ES2825710T3 - Composiciones de Trichoderma y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Microesclerocios aislados de un hongo, que comprenden un microesclerocio de una especie de Trichoderma.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de Trichoderma y procedimientos de uso

Campo de la invención

La invención se refiere a la formación de propágulos microescleróticos por hongos micoparasitarios y al uso de esos microesclerocios para el control de enfermedades de las plantas.

Antecedentes de la invención

El género Trichoderma es un hongo cosmopolita del suelo muy conocido que ha sido ampliamente explorado como antagonista de numerosos hongos fitopatógenos (Howell CR, 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: The history and evolution of current concepts. Plant Disease 87:4-10; Harman G E, 2006. Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. Phytopathology 96:190-194). Los aislados de especies de Trichoderma pueden tener éxito en el control de enfermedades de las plantas debido a la actividad antagonista directa del patógeno y/o a la inducción de respuestas de resistencia del huésped (Harman GE, 2000. Myths and dogmas of biocontrol: Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease 84:377-393). Además, se ha informado de la función de Trichoderma como promotor del crecimiento de las plantas en algunas cepas después de establecerse como un simbionte de plantas no estricto mediante la colonización de la rizosfera (Harman G E, Howell C R, Viterbo A, Chet I, Lorito M, 2004. Trichoderma species—Opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews Microbiology 2:43-56; Harman G E, Kubicek P K, 1998. Trichoderma and Gliocladium Vol 2. Enzymes, biological control and commercial applications. Taylor and Francis, Londres 1-393). Se describieron diferentes modos de acción para las cepas de Trichoderma empleadas como agentes de control biológico: a) competencia de la rizosfera al colonizar el suelo y/o partes de la planta o mediante la competencia por nutrientes; b) micoparasitismo mediante la producción de una amplia variedad de enzimas que degradan la pared celular contra los patógenos; c) antibiosis mediante la producción de compuestos antimicrobianos (volátiles y no volátiles) que pueden matar a los patógenos; d) promoción del crecimiento mediante la mejora del desarrollo de las plantas y e) inducción de respuestas defensivas sistémicas en las plantas (Harman y Kubicek, 1998, ibid.; Harman, 2006, ibid.).

En la actualidad, la mayoría de los productos de Trichoderma en el mercado de biopesticidas se basan en conidios aéreos producidos en sustratos sólidos. Los conidios aéreos de Trichoderma se producen mediante la fermentación de sustratos sólidos en granos humedecidos y este proceso requiere semanas para la producción y el secado, lo que, en consecuencia, aumenta los costes de producción (Pandey A, Fernandes M, Larroche C, 2008. Current developments in solid-state fermentation. Springer New York, US, 517p. DOI: 10.1007/978-0-387-75213-6; Ramanujam B, Prasad R D, Rangeswaran R, 2010. Mass production, formulation, quality control and delivery of Trichoderma for plant disease management. The Journal of Plant Protection Sciences 2(2):1-8). La producción de conidios fúngicos en granos humedecidos adolece de numerosas limitaciones, incluyendo los elevados costes de mano de obra, el control deficiente de la calidad, los largos tiempos de fermentación, las preocupaciones ambientales para los trabajadores y las dificultades para la ampliación de la escala. Los procedimientos de producción de cultivos líquidos han sido investigados y se han centrado en la producción de conidios sumergidos y clamidosporas de Trichoderma (Lewis J A, Papavizas G C, 1983. Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp. in liquid and solid growth media. Soil Biology and Biochemistry 15: 351-357; Papavizas G C, Dunn M T, Lewis J A, Beagle-Ristaino J, 1984. Liquid fermentation technology for experimental production of biocontrol fungi. Phytopathology 74(10): 1171-1175; Tabachnik M, 1989. Method of growing Trichoderma. Patente de Estados Unidos n.° 4.837.155A; Harman G E, Jin X, Stasz T E, Peruzzotti G, Leopold A C, Taylor A G, 1991. Production of conidial biomass of Trichoderma harzianum for biological control. Biological Control 1: 23-28; Jin X, Taylor A G, Harman G E, 1996. Development of media and automated liquid fermentation methods to produce desiccationtolerant propagules of Trichoderma harzianum. Biological Control 7: 267-274; Sriram S, Roopa K P, Savitha M J, 2011. Extended shelf-life of liquid fermentation derived talc formulations of Trichoderma harzianum with the addition of glycerol in the production medium. Crop Protection 30:1334-13339). Los estudios de formulación se centraron en los procesos de estabilización de la biomasa de Trichoderma, los conidios aéreos y las clamidosporas que proporcionaron una estabilidad de almacenamiento adecuada (Lewis J A, Papavizas G C, 1985. Characteristics of alginate pellets formulated with Trichoderma and Gliocladium and their effect on the proliferation of the fungi in soil. Plant Pathology 34(4): 571-577; Jin X, Custis D, 2010. Microencapsuling aerial conidia of Trichoderma harzianum through spray drying at elevated temperatures. Biological Control 56: 202-208; Yonsel Y S, Batum M S, 2010. Trichoderma granule production. Patente europea n.° EP20080866322; Sriram y col., 2011, ibid.). A pesar de estos intentos de producir Trichoderma en cultivo líquido, los bajos rendimientos, los largos tiempos de fermentación y la escasa tolerancia a la desecación y la estabilidad de almacenamiento han afectado la adopción a gran escala de esta metodología de producción por parte de la industria.

Para satisfacer las expectativas del mercado de biopesticidas y promover el uso de Trichoderma como fungicida o para promover la salud de las plantas, se debe desarrollar una tecnología de producción de líquido de cultivo eficiente y viable para concebir un producto de alta calidad a base de Trichoderma. Preferiblemente, el Trichoderma sería la persistencia en el suelo y el material vegetal en descomposición. Para ese fin, muchos hongos fitopatógenos producen esclerocios; es decir, agregados hifales compactos melanizados que son altamente resistentes a la desecación. Estos propágulos a menudo sirven como estructura de hibernación del hongo (Cooke, 1983, Morphogenesis of sclerotia. En “Fungal Differentiation: A Contemporary Synthesis" Smith, J. E, ed. pp 397-418. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., EE.UU.; Coley-Smith y Cooke, 1971, Survival and germination of fungal sclerotia. En “Annual Review of Phytopathology’, Horsfall, J. G., Baker, K. F., Zentmyer, G. A., eds. pp 65-92. Annual Reviews Inc., Palo Alto, California, EE. UU.). Los microesclerocios (pequeñas partículas escleróticas, 200-600 |jm) de hongos fitopatógenos tales como Colletotrichum truncatum y Mycoleptodiscus terrestris se han producido en alta concentración en fermentación de cultivo líquido sumergido (Jackson y Schisler, 1995, Mycological Research, 99: 879-884; Shearer y Jackson, 2003, patente de Estados Unidos n.° 6.569.807). Los microesclerocios de estos patógenos de las plantas herbáceas han mostrado valor como propágulos persistentes en el suelo y los ambientes acuáticos (Shearer y Jackson, 2006, Biological Control. 38: 298-306; Boyette y col., 2007, BioControl 52: 413-426). Sin embargo, hasta la fecha, no se ha informado de la existencia de microesclerocios en ninguna especie de Trichoderma.

El documento WO 2009/035925 A2 se refiere al microesclerocio de los hongos entomopatógenos y el uso de estos microesclerocios para el control de plagas de insectos.

Breve sumario de la invención

En el presente documento se divulgan microesclerocios aislados de un hongo, comprendiendo la composición microesclerocios de una especie de Trichoderma. En una realización de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma harzianum. En otra realización de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma lignorum. En otra realización más de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma viridae. En una realización de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma harzianum. En otra realización de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma reesei. En otra realización más de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma koningii. En una realización de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma pseudokoningii. En otra realización más de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma polysporum. En otra realización más de la invención, los microesclerocios aislados son de Trichoderma asperellum, Trichoderma hamatum, Trichoderma gamsii, Gliocladium virens y Gliocladium catenulatum.

Se divulga una composición que comprende microesclerocios de un hongo, comprendiendo la composición microesclerocios de una especie de Trichoderma con un portador agronómicamente aceptable, que dichos microesclerocios, tras la rehidratación, germinan hifal o esporogénicamente para producir conidios. En una realización de la invención, los microesclerocios están presentes en una cantidad eficaz para controlar una enfermedad de las plantas. En otra realización de la invención, los microesclerocios están presentes en una cantidad eficaz para promover el crecimiento de las plantas. En otra realización de la invención, los microesclerocios se producen por fermentación de cultivo líquido y están presentes en la biomasa recuperada en una concentración de al menos aproximadamente 1 x 105 microesclerocios por gramo de dicha biomasa.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para producir un hongo en una alta concentración de microesclerocios fúngicos tolerantes a la desecación. El procedimiento comprende la etapa de inocular un medio de cultivo líquido que comprende una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno con propágulos fúngicos de un hongo de biocontrol que comprende hifas o esporas de una especie de Trichoderma, teniendo dicha fuente de nitrógeno orgánico una concentración entre 8 gramos/litro y 40 gramos/litro y teniendo dicha fuente de carbono una concentración superior a 40 gramos/litro, incubar los propágulos durante un tiempo suficiente para permitir la producción de microesclerocios; y recoger los microesclerocios que contienen biomasa resultantes. En una realización, los microesclerocios resultantes son estables al almacenamiento después de secarse. En otra realización, los microesclerocios resultantes son estables al almacenamiento después de ser aplicados a las semillas. En otra realización, los microesclerocios resultantes tras la rehidratación producen conidios.

También se divulga en el presente documento un procedimiento para producir un hongo en una alta concentración de microesclerocios fúngicos tolerantes a la desecación y conidios sumergidos. El procedimiento comprende la etapa de inocular un medio de cultivo líquido que comprende una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno con propágulos fúngicos de un hongo que comprende hifas o esporas de una especie de Trichoderma, teniendo dicha fuente de nitrógeno orgánico una concentración entre 8 gramos/litro y 40 gramos/litro y teniendo dicha fuente de carbono una concentración superior a 40 gramos/litro, incubar los propágulos en un biorreactor durante un tiempo suficiente para permitir la producción de microesclerocios y conidios sumergidos, aireando el biorreactor a un flujo de aire que mantenga los niveles de oxígeno disuelto cerca o por encima de cero y proporcionando al menos 0,1 Vaire/vmedio de cultivo; y recoger los microesclerocios y conidios sumergidos resultantes. En una realización de la invención, se recogen del procedimiento divulgado aproximadamente 10,8 x 106 microesclerocios por litro y aproximadamente 1,9 x 1012 conidios sumergidos por litro.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención junto con las realizaciones descritas, se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada de los dibujos, en los que:

La FIGURA 1 es un gráfico que muestra el impacto de la relación C:N (36 g de carbono L-1) en la producción de conidios por medio de gránulos microescleróticos (MS) secos de Trichoderma harzianum T-22 formulados con tierra de diatomeas al 5 % después del secado al aire y durante el almacenamiento a largo plazo en condiciones de refrigeración (4 °C). La producción de conidios se evaluó después de que los gránulos de MS se incubaran en agar de agua durante 7 días a 25 °C. Las medias (± SE) en el momento “0” se refieren a la tolerancia a la desecación y las diferentes letras indican diferencias significativas (P ^ 0,05).

