ES2824204T3

ES2824204T3 - Composiciones que comprenden un concentrado de tomate claro tratado térmicamente

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Publication number: ES2824204T3
Application number: ES14742819T
Authority: ES
Inventors: Tatyana Atlasman; Yoav Blatt; Rachel Levy; Yoav Sharoni; Joseph Levy; Morris Zelkha
Original assignee: Lycored Ltd
Current assignee: Lycored Ltd
Priority date: 2013-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: MX2015009385A; JP2016505037A; JP6641180B2; CL2015002037A1; EP2948005B1; EP2948005A1; ZA201505259B; CA2898284C; BR112015017355A2; US10993982B2; KR20150109471A; EP2948005A4; RU2015135595A; US20150352169A1; CA2898284A1; WO2014115140A1; CN105228467A

Abstract

Una composicion terapeutica, que comprende un concentrado de tomate claro (CTC) tratado termicamente, en donde la concentracion total de aminoacidos libres es inferior al 2 % p/p, en donde el concentrado de tomate claro (CTC) tratado termicamente se obtiene al calentar el CTC a 90 ºC durante un periodo de entre 1 y 3 horas.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones que comprenden un concentrado de tomate claro tratado térmicamente

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición, que comprende un concentrado derivado de tomate tratado térmicamente, que ha sido descubierto por poseer un nivel inesperadamente alto de actividad antiinflamatoria. La presente invención también se dirige a una combinación sinérgica de un concentrado derivado de tomate tratado térmicamente con carotenoides.

Antecedentes de la invención

El proceso inflamatorio, que forma una parte importante del sistema inmunitario no específico, se caracteriza por un conjunto complejo de cambios químicos y celulares que son esenciales para la defensa del huésped ante agentes microbianos y otros factores ambientales potencialmente perjudiciales. Sin embargo, en muchos casos, la inflamación puede ser provocada inapropiadamente, y/o puede persistir hasta un grado que llega a ser perjudicial para el huésped. En estos casos, puede haber una necesidad para inhibir o prevenir el desarrollo de uno o más aspectos del proceso inflamatorio, en particular, en casos de enfermedades inflamatorias no infecciosas.

Se ha mostrado que un número muy grande de diferentes mediadores químicos está implicado en el desarrollo y control del proceso inflamatorio. Estudios recientes por un número de diferentes laboratorios han implicado el óxido nítrico (NO) como un importante modulador de varios trastornos inflamatorios agudos y crónicos, incluyendo varios tipos de artritis, enfermedades gastrointestinales, afecciones inflamatorias del sistema nervioso central y ciertas formas de asma. Por consiguiente, se ha propuesto que la inhibición de la producción de NO podría proporcionar un mecanismo terapéutico útil para el tratamiento y/o gestión de estos trastornos inflamatorios. Adicionalmente, la inhibición de la síntesis de NO también ha mostrado que es útil en algunas afecciones o estados que no son principalmente de naturaleza inflamatoria. Por tanto, por ejemplo, la inhibición de la síntesis de NO ha sido descubierta por reducir la captación de glucosa en el tejido de la extremidad en individuos con diabetes tipo 2 durante el ejercicio.

La producción in vivo de NO es mediada por una familia de enzimas de óxido nítrico sintasa (NOS), incluyendo óxido nítrico sintasa inducible (I-NOS), que es activada por muchos estímulos inmunológicos diferentes incluyendo lipopolisacárido (LPS), interferón gama e interleucina 1 (IL-1).

La inhibición de NO se puede lograr tanto in vitro como in vivo mediante el uso de citrato de L-NG-monometil arginina (L-NMMA). Asimismo, varios otros compuestos, incluyendo un número de productos naturales, también han mostrado que inhiben la producción de NO. El último grupo incluye compuestos tales como luteína /Rafi M.M. et al. Mol Nutr Food Res. marzo de 2007; 51(3):333-40; Choi, J.S. Nutrition. junio de 2006; 22(6):668-71/ y licopeno /Rafi, M.M. et al. J Food Sci. enero de 2007; 72(í):S069-74/. Sin embargo, la eficacia y potencia de muchos de los inhibidores de NO de producto natural han demostrado que no son particularmente altas. Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones mejoradas de origen natural que inhiban la producción de NO.

El documento US 2009/0264291 A1 divulga extractos acuosos derivados de plantas, incluyendo tomates que tienen efectos antiproliferativos.

Otro mediador inflamatorio de gran importancia es el factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa), que es una citocina producida por varios tipos de células incluyendo macrófagos, neutrófilos y linfocitos. El TNF-alfa ocupa una posición clave en la fase temprana del proceso inflamatorio y es responsable de estimular la producción de otros factores tales como el factor nuclear kB que, a su vez, provoca la activación de un amplio intervalo de genes proinflamatorios. Por tanto, en vista de esta función proinflamatoria clave, el TNF-alfa es claramente una diana terapéutica potencial importante para los agentes antiinflamatorios.

Volviendo ahora a otro aspecto, con el fin de conservar la estructura ósea normal, sana, el hueso es sometido continuamente a remodelación, en donde el hueso se rompe por los osteoclastos y se vuelve a construir por los osteoblastos.

La diferenciación de los osteoclastos se ve influida entre otras cosas por RANKL (activador del receptor de ligando NFKB), una citocina producida por osteoblastos, que se une a las células progenitoras de osteoclastos. La inhibición de este proceso conduciría a una reducción en la actividad osteoclástica, y, de este modo, inhibiría la resorción ósea.

