ES2831359T3 - Complejos inhibidores de enzimas - Google Patents

Abstract

Método para activar selectivamente una hidrolasa termoestable a una temperatura por encima de T1, comprendiendo dicho método las siguientes etapas: a) proporcionar, a una temperatura por debajo de T1, en donde dicha temperatura T1 es al menos 60 °C, una composición que comprende la hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I y es resistente a inactivación irreversible a una temperatura por encima de T1, en donde dicho inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semi- sintética o sintética de los mismos y en donde el inhibidor se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta, y en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo inhibidor de hidrolasa a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en dicho complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo a una temperatura de aproximadamente T1, y; b) elevar la temperatura de dicha composición a una temperatura por encima de T1, activando de esta manera la hidrolasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Complejos inhibidores de enzimas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para activar selectivamente una hidrolasa termoestable en una temperatura por encima de T1. La presente invención proporciona composiciones que comprenden una hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo inhibidor de hidrolasa a una temperatura por debajo de T1, pero el cual se disocia en una temperatura de aproximadamente T1. La presente invención también se refiere al uso de dichas composiciones, y a un método para preparar dichas composiciones.

Antecedentes de la invención

El uso de enzimas termoestables y preferentemente termófilas es altamente deseado en la industria ya que muchas reacciones industriales enzimáticas se realizan a altas temperaturas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el uso de peptidasas en sectores que incluyen, pero no se limitan a, producción y procesamiento de alimentos tales como por ejemplo procesamiento y horneado de cereal (por ejemplo producción de pan, pasteles), la industria alimentaria (por ejemplo, producción de alimentos para mascotas), la industria del detergente (por ejemplo, detergentes de lavandería), la industria textil (por ejemplo biopulido de lana y seda, desgomado de seda), etc. Sin embargo, algunas enzimas inducen alergenicidad y/u otras cuestiones de salud a temperaturas ambiente. La aplicación de estas enzimas tiene que realizarse con gran cuidado. Puede por lo tanto ser deseable en estas y otras aplicaciones inactivar la enzima a temperatura inferior sin comprometer la actividad de la enzima a temperaturas elevadas. También, en ciertas circunstancias, por ejemplo en procesamiento de alimentos, es indeseable tener enzimas que actúan a bajas temperaturas, por ejemplo a temperatura ambiente, cuando ocurren otras etapas de procesamiento. Durante estas primeras etapas de procesamiento no se desea actividad enzimática, mientras que en etapas de procesamiento tardías en temperatura elevada la actividad enzimática puede ser beneficiosa para la calidad de producto final.

En general, llevar complejos de inhibidores de enzima a temperaturas más altas desnaturaliza simultáneamente tanto el inhibidor como la enzima, lo cual no resulta en volver a conseguir actividad enzimática. Tras el tratamiento de calor del complejo entre pectinmetilesterasa de zanahoria (PME por sus siglas en inglés) y su inhibidor (PMEI por sus siglas en inglés) de kiwi, la enzima y el inhibidor no se separaron. A pesar de todo, el complejo se desnaturaliza (y agrega) como una entidad, después de cinéticas de primer orden. Tras el tratamiento de presión, por encima de 300 MPa, la diferencia en la proporción de reacción de PME de zanahoria y sin PMEI disminuye gradualmente, señalando a una cantidad disminuida de PME inhibida. Esta tendencia indica una disociación inducida por presión del complejo PME-PMEI. Mientras el PMEI de kiwi liberado puede inactivarse parcialmente de forma irreversible, la PME de zanahoria liberada se comporta de forma similar a la otra PME presente, es decir, se produce una inactivación reversible putativa (Jolie et al. (2009) Innovative Food Science & Emerging Technologies 10(4):601-609). Estos descubrimientos son soportados por estudios de cromatografía de exclusión de tamaño en los cuales se determina el comportamiento del complejo de PME-PMEI a niveles de temperatura o presión elevados. El tratamiento con calor no prueba disociar el complejo, sino más bien desnaturalizar el complejo como una entidad. En contraste, el tratamiento con alta presión induce desunión de enzima e inhibidor, seguido de inactivación gradual de PME y PMEI (Jolie et al. (2009) Journal of Agricultural and Food Chemistry 57(23): 11218-11225).

El documento US2006269538 desvela serina proteasas de la clase S1 con sensibilidad alterada a una o más sustancias moduladoras de actividad, en particular inhibidores de polipéptido o proteína de la enzima.

Balti y colaboradores (Food Chemistry, 2009, Vol. 113, p. 146-154) desvela una tripsina termoestable del hepatopáncreas de Sepia officinalis y analizan el efecto de inhibidores de enzimas, tales como inhibidor de tripsina de soja, en la actividad de enzimas.

Gupta y colaboradores (Protein Expression and Purification, 2008, Vol. 57, p. 290-302) desvelan un inhibidor de alfa-1-proteinasa ovina y variantes del mismo y su inhibición de tripsina, quimiotripsina y elastasa.

Taylor y colaboradores (Clinica Chimica Acta, 1980, Vol. 104(3), p. 301-308) desvelan un inhibidor de alfa-1 proteasa sensible a temperatura y su inhibición de tripsina y elastasa.

El documento WO03084334 desvela un método para prevenir o retardar el envejecimiento de un producto de panadería añadiendo una cantidad suficientemente eficaz de al menos un intermedio termoestable y/o una serina proteasa termoestable en dicho producto de panadería.

Es un objeto de la presente invención proporcionar preparaciones de enzima las cuales son inactivas a temperaturas inferiores, pero activas a temperaturas elevadas. El uso de tales preparaciones de enzima puede reducir ventajosamente o eliminar problemas de salud potenciales asociados a la aplicación (industrial) de las enzimas a temperatura ambiente. También, en ciertas aplicaciones, el uso de preparaciones de enzima las cuales son inactivas a temperaturas inferiores, pero activas a temperaturas elevadas, tiene un efecto beneficioso en la calidad de proceso global y/o en la calidad del producto final (almacenamiento, textura, etc.).

Sumario de la invención

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que ciertos complejos de enzima-inhibidor, en particular complejos de Aqualisina I-inhibidor de tripsina de soja, eran inactivos a temperatura ambiente, y se disociaban a temperaturas elevadas, liberando de esta manera las enzimas, cuyas enzimas volvieron a ganar su actividad.