Las FIGURAS 2A y 2B son gráficos que representan la tolerancia a la desecación y la estabilidad al almacenamiento de conidios sumergidos de Trichoderma harzianum T-22 producidos en varios medios. Los conidios sumergidos secos se envasaron al vacío y se almacenaron a 4 °C. La germinación de los conidios sumergidos secos se evaluó en agar de agua después de 16 horas de incubación a 25 °C. En la FIGURA 2A, se representan comparaciones por pares entre las tasas de viabilidad (medias ± SE) antes y después del secado al aire; prueba t de Student pareada en P ^ 0,05 (*), P ^ 0,01 (**) o no significativo (ns). En la FIGURA 2B, los círculos completos representan las medias (± SE) mientras que las líneas son los datos ajustados por un modelo de desintegración exponencial: y = 40 40,3 exp (-0,72 * tiempo) (R2 = 0,75) [30:1 C:N, 8 g L-1], y = 7,7 71,6 exp (-0,5 * tiempo) (R2 = 0,80) [50:1 C:N, 8 g L-1], y = 14,1 58,7 exp (-0,39 * tiempo) (R2 = 0,79) [30:1 C:N, 36 g L-1], e y = 17,2 61,9 exp (-0,35 * tiempo) (R2 = 0,81) [50:1 C:N, 36 g L-1]. Las curvas de disminución de la viabilidad se compararon mediante la prueba de reducción de suma de cuadrados y las diferentes letras indican una diferencia significativa entre las curvas a P < 0,05.

La FIGURA 3 es un gráfico que representa la estabilidad al almacenamiento de los gránulos microescleróticos (MS) de Trichoderma harzianum T-22 producidos en varios medios líquidos utilizando harina de semilla de algodón como fuente de nitrógeno. Los cultivos se cosecharon después de 4 días de crecimiento a 28 °C y 350 rpm en una incubadora de agitación rotatoria. Los cultivos que contenían microesclerocios se mezclaron con tierra de diatomeas, se deshidrataron y se secaron al aire a menos del 4 % de humedad y se almacenaron envasados al vacío a 4 °C o 25 °C.

La FIGURA 4 es un gráfico que muestra la probabilidad de que emergan plántulas que sobrevivieron al marchitamiento fúngico postemergencia para el melón cantalupo (variedad “Hales Best”) sembrado en suelo infestado por Rhizoctonia solani aplicado en dos dosis (0,625 y 1,5 g/1000 cm3) con o sin tratamiento biológico con Trichoderma harzianum T-22 (0,4 g MS gránulo/1000 cm3) en bioensayos en cámara de crecimiento. Tiempo censurado por incidencia de marchitamiento fúngico hasta 15 días después de la siembra. Los valores son medias (± SE) de tres experimentos independientes. Las curvas de supervivencia seguidas de letras diferentes son estadísticamente significativas según la prueba de rango logarítmico (P ^ 0,05). Las curvas para el control, T. harzianum y T. harzianum + R. solani 0,625 g/1000 cm3 se superponen y no son significativamente diferentes entre sí.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se divulga la formación de propágulos de microesclerocios por Trichoderma y el uso de esos microesclerocios.

Definiciones

Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una" y "el", "la”, incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "microesclerocios" se refiere a pequeños cuerpos escleróticos que son algún estado de reposo de los hongos. Los microesclerocios son agregados hifales compactos, estables, viables, a veces melanizados, del hongo. Los microesclerocios en sí no son infecciosos, pero cuando se rehidratan, tal como mediante la exposición a la humedad del suelo o dentro de las grietas en la corteza de los árboles, los microesclerocios germinan hifal o esporogénicamente para producir conidios que son infecciosos para los patógenos fúngicos de la planta diana. Los microesclerocios son extremadamente tolerantes a la desecación, son capaces de germinar tanto esporógena como vegetativamente y también retienen las capacidades fungicidas de sus formas nativas o normales (es decir, hifas, blastosporas y/o conidios del mismo hongo). Morfológicamente, los microesclerocios pueden estar presentes como un grupo de células aglomeradas.

Tal como se usa en el presente documento, el término "conidios" se refiere a esporas asexuales e inmóviles de un hongo. Los conidios "aéreos" se forman a partir de hifas fúngicas que crecen en un sustrato sólido o pueden formarse directamente a partir de cuerpos esclerociosos, incluidos los microesclerocios. Los conidios formados en un ambiente acuoso como el caldo de fermentación líquido se denominan conidios "sumergidos".

Tal como se usa en el presente documento, el término "fungicida" se refiere a un material o mezcla de materiales que inducen la mortalidad, interrumpen o impiden el crecimiento y para evitar la propagación de hongos diana. Los fungicidas también se utilizan para combatir las infecciones por hongos. Los fungicidas pueden ser de contacto o sistémicos. Un fungicida de contacto mata los hongos cuando se rocía sobre su superficie. Un fungicida sistémico tiene que ser absorbido por el hongo antes de que este muera. Los procedimientos fungicidas descritos en el presente documento incluyen tratamientos preventivos, protectores, profilácticos y erradicadores.

La invención descrita en el presente documento es eficaz para producir microesclerocios a partir de cualquier especie, cepa o variedad de hongos micoparásitos del género Trichoderma, aunque también se prevé que la invención pueda usarse para producir microesclerocios de especies del género Gliodadium. Las especies preferidas para su uso en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, Trichoderma harzianum, Trichoderma lignorum, Trichoderma viridae, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma polysporum, Trichoderma asperellum, Trichoderma hamatum y Trichoderma gamsii.

La producción de microesclerocios de la presente invención se efectúa preferiblemente en cultivo líquido, y la producción a gran escala se realiza preferiblemente mediante fermentación de cultivo líquido en tanque profundo. También se prevé que se puedan utilizar medios de cultivo sólidos. El medio líquido utilizado en la preparación de los microesclerocios melanizados es crítico, ya que su formación y rendimiento dependen del medio. Para su uso en el presente documento, el medio contiene preferiblemente una fuente de nitrógeno a una concentración entre 8 gramos de fuente de nitrógeno/litro y menos de 40 gramos de fuente de nitrógeno/litro, y una fuente de carbono a una concentración mayor de 18 gramos de carbohidrato/litro, preferiblemente mayor de 40 gramos de carbohidratos/litro. Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen, pero no se limitan a, caseína hidrolizada, extracto de levadura, proteína de soja hidrolizada, proteína de semilla de algodón hidrolizada, licor de maíz en polvo y proteína de gluten de maíz hidrolizada. Las fuentes de carbono adecuadas incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos, que incluyen glucosa, fructosa y sacarosa y glicerol. El medio de cultivo líquido preferido para su uso en el presente documento es descrito por Jackson (patente de Estados Unidos n.° 5.968.808). Los hongos del género Trichoderma producen microesclerocios cuando se cultivan en cultivo sumergido en el medio de Jackson. Estas microesclerocios no se han descrito hasta ahora a partir de estos hongos. La fermentación puede realizarse usando técnicas de cultivo líquido aeróbico convencionales con agitación y aireación. Se prefiere la agitación para inhibir el crecimiento micelial en la pared del vaso. Las temperaturas adecuadas pueden variar de aproximadamente 15 °C a aproximadamente 32 °C, y el pH puede variar de aproximadamente 4 a aproximadamente 8. El intervalo de temperatura preferible para la fermentación es de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 30 °C. Una vez que se ha obtenido un crecimiento suficientemente fuerte del hongo, normalmente en aproximadamente 2-4 días, comienzan a formarse microesclerocios y se continúa la fermentación hasta que se obtiene una concentración suficientemente alta de microesclerocios. Sin limitarse a ello, en una realización preferida, la fermentación continúa hasta que una proporción mayoritaria de los hongos viables en el cultivo (es decir, más del 30 % en peso), y más preferiblemente hasta que una proporción predominante de los hongos viables en el cultivo (es decir, más del 50 % en peso) se diferencian para formar microesclerocios. Las condiciones de fermentación de alta pureza que se encuentran en algunas configuraciones de biorreactores pueden dar como resultado que los microesclerocios se descompongan en agregados hifales, melanizados más pequeños o formulaciones mezcladas. Estos agregados hifales o formulaciones mezcladas propagarían los conidios. Una vez completada la fermentación, los microesclerocios pueden recuperarse utilizando técnicas convencionales, como la filtración o la centrifugación. Los microesclerocios se pueden secar, por ejemplo, mediante secado al aire o por aplicación a las semillas, hasta un nivel de humedad bajo, y almacenarse a temperatura ambiente o inferior. En una realización preferida, la biomasa recuperada de la fermentación, después del secado, contendrá aproximadamente 1 x 105 o más microesclerocios por gramo de biomasa (basado en el peso seco de la biomasa), en particular al menos 1 x 106 microesclerocios por gramo de biomasa.

Se contempla que la producción comercial de microesclerocios por fermentación líquida se lograría mediante fermentación en un biorreactor. Las condiciones en el biorreactor formarían cultivos tanto de microesclerocios como de conidios sumergidos mediante fermentación líquida. Se contempla que una persona con conocimientos ordinarios en la técnica sería capaz de controlar la formación de microesclerocios y conidios sumergidos controlando la tasa de oxígeno disuelto en el fermentador, dadas las enseñanzas de las condiciones de los medios divulgadas en el presente documento.

Las formulaciones comerciales para su uso como biocontrol contra hongos patógenos se pueden preparar a partir de microesclerocios que se han cosechado del medio de cultivo tal como se describe en el presente documento. Como cuestión práctica, se prevé que las formulaciones comerciales se puedan preparar directamente a partir del cultivo, obviando así la necesidad de cualquier etapa de purificación. Si bien los cultivos líquidos se pueden usar directamente, como en el recubrimiento de semillas, mezcla de envasado, en la realización preferida el agua se elimina de los cultivos hasta sequedad parcial o sustancial como se describe anteriormente, y el cultivo seco se fragmenta o se muele en partículas pequeñas adecuadas para aplicación a través de aplicadores de gránulos convencionales, utilizando técnicas convencionales en la técnica. Para facilitar la aplicación y el subsiguiente crecimiento y conidiación de hongos, los microesclerocios cosechados se pueden formular, de manera alternativa, en un portador o vehículo adecuado, agronómicamente aceptable, nutricional o inerte para su aplicación como polvos humectables, polvos, gránulos, cebos, soluciones, concentrados emulsionables, emulsiones, concentrados de suspensión y pulverizadores (aerosoles). Por ejemplo, para aplicaciones líquidas, los microesclerocios se pueden formular como suspensión o emulsión. En esta realización, los portadores preferidos incluyen, pero no se limitan a, agua, tampones o aceites vegetales o de plantas. En una realización alternativa preferida particularmente adecuada para aplicaciones granulares sólidas, los microesclerocios puede formularse con portadores o diluyentes sólidos inertes tales como tierra de diatomeas, talco, arcilla, vermiculita, CaCO3, sémola de mazorca de maíz, geles de alginato, matrices de almidón o polímeros sintéticos, o pueden incorporarse en micropartículas o microcápsulas de liberación controlada convencionales. El profesional experto reconocerá que los hongos también pueden formularse en combinación con aditivos convencionales tales como agentes adhesivos o adherentes, agentes emulsionantes, tensioactivos, espumas, humectantes o agentes humectantes, antioxidantes, protectores UV, aditivos nutritivos, fertilizantes o insecticidas. Para su aplicación sobre semillas, la corteza o el dosel de árboles y plantas, los microesclerocios también se formulan preferiblemente con un adyuvante higroscópico o hidrófilo. Las formulaciones pueden tener concentraciones de microesclerocios más bajas en las que una persona con conocimientos ordinarios en la técnica usaría los microesclerocios como agroquímico, biopesticida, pesticida, fungicida, aditivo para el crecimiento de las plantas y bioestimulantes.