Una estrategia alternativa para alterar el equilibrio entre la resorción ósea y el producto de nuevo hueso en el proceso de remodelación ósea sería provocar un incremento de la actividad de osteoblastos. Si bien este resultado se puede lograr potencialmente en varias formas, una vía posible es a través de la activación de la señalización del elemento de respuesta antioxidante (ARE/Nrf2) en los osteoblastos.

Un desequilibrio entre la formación ósea y la resorción ósea puede conducir al desarrollo de afecciones patológicas tales como osteoporosis, artritis, enfermedad periodontal, mieloma múltiple y canceres metastásicos. Para los individuos con osteoporosis, las fracturas óseas representan eventos potencialmente mortales, y hoy en día están en riesgo más de 70 millones de personas en el mundo.

En casos de resorción ósea excesiva (tal como ocurre en la osteoporosis), sería ventajoso ser capaces de alterar el equilibrio entre la resorción y la fijación del nuevo hueso. Idealmente, esto se lograría mediante el uso de una sustancia no tóxica, natural que esté sustancialmente libre de efectos adversos. Uno de los objetivos de la presente invención es cumplir esta necesidad.

Un fin de la presente invención es proporcionar una composición de producto natural que se pueda usar para inhibir la producción de uno o más mediadores inflamatorios claves, tales como NO y TNF-alfa, como un medio para tratar o gestionar estados patológicos y procesos en los que están implicados dichos mediadores.

Es otro fin de la presente invención proporcionar una composición derivada de tomate que tenga propiedades antiinflamatorias mejoradas.

Todavía un fin adicional de la presente invención es proporcionar una composición de producto natural para mejorar la salud ósea.

Otros objetivos y fines llegarán a ser evidentes conforme la descripción proceda.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto ahora que las propiedades antiinflamatorias de un producto derivado de tomate conocido como concentrado de tomate claro (CTC) se mejoran al someter dicho CTC a un tratamiento térmico antes de su uso.

El término "CTC" se refiere a un suero de tomate concentrado que se obtiene por medio de la separación del material de tomate (tal como tomates triturados o jugo de tomate) en pulpa y suero, desechando la pulpa y luego concentrando dicho suero a un valor Brix entre aproximadamente 40 y 80, preferentemente entre 55° Bx. El suero concentrado es referido como "CTC". Los detalles adicionales de la preparación del CTC se proporcionarán a continuación en el presente documento.

En consecuencia, la presente invención proporciona una composición como se expone en la reivindicación 1. Las características preferidas han sido expuestas en las reivindicaciones 2 a 16.

El CTC (a una concentración que corresponde a aproximadamente 60 Bx) se calienta a 90 grados C durante un período de entre 1 y 3 horas. En una realización preferida, el CTC tratado térmicamente se prepara al calentar el CTC durante 1 hora a 90 grados C.

En una realización preferida, la composición terapéutica de la presente invención consiste esencialmente en un CTC tratado térmicamente.

Cabe señalar que la expresión "consiste esencialmente en", como se usa a lo largo de esta divulgación y las reivindicaciones adjuntas se refiere a la situación en donde la composición de la presente invención puede comprender, además de la sustancia activa primaria (CTC calentado), otros compuestos, sustancias y agentes que no afectan materialmente las características básicas y novedosas e inventivas de la presente invención.

La composición divulgada anteriormente que comprende CTC tratado térmicamente tiene una concentración total de aminoácidos libres que es inferior a 2 % p/p. También, la concentración de glutamina libre de la composición que comprende CTC tratado térmicamente es preferentemente inferior a 0,1 % p/p.

Adicionalmente, ahora se ha descubierto inesperadamente que el CTC calentado interactúa sinérgicamente con los carotenoides, produciendo de esta manera un efecto antiinflamatorio mejorado. La presente invención por lo tanto se dirige además a una composición terapéutica que comprende una combinación sinérgica de CTC tratado térmicamente y uno o más carotenoides.

En una realización preferida de esta composición de combinación, la concentración total de aminoácidos libres es inferior a 2 % p/p. Similarmente, la concentración de glutamina libre es preferentemente inferior a 0,1 % p/p.

Si bien pueden incorporarse muchos carotenoides diferentes en la composición de la presente invención, en una realización preferida, dicha composición comprende uno o más carotenoides seleccionados entre el grupo que consiste en licopeno, fitoeno, fitoflueno, beta-caroteno y luteína, y/o sus derivados. Sin embargo, se va a reconocer que muchos otros carotenoides también se pueden usar para preparar las composiciones sinérgicas de la presente invención.

En una realización particularmente preferida, la composición de la presente invención comprende CTC calentado y oleorresina de tomate, en donde dicha oleorresina comprende los carotenoides licopeno, fitoeno, fitoflueno y betacaroteno. Un ejemplo comercialmente disponible de tal oleorresina de tomate es Lyc-O-Mato®, fabricado y suministrado por el solicitante, LycoRed Ltd. de Be'er Sheva, Israel.

En una realización preferida, la composición terapéutica de la presente invención consiste esencialmente en una combinación sinérgica de CTC tratado térmicamente y uno o más carotenoides. En una realización particularmente preferida, la composición terapéutica consiste esencialmente en una combinación sinérgica de CTC tratado térmicamente y uno o más carotenoides seleccionados entre el grupo que consiste en licopeno, fitoeno, fitoflueno, beta-caroteno y luteína. En una realización particularmente preferida, la composición de combinación comprende licopeno. De la manera más preferente, la composición consiste esencialmente en CTC tratado térmicamente y oleorresina de tomate.

Preferentemente, la concentración total de los carotenoides en la composición de combinación es al menos 0,1 % (p/p). En otra realización preferida, en donde los carotenoides incluyen licopeno, la concentración de dicho licopeno es al menos 0,1 % (p/p).

