ES2829568T3 - Parches biomédicos con fibras alineadas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una estructura de fibras, comprendiendo el método: cargar eléctricamente uno o más primeros electrodos que definen un área con una primera polaridad; cargar eléctricamente un segundo electrodo situado dentro del área definida con la primera polaridad; cargar eléctricamente una hilera con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad, en donde la hilera está alineada con el segundo electrodo; y dispensar un polímero desde la hilera para crear una estructura de fibras que se extiende desde el segundo electrodo hasta el primer o los primeros electrodos.

Description

DESCRIPCIÓN

Parches biomédicos con fibras alineadas

Antecedentes

Numerosos procedimientos quirúrgicos tienen como resultado la perforación o eliminación de tejido biológico, como por ejemplo la membrana fibrosa impermeable al agua que rodea el cerebro, conocida como duramadre. En algunos casos, por ejemplo, en los procedimientos neuroquirúrgicos mínimamente invasivos, se crea un número relativamente reducido de pequeños orificios en la duramadre, mientras que, en otros, por ejemplo, la resección quirúrgica de tumores avanzados, se pueden eliminar grandes secciones de la duramadre. En todos estos casos, la barrera de tejido que rodea el cerebro debe ser reparada para evitar daños a los tejidos corticales y la fuga de líquido cefalorraquídeo. Para facilitar esta reparación, los neurocirujanos utilizan láminas de materiales poliméricos o tejido procesado, que actúan como la duramadre nativa, y que se conocen por el nombre de sustitutos durales.

Al menos algunos sustitutos durales conocidos y utilizados en clínicas neuroquirúrgicas están compuestos de una matriz de colágeno acelular obtenida a partir de tejidos bovinos o porcinos aislados. Aunque generalmente son aceptados en este campo, dichos sustitutos durales xenogénicos pueden aumentar la incidencia de adherencias y contracturas, transmitir diversas enfermedades zoonóticas a los pacientes y, por lo general, afectar negativamente la evolución de los pacientes después de la cirugía. Además, los injertos de colágeno procesado resultan sumamente caros, costándoles a pacientes y compañías de seguros miles de dólares por procedimiento.

Además, aunque las micromatrices celulares pueden ser útiles en investigaciones biomédicas e ingeniería de tejidos, al menos algunas técnicas conocidas para la producción de dichas micromatrices celulares pueden ser costosas y requerir un largo periodo de tiempo, y también pueden requerir el uso de instrumentos especializados y sofisticados.

En la patente japonesa n.° 2008223186 A se divulgan un método y un aparato para producir nanofibras, mediante los cuales se puede mejorar la orientación de las nanofibras acumuladas en un colector.

En la patente estadounidense n.° 3.280.229 A se divulgan un método y un aparato para la producción de tejidos no tejidos en patrón y texturizados, en donde los filamentos hilados eléctricamente se agregan en haces o grupos que definen un patrón controlado de agregados de alta densidad de filamentos.

En la patente estadounidense n.° 2005/104258 A1 se divulgan un método y un aparato para la formación de fibras electrohiladas que se depositan sobre una superficie colectora para formar de este modo una estructura de polímero con un patrón.

En la patente estadounidense n.° 2006/264140 A1 se divulgan un aparato y un método para electrohilar bajo una primera polaridad eléctrica primeras fibras de una primera sustancia, electrohilar bajo una segunda polaridad eléctrica fibras de una segunda sustancia y unir las primeras y segundas fibras para formar una estera de fibra.

Sumario

De conformidad con un aspecto de la invención, se da a conocer un método para producir una estructura de fibras, y este método comprende cargar eléctricamente uno o más primeros electrodos que definen un área con una primera polaridad, cargar eléctricamente un segundo electrodo situado dentro del área definida con la primera polaridad, cargar eléctricamente una hilera (spinneret) con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad, en donde la hilera está alineada con el segundo electrodo, y dispensar un polímero desde la hilera para crear una estructura de fibras que se extiende desde el segundo electrodo hasta el uno o más primeros electrodos.

De conformidad con otro aspecto de la invención, se da a conocer un aparato para producir una estructura que incluye una pluralidad de fibras, comprendiendo este aparato una pluralidad de primeros electrodos que circunscriben al menos parcialmente un área, un segundo electrodo situado dentro del área y acoplado eléctricamente a los primeros electrodos y una fuente de alimentación acoplada eléctricamente a los primeros electrodos y al segundo electrodo, en donde la fuente de alimentación está configurada para cargar eléctricamente los primeros electrodos y el segundo electrodo con una primera polaridad, en donde cuando una hilera alineada con el segundo electrodo y cargada con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad dispensa un polímero, el polímero dispensado forma una pluralidad de fibras que se extienden desde el segundo electrodo a los primeros electrodos.

Una o varias divulgaciones descritas en la presente proporcionan estructuras que tienen una pluralidad de fibras alineadas (por ejemplo, alineadas radialmente y/o alineadas de forma poligonal). Cuando dicha estructura se usa como un parche biomédico, la alineación de las fibras, tal y como se describe en la presente, puede proporcionar indicaciones direccionales que influyen en la propagación celular. Por ejemplo, las estructuras proporcionadas pueden promover un nuevo crecimiento celular a lo largo de las fibras, de manera que se puede obtener la propagación celular en una o varias direcciones deseadas.

Se pueden crear una o más estructuras divulgadas proporcionadas usando un aparato que incluye uno o más primeros electrodos que definen un área y/o circunscriben parcialmente un área. Por ejemplo, un único primer electrodo puede encerrar el área, o se puede colocar una pluralidad de uno o más primeros electrodos en al menos una parte del perímetro del área. Se coloca un segundo electrodo dentro del área. En ejemplos de divulgaciones, cuando los electrodos se cargan eléctricamente con una primera polaridad, y una hilera que dispensa un polímero (por ejemplo, hacia el segundo electrodo) se carga eléctricamente con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad, el polímero dispensado forma una pluralidad de fibras que se extienden desde el segundo electrodo hasta los primeros electrodos. Además, los electrodos con superficies redondeadas (por ejemplo, convexas) pueden configurarse en una matriz, y una estructura fibrosa creada usando dichos electrodos puede incluir una matriz de pocillos en las posiciones correspondientes a las posiciones de los electrodos.

El ámbito de la protección está definido por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que se encuentre fuera del ámbito de las reivindicaciones se proporciona tan solo con fines comparativos.

Breve descripción de los dibujos

Se pueden comprender mejor las realizaciones descritas en la presente haciendo referencia a la siguiente descripción, acompañada de los dibujos adjuntos.

La Figura 1 es un diagrama en el que se ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de un sistema de electrohilado (electrospinning) para producir una estructura de fibras alineadas radialmente.

La Figura 2 es un diagrama en el que se ilustra un campo eléctrico generado por el sistema de electrohilado mostrado en la Figura 1.

La Figura 3 es un diagrama de un electrodo retirado del sistema de electrohilado mostrado en la Figura 1 y que tiene una pluralidad de fibras depositadas sobre el mismo que forman un parche biomédico.

La Figura 4 es una fotografía de un parche biomédico que incluye una pluralidad de fibras electrohiladas alineadas radialmente depositadas sobre un electrodo periférico.

La Figura 5 es una imagen de un microscopio electrónico de barrido (SEM) del parche biomédico mostrado en la Figura 4, en la que se ilustra además que las fibras del parche biomédico están alineadas radialmente.

La Figura 6 es una ilustración de una hilera de fibras sólidas.

La Figura 7 es una ilustración de una hilera de fibras huecas.

La Figura 8 es una ilustración de una capa de parche biomédico con una pluralidad de fibras orientadas aleatoriamente, una capa de parche biomédico con una pluralidad de fibras alineadas radialmente y un parche biomédico de múltiples capas que incluye múltiples órdenes de fibras.

La Figura 9 es un diagrama de un colector con un electrodo central, un electrodo periférico interno que define un área cerrada interna, y un electrodo periférico externo que define un área cerrada externa.

La Figura 10 es un diagrama de un parche biomédico concéntrico que puede producirse utilizando el colector mostrado en la Figura 9 en conjunción con el sistema de electrohilado mostrado en la Figura 1.

La Figura 11 es un diagrama de flujo de un ejemplo de método para producir una estructura de fibras alineadas radialmente usando un electrodo periférico que define un área cerrada y un electrodo central situado aproximadamente en un centro del área cerrada.

La Figura 12 es un diagrama de flujo de un ejemplo de método para reparar un defecto, daño o vacío en un tejido biológico.

La Figura 13 es una ilustración esquemática de una infiltración celular de un parche biomédico a partir de un tejido dural intacto adyacente al borde de un parche biomédico.

Las Figuras 14A-14D son micrografías de fluorescencia en las que se compara la migración de células cuando se cultivaron tejidos de duramadre en armazones de nanofibras alineadas radialmente y nanofibras orientadas aleatoriamente durante 4 días.

La Figura 15 es un diagrama esquemático de un sistema de cultivo de células diseñado a medida para modelar la respuesta de curación de heridas de defectos o vacíos en un tejido biológico.

Las Figuras 16A-16D son micrografías de fluorescencia en las que se muestran la morfología y la distribución de células en armazones de nanofibras alineadas radialmente y nanofibras orientadas aleatoriamente con y sin revestimiento de fibronectina después de una incubación durante 1 día.

Las Figuras 17A-17D son micrografías de fluorescencia en las que se muestra la migración de fibroblastos de duramadre sembrados en armazones recubiertos con fibronectina de nanofibras alineadas radialmente durante 1 día, 3 días y 7 días.

La Figura 18 es una ilustración de un método utilizado para determinar el área de la región acelular restante de los armazones de nanofibras dentro del defecto de tejido simulado.

La Figura 19 es un gráfico en el que se ilustra el área acelular restante en el armazón de nanofibras dentro del defecto de tejido simulado en función del tiempo de incubación.

Las Figuras 20A-20D son micrografías de fluorescencia en las que se muestran los fibroblastos durales vivos marcados con tinte de membrana en armazones de nanofibras alineadas radialmente con revestimiento de fibronectina después de un cultivo de 1 día, un cultivo de 3 días, un cultivo de 7 días y un cultivo de 10 días.

Las Figuras 21A-21D son micrografías de fluorescencia que demuestran la organización de las células y de la matriz extracelular adherente en armazones de fibras alineadas radialmente y fibras orientadas aleatoriamente obtenidas por inmunotinción para colágeno de tipo I (verde) y núcleos celulares (azul).

La Figura 22 es un gráfico en el que se ilustra el grosor de la duramadre regenerada en el centro de los defectos durales reparados a lo largo del tiempo.

La Figura 23 es un gráfico en el que se ilustra el contenido de tejido colagenoso regenerativo a lo largo del tiempo. La Figura 24 es un diagrama en el que se ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de sistema de electrohilado para producir una estructura de fibras alineadas en polígonos usando una matriz de electrodos.

La Figura 25 es un diagrama en el que se ilustra una vista alzada de un ejemplo de colector modular de electrohilado. La Figura 26 es un diagrama en el que se ilustra un campo eléctrico generado por un sistema de electrohilado como el sistema de electrohilado mostrado en la Figura 24.

Las Figuras 27A-27F son imágenes de microscopía de una membrana producida usando un colector con una matriz de electrodos, como por ejemplo el colector mostrado en la Figura 24.

Las Figuras 28A-28D son imágenes de microscopía en las que se ilustra el crecimiento celular en una membrana como la mostrada en las Figuras 27A-27F.

Las Figuras 29A y 29B son imágenes de microscopía en las que se ilustra la propagación de neuritas en una membrana como la mostrada en las Figuras 27A-27F.

Las Figuras 30A y 30B son superposiciones de una imagen de microscopía óptica y una imagen de microscopía fluorescente en las que se ilustra la formación de redes neuronales a partir de cuerpos embrioides en una membrana como la mostrada en las Figuras 27A-27F.

Las Figuras 31A-31D son imágenes de microscopía electrónica de barrido en las que se ilustran membranas producidas usando una variedad de matrices de electrodos.

La Figura 32 es un diagrama de un colector con electrodos periféricos que circunscriben parcialmente un área. Descripción detallada

Las realizaciones que se dan a conocer en la presente facilitan la reparación de tejido biológico con el uso de un parche biomédico que incluye una pluralidad de fibras. Estas fibras pueden tener un diámetro de sección transversal muy pequeño (por ejemplo, de 1-1000 nanómetros) y, en consecuencia, pueden denominarse nanofibras. Aunque en la presente se describen los parches biomédicos haciendo referencia a la duramadre y a su uso como un sustituto dural, pueden aplicarse las realizaciones descritas a cualquier tejido biológico. Asimismo, aunque se describen como parches biomédicos, pueden usarse las estructuras con fibras alineadas para otros fines. Por consiguiente, las realizaciones descritas no están limitadas a parches biomédicos.

Durante su funcionamiento, los parches biomédicos dados a conocer en la presente facilitan el crecimiento celular y pueden denominarse “membranas”, “armazones”, “matrices” o “sustratos”. Dichos parches biomédicos facilitan también la migración celular desde un perímetro del parche hasta un centro del parche biomédico. Los parches biomédicos con fibras alineadas, como se describen en la presente, pueden promover una curación y/o regeneración de tejido, como por ejemplo la duramadre, significativamente más rápida que la de los sustitutos, los cuales carecen de organización nanoscópica e indicaciones direccionales.

La duramadre es un tejido conjuntivo membranoso ubicado en la capa más exterior de las tres capas de las meninges que rodean el cerebro y la médula espinal, que cubre y soporta los senos durales y transporta la sangre desde el cerebro al corazón. Con frecuencia se requieren sustitutos durales después de un procedimiento neuroquirúrgico para reparar, expandir o reemplazar la duramadre cortada, dañada o reseccionada.