La cantidad absoluta de microesclerocios y su concentración en la composición final se seleccionan para proporcionar una reducción eficaz de hongos patógenos en comparación con un control no tratado. La cantidad real no es crítica y depende de consideraciones prácticas tales como las propiedades del vehículo o portador, la densidad de los hongos patógenos diana y el procedimiento y lugar de aplicación, y puede determinarse fácilmente mediante pruebas de rutina. En el caso de una composición que comprenda un microesclerocio de una especie de Trichoderma con un portador agronómicamente aceptable en el que dicho microesclerocio, tras la rehidratación, germine hifal o esporogénicamente para producir conidios aéreos, a los efectos de formulación y aplicación, una "cantidad eficaz" se define como cualquier cantidad de microesclerocios suficiente para producir posteriormente suficientes conidios en el hábitat objetivo para infectar y matar los hongos patógenos diana en relación con un control no tratado. A modo de ejemplo y sin limitarse a ello, se prevé que las formulaciones adecuadas contendrán normalmente alrededor de 1 x 105 o más microesclerocios por gramo de biomasa recuperada del cultivo líquido (basándose en el peso seco de la biomasa), preferiblemente al menos 1 x 106 microesclerocios por gramo de biomasa.

Durante su uso, los microesclerocios de la presente invención se pueden aplicar en las proximidades o en la superficie de las plantas que se van a proteger, por ejemplo, sobre la corteza de los árboles, o como recubrimiento de semillas, usando técnicas convencionales. En una realización preferida, los microesclerocios se aplican al suelo, o a mezclas de envasado sin tierra, como las que se utilizan en los invernaderos, en forma granular. Dependiendo de la plaga fúngica diana, los microesclerocios se pueden aplicar en campos agrícolas, huertos, invernaderos, jardines o céspedes, o sobre o en las proximidades de plantas ornamentales, árboles o estructuras comerciales o residenciales como antagonista contra hongos fitopatógenos.

En otra realización de la invención, los microesclerocios se pueden aplicar en las proximidades o en la superficie de las plantas para promover el crecimiento y la salud de las mismas.

La cantidad absoluta de microesclerocios y su concentración en la composición final se seleccionan para proporcionar una reducción eficaz de los hongos patógenos o aumentar la salud de las plantas en comparación con un control no tratado. La cantidad real no es crítica y depende de consideraciones prácticas tales como las propiedades del vehículo o portador, la densidad de los hongos patógenos diana y el procedimiento y lugar de aplicación, y puede determinarse fácilmente mediante pruebas de rutina. A los efectos de la formulación y aplicación, una "cantidad eficaz" se define como cualquier cantidad de microesclerocios suficiente para producir posteriormente suficiente crecimiento de hifas o conidios en el hábitat objetivo para inhibir el crecimiento y la infectividad de los hongos patógenos diana en relación con un control no tratado. A modo de ejemplo y sin limitarse a ello, se prevé que las formulaciones adecuadas contendrán normalmente alrededor de 1 x 105 o más microesclerocios por gramo de biomasa recuperada del cultivo líquido (basándose en el peso seco de la biomasa), preferiblemente al menos 1 x 106 microesclerocios por gramo de biomasa.

La microesclerocios de la especie Trichoderma divulgados en el presente documento producen hifas y conidios aéreos eficaces para el control de los patógenos de las plantas. Sin limitarse a ello, los patógenos de las plantas que pueden ser controlados por los microesclerocios de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, diversas especies de Rhizoctonia, Sclerotinia, Sclerotiorum, Fusarium, Verticillium, Phytophthora, Castenea, Armillaria, Pythium y Thielviopsis.

Análisis estadístico

Cada experimento se llevó a cabo con una configuración completamente aleatoria y se repitió al menos tres veces. R (R Core Team, 2012. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria) y el paquete lme4 (Bates DM, Maechler M, Bolker B, 2012. lme4: Linear mixed-effects models using S4 classes. R package version 0.999999-0. Disponible en http://cran.stat.sfu.ca/web/packages/lme4/lme4.pdf) se utilizaron con el fin de realizar análisis lineales de efectos mixtos para datos de medidas repetidas para abordar la efectos del medio de cultivo y el tiempo sobre la acumulación de biomasa, la concentración de conidios sumergidos, la concentración de microesclerocios, la producción de conidios a partir de microesclerocios secos y la viabilidad de los conidios. Para los estudios de fermentación líquida, el tratamiento (es decir, el medio de cultivo), el tiempo (es decir, el día de fermentación o el periodo de almacenamiento) y su término de interacción se introdujeron como efectos fijos en el modelo. Como efectos aleatorios, el matraz de agitación (es decir, el sujeto o la réplica) se sometió a observaciones repetidas a lo largo del tiempo y repetición experimental para contabilizar cualquier variación entre los experimentos realizados en diferentes fechas. Se empleó la prueba de chi-cuadrado de razón de verosimilitud para abordar la importancia de los efectos fijos y su interacción en los modelos lineales mixtos estimando sus valores P mediante la comparación de modelos anidados (Pinheiro JC, Bates DM, 2000. Mixed-Effects Models in S and SPLUS. Nueva York: Springer. R Core Team, 2012. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Viena, Austria). Los datos de producción de conidios y microesclerocios sumergidos se transformaron mediante log1ü(x 1) cuando fue necesario para cumplir con los supuestos de normalidad y homogeneidad de los datos antes del análisis. Se llevaron a cabo comparaciones pareadas post-hoc utilizando la función ghlt en el paquete multcomp para comparar tratamientos, corrigiendo los valores P para comparaciones múltiples mediante el procedimiento de una sola etapa. La viabilidad de los conidios sumergidos (% de germinación) registrada antes y después del secado al aire (es decir, dos muestras dependientes) se comparó mediante la prueba t de Student pareada para contabilizar el impacto de la tolerancia a la desecación en la supervivencia de los conidios sumergidos dentro de cada tratamiento. Para el conjunto de datos longitudinales sobre la estabilidad al almacenamiento de microesclerocios, medida por la producción de conidios a lo largo del tiempo, el tratamiento (= medio de cultivo) y el tiempo (meses) se ajustaron como efectos fijos, mientras que los paquetes de muestras (es decir, los sujetos) se consideraron un efecto aleatorio en un modelo lineal mixto. Luego se compararon las pendientes para las curvas de estabilidad al almacenamiento utilizando una matriz de contraste para evaluar las diferencias entre los tratamientos. Los datos de estabilidad al almacenamiento de conidios sumergidos se ajustaron mediante un modelo de desintegración exponencial utilizando la función nls, y las comparaciones entre modelos no lineales se realizaron mediante la prueba de reducción de la suma de cuadrados (Ratkowsky D, 1990. Handbook of Nonlinear Regression Models. Nueva York y Basilea: Marcel Dekker).

Se evaluó el efecto de los tratamientos del suelo sobre la proporción de plántulas de melón muertas por marchitamiento fúngico causado por R. solani mediante análisis de supervivencia (Kaplan EL, Meier P, 1958. Nonparametric estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association 53 (282): 457-481). Las plántulas que sobrevivieron más allá del día 15 se consideraron censuradas. Las diferencias estadísticamente significativas entre las curvas de supervivencia para los tratamientos se estimaron mediante la prueba de rango logarítmico (paquete de supervivencia) con valores de P ajustados por Bonferroni. Los datos proporcionales sobre el total de plántulas emergidas y plántulas sanas registradas el día 15 se analizaron mediante un modelo lineal mixto generalizado (glmer) con tratamientos como efecto fijo, mientras que las canastas (réplicas) y los bioensayos (repeticiones experimentales) se puntuaron como efectos aleatorios.

Aislados de Trichoderma

Se usó la cepa T-22 Rifai de Trichoderma harzianum (ATCC 20847; Rootshield®, BioWorks, Inc., Geneva, N.Y.) a lo largo de este estudio. Se aislaron cultivos puros de T. harzianum a partir de diluciones seriadas de Rootshield® y se cultivaron en agar de dextrosa de patata (PDA, Difco®) a 25 ± 1 °C durante al menos siete días. Se purificaron colonias individuales por reaislamiento en PDA y se aisló una sola punta de hifa y se cultivó en PDA. El análisis molecular del aislado de Trichoderma confirmó que la cepa era T. harzianum T-22 (ATCC 20847). La colonia esporulada que surgió de esta punta de hifa se utilizó como cultivo madre de T. harzianum T-22 y se cortó en trozos de 1 mm2, se colocó en crioviales que contenían glicerol al 10 % y se almacenó a -80 °C.

Se probaron otras especies de Trichoderma, se tomaron del USDA, Agricultural Research Service, Culture Collection en Peoria, Illinois. A saber, Trichoderma harzianum (NRRL 13879), T. harzianum (NRRL 13019), T. harzianum (NRRL) A-24290), T. lignorum (NRRL 1762), T. viridae (NRRL A-23264), T. reesei (NRRL 6156), T. koningii (NRRL A-18871), T. pseudokoningii (NRRL 22083) y T. polysporum (NRRL 28981). Cultivos madre de cada cepa de Trichoderma spp. se cultivaron como aislados de una sola espora en agar de dextrosa de patata (PDA) durante tres semanas a temperatura ambiente. La placa esporulada se cortó en tapones de agar de 1 mm2 y los cultivos madre de estos tapones de agar se almacenaron en glicerol al 10 % a -80 °C. Los inóculos de conidios para experimentos de cultivo líquido se produjeron inoculando placas de PDA con una suspensión de conidios de los cultivos madre y desarrollando estos cultivos a temperatura ambiente (~ 22 °C) durante 2-3 semanas. Todos los cultivos líquidos se inocularon a una concentración inicial de 5 x 106 conidios mL-1 de caldo de cultivo.

