La densidad de las células presentadoras de antígeno suspendidas en el medio líquido no está restringida, y es habitualmente de aproximadamente 100 a 10.000.000 células/ml, preferentemente de aproximadamente 10.000 a 1.000.000 células/ml. El co-cultivo se lleva a cabo preferentemente a 37 °C bajo una atmósfera con un 5 % de CO²de acuerdo con un método convencional. El tiempo de cultivo no está restringido, y es habitualmente de 2 días a 3 semanas, preferentemente de aproximadamente 4 días a 2 semanas. El co-cultivo se lleva a cabo preferentemente en presencia de una o más interleucinas tales como IL-2, IL-6, IL-7 e IL-12. En este caso, la concentración de IL-2 e IL-7 es habitualmente de aproximadamente 5 U/ml a 20 U/ml, la concentración de IL-6 es habitualmente de aproximadamente 500 U/ml a 2000 U/ml, y la concentración de IL-12 es habitualmente de aproximadamente 5 ng/ml a 20 ng/ml, pero la concentración de interleucinas no se restringe a estas. El co-cultivo descrito anteriormente se puede repetir una vez a varias veces. Las condiciones de cada co-cultivo pueden ser las mismas que se han descrito anteriormente.

Mediante el co-cultivo descrito anteriormente, se inducen células T citotóxicas específicas del polipéptido y se permite que proliferen. Por lo tanto, utilizando el polipéptido descrito anteriormente, se pueden preparar células T aisladas que se unan selectivamente al complejo entre el polipéptido y la molécula del MHC.

Como se describe en los Ejemplos posteriormente, los genes que codifican los polipéptidos de los SEQ ID NO: 2, 16, 26, 28 y 39 y los SEQ iD NO: 4, 18, 30 y 41 se expresan específicamente en células cancerosas y en testículos de perros y seres humanos, respectivamente. Por lo tanto, en las células cancerosas, existe un número significativamente más alto de polipéptidos de SEQ ID NO: 2, 16, 26, 28 y 39 o SEQ ID NO: 4, 18, 30 y 41 que en células normales. Cuando las células T citotóxicas preparadas como se describe anteriormente se administran a un cuerpo vivo mientras una parte de los polipéptidos que existen en las células cancerosas se presentan por las moléculas del MHC sobres las superficies de las células cancerosas, las células T citotóxicas pueden dañar las células cancerosas utilizando los polipéptidos presentados como marcadores. Como las células presentadoras de antígeno que presentan los polipéptidos descritos anteriormente pueden inducir, y permitir la proliferación de células T citotóxicas específicas para los polipéptidos también in vivo, también se pueden dañar las células cancerosas administrando las células presentadoras de antígeno a un cuerpo vivo. Es decir, las células T citotóxicas descritas anteriormente y las células presentadoras de antígeno descritas anteriormente preparadas utilizando el polipéptido descrito anteriormente también son eficaces como agentes terapéuticos y/o profilácticos para un cáncer(es).

En los casos en los que las células presentadoras de antígeno descritas anteriormente o las células T aisladas se vayan a administrar a un cuerpo vivo, éstas se preparan preferentemente tratando las células presentadoras de antígeno o las células T recogidas del paciente que se va a tratar con el polipéptido (a) o (b) como se ha descrito anteriormente, con el fin de impedir que la respuesta inmunitaria que se produce en el cuerpo humano ataque a estas células como cuerpos extraños.

El agente terapéutico y/o profiláctico para uno o más cánceres que como principio activo comprende las células presentadoras de antígeno o las células T, se va a administrar preferentemente por medio de una vía de administración parenteral tal como la administración intravenosa o intra-arterial. La dosis se selecciona apropiadamente dependiendo del síntoma, el fin de la administración y similares, y es habitualmente de 1 célula a 10.000.000.000.000 células, preferentemente de 1.000.000 células a 1.000.000.000 células, cuya dosis se administra una vez por varios días a una vez por varias semanas. La formulación puede ser, por ejemplo, las células suspendidas en solución salina fisiológica tampón, y la formulación se puede utilizar en combinación con otras preparaciones anticáncer y/o citocinas. Además, se pueden añadir también uno o más aditivos bien conocidos en el campo de la formulación de agentes farmacéuticos.

También mediante la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido (a) o (b) descrito anteriormente en el cuerpo del animal que se va a tratar, se puede inducir la producción de anticuerpos y células T citotóxicas en el cuerpo vivo, y se puede obtener un efecto comparable a la administración de un polipéptido. Es decir, el agente inductor de inmunidad de la presente invención puede ser el que comprende como principio activo un vector recombinante que tiene un polinucleótido que codifica el polipéptido (a) o (b) descrito anteriormente, cuyo vector recombinante es capaz de expresar el polipéptido en un cuerpo vivo. Dicho vector recombinante capaz de expresar un polipéptido antigénico también se llama vacuna genética. El vector que se utiliza para la producción de una vacuna genética no se restringe a condición de que sea un vector capaz de expresar un polipéptido en las células del animal que se va a tratar (preferentemente una célula de mamífero), y puede ser un vector plasmídico o un vector vírico, y se puede utilizar cualquier vector conocido en el campo de las vacunas genéticas. El polinucleótido tal como un ADN o ARN que codifica el polipéptido descrito anteriormente se puede preparar fácilmente, como se ha mencionado anteriormente, por un método convencional. La incorporación del polinucleótido en un vector se puede llevar a cabo utilizando un método bien conocido por los expertos en la técnica.

La vía de administración de la vacuna genética preferentemente es una vía parenteral tal como la administración intramuscular, subcutánea, intravenosa o intra-arterial, y la dosis se puede seleccionar apropiadamente dependiendo del tipo de antígeno y similares, y habitualmente es de aproximadamente 0,1 |jg a 100 mg, preferentemente aproximadamente de 1 jg a 10 mg en términos de peso de vacuna genética por 1 kg de peso corporal.

Un vector vírico puede utilizarse en métodos en los que un polinucleótido que codifica el polipéptido descrito anteriormente se incorpora en un virus ARN o virus ADN tal como un retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, herpes virus, virus vaccinia, poxvirus, poliovirus y virus Sindbis, y entonces el animal que se va a tratar se infecta por el virus resultante. Entre estos métodos, los que utilizan retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociado, virus vaccinia o similares se prefieren especialmente.

Un plásmido de expresión puede utilizarse en métodos en los que se administra directamente por vía intramuscular (método de vacuna de ADN), el método del liposoma, método de lipofectina, método por microinyección, método de fosfato cálcico, método de electroporación, y similares, y el método de vacuna de ADN y el método de liposoma se prefieren especialmente.

Los métodos para hacer actualmente el gen que codifica el polipéptido descrito anteriormente de la presente invención que actúa como un agente farmacéutico incluyen el método in vivo en el que el gen se va a introducir en el cuerpo, y el método ex vivo en el que un tipo de células se recogen del animal que se va a tratar, el gen se introduce en las 'células ex vivo, y entonces las células se devuelven al cuerpo (Nikkei Science, 1994, Abril, p. 20-45; The Pharmaceutical Monthly, 1994, Vol. 36, No. 1, p. 23-48; Experimental Medicine, Edición Extra, 1994, Vol. 12, N° 15; y referencias citadas en estos papeles y similares). Es más preferido el método in vivo.

En los casos en los que el gen se va a administrar por el método in vivo, el gen puede administrarse mediante una vía de administración apropiada dependiendo de la enfermedad que se va a tratar, los síntomas y demás. Se puede administrar por ejemplo, por administración intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intramuscular o similar. En los casos en los que el gen se va a administrar por el método in vivo, el gen se puede formular en una preparación tal como una solución, y en general, se formula en una solución para inyección o similar que contiene el ADN que codifica el péptido descrito anteriormente de la presente invención como principio activo. Un vehículo(s) utilizado comúnmente se puede añadir si fuera necesario. En el caso de un liposoma o liposoma de fusión de membrana (virus Sendai (HVJ)-liposoma o similares) que contienen el ADN, el liposoma se puede formular en una preparación liposómica tal como una suspensión, una preparación congelada o una preparación congelada concentrada por centrifugación.

En la presente invención, “la secuencia de bases se muestra en el SEQ ID NO: 1" incluye no solo la secuencia de bases que se ha escrito expresamente en el SEQ ID NO: 1, sino también la secuencia complementaria de la misma. Por tanto, “un polinucleótido que tiene la secuencia de bases se muestra en el SEQ ID NO: 1" incluye un polinucleótido de cadena sencilla que tiene la secuencia de bases que se ha escrito expresamente en el SEQ ID NO: 1, un polinucleótido de cadena sencilla que tiene la secuencia de bases complementaria de la misma, y un polinucleótido de doble cadena compuesto de estos polinucleótidos de cadena sencilla. Cuando se preparan los polinucleótidos que codifican el polipéptido que se utiliza en la presente invención, cualquiera de estas secuencias de bases se debería seleccionar apropiadamente, y los expertos en la técnica pueden llevar a cabo fácilmente la selección.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora más concretamente por medio de Ejemplos.

Ejemplo de referencia A-1: Adquisición de un nuevo antígeno proteico del cáncer por el método SEREX

(1) Preparación de una biblioteca de ADNc

Se preparó el ARN total a partir de tejido testicular de un perro sano con el método del guanidinio ácido-fenolcloroformo, y se purificó el ARN con poli(A) utilizando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit.

Utilizando el ARNm obtenido (5 jg), se sintetizó una biblioteca de fagos ADNc de testículo de perro. La preparación de la biblioteca de fagos ADNc se llevó a cabo utilizando un kit de síntesis de ADNc, Kit de síntesis ADNc-ZAP, y kit de clonación ZAP-ADNc Gigapack III Gold (fabricado por STRATAGENE) de acuerdo con los protocolos adjuntos al kit. El tamaño de la biblioteca de fabos ADNc era de 1,3 x 106 ufp/ml.