En el presente documento se divulgan combinaciones de uno o más carotenoides (como se ha divulgado más arriba) junto un CTC modificado que tiene una composición química y/o bioquímica similar a la del CTC tratado térmicamente definido más arriba o a dicho CTC modificado solo. Por tanto, en el presente documento se divulga una composición terapéutica que comprende una combinación sinérgica de uno o más carotenoides junto con el CTC que tiene una concentración total de aminoácidos libres de menos de 2 % p/p. Además, en el presente documento se divulga una composición terapéutica que comprende una combinación sinérgica de al menos un carotenoide junto con el CTC que tiene una concentración de glutamina libre de menos de 0,1 % p/p.

En el presente documento se divulga un método para inhibir o reducir la producción de uno o más mediadores antiinflamatorios en un sujeto, como un medio para tratar o gestionar estados y procesos patológicos en los que está implicado dicho mediador, en donde dicho método comprende administrar a dicho sujeto una composición terapéutica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones divulgadas más arriba. Si bien dicho método se puede usar para inhibir la producción de muchos mediadores inflamatorios diferentes, en una realización preferida, el mediador antiinflamatorio está seleccionado entre el grupo que consiste en NO, TNF-alfa e interleucina 1.

En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a una composición que comprende el dicho CTC tratado térmicamente para su uso en el tratamiento de afecciones sensibles a la inhibición de mediadores inflamatorios, particularmente NO, TNF-alfa y/o interleucina 1.

En un aspecto adicional, la presente invención se dirige a una composición que comprende el dicho CTC tratado térmicamente y uno o más carotenoides para su uso en el tratamiento de afecciones sensibles a la inhibición de NO, TNF-alfa y/o interleucina 1.

Aún en un aspecto adicional, la presente invención se dirige a cualquiera de las composiciones divulgadas más arriba para su uso en mejorar la salud ósea. En una realización preferida, dicha composición es capaz de inhibir la resorción ósea, y se puede usar en la prevención, el tratamiento o la gestión de afecciones tales como (pero no limitadas a) osteoporosis, artritis, enfermedad periodontal, mieloma múltiple y canceres metastásicos.

Adicionalmente, en el presente documento se divulga un método del tratamiento de afecciones patológicas en las que NO, TNF-alfa y/o interleucina 1 actúan como moduladores o mediadores de dicha afección en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, en donde dicho método comprende administrar a dicho sujeto una composición terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones divulgadas más arriba. En una realización preferida de este método, la afección que se va a tratar está seleccionada entre el grupo que consiste en afecciones inflamatorias agudas, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto (SDRA), asma, rinitis, fibrosis pulmonar idiopática, peritonitis, inflamación cardiovascular, isquemia miocárdica, lesión por reperfusión, ateroesclerosis, septicemia, traumatismo, diabetes tipo II, retinopatía, psoriasis, inflamación gastrointestinal, cirrosis, peritonitis y enfermedad inflamatoria intestinal, y enfermedades neurodegenerativas, tales como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (EA).

En una realización preferida, la afección que se va a tratar es una afección inflamatoria.

En otro aspecto, en el presente documento se divulga un método para mejorar la salud ósea en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una composición terapéutica como se divulga más arriba.

En una realización preferida de este aspecto, la mejora en la salud ósea comprende la inhibición de la resorción ósea.

El método para mejorar la salud ósea se puede usar en sujetos que tienen cualquier afección o enfermedad que responderán a la misma, incluyendo, pero no limitado a, osteoporosis, artritis, enfermedad periodontal, mieloma múltiple y canceres metastásicos.

En realizaciones preferidas de los métodos descritos más arriba, el sujeto es un sujeto mamífero y más preferentemente un sujeto humano.

Si bien en los métodos divulgados anteriormente, la composición terapéutica se puede administrar por cualquier medio conveniente, en una realización preferida, dicha composición se administra en una forma de dosificación farmacéutica. En otra realización preferida, sin embargo, la composición terapéutica se incorpora en un producto alimenticio o bebida. Todas las características y ventajas anteriores y otras de la presente invención se entenderán además a partir de los siguientes ejemplos ilustrativos y no limitantes de las realizaciones preferidas de la misma.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 compara gráficamente la inhibición de la producción de NO por macrófagos peritoneales mediante tratamiento con CTC regular no calentado (Fig. 1A) con aquel provocado por el tratamiento con CTC tratado térmicamente (Fig. 1B).

La Fig. 2 ilustra gráficamente el efecto de diferentes tiempos de calentamiento (0-120 minutos) en la capacidad del CTC tratado térmicamente para inhibir la producción de NO por macrófagos peritoneales.

La Fig. 3 ilustra gráficamente la concentración de glucosa en cada uno de los cinco lotes separados de CTC, tanto antes como después del calentamiento.

La Fig.4 ilustra gráficamente la concentración de fructosa en cada uno de los cinco lotes separados de CTC, tanto antes como después del calentamiento.

La Fig. 5 muestra el efecto inhibidor del CTC tratado térmicamente en la producción de TNF por macrófagos estimulados con LPS. La primera de cada una de las tres barras representa la inhibición obtenida con CTC tratado térmicamente reciente, mientras que la segunda y tercera barras representan los resultados obtenidos con el CTC tratado térmicamente que se almacenó durante seis meses a temperatura ambiente o a 40 °C, respectivamente. La Fig. 6 compara gráficamente la inhibición de la producción de NO por macrófagos peritoneales provocada por la oleorresina de tomate (Lyc-O-Mato) sola y CTC calentado solo, con una combinación de oleorresina de tomate y CTC calentado.