Aunque se han realizado muchos esfuerzos en este sentido, el reto de desarrollar un sustituto dural apropiado solo ha tenido un éxito limitado. Los autoinjertos (por ejemplo, la fascia lata, la fascia temporal y el pericráneo) son preferibles porque no provocan reacciones inflamatorias o inmunológicas graves. Entre los inconvenientes potenciales de los autoinjertos figuran la dificultad de lograr un cierre impermeable al agua, la formación de tejido cicatricial, los materiales de injerto insuficientemente accesibles para cerrar defectos de gran tamaño de la duramadre, un mayor riesgo de infección, la morbilidad del sitio donante y la necesidad de un sitio operativo adicional. Los aloinjertos y xenoinjertos a menudo se asocian con reacciones adversas como la disolución del injerto, la encapsulación, el rechazo de cuerpos extraños, la cicatrización, la formación de adherencias y los efectos secundarios provocados por toxicidad que se derivan de regímenes inmunosupresores. También se ha notificado que la duramadre humana liofilizada como sustituto dural es una fuente de enfermedades transmisibles relacionadas específicamente con priones, como por ejemplo la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob.

Por lo que respecta a los materiales, los polímeros sintéticos no absorbibles, como por ejemplo la silicona y el politetrafluoroetileno expandido (ePTFE), con frecuencia causan complicaciones graves que pueden incluir la inducción de formación de tejido de granulación debido a la estimulación crónica de la respuesta al cuerpo extraño. Los polímeros naturales absorbibles, como el colágeno, la fibrina y la celulosa, pueden presentar un riesgo de infección y de transmisión de enfermedades. Como resultado, los polímeros sintéticos como el poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (PHBV), el ácido poliláctico (PLA), el ácido poliglicólico (PGA), los copolímeros ternarios PLA-PCL-PGA y los hidrogeles de hidroxietilmetacrilato han despertado interés recientemente como materiales de implantes biodegradables para la reparación de la duramadre. Se pueden poner en práctica los métodos y sistemas descritos en la presente con estos materiales y/o con cualquier polímero biomédico.

Con el fin de facilitar la regeneración y/o reparación con éxito de la duramadre después de una operación quirúrgica, un parche biomédico o un sustituto dural sintético deberá promover: (i) la adhesión de los fibroblastos durales (el tipo de célula primaria presente en la duramadre) a la superficie del parche biomédico; (ii) la migración de los fibroblastos durales desde la periferia del parche biomédico hacia el centro; y (iii) una respuesta inmunológica mínima. Hasta la fecha, solo se han probado sustitutos durales sintéticos en forma de láminas, películas, mallas, pegamentos e hidrogeles. Debido a las propiedades de superficie isotrópicas, dichos sustitutos no son muy apropiados para la unión de células y la migración dirigida hacia dentro.

Este problema puede resolverse potencialmente fabricando los polímeros como fibras a nanoescala con un orden y organización específicos. Por ejemplo, la velocidad de migración celular puede ser muy baja en superficies isotrópicas planas, mientras que las células pueden migrar a una distancia muy larga en una forma muy correlacionada con una velocidad constante en un armazón fibroso y alineado uniaxialmente.

El electrohilado es una técnica capacitadora que puede producir fibras a nanoescala a partir de una gran cantidad de polímeros. Las nanofibras electrohiladas se recogen normalmente como una estera no tejida orientada aleatoriamente. También se pueden obtener matrices de nanofibras alineadas uniaxialmente en determinadas condiciones, específicamente cuando se utiliza un colector de cámara de aire o un mandril que gira a alta velocidad. No obstante, los armazones de nanofibras alineadas uniaxialmente promueven la migración celular solo a lo largo de una dirección específica y, por lo tanto, no resultan ideales como sustitutos durales.

Con el fin de promover la migración celular desde el tejido circundante al centro de un defecto dural y reducir el tiempo de curación y regeneración de la duramadre, una superficie con un patrón con características a nanoescala alineadas (por ejemplo, alineadas radialmente y/o en uno o varios polígonos) resultaría muy ventajosa como un sustituto dural artificial. Más específicamente, los armazones construidos con nanofibras alineadas podrían satisfacer esta demanda al guiar y mejorar la migración celular desde el borde de un defecto dural al centro.

Existe una gran cantidad de polímeros disponibles para su uso en el electrohilado. En algunas realizaciones descritas en la presente, se producen nanofibras para sustitutos durales como el polímero electrohilado a partir de poli(scaprolactona) (PCL), un poliéster semicristalino aprobado por la FDA (Agencia de Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos) que puede degradarse mediante hidrólisis de sus enlaces éster en condiciones fisiológicas con productos de degradación no tóxicos. Este polímero ha sido ampliamente utilizado y estudiado en el cuerpo humano como un material para la fabricación de portadores de administración de fármacos, suturas o barreras de adhesión. Como se describe en la presente, se pueden alinear las nanofibras de PCL electrohiladas para generar armazones que son útiles como sustitutos durales.

Las realizaciones dadas a conocer en la presente facilitan la producción de un nuevo tipo de sustituto de tejido artificial que incluye un material de nanofibras poliméricas, el cual se forma a través de un nuevo método de electrohilado. Este material polimérico incluye nanofibras no tejidas (por ejemplo, fibras que tienen un diámetro de 1-1000 nanómetros) que están alineadas dentro de una lámina de material.

En ejemplos de realizaciones, se forma un material con nanofibras alineadas a través de un método nuevo de electrohilado que utiliza un colector que incluye uno o varios primeros electrodos, o electrodos “periféricos”, que definen un área y/o circunscriben al menos parcialmente dicha área, y un segundo electrodo “interno” ubicado dentro del área. Cuando los electrodos están cargados eléctricamente con una primera polaridad, y una hilera que dispensa un polímero (por ejemplo, hacia el electrodo interno) está cargada eléctricamente con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad, el polímero dispensado forma una pluralidad de fibras que se extienden desde el electrodo interno al electrodo o electrodos periféricos. Los electrodos pueden incluir una superficie redondeada (por ejemplo, convexa), de modo que se forme una depresión o “pocillo” en el lado orientado hacia el electrodo de una estructura de fibras. Alternativamente, los electrodos pueden incluir una superficie cóncava, de tal manera que se forme un pocillo en el lado de la estructura opuesto a los electrodos.

En algunas realizaciones, el colector incluye un electrodo interno único y un electrodo periférico único. En otras realizaciones, el colector incluye una pluralidad de electrodos periféricos y el polímero dispensado puede formar fibras que se extienden entre dichos electrodos periféricos, además de las fibras que se extienden desde el electrodo interno a uno o varios de los electrodos periféricos.

Además, en algunas realizaciones, hay múltiples áreas definidas y/o parcialmente circunscritas por electrodos periféricos. Por ejemplo, un electrodo periférico interno puede definir un área cerrada interna que rodea al electrodo interno, y un electrodo periférico externo puede definir un área cerrada externa que rodea al electrodo periférico interno. En otras realizaciones, los electrodos están configurados en una matriz, como por ejemplo una rejilla y/u otro patrón poligonal (por ejemplo, un patrón hexagonal), y se pueden definir múltiples áreas parcialmente superpuestas por dichos electrodos. Por ejemplo, un electrodo interno de un área puede funcionar como un electrodo periférico de otra área. En dichas realizaciones, el polímero dispensado puede formar fibras que se extienden entre los electrodos del colector, de tal manera que las fibras definen los lados de una pluralidad de polígonos, con los electrodos situados en los vértices de los polígonos.

A diferencia de las estructuras de nanofibras conocidas, los materiales de nanofibras alineadas dados a conocer en la presente son capaces de presentar indicaciones topográficas a nanoescala a células locales que mejoran y dirigen la migración celular (por ejemplo, por toda la hoja de material o hacia el centro de la hoja de material). Como resultado, los materiales de nanofibras alineadas pueden provocar una migración y una población celulares más rápidas que los materiales orientados aleatoriamente, como por ejemplo las matrices de colágeno procesado de referencia. Los materiales descritos en la presente pueden ser particularmente útiles como sustrato para diversos tipos de parches biomédicos o injertos diseñados para provocar la protección, el cierre, la curación, la reparación de heridas y/o la regeneración de tejidos.

Un armazón de nanofibras alineadas, como se describe en la presente, posee un potencial significativo como un sustituto dural artificial, ya que es capaz de estimular una migración celular robusta de la duramadre intacta adyacente y promover la población celular rápida de la matriz de nanofibras requerida para provocar la reparación dural. Además, dichos materiales de nanofibras ofrecen la ventaja de una producción económica y de ser totalmente adaptables y reabsorbibles. Los sustitutos durales de nanofibras también pueden reducir el riesgo de contracturas y eliminar completamente el riesgo de enfermedades zoonóticas transmitidas cuando se aplican intraoperatoriamente, mejorando en general los resultados del paciente después de la cirugía.

Electrodo interno y electrodo o electrodos periféricos

La Figura 1 es un diagrama en el que se ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de sistema de electrohilado 100 para producir una estructura de fibras alineadas radialmente. El sistema 100 incluye un colector 105 con un primer electrodo 110, que puede denominarse electrodo periférico, y un segundo electrodo 115, que puede denominarse electrodo interno o electrodo central. El sistema 100 también incluye una hilera 120. El electrodo periférico 110 define un área cerrada 125 y el electrodo central 115 está situado aproximadamente en un centro del área cerrada 125.

El sistema 100 está configurado para crear un potencial eléctrico entre el colector 105 y la hilera 120. En una realización, el electrodo periférico 110 y el electrodo central 115 están configurados para estar cargados eléctricamente con una primera amplitud y/o polaridad. Por ejemplo, el electrodo periférico 110 y el electrodo central 115 pueden estar eléctricamente acoplados a una fuente de alimentación 130 a través de un conductor 135. La fuente de alimentación 130 está configurada para cargar el electrodo periférico 110 y el electrodo central 115 con la primera amplitud y/o polaridad a través del conductor 135.

En la realización ilustrada en la Figura 1, el electrodo periférico 110 es un anillo que define un área cerrada 125 que es circular. Por ejemplo, el área cerrada circular 125 puede tener un diámetro de entre 1 cm y 20 cm. En otras realizaciones, el electrodo periférico 110 puede tener cualquier forma adecuada para su uso con los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, el electrodo periférico 110 puede definir un área cerrada 125 elíptica, ovular, rectangular, cuadrada, triangular y/o de otra forma rectilínea o curvilínea. En algunas realizaciones, el electrodo periférico 110 define un área cerrada 125 de entre 5 cm2 y 100 cm2. El electrodo periférico 110 puede tener una altura 112 de entre 0,5 cm y 2,0 cm. El electrodo central 115 puede incluir una aguja metálica y/o cualquier otra estructura que termine en punta o conjunto de puntas.

En una realización, el área cerrada 125 define un plano horizontal 127. La hilera 120 está alineada con el electrodo central 115 y está desplazada verticalmente con respecto al plano horizontal 127 a una distancia variable. Por ejemplo, la hilera 120 puede estar desplazada verticalmente con respecto al plano horizontal 127 a una distancia de entre 1 cm y 100 cm.

La hilera 120 está configurada para dispensar un polímero 140 mientras está cargada eléctricamente con una segunda amplitud y/o polaridad opuesta a la primera polaridad. Como se muestra en la Figura 1, la hilera 120 está acoplada eléctricamente a la fuente de alimentación 130 mediante un conductor 145. La fuente de alimentación 130 está configurada para cargar la hilera 120 con la segunda amplitud y/o polaridad a través del conductor 145. En algunas realizaciones, la fuente de alimentación 130 proporciona un voltaje de corriente continua (CC) (por ejemplo, entre 10 kilovoltios y 17 kilovoltios). En una realización, el conductor 145 está cargado positivamente, y el conductor 135 está cargado negativamente o está conectado a tierra. En algunas realizaciones, la fuente de alimentación 130 está configurada para permitir el ajuste de una corriente, un voltaje y/o una potencia.

En una realización, la hilera 120 está acoplada a una jeringa 150 que contiene un polímero 140 en forma de solución líquida. Puede hacerse funcionar la jeringa 150 manualmente o mediante una bomba de jeringa 155. En un ejemplo de realización, la hilera 120 es una aguja metálica que tiene una abertura de entre 100 micrómetros y 2 milímetros de diámetro.

A medida que la jeringa 150 ejerce presión sobre el polímero 140, la hilera 120 dispensa el polímero 140 en forma de flujo 160. El flujo 160 tiene un diámetro aproximadamente igual al diámetro de la abertura de la hilera 120. El flujo 160 desciende hacia el colector 105. Por ejemplo, el flujo 160 puede caer hacia abajo bajo la influencia de la gravedad y/o puede ser atraído hacia abajo por una superficie conductora cargada 162 situada debajo del colector 105. Por ejemplo, la superficie conductora 162 puede estar acoplada eléctricamente al conductor 135 y cargada con la misma amplitud y/o polaridad que el electrodo periférico 110 y el electrodo central 115. A medida que desciende el flujo 160, el polímero 140 forma una o varias fibras poliméricas sólidas 165.

En algunas realizaciones, se aplica una máscara 164, compuesta de un material conductor o no conductor, en el colector 105 para manipular la deposición de fibras 165. Por ejemplo, la máscara 164 puede colocarse entre la hilera 120 y el colector 105 de tal manera que no se depositen fibras 165 en el colector 105 debajo de la máscara 164. Además, la máscara 164 puede usarse como una máscara variante en el tiempo ajustando su posición mientras que la hilera 120 dispensa el polímero 140, facilitando la variación espacial de la densidad de fibras en el colector 105. Aunque la máscara 164 se muestra como circular, la máscara 164 puede ser de cualquier forma (por ejemplo, rectangular o semicircular) y de un tamaño adecuado para su uso con el sistema 100. Alternativa o adicionalmente, la deposición de fibras 165 en el colector 105 puede manipularse ajustando la posición del colector 105 con respecto a la hilera 120 o variando espacialmente el potencial eléctrico aplicado entre la hilera 120 y/o los electrodos que componen el colector 105. Por ejemplo, la ubicación de un lado del colector 105 directamente debajo de la hilera 120 puede hacer que se depositen más fibras 165 en ese lado que las que se depositan en el lado opuesto del colector 105.

