ES2831699T3 - Un carbonato de calcio morfo para el tratamiento de la mala absorción de calcio y los trastornos metabólicos óseos - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende carbonato cálcico amorfo estable (CCA) que comprende al menos un estabilizador para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio en un sujeto que padece hipoparatiroidismo, en donde dicho estabilizador se selecciona de ácidos carboxílicos, aminoácidos fosforilados, péptidos fosforilados, quitina, fosfórico o ésteres sulfúricos de ácidos hidroxicarboxílicos, compuestos orgánicos portadores de hidroxilo seleccionados de mono-, di-, tri-, oligo- y polisacáridos, y polioles seleccionados entre alcoholes y sacáridos y en los que el 100% (en mg) de la ingesta diaria total inicial de calcio elemental se reemplaza por el 50% del calcio elemental de CCA (en mg, calculado sobre la ingesta diaria total inicial).

Description

DESCRIPCIÓN

Un carbonato de calcio morfo para el tratamiento de la mala absorción de calcio y los trastornos metabólicos óseos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a composiciones de carbonato de calcio amorfo natural y sintético para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio, y trastornos, enfermedades y condiciones asociadas con la mala absorción, y para aumentar la densidad mineral ósea en trastornos del metabolismo asociado de mala absorción de calcio y del hueso.

ANTECEDENTES

[0002] Se considera que el calcio es uno de los minerales más importantes en el cuerpo humano. Es necesario para mantener la densidad mineral ósea, es esencial para la exocitosis de neurotransmisores, participa en la contracción de las células musculares, reemplaza al sodio como mineral despolarizante en el corazón y participa en muchas otras funciones fisiológicas.

[0003] La absorción gastrointestinal del calcio depende no solo de la disponibilidad de calcio en la dieta sino de la capacidad de absorción de los intestinos, que se ve afectada por factores fisiológicos como las reservas de calcio, la regulación hormonal o el aporte previo de calcio en la dieta. La disolución de las sales de calcio (p. ej., carbonato de calcio) en el estómago es un paso en la absorción activa y pasiva adecuada de calcio como ión calcio (Ca(2+)) en el intestino delgado proximal. El ácido del estómago aumenta notablemente la disolución e ionización de las sales de calcio poco solubles.

[0004] Si el ácido no se secreta correctamente, sales de calcio se disuelven mínimamente (son ionizadas) y, posteriormente, pueden no ser absorbidas adecuada y eficazmente. La gastritis atrófica, la cirugía gástrica y el uso prolongado y en dosis altas de fármacos antisecretores reducen notablemente la secreción de ácido y, por lo tanto, pueden ser condiciones de riesgo de mala absorción de calcio dietético y suplementario, y por lo tanto pueden aumentar el riesgo de osteoporosis a largo plazo (Sipponen y col., Scand J Gastroenterol. 2010; 45 (2): 133-8).

[0005] La absorción gastrointestinal de calcio también se puede disminuir en pacientes después de la cirugía bariátrica, los pacientes que sufren de hipoparatiroidismo, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria del intestino o enfermedad celíaca. Las personas que consumen tipos adicionales de fármacos, como inhibidores de la bomba de protones, anticonvulsivos y corticosteroides crónicos, también pueden desarrollar mala absorción de calcio.

[0006] La biodisponibilidad del calcio depende de su absorción gastrointestinal y de la incorporación del calcio absorbido en el hueso. En cuanto a la absorción intestinal, los factores fisiológicos, en particular las hormonas, juegan un papel importante en la incorporación del calcio al hueso. Por tanto, la biodisponibilidad del calcio puede definirse como la fracción de calcio de la dieta que es potencialmente absorbible por el intestino y puede utilizarse para funciones fisiológicas, en particular la mineralización ósea, o para limitar la pérdida ósea (Gueguen et al, J Am Coll Nutr, 2000 vol. 19 no. Supl.2 119S-136S).

[0007] La pérdida de densidad mineral ósea está asociada con diversas enfermedades óseas metabólicas, tales como: osteopenia, osteomalacia, raquitismo, osteítis fibrosa quística y osteoporosis. Los estudios han demostrado que la ingesta inadecuada de calcio en la dieta puede inducir muchas enfermedades relacionadas con los huesos, como la osteoporosis.

[0008] Un medicamento estándar para la prevención y el tratamiento de ciertos tipos de pérdida de masa ósea (incluyendo osteoporosis) es un agente anti-resorción. Un ejemplo no limitante de los agentes antirresortivos son los bisfosfonatos, por ejemplo, el bisfosfonato de alendronato (ALN). La administración de ALN atenúa la disminución de la densidad mineral ósea (DMO), ya que ALN tiene un efecto inhibidor de la resorción ósea. Sin embargo, es un problema reconocido que ALN también suprime la formación de hueso y su administración está asociada con un riesgo de síntomas adversos. Se ha sugerido el uso de varios fármacos en combinación para mejorar el cumplimiento de los pacientes y el efecto terapéutico.