Para los estudios de cultivo líquido, se obtuvieron inóculos de conidios inoculando placas de PDA con una suspensión de conidios de los cultivos madre congelados y desarrollando los cultivos a 25 ± 1 °C durante 2-3 semanas. Las suspensiones de conidios se obtuvieron a partir de placas de agar esporuladas enjuagando las placas con 10 mL de una solución estéril que contenía monooleato de polioxietilensorbitano al 0,04 % (Tween 80, Sigma®).

Se evaluó el crecimiento y la formación de propágulos por T. harzianum en medios líquidos que contenían diferentes concentraciones de carbono, relaciones de carbono a nitrógeno (C:N) y fuentes de nitrógeno utilizando un medio líquido semidefinido compuesto de sales basales con glucosa (Sigma®) y caseína hidrolizada con ácido (Casamino Acids®, Difco Laboratories, Detroit, MI, EE. UU.) como fuentes de carbono y nitrógeno. El medio de sales basales definido utilizado en todos los cultivos líquidos contenía por litro de agua doblemente desionizada (Jackson MA, McGuire MR, Lacey LA, Wraight SP, 1997. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus. Mycological Research 101: 35-41) KH2PO4, 2,0 g; CaC^2H2O, 0,4 g; MgSO4.7H2O, 0,3 g; FeSO4.7H2O, 0,05 g; CoCl2.6H2O, 37 mg; MnSO4.H2O, 16 mg; ZnSO4.7H2O, 14 mg; tiamina, riboflavina, pantotenato, niacina, piridoxamina, ácido tióctico, 500 |jg cada uno; y ácido fólico, biotina, vitamina B12, 50 jg cada uno. Las cantidades de glucosa y caseína hidrolizada con ácido y las correspondientes concentraciones de carbono y las relaciones C:N se muestran en la Tabla 1 para cada medio de cultivo ensayado. Los cálculos de la concentración de carbono y la relación C:N se basaron en un 40 % de carbono en glucosa y un 53 % de carbono y un 8 % de nitrógeno en caseína hidrolizada con ácido.

Todos los cultivos se desarrollaron en 100 mL de medio líquido usando matraces Erlenmeyer con deflectores de 250 mL (Bellco Glass, Vineland, NJ, EE. UU.) incubados a 28 °C y 300 rev.min"1 (rpm) en una incubadora de agitación rotatoria con un alcance horizontal de 1,9 cm (INNOVA 4000, New Brunswick Scientific, Edison, Nueva Jersey, EE. UU.). Durante el periodo de fermentación, los matraces se agitaron a mano con frecuencia para evitar el crecimiento de micelios en la pared del matraz. Para los estudios de la relación C:N y la concentración de carbono, los medios se inocularon con una suspensión de conidios obtenida de una placa de agar esporulada de 2-3 semanas de T. harzianum ajustada para proporcionar una concentración final de 5 * 105 conidios mL-1 en el medio. Dos, 4 y 7 días después de la inoculación, se tomaron muestras de 3 mL para medir las concentraciones de biomasa, los conidios sumergidos y los microesclerocios. Para cada experimento, se tomaron muestras duplicadas de cada matraz en cada fecha de muestreo, y en los estudios se utilizaron dos matraces duplicados para cada tratamiento. Los experimentos se repitieron cuatro veces.

Diferentes fuentes de nitrógeno

Se evaluaron diferentes fuentes de nitrógeno para su uso en cultivos de T. harzianum basados en la acumulación de biomasa y la formación de propágulos. Las fuentes de nitrógeno se agregaron al medio de sales basales con glucosa para producir un medio con una relación C:N de 50:1 y una concentración de carbono de 36 g L-1 correspondiente al medio 6 del experimento anterior (véase la Tabla 1). Además, se probó una formulación de medio que contenía melaza en polvo (BioSev Ltd., Sao Paulo, SP, Brasil) con aproximadamente un 40 % de carbono como sustituto de la glucosa como principal fuente de carbono. Los subproductos a base de proteínas que se probaron fueron harina de soja (Toasted Nutrisoy®, ADM Co., Decatur, IL, EE. UU.), harina de semilla de algodón (Pharmamedia®, AdM, Memphis, TN, EE. UU.), extracto de levadura (Difco®, Detroit, MI, EE. UU.) y licor de maíz en polvo (Solulys® AST, Roquette Corporation, Gurnee, IL, EE. UU.). Todas las composiciones de los medios seguidas por su contenido de nitrógeno se muestran en la Tabla 2. Para las evaluaciones de la fuente de nitrógeno, el inóculo conidial de T. harzianum se obtuvo a partir de placas de PDA esporuladas para proporcionar una concentración final de 5 * 106 conidios mL-1 de medio. Se probaron dos velocidades de agitación, 300 o 350 rpm, y se consideró un segundo factor en el diseño experimental. Se tomaron muestras a los 2 y 4 días de crecimiento y se midieron las concentraciones de acumulación de biomasa, conidios sumergidos y microesclerocios. Cada tratamiento se duplicó y los experimentos se repitieron tres veces.

Para completar los estudios de fuentes de nitrógeno, el medio de sales basales que contiene harina de semilla de algodón como fuente de nitrógeno (relación C:N de 30:1 y 10:1 con una concentración de carbono de 36 g L-1) se inoculó con un precultivo de T. harzianum de 3 días de edad en el medio 6 (Tabla 1). Los precultivos se inocularon con conidios utilizando los procedimientos descritos anteriormente. Los experimentos fueron repetidos tres veces. Tabla 1 - Composición del medio basada en la concentración de carbono (g L 1) y la relación carbono-nitrógeno (C:N) utilizada para evaluar el crecimiento, la formación de propágulos y los rendimientos de Trichoderma harzianum

T-22.

Designación del . . -1. Caseína hidrolizada con ácido (g _{medio líquido} Carbono (g L-1) _{Relación C:N Glucosa (g L ) -^1^}

1 8 10:1 10,0 10,0

2 8 30:1 16,6 3,4

3 8 50:1 18,0 2,0

4 36 10:1 45,0 45,0

5 36 30:1 75,0 15,0

6 36 50:1 81,0 9,0

Crecimiento y formación de propágulos

Se tomaron muestras de tres mL en varios momentos durante el crecimiento para medir la acumulación de biomasa y las concentraciones de conidios y microesclerocios. Se utilizaron puntas de pipeta de plástico de 1 mL de diámetro largo (la punta se retiró con una cuchilla de afeitar para crear una abertura más amplia) para todas las muestras. Para las mediciones de acumulación de biomasa, se tomó un mL del caldo de cultivo completo de los matraces y la biomasa se separó del medio gastado mediante filtración al vacío en discos de filtro prepesados (fibra de vidrio G6 de 2,4 cm, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). La acumulación de peso seco se determinó secando la biomasa y el disco de filtro a 60 °C hasta un peso constante antes de la medición. Las concentraciones de conidios sumergidos se determinaron microscópicamente usando un hemocitómetro. Para las medidas de concentración de microesclerocios, se colocaron 100 |jL de caldo de cultivo en un portaobjetos de vidrio y se cubrió con un cubreobjetos grande de 24 x 50 mm (Fisher Scientific, EE. UU.). Todos los microesclerocios del portaobjetos se contaron microscópicamente. Solo los agregados de hifas compactos y discretos mayores de 50 |jm de diámetro se contaron como microesclerocios. El caldo de cultivo se diluyó según fuera apropiado para facilitar el recuento de microesclerocios. Durante el muestreo y la dilución del caldo de cultivo, las suspensiones de microesclerocios se agitaron constantemente para asegurar la homogeneidad. No se pudo usar un hemocitómetro para contar microesclerocios debido a su gran tamaño. Todos los análisis microscópicos se realizaron utilizando un microscopio Olympus BH-2 con óptica Nomarski.

Tabla 2 - Evaluación de medios que contienen diferentes fuentes de nitrógeno, medio líquido 6 (36 g de carbono L"1; _______________________________________relación C:N 50:1)_______________________________________

Fuente de carbono Proteína (% de nitrógeno) Nombre comercial Fabricante

Glucosa Caseína hidrolizada con ácido (8) Casamino acids® Difco

Glucosa Harina de soja (8,5) Toasted Nutrisoy® Flour ADM, Decatur, IL, EE.UU.

Glucosa Harina de semilla de algodón (9,5) Pharmamedia® ^{Traders Protein,} Memphis _{TN, EE.UU.}

Glucosa Levadura autolizada (8) Yeast extract® Difco

Glucosa Licor de maíz fermentado (7,2-8,2) Solulys® AST ^{Roquette Corp., Gurnee, IL,}

_EE.UU.

Melaza Caseína hidrolizada con ácido (8) Casamino acids® Difco

EJEMPLO 1: Formulación, tolerancia a la desecación y estabilidad al almacenamiento de T. harzianum

En estudios de evaluación del medio, se tomaron muestras de cultivos de la cepa T-22 de T. harzianum como se describe anteriormente los días 2 y 4 y se cosecharon el día 7. En la cosecha el día 7, se añadió tierra de diatomeas [DE (HYFLO®, Celite Corp., Lompoc, CA, EE.UU.)] a la biomasa fúngica de cada matraz que contenía microesclerocios y/o conidios sumergidos a una concentración de 5 g de caldo de cultivo DE 100 mL"1. Las mezclas de biomasa de cultivo-DE se filtraron al vacío en un embudo Buchner usando papel de filtro Whatman n.° 1. La torta de filtración resultante se rompió mediante pulsación en una licuadora (Mini Prep® Plus, Cuisinart, Stamford, CT, EE. UU.), se colocó en capas en placas de Petri y se secó al aire durante la noche a ~22 °C con una humedad relativa (HR) de 50-60 %. El contenido de humedad de las preparaciones de microesclerocios-DE se determinó con un analizador de humedad (Mark II, Denver Instruments, Arvada, CO, EE. UU.) junto con sus correspondientes actividades de agua, medidas a una temperatura equilibrada de 25 °C (AquaLab serie 4TEV, Decagon Devices, Inc., Pullman, WA, EE. UU.). Cuando las formulaciones de T. harzianum se secaron hasta un contenido de humedad inferior al 4 % (actividad del agua <0,35), las formulaciones secas se envasaron al vacío en bolsas de polietileno de nailon (15,3 x 21,8 cm) con una envasadora al vacío (Multivac C 100, Sepp Haggenmüller, Wolfertschwenden, Alemania) y se almacenó a 4 °C.

Para comparar la estabilidad al almacenamiento de los microesclerocios de Trichoderma a temperatura ambiente y refrigerada, se cultivaron cien mL de cultivos de T. harzianum T-22 en un medio de 10:1 y una relación C:N de 30:1 con harina de semilla de algodón como fuente de nitrógeno, cosechados el día 4, formulados con 5 % de DE (p/v) y secados al aire hasta menos del 4 % de humedad. Las formulaciones de microesclerocios secadas al aire se envasaron al vacío en bolsas de Mylar aluminizadas de 15 x 22 cm (PAKVF4, IMPAK Corporation, Los Ángeles, CA, EE.UU.) y se mantuvieron en condiciones ambientales (25 °C) o refrigeradas (4 °C).

