RS61032B1 - Trichoderma kompozicije i postupci primene - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na stvaranje mikrosklerocijalnih propagula pomoću mikoparazitskih gljiva i upotrebu ovih mikrosklerocija za kontrolu bolesti biljaka.

Stanje tehnike

[0002] Rod Trichoderma je zemljišna gljiva poznata u svetu, koja je široko istražena kao antagonist brojnih biljnih patogenih gljiva (Howell CR, 2003. Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases: The history and evolution of current concepts. Plant Disease 87:4-10; Harman GE, 2006. Overview of mechanisms and uses ofTrichoderma spp. Phytopathology 96:190-194). Izolati vrsta Trichoderma mogu biti uspešni u suzbijanju biljnih bolesti zbog direktnog antagonizovanja aktivnosti patogena i / ili indukovanja reakcija rezistencije domaćina (Harman GE, 2000. Myths and dogmas of biocontrol: Changes in perceptions derived from research on Trichoderma harzianum T-22. Plant Disease 84: 377-393). Dalje, zabeležena je funkcija Trichoderma kao promotora rasta biljaka za neke sojeve nakon potvrde kao nestalni biljni simbiont kolonizacijom rizosfere (Harman GE, Howell CR, Viterbo A, Chet I, Lorito M, 2004. Trichoderma species - Opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews MicrobioIogy 2:43-56; Harman GE, Kubicek PK, 1998. Trichoderma and Gliocladium Vol 2. Enzymes, biological control and commercial applications. Taylor and Francis, London 1-393). Opisani su različiti načini delovanja za sojeve Trichoderma koji se koriste kao agensi za biokontrolu: a) kompetentnost rizosfere kolonizacijom tla i / ili delova biljke ili nadmetanjem za hranljive materije; b) mikoparazitizam stvaranjem širokog spektra enzima koji razgrađuju ćelijski zid protiv patogena; c) antibioze putem proizvodnje antimikrobnih jedinjenja (isparljivih i neisparljivih sastojaka) koja mogu da ubiju patogene; d) unapređenje rasta poboljšanjem razvoja biljaka i e) indukovanje sistemskih odbrambenih odgovora u biljkama (Harman and Kubicek, 1998, ibid; Harman, 2006, ibid).

[0003] Trenutno se većina proizvoda od Trichoderma na tržištu biopesticida zasniva na čvrstim vazdušnim konidijama koje proizvodi supstrat. Vazdušne konidije Trichoderme proizvodene su fermentacijom čvrstog supstrata na navlaženim zrnima i ovaj postupak traje nedeljama za proizvodnju i sušenje, što posledično povećava proizvodne troškove (Pandey A, Fernandes M, Larroche C, 2008. Current developments in solid-state fermentation. Springer New York, US, 517p. DOI: 10.1007/978-0-387-75213-6; Ramanujam B, Prasad RD, Rangeswaran R, 2010. Mass production, formulation, quality control and delivery of Trichoderma for plant disease management. The Journal of Plant Protection Sciences 2(2): 1-8). Proizvodnja gljivičnih konidija na navlaženim zrnima ima brojna ograničenja, uključujući visoke troškove radne snage, lošu kontrolu kvaliteta, dugo vreme fermentacije, zaštitu okoline za radnike i poteškoće u transferu tehnologije za proizvodnju na veliko. Metode proizvodnje tečnih kultura su istražene i fokusirane su na proizvodnju potopljenih konidija i hlamidospora Trichoderma (Lewis JA, Papavizas GC, 1983. Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp. in liquid and solid growth media. Soil Biology and Biochemistry 15: 351-357; Papavizas GC, Dunn MT, Lewis JA, Beagle-Ristaino J, 1984. Liquid fermentation technology for experimental production of biocontrol fungi. Phytopathology 74(10): 1171-1175; Tabachnik M, 1989. Method of growing Trichoderma. Patent US 4,837,155A; Harman GE, Jin X, Stasz TE, Peruzzotti G, Leopold AC, Taylor AG, 1991. Production of conidial biomass of Trichoderma harzianum for biological control. Biological Control 1: 23-28; Jin X, Taylor AG, Harman GE, 1996. Development of media and automated liquid fermentation methods to produce desiccation-tolerant propagules ofTrichoderma harzianum. Biological Control 7: 267-274; Sriram S, Roopa KP, Savitha MJ, 2011. Extended shelf-life of liquid fermentation derived talc formulations of Trichoderma harzianum with the addition of glycerol in the production medium. Crop Protection 30 : 1334-13339). Ispitivanja formulacije fokusirale su se na procese stabilizacije biomase Trichoderma, vazdušnih konidija i klamidospora koje su pružale odgovarajuću stabilnost skladištenja (Lewis JA, Papavizas GC, 1985. Characteristics of alginate pellets formulated with Trichoderma and Gliocladium and their effect on the proliferation of the fungi in soil. Plant Pathology 34(4): 571-577; Jin X, Custis D, 2010. Microencapsuling aerial conidia of Trichoderma harzianum through spray drying at elevated temperatures. Biological Control 56: 202-208; Yonsel YS, Batum MS, 2010. Trichoderma granule production. Patent EP20080866322; Sriram et al., 2011, ibid). Uprkos ovim pokušajima da se Trichoderma proizvede u tečnoj kulturi, niski prinosi, dugo vreme fermentacije i loša tolerancija na isušivanje i stabilnost skladištenja narušili su široku primenu ove proizvodne metodologije u industriji.

[0004] Da bi se ispunila očekivanja tržišta biopesticida i promovisala upotreba Trichoderma kao fungicida ili za unapređivanje zdravlja biljaka, mora se razviti efikasna i izvodljiva tehnologija proizvodnje tečne kulture kako bi se stvorio visokokvalitetni proizvod na bazi Trichoderma. Poželjno je da Trichoderma bude postojana u zemljištu i propadajućem biljnom materijalu. U tom cilju mnoge biljne patogene gljive proizvode sklerocije; tj. melanizovane, kompaktne hifalne agregate koji su visoko otporni na isušivanje. Ove propagule često služe kao prezimljavajuća struktura za gljive (Cooke, 1983, Morphogenesis of sclerotia. In "Fungal Differentiation: A Contemporary Synthesis" Smith, J.E, ed. pp 397-418. Marcel Dekker, Inc., New York, NY, U.S.A.; Coley-Smith and Cooke, 1971, Survival and germination of fungal sclerotia. In "Annual Review of Phytopathology", Horsfall, J. G., Baker, K. F., Zentmyer, G. A., eds. pp 65-92. Annual Reviews Inc., Palo Alto, CA, U.S.A.). Mikrosklerocija (small sclerotial particles, 200-600 um) of fungal plant pathogens such as Colletotrichum truncatum and Mycoleptodiscus terrestris have been produced in high concentration in submerged liquid culture fermentation (Jackson and Schisler, 1995, Mycological Research,99:879-884; Shearer and Jackson, 2003, U.S. Patent no. 6,569,807). Mikrosklerocije ovih patogena korovitih biljaka pokazale su se kao uporne propagule u zemljištu i vodenom okruženju (Shearer and Jackson, 2006, Biological Control. 38:298-306; Boyette etal., 2007, BioControl 52:413-426). Međutim, do danas, nisu zabeleženi mikrosklerocije ni za jednu vrstu Trichoderma.

[0005] WO 2009/035925 A2 se odnosi na mikrosklerocije entomopatogenih gljiva i upotrebu ovih mikrosklerocija za suzbijanje štetnih insekata.

Kratak opis pronalaska

[0006] Ovde su otkriveni izolovane mikrosklerocije gljive, koji sadrže mikrosklerocije vrste Trichoderma. U jednoj realizaciji ostvarenju pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma harzianum. U još jednoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma lignorum. U sledećoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma viridae. U jednoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma harzianum. U još jednoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma reesei. U sledećoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma koningii. U još jednoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma pseudokoningii. U narednoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma polisporum. U sledećoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su izolovane iz Trichoderma asperellum, Trichoderma hamatum, Trichoderma gamsii, Gliocladium virens i Gliocladium catenulatum.

[0007] Otkrivena је kompozicija koja sadrži mikrosklerocije gljive, kompozicija koja sadrži mikrosklerocije vrste Trichoderma sa agronomski prihvatljivim nosačem, gde date mikrosklerocije, nakon rehidracije, klijaju hifalno ili sporogeno da bi proizvele konidije. U jednoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su prisutne u efikasnoj količini za kontrolu bolesti biljaka. U sledećoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije su prisutne u efikasnoj količini za podsticanje rasta biljaka. U sledećoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocije se dobijaju fermentacijom u tečnoj kulturi i prisutne su u regenerisanoj biomasi u koncentraciji od najmanje oko 1x10<5>mikrosklerobija po gramu date biomase.

[0008] Ovde je takođe otkriven postupak za proizvodnju gljivica u visokoj koncentraciji gljivičnih mikrosklerocija tolerantnih na isušivanje. Postupak obuhvata korak inokulacije tečnog medijuma za kulturu koji sadrži izvor ugljenika i izvor azota gljivičnih progula biokontrolne gljiva koje sadrže hife ili spore vrste Trichoderma, pri čemu navedeni organski izvor azota ima koncentraciju između 8 grama / litri i 40 grama / litri i navedeni izvor ugljenika ima koncentraciju veću od 40 grama / litri, inkubiranjem propagule dovoljno dugo da omogući proizvodnju mikrosklerocija; i sakupljanje nastalih mikrosklerocija koje sadrže biomasu. U jednoj realizaciji, rezultujuće mikrosklerocije su stabilne pri skladištenju nakon sušenja. U još jednoj realizaciji, rezultujuće mikrosklerocije su stabilne pri skladištenju nakon nanošenja na seme. U sledećoj realizaciji, rezultujuće mikrosklerocije nakon rehidracije stvaraju konidiju.

[0009] Takođe je ovde otkriven postupak za proizvodnju gljiva u visokoj koncentraciji gljivičnih mikrosklerocija koje su tolerantne na isušivanje i potopljenih konidija. Postupak obuhvata korak inokulacije tečne podloge za kulturu koja sadrži izvor ugljenika i izvor azota gljivičnim propagulama gljiva koje sadrže hife ili spore vrste Trichoderma, pri čemu navedeni izvor organskog azota ima koncentraciju između 8 grama / litri i 40 grama / litri i dati izvor ugljenika ima koncentraciju veću od 40 grama / litri, inkubiranjem propagula u bioreaktoru dovoljan vremenski period da omogući proizvodnju mikrosklerocija i potopljenih konidija, aeracijom bioreaktora u protoku vazduha koji održava nivo rastvorenog kiseonika u blizini ili iznad nule i obezbeđuje najmanje 0,1 V<vazduh/>V<medijum za kuituru;>i sakupljanje nastalih mikrosklerocija i potopljenih konidija. U jednoj realizaciji pronalaska, pomoću otkrivenog postupka sakupljeno je oko 10,8 х 10<6>mikrosklerocija po litri i oko 1,9 х 10<12>potopljenih konidija po litri.