[0009] El calcio usado en suplementos hoy, ya sea obtenido de fuentes naturales o precipitados sintéticos, puede comprender tanto sales de calcio orgánicas como inorgánicas. En condiciones específicas donde la absorción gastrointestinal de calcio es limitada, la ingesta estándar de los suplementos disponibles es insuficiente para promover la absorción, lo que resulta en la necesidad de aumentar las dosis de ingesta. El requerimiento del consumo de dosis más altas de calcio en condiciones asociadas con la mala absorción conduce a efectos adversos como estreñimiento, cálculos renales, problemas vasculares y la consiguiente reducción del cumplimiento. Además, la mayoría de los suplementos de calcio requieren un pH gástrico bajo para poder disolverse y absorberse eficazmente a través del intestino y, por tanto, su biodisponibilidad es superior en ayunas.

[0010] En los últimos 20 años, un creciente interés científico en el polimorfo amorfo termodinámicamente inestable de carbonato de calcio, carbonato de calcio amorfo llamado (CCA), ha surgido. En la naturaleza, el CCA es utilizado por una pequeña cantidad de organismos, principalmente crustáceos y otros invertebrados que desarrollaron capacidades para estabilizar el CCA en sitios transitorios de deposición de minerales. Estos organismos requieren una fuente mineral excepcionalmente eficiente para la movilización, absorción y precipitación periódicas de calcio. En algunos crustáceos, como el cangrejo de río de agua dulce, CCA se almacena en grandes cantidades en órganos de almacenamiento transitorio especializados, llamados Gastrolith.

[0011] En los últimos años, algunos de los inventores de la presente invención han dado a conocer el uso de los órganos de gastrolito, molidos hasta obtener un polvo fino útil como composiciones de calcio farmacéuticas y nutracéuticas (documento WO 05/115414). Se reveló que el consumo oral diario de composiciones que comprenden componentes de gastrolito mejora drásticamente una variedad de afecciones tales como trastornos óseos, fracturas óseas y cáncer (WO 2008/041236). En el documento WO 2009/053967 se describen composiciones farmacéuticas y nutracéuticas que comprenden CCA y péptidos o aminoácidos fosforilados para tratar diversos trastornos y afecciones. El documento WO 2009087553 A1 describe una administración combinada de bisfosfonatos con carbonato de calcio. El documento WO 9857656 A1 describe una preparación farmacéutica combinada que comprende hormona paratiroidea y un inhibidor de la resorción ósea. Meiron y col. (Meiron Oren et al. J. of Bone and Mineral Research, vol.

26, no. 2, p. 364-372, 1 de febrero de 2011) describen un estudio que compara la solubilidad y la absorción fraccionada de CCA, CCA con quitosano (CCA-C) y carbonato cálcico cristalino (CCC) en vista de la biodisponibilidad del calcio en la prevención de la osteoporosis. Sin embargo, todavía existe una necesidad no satisfecha de un tratamiento eficaz de la mala absorción de calcio, la pérdida de densidad ósea asociada a la mala absorción de calcio y las enfermedades asociadas al metabolismo óseo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

[0012] La presente invención proporciona una composición que comprende CCA estable sintético o natural para el tratamiento de la mala absorción de calcio en un sujeto que padece de hipoparatiroidismo. Se describe en este documento por primera vez que CCA puede superar las deficiencias de otros tipos de suplementos de calcio incluso en pacientes que padecen mala absorción de calcio.

[0013] El tratamiento de la mala absorción de calcio puede evitar, además, o disminuir o retrasar la aparición de trastornos o enfermedades relacionadas con la deficiencia de calcio. Según una primera realización la invención proporciona una composición que comprende carbonato cálcico amorfo (CCA) estable con al menos un estabilizador, seleccionándose dicho estabilizador entre ácidos carboxílicos, aminoácidos fosforilados, péptidos fosforilados, quitina, ésteres fosfóricos o sulfúricos de ácidos hidroxicarboxílicos, hidroxilo que contienen compuestos orgánicos seleccionados entre mono, di, tri, oligo y polisacáridos, y polioles seleccionados entre alcoholes y sacáridos y en los que el 100% (en mg) de la ingesta diaria total inicial de calcio elemental se reemplaza por el 50% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial) para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio en un sujeto que padece hipoparatiroidismo. La mala absorción de calcio puede abarcar además a sujetos con formación ósea mejorada y a individuos que consumen corticosteroides, inhibidores de la bomba de protones, anticonvulsivos, rifampicina y antibióticos similares, agentes quelantes y fármacos antisecretores.