Para probar la viabilidad de los microesclerocios y la producción de conidios sumergidos, se adaptó la metodología de Jackson MA, Jaronski ST, 2009. Production of microsclerotia of the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol agent for soil-inhabiting insects. Mycological Research 113: 842­ 850. Brevemente, se inocularon 25 mg de preparaciones secas de microesclerocios-DE de T. harzianum en placas de agar de agua (2 % p/v) y se incubaron a 25 °C. Tras la rehidratación, los gránulos de microesclerocios germinaron miceliogénicamente (formación del tubo germinal) y esporogénicamente (producción de conidios). Se utilizaron dos placas de agar de agua (submuestras) para cada réplica del tratamiento. Después de una incubación de 24 horas a 25 °C, se examinaron cien gránulos de microesclerocios-DE por placa con un microscopio estereoscópico (Olympus, modelo SZH10) para determinar la germinación hifal como medida de viabilidad. Para enumerar la producción de conidios, las placas de agar de agua se mantuvieron a 25 °C durante un total de siete días. Después, cada placa se inundó con 7 mL de solución de Tween 80 al 0,04 % y los conidios se separaron de los gránulos de microesclerocios-DE utilizando una cinta estéril. Una vez desalojados los conidios, se pipeteó el líquido disponible de cada placa y se midió el volumen de líquido. Se midió microscópicamente la concentración de conidios en el líquido pipeteado usando un hemocitómetro y se calculó el número total de conidios por placa. Para determinar el número de conidios de T. harzianum producidos por gramo de preparación de microesclerocios-DE secada al aire, el número de conidios cosechados por placa se dividió por el peso de la preparación de microesclerocios-DE seca añadida a cada placa de agar de agua (0,025 g).

Para los ensayos de viabilidad de conidios sumergidos, se diluyeron 0,01 g de cada formulación de conidios sumergidos secos-DE en 10 mL de Tween 80 al 0,04 % (Sigma®), se agitaron en vórtex durante 1 min y se dejaron sedimentar las partículas de DE durante 1 min. Se inocularon dos alícuotas de 100 j l del sobrenadante que contenía principalmente conidios sumergidos en placas de agar de agua (agar al 1 % p/v) para suministrar aproximadamente 1 x 105 conidios sumergidos por placa. Los estudios preliminares no revelaron diferencias significativas entre el PDA y el agar de agua para la evaluación de la germinación. La germinación se evaluó microscópicamente mediante la evaluación de 200 conidios sumergidos por placa de agar de agua utilizando un microscopio invertido (Olympus IMT-2) después de 16 h de incubación a 25 °C. Los conidios sumergidos se consideraron germinados cuando el tubo germinal era mayor que el diámetro del conidio. La tolerancia a la desecación se expresó como porcentaje de supervivencia de conidios sumergidos y cada réplica de tratamiento tenía dos submuestras. Se llevaron a cabo evaluaciones adicionales mensualmente hasta que la viabilidad de las esporas fue inferior al 40 %.

En condiciones de cultivo en matraz de agitación, se observó y controló la formación de conidios sumergidos y microesclerocios de T. harzianum T-22 durante un periodo de fermentación de 7 días en medios de cultivo líquidos con diferentes relaciones C:N. Los microesclerocios de T. harzianum se formaron y desarrollaron exclusivamente en medios con alto contenido de carbono (36 g L"1), independientemente de la relación C:N probada. El medio más rico (n.° 4) con una relación C:N de 10:1 carecía de la producción de conidios sumergidos, pero promovió el desarrollo de microesclerocios. Los microesclerocios completamente formados de T. harzianum tenían un diámetro de 90-600 jm. De acuerdo con el modelo lineal de efectos mixtos que cuenta con medidas repetidas a lo largo del tiempo, la producción de microesclerocios por T. harzianum se vio afectada tanto por el medio de cultivo (x2(15) = 264,84, P <0,0001) como por el tiempo de fermentación (x2(12) = 32,09, P = 0,0013). La interacción entre el tiempo de fermentación y el medio de cultivo contribuyó en gran medida a la variación en las tasas de producción de microesclerocios (x2(12) = 20,78, P = 0,023) (Tabla 3). En general, se produjeron más microesclerocios el día 4 en todos los medios de cultivo (2,6-4,8 x 104 mL"1), observándose menos microesclerocios el día 7, probablemente debido a la agregación de microesclerocios. Los microesclerocios de T. harzianum comenzaron a formarse después de 48 h de crecimiento con los microesclerocios volviéndose más bien definidos y compactos el día 4 y melanización en el día 7. Mientras que los microesclerocios eran más compactos y melanizados, estas estructuras presentaban pequeñas extensiones hifales que emanaban de su superficie. Se observaron concentraciones de microesclerocios en el día 4 en los medios 4 y 5, mientras que en el medio 6 se observaron números más altos de microesclerocios inmaduros en el día 2.

La conidiación sumergida fue soportada por todos los medios probados excepto el medio 4 que produjo solo microesclerocios. Estos conidios sumergidos fueron formados por células conidiógenas (por ejemplo, fiálides) ligadas a hifas sumergidas en las primeras etapas (día 2) de crecimiento, especialmente cuando el hongo fue cultivado en medio débil (8 g de carbono L-1). Después de 4 días de crecimiento, se produjeron conidios sumergidos en altas concentraciones en aquellos cultivos con altos niveles de carbono y menores concentraciones de nitrógeno (relaciones C:N de 50:1, 30:1; Tabla 3). Las tasas de producción de conidios sumergidos se vieron significativamente afectadas por la interacción del medio de cultivo * el tiempo de fermentación (x2(15) = 904,97, P <0,0001). Se observó un aumento general significativo en la producción de conidios sumergidos a lo largo del tiempo en todos los medios de cultivo (x2(12) = 980,8, P <0,0001), con un mayor número de conidios sumergidos alcanzado el día 7. Los medios 1, 2 y 3 que contenían concentraciones de carbono más bajas alcanzaron la producción máxima de conidios sumergidos el día 4 (1,6-3,2 * 108 conidios mL-1), mientras que los medios ricos en carbono 5 y 6 alcanzaron la producción máxima el día 7 (3,9-9,7 * 108 conidios mL-1). Se esperaban las concentraciones más altas de conidios sumergidos observadas en medios ricos en carbono, ya que la mayor disponibilidad de nutrientes en estos medios promovió un mejor crecimiento vegetativo y la posterior conidiación (x2(15) = 1028,2, P <0,0001). Los cultivos de T. harzianum cultivados en medios limitados en carbono (medios 1, 2 y 3) produjeron altas cantidades de conidios sumergidos en 2 días (6,5-7,7 * 107 conidios mL-1), mientras que el medio 6 (la relación C:N de 50:1 y 36 g de carbono L-1) produjeron significativamente más conidios sumergidos (9,7 * 108 conidios mL-1)al día 7.

Tabla 3 - Evaluación de conidios sumergidos, microesclerocios (MS) y producción de biomasa por cultivos de Trichoderma harzianum T-22 cultivados en medios con diferentes relaciones C:N y concentraciones de carbono a 28 ° C y 300 rpm en una incubadora de agitación rotatoria.___________________________________

Conidios sumergidos Microesclerocios

_Medio Carbono Relación (x 107 conidios mL"1) (x 103 MS mL"1)

(g L"1) C:N

Día 2 Día 4 Día 7 Día 2 Día 4 Día7

1 8 10 16,5 af 25,4 ab 27,1 be 0 b 0 b 0 b

2 8 30 17,7 a 32,1 a 33,6 b 0 b 0 b 0 b

3 8 50 13,4 b 15,8b 20,5 c 0 b 0 b 0 b

4 36 10 0 c 0 c 0 d 27,8 a 48,3 a 15,3 a

5 36 30 0 c 0 c 39,1 b 22,2 a 33,3 a 16,6 a

6 36 50 0 c 49,9 a 95,5 a 32,8 a 25,8 a 25,9 a

Biomasa

_Medio Carbono Relación (mg mL"1)

(g L"1) C:N

Día 2 Día 4 Día 7

1 8 10 7,7 c 5,6 c 4,9 d

2 8 30 5,0 d 7,1 c 8,5 c

3 8 50 3,5 d 4,7 d 4,5 d

4 36 10:1 10,0 b 16,1 a 19,3 a

5 36 30:1 12,4 a 16,3 a 16,8 b

6 36 50:1 10,4 b 13,4 b 16,3 b

f Las medias seguidas de letras diferentes dentro de una columna son significativamente diferentes (P ^ 0,05).

La acumulación de biomasa (mg mL-1) siguió el patrón previsto en que el crecimiento de hongos en medios limitados en carbono (8 g L-1) resultó en menos biomasa en comparación con cultivos desarrollados en medios con 36 g L-1 de carbono, independientemente de la relación C:N (Tabla 3). Esta diferencia fue significativa por la interacción del medio de cultivo y el tiempo de fermentación (x2(io) = 122,95, P <0,0001). Los medios 4, 5 y 6 que contenían concentraciones de carbono más altas indujeron una mayor acumulación de biomasa con el tiempo (X(12) = 185,4, P <0,0001). Como se esperaba, el medio 4 produjo la mayor cantidad de biomasa en todos los días de evaluación, con las concentraciones más altas de carbono y nitrógeno (C:N = 10:1 y 36 g L-1 carbono) (x2(15) = 247,14, P <0,0001). La biomasa fúngica disminuyó linealmente con los días de fermentación para el medio 1, el medio más pobre en carbono y nitrógeno. El examen microscópico reveló que el crecimiento de las hifas aumentó con el tiempo en los medios ricos en carbono, seguido de la rápida formación de microesclerocios.