La Figura 2 es un diagrama 200 que ilustra un campo eléctrico generado por el sistema 100. En el diagrama 200 se muestra una vista bidimensional en sección transversal de vectores de fuerza de campo eléctrico entre la hilera 120 y el electrodo periférico 110 y el electrodo central 115 del colector 105 (mostrado en la Figura 1). A diferencia de los sistemas de electrohilado conocidos, los vectores de campo eléctrico (líneas de flujo) en las proximidades del colector se dividen en dos poblaciones, las que apuntan hacia el electrodo periférico 110 y las que apuntan hacia el electrodo central 115.

Si no se tiene encuentra el efecto de las cargas sobre las fibras poliméricas, puede calcularse el campo de potencial v V =zJL

eléctrico usando la ecuación de Poisson, e , donde V es el potencial eléctrico, £ es la permitividad eléctrica del aire y P es la densidad de carga espacial. El campo eléctrico, E , puede calcularse tomando el gradiente negativo del campo de potencial eléctrico, E — —V V Aquí, el campo eléctrico se calculó para verificar el efecto de alineación demostrado por las fibras depositadas, que se llevó a cabo usando el software COMSOL3.3.

La Figura 3 es un diagrama del electrodo periférico 110 retirado del sistema de electrohilado 100 (mostrado en la Figura 1) y que tiene una pluralidad de fibras 165 depositadas encima del mismo que forman un parche biomédico 170. Las fibras 165 se extienden radialmente entre un centro 175 correspondiente a la posición del electrodo central 115 (mostrado en la Figura 1) y un perímetro 178 correspondiente a la posición del electrodo periférico 110. Por ejemplo, el perímetro 178 puede ser un perímetro circular alrededor del centro 175 que define un diámetro de entre 1 cm y 6 cm.

El parche biomédico 170 se ilustra con una pequeña cantidad de fibras 165 en la Figura 3 para una mayor claridad. En algunas realizaciones, el parche biomédico 170 incluye miles, decenas de miles, cientos de miles o una cantidad superior de fibras 165, distribuidas uniformemente por toda el área cerrada 125 (mostrada en la Figura 1) del electrodo periférico 110. Incluso con millones de fibras 165, el parche biomédico 170 es flexible y/o maleable, lo que facilita la aplicación del parche biomédico 170 en superficies irregulares de tejido biológico, como por ejemplo la superficie de la duramadre.

La alineación radial de las fibras 165 demuestra el recorrido más corto posible entre el perímetro 178 y el centro 175. Por consiguiente, el parche biomédico 170 también facilita la migración celular directamente desde el perímetro 178 al centro 175, permitiendo una reducción del tiempo requerido para la infiltración y población de las células en el parche biomédico aplicado, así como para la regeneración del tejido nativo.

Las fibras 165 tienen un diámetro de 1-1000 nanómetros. En una realización, las fibras tienen un diámetro de aproximadamente 220 nanómetros (por ejemplo, de 215 nm a 225 nm). El diámetro de las fibras 165, el grosor del parche biomédico 170 y/o la densidad de las fibras dentro del parche biomédico 170 pueden afectar la durabilidad (por ejemplo, resistencia a la tracción) del parche biomédico 170. Se puede producir el parche biomédico 170 con diferentes propiedades mecánicas modificando el grosor y/o la densidad de las fibras del parche biomédico 170 mediante la operación del sistema de electrohilado 100 durante periodos relativamente más largos o más cortos.

La Figura 4 es una fotografía 300 de un parche biomédico 305 que incluye una pluralidad de fibras electrohiladas alineadas radialmente depositadas sobre un electrodo periférico 110. La Figura 5 es una imagen de un microscopio electrónico de barrido (SEM) 310 del parche biomédico 305, en la que se ilustra adicionalmente que las fibras del parche biomédico 305 están alineadas radialmente.

Por lo que respecta a las Figuras 1 y 3, las fibras 165 pueden ser sólidas o huecas. En algunas realizaciones, el tamaño y/o estructura de las fibras 165 están determinados por el diseño de la hilera 120. La Figura 6 es una ilustración de una hilera de fibras sólidas 120A. La hilera de fibras sólidas 120A incluye un cuerpo cónico 180 que define una línea central 182. En un extremo de dispensación 184, el cuerpo cónico 180 incluye un anillo 186. El anillo 186 define una abertura circular 190A a través de la cual se puede dispensar el polímero 140. Las fibras 165 producidas con una hilera de fibras sólidas 120A tienen una composición sólida.

La Figura 7 es una ilustración de una hilera de fibras huecas 120B. Al igual que la hilera de fibras sólidas 120A, la hilera de fibras huecas 120B incluye un cuerpo cónico 180 con un anillo 186 en un extremo dispensador 184. La hilera de fibras huecas 120B también incluye un cuerpo central 188B ubicado dentro del anillo 186. El anillo 186 y el cuerpo central 188B definen una abertura anular 190B. En consecuencia, cuando el polímero 140 se dispensa mediante la hilera de fibras huecas 120B, las fibras 165 tienen una composición hueca, con una pared exterior que rodea una cavidad. La pared exterior de una fibra 165 dispensada por la hilera de fibras huecas 120B define un diámetro exterior que corresponde al diámetro interior del anillo 186 y un diámetro interior que corresponde al diámetro del cuerpo central 188B. Por consiguiente, pueden ajustarse el diámetro exterior y el diámetro interior de las fibras huecas 165 ajustando los diámetros del anillo 186 y del cuerpo central 188B.

La hilera de fibras huecas 120B facilita la incorporación de una sustancia, como por ejemplo un agente biológico, factor de crecimiento y/o fármaco (por ejemplo, una sustancia quimioterapéutica), al parche biomédico 170. Por ejemplo, la sustancia puede depositarse dentro de una cavidad definida por fibras huecas 165 del parche biomédico 170. En una realización, se selecciona el polímero 140 para crear fibras porosas y/o semisolubles 165, y la sustancia se dispensa desde la cavidad a través de las fibras 165. En otra realización, el polímero 140 es degradable y la sustancia se dispensa a medida que las fibras 165 se degradan in vivo. Por ejemplo, se pueden configurar las fibras 165 para que se degraden en 12 meses, 6 meses o 3 meses. Puede manipularse la velocidad de degradación del polímero 140 ajustando la proporción de los polímeros constituyentes dentro del polímero 140.

En otra realización, las fibras sólidas 165 administran una sustancia. Por ejemplo, se puede crear una fibra sólida 165 a partir de un polímero 140 que incluye la sustancia en solución. A medida que la fibra sólida 165 se degrada, la sustancia se libera en el tejido circundante.

Como se muestra en las Figuras 6 y 7, el anillo 186 es perpendicular a la línea central 182. En una realización alternativa, el anillo 186 es oblicuo (por ejemplo, está orientado en un ángulo agudo u obtuso) con respecto a la línea central 182. Se puede determinar el diámetro exterior de las fibras 165 por el diámetro interior del anillo 186.

Algunas realizaciones facilitan la producción de un parche biomédico que tiene fibras alineadas radialmente y fibras alineadas no radialmente. Por ejemplo, las fibras alineadas radialmente pueden depositarse en una primera capa, y las fibras alineadas no radialmente pueden depositarse en una segunda capa. Alternativamente, las fibras alineadas radialmente y alineadas no radialmente pueden depositarse en una sola capa (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente y/o alternativamente). Por lo que respecta a la Figura 1, puede usarse el sistema 100 para crear fibras orientadas aleatoriamente cargando o conectando a tierra la superficie conductora 162. Opcionalmente, el electrodo periférico 110 y el electrodo central 115 pueden no estar cargados o no tener conexión a tierra (por ejemplo, estar desacoplados del conductor 135).

La Figura 8 es una ilustración de una capa 400 de parche biomédico con una pluralidad de fibras orientadas aleatoriamente 405 y una capa 410 de parche biomédico con una pluralidad de fibras alineadas radialmente 415. Como se muestra en la Figura 8, las capas (400 y 410) de parche biomédico pueden combinarse (por ejemplo, de forma superpuesta) para producir un parche biomédico de múltiples capas 420 con fibras orientadas aleatoriamente 405 y fibras alineadas radialmente 415, o cualquier otra combinación de cualquier número o tipo de capas de fibras. La combinación de fibras alineadas no radialmente 405 y fibras alineadas radialmente 415 facilita el suministro de un parche biomédico que promueve la migración celular a un centro del parche biomédico, y a la vez presenta una durabilidad potencialmente mayor (por ejemplo, resistencia a la tracción) que la de un parche biomédico que tiene solo fibras alineadas radialmente 415. La combinación de fibras alineadas no radialmente 405 y fibras alineadas radialmente 415 también puede permitir el control espacial de la migración y la infiltración celular a lo largo de un eje perpendicular al plano del parche biomédico, facilitando así la formación y organización de capas específicas de células y/o proteínas de matriz extracelular que se asemejan a los estratos de tejidos naturales.

En algunas realizaciones, se pueden combinar múltiples capas 410 de parche biomédico con fibras alineadas radialmente 415 para crear un parche biomédico de múltiples capas. Por ejemplo, por lo que respecta a las Figuras 1 y 3, después de depositar un primer conjunto de fibras en el colector 105, se puede esperar a que el primer conjunto de fibras 165 se solidifique o se cure por completo y luego se deposita un segundo conjunto de fibras 165 en el colector 105. El segundo conjunto de fibras 165 puede ser depositado directamente sobre el primer conjunto de fibras 165 en el colector 105. Alternativamente, se puede retirar el primer conjunto de fibras 165 del colector 105 y el segundo conjunto de fibras 165 puede ser depositado sobre la superficie conductora 162 y/o el colector 105, y después ser retirado y superpuesto sobre el primer conjunto de fibras 165. Dichas realizaciones facilitan una mayor durabilidad del parche biomédico y un control espacial adicional de la migración/actividad celular, incluso cuando solo se usan fibras alineadas radialmente. En algunas realizaciones, se puede colocar un armazón de hidrogel o polimérico entre las capas 400 de parche biomédico y/o las capas 410 de parche biomédico.

Un parche biomédico de múltiples capas puede ser útil para injertos durales y para otras aplicaciones de ingeniería de tejidos. Se pueden crear capas secuenciales de fibras con órdenes variables (por ejemplo, alineadas radialmente u orientadas aleatoriamente) y densidades (por ejemplo, alta o baja densidad de fibras), que pueden permitir la infiltración y población de tipos específicos de células en capas seleccionadas del parche biomédico artificial. Por ejemplo, los parches biomédicos que contienen una alta densidad de fibras generalmente impiden la migración y la infiltración celular, mientras que los parches biomédicos que contienen una baja densidad de fibras generalmente mejoran la migración e infiltración celular.

En general, la capacidad de formar materiales de fibras de múltiples capas, como se describe en el presente documento, puede ser sumamente beneficiosa en la construcción de parches biomédicos diseñados para reproducir la estructura natural de láminas múltiples no solo de la duramadre, sino también de otros tejidos biológicos como la piel, las valvas de válvulas cardíacas, el pericardio y/o cualquier otro tejido biológico. Asimismo, pueden fabricarse una o varias capas de un parche biomédico a partir de polímeros biodegradables, de manera que se reabsorban los materiales de nanofibras resultantes completamente después de la implantación. La manipulación de la composición química de los polímeros utilizados para fabricar estos armazones puede permitir además el control específico de la velocidad de degradación y/o reabsorción de un parche biomédico después de la implantación.

Algunas realizaciones proporcionan un parche biomédico que incluye una pluralidad de áreas anidadas (por ejemplo, concéntricas). La Figura 9 es un diagrama de un colector 505 con un electrodo central 115, un electrodo periférico primero o interno 510 que define un área cerrada primera o interna 515, y un electrodo periférico segundo o externo 520 que define un área cerrada segunda o externa 525 que es más grande que el área cerrada interna 515. En algunas realizaciones, el electrodo periférico externo 520 está orientado concéntricamente con el electrodo periférico interno 510. Aunque el electrodo periférico interno 510 y el electrodo periférico externo 520 son mostrados como que definen áreas circulares cerradas 515, 525 en la Figura 9, el electrodo periférico interno 510 y el electrodo periférico externo 520 pueden definir áreas cerradas 515, 525 de cualquier forma adecuada para su uso con los métodos descritos en la presente. Además, el área cerrada interna 515 y el área cerrada externa 525 pueden ser de diferentes formas y/o tener diferentes centros.

En funcionamiento con el sistema de electrohilado 100 (mostrado en la Figura 1), el electrodo central 115 y el colector periférico interior 505 se cargan con la primera amplitud y/o polaridad (opuesta a la polaridad con la que está cargada la hilera 120), mientras que la hilera 120 dispensa el polímero 140 como un flujo 160. El flujo 160 desciende hacia el colector 505 y forma una o varias fibras 530 que se extienden desde el electrodo central 115 al electrodo periférico interno 510.

Se elimina la carga de la primera polaridad del electrodo central 115 (por ejemplo, desacoplando el electrodo central 115 del conductor 135), y se carga el electrodo periférico externo 520 con la primera amplitud y/o polaridad. La hilera 120 dispensa el polímero 140 como flujo 160, el cual desciende hacia el colector 505 y forma una o varias fibras 535 que se extienden desde el electrodo periférico interno 510 al electrodo periférico externo 520. Juntas, las fibras 530 y 535 forman un parche biomédico concéntrico 550, como se muestra en la Figura 10. En algunas realizaciones, no se elimina la carga del electrodo central 115 antes de depositar las fibras 535 entre el electrodo periférico interno 510 y el electrodo periférico externo 520.

La Figura 10 es un diagrama de un parche biomédico concéntrico 550 que se puede producir con el colector 505 (mostrado en la Figura 9). Las fibras 530 definen un área interna 555, mostrada como un círculo que se extiende desde un centro 560 a un perímetro interior 565. Un área externa 570 incluye fibras 535 que se extienden aproximadamente desde el perímetro interior 565 (por ejemplo, aproximadamente 100 pm a 2000 pm dentro del perímetro interior 565) a un perímetro exterior 575. Las fibras 535 están orientadas radialmente o aproximadamente (por ejemplo, a 1, 3 o 5 grados) radialmente con respecto al centro 560.