[0014] Absorción gastrointestinal de calcio mejorada de CCA estable en comparación con otros suplementos de calcio puede retrasar o reducir al mínimo las condiciones y trastornos que resultan de la deficiencia de calcio en otras poblaciones incluyendo mujeres posmenopáusicas, y las mujeres perimenopáusicas, hombres de edad avanzada, niños, adolescentes, mujeres embarazadas, y mujeres en lactancia materna.

[0015] Biodisponibilidad de calcio mejorada de CCA puede hacer demorar o minimizar la pérdida de densidad ósea en sujetos que sufren de mala absorción de calcio. La presente invención proporciona el uso de una composición que comprende CCA estable sintético o natural para aumentar la densidad mineral ósea en un sujeto con trastornos, enfermedades y afecciones óseas metabólicas. La composición a usar según la presente invención puede usarse además para retrasar la aparición y para el tratamiento de dichos trastornos, enfermedades o afecciones, que comprenden osteomalacia, enfermedad ósea de Paget, osteopenia, osteítis fibrosa quística, raquitismo, osteoporosis y consumo agudo de alcohol.

[0016] En algunas realizaciones, dicho estabilizador comprende al menos un componente seleccionado de entre ésteres fosfórico o sulfúrico de ácidos carboxílicos de hidroxilo e hidroxilo que llevan compuestos orgánicos. En algunas realizaciones, dicho estabilizador comprende al menos un componente seleccionado entre aminoácidos fosforilados y polioles. Dichos aminoácidos pueden estar presentes en derivados de aminoácidos u oligopéptidos o polipéptidos, y dichos polioles pueden comprender alcoholes o sacáridos. Cada posibilidad representa una realización separada de la invención. Según algunas realizaciones, los aminoácidos fosforilados se seleccionan entre fosfoserina y fosfotreonina. Según algunas realizaciones, dicho estabilizador comprende al menos un sacárido seleccionado entre mono, di, oligo y polisacáridos. Según algunas realizaciones, dicho estabilizador comprende compuestos orgánicos que llevan hidroxilo combinados además con al menos un hidróxido alcalino. Según algunas realizaciones, el estabilizador es un ácido carboxílico, preferiblemente ácido cítrico, ácido tartárico o ácido málico. En algunas realizaciones, dicho estabilizador comprende al menos un compuesto seleccionado entre aminoácidos fosforilados, péptidos fosforilados, quitina con al menos un péptido y poliol con hidróxido alcalino.

[0017] De acuerdo con algunas realizaciones ejemplares, dicho CCA se obtiene de gastrolitos de crustáceos aislados. Según una realización, dicho CCA natural está estabilizado por quitina y polipéptidos. Según otra realización, el CCA es sintético, en donde dicho CCA sintético está estabilizado por aminoácidos fosforilados seleccionados entre fosfoserina o fosfotreonina. Según otra realización, dicho CCA sintético se estabiliza mediante fosfoserina en combinación con ácido cítrico. Según otra realización más, dicho CCA sintético se estabiliza mediante ácido cítrico. Según otra realización más, dicho CCA se estabiliza mediante sacarosa en combinación con hidróxido de sodio.

[0018] De acuerdo con algunas realizaciones, el sujeto padece un trastorno del metabolismo del calcio asociado con una disminución de la concentración de calcio en plasma por debajo de 8,8 mg/dL. El sujeto puede seleccionarse entre mujeres posmenopáusicas o perimenopáusicas. Dicho sujeto puede ser susceptible al desarrollo de trastornos, enfermedades y afecciones asociadas a la pérdida de densidad mineral ósea. El trastorno asociado a la pérdida de densidad ósea en un sujeto que necesita un tratamiento de mala absorción de calcio puede ser osteoporosis.

[0019] En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende carbonato de calcio estable amorfo (CCA) que comprende al menos un estabilizador seleccionado del grupo que consiste en ácidos orgánicos, ésteres fosfóricos o sulfúricos de ácidos hidroxicarboxílicos y compuestos orgánicos que portan hidroxilo, para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio en un individuo que padece hipoparatiroidismo. La composición farmacéutica a utilizar según la invención puede comprender además vehículos, adyuvantes, diluyentes o excipientes.

[0020] La composición que comprende CCA estable tiene una absorción gastrointestinal superior cuando se administra en un estado fed. La composición que comprende CCA estable puede tener una absorción gastrointestinal superior cuando se administra en ayunas.