Tolerancia a la desecación y estabilidad al almacenamiento de los propágulos T-22 de T. harzianum

Se prepararon T. harzianum T-22 tal como se describió anteriormente. Después de 7 días de crecimiento, todos los cultivos de T. harzianum de los estudios de relación C:N se secaron al aire hasta una humedad de 0,8 a 3,8 % con las correspondientes mediciones de actividad del agua (Aw) en un rango de 0,35 a 0,41 y se envasaron al vacío para su almacenamiento a 4 °C. Tras la rehidratación e incubación durante 24 h, el 100 % de los gránulos de microesclerocios secos germinaron hifalmente y empezaron a producir conidios aéreos en las extensiones de hifas y en la superficie de los gránulos de microesclerocios, conforme se observa por su coloración verdosa clara. Estos gránulos de microesclerocios continuaron germinando esporogénicamente produciendo conidios con medio de cultivo que influye en la producción de conidios para gránulos de microesclerocios secados al aire (x2(2) = 31,08, P <0,0001). Los gránulos de microesclerocios derivados de medios con una relación C:N de 10:1 produjeron 35 % y 52 % más de conidios en comparación con los gránulos de microesclerocios cosechados de medios con una relación C:N de 30:1 y 50:1, respectivamente (Figura 1). Para los gránulos de microesclerocios secos almacenados a 4 °C, la producción de conidios se vio significativamente afectada tanto por el medio de cultivo (x2(4) = 98.4, P <0.0001) como por el periodo de almacenamiento (x2(3) = 47,2, P <0,0001). Como la interacción de estos dos factores también fue significativa (x2(2) = 13,23, P = 0,0013), las pendientes para las curvas de estabilidad al almacenamiento son estadísticamente diferentes, lo que indica una variación considerable en la producción de conidios durante el tiempo de almacenamiento en los medios de cultivo probados. El patrón de estabilidad al almacenamiento de 12 meses (Figura 1) medido como producción de conidios a partir de gránulos de microesclerocios rehidratados difería solo entre el medio 4 (relación C:N de 10:1) y el medio 6 (relación C:N de 50:1) (P = 0,0007 ), mientras que no se encontraron diferencias en la producción de conidios temporales entre el medio 5 (relación C:N de 30:1) y los demás (P> 0,05). La producción de conidios por gránulos de microesclerocios cosechados de medios con una relación C:N de 10:1 y 36 g de carbono L-1 (medio 4) permaneció alta (1,13-2,03 * 1010 conidios g-1) durante 12 meses de almacenamiento con un aumento significativo en la producción de conidios después de 6 meses de almacenamiento. Los gránulos de microesclerocios del medio con una relación C:N de 30:1 exhibieron la segunda mayor producción de conidios, mientras que los producidos en el medio 6 (relación C:N de 50:1) alcanzaron el rendimiento más bajo. Independientemente de las diferencias en la producción de conidios por los gránulos de microesclerocios de diferentes medios de cultivo, la producción de conidios para cada tratamiento no se redujo con el tiempo, lo que indica que estos gránulos de microesclerocios permanecieron estables en almacenamiento frío hasta 12 meses.

Se evaluó la viabilidad y estabilidad de los conidios sumergidos producidos en diferentes medios de cultivo y cosechados después de 7 días de crecimiento antes y después del secado y luego 1, 2 y 12 meses después del almacenamiento a 4 °C. Solo los conidios sumergidos producidos en el medio 2 (8 g de carbono L"1, relación C:N de 30:1) no sufrieron una reducción significativa en la germinación después del secado en comparación con los conidios sumergidos frescos (pareados t(5) = 1,23, P = 0,273), mientras que los conidios sumergidos de los otros medios probados exhibieron una tolerancia a la desecación significativamente menor (prueba t pareada: P <0,01) (Figura 2). Los conidios sumergidos frescos del medio 1 (nutrientes limitados) tuvieron la tasa de germinación más alta (84,3 % de viabilidad) para los conidios sumergidos frescos, pero la tolerancia a la desecación más baja (2,1 % de viabilidad) (Figura 2). Se utilizó un modelo de desintegración exponencial no lineal para explicar la relación entre el tiempo de almacenamiento y la viabilidad de los conidios sumergidos en cada tratamiento con una confianza de R2 = 0,75-0,81. De acuerdo con los modelos ajustados a nuestros datos de viabilidad experimental registrados a lo largo del tiempo, las vidas medias de los conidios sumergidos almacenados se estimaron en 1,93, 1,05, 1,26 y 1,81 meses cuando se cosecharon de los medios 2, 3, 5 y 6, respectivamente. El medio 2 (bajo contenido de carbono y proporción C:N de 30:1) y 6 (alto contenido en carbono, bajo contenido en nitrógeno relación C:N de 50:1) exhibieron las tasas de germinación más altas para el mes 2, aunque la viabilidad disminuyó significativamente después de 12 meses de almacenamiento con conidios sumergidos del medio 3 (bajo contenido de carbono y relación C:N de 50:1) siendo el más viable (41 % de supervivencia). Una comparación de las curvas de supervivencia mostró que los conidios sumergidos cosechados del medio 3 sobrevivieron más tiempo en almacenamiento en comparación con los conidios sumergidos producidos en los otros medios (P <0,01).

EJEMPLO 2: Efecto de la velocidad de agitación y las fuentes de nitrógeno sobre la fermentación líquida de T. harzianum T-22

Los estudios de fermentación con diferentes fuentes de nitrógeno a concentraciones de nutrientes que conducen a la formación de microesclerocios revelaron que la formación de microesclerocios se produjo en diversos grados con todas las fuentes de nitrógeno ensayadas (Tabla 4). La sustitución de glucosa por melaza como fuente de carbono inhibió la formación de microesclerocios. Todas las fuentes de carbono y nitrógeno probadas a 50:1 (relación C:N) con 36 g de carbono L"1 dieron como resultado la producción de conidios sumergidos y microesclerocios, con la excepción del tratamiento con melaza que solo produjo conidios sumergidos. El aumento de la velocidad de agitación de 300 a 350 rpm no afectó a la producción de conidios sumergidos (x2(1) = 3,11, P = 0,08), a los rendimientos de los microesclerocios (x2(1) = 1,06, P = 0,302) ni a la acumulación de biomasa (x2(1) = 2,16, P = 0,142). Así, los datos experimentales obtenidos durante el crecimiento a 300 y 350 rpm se agruparon para su análisis. Según los rendimientos de los microesclerocios, la harina de semilla de algodón combinada con glucosa a 36 g de carbono L-1 y una relación C:N de 50:1 produjo un número significativamente mayor de microesclerocios del día 2 al 4 en comparación con los otros compuestos nitrogenados analizados (x2(10) = 137,56, P <0,0001, Tabla 4). En general, la formación de microesclerocios aumentó durante el tiempo de fermentación, independientemente de la fuente de nitrógeno empleada (x2(6) = 34,14, P <0,0001). La interacción del medio de cultivo * días de fermentación tuvo un impacto significativo en la producción de microesclerocios (x2(5) = 13,17, P = 0,022), lo que indica que las tasas de crecimiento de los microesclerocios diferían según el medio de cultivo.

Tabla 4 - Evaluación de conidios sumergidos, microesclerocios (MS) y producción de biomasa por cultivos de Trichoderma harzianum T-22 cultivados en medio de cultivo líquido con diferentes fuentes de nitrógeno, relación C:N de 50:1 y concentración de carbono de 36 g L"1. Los cultivos se incubaron a 28 °C y 300 o 350 rpm en una incubadora de agitación rotatoria.

Fuente de Fuente de Conidios sumergidos Microesclerocios carbono nitrógeno (x 107 conidios mL'1) (x 103 MS mL"1) Día 2 Día 4 Día 2 Día 4 Glucosa Caseína hidrolizada con ácido 33,3 aT 80,5 a 25,4 ab 31,9 ab Glucosa Harina de soja 4,6 b 13,5 b 8,8 b 19,9 b Glucosa Harina de semilla de algodón 2,1 b 4,5 c 66,0 a 115,4 a Glucosa Extracto de levadura 0 d 24,5 b 10,5 b 20,8 b Glucosa Licor de maíz fermentado 0 d 14,6 b 0,21 c 0,41 c Melaza Caseína hidrolizada con ácido 19,4 a 24,4 b 0 d 0 d T

Fuente de Fuente de Biomasa

carbono nitrógeno (mg mL-1)

Día 2 Día 4

Glucosa Caseína hidrolizada con ácido 11,2c 15,3 b

Glucosa Harina de soja 15,5 b 19,8 a

Glucosa Harina de semilla de algodón 15,5 b 19,9 a

Glucosa Extracto de levadura 12,4 c 15,1 b

Glucosa Licor de maíz fermentado 11,2c 14,6 b

Melaza Caseína hidrolizada con ácido 19,5 a 21,8 a

TLas medias seguidas de letras diferentes dentro de una columna son significativamente diferentes (P ^ 0,05). Los datos se combinaron a partir de experimentos realizados con diferentes velocidades de agitación, ya que no hubo diferencia significativa entre 300 y 350 rpm.

La composición del medio tuvo un efecto significativo sobre la formación y melanización de microesclerocios de T. harzianum, en particular cuando se usaron diferentes fuentes de nitrógeno. Por ejemplo, los microesclerocios producidos con harina de semilla de algodón (Pharmamedia®) estaban muy melanizados como lo indica su coloración más oscura; mientras que los microesclerocios producidos con caseína hidrolizada con ácido eran de color más claro y menos compactos después de 4 días de crecimiento. Además, se formaron microesclerocios el día 4 a medida que estos propágulos se volvieron más distintos, melanizados y compactos, especialmente cuando se cultivaron con harina de semilla de algodón. No se formaron microesclerocios en el medio modificado con melaza caseína hidrolizada con ácido, y los números de microesclerocios se redujeron en medios que contenían glucosa licor de maceración de maíz (g 400 microesclerocios mL-1).

En el caso de los conidios sumergidos, la producción estuvo significativamente influenciada por la interacción entre la composición del medio y el tiempo de fermentación (x2(5) = 406,3, P <0,0001). La producción de conidios sumergidos aumentó con el tiempo en todos los medios probados (x2(6) = 453,21, P <0,0001) a excepción del medio de melaza caseína hidrolizada con ácido. Los cultivos desarrollados en medios con glucosa harina de semilla de algodón produjeron los mayores rendimientos de conidios sumergidos en 4 días de fermentación (x2(10) = 472,6, P <0,0001). La composición del medio y el tiempo de fermentación actuaron de forma independiente y no tuvieron efecto sobre la acumulación de biomasa (x2(5) = 7,92, P = 0,161). Los cultivos que crecieron en medios que contenían melaza caseína hidrolizada con ácido produjeron más biomasa fúngica (x2(10) = 98,24, P <0,0001), que los cultivos en medios modificados con glucosa extracto de levadura, glucosa caseína hidrolizada con ácido o glucosa licor de maceración de maíz (Tabla 4).

Usando harina de semilla de algodón como fuente de nitrógeno y un inóculo de precultivo, la producción de microesclerocios se vio significativamente afectada tanto por la relación C:N (x2(2) = 6,5, P = 0,039) como por el tiempo de fermentación (x2(2) = 16,51, P = 0,0003), pero no por su interacción (x2(1) = 2,05, P = 0,152) lo que indica que las tasas de crecimiento fueron similares. Se produjeron más microesclerocios para el día 2 en cultivos desarrollados en medios con una relación C:N de 10:1 en comparación con los medios con una relación C:N de 30:1, mientras que, para el día 3, las concentraciones de microesclerocios fueron más bajas en ambos medios sin diferencia estadística (Tabla 5). Trichoderma harzianum creció más rápido produciendo más biomasa en medios con más nitrógeno y una relación C:N de 10:1. Hubo un efecto significativo tanto de la relación C:N (x2(2) = 66,25, P <0,0001) como del tiempo de fermentación (x2(2) = 26,34, P <0,0001) y su interacción (x2(2) = 10,8, P = 0,001) sobre la acumulación de biomasa, lo que indica que el desarrollo de biomasa entre los medios asumió tasas diferentes. De acuerdo con estos datos, los gránulos de microesclerocios secos de cultivos desarrollados en medios con una relación C:N de 10:1 produjeron un 25 % más de conidios en comparación con los gránulos de microesclerocios de cultivos desarrollados en el medio con una relación C:N de 30:1 (x2(1) = 17,95, P <0,0001) cuando se rehidrataron y se incubaron en agar de agua. No obstante, los gránulos de microesclerocios de ambos medios fueron tolerantes a la desecación y mostraron un 100 % de germinación de hifas después de 24 h de incubación. El estudio de estabilidad durante el almacenamiento reveló que la producción de conidios por microesclerocios en gránulos fue generalmente mayor en medio con mayor contenido de nitrógeno (relación C:N de 10:1) (x2(10) = 47,14, P <0,0001) y variable a través de la temperatura (x2(10) = 32,93, P = 0,0003) y mes de almacenamiento (x2(16) = 46,63, P <0,0001) (Figura 3). Hubo una disminución general en la producción de conidios a lo largo del tiempo para los gránulos de microesclerocios a partir de la relación C:N de 10:1 almacenados a 25 °C, mientras que la producción de conidios aumentó para los microesclerocios del medio de relación C:N de 30:1 almacenados a esta misma temperatura (x2(8) = 25,16, P = 0,0015).