Como se muestra en la Figura 10, el área interna 555 y el área externa 570 pueden superponerse en un área de solapamiento 580. En una realización, el área de solapamiento 580 corresponde a un grosor del anillo periférico interior 510 (mostrado en la Figura 8). De forma similar a la Figura 3, para mayor claridad, en la Figura 10 se muestra el parche biomédico concéntrico 550 con una pequeña cantidad de fibras 530 y 535. En algunas realizaciones, el área interna 555 y el área externa 570 incluyen cada una miles, decenas de miles, cientos de miles o más fibras 530 y 535, respectivamente. Las fibras 530 y las fibras 535 pueden acoplarse entre sí en el área de solapamiento 580. Por ejemplo, se pueden depositar las fibras 535 antes de que las fibras 530 se hayan solidificado por completo (o viceversa). En algunas realizaciones, las fibras 530 y las fibras 535 son depositadas en el colector 505 (mostrado en la Figura 9) simultáneamente o de forma alternada.

Las realizaciones como las mostradas en las Figuras 9 y 10 facilitan la provisión de un parche biomédico que tiene una densidad de fibras relativamente uniforme en toda su extensión. En cambio, si las fibras 530 se extendieran desde el centro 560 al perímetro exterior 575, la densidad de fibras en el centro 560 sería considerablemente mayor que la densidad de fibras en el perímetro exterior 575. La baja densidad de fibras periféricas puede comprometer la durabilidad de un parche biomédico cerca de un perímetro exterior, especialmente en los diámetros de gran tamaño (por ejemplo, superiores a 5 o 6 cm). En consecuencia, dichas realizaciones facilitan también la provisión de un parche biomédico de gran diámetro (por ejemplo, de hasta 10 o 12 cm), a la vez que se mantiene la durabilidad del parche biomédico. En algunas realizaciones, se combina una capa de fibras alineadas no radialmente con el parche biomédico 550, como se ha descrito anteriormente con respecto a la Figura 8, lo que puede mejorar adicionalmente la durabilidad del parche biomédico 550.

En algunas realizaciones, la densidad espacial de las fibras dentro del área interna 555 es diferente de la densidad espacial de las fibras dentro del área externa 570. En un ejemplo, las fibras 530 son depositadas entre el electrodo central 115 y el electrodo periférico interno 510 durante un primer periodo, y las fibras 535 son depositadas entre el electrodo periférico interno 510 y el electrodo periférico externo 520 durante un segundo periodo.

Aunque el colector 505 y el parche biomédico concéntrico 550 se ilustran con áreas internas y externas circulares, se puede usar cualquier cantidad y forma de electrodos periféricos para crear cualquier cantidad de áreas de fibras distintas dentro de un parche biomédico.

La Figura 11 es un diagrama de flujo de un ejemplo de método 600 para producir una estructura de fibras alineadas radialmente usando un electrodo periférico que define un área cerrada y un electrodo central situado aproximadamente en un centro del área cerrada. Aunque se muestra una realización del método 600 en la Figura 11, se prevé que se pueda omitir cualquiera de las operaciones ilustradas y que las operaciones se puedan realizar en un orden diferente al mostrado.

El método 600 incluye cargar eléctricamente 605 el electrodo periférico y el electrodo central con una primera amplitud y/o polaridad (por ejemplo, con carga negativa o conexión a tierra). Una hilera alineada aproximadamente con el electrodo central es cargada eléctricamente 610 con una segunda amplitud y/o polaridad opuesta a la primera amplitud y/o polaridad (por ejemplo, con una carga positiva).

Se dispensa un polímero (por ejemplo, un polímero líquido) 615 desde la hilera. En un ejemplo de realización, la dispensación 615 del polímero forma una pluralidad de fibras poliméricas que se extienden desde el electrodo central al electrodo periférico para crear una capa de fibras alineadas radialmente.

Algunas realizaciones facilitan la creación de una estructura concéntrica de fibras alineadas radialmente usando múltiples electrodos periféricos. En una realización, el electrodo periférico es un electrodo periférico interno. Un electrodo periférico externo que define un área cerrada externa más grande que el área cerrada interna está cargado eléctricamente 620 con la primera amplitud y/o polaridad. La carga eléctrica puede eliminarse o no 622 del electrodo central y/o el electrodo periférico interno. El polímero se dispensa 625 desde la hilera para crear un área externa de fibras alineadas radialmente que se extienden desde el electrodo periférico interno al electrodo periférico externo.

Además, algunas realizaciones facilitan la creación de una estructura con múltiples capas que incluye fibras alineadas radialmente y fibras alineadas no radialmente. Se elimina la carga eléctrica 630 del electrodo o electrodos periféricos y del electrodo central. Una superficie conductora debajo de la capa de fibras alineadas radialmente está cargada eléctricamente 635 con la primera amplitud y/o polaridad. El polímero se dispensa 640 desde la hilera para crear una capa de fibras alineadas no radialmente (por ejemplo, orientadas aleatoriamente y/o alineadas de forma uniaxial) sobre la capa de fibras alineadas radialmente.

La Figura 12 es un diagrama de flujo de un ejemplo de método 700 para reparar un defecto en un tejido biológico. El defecto puede incluir un vacío, un daño y/o cualquier otra afección que tenga como resultado una función disminuida del tejido biológico. En una realización, el método 700 incluye la creación 705 de un vacío en el tejido biológico, y el defecto es el vacío creado. Por ejemplo, el vacío puede crearse 705 mediante una incisión quirúrgica para proporcionar acceso a un tejido subyacente (por ejemplo, un tumor). En otro ejemplo, el vacío se crea 705 cortando tejido necrótico (por ejemplo, células de la piel). Se seleccionan uno o varios parches biomédicos 710 capaces de cubrir el defecto. Por ejemplo, se puede seleccionar una pluralidad de parches biomédicos 710 para un defecto grande y/o complejo (por ejemplo, de forma irregular). El parche biomédico incluye una pluralidad de fibras poliméricas alineadas radialmente que se extienden desde un centro del parche biomédico hasta un perímetro del parche biomédico. Por ejemplo, se puede seleccionar un parche biomédico 710 que tenga un diámetro mayor que el diámetro de un defecto aproximadamente circular.

El parche biomédico seleccionado 710 también puede incluir fibras poliméricas alineadas no radialmente (por ejemplo, orientadas aleatoriamente y/o alineadas uniaxialmente). Por ejemplo, las fibras alineadas radialmente y las fibras alineadas no radialmente pueden estar configuradas en capas separadas.

En algunas realizaciones, el parche biomédico incluye múltiples áreas de fibras alineadas radialmente. En una realización, un primer conjunto de fibras alineadas radialmente se extiende desde un centro del parche biomédico hasta un primer perímetro y define un área interna. Un segundo conjunto de fibras alineadas radialmente se extiende desde el primer perímetro hasta un segundo perímetro y define un área externa.

Se puede aplicar una sustancia como un factor de crecimiento y/o un fármaco (por ejemplo, un fármaco quimioterapéutico) 715 al parche biomédico. Por ejemplo, el parche biomédico puede sumergirse en dicha sustancia para permitir que esta ocupe una cavidad dentro de las fibras huecas del parche biomédico, dopar el polímero que comprende las fibras en el parche biomédico o recubrir la superficie de las fibras dentro del parche biomédico.

El parche biomédico se aplica 720 al tejido biológico (por ejemplo, se superpone al mismo) para cubrir al menos una parte del defecto. Por ejemplo, el parche biomédico puede aplicarse 720 a tejido de duramadre, a tejido cardíaco y/o a cualquier tejido biológico que incluya un defecto. En una realización, el perímetro del parche biomédico se extiende más allá del perímetro del defecto, de tal manera que todo el defecto queda cubierto por el parche biomédico. En algunas realizaciones, el parche biomédico está acoplado 725 al tejido biológico mediante una pluralidad de suturas, adhesivos y/u otros medios para unir el parche biomédico al tejido biológico. En una realización alternativa, simplemente se permite al parche biomédico fusionarse con el tejido biológico, por ejemplo, mediante la adhesión de las células biológicas al parche biomédico.

Después de aplicar el parche biomédico 720 y, opcionalmente, acoplarlo 725 al tejido biológico, el tejido biológico queda cubierto 730. En una realización, otro tejido que cubre el defecto (por ejemplo, dermis y/o epidermis) es reparado (por ejemplo, cerrado mediante sutura). En otra realización, se aplican una o varias capas protectoras sobre el tejido biológico. Por ejemplo, se puede aplicar un apósito en un injerto de piel, con o sin una sustancia protectora, como un gel, una pomada y/o un agente antibacteriano. En una realización, la capa protectora incluye una estructura de nanofibras, por ejemplo, un parche biomédico adicional, tal y como se describe en la presente.

Se pueden utilizar las realizaciones descritas en la presente con cualquier procedimiento neuroquirúrgico que implique la reparación, sustitución o expansión de la duramadre, incluidos, entre otros, un procedimiento transfenoidal (por ejemplo, la extirpación quirúrgica de adenomas pituitarios), varios tipos de cirugías en la base del cráneo y/o la extirpación quirúrgica de tumores craneales o medulares (por ejemplo, meningiomas y/o astrocitomas). En una realización, se puede aplicar un parche biomédico a una fractura ósea (por ejemplo, una fractura compleja). En otra realización, se puede aplicar un parche biomédico en un defecto en la piel (por ejemplo, una quemadura).

Asimismo, se pueden utilizar dichas realizaciones para proporcionar un sustituto de duramadre, un parche biomédico para un injerto de piel (por ejemplo, dérmico o epidérmico), un parche biomédico para la reparación traqueal, un armazón para una valva de válvula cardíaca artificial, una malla artificial para la reparación quirúrgica del tubo gastrointestinal (por ejemplo, una hernia abdominal o una úlcera) y una malla artificial para la reparación quirúrgica de defectos cardíacos. Por ejemplo, puede usarse un parche biomédico cardíaco que incluye fibras alineadas radialmente para promover la regeneración de cardiomiocitos. Las realizaciones descritas en la presente facilitan la provisión de un parche cardíaco de suficiente flexibilidad para permitir el movimiento del parche biomédico por un tejido biológico (por ejemplo, cardiomiocitos).

En algunas realizaciones, un parche biomédico tiene un grosor inferior al grosor del tejido biológico que se está reparando. A medida que las células migran a lo largo de las fibras radiales del parche biomédico, el tejido biológico se regenera.

Los parches biomédicos con fibras poliméricas alineadas radialmente facilitan la reducción del coste de reparación tisular, mejoran el tiempo de curación del tejido y reducen o eliminan el riesgo de infección zoonótica. Además, dichos parches biomédicos son relativamente sencillos de fabricar, lo que permite la adaptación de la forma, el tamaño y la composición química y una mejor disponibilidad y ausencia de inmunogenicidad. Además, los parches biomédicos con fibras poliméricas alineadas radialmente presentan excelentes propiedades de manipulación debido a su composición similar a la tela, eliminan la necesidad de una segunda cirugía para cosechar tejido de injerto autólogo y reducen el riesgo de contractura y adhesión en comparación con otros productos conocidos.

Resultados experimentales

La duramadre es una membrana fibrosa compleja que consiste en numerosas células y tipos de células, proteínas de matriz extracelular y factores tróficos, todos los cuales desempeñan un papel importante en la colonización y duralización de los sustitutos durales artificiales, así como en la implementación con éxito de dichos parches biomédicos in vivo. Con el fin de evaluar la capacidad de las nanofibras alineadas radialmente para interactuar con la duramadre natural, promover la adhesión de la célula hospedadora al injerto y mejorar la migración de la célula hospedadora a lo largo del injerto, se desarrolló un modelo ex vivo de la reparación quirúrgica de un pequeño defecto dural.

En un procedimiento habitual, se introdujo un “defecto dural artificial” en una pieza de duramadre (1 cm x 1 cm) seccionando microquirúrgicamente un orificio circular pequeño, de 7 mm de diámetro, en el centro de la muestra. A continuación, se utilizó un armazón basado en nanofibras para reparar el defecto artificial mediante la superposición del injerto sobre la muestra dural.

La Figura 13 es una ilustración esquemática de células biológicas que se extienden desde el tejido dural intacto, situado adyacente al borde de un armazón, hasta la porción central del armazón a lo largo de nanofibras alineadas radialmente. El injerto cubrió todo el defecto dural simulado, a la vez que entraba en contacto simultáneamente con el tejido dural en la periferia de la muestra, y demuestra la capacidad de las células nativas en el tejido intacto para adherirse fácilmente y migrar a través de los armazones de nanofibras.

Las Figuras 14A-14D son una colección de micrografías de fluorescencia que comparan la migración de células cuando se cultivaron tejidos durales en armazones de nanofibras alineadas radialmente (Figuras 14A y 14C) y nanofibras orientadas aleatoriamente (Figuras 14B y 14D) durante 4 días usando un sistema de cultivo de células hecho a medida (Figura 15). Las Figuras 14C y 14D son vistas ampliadas de la parte central mostrada en, respectivamente, las Figuras 14A y 14B. La flecha marca el centro del armazón.

Como se muestra en la Figura 14A, los fibroblastos durales teñidos con diacetato de fluoresceína (FDA) migraron desde el tejido circundante a lo largo de las nanofibras alineadas radialmente y más allá al centro del armazón circular después de una incubación durante 4 días. Se descubrió que las células podían cubrir completamente toda la superficie del armazón en 4 días. Al contrario, se observó un vacío después del mismo período de tiempo de incubación para un armazón hecho de fibras aleatorias (Figura 14B), lo que indica una migración más rápida de células nativas en los armazones de nanofibras alineadas radialmente que en los de sus homólogas aleatorias. Está claro que el armazón hecho de nanofibras alineadas radialmente (mostrado en las Figuras 14A y 14C) estaba completamente poblado de células durales que habían migrado desde los bordes del tejido dural adyacente. Por el contrario, una región acelular es claramente visible en el centro del armazón formado por las nanofibras orientadas aleatoriamente después del mismo tiempo de incubación, lo que indica que la infiltración celular fue incompleta y se produjo a un ritmo más lento.