[0021] La mejora de la densidad mineral ósea puede comprender el uso de la presente composición que comprende CCA estable en combinación con un inhibidor de la resorción ósea. El inhibidor de la resorción ósea puede ser bisfosfonato. El bisfosfonato puede seleccionarse entre alendronato, risedronato, tiludronato, ibandronato, zolendronato, pamidronato, etidronato y sales y ésteres de los mismos. El bisfosfonato puede ser alendronato. La composición puede administrarse en combinación con dosis terapéuticas más bajas de bisfosfonato de alendronato, en comparación con la dosis requerida sin suplementos de calcio o con suplementos de calcio distintos de los suplementos de CCA estables.

[0022] Todas las anteriores y otras características y ventajas de la invención se entenderán adicionalmente a través de la siguiente descripción ilustrativa y no limitativa de realizaciones de la misma, con referencia a los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0023]

Figura 1: Los niveles de calcio se elevan después de carbonato de calcio amorfo (CCA) vs. administración de carbonato cálcico cristalino a ratas Resultados son medios ± SEM. Prueba t de Student: *p< 0,05 Figura 2: La absorción fraccional de calcio se incrementa en 2,1 veces por cada mujer siguiente de administración de carbonato de calcio amorfo (CCA) vs. carbonato de calcio cristalino (CCC) en mujeres posmenopáusicas alimentadas

Prueba t pareada: p< 0,01

Figura 3: La absorción fraccional de calcio se incrementa en 1,9 veces como dos grupos analizados separados después de la administración de carbonato de calcio amorfo (CCA) vs. Carbonato de calcio cristalino (CCC) en mujeres posmenopáusicas alimentadas

Resultados son medias ± s Em . Prueba t de Student: * p< 0,05

Figura 4: La absorción fraccional de calcio se incrementa en 4,6 después de la administración de carbonato de calcio amorfo (CCA) vs. carbonato de calcio cristalino (CCC) en una mujer posmenopáusica en ayunas Figs. 5A-5E: Reconstrucción tridimensional de fémures distales representativos y secciones transversales de 4as vértebras de cada grupo de tratamiento.

Región de hueso tuberculoso para simulación (Fig. 5A); Carbonato de calcio cristalino (CCC) (Fig. 5B); carbonato de calcio amorfo (c Ca ) (Fig. 5C); CCC+alendronato (ALN) (Fig. 5D); y CCA+Al N (Fig. 5E). La barra de escala representa una distancia de 1,5 mm.

Figs. 6A-6D: Densidad mineral ósea trabecular (Tb.DMO) y volumen óseo a partir del volumen total de tejido óseo (BV/TV) de los grupos obtenidos por m

yCT.

Fig. 6A: Tb.DMO del fémur distal.

Fig. 6B: Tb.DMO de la 4a vértebra lumbar.

Fig. 6C: VB/TV del fémur distal.

Fig. 6D: BV/TV de la 4a vértebra lumbar.

El porcentaje representa el aumento del grupo tratado con CCC (control).

Figs. 7A-7E: Reconstrucción tridimensional de fémures distales representativos y secciones transversales 4as vértebras de cada grupo de tratamiento. Región de hueso tuberculoso para simulacro (Fig. 7A); control (Fig. 7B); gastrolito (Gast) (Fig. 7C); carbonato de calcio amorfo (CCA) (Fig. 7D); y citrato (Fig. 7E). La barra de escala representa una distancia de 1,5 mm.

Figs. 8A-8B: Densidad mineral ósea trabecular (Tr.DMO) de los grupos obtenidos por ¡iCT.

Fig. 8A: Tr.DMO de los fémures distales.

Fig.8B: Tr.DMO de la 4a vértebra lumbar. ANOVA de una vía: p<0,001. Las letras representan la comparación post-hoc de Fishers LSD.

Figs. 9A-9B: Volumen de hueso trabecular del tejido óseo total (BV/TV) de los grupos de tratamiento obtenidos poryCT.

Fig. 9A: BV/t V de los fémures distales.

Fig. 9B: VB/TV de la 4a vértebra lumbar. ANOVA de una vía: p<0,001. Las letras representan la comparación post-hoc de Fishers LSD.

Figs. 10A-10G: Propiedades de microarquitectura mecánica de las vértebras lumbares.

Fuerza máxima (Fig. 10A); Energía a fuerza última (UF) (Fig. 10B); Dureza (Fig. 10C); Energía al rendimiento (Fig. 10D); Factor de patrón de hueso trabecular (TBPf) (Figura 10E); Índice de modelo de estructura (SMI) (Figura 10F); Grado de anisotropía (DA) (Figura 10G).

