ES2829574T3 - Sistema de regulación de plásmidos basado en temperatura - Google Patents
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Abstract
Una célula de E. coli recombinante que comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente donde la expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura.
Description
DESCRIPCIÓN
Sistema de regulación de plásmidos basado en temperatura
Campo técnico
La presente invención se refiere a células de E. coli recombinantes que tienen un sistema de selección de plásmidos basado en temperatura.
Antecedentes de la invención
Una presión clave en la industria biofarmacéutica es el impulso regulador para alejarse de cualquier uso de antibióticos para la selección o el mantenimiento de células transfectadas. Más allá de la introducción de importantes costos materiales e impurezas del proceso, los genes de resistencia a antibióticos incorporados en los plásmidos resultan en importantes obstáculos regulatorios para las terapias basadas en ácidos nucleicos debido a la transferencia potencial a los pacientes o al medio ambiente.
Los sistemas de compensación, donde los genes necesarios se eliminan del genoma de la célula huésped y se suministran in trans por el plásmido, son un compromiso común y un reemplazo para los sistemas de resistencia a antibióticos. Para producir células huésped libres de vectores, la mayoría de los sistemas de compensación dependen de la eliminación de genes metabólicos (tales como dapD o pyrF) y la introducción correspondiente de los intermediarios metabólicos necesarios para el crecimiento (auxotrofia mediante el uso del aminoácido lisina o base de nucleósido uracilo, respectivamente) hasta los plásmidos que contienen el gen compensador se introducen. Una vez que el gen se ha compensado por el plásmido, se producirá un crecimiento en medios mínimos solo para las células que contienen plásmidos y ejercerá una presión selectiva para la retención del plásmido. Desafortunadamente, si bien tal selección es robusta a densidades celulares bajas, los huéspedes que contienen plásmidos producen y secretan una sobreabundancia del intermediario metabólico requerido y permiten la alimentación cruzada a densidades celulares altas. En la alimentación cruzada, las células que contienen plásmidos soportan el crecimiento de células deficientes de plásmidos y reducen la eficiencia general del sistema de selección durante los procesos industriales.
Por el contrario, la selección de genes diana no metabólicos esenciales para la complementación resulta en un mantenimiento tanto estable como estricto de los plásmidos, pero resulta en un fenotipo “bloqueado” - tal como con complementación infA / IF-1 (Hagg y otros J Biotechnol. 2004;111(1):17-30). En este caso, la proteína genómicamente eliminada (IF-1) es necesaria para la producción de proteínas al estabilizar la primera etapa de la traducción - la deleción del gen infA (y, en consecuencia, la proteína IF-1) es, por lo tanto, absolutamente letal para la bacteria y ocurre incluso si se suministra IF-1 en el medio, ya que no existe una vía de captación para el rescate de células deficientes de infA lo que evita así, la alimentación cruzada. Cualquier célula huésped manipulada que pierda incluso transitoriamente su plásmido compensador muere rápidamente. Si bien esto mantiene la selección estricta, también significa que no hay posibilidad de propagar células huésped libres de plásmidos y, por lo tanto, no hay forma de introducir nuevos plásmidos o modificar aún más el sistema - por lo tanto, el fenotipo está “bloqueado” y es inútil para propósitos de modificación o producción aguas abajo.
Croitoru y otros Eur J Biochem 271 (2004) 534-544, describen una gama de mutantes funcionales del factor de iniciación de la traducción IF1 de Escherichia coli. El reemplazo del gen infA genómico con estos mutantes de crecimiento lento de infA daría como resultado una ventaja de crecimiento para las células complementadas con plásmido, pero carece de una selección estricta que eliminaría las células deficientes de plásmidos. Como tal, un sistema con estas características siempre contendría una proporción significativa de biomasa libre de plásmidos y resultaría en rendimientos industriales de plásmidos más bajos que los actuales sistemas de selección basados en antibióticos.