Kratk opis crteža

[0010] Predmetni pronalazak, zajedno sa otkrivenim realizacijama, najbolje se može razumeti iz sledećeg detaljnog opisa crteža, pri čemu:

SLIKA 1 je grafikon koji prikazuje uticaj odnosa C: N (36 g ugljenika L<-1>) na proizvodnju konidija pomoću osušenih granulama mikrosklerocije (MS) Trichoderma harzianum T-22 formulisanim sa 5% diatomejske zemlje nakon sušenja na vazduhu i tokom dugotrajnog skladištenja uz hlađenje (4 ° C). Proizvodnja konidija procenjena je nakon što su granule MS inkubirane na vodenom agaru tokom 7 dana na 25 ° C. Srednje vrednosti a (± SE) u trenutku „0“ odnosile su se na toleranciju isušivanja i različita slova ukazuju na značajne razlike (P ≤ 0,05).

SLIKE 2A i 2B su grafici koji prikazuju toleranciju na isušivanje i stabilnost skladištenja potopljenih konidija Trichoderma harzianum T-22 proizvedenih u različitim medijima. Osušene submerzno kultivisane konidije pakovane su u vakuum i čuvane na 4 ° C. Klijavost osušenih submerzno kultivisanih konidija procenjena je na vodenom agaru nakon 16 sati inkubacije na 25<0>C. Na sl. 2A, poređenje u parovima između stopa održivosti (znači ± SE) pre i posle sušenja na vazduhu; upareni t-Student test pri P ≤ 0,05 (*), P ≤ 0,01 (**) ili nije značajan (ns). Na sl. 2B, puni krugovi predstavljaju sredinu (± SE), dok su linije fitovanih podataka eksponencijalnim modelom raspada: у = 40 40.3exp(-0.72xvreme) (R<2>= 0.75) [30 : 1 C:N, 8 g L<-1>], у = 7.7 71.6exp(- 0.5xVreme) (R<2>= 0.80) [50 : I C:N, 8 g L<-1>], у = 14.1 58.7exp(-0.39xvreme) (R<2>= 0.79) [30 : 1 C:N, 36 g L<-1>],i у = 17.2 61.9ехр(- 0.35xvreme) (R<2>= 0.81) [50 : 1 C:N, 36 g L<-1>]. Krive raspadanja održivosti upoređene su testom smanjenja zbira kvadrata, a različita slova ukazuju na značajnu razliku između krivih pri P ≤ 0,05.

SLIKA 3 je grafik koji prikazuje stabilnost skladištenja mikrosklerotivnih (MS) granula Trichoderma harziartum T-22 proizvedenih u različitim tečnim medijima koristeći brašno od pamučnog semena kao izvor azota. Kulture su sakupljane nakon 4-dnevnog rasta na 28 ° C i 350 o / min u inkubatoru sa rotacionom mućkalicom. Kulture koje sadrže mikrosklerocije pomešane su sa diatomejskom zemljom, obezvodnjene i osušene na vazduhu na manje od 4% vlage i čuvane u vakuumu upakovane na 4 ° C ili 25 °C.

SLIKA 4 je grafik koji prikazuje verovatnoću koje su preživele iznikle sadnice nakon poleganja ponika za dinju (vrsta „Hales Best“) posejane u zemljištu zaraženom Rhizoctonia solani, primenjene u dve rate (0,625 i 1,5 g /1000 cm<3>) sa ili bez biološkog tretmana sa Trichoderma harzianum T-22 (0,4 g MS granula /1000 cm<3>) u biotestovima u komorama za rast. Vreme cenzurisano za pojavu poleganja ponika do 15 dana nakon setve. Vrednosti predstavljaju srednju vrednost (± SE) tri nezavisna eksperimenta. Krive preživljavanja praćene različitim slovima su statistički značajne prema log-rank testu (P ≤ 0,05). Krive za kontrolu, T. harzianum i T. harzianum R. solani 0,625g / 1000 cm<3>preklapaju se i međusobno se značajno ne razlikuju.

Detaljan opis pronalaska

[0011] Ovde je otkriveno formiranje mikrosklerocijalnih propagula sa Trichoderma i upotreba ovih mikrosklerocija.

Definicije

[0012] Kao što se koristi u specifikaciji i zahtevima, oblik jednine na engleskom "a", "an" i "the" uključuje množinske reference, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Na primer, termin "ćelija" uključuje veći broj ćelija, uključujući njihove smeše.

[0013] Kako se ovde koristi, termin "mikrosklerocija" odnosi se na mala sklerocijalna tela koja su stanje mirovanja gljiva. Mikrosklerocije su stabilni, održivi, ponekad melanizovani, kompaktni hifalni agregati gljiva. Mikrosklerocije same po sebi nisu infektivne, ali kada se rehidriraju, na primer izlaganjem vlazi u zemlji ili u pukotinama u kori drveća, mikrosklerocije će klijati hifalno ili sporogeno da bi proizvele konidije koje su zarazne za ciljne biljne gljivične patogene. Mikrosklerocije su izuzetno tolerantne na isušivanje, sposobne su za klijanje i sporogeno i vegetativno, a takođe zadržavaju fungicidne sposobnosti svojih prirodnih ili normalnih oblika (tj. hifa, blastospore i / ili konidija iste gljive). Morfološki, mikrosklerocija može da bude prisutna kao aglomerisana grupa ćelija.

[0014] Kako se ovde koristi, termin "konidija" odnosi se na aseksualne, nepokretne spore gljive. "Vazdušne" konidije nastaju od hifa gljiva koje rastu na čvrstom supstatu ili se mogu formirati direktno od sklerocijalnih tela uključujući mikrosklerocije. Konidije nastale u vodenom okruženju, kao što je fermentaciona tečnost, nazivaju se „ submerzno kultivisane “ konidije.

[0015] Kako se ovde koristi, termin "fungicid" odnosi se na materijal ili smešu materijala koji indukuju smrtnost, ometaju ili onemogućavaju rast i sprečavaju širenje ciljnih gljiva. Fungicidi se takođe koriste u borbi protiv gljivičnih infekcija. Fungicidi mogu biti kontaktni ili sistemski. Kontaktni fungicid ubija gljive kada se poprskaju po njihovoj površini. Gljiva mora da apsorbuje sistemski fungicid pre nego što gljiva umre. Ovde otkriveni fungicidni postupci ukijučuju preventivne, zaštitne, profilaktičke tretamne i tretmane iskorenjenja.

[0016] Ovde opisan pronalazak je efikasan za proizvodnju mikrosklerocija od bilo koje vrste, soja ili podvrste mikoparazitnih gljiva iz roda Trichoderma, mada je takođe predviđeno da se pronalazak može koristiti za proizvodnju mikrosklerocija od vrsta iz roda Gliocladium. Poželjne vrste za upotrebu uključuju, ali nisu ograničene na Trichoderma harzianum, Trichoderma lignorum, Trichoderma viridae, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma polysporum, Trichoderma asperellum, Trichoderma hamatum, i Trichoderma gamsii.

[0017] Proizvodnja mikrosklerocija predmetnog pronalaska se poželjno vrši u tečnoj kulturi, a proizvodnja velikih razmera se poželjno sprovodi fermentacijom tečne kulture u dubokim rezervoarima. Takođe je predviđeno da mogu da se koriste čvrsti medijumi za kulturu. Tečni medijum koji se koristi za pripremu melanizovane mikrosklerocije je kritičan, jer njihovo formiranje i prinos zavise od medijuma. Za upotrebu, medijum poželjno sadrži izvor azota u koncentraciji između 8 grama izvora azota / litri i manje od 40 grama izvora azota / litri i izvor ugljenika u koncentraciji većoj od 18 grama ugljenih hidrata / litri, poželjno više od 40 grama ugljenih hidrata / litri. Pogodni izvori azota uključuju, ali se ne ograničavaju na hidrolizovani kazein, ekstrakt kvasca, hidrolizovani protein soje, hidrolizovani protein semena pamuka, kukuruzni ekstrakt u prahu, i hidrolizovani glutenski protein kukuruza. Pogodni izvori ugljenika uključuju, ali nisu ograničeni na ugljene hidrate, uključujući glukozu, fruktozu i saharozu i glicerol. Poželjni medijum za tečne kulture za upotrebu ovde je opisao Džekson (U.S. patent 5,968,808). Gljive iz roda Trichoderma proizvode mikrosklerocije kada se gaje u submerznoj podlozi na Džeksonovom medijumu. Ove mikrosklerocije do sada nisu opisane od ovih gljiva. Fermentacija se može sprovesti upotrebom konvencionalnih aerobnih tehnika tečne kulture uz mešanje i aeraciju. Poželjno je da agitacija inhibira rast micelija na zidu posude. Pogodne temperature mogu se kretati od oko 15 ° C do oko 32 ° C, a pH može da se kreće od oko 4 do oko 8. Poželjni temperaturni opseg za fermentaciju je od oko 25 ° C do oko 30 ° C. Kada se dobije izrasla gljiva dovoljne težine, obično za oko 2-4 dana, počinju da se formiraju mikrosklerocije i fermentacija se zatim nastavlja dok se ne dobije dovoljno visoka koncentracija mikrosklerocije. Bez ograničavanja na to, u poželjnoj realiaciji, fermentacija se nastavlja sve dok veći deo održivih gljiva u kulturi (tj. veći od 30 tež. %), a još poželjnije do pretežnog udela održivih gljiva u kulturi (tj. veće od 50 tež. %) se diferenciraju i formiraju mikrosklerocije. Uslovi vrtložne fermentacije pronađeni u nekim konfiguracijama bioreaktora mogu da dovedu do pucanja mikrosklerocija u manjemelanizovane, hifalne agregate ili mešane formulacije. Ovi hifalni agregati ili mešane formulacije će razmnožavati konidije. Po završetku fermentacije, mikrosklerocija se može regenerisati upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je filtracijom ili centrifugiranjem. Mikrosklerocije se mogu osušiti, na primer vazdušnim sušenjem ili nanošenjem na seme, do niskog nivoa vlage i čuvati na sobnoj temperaturi ili nižoj. U poželjnoj realizaciji, biomasa koja se regeneriše iz fermentacije, nakon sušenja, sadržaće približno 1 х 10<5>ili više mikrosklerocija po gramu biomase (na osnovu suve težine biomase), naročito najmanje I х 10<6>mikrosklerocija pogramu biomase.