ANOVA de una vía: p<0,01. Las letras representan la comparación post-hoc de Fishers LSD. Las barras representan SEM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0024] La presente invención da a conocer un uso previamente desconocido de composiciones que comprenden carbonato de calcio amorfo (CCA) estable para el tratamiento de hipoparatiroidismo. Se descubrió que las composiciones a base de carbonato cálcico amorfo que se utilizarán según la presente invención son fuentes de calcio superiores a los suplementos de calcio comercializados habitualmente. Se ha descubierto ahora que una composición que comprende CCA como se detalla anteriormente tiene una biodisponibilidad de calcio sorprendentemente alta, que comprende una mayor capacidad de absorción en el tracto gastrointestinal y en los huesos. Por tanto, el uso de CCA es beneficioso en trastornos, enfermedades y afecciones asociadas a la mala absorción de calcio (tanto en la alimentación como en el estado de ayuno) y en las afecciones y trastornos relacionados con la pérdida ósea.

[0025] El término "tratamiento" tal como se emplea aquí se refiere a la administración de CCA y la mejora de absorción de calcio en el tracto gastrointestinal y en los huesos.

[0026] Los términos "retrasar la aparición" o "profilaxis" como se emplea en este documento se refieren al aplazamiento del desarrollo de las enfermedades de los huesos, el aplazamiento del desarrollo de los síntomas y/o una reducción en la gravedad de tales síntomas que se desarrollarán o se espera que se desarrollarán.

[0027] El término "CCA estable" se utiliza aquí para indicar que el carbonato de calcio se mantiene en el estado amorfo durante largos períodos de tiempo, por ejemplo, desde varias semanas hasta varios años, sin conversión de más del 5% en la forma cristalina durante dicho período de tiempo. La cristalización de la CCA se inhibe según la invención mediante la adición de uno o más estabilizadores, seleccionados entre ingredientes orgánicos o inorgánicos tales como aminoácidos fosforilados, otros ácidos orgánicos, péptidos, sales, sacáridos o lípidos. Dichas sales pueden comprender, por ejemplo, cationes seleccionados entre magnesio, potasio, estroncio y sodio, y aniones seleccionados entre carbonato, fosfato, sulfato, cloruro, bromuro, fluoruro, citrato, fumarato, malato u otros aniones orgánicos; los términos anión y catión se utilizan para describir simplemente la composición de la sal, sin implicar nada sobre la solubilidad o el pH de dichas moléculas.

[0028] Los términos "estabilizador" o "agente estabilizante" como se usa en el presente documento se utilizan indistintamente y se refieren a cualquier sustancia que conserva el carbonato de calcio en el estado amorfo.

[0029] El término "mala absorción de calcio", como se usa aquí, se refiere a una anomalía en la absorción de calcio en la dieta a través del tracto gastrointestinal. El término "pérdida ósea", como se usa en este documento, se refiere a cualquier disminución en las células o tejido óseo, disminución en la masa ósea, disminución de minerales óseos o disminución de la densidad mineral ósea en un sujeto.

[0030] El término "cantidad eficaz" como se usa aquí se refiere a una cantidad suficiente de las composiciones de CCA estable para tratar la mala absorción de calcio, mala absorción de calcio y las enfermedades, trastornos y condiciones asociadas a densidad ósea mineral, y para mejorar la densidad ósea mineral en una relación razonable beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico o nutricional.

[0031] En una realización, la presente invención proporciona una composición sintética (artificial) que comprende CCA estable y una cantidad de un estabilizador suficiente para mantener la CCA en un estado no cristalino para uso en el tratamiento de calcio mala absorción en un sujeto que padece hipoparatiroidismo. El estabilizador se selecciona de, pero no se limita a, ésteres fosfóricos o sulfúricos de ácidos hidroxilcarboxílicos y compuestos orgánicos que llevan hidroxilo.

[0032] De acuerdo con algunas realizaciones, dicho estabilizador comprende al menos un componente seleccionado de ésteres fosfóricos o sulfúricos de ácidos carboxílicos de hidroxilo, tales como compuestos orgánicos portadores de fosfoenolpiruvato, fosfoserina, fosfotreonina, sulfoserina o sulfotreonina y hidroxilo, seleccionados de mono-, di-, trisacáridos, oligosacáridos y polisacáridos, por ejemplo, sacarosa, manosa, glucosa. El estabilizador que comprende el compuesto portador de hidroxilo puede comprender además al menos un hidróxido alcalino, tal como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y similares. En algunas realizaciones de la invención, dicho estabilizador se selecciona de aminoácidos fosforilados y polioles. Los ácidos fosforilados pueden estar presentes en oligopéptidos y polipéptidos. En otras realizaciones de la invención, el estabilizador es un ácido orgánico, preferiblemente un ácido carboxílico. El ácido carboxílico se selecciona preferiblemente de ácido cítrico, ácido tartárico o ácido málico.