La complementación metabólica (auxotrófica) es bien conocida pero resulta en una rigurosidad relajada durante los entornos de cultivo industrial de alta densidad. Otras estrategias de complementación funcionan bien para el mantenimiento de plásmidos, pero son sistemas inflexibles de “uso único”. Por tanto, existe una necesidad de sistemas de complementación que sean adecuados para uso industrial y que sean sistemas flexibles que permitan rondas repetitivas de modificaciones para optimizar el sistema.
Breve descripción de la invención
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula de E. coli recombinante que comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente donde la expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para mantener un plásmido en una E. coli recombinante que comprende la inserción de un plásmido recombinante en una célula de E. coli recombinante en donde
- dicha célula de E. coli recombinante comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente cuya expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura, y
- dicho plásmido recombinante comprende un gen de E. coli esencial que codifica una proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma función que dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente por dicha célula de E. coli lo que permite así, el crecimiento a ambas temperaturas.
En una modalidad, la célula de E. coli recombinante de acuerdo con la invención comprende un plásmido que codifica un gen de E. coli esencial que codifica una proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma función que dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente por dicha célula de E. coli recombinante.
En una modalidad, dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente es infA o un equivalente funcional del mismo.
En una modalidad, dicha secuencia líder aguas arriba comprende la secuencia líder de ARNm de L. monocytogenes prfA o un equivalente funcional del mismo.
Al colocar la copia genómica de un gen esencial bajo control ambiental (temperatura), proporcionamos un sistema donde se puede lograr una selección y mantenimiento estrictos a través del cultivo a una temperatura selectiva y donde las células huésped vacías (libres de plásmidos) se pueden propagar y expandir para uso futuro a una temperatura permisiva. Esto permite flexibilidad aguas abajo (capacidad de usar la misma cepa huésped para muchos sistemas de plásmidos complementarios) pero también elimina las desventajas de los sistemas conocidos debido a la alimentación cruzada y la rigurosidad relajada.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Confirmación de la digestión de restricción de la retención de plásmido, muestras 1-16.
Figura 2. Confirmación de la digestión de restricción de la retención de plásmido, muestras 17-48.
Figura 3. Confirmación de la digestión de restricción de la retención de plásmido, muestras 49-80.
Figura 4. Confirmación de la digestión de restricción de la retención de plásmido, muestras 81-100.
Figura 5. Confirmación del fenotipo de la retención de plásmido por crecimiento a 30 °C (muestras 1-50, 17 horas de incubación; muestras 51-100, 22 horas de incubación).
Descripción
La presente invención proporciona una línea celular modificada que es capaz de replicarse bajo temperaturas permisivas, mientras que también es inviable a temperaturas no permisivas a menos que se complemente con un plásmido compensatorio. Tales sistemas de línea celular/plásmido proporcionan facilidad de uso aguas abajo con selección industrial estricta.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona una célula de E. coli recombinante que comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente donde la expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura.
El término “sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura” como se usa en la presente descripción, pretende significar que no permite el crecimiento a ninguna velocidad significativa en comparación con el crecimiento normal a dicha primera temperatura, es decir, a una velocidad de crecimiento inferior al 30 % de la velocidad de crecimiento normal, inferior al 10 % de la velocidad de crecimiento normal o inferior al 1 % de la velocidad de crecimiento normal. A la inversa, el término “permite el crecimiento a una segunda temperatura” como se usa en la presente descripción, pretende significar que permite el crecimiento a una velocidad que es sustancialmente la misma que la velocidad de crecimiento normal a dicha segunda temperatura
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para mantener un plásmido en una E. coli recombinante que comprende la inserción de un plásmido recombinante en una célula de E. coli recombinante en donde
- dicha célula de E. coli recombinante comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente cuya expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura, y
- dicho plásmido recombinante comprende un gen de E. coli esencial que codifica una proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma función que dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente por dicha célula de E. coli lo que permite así, el crecimiento a ambas temperaturas.