La presente invención se dirige a un método para activar selectivamente una hidrolasa termoestable a una temperatura por encima de T1, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

a) proporcionar, a una temperatura por debajo de T1, en donde dicha temperatura T1 es al menos 60 °C, una composición que comprende la hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I y es resistente a inactivación irreversible a una temperatura por encima de T1, en donde dicho inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semisintética o sintética de los mismos y en donde el inhibidor se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta, en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo inhibidor de hidrolasa a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en dicho complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo a una temperatura de aproximadamente T1, y;

b) elevar la temperatura de dicha composición a una temperatura por encima de T1, activando de esta manera la hidrolasa.

En algunas realizaciones, la hidrolasa es Aqualisina I de Thermus aquaticus LMG 8924.

En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de tripsina de soja.

En algunas realizaciones, dicha hidrolasa tiene actividad máxima a una temperatura por encima de T1.

En algunas realizaciones, la actividad de la enzima en el complejo es menos del 25 % de la actividad de la enzima no inhibida.

La presente invención también proporciona una composición que comprende una hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I, en donde el inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semi-sintética o sintética de los mismos y se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta y en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo de hidrolasa e inhibidor a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en dicho complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo a una temperatura de aproximadamente T1, en donde dicha temperatura T1 es al menos 60 °C.

En algunas realizaciones, la hidrolasa es Aqualisina I de Thermus aquaticus LMG 8924.

En algunas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de tripsina de soja.

En algunas realizaciones, dicho inhibidor se inactiva irreversiblemente a una temperatura de aproximadamente T1. En algunas realizaciones, dicha hidrolasa tiene actividad máxima a una temperatura por encima de T1.

En algunas realizaciones, la actividad de la enzima en el complejo es menos del 25 % de la actividad de la enzima no inhibida.

En algunas realizaciones, la composición es un alimento o composición alimenticia, o una composición de detergente. En algunas realizaciones, dicho alimento o composición alimenticia es un alimento o aditivo alimenticio.

En algunas realizaciones, dicho aditivo alimenticio es un mejorador de pan o pastelería.

La invención también se refiere al uso de la composición como se enseña en el presente documento en el alimento o industria alimenticia, o en la industria de detergente, preferentemente en la industria alimenticia, más preferentemente para aplicaciones de horneado o pastelería.

En algunas realizaciones, la composición como se enseña en el presente documento se usa para mejorar el efecto crujiente de productos horneados.

La presente invención se dirige además a un método para preparar una composición como se enseña en el presente documento, que comprende las siguientes etapas:

a) mezclar la hidrolasa termoestable y el inhibidor sensible a temperatura en un disolvente adecuado;

b) permitir al inhibidor formar un complejo con la hidrolasa incubando la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperatura entre 0 °C y 40 °C; y

c) opcionalmente secar, refrigerar, congelar y/o estabilizar la mezcla.

Estos y adicionales aspectos y realizaciones se describen en las siguientes secciones y en las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra actividad relativa de Aqualisina I en ausencia (diamantes negros) y presencia (cuadros abiertos) de inhibidor de tripsina de soja (SBTI por sus siglas en inglés) (inhibidor de tipo Kunitz) como una función de la temperatura. La actividad enzimática se determinó colorimétricamente usando el sustrato sintético N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida (AAPF) y se expresa como un porcentaje de la actividad de Aqualisina I máxima como se mide a 70 °C.

La Figura 2 muestra el porcentaje de captación de agua durante enjuague de masas de rollo de pan como se determina midiendo la masa de la masa antes y después del enjuague. Las diferentes soluciones de enjuague son agua corriente, agua corriente con Aqualisina I (Aql), agua corriente con inhibidor de tripsina de soja (SBTI) y agua corriente con complejos Aql-SBTI.

La Figura 3 muestra actividad de agua de la corteza de rollos de pan como se mide después de 1, 2 o 4 horas de enfriamiento. Antes de la fermentación y el horneado, la masa para los rollos de pan se enjuagó en uno de agua corriente, agua corriente con Aqualisina I (Aql), agua corriente con inhibidor de tripsina de soja (SBTI) o agua corriente con complejos Aql-SBTI.

Descripción detallada de la invención

Antes de que se describan el presente método y los dispositivos usados en la invención, ha de entenderse que esta invención no está limitada a métodos, componentes o dispositivos particulares descritos, ya que tales métodos, componentes y dispositivos pueden, por supuesto, variar. Ha de entenderse también también que la terminología usada en el presente documento no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos de que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por un experto en la materia a la cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos pueden usarse en la práctica o la prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen ahora.

En esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un, uno, una" y "el, la" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.

Las frases "que comprende", "comprende", y "comprendido por" como se usa en el presente documento son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o de extremo abierto y no excluyen miembros, elementos o etapas de método no recitados adicionales.

Las frases "que comprende", "comprende" y "comprendido por" también incluyen la frase "que consiste en".

El término "aproximadamente" como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tales como un parámetro, una cantidad, una duración temporal, y similares, pretende abarcar variaciones de /- 10 % o menos, preferentemente /- 5 % o menos, más preferentemente /-1 % o menos y todavía más preferentemente /- 0,1 % o menos de y del valor específico, hasta ahora las variaciones son apropiadas para realizarse en la invención desvelada. Ha de entenderse que el valor al cual el modificador "aproximadamente" se refiere es por sí mismo también específicamente, y preferentemente, desvelado.

La recitación de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los números y fracciones subsumidos dentro de los intervalos respectivos, así como también los puntos finales recitados.

La presente invención proporciona un método para activar selectivamente una hidrolasa termoestable a una temperatura por encima de T1, cuyo método comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar, a una temperatura por debajo de T1, en donde dicha temperatura T1 es al menos 60 °C, una composición que comprende la hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I y es resistente a inactivación irreversible a una temperatura por encima de T1, en donde dicho inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semisintética o sintética de los mismos y en donde el inhibidor se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta, en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo inhibidor de hidrolasa a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en dicho complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo a una temperatura de aproximadamente T1, y;

b) elevar la temperatura de dicha composición a una temperatura por encima de T1, activando de esta manera la hidrolasa.

Los términos "activar" o "activado" o derivados de los mismos se usan en su sentido más amplio en el presente documento, y particularmente denotan aumentar o estimular, en cualquier grado, o proporcionar una propiedad, función, variable, etc. de lo que se dice que está activado. Donde la activación efectúa una variable determinable o medible, entonces la activación puede abarcar un aumento en el valor de dicha variable en al menos aproximadamente el 10 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 20 %, en al menos aproximadamente el 30 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 40 %, en al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 60 %, en al menos aproximadamente el 70 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 80 %, en al menos aproximadamente el 90 %, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 95 %, tal como en al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso en el 100 %, en comparación con una situación de referencia sin dicha activación.