Tabla 5 - Evaluación de la relación C:N en microesclerocios (MS) y producción de biomasa por cultivos de Trichoderma harzianum T-22 cultivado en medios líquidos con 36 g de carbono L-1 y harina de semilla de algodón como fuente de nitrógeno.________________________________________________________________________

Relación C:N Microesclerocios (*103 MS mL 1) Biomasa (mg mL-1) ^{Producción de conidios aéreos (g-1gránulos} _{secos de MS)a}

Día 2 Día 4 Día 2 Día 4

10:1 5,9 a 3,6 a 27,8 a 28,6 a 1,7 x 1010 a

30:1 4,4 b 3,3 a 16,3 b 19,0 b 1,3 X 1010 b

a Producción de conidios en agar de agua mediante gránulos de MS rehidratados después de 7 días de incubación a 25 °C. Las medias dentro de una columna que no van seguidas de la misma letra son significativamente diferentes (P g 0,05)._____________________________________________________________________________________

EJEMPLO 3: Producción de cultivo líquido de microesclerocios de una pluralidad de Trichoderma spp.

Se ensayó una pluralidad de Trichoderma spp. en la producción de cultivos líquidos de microesclerocios y biomasa en condiciones de matraz de agitación, tal como se describe en el Ejemplo 1. Estos cultivos de Trichoderma se cultivaron en medio de cultivo líquido 6 (Tabla 1) usando harina de semilla de algodón en lugar de caseína hidrolizada con ácido como fuente de nitrógeno. Tal como se desvela en la Tabla 6, una pluralidad de especies de Trichoderma fueron capaces de formar microesclerocios en las condiciones establecidas. Después de 7 días de crecimiento, se cosecharon los microesclerocios del caldo de cultivo añadiendo tierra de diatomeas (DE) al 5 % p/v y filtrando al vacío para eliminar el medio de cultivo gastado. La torta de filtración de DE-microesclerocios se desintegró en una licuadora y se secó al aire durante la noche hasta menos del 5 % de humedad.

TABLA 6 - Producción de microesclerocios en cultivo líquido por varias especies de Trichoderma utilizando un medio de sales basales suplementado con glucosa y harina de semilla de algodón. Cultivos desarrollados durante 7 días a 350 rpm y 28 °C en una incubadora de agitación rotatoria.______________________________________

Especie de ge -nero Nú .m..ero * de acceso del . M..icroescl .eroci .os (L - ¹ . ) Biomasa ( .g . L .1..)

Trichoderma harzianum NRRL 13879 2,0 x 106 29,4

T. harzianum NRRL 13019 2,0 x 107 21,5

T. harzianum NRRL 54962 1,9 x 106 22,4

T. harzianum ATCC 20847 (T-22) 1,2 x 107 19,9

T. lignorum NRRL 1762 5,3 x 106 25,9

T. viridae NRRL 66084 1,1 x 106 18,8

T. reesei NRRL 6156 9,7 x 105 25,9

T. koningii NRRL 66085 1,0 x 106 26,8

T. pseudokoningii NRRL 22083 1,0 x 106 14,2

T. polysporum NRRL 28981 2,4 x 106 14,4

T. hamatum NRRL 22973 8,6 x 106 32,1

T. asperellum ATCC 204424 1,0 x 106 30,6

* NRRL Culture Collection-USDA, Agricultural Research Service, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL, 61604. ATCC-American Type Culture Collection, Manassas, VA, 20110.

EJEMPLO 4: Producción de conidios por gránulos de microesclerocios secos

Para determinar la producción de conidios mediante gránulos de microesclerocios secados al aire de varias especies de Trichoderma, se adoptaron procedimientos de Jackson MA, Jaronski ST, 2009. Production of microsclerotia of the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol agent for soil-inhabiting insects. Mycological Research 113: 842-850. Brevemente, se inocularon 25 mg de microesclerocios secospreparaciones DE de Trichoderma en placas de agar de agua (2 % p/v) y se incubaron a 25 °C. Tras la rehidratación, los gránulos de microesclerocios germinaron miceliogénicamente (formación del tubo germinal) y esporogénicamente (producción de conidios). Se utilizaron dos placas de agar de agua (submuestras) para cada réplica del tratamiento. Después de una incubación de 24 horas a 25 °C, se examinaron cien gránulos de microesclerocios-DE por placa con un microscopio estereoscópico (Olympus, modelo SZH10) para determinar la germinación de hifas como medida de viabilidad. Para enumerar la producción de conidios, las placas deagar de agua se mantuvieron a 25 °C durante un total de siete días. Después, cada placa se inundó con 7 mL de solución Tween 80 al 0,04 % y los conidios se separaron de los gránulos de microesclerocios-DE utilizando una cinta estéril. Una vez desalojados los conidios, se pipeteó el líquido disponible de cada placa y se midió el volumen de líquido. Se midió microscópicamente la concentración de conidios en el líquido pipeteado usando un hemocitómetro y se calculó el número total de conidios por placa. Para determinar el número de conidios de Trichoderma producidos por gramo de preparación de microesclerocios-DE secada al aire, se dividió el número de conidios cosechados por placa por el peso de la preparación de microesclerocios-DE seca añadida a cada placa de agar de agua (0,025 g).

Tabla 7. Producción de conidios mediante gránulos secos de microesclerocios (MS) de varias especies de Trichoderma formulados con tierra de diatomeas al 5 % después del secado al aire. La producción de conidios se evaluó después de que los gránulos de MS se hubieran incubado en agar de agua durante 7 días a 25 °C._____

Especie de género Número de acceso del cultivo * ^{Producción de conidios} _{(formulación seca g-1)}

Trichoderma harzianum NRRL 13879 1.5 x 1010 /- 0,07

T. harzianum NRRL 13019 1.5 x 1010 /- 0,14

T. harzianum NRRL 54962 1.1 x 1010 /- 0,05

T. harzianum ATCC 20847 (T-22) 9.2 x109 /-0,14

T. lignorum NRRL 1762 2.2 x 1010 /- 0,14

T. viridae NRRL 66084 3,0 x 1010+/-0,14

T. reesei NRRL 6156 2.5 x109 /-0,19

T. koningii NRRL 66085 6.5 x109 /-0,44

T. pseudokoningii NRRL 22083 4.6 x109 /-0,96

(continuación)

T. polysporum NRRL 28981 1,1 x 109 /-0,68

T. hamatum NRRL 22973 3,9 x109 /-1,01

T. asperellum ATCC 204424 6,5 x109 /-1,68

* NRRL Culture Collection - USDA, Agricultural Research Service, National Center for Agricultural Utilization Re­ search, Peoría, IL, 61604.

ATCC - American Type Culture Collection, Manassas, VA, 20110

EJEMPLO 5: Bioensayo del efecto de microesclerocios sobre la enfermedad por marchitamiento fúngico

Se realizaron bioensayos con melón cantalupo (variedad “Hales Best”) para evaluar la bioeficacia de microesclerocios de T. harzianum (T-22) producidos en cultivo líquido (36 g C; relación C:N de 30:1; cosechado en el día 4 y formulado con tierra de diatomeas al 5 % [Hyflo®]). El patógeno de marchitamiento fúngico, Rhizoctonia solani NRRL 22805 (Colección de cultivos del Servicio de Investigación Agrícola (NRRL)) se cultivó en placas de Petri de agar CV8 durante tres días a 25 °C. En un matraz Erlenmeyer de 100 mL, se combinaron 25 cm3]~8,5 g) de cáscaras de arroz pulverizadas lavadas y secas (partículas de ~1 mm3) con 6 mL de caldo de soja tríptico al 10 % (Difco Laboratories, Detroit, MI) y 12 mL de agua doblemente desionizada. Los matraces se esterilizaron en autoclave durante 30 minutos durante tres días consecutivos. Las cáscaras de arroz estériles se inocularon luego con diez tapones de agar colonizado de 1 mm2 de R. solani, se incubaron a 25 °C y se agitaron diariamente durante ocho días para asegurar la colonización homogénea de las partículas individuales. Un día antes de la experimentación, se sembró una pequeña muestra de las cáscaras de arroz infestadas en medio CV8 para asegurar la pureza del cultivo. Los tratamientos del experimento de bioensayo consistieron en R. solani solo (1,5 y 0,625 g de cáscaras de arroz infestadas/1000 cm3 de mezcla de envasado Terra-lite RediEarth® sin vapor (WR Grace, Cambridge, MA), R. solani (ambas dosis de inóculo) T. harzianum (0,4 g de microesclerocios secados al aire/1000 cm3 de sustrato de envasado), solo T. harzianum y un control no inoculado. Estos tratamientos se homogeneizaron en bolsas plásticas y se agitaron vigorosamente antes de la siembra. Los experimentos se realizaron en barquetas (18 x 13 x 5,5 cm) que contenían seis celdas, y cada tratamiento tuvo dos repeticiones (barquetas). En cada celda (5,5 x 5 x 5,5 cm), un pequeño cuadrado de papel (Wypall®, Kimberly -Clark Professional, EE. UU.) se colocó en el fondo para evitar que la mezcla de envasado se saliera de las barquetas. Se añadió un cuarto de taza (59,15 cm3) de medio de envasado no inoculado y no estéril al fondo de cada celda. A continuación, se colocaron en capas cuarenta y cuatro cm3 de los tratamientos únicos o mixtos (infestados con R. solani y/o tratados con T. harzianum) encima de la mezcla de envasado inoculada. Luego se sembraron tres semillas de melón dentro de la capa de mezcla de tratamiento a una profundidad de 0,5 cm y luego se colocaron en una cámara de crecimiento a 26 °C y 14 h de fotofase. Las barquetas se regaron por la parte superior los primeros dos días después de la siembra y luego se mantuvieron en bandejas de plástico separadas con agua adecuada para mantener la humedad de la mezcla de envasado. Se realizaron evaluaciones diarias para enumerar la proporción de plántulas emergidas y plántulas muertas que presentaban síntomas de marchitamiento fúngico causado por R. solani hasta el día 15 después de la siembra. El experimento se repitió tres veces en días diferentes y el tiempo se consideró un efecto de bloqueo. De las plántulas que mostraban síntomas de marchitamiento fúngico, se cortaron muestras del tejido necrótico inmediatamente encima del sistema radicular (es decir, tallo hipocótilo) y se esterilizó la superficie con una solución de hipoclorito de sodio (0,35 % v/v) y se enjuagó tres veces con agua estéril doblemente desionizada. A continuación, las muestras se sembraron en agar de rosa de bengala (MRB) de Martin (Martin, 1950) para confirmar la asociación de R. solani con plántulas marchitas. Para determinar si T. harzianum pudo colonizar el sistema radicular del melón, se esterilizaron en la superficie muestras de plántulas cultivadas en una mezcla de envasado tratadas solo con este hongo, tal como se mencionó anteriormente, y luego se sembraron en agar MRB.