En una modalidad, la célula de E. coli recombinante de acuerdo con la invención comprende un plásmido que codifica un gen de E. coli esencial que codifica una proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma función que dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente por dicha célula de E. coli recombinante.
En una modalidad, dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente es infA o un equivalente funcional del mismo.
En una modalidad, dicha secuencia líder aguas arriba comprende la secuencia líder de ARNm de L. monocytogenes prfA o un equivalente funcional del mismo.
El término “equivalente funcional del mismo” como se usa en la presente descripción pretende significar una alternativa que exhibe sustancialmente la misma función principal.
Para corregir el fenotipo no modificable del sistema de complementación infA / IF-1 de Hagg y otros, utilizamos el líder de ARNm de L.monocytogenes prfA. En L.monocytogenes el segmento líder prfA funciona como un termosensor para controlar la traducción de una proteína de invasión clave - que prohíbe la traducción a temperaturas ambientales por debajo de 30 °C (en superficies, en alimentos, etc.) pero que permite la traducción del ARNm a temperaturas de 37 °C (una vez consumido por un huésped adecuado). El líder de ARNm logra esto al plegarse sobre sí mismo y formar una horquilla estable a 30 °C que ocluye el sitio de unión ribosomal y el codón de iniciación AUG. Esta estructura se funde y se despliega a temperaturas superiores a 37 °C (temperaturas fisiológicas para huéspedes potenciales), lo que permite la unión y traducción ribosomal (Johansson y otros Cell. 2002 (110) 551-61). Mientras que los segmentos líderes de ARN termosensores de bacterias patógenas están sintonizados evolutivamente a las transiciones de temperatura que son útiles industrialmente (30°C to 37°C, L. monocytogenes prfA y Y. pestis lcrF) hay muchas otras opciones potenciales disponibles para tales constructos. Por ejemplo, elementos ROSE (represor de la expresión del gen de choque térmico), elemento FourU de S. enterica, rpoH de E. coli, hsp17 de la cianobacteria Synechocystis, hsp90 de D. melanogaster, y el cIII del bacteriófago lambda (Á) todos contienen motivos termosensores de ARN similares. Si bien estos elementos inhiben la traducción más abajo de las temperaturas permisivas, se usan para evitar la traducción de proteínas de choque térmico a temperaturas normales y las temperaturas permisivas para estos sistemas no son útiles para la fermentación bacteriana (comúnmente por encima de 42°C). Por el contrario, existen termosensores de ARN de choque frío donde la estabilidad del ARNm se ve afectada negativamente por el plegamiento parcial y la sensibilidad a la nucleasa bajo condiciones fisiológicas normales, pero se estabiliza y permite la acumulación y traducción del ARNm después de un plegamiento más extenso y compacto más abajo de 25°C. Si bien estos sistemas no son directamente útiles, se prevé que la modificación de estos elementos o el diseño de elementos totalmente sintéticos basados en sus principios (Waldminghaus, y otros Biol Chem. 2008 389:1319-26), pueden proporcionar termosensores alternativos con propiedades convenientes.
El control basado en temperatura del gen huésped infA esencial se logra, por tanto, al reemplazar la secuencia genómica aguas arriba en la línea celular de E. coli con la secuencia líder de ARNm de L.monocytogenes prfA o un mecanismo de control de la traducción equivalente. Como estas regiones bloquean funcionalmente la traducción del producto del gen IF-1/infA fusionado a temperaturas de 30 °C o más abajo, induce rápidamente la muerte del huésped diseñado a menos que el gen se complemente in trans a partir de un plásmido que también puede contener un gen de producción de interés. Cualquier enfoque para integrar un termosensor equivalente al L.monocytogenes prfA aguas arriba de un pequeño gen esencial de E. coli se puede esperar que tenga el mismo rendimiento. Si bien muchos genes se consideran “esenciales” para E. coli, la mayoría son específicos de condición y pierden su requerimiento bajo muchos medios ricos, crecimiento lento o sistemas metabólicos alternativos - solo una pequeña fracción es verdaderamente esencial y resulta en la eliminación celular completa al ser retirados. Una variedad de genes no metabólicos verdaderamente esenciales de E. coli distintos de infA se pueden seleccionar para sistemas de complementación, como infC/IF-3, dnaJ, dnaK, era, frr, ftsL, ftsN, ftsZ, grpE, mopA, mopB, msbA, nusG, parC, rpsB, o trmA pueden usarse como alternativas. De estas alternativas, los genes pequeños son preferentes debido a las restricciones en el tamaño de los plásmidos complementarios, lo que lleva a una preferencia clasificada de infA, mopB, ftsL, infC, nusG, frr y grpE en base a la longitud del gen, como lo son los otros genes candidatos, en promedio, más de tres veces la longitud y la complejidad.
En este arreglo (segmento líder prfA fusionado 5' a la copia genómica infA), se añaden cuatro aminoácidos al N-terminal de IF-1 y la traducción de la fusión se regula por la temperatura del entorno de fermentación. A temperaturas permisivas (37 °C y superiores), las células huésped libres de plásmidos pueden crecer debido al despliegue del líder prfA y la traducción del gen infA a IF-1, lo que permite una mayor síntesis de proteínas y supervivencia celular. A temperaturas de selección estrictas (25 °C a 30 °C) el líder prfA permanece plegado, lo que evita así una mayor síntesis de proteínas y conduce rápidamente a la muerte de las células huésped libres de plásmidos.
Como beneficio adicional, y sorprendente, los cuatro aminoácidos añadidos a la fusión debido al líder prfA (MNAQ) reducen la eficiencia del producto de fusión IF-1 sin comprometer completamente su actividad - como un resultado, si bien las células huésped libres de plásmidos pueden propagarse a temperaturas permisivas (37 °C y superiores), 10 hacen con un aumento de aproximadamente dos a cuatro veces en el tiempo de duplicación. Esto resulta en una “selección suave” adicional e inesperada en donde los plásmidos que contienen el infA nativo confieren una ventaja de crecimiento sustancial a las células huésped manipuladas incluso bajo las condiciones de cultivo más permisivas. Se prevé que otras pequeñas modificaciones de genes esenciales, tales como los mutantes infA descritos en Croitoru, y otros Eur J Biochem 271 (2004) 534-544, puedan existir lo que también mejoraría la eficiencia de selección de estos sistemas (al disminuir la duración de la exposición a baja temperatura requerida para la selección, al reducir además la velocidad de crecimiento a temperaturas permisivas, etc.). Si bien tales modificaciones por sí solas no pueden resultar en la deselección completa de bacterias deficientes de plásmidos, pueden incluirse para optimizar el rendimiento de la selección en combinación con controles de traducción basados en ARN.
Otras características convenientes de estos sistemas de complementación de genes esenciales incluyen la falta de proporcionar cualquier ventaja selectiva para las bacterias de tipo salvaje - lo que minimiza, por tanto, la posibilidad de persistencia ambiental después de la transferencia horizontal de genes (HGT, por sus siglas en inglés, una preocupación clave de la agencia reguladora) no deseada.
Nuestra reducción a la práctica fue utilizar tecnología de recombinación estándar para introducir específicamente la secuencia líder L.monocytogenes prfA nativa (extremo 5' a través de los primeros cuatro aminoácidos de PrfA, 127 pb) en lugar del líder de ARNm E. coliinfA nativo que se produjo aguas arriba del codón iniciador AUG - lo que crea así una fusión híbrida de temperatura controlada del gen esencial IF-1 (o infA.prfA).
Después de esto, la cepa huésped puede propagarse en un estado “vacío” o receptivo por crecimiento a una temperatura permisiva de 37 °C, aunque con un defecto de velocidad de crecimiento de cuatro veces. Una vez que un plásmido complementario que contiene el gen de interés, así como también un ORF infA nativo se suministra, la temperatura de crecimiento puede bajarse a 30 °C y todas las células huésped deficientes de plásmido morirán rápidamente y se activará una fuerte presión selectiva para la retención del plásmido. Incluso cuando se cultiva a la temperatura totalmente permisiva de 37 °C, existe una ventaja de crecimiento para las células que contienen plásmidos, ya que la fusión de cuatro aminoácidos PrfA/IF-1 tiene una actividad inferior a la del IF-1 nativo suministrado por plásmidos complementarios.
EJEMPLOS
Ejemplo 1.
Para evitar la contaminación con variantes de plásmido previas que utilizan el marcador de selección de resistencia a kanamicina pVAX1, se raspó dos veces un vial ICC y se usó para inocular por separado placas de agar LB libre de animal que contenían kanamicina o ácido nalidíxico. Las placas se incubaron a 37 °C durante 17 horas antes de la prueba. No se observó crecimiento en la placa de kanamicina, lo que indica que no estaba presente el vector parental pVAX1 para confundir el análisis.
Se generaron de 1-100 pases del huésped diseñado (infA::prfA) que contenía un plásmido complementario de infA a 11 por semana, 2 (12 horas) pases por día de la semana a 37 °C y uno (48 horas) cada fin de semana a 30 °C. Como el tiempo de duplicación estándar para E. coli en los medios LB es de 20-30 minutos, cada pase de un día de la semana refleja 24 rondas de división celular. Todos los pases se realizaron en medio LB líquido libre de animal suplementado con 15 microgramos/ml de ácido nalidíxico (que selecciona la cepa base DH5a, no la presencia de plásmido). Se generaron reservas de glicerol a partir de cada pase y se retuvieron hasta que se obtuvieron los 100 pases para el procesamiento simultáneo.
Se usaron raspados de las reservas de glicerol para inocular 5 ml de cultivos de la noche que se procesaron mediante las instrucciones del proveedor en los estuches Qiagen miniprep mediante el uso de un colector de vacío (16 o 32 cultivos por ciclo, debido a limitaciones de tamaño del gel). No se hizo ningún intento de recolectar lecturas de DO600 para la normalización de la entrada de células y todas las preparaciones se realizaron en base a volúmenes estándar. Un microlitro de cada minipreparación se sometió a digestión con PstI/XhoI para resolver la cadena principal (aproximadamente 2,4 Kpb) del inserto (aproximadamente 4 Kbp), sin corrección para la concentración de plásmido resultante de cada minipreparación. Cada gel se corrió con escaleras Tridye 2-Log flanqueantes, un primer carril de muestra de plásmido no digerido, y todas las muestras se visualizaron con
colorante SybrSafe. A pesar de la falta de control de la cantidad de ácido nucleico, todos los carriles de digestión muestran tanto la presencia como el patrón de digestión esperado para el plásmido. Estos resultados demuestran un mantenimiento estable y a largo plazo del plásmido a través de este sistema de selección.
Las reservas de glicerol para los pases 1-100 también se estriaron en 50 sectores de placas de agar LB libre de antibióticos y libre de animal y se incubaron durante la noche a 30 °C. No se hizo ningún intento de controlar el inóculo de la estría. Todas las estrías representativas de la reserva de glicerol resultaron en un crecimiento notable y, por tanto, en retención de plásmidos. No se observó crecimiento en las placas estriadas con células huésped deficientes de plásmido. Estos resultados también demuestran un mantenimiento efectivo del plásmido a través de este sistema de selección y la falta de generación de mutantes de escape durante los pases a largo plazo.