Como se pretende en el presente documento, la frase "activar una hidrolasa" denota particularmente aumentar o estimular la actividad de una hidrolasa más allá de la actividad de la hidrolasa sin dicha activación tal como por ejemplo hidrolasa inhibida, o proporcionar actividad de hidrolasa (es decir, hacer funcional a una hidrolasa inactiva). En realizaciones, dicha activación comprende hacer activa o funcional a una hidrolasa inactiva.

En realizaciones, la hidrolasa activada tiene una actividad de al menos el 40 %, preferentemente al menos el 50 %, o al menos el 60 %, más preferentemente al menos el 70 %, o al menos el 80 %, incluso más preferentemente al menos el 90 % o al menos el 95 % de la hidrolasa no inhibida (es decir hidrolasa en la ausencia de inhibidor) como se mide a una temperatura por encima de T1.

Los términos "inhibir" o "inhibido" o derivados de los mismos se usan en su sentido más amplio en el presente documento, y particularmente denotan disminuir o reducir, en cualquier grado, abolir o evitar una propiedad, función, variable, etc. de lo que se dice que está inhibido. Cuando la inhibición efectúa una variable determinable o medible, entonces la inhibición puede abarcar una disminución o reducción en el valor de dicha variable en al menos aproximadamente el 10 %, por ejemplo en al menos aproximadamente el 20 %, en al menos aproximadamente el 30 %, por ejemplo en al menos aproximadamente el 40 %, en al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo en al menos aproximadamente el 60 %, en al menos aproximadamente el 70 %, por ejemplo en al menos aproximadamente el 80 %, en al menos aproximadamente el 90 %, por ejemplo en al menos aproximadamente el 95 %, como en al menos aproximadamente el 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o incluso en el 100 %, comparado con una situación de referencia sin dicha inhibición.

Como se propone en el presente documento, la frase "inhibir una hidrolasa" denota particularmente inhibir, tal como reducir, abolir o evitar, la actividad de una hidrolasa por debajo de la actividad de la hidrolasa no inhibida. Con "actividad residual" se entiende en el presente documento la actividad de la hidrolasa en la presencia de inhibidor con respecto a la actividad de la hidrolasa en la ausencia del inhibidor. En realizaciones, la actividad de la hidrolasa en el complejo hidrolasa - inhibidor (es decir, la hidrolasa inhibida) como se describe en el presente documento es menor del 25 %, preferentemente menor del 20 %, o menor del 15 %, más preferentemente menor del 10 %, incluso más preferentemente menor del 5 % de la actividad de la hidrolasa no inhibida (es decir, la hidrolasa en la ausencia del inhibidor) como se mide a una temperatura por debajo de T1, tal como a temperatura ambiente (por ejemplo, en 20,0 2,0 °C). Por consiguiente, en realizaciones la actividad relativa de la hidrolasa inhibida es menor del 25 %, preferentemente menor del 20 % o menor del 15 %, más preferentemente menor del 10 %, incluso más preferentemente menor del 5 %, como se mide a una temperatura por debajo de T1, tal como a temperatura ambiente.

La actividad enzimática puede determinarse o medirse con ensayos conocidos en la técnica. Típicamente, la enzima se pre-incuba con o sin inhibidor de enzima, y la actividad enzimática (residual) se mide después tras poner en contacto la enzima con un sustrato apropiado. Por ejemplo, la actividad proteasa puede determinarse usando el sustrato sintético N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanalida (AAPF) midiendo colorimétricamente la cantidad de p-nitroanalida formada enzimáticamente.

Los términos "inhibidor" o "inhibidor de enzima" generalmente se refieren a una molécula la cual es capaz de inhibir la actividad de una enzima. El inhibidor puede unirse a la enzima para inhibirla. En "inhibición irreversible", el inhibidor se enlaza covalentemente a la enzima o se une tan fuertemente que su disociación de la enzima es muy lenta. La "inhibición reversible" se caracteriza por un enlace no covalente del inhibidor a la enzima y puede caracterizarse por un equilibrio rápido entre la enzima y el inhibidor. Un "inhibidor competitivo" bloquea el sitio activo de la enzima y en esta forma evita la interacción de sitio sustrato/activo, de esta manera disminuyendo la tasa de reacción. En el caso de inhibición competitiva, el inhibidor puede imitar el sustrato normal de dicha enzima. Para este tipo de inhibición, las gráficas Dixon (inversa de proporción de reacción, 1/V, frente a concentración de inhibidor, [I]) que corresponde a las diferentes concentraciones de sustrato y las gráficas Lineweaver-Bruk (inversa de proporción de reacción, 1/V, frente a inversa de concentración de sustrato, 1/[S]) que corresponde a concentraciones de inhibidor diferentes intersectadas en el cuadrante izquierdo y el eje vertical, respectivamente. Para "inhibición no competitiva", tanto inhibidor como sustrato pueden unirse a la enzima y esto independiente del orden de unión. La inhibición puede deberse a un cambio conformacional de la enzima en o cerca del sitio activo, de esta manera disminuyendo el número de rotación. En el caso de inhibición no competitiva, las gráficas Dixon y Lineweaver-Burk intersectan en el eje horizontal en el cuadrante izquierdo.

El inhibidor de hidrolasa en los complejos como se enseña en el presente documento pueden ser cualquier tipo de inhibidor que inhibe reversiblemente la hidrolasa. Más particularmente, el inhibidor como se enseña en el presente documento inhibe la hidrolasa a través de la formación de un complejo de inhibidor hidrolasa reversible. El inhibidor puede ser por ejemplo un inhibidor competitivo o un inhibidor no competitivo.

Los inhibidores como se usan en el presente documento son preferentemente proteínas o péptidos, más preferentemente proteínas. El término "proteína" como se usa en el presente documento generalmente se refiere a una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas, es decir, cadenas poliméricas de restos de aminoácidos enlazados por enlaces peptídicos. El término puede abarcar proteínas producidas de forma natural, recombinantes, semi-sintéticas o sintéticas. El término también abarca proteínas que llevan una o más modificaciones co- o post-expresión de la cadena o cadenas polipeptídicas, tales como, sin limitación, glucosilación, acetilación, fosforilación, sulfonación, metilación, ubiquitinación, retirada de péptido de señal, retirada de Met N-terminal, conversión de pro-enzimas o pre-hormonas en formas activas, etc. El término además también incluye variantes o mutantes de proteína que llevan variaciones de secuencia de aminoácidos vis-á-vis una proteína nativa correspondiente, tales como, por ejemplo, deleciones, adiciones y/o sustituciones de aminoácidos. El término contempla tanto proteínas de longitud completa como partes o fragmentos de proteína, por ejemplo, partes de proteína que se producen de forma natural que resultan de procesamiento de dichas proteínas de longitud completa.