[0033] En una realización de la invención, el CCA se estabiliza por fosfoserina (P-Ser) o fosfotreonina (PThr). En otra realización, el CCA estable comprende una combinación de sacarosa e hidróxido de sodio. En otra realización más de la invención, el CCA se estabiliza con ácido cítrico. En otra realización más de la invención, el CCA se estabiliza mediante una combinación de fosfoserina y ácido cítrico. La composición artificial que comprende CCA estable que comprende trazas de uno o más estabilizadores puede administrarse a una persona que necesite una absorción de calcio aumentada o mejorada.

[0034] En otra realización, la presente invención proporciona una composición natural, que comprende CCA estable presente en gastrolito de cangrejo aislado para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio en un sujeto que padece de hipoparatiroidismo. El gastrolito molido comprende CCA, materia orgánica compuesta principalmente por quitina y polipéptidos, y sales. Los componentes presentes en la materia orgánica estabilizan el CCA e impiden su cristalización.

[0035] En un aspecto, la biodisponibilidad de calcio de alta presentada en las invenciones no está relacionada con la molécula de estabilización. En otro aspecto, la presente invención reivindica que la alta biodisponibilidad del calcio sólo está relacionada con el estado amorfo del carbonato cálcico.

[0036] En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende CCA estable, que comprende al menos un estabilizador para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio en pacientes que sufren de trastornos, enfermedades y condiciones asociadas con hipoparatiroidismo y calcio de mala absorción.

[0037] La afección relacionada con la deficiencia de calcio es hipoparatiroidismo. Según realizaciones adicionales, la mala absorción de calcio puede abarcar sujetos con formación de hueso mejorada e individuos que consumen corticosteroides, inhibidores de la bomba de protones, anticonvulsivos, rifampicina y antibióticos, agentes quelantes y fármacos antisecretores similares.

[0038] La absorción gastrointestinal de calcio reducida puede conducir además a una pérdida de densidad mineral ósea.

[0039] Las composiciones que comprenden CCA estable, comprendiendo al menos un estabilizador para ser utilizado en el tratamiento de la mala absorción de calcio en un sujeto que padece de hipoparatiroidismo puede utilizarse también para aumentar densidad mineral ósea en pacientes que sufren de trastornos, enfermedades y condiciones asociadas a mala absorción de calcio. La presente invención proporciona además una composición que comprende CCA estable que comprende al menos un estabilizador para el tratamiento de la pérdida de densidad ósea en un sujeto que padece mala absorción de calcio. La absorción gastrointestinal de calcio mejorada del CCA estable en comparación con otros suplementos de calcio puede retrasar o minimizar las afecciones y trastornos resultantes de la deficiencia de calcio en poblaciones que incluyen mujeres posmenopáusicas y mujeres perimenopáusicas, hombres ancianos, niños, adolescentes, mujeres embarazadas y mujeres en período de lactancia.

[0040] En aún otro aspecto, la composición que comprende CCA estable que comprende al menos un estabilizador se puede usar en la mejora de la densidad mineral ósea en trastornos, enfermedades o condiciones asociadas al metabolismo óseo. La composición se puede administrar en combinación con otros medicamentos para la prevención y el tratamiento de la pérdida ósea. Los medicamentos para la prevención y el tratamiento de la pérdida ósea pueden seleccionarse entre inhibidores de la resorción ósea, que comprenden bisfosfonatos (sales de ácido bisfosfónico), moduladores del receptor de estrógenos, moduladores del receptor de andrógenos, formulaciones de calcitonina, formulaciones de péptidos relacionados con el gen de alfa-calcitonina, formulaciones de ipriflavona, formulaciones de esteroides anabólicos, anticuerpo anti-RANKL (receptor activador del ligando NF-kappa B) y similares. Un ejemplo no limitante de un bisfosfonato utilizado para la prevención o el tratamiento de la pérdida de densidad mineral ósea es el bisfosfonato de alendronato. El uso de una composición que comprende CCA en combinación con inhibidores de la resorción ósea proporciona un efecto aditivo sobre el aumento de la densidad mineral ósea. Sin desear estar ligado a ninguna teoría específica, el efecto aditivo proporcionado por CCA puede atribuirse a la alta biodisponibilidad y al efecto inductor de la formación de hueso del mismo. La administración de CCA en combinación con inhibidor de resorción ósea permite la reducción de dosis terapéuticas de inhibidor de resorción ósea debido al efecto aditivo observado, en comparación con la administración de ALN en combinación con carbonato cálcico cristalino. En el contexto de la presente invención, el término terapia de combinación abarca la administración de dos o más ingredientes activos en una única forma de dosificación o en formas de dosificación separadas. Se pueden administrar formas de dosificación separadas de forma simultánea o secuencial o en regímenes separados completamente independientes. Por ejemplo, el CCA puede administrarse diariamente y el bisfosfonato puede administrarse con menos frecuencia.