[0018] Smatra se da bi se komercijalna proizvodnja mikrosklerocija tečnom fermentacijom mogla postići fermentacijom u bioreaktoru. Uslovi u bioreaktoru bi tečnom fermentacijom formirali kulture i mikrosklerocije i submerzno kultivisanih konidija. Smatra se da bi prosečan stručnjak u ovoj oblasti bio u stanju da kontroliše nastajanje mikrosklerocija i submerzno kultivisanih konidija kontrolom brzine rastvorenog kiseonika u fermentoru, s obzirom na ovde opisanom saznanju o uslovima medijuma.

[0019] Komercijalne formulacije za upotrebu kao biokontrola protiv patogenih gljiva mogu se pripremiti od mikrosklerocija koje su sakupljene iz medijuma za kulturu, kao što je ovde opisano. Praktički, predviđeno je da se komercijalne formulacije mogu pripremiti direktno iz kulture, čime se otklanja potreba za bilo kojim koracima prečišćavanja. lako se tečne kulture mogu koristiti direktno, na primer za oblaganje semena, supstrat za sadnju, u poželjnoj realizaciji voda se uklanja iz kultura do delimičnog ili značajnog sušenja kao što je gore opisano, a osušena kultura se lomi ili melje na sitne čestice pogodne za nanošenje putem konvencionalnih aplikatora granula, koristeći tehnike uobičajene u struci. Da bi se olakšala primena i naknadni rast gljiva i konidacija, ubrane mikrosklerocije mogu se alternativno formulisati u pogodnom, agronomski prihvatljivom, hranljivom ili inertnom nosaču ili vehikulumu za primenu kao vlažni prah, prašina, granule, mamci, rastvori, koncentrati za emulziju, emulzije, suspenzija koncentrata i sprejevi (aerosoli). Na primer, za primene kao tečnost, mikrosklerocija se može formulisati kao suspenzija ili emulzija. U ovoj realizaciji, poželjni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na vodu, pufere ili ulja semenja ili biljna ulja. U alternativnoj, poželjnoj reaklizaciji posebno pogodnoj za primenu u čvrstim granulama, mikrosklerocije se mogu formulisani sa čvrstim inertnim nosačima ili razblaživačima kao što su diatomejska zemlja, talk, glina, vermikulit, СаСО3, zrno kukuruznog klipa, alginatni gel, matrice skroba ili sintetički polimeri, ili se mogu inkorporirati u konvencionalne mikročestice ili mikrokapsule sa kontrolisanim oslobađanjem. Prosečan stručnjak će prepoznati da se gljive mogu takođe formulisati u kombinaciji sa konvencionalnim aditivima, kao što su sredstva za slepljivanje ili adherensi, emulgatori, površinski aktivne materije (surfaktanti), pene, ovlaživači ili okvašivači, antioksidansi, UV protektanti, hranljivi aditivi, đubriva ili insekticidi. Za primenu na seme, koru ili krošnju drveća i biljaka, mikrosklerocije se takođe poželjno formulišu sa higroskopnim ili hidrofilnim adjuvansom. Formulacije mogu imati niže koncentracije mikrosklerocije u kojima bi prosečan stručnjak u oblasti tehnike koristio mikrosklerociju kao agrohemijski agens, biopesticid, pesticid, fungicid, aditiv za rast biljaka i biostimulante.

[0020] Apsolutna količina mikrosklerocija i njihova koncentracija u finalnoj kompoziciji odabrane su tako da obezbede efikasno smanjenje patogenih gljiva u poređenju sa netretiranom kontrolom. Stvarna količina nije kritična i funkcija je praktičnih razmatranja kao što su osobine nosača ili vehikuluma, gustina ciljnih patogenih gljiva i način i mesto primene, a mogu se lako utvrditi rutinskim ispitivanjem. Za kompoziciju koja sadrži mikrosklerocijum vrste Trichoderma sa agronomski prihvatljivim nosačem, gde pomenuta mikrosklerocija, nakon rehidracije, klija hifalno ili sporogeno za proizvodnju vazdušnih konidija, u svrhu formulacije i primene, definiše se kao „efikasna količina" u smislu bilo koje količine mikrosklerocije dovoljne da naknadno proizvedu dovoljno konidija u ciljnom staništu da zaraze i ubiju ciljne patogene gljive u odnosu na netretiranu kontrolu. Kao primer i bez ograničavanja na iste, predviđeno je da pogodne formulacije obično sadrže oko 1 х 10<5>ili više mikrosklerocija po gramu biomase izdvojene iz tečne kulture (na osnovu sušene težine biomase), poželjno najmanje 1 х 10<6>mikrosklerocija po gramu biomase.

[0021] U upotrebi, mikrosklerocija predmetnog pronalaska može se primeniti u blizini ili na površinu biljaka koje se štite, na primer, na kori drveta ili kao obloga semena, koristeći konvencionalne tehnike. U poželjnoj realizaciji, mikrosklerocija se nanosi na zemljište ili na supstrate za saksije bez zemlje koje se koriste u staklenicima, u granulisanom obliku. U zavisnosti od ciljane gljivične štetočine, mikrosklerocija se može primeniti u poljoprivrednim poljima, voćnjacima, staklenicima, baštama ili travnjacima, ili na ili u blizini ukrasnog bilja, drveća ili komercijalnih ili stambenih objekata kao antagonist biljnim patogenim gljivama.

[0022] U sledećoj realizaciji pronalaska, mikrosklerocija se može primeniti u blizini ili na površinu biljaka da pospeši rast i zdravlje biljaka.

[0023] Apsolutna količina mikrosklerocija i njihova koncentracija u finalnoj kompoziciji su odabrane da obezbede efikasno smanjenje patogenih gljiva ili poboljšaju zdravlje biljaka u

1

poređenju sa netretiranom kontrolom. Stvarna količina nije kritična i funkcija je praktičnih razmatranja kao što su osobine nosača ili vehikuluma, gustina ciljnih patogenih gljiva, i način i mesto primene, i mogu se lako utvrditi rutinskim ispitivanjem. U svrhu formulisanja i primene, "efikasna količina" je definisana da označava bilo koju količinu mikrosklerocije koja je dovoljna da naknadno proizvede dovoljno hifnog rasta ili konidija u ciljnom staništu da inhibiraju rast i infektivnost ciljnih patogenih gljiva u odnosu na netretiranu kontrolu. Kao primer i bez ograničavanja na iste, predviđeno je da pogodne formulacije obično sadrže oko 1 х 10<5>ili više mikrosklerocije po gramu biomase izdvojene iz tečne kulture (na osnovu sušene težine biomase), poželjno najmanje 1 х 10<6>mikrosklerocija po gramu biomase

[0024] Ovde opisane mikrosklerocije vrste Trichoderma proizvode hife i vazdušne konidije efikasne za kontrolu biljnih patogena. Bez ograničenja na to, biljni patogeni koji mogu biti kontrolisani mikrosklerocijom ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na različite vrste Rhizoctonia, Sclerotinia, Sclerotiorum, Fusarium, Verticillium, Phytophthora, Casienea, Armillaria, Pythium, i Thielviopsis.

Statistička analiza

[0025] Svaki eksperiment izveden je sa potpuno slučajnim dizajnom i ponovljen najmanje tri puta. R (R Core Team, 2012. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria) i paket lте4 (Bates DM, Maechler M, Bolker B, 2012. Ime4: Linear mixed-effects models using S4 classes. R package version 0.999999-0. Available at http://cran.stat.sfu.ca/web/packages/lme4/lme4.pdf) korišćene su za izvođenje analize mešovitih linearneih efekata za podatke ponovljenih mera za adresiranje efekta medijuma kulture i vremena na akumulaciju biomase, koncentraciju submerzno kultivisanih konidija, koncentraciju mikrosklerocija, proizvodnju konidija iz osušene mikrosklerocije i održivost konidija. Za ispitivanje tečne fermentacije, tretman (tj. medijum za kulturu), vreme (tj. dan fermentacije ili period skladištenja) i njihov rok interakcije uneti su kao fiksni efekti u model. Kao nasumični efekti, balon za mućkanje (tj. predmet ili replika) bio je predmet ponovljenih posmatranja tokom vremena i eksperimentalnog ponavljanja kako bi se uzele u obzir varijacije u eksperimentima izvedenim različitih datuma. Hi-kvadrat test odnosa verovatnoće korišćen je za rešavanje značaja fiksnih efekata i njihove interakcije u linearnim mešovitim modelima procenom njihovih P-vrednosti upoređivanjem ugneždenih modela (Pinheiro JC, Bates DM, 2000. Mixed-Effects Models in S and SPLUS. New York: Springer. R Core Team, 2012. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Podaci o proizvodnji submerzno kultivisanih konidija i mikrosklerocija transformisani su sa log10(x 1) kada je to bilo potrebno kako bi se ispunile pretpostavke normalnosti i homogenosti podataka pre analize. Post-hoc poređenja u paru izvedena su upotrebom funkcije ghlt u multcomp paketu za poređenje tretmana, korigovanjem P-vrednosti za višestruka poređenja metodom u jednom koraku. Održivost submerzno kultivisanih konidija (% klijavosti (germinacije)) zabeležena pre i posle sušenja na vazduhu (tj. dva zavisna uzorka) upoređene su uparenim t-Student testom da bi se objasnio uticaj tolerancije na isušivanje na preživljavanje submerzno kultivisanih konidija u okviru svakog tretmana. Za longitudinalni skup podataka o stabilnosti skladištenja mikrosklerocija, mereno proizvodnjom konidija tokom vremena, tretman (=medijum za kulturu) i vreme (meseci) su fitovani kao fiksni efekti, dok su paketi uzoraka (tj. subjekti) smatrani nasumičnim efektom u mešovitom linearnom modelu. Zatim su upoređeni nagibi kriva stabilnosti skladištenja upotrebom kontrastne matrice da bi se procenile razlike među tretmanima. Podaci o stabilnosti skladištenja submerzno kultivisanih konidija fitovani su eksponencijalnim modelom raspadanja pomoću funkcije nls, a poređenje nelinearnih modela izvršeno je testom smanjenja zbira kvadrata (Ratkowsky D, 1990. Handbook of Nonlinear Regression Models. New York and Basel: Marcel Dekker).