Los inhibidores como se usan en el presente documento pueden ser de naturaleza biológica (por ejemplo, aislarse de una especie biológica tal como una planta o un microorganismo), recombinante o (semi)sintético. Como también se desvela en el presente documento, el inhibidor es de origen vegetal (es decir que se produce de forma natural en plantas) o una variante recombinante o (semi)sintética del mismo. Los ejemplos no limitantes de fuentes vegetales incluyen trigo (Triticum aestivum), maíz, avena, centeno, arroz, soja (Glycine max), etc. Como también se desvela en el presente documento, la fuente vegetal se selecciona del grupo que comprende o que consiste en trigo (Triticum aestivum), maíz, avena, centeno, arroz y soja (Glycine max). En realizaciones particulares, el inhibidor se origina de soja o es una variante recombinante o (semi)sintética del mismo.

El término "enzima" generalmente se refiere a una molécula que cataliza una reacción química. Las enzimas usadas en el presente documento son preferentemente hidrolasas. Con "hidrolasa" se entiende en el presente documento una enzima que cataliza la hidrólisis (es decir, la escisión de enlaces químicos por la adición de agua) de un enlace químico. Los ejemplos no limitantes de hidrolasas incluyen las enzimas como se clasifica en E.C. 3, tales como proteasas (o peptidasas), deshalogenasas, desacetilasas, nitrilasas, lactamasas, glucosidasas, fosfatasas, difosfatasas, amilasas, lipasas, betaglucanasas, celulasas, lipasas, oxidasas, lipoxigenasas, deshidrogenasas, lacasas, etc.

Como también se desvela en el presente documento, la hidrolasa se selecciona del grupo que comprende enzimas celulolíticas y/o glucanolíticas (también denominadas celulasas (EC:3.2.1.4), amilasas (EC:3.2.1.1) y/o hemicelulasas), 1,3-xilosidasas (tales como EC:3.2.1.72), alfa-L-arabinofuranosidasas (como EC:3.2.1.55), 1,3-1,4-glucanasas (tales como EC:3.2.1.73 o tales como 3.2.1.6) e hidrolasas de enlaces peptídicos (también denominadas proteasas o peptidasas (EC:3.4), tales como serina peptidasas (EC:3.4.21)).

Como también se desvela en el presente documento, la hidrolasa es una proteasa. Los términos "proteasa", "peptidasa" y "péptido hidrolasa" se usan como sinónimos en el presente documento y denotan hidrolasas que catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos. La hidrolasa es una serina proteasa, más particularmente Aqualisina I de Thermus aquaticus, más particularmente Thermus aquaticus LMG 8924.

La hidrolasa es una serina proteasa, y el inhibidor es un inhibidor de tripsina. Por ejemplo, la hidrolasa puede ser Aqualisina I de Thermus aquaticus, más particularmente Thermus aquaticus LMG 8924, y el inhibidor puede ser inhibidor de tripsina de soja.

En realizaciones, la hidrolasa puede ser Aqualisina I de Thermus aquaticus, más particularmente Thermus aquaticus LMG 8924, y el inhibidor puede ser un extracto de trigo, un extracto de arroz, un extracto de avena o un extracto de centeno.

La expresión "sensible a temperatura" como se usa en el presente documento en conexión con el inhibidor denota que la estabilidad del inhibidor es dependiente de temperatura. Un inhibidor sensible a temperatura como se usa en el presente documento denota particularmente un inhibidor el cual llega a ser inactivo irreversiblemente a temperaturas elevadas, más particularmente a una temperatura de aproximadamente T1 o más alta. En realizaciones, el inhibidor sensible a temperatura se inactiva irreversiblemente a una temperatura de aproximadamente T1. Un ejemplo no limitante de un inhibidor sensible a temperatura es inhibidor de tripsina de soja (SBTI).

El término "termoestable" como se usa en el presente documento en conexión con la enzima, en particular la hidrolasa, significa que la enzima, en particular la hidrolasa, es resistente a inactivación irreversible (por ejemplo, debido a cambios irreversibles en su estructura química tales como desnaturalización) a temperaturas elevadas, más particularmente a una temperatura por encima de T1. Por lo tanto, la temperatura T1 está preferentemente abajo de la temperatura de desnaturalización de la hidrolasa. Un ejemplo no limitante de una hidrolasa termoestable es Aqualisina I.

La hidrolasa como se enseña en el presente documento es una hidrolasa "termoestable", es decir, una hidrolasa la cual es activa a temperaturas elevadas, en particular a temperaturas por encima de T1. Una ventaja de usar hidrolasas termófilas es que la proporción de reacción química aumenta con el aumento de la temperatura del proceso industrial. Como también se desvela en el presente documento, la hidrolasa como se enseña en el presente documento tiene una actividad máxima a 40 °C o más alta, preferentemente a 50 °C o más alta. En particular, la hidrolasa como se enseña en el presente documento tiene una actividad máxima a 60 °C o más alta, preferentemente a 70 °C o más alta.

"T1" como se usa en el presente documento denota la temperatura a la cual el complejo inhibidor de hidrolasa como se enseña en el presente documento se disocia. Como también se desvela en el presente documento, dicha temperatura T1 es preferentemente al menos 40 °C, tal como al menos 45 °C, más preferentemente al menos 50 °C, tal como al menos 52 °C, al menos 54 °C, al menos 55 °C, al menos 56 °C o al menos 58 °C. Dicha temperatura T1 es al menos 60 °C.

El término "disociación" como se usa en el presente documento denota el proceso en donde el complejo inhibidor de hidrolasa como se enseña en el presente documento se separa o se rompe, liberando de esta manera la hidrolasa y el inhibidor. En realizaciones, la disociación del complejo hidrolasa-inhibidor es reversible. En caso de que la disociación sea reversible, el complejo de hidrolasa-inhibidor, puede reasociarse tras la disminución de la temperatura por debajo de T1. En otras realizaciones, la disociación del complejo hidrolasa-inhibidor es irreversible, por ejemplo en caso de que el inhibidor se vuelva irreversiblemente inactivado a una temperatura de aproximadamente T1.