La deriva del plásmido se determinó mediante la secuenciación completa de Sanger del plásmido (6383 pares de bases) aislado del pase 1 y del pase 100. La secuenciación se realizó con lecturas bicatenarias a un mínimo de 2x de profundidad y se volvió a correr si la integridad era cuestionable. Se detectó una deriva no significativa (<1 llamada base ambigua por 1000 pb; sin cambios de bases múltiples, inversiones, adiciones o eliminaciones; dentro de la tolerancia de error de lectura para el equipo y el protocolo). Estos resultados demuestran que el sistema de selección no introduce un estrés mutacional o de recombinación significativo en el plásmido que sería perjudicial para la producción industrial de plásmidos, el plásmido es estable en secuencia a través de más de 2400 rondas de división celular.
La persistencia del plásmido en las células huésped modificadas (infA::prfA) frente a las no modificadas se realizó sin selección de antibióticos mediante la transfección por triplicado de células de E. coli químicamente competentes con el plásmido complementario infA usado previamente o un simulacro de transfección. Las células se sembraron en matraces de agitación de 250 mL y se cultivaron durante 10 horas antes del muestreo para el rendimiento del ADN plasmídico mediante Qiagen miniprep. Bajo estas condiciones, se espera que pocas células iniciales sean positivas para el plásmido y se espera una rápida pérdida de plásmido sin presión selectiva positiva - ya que el mantenimiento del plásmido ralentiza el crecimiento debido a los requisitos metabólicos añadidos y añade su propia presión selectiva negativa a las células que contienen plásmidos. El ADN medio (plásmido) produce todos los errores std. exhibidos de aproximadamente 0,02 pg. Esto demuestra que el plásmido complementario a infA no es persistente en la E. coli de tipo salvaje o es de esperar si se libera al medio ambiente.
Tabla 1.
Ejemplo 2
Verificación de la retención de plásmidos con el sistema de complementación infA.
Para verificar que el sistema de selección de retención de plásmido basado en infA funcionó como se deseaba, las bacterias transformadas con plásmido se cultivaron a través de 100 pases (aproximadamente 36 duplicaciones/generaciones por pase, para un total de 3600 generaciones de deriva potencial o pérdida de plásmido examinada). Los pases 1-100 se generaron a razón de 11 por semana, 2 pases por día de la semana a 37 °C y uno cada fin de semana a 30 °C. Todos se realizaron en medio LB líquido libre de animal (Teknova soy-tone) suplementado con 15 microgramos/ml de ácido nalidíxico (que selecciona la cepa base DH5a, no la presencia de plásmido). Se generaron reservas de glicerol a partir de cada pase y se retuvieron hasta que se obtuvieron los 100 pases para el procesamiento simultáneo.
Se usaron raspados de las reservas de glicerol para inocular 5 ml de cultivos de la noche que se procesaron mediante las instrucciones del proveedor en los estuches Qiagen miniprep mediante el uso de un colector de vacío (16 o 32 cultivos por ciclo, debido a limitaciones de tamaño del gel). No se hizo ningún intento de recolectar lecturas de DO600 para la normalización de la entrada de células y todas las preparaciones se hicieron en base a volúmenes estándar. Un microlitro de cada minipreparación se sometió a digestión con PstI/Xhol para resolver la cadena principal (aproximadamente 2,4 Kpb) del inserto (aproximadamente 4 Kbp), sin corrección para la concentración de plásmido resultante de cada minipreparación. Cada gel se corrió con escaleras Tridye 2-Log flanqueantes (NEB https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb), un primer carril de muestra de plásmido no digerido, y visualizado con tinte SybrSafe. En las figuras 1-4, a pesar de la falta de control de la cantidad de ácido nucleico, todos los carriles de digestión muestran tanto la presencia como el patrón de digestión esperado para el plásmido. (Véase figuras 1-4 para pases 1-16, 17-48, 49-80 y 81-100, respectivamente.)
Como una confirmación adicional, las reservas de glicerol para los pases 1-100 también se estriaron en 50 sectores de placas de agar LB libre de antibióticos y libre de animal y se incubaron durante la noche a 30 °C. No se hizo ningún intento de controlar el inóculo de la estría. Como se muestra en la figura 5, todas las estrías representativas de la reserva de glicerol resultaron en un crecimiento notable y, por tanto, en retención de plásmidos.
Ejemplo 3
Idoneidad para el escalado con el sistema de complementación infA.
Con el fin de verificar que el sistema de selección de retención de plásmido basado en infA funcionó como se deseaba a escala de producción, las bacterias transformadas con plásmido se usaron en un fermentador piloto de alimentación por lotes de 50 L con una etapa de cambio de temperatura que mejora el rendimiento específico. Se utilizó un medio mínimo con la adición de extracto de levadura, que reduce la velocidad de duplicación a 0,88/hora. El lote de alimentación se inició a las 17h00 después de la inoculación y la regulación del oxígeno disuelto al 30 % se realizó mediante el aumento sucesivo de los parámetros de la cascada de pO2 (agitación a las 32h15, presión a las 40h30 y luego flujo de aire a las 45h40). La velocidad de aumento de biomasa disminuyó inmediatamente después del cambio a 42 °C, como se anticipó. La cantidad de ADN plasmídico producido se estimó en 1,03 ± 0,17 g/L mediante el uso de un procedimiento de extracción de plásmido a pequeña escala que imita el rendimiento inmediatamente posterior a la lisis.
Claims (15)
1. Una célula de E. coli recombinante que comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente donde la expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura.
2. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura sin complementación de genes nativos.
3. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde dicha célula de E. coli recombinante no comprende más versiones codificadas genómicamente de dicho gen de E. coli esencial.
4. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores la cual comprende un plásmido que codifica un gen de E. coli esencial que codifica una proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma función que dicha función del gen de E. coli esencial codificado genómicamente por dicha célula de E. coli.
5. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho gen de E. coli esencial codificado por dicho plásmido codifica un producto génico que tiene mayor actividad en dicha célula de E. coli recombinante que dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente.
6. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha secuencia líder aguas arriba comprende la secuencia líder de ARNm de L. monocytogenes prfA o un equivalente funcional del mismo.
7. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho gen de E. coli esencial codifica una proteína involucrada en la transcripción o traducción.
8. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente es infA o un equivalente funcional del mismo.
9. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la proteína expresada a partir de dicho infA o un equivalente funcional del mismo tiene una actividad menor que la proteína (IF1) codificada por el infA de E. coli nativo.
10. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde dicho gen de E. coli esencial codificado por dicho plásmido es infA de E. coli nativo.
11. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde la velocidad de crecimiento de dicha célula de E. coli a cualquier temperatura que permita el crecimiento es mayor cuando dicho gen de E. coli esencial se expresa principalmente a partir del plásmido en lugar de principalmente o únicamente a partir de dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente.
12. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha primera temperatura es más baja que dicha segunda temperatura.
13. La célula de E. coli recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la diferencia entre dicha primera temperatura y dicha segunda temperatura es al menos de aproximadamente 1 °C, al menos de aproximadamente 2 °C, al menos de aproximadamente 5 °C o al menos de aproximadamente 7 °C.
14. Un método para mantener un plásmido en una E. coli recombinante que comprende la inserción de un plásmido recombinante en una célula de E. coli recombinante en donde
- dicha célula de E. coli recombinante comprende un gen de E. coli esencial codificado genómicamente cuya expresión está regulada por una secuencia líder aguas arriba no asociada de forma nativa con dicho gen de E. coli esencial, donde dicha secuencia líder aguas arriba tiene la función de ser un interruptor térmico que sustancialmente no permite el crecimiento a una primera temperatura pero permite el crecimiento a una segunda temperatura, y
- dicho plásmido recombinante comprende un gen de E. coli esencial que codifica una proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma función que dicho gen de E. coli esencial codificado genómicamente por dicha célula de E. coli lo que permite así, el crecimiento a ambas temperaturas.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha célula de E. coli recombinante es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4-13.
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