Con el fin de investigar en mayor profundidad el efecto del alineamiento de las fibras y la modificación posterior del armazón de nanofibras en la migración celular, se cultivaron fibroblastos durales primarios aislados de tejido de duramadre en armazones de nanofibras alineadas radialmente y orientadas aleatoriamente con y sin recubrimiento de fibronectina. La Figura 15 es un diagrama esquemático de un sistema de cultivo de células hecho a medida y diseñado para modelar la curación de heridas de defectos de tejidos. Específicamente, se sembraron selectivamente fibroblastos durales alrededor de la periferia de un armazón circular de nanofibras, formando efectivamente un “defecto dural simulado” de 7 mm en el centro de la muestra.

Las Figuras 16A-16D son micrografías de fluorescencia en las que se muestran la morfología y distribución celular en los armazones de nanofibras alineadas radialmente (Figuras 16A y 16C) y de nanofibras orientadas aleatoriamente (Figuras 16B y 16D) con y sin recubrimiento de fibronectina después de una incubación de 1 día. Como se muestra en la Figura 16A, muchas células podían unirse a los armazones no recubiertos que incluyen nanofibras alineadas radialmente. En comparación, se observaron un número menor de células unidas deficientemente al armazón sin recubrimiento de nanofibras orientadas aleatoriamente y agregaciones de células (Figura 16B). Las células sembradas se distribuyeron uniformemente por toda la superficie del armazón recubierto con fibronectina de nanofibras alineadas radialmente, y exhibieron una forma alargada paralela al eje de alineación de las nanofibras (Figura 16C). Este resultado indica que el recubrimiento de fibronectina podría mejorar la influencia de las indicaciones topográficas sobre la morfología celular proporcionada por las fibras alineadas. Las células también podían adherirse adecuadamente al armazón recubierto con fibronectina de nanofibras orientadas aleatoriamente y la distribución celular era más uniforme que en las muestras no recubiertas, aunque no se observó elongación o alineamiento celular (Figura16D). La organización aleatoria de las células en los armazones de nanofibras orientadas aleatoriamente también imita la organización de las células en el tejido cicatricial. Esto indica que los armazones alineados pueden ayudar a reducir la formación de tejido cicatricial al promover una organización/función celular más regular.

Para caracterizar la motilidad celular en el armazón, las células se tiñeron con FDA y se tomaron imágenes de fluorescencia en distintos momentos. Las Figuras 17A-17D son micrografías de fluorescencia en las que se muestra la migración de fibroblastos de duramadre sembrados en armazones recubiertos con fibronectina de nanofibras alineadas radialmente durante 1 día (Figura 17A), 3 días (Figura 17B) y 7 días (Figura 17C). La Figura 17D es una vista ampliada de la Figura 17C. Las células se alinearon radialmente, replicando la alineación de las fibras subyacentes, como se muestra en la Figura 17D.

La capacidad de los fibroblastos durales para migrar y repoblar un defecto dural simulado se midió como una estimación de la capacidad regenerativa del sustituto en diversos momentos a lo largo del experimento. La Figura 18 es una ilustración de la determinación (por ejemplo, el cálculo) del área del defecto dural simulado que sigue presente en el armazón en un momento determinado. La Figura 19 es una ilustración del área de espacio vacío como una función del tiempo de incubación. En la Figura 19, “aleatorias” indica muestras con un armazón de fibras aleatorias; “aleatorias F” indica muestras con un armazón de fibras aleatorias recubierto con fibronectina; “alineadas” indica muestras con un armazón de fibras alineadas radialmente, y “alineadas F” indica muestras con un armazón de fibras alineadas radialmente recubierto con fibronectina. Un asterisco (*) y una almohadilla (#) indican una probabilidad p < 0,05 para las muestras en comparación con las muestras aleatorias y las muestras aleatorias F en el mismo período de tiempo de incubación.

El área de vacío disminuyó al aumentar el tiempo de incubación para todos los armazones sometidos a pruebas debido a la migración de las células hacia el interior. Como se ilustra en las Figuras 17A-17D, las fibras alineadas pueden mejorar significativamente la migración celular en comparación con las fibras aleatorias, y la migración más rápida de las células se produjo en el armazón de nanofibras alineadas radialmente recubierto con fibronectina durante los primeros 3 días de incubación. Aproximadamente 5 mm2 de superficie quedaron sin cubrir por las células en los armazones aleatorios no recubiertos incluso después de la incubación durante 7 días. En cambio, las células cubrieron casi la totalidad del área del defecto simulado dentro del mismo período de incubación en los otros tres tipos de armazones.

Las Figuras 20A-20D son micrografías de fluorescencia en las que se muestran fibroblastos durales vivos marcados con tinte de membrana en armazones de nanofibras alineadas radialmente con recubrimiento de fibronectina después de un cultivo de 1 día (Figura 20A), un cultivo de 3 días (Figura 20B), un cultivo de 7 días (Figura 20C) y un cultivo de 10 días (Figura 20D). La Figura 20D incluye un recuadro interior de una imagen de gran aumento de la Figura 20D que indica que las células se alinearon radialmente en los armazones alineados. También se confirmó la migración celular hacia el centro de un armazón de nanofibras alineadas radialmente recubierto de fibronectina mediante imágenes tomadas a intervalos prefijados en las Figuras 20A-20D.

El tejido dural se compone principalmente de colágeno de tipo I. También se examinó la producción de colágeno de tipo I a partir de fibroblastos durales. Las Figuras 21A-21D son micrografías de fluorescencia obtenidas mediante la inmunotinción de colágeno de tipo I con núcleos celulares con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en azul para armazones de fibras alineadas radialmente (Figuras 21A y 21C) y fibras orientadas aleatoriamente (Figuras 21b y 21D). Se observó que las células en los armazones de fibras alineadas radialmente producían niveles comparables de colágeno de tipo I cuando se comparaban con los armazones de fibras aleatorias, aunque un estudio previo mostró que las células más alargadas expresaban un colágeno de tipo I más alto que las células menos alargadas. Además, el revestimiento de fibronectina no tuvo una influencia significativa en la producción de colágeno de tipo I. El colágeno de tipo I se orientó al azar para los armazones aleatorios, asemejándose a la composición extracelular del tejido cicatricial amorfo, y poseía un alto grado de organización para los armazones alineados radialmente, asemejándose a un tejido conjuntivo saludable.

Los avances recientes en la interacción entre célula y biomateriales han demostrado que las propiedades químicas y topográficas de la superficie de los materiales pueden regular y controlar la forma y función de la célula. La orientación, motilidad, adhesión y forma celulares pueden ser moduladas mediante microtopografías y nanotopografías de superficie específicas. Las células se pueden alinear a lo largo de microranuras o características topográficas similares en una superficie. Se demostró que los fibroblastos eran el tipo de célula más sensible en comparación con las células endoteliales y las células de músculo liso, y respondían con una alineación, elongación y migración robustas a lo largo de dichas características topográficas.

Simultáneamente, se ha utilizado ampliamente el electrohilado para producir nanofibras para una amplia variedad de aplicaciones en ingeniería de tejidos, incluidos los injertos de piel, los vasos sanguíneos artificiales, la reparación de nervios y otras. Sin embargo, los estudios previos se limitaron al uso de armazones hechos de nanofibras alineadas aleatoriamente y uniaxialmente. Los armazones compuestos por nanofibras alineadas uniaxialmente no son prácticos para las aplicaciones de curación de heridas debido a que es frecuente que las heridas tengan una forma irregular. El trabajo descrito en la presente demostró por primera vez la fabricación de un nuevo tipo de armazones hechos de nanofibras alineadas radialmente. Este nuevo tipo de armazón puede servir de guía para los fibroblastos durales que se extienden en la dirección de la alineación de las fibras y dirigir la motilidad celular hacia el centro del armazón, lo que tiene como resultado una migración e infiltración celular más rápida en comparación con los armazones compuestos de nanofibras orientadas aleatoriamente.

Además, los armazones de nanofibras alineadas uniaxialmente no pueden igualar tal capacidad, ya que solo pueden guiar la migración celular en una dirección. Se informó que el control de la orientación o la morfología celular mediante la topografía, la denominada “guía de contacto”, podría permitir la organización de la matriz extracelular. Para la mayoría de las lesiones, la reparación tiene como consecuencia que el tejido previamente funcional se convierte en una amalgama desorganizada de células (por ejemplo, fibroblastos) y una matriz extracelular (por ejemplo, fibras de colágeno) conocida como cicatriz. Se requieren células y una matriz extracelular altamente organizadas para la regeneración y función tisulares adecuadas, lo que normalmente es muy diferente de la reparación de tejido con cicatrización. Se ha demostrado en el presente trabajo que el colágeno de tipo I de la matriz extracelular en armazones de nanofibras alineadas radialmente mostraba un alto grado de organización, lo que indica que los armazones de nanofibras alineadas radialmente pueden reducir la posibilidad de formación de tejido cicatricial después de la curación de heridas.

Un sustituto de duramadre debe ser seguro, eficaz, fácil de manejar, impermeable al agua y fácil de integrar en el tejido circundante para formar un nuevo tejido similar al tejido nativo. Asimismo, debe evitar reacciones perjudiciales causadas por cuerpos extraños, estar libre de cualquier riesgo potencial de infecciones, tener propiedades mecánicas similares a las de la duramadre natural -en particular con respecto a su flexibilidad y resistencia-, ser estable y/o almacenable, y estar disponible para su uso inmediato. En el presente trabajo, se eligió el polímero biodegradable policaprolactona (PCL) como material para el sustituto dural, ya que la PCL posee algunas ventajas en comparación con otros poliésteres bioabsorbibles. La degradación heterogénea de PGA y ácido poli(L-láctico) (PLLA) podría tener como consecuencia un aumento repentino de los productos de degradación, lo que daría como resultado condiciones ácidas y reacciones tóxicas en el tejido circundante. La degradación de la PCL es más lenta y produce productos de degradación menos ácidos y se ha estudiado como material de vendaje para heridas desde la década de 1970.

Con el fin de obtener propiedades herméticas al agua, el armazón de nanofibras alineadas radialmente puede combinarse con una estera no tejida para formar sustitutos de dos capas o incluso de múltiples capas. Simultáneamente, se pueden encapsular los antibióticos fácilmente dentro de las nanofibras para reducir adicionalmente la respuesta inflamatoria, mejorar la curación de heridas y prevenir una adhesión posterior a la cirugía. Alternativamente, la PCL puede mezclarse con otros polímeros para mejorar aún más su biocompatibilidad, así como también sus propiedades mecánicas, físicas y químicas. Además, se pueden inmovilizar las proteínas extracelulares y/o los factores de crecimiento en la superficie de las nanofibras usando diversos enfoques de modificación de superficie para mejorar la adhesión celular. El trabajo actual demuestra el efecto del recubrimiento de fibronectina en las nanofibras de PCL a través de la interacción electrostática en la adhesión y la motilidad de los fibroblastos durales. Los resultados presentados en la presente demuestran que el recubrimiento con fibronectina mejoró la adhesión de fibroblastos durales y mejoró la migración celular en armazones de nanofibras orientadas aleatoriamente. En cambio, el recubrimiento tuvo una contribución marginal a la motilidad celular en los armazones de nanofibras alineadas radialmente, en comparación con los armazones sin recubrimiento, lo que indica el papel predominante desempeñado por la alineación de nanofibras y la topografía superficial resultante.

En resumen, en la presente se describe la fabricación de un nuevo tipo de armazón de nanofibras electrohiladas que incluye fibras alineadas radialmente y la posible aplicación de tales estructuras como sustitutos durales. Los fibroblastos durales cultivados en armazones de nanofibras alineadas radialmente se alargaron de forma paralela al eje de las fibras, y la migración celular hacia el centro del armazón se aceleró junto con el desarrollo de una configuración regular de matriz extracelular similar a colágeno de tipo I, lo que potencialmente promueve la regeneración rápida y la formación de neodura. Tomados en conjunto, estos resultados indican que las nanofibras alineadas radialmente poseen un gran potencial como un sustituto dural artificial, pueden ofrecer una alternativa en la reparación de los defectos durales, y, además, ocupan un lugar único y deseable dentro de la comunidad neuroquirúrgica.

Resultados experimentales adicionales

En un procedimiento habitual de electrohilado de nanofibras de PCL (Mw = 65 kDa, Sigma-Aldrich), se usó una solución de PCL al 20 % (p/v) en una mezcla de diclorometano (DCM) y N, N-dimetilformamida (DMF) (Fisher Chemical) con una relación de volumen de 8:2. Las fibras se hilaron a 10-17 kV con una velocidad de alimentación de 0,5 ml/h en adelante, junto con una aguja de calibre 23 como hilera. Se usó un trozo de lámina de aluminio como colector para obtener armazones de nanofibras aleatorias. Se fabricaron los armazones de nanofibras alineadas radialmente utilizando un colector que consistía en un electrodo de anillo (por ejemplo, un anillo de metal) y un electrodo con punta (por ejemplo, una aguja afilada). Se recubrieron las nanofibras de PCL electrohiladas con fibronectina (Millipore, Temecular, California) de la siguiente manera. Se esterilizaron los armazones de fibras electrohiladas al dejarlos en remojo en etanol al 70 % durante una noche y se lavaron tres veces con tampón fosfato salino (PBS). A continuación, los armazones se sumergieron en una solución de 0,1 % de poli-L-lisina (PLL) (Sigma-Aldrich) durante una hora a temperatura ambiente, y después se lavaron con tampón PBS (Invitrogen) tres veces.

Posteriormente, las muestras se sumergieron en una solución de fibronectina (26 |jl 50 jg/m l de solución de fibronectina diluida con 5 ml de tampón PBS) a 4 °C durante una noche. Con anterioridad a la siembra de células, se eliminó la solución de fibronectina y se enjuagaron los armazones de nanofibras con tampón PBS.

Los armazones de nanofibras de PCL se recubrieron por pulverización catódica con oro antes de tomar imágenes con un microscopio electrónico de barrido (Nova 200 NanoLab, FEI, Oregón, Estados Unidos) con un voltaje de aceleración de 15 kV. Se insertaron muestras preparadas para su uso en cultivos celulares en una placa de cultivo de poliestireno tratado para el cultivo celular (TCPS) de 24 pocillos y se esterilizaron mediante el remojo de los armazones en etanol al 70 %.