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero

Utilizando la biblioteca de fagos ADNc derivada de testículos de perro preparada como se ha descrito anteriormente, se llevó a cabo una inmunoexploración. Más particularmente, se infectaron células huésped de E. coli (XL 1-Blue MRF') con la biblioteca de manera que deberían aparecer 2.340 clones en una placa de agarosa NZY que tengan un tamaño de 090 x 15 mm, y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para permitir el fago para formar placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar proteínas, que se transfirieron de esta manera a la membrana. Posteriormente, la membrana se recuperó y se empapó en TPBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl; pH 7,5) que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, seguido por agitado a 4 °C durante una noche para suprimir las reacciones no específicas. Se permitió que el filtro reaccionara con el suero de un paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Se utilizó como suero del paciente canino descrito anteriormente, el suero recogido de pacientes caninos que padecían carcinoma de células escamosas. El suero se almacenó a -80 °C y se pre-trató inmediatamente antes de su uso. El método del pre-tratamiento del suero era el siguiente. Es decir, se infectaron las células huésped de E. coli (XL 1-Blue MRF') con el fago A ZAP Express en el que no se había insertado ningún gen ajeno, y entonces se cultivó en una placa con medio NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió el tampón de 0,2 M de NaHCO3, pH 8,3 que contenía 0,5 M de NaCl a la placa, y se dejó en reposo la placa a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recogida del sobrenadante como un extracto de E. coli/fago. A continuación, se permitió que el extracto de E. coli/fago recogido fluyera a través de una columna NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Science) para inmovilizar las proteínas derivados de E. coli/fago en la misma. Se permitió que el suero de los pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna con proteínas inmovilizada para retirar los anticuerpos adsorbidos sobre la E. coli y/o el fago. La fracción sérica que pasó a través de la columna estaba diluido 500 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración.

La membrana sobre la que se transfirieron el suero tratado de esta manera y la proteína de fusión descrita anteriormente se lavó cuatro veces con TBS-T (0,05 % Tween 20/TBS), y se le permitió que reaccionara con anti-IgG de perro de cabra (anti-IgG-h+I de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5000 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la detección por la reacción enzimática colorante utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Se observaron las colonias en las posiciones donde eran positivas las reacciones coloreadas y se recuperaron de la placa de agarosa NZY las que tuvieran un tamaño de 090 x 15 mm, y se disolvieron en 500 |jl de tampón SM (100 mM de NaCl, 10 mM de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01 % de gelatina; pH 7,5). La exploración se repitió como una segunda y tercera exploraciones de la misma manera que se ha descrito anteriormente hasta que se obtuvo una única colonia positiva a la reacción coloreada, aislando de esta manera un clon positivo tras la exploración de 30.940 clones de fagos reactivos con la IgG del suero.

(3) Búsqueda de homología del gen de antígeno aislado

Para someter el único clon positivo aislado por el método descrito anteriormente al análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo una operación de conversión del vector fago a un vector plásmido. Más particularmente, se mezclaron 200 j l de una solución preparada para contener una E. coli huésped (XL 1-Blue MRF') de manera que la DO⁶⁰⁰debería ser de 1,0 con 100 j l de una solución de fago purificado y además con 1 j l de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se permitió que se produjera la reacción a 37 °C durante 15 minutos. A la mezcla de reacción se añadieron 3 ml de medio LB, y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido por la incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. La mezcla se centrifugó entonces a 4 °C a 1000 x g durante 15 minutos, y se recuperó el sobrenadante como una solución de fagémidos. Posteriormente, se mezclaron 200 j l de una solución preparada para que contuviera una E. coli huésped (SOLR) fagémido de manera que la absorbancia DO⁶⁰⁰debería ser 1,0 con 10 j l de una solución de fagos purificados, y se permitió que la reacción procediera a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, se colocaron en placas 50 j l de la mezcla de reacción se colocó en una placa que contenía un medio LB agar con ampicilina (concentración final: 50 jg/ml), y se cultivó a 37 °C durante una noche. Una única colonia de la SOLR transformada se recuperó y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/ml) a 37 °C, seguido por la purificación del ADN plasmídico que tiene una inserción de interés utilizando el Kit plasmid Miniprep QIAGEN (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia completa de la inserción por el método de cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en el SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en el SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia genética descrita en el SEQ ID NO: 1. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo la búsqueda de homología contra genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen (N° de registro XM_535343) que codifica una proteína (N° de registro XP_535343) cuya función es desconocida. El factor homólogo humano de este gen era el gen (N° de registro NM_152660) que codifica una proteína (N° de registro NP_689873) cuya función también es desconocida (homología: secuencia de bases, un 93 %; secuencia de aminoácidos, un 99 %). La secuencia de bases del factor homólogo humano se muestra en el SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en SEQ ID NO: 4.

(4) Análisis de expresión en cada tejido

La expresión del gen, que se obtiene por el método descrito anteriormente, en tejidos normales y en distintas líneas celulares de perros y seres humanos se investigó por el método RT-PCR (PCR de transcripción inversa). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la siguiente manera. Es decir, el ARN total se extrajo de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando el reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó el ADNc por el sistema de síntesis de primera-cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Con respecto a los ADNc de tejidos humanos normales (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizaron el agrupamiento genético de ADNc (fabricado por Invitrogen), el ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADN de gran inserción (fabricado por CLONTECH). Las reacciones PCR se llevaron a cabo como sigue utilizando cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 7 y 8) específicos para el gen canino obtenido y su gen homólogo humano. Es decir, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de manera que la mezcla debería contener 0,25 pl de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa, 2 mM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de la polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 pl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 min utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos del gen que tienen las secuencias de bases que se muestran en los SEQ ID NO: 7 y 8 descritos anteriormente eran los que amplifican las regiones de las bases 87a a 606a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 1 y las bases 173a a 695a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 3, y se puede utilizar para la investigación de la expresión de el gen canino y su gen homólogo humano. Como control para la comparación, se utilizaron simultáneamente cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 9 y 10) específicos parara GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 1, se observaba una fuerte expresión del gen canino obtenido en los testículos entre los tejidos normales de perro y por otra parte, se observó una fuerte expresión en la línea celular de cáncer de mama canino. La expresión del gen homólogo humano se confirmó, como en el caso del gen canino, solamente en los testículos entre los tejidos normales humanos pero la expresión se detectó en células de tumor cerebral, leucemia, cáncer de mama y células de cáncer de pulmón entre las líneas celulares. Por lo tanto, también se confirmó que el gen homólogo humano se expresa específicamente en los testículos y en células cancerosas.

En la Fig. 1, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen identificado anteriormente, y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control de comparación.

Ejemplo de referencia A-2: Preparación de nuevos antígenos proteicos del cáncer

(1) Preparación de la proteína recombinante

Basándose en el gen de SEQ ID NO: 1 obtenido en el Ejemplo A-1, se preparó una proteína recombinante por el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del vector que se preparó de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo A-1 y se sometió a análisis de secuencia, 0,4 mM de cada uno de los dos tipo de cebadores que tenían los sitios de restricción NdeI y Xhol (descritos en los SEQ ID NO: 11 y 12), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 1 minuto utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplifican la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 2. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 930 pb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó la El coli con el resultante producto de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción NdeI y XhoI y se purificó utilizando el Kit de extracción en gel QIAquick, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en el vector de expresión para E. coli, pET16b (fabricado por Novagen) que se había tratado con NdeI y XhoI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína de fusión recombinante con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y la expresión de la proteína de interese se indujo en E. coli con 1 mM de IPTG.

Por otra parte, basándose en el gen de SEQ ID NO: 3, se preparó una proteína recombinante del gen homólogo humano mediante el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del ADNc preparado en el Ejemplo A-1 cuya expresión se podía confirmar por el método RT-PCR en distintos tejidos/células, 0,4 mM de cada uno de los tipos de cebadores que tenían sitios de restricción EcoRV y EcoRI (descritos en los SEQ ID NO: 13 y 14), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo una PCR con 30 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 1 minuto utilizando un Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplificaban la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 4. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 930 pb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). La E. coli se transformó con el producto resultante de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción EcoRV y EcoRI y se purificó utilizando un Kit de extracción en gel QIAquick, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con EcoRV y EcoRI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína recombinante de fusión con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y se indujo la expresión de la proteína de interés con 1 mM de IPTG.

(2) Purificación de la proteína recombinante

Las células de E. coli recombinantes que expresabanel SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente, se cultivaron en 100 |jg/ml de medio LB que contenía ampicilina a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzaba aproximadamente 0,7, y entonces se añadió al mismo isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido de manera que su concentración final debería ser de 1 mM, seguido por el cultivo a 37 °C durante 4 horas. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El aglomerado de células se suspendió en solución salina tampón fosfato y adicionalmente se sometió a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

Las células se suspendieron en 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 8,0) y se sometieron a sonicación en hielo. La solución de E. coli sonicada se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como fracción soluble y el precipitado como fracción insoluble.

La fracción insoluble se suspendió en 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 8,0) y se centrifugó a 6.000 rpm durante 15 minutos. Esta operación se repitió dos veces y se llevó a cabo una operación de retirada de proteasas.

El resto se suspendió en hidrocloruro de guanidina 6 M, 50 M de tampón Tris-HCl (pH 8,0) que contenía cloruro sódico 0,15 M, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C durante 20 horas para desnaturalizar las proteínas. A continuación, se centrifugó la suspensión a 6.000 rpm durante 30 minutos, y la fracción soluble obtenida se colocó en una columna con quelante de níquel preparada por un método convencional (vehículo: Fast Flow Sepharose Chelating (marca registrada) (GE Healthcare); volumen de columna: 5 ml; tampón de equilibración: hidrocloruro de guanidina 6 M, 50 M de tampón Tris-HCl, que contenía 0,15 M de cloruro sódico (pH 8,0)), seguido por un reposo a 4 °C durante una noche permitiendo la adsorción del vehículo de níquel quelado. Se recuperó el sobrenadante por centrifugación de este vehículo de la columna a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el vehículo de la columna se suspendió en solución salina tampón fosfato, seguido por rellenado de la columna con la suspensión resultante.