La Fig. 7 representa gráficamente la inhibición de la producción de NO por macrófagos peritoneales provocada por la luteína sola y CTC calentado solo, con una combinación de luteína y CTC calentado.

La Fig. 8 representa gráficamente la inhibición de la producción de NO por macrófagos peritoneales provocada por el beta-caroteno solo y CTC calentado solo, con una combinación de beta-caroteno y CTC calentado.

La Fig. 9 ilustra gráficamente el efecto inhibidor de una combinación de Lyc-O-Mato y CTC calentado en la producción de interleucina 1-B en un modelo de inflamación de la pata de rata inducida por carragenano.

La Fig. 10 compara gráficamente la capacidad de CTC calentado y el CTC no calentado para inhibir la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL, como se mide por la actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP). Los resultados indican que el CTC calentado es significativamente más potente que el CTC no calentado.

La Fig. 11 compara gráficamente la influencia de licopeno solo con CTC solo y con la adición del licopeno y CTC en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos inducida por RANKL, como se mide por TRAP.

La Fig. 12 compara gráficamente la activación dependiente de la dosis del elemento de respuesta antioxidante (ARE) por el CTC calentado en células osteoblásticas MC3T3 con la falta de tal activación que se observa con el CTC no calentado.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

Como se divulga más arriba, la presente invención proporciona composiciones que comprenden CTC tratado térmicamente solo o combinado con uno o más carotenoides. La fracción conocida como CTC se puede preparar normalmente (pero no exclusivamente) por medio del siguiente proceso:

Etapa 1: Los tomates se lavan y se clasifican de acuerdo con su color y calidad.

Etapa 2: Los tomates limpios se trituran; en este punto los tomates triturados crudos se muestrean para el contenido de licopeno y el contenido de azúcar.

Etapa 3: Los tomates triturados crudos se criban a través de redes de 4-6 y 12 mm.

Etapa adicional 3.1: Se añade agua a los sólidos retenidos que se criban adicionalmente en redes de 0,6 y 0,8 mm con el fin de eliminar las partículas de cáscara.

Etapa 4: La suspensión obtenida de la etapa 3 se criba adicionalmente en redes de 1,5 a 4 mm.

Etapa 5: Las suspensiones de la etapa 4 y 3.1 se agrupan conjuntamente y se almacenan en un recipiente; en este punto las suspensiones se muestrean y se analizan.

Etapa 6: La suspensión se transfiere a tanques de almacenamiento grandes.

Etapa 7: La suspensión se calienta a 80-85 °C y se muestrea.

Etapa 8: Una vez que la temperatura ha alcanzado 80-85 °C, la fase acuosa se separa de los sólidos en centrifugadoras horizontales (decantadores).

Etapa 9: El material sólido (pulpa) se empaca en bolsas laminadas colocadas en tambores de metal que después se muestrean y se etiquetan. Los tambores que contienen la pulpa después se congelan y se almacenan en condiciones congeladas.

Etapa 10: La fase acuosa (suero del decantador) se muestrea.

Etapa 11: El suero se filtra y se desairea bajo vacío con el fin de eliminar el exceso de espuma.

Etapa 12: El suero se almacena temporalmente en un recipiente grande.

Etapa 13: El suero se centrifuga y el sedimento se envía de regreso a la Etapa 5.

Etapa 14: El suero se concentra bajo vacío en un evaporador al valor Bx deseado.

El esquema anterior es solo un ejemplo de un proceso para producir CTC, y varios otros procesos también se pueden usar, sin desviarse del alcance de la presente invención. Sin embargo, las etapas clave de este proceso se puede resumir de la siguiente manera: Los tomates triturados se separan en dos fracciones - suero y pulpa -. El suero de tomate se concentra al valor Brix entre 40 y 80, preferentemente superior a 55°Bx. Este producto, que consiste en concentrado de tomate claro, es referido comúnmente como CTC.

Más información sobre la preparación y propiedades del CTC se puede encontrar en el documento WO 99/60868 de copropiedad, que se incorpora en el presente documento.

Como se ha explicado anteriormente en el presente documento, el CTC de la presente invención se somete a un tratamiento térmico. El CTC (a una concentración que corresponde a aproximadamente 60 Bx) se calienta a 90 grados C durante un período de entre 1 y 3 horas. En una realización particularmente preferida, el CTC tratado térmicamente se prepara al calentar el CTC durante 1 hora a 90 grados C.

Las cantidades diarias preferidas del CTC calentado, presentes en las composiciones que se administran a sujetos en necesidad de tal tratamiento están en el intervalo de 100 a 500 mg.

Las cantidades diarias preferidas de los carotenoides totales en las composiciones que contienen tanto CTC tratado térmicamente como carotenoides, que se administran a sujetos en necesidad de tal tratamiento, están en el intervalo de 2 a 20 mg.

Preferentemente, en las composiciones que contienen tanto CTC tratado térmicamente como carotenoides, los carotenoides están presentes en una concentración de al menos 0,1 %. En una realización preferida de la invención, las composiciones de combinación (es decir, aquellas composiciones que contienen tanto CTC calentado como carotenoides) comprenden licopeno en una concentración de al menos 0,1 %.

La composición de la presente invención se puede formular para ya sea uso sistémico o tópico. En el caso de administración sistémica, el CTC tratado térmicamente se puede incorporar en las formas de dosificación oral tales como comprimidos, comprimidos oblongos, cápsulas, jarabes, elixires, líquidos, etc.