Se aislaron los fibroblastos a partir de secciones de duramadre explantada. Específicamente, se extrajo una sección de duramadre de 2,0 cm x 1,5 cm mediante una disección cortante, la cual se lavó tres veces con PBS frío. A continuación, se aislaron los fibroblastos durales mediante el ablandamiento de duramadre picada tres veces en 4 ml de Solución Salina Equilibrada de Hank (HBSS) que contenía 0,05 % de Tripsina y 0,04 % de EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Misuri). Después del ablandamiento, el sobrenadante recogido se centrifugó y se aisló y resuspendió el sedimento de células durales en un medio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) suplementado con un 10 % de suero bovino y un 1 % de penicilina y estreptomicina. Las células de la duramadre obtenidas de esta manera se prepararon en placas en matraces de 75 cm2 y se expandieron (transfirieron a un nuevo medio de cultivo no más de 5 veces).

Se colocaron piezas grandes y continuas de duramadre en PBS frío y se cortaron microquirúrgicamente en secciones de 1 cm x 1 cm. A continuación, se introdujo un defecto artificial en cada sección de la duramadre cortando microquirúrgicamente un pequeño orificio circular, de 7 mm de diámetro, en el centro de la sección. Después se introdujeron secciones de duramadre en pocillos individuales de placas de cultivo de 6 pocillos que contenían 4 ml de DEMEM suplementado con un 10 % de suero bovino y 1 % de penicilina y estreptomicina. Posteriormente, se utilizaron armazones de nanofibras alineadas aleatoriamente y radialmente de 1 cm de diámetro para reparar los defectos artificiales mediante la superposición del injerto sobre la muestra dural. Se colocaron armazones de nanofibras sobre la duramadre, de tal forma que el injerto cubrió todo el defecto y al mismo tiempo se ponía en contacto con el tejido dural en la periferia de la muestra. Se mantuvieron los armazones de nanofibra en esta posición durante todo el experimento colocando un anillo de metal esterilizado sobre el armazón y la duramadre. Después de 4 días de cultivo, las células se tiñeron con FDA en un color verde y se obtuvieron imágenes con un microscopio de fluorescencia. Las imágenes de fluorescencia se tomaron usando una cámara QICAM Fast Cooled Mono de 12 bits (Q Imaging, Burnaby, Columbia Británica, Canadá) acoplada a un microscopio Olympus con OCapture 2.90.1 (Olympus, Tokio, Japón). De forma similar, se sembraron alrededor de 1 x 105 células de fibroblastos durales en la periferia de los armazones de nanofibras usando el sistema de cultivo hecho a medida mostrado en la Figura 15. Después de diferentes periodos de tiempo, las células se tiñeron con FDA en color verde y se obtuvieron imágenes con un microscopio de fluorescencia. A continuación, se calculó el área de superficie total del armazón de nanofibras desprovisto de células migratorias utilizando un software de Image J (National Institute of Health).

Las células vivas se marcaron con un colorante de membrana usando una solución de marcado de células VYBRANT DiO (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante, y luego se tomaron imágenes en los días 1, 3, 7 y 10.

Se evaluó la producción de colágeno de tipo I por los fibroblastos durales en los armazones de fibras mediante inmunohistoquímica. El día 7, las células se enjuagaron con PBS y se fijaron con formalina al 3,7 % durante 1 h (N=4). Las células se permeabilizaron usando Triton X-100 al 0,1 % (Invitrogen) en PBS durante 20 minutos, seguido de bloqueo en PBS que contenía 5 % de suero de cabra normal (NGS) durante 30 min. Se obtuvieron anticuerpos monoclonales para colágeno de tipo I (dilución 1:20) de EMD Chemicals (Calbiochem, San Diego, California). Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía un 2 % de FBS. Se aplicó el anticuerpo secundario Gt x Rb IgG Fluor (Chemicon, Temecula, California) (dilución 1:200) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se tomaron las imágenes de fluorescencia usando una cámara QICAM Fast Cooled Mono de 12 bits (Q Imaging, Burnaby, Columbia Británica, Canadá) acoplada a un microscopio Olympus con OCapture 2.90.1 (Olympus, Tokio, Japón).

Se obtuvieron los valores medios y la desviación estándar. Se llevaron a cabo análisis comparativos utilizando la prueba post hoc de Tukey mediante análisis de varianza a un nivel de confianza del 95 %.

Como estudio secundario, se desarrolló un modelo ex vivo de la reparación quirúrgica de un pequeño defecto dural. Se colocaron piezas de gran tamaño de duramadre sana (3 cm x 3 cm) en un medio modificado por Dulbecco de Eagle (DMEM) frío y suplementado y se cortó microquirúrgicamente en trozos más pequeños (1 cm x 1 cm). Se introdujeron defectos artificiales en las piezas de duramadre mediante el corte microquirúrgico de pequeños orificios circulares, de 6-8 mm de diámetro, en el centro de las muestras. A continuación, se utilizaron los armazones de nanofibras alineadas radialmente, los armazones de nanofibras orientadas aleatoriamente y los armazones de colágeno DURA MATRIX (1 cm x 1 cm) para reparar los defectos artificiales superponiendo el injerto a la muestra dural, de tal manera que el injerto cubriera todo el defecto, a la vez que entraba en contacto con el tejido dural en la periferia de la muestra.

Los conjuntos de sustituto dural/dural se cultivaron in vitro en DMEM suplementado durante un período de cuatro días. En el punto final de este periodo, se utilizó microscopía óptica y de fluorescencia para evaluar la capacidad regenerativa del sustituto, definida como la capacidad de las células durales para migrar al sustituto artificial y repoblar la región acelular del sustituto dural dentro del defecto artificial.

Los resultados demostraron que las células nativas presentes en la duramadre intacta (principalmente fibroblastos durales) migraron fácilmente a los sustitutos durales de nanofibras poliméricas adyacentes en altas concentraciones en un periodo de 24 a 48 horas después de entrar en contacto con fragmentos de duramadre explantados. La migración de células durales a matrices de colágeno de referencia se produjo en un periodo similar, aunque se observaron concentraciones de células durales ligeramente más bajas que migraron a matrices de colágeno si las comparamos con los sustitutos durales de nanofibras. Esta observación indica que los sustitutos durales de nanofibras se adhieren fácilmente al tejido dural nativo, una cualidad importante por lo que respecta a la manipulación y/o colocación intraoperatoria del material, y que los sustitutos durales de nanofibras proporcionan un sustrato ideal para la adhesión de fibroblastos durales.

El examen adicional de los diversos sustitutos durales después de cuatro días de cultivo reveló que la migración dural de fibroblastos a la región acelular central del material procedió de una forma significativamente más rápida en sustitutos de nanofibras alineadas radialmente que en sustitutos de nanofibras orientadas aleatoriamente o matrices de colágeno. Este descubrimiento quedó en evidencia por el hecho de que después de cuatro días de cultivo, una región acelular prominente (“espacio vacío”) permanecía en las muestras tanto del sustituto de nanofibras aleatorias como de la matriz de colágeno.

En cambio, las muestras de materiales de nanofibras alineadas radialmente, examinadas en el mismo punto temporal, habían sido pobladas por completo con células durales que habían migrado desde los bordes del tejido dural adyacente. En efecto, los sustitutos de nanofibras alineadas radialmente fueron capaces de provocar una “curación” significativamente más rápida de este defecto dural simulado que ambos materiales orientados aleatoriamente. Las vistas de gran aumento de los sustitutos durales dentro de este cultivo ex vivo demostraron además la capacidad de los materiales de nanofibras alineadas radialmente para alinear y dirigir las células durales migratorias nativas, un resultado similar al del estudio previo llevado a cabo utilizando fibroblastos durales presembrados. Específicamente, se observó que las células durales se alinean y extienden paralelas a las nanofibras individuales dentro del sustrato artificial, y también depositan proteínas de matriz extracelular organizadas (concretamente colágeno de tipo I) en los materiales de nanofibras alineadas. Esta observación indica que las indicaciones topográficas presentadas por sustitutos de nanofibras alineadas son capaces de organizar y dirigir células durales nativas que migran desde la duramadre intacta y pueden mejorar la capacidad de estas células migratorias para depositar las proteínas de matriz extracelular necesarias para curar y reparar los defectos durales.

Los resultados de este estudio secundario demuestran que los sustitutos durales de nanofibras no solo proporcionan un armazón favorable para la adhesión y migración de células durales, sino que fomentan fácilmente el crecimiento hacia el interior de las células durales a partir de la duramadre intacta completa. La capacidad de los materiales de nanofibras para interconectar íntimamente con la duramadre intacta y facilitar la población celular rápida del armazón polimérico indica claramente que este material puede funcionar excepcionalmente bien como un injerto artificial en la reparación quirúrgica de defectos durales complejos. Además, se demostró que los sustitutos durales construidos a partir de nanofibras alineadas radialmente promueven una “curación” más rápida de los defectos durales simulados que los materiales orientados aleatoriamente, lo que indica que los armazones de nanofibras alineadas que imparten características topográficas a nanoescala pueden representar un avance tecnológico significativo con respecto a las matrices clínicas de colágeno de referencia.

Aunque los experimentos descritos en la presente tuvieron una duración limitada, los resultados de estos experimentos indican que los parches biomédicos que incluyen fibras alineadas radialmente son viables para su uso en la reparación de tejidos en periodos de tiempo más largos. Por ejemplo, se prevé que el crecimiento celular acelerado observado continuaría hasta que el tejido biológico en el sitio de un defecto se regenerase completamente y/o hasta que se completase la degradación del parche biomédico.

Resultados experimentales in vivo

Se llevó a cabo la experimentación in vivo mediante la imposición de un defecto dural de 12 milímetros de diámetro en una duramadre porcina nativa. El defecto se reparó con un sustituto dural de colágeno, un sustituto dural de una sola capa con nanofibras orientadas aleatoriamente y un sustituto dural de dos capas con una capa de nanofibras alineadas radialmente fusionada con una segunda capa de nanofibras orientadas aleatoriamente mediante un apilamiento de capa por capa (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente con referencia a la Figura 8). En un grupo de control, el defecto no se reparó.

La Figura 22 es un gráfico 2200 en el que se ilustra el grosor de la duramadre regenerada en el centro de defectos durales reparados a lo largo del tiempo. En el gráfico 2200, el eje “y” 2205 representa el grosor total de la duramadre regenerada, incluidos tanto el tejido regenerativo como el material sustituto dural integrado, en el centro de un defecto dural. Las muestras sin sustituto dural (muestras de control) o con un sustituto dural de colágeno, un sustituto dural de nanofibras orientadas aleatoriamente de una sola capa y un sustituto dural de nanofibras alineadas radialmente de dos capas son agrupadas por tiempo transcurrido en el eje “x” 2210.

La Figura 23 es un gráfico 2300 en el que se ilustra el contenido de tejido colagenoso regenerativo a lo largo del tiempo. En el gráfico 2300, el eje “y” 2305 representa el porcentaje de duramadre regenerada que se compone de tejido colagenoso regenerativo. Las muestras con un sustituto dural de colágeno, un sustituto dural de nanofibras orientadas aleatoriamente de una sola capa y un sustituto dural de nanofibras alineadas radialmente de dos capas son agrupadas por tiempo transcurrido en un eje “x” 2310.

Matrices de electrodos

En algunas realizaciones, un colector incluye una pluralidad de electrodos que circunscriben al menos parcialmente un área y un segundo electrodo situado dentro de esa área. Los electrodos pueden configurarse en una matriz, como por ejemplo una rejilla y/u otro patrón poligonal, y un polímero depositado sobre los electrodos puede formar fibras que se extienden entre los electrodos del colector, de tal manera que las fibras definen los lados de una pluralidad de polígonos, con los electrodos situados en los vértices de los polígonos. En algunas realizaciones, se puede usar la estructura creada por dichas fibras para crear una micromatriz celular, por ejemplo, sembrando la estructura con células e incubando las células para promover la propagación de las células por toda la estructura.

Las micromatrices celulares pueden proporcionar poderosas herramientas experimentales para una preselección de elevado rendimiento, útiles en una serie de aplicaciones que van desde el descubrimiento de fármacos y la toxicología hasta la investigación de células madre y la ingeniería de tejidos. Por ejemplo, las micromatrices celulares pueden representar un medio eficaz de fabricar redes neuronales ordenadas útiles para estudiar la formación de sinapsis y la plasticidad neuronal in vitro. Al menos algunas técnicas conocidas para la fabricación de micromatrices neuronales se han concentrado en el uso de patrones espaciales de materiales y agentes adhesivos a células y/o repelentes de células. Desgraciadamente, dichas técnicas de fabricación pueden requerir mucho tiempo y ser costosas, e implican el uso de instrumentos sofisticados (por ejemplo, la fotolitografía, la litografía blanda, la impresión por contacto, la técnica de microfluidos, la nanoimpresión y la impresión por inyección de tinta).

El electrohilado es capaz de producir fibras unidimensionales con diámetros que van desde varios nanómetros hasta varias micras. La elevada relación superficie-volumen y la morfología a nanoescala de las nanofibras electrohiladas pueden indicar que estos materiales imitan efectivamente la arquitectura de la matriz extracelular (MEC). Como resultado, se han utilizado los materiales de nanofibras electrohiladas en una amplia variedad de aplicaciones biomédicas. Las nanofibras electrohiladas pueden depositarse en un colector conductor de forma aleatoria y/o alinearse en matrices uniaxiales mediante la manipulación de un campo eléctrico y/o la aplicación de fuerzas mecánicas.

Las realizaciones descritas en la presente facilitan la producción de una micromatriz celular compleja usando nanofibras electrohiladas. En ejemplos de realizaciones se usa un colector con una matriz de electrodos para fabricar armazones de nanofibras electrohiladas que incluyen una arquitectura ordenada compleja y numerosos pocillos múltiples. Dicho armazón puede resultar útil al menos para: (i) la formación de micromatrices celulares; y (ii) la formación de redes neuronales. El uso de matrices de nanofibras complejas presentadas puede facilitar la creación de sustratos avanzados útiles en aplicaciones de ingeniería neuronal y matrices celulares útiles en aplicaciones de biodetección y preselección de fármacos.