La invención también se refiere a una composición que comprende una hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I, en donde el inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semi-sintética o sintética de los mismos y se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta y en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo de hidrolasa-inhibidor a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en el complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo en una temperatura de aproximadamente t 1.

Las composiciones como se enseñan en el presente documento pueden comprender uno o más, tal como dos, tres, cuatro, etc. complejos de hidrolasa-inhibidor.

Además de la hidrolasa termoestable y el inhibidor sensible a temperatura como se enseña en el presente documento, la composición como se enseña en el presente documento puede además comprender uno más vehículos o excipientes adecuados. Los ejemplos no limitantes de "vehículos" o "excipientes" incluyen cualquiera y todos de disolventes, diluyentes, tampones, solubilizantes, coloides, medios de dispersión, vehículos, cargas, harinas de cereal, fibra (tal como, por ejemplo, fibra de avena), proteínas, lípidos (tales como, por ejemplo, margarina, mantequilla, aceite y mantecas), sales, almidones, azúcares, polisacáridos, polioles, álcalis (tales como, por ejemplo, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, silicato de sodio, citrato de sodio e hidróxido de amonio), antioxidantes (tales como, por ejemplo, ácido ascórbico, glutatión, cisteína), emulsionantes (tales como, por ejemplo, ésteres de ácido diacetil tartárico de monoglicéridos (DATEM), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), monoestearato de glicerilo (GMS), ramnolípidos, lecitinas, sacaroésteres y sales biliares), vitaminas (tales como, por ejemplo, ácido pantoténico y vitamina E), edulcorantes, colorantes, saborizantes, aromatizantes, agentes espesantes (tales como, por ejemplo, gomas), tensioactivos (tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo lineales (LAS), alquilaril sulfonatos tales como sulfonato de dodecilbenceno (DDBS), sulfatos de alcohol éter tales como sulfato de sodio lauril éter (SLES), etoxilatos de alcohol y compuestos de amonio cuaternario de cadena larga), agentes de formación (tales como, por ejemplo, tripolifosfato de sodio (STPP), citratos, tartratos, succinatos, gluconatos, policarboxilatos, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietiltriaminopentaacético (DTPA), ácido hidroxietilendiaminotriacético (HEDTA), dihidroxietilglicina (DEG) y trietanolamina), agentes anti-redeposición (tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa (CMC), polivinilpirrolidona, polietilenglicol (PEG) y alcohol polivinílico), blanqueadores de oxígeno activo (tales como, por ejemplo, percarbonato de sodio), agentes antimicrobianos (tales como, por ejemplo, cloruros de amonio cuaternarios y alcoholes), agentes antifúngicos, suavizantes de tela (tales como, por ejemplo, aminas de cadena larga y compuestos de amonio cuaternario de cadena larga), una o más fragancias, uno o más abrillantadores ópticos (tales como, por ejemplo, aminotriazinas, cumarinas y estilbenos), uno o más conservantes (tales como, por ejemplo, glutaraldehído y EDTA), hidrótopos (tales como, por ejemplo, xilenosulfonato, cumenosulfonato, algunos sulfatos de glicol y éter, y urea), reguladores de espuma (tales como jabones, siloxanos y parafinas), inhibidores de corrosión (tales como, por ejemplo, silicato de sodio), agentes de quelación (tales como, por ejemplo, EDTA o glutationa), disgregantes, aglutinantes, lubricantes, agentes de humectación y similares.

Las composiciones como se enseña en el presente documento pueden emplearse ventajosamente en diversas aplicaciones, más particularmente en aplicaciones las cuales requieren una hidrolasa activa a temperaturas elevadas, pero en donde la actividad de dicha hidrolasa a temperaturas inferiores, en particular a temperatura ambiente, se inhibe preferentemente. Los ejemplos no limitantes incluyen el uso de las composiciones como se enseña en el presente documento en la industria alimenticia, por ejemplo para hornear, para aplicaciones de pastelería, cervecería (para clarificación de cerveza), preparación de auxiliares digestivos, producción de zumos de frutas (para clarificación de zumos de frutas) y jarabes de almidón, producción de bebidas espirituosas y en la industria del alcohol; en la industria de alimentos, por ejemplo para gránulos de alimentos y producción de alimento de mascotas; en industria textil, por ejemplo para desencolado, para bioblanqueado de madera o seda; en industria del papel, por ejemplo para blanqueamiento de papel, para procesamiento de celulosa; para la producción de biocombustible; en la industria de detergente, por ejemplo como aditivo en detergentes de lavandería o de vajilla o limpieza superficial; para conversión de almidón; en la industria farmacéutica, por ejemplo para la producción de componentes farmacéuticos tales como quitosano, etc.

En realizaciones, las composiciones como se enseñan en el presente documento son alimentos o aditivos alimenticios, tales como por ejemplo mejoradores de pan o pastelería, o composiciones de detergente, tales como, por ejemplo, detergentes de lavandería y detergentes de vajilla.

Los "mejoradores de pan" (también denominados "mejoradores de masa" o "agente mejorador" o "agente de tratamiento de harina") se añaden típicamente a la masa durante el horneado con el fin de mejorar textura, volumen, sabor y frescura del producto horneado así como también para mejorar la maquinabilidad y estabilidad de la masa. Típicamente, un mejorador de pan comprende o consiste en: una o más enzimas (tales como, por ejemplo, amilasas, xilanasas, lipasas, oxidasas, lipoxigenasas, proteasas, deshidrogenadas y lacasas), uno o más agentes de oxidación o reducción (tales como, por ejemplo, ácido ascórbico, glutationa, cisteína), uno o más emulsionantes (tales como, por ejemplo, ésteres de ácido diacetil tartárico de monoglicéridos (DATEM), estearoil lactilato de sodio (SSL), estearoil lactilato de calcio (CSL), monoestearato de glicerol (GMS), ramnolípidos, lecitinas, sacaroésteres, sales biliares), uno o más materiales lipídicos (tales como, por ejemplo, margarina, mantequilla, aceite, manteca), una o más vitaminas (tales como, por ejemplo, ácido pantoténico y vitamina E), una o más gomas y/o una o más fuentes de fibra (tales como por ejemplo fibra de avena).