En otras realizaciones preferidas, la composición de la presente invención puede administrarse por vía tópica, por ejemplo sobre la piel o membranas mucosas (p. ej., como cremas, lociones, ungüentos, etc.). Los detalles adicionales de los métodos adecuados para incorporar las composiciones que contienen CTC tratado térmicamente de la presente invención en las diversas formas de dosificación diferentes se pueden obtener de cualquier trabajo de referencia convencional conocido por el experto en la materia, incluyendo, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa, EE. UU., (1980).

En otras realizaciones preferidas, la composición de la presente invención se prepara como un aditivo alimenticio que es adecuado para la incorporación directa en un producto alimenticio o una bebida.

Los siguientes ejemplos están proporcionados para fines ilustrativos y con el fin de explicar y describir más particularmente la presente invención. La presente invención, sin embargo, no se limita a las realizaciones particulares divulgadas en estos ejemplos.

Ejemplo 1

Inhibición de la producción de NO usando CTC tratado térmicamente

Métodos y materiales:

Aislamiento de macrófagos y cultivo celular - Se recolectaron macrófagos peritoneales de la cavidad peritoneal de ratones ICR machos de 6-8 semanas de edad (Harlan, Israel) que se les había administrado una inyección intraperitoneal de 1,5 ml de caldo de tioglicolato (4 %) 4 días antes de la recolección. Los macrófagos peritoneales se lavaron tres veces con PBS y, si es necesario, se realizó una lisis hipotónica de eritrocitos, produciendo 90-95 % de pureza. Los macrófagos se identificaron por el análisis FACS usando F4/80 anti-ratón de rata conjugado con FITC (MCA497F) (Serotec, Oxford, Inglaterra) por microfluorimetría de flujo en FACS (Becton Dickinson, Mountain View, Ca ). Para cada muestra, se analizaron 10.000 células viables controladas por dispersión de luz. Se cultivaron macrófagos peritoneales en el medio RPMI 1640 que contiene 10 % de FCS, L-glutamina 2 mM; 100 U/ml de penicilina; 100 |jg/ml de estreptomicina (Beit-Baemek, Israel) en placas de 96 pocillos (1 x 106 células/pocillo) a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO². Las células se estimularon con LPS (1 jg/m l) en presencia o ausencia de CTC calentado. Se añadieron volúmenes apropiados de DMSO (0,1 %-0,2 %) a los controles y el porcentaje de inhibición en cada tubo de prueba se calculó en relación con su control.

El concentrado de tomate claro (CTC) se preparó como se ha descrito más arriba y, ya que es soluble en agua, se añadió directamente al medio de cultivo caliente en las diluciones deseadas.

A menos que se exprese lo contrario, el CTC tratado térmicamente usado en este estudio se refiere a CTC que se calentó a 90 grados C durante un período de una hora.

Ensayo de producción de NO - Los niveles de NO en los sobrenadantes de los cultivos celulares se determinaron al someter a ensayo los niveles de nitrito usando reactivo Griess y nitrito de sodio como un patrón como se describe en Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., y Tannenbaum, S. R. (1982) Anal Biochem.

126: 131-138.

Análisis estadístico - Los datos se representan como la media ± EEM. La significancia estadística para las comparaciones entre los grupos se determinó usando la prueba t de dos colas pareada de Student.

RESULTADOS

A. Inhibición dependiente de dosis de la producción de NO por CTC o CTC calentado.

Como se muestra en la Figura 1, la adición de CTC o CTC tratado térmicamente en diferentes soluciones a los macrófagos 1 h antes de la adición de 1 mg/ml de LPS durante 24 h, provocó una inhibición dependiente de dosis, que fue significativamente mucho más eficiente en el caso del CTC tratado térmicamente.

Como se ve en Fig. 1A, la inhibición por CTC (no tratado) se observó primero en una dilución de 1:200 y provocó 16+4 % de inhibición mientras que la inhibición máxima de 100 % se logró por la dilución de 1:25 de CTC.

La inhibición por el CTC tratado térmicamente (Fig. 1B) fue mucho más notable que aquella provocada por el CTC no calentado en la misma concentración. Incluso en una dilución de 1:8000 (datos no mostrados) se detectó una ligera inhibición de 3,5 %±1,5 %. En una dilución de 1:2000, la inhibición observada fue superior a 20 %, un incremento dependiente de dosis en la eficacia fue observado hasta una dilución de 1:200, punto en el cual se observó la inhibición máxima (100 %) de la producción de NO.

Ejemplo 2

Determinación de las condiciones óptimas del tratamiento térmico

Con el fin de investigar la duración del tiempo de calentamiento necesario para producir un incremento máximo en la eficacia antiinflamatoria, el CTC se calentó a 90 °C durante diferentes duraciones de tiempo antes de ser añadido a los macrófagos. Como se muestra en la Figura 2, 1 h de incubación es suficiente para lograr una inhibición máxima de la producción de NO para todas las diluciones de CTC diferentes analizadas.

Ejemplo 3

Caracterización del CTC tratado térmicamente

Las concentraciones de ciertos constituyentes clave de CTC tratado térmicamente se determinaron y se compararon con los niveles de dichos constituyentes en el CTC regular que no se ha sometido al tratamiento térmico.

A) Aminoácidos

Las concentraciones de varios aminoácidos libres en las muestras de CTC, (calentadas y no calentadas) se determinaron usando un método de HPLC de fase inversa. Se usó una columna Zorbax Eclipse XDB-C8 para la separación de los aminoácidos derivatizados con Fmoc, en la que se usó un tampón acetato/gradiente de acetonitrilo como la fase móvil, a un caudal de 1,5 ml/min. Los componentes eluidos se detectaron y se cuantificaron usando un detector de UV de 265 mm.