La Figura 24 es un diagrama en el que se ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de sistema de electrohilado 2400 para producir una estructura de fibras alineadas poligonalmente utilizando una matriz de electrodos. El sistema 2400 es similar al sistema 100 (mostrado en la Figura 1) por lo que respecta a estructura y funcionamiento. Un colector 2405 incluye una pluralidad de primeros electrodos 2410, los cuales pueden denominarse electrodos periféricos. Los primeros electrodos 2410 definen y/o al menos circunscriben parcialmente un área 2415, como por ejemplo un polígono. Como se ilustra en la Figura 24, el área 2415 definida por los primeros electrodos 2410 es un hexágono. Un segundo electrodo 2420, que puede denominarse electrodo interno, está situado dentro (por ejemplo, aproximadamente en el centro) del área 2415, de modo que los primeros electrodos 2410 rodean al segundo electrodo 2420. En realizaciones de ejemplo, los primeros electrodos 2410 y los segundos electrodos son esferas metálicas (por ejemplo, de acero inoxidable) que tienen un diámetro entre 0,5 mm y 5,0 mm (por ejemplo, 1,0 mm o 2,0 mm).

El sistema 2400 también incluye una hilera 120 y está configurado para crear un potencial eléctrico entre el colector 2405 y la hilera 120, como se ha descrito anteriormente con referencia a la Figura 1. En ejemplos de realizaciones, los electrodos periféricos 2410 y el electrodo interno 2420 están acoplados eléctricamente a una fuente de alimentación 130 a través de un conductor 135, y la hilera 120 está acoplada a la fuente de alimentación 130 a través de un conductor 145. La fuente de alimentación 130 está configurada para cargar los electrodos periféricos 2410 con una primera amplitud y/o polaridad a través del conductor 135, y para cargar la hilera 120 con una segunda amplitud y/o polaridad, opuesta a la primera polaridad, a través del conductor 145.

En la realización ilustrada en la Figura 24, los electrodos periféricos 2410 y el electrodo interno 2420 son esferas o bolas metálicas (por ejemplo, de acero inoxidable), que pueden denominarse “microesferas”, configuradas en un patrón hexagonal. En algunas realizaciones, el área cerrada circular 125 puede tener un diámetro de entre 1 cm y 20 cm. En otras realizaciones, los electrodos periféricos 2410 y el electrodo interno 2420 pueden ser de cualquier forma y/o pueden estar configurados en cualquier patrón apropiado para su uso con los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, los electrodos periféricos 2410 y el electrodo interno 2420 pueden ser ejes, varillas, bóvedas y/o rebordes. Además, los electrodos periféricos 2410 y el electrodo interno 2420 pueden estar configurados en un patrón octagonal, pentagonal y/o cuadrado, por ejemplo, aunque también se prevén otras configuraciones poligonales y no poligonales, regulares y/o irregulares.

En una realización, el área 2415 define un plano horizontal 2425. La hilera 120 está alineada con el electrodo interno 2420 y está desplazada verticalmente con respecto al plano horizontal 2425 a una distancia variable. Por ejemplo, la hilera 120 puede estar desplazada verticalmente con respecto al plano horizontal 2425 a una distancia de 1 cm a 100 cm. En ejemplos de realizaciones, el electrodo interno 2420 y/o los electrodos periféricos 2410 incluyen una superficie redondeada (por ejemplo, convexa), como por ejemplo la superficie de las esferas metálicas mostradas en la Figura 24, orientada hacia el plano horizontal 2425.

Como se ha descrito anteriormente con respecto a la Figura 1, la hilera 120 está configurada para dispensar un polímero 140 mientras que dicha hilera 120 está cargada eléctricamente con la segunda amplitud y/o polaridad, y los electrodos periféricos 2410 y el electrodo interno 2420 están cargados eléctricamente con la primera amplitud y/o polaridad. La hilera 120 dispensa el polímero 140 como un flujo 160. El flujo 160 tiene un diámetro aproximadamente igual al diámetro de la abertura de la hilera 120. El flujo 160 desciende hacia el colector 2405. Por ejemplo, el flujo 160 puede caer hacia abajo bajo la influencia de la gravedad y/o puede ser atraído hacia abajo por una superficie conductora cargada 162 situada debajo del colector 2405. Por ejemplo, la superficie conductora 162 puede estar acoplada eléctricamente al conductor 135 y cargada con la misma amplitud y/o polaridad que los electrodos periféricos 2410 y el electrodo central 2420. A medida que desciende el flujo 160 y se deposita en el colector 2405, el polímero 140 forma una o varias fibras poliméricas sólidas 2430 que se extienden desde el electrodo interno 2420 a un electrodo periférico 2410 y/o entre los electrodos periféricos 2410.

En algunas realizaciones, el colector 2405 incluye electrodos periféricos 2410 que definen una pluralidad de áreas 2415. Por ejemplo, los electrodos periféricos 2410 que rodean inmediatamente al electrodo interno 2420 pueden considerarse electrodos periféricos internos, y una pluralidad de electrodos periféricos externos 2435 puede rodear a los electrodos periféricos internos 2410, de manera que los electrodos periféricos internos 2410 están anidados dentro de los electrodos periféricos externos 2435. El colector 2405 puede incluir cualquier cantidad de conjuntos anidados de electrodos periféricos. Aunque el colector 2405 incluye electrodos en una configuración compacta (por ejemplo, con electrodos que están en contacto entre sí), se prevé que los electrodos puedan estar separados entre sí por una distancia entre electrodos, que puede ser constante en todo el colector o puede variar entre diferentes pares de electrodos.

Además, en algunas realizaciones, un colector puede incluir electrodos que definen una pluralidad de áreas parcialmente superpuestas de una manera modular. La Figura 25 es un diagrama en el que se ilustra una vista en perspectiva de un ejemplo de colector de electrohilado modular 2500. El colector 2500 incluye primeros electrodos 2505 que rodean a un segundo electrodo 2510. Los primeros electrodos 2505 definen una primera área hexagonal 2515. Con respecto a la primera área hexagonal 2515, el segundo electrodo 2510 puede ser considerado un electrodo interno, y los primeros electrodos 2505 pueden ser considerados electrodos periféricos.

El colector 2500 también incluye una pluralidad de terceros electrodos 2520 que están situados fuera de la primera área hexagonal 2515. Los terceros electrodos 2520, el segundo electrodo 2510 y un subconjunto de primeros electrodos 2505 definen una segunda área hexagonal 2525 que se superpone parcialmente a la primera área hexagonal 2515. Uno de los primeros electrodos 2505 (por ejemplo, un electrodo periférico con respecto a la primera área hexagonal 2515) está situado dentro de la segunda área hexagonal 2525. Por lo que respecta a la segunda área hexagonal 2525, este primer electrodo 2505 puede ser considerado un electrodo interno. Los terceros electrodos 2520, el subconjunto de los primeros electrodos 2505 y el segundo electrodo 2510 pueden ser considerados electrodos periféricos. Aunque los electrodos que definen dos áreas parcialmente superpuestas se ilustran en la Figura 25, se prevé que la naturaleza modular del colector 2500 facilita la inclusión de cualquier cantidad de electrodos que definan cualquier cantidad de áreas, de tal manera que el colector 2500 pueda extenderse en una o varias direcciones mediante la adición de electrodos al perímetro del colector 2500.

Como se ha descrito anteriormente con referencia al sistema 2400 (mostrado en la Figura 24), el colector 2500 (por ejemplo, los primeros electrodos 2505, el segundo electrodo 2510 y los terceros electrodos 2520) está configurado para estar cargado eléctricamente con una amplitud y/o polaridad opuesta a la amplitud y/o polaridad con la que la hilera 120 está cargada eléctricamente. Cuando estos componentes están así cargados, un polímero dispensado por la hilera 120 puede formar fibras que se extienden entre los electrodos (por ejemplo, los primeros electrodos 2505, el segundo electrodo 2510 y/o los terceros electrodos 2520) del colector 2500.

La Figura 26 es un diagrama 2600 en el que se ilustra un campo eléctrico generado por un sistema de electrohilado como el sistema de electrohilado 2400 (que se muestra en la Figura 24). El diagrama 2600 muestra una vista bidimensional en sección transversal de vectores de intensidad de campo eléctrico entre una hilera 120 y una pluralidad de electrodos 2605.

Los vectores de campo eléctrico cerca de la superficie de los electrodos 2605 están orientados perpendicularmente a la superficie de los electrodos 2605. Los vectores de campo eléctrico entre dos electrodos vecinos se dividen en dos flujos principales, apuntando hacia los centros de los dos electrodos adyacentes 2605. Por consiguiente, se pueden distribuir aleatoriamente las fibras depositadas sobre la superficie de los electrodos 2605, mientras que las fibras depositadas en el área entre dos electrodos vecinos 2605 pueden alinearse uniaxialmente entre estos dos electrodos adyacentes 2605.

Las Figuras 27A-27F son imágenes de microscopía de una membrana de nanofibras 2705 producida utilizando un colector con una matriz de electrodos, como por ejemplo el colector 2405 (mostrado en la Figura 24). Por ejemplo, se puede producir la membrana 2705 usando una matriz de esferas de acero inoxidable. La Figura 27A es una imagen de microscopía óptica de una membrana 2705. La Figura 27A incluye un recuadro interior 2710 que ilustra una ampliación de la membrana 2705 con una fuente de luz en el lado derecho de la imagen. Las sombras del recuadro 2710 indican pocillos dentro de la membrana 2705, cuyas posiciones corresponden a las posiciones de los electrodos en el colector.

La Figura 27B es una imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la membrana 2705 en la que se ilustra la compleja arquitectura ordenada compuesta de pocillos dispuestos hexagonalmente 2715 conectados con matrices de fibras alineadas uniaxialmente 2720. La profundidad de los pocillos formados al depositar nanofibras electrohiladas sobre microesferas de acero inoxidable compactas de 1,0 mm y 2,0 mm de diámetro era de aproximadamente 200 micrómetros (pm) y 400 pm, respectivamente. Dichos pocillos se pueden denominar “micropocillos”.

Las Figuras 27C-27F son ampliaciones de áreas correspondientes dentro de la Figura 27B. La Figura 27C indica que las fibras depositadas sobre la superficie de los electrodos de microesferas se distribuyeron aleatoriamente. La Figura 27D muestra que las fibras en la interfaz entre la superficie de un electrodo y un espacio entre electrodos pasaron de una orientación aleatoria a una orientación alineada. La Figura 27E indica que las fibras depositadas a lo largo del eje que conecta los centros de dos electrodos adyacentes se alinearon uniaxialmente de forma paralela a ese eje. La Figura 27F muestra que la densidad de fibras era significativamente menor entre esferas vecinas y lejos de los ejes que conectaban los centros de esferas adyacentes que en otras áreas (por ejemplo, las mostradas en las Figuras 27c -27E), y que las fibras depositadas en esta área estaban orientadas aleatoriamente.

En algunas realizaciones, se puede combinar una membrana de fibras, como por ejemplo la membrana 2705, con otras membranas. Por ejemplo, se puede usar una membrana con una pluralidad de pocillos interconectados por fibras alineadas uniaxialmente como una capa dentro de una estructura de capas múltiples, como se describió anteriormente con referencia a la Figura 8. Adicional o alternativamente, se pueden combinar diferentes tipos de colectores, por ejemplo, utilizando un colector de matriz de electrodos como un colector interno (por ejemplo, correspondiente a un centro de un parche biomédico), y utilizando un colector de tipo anillo (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1) como un colector externo que rodea el colector interno.

Resultados experimentales

Se evaluaron las membranas de fibras o “armazones” producidos por un colector de matriz de electrodos, tal y como se ha descrito anteriormente, para su uso como sustratos con el fin de generar micromatrices celulares. Se sembraron células selectivamente en la superficie del armazón colocando una pequeña cantidad de medios, los cuales contenían un número específico de células, sobre los micropocillos presentes dentro de las matrices de nanofibras.

Las Figuras 28A-28D son imágenes de microscopía que ilustran el crecimiento celular en una membrana como la membrana 2705 (mostrada en las Figuras 27A-27F). La Figura 28A es una imagen de microscopía óptica en la que se ilustra que las gotas 2805 que contienen células pueden colocarse dentro de los pocillos de una membrana de fibras. Además, las fibras hidrófobas pueden facilitar el mantenimiento de dichas gotas durante más de dos horas. Se descubrió que las células adherentes a las matrices de nanofibras después de dos horas estaban débilmente unidas y se eliminaban fácilmente usando un tampón PBS, lo que indica una unión rápida y reversible de las células dentro de las micromatrices. Las células adherentes a las matrices de nanofibras después de veinticuatro horas se tiñeron con diacetato de fluoresceína (FDA) en verde para identificar las células vivas.

Las Figuras 28B-28D son imágenes de microscopía de fluorescencia en las que se ilustran micromatrices celulares. Las células MG-63 vivas se tiñeron con diacetato de fluoresceína y en las Figuras 28B-28D se muestran como áreas claras contra un fondo oscuro.

En la Figura 28B se muestra una matriz de células adheridas selectivamente a los micropocillos dentro de la membrana de nanofibras. Se observó que cada pocillo dentro del armazón contenía aproximadamente 45 células, mientras que se observaron muy pocas células fuera de los micropocillos dentro de la membrana de fibras. Se manipuló fácilmente el promedio de células adherentes en cada micropocillo controlando la densidad de las células presentes dentro de las gotas de siembra.

La Figura 28C demuestra micromatrices celulares sembradas con un mayor número de células (aproximadamente 150 células por pocillo) que las utilizadas en las matrices que se muestran en la Figura 28B. A pesar del aumento de las concentraciones celulares, las células permanecieron muy confinadas en los pocilios del armazón de nanofibras. En la Figura 28D se muestra la misma micromatriz celular ilustrada en la Figura 28C después de una incubación durante tres días. La comparación de la Figura 28D y la Figura 28C demuestra que las células sembradas eran capaces de proliferar y migrar en la superficie de los armazones de nanofibras, aunque generalmente permanecieron confinadas físicamente dentro de los pocillos de la micromatriz celular.