La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de 0,1 M de tampón de acetato (pH 4,0) que contenía 0,5 M de cloruro sódico, y se llevó a cabo inmediatamente la elución con 0,1 M de tampón de acetato (pH 3,0) que contenía 0,5 M de cloruro sódico para obtener una fracción purificada, que se utilizó como material para los ensayos de administración a continuación. Las proteínas de interés en las fracciones eluídas respectivas se confirmaron por tinción de Coomasie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. Entre estas, la proteína canina de interés se muestra en la Fig. 2.

El tampón contenido en la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con un tampón de reacción (50 mM de Tris-HCl, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCh; pH 8,0) y se llevó a cabo la escisión del marcador His por la proteasa Factor Xa y la purificación de la proteína de interés, utilizando el kit de captura de escisión FactorXa (fabricado por Novagen), de acuerdo con los protocolos adjuntos al kit. Posteriormente, el tampón contenido en 1,2 ml de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con tampón de fosfato fisiológico (fabricado por Nissui Pharmaceutical) por ultrafiltración utilizando NANOSEP 10K OMEGA (fabricado por PALL), y se utilizó en los siguientes experimentos.

Ejemplo de referencia A-3: Ensayo de Administración de una proteína recombinante a perros que albergan un cáncer

(1) Ensayo antitumoral

El efecto antitumoral de los dos tipos de proteínas recombinantes que se purificaron como se ha descrito anteriormente, se evaluó en dos individuos caninos que albergaban un tumor, que tenían un tumor epidérmico (los 2 individuos tenían tumores de glándulas mamarias).

Se mezcló una cantidad igual de adyuvante incompleto de Freund (fabricado por Wako Pure Chemicals) con 100 |jg (0,5 ml) de los polipéptidos recombinantes (derivados de perro y ser humano), respectivamente, para preparar dos tipos de agentes terapéuticos para un cáncer(es). Cada uno de estos agentes se administró en un ganglio linfático en la vecindad del tumor un total de 3 veces, llevando a cabo las administraciones posteriores a los 3 días y 7 días después de la primera administración. Como resultado los tumores con un tamaño de aproximadamente 25 mm3 y 50 mm3 en el momento de la administración de los agentes terapéuticos para un cáncer(es) (derivados de perro y ser humano), respectivamente, se redujeron en tamaño a 20 mm3 y 42 mm3, respectivamente, 10 días después de la primera administración; 13 mm3 y 26 mm3, respectivamente 20 días después de la primera administración; y a 5 mm3 y 10 mm3, respectivamente 30 días después de la primera administración.

Adicionalmente, se administró por vía intra-cutánea a un paciente canino que padecía un melanoma maligno, una mezcla de 100 jg (0,5 ml) del polipéptido descrito anteriormente derivado del perro y 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund en la periferia del tumor un total de 3 veces en los mismos intervalos descritos anteriormente. Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron por vía subcutánea 10 mU de “Intercat” que es un interferón recombinante felino. Como resultado el tumor, con un tamaño de aproximadamente 142 mm3 en el momento de la administración del agente terapéutico para un cáncer(es) remitió completamente 29 días después de la primera administración.

Además, se administró a un paciente canino que padecía un adenocarcinoma nasal, una mezcla de 100 jg (0,5 ml) del polipéptido descrito anteriormente derivado del perro y 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund de la misma manera que se ha descrito anteriormente un total de 3 veces. Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron 100 jg de interleucina-12 canina por vía subcutánea. Como resultado, el tumor con un tamaño de aproximadamente 57 mm3 en el momento de la administración del agente terapéutico para un cáncer(es) remitió completamente 14 días después de la primera administración.

(2) Ensayo de inducción de la inmunidad

Se obtuvo sangre del paciente canino en el que se obtuvo el efecto antitumoral en el ensayo de administración de (1) descrito anteriormente antes de la administración del agente terapéutico para un cáncer(es), y 10 días y 30 días después de la primera administración. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica de acuerdo con un método convencional, y usándolas en el ensayo ELISPOT para IFNy, se ensayó la inducción de inmunidad de cada proteína recombinante administrada.

En una placa de 96 pocillos fabricada por Millipore (MultiScreen-IP, MAIPS 4510), se colocaron 100 jl/pocillo de etanol al 70 % y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del etanol por aspiración. La placa se lavó con agua estéril y se colocaron 300 jl/pocillo de Bicarbonato sódico 200 mM (pH 8,2) en los mismos. Después de dejarlo en reposo durante 5 minutos se retiró el Bicarbonato Sódico por aspiración, y entonces la placa se lavó. Posteriormente, se colocaron 0,5 jl/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-interferón y canino (fabricado por R&D, clon 142529, MAB781) mezclado con 200 mM de Bicarbonato Sódico, y la placa se incubó a 37 °C durante una noche para inmovilizar el anticuerpo primario. Después de retirar el anticuerpo primario por aspiración, se añadieron a los pocillos 300 jl/pocillo de una solución bloqueante (un 1 % de BSA-5 % de sacarosa-200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2)), y la placa se incubó a 4 °C durante una noche para bloquear la placa. Después de retirar la solución bloqueante por aspiración se colocaron 300 jl/pocillo de medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino (fabricado por Invitrogen) en los pocillos, y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del medio por aspiración. Posteriormente, se colocaron en la placa 5 x 105 células /pocillo de las células mononucleares de sangre periférica caninas suspendidas en medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino, y se añadieron 10 jl/pocillo del polipéptido derivado de caninos o el polipéptido derivado de seres humanos utilizando en cada administración a las mismas, seguido por el cultivo de las células en condiciones de 37 °C y un 5 % de CO². Durante 24 horas, para permitir que los inmunocitos que pudieran existir en las células mononucleares de sangre periférica produjeran interferón y. Después del cultivo, se retiró el medio, y los pocillos se lavaron 6 veces con una solución de lavado (un 0,1 % de Tween 20- 200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2). En cada pocillo se colocaron 100 j l de anticuerpo policlonal de conejo anti-perro diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y la placa se incubó a 4 °C durante una noche. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, se colocaron en cada pocillo 100 j l de anticuerpo anti conejo marcado con HRP diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y se permitió proceder la reacción a 37 °C durante 2 horas. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, el resultado se coloreó con inmunotinción de Konica (fabricado por Konica), y los pocillos se lavaron con agua para parar la reacción. A continuación, se secó la membrana, y se hizo el recuento del número de puntos que aparecían utilizando el KS ELISPOT (fabricado por Carl Zeiss, Inc.).

Como resultado en el paciente canino al que se administró el polipéptido canino o el polipéptido humano, la muestra de células mononucleares de sangre periférica que se había extraído antes de la administración del polipéptido no presentaba puntos. Por otra parte, en el paciente canino al que se había administrado el polipéptido canino, las muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas 10 días y 30 días después de la administración presentaban 20 y 36 puntos, respectivamente. En el paciente en el que se había administrado el polipéptido humano, las muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas a los 10 días y 30 días después de la administración presentaban 24 y 36 puntos, respectivamente.

A partir de los resultados anteriores, se confirmó que se inducían inmunocitos que reaccionaban específicamente con la proteína recombinante administrada y que producían interferón y en todos los pacientes caninos a los que se había administrado la proteína recombinante, y se cree que el efecto anti-tumoral descrito en (1) se ejerció por inmunorreacciones en las que estaban implicados principalmente estos inmunocitos.

Ejemplo B-1: Adquisición del nuevo antígeno proteico del cáncer por el método SEREX

(1) Preparación de la biblioteca de ADNc

Se preparó el ARN total del tejido testicular de un perro sano por el método de guanidio ácido-Fenol-Cloroformo y se purificó el ARN poli(A) utilizando el kit de purificación Oligotex-dT30 ARNm (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit.

Utilizando el ARNm obtenido (5 |jg), se sintetizó una biblioteca de fagos ADNc. La preparación de la biblioteca de fagos ADNc se llevó a cabo utilizando un kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis ZAP-ADNc, y el kit de clonación ZAP-cDNA Gigapack III Gold (fabricado por STRATAGENE) de acuerdo con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la biblioteca de fabos ADNc era de 1,3 x 106 ufp/ml.