Las muestras de CTC (calentadas y no calentadas) se prepararon de la siguiente manera: Un gramo de CTC se diluyó en una solución de base molar de 0,2 (preparada al disolver 16,8 g de bicarbonato de sodio en un litro de agua. 0,5 ml del CTC diluido se transfirió después a un vial limpio, al que se añadieron 0,5 ml de una solución de amino convencional (preparada al disolver de 20 a 40 mg de cada patrón de aminoácido en la solución base mencionada anteriormente, a un volumen final de 100 ml). Se añadieron al vial nueve ml de una solución de Fmoc (preparada al disolver 40 mg de Fmoc-OnSU en 100 ml de una mezcla de 75 % de acetona/25 % de agua, que se agitó a continuación gradualmente durante 30 minutos a temperatura ambiente. con el fin de prevenir la racemización y la formación de dipéptidos, las muestras preparadas como se ha descrito anteriormente se analizaron en un plazo de dos horas después de la compleción de la reacción de Fmoc.

Se estableció una curva de calibración usando soluciones convencionales de aminoácidos libres tratados de la misma manera que las muestras de CTC, y se usó para derivar las concentraciones de dichos aminoácidos en las muestras de CTC.

Los resultados obtenidos de un análisis de HPLC típica son de la siguiente manera:

Estos resultados indican que hay una reducción en la cantidad total de los aminoácidos libres medidos en el CTC tras el calentamiento (1,07 % en el CTC calentado frente a 1,88 % en el CTC no calentado). Adicionalmente, la mayoría de esta reducción es debida a la disminución marcada en la concentración de glutamina libre de un nivel de 0,89 % en el CTC no calentado a 0,05 % en el CTC calentado.

B) Azúcares - glucosa y fructosa

Las concentraciones de glucosa y fructosa en las muestras de CTC (calentadas y no calentadas) se midieron usando una técnica de HPLC.

Los resultados obtenidos para los ensayos de glucosa y fructosa en cinco lotes separados de CTC (antes y después del calentamiento) se muestran en las Figs. 3 y 4, respectivamente. El conjunto de barras en la parte frontal de cada figura representa los resultados obtenidos para el CTC calentado, mientras que el conjunto posterior representa los resultados obtenidos para el CTC no calentado. Se puede observar a partir de estas figuras que el calentamiento de una muestra de CTC da como resultado una disminución de aproximadamente 35 % en la concentración de glucosa de estas muestras, y una disminución de aproximadamente 10 % en la concentración de fructosa.

Ejemplo 4

Inhibición de la producción de TNFa usando CTC tratado térmicamente

Se inició un estudio adicional con el fin de determinar la inhibición dependiente de dosis de la producción de TNF-alfa por el CTC calentado.

Se preparó el concentrado de tomate claro (CTC) calentado como se ha descrito más arriba. Los macrófagos se estimularon con LPS en presencia del CTC calentado, y los niveles de producción de TNF-alfa se midieron (como se describe a continuación) después del tratamiento con el CTC calentado.

Ensayo de producción de TNF-alfa - Concentraciones de TNF-alfa se cuantificaron usando los kits ELISA (Biolegend Inc., San Diego, CA).

Se observó la inhibición de la producción de TNFa con las concentraciones de CTC calentado indicadas, tanto cuando el CTC calentado se preparó recientemente como después del almacenamiento durante seis meses a cualquier temperatura ambiente (25 grados C) o a una temperatura de almacenamiento acelerada de 40 grados C.

Los resultados de este estudio se resumen en la Fig. 5. Como se muestra en esta figura, la adición del CTC tratado térmicamente en diferentes diluciones a los macrófagos provoca una inhibición dependiente de dosis. Una ligera inhibición por el CTC calentado se observó primero en una dilución de 1:2000 y fue mucho más marcada en una dilución de 1:1000. Un incremento dependiente de dosis en la eficacia fue observado hasta una dilución de 1:200, punto en el cual se observó la inhibición máxima (80 %) de la producción de TNFa.

Además, se puede observar a partir de la gráfica de barras mostrada en esta figura (primera barra en cada grupo de tres barras) que se analizaron todas las diluciones del CTC calentado, no se observó pérdida de la inhibición de la producción de TNFa después del almacenamiento durante seis meses a cualquier temperatura ambiente (25 grados C; segunda barra en cada grupo) o a una temperatura de almacenamiento acelerada de 40 grados C (tercera barra en cada grupo).

Ejemplo 5

Inhibición de la producción de NO usando combinaciones sinérgicas de CTC tratado térmicamente y carotenoides

Métodos y materiales:

Aislamiento de macrófagos y cultivo celular - Se recolectaron macrófagos peritoneales de la cavidad peritoneal de ratones ICR machos de 6-8 semanas de edad (Harlan, Israel) que se les había administrado una inyección intraperitoneal de 1,5 ml de caldo de tioglicolato (4 %) 4 días antes de la recolección. Los macrófagos peritoneales se lavaron tres veces con PBS y, si es necesario, se realizó una lisis hipotónica de eritrocitos, produciendo 90-95 % de pureza. Los macrófagos se identificaron por el análisis FACS usando F4/80 anti-ratón de rata conjugado con FITC (MCA497F) (Serotec, Oxford, Inglaterra) por microfluorimetría de flujo en FACS (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Para cada muestra, se analizaron 10.000 células viables controladas por dispersión de luz. Se cultivaron macrófagos peritoneales en el medio RPMI 1640 que contiene 10 % de f Cs , L-glutamina 2 mM; 100 U/ml de penicilina; 100 |jg/ml de estreptomicina (Beit-Baemek, Israel) en placas de 96 pocillos (1 x 106 células/pocillo) a 37 °C en 5 % de atmósfera de CO². Las células se estimularon con LPS (1 jg/m l) en presencia o ausencia de Lycomato o CTC y sus combinaciones.

En algunos experimentos, el Lyc-o-Mato se disolvió en DMSO (a una concentración final de 5 mM). La mezcla se sometió a agitación vorticial y se incubó en un baño de agua a 37 °C (con agitación) durante 10 min y después se sometió a un tratamiento de ultrasonidos en un baño sonicador tres veces durante 15 segundos cada vez. Usando esta solución madre, las concentraciones deseadas se prepararon por la adición de volúmenes apropiados de los mismos al medio de cultivo caliente.

Las concentraciones de licopeno en la solución se determinaron después de la extracción de la siguiente manera: Se añadieron 0,5 ml de isopropanol 1,5 de hexano/diclorometano (1:5 v/v) que contiene 0,025 % de BHT a 1 ml de solución de licopeno preparada recientemente a una concentración de 20 uM en un medio precalentado. La solución se sometió a agitación vorticial y las fases se separaron por centrifugación 3000 rpm durante 10 minutos.

Se llevó a cabo un análisis de espectro para medir el contenido de licopeno (pico de absorción a 471 nm).

En otros experimentos, se usaron beta-caroteno o luteína purificada en combinación con el CTC calentado. Las soluciones madre y las diluciones de cada uno de estos carotenoides se prepararon como se ha descrito más arriba en relación con Lyc-O-Mato.

Se añadieron volúmenes apropiados de DMSO (0,1 %-0,2 %) a los controles y el porcentaje de inhibición en cada tubo de prueba se calculó en relación con su control.

126: 131-138.

RESULTADOS

Inhibición sinérgica de la producción de NO por combinaciones de Lycomato con CTC calentado.

Como se muestra en la Fig. 6, hay una inhibición sinérgica de la producción de NO por los macrófagos tratados con LPS por las combinaciones de CTC calentado en el intervalo de diluciones de 1:4000 a 1:1000 con 0,2 y □M de Lyc-O-mato. La primera barra en cada par de barras en la figura representa el resultado obtenido con el CTC calentado solo, mientras que la segunda barra en cada par representa el resultado obtenido con una combinación de la dilución indicada del CTC calentado y 0,2 □M de Lycomato. Los resultados mostrados son los valores medios para tres experimentos separados, cada uno realizado por triplicado.

Se obtuvo el efecto sinérgico más grande por una combinación de dilución de CTC de 1:4000 con 0,2 □M de Lycomato que provocó 28,1 %+6 % de inhibición. El CTC calentado (1:4000) solo provocó 4,9 %±2,1 % de inhibición y 0,2 □M de Lycomato provocó una inhibición insignificante. Por tanto, el efecto de esta combinación fue 5,7 veces más alta que el efecto aditivo de cada uno del ingrediente.

Inhibición sinérgica de la producción de NO por combinaciones de luteína con CTC calentado.

Como se muestra en la Fig. 7, las combinaciones de CTC calentado en el intervalo de dilución de 1:1000 a 1:7000 con tanto 1 □M como 2 □M de luteína provocó la inhibición sinérgica de la producción de NO por los macrófagos tratados con LPS. Los resultados mostrados son los valores medios para tres experimentos separados.

Cabe destacar que el efecto sinérgico más grande se obtuvo por una combinación de luteína (en ambas concentraciones analizadas) junto con diluciones de CTC calentado en el intervalo de 1:2000 a 1:5000.

Inhibición sinérgica de la producción de NO por combinaciones de beta-caroteno con CTC calentado.

Como se muestra en la Fig. 8, las combinaciones de CTC calentado en el intervalo de dilución de 1:1000 a 1:7000 con tanto 0,5 □M como 1 □M de beta-caroteno provocó la inhibición sinérgica de la producción de NO por los macrófagos tratados con LPS. Los resultados mostrados son los valores medios para tres experimentos separados.

Cabe destacar que en el caso de 0,5 □M de beta-caroteno, el efecto sinérgico más grande se obtuvo por una combinación con diluciones de CTC calentado en el intervalo de 1:2000 a 1:7000.

Estos resultados indican claramente que existe una interacción sinérgica entre el CTC calentado y los carotenoides con respecto a su capacidad para inhibir la inflamación.

Ejemplo 6

Inhibición de la producción de interleucina 1-beta de NO usando combinaciones sinérgicas de CTC tratado térmicamente v carotenoides

Se usó un modelo de inflamación de pata inducida por carragenano con el fin de investigar los efectos de una combinación del CTC tratado térmicamente y la oleorresina de tomate (Lyo-O-Mato; Lycored Ltd., Israel) en la producción de la citocina proinflamatoria, IL1-beta.

Método:

El Lyc-O-Mato y el CTC tratado térmicamente (preparado como se ha descrito más arriba) se administraron (por separado y en conjunto) por vía oral a ratas de laboratorio, una vez al día, durante 7 días. El diclofenaco (administrado i.p. dos horas antes de la estimulación) se usó como un control positivo.

En el día 8, se inyectó una solución de carragenano en la pata izquierda de las ratas. Después de esta inyección, la inflamación, mediada por el influjo de neutrófilos que generan ROS y citocinas proinflamatorias, se desarrolló en la pata tratada. La secreción de la citocina pro-inflamatoria, inteleucina-1-beta en el tejido inflamado se midió usando un kit de ELISA convencional.

Resultados:

Se puede observar a partir de la Fig. 9 que una combinación de 3 mg/kg de Lyc-O-Mato (oleorresina de tomate) junto con 5 mg/kg de CTC calentado provocó una disminución marcada y estadísticamente significativa en la secreción de IL-1beta en el tejido inflamado. Esta disminución fue similar en magnitud a aquella provocada por el control positivo de diclofenaco.

Ejemplo 7

Los efectos positivos del CTC calentado y las combinaciones del CTC calentado y carotenoides en la salud ósea

Ambos osteoblastos y osteoclastos se implican en la remodelación ósea. Los presentes inventores han descubierto que el CTC calentado mejora la salud ósea en al menos dos mecanismos complementarios:

1. Reducción de la diferenciación de osteoclastos.

2. Estimulación de la señalización del elemento de respuesta antioxidante (ARE/Nrf2) en los osteoblastos.

El efecto inhibidor de CTC en la diferenciación y activación de osteoclastos mediada por RANKL se estudió in vitro.

Métodos:

1. Diferenciación de osteoclastos

Las células de una línea de células de macrófago de monocitos de ratón RAE 264.7, un linaje precursor de osteoclastos, se incubaron durante 3 días con 20 ng/ml de RANKL con o sin CTC (no calentado o calentado) en las diluciones indicadas y se tiñó para la actividad de TRAP (un marcador para la diferenciación de osteoclastos). El porcentaje de inhibición se calculó de la actividad obtenida en presencia del RANKL solo. El LycoMato (equivalente a 1 |jM del licopeno) se añadió como se indica en la Fig. 9. Los dados son de un representante de 3 experimentos, cada uno realizado por triplicados.

2. Medición de la señalización del elemento de respuesta antioxidante (ARE/Nrf2) en los osteoblastos

Los cultivos de células osteoblásticas de ratón MC3T3-E1 se usaron para este estudio. El CTC (calentado y no calentado) solo, o junto con el producto de oxidación de licopeno (6,14') se añadió a las células y se midió la actividad transcripcional del gen indicador ARE, de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 2007/043046 de copropiedad.

Los resultados de este estudio se resumen en las Figs. 10-12.

Como se muestra en la Fig. 10, tanto el CTC calentado como no calentado provoca inhibición relacionada con dosis de la diferenciación de osteoclastos mediada por RANKL, como se mide por TRAP. Sin embargo, el calentamiento de la muestra de CTC da como resultado un incremento significativo en la potencia de CTC en la inhibición de la diferenciación de osteoclastos.

La Fig. 11 presenta los resultados que muestran la inhibición de la diferenciación de osteoclastos provocada por las combinaciones del CTC tratado térmicamente con licopeno. La comparación de los resultados de los diversos tratamientos mostrados en la gráfica indica el sinergismo entre el licopeno y el CTC tratado térmicamente.

La Fig. 12 representa los resultados que muestran la estimulación de la señalización de ARE relacionada con dosis en MC3T3 cultivado osteoblástico por medio del tratamiento con CTC calentado. También se puede observar que el CTC no calentado no tiene efecto en este modelo.

Si bien las realizaciones específicas de la invención se han descrito para fines de ilustración, se entenderá que la invención se puede llevar a cabo en la práctica por las personas expertas con muchas modificaciones, variaciones y adaptaciones, sin exceder el alcance de las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición terapéutica, que comprende un concentrado de tomate claro (CTC) tratado térmicamente, en donde la concentración total de aminoácidos libres es inferior al 2 % p/p, en donde el concentrado de tomate claro (CTC) tratado térmicamente se obtiene al calentar el CTC a 90 °C durante un período de entre 1 y 3 horas.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la concentración de glutamina libre es inferior al 0,1 % p/p.

3. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en la que el concentrado de tomate claro (CTC) se obtiene a partir de un suero que tiene un valor Brix de entre 40 y 80, opcionalmente superior a 55, opcionalmente a 60.

4. Una composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el concentrado de tomate claro (CTC) tratado térmicamente se obtiene al calentar el CTC a 90 °C durante un período de 1 hora.

5. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una combinación sinérgica de concentrado de tomate claro (CTC) tratado térmicamente y uno o más carotenoides.

6. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el carotenoide es el licopeno o un derivado del mismo.

7. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, en la que una concentración de glutamina libre es inferior al 0,1 % p/p.

8. Una composición de acuerdo con las reivindicaciones 5 o 6, en la que la concentración total del carotenoide es de al menos el 0,1 % p/p.

9. Una composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la concentración de licopeno es de al menos el 0,1 % p/p.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el uno o más carotenoides están proporcionados por una oleorresina de tomate.

11. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de una afección patológica, en donde NO, TNF-alfa y/o interleucina 1-beta actúan como un modulador o un mediador de dicha afección en un sujeto mamífero que necesita tal tratamiento.

12. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el modulador o el mediador están seleccionados entre el grupo que consiste en NO, TNF-alfa e interleucina 1.

13. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o con la reivindicación 12, en donde la afección que se va a tratar es una afección inflamatoria.

14. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 o con la reivindicación 12, en donde la afección que se va a tratar está seleccionada entre el grupo que consiste en artritis reumatoide, síndrome de dificultad respiratoria en el adulto (SDRA), asma, rinitis, fibrosis pulmonar idiopática, peritonitis, inflamación cardiovascular, isquemia miocárdica, lesión por reperfusión, ateroesclerosis, septicemia, traumatismo, diabetes tipo II, retinopatía, psoriasis, inflamación gastrointestinal, cirrosis, peritonitis y enfermedad inflamatoria intestinal, y enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer.

15. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en mejorar la salud ósea en un sujeto.

16. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, para su uso en tratar una afección seleccionada entre el grupo que consiste en osteoporosis, artritis, enfermedad periodontal, mieloma múltiple y canceres metastásicos.