[0026] Efekat tretmana zemljišta na udeo sadnica dinja ubijenih odbacivanjem uzrokovanim sa R. solani procenjen je analizom preživljavanja (Kaplan EL, Meier P, 1958. Nonparametric estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association 53 (282): 457-481). Sadnice koje prežive nakon 15. dana smatrane su cenzurisanim. Statistički značajne razlike između krivih preživljavanja za tretmane procenjene su log-rank testom (paket preživljavanja) sa P-vrednostima podešenim Bonferroni metodom. Podaci o udelu u ukupnom izdanku sadnica i zdravih sadnica zabeleženih 15. dana analizirani su generalizovanim linearnim mešovitim modelom (glmer) sa tretmanima kao fiksnim efektom, dok su kockice (kopije) i biotestovi (eksperimentalna ponavljanja) ocenjeni kao slučajni efekti.

Izolati Trichoderma

[0027] Trichoderma harzianum Rifai soj T-22 (ATCC 20847; Rootshield®, BioWorks, Inc., Geneva, NY) je korišćen tokom ovog ispitivanja. Čiste kulture T. harzianum izolovane su iz serijskih razblaženja Rootshield®-a i gajene na krompir dekstroznom agaru (PDA, Difco®) na 25 ± 1 ° C najmanje sedam dana. Pojedinačne kolonije su prečišćene ponovnim izolovanjem na PDA, a jedan hifalni vrh je izolovan i gajen na PDA. Molekulska analiza izolata trihoderme potvrdila je da je soj T. harzianum T-22 (ATCC 20847). Kolonija formirana sporupacijom, која је proizašla iz ovog hifalnog vrha korišćena je kao osnovna kultura T. harzianum T-22 i isečena na delove od 1 mm<2>smeštena u krio-epruvete sa 10% glicerola i čuvana na -80<0>C.

[0028] Ispitane su i druge vrste Trichoderma, preuzete od USDA, Agricultural Research Service, Culture Collection in Peoria, Ulinois. Namely, Trichoderma harzianum (NRRL 13879), T. harzianum (NRRL 13019), T. harzianum (NRRL A-24290), T. lignorum (NRRL 1762), T. viridae (NRRL A-23264), T. reesei (NRRL 6156), T. koningii (NRRL A-18871), T. pseudokoningii (NRRL 22083), i T.polysporum (NRRL 28981). Osnovne kulture svakog soja Trichoderma spp. uzgajane su kao izolati pojedinačnih spora na krompir dekstroznom agaru (PDA) tokom tri nedelje na sobnoj temperaturi. Ploča formirana sporulacijom je isečena na agar čepiće od 1 mm<2>i osnovne kulture ovih agar čepića čuvane u 10% glicerolu na -80 ° C. Konidijalne inokulumi za eksperimente satečnom kulturom proizvedeni su inokulacijom PDA ploča konidijalnom suspenzijom iz smrznutih matičnih kultura i uzgajanjem ovih kultura na sobnoj temperaturi (~ 22 ° C) tokom 2-3 nedelje. Sve tečne kulture inokulirane su u početnoj koncentraciji od 5 х 10<6>konidija ml<-1>tečne hranljive podloge.

[0029] Za ispitivanje tečne hranljive podloge, konidijalne inokulume su dobijene inokulacijom PDA ploča sa konidijalnom suspenzijom iz zamrznutih matičnih kultura i uzgajanjem kultura na 25 ± 1<0>C tokom 2-3 nedelje. Konidijaine suspenzije su dobijene iz sporulisanih ploča od agara ispiranjem ploča sa 10 ml sterilnog rastvora koji sadrži 0,04% polioksietilen sorbitan mono-oleata (Tween 80, Sigma®).

[0030] Rast i stvaranje propagule od T. harzianum procenjeni su u tečnim medijumima koji sadrže različite koncentracije ugljenika, odnos ugljenik-azot (C: N) i izvore azota koristeći poludefinisani tečni medijum sastavljen od bazalnih soli sa glukozom (Sigma®) i kazeina hidrolizovanog kiselinom (Casamino acid®, Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) kao izvori ugljenika i azota. Definisani medijum bazalnih soli koji se koriste u svim tečnim kulturama sadrži po litri dvostruke dejonizovane vode (Jackson MA, McGuire MR, Lacey LA, Wraight SP, 1997. Liquid culture production of desiccation tolerant blastospores of the bioinsecticidal fungus Paecilomyces fumosoroseus. Mycological Research 101: 35-41) KH2PO4, 2,0 g; CaCI2.2H2O, 0,4 g; MgS04.7H20, 0,3 g; FeSO4.7H2O, 0,05 g; СоС12.6Н2O, 37 mg; MnSO4.H2O, 16 mg; ZnSO4.7H2O, 14 mg; tiamin, riboflavin, pantotenat, niacin, piridoksamin, lipoinsku kiselinu, po 500 µg ; i folnu kiselinu, biotin, vitamin B12, po 50 µg . Količine glukoze i kazeina hidrolizovanog kiselinom i odgovarajuće koncentracije ugljenika i odnosi C: N prikazani su u Tabeli 1 za svaki ispitivani medijum za kulturu. Izračunavanja koncentracije

1

ugljenika i odnosa C: N zasnovana su na 40% ugljenika u glukozi i 53% ugljenika i 8% azota u kazeinu hidrolizovanom kiselinom.

[0031] Sve kulture su uzgajane u 100 ml tečne hranljive podloge koristeći 250 ml Erlenmajere sa uskim grlom (Bellco Glass, Vineland, NJ, SAD) inkubirane na 28<0>C i 300 obrtaja min<-1>(o / min) u inkubatoru sa rotacionom mućkalicom sa horizontalnim momentum od 1,9 cm (INNOVA 4000, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA). Tokom perioda fermentacije, erlenmajeri su često ručno protresani da bi se sprečio rast micelija na zidu erlenmajera. Za ispitivanja odnosa C: N i koncentracije ugljenika, medijumi su inokulirani sa konidijalnom suspenzijom dobijenom od 2-3 nedelje stare agarne ploče formirane sporulacijom T. harzianum prilagođene da daju konačnu koncentraciju od 5<x>10<5>konidija mL<-l>u medijumu. Dva, 4 i 7 dana nakon inokulacije uzeti su uzorci od 3 ml za merenje koncentracije biomase, submerzno kultivisanih konidija i mikrosklerocija. Za svaki eksperiment, uzeti su uzorci u duplikatu iz svakog erienmajera na svaki dan uzorkovanja, a u ispitivanjima su korišćena dva duplikatna erlenmajera za svaki tretman. Eksperimenti su ponovljeni četiri puta.

Različiti izvori azota

[0032] Različiti izvori azota su ocenjeni za upotrebu u gajenju kultura T. harzianum na osnovu akumulacije biomase i formiranja propagule. Izvori azota su dodati medijumu bazalnih soli sa glukozom da bi se dobio medijum sa odnosom C:N od 50:1 i koncentracijom ugljenika od 36 g L<-1>koji odgovara medijumu 6 iz prethodnog eksperimenta (videti Tabelu 1). Pored toga, srednja formulacija koja sadrži melasu u prahu (BioSev Ltd., Sao Paulo, SP, Brazil) sa približno 40% ugljenika testirana je kao zamena za glukozu kao glavni izvor ugljenika. Testirani nusproizvodi na bazi proteina bili su sojino brašno (Toasted Nutrisoi®, ADM Co., Decatur, IL, SAD), pamučno brašno (Pharmamedia®, ADM, Memphis, TN, SAD), ekstrakt kvasca (Difco®, Detroit, MI, SAD) i kukuruzni liker u prahu (Solulis® AST, Rokuette Corporation, Gurnee, IL, SAD). Svi sastavi medija praćeni njihovim sadržajem azota prikazani su u Tabeli 2. Za procene izvora azota, dobijen je konidijalni inokulum T. harzianum iz sporulisanih PDA ploča da bi se dobila konačna koncentracija 5 х 10<6>konidija mL<-1>medijuma. Testirane su dve brzine mešanja, 300 ili 350 o / min, i smatrane su drugim faktorom u eksperimentalnom dizajnu. Uzorci su uzeti nakon 2 i 4 dana rasta i akumulacije biomase, izmerene su koncentracije potopljenih konidija i mikrosklerocije. Svaki tretman je dupliran i eksperimenti su ponovljeni tri puta.

[0033] Da bi se završile studije izvora azota, medijum bazalnih soli koji sadrži brašno pamučnog semena kao izvor azota (odnos C: N od 30 : 1 i 10 : 1 sa koncentracijom ugljenika od 36 gL<-1>) inokuliranje trodnevnim pred-kulturom T. harzianum -a koja je gajena u medijumu 6 (Tabela 1). Pred-kulture su inkulirane konidijama koristeći prethodno opisane metode. Eksperimenti su ponovljeni tri puta.

Rast i formiranje propagula

[0034] U različitim vremenima tokom rasta uzimana su tri ml uzorka za merenje akumulacije biomase i koncentracija konidija i mikrosklerocija. Za celokupno uzorkovanje korišćeni su plastični vrhovi pipete od 1 ml sa širokim otvorom (vrh uklonjen skalpelom radi stvaranja šireg otvora). Za merenja akumulacije biomase, iz boca je uzet jedan ml celokupne tečnosti za kulture, a biomasa je odvojena iz utrošenog medija, vakuum filtracijom na prethodno izvagane filter diskove (2,4 cm stakleno vlakano G6, Fisher Scientiflc, Pittsburgh, PA, USA). Akumulacija suve težine određena je sušenjem biomase i filter diska na 60 ° C do konstantne težine pre merenja. Koncentracije submerzno kultivisanih konidija određivane su mikroskopski pomoću hemocitometra. Za merenje koncentracije mikrosklerocija, 100 µL tečnosti za kulturu je postavljeno na staklo i prekriveno pokrivnim stakalcem od 24<х>50 mm (Fisher Scientific, USA). Celokupna mikrosklerocija na staklu izbrojana je mikroskopski. Samo diskretni, kompaktni hifalni agregati prečnika većeg od 50 µm su računati kao mikrosklerocije. Tečnost kulture je razblažena kako je bilo prikladno radi lakšeg brojanja mikrosklerocija. Tokom uzorkovanja i razblaživanja tečnosti kulture, suspenzije mikrosklerocija su neprekidno vorteksovane kako bi se osigurala homogenost. Flemocitometar

1

PRIMER 1: Formulacija, tolerancija na isušivanje i stabilnost skladištenja T. harzianum

[0035] U studijama procene medijuma, kulture soja T. harzianum T-22, kako je gore opisano, uzorkovane su 2. i 4. dana i sakupljene 7. dana. Sedmog dana sakupljanja, diatomejska zemlja [DE (HYFLO®, Celite Corp., Lompoc, CA, USA)] dodata je gljivičnoj biomasi svakog balona sa mikrosklerocijom i / ili submerzno kultivisanom konidijom u koncentraciji od 5 g DE 100 mL-<1>tečnosti kulture. Smeše biomase kulture - DE su profiltrirane vakuumom u Bihnerovom levku koristeći filter papir Whatman No. 1. Dobijeni filter kolač je razbijen pulsiranjem u blenderu (Mini Prep® Plus, Cuisinart, Stamford, CT, USA), nanet u sloju u Petrijeve šolje, i sušen na vazduhu preko noći na ~22 ° C sa relativnom vlažnošću (rh) od 50-60%. Sadržaj vlage u preparatima mikrosklerocija -DE određen je analizatorom vlage (Mark II, Denver Instruments, Arvada, CO, USA) zajedno sa odgovarajućim aktivnostima vode, mereno na uravnoteženoj temperaturi od 25 ° C (AquaLab series 4TEV, Decagon Devices, Inc., Pullman, WA, USA). Kada su formulacije T. harzianum osušene do sadržaja vlage manji od 4% (aktivnost vode < 0,35), osušene formulacije su vakuumski upakovane u najlonske polietilenske vrećice (15,3 х 21,8 cm) vacuum aparatu za pakovanje (Multivac C 100, Sepp Haggenmiiller, Wolfertschwenden, Germany) i čuvane na 4 ° C.

1

[0036] Da bi se uporedila stabilnost skladištenja Trichoderma mikrosklerocija pod sobnom temperaturom i hlađenjem, uzgajano je sto ml kultura T. harzianum T-22 u medijumu u odnosu C: N, 10 : 1 i 30 : 1 sa brašnom pamučnog semena kao izvorom azota, sakupljeno je 4. dana, formulisano sa 5% DE (m / z) i sušeno na vazduhu do manje od 4% vlage. Formulacije mikrosklerocija osušene na vazduhu su vakuumski upakovane u aluminijumske Mylar kesice veličine 15 * 22 cm (PAKVF4, IMPAK Corporation, Los Angeles, CA, USA) i čuvane na temperaturi ambijenta (25 ° C) ili u frižideru (4 ° C).

[0037] Za ispitivanje održivosti mikrosklerocije i proizvodnje submerzno kultivisanih konidija, metodologija je prilagođena iz Jackson MA, Jaronski ST, 2009. Production of microsclerotia of the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol agent for soil-inhabiting insects, Mycological Research 113: 842-850. Ukratko, 25 mg osušenih mikrosklerocija - DE preparata T. harziamm inokulirano je na ploče od vodenog agara (2% t/ z) i inkubirano na 25 ° C. Nakon rehidracije, granule mikrosklerocije klijale su miceliogeno (stvaranje zametnih cevi) i sporogeno (proizvodnja konidija). Dve ploče sa agarima sa vodom (poduzorci) korišćene su za svaku ponovljenu obradu. 24 sata nakon inkubacije na 25 ° C, sto mikrosklerocija -DE granula po ploči ispitivano je stereo mikroskopom (Olympus, model SZH10) za klijanje (germinaciju) hifa kao meru održivosti. Da bi se prebrojala proizvodnja konidija, ploče s vodenim agarom držane su na 25 ° C ukupno sedam dana. Zatim je svaka ploča preplavljena sa 7 ml 0,04% rastvora Tween 80 i konidije su uklonjene iz granula mikrosklerocija -DE pomoću sterilne petlje/prstena. Nakon uklanjanja konidija, pipetirana je dostupna tečnost sa svake ploče i izmerena zapremina tečnosti. Koncentracija konidija u pipetiranoj tečnosti izmerenaje mikroskopski pomoću hemocitometra i izračunat je ukupan broj konidija po pločici. Da bi se odredio broj proizvedenih konidija T. harzianum po gramu vazduhom osušenog preparata mikrosklerocija -DE, broj konidija sakupljenih po pločici podeljen je sa težinom osušenog preparata mikrosklerocija -DE dodatog na svaku pločicu vodenog agara (0,025 g ).

[0038] Zatestove održivosti submerzno kultivisanih konidija, 0,01 g svake formulacija osušene submerzno kultivisane konidije - DE je razblaženo u 10 ml 0,04% Tween 80 (Sigma®), vorteksovano 1 min, a DE čestice su ostavljene da se slegnu 1 min. Dva alikvota od 100 uL supernatanta koji sadrže uglavnom potopljene konidije inokulirani su na pločice sa vodenim agarom (1% agar m / z) da bi se dobilo približno 1 х 10<5>submerzno kultivisanih konidija po pločici. Preliminarna ispitivanja nisu otkrila značajne razlike između PDA i vodenog agara za procenu germinacije. Germinacija je procenjena mikroskopski procenom 200 submerzno

1

kultivisanih konidija po pločici vodenog agara primenom inverznog mikroskopa (Olympus IMT-2) nakon 16 sati inkubacije na 25 ° C. Smatralo se da je submerzno kultivisana konidija proklijala kada je zametna cev veća od prečnika konidijuma. Tolerancija na isušivanje izražena je kao procenat preživljavanja submerzno kultivisanih konidija i svaka replika tretmana imala je dva poduzorka. Dalja ispitivanja su se sprovodila mesečno sve dok održivost spora nije iznosila manje od 40%.

[0039] U uslovima kulture u sudu uz mućkanje, primećeno je praćenje formiranja submerzno kultivisanih konidija i mikrosklerocije T. harzianum T-22 tokom 7-dnevnog perioda fermentacije u tečnim hraljivim podlogama sa različitim odnosima C: N. Mikrosklerocija T. harzianum su isključivo nastale i razvijene u medijima sa visokim ugljenikom (36 g L<-1>), bez obzira na ispitivani odnos C: N. U najbogatijem medijumu (# 4) sa odnosom C: N od 10 : 1 nedostajala je proizvodnja submerzno kultivisanih konidija, ali je promovisan razvoj mikrosklerocija. Potpuno formirana mikrosklerocija T harzianum bila je prečnika 90-600 µm. Prema modelu linearnih mešovitih efekata koji se uzima u obzir za ponovljena merenja tokom vremena, na proizvodnju mikrosklerocije sa T harzianum uticali su i medijum za kulturu (X<2>(15)= 264.84, P < 0.0001) i vreme fermentacije (X2

(12)= 32.09, P = 0.0013). Interakcija između vremena fermentacije i medijuma za kulturu u velikoj meri je doprinela variranju u stopama proizvodnje mikrosklerocije (X<2>(12)= 20.78, P = 0.023) (Tabela 3). Generalno, više mikrosklerocija je proizvedeno do 4. dana u svim hranljivim podlogama (2.6 - 4.8 х 10<4>mL<-1>), a manji broj mikrosklerocija je primećen 7. dana, verovatno usled agregacije mikrosklerocija. Mikrosklerocija T. harzianum počela je da se formira nakon rasta od 48 sati, s tim što je mikrosklerocija postala bolje definisana i kompaktnija do 4. dana, a melanizacija do 7. dana. Dok su mikrosklerocije bile kompaktnije i melanizovane, ove strukture su imale kratke hifalne nastavke koji su proizašli sa njihove površine. Koncentracije mikrosklerocija su zabeležene do 4. dana u medijima 4 i 5, dok je veći broj nezrele mikrosklerocije bio prisutan u medijumu 6. do 2. dana.

[0040] Uslove za submerzno kultivisanje podržali su svi testirani mediji, osim medijuma 4 koji je proizveo samo mikrosklerocije. Ove submerzno kultivisane konidije su formirane od konidiogenih ćelija (npr. fijalida) vezanih za submerzno kultivisane hife u ranim fazama (dan 2) rasta, posebno kada su gljive gajene u slabom medijumu (8 g ugljenika L<-1>). Posle 4-dnevnog rasta, submerzno kultivisane konidije su proizvedene u visokim koncentracijama u onim kulturama sa visokim nivoom ugljenika i nižim koncentracijama azota (50 : 1, 30 : 1 odnos C: N; tabela 3). Na brzinu proizvodnje potopljenih konidija značajno je uticala interakcija

1

medijuma za kulturu х vreme fermentacije (X<2>(15)) = 904.97, P < 0.0001). Značajan ukupni porast proizvodnje submerzno kultivisanih konidija tokom vremena zabeležen je u svim podlogama za kulturu (X<2>(12)= 980.8, P < 0.0001), a veći broj uornjenih konidija postignut je do 7. dana. Medijum 1, 2 i 3 koji sadrži niže koncentracije ugljenika su dostigle maksimalnu submerznu proizvodnju konidija do 4. dana (1.6 - 3.2 х 10<8>conidia mL<-1>), dok su mediji bogati ugljenikom 5 i 6 postigli maksimalnu proizvodnju do 7 dana (3.9 - 9.7 х 10<8>konidija mL<-1>). Očekivane su se veće koncentracije submerzno kultivisanih konidija zapažene u medijima bogatim ugljenikom, jer je veća dostupnost hranljivih sastojaka u tim medijima promovisala bolji vegetativni rast i naknadnu konidaciju (X<2>(15)<=>1028.2, P <0.0001). Kulture T. harziamm uzgajane u medijima sa ograničenim ugljenikom (mediji 1, 2 i 3) dale su velike količine submerzno kuitivisanih konidija u roku od 2 dana (6.5 - 7.7<х>10<7>konidija mL<-1>), dok je medijum 6 (odnos C: N od 50:1 i 36 g ugljenika L<-1>) proizveo znatno više submerzno kultivisanih konidija (9,7<х>10<8>konidija mL<-1>do 7. dana.

Tabela 3 - Procena proizvodnje submerzno kultivisanih konidija, mikrosklerocija (MS) i biomase kulturama Trichoderma harzianum T-22 gajene u medijumu sa različitim odnosima C : N i koncentracijama ugljenika na 28°C i 300 o/min u inkubatoru sa rotacionom mućkalicom

1

[0041] Akumulacija biomase (mg mL<-1>) pratila je predviđeni obrazac u kome je rast gljiva u medijima sa ograničenim ugljenikom (8 g L<-1>) rezultirao manjom biomasom u poređenju sa kulturama uzgajanim u medijima sa 36 g L<-1>ugljenika, bez obzira na odnos C: N (tabela 3). Ova razlika je značajna interakcijom medijuma za kulturu i vremenom fermentacije (X<2>(10)= 122.95, P < 0.0001). Mediji 4, 5 i 6 koji sadrže veće koncentracije ugljenika, indukovali su povećanu akumulaciju biomase tokom vremena (Х<2>(12)= 185.4, P < 0.0001). Kao što se i očekivalo, medijum 4 je proizveo najviše biomase u svim danima procene, imajući najviše koncentracije ugljenika i azota (C:N= 10 : 1 i 36 gL<-1>ugljenika) (Х<2>(15)= 247.14, P < 0.0001). Gljivična biomasa linearno se smanjivala sa danima fermentacije za medijum L medijum koji je najsiromašniji u ugljeniku i azotu. Mikroskopskim pregledom otkriveno je da se rast hifa s vremenom povećavao u medijima bogatim ugljenikom praćen brzim stvaranjem mikrosklerocija.

Tolerancija na isušivanje i stabilnost sklađištenja T. harzianum T-22 propagula [0042] T harzianum T-22 su pripremljeni kako je gore opisano. Posle rasta od 7 dana, sve kulture T. harziamtm iz ispitivanja odnosa C: N sušene su na vazduhu do 0,8 do 3,8% vlage sa odgovarajućim merenjima aktivnosti vode (Aw) u opsegu od 0,35 do 0,41 i pakovane u vakuum za skladištenje na 4<0>C. Nakon rehidratacije i inkubacije tokom 24 sata, 100% osušenih granula mikrosklerocije klijale su hifalno i vazdušne konidije su počele da se proizvode na hifalnim nastavcima i na površini granula mikrosklerocija, što je primećeno njihovom svetlo zelenkastom bojom. Ove granule mikrosklerocija nastavile su da klijaju sporogeno proizvodeći konidije sa medijumom za kulturu koji utiču na proizvodnju konidija za granule mikrosklerocije sušene na vazduhu (Х<2>(2)= 31.08, P < 0.0001). Mikrosklerocijalne granule dobijene sa hranljive podloge sa odnosom C : N od 10 : 1 dale su 35% i 52% više konidija u poređenju sa granulama mikrosklerocija sakupljenim sa hranljive podloge sa odnosnom C: N od 30 : 1 odnosno 50 : 1 (slika 1). Za osušene granule mikrosklerocija čuvane na 4<0>C, na proizvodnju konidija značajno su uticali i hranljiva podloga (Х<2>(4)= 98.4, P < 0.0001) i period skladištenja (Х<2>(3)= 47.2, P < 0.0001). Kako je interakcija ova dva faktora takođe bila značajna (Х<2>(2)= 13.23, P = 0.0013), nagibi krivih stabilnosti skladištenja su statistički različiti, što ukazuje na značajne razlike u stvaranju konidija tokom vremena skladištenja u ispitivanim hranljivim podlogama. Model stabilnosti 12-mesečnog skladištenja (slika 1) meren kao proizvodnja konidija od rehidrartisanih granula mikrosklerocija razlikovao se samo između medijuma 4 (odnos C: N od 10 : I) i medija 6 (odnos C: N od 50 : 1) (P = 0,0007 ), dok nije utvrđena razlika u proizvodnji privremenih konidija između medijuma 5 (odnos C: N od 30 :

2

1) i ostalim (P> 0,05). Proizvodnja konidija granuloma mikrosklerocija sakupljenim iz podloga sa odnosom C: N od 10 : 1 i 36 g ugljenika L<-1>(medijum 4) ostala je visoka (1,13-2,03 x 10<10>konidija g<-1>) tokom 12 meseci skladištenja sa značajnim povećanjem proizvodnja konidija nakon 6 meseci skladištenja. Mikrosklerocijalne granule iz medijuma sa odnosom C: N od 30 : 1 pokazale su drugu najveću proizvodnju konidija, dok su one proizvedene u medijumu 6 (odnos C: N od 50 : 1) postigle najniži prinos. Bez obzira na razlike u proizvodnji konidija iz granula mikrosklerocije od različitih hranljivih podloga, proizvodnja konidija za svaki tretman nije vremenom smanjena, što ukazuje da su ove granule mikrosklerocije ostale stabilne tokom skladištenja na hladnom do 12 meseci.

[0043] Održivost i stabilnost submerzno kultivisanih konidija proizvedenih u različitim hranljivim podlogama i sakupljenim nakon 7-dnevnog rasta procenjeni su pre i posle sušenja, a zatim 1, 2 i 12 meseci nakon skladištenja na 4<0>C. Samo submerzno kultivisane konidije proizvedene u medijumu 2 (8 g ugljenika L<-1>, odnos C: N od 30 : 1) nisu pretrpele značajno smanjenje germinacije nakon sušenja u poređenju sa sveže submerzno kultivisanim konidijama (upareni t(5)= 1,23, P = 0,273), dok su submerzno kultivisane konidije iz drugih ispitivanih podloga pokazale značajno nižu toleranciju na isušivanje (upareni t-test: P < 0,01) (slika 2). Sveže submerzno kultivisane konidije iz medijuma 1 (ograničene količine hranljivih materija) imale su najveću brzinu klijanja (84,3% održivosti) za sveže uronjene konidije, ali najslabiju toleranciju na isušivanje (2,1% održivosti) (slika 2). Model nelinearnog eksponencijalnog raspada korišćen je da objasni odnos između vremena skladištenja i održivosti submerzno kultivisanih konidija u svakom tretmanu sa pouzdanošću od R<2>= 0,75-0,81. Prema modelima prilagođenim našim eksperimentalnim podacima o održivosti zabeleženim tokom vremena, vreme polu-života uskladištenih submerzno kultivisanih konidija procenjeno je za 1,93, 1,05, 1,26 i 1,81 meseca kada se vrši prikupljanje iz medijuma 2, 3, 5 i 6, tim redom. Medijum 2 (mali sadržaj ugljenika i odnos C: N od 30 : 1) i 6 (visok nivo ugljenika, nizak nivo azota odnos C: N od 50 : 1) pokazali su najviše brzine klijanja do 2. meseca, mada se održivost značajno smanjila nakon 12 meseci skladištenja sa submerzno kultivisanim konidijama od medijuma 3 (nizak nivo ugljenika i odnos C: ТМ od 50 : 1) koji je najodrživiji (preživljavanje od 41%). Poređenje krivih preživljavanja pokazalo je da su potopljene konidije ubrane iz medijuma 3 duže preživele u skladištu u poređenju sa onima submerzno kultivisanim konidijama proizvedenim u drugim medijima (P < 0,01).

PRIMER 2: Uticaj brzine mešanja i izvora azota na fermentaciju tečnosti sa T. harzianum T-22

[0044] Ispitivanje fermentacije sa različitim izvorima azota pri koncentracijama hranljivih sastojaka pogodnih za stvaranje mikrosklerocija otkrile su da se formiranje mikrosklerocija javlja u različitom stepenu kod svih testiranih izvora azota (tabela 4). Zamena melase glukozom kao izvorom ugljenika inhibirala je stvaranje mikrosklerocija. Svi izvori ugljenika i azota testirani na 50 : 1 (odnos C: N) sa 36 g ugljenika L<-1>rezultirali su proizvodnjom i submerzno kultivisanih konidija i mikrosklerocija, sa izuzetkom tretmana melasom koji je proizvodio samo submerzno kultivisane konidije. Povećanje brzine mešanja sa 300 na 350 o / min nije uticalo na proizvodnju submerzno kultivisanih konidija (Х<2>(1)= 3.11, P = 0,08), prinose mikrosklerocija (Х<2>(1)= 1.06, P = 0,302), ili na akumulaciju biomase (Х2

(1)= 2.16, P = 0,142). Tako su eksperimentalni podaci dobijeni tokom rasta pri 300 i 350 o / min grupisani zajedno za analizu. Na osnovu prinosa mikrosklerocija, brašno pamučnog semena u kombinaciji sa glukozom pri 36 g ugljenika L<-1>i odnosom C: N od 50 : 1 dalo je značajno veći broj mikrosklerocija od 2. do 4. dana u poređenju sa ostalim ispitivanim jedinjenjima azota (Х<2>(10)= 137,56 , P < 0,0001, tabela 4). Sve u svemu, stvaranje mikrosklerocija se povećavalo tokom vremena fermentacije, bez obzira na upotrebljen izvor azota (Х<2>(6)= 34,14, P < 0,0001). Interakcija hranljivih podloga x dana fermentacije imala je značajan uticaj na proizvodnju mikrosklerocija (Х<2>(5)= 13,17, P = 0,022), što ukazuje da su se stope rasta mikrosklerocija razlikovale u zavisnosti od hranljivih podloga.

Tabela 4 - Procena proizvodnje submerzno kultivisanih konidija, mikrosklerocija (MS) i biomase kulturama Trichoderma harzianum T-22 gajenim u medijumu sa različitim izvorima azota, odnosima C : N od 50 : 1 i koncentracijama ugljenika od 36g L<-1>. Kulture su inkubirane na 28°C i 300 ili 350 o/min u inkubatoru sa rotacionom mućkalicom

[0045] Sastav medijuma imao je značajan uticaj na formiranje i melanizaciju T. harziamtm mikrosklerocija, posebno kada su korišćeni različiti izvori azota. Na primer, mikrosklerocije proizvedene sa brašnom pamučnog semena (Pharmamedia®) bile su visoko melanizovane, što pokazuje njihova tamnija obojenost; dok su mikrosklerocije proizvedene kiselinski hidrolizovanim kazeinom bile svetlije boje i manje kompaktne nakon 4-dnevnog rasta. Dalje, mikrosklerocije su nastale do 4. dana, jer su ove propagule postajale više određene, melanizovane i kompaktnije, posebno kada su uzgajane sa brašnom od pamučnog semena. Nijedna mikrosklerocija nije nastala u medijumu dopunjenom melasom kiselinski hidrolizovani kazein, a broj mikrosklerocija je smanjen u hranljivim podlogama a koje sadrže glukozu kukuruzni liker (≤ 400 mikrosklerocija mL<-1>).

[0046] Za potopljene konidije, na proizvodnju je značajno uticala interakcija između sastava medijuma i vremena fermentacije (Х<2>(5)= 406,3, P < 0,0001). Proizvodnja submerzno kultivisanih konidija povećavala se tokom vremena u svim ispitivanim hranljivim podlogama

2

(Х<2>(6)= 453,21, Р <0,0001), osim u medijumu melasa kiselinski hidrolizovan kazein. Kulture uzgajane u medijima sa glukozom i brašnom od pamučnog semena dale su najviše prinosa submerzno kultivisanih konidija za 4 dana fermentacije (Х<2>(10)= 472,6, P < 0,0001). Sastav medijuma i vreme fermentacije delovali su nezavisno i nisu uticali na akumulaciju biomase (Х<2>(5)= 7,92, P = 0,161). Kulture uzgajane u hranljivim podlogama koje sadrže melasu kiselinski hidrolizovani kazein proizvele su više gljivične biomase (Х<2>(10)= 98,24, P < 0,0001), nego kulture uzgajane u hranljivim podlogama dopunjenim sa glukozom ekstraktom kvasca, glukozom kiselinski hidrolizovanim kazeinom ili glukozom kukuruznim likerom (Tabela 4).

[0047] Korišćenje brašna od pamučnog semena kao izvora azota i inokuluma pre-uzgoja, na proizvodnju mikrosklerocija značajno su uticali i odnos C: N (Х<2>(10)= 6,5, P = 0,039) i vreme fermentacije (Х<2>(2)= 16,51, P = 0,0003), ali ne njihovom interakcijom (Х2

(1)= 2,05, P = 0,152) što ukazuje na to da su brzine rasta bile slične. Više mikrosklerocija je proizvedeno do 2. dana u kulturama uzgajanim u medijumima sa odnosom C: N od 10 : 1 u odnosu na medijume sa odnosom C: N od 30 : 1, dok su do 3. dana koncentracije mikrosklerocija bile niže u oba medija bez statističke razlike (Tabela 5). Trichoderma harziamim je brže rasla proizvodeći više biomase u medijumima sa više azota i odnosom C: N od 10 : 1. Ostvaren je značajan efekat i odnosa C: N (Х<2>(2)<=>66,25, P < 0,0001) i vremena fermentacije (Х<2>(2)= 26,34, P < 0,0001) i njihove interakcije (Х<2>(2)= 10,8, P = 0,001) na akumulaciji biomase, što ukazuje na to da je razvoj biomase između medija pretpostavljao različite brzine. U saglasnosti sa ovim podacima, osušene granule mikrosklerocija iz kultura uzgajanih u medijima u odnosu C: N od 10 : 1 proizvele su 25% više konidija u poređenju sa granulama mikrosklerocija iz kultura uzgajanih u medijumu sa odnosom C: N od 30 : 1 (Х<2>(1)= 17,95 , P < 0,0001) kada se rehidrira i inkubira na vodenom agaru. Ipak, granule mikrosklerocija oba medijuma bile su tolerantne na isušivanje i pokazale su 100% hifalnog klijanja nakon 24 sata inkubacije. Ispitivanje stabilnosti skladištenja otkrilo je da je proizvodnja konidija sa granuloma mikrosklerocija uglavnom veća u medijumu sa većim sadržajem azota (odnos C: N od 10 : 1) (Х<2>(10)= 47,14, P < 0,0001) i promenljivom temperaturom (Х<2>(10)= 32,93, P = 0,0003) i mesecom skladištenja (Х<2>(16)= 46,63, P < 0,0001) (slika 3). Vremenom je došlo do opšteg pada proizvodnje konidija za granule mikrosklerocije od odnosa C: N od 10 : 1 skladištenih na 25 ° C, dok je proizvodnja konidija porasla za mikrosklerocije sa odnosom medijuma C: N od 30 : 1 koji se čuva na istoj temperaturi (Х<2>(8)= 25,16, P = 0,0015).

[0048] Veći broj Trichoderma spp. je testirano u proizvodnji tečne kulture mikrosklerocije i biomase u sudu za mućkanje (erlemajeru), kao što je opisano u primeru 1. Ove kulture Trichoderma uzgajane su u tečnom medijumu za kulturu 6 (tabela 1), koristeći kao izvor azota brašno od pamučnog semena umesto kiselinski hidrolizovanog kazeina. Kao što je otkriveno u tabeli 6, veći broj vrsta Trichoderma je mogao da formira mikrosklerocije pod navedenim uslovima. Nakon 7-dnevnog rasta, mikrosklerocija je sakupljena iz tečnosti za gajenje dodavanjem diatomejske zemlje (DE) kao 5% m / z i filtriranjem pod vakuumom da bi uklonio utrošenu hranljivu prodlogu. Filter kolač DE-mikrosklerocija izmrvljen je u blenderu i preko noći sušen na vazduhu do manje od 5% vlage.

TABELA 6- Proizvodnja tečne kulture mikrosklerocija od različitih vrsta Trichoderma koristeći medijum bazalnih soli dopunjen glukozom i brašnom od pamučnog semena. Kulture su uzgajane 7 dana na 350 o / min i 28 ° C u inkubatoru sa rotirajućom mućkalicom

2

PRIMER 4: Proizvodnja konidija suvim mikrosklerocijalnim granulama

[0049] Za određivanje proizvodnje konidija pomoću vazduhom osušenim mikrosklerocijalnim granulama različitih vrsta Trichoderma, prihvaćene su metode od Jackson MA, Jaronski ST, 2009. Production of mikrosklerocija of the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliae and their potential for use as a biocontrol agent for soil-inhabiting insects. Mycological Research 113: 842-850. Ukratko, 25 mg osušenih mikrosklerocija -DE preparata Trichoderma-e inokulirano je na ploče od vodenog agara (2% t / a) i inkubirano na 25<0>C. Nakon rehidracije, granule mikrosklerocije klijale su miceliogeno (stvaranje zametnih cevi) i sporogeno (proizvodnja konidija). Dve ploče sa vodenim agarima (pod-uzorci) koriščene su za svaki ponovljen tretman. Nakon 24 sata inkubacije na 25<0>C, sto mikrosklerocija -DE granula po ploči ispitivano je stereo mikroskopom (Olympus, model SZH10) za klijanje hifa kao meru održivosti. Da bi se specifikovala proizvodnja konidija, ploče s vodenim agarom držane su na 25<0>C ukupno sedam dana. Zatim je svaka ploča zalivena sa 7 ml 0,04% rastvora Tween 80 i konidije su uklonjene iz granula mikrosklerocija -DE pomoću sterilne petlje. Nakon izbacivanja konidija, pipetirana je dostupna tečnost sa svake ploče i izmerena zapremina tečnosti. Koncentracija konidija u pipetiranoj tečnosti izmerena je mikroskopski pomoću hemocitometra i izračunat je ukupan broj konidija po pločici. Da bi se odredio broj proizvedenih konidija Trichoderma-e po gramu vazduhom osušenog preparata mikrosklerocija - DE, broj konidija pokupljenih po ploči podeljen je sa težinom osušenog preparata mikrosklerocija -DE dodatog na svaku ploču vodenog agara (0,025 g).

Tabela 7. Proizvodnja konidija suvim granulama mikrosklerocija (MS) različitih vrsta Trichoderma formulisanih sa 5% diatomejskom zemljom nakon sušenja na vazduhu.

2

Proizvodnja konidija procenjena je nakon što su granule MS inkubirane na vodenom agaru tokom 7 dana na 25<0>C.

* NRRL - Culture Collection, USDA, Agricultural Research Service, National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL, 61604

\ATCC - American Туре Culture Collection, Manassas, VA, 20110

PRIMER 5: Biološki test dejstva mikrosklerocija na uzročnike poleganja ponika [0050] Biološka ispitivanja dinje Cantaloupe melon (cv. „Hales Best“) sprovedena su da bi se procenila bioefikasnost mikrosklerocija T. harzianum (T-22) proizvedene u tečnoj kulturi (36 g C; odnos C: N od 30 : 1; sakupljeno 4. dana i formulisan sa 5% diatomejskom zemljom [Hyflo®]). Patogen uzročnik poleganja ponika, Rhizoctonia solani NRRL 22805 (Agricultural Research Service (NRRL) Culture Collection) uzgajan je u Petrijevim šoljama na agaru CV8 tokom tri dana na 25 ° C. U erlenmajeru od 100 ml, 25 m<3>(~ 8,5 g) oprane i osušene praškaste ljuske pirinča (čestice ~ 1 mm<3>) kombinovane su sa 6 ml 10% triptične sojine tečnosti (Difco Laboratories, Detroit, MI) i 12 ml dvostruko dejonizovane vode. Posude su autoklavirane 30 minuta tri dana za redom. Zatim su sterilne pirinčane ljuske inokulirane sa deset, 1 mm<2>čepića kolonizovanog agara R. solani, inkubirane na 25 ° C, i svakodnevno mućkane tokom osam dana kako bi se obezbedila homogena kolonizacija pojedinačnih čestica. Jedan dan pre eksperimenta, mali uzorak zaraženih pirinčanih ljuski stavljen je na podlogu CV8 da bi se obezbedila čistoća kulture. Eksperimentalni biološki tretmani sastojali su se samo od R. solani

2

(1,5 i 0,625 g zaraženih pirinčanih ljuski / 1000 cm<3>neparene smeše Terra-lite RediEarth® supstata za sađenje (W.R. Grace, Cambridge, MA), R. solani (obe doze inokuluma) T. harzianum (0,4 g sušene na vazduhu mikrosklerocije / 1000 m<3>supstata za sađenje), samo T. harzianum i neinokulisana kontrola. Ovi tretmani su homogenizovani u plastičnim kesama i snažno promućkani pre setve. Eksperimenti su sprovedeni na posudama ( 18 * 13 х 5,5 cm) koje sadrže šest ćelija, a svaki tretman je imao dve replikacije (posude). U svakoj ćeliji (5,5<х>5 х 5,5 cm) po jedan mali kvadratni papir (Wypall®, Kimberly-Clark Professional, USA) postavljen na dno kako bi sprečio da supstrat za sadnju istekne iz posuda. Na dno svake ćelije dodata je jedna četvrtina šolje (59,15 cm<3>) nesterilne, neinokulirane podloge za sadnju. Četrdeset četiri cm<3>pojedinačnog ili kombinovanog tretmana (zaražene sa R. solani i / ili tretirane sa T. harzianum) su zatim nanete u sloju na vrh neinokuliranog supstrata za sadnju. Zatim su tri semena dinje posejana u sloj mešavine za obradu na dubini od 0,5 cm, a zatim postavljena u komoru za rast na 26 ° C i 14 h fotofaze. Posude su prvo zalivane vodom prva dva dana nakon setve, a zatim su držane u odvojenim plastičnim tacnama sa dovoljno vode da bi se održala vlažnost smeše za sadnju. Svakodnevno su vršene procene kako bi se prebrojao udeo izniklih sadnica i uvelih sadnica koje pokazuju simptome poleganja ponika izazvanog sa R. solani do 15. dana posle setve. Eksperiment je ponovljen tri puta u različitim danima, a vreme se smatralo blok efektom. Od onih sadnica koje pokazuju simptome poleganja ponika, uzorci iz nekrotičnog tkiva neposredno iznad korenovog sistema (tj. hipokotilne stabljike) su isečeni i površinski sterilisani rastvorom natrijum-hipohlorita (0,35% z / z) i isprani tri puta sterilnom dvostruko-dejonizovanom vodom. Zatim su uzorci postavljeni na Martin's rosebengal (MRB) (Martin, 1950) da bi se potvrdila povezanost R. solani sa simptome poleganja ponika. Da bi se utvrdilo da li je T. harzianum uspeo da kolonizuje korenov sistem dinje, uzorci korena od sadnica uzgajanih u smeši za sadnju tretiranim samo ovom gljivom su površinski sterilisani, kao što je prethodno pomenuto, a zatim naneti na MRB agar.

[0051] Tretiranje mešavine za sadnju sa R. solani smanjilo je procenat nicanja semena dinje i takođe rezultiralo odloženim nicanjem u poređenju sa negativnom kontrolom ili semenom tretiranim samo T. harzianum (X<2>(5)= 44,37, P < 0.0001). Veća stopa inokuluma R. solani je u većoj meri oslabila klijavost semena u poređenju sa ostalim tretmanima. Nasuprot tome, procenat nicanja sadnica dinje značajno je povećan u prisustvu antagonista za najviši nivo inokuluma R. solani i aritmetički povećan, mada ne značajno, za tretman sa nižim nivoom inokuluma R. solani (Tabela 8 ). Smanjenje bolesti za tretmane koji su kombinovali R. solani i T. harzianum izračunato je na osnovu nivoa bolesti dobijenih kada je seme uzgajano u smeši

2

za sadnju zaraženom istom stopom samo inokuluma patogena. Tako je prisustvo T. harzianum mikrosklerocija značajno povećalo udeo zdravih sadnica 15. dana (X<2>(5)= 54,09, P < 0,0001). Napredovanje simptoma poleganja ponika tokom vremena bilo je izraženije u oba tretmana samo sa R. solani (log-rank test: X<2>(5)= 194,7, P < 0,0001) (slika 4). Suprotno tome, antoganist je smanjio nivo simptoma poleganja ponika posle nicanja za 90, odnosno 100%, u poređenju sa zemljištem inokuliranim samo visokim i niskim nivoima R. solani. Zanimljivo je da je dodavanje granula T. harzianum mikrosklerocija bilo kom nivou inokuluma R. solani značajno povećao verovatnoću preživljavanja sadnica dinje do poleganja ponika u poređenju sa odgovarajućim tretmanima bez antagonista. Potvrđeno je da su sadnice sa simptomom poleganja ponika zaražene sa R. solani, što je i otkrila karakteristična morfologija rasta gljiva iz površinski sterilisanog korena i hipokotilnih tkiva nanetih na MRB agar (slika 5). Suprotno tome, uzorci tla i površinski sterilisani fragmenti korena i stabljika iz smeše za sadnju koje su tretirane sa T. harzianum -om pokazali su izdanak T. harzianum -a kada je nanet na MRB, što ukazuje da je ova biokontrola gljive održavala visoke populacije u inokuliranim smešama za sadnju i bila je usko povezana sa tkivima korena biljaka. (Slika 5).

Tabela 8 - Procenat semena dinja koji je iznikao i procenat koji se razvio u zdrave sadnice u biološkim testovima u komori za rast nakon tretmana sa Trichoderma harzianum T-22 (0,4 g formulisane granule / 1000 cm<3>) za kontrolu R. solani inokuliranih po dve stope (0,563 i 1,5 g / 1000 cm<3>) u nesterilnom medijumu za sadnju 15 dana nakon setve.

2

PRIMER 6: Proizvodnja dvostrukih mikrosklerocija Trichoderma harzianum T-22 i submerzno kultivisanih konidija putem bioreaktora

[0052] Koristeći Trichoderma harzianum T-22, kao što je gore otkriveno, proizvodnja mikrosklerocija, konidijia i biomase određene su pod 5L B, Braun fermentorom, zapremine od 4L. Korišćenjem medijuma za bazalnu so dopunjenog glukozom i brašnom od pamučnog semena, dobija se odnos C: N od 30 : 1 i sadrži 36 g ugljenika L-l. Kulture Trichoderma harzianum T-22 gajene su 4 dana na 28 ° C. Reaktor je podešen na brzinu rada od 900 o / min, omogućavajući 1,5 1 vazduha u minuti tako da protok vazduha održava nivo rastvorenog kiseonika blizu ili iznad nule i obezbeđuje najmanje 0,1 Vvazduh/ Vhranijivi medijum. Neočekivano, nakon četiri dana rasta kulture, aeracija bioreaktora omogućila je poboljšane prinose mikrosklerocija i poboljšani prinos submerzno kultivisanih konidija, kako je dato u Tabeli 9. Pored toga, kako je dato u Tabeli 10, formulacije osušene mikrosklerocije-diatomejske zemlje iz bioreaktora od 5L daloje 5,3 х 10<9>konidija po gramu kada se rehidrira i inkubira na vodenom agaru. Takođe, 97% submerzno kultivisanih konidija formiranih u ovoj tečnom fermentacionom medijumu bilo je održivo nakon sušenja na vazduhu na manje od 5% vlage.

[0053] U meri u kojoj se termin "uključuje" ili "uključujući" koristi u detaljnom opisu ili zahtevima, nameraje da bude sveobuhvata na način sličan terminu "sadrži/obuhvata", jer se taj termin tumači kada se koristi kao prelazna reč u zahtevu. Dalje, u meri u kojoj se termin "ili" koristi u detaljnom opisu ili zahtevima (npr. A ili B), namera je da ima značenje "A ili B ili oba". Kada podnosioci nameravaju da navedu „samo A ili B, ali ne i oba“, tada će se koristiti izraz „samo A ili B, ali ne i oba“. Dakle, upotreba izraza ,,ili “ je ovde inkluzivna, a ne upotreba koja podrazumeva izuzimanje. Videti, Bryan A. Garner, A Dictionary of Modern Legal Usage 624 (2d. Ed. 1995). Takođe, u meri u kojoj se izrazi ,,u“ ili ,,unutar“ koriste u specifikaciji ili zahtevima, podrazumeva se da dodatno znače „nа “ ili ,,uz“. Dalje, u meri u kojoj se termin "povezivanje" koristi u specifikaciji ili patentnim zahtevima, namera je da nema samo značenje "direktno povezan sa", već i "indirektno povezan sa" kao što je povezan preko druge komponente ili komponenti.

1

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Izolovana mikrosklerocija gljiva, naznačena time, što sadrži mikrosklerocijum vrste Trichoderma.

2. Izolovana mikrosklerocija prema zahtevu 1, naznačena time, što navedena gljiva obuhvata jednu ili više od Trichoderma harziamim, Trichoderma lignorum, Trichoderma viridae, Trichoderma reesei, Trichoderma koningii, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma polysporum, Trichoderma hamatum, Trichoderma gamsii, i Trichoderma asperellum.

3. Kompozicija koja sadrži izolovanu mikrosklerociju gljiva prema zahtevima 1 ili 2, naznačena time, što sadrži mikrosklerociju vrste Trichoderma sa agronomski prihvatljivim nosačem, pri čemu data mikrosklerocija, nakon rehidracije, klija hifalno ili klija sporogeno u cilju proizvodnje konidija.

4. Kompozicija prema zahtevu 3, naznačena time, što su mikrosklerocije prisutne u efikasnoj količini za kontrolu gljivične bolesti biljaka.

5. Kompozicija prema zahtevu 4, naznačena time, što gljivična bolest biljke je Rhizoctonia, Sclerotinia, Sclerotiorum, Fusarium, Verlicillium, Phytophlhora, Castenea, Armillaria, Pythium ili Thielaviopsis

6. Kompozicija prema zahtevima 4 ili 5, naznačena time, što su pomenute mikrosklerocije prisutne u efikasnoj količini za podsticanje rasta biljaka.

7. Kompozicija prema bilo kojem od zahteva 3-6, naznačena time, što su pomenute mikrosklerocije proizvedene fermentacijom u tečnoj kulturi i prisutne su u obnovljenoj biomasi u koncentraciji najmanje oko 1x10<5>mikrosklerocija po gramu biomase.

8. Kompozicija prema bilo kojem od zahteva 3-7, naznačena time, što je kompozicija gljiva kombinovana sa agrohemijskim proizvodom, biopesticidom, pesticidom, fungicidom, mikrobom, biostimulansom ili njihovim kombinacijama.

9. Postupak za proizvodnju gljiva u visokoj koncentraciji mikrosklerocija gljiva tolerantnih na isušivanje, naznačen time, što obuhvata:

a) inokulaciju tečnog medijuma za kulturu koji sadrži izvor ugljenika i izvor azota sa propagulama gljiva biokontrolne gljive koje sadrže hife ili spore vrste Trichoderma, pri čemu navedeni izvor azota ima koncentraciju između 8 grama / litri i 40 grama / litri i izvor ugljenika koncentracije veće od 40 grama / litri;

2

b) inkubaciju propagula tokom vremena dovoljnog da omogući proizvodnju mikrosklerocija; i

c) sakupljanje nastalih mikrosklerocija.

10. Postupak za kontrolu biljnih bolesti, naznačen time, što obuhvata:

proizvodnju gljiva u visokoj koncentraciji mikrosklerocija gljiva tolerantnih na isušivanje, prema postupku iz zahteva 9; i

primenu dobijenih mikrosklerocija na seme.

11. Postupak prema zahtevu 9 ili zahtevu 10, naznačen time, što dalje uključuje rehidrataciju rezultujućih mikrosklerocija za proizvodnju konidija.

12. Postupak za proizvodnju gljiva u visokoj koncentraciji gljivičnih mikrosklerocija i submerzno kultivisanih konidija tolerantnih na isušivanje, naznačen time, što obuhvata : a) inokulaciju tečnog medijuma za kulturu koji sadrži izvor ugljenika i izvor azota sa gljivičnim propagulama gljiva koje sadrže hife ili spore vrste Trichoderma, pri čemu navedeni izvor azota ima koncentraciju između 8 grama / litri i 40 grama / litri i izvor ugljenika sa koncentracijom većom od 40 grama / litri;

b) inkubaciju propagula u bioreaktoru tokom vremena dovoljnog da omogući proizvodnju mikrosklerocija i submerzno kultivisanih konidija

c) prozračivanje bioreaktora do protoka vazduha koji održava nivo rastvorenog kiseonika blizu ili iznad nule i obezbeđuje najmanje 0,1 Vvazduh/ Vhranijiva podloga; i d) sakupljanje nastalih mikrosklerocija i submerzno kultivisanih konidija.

13. Postupak prema zahtevu 12, naznačen time, što se sakuplja oko 10,8 х 10<6>mikrosklerocija po litri i oko 1,9 х 10<12>submerzno kultivisanih konidija po litri.