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero

Utilizando la biblioteca de fagos ADNc derivada de testículo de perro preparada como se ha descrito anteriormente, se llevó a cabo la inmunoexploración. Más particularmente, se infectaron células de E. coli (XL1-Blue MRF') con la biblioteca de manera que deberían aparecer 2.340 clones en una placa de agarosa NZY que tenía un tamaño de 090 x 15 mm, y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para permitir al fago que formase placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar las proteínas, que se transferían entonces a la membrana. Posteriormente se recuperó la membrana y se empapó en TBS (10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl; pH 7,5) que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, seguido por el agitado a 4 °C durante una noche para suprimir las reacciones no específicas. Se permitió que el filtro reaccionara con el suero del paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Respecto al suero del paciente canino descrito anteriormente, se utilizó el suero recogido de pacientes caninos que padecían un tumor proximal del ano. El suero se almacenó a -80 °C y se pre-trató inmediatamente antes de su uso. El método del pre-tratamiento era el siguiente. Es decir, se infectaron las células huésped de E. coli (XL1-Blue MRF') con el fago A ZAP Express en el que no se había insertado ningún gen ajeno, y entonces se cultivó en una placa con medio NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa el tampón de 0,2 M de NaHCO3, pH 8,3 que contenía 0,5 M de NaCl, y la placa se dejó en reposo a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recogida del sobrenadante como extracto de E. coli/fago. A continuación, se permitió que el extracto de E. coli/fago recogido fluyera a través de una columna NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Science) para inmovilizar las proteínas derivadas de E. coli/fago en la misma. Se permitió que el suero de los pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna de proteína inmovilizada para retirar los anticuerpos absorbidos en la E. coli y/o el fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna estaba diluida 500 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración. La membrana sobre la cual el suero tratado de esta manera y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron se lavó 4 veces con TBS-T (0,05 % de Tween 20/t BS), y se permitió que reaccionara con anti-IgG de perro de cabra (anti-IgG-h+I de perro de cabra conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5000 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada como un anticuerpos secundario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la detección por la reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones donde se observó la reacción de coloración era positiva se recuperaron de la placa de NZY agarosa que tiene un tamaño de 090 x 15 mm, y se disolvieron en 500 j l de tampón SM (100 mM de NaCl, 10 mm de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01 % de gelatina; pH 7,5). Se repitió la exploración como una segunda y tercera exploración de la misma manera que se ha descrito anteriormente hasta que se obtenía una única colonia positiva a la reacción coloreada, aislando de esta manera un clon positivo después de la exploración de 30.940 clones de fago reactivos con la IgG del suero.

(3) Búsqueda de homología del gen antigénico asilado

Para someter el único clon positivo aislado por el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo una operación de conversión del vector fago a un vector plasmídico. Más particularmente, se mezclaron 200 j l de una solución preparada para contener una E. coli huésped (XL1-Blue MRF') de manera que la absorbancia a DO⁶⁰⁰debería ser 1,0 con 100 j l de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 j l del fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se permitió que la reacción procediera a 37 °C durante 25 minutos. A la mezcla de reacción, se añadieron 3 ml de medio LB, y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido por incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. La mezcla se centrifugó entonces a 4 °C a 1000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se recuperó como una solución de fagémidos. Posteriormente, se mezclaron 200 |jl de una solución preparada para contener una E. coli huésped fagémido (SOLR) de manera que la DO⁶⁰⁰debería ser de 1,0 con l0 j l de una solución de fagos purificados, y se permitió que procediera la reacción a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, 50 j l de la mezcla de reacción se colocaron en una placa con medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/ml) a 37 °C durante una noche. Se recuperó una única colonia de SOLR transformadas y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/ml) a 37 °C, seguido por purificación del ADN plasmídico que tiene una inserción de interés utilizando el kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia completa de la inserción por el método del cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en el SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en el SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia genética descrita en el SEQ ID NO: 15. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo una búsqueda de homología contra genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen de la calmegina. El factor homólogo humano del gen de la calmegina canina era el de calmegina humana (homología: secuencia de bases, 90 %; secuencia de aminoácidos, 89 %). La secuencia de bases de la calmegina humana se muestra en el SEQ ID NO: 17, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en el SEQ ID NO: 18.

(4) Análisis de expresión en cada tejido

La expresión del gen, que se obtuvo por el método descrito anteriormente, en tejidos normales y en distintas líneas celulares de perros y seres humanos se investigó por el método RT-PCR (PCR de transcripción inversa). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la siguiente manera. Es decir, el ARN total se extrajo de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando el reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó el ADNc por el sistema de síntesis de primera-cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Con respecto a los ADNc de tejidos humanos normales (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizaron el agrupamiento genético de ADNc (fabricado por Invitrogen), el ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADN de gran inserción (fabricado por CLONTECH). Las reacciones PCR se llevaron a cabo como sigue utilizando cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 19 y 20) específicos para el gen obtenido. Es decir, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de manera que la mezcla debería contener 0,25 j l de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa, 2 mM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de la polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 jl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 min utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos del gen eran los que amplifican las regiones de las bases 755a a 1318a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 15 (gen de la calmegina canina) y las bases 795a a ¹³⁵⁸a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 17 (gen de la calmegina humana), y se puede utilizar para la investigación de la expresión tanto del gen de calmegina canino como del gen de calmegina humano. Como control para la comparación, se utilizaron simultáneamente cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 9 y 10) específicos parara GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 3, se observaba una fuerte expresión del gen de calmegina canino obtenido en los testículos entre los tejidos normales de perro y por otra parte, se observó una fuerte expresión en líneas celulares tumorales caninas. La expresión del gen de calmegina humano se confirmó, como en el caso del gen de calmegina canino, solamente en los testículos entre los tejidos normales humanos pero la expresión se detectó en células de tumor cerebral, leucemia y células de cáncer de esófago entre las líneas celulares. Por lo tanto, también se confirmó que el gen de calmegina humano se expresa específicamente en los testículos y en células cancerosas.

En la Fig. 3, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen de la calmegina, y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control de comparación.

Ejemplo B-2: Preparación de proteínas Calmegina canina y humana

(1) Preparación de la proteína recombinante

Basándose en el gen de SEQ ID NO: 15 obtenido en el Ejemplo B, se preparó una proteína recombinante por el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 j l del vector que se preparó de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo B y se sometió a análisis de secuencia, 0,4 mM de cada uno de los dos tipo de cebadores que tenían los sitios de restricción BamHI y EcoRI (descritos en los SEQ ID NO: 21 y 22), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 jl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 2 minutos utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplifican la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 16. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,9 kpb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó la El coli con el resultante producto de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI y se purificó utilizando el Kit de extracción en gel QIAquick, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en el vector de expresión para E. coli, pET16b (fabricado por Novagen) que se había tratado con BamHI y EcoRI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína de fusión recombinante con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y la expresión de la proteína de interese se indujo en E. coli con 1 mM de IPTG.

Por otra parte, basándose en el gen de SEQ ID NO: 17, se preparó una proteína recombinante del gen homólogo humano mediante el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del ADNc preparado en el Ejemplo B-1 cuya expresión se podía confirmar por el método RT-PCR en distintos tejidos/células, 0,4 mM de cada uno de los tipos de cebadores que tenían sitios de restricción EcoRI y XhoI (descritos en los SEQ ID NO: 23 y 24), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo una PCR con 30 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 2 minutos utilizando un Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplificaban la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 18. Después de la pCr , el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,9 kpb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). La E. coli se transformó con el producto resultante de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y se purificó utilizando un Kit de extracción en gel QIAquick, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con EcoRI y XhoI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína recombinante de fusión con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y se indujo la expresión de la proteína de interés con 1 mM deIPTG.

(2) Purificación de la proteína recombinante

Las células de E. coli recombinantes que expresabanel SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17, respectivamente, se cultivaron en 30 pg/ml de medio LB que contenía kanamicina a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzaba aproximadamente 0,7, y entonces se añadió al mismo isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido de manera que su concentración final debería ser de 1 mM, seguido por el cultivo a 37 °C durante 4 horas. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El aglomerado de células se suspendió en solución salina tampón fosfato y adicionalmente se sometió a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

El aglomerado obtenido de células de E. coli se suspendieron en 20 mM de tampón de fosfato (pH 7,0) y se sometieron a sonicación en hielo. La solución de E. coli sonicada se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como fracción soluble y el precipitado como fracción insoluble.

La fracción soluble se colocó en una columna de intercambio iónico (vehículo: SP Sepharose Fast Flow (marca registrada) (GE Healthcare); volumen de columna: 5 ml; tampón de equilibración: 20 mM de tampón fosfato (pH 7,0)). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de 20 mM de tampón de fosfato (pH 7,0), y se llevó a cabo la elución con un gradiente de densidad de sal de 20 mM de tampón fosfato que contenía 0,3 M-1,0 M de cloruro sódico (pH 7,0). Se recogieron seis volúmenes de columna de la fracción eluída en cada etapa de elución.

Entre estas fracciones eluídas, la 1a a 6a fracciones eluídas con 20 mM de tampón fosfato que contenía 0,3 M de cloruro sódico (pH 7,0) y la 1a fracción eluída con 20 mM de tampón de fosfato que contenía 1,0 de cloruro sódico (pH 7,0) se combinaron, y la solución resultante se sometió a purificación adicional por una columna secundaria.

Para la columna secundaria, se utilizó un vehículo de columna Bio gel HT Type II (BioRad). El volumen de columna era 5 ml. La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna de 20 mM de tampón fosfato que contenía 0,3 M de cloruro sódico (pH 7,0), y las fracciones eluídas descritas anteriormente se colocaron en la columna. Las fracciones que no se adsorbieron a la columna se lavaron con 10 volúmenes de columna de 20 mM de tampón de fosfato que contenía 0,3 M de cloruro sódico (pH 7,0) y 0,1 de tampón fosfato (pH 7,0), y se llevó a cabo la elución con 0,2 M de tampón fosfato (pH 7,0) para obtener la fracción purificada, que se utilizó como material para los ensayos de administración a continuación. Las proteínas de interés de las fracciones eluídas se confirmaron por tinción de Coomasie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. Entre estas, la proteína calmegina canina se muestra en la Fig. 4.

Para 1 ml del tampón de reacción (20 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCI, 5 mM de CaCh; pH 7,4) se hicieron alícuotas de 200 pl de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente, y se añadieron 2 pl de enterocinasa (fabricada por Novagen) a la misma, dejándolo en reposo a continuación a temperatura ambiente durante una noche para escindir el marcador His. El producto resultante se purificó utilizando el Kit de captura de escisión de enterocinasa (Fabricado por Novagen) de acuerdo con los protocolos adjuntos al kit. Posteriormente, el tampón contenido en 1,2 ml de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con tampón de fosfato fisiológico (fabricado por Nissui Pharmaceutical) por ultra-filtración utilizando NANOSEP l0K OMEGA (fabricado por PALL), y se utilizó en los siguientes experimentos.