[0041] En algunas realizaciones, el bisfosfonato es alendronato. En algunas realizaciones, dicha composición en combinación con ALN se usa para mejorar la densidad mineral ósea en la osteoporosis.

[0042] En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende CCA estable, que comprende al menos un estabilizador para retrasar la aparición o la profilaxis de trastornos de pérdida asociada de densidad mineral ósea. En otro aspecto, las composiciones a utilizar según la invención se administran a sujetos que requieran consumir niveles elevados de calcio tales como niños, adolescentes y mujeres durante el embarazo y la lactancia. En otro aspecto más, las composiciones de la invención se administran a sujetos que padecen mala absorción de calcio.

[0043] En una realización, la presente descripción se refiere a la administración oral de una composición que comprende CCA estable que tiene una biodisponibilidad gastrointestinal superior cuando se administra en un estado alimentado. En otra realización, la presente divulgación se refiere a la administración oral de una composición que comprende CCA estable en un estado de ayuno para alcanzar una biodisponibilidad gastrointestinal más eficaz.

[0044] La evidencia ha sido proporcionada, apoyando la idea de que es el carbonato de calcio amorfo solo, independientemente de la molécula o mecanismo estabilizador, que promueve la mayor biodisponibilidad del calcio cuando se administra como CCA. En una realización importante de la invención, el CCA sintético tiene una biodisponibilidad gastrointestinal superior cuando se usa para el tratamiento en estado de alimentación. En otra realización importante de la invención, el CCA sintético tiene una biodisponibilidad gástrica superior cuando se usa para el tratamiento en ayunas. En otra realización importante más de la invención, el CCA de fuentes naturales tiene una biodisponibilidad gástrica superior cuando se usa en el tratamiento en estado alimenticio. En otra realización importante de la presente invención, el CCA de fuentes naturales tiene una biodisponibilidad gástrica superior cuando se usa en el tratamiento en ayunas.

[0045] Las composiciones para usar de acuerdo con la invención pueden administrarse preferiblemente por vía oral en diversas orales formas incluyendo, pero no limitadas a, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, elixires, tinturas, suspensiones, jarabes, emulsiones y como forma en gel.

[0046] En los casos en los que la administración oral es en la forma de un comprimido o cápsula, los componentes de la composición pueden combinarse con un vehículo no tóxico farmacéuticamente aceptable inerte o excipientes tales como lactosa, almidón, sacarosa, glucosa, azúcares modificados, almidones modificados, metilcelulosa y sus derivados, manitol, sorbitol y otros reductores y azúcares no reductores, estearato de magnesio, ácido esteárico, estearilfumarato de sodio, behenato de glicerilo, gel de sílice amorfo u otro material desecante y similares.

[0047] Las composiciones para usar de acuerdo con la invención se pueden administrar en dosis diarias de 0,5 a alrededor de 5 g. Las composiciones a utilizar según la invención pueden administrarse en dosis diarias de 1,5 a aproximadamente 20 g. Las composiciones que se van a usar de acuerdo con la invención se pueden administrar en dosis diarias que comprenden calcio elemental en un intervalo de 0,15 a aproximadamente 1,5 g. Las composiciones que se van a utilizar de acuerdo con la invención pueden administrarse típicamente en dosis diarias que comprenden calcio elemental en un intervalo de 0,5 a aproximadamente 6 g.

[0048] Para administración oral en forma líquida, los componentes de la composición pueden combinarse con vehículos inertes farmacéuticamente aceptables no tóxicos tales como etanol, glicerol, agua y similares. Cuando se desee o sea necesario, también se pueden incorporar a la mezcla aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes y aromatizantes adecuados.

[0049] Una ventaja particular de las composiciones a utilizar de acuerdo con la invención es su baja toxicidad confirmada y alta seguridad para la administración oral. Por consiguiente, las composiciones a utilizar según la invención se utilizan ventajosamente como alimentos medicinales.