En alimento animal, se han usado enzimas como aditivos alimenticios por décadas. Se ha demostrado que algunas enzimas mejoran uno o ambos de la ganancia de peso corporal absoluto animal (BWG, por sus siglas en inglés) y la proporción de conversión alimenticia (FCR, por sus siglas en inglés) de un alimento dado. Las enzimas usadas en alimento pueden por ejemplo permitir a los nutricionistas reducir la energía y/o requerimientos de proteína en las dietas sin afectar los rendimientos zootécnicos de animales. El alimento animal, que incluye ensilado, alimentación granulada y alimento granulado, comprende principalmente productos alimenticios y aditivos de alimentos entre los cuales están enzimas. Los productos alimenticios pueden ser materiales vegetales tales como cereales, legumbres, melaza de remolacha, pulpas de patata, harina de cacahuete y productos de biocombustible o siendo productos animales como harina de pescado, harina de carne y hueso, harina de insecto, etc.

Las composiciones de detergente comprenden típicamente o consisten en: uno o más tensioactivos (tales como, por ejemplo, sulfonatos de alquilo lineales (LAS), sulfonatos de alquilo y arilo tales como dodecilbencensulfonato (DDBs ) y sulfatos de alcohol y éter tales como lauril éter sulfato de sodio (SLES), etoxilatos de alcohol, y compuestos de amonio cuaternario de cadena larga), uno o más formadores de volumen (tales como, por ejemplo, tripolifosfato de sodio (STPP), citratos, tartratos, succinatos, gluconatos, policarboxilatos, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido hidroxietilendiaminotriacético (HEDTA), dihidroxietilglicina (DEG), y trietanolamina), uno o más álcalis (tales como, por ejemplo, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, silicato de sodio, citrato de sodio e hidróxido de amonio), agentes anti-redeposición (tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa (CMC), polivinilpirrolidona, polietilenglicol (PEG), y alcohol polivinílico), una o más enzimas (tales como, por ejemplo, peptidasa, amilasas y lipasas), uno o más blanqueadores de oxígeno activo (tales como, por ejemplo, percarbonato de sodio), uno o más agentes antimicrobianos (tales como, por ejemplo, cloruros de amonio cuaternario y alcoholes), uno o más suavizantes de tela (tales como, por ejemplo, aminas de cadena larga y compuestos de amonio cuaternario de cadena larga), una o más fragancias, uno o más abrillantadores ópticos (tales como, por ejemplo, aminotriazinas, cumarinas y estilbenos), tales como, por ejemplo, xilensulfonato, cumensulfonato, algunos sulfatos de glicol y éter y urea), uno o más reguladores de espuma (tales como jabones, siloxanos y parafinas) y/o uno o más inhibidores de corrosión (tales como, por ejemplo, silicato de sodio).

También se describe en el presente documento el uso de los complejos de hidrolasa-inhibidor o las composiciones como se enseña en el presente documento en los alimentos o industria de alimentos, en la industria de detergentes, en la industria de papel, en la industria textil, para la producción de biocombustible y/o en la industria farmacéutica.

Una realización se refiere al uso de los complejos de hidrolasa-inhibidor o las composiciones como se enseña en el presente documento en la industria alimentaria.

Una realización se refiere al uso de los complejos de hidrolasa-inhibidor o las composiciones como se enseña en el presente documento en la industria de detergentes.

Una realización se refiere al uso de los complejos de hidrolasa-inhibidor o las composiciones como se enseña en el presente documento en la industria de alimentos. Una realización adicional se refiere al uso de los complejos de hidrolasa-inhibidor o las composiciones como se enseña en la presente en aplicaciones de panadería o pastelería.

Una realización particular se refiere al uso de los complejos de hidrolasa-inhibidor o las composiciones como se enseña en el presente documento para mejorar el efecto crujiente de productos horneados, en particular productos de pan, más particularmente para retener la corteza crujiente de productos horneados, en particular productos de panadería, durante un tiempo considerable después de horneado. También se desvela en el presente documento un método para mejorar el efecto crujiente de productos horneados, en particular productos de panadería, más particularmente para retener la corteza crujiente de productos horneados, en particular productos de panadería, durante un tiempo considerable después de horneado, el método que comprende aplicar una composición como se enseña en el presente documento en la parte externa de una masa o un producto parcialmente horneado, en particular producto de panadería.

"Productos de panadería" incluyen productos de pan blando y productos crujientes. Los "productos de pan blando" presentan una corteza blanda, incluyendo entre otros todos los productos de panadería envasados y productos dulces (envasados o no envasados). Los ejemplos no limitantes de productos de pan blando son pan, rollos blandos, donuts, bollos, bollos de microondas, pastelería danesa, rollos de hamburguesa, pizza y pan de pita. Los "productos crujientes" tienen una corteza crujiente. Habitualmente no están envasados o están envueltos con un envase de papel. Los ejemplos no limitantes de productos crujientes son baguettes y rollos.

Las "tartas" son productos horneados basados en masa preparados con tres ingredientes principales presentes en proporciones diferentes dependiendo del tipo de tarta: harina, azúcar y huevos (huevos enteros y/o clara de huevo y/o yema de huevo). Los ingredientes adicionales pueden ser por ejemplo grasas y/o lípidos, agentes fermentadores, emulsionantes, proteínas de leche, hidrocoloides, almidón (nativo, química o físicamente modificado), polvo de cacao, chocolate, agentes colorantes, saborizantes, etc. Las tartas pueden fermentarse debido a la adición de ingredientes (por ejemplo polvo de horneado, huevo, emulsionante, proteína...) y/o debido al proceso de preparación de tarta (por ejemplo (batido de la masa). Los tipos típicos de tartas son crema para hogaza y pasteles de mantecado, crema para batir y pasteles de mantecado, bizcochos, magdalenas, donuts de tarta, brownies, etc.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para preparar las composiciones como se enseña en el presente documento, comprendiendo el método las siguientes etapas:

a) mezclar la hidrolasa termoestable y el inhibidor sensible a temperatura en un disolvente adecuado;

b) permitir al inhibidor formar un complejo con la hidrolasa incubando la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperatura por debajo de T1; y

c) opcionalmente secar, refrigerar, congelar y/o estabilizar la mezcla.

La hidrolasa y el inhibidor pueden proporcionarse en estado líquido o como un sólido.

El disolvente es preferentemente un líquido. Un "disolvente adecuado" denota un disolvente que es compatible con los otros componentes de la composición, más particularmente que es compatible con la hidrolasa (es decir, que no afecta a la estabilidad de la hidrolasa). Los ejemplos no limitantes de disolventes adecuados incluyen tampones tales como, por ejemplo, tampón acetato de sodio o tampón borato de sodio.

La mezcla obtenida en la etapa a) puede ser, por ejemplo, una solución o una suspensión.

La incubación de la mezcla del inhibidor sensible a temperatura y la hidrolasa termoestable obtenida en la etapa a) debe llevarse a cabo a una temperatura por debajo de T1 para permitir que se forme el complejo de hidrolasa-inhibidor. En realizaciones, la incubación se lleva a cabo a una temperatura de al menos 1o °C por debajo de T1, preferentemente al menos 15 °C por debajo de T1, más preferentemente al menos 20 °C por debajo de T1, tal como al menos 25 °C, 30 °C, 35 °C, o 40 °C por debajo de T1. Preferentemente, la incubación se lleva a cabo a una temperatura entre 0 °C y aproximadamente 40 °C, preferentemente entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 30 °C, más preferentemente entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 25 °C, tal como a aproximadamente 20 °C.

La incubación se realiza durante un tiempo suficiente para lograr la inhibición de la actividad hidrolasa. Preferentemente, la actividad enzimática se inhibe en al menos el 75 %, preferentemente en al menos el 80 %, o al menos el 85 %, más preferentemente en al menos el 90 %, incluso más preferentemente en al menos el 95 %, y lo más preferentemente en el 100 % (es decir, enzima inactiva) con respecto a la actividad enzimática de enzima no inhibida (es decir enzima en la ausencia de inhibidor) como se mide a temperatura ambiente (es decir, a una temperatura entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 30 °C, preferentemente entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 25 °C, tal como aproximadamente 20 °C). Típicamente, el tiempo de incubación puede variar de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 2 horas, preferentemente de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1 hora, tal como aproximadamente 30 minutos.

La mezcla obtenida en la etapa b) después de incubación puede usarse como tal o puede además procesarse. Por ejemplo, la mezcla puede secarse, enfriarse o refrigerarse, congelarse y/o estabilizarse. Por consiguiente, en realizaciones, el método como se enseña en el presente documento puede además comprender una etapa c), en donde puede realizarse una o más de las siguientes etapas de procesamiento: secado de la mezcla, enfriado de la mezcla, congelado de la mezcla y estabilizado de la mezcla.

El secado de la mezcla puede lograrse por ejemplo por secado por aspersión, secado por congelación, secado por lecho fluido, secado por tambor, secado por película, secado rápido, secado por anillo, secado por infrarrojo, extrusión o aglomeración.

La mezcla puede enfriarse a una temperatura por debajo de 10 °C, preferentemente por debajo de 8 °C, más preferentemente por debajo de 5 °C (es decir, refrigeración).

La mezcla puede congelarse a una temperatura por debajo de 0 °C, preferentemente por debajo de -10 °C, más preferentemente por debajo de -20 °C.

Para estabilizar la mezcla, pueden añadirse estabilizantes adecuados tales como, por ejemplo, glicerol, sales y conservantes.

Como se describe anteriormente, la composición como se enseña en el presente documento puede además comprender uno o más vehículos o excipientes. Estos pueden añadirse a la mezcla antes o después de las etapas de procesamiento adicionales.

La presente invención además será descrita en los siguientes ejemplos sin limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Complejos de inhibidor de peptidasa-peptidasa

Métodos

Ensayo de actividad de peptidasa

Se determina colorimétricamente la actividad peptidasa usando el sustrato sintético N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-pnitroanilida (AAPF). La peptidasa es Aqualisina I (Aq I), una serina peptidasa alcalina termófila de endo-funcionamiento producida por Thermus aquaticus LMG 8924. La mezcla de ensayo comprende 45 pl de una solución apropiadamente de enzima diluida [0,95 pM de Aql] mezclada con 60 pl de 50 mM de tampón de borato de sodio (pH 10,0) y 60 pl de solución de sustrato [1,28 mM a A p F en 50 mM de tampón de borato de sodio (pH 10,0)], y se calienta durante exactamente 20 min a diferentes temperaturas de incubación (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 80 °C y 90 °C). Inmediatamente después del calentamiento, todas las muestras se enfriaron en agua enfriada con hielo, 100 pl del volumen de reacción se transfirieron a una placa de microtitulación y se determinó la absorbancia a 415 nm (Abs 415 nm) a temperatura ambiente para medir la cantidad de p-nitroanilida formada enzimáticamente. Cada muestra se analizó por triplicado.

Actividad peptidasa en presencia de inhibidor de peptidasa

El inhibidor fue inhibidor de tripsina de soja (SBTI) de Glycine max (soja) (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica). Se preparó una mezcla (45 pl) que contiene 0,95 pM de Aq I y 95,7 pM de SBTl y se preincubó durante 30 min a temperatura ambiente. Esta mezcla se usó en la mezcla de ensayo como se describe anteriormente en lugar de la solución enzimática. Se incubaron las muestras durante exactamente 20 min a diferentes temperaturas de incubación (40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C y 90 °C). Inmediatamente después del calentamiento, todas las muestras se enfriaron en agua enfriada en hielo, 100 pl del volumen de reacción se transfirieron a una placa de microtitulación y la extinción a 415 nm se midió contra un control, preparado incubando la mezcla de ensayo con agua en lugar de solución enzimática. Todas las muestras se analizaron por triplicado.

Resultados

A temperaturas de incubación inferiores el impacto del inhibidor fue más pronunciado que a temperaturas más altas (Figura 1). En presencia de inhibidor suficiente, no se midió actividad Aq I durante incubación a temperaturas hasta 60 °C. En contraste, a 70 °C y a 80 °C la actividad Aq I relativa (comparada con la actividad Aq en ausencia del inhibidor) en presencia de la misma cantidad de inhibidor permaneció aproximadamente al 50 %.

Estos resultados muestran que durante la preincubación Aq I interactúa con SBTI para formar un complejo de enzimainhibidor con una estabilidad dependiente de la temperatura. A 60 °C, la actividad relativa de Aq I no es significativamente diferente de aquella a temperaturas inferiores (30-50 °C). Esto indica que hasta 60 °C el complejo de enzima-inhibidor es relativamente estable. A temperaturas superiores (de 60 a 80 °C), el impacto de inhibidor disminuye debido a una disociación dependiente a temperatura del complejo de enzima-inhibidor.

En ausencia de inhibidor, la actividad de Aq I es la más alta a 70 °C. A temperaturas que exceden 70 °C, la actividad de Aq I disminuye debido a la desnaturalización de la enzima como se describe por Matsuzawa et al. (1988, European Journal of Biochemistry: 171, 441-447).

Bajo las condiciones experimentales presentes, no se midió actividad de Aq I en presencia de inhibidor a temperaturas de incubación de hasta 60 °C. La incubación de Aq I en presencia de inhibidor en 70 °C y 80 °C resultó en actividades de Aq I residuales de aproximadamente el 50 % de la actividad Aq I en ausencia de inhibidor. A temperaturas superiores a 80 °C, la presencia de inhibidor no tuvo impacto en la actividad de Aq I.

Ejemplo 2: Uso de complejos de inhibidor de peptidasa-peptidasa para mejorar el crujido de productos de pan

Métodos

Los complejos de enzima-inhibidor que comprenden Aq I e inhibidor de tripsina de soja (Sigma-Aldrich, Bornem, Bélgica) se aplicaron en la superficie de muestras de masa de rollo de pan almacenadas congeladas. La masa de rollo de pan almacenada congelada se compró de un supermercado local (AVEVE Group, Leuven, Bélgica).

Antes de descongelar y fermentar, se enjuagan consecutivamente las muestras de masa de rollo congeladas en nitrógeno líquido (para congelar uniformemente la superficie de todas las muestras de masa de rollo de pan antes de enjuagar) y en solución acuosa con 1) complejos de enzima-inhibidor, 2) enzima sola (a una concentración de 8,54 nmol/ml de agua corriente), 3) inhibidor solo (a una concentración de 853,73 nmol/ml de agua corriente) o 4) en agua corriente sin aditivos (control). La solución con complejos de enzima-inhibidor contenía 8,54 nmol/ml de enzima agua corriente y 853,73 nmol/ml de inhibidor de agua corriente para obtener el 100 % de inhibición de enzima y se equilibró durante 30 min para asegurar la formación de complejos de enzima-inhibidor. Al enjuagar las muestras de masa de rollo de pan congelado en la solución acuosa, se asegura que la enzima, ya sea o no después de ser liberada del inhibidor, solamente modifica la superficie del rollo de masa/pan durante horneado.

La masa de la masa de rollo de pan se determinó antes y después de enjuagar en las soluciones acuosas o el agua corriente.

Las muestras de masa de rollo de pan enjuagadas después se fermentaron (a 33 °C y 95 % de humedad relativa) durante 4 horas en una cabina de fermentación (National Manufacturing, Lincoln, NE, EE.UU.). Se realizó el horneado en un horno Condilux deck (Hein, Strasse, Luxemburgo) durante 30 minutos a 220 °C con calentamiento por arriba y por abajo.

La actividad de agua de la corteza, que es una medición para corteza crujiente (Primo-Martinet et al. 2006 Journal of Cereal Science 43(3):342-352), se determinó después de 1, 2 y 4 horas de enfriamiento.

Resultados

Para todos los experimentos, una cantidad similar de agua podría añadirse a las superficies de masa como se evidencia por la Figura 2 lo cual muestra el aumento en masa de pasta antes y después del enjuague. La Figura 3 muestra, especialmente después de 2 h de enfriamiento, que los rollos de pan de muestras de masa enjuagadas previamente en soluciones de enzima y complejo de enzima-inhibidor tienen una actividad de agua inferior y, de esta forma, una corteza más crujiente comparada con rollos de pan enjuagados en agua (control) o en agua con solo inhibidor presente. La actividad de agua de rollos de pan de muestras de masa previamente enjuagadas en soluciones de enzima y complejo de enzima-inhibidor es sustancialmente la misma, indicando que la enzima añadida como un complejo con inhibidor es capaz de realizar una actividad hidrolítica lo cual resulta en actividad de agua de corteza similar comparada con la enzima añadida sin inhibidor.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Método para activar selectivamente una hidrolasa termoestable a una temperatura por encima de T1, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:

a) proporcionar, a una temperatura por debajo de T1, en donde dicha temperatura T1 es al menos 60 °C, una composición que comprende la hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I y es resistente a inactivación irreversible a una temperatura por encima de T1, en donde dicho inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semisintética o sintética de los mismos y en donde el inhibidor se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta, y en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo inhibidor de hidrolasa a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en dicho complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo a una temperatura de aproximadamente T1, y;

b) elevar la temperatura de dicha composición a una temperatura por encima de T1, activando de esta manera la hidrolasa.

2. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la hidrolasa es Aqualisina I de Thermus aquaticus LMG 8924.

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el inhibidor es inhibidor de tripsina de soja.

4. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho inhibidor se inactiva irreversiblemente a una temperatura de T1; en donde dicha hidrolasa tiene actividad máxima a una temperatura por encima de T1; y/o en donde la actividad de la enzima en el complejo es menos del 25 % de la actividad de la enzima no inhibida.

5. Una composición que comprende una hidrolasa termoestable y un inhibidor sensible a temperatura, en donde dicha hidrolasa es Aqualisina I, en donde el inhibidor es un inhibidor de tripsina de maíz, avena, centeno, arroz o soja o una variante recombinante, semi-sintética o sintética de los mismos y se vuelve irreversiblemente inactivado a una temperatura de T1 o más alta y en donde dicha hidrolasa termoestable y dicho inhibidor sensible a temperatura forman un complejo de hidrolasa-inhibidor a una temperatura por debajo de T1, en donde dicho inhibidor inhibe la actividad de dicha hidrolasa en dicho complejo a una temperatura por debajo de T1 y se disocia de dicho complejo a una temperatura de T1, en donde dicha temperatura T1 es al menos 60 °C y cuya composición es un alimento o composición alimenticia o una composición de detergente.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la hidrolasa es Aqualisina I de Thermus aquaticus LMG 8924.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en donde el inhibidor es inhibidor de tripsina de soja.

8. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde dicho inhibidor se inactiva irreversiblemente a una temperatura de T1; en donde dicha hidrolasa tiene actividad máxima a una temperatura por encima de T1; y/o en donde la actividad de la enzima en el complejo es menos del 25 % de la actividad de la enzima no inhibida.

9. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicho alimento o composición alimenticia es un alimento o aditivo alimenticio.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho aditivo alimenticio es un mejorador de pan o de pastelería.

11. Uso de la composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10 en la industria de alimentos o de alimentación, o en la industria de detergente, preferentemente en la industria de alimentos, más preferentemente para aplicaciones de panadería o pastelería.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, para mejorar el efecto crujiente de productos horneados.

13. Método para preparar una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, que comprende las siguientes etapas:

a) mezclar la hidrolasa termoestable y el inhibidor sensible a temperatura en un disolvente adecuado;

b) permitir al inhibidor formar un complejo con la hidrolasa incubando la mezcla obtenida en la etapa a) a una temperatura entre 0 °C y 40 °C; y

c) opcionalmente secar, refrigerar, congelar y/o estabilizar la mezcla.