Ejemplo B-3: Ensayo de Administración de una proteína recombinante a perros que albergan un cáncer

(1) Ensayo antitumoral

El efecto antitumoral de los dos tipos de proteínas recombinantes que se purificaron como se ha descrito anteriormente se evaluó en dos individuos caninos que albergaban un tumor, que tenían un tumor epidérmico (los 2 individuos tenían tumores de glándulas mamarias).

Se mezcló una cantidad igual de adyuvante incompleto de Freund (fabricado por Wako Pure Chemicals) con 100 pg (0,5 ml) de las proteínas recombinantes calmegina canina y calmegina humana, respectivamente, para preparar agentes terapéuticos para un cáncer(es). Cada uno de estos agentes se administró en un ganglio linfático en la vecindad del tumor un total de 3 veces, llevando a cabo las administraciones posteriores a los 3 días y 7 días después de la primera administración. Como resultado los tumores con un tamaño de aproximadamente 45 mm3 y 78 mm3, respectivamente, en el momento de la administración de los agentes terapéuticos, se redujeron a 27 mm3 y 46 mm3, respectivamente, 10 días después de la primera administración; 15 mm3 y 26 mm3, respectivamente, 20 días después de la primera administración; y a 7 mm3 y 15 mm3, respectivamente 30 días después de la primera administración.

Adicionalmente, se administró a un paciente canino que padecía un melanoma maligno, una mezcla de 100 pg (0,5 ml) de la proteína calmegina canina descrita anteriormente y 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund un total de 3 veces de la misma manera descrita anteriormente. Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron por vía subcutánea 100 pg de interleucina 12 canina. Como resultado el tumor, con un tamaño de aproximadamente 38 mm3 en el momento de la administración del agente terapéutico remitió completamente 21 días después de la primera administración del agente terapéutico.

(2) Ensayo de inducción de la inmunidad

En una placa de 96 pocillos fabricada por Millipore (MultiScreen-IP, MAIPS 4510), se colocaron 100 pl/pocillo de etanol al 70 % y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del etanol por aspiración. La placa se lavó con agua estéril y se colocaron 300 pl/pocillo de Bicarbonato sódico 200 mM (pH 8,2) en los mismos. Después de dejarlo en reposo durante 5 minutos se retiró el Bicarbonato Sódico por aspiración, y entonces la placa se lavó. Posteriormente, se colocaron 0,5 pg/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-interferón ^ycanino (fabricado por R&D, clon 142529, MAB781) mezclado con 200 mM de Bicarbonato Sódico, y la placa se incubó a 37 °C durante una noche para inmovilizar el anticuerpo primario. Después de retirar el anticuerpo primario por aspiración, se añadieron a los pocillos 300 pl/pocillo de una solución bloqueante (un 1 % de BSA-5 % de sacarosa-200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2)), y la placa se incubó a 4 °C durante una noche para bloquear la placa. Después de retirar la solución bloqueante por aspiración se colocaron 300 pl/pocillo de medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino (fabricado por Invitrogen) en los pocillos, y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del medio por aspiración. Posteriormente, se colocaron en la placa 5 x 105 células /pocillo de las células mononucleares de sangre periférica caninas suspendidas en medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino, y se añadieron a las mismas 10 pl/pocillo la proteína calmegina canina o calmegina humana que se utilizada en cada administración, seguido por el cultivo de las células en condiciones de 37 °C y un 5 % de CO²durante 24 horas, para permitir que los inmunocitos que pudieran existir en las células mononucleares de sangre periférica produjeran interferón ^y. Después del cultivo, se retiró el medio, y los pocillos se lavaron 6 veces con una solución de lavado (un 0,1 % de Tween 20- 200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2). En cada pocillo se colocaron 100 pl de anticuerpo policlonal de conejo anti-perro diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y la placa se incubó a 4 °C durante una noche. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, se colocaron en cada pocillo 100 pl de anticuerpo anti-conejo marcado con HRP diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y se permitió proceder la reacción a 37 °C durante 2 horas. Después de lavar los pocilios 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, el resultado se coloreó con inmunotinción de Konica (fabricado por Konica), y los pocillos se lavaron con agua para parar la reacción. A continuación, se secó la membrana, y se hizo el recuento del número de puntos que aparecían utilizando el KS ELISPOT (fabricado por Carl Zeiss, Inc., Alemania).

Como resultado, en cualquier paciente canino al que se administró calmegina canina o calmegina humana, la muestra de células mononucleares de sangre periférica que se había extraído antes de la administración no presentaba puntos. Por otra parte, en el paciente canino al que se había administrado la calmegina canina, las muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas 10 días y 30 días después de la administración presentaban 15 y 45 puntos, respectivamente. En el paciente canino en el que se había administrado la calmegina humana, las muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas a los 10 días y 30 días después de la administración presentaban 12 y 39 puntos, respectivamente.

A partir de los resultados anteriores, se confirmó que se inducían inmunocitos que reaccionaban específicamente con la proteína recombinante administrada y que producían interferón ^y, en todos los pacientes caninos a los que se había administrado la proteína recombinante, y se cree que el efecto anti-tumoral descrito en (1) se ejerció por inmunorreacciones en las que estaban implicados principalmente estos inmunocitos.

Ejemplo de referencia C-1: Adquisición del nuevo antígeno proteico del cáncer por el método SEREX

(1) Preparación de la biblioteca de ADNc

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero

Utilizando la biblioteca de fagos ADNc derivada de testículo de perro preparada como se ha descrito anteriormente, se llevó a cabo la inmunoexploración. Más particularmente, se infectaron células de E. coli (XL 1-Blue MRF') con la biblioteca de manera que deberían aparecer 2.340 clones en una placa de agarosa NZY que tenía un tamaño de 090 x 15 mm, y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para permitir al fago que formase placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar las proteínas, que se transferían entonces a la membrana. Posteriormente se recuperó la membrana y se empapó en TBS (10 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl; pH 7,5) que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, seguido por el agitado a 4 °C durante una noche para suprimir las reacciones no específicas. Se permitió que el filtro reaccionara con el suero del paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.

Respecto al suero del paciente canino descrito anteriormente, se utilizó el suero recogido de pacientes caninos que padecían un tumor proximal del ano. El suero se almacenó a -80 °C y se pre-trató inmediatamente antes de su uso. El método del pre-tratamiento era el siguiente. Es decir, se infectaron las células huésped de E. coli (XL1-Blue MRF') con el fago A ZAP Express en el que no se había insertado ningún gen ajeno, y entonces se cultivó en una placa con medio NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa el tampón de 0,2 M de NaHCO3, pH 8,3 que contenía 0,5 M de NaCl, y la placa se dejó en reposo a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recogida del sobrenadante como extracto de E. coli/fago. A continuación, se permitió que el extracto de E. coli/fago recogido fluyera a través de una columna NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Science) para inmovilizar las proteínas derivadas de E. coli/fago en la misma. Se permitió que el suero de los pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna de proteína inmovilizada para retirar los anticuerpos adsorbidos en la E. coli y/o el fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna estaba diluida 500 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración. La membrana sobre la cual el suero tratado de esta manera y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron, se lavó 4 veces con TBS-T (0,05 % de Tween 20/TBS), y se permitió que reaccionara con anti-IgG de perro de cabra (anti-IgG-h+I de perro de cabra conjugado con ^hRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5000 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada como un anticuerpos secundario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la detección por la reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones donde se observó la reacción de coloración era positiva se recuperaron de la placa de NZY agarosa que tiene un tamaño de 090 x 15 mm, y se disolvieron en 500 j l de tampón SM (100 mM de NaCl, 10 mm de MgClSO4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01 % de gelatina; pH 7,5). Se repitió la exploración como una segunda y tercera exploración de la misma manera que se ha descrito anteriormente hasta que se obtenía una única colonia positiva a la reacción coloreada, aislando de esta manera un clon positivo después de la exploración de 30.940 clones de fago reactivos con la IgG del suero.

(3) Búsqueda de homología del gen antigénico asilado

Para someter el único clon positivo aislado por el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo una operación de conversión del vector fago a un vector plasmídico. Más particularmente, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener una E. coli huésped (XL 1-Blue MRF') de manera que la absorbancia a DO⁶⁰⁰debería ser 1,0 con 100 pl de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 pl del fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se permitió que la reacción procediera a 37 °C durante 25 minutos. A la mezcla de reacción, se añadieron 3 ml de medio LB, y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido por incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. La mezcla se centrifugó entonces a 4 °C a 1000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se recuperó como una solución de fagémidos. Posteriormente, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener una E. coli huésped fagémido (SOLR) de manera que la DO⁶⁰⁰debería ser de 1,0 con 10 pl de una solución de fagos purificados, y se permitió que procediera la reacción a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, 50 pl de la mezcla de reacción se colocó en una placa con medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) a 37 °C durante una noche. Se recogió una única colonia de SOLR transformada y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) a 37 °C, seguido por purificación del ADN plasmídico que tiene una inserción de interés utilizando el kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia completa de la inserción por el método del cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en el SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en el SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia genética descrita en el SEQ ID NO: 15. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo una búsqueda de homología contra genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen tenía un 99 % de homología (que se calculó solo en la región solapada con el gen CEP descrito en el SEQ ID NO: 27 en términos de secuencias de bases y de secuencia de aminoácidos, de manera que se juzgó que el gen era el gen CEP. El factor homólogo humano de la CEP canina era la CEP humana (homología respecto al gen CEP descrito en el SEQ ID NO: 25: secuencia de bases, 87 %; secuencia de aminoácidos, 84 %). La secuencia de bases del CEP humano se muestra en el SEQ ID NO: 29, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en el SEQ ID NO: 30.

(4) Análisis de expresión en cada tejido

La expresión del gen, que se obtuvo por el método descrito anteriormente, en tejidos normales y en distintas líneas celulares de perros y seres humanos se investigó por el método RT-PCR (PCR de transcripción inversa). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la siguiente manera. Es decir, el ARN total se extrajo de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando el reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó el ADNc por el sistema de síntesis de primera-cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Con respecto a los ADNc de tejidos humanos normales (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizaron el agrupamiento genético de ADNc (fabricado por Invitrogen), el ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADN de gran inserción (fabricado por CLONTECH). Las reacciones PCR se llevaron a cabo como sigue utilizando cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 31 y 32) específicos para el gen obtenido. Es decir, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de manera que la mezcla debería contener 0,25 pl de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa, 2 mM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de la polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 pl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 min utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos del gen eran los que amplifican las regiones de las bases 4582a a 5124a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 25 y 27 (gen CEP canino) y las bases 4610a a ^{5 152}a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 29 (gen CEP humano), y se puede utilizar para la investigación de la expresión tanto del gen CEP canino como del gen CEP humano. Como control para la comparación, se utilizaron simultáneamente cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 9 y 10) específicos para GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 5, se observaba una fuerte expresión del gen CEP canino obtenido en los testículos entre los tejidos normales de perro y por otra parte, se observó una fuerte expresión en líneas celulares tumorales caninas. La expresión del gen CEP humano se confirmó, como en el caso del gen CEP canino, solamente en los testículos entre los tejidos normales humanos pero la expresión se detectó en células de tumor cerebral, leucemia y células de cáncer de esófago entre las líneas celulares, y especialmente, se observaba una fuerte expresión en la línea celular de leucemia. Por lo tanto, también se confirmó que el gen CEP humano se expresa específicamente en los testículos y en células cancerosas.

En la Fig. 5, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen CEP, y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control de comparación.

Ejemplo de referencia C-2: Preparación de CEP canina y humana

(1) Preparación de la proteína recombinante

Basándose en el gen de SEQ ID NO: 1 obtenido en el Ejemplo C-1, se preparó una proteína recombinante por el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del vector que se preparó de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo C-1 y se sometió a análisis de secuencia, 0,4 mM de cada uno de los dos tipo de cebadores que tenían los sitios de restricción BamHI y SalI (descritos en los SEQ ID NO: 33 y 34), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 7 minutos utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplifican la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 26. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 7,0 kpb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó la El coli con el resultante producto de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción BamHI y SalI y se purificó utilizando el Kit de extracción en gel QIAquick, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en el vector de expresión para E. coli, pET16b (fabricado por Novagen) que se había tratado con BamHI y SalI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína de fusión recombinante con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y la expresión de la proteína de interese se indujo en E. coli con 1 mM de IPTG. De la misma manera, basándose en el gen del SEQ ID NO: 27, utilizando el ADNc de testículos caninos como matriz y dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción BamHI y SalI (SEQ ID NO: 33 y 35), se preparó una proteína recombinante del gen CEP canino registrado. Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplificaban la región de aproximadamente 7,8 kpb que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 28.

Además, basándose en el gen de SEQ ID NO: 29, se preparó una proteína recombinante del gen homólogo humano mediante el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del ADNc preparado en el Ejemplo C-1 cuya expresión se podía confirmar por el método RT-PCR en distintos tejidos/células, 0,4 mM de cada uno de los tipos de cebadores que tenían sitios de restricción BamHI y SalI (descritos en los SEQ ID NO: 36 y 37), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo una PCR con 30 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 7 minutos utilizando un Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplificaban la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 30. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 7,0 kpb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). La E. coli se transformó con el producto resultante de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción BamHI y SalI y se purificó utilizando un Kit de extracción en gel QIAquick, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con BamHI y SalI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína recombinante de fusión con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y se indujo la expresión de la proteína de interés con 1 mM deIPTG.

(2) Purificación de la proteína recombinante

Las células de E. coli recombinantes que expresabanel SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 29, respectivamente, se cultivaron en 30 pg/ml de medio LB que contenía kanamicina a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzaba aproximadamente 0,7, y entonces se añadió al mismo isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido de manera que su concentración final debería ser de 1 mM, seguido por el cultivo a 30 °C durante 20 horas. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El aglomerado de células se suspendió en solución salina tampón fosfato y adicionalmente se sometió a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

Las células se suspendieron en solución salina de tampón de fosfato y se sometieron a sonicación en hielo. La solución de E. coli sonicada se centrifugó a 7000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como fracción soluble y el precipitado como fracción insoluble. La fracción insoluble se suspendió en un 4 % de solución de Triton X-100 y la suspensión resultante se centrifugó a 7000 rpm durante 20 minutos. Esta operación se repitió dos veces y se llevó a cabo una operación de retirada de proteasas. El resto se suspendió en 10 mM de Tris-HCl que contenía urea 8 M, 100 mM de tampón fosfato (al que se hace referencia de aquí en adelante como solución de urea 8 M) y una solución de un coctel de inhibidores de proteasa, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C durante 20 horas para desnaturalizar las proteínas.

A continuación, se centrifugó la suspensión a 7.000 rpm durante 20 minutos, y la fracción soluble obtenida se colocó en una columna con quelante de níquel preparada por un método convencional (vehículo: Fast Flow Sepharose Chelating (marca registrada) (GE Healthcare); volumen de columna: 5 ml; tampón de equilibración: solución de urea 8 M), seguido por un reposo a 4 °C durante una noche. Se recuperó el sobrenadante por centrifugación de este vehículo de la columna a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el vehículo de la columna se suspendió en solución salina tampón fosfato, seguido por rellenado de la columna con la suspensión resultante. La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de solución de urea 8 M, 10 volúmenes de columna de 0,1 M de tampón de acetato que contenía 0,5 M de cloruro sódico (pH 5,0) y 20 mM de tampón fosfato que contenía 10 mM de imidazol(pH 8,0), y se llevó a cabo inmediatamente la elución con un gradiente de densidad de cinco etapas de 100 mM-500 mM de imidazol para obtener una fracción purificada, que se utilizó como material para los ensayos de administración a continuación. Las proteínas de interés en las fracciones eluídas respectivas se confirmaron por tinción de Coomasie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. Entre estas, la CEP canina recombinante descrita en el SEQ ID NO: 26 se muestra en la Fig. 6.

Para 1 ml del tampón de reacción (20 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 2 mM de CaCh; pH 7,4) se hicieron alícuotas de 200 |jl de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente, y se añadieron 2 jl de enterocinasa (fabricada por Novagen) a la misma, dejándolo en reposo a continuación a temperatura ambiente durante una noche para escindir el marcador His. El producto resultante se purificó utilizando el Kit de captura de escisión de enterocinasa (Fabricado por Novagen) de acuerdo con los protocolos adjuntos al kit. Posteriormente, el tampón contenido en 1,2 ml de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con tampón de fosfato fisiológico (fabricado por Nissui Pharmaceutical) por ultra-filtración utilizando NANOSEP 10k OMEGA (fabricado por PALL), y la solución resultante se filtró asépticamente utilizando HT Tuffryn Acrodisc de 0,22 mm (fabricado por PALL) y se utilizó en los siguientes experimentos.

Ejemplo de referencia C-3: Ensayo de Administración de una proteína recombinante a perros que albergan un cáncer

(1) Ensayo antitumoral

Se mezcló una cantidad igual de adyuvante incompleto de Freund (fabricado por Wako Pure Chemicals) con 100 jg (0,5 ml) de cada una de CEP canina recombinante descrita en el SEQ ID NO: 26 y CEP humana purificadas como se ha descrito anteriormente para preparar agentes terapéuticos para un cáncer(es). Cada uno de estos agentes se administró en un ganglio linfático en la vecindad del tumor un total de 3 veces, llevando a cabo las administraciones posteriores a los 3 días y 7 días después de la primera administración. Como resultado los tumores con un tamaño de aproximadamente 87 mm3 y 69 mm3 en el momento de la administración de los agentes terapéuticos para un cáncer(es) (derivados de perro y ser humano), respectivamente, se redujeron en tamaño a 69 mm3 y 56 mm3, respectivamente, 10 días después de la primera administración; 24 mm3 y 31 mm3, respectivamente 20 días después de la primera administración; y a 10 mm3 y 8 mm3, respectivamente 30 días después de la primera administración.

Adicionalmente, se administró a un paciente canino que padecía un adenocarcinoma mamario, una mezcla de 100 jg (0,5 ml) de la proteína CEP canina descrita en el SEQ ID NO: 26 con 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund un total de 3 veces de la misma manera descrita anteriormente. Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron por vía subcutánea 10 mU de “Intercat” que es un interferón recombinante felino. Como resultado el tumor, con un tamaño de aproximadamente 126 mm3 en el momento de la administración del agente terapéutico para un cáncer(es) remitió completamente 26 días después de la primera administración del agente terapéutico. De manera similar, en el caso en el que se utilizó la CEP canina descrita en el SEQ ID NO: 28, también se observó un efecto anti-tumoral en un perro que albergaba un cáncer.

Además, se administró a un paciente canino que padecía un mastocitoma, una mezcla de 100 jg (0,5 ml) de la proteína CEP canina descrita en el SEQ ID NO: 26 con 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund un total de 3 veces de la misma manera que se ha descrito anteriormente. Además, simultáneamente a las respectivas administraciones, se administraron 100 jg de interleucina-12 canina por vía subcutánea. Como resultado, el tumor con un tamaño de aproximadamente 83 mm3 en el momento de la administración del agente terapéutico remitió completamente 18 días después de la primera administración del agente terapéutico.

(2) Ensayo de inducción de la inmunidad

En una placa de 96 pocillos fabricada por Millipore (MultiScreen-IP, MAIPS 4510), se colocaron 100 |jl/pocillo de etanol al 70 % y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del etanol por aspiración. La placa se lavó con agua estéril y se colocaron 300 jl/pocillo de Bicarbonato sódico 200 mM (pH 8,2) en los mismos. Después de dejarlo en reposo durante 5 minutos se retiró el Bicarbonato Sódico por aspiración, y entonces la placa se lavó. Posteriormente, se colocaron 0,5 jl/pocillo de anticuerpo monoclonal anti-interferón y canino (fabricado por R&D, clon 142529, MAB781) mezclado con 200 mM de Bicarbonato Sódico, y la placa se incubó a 37 °C durante una noche para inmovilizar el anticuerpo primario. Después de retirar el anticuerpo primario por aspiración, se añadieron a los pocillos 300 jl/pocillo de una solución bloqueante (un 1 % de BSA-5 % de sacarosa-200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2)), y la placa se incubó a 4 °C durante una noche para bloquear la placa. Después de retirar la solución bloqueante por aspiración se colocaron 300 jl/pocillo de medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino (fabricado por Invitrogen) en los pocillos, y la placa se dejó en reposo durante 5 minutos, seguido por la retirada del medio por aspiración. Posteriormente, se colocaron en la placa 5 x 105 células /pocillo de las células mononucleares de sangre periférica caninas suspendidas en medio RPMI que contenía un 10 % de suero fetal bovino, y se añadieron a las mismas 10 jl/pocillo de la CEP canina descrita en el SEQ ID NO: 26 o la CEP humana que se utilizaron en cada administración, seguido por el cultivo de las células en condiciones de 37 °C y un 5 % de CO²durante 24 horas, para permitir que los inmunocitos que pudieran existir en las células mononucleares de sangre periférica produjeran interferón ^y. Después del cultivo, se retiró el medio, y los pocillos se lavaron 6 veces con una solución de lavado (un 0,1 % de Tween 20- 200 mM de Bicarbonato Sódico (pH 8,2). En cada pocillo se colocaron 100 j l de anticuerpo policlonal de conejo anti-canino diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y la placa se incubó a 4 °C durante una noche. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, se colocaron en cada pocillo 100 j l de anticuerpo anti-conejo marcado con HRP diluido 1000 veces con la solución bloqueante descrita anteriormente, y se permitió proceder la reacción a 37 °C durante 2 horas. Después de lavar los pocillos 3 veces con la solución de lavado descrita anteriormente, el resultado se coloreó con inmunotinción de Konica (fabricado por Konica), y los pocillos se lavaron con agua para parar la reacción. A continuación, se secó la membrana, y se llevó a cabo el procesamiento de imágenes de los pocillos, seguido por el recuento del número de células formadoras de puntos (SFC) utilizando el KS ELISPOT compact system (Carl Zeiss, Inc., Alemania).

Como resultado en el paciente canino al que se administró la CEP canina descrita en el SEQ ID NO: 26 o la CEP humana, la muestra de células mononucleares de sangre periférica que se había extraído antes de la administración no presentaba puntos. Por otra parte, en el paciente canino al que se había administrado la CEP canina, las muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas 10 días y 30 días después de la administración presentaban 23 y 52 puntos, respectivamente. En el paciente canino en el que se había administrado la CEP humana, las muestras de células mononucleares de sangre periférica extraídas a los 10 días y 30 días después de la administración presentaban 19 y 49 puntos, respectivamente.

Ejemplo de referencia D-1: Adquisición del nuevo antígeno proteico del cáncer por el método SEREX

(1) Preparación de la biblioteca de ADNc

Utilizando el ARNm obtenido (5 jg), se sintetizó una biblioteca de fagos ADNc. La preparación de la biblioteca de fagos ADNc se llevó a cabo utilizando un kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis ZAP-ADNc, y el kit de clonación ZAP-cDNA Gigapack III Gold (fabricado por STRATAGENE) de acuerdo con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la biblioteca de fabos ADNc era de 1,3 x 106 ufp/ml.

(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero

Respecto al suero del paciente canino descrito anteriormente, se utilizó el suero recogido de pacientes caninos que padecían cáncer de mama. El suero se almacenó a -80 °C y se pre-trató inmediatamente antes de su uso. El método del pre-tratamiento era el siguiente. Es decir, se infectaron las células huésped de E. coli (XL 1-Blue MRF') con el fago A ZAP Express en el que no se había insertado ningún gen ajeno, y entonces se cultivó en una placa con medio NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa el tampón de 0,2 M de NaHCÜ3, pH 8,3 que contenía 0,5 M de NaCl, y la placa se dejó en reposo a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recogida del sobrenadante como extracto de E. coli/fago. A continuación, se permitió que el extracto de E. coli/fago recogido fluyera a través de una columna NHS (fabricada por GE Healthcare Bio-Science) para inmovilizar las proteínas derivadas de E. coli/fago en la misma. Se permitió que el suero de los pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna de proteína inmovilizada para retirar los anticuerpos absorbidos en la E. coli y/o el fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna estaba diluida 500 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada, y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración.

La membrana sobre la cual el suero tratado de esta manera y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron se lavó 4 veces con TBS-T (0,05 % de Tween 20/t BS), y se permitió que reaccionara con anti-IgG de perro de cabra (anti-IgG-h+I de perro de cabra conjugado con h RP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5000 veces con TBS que contenía un 0,5 % de leche en polvo desnatada como un anticuerpos secundario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por la detección por la reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones donde se observó la reacción de coloración era positiva se recuperaron de la placa de NZY agarosa que tiene un tamaño de 090 x 15 mm, y se disolvieron en 500 |jl de tampón SM (100 mM de NaCl, 10 mm de MgClSÜ4, 50 mM de Tris-HCl, 0,01 % de gelatina; pH 7,5). Se repitió la exploración como una segunda y tercera exploración de la misma manera que se ha descrito anteriormente hasta que se obtenía una única colonia positiva a la reacción coloreada, aislando de esta manera un clon positivo después de la exploración de 30.940 clones de fago reactivos con la IgG del suero.

(3) Búsqueda de homología del gen antigénico asilado

Para someter el único clon positivo aislado por el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo una operación de conversión del vector fago a un vector plasmídico. Más particularmente, se mezclaron 200 j l de una solución preparada para contener una E. coli huésped (XL 1-Blue MRF') de manera que la absorbancia a D^ü6^oodebería ser 1,0 con 100 j l de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 j l del fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se permitió que la reacción procediera a 37 °C durante 25 minutos. A la mezcla de reacción, se añadieron 3 ml de medio LB, y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido por incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. La mezcla se centrifugó entonces a 4 °C a 1000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante se recuperó como una solución de fagémidos. Posteriormente, se mezclaron 200 j l de una solución preparada para contener una E. coli huésped fagémido (SÜLR) de manera que la DÜ⁶⁰⁰debería ser de 1,0 con 10 j l de una solución de fagos purificados, y se permitió que procediera la reacción a 37 °C durante 15 minutos. A continuación, 50 j l de la mezcla de reacción se colocaron en una placa con medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/ml) a 37 °C durante una noche. Se recogió una única colonia de S^üLR transformada y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/ml) a 37 °C, seguido por purificación del ADN plasmídico que tiene una inserción de interés utilizando el kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen).

El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia completa de la inserción por el método del cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en el SEQ ID NÜ: 5 y el cebador T7 descrito en el SEQ ID NÜ: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia genética descrita en el SEQ ID NÜ: 15. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo una búsqueda de homología contra genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen TRIP11. El factor homólogo humano del gen TRIP11 canino era el TRIP11 humano (homología: secuencia de bases, 88 %; secuencia de aminoácidos, 86 %). La secuencia de bases de la TRIP11 humana se muestra en el SEQ ID NÜ: 40, y su secuencia de aminoácidos se muestra en el SEQ ID NÜ: 41.

(4) Análisis de expresión en cada tejido

La expresión del gen, que se obtuvo por el método descrito anteriormente, en tejidos normales y en distintas líneas celulares de perros y seres humanos se investigó por el método RT-PCR (PCR de transcripción inversa). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo de la siguiente manera. Es decir, el ARN total se extrajo de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando el reactivo TRIZÜL (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó el ADNc por el sistema de síntesis de primera-cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Con respecto a los ADNc de tejidos humanos normales (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizaron el agrupamiento genético de ADNc (fabricado por Invitrogen), el ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADN de gran inserción (fabricado por CLONTECH). Las reacciones PCR se llevaron a cabo como sigue utilizando cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 42 y 43) específicos para el gen obtenido. Es decir, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de manera que la mezcla debería contener 0,25 pl de la muestra preparada por la reacción de transcripción inversa, 2 mM de cada uno de los cebadores anteriores, 0,2 mM de cada uno de los dNTP, y 0,65 U de la polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 pl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1,5 minutos utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos del gen eran los que amplifican las regiones de las bases 1519a a 2957a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 38 (gen TRIP11 canino) y las bases 1872a a ^{33 10}a de la secuencia de bases de SEQ ID NO: 40 (gen TRIP11 humano), y se puede utilizar para la investigación de la expresión tanto del gen TRIP11 canino como del gen TRIP11 humano. Como control para la comparación, se utilizaron simultáneamente cebadores (descritos en los SEQ ID NO: 9 y 10) específicos parara GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 7, se observaba una fuerte expresión del gen TRIP11 canino obtenido en los testículos entre los tejidos normales de perro y por otra parte, se observó una fuerte expresión en la línea celular de cáncer de mama canino. La expresión del gen humano se confirmó, como en el caso del gen TRIP11 canino, solamente en los testículos entre los tejidos normales humanos pero la expresión se detectó en muchos tipos de líneas celulares tales como líneas celulares de tumor cerebral, leucemia, cáncer de mama, cáncer de pulmón y células de cáncer de esófago entre las líneas celulares de cáncer humano. Por lo tanto, también se confirmó que el gen TRIP11 humano se expresa específicamente en los testículos y en células cancerosas.

En la Fig. 7, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen TRIP11, y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control de comparación.

Ejemplo de referencia D-2: Preparación de proteínas TRIP11 caninas y humanas

(1) Preparación de la proteína recombinante

Basándose en el gen de SEQ ID NO: 38 obtenido en el Ejemplo D-1, se preparó una proteína recombinante por el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del vector que se preparó de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo D-1 y se sometió a análisis de secuencia, 0,4 mM de cada uno de los dos tipo de cebadores que tenían los sitios de restricción SalI y Xhol (descritos en los SEQ ID NO: 11 y 12), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 6 minutos utilizando el Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplifican la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 39. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,0 kpb utilizando el kit de extracción QIAquick Gel (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó la El coli con el resultante producto de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción SalI y XhoI y se purificó utilizando el Kit de extracción QIAquick Gel, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en el vector de expresión para E. coli, pET16b (fabricado por Novagen) que se había tratado con SalI y XhoI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína de fusión recombinante con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y la expresión de la proteína de interese se indujo en E. coli con 1 mM de IPTG.

Además, basándose en el gen de SEQ ID NO: 40, se preparó una proteína recombinante del gen homólogo humano mediante el siguiente método. Los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de manera que la mezcla debería contener 1 pl del ADNc preparado en el Ejemplo D-1 cuya expresión se podía confirmar por el método RT-PCR en distintos tejidos/células, 0,4 mM de cada uno de los tipos de cebadores que tenían sitios de restricción NdeI y KpnI (descritos en los SEQ ID NO: 46 y 47), 0,2 mM de dNTP y 1,25 U de polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo una PCR con 30 ciclos a 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 6 minutos utilizando un Thermal Cycler (fabricado por BIO RAD). Los dos tipos de cebadores descritos anteriormente eran los que amplificaban la región que codifica la secuencia de aminoácidos completa de SEQ ID NO: 41. Después de la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un 1 % de gel de agarosa, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,0 kpb utilizando el kit de extracción QIAquick Gel (fabricado por QIAGEN).

El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). La E. coli se transformó con el producto resultante de la ligadura, y se recuperaron los plásmidos a continuación, seguido por la confirmación, por secuenciación, de que el fragmento de gen amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción NdeI y KpnI y se purificó utilizando un Kit de extracción QIAquick Gel, seguido por la inserción de la secuencia genética de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con NdeI y KpnI. El uso de este vector hacía posible la producción de una proteína recombinante de fusión con marcador His. La E. coli para la expresión, BL21 (DE3), se transformó con este plásmido, y se indujo la expresión de la proteína de interés con 1 mM deIPTG.

(2) Purificación de proteínas recombinantes

Las células de E. coli recombinantes obtenidas anteriormente que expresabanel SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40, respectivamente, se cultivaron en 30 |jg/ml de medio LB que contenía kanamicina a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzaba aproximadamente 0,7, y entonces se añadió al mismo isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido de manera que su concentración final debería ser de 1 mM, seguido por el cultivo a 30 °C durante 20 horas. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El aglomerado de células se suspendió en solución salina tampón fosfato y adicionalmente se sometió a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos para lavar las células.

El aglomerado de células de E. coli obtenido se suspendió en solución salina tampón de fosfato y se sometió a sonicación en hielo. La solución de E. coli sonicada se centrifugó a 7.000 rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante como fracción soluble y el precipitado como fracción insoluble.

La fracción insoluble se suspendió en una solución de Triton X-100 al 4 % y la suspensión resultante se centrifugó a 7.000 rpm durante 10 minutos. Esta operación se repitió dos veces y se llevó a cabo una operación de retirada de proteasas. A continuación, el resto se suspendió en solución salina tampón de fosfato y se llevó a cabo una operación de retirada del tensioactivo.

El residuo se suspendió en 20 mM de tampón de fosfato que contenía hidrocloruro de guanidina 6 M (pH 8,0) y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C durante 20 horas para desnaturalizar las proteínas. A continuación, se centrifugó la suspensión a 7.000 rpm durante 20 minutos, y la fracción soluble obtenida se colocó en una columna con quelante de níquel preparada por un método convencional (vehículo: Fast Flow Sepharose Chelating (marca registrada) (GE Healthcare); volumen de columna: 5 ml; tampón de equilibración: 20 mM de tampón de fosfato que contenía hidrocloruro de guanidina 6 M, (pH 8,0)). La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de 20 mM de tampón de fosfato que contenía hidrocloruro de sodio 6 M (pH 8,0) y 20 mM de tampón de fosfato que contenía 10 mM de imidazol (pH 8,0), y se llevó a cabo inmediatamente la elución con un gradiente de densidad de cuatro etapas de 50 mM-500 mM de para obtener una fracción purificada, que se utilizó como material para los ensayos de administración a continuación. Las proteínas de interés en las fracciones eluídas se confirmaron por tinción de Coomasie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. Entre estas, la proteína TRIP11 canina se muestra en la Fig. 8.

Para 1 ml del tampón de reacción (20 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, 2 mM de CaCh; pH 7,4) se hicieron alícuotas de 200 j l de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente, y se añadieron 2 jl de enterocinasa (fabricada por Novagen) a la misma, dejándolo en reposo a continuación a temperatura ambiente durante una noche para escindir el marcador His. El producto resultante se purificó utilizando el Kit de captura de escisión de enterocinasa (Fabricado por Novagen) de acuerdo con los protocolos adjuntos al kit. Posteriormente, el tampón contenido en 1,2 ml de la preparación purificada obtenida por el método descrito anteriormente se sustituyó con tampón de fosfato fisiológico (fabricado por Nissui Pharmaceutical) por ultra-filtración utilizando NANOSEP 10^kOMEGA (fabricado por PALL), y la solución resultante se filtró asépticamente utilizando HT Tuffryn Acrodisc de 0,22 mm (fabricado por PALL), y se utilizó en los siguientes experimentos.

Ejemplo de referencia D-3: Ensayo de Administración de una proteína recombinante a perros que albergan un cáncer

(1) Ensayo antitumoral

Se prepararon agentes terapéuticos para un cáncer(es) mezclando 0,5 ml de adyuvante incompleto de Freund (fabricado por Wako Pure Chemicals) con 100 jg (0,5 ml) de proteínas recombinantes TRIP11 canina y TRIP11 humana, respectivamente, purificadas como se ha descrito anteriormente. Cada uno de estos agentes se administró en un ganglio linfático en la vecindad del tumor un total de 3 veces, llevando a cabo las administraciones posteriores a los 3 días y 7 días después de la primera administración. como resultado los tumores con un tamaño de aproximadamente 75 mm3 y 102 mm3 en el momento de la administración de los agentes terapéuticos para un

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente para su uso en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de un cáncer/cánceres, comprendiendo el agente, como principio activo, uno cualquiera de los polipéptidos (a) o (b) de abajo, teniendo dicho polipéptido actividad inductora de citotoxicidad de inducción de actividad citotóxica contra células tumorales in vitro en células T estimuladas con el polipéptido, o como principio activo, un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica dicho polipéptido y que es capaz de expresar in vivo dicho polipéptido:

(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en los SEQ ID NO: 16 o 18 del LISTADO DE SECUENCIAS; y

(b) un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de no menos del 90 % con el polipéptido (a).

2. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido (b) tiene una identidad de secuencia de no menos del 95 % con dicho polipéptido (a).

3. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido que tiene actividad inductora de citotoxicidad consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra en los SEQ iD NO: 16 o 18 del LISTADO DE SECUENCIAS.

4. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que como principio activo, contiene el polipéptido.

5. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, que es para su uso poniendo en contacto in vitro células presentadoras de antígeno con el agente, de manera que se hace que las células presentadoras de antígeno presenten el polipéptido, y después (i) administrar las células presentadoras de antígeno a un sujeto; o (ii) poner en contacto in vitro las células T con las células presentadoras de antígeno, de tal manera que las células T citotóxicas específicas para el polipéptido se induzcan y se permita que proliferen, y después administrar al sujeto las células T citotóxicas.

6. El agente para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es para su uso en seres humanos, perros o gatos.

7. El agente para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende adicionalmente un inmunopotenciador.

8. El agente para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho inmunopotenciador es al menos uno que se selecciona de entre el grupo que consiste en adyuvante incompleto de Freund; poli I:C y derivados del mismo; oligonucleótidos CpG; interleucina-12; interleucina-18; interferón-a; interferón-p; interferón-w; interferón-Y; y ligando FIt3.

9. Un método in vitro para el tratamiento de células presentadoras de antígeno, comprendiendo dicho método poner en contacto con células presentadoras de antígeno, uno cualquiera de los polipéptidos (a) o (b) de abajo, teniendo dicho polipéptido una actividad inductora de citotoxicidad de inducción de actividad citotóxica contra células tumorales in vitro en células T estimuladas con el polipéptido:

10. Un método in vitro de preparación de una célula T citotóxica, comprendiendo el método:

cultivar conjuntamente una célula presentadora de antígeno, preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 9, con células T en un medio líquido, y

permitir que las células T proliferen.

11. Un método in vitro de acuerdo con la reivindicación 10, en el que se utiliza una relación entre célula presentadora de antígeno: célula T de 1:1 a 1:100, opcionalmente en el que el cultivo conjunto se realiza en presencia de IL-2, IL-6, IL-7 y/o IL-12.

12. Un uso de uno cualquiera de los polipéptidos (a) o (b) de abajo, teniendo dicho polipéptido una actividad inductora de citotoxicidad de inducción de actividad citotóxica contra células tumorales in vitro en células T estimuladas con el polipéptido, o un vector recombinante que comprende un polinucleótido que codifica dicho polipéptido y que es capaz de expresar in vivo dicho polipéptido, en la fabricación de un agente para su uso en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de uno o más cánceres: