RS61138B1 - Tolerogena dnk vakcina - Google Patents

Tolerogena dnk vakcina

Info

Publication number
RS61138B1
RS61138B1 RS20201421A RSP20201421A RS61138B1 RS 61138 B1 RS61138 B1 RS 61138B1 RS 20201421 A RS20201421 A RS 20201421A RS P20201421 A RSP20201421 A RS P20201421A RS 61138 B1 RS61138 B1 RS 61138B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
plasmid
antigen
sequence
tgf
dna
Prior art date
Application number
RS20201421A
Other languages
English (en)
Inventor
Jay Chaplin
Michael Wijaranakula
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Priority claimed from PCT/EP2017/077949 external-priority patent/WO2018083111A1/en
Publication of RS61138B1 publication Critical patent/RS61138B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1841—Transforming growth factor [TGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2066—IL-10
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/495—Transforming growth factor [TGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55533—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/577—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 tolerising response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na tolerogene DNK imunoterapijske vakcine za smanjenje antigen-specifične T ćelijske reaktivnosti.
STANJE TEHNIKE
Prema tradicionalnim pristupima vakcinama, prečišćeni protein/antigen se ubrizgava u osobu/pacijenta /životinju kako bi se stimulisali imuni odgovori specifični na taj protein/antigen. Ovaj pristup vakcini ima tendenciju da prvenstveno utiče na proizvodnju antitela, dok T ćelije obično nemaju značajan uticaj, osim što generišu memoriju antigena u T ćelijama. Tradicionalni pristupi vakcinama se stoga ne smatraju pogodnim u vezi sa lečenjem i/ili prevencijom oboljenja uzrokovanih T ćelijama kao što je npr. dijabetes tipa 1 (T1D), jer se aktivacija T ćelija, posebno CD8<+>T ćelija smatra uzročnikom ove bolesti. Eksperimentalni pristupi sa tolerogenim vakcinama na bazi proteina cilјaju prvenstveno B ćelije koje proizvode antitela, a ne T ćelije relevantne za bolest.
Vakcine zasnovane na DNK, za razliku od vakcina zasnovanih na proteinima, obično su plazmidi koji kodiraju određene antigene - ove plazmide zauzimaju ćelije u telu domaćina („transfektovane“). Ove transfektovane ćelije domaćina zatim proizvode antigen i obrađuju antigen u male fragmente (epitopi T-ćelija) radi prezentacije imunološkom sistemu, posebno cirkulišućim T ćelijama. Kako T ćelije mogu da otkriju samo ove male fragmente antigena, a ne i cele proteine, ovaj pristup preferencijalno dovodi do modifikacije odgovora T ćelija, posebno za CD8<+>T ćelije (ili citotoksične T ćelije), klјučnih pokretača npr. T1D patologije. Dakle, DNK vakcine su, više nego proteinske vakcine, pogodne za indukovanje odgovora T ćelija. Iako trenutno nijedna DNK vakcina nije dostupna za humanu upotrebu, postoje tri stimulativne plazmidne DNK vakcine koje imaju dozvolu za veterinarsku upotrebu, indukujući imunitet na virus konjske infektivne anemije, virus zapadnog Nila i određene vrste raka kod pasa.
Za razliku od stimulativnih DNK vakcina, tolerogene DNK imunoterapijske vakcine namenjene su suzbijanju imune reaktivnosti prema antigenu, umesto aktiviranju imunoloških odgovora na njega. Ove vakcine ne stimulišu imunitet protiv kodiranog antigena ili menjaju vrstu stimulacije (kao što su npr. pristupi antigenskoj desenzibilizacionoj vakcinaciji za alergije), već uzrokuju iscrplјivanje i/ili nedostatak funkcije i/ili smrt samoreagujućeg T ćelije. Da bi se to postiglo, antigen mora biti predstavlјen imunološkom sistemu bez kostimulacije ili zapaljenskih efekata, koji bi inače bili glavni stimulativni imunološki odgovori. Ovaj pristup predstavlјanja antigena koji imuni sistem ignoriše ili toleriše mogao bi biti od koristi u lečenju autoimunih bolesti, jer bi specifični mehanizam bolesti na taj način bio usmeren umesto da sistemski suzbija celokupni imuni odgovor. Tolerogena DNK imunoterapijska vakcina je stoga blaga metoda modulacije neželјenih imunoloških odgovora.
Krajnji cilј tolerogene DNK imunoterapijske vakcine specifične za T1D je očuvanje funkcije beta ćelija i endogene proizvodnje insulina. To se može dogoditi prevencijom ili odlaganjem bolesti (posebno dragoceno u pedijatrijskim i mlađim odraslim grupama gde je nadgledanje otežano, a „normalnost“ života je glavni pokretač pacijenta) ili produženjem „faze medenog meseca“ minimalnog praćenja i upotrebe insulina koji često se javlјa prvih šest meseci nakon dijagnoze T1D.
Gottleib et al. (Clin Immunol 2013; 149:297-306) opisuje tolerogenu DNK vakcinu za sprečavanje ili lečenje T1D korišćenjem plazmida koji sadrže insulinski antigen i citokin (IL-10). Dalјe se predlaže da se mogu dodati dodatni plazmidi koji kodiraju supresivne citokine, npr. IL-4 ili IL-10. Solvason et al. (J Immunol 2008; 181:8298-8307) stavlja na uvid javnosti da je plazmidna DNK vakcina koja kodira mišji proinsulin II smanjila učestalost dijabetesa u mišjem modelu T1D. WO2012/062697 otkriva kombinaciju molekula koji inhibira IL1beta i tolerogenu DNK vakcinu protiv T1D autoantigena. Cailin et al. (J Diabetes Res 2016; 1-12) stavlja na uvid javnosti da su miševi koji su primali kombinacije plazmida bili zaštićeni u većoj meri nego bilo kojim pojedinačnim plazmidima, uklјučujući samo proinsulin. Torres-Aguilar et al. (J Clin Immunol 2010; 30;659-688) pokazuje izvodljivost da monocitno izvedene IL-10 / TGF dendritične ćelije indukuju antigen-specifičnu toleranciju u efektorskim / memorijskim T ćelijama generisanim tokom autoimune bolesti, ali nije povezana sa plazmidima ili DNK vakcinama. Nijedna od ovih referenci nije opisala jedan plazmid koji kodira sve i i) insulinski antigen, ii) TGF-beta, iii) IL-10 i iv) IL-2 niti da se postiže pobolјšana efikasnost suzbijanja T1D bolesti bez ugrožavanja bezbednosti.
Iako je poznato da su vakcine zasnovane na DNK sigurne, nijedna (stimulativna ili tolerogenska) DNK vakcina koja je testirana u kliničkim studijama nema dovolјnu snagu kao samostalni pristup za lečenje npr. T1D.
Tolerogene DNK vakcine poznate u tehnici pokazale su malu efikasnost i obično su zahtevale visoko veštačke sisteme da izazovu želјene efekte. Stoga u struci postoji potreba za tolerogenim DNK imunoterapijskim vakcinama sa značajno povećanom potentnošću, bez ugrožavanja sigurnosnog profila, a poželјno i bez potrebe za neprikladnim režimom primene.
KRATAK PRIKAZ
Predmetni pronalazak se odnosi na multicistronski vektor/plazmid koji koeksprimuje/kodira ćelijski zadržani antigen, kao što je insulin, kao i izlučene imunološke modifikatore kao što su TGF-β, IL-10 i IL-2. Predmetni pronalazak se dalјe odnosi na DNK imunoterapijske vakcine koje sadrže takve plazmide kao i takve farmaceutske formulacije i njihove komplete. Predmetni pronalazak se konačno odnosi na medicinsku upotrebu takvih proizvoda kao i na postupke za proizvodnju takvih plazmida.
Ovde plazmidi/imunoterapijske DNK vakcine imaju terapeutski potencijal u lečenju autoimunih bolesti koje su uglavnom pokretane T ćelijama, kao što je npr. dijabetes tipa 1 (T1D).
U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje plazmid koji kodira:
i. antigen insulina;
ii. TGF-β;
iii. IL-10, and
iv. pri čemu dati plazmid dalјe pokreće ekspresiju Interleukina-2 (IL-2).
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1. Kružna mapa plazmida.
Slika 2. mapa iRNK i translacione proteinske materije za vektorske proizvode plazmida sa slike 1.
Slika 3. Stabilnost raspadanja plazmida na tri prolaza za ubrizgavanje pomoću igle G30. Slika 4. Potvrda fenotipa zadržavanja plazmida rastom na 30°C (pasusi 1-50 korišćenjem 17-časovne inkubacije i pasusi 51-100 korišćenjem 22-časovne inkubacije).
OPIS
Pronalazač predmetnog pronalaska je ovde obezbedio jedan vektor koji pokreće ekspresiju višestruko sekretovanih citokina, kao i ćelijski zadržani antigen, iz jednog promotora / multi-cistronske mRNK.
DNK imunoterapijska vakcinacija sa jednim vektorom koji kodira sve komponente terapije u jednoj ćeliji je visoko poželјna u odnosu na imunoterapijsku vakcinaciju mešavinom odvojenih vektora / plazmida, od kojih svaki pokreće eksprimovanje pojedinačnih komponenti, jer nasumična transfekcija ćelija sa različitim vektorima ne garantuje eksprimovanje svih komponenti, ili čak bilo koji određeni odnos komponenti, iz date, specifične transfektovane ćelije.
Transfekcija pojedinačnog multicistronskog plazmida / vektora rezultira specifično projektovanim lokalnim okruženjem / mikro-okruženjem oko transfektovane ćelije. Na taj način, antigenu se mogu dodati kombinacije imuno-modulatora tako da pojačavaju želјeni imunološki efekat pojedinačnih T ćelija bez potrebe za visokim sistemskim dozama imunomodulatora koje bi inače mogle da izazovu neželјene efekte i široku imunosupresiju.
Ovo lokalno ograničenje proizvodnje imuno-modulatora ćelija domaćina transfektovanih DNK imunoterapijskom vakcinom omogućava sigurnu upotrebu visoko potentnih citokinskih hormona, koji su sinergistički za modifikaciju odgovora T ćelija, ali se ne mogu dozirati dovolјno često da bi se postigao efekat, i/ili titrirati da daju želјeni odgovor, bez neprihvatlјivih neželјenih efekata.
Na primer, za Interleukin-10 (IL-10) i Transformišući faktor rasta-beta1 (TGF- β1) poznato je da mogu da indukuju regulatorne T ćelije (Tregs) iz nativnih CD4<+>T ćelija. Međutim, kombinacija IL-10 / TGF- β1 pruža sinergijski efekat (15 do 20 puta efikasniji) u indukovanju Treg nego bilo koji od dva citokina samostalno (US6083919 A) i ova kombinacija dalјe rezultira imunološkom tolerancijom u široj populaciji cilјnih ćelija od bilo kog citokina samostalno (Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ, et. al. 1999 J Immunol.
163(7):3684-91).
Pored toga, poznato je da Interleukin-2 (IL-2) proširuje i stabilizuje Treg, ali s druge strane takođe može doprineti inflamatornim (upalnim) odgovorima. Kombinacija IL-2 i IL-10, međutim, rezultira supresivnim Treg-om, a ne inflamatornom stimulacijom. Kako se cirkulišuće T ćelije susreću sa ćelijama koje su ovde transfektovane DNK imunoterapijskom vakcinom, privremeno su izložene neoptimalnim koncentracijama IL-10 i IL-2. Cirkulirajuće T ćelije su blago pristrasne prema toleranciji, a ako su takođe reaktivne prema koekspresprimovanom antigenu (npr. insulinu), vezaće se za transfektovanu ćeliju i na taj način će dobiti duže trajanje izloženosti imuno-modulatoru, a pored toga primiće još jedan signal koji ih programira / preobučava za supresivne efekte. Na taj način, one T ćelije koje reaguju na kodirani antigen selektivno se preobučavaju u supresivni fenotip kada naiđu na transfektovanu ćeliju.
Plazmidi/vektori/DNK imunoterapijske vakcine su ovde prema tome dizajnirani za indukciju antigena specifičnih Treg-a koji se akumuliraju na mestima autoimunosti da bi prigušili bolest (npr. pankreas kod T1D), umesto da direktno utiču na bolest putem eksprimovanih citokinskih hormona.
Pored antigena (insulin u primeru T1D), vektor / operon / plazmid ovde kodira najmanje dva citokina (npr. TGF-β1 i IL-10) koji zajedno sinergijski potiskuju ćelije koje predstavlјaju antigen, kao i funkciju T ćelija, i pokreću indukciju Treg-a. Ovaj efekat je pojačan ako se, takođe, javlјa u kombinaciji sa efikasnom izloženošću antigenu.
U jednoj realizaciji, TGF-β1 je u konstitutivno aktivnom obliku koji ne zahteva obradu ili upalno okruženje za funkcionisanje. Iako se Treg-ovi mogu proizvesti iz nativnih T ćelija izlaganjem antigenu i TGF-β1, Treg su, međutim, „plastični“, što znači da mogu da se diferenciraju i pretvore u Th17 efektorske ćelije, a zatim da izazovu više, a ne manje, autoimunog uništavanja. Kombinacija IL-10 sa TGF-β1, pored toga što je snažniji imunomodulator, potiskuje okuženje koje bi proizvodilo patogene Th17 ćelije, umesto Treg.
U jednoj realizaciji, multicistronski vektor ovde, takođe, kodira IL-2 pored antigena, TGF- β1, IL-10. IL-2 proširuje Treg brojeve i stabilizuje njihov fenotip (sprečava Treg ćelije da diferentuju u efektorske T ćelije) i na taj način povećava njihov funkcionalni životni vek u upalјenim cilјnim tkivima.
Ova tri citokina (TGF-β1, IL-10 i IL-2), u kombinaciji sa antigenom, imaju dobro poznata sinergijska dejstva za indukovanje tolerancije sledećim mehanizmima: (i) značajno pojačano generisanje antigen-specifičnih supresivnih Treg-ova , (ii) duži životni vek Treg-a i (iii) veća efikasnost po pojedinačnoj Treg ćeliji u suzbijanju upale / auto-reaktivnosti. Međutim, potrebne koncentracije prečišćenog citokina koji se sistemski ubrizgavau imale bi niz ozbilјnih, ili čak smrtonosnih, neželјenih efekata, kao što su: (i) letalna fibroza zbog viška TGF- β1, (ii) simptomi slični gripu, (iii) sindrom kapilarnog curenja od viška IL-2, (iv) široka imunosupresija koja dovodi do hroničnih infekcija, (v) pojačani razvoj tumora kao i (vi) anemija od viška IL-10.
Koekspresijom ovih citokina iz istog vektora/plazmida, a samim tim i istom ćelijom koja predstavlјa antigen imunološkom sistemu, vektor postiže želјeno lokalno okruženje za indukciju tolerancije bez sistemskog delovanja i odgovarajućih neželјenih efekata koji bi inače nastali usled primena prečišćenih citokina u visokim dozama.
Injekcija „gole“/„ogoljene“ plazmidne/vektorske DNK (samo vektor i pufer) ima vrlo nisku stopu unosa i transfekcije - manje od jednog od oko 100.000 molekula plazmida transfektuje ćeliju, dok se ostatak razgrađuje i samim tim je bez ikakvih bioloških efekata. Ova izuzetno niska neefikasnost transfektovanja pruža bezbednosni mehanizam za distribuciju i ograničavanje transfektovanih ćelija.
Davanje sistemski aktivnih količina bilo kog od ovih citokina, bilo davanjem zrelih proteina ili transdukcijom virusnih vektora visoke efikasnosti, bilo bi teško, ako ne i nemoguće, titrovati za sigurnu i efikasnu dozu. Ograničavanje ukupne izloženosti vrlo maloj sistemskoj dozi raspoređenoj u nekoliko visoko ekspresivnih mikro-okruženja dovodi do izuzetno povolјnog profila bezbednosti i efikasnosti.
Kombinacija antigena i ova tri citokina ovde daje efikasnu zaštitu od razvoja T1D i čak se čini da je u stanju da stabilno preokrene napredovanje bolesti. Zbog niske efikasnosti transfektovanja ubrizgavanja golog DNK plazmida/vektora, vrlo mali broj ćelija proizvodi ove rekombinantne proteine i stoga nema zabeležive promene u nivou citokina u serumu iz citokina kodiranih plazmidima/vektorima - a samim tim ni imune stimulacije ili imuno-supresije koja se detektuje prema bilo kom drugom antigenu osim antigena kodiranog plazmidom/vektorom (pre-proinsulin). To rezultira poželјnim sigurnosnim profilom.
Obično se DNK vakcine loše ponašaju u vezi sa supkutanom (s.c.) injekcijom i zato se obično daju intramuskularnom injekcijom (često sa elektroporacijom) ili alternativno intradermalnim mlaznim ubrizgavanjem, što zahteva glomazan uređaj, kao i značajno održavanje i kalibraciju. Kako je većina problema sa neželјenim efektima kod intramuskularne injekcije povezana sa adjuvansom (iritacija na mestu ubrizgavanja), oni stoga ne predstavlјaju problem za ogoljeni format DNK imunoterapijske vakcine. Pored toga, ubrizgane količine su obično relativno male i stoga ne uzrokuju značajno rastezanje mišića i bol. U jednoj realizaciji, ubrizgane količine su 1 ml ili manje. U još jednoj realizaciji, ubrizgane količine su približno 0,6 ili 0,5 ml. Bez obzira na to, ovde se neočekivano čini da multicitokinski plazmid/vektor pruža zaštitu od T1D čak i kada se daje s.c. putem, omogućavajući tako više potencijalnih formata doziranja za pacijente.
Pored obezbeđivanja lokalne sinergije, kodiranjem sva tri ili četiri transkribovana proizvoda jednim plazmidom / vektorom i jednim promoterom, regulatorni teret i kriterijumi oslobađanja lekovite supstance su dodatno pojednostavlјeni obezbeđivanjem multicistronskog plazmida ovde.
Nasuprot tome, ako se svaki od proteinskih proizvoda proizvodi iz zasebnog plazmida, tada bi se sinergijska vrednost koekspresije iz iste transfektovane ćelije potencijalno izgubila ili smanjila, jer bi svako transfektovanje plazmida/vektora bilo nezavisan događaj, verovatno ciljajući različite ćelije. Ako se tri do četiri rekombinantna proteina proizvode iz dva, tri ili četiri pojedinačna plazmida/vektora, bilo koji sinergijski efekti u lokalnom okruženju transfektovane ćelije mogu se izgubiti; pored toga, bilo bi neophodno nekoliko pojedinačnih kliničkih ispitivanja (po jedno za svaki plazmid i svaku kombinaciju). Proizvodnja svih proteina iz jednog plazmida/vektora i jedne mRNK olakšava zahteve za testiranje više pojedinačnih molekula i određivanje idealnih odnosa kopakovanja svojstvenih višestrukom formatu plazmida/vektora.
Ovde se mogu koristiti bilo koji vektorski formati pogodni za ovaj pronalazak, kao što su plazmidi (replikacioni ili pasivni), mini-krugovi, linearni vektori (MiLV), virusni vektori (i integrišući [npr. lentivirusni] i neintegrišući [npr. adenovirusni]), kosmidi, bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi čoveka (HAC), itd.
Dalјe, ovde se može koristiti bilo koja dozvolјena metoda za pobolјšanje transfektovanja: npr. elektroporacija, sonoporacija (ultrazvučno pojačanje, sa ili bez pojačanja kontrasta mikromehurića), lipidni/polimerni agregati, hidrodinamika (pritisak velikom zapreminom ubrizgavanja), biobalistika / genska puška (taloženje kroz kožu komprimovanim gasom), itd.
U jednoj realizaciji, ovde se koristi nereplicirajuća epizomalna plazmidna DNK zbog: i) višestrukih kopija mRNK izvedenih iz jednog transfektovanja plazmida i ii) proširene stabilnosti i funkcije plazmidnih nukleinskih kiselina u odnosu na mRNK i druge DNK formate vektora. Dakle, dok ekspresioni sistemi zasnovani na i mRNK i DNK mogu da obezbede unutarćelijsku isporuku i kolokalizaciju, sistemi zasnovani na plazmidima pružaju veću kontrolu i trajnost doziranja.
U jednoj realizaciji, plazmidi/vektori kodiraju četiri proteina:
i) antigen,
ii) TGF beta 1 (TGF- β 1),
iii) Interleukin-10, i
iv) Interleukin-2.
U jednoj realizaciji, antigen je endosomno cilјani T1D relevantan antigen, kao što je insulin ili GAD65. Endosomno cilјanje se može izvršiti preko npr. fuzija li / CD74, fuzija LIMPII/SCARB ili fuzija receptora transferina.
U jednoj realizaciji, TGF-β1 je u aktiviranom obliku.
Ekspresija četiri proteina iz jednog plazmida/vektora je moguća npr. ako su želјene sekvence odvojene ili A) odvojenim promotorima, B) IRES (interno mesto za ulazak u ribozome) sekvencama koje regrutuju novi ribosom za transkribovanje svakog segmenta ili C) virusne 2A sekvence (npr. sekvence FMDV 2A ili TaV 2A) koje se transkribuju i izazivaju ribozomsku pauzu / preskakanje što rezultuje proizvodnjom odvojenih polipeptida iz jednog otvorenog okvira za čitanje. Međutim, u praksi je svaka od ovih strategija složena i teško ju je omogućiti.
Ekspresija četiri nezavisna proteina iz jednog plazmida / vektora najlakše se postiže ako se za svaki gen ima odvojeni promoter. Međutim, ovaj format ima značajne nedostatke u tome što A) rezultira vrlo velikim, nestabilnim i teškim za proizvodnju plazmidom zbog prekomerne dužine višestrukih promotera, B) rezultira nepredvidlјivim ponašanjem transkribovanih proteina jednog prema drugom (oni više se ne proizvode u fiksnim odnosima jedni prema drugima), C) svaki promoter se može nezavisno utišati, što dovodi do selektivnog eksprimovanja nekih gena, ali ne i drugih potrebnih za potpunu efikasnost, i D) nedostatak regulatorne jednostavnosti. Suprotno tome, IRES elementi i 2A sekvence deluju na nivoima mRNK i translacije i reproduktivno koeksprimuju fiksne odnose svakog proteina iz jednog promotera.
Svaka od četiri klase IRES elemenata ima različite zahteve za ko-faktorom za funkciju, kao i različite zahteve za sekvencu za nizvodni gen koji se transkribuje. Na primer, EMCV (EndoMioCarditis Virus) IRES je 630 bazni par tipa 1 IRES koji koristi sve eukariotske faktore inicijacije translacije, dok CrPv (virus paralize cvrčka) IRES je 200 bazni par tipa 4 IRES koji nema potrebne kofaktore, ali koristi nestandardni inicijacijski kodon.
Kada se koriste IRES elementi iz različitih klasa, oni ometaju jedni druge tako da se svaki tip IRES elementa može koristiti samo jednom u svakom plazmidu, a kada se koriste zajedno, različiti tipovi IRES elemenata međusobno se umanjuju (smanjenje efikasnosti) na načine koje je teško predvideti.
Dalјe, mešanje kombinacija gena / IRES rezultira nepredvidivim odnosima prevedenih proizvoda, jer interakcije gena sa IRES elementima nisu statične, već zavisne od konteksta od pratećih nukleotidnih sekvenci. Pored toga, IRES elementi nameću ograničenja na prvih nekoliko pozicija amino-kiselina na ili neposredno nakon inicijacije. Na primer, CrPv IRES zahteva da prva amino-kiselina bude alanin, a ne standardni metionin, a EMCV IRES ne mogu tolerisati P, W, C, R ili K amino-kiseline u prva tri kodona. U jednoj realizaciji, da bi se prilagodila ograničenjima N-terminalnih amino-kiselina nametnutim EMCV IRES, DNK vakcina sadrži tri alaninska produžetka na N-kraju IL-10 gena.
Pored toga, svaki IRES element sadrži značajan broj baznih parova, u rasponu od 230 bp do preko 700 bp; uklјučivanje višestrukih IRES elemenata tako povećava veličinu i složenost plazmida / vektora do te mere da mnogi postaju nestabilni i teško ih je industrijski proizvesti zbog spontanih delecija i rekombinacija. Dalјe, zbog visokog stepena sekundarne strukture koju IRES elementi nameću transkribovanoj mRNK koja ih sadrži, povećavaju verovatnoću aktiviranja receptora za prepoznavanje patogena (Dabo S, Meurs EF. 2012 Viruses 4(11):2598-635.) u transfektovanoj ćeliji i proizvode stimulativne efekte suprotno predviđenoj indukciji tolerancije.
2A sekvence, za razliku od IRES elemenata, ne međusobno deluju i stoga pružaju stabilne i dosledne performanse. Međutim, one se same transkribuju i stoga utiču na savijanje, funkciju i stabilnost konačnih transkribovanih proteinskih proizvoda. Sve 2A sekvence rezultuju značajnom C-terminalnom fuzijom (19-22 aa) na 5’ kraju sekvenci koje treba razdvojiti i takođe započinju 3’ sekvencu prolinom. Neki proteini dozvolјavaju ove modifikacije, a neki ne, što dovodi do praktičnih ograničenja u upotrebi 2A sekvenci. Na primer, proizvod Interleukin-10 dozvolјava rep 2A, ali i Interleukin-2 i TGF-β1 se pogrešno preklapaju i gube funkciju ako se eksprimuju uzvodno od oznake 2A. Prema tome, iako je moguće eksprimovati nekoliko nezavisnih proteina odvojenih 2A sekvencama, dva od četiri proteina se ovde ne mogu završiti u 2A oznakama i zato se moraju koristiti druge strategije.
Kako svaki tip 2A sekvence amino-kiseline modifikuje ribozomsku funkciju tokom translacije proteina, imaće različitu efikasnost u dva osnovna svojstva porodice 2A, naime (i) razdvajanje jukstaponih genskih proizvoda i (ii) procesivnost (ponovno pokretanje) u drugi genski proizvod. Različite 2A sekvence imaju različitu efikasnost u generisanju ribozomske pauze koja razbija peptidnu kičmu (što rezultira u dva odvojena proteina), kao i različitu efikasnost u ponovnom pokretanju sinteze peptida drugog genskog proizvoda.
Sposobnost 2A sekvenci da razdvajaju proteinske proizvode i ponovo iniciraju translaciju proteina zavise od 2A sekvence amino-kiseline (Donnelly ML, Hughes LE, Luke G, et. al. 2001 J Gen Virol. 82(Pt 5):1027-41). Male varijacije u 2A sekvencama aminokiselina rezultuju značajno različitim smešama odvojenih i spojenih bočnih genskih proizvoda, u rasponu od ispod 5% (>95% sjedinjenih) do potpuno odvojenih (0% sjedinjenih ili 100% odvojenih).
Dalјe, pronalazač je ovde otkrio da susedne sekvence amino-kiseline koje kodiraju dva bočna proteinska proizvoda, takođe, utiču na efikasnost ponovnog pokretanja i razdvajanja 2A sekvenci, što dovodi do značajnih odstupanja od prijavlјenih rezultata. Efikasnost ponovnog pokretanja tako varira u zavisnosti od vrste 2A sekvence amino-kiseline koja se koristi, kao i od okruženja koje pružaju susedne sekvence amino-kiseline, pa će tako odnos pre-2A genskog proizvoda i razdvajanja proteina biti određen i upotreblјenom 2A sekvencom amino-kiseline i njenim kontekstom.
U jednoj realizaciji, „FMDV 2A“ je umetnut između sekvence kodiranja antigena i sekvence kodiranja TGF-β1 što rezultira 100% razdvajanjem, kao i odnosom 1:1, proteinskih proizvoda.
U još jednoj realizaciji, „TaV 2A“ se može umetnuti između IL-10 kodirajuće sekvence i IL-2 kodirajuće sekvence ovde, što rezultira sa oko 50% odvojenih proizvoda kao i odnosom 10 na prema 6 proteinskih proizvoda. Svaka transfektovana ćelija tako isporučuje relativno malu dozu Interleukina-2, koja nije u stanju da stimuliše efektorske T ćelije, i veću dozu Interleukina-10 da prikloni T ćelije ka Treg fenotipu. S obzirom na to da je proizvodnja fuzionisanog IL-10 / IL-2 nepovolјna, izvršeni su pokušaji da se poveća efikasnost cepanja na TaV 2A segmentu. Pokušaj da 2A segmentu prethodi „izolacioni segment“, koji je element koji proširuje transkribovanu regiju uzvodno od TaV 2A da bi se smanjio uticaj uzvodne sekvence na element 2A, nije pobolјšao razdvajanje. U drugačijem pokušaju da se reši problem fuzije, dodat je uzvodni odvojivi segment sa transkribovanom sekvencom proteina GSG; međutim, ovaj pristup rezultirao je samo postupnim pobolјšanjem efikasnosti cepanja.
Kao takve, fuzije citokina, nastali razdvajanjem gena koji kodiraju IL-10 i IL-2 pomoću TAV 2A, verovatno će biti imunogene,
U dalјoj realizaciji, vektor/plazmid ovde ima segment „P 2A“. Razdvajanje gena koji kodiraju IL-10 i IL-2 pomoću P2A rezultira potpunim ili gotovo potpunim odvajanjem
1
proteinskih proizvoda, kao i odnosom najmanje dvostruko većim (ili možda čak do četiri ili pet puta većim) IL-10 u poređenju sa IL-2.
Da bi se rešili nedostaci gore opisanih sistema samo za IRES i samo za 2A, ovde opisane četiri sekvence cDNK (antigen, TGF-β1, IL-10, IL-2) su postavljene u parovima pre i posle pojedinačnog IRES-a. Svaki par je dalјe odvojen 2A sekvencom, koja indukuje ribozomsko preskakanje i proizvodnju nezavisnih proteina iz svake sekvence u poliproteinskom paru. Kako TGF-β1 i IL-2 možda nisu na N-terminalnoj strani fuzije, jedan od njih mora završiti na centralnom IRES mestu, a drugi mora završiti transkribovani deo sekvence mRNK.
Hronologija / sekvenca eksprimovanih proteina i IRES / 2A elemenata ovde može, prema tome, biti sledeća: (i) Antigen, (ii) FMDV 2A, (iii) TGF beta 1, (iv) IRES, (v) IL-10, ( vi) P 2A i (vii) IL-2. Kao posledica, sva četiri proteina mogu se nezavisno eksprimovati iz jednog segmenta operona/gena na stabilan i predvidlјiv način. Kako se svaki od ovih proteina izražava iz jedne mRNK, odnosi svakog proizvoda su fiksni - na primer, nije moguće generisati višak IL-2 u odnosu na IL-10.
Pored upotrebe kombinacije IRES i 2A elemenata za odvajanje kodiranih gena, ovde bi alternativno rešenje moglo biti korišćenje dvosmernog promotera za generisanje 2 mRNK - ove mRNK bi svaka kodirala par proteina, a ne sva četiri u jednom molekulu mRNK. Stoga se ekvivalentni aranžmani mogu konstruisati korišćenjem parova ekspresionih kaseta odgovarajuće raspoređenih oko dvosmernog promotera sisara i korišćenjem razdvajanja 2A sekvenci i/ili IRES elemenata. Ovaj pristup je, međutim, povezan sa nedostacima, pre svega zbog velike veličine dvosmernih promotera, ali i potencijalnog povećanog regulatornog tereta sa odvojenim elementima mRNK koji su uklјučeni u jedan lek. Poželјne realizacije ovde, prema tome, koriste jednog promotera i kombinaciju IRES i 2A elemenata umesto dvosmernog promotera.
U teoriji, neke 2A sekvence mogu se zameniti unutarćelijskim endogenim sekvencama osetlјivim na proteazu. Međutim, pronalazač je ovde otkrio da su takve proteaze povezane sa značajnim nedostacima (npr. nedostatak prijavlјene funkcije koja rezultira lučenjem fuzionih proteinskih proizvoda).
Da bi se antigen mogao preraditi i predstaviti imunološkom sistemu u lokalnom okruženju citokinskih hormona kodiranih plazmidom, antigen se mora zadržati u transfekovanoj ćeliji. U slučaju dijabetesa tipa 1, proizvodnja aktivnog insulina potencijalno bi mogla dovesti do neželјenog smanjenja glukoze u krvi ako bi se on izlučio ili na neki drugi način oslobodio iz transfektovane ćelije.
Da bi se izbeglo lučenje antigena, bilo koji signali sekrecije mogu se ukloniti iz sekvence koja kodira antigen, npr. ukloniti sekvencu za kodiranje signala sekrecije iz sekvence nukleinske kiseline koja kodira pre-proinsulin, čime bi se stvorio proinsulin, a ne pre-proinsulin, omogućavajući tako da se antigen akumulira unutar transfektovane ćelije. Iako se ovaj prevedeni antigenski proizvod (npr. insulin) ne bi aktivno lučio, mogao bi se osloboditi tokom lize usled nekroze koja je posledica napada CD8<+>T ćelija. Pored toga, signalna sekvenca insulina je region za koji je poznato da sadrži epitope relevantne za bolest (koji potencijalno indukuju auto-imunitet), a uklјučivanje signalne sekvence stoga obezbeđuje širu indukciju tolerancije i veću verovatnoću smanjenja bolesti.
Pored toga, citoplazmatsko zadržavanje antigena omogućava samo obradu proteazom i prezentaciju putem MHC klase I, koji otkriva unutarćelijske patogene putem CD8<+>T ćelija. Kako CD4<+>T ćelije značajno doprinose pro-inflamatornim citokinima, a većina, ako ne i sve, autoimuno suzbijajuće Treg su CD4<+>, proširivanje prezentacije antigena na MHC klasu II, koju prepoznaju CD4<+>T ćelije može biti korisno.
Obrada MHC klase II i stimulacija CD4+ T ćelija obično ne uklјučuju unutarćelijski antigen, jer je pristup ovom putu putem endocitoze ekstracelularnog (vanćelijskog) antigena. Obično se proteinski proizvodi proizvedeni u transfektovanoj ćeliji predstavlјaju samo podrazumevanim unutarćelijskim / proteazkim procesnim putem i MHC klase I, što rezultira efektima CD8+ T ćelija, ali ne i efektima CD4+ T ćelija. Da bi se cilјale i CD4+ i CD8+ T ćelije za imunomodulaciju, poželјna realizacija takođe uklјučuje faktore koji dovode do prezentacije MHC klase II.
U principu, da bi se indukovala prezentacija MHC klase II, antigen se može fuzionisati sa bilo kojim partnerom koji usmerava fuziju u endozomni odelјak, ali postoje funkcionalne razlike u aktivnosti i izloženosti. Fuzije receptora za transferin, poznat i kao receptor proteina koji prenosi gvožđe, kruže od plazmatske membrane / vanćelijskog prostora do endozoma i stoga mogu, takođe, izložiti druge imune ćelije celom antigenu, poput B ćelija, makrofaga itd. LimpII/SCARB fuzije ciljaju direktno na endozom, ali prvenstveno na rani endozom i ponekad rezultiraju prekomernom preradom i potpunim uništenjem antigena. Fuzije li (CD74), koristeći isti signal šaperona koji MHC klasa II koristi za kasnu lokalizaciju endozoma, dostavlјaju antigen i MHC klase II do istih vezikula u istoj razvojnoj fazi i povećavaju verovatnoću efikasnog predstavlјanja antigena u kontekstu MHC klase II. Pored toga, čak i sa endosomskim sortiranjem iz Ii fuzija, sekvenca sekrecije preproinsulina mora biti učinjena neaktivnom ili bi se antigen, takođe, izlučio i izgubio pre obrade.
Blokada sekrecije insulinskog antigena ovde je alternativno postignuta mutiranjem dve amino-kiseline potrebne za uklanjanje oznaka sekrecije pomoću SRP (čestica za prepoznavanje signala) na grubom endoplazmatičnom retikulumu. Mutacije Ala (A) u Glu (E) u potpunosti ukidaju sazrevanje i sekreciju pre-proinsulina, istovremeno zadržavajući potrebnu epitopsku strukturu antigena za najbolјu indukciju tolerancije.
U jednoj realizaciji, ovde se koristi plazmidna DNK vakcina. Plazmid se uzgaja/replicira, na primer u E. coli, i izoluje / prečišćava iz medijuma, a zatim je formulisan u tečnim formulacijama, npr. vode, fiziološkog rastvora, PBS tečnih formulacija ili kao liofilizovani prah za intrademalno injektiranje, intranazalno davanje ili inhalaciju. U jednoj realizaciji, plazmid ovde je formulisan u vodenoj farmaceutskoj formulaciji koja opciono sadrži stabilizatore. Bilo koji pogodan mikrobni sistem može se koristiti za proizvodnju plazmida.
Stabilizatori u formulaciji uklјučuju helatna sredstva, kao što su EDTA, EGTA ili DPTA za uklanjanje Mg<++>i Fe<+++>koji inače mogu biti uklјučeni u razgradnju DNK i/ili citrat, koji štiti plazmid od nespecifičnih efekata razgradnje. U jednoj realizaciji, plazmid ovde može biti formulisan u izotoničnom PBS ili alternativno TRIS citrat EDTA. Prednost takvih plazmida je što su stabilni, jednostavni za proizvodnju i što su sigurni i pogodni za upotrebu.
U još jednoj realizaciji, sredstva za isporuku, kao što su virus, lipidi, lipozomi, kopakovanje itd., mogu se dodati u vezi sa ovim pronalaskom. Međutim, ovde upotreba sredstva za isporuku može imati potencijalne probleme sa imunitetom, virusnom integracijom, itd.
Definicije
Antigen: DNK imunoterapijska vakcina ovde kodira antigen. Ovde antigen može biti bilo koja vrsta proteina povezanih sa imunogenom bolešću ili njegov fragment koji može da prepozna komponenta T ćelije imunog sistema. Na primer, u slučaju lečenja ili prevencije dijabetesa tipa 1, može se koristiti insulinski antigen. U jednom primeru, insulinski antigen je InsB 9-23 imunodominantni peptid. Za vakcine za DNK imunoterapiju protiv multiple skleroze, ovde se kao antigen mogu koristiti mijelinski bazični protein (MBP), mijelinski oligodendrocitni protein (MOG) i/ili antigen proteolipidnog proteina (PLP). Slične sekvence kodiranja proteinskih antigena za reprezentativne antigene iz alopecije, polimiozitisa / dermatomiozitisa, celijakije i proteinskih alergena (npr. protein kikirikija ara h 2) su, takođe, primeri antigena pogodnih za upotrebu u ovde datim DNK imunoterapijskim vakcinama.
Cilјanje antigena: U jednoj realizaciji, antigen ovde je endozomski cilјan. Ovde antigeni uklјučuju ceo protein, pre-proteine sa nedostatkom sekrecije ili njihov funkcionalni ili imuno-dominantni peptidni fragment.
1
Na primer, insulinski antigen ovde je antigen za upotrebu u imuno-modulacionoj terapiji a ne sredstvo za snižavanje glukoze. Stoga ga ne bi trebalo u potpunosti da je obrađen / sazreo ili izlučen da bi se obezbedilo da je predstavlјen na molekulima MHC cirkulatornim T ćelijama. DNK imunoterapijska vakcina ovde ne rezultira povećanim nivoom insulina u krvi, već rezultira povećanom prezentacijom antigena imunološkom sistemu, posebno T ćelijama.
Stoga, insulinski antigen ovde može biti mali imuno-dominantni peptid koji kodira fragmente (npr. peptid lanca 9-23 insulina B, uklјučujući peptide pomerenog registra koji pokazuju ekvivalentne epitope T ćelija), ceo proinsulin, kome nedostaje potrebna sekvenca sekrecije, ali na neki drugi način netaknut, ili pre-proinzulin muteini koji sadrže sekvencu sekrecije, ali su modifikovani da spreče sekretornu funkciju.
Primeri insulinskih antigena ovde uklјučuju:
Mišji proinsulin (SEQ ID NO 1): FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEG SLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Humani proinsulin (SEQ ID NO 2):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQ PLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Modifikovani mišji pre-proinsulin koji se ne luči (supstitucije u odnosu na wt preproinzulin prikazane podeblјano i podvučeno (SEQ ID NO 3)): MALWMRLLPLLALLALWGPDPEQEFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDL QVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Modifikovani humani pre-proinsulin koji se ne izlučuje (supstitucije u odnosu na wt pre-proinzulin prikazane podeblјano i podvučeno (SEQ ID NO 4)):
MALWMRLLPLLALLALWGPDPEQEFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Mišji wt pre-proinsulin (SEQ ID NO 5): ALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQ VGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Humani wt pre-proinsulin (SEQ ID NO 6):
MALWMRLLPLLALLALWGPDPAQAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR REAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Insulinski peptid „InsB 9-23“ identičan kod miša i čoveka:
SHLVEALYLVCGERG (SEQ ID NO 7)
Modifikovani InsB 9-23 (supstitucije u odnosu na wt InsB 9-23 prikazane podeblјano i podvučeno (SEQ ID NO 8) i (SEQ ID NO 27)):
SHLVEALYLVCGEEG and SHLVEALYLVCGGEG
Ovde navedeni antigeni insulina mogu se akumulirati u citozolu transfektovane ćelije domaćina i na taj način se mogu predstaviti putem MHC klase I ili se osloboditi nakon citolize.
Endozomno cilјanje koje rezultira prezentacijom MHC klase II se ovde može postići fuzijom antigenske sekvence sa vodećim sekvencama koje formiraju transmembranske segmente sa citoplazmatskim “YXXØ” sekvencama, u kojima je Y tirozin, X je bilo koja amino-kiselina, a Ø je glomazna hidrofobna amino-kiselina kao što su triptofan ili izoleucin, „[DE]XXXL[LI]“ gde su D i E asparaginska ili glutaminska kiselina, tim redosledom, dok su L i I leucin i izoleucin, ili „DXXLL“ signali za endozomsko / lizosomsko sortiranje, koji su podvučeni u sledećim primernim sekvencama. Proteinski domeni koji uklјučuju ove signale i prema tome cilјaju ili kruže do endozoma / lizozoma, uklјučuju: receptor za transferin, Limpll ili CD74, takođe poznat kao Nepromenljivi lanac, MHC II šaperon ili Ii, ili bilo koji sličan domen.
Primeri domena endozomskog cilјanja ovde uklјučuju:
Domen endozomskog cilјanja mišjeg CD74 / nepromenlјivog lanca (Ii) (SEQ ID NO 9):
MDDQRDLISNHEQLPILGNRPREPERCSRGALYTGVSVLVALLLAGQATTAYFLYQ QQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
Domen endozomskog cilјanja humanog CD74 / nepromenlјivog lanca (Ii) (SEQ ID NO 10):
MHRRRSRSCREDQKPVMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFS ILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTITSQNLQLESLRMKLP
Dijabetes tipa 1: Smatra se da je dijabetes tipa 1 (T1D) hronična autoimuna bolest, gde se autoagresivne T ćelije infiltriraju u Langerhansova ostrvca u pankreasu i igraju važnu ulogu specifičnim uništavanjem populacije beta-ćelija koje proizvode insulin. Jednom kada je značajan broj ćelija ostrvaca uništen, smanjene količine insulina ili uopšte bez njega rezultiraće nedostatkom insulina i hiperglikemijom kod pacijenta. Pacijenti sa T1D stoga nisu u stanju da proizvedu dovolјno insulina i potrebne su im redovne injekcije hormona tokom čitavog života. Nekim pacijentima sa dijabetesom tipa 1 dijagnostikuje se „dijabetes tipa 1.5“, „latentni autoimuni dijabetes“/LADA, „dvostruki dijabetes“ itd., koji su oboljenja dijabetesa sa simptomima kako dijabetesa tipa 1, tako i tipa 2 – sva oboljenja dijabetesa koja nose tragove i dijabetesa tipa 1 i tipa 2 su tako takođe ovde sadržana u izrazu „dijabetes tipa 1“.
1
Tolerogena DNK vakcina: Ovde date imunoterapijske vakcine / vektori / plazmidi zasnovani na DNK dizajnirani su da isklјuče ili regulišu smanjivanje dela imunološkog sistema odgovornog za uništavanje normalnih zdravih „sopstvenih“ ćelija i tako spreče ili pobolјšaju autoimunost zasnovanu na T ćelijama.
Izraz „DNK imunoterapijska vakcina“ kako se ovde koristi, podrazumeva jedinjenje ili kompozicija koja sadrži molekul DNK i koja se daje subjektu kako bi se smanjio rizik od navedenog subjekta da razvije jednu ili više bolesti.
U nekim realizacijama, imunoterapijske vakcine zasnovane na DNK ovde su plazmidi/vektori koji kodiraju određene antigene. Nakon vakcinacije, ovi plazmidi se uzimaju, drugim rečima, transformišu u ćelije koje predstavlјaju antigen u telu domaćina. „Transfektovane“ ćelije domaćina tada proizvode antigen i prezentuju male fragmente antigena imunološkom sistemu, posebno T ćelijama. Ovaj pristup dovodi do modifikacije specifičnih odgovora T ćelija na kodirani antigen, kao i do minimalne modifikacije imunih odgovora na druge (nekodirane ili „nebitne“) antigene. Samo nekoliko ćelija domaćina se obično transformiše sa DNK vakcinskim plazmidom/vektorom ovde, što znači da verovatno manje od jednog od sto hilјada, jednog od petsto hilјada ili čak manje od jednog od milion molekula plazmida/vektora na kraju uđe u ćeliju domaćina. DNK vakcine ovde predstavlјaju veoma blag i specifičan pristup za moduliranje imunološkog odgovora na antigene kao što je insulin kod pacijenata sa T1D ili pacijenata sa rizikom od razvoja T1D.
Plazmid: Plazmid je mali molekul DNK koji se najčešće nalazi u bakterijama kao mali, kružni, dvolančani molekul DNK. Veštački plazmidi se široko koriste kao vektori u molekularnom kloniranju, služeći da pokrenu replikaciju rekombinantnih sekvenci DNK unutar organizama domaćina. Plazmidi se mogu konstruisati tako da budu pogodni za upotrebu kao DNK imunoterapijske vakcine. Plazmidi se smatraju replikonima, jedinicom DNK sposobnom da se autonomno repliciraju unutar odgovarajućeg domaćina. Plazmidi se mogu preneti sa jedne na drugu bakteriju, koja može biti iste ili različite bakterijske vrste kroz tri glavna mehanizma: transformaciju, transdukciju i konjugaciju. DNK vakcinske plazmide ćelija domaćin može da preuzme pasivnom transformacijom - obično relativno malom brzinom. Ovde navedeni plazmidi se efikasno repliciraju - ali ne podstiču ekspresiju proteina - u bakterijama. Ovde navedeni plazmidi dalјe pokreću ekspresiju proteina - ali ne i replikaciju plazmida - kod lјudi i drugih sisara, npr. miševa. U jednoj realizaciji, pVAX1 vektor (Invitrogen / LifeTechnologies) se ovde koristi kao kostur za umetanje elemenata koji su deo ovog pronalaska. Ostali pogodni vektorski kosturi ovde uklјučuju bilo koju vektorsku kičmu koja sadrži eukariotski promoterski element, prokariontsko poreklo replikacije u velikom broju kopija i sistem za selekciju za održavanje plazmida.
1
Selekcioni gen i sistem selekcije: U jednom aspektu, DNK imunoterapijske vakcine sadrže selekcioni gen / selekcioni marker u proizvodne svrhe. Marker koji se ovde može izabrati je npr. gen koji prenosi otpor na ćelijski toksin - npr. antibiotik kao što su ampicilin, kanamicin, hloramfenikol, streptomicin, itd.
Ostale vrste pogodnih sistema za odabir ovde uklјučuju npr. uslovne letalne sisteme za prigušivanje (npr. sistemi CcdA/CcdB ili ParD/ParE Hok/Sok) ili sekvence koje dopunjuju genomski defekt u soju proizvodne ćelije i na taj način omogućavaju rast inače neodrživog domaćina (npr. dapD<->ili pyrF<->auksotrofna komplementacija, infA<->komplementacija inicijacije translacija, itd.)
Proizvodne ćelije koje sadrže plazmid/DNK vakcinu, što uklјučuje selekcioni marker, preživeće kada su izložene toksinu/antibiotiku/stanju, dok će one koje nisu uspele da zauzmu sekvence plazmida umreti. Kao takve, u jednoj realizaciji, DNK vakcine ovde sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker kako bi se obezbedio veći prinos / čistoća i efikasnija proizvodnja / replikacija u proizvodnim ćelijama, kao što je npr. E.coli.
Iako je odabir antibiotika uobičajena laboratorijska strategija, možda postoje prednosti povezane sa sistemima za odabir bez antibiotika - npr. u odnosu na efikasnije regulatorne procese. Iako se ovde mogu koristiti i vektori koji ne sadrže mehanizam selekcije kao što su minikrugovi, sintetički linearni vektori, itd., ove primene su povezane sa određenim nedostacima u proizvodnji, posebno zbog povećanih troškova proizvodnje i kontrole kvaliteta.
Primeri strategija komplementacije („spasavanja“) poznati su u stanju tehnike, međutim ove strategije trpe zbog različitih nedostataka.
Sistemi metaboličke komplementacije kao što su dapD [biosinteza lizina] ili pyrF [biosinteza uridina], često rezultiraju „ukrštanjem“ tokom proizvodnje velike gustine E.coli, gde će bakterija koja sadrži plazmid proizvesti i izlučiti višak potrebnog jedinjenja i na taj način „opustiti“ selekcioni pritisak za susedne bakterije bez plazmida.
Sledeći primer pogodnog sistema za selekciju ovde su plazmidi koji kodiraju esencijalne proteine, kao što je infA, koji kodira IF1 / inicijacioni faktor 1 koji je potreban za sintezu proteina. U ovom sistemu selekcije ne dolazi do unakrsnog hranjenja jer se protein infA ne luči. Međutim, nije moguće dalјe modifikovati plazmid ili proširiti ćelije sa nedostatkom plazmida, jer ne postoji način da se egzogeno dopunjuju potrebni protein / infA (J Bacteriol.1994 Jan;176(1):198-205 and J Biotechnol.2004 Jul 1;111(1):17-30).
Da bi se zaobišli nedostaci povezani sa sistemom za selekciju infA, ovde je obezbeđen alternativni sistem za selekciju sa osetlјivim na temperaturu translaciomnim prekidačem (ili „termosenzorom“) iz invazijskog proteindkog gena prfA od L. monocytogenes
1
(Cell. 2002 Sep 6;110(5):551-61). Postavlјanjem dela ukosnice u obliku sekvence „termosenzora“ RNK uzvodno od E.coli genomske kopije infA putem standardne tehnologije rekombinacije, njihovo eksprimovanje se reguliše kontrolom temperature fermentacije, omogućavajući polagani rast ćelija bez plazmida na 37 ̊C i brzu ćelijsku smrt na temperaturama <30 ̊C. Transformacija konstruisanog termo osetlјivog E.coli proizvodnog soja sa ekspresijom plazmida wt infA tako omogućavaju potpuno normalne stope rasta pri svim temperaturama, omogućavajući ekspanziju bez plazmida na 37 ̊C, kao i strogu selekciju za plazmid na 30 ̊C. Pored toga, ovaj sistem ne stvara selektivni pritisak za wtE.coli da zadrži plazmid i on se na taj način izgubi u kulturi u roku od 8 sati - ne obezbeđujući postojanost terapijskog plazmida u sredini.
wt Sekvenca nukleotida E.coli infA (SEQ ID NO 11):
ATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCT AATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGG TAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGA CCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGA
wt E.coli IF1 sekvenca proteina koja je rezultat translacije gena infA (početni metionin / M nije uklјučen u fuziju prfA - (SEQ ID NO 12)):
MAKEDNIEMQGTVLETLPNTMFRVELENGHVVTAHISGKMRKNYIRILTGDKVTVEL TPYDLSKGRIVFRSR
E. coli proizvodne ćelijske linije koje se ovde koriste za proizvodnju DNK imunoterapijskih vakcinskih plazmida mogu na taj način da sadrže sledeću termo osetlјivu prfA nukleotidnu sekvencu:
wt L.monocytogenes prfA („termo senzorska ukosnica“) nukleotidna sekvenca (Shine Dalgarno podvučeno, ATG početak podeblјano - (SEQ ID NO 13)):
TGTAAAAAACATCATTTAGCGTGACTTTCTTTCAACAGCTAACAATTGTTGTTAC TGCCTAATGTTTTTAGGGTATTTTAAAAAAGGGCGATAAAAAACGATTGGGGGATGAGAA ATGAACGCTCAA
wtL.monocytogenes prfA sekvenca proteina (fuzionisana uzvodno od E.coli IF1 -rezultat translacije SEQ ID NO 13):
MNAQ
Poreklo replikacije („Ori“): Poreklo replikacije, koje se naziva i replikacijsko poreklo, je određena sekvenca u genomu na kojoj se započinje replikacija lanca DNK. U jednoj realizaciji, poreklo mesta replikacije ovde uklјučuje „pUC Ori“ koje omogućava replikaciju u bakteriji E. coli proizvodne ćelijske linije - ali ne u ćelijama domaćinima sisara, tj. ćelijama iz
1
tela vakcinisanog subjekta / osobe / pacijenta. Ostala pogodna porekla bakterijske replikacije ovde uklјučuju: R6K, pBR322, ColE1, pMB1, 15A, pSC101, itd. U jednom aspektu, poreklo replikacije ovde je verzija sa visokim udvajanjem koja daje visok odnos plazmida / biomase za efikasniju proizvodnju. Vektori koji ne sadrže poreklo replikacije, kao što su minikrugovi, sintetički linearni vektori, itd., takođe se ovde mogu koristiti.
Promoter: Promoter je regija DNK koja inicira transkripciju određenog gena. Promoteri se nalaze u blizini mesta početka transkripcije gena, na istom lancu i uzvodno na DNK, koji je prema 5’ regionu lanca u pitanju. Da bi se transkripcija odvijala, RNK polimeraza mora da se veže za DNK u blizini gena. Promoteri sadrže specifične sekvence DNK, kao što su elementi odgovora, koji pružaju sigurno početno mesto vezivanja za RNK polimerazu i za faktore transkripcije koji regrutuju RNK polimerazu. Transkripcioni faktori imaju specifične sekvence aktivatora ili represora koji se vežu za određene promotere i regulišu ekspresiju gena. Stoga promoteri predstavlјaju kritične elemente koji mogu da rade zajedno sa drugim regulatornim regijama, poput pojačivača, prigušivača, graničnih elemenata/izolatora, kako bi usmerili nivo transkripcije datog gena. Klasični promoter pokreće proizvodnju RNK sa jednim glasnikom (mRNK), dok dvosmerni promoteri ovde pokreću proizvodnju dve mRNK neposredno uz promoter, i uzvodno i nizvodno od promotera.
U jednoj realizaciji, ovde se koriste eukariotski promoteri. Eukariotski promoteri se ne moraju pokoravati pravilu jedan gen/jedan promoter, kao što je nekoliko virusnih promotera, kao i promoteri koji pokazuju široku ekspresiju (tj. nemaju uske specifičnosti tipa ćelija kao što je ekspresija samo sa neuronima). Primeri promotera ovde koji su sposobni da pokreću široku transkripciju velikih molekula multi-gena mRNK uklјučuju: virusni CMV odmah-rano (IE) i SV40 promoteri; endogeni promoteri EF1a, PGK1, Ubc i beta aktina; i sintetički promoteri kao što je CAG hibridni promoter. Postoje mnogi drugi pogodni promoteri sisara, a više ih se dizajnira pokušajima sintetičke biologije. Bilo koji promoter koji rezultira želјenim karakteristikama ekspresije u humanim ćelijama može se ovde koristiti u plazmidima DNK imunoterapijske vakcine.
Pojačivači: Pojačivači su DNK elementi koji povećavaju efikasnost promotera u stvaranju mRNK transkripata. Pojačivači u ovom tekstu mogu se podudarati (npr. pojačivač SV40 / promoter CMV) ili se ne podudarati. Ovde se može koristiti bilo koja pogodna kombinacija pojačivača / promotera za eukariotsku funkciju.
Početak eukariotske translacije: Početni niz eukariotskog prevoda obično se naziva konsenzusnim nizom „Kozak“. Kozak sekvencu na molekulu mRNK ribozom prepoznaje kao translaciono početno mesto odakle je protein kodiran. Eukariotski ribozom zahteva ovu sekvencu ili njenu varijaciju da započne translaciju proteina. Kozak sekvence su
1
degenerisane ili varijabilne i retko se podudaraju sa konsenzusnim sekvencama. U stvari, konsenzus Kozak sekvence su obično manje efikasne od varijanti divlјeg tipa izolovanih od mRNK sisara. Iako su slabe Kozak sekvence redovno izolovane od nativnih mRNK i verovatno igraju ulogu u translacionoj kontroli proteina sa malim obilјem, DNK imunoterapijske vakcine ovde poželјno kodiraju Kozak sekvencu srednje ili visoke efikasnosti. Primeri korisnih Kozak sekvenci ovde obuhvataju sledeću nukleotidnu sekvencu: gccRccATGG (SEQ ID NO 14), gde su malim slovima dati najčešći nukleotidi, ali mogu varirati dok su nukleotidi velikim slovima fiksirani (R je IUPAC kod nesigurnosti za A ili G baze), a ATG označava translaciono početno mesto metioninskog kodona na položaju 1.
Signal za sortiranje endozoma: Endozom je membranski ograničen odelјak unutar eukariotskih ćelija. Neki proteini se mogu transportovati do endozoma i tamo razgraditi u peptidne fragmente. Peptidni fragmenti mogu da se vežu za molekule MHC prisutne u endozomu da bi formirali MHC / peptidne komplekse, koji se naknadno mogu transportovati na ćelijsku površinu kako bi bili predstavlјeni cirkulišućim T ćelijama, posebno CD4<+>T ćelijama. Sortiranje proteina u endozome posreduje se signalima koji su prisutni u citosolnim domenima proteina. Endosomski signali su obično kratke linearne sekvence amino-kiselina. Ovde su poželјno ciljani antigeni na endosomima koristeći signal za sortiranje endosoma, kao što su npr. YXXØ, [DE]XXXL[LI], ili DXXLL endosomski / lizosomski signali za sortiranje. Endosomski signali za sortiranje uklјučuju različite prirodne ili sintetičke signale za sortiranje endosoma. Primeri ovde uklјučuju signale za sortiranje endosoma koji su prisutni na Cd74/nepromenlјivom lancu/Ii, LimpII/SCARB ili receptoru transferina. Može se koristiti bilo koji endozomski ciljajući domen koji je farmaceutski prihvatlјiv i obezbeđuje želјenu funkciju. Fuzija takvih endozomski ciljajućih domena sa antigenima usmerava ih u endozomni odelјak nakon translacije radi veće efikasnosti. Endozomno sortiranje antigena omogućava obradu i prezentaciju imunološkom sistemu u kompleksima MHC klase II, pored konstitutivne prezentacije u kompleksima MHC klase I, za potpuniju i robusniju indukciju tolerancije i moguće širenje Treg-ova (što se ne može postići pomoću MHC klase I / antigen kompleksima). U jednoj realizaciji, tolerogene DNK vakcine ovde kodiraju fuziju antigena sa CD74/nepromenlјivim lancem/Ii da pokrenu endosomsko cilјanje i prezentaciju antigena preko MHC klase II.
Introni: Introni su nekodirajuće sekvence unutar mRNK. Poznato je da neki introni značajno povećavaju translaciju i funkciju mRNK. Shodno tome, ovde se može koristiti i uklјučivanje intronskih sekvenci. Mogu se koristiti standardni introni, kao što je beta-globin, ili bilo koji intron koji poštuje konvencije o splajsovanju sisara, kao što je MCM7. U jednoj realizaciji, vektori DNK imunoterapijske vakcine ovde sadrže sekvence koje kodiraju jedan ili
2
više introna. U još jednoj realizaciji, vektori DNK imunoterapijske vakcine ovde ne poseduju sekvence koje kodiraju introne.
Oznaka za ribozomsku pauzu: U vezi sa predmetnim pronalaskom, možda će biti prednost ako se ovde uklјuči jedan ili više oznaka sekvence(i) ribozomske pauze između sekvenci koje kodiraju protein u vektoru/plazmidu DNK imunoterapijske vakcine kako bi se odvojili proteinski proizvodi.
Primer je virusna „FMDV 2A oznaka“ (oznaka virusa slinavke i šapa 2A). Transkribovana sekvenca amino-kiseline FMDV 2A je APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP -(SEQ ID NO. 15). Oznaka FMDV 2A je sposobna da zaustavi i ponovo pokrene ribozom. Odnos translacionog proizvoda pre i nakon oznake FMDV 2A je blizu 1:1 i nastali proteinski proizvodi su obično potpuno odvojeni. Ove vrste ribozomskih oznaka su se ranije koristile u vezi sa koekspresijom dva različita domena, npr. teškog lanca i lakog lanca u proizvodnji rekombinantnog antitela. Međutim, pronalazače ovog pronalaska je iznenadilo otkriće da su one korisne u vezi sa multicistronskim DNK vakcinama kako za odvajanje bočnih proizvoda, tako i za kontrolu odnosa eksprimovanih proteina zbog inherentne efikasnosti ribozomskih ponovnih pokretanja. Oznake sekvence koje favorizuju odnos 1:1 translacionih proizvoda ovde su poželјno umetnute između dve sekvence koje kodiraju proteine, a koje bi po mogućnosti trebalo proizvesti u (ili blizu) odnosa 1:1 kao što je npr. insulinski antigen i potentni citokin kao što je npr. TGF-β.
Sledeći primer oznake ribozomske pauze ovde je oznaka virusne sekvence „TaV 2A” (Thosea asigna virus 2A - transkribovana sekvenca amino-kiseline TaV 2A: RAEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO 16). Zabeleženo je da je odnos translacionog proizvoda pre/uzvodno i posle nizvodno od ove oznake 50:1 (ili blizu). Pronalazač ovog pronalaska je iznenađujuće otkrio da, iako se ova vrsta oznaka može koristiti za kontrolu nivoa ekspresije u slučajevima kada je od vitalnog značaja da jedan translacioni proizvod apsolutno dominira drugim, razdvajanje bočnih proizvoda citokina je manje od 50% u odnosu na sekvence predstavljene u literaturi i odnos ekspresije je prema tome oko 10:6. U vezi sa predmetnim pronalaskom, 2A vrsta oznake sekvence ribozomske pauze bi trebalo da rezultira različitim nivoima ekspresije dva proteina kodirana istim vektorom/plazmidom. Ovde je poželјno eksprimovanje malih količina pleiotropnog citokina (kao što je IL-2) u odnosu na antiinflamatorni citokin, kao što je IL-10, a fuzioni proizvodi nisu poželјni.
Sledeći primer sekvence amino-kiseline oznake ribosomske pauze ovde je virusna sekvenca „“P 2A” (Svinjski teschovirus-1 2A, ATNFSLLKQAGDVEENPGP - (SEQ ID NO.
17)). P2A sekvence odgovarajuće funkcionišu kada se ovde umetnu između IL-10 i IL-2, što rezultira skoro potpunim razdvajanjem sa odnosom ekspresije >5:1 između IL-10 i IL-2.
Alternativno, ovde se mogu koristiti sekvence osetlјive na proteinaze, koje omogućavaju endogeno cepanje između poliproteina eksprimovanih plazmidom. Sekvenca osetlјiva na furin (prepoznavanje RAKR motiva) ili sekvenca osetlјiva na karboksipeptidazu (prepoznavanje RRRR, RKRR ili RRKR motiva) ovde se mogu koristiti za odvajanje proteinskih proizvoda. Međutim, pronalazač ovog pronalaska je iznenađujuće otkrio da ni sekvence cepanja furina ni karboksipeptidaze ne rezultiraju ovde odvojenim proizvodima -što dovodi do sekrecije neželјenih fuzionih proteina IL-10/IL-2.
TGF-b/β/β1 (Transformišući faktor rasta beta/β1): TGF-β je izlučeni protein koji kontroliše proliferaciju, ćelijsku diferencijaciju i druge funkcije u većini ćelija. TGF-β je veoma potentan citokin sa značajnim efektima na ćelijsku sudbinu i fenotip na način koji zavisi od konteksta, npr. u zavisnosti od ostalih istovremeno primlјenih signala citokina. Endogeni TGF-β se proizvodi u latentnom obliku povezanom sa spolјnom površinom membrane proizvođačke ćelije i zahteva aktivaciju (npr. upalnim makrofagima koji eksprimuju CD36 i plazmin proteinazu) za sazrevanje i oslobađanje aktivnog oblika. U jednoj realizaciji, TGF-β ovde je modifikovani oblik koji je konstitutivno aktivan. To se postiže zamenom cisteina na pozicijama 223 i 225 amino-kiselinama nesposobnim da formiraju disulfidne mostove. Na primer, serin ili valin se koriste za zamenu cisteina na pozicijama 223 i 225. To rezultira aktivnom pro-proteinskom strukturom koja se oslobađa u lokalno mikrookruženje.
Humana endogena TGF-β1 sekvenca - SEQ ID NO 18: MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPS QGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLL APSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDL ATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW KWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYV GRKPKVEQLSNMIVRSCKCS.
Modifikovana humana TGF-β1 sekvenca koja je konstitutivno aktivna i izlučena (supstitucije u odnosu na wt TGF-β1 prikazane podeblјano i podvučeno) - SEQ ID NO 19: MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPS QGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLL APSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHVSVDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDL ATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW KWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYV GRKPKVEQLSNMIVRSCKCS.
Još jedna modifikovana humana TGF-β1 sekvenca koja se može koristiti je SEQ ID NO 25: MPPSGLRLLLLLLPLLWLLVLTPGRPAAGLSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPS QGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFK QSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLL APSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHSSSDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDL ATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGW KWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYV GRKPKVEQLSNMIVRSCKCS.
Terminatorska sekvenca: terminator transkripcije je deo sekvence nukleinske kiseline koji označava kraj gena tokom transkripcije. Oslobađanje transkripcionog kompleksa oslobađa RNK polimerazu i srodne transkripcione mehanizme da se započne transkribovanje novih mRNK. Pored toga, isti ćelijski faktori dodaju nešablonizovani „poli-A rep“ koji značajno pobolјšava životni vek i funkcionalnost mRNK. Primer pogodnog terminatora transkripcije ovde uklјučuje terminator „bGH_PA“, CGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCT TCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGC ATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGC AAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATG
G (SEQ ID NO 20).
Ovde se može koristiti bilo koja prihvatlјiva terminatorska sekvenca. Varijacije uklјučuju upotrebu dve različite bočne terminatorske sekvence u slučaju dvosmernih promotera koji proizvode dve suprotno orijentisane mRNK.
U jednoj realizaciji plazmid pronalaska ima sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO 24.
U drugoj realizaciji plazmid iz pronalaska ima sekvencu SEQ ID NO 26: puna (neobeležena) plazmidna sekvenca GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGT TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAA TGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA CCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG
2
GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATC AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACT GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGC ACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCAC GCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGC CGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGG AGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTA GGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTT TCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAG AAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAAC GCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCC GTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAG ACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTC CATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACA GCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGC GGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTC TGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGG TGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGA CGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCC GGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAG CAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGG AGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATC CGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGG CTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTG ATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAG CTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAG CAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACC AGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTC GAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTC TTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAG AACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAAT ACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTG AATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGA GATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTG CAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACG GCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTA CAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAA GAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGG ATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTG GTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAG CTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTAT GTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTG TAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCC CACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCC GGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGG CCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTG AAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGAT AGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAAC CCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGC GTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCT GGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCC CCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGC TCAGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAG GGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTC GAGATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTG GACAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCA AGCCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACC AAGACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAG GCTGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTG GAGCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAG TGAGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGG GAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCT GGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGA CCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTA CTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACT CGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCA ATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAG
2
AATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCT GAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTC GAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAA CTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTT GCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACT CCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCAT TCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAAT AGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGAC AGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTG CAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGC TCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAAT GCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACG GTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTG ACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTG TCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCT TACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG CGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAA TAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGA TCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTT CCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCT GCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGC CGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATA CCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCA CCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAA GTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCG GGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAA CTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGG CGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTC CAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAG CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACG CGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT.
U trećoj realizaciji plazmid iz pronalaska ima sekvencu SEQ ID NO 28: puna (neobeležena) sekvenca plazmida GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGT
2
TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAA TGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA CCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATC AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACT GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGC AGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGG TTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCT AGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCT ACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAA GTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGC CAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGAC GAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGC CACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGAT GGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGC CTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTT AGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAG GCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATG AAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGG ACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAG GCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGG AGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGA GCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTG TTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGA AGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGG GCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTT GGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATG GAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGC GGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGT CCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAG
2
CCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGA CCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCA ACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACT CCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTC TAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATG GCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATA GAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAG TGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCAT GAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGT CTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAA CTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATT CATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTC ACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTT CCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTC GGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAG CTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCAC CCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGT GTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCC GGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAA GGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAG ACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGA TGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCC AGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTA TTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGG GGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCC CGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTC AGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGG CACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGA GATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGA CAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAG CCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAA GACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGC TGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGA GCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTG AGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGA
2
GCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTG GACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGAC CAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTAC TTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTC GCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAA TGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGA ATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTG AAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGA GTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACT CGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCC AGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCC ACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT ATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC AGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGC AAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAA GTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTG ATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAA GGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCA CGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGG GCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTT CCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC GCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCG GAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATA ACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATC TAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTC CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTG CGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCC GGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATAC CAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCAC CGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAG TCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCG GACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCA GGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCG
2
TCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCG GCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT.
U četvrtoj realizaciji plazmid iz pronalaska ima sekvencu SEQ ID NO 29: puna (neobeležena) sekvenca plazmida GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGT TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAA TGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA CCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATC AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACT GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGC AGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGG TTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCT AGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCT ACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTAGGTAA GTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTTTCTGC CAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAGAAGAC GAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAACGCCGC CACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCCGTGAT GGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAGACGGC CTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTCCATTTT AGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACAGCAAG GCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGCGGATG AAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTCTGGGG ACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGGTGGAG GCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGACGGG AGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCCGGGA GCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAGCAGTG TTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGGAGTGA AGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATCCGGG GCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGGCTCTT GGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTGATATG GAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAGCTGC GGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAGCAGT CCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACCAGAG CCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTCGAGA CCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTCTTCA ACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAGAACT CCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAATACTC TAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTGAATG GCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGAGATA GAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATAGCTCTAGCGACTCAAGGGACAACACATTGCAAG TGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACGGCAT GAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTACAGT CTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAAGAA CTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGGATT CATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTGGTC ACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAGCTT CCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTATGTC GGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTGTAG CTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCAC CCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGT GTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCC GGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAA GGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAG ACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGATAGA TGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCC AGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTA TTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGG GGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCC CGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGATGCACAGCTC AGCACTGCTCTGTTGCCTGGTCCTCCTGACTGGGGTGAGGGCCAGCCCAGGCCAGGG CACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGCAACCTGCCTAACATGCTTCGA
1
GATCTCCGAGATGCCTTCAGCAGAGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGGATCAGCTGGA CAACTTGTTGTTAAAGGAGTCCTTGCTGGAGGACTTTAAGGGTTACCTGGGTTGCCAAG CCTTGTCTGAGATGATCCAGTTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCCCAAGCTGAGAACCAA GACCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGGGAGAACCTGAAGACCCTCAGGC TGAGGCTACGGCGCTGTCATCGATTTCTTCCCTGTGAAAACAAGAGCAAGGCCGTGGA GCAGGTGAAGAATGCCTTTAATAAGCTCCAAGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGAGTG AGTTTGACATCTTCATCAACTACATAGAAGCCTACATGACAATGAAGATACGAAACGGGA GCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTG GACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGAC CAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGTTGGAGCATCTAC TTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATCCTAAACTTACTC GCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGAAGCACTTGCAA TGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGCGCAGTCCAAGA ATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAGTGCTGGAGCTG AAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGCTACAATCGTCGA GTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCTGACATGATAACT CGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCC AGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCC ACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCT ATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGC AGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGC AAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAA GTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTG ATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGACAATATTGAAATGCAA GGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGAGTTAGAAAACGGTCA CGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACATCCGCATCCTGACGG GCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAAAGGCCGCATTGTCTT CCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTAC GCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCG GAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATA ACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATC TAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTC CACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTG CGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCC GGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATAC
2
CAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCAC CGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAG TCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACT GAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCG GACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCA GGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCG TCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCG GCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT
Izraz „GLP-1/GLP-1 peptid/GLP-1R agonist peptid” kako se ovde koristi odnosi se na molekule GLP-1/peptide/proteine/varijante/agoniste, ovde su molekuli koji imaju GLP-1R agonističku funkciju, što znači da su agonisti GLP-1 receptora. Ova klasa lekova se obično koristi za lečenje dijabetesa, posebno dijabetesa tipa 2. Sekvenca amino-kiseline zrelog „humanog GLP-1“ je: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG (SEQ ID NO: 21).
Izraz „Analog GLP-1“, kako se ovde koristi, odnosi se na peptid, ili jedinjenje, koje je GLP-1 (SEQ ID NO: 15). Izrazi „analogni GLP-1“ i „analog“ ovde se mogu koristiti naizmenično.
Analozi GLP-1 mogu biti opisani uz upućivanje na i) broj aminokiselinskih ostataka u humanom GLP-1 (SEQ ID NO: 15) koji odgovara aminokiselinskom ostatku koji je modifikovan (tj. odgovarajućoj poziciji u GLP-1 (SEQ ID NO: 15)), i na ii) stvarnu modifikaciju.
Izraz GLP-1 Derivati odnose se na derivate analoga GLP-1. Izraz „derivat“ kako se ovde koristi u kontekstu GLP-1 analoga, označava hemijski modifikovani analog GLP-1, u kome je jedan ili više supstituenata kovalentno vezano za analog GLP-1. Izraz „supstituent“, kako se ovde koristi, označava hemijski deo ili grupu/bočnu grupu konjugovanu sa GLP-1 proteinom/agonistom/analogom. Derivat može sadržati jednu ili više modifikacija izabranih između amida, uglјenih hidrata, alkil grupa, acil grupa, estara i slično.
U nekim realizacijama supstituent je kovalentno vezan preko ostatka amino-kiseline u datom polipeptidu, npr. na jednoj od pozicija amino-kiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od pozicija 22, 23, 27, 34, 35 i 36.
U nekim realizacijama, derivat GLP-1 sadrži supstituent koji sadrži lipofilni deo. Izraz „lipofilni deo“, kako je ovde upotrebljen, označava alifatičnu ili cikličnu ugljovodoničnu grupu sa više od 6 i manje od 30 atoma ugljenika, pri čemu data ugljovodonična grupa može da sadrži dodatne supstituente.
Primeri agonista GLP-1 uklјučuju eksenatid, liraglutid, liksisentid, albiglutid, dulaglutid, taspoglutid i semaglutid. DNK imunoterapijske vakcine koje ovde koriste plazmide mogu se u početku kombinovati sa paralelnim tretmanom GLP-1R agonistom u lečenju npr. pacijenata sa nedavno dijagnostikovanim T1D. Istovremena primena GLP-1 može biti hronična ili privremena i uklјučivati oralne puteve pored parenteralnih.
Liraglutid: (SEQ ID No 22):
O O H O
Farmaceutske kompozicije ovde su poželјno vodene formulacije koje sadrže najmanje 50% vode, poželјnije najmanje 60% vode, još poželјnije najmanje 75% vode, još poželјnije najmanje 90% vode, još poželјnije najmanje 95% vode, a najpoželјnije najmanje 99 % vode. Farmaceutske kompozicije ovde mogu alternativno biti suve formulacije, kao što su liofilizovane formulacije, namenjene za rekonstituciju, inhalaciju, intranazalnu instilaciju, intradermalnu primenu, itd.
Farmaceutske formulacije ovde se poželјno daju bez upotrebe postupaka za pojačavanje transformacije, kao što je elektroporacija. U jednoj realizaciji, farmaceutske formulacije su namenjene za parenteralnu primenu, npr. supkutanu primenu, intradermalnu primenu, intravensku primenu, intramuskularnu primenu, itd. U još jednoj realizaciji, farmaceutske kompozicije ovde mogu dalјe da se daju lokalno, oralno, rektalno ili inhalacijom.
Farmaceutske kompozicije ovde su poželјno bez dodavanja bilo kakvih sredstava za kondenzaciju ili drugih ekscipijenasa koji mogu izazvati lokalne reakcije. Formulacije ovde poželјno sadrže sredstva za uklanjanje slobodnih radikala (npr. 1% etanol) i/ili helatore kao što je npr. sredstvo za uklanjanje dvovalentnih katjona (npr. EDTA [CAS #60-00-4], EGTA
4
[CAS #67-42-5], ili DPTA [CAS #67-43-6]) kako bi se pobolјšala stabilnost vodenih DNK plazmida. Farmaceutske kompozicije ovde mogu dalјe biti u obliku fiziološkog rastvora i/ili puferskog rastvora ili sadržati fiziološki rastvor i/ili sadržati puferski rastvor (npr. PBS - slani rastvor puferisan fosfatom, TRIS pufer ili ekvivalentne farmaceutski prihvatlјive pufere). Farmaceutske formulacije ovde su poželјno bez bilo kakvih dodataka, kao i drugih uobičajenih sastojaka vakcine, kao što je npr. aluminijum hidroksid, fenol, sorbitol, silikon, itd.
Primena: DNK imunoterapijska vakcina ovde se može primeniti kod pacijenta sa T1D ili pacijenta sa rizikom od razvoja T1D. Vakcina se može primenjivati, na primer, svakodnevno, svakog drugog dana, dva puta nedelјno, jednom nedelјno, dva puta mesečno, jednom mesečno, svakog drugog meseca, četiri puta godišnje ili jednom godišnje -učestalost se može prilagoditi prema opštim ili pojedinačnim potrebama. Ovde navedena imunoterapija može biti hronična. Trajanje terapije može biti npr. mesec, dva meseca, tri meseca, 6 meseci, godinu dana, dve godine, tri godine, pet godina, šest godina, sedam godina, osam godina, devet godina ili 10 godina.
PRIMERI
Negojazni miševi s dijeabetesom (model NOD miša kod dijabetesa tipa 1): Imunska funkcija u autoimunosti oslanja se na složenu mrežu ćelijskih interakcija koje se ne mogu adekvatno proceniti in vitro.
Procene supresije bolesti i/ili tretmana ovde su izvedene na modelu NOD miša, ovaj model je poligenski model spontanog početka gde većina miševa razvija povišene koncentracije glukoze u krvi (BGV, vrednost glukoze u krvi, utvrđena pomoću igle za repne vene i ručnog merača) između 12. i 30. nedelјe starosti. Incidencija i napredovanje bolesti je nepredvidlјiva, sa ukupnom incidencijom u rasponu od 60% do 95% u starosti od 30 nedelјa (WoA) i napredovanjem od dijagnoze (dva uzastopna očitavanja BGV od >250) do terminalnih (dva uzastopna očitavanja BGV od 600 ili više) u rasponu od 2 dana do 4 nedelјe. Replikacija povišenih BGV na sekvencijalnim očitavanjima je neophodna jer je miševima dozvolјena hrana i voda ad libitum, što rezultira umerenom varijabilnošću BGV izvan one izazvane imuno-patologijom.
Primer plazmidne nukleotidne sekvence ovde:
SEQ ID NO 24: puna (neobeležena) sekvenca plazmida (6.401 bazni par) GACTCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG TTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGT TACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAA TGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTA CCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACG GGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATC AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAG GCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACT GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCG TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCTGC ACTGCAGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCAC GCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGC CGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGG AGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTA GGTAAGTTAATGAGACAGATAGAAACTGGTCTTGTAGAAACAGAGTAGTCGCCTGCTTT TCTGCCAGGTGCTGACTTCTCTCCCCTGGGCTTTTTTCTTTTTCTCAGGTTGAAAAGAAG AAGACGAAGAAGACGAAGAAGACAAACCGTCGTCGACTGCCATGCGCCGCTGATTAAC GCCGCCACCATGGCCCACCGACGCAGATCCAGAAGCTGCCGTGAGGACCAGAAGCCC GTGATGGATGATCAGAGGGACCTTATCTCTAACAATGAACAACTGCCAATGCTCGGCAG ACGGCCTGGGGCCCCGGAGAGCAAGTGCAGCAGAGGAGCCTTGTACACGGGGTTCTC CATTTTAGTGACTCTCCTTCTCGCCGGCCAAGCTACCACCGCCTACTTTCTGTACCAACA GCAAGGCAGACTAGACAAACTGACAATCACAAGCCAGAACCTTCAGCTGGAGTCTCTGC GGATGAAGCTGCCCGCTTTGTGGATGAGATTGCTTCCTCTACTTGCTCTCCTGGCGCTC TGGGGACCTGACCCCGAGCAAGAGTTTGTTAATCAGCACCTGTGTGGGAGTCATCTGG TGGAGGCACTCTATTTAGTGTGCGGAGAGAGGGGCTTCTTCTACACTCCAAAGACCAGA CGGGAGGCCGAAGACCTTCAAGTGGGGCAAGTAGAACTGGGTGGCGGACCCGGTGCC GGGAGCCTTCAGCCGCTCGCCCTGGAGGGCTCTCTTCAGAAACGCGGCATCGTGGAG CAGTGTTGCACATCCATTTGCTCACTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGGAAGCGG AGTGAAGCAGACGTTGAATTTTGATTTGTTGAAGTTGGCGGGGGATGTGGAGAGCAATC CGGGGCCGATGCCCCCTAGTGGCCTCAGACTTTTGTTATTGTTATTACCGCTTTTATGG CTCTTGGTGCTGACACCGGGCCGTCCGGCTGCTGGCTTGTCGACTTGTAAGACAATTG ATATGGAATTGGTGAAACGAAAACGGATTGAGGCCATCCGAGGACAGATTTTGAGCAAG CTGCGGCTTGCCTCGCCACCCTCGCAAGGGGAAGTCCCACCCGGACCTCTACCAGAAG CAGTCCTAGCGCTGTACAACAGTACAAGAGATAGAGTGGCCGGGGAATCCGCAGAACC AGAGCCTGAGCCTGAAGCCGATTATTATGCAAAGGAAGTGACTAGGGTCCTGATGGTC GAGACCCATAACGAAATCTACGACAAATTCAAACAAAGTACCCACTCTATCTACATGTTC TTCAACACCAGTGAGCTAAGAGAAGCCGTGCCCGAACCTGTGCTTCTTTCCCGCGCAG AACTCCGCCTCTTGAGACTCAAATTGAAAGTTGAACAACACGTAGAGCTTTACCAGAAAT ACTCTAATAATTCATGGCGATATCTTTCTAATCGTCTCCTCGCCCCATCTGACAGCCCTG AATGGCTCTCCTTCGACGTTACGGGAGTTGTGCGCCAGTGGCTCAGCAGAGGCGGAGA GATAGAGGGCTTTCGGCTGAGCGCACATGTATCTGTGGACTCAAGGGACAACACATTG CAAGTGGATATTAACGGTTTTACAACTGGACGGAGAGGGGACCTGGCGACCATCCACG GCATGAATAGACCTTTCCTGCTGCTGATGGCTACTCCCCTGGAGAGGGCACAGCACTTA CAGTCTTCCAGACACCGGCGCGCCCTGGATACAAACTACTGCTTCAGCTCCACCGAAAA GAACTGTTGCGTGCGGCAGCTGTACATTGACTTCAGAAAGGATCTGGGCTGGAAGTGG ATTCATGAGCCCAAGGGGTATCATGCCAACTTCTGTCTTGGGCCATGCCCATACATCTG GTCACTGGATACCCAGTACTCCAAAGTTCTGGCCTTGTACAATCAACACAACCCTGGAG CTTCCGCCGCTCCTTGCTGTGTGCCCCAAGCCCTAGAGCCCCTGCCCATCGTTTATTAT GTCGGACGCAAGCCCAAAGTAGAACAGCTATCAAATATGATCGTGAGAAGCTGCAAGTG TAGCTGATAAACGCGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCC CACCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCC GGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGG CCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCC AAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTG AAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGTAGACAGCGGAACCCCCCACCTGGCGAT AGATGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAAC CCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGC GTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCT GGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCC CCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCTGCCGCT CATTCTAGTGCCCTTCTTTGCTGCCTGGTCCTGCTCACCGGGGTGCGAGCTAGCCCTG GACAAGGGACACAATCCGAAAACTCGTGCACCCACTTCCCGGGCAACCTCCCTAACAT GCTGAGGGACCTCCGTGATGCCTTCAGTAGAGTGAAGACGTTCTTCCAAATGAAAGATC AGTTAGATAACCTGCTCCTGAAGGAGTCACTCTTAGAAGACTTCAAAGGATACCTCGGC TGCCAAGCACTTAGCGAGATGATTCAATTCTACTTAGAAGAAGTCATGCCTCAAGCTGA GAATCAAGACCCCGACATCAAAGCTCATGTGAATTCTTTGGGAGAAAATTTGAAGACTTT GCGGCTGCGGCTGCGGAGATGTCACCGCTTTCTGCCCTGTGAGAACAAATCAAAAGCG GTCGAGCAAGTTAAGAATGCCTTCAATAAGCTACAAGAGAAGGGCATCTACAAAGCAAT GAGCGAGTTTGATATCTTTATCAATTACATTGAAGCCTACATGACAATGAAGATTAGGAA TGCCGCGGGGAGCGGCGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGA GGAGAACCCTGGACCTATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTG GCCCTGGTGACCAACAGCGCACCCACGTCCTCTAGCACCAAGAAGACCCAGTTACAGT TGGAGCATCTACTTTTAGACCTGCAAATGATTTTGAACGGCATCAACAACTACAAGAATC CTAAACTTACTCGCATGCTTACCTTCAAATTTTACATGCCCAAGAAGGCCACCGAACTGA AGCACTTGCAATGTCTGGAGGAAGAACTCAAGCCGCTGGAGGAAGTTCTCAACCTCGC GCAGTCCAAGAATTTCCACCTCCGGCCAAGAGACCTGATCAGTAACATTAATGTGATAG TGCTGGAGCTGAAGGGAAGCGAGACTACATTTATGTGCGAGTACGCCGATGAAACCGC TACAATCGTCGAGTTCCTGAATAGATGGATCACATTTTGCCAGTCAATTATCTCTACTCT GACATGATAACTCGAGGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGT GCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGG AAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGA GTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATT GGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGC GGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTT GGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCA GGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGGCCAAAGAAGA CAATATTGAAATGCAAGGTACCGTTCTTGAAACGTTGCCTAATACCATGTTCCGCGTAGA GTTAGAAAACGGTCACGTGGTTACTGCACACATCTCCGGTAAAATGCGCAAAAACTACA TCCGCATCCTGACGGGCGACAAAGTGACTGTTGAACTGACCCCGTACGACCTGAGCAA AGGCCGCATTGTCTTCCGTAGTCGCTGATAAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCG GTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGG GGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGC TCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGCTAAAACTTCATTTTTA ATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGT GAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGA TCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGT GGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCA GAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAG AACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGC CAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAG GCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACG ACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCG AAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCA CGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCA CCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA AACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACAT GTTCTT
Primer 1 - Plazmidi koji kodiraju antigen u poređenju sa plazmidima koji kodiraju IL-10 antigen:
U prethodnom stanju tehnike sugerisano je da će iscrplјivanje imuno-stimulativnih CpG sekvenci u kičmi plazmida biti potrebno za efikasno lečenje T1D DNK imunoterapijom. Ovaj eksperiment je tako modeliran nakon prethodno objavlјenih eksperimenata (2008 J Immunol.181(12):8298-307).
NOD miševima je dato osam doza jednom nedelјno plazmida počev od 9. nedelјe (starosti): dat je ili prazan vektor (pVAX1, 50 ug), ili pVAX1-proinsulin Ag (nije endozomno cilјano, nije preproinsulin), ili pVAX1-proinsulin osiromašen od CpG Ag, ili bicistronski konstrukt pVAX1-IL10-IRES-proinzulin Ag u ekvimolarnim odnosima.
Sve primene su bile intramuskularno u levom kvadricepsu pod anestezijom izofluranom i sadržale su samo plazmid u PBS EDTA. BGV su procenjivani kod svih miševa nedelјno, a incidencija dijabetesa tipa 1 je procenjena na osnovu dva očitavanja BGV preko 250 mg/dl. Miševi su procenjivani do starosti od 30 nedelјa ili dok nije postignut BGV od 600, kada su životinje uspavane.
Rezultati ovog eksperimenta (tabela 1) pokazuju da A) iscrplјenje CpG nije ni potrebno ni korisno za efikasnost, B) uklјučivanje imuno-modulacionih citokina značajno povećava efikasnost, a C) kičma plazmida (prazan vektor) ekvivalentna kao kod netretirane grupe.
Tabela 1: Incidencija T1D kod NOD miševa u starosti od 30 nedelјa.
* za poređenje
Primer 2 - Eksprimovani proteinski proizvodi dobijeni iz plazmida koji kodiraju antigen, IL-10, IL-2 i TGF-β
Multi-cistronski plazmidi su stvoreni za ko-eksprimovanje TGF- β, IL-10 i opciono IL-2. Ćelije Freestile293 su privremeno transfektovane i kultivisane u medijumu bez seruma. Supernatanti su sakuplјeni i podvrgnuti ELISA kvantifikaciji nakon 72 sata.
Rezultati u donjoj tabeli 2 pokazuju da: A) ekspresija višestrukih nezavisnih citokina se postiže iz jednog vektora, B) proizvode se značajne količine svakog citokina i u očekivanim odnosima, C) manje promene sekvence značajno pobolјšavaju ekspresiju IL-10 iz prve generacije IL10 / proinsulinskog plazmida, i D) ni plazmidna kičma (prazan vektor) ni endozomno cilјanje antigena (IIAg) ne indukuju proizvodnju ili disregulaciju citokina.
4
Tabela 2: ELISA kvantifikacija izraženih proteinskih proizvoda.
* za poređenje
Primer 3 - Uticaj TGF-β i IL-2 na suzbijanje bolesti
Multi-cistronski plazmidi su procenjeni za prevenciju bolesti kod NOD miševa kao u primeru 1, sa izuzetkom da je doziranje nastavlјeno jednom nedelјno do žrtvovanja (početak dijabetesa) ili 30. nedelјe. Poslat je po jedan miš iz svake grupe (početni n=24) na potpunu nekropsiju nakon 10 nedelјa doziranja - uklјučujući patologiju na 10 standardnih visoko perfundiranih tkiva, kompletnu krvnu sliku i kliničku hemiju. Osim manjih poremećaja i ponovnog rasta mišića usled mehaničke traume na mestu uboda, nije bilo odstupanja od nedoziranih životinja.
Rezultati u donjoj tabeli 3 pokazuju da: A) dodavanje TGF β značajno povećava efikasnost, B) uklјučivanje Interleukina-2 može povećati efikasnost i ne indukuje patologiju, C) hronično doziranje plazmidima koji eksprimuju IL-10 i antigenom povećava efikasnost u prevenciji bolesti i D) hronično doziranje plazmidima koji eksprimuju TGF β , IL-10 i IL-2 povećava efikasnost bez rezultiranja bilo kakvim sigurnosnim signalima.
Tabela 3: Incidencija T1D kod NOD miševa.
* za poređenje
Primer 4 Procena IRES elemenata, introna kao i supkutana primena
Multi-cistronski plazmidi su procenjeni za prevenciju bolesti kod NOD miševa kao u primeru 3, osim što je doziranje započelo ranije (u 5. nedelјi) kako bi se bolјe imitiralo hronično davanje kod dece. Pored validacije plazmida pVAX1-IIAg/TGF β/IL10 i pVAX1-IIAg/TGF β/IL10/IL2 koji sadrže introne, ispitivane su i druge kontrolne grupe. Konkretno, procenjen je drugačiji IRES segment (CrPV [od virusa paralize cvrčka] nasuprot EMCV [od virusa encefalomiokarditisa]) zbog očekivanog povećanja efikasnosti, kao i brisanje intronskog segmenta radi procene njegove neophodnosti. Zbog očiglednog nedostatka efikasnosti u poređenju sa roditelјskim plazmidom (pVAX1-IIAg/TGF β/IL10/IL2), CrPV grupe i grupe bez introna (n.i. = bez introna) su rano prekinute. Pored toga, kohorta miševa korišćenih u ovom eksperimentu iskusila je brže napredovanje bolesti nego prethodne kohorte, s vremenom od dijagnoze do žrtvovanja u proseku 1,25 nedelјe umesto 2,75 iz prethodnih eksperimenata. Na kraju je dodata grupa za supkutano davanje. Ovoj grupi je doziran trostruki citokinski plazmid (pVAKS1-IIAg/TGF β/IL10/IL2) uz injekciju jednom nedelјno u s.c. prostor u nabor vrata bez anestezije.
Rezultati u donjoj tabeli 4 pokazuju da: A) EMCV IRES elementi pružaju znatno bolјu efikasnost od CrPV IRES, B) uklјučivanje introna (u ovom plazmidu smeštenog unutar CD74 regiona koji cilja endozom) značajno povećava efikasnost, C) dok uklјučivanje IL-2 pruža minimalnu korist u blagim uslovima bolesti, njegovo prisustvo značajno povećava efikasnost i robusnost lečenja u agresivnim uslovima bolesti, i D) supkutano doziranje, koje je neefikasno u većini primena DNK vakcina, ovde pokazuje umerenu efikasnost i značajno odlaganje bolesti i bez optimizacije.
Tabela 4: Incidencija T1D kod NOD miševa.
* za poređenje
Primer 5 Poređenje komercijalne selekcije bez antibiotika sa sistemima za selekciju sa antibiotikom
Alternativna kičma plazmida procenjena je sa cilјem uklanjanja rezistencije na kanamicin u skladu sa smernicama Evropske agencije za lekove. Isti umetak (IIAg/TGF β/IL10/IL2, uklјučujući intron) kloniran je u kičmu NTC9385R „nanoplazmida“ Nature Technology-ja. Dobijeni plazmid je procenjen na NOD miševima kao u primeru 3, osim što je tretman započeo 11. nedelјe (kasni početak) i završen rano zbog neuspeha plazmida zasnovanog na NTC9385R.
Rezultati u donjoj tabeli 5 pokazuju da: A) promene sistema za odabir kičme plazmida iznenađujuće indukuju značajne promene u efikasnosti plazmida i B) kasni početak lečenja rezultira ranim konverzijama. Podaci iz drugih srodnih eksperimenata pokazuju da doziranje sa ovim tolerogenim plazmidima DNK vakcine zahteva dve do četiri nedelјe da bi bilo efikasno, tako da kasni početak lečenja rezultira u nekoliko ranih slučajeva dijabetesa pre nego što lečenje postane efikasno.
4
Tabela 5: Incidencija T1D bolesti kod NOD miševa.
* za poređenje
Primer 6: Efikasnost suzbijanja bolesti sa plazmidima sa i bez antigena Da bi se utvrdila uloga kodiranog antigena u funkciji plazmida, izvedena su dva eksperimenta (primeri 6 i 7). Alternativni plazmid je ispitivan sa cilјem uklanjanja regiona koji kodira antigen (pre-proinsulin) uz zadržavanje domena za cilјanje CD74 i sva tri izlučena citokina. Dobijeni plazmid je procenjen na NOD miševima kao u primeru 3, osim što je tretman počeo 11. nedelјe (kasni početak).
Ovaj eksperiment pokazuje da je deo antigena potreban za potpunu efikasnost i da nije samo proizvodnja citokina pokretačka funkcija plazmida. Ovo je jedan od dva kriterijuma potrebna za dokazivanje antigenske specifičnosti lečenja.
Tabela 6: Incidencija T1D kod NOD miševa.
* za poređenje
Primer 7 Uticaj antigenske imunoterapije ovde na efikasnost nepovezanih antigenskih vakcina
Da bi se utvrdila uloga kodiranog antigena u funkciji plazmida, izvedena su dva eksperimenta (primeri 6 i 7). NOD miševi su ili lažno tretirani injekcijom PBS-a ili tretirani pVAX1-IIAg/TGF β/IL10/IL2 plazmidom kao u Primeru 3. Posle četiri doze (tj. u starosti od 13 nedelјa) svaki miš je imunizovan i.p. sa 50 μg irelevantnog antigena (pileći ovalbumin, OVA) u 100 μl suspenzije 1:1 aluma. Lažni ili plazmidni tretmani nastavlјeni su jednom sedmično do žrtvovanja tri nedelјe (21 dan) nakon imunizacije, kada je sakuplјan serum. Antitela zamenjene klase (ukupni IgG i IgG2a) protiv ovalbuminskog antigena određena su pomoću komercijalnih ELISA kompleta. Nisu primećene značajne razlike između grupa tretiranih plazmidom i lažno tretiranih u njihovim ukupnim nivoima anti-OVA IgG, niti je bilo koja grupa proizvela anti-OVA IgG2a.
Rezultati u tabeli 7 u daljem tekstu pokazuju da, iako plazmid potiskuje imuni odgovor povezan sa cilјanom bolešću, on ne potiskuje imunološku reaktivnost prema nesrodnim antigenima (tj. bilo kojim antigenima koji nisu kodirani u plazmidu). Ovo je drugi od dva kriterijuma potrebna za dokazivanje antigenske specifičnosti lečenja. Kako će lečenje pedijatrijskih pacijenata podrazumevati istovremenu primenu standardnih vakcinacija kod dece, ovo je značajna prednost u odnosu na sistemsku / generičku imunosupresiju pomoću sredstava kao što su metotreksat ili ciklosporin A.
Tabela 7: Odgovor na irelevantni antigen kod NOD miševa koji su primili DNK imunoterapijsku vakcinaciju protiv T1D.
Ove vrednosti rezultiraju neznačajnom p vrednošću od 0,377 i intervalom pouzdanosti od -1,99 do 4,87. Ovi rezultati ukazuju da lečenje imunomodulatornim plazmidom ne utiče na imuni odgovor na druge antigene koji nisu kodirani plazmidom, te stoga ne rezultira širokom ili sistemskom supresijom imunološkog sistema.
Primer 8 Pojedinačni proteinski proizvodi eksprimovani iz plazmida
TaV 2A element rezultirao je ovde neočekivanim fuzionim proizvodima IL-10 IL-2 (podaci nisu prikazani) i stoga su procenjene druge strategije razdvajanja. Inicijalne tehnologije razdvajanja obuhvatale su nadogradnje TaV 2A sekvence (što dovodi do brze razgradnje i nedostatka sekretiranog IL-10), a takođe i mesto cepanja karboksipeptidaze (koja je indukovala smrt transfektovanih ćelijskih linija). Dalјe procenjene strategije razdvajanja bile su GSG-TaV 2A, mesto cepanja furina, mesto furina praćeno TaV 2A, P 2A i E 2A (virus A konjskog rinitisa).
4
Ćelije Freestile293 su privremeno transfektovane i kultivisane u medijumu bez seruma. I ćelijski pelet i supernatanti su sakuplјeni i podvrgnuti polukvantitativnom višebojnom Vestern blot-u nakon 72 sata.
Rezultati u donjoj tabeli 8 pokazuju da: A) neočekivano, mesta proteolitičkog cepanja ne funkcionišu između gena IL-10 i IL-2, B) GSG oznake (sekvence odvajača) između IL-10 IL-2 su poželјnije od proširenih izolacionih sekvenci, C) P2A je poželјniji od TaV2A ili E2A, i D) 2A sekvence mogu imati značajne i neočekivane efekte na razgradnju i sekreciju eksprimovanih uzvodnih proteina kao što je IL-10.
Tabela 8: Razdvajanje eksprimovanih proteinskih proizvoda IL-10 i IL-2.
Primer 9 Poređenje komercijalnog sistema za selekciju sa ovde obezbeđenim sistemom za selekciju osetlјivim na toplotu, kao i poređenje između plazmida koji kodiraju IL-2 i plazmida koji ne kodiraju IL-2 (supkutana primena)
Kičme plazmida su stvorene i procenjene sa cilјem uklanjanja rezistencije na kanamicin u skladu sa smernicama Evropske agencije za lekove. Ispravlјeni umetak (IIAg/GSG-FMDV 2A/TGF β/EMCV IRES/IL10/GSG-P 2A/IL2, uklјučujući intron u uzvodnom nekodirajućem regionu) kloniran je u bilo koji naknadno ugrađeni/minimalno modifikovani pVAX1 vektor koji sadrži Nature Technology „RNA-OUT” selekcioni marker ili ekvivalentno minimalno modifikovano pVAX1 vektorsko kodiranje wt infA („pNN“) kao kičmu. Pored toga, proizvedeni su plazmidi koji sadrže dodatni element pojačivača SV40 ili imaju nedostatak IL-2. Dobijeni plazmidi su procenjeni na NOD miševima kao u primeru 3, osim što je administracija bila s.c. bilo jednom nedelјno ili tri puta nedelјno (poželјno).
4
Rezultati u donjoj tabeli 9+10 pokazuju da: A) komercijalno dostupna razmena RNA-OUT za rezistenciju na antibiotik kanamicin u kičmi pVAX1 i dalјe neočekivano ima loš učinak, B) sistem za selekciju komplementacije infA bez antibiotika deluje ekvivalentno roditelјskom pVAX1 vektoru, C) Interleukin-2 je potreban za optimalnu efikasnost, D) dodavanje elementa pojačivača SV40 ne pobolјšava efikasnost i E) korigovani trostruki citokinski umetak zadržava punu funkcionalnost.
Tabela 9: Incidencija T1D kod NOD miševa.
* za poređenje
Tabela 10: Incidencija T1D kod NOD miševa.
4
* za poređenje
Primer 10 Ispitivanje trajnosti efekta tolerancije nakon povlačenja plazmida U prethodnom eksperimentu (predstavlјenom u tabeli 9), grupa pNN-IIAg/FMDV/TGF β/IL10/P2A/IL2 nije žrtvovana u starosti od 30 nedelјa, već se prestalo sa doziranjem plazmidom. Vrednosti glukoze u krvi praćene su dodatnih deset (10) nedelјa, do ukupno 40 nedelјa starosti, kako bi se procenilo da li je plazmid indukovao trajno stanje tolerancije ili je za efikasnost neophodno dalјe doziranje.
Rezultati prikazani u donjoj tabeli 11 pokazuju da je za trajnost tolerancije potrebno kontinuirano doziranje, jer se stabilno stanje bez bolesti do starosti 30 nedelјa brzo pogoršalo nakon prekida doziranja. Ovo ukazuje na povolјan sigurnosni profil, jer bi se takođe očekivalo da bilo koji neželјeni događaji koji se mogu dogoditi pri doziranju plazmida prestanu sa doziranjem.
Tabela 11: Incidencija T1D kod NOD miševa nakon prestanka doziranja plazmida.
Primer 11 Ispitivanje stabilnosti i trajnosti plazmida pri ubrizgavanju Klјučno pitanje primene plazmida je degradacija pri davanju. U slučaju injekcije, sile smicanja na koje nailaze veliki i viskozni molekuli plazmida koji prolaze kroz tanku iglu pod pritiskom dovode do loma kovalentno zatvorene kružne strukture plazmida - čineći je linearnom i podložnom smanjenoj sposobnosti transfektovanja i brzom uništavanju. Većina plazmida ima 5 do 15% razgradnje u linearne oblike nakon injekcije kroz igle veličine prihvatlјive za kliničku upotrebu, što dovodi ili do smanjene efikasnosti ili do potrebe za većim početnim dozama kako bi se nadoknadio gubitak. Nekoliko tipova struktura sekvenci koje
4
mogu dovesti do odmotavanja plazmida i podložnosti degradaciji na smicanje su namerno umanjene u otkrivenim plazmidima, sa namerom da povećaju robusnost i pouzdanost protokolima ubrizgavanja. Da bi se procenila degradacija plazmida na smicanje, koja može da varira u zavisnosti od viskoznosti, a time i koncentracije, humani vodeći plazmid je resuspendovan u Tris EDTA puferu do koncentracije od 5, 7 i 9 mg/ml i propušten tri puta kroz iglu G30 (izbačen, ponovo povučen u špric, zatim ponovo izbačen) i jedan (1) uzorak mikrograma je pokrenut na agaroznom gelu protiv referentnih uzoraka koji nisu prolazni kroz postupak ubrizgavanja.
Rezultati prikazani na slici 3, iznenađujuće pokazuju da se ne primećuje razgradnja plazmida u tri injekciona prolaska ni u jednoj ispitivanoj koncentraciji ili viskoznosti. Degradacija plazmida bi se vizualizovala i kao razmazivanje manjih traka (između glavne izuvijane trake na 6 Kb i male trake nečistoća procesa na dnu gela ili približno 600 bp). Takvi razmazi za linearizaciju / razgradnju nisu primećeni ni za jedan uzorak koji je prolazio kroz proces ubrizgavanja. Ova robusna fizička stabilnost pri doziranju je veoma poželјna i veća nego što se očekivalo ili je prethodno navedeno u literaturi.
Primer 12 Verifikacija zadržavanja plazmida sistemom komplementacije infA Da bi se verifikovalo da je sistem za selekciju zadržavanja plazmida zasnovan na infA funkcionisao po želјi, plazmidno transformisane bakterije uzgajane su kroz 100 pasaža (otprilike 36 udvostručavanja / generacije po pasažu, za ukupno 3.600 generacija ispitivanih potencijalnih driftova ili gubitaka plazmida). Pasaži 1-100 su generisani 11 nedelјno, 2 prolaza radnim danom na 37°C i jedan svaki vikend na 30°C. Svi su izvedeni u tečnom LB medijumu bez životinja (Teknova soy-tone), dopunjenom sa 15 mikrograma / ml naladiksične kiseline (odabir za DH5α bazni soj, a ne za prisustvo plazmida). Zalihe glicerola generisane su iz svakog pasaža i zadržane sve dok nije dobijeno svih 100 pasaža za istovremenu obradu.
Otpadi zaliha glicerola korišćeni su za inokulaciju 5 ml kultura preko noći koje su obrađene prema uputstvima dobavlјača na Qiagen miniprep setovima pomoću vakuumskog kolektora (bilo 16 ili 32 kulture po seriji, zbog ograničenja veličine gela). Nije pokušano prikuplјanje očitavanja OD600 za normalizaciju unosa ćelije, a sve pripreme su izvršene na osnovu standardnih zapremina. Jedan mikrolitar svakog miniprepa je podvrgnut digestiji PstI/XhoI da bi se oslobodila kičma (približno 2,4 Kbp) iz umetka (približno 4 Kbp), bez korekcije za koncentraciju plazmida koja je dobijena iz svakog miniprepa. Svaki gel je pokrenut bočnim merdevinama Tridye 2-Log (NEB https://www.neb.com/products/n3200-2-log-dna-ladder-01-100-kb), prvom trakom uzorka nesvarenog plazmida, i vizuelizovano
4
bojom SybrSafe. Na slikama gelova, uprkos nedostatku kontrole količine nukleinske kiseline, sve probavne trake pokazuju i prisustvo i očekivani obrazac varenja plazmida (vidi se na slikama za pasaže 1-16, 17-48, 49-80 i 81-100).
Kao dodatna potvrda, zalihe glicerola za prolaze 1-100 su takođe nanizane na 50 sektorskih LB agar ploča bez antibiotika i životinjskog LB i inkubirane preko noći na 30°C. Nije izvršen nijedan pokušaj kontrole niza inokuluma. Kao što je prikazano na slici 4, svi reprezentativni nizovi glicerola rezultirali su primetnim rastom i samim tim zadržavanjem plazmida.
Primer 13 Pogodnost za uvećanje sa sistemom infA komplementacije
Da bi se verifikovalo da je sistem za selekciju zadržavanja plazmida na bazi infA funkcionisao po želјi na skali proizvodnje, transformisane plazmidne bakterije su korišćene u 50-litarskom pilot fermentoru sa šaržom sa specifičnim korakom povećanja temperature koji pobolјšava prinos. Korišćen je minimalni medijum sa dodatkom ekstrakta kvasca, smanjujući stopu udvostručenja na 0,88 / sat. Dodavanje šarže započeto je u 17sati nakon inokulacije, a regulacija rastvorenog kiseonika na 30% ostvarena je uzastopnim povećanjem parametara pO2 kaskade (mešanje u 32 sati 15 min, pritisak u 40 sati 30 min, zatim protok vazduha u 45 sati 40 min). Stopa povećanja biomase smanjila se neposredno nakon pomeranja na 42°C, kako se i očekivalo. Količina proizvedene plazmidne DNK procenjena je na 1,03 ± 0,17 g/L primenom postupka ekstrakcije plazmida malog obima koji imitira trenutni prinos posle lize.
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI
1. A. plazmid koji kodira:
i. antigen insulina;
ii. TGF-β;
iii. IL-10; i
naznačen time što dati plazmid dalјe pokreće ekspresiju Interleukina-2 (IL-2).
2. Plazmid prema zahtevu 1, naznačen time što je dati antigen insulina odabran iz grupe koju čine: proinsulin, pre-proinsulin i njegov funkcionalni ili imuno-dominantni peptidni fragment.
3. Plazmid prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što je dati antigen insulina endozomski cilјani insulin.
4. Plazmid prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što dati plazmid pokreće ekspresiju antigena insulina i TGF-P u količini koja je najmanje dva puta niža od IL-10.
5. Plazmid prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što dati plazmid sadrži: (i) element FMDV 2A koji razdvaja sekvencu za kodiranje antigena insulinsa i sekvencu za kodiranje TGF-β, (ii) EMCV IRES element koji odvaja sekvence koje kodiranju TGF-β i sekvence koje kodiranju IL-10 i (iii) element 2A koji razdvaja sekvencu koja kodira IL-10 i sekvencu koja kodira IL-2.
6. Plazmid prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što sekvenca koja kodira TGF-P kodira konstitutivno aktivni TGF-P.
7. Plazmid prema bilo kom od prethodnih zahteva, gde navedeni plazmid sadrži: (i) endozomno cilјanu sekvencu za kodiranje pre-pro-insulina, (ii) element FMDV 2A, (iii) sekvencu koja kodira TGF-β, (iv ) EMCV IRES element, (v) sekvencu koja kodira IL-10, (vi) P 2A element, (vii) sekvencu koja kodira IL-2, (viii) poliadenilacioni / terminacioni element, (ix) selekcioni gen, (x) poreklo replikacije, (xi) eukariotski promoterski element, (xii) eukariotsku sekvencu za početak translacije, (xiii) sekvencu za endoszomsko sortiranje i (xiv) opciono intron.
8. DNK imunoterapijska vakcina koja sadrži plazmid prema bilo kom od prethodnih zahteva.
9. DNK imunoterapijska vakcina prema zahtevu 8, ili plazmid prema bilo kom od zahteva 1-7, za upotrebu u odlaganju ili prevenciji dijabetesa tipa I.
10. DNK imunoterapijska vakcina prema zahtevu 8, ili plazmid prema bilo kom od zahteva 1-7, za supkutano davanje.
11. DNK imunoterapijska vakcina prema zahtevu 8, ili plazmid prema bilo kom od zahteva 1-7, za intramuskularnu primenu.
12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži DNK imunoterapijsku vakcinu prema zahtevu 8 ili plazmid prema bilo kom od zahteva 1-7, naznačena time, što data farmaceutska kompozicija sadrži fiziološki rastvor i/ili pufer i/ili helator.
13. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 12, naznačena time što dati pufer ne sadrži nijedan virus, sredstvo za kopakovanje lipida ili sredstvo za kondenzaciju.
14. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 12-13, naznačena time, što data kompozicija dalјe sadrži GLP-1R agonist.
1 1
RS20201421A 2016-11-01 2017-11-01 Tolerogena dnk vakcina RS61138B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662415717P 2016-11-01 2016-11-01
EP17150037 2017-01-02
EP17169019 2017-05-02
EP17177289 2017-06-22
EP17198041 2017-10-24
EP17801363.7A EP3534936B1 (en) 2016-11-01 2017-11-01 Tolerogenic dna vaccine
PCT/EP2017/077949 WO2018083111A1 (en) 2016-11-01 2017-11-01 Tolerogenic dna vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61138B1 true RS61138B1 (sr) 2020-12-31

Family

ID=60190888

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201421A RS61138B1 (sr) 2016-11-01 2017-11-01 Tolerogena dnk vakcina

Country Status (24)

Country Link
US (1) US11466278B2 (sr)
EP (3) EP3535399B1 (sr)
JP (3) JP6721790B2 (sr)
KR (1) KR102476552B1 (sr)
CN (3) CN109922827B (sr)
AU (1) AU2017353323B2 (sr)
BR (1) BR112019007408A2 (sr)
CA (1) CA3042321A1 (sr)
CL (1) CL2019001181A1 (sr)
CO (1) CO2019004193A2 (sr)
DK (1) DK3534936T3 (sr)
ES (2) ES2829574T3 (sr)
HR (1) HRP20201710T1 (sr)
HU (1) HUE051766T2 (sr)
IL (1) IL266237B (sr)
MX (1) MX2019004774A (sr)
MY (1) MY190102A (sr)
PE (1) PE20190841A1 (sr)
PH (1) PH12019500851A1 (sr)
PL (1) PL3534936T3 (sr)
RS (1) RS61138B1 (sr)
RU (1) RU2752608C2 (sr)
SA (1) SA519401615B1 (sr)
SI (1) SI3534936T1 (sr)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
PL3534936T3 (pl) * 2016-11-01 2021-01-25 Novo Nordisk A/S Szczepionka tolerogennego dna
US11279745B2 (en) 2019-04-26 2022-03-22 Novo Nordisk A/S Tolerogenic DNA vaccine
IL308312A (en) * 2021-05-10 2024-01-01 Nykode Therapeutics ASA Expression from a combination of inhibitory structures and compounds
CN113461796A (zh) * 2021-08-04 2021-10-01 深圳晶蛋生物医药科技有限公司 一种重组sglt2蛋白及其应用
JP2024531827A (ja) * 2021-08-13 2024-08-29 トリオヴァンス ホールディング リミテッド ライアビリティ カンパニー 代用皮膚組成物ならびにそれを製造および使用する方法

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9518395D0 (en) * 1995-09-08 1995-11-08 Therexsys Ltd Plasmid stabilization
WO1998024469A1 (en) * 1996-12-05 1998-06-11 University Of Florida Il-10 and tgf-beta for treating autoimmune disease
US7030098B2 (en) 1999-03-12 2006-04-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DNA vaccination for treatment of autoimmune disease
US6884785B2 (en) 1999-06-17 2005-04-26 The Scripps Research Institute Compositions and methods for the treatment or prevention of autoimmune diabetes
US7531352B2 (en) 2000-04-20 2009-05-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inducible plasmid vector encoding TGF-β and use thereof
EP1315816B1 (en) * 2000-09-08 2010-12-29 University Of Maryland Biotechnology Institute Genetically engineered co-expression dna vaccines, construction methods and uses thereof
USD459798S1 (en) 2001-03-26 2002-07-02 Aventis Pharma S.A. Pill tablet
SE0102204D0 (sv) 2001-06-21 2001-06-21 Leif Isaksson New method
EP2322185A3 (en) 2001-11-21 2011-08-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Polynucleotide therapy
US20040110295A1 (en) 2002-05-28 2004-06-10 Maxygen, Inc., A Delaware Corporation Nucleic acid vectors
RU2228198C1 (ru) 2002-08-21 2004-05-10 Полетаев Александр Борисович Способ коррекции патологического аутоиммунного процесса при сахарном диабете
EP2298360A3 (en) 2002-11-21 2011-07-13 Bayhill Therapeutics, Inc. Methods and immune modulatory nucleic acid compositions for preventing and treating disease
US20050026189A1 (en) 2003-05-29 2005-02-03 Liangsu Wang Microbial operons
US20050147621A1 (en) 2003-10-10 2005-07-07 Higgins Darren E. Use of bacterial 5' untranslated regions for nucleic acid expression
WO2005089101A2 (en) 2004-02-03 2005-09-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Non-pathogenic listeria vaccine vectors and methods of treatment therewith
CA2658678A1 (en) 2005-08-06 2007-02-15 Gerald J. Prud'homme Composition and method for prevention and treatment of type i diabetes
JP2009511014A (ja) 2005-10-05 2009-03-19 ベイヒル セラピューティクス インコーポレーティッド 自己免疫疾患の処置のための組成物および方法
CA2550133A1 (en) 2006-02-16 2007-08-16 The Governors Of The University Of Alberta Temperature regulated gene expression
CN101489382A (zh) 2006-06-13 2009-07-22 贝希尔治疗学股份有限公司 多核苷酸疗法
US9339500B2 (en) 2008-03-04 2016-05-17 Intra-Cellular Therapies, Inc. Methods of treating vasomotor symptoms
RU2548809C2 (ru) 2009-05-22 2015-04-20 Мериал Лимитед Плазмида без устойчивости к антибиотику
EP2461828B1 (en) 2009-07-31 2017-06-21 President and Fellows of Harvard College Programming of cells for tolerogenic therapies
WO2011091138A1 (en) 2010-01-20 2011-07-28 Bayhill Therapeutics, Inc. Combination therapy to treat autoimmune diseases
CN103200959A (zh) 2010-09-27 2013-07-10 中国农业大学 预防和治疗自身免疫性疾病的联合抗原和dna疫苗
WO2012062697A1 (en) * 2010-11-08 2012-05-18 Novartis Ag Combination therapy for type 1 diabetes
EP2753362A4 (en) * 2011-09-08 2015-04-15 Univ Florida MATERIALS AND METHOD FOR MODULATING IMMUNE SYSTEM REACTIONS
US9550998B2 (en) 2012-08-29 2017-01-24 Nature Technology Corporation DNA plasmids with improved expression
US9636386B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-02 City Of Hope Attenuated Salmonella bacteria and methods of using
WO2016057986A1 (en) * 2014-10-10 2016-04-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tandem epitope constructs for presentation of cd4 and cd8 epitopes and uses thereof
WO2016162385A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Bacterial system for the identification of amyloidogenic peptides and the screening of inhibitors of amyloidosis
ES2855992T3 (es) 2015-12-11 2021-09-27 Wacker Chemie Ag Cepa de microorganismos y procedimiento para la producción fermentativa exenta de antibióticos de sustancias y proteínas de bajo peso molecular
PL3534936T3 (pl) * 2016-11-01 2021-01-25 Novo Nordisk A/S Szczepionka tolerogennego dna
TWI728201B (zh) 2016-11-01 2021-05-21 丹麥商諾佛 儂迪克股份有限公司 耐受性ｄｎａ疫苗
USD813372S1 (en) 2017-02-22 2018-03-20 Celgene Corporation Pharmaceutical tablet
US11279745B2 (en) 2019-04-26 2022-03-22 Novo Nordisk A/S Tolerogenic DNA vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
RU2019115540A3 (sr) 2021-01-28
JP2019532660A (ja) 2019-11-14
ES2834329T3 (es) 2021-06-17
CN109890967B (zh) 2024-03-19
ES2829574T3 (es) 2021-06-01
CO2019004193A2 (es) 2019-07-31
DK3534936T3 (da) 2020-11-02
CN109890967A (zh) 2019-06-14
AU2017353323A1 (en) 2019-05-02
EP3534936B1 (en) 2020-10-21
RU2752608C2 (ru) 2021-07-29
KR102476552B1 (ko) 2022-12-13
HUE051766T2 (hu) 2021-03-29
SA519401615B1 (ar) 2023-01-31
PL3534936T3 (pl) 2021-01-25
SI3534936T1 (sl) 2020-12-31
PE20190841A1 (es) 2019-06-17
CN109922827A (zh) 2019-06-21
EP3535399B1 (en) 2020-10-07
AU2017353323B2 (en) 2024-02-29
RU2019115540A (ru) 2020-12-03
CL2019001181A1 (es) 2019-07-05
MX2019004774A (es) 2019-08-05
PH12019500851A1 (en) 2019-12-02
IL266237A (en) 2019-06-30
BR112019007408A2 (pt) 2019-07-02
JP2020062057A (ja) 2020-04-23
US20190241898A1 (en) 2019-08-08
HRP20201710T1 (hr) 2020-12-25
JP2019532659A (ja) 2019-11-14
CN118086388A (zh) 2024-05-28
EP3534936A1 (en) 2019-09-11
JP7084388B2 (ja) 2022-06-14
KR20190076020A (ko) 2019-07-01
JP6721790B2 (ja) 2020-07-15
MY190102A (en) 2022-03-28
EP3799882A1 (en) 2021-04-07
IL266237B (en) 2022-08-01
EP3535399A1 (en) 2019-09-11
CA3042321A1 (en) 2018-05-11
US11466278B2 (en) 2022-10-11
CN109922827B (zh) 2024-03-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI728201B (zh) 耐受性ｄｎａ疫苗
RS61138B1 (sr) Tolerogena dnk vakcina
JP7089003B2 (ja) Ｒｎａの免疫原性を低減するための方法
US20230270841A1 (en) Coronavirus vaccine
WO2017190684A1 (zh) 白细胞介素组合及其用途
US11279745B2 (en) Tolerogenic DNA vaccine
AU2006259041A1 (en) Agents and methods based on the use of the EDA domain of fibronectin
RS58313B1 (sr) Himerni proteini na bazi hpv/cyaa i njihove upotrebe u indukovanju imunskih odgovora na hpv infekciju i hpv-indukovane poremećaje
WO2021186042A1 (en) Plasmid comprising alopecia antigen
HK40006260B (en) Tolerogenic dna vaccine
HK40006260A (en) Tolerogenic dna vaccine
US20220257747A1 (en) Methods and compositions of astrovirus replicons
WO2023097318A1 (en) Compositions and methods for expression of il-12 and il-1ra
JP2024539087A (ja) 修飾複製可能ｒｎａおよび関連組成物ならびにそれらの使用