El tratamiento de la mezcla de envasado con R. solani redujo el porcentaje de semillas de melón que emergieron y también resultó en una emergencia tardía en comparación con el control negativo o las semillas tratadas solo con T. harzianum (x2(5) = 44,37, P < 0,0001). La mayor tasa de inóculo de R. solani afectó a la germinación de las semillas en mayor medida en comparación con los otros tratamientos. Por el contrario, el porcentaje de emergencia de plántulas de melón aumentó significativamente en presencia del antagonista para el nivel más alto de inóculo de R. solani y aumentó aritméticamente, aunque no significativamente, para el tratamiento con el nivel más bajo de inóculo de R. solani (Tabla 8). La reducción de la enfermedad para los tratamientos que combinaron R. solani y T. harzianum se calculó sobre la base de los niveles de enfermedad obtenidos cuando las semillas se cultivaron en una mezcla de envasado infestadas con la misma tasa de inóculo de patógenos solo. Por tanto, la presencia de microesclerocios de T. harzianum aumentó sustancialmente la proporción de plántulas sanas en el día 15 (x2(5) = 54,09, P <0,0001). La progresión del marchitamiento fúngico con el tiempo fue más pronunciada en ambos tratamientos con solo R. solani (prueba de rango logarítmico: x2(5) = 194,7, P <0,0001) (Figura 4). Por el contrario, el antagonista redujo el nivel de marchitamiento fúngico posterior a la emergencia en un 90 y un 100 %, respectivamente, en comparación con el suelo inoculado únicamente con el nivel alto y bajo de R. solani. Curiosamente, la adición de gránulos de microesclerocios de T. harzianum a cualquier nivel de inóculo de R. solani aumentó significativamente la probabilidad de supervivencia de las plántulas de melón al marchitamiento fúngico en comparación con los respectivos tratamientos sin el antagonista. Se confirmó que las plántulas con síntomas de marchitamiento fúngico estaban infectadas con R. solani, como lo revela la morfología característica del crecimiento fúngico de la raíz esterilizada en la superficie y los tejidos de hipocótilo sembrados en agar MRB (Figura 5). Por el contrario, las muestras de suelo y los fragmentos de raíz y tallo esterilizados en la superficie de la mezcla de envasado tratada con T. harzianum mostraron el crecimiento de T. harzianum cuando se sembraron en MRB, lo que indica que este hongo de control biológico mantuvo altas poblaciones en la mezcla de envasado inoculada y estaba estrechamente asociado con los tejidos de las raíces de las plantas (FIGURA 5).

Tabla 8 - Porcentaje de semillas de melón que emergieron y porcentaje que se convirtió en plántulas sanas en bioensayos de cámara de crecimiento después de los tratamientos con Trichoderma harzianum T-22 (0,4 g gránulo formulado/1000 cm3) para controlar R. solani inoculado en dos tasas (0,563 y 1,5 g/1000 cm3) en medio de envasado no estéril 15 días después de la siembra.________________________________________________ Tratamiento del suelo Emergencia total (%)a Semillas sanas (%)c Control (sin patógenos) 84,3 af 84,3 a

Control - T. harzianum 84,3 a 84,3 a

R. solani 0,625 g/L 61,1 b 33,3 c

R. solani 1,5 g/L 11,1 c 2,8 d

R. solani 0,625 g/L T. h

75,9 ab 75,9 ab

R. solani 1,5 g/L T. harz 63,9 b

58,3 b

a Porcentaje de emergencia de plántulas de 18 semillas sembradas por barqueta promediado en tres experimentos independientes. c Porcentaje de 18 semillas que desarrollaron plántulas sanas promediado en tres experimentos independientes. f Las medias dentro de una columna que no están seguidas por la misma letra son significativamente diferentes (P ^ 0,05).

EJEMPLO 6: Producción en duelo de microesclerocios y conidios sumergidos de Trichoderma harzianum T-22 a través de un biorreactor

Utilizando Trichoderma harzianum T-22 como se describe anteriormente, se evaluaron microesclerocios, conidios y producción de biomasa en un fermentador B. Braun de 5 L, 4 L en volumen. Se utilizó un medio de sal basal suplementado con glucosa y harina de semilla de algodón para producir una relación C:N de 30:1 y que contenía 36 g de carbono L"1. Los cultivos de Trichoderma harzianum T-22 se cultivaron durante 4 días a 28 °C. El reactor se fijó a una velocidad del impulsor de 900 rpm que permitía 1,5 L de aire por minuto, de modo que el flujo de aire mantenía los niveles de oxígeno disuelto cerca o por encima de cero y proporcionando al menos 0,1 Vaire/Vmedio de cultivo. De manera sorprendente, después de cuatro días de crecimiento del cultivo, la aireación del biorreactor permitió obtener mejores rendimientos de microesclerocios y un mejor rendimiento de conidios sumergidos, tal como se describe en la Tabla 9. Además, tal como se describe en la Tabla 10, las formulaciones secas de microesclerocios y tierra de diatomeas del biorreactor de 5 L produjeron 5,3 x 109 conidios por gramo cuando se rehidrató y se incubó en agar de agua. Además, el 97 % de los conidios sumergidos formados en esta fermentación líquida eran viables después del secado al aire a menos del 5 % de humedad.

Tabla 9

Tabla 10

En la medida en que el término "incluye" o "incluyendo" se emplea en la descripción detallada o en las reivindicaciones, se pretende que sea inclusivo de una manera similar al término "comprendiendo", tal como ese término se interpreta cuando se emplea como una palabra de transición en una reivindicación. Además, en la medida en que el término "o" se emplee en la descripción detallada o en las reivindicaciones (por ejemplo, A o B), se pretende que signifique "A o B o ambos". Cuando los solicitantes tengan la intención de indicar "solo A o B, pero no ambos", entonces se utilizará la expresión "solo A o B, pero no ambos". Por lo tanto, el uso del término "o" en el presente documento es el uso inclusivo y no exclusivo. Véase, Bryan A. Garner, A Dictionary of Modern Legal Usage 624 (2a Ed. 1995). Además, en la medida en que los términos "en" o "dentro" se utilicen en la memoria descriptiva o en las reivindicaciones, se pretende que también signifiquen "en" o "sobre". Además, en la medida en que el término "conectar" se utilice en la memoria descriptiva o en las reivindicaciones, se pretende que no solo signifique "conectado directamente a", sino también "conectado indirectamente a", tal como conectado a través de otro componente o componentes.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Microesclerocios aislados de un hongo, que comprenden un microesclerocio de una especie de Trichoderma. 2. Microesclerocios aislados de acuerdo con la reivindicación 1, en los que dicho hongo comprende uno o más de Trichoderma harzianum, Trichoderma lignorum, Trichoderma viridae, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma polysporum, Trichoderma hamatum, Trichoderma gamsii y Trichoderma asperellum.

   3. Composición que comprende los microesclerocios aislados de un hongo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, comprendiendo la composición microesclerocios de una especie de Trichoderma con un portador agronómicamente aceptable en la que dichos microesclerocios, tras la rehidratación, germinan hifal o esporogénicamente para producir conidios.

   4. Composición de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dichos microesclerocios están presentes en una cantidad eficaz para controlar una enfermedad fúngica de las plantas.

   5. Composición de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la enfermedad fúngica de las plantas es Rhizoctonia, Sclerotinia, Sclerotiorum, Fusarium, Verticillium, Phytophthora, Castenea, Armillaria, Pythium o Thielaviopsis.

   6. Composición de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, en la que dichos microesclerocios están presentes en una cantidad eficaz para promover el crecimiento de las plantas.

   7. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, en la que dichos microesclerocios se producen mediante fermentación de cultivo líquido y están presentes en una biomasa recuperada en una concentración de al menos aproximadamente 1x105 microesclerocios por gramo de dicha biomasa.

   8. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-7, en la que la composición fúngica se combina con un agroquímico, biopesticida, pesticida, fungicida, microbio, bioestimulante o combinaciones de los mismos.

   9. Procedimiento para producir un hongo en una alta concentración de microesclerocios fúngicos tolerantes a la desecación, que comprende:

   a) inocular un medio de cultivo líquido que comprende una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno con propágulos fúngicos de un hongo de control biológico que comprende hifas o esporas de una especie de Trichoderma, teniendo dicha fuente de nitrógeno una concentración entre 8 gramos/litro y 40 gramos/litro y dicha fuente de carbono con una concentración superior a 40 gramos/litro;

   b) incubar los propágulos durante un tiempo suficiente para permitir la producción de microesclerocios; y c) recoger los microesclerocios resultantes.

   10. Procedimiento para el control de enfermedades de las plantas que comprende:

   producir un hongo en una alta concentración de microesclerocios fúngicos tolerantes a la desecación de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 9; y

   aplicar los microesclerocios resultantes a las semillas.

   11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, que comprende, además, rehidratar los microesclerocios resultantes para producir conidios.

   12. Procedimiento para producir un hongo en una alta concentración de microesclerocios fúngicos tolerantes a la desecación y conidios sumergidos, que comprende:

   a) inocular un medio de cultivo líquido que comprende una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno con propágulos fúngicos de un hongo que comprende hifas o esporas de una especie de Trichoderma, teniendo dicha fuente de nitrógeno una concentración entre 8 gramos/litro y 40 gramos/litro y dicha fuente de carbono con una concentración superior a 40 gramos/litro;

   b) incubar los propágulos en un biorreactor durante un tiempo suficiente para permitir la producción de microesclerocios y conidios sumergidos

   c) airear el biorreactor a un flujo de aire que mantenga los niveles de oxígeno disuelto cerca o por encima de cero y proporcionar al menos 0,1 Vaire/Vmedio de cultivo; y

   d) recoger los microesclerocios resultantes y los conidios sumergidos.

   13. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que se recogen aproximadamente 10,8 x 106 microesclerocios por litro y aproximadamente 1,9 x 1012 conidios sumergidos por litro.