Para examinar el potencial de estos armazones únicos de nanofibras como sustratos eficaces para aplicaciones de ingeniería neuronal, se sembraron ganglios de las raíces dorsales (DRG) en membranas de fibras funcionalizadas con polilisina y laminina y se incubaron durante 6 días. Los campos de neuritas resultantes que sobresalían de los DRG fueron teñidos con antineurofilamento 200 para visualizar la extensión de las neuritas a lo largo del armazón subyacente de nanofibras.

Las Figuras 29A y 29B son imágenes de microscopía que ilustran la propagación de neuritas en una membrana como, por ejemplo, la membrana 2705 (mostrada en las figuras 27A-27F). La Figura 29A es una superposición de una imagen de microscopía óptica y una imagen de microscopía de fluorescencia que ilustra que las neuritas emanaron de un cuerpo principal de DRG ubicado en el centro de la Figura 29A y formaron una red neuronal apreciable después de 6 días de cultivo. Se observó que las neuritas crecían a lo largo de los ejes largos de nanofibras alineadas uniaxialmente y alcanzaban los micropocillos vecinos, reproduciendo efectivamente la geometría de la arquitectura de nanofibras subyacente.

La Figura 29B es una superposición de una imagen de microscopía óptica y una imagen de microscopía de fluorescencia adyacente al área mostrada en la Figura 29A. La Figura 29B demuestra que las neuritas pueden continuar creciendo a lo largo de la dirección de alineación uniaxial de nanofibras después de llegar a los pocillos vecinos y navegar a otros pocillos vecinos a lo largo de la alineación de las fibras en varias direcciones. Posteriormente, se observó que las neuritas que se extendían a los micropocillos adyacentes se dividían en cinco grupos siguiendo las matrices de fibras alineadas que se conectaban a un conjunto secundario de pocillos adyacentes, indicando además la capacidad del armazón para formar una red neuronal compleja in vitro.

Las Figuras 30A y 30B son superposiciones de una imagen de microscopía óptica y una imagen de microscopía fluorescente que ilustra la formación de redes neuronales a partir de cuerpos embrioides en una membrana, como por ejemplo la membrana mostrada en las Figuras 27A-27F. Las células madre embrionarias (ES, por sus siglas en inglés), cultivadas para agregarse y formar cuerpos embrioides (EB, por sus siglas en inglés) usando el protocolo 4-/4+, se sembraron en armazones de nanofibras electrohiladas como los que se muestran en las Figuras 27A-27F, y se incubaron con suplemento B27 para provocar la diferenciación neuronal. La inmunotinción con Tuj1, un marcador neuronal, se realizó después de la incubación durante 14 días con el fin de examinar la capacidad de los armazones de nanofibras subyacentes para promover la diferenciación neuronal in vitro.

Las Figuras 30A y 30B demuestran la capacidad de los cuerpos embrioides para formar redes neuronales en sustratos de membrana de nanofibras. En un caso, un cuerpo embrioide fue confinado dentro de uno de los micropocillos, mientras que las neuritas se extendieron periféricamente a lo largo del patrón de fibras subyacente, como se muestra en la Figura 30A. Las neuritas que se extienden desde los cuerpos embrioides cultivados se alinearon de forma similar en la parte uniaxial del armazón donde las fibras estaban altamente organizadas. Al alcanzar el área de los pocillos adyacentes, las neuritas se organizaron al azar como resultado de la orientación aleatoria de las fibras subyacentes.

En otro caso, los cuerpos embrioides fueron sembrados en áreas de nanofibras alineadas uniaxialmente dentro del conjunto de nanofibras, como se muestra en la Figura 30B. De nuevo, las neuritas se extendieron a lo largo de la dirección de alineación de las fibras y, al llegar al pocillo más cercano, exhibieron una organización desordenada. En particular, cuando las neuritas se extendieron a través del área de micropocillos, se restableció su alineación uniaxial, paralela a la alineación de las fibras subyacentes. En conjunto, estos resultados indican que las arquitecturas de nanofibras descritas en la presente representan un medio simple y eficaz para desarrollar redes neuronales complejas a partir de neuronas primarias o células madre embrionarias.

Procedimiento experimental

El sistema de electrohilado utilizado para fabricar y recoger nanofibras alineadas fue similar al sistema 2400 (mostrado en la Figura 24). La solución de polímero utilizada para el electrohilado contenía un 20 % de PCL (p/v) en un disolvente mixto de diclorometano (DCM) y dimetilformida (DMF) con una relación de volumen de 80:20. El colector incluyó conjuntos de microesferas de acero inoxidable con diámetros de 1 mm y 2 mm, respectivamente. Las membranas de fibras se transfirieron a placas de cultivo y después se fijaron mediante adhesivo de silicona de calidad médica. Las fibras de PCL se recubrieron por pulverización catódica con oro antes de la obtención de imágenes con un microscopio electrónico de barrido a un voltaje de aceleración de 15 kV.

Para el cultivo de los ganglios de raíces dorsales (DRG) y la inmunotinción, se diseccionaron DRG de la región torácica de polluelos embrionarios del día 8 (E8, estadio HH35-36) y se recogieron en una solución salina tamponada de Hank (HBSS) antes de la preparación en placas. Los DRG se sembraron en las arquitecturas de fibras y se incubaron durante 6 días en medios neurobasales (NB) modificados que contenían un 1 % de ABAM, un 1 % de suplemento de N-2 (Invitrogen) y 30 ng/ml de factores de crecimiento nervioso beta (B-NGF) (R&D Systems, Minneapolis, Minnesota). Después de la incubación durante 6 días, los DRG fueron inmunoteñidos con el marcador anti-neurofilamento 200 (Sigma-Aldrich). En resumen, los DRG se fijaron en formaldehído al 3,7 % durante 45 minutos y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % durante 30 minutos. Las muestras se bloquearon en PBS que contenía un 2,5 % de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma-Aldrich) durante 1 hora. Se aplicó anti-NF 200 diluido con PBS que contenía 1,5 % de BSA a las células durante una noche a 4 °C. A continuación, se aplicó un anticuerpo secundario, AlexaFluor 488 IgG antirratón (de cabra) (1:200, Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la tinción, se capturaron imágenes de fluorescencia.

Para la formación de cuerpos embrioides y la inmunotinción, los cuerpos embrioides fueron sembrados en arquitecturas de fibras e incubados con medios neuronales basales que contenían el suplemento B27. Después de 14 días, se realizó una inmunohistoquímica para visualizar la distribución espacial de neuritas de acuerdo con nuestro estudio anterior.

Se usó la línea celular MG-63 para demostrar la formación de micromatrices celulares. Las células se cultivaron en medio esencial mínimo alfa (a-MEM, Invitrogen, Grand Island, Nueva York), suplementado con un 10 % de suero bovino fetal (FBS, Invitrogen) y un 1 % de antibióticos (que contenían penicilina y estreptomicina, Invitrogen). El medio se cambió cada dos días y los cultivos se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía un 5 % de CO2. Se sembró un determinado número de células en cada pocillo de los armazones colocando gotas pequeñas en los pocillos. Después de la incubación durante 2 horas, los armazones se lavaron con medio de cultivo para eliminar las células unidas débilmente. A continuación, las células vivas se tiñeron con diacetato de fluoresceína (FDA) después de una incubación durante 24 horas y se tomaron imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Configuraciones adicionales de matriz de electrodos

Además de los ejemplos concretos de matrices de electrodos descritas anteriormente con referencia a resultados experimentales, se prevé que se pueden producir estructuras de nanofibras, como por ejemplo las descritas en la presente, con varias matrices de electrodos diferentes. Las Figuras 31A-31D son imágenes de microscopía electrónica de barrido que ilustran membranas producidas usando una variedad de matrices de electrodos.

En la Figura 31A se ilustra una membrana de fibras fabricada usando un colector compuesto por matrices hexagonales de esferas de acero inoxidable. En la Figura 31B se ilustra una membrana de fibras fabricada usando un colector compuesto por matrices hexagonales de esferas de acero inoxidable que tienen un diámetro mayor que las esferas de acero inoxidable usadas para producir la membrana mostrada en la Figura 31A.

También se pueden usar otras configuraciones de agrupamiento no hexagonales con los electrodos para lograr diferentes geometrías. En la Figura 31C se muestra una membrana de fibras fabricada usando un colector compuesto por una matriz cuadrada compacta con esferas de acero inoxidable. En la Figura 31D se muestra una membrana de fibras producida utilizando un colector compuesto por matrices cuadradas de microesferas de acero inoxidable con un aumento gradual de la distancia entre electrodos en una dirección. Las membranas de fibras no se retiraron de los colectores durante la formación de imágenes SEM y pueden retirarse fácilmente (por ejemplo, despegándolas) de los colectores cuando así se requiera.

La Figura 32 es un diagrama de un colector 3200 con electrodos periféricos 3205 que circunscriben parcialmente un área 3210. El colector 3200 también incluye un electrodo interno 3215. Los electrodos periféricos 3205 y el electrodo interno 3215 definen una parte 3220 del área 3210. En ejemplos de realización, los electrodos periféricos 3205 están situados en un perímetro 3225 del área 3210.

En la realización mostrada en la Figura 32, se muestra el área 3210 como una elipse (por ejemplo, un círculo), y se muestra la parte 3220 como un sector de la elipse. Se prevé que el área 3210 puede ser de cualquier forma geométrica o no geométrica, como por ejemplo una elipse, un polígono, un óvalo, un rectángulo, un cuadrado, un triángulo y/o cualquier forma rectilínea o curvilínea, y que la parte 3220 puede ser cualquier parte de dicha forma.

Las estructuras de fibras de matriz de electrodos descritas en la presente permiten la formación de estructuras de “hoyuelos” dentro de una membrana de fibras. Por consiguiente, la producción de dichas membranas representa un avance significativo ya que las membranas de fibras descritas poseen múltiples micropocillos dispuestos en geometrías ordenadas variables. Además, estas estructuras poseen micropocillos tridimensionales únicos capaces de confinar físicamente las células sembradas en la superficie del armazón y facilitar la fabricación de micromatrices celulares. En comparación con los enfoques conocidos para la fabricación de micromatrices, el uso de membranas de fibras puede ser una técnica más simple y menos costosa para formar micromatrices de células complejas para uso in vitro e in vivo. Además, los resultados experimentales descritos previamente demuestran que las neuritas en el sitio de los pocillos presentaban una distribución aleatoria, y que las neuritas podían unir un pocillo con otro a lo largo de las fibras alineadas intermedias. Podría usarse una red neuronal desarrollada usando esta estructura para aplicaciones de alto rendimiento en neurotoxicología y neurobiología del desarrollo.

Para facilitar la comprensión de esta invención, a continuación, se definen una serie de términos. Los términos definidos en la presente tienen el significado habitual que tendrían para una persona experta en la materia en las áreas pertinentes a las realizaciones de la invención. Los artículos como “un/a”, “el”, “la”, “los” y “ las” no se refieren solo a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la cual se puede usar un ejemplo específico a título ilustrativo.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una estructura de fibras, comprendiendo el método:

cargar eléctricamente uno o más primeros electrodos que definen un área con una primera polaridad; cargar eléctricamente un segundo electrodo situado dentro del área definida con la primera polaridad; cargar eléctricamente una hilera con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad, en donde la hilera está alineada con el segundo electrodo; y

dispensar un polímero desde la hilera para crear una estructura de fibras que se extiende desde el segundo electrodo hasta el primer o los primeros electrodos.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la dispensación del polímero comprende la formación de una pluralidad de fibras poliméricas que se extienden desde el segundo electrodo hasta el primer electrodo para crear una capa de fibras alineadas radialmente.

3. El método de la reivindicación 2, que además comprende, después de crear la capa de fibras alineadas radialmente:

eliminar la carga eléctrica del primer electrodo y del segundo electrodo;

cargar eléctricamente una superficie conductora debajo de la capa de fibras alineadas radialmente con la primera polaridad; y

dispensar el polímero desde la hilera para crear una capa de fibras alineadas no radialmente sobre la capa de fibras alineadas radialmente.

4. El método de la reivindicación 2, en donde dicho uno o más primeros electrodos son uno o varios electrodos internos que definen un área interna, y la capa de fibras alineadas radialmente es un área interna de fibras alineadas radialmente, y este método comprende, además:

cargar eléctricamente uno o varios electrodos externos que definen un área externa más grande que el área interna con la primera polaridad; y

dispensar el polímero desde la hilera para crear un área externa de fibras alineadas radialmente que se extienden desde el electrodo interno hasta el electrodo externo.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la dispensación del polímero comprende la dispensación de un polímero líquido hacia el segundo electrodo.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la carga de dicho uno o más primeros electrodos comprende cargar un electrodo circular que rodea al segundo electrodo.

7. El método de la reivindicación 1, que además comprende aplicar una máscara entre la hilera y el dicho uno o más primeros electrodos mientras se dispensa el polímero.

8. Un aparato para producir una estructura que incluye una pluralidad de fibras, comprendiendo el aparato:

una pluralidad de primeros electrodos que circunscriben al menos parcialmente un área;

un segundo electrodo situado dentro del área y acoplado eléctricamente a los primeros electrodos;

y

una fuente de alimentación acoplada eléctricamente a los primeros electrodos y al segundo electrodo, en donde la fuente de alimentación está configurada para cargar eléctricamente los primeros electrodos y el segundo electrodo con una primera polaridad,

en donde cuando una hilera alineada con el segundo electrodo y cargada con una segunda polaridad opuesta a la primera polaridad dispensa un polímero, el polímero dispensado forma una pluralidad de fibras que se extienden desde el segundo electrodo hasta los primeros electrodos.

9. El aparato de la reivindicación 8, en donde los primeros electrodos rodean al segundo electrodo.

10. El aparato de la reivindicación 8, en donde los primeros electrodos definen un polígono, y el segundo electrodo está situado dentro del polígono.

11. El aparato de la reivindicación 8, en donde los primeros electrodos y el segundo electrodo definen un sector de una elipse.

12. El aparato de la reivindicación 8, en donde el área define un plano horizontal, y cada primer electrodo de los primeros electrodos incluye una superficie redondeada orientada hacia el plano horizontal.