[0050] Los inventores han llevado a cabo experimentos con el objetivo de evaluar la biodisponibilidad de la fuente de calcio que comprende CCA estable. La biodisponibilidad del calcio de CCA se evaluó tanto en términos de absorción gastrointestinal de calcio como de disponibilidad de calcio para el proceso de mineralización ósea (absorción ósea). Se evaluó la absorción gastrointestinal de calcio en la población generalmente sana y en la población que padece o es susceptible de padecer mala absorción de calcio. La absorción gastrointestinal de calcio reducida es una de las causas de la pérdida de densidad ósea. Por lo tanto, también se evaluó la capacidad de absorción ósea de calcio en poblaciones que padecían mala absorción de calcio. El uso de CCA estable puede ser beneficioso para mejorar la absorción gastrointestinal de calcio y para aumentar la densidad mineral ósea en sujetos que padecen o son susceptibles de padecer mala absorción de calcio. La absorción gastrointestinal de calcio se evaluó adicionalmente en poblaciones susceptibles a los trastornos y afecciones relacionados con la pérdida ósea, por ejemplo, mujeres posmenopáusicas.

[0051] Se encontró la disponibilidad de calcio mejorada para el proceso de mineralización ósea para aumentar la densidad mineral ósea y afectar positivamente a otros parámetros óseos. Como se ejemplifica a continuación, se evaluó el efecto del CCA estable que comprende diferentes estabilizadores sobre diversos parámetros óseos. También se evaluó el efecto de CCA sobre la densidad mineral ósea y otros parámetros óseos en el modelo de rata osteoporótica. Las composiciones a base de carbonato de calcio amorfo también se combinaron con medicamentos antirresortivos óseos, tales como bifosfonato de alendronato, y se evaluó su efecto mutuo sobre los parámetros de la fracción ósea.

[0052] Las mediciones de biodisponibilidad comprendían la evaluación de la absorción de calcio de la fuente CCA estable en el tracto gastrointestinal por medio de toma de muestras de suero y orina, en base a modelos de biodisponibilidad informados ampliamente utilizados para la evaluación de varios fármacos y suplementos, y la evaluación del efecto de calcio de una fuente estable de CCA sobre la densidad mineral ósea y otros parámetros óseos, basados en los modelos de prevención y tratamiento de la osteoporosis ampliamente informados, utilizados para la evaluación de varios medicamentos y suplementos.

[0053] La biodisponibilidad de CCA estable se evaluó en pacientes que sufren de mala absorción, por ejemplo, los pacientes que sufren de hipoparatiroidismo y de los individuos que consumen los corticosteroides y en poblaciones que sufren de trastornos asociados a la densidad mineral ósea. La biodisponibilidad mejorada del calcio de la fuente de CCA permite el uso de CCA para el tratamiento y profilaxis de diversas enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a la mala absorción de calcio y metabólicas óseas, solos o en combinación con medicamentos estándar para el tratamiento de la pérdida ósea. Habiendo descrito ahora la invención en general, la misma se entenderá más fácilmente mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden ser limitantes de la presente invención.

EJEMPLOS

Ensayo 1: Absorción gastrointestinal de calcio de una fuente de CCA.

[0054] El objetivo del presente experimento fue el de evaluar la absorción gastrointestinal de la fuente de calcio que comprende carbonato de calcio amorfo (CCA) estable en el modelo de etiquetado de radioisótopo en ratas.

[0055] Veintiséis ratas Wistar machos de 2 meses de edad, que pesaban 240 ± 15 g, se administraron por vía oral con una sola cápsula de gelatina que contiene ya sea CCA (carbonato de calcio amorfo) o CCC (carbonato de calcio cristalino) intrínsecamente marcado con 45Ca, seguido mediante mediciones de la absorción fraccionada de calcio en suero y excreción de calcio.

[0056] La Figura 1 presenta los cambios en la concentración de calcio sérico, calculados por las lecturas radiactivas normalizadas a la dosis administrada. Los valores de C max en ratas que recibieron CCA fueron significativamente más altos (hasta un 40%) que los del grupo CCC (Figura 1 y Tabla 1).

Tabla 1: Parámetros farmacocinéticos de calcio en el suero después de la administración oral de preparaciones de carbonato de calcio radiactivo

[0057] El análisis farmacocinético indica que la absorción gastrointestinal de la CCA es significativamente mayor que la de CCC (área bajo la curva, AUC, los valores son más altos en un 22,5% y 20%, respectivamente, p<0,05), mientras que el tiempo requerido para alcanzar la concentración máxima (Tmax) no difirió entre los grupos (Tabla 1).

[0058] Los valores de retención presentados en la Figura 1 sugieren que las ratas que recibieron cápsulas que contienen CCC retuvieron 48,5 ± 1,3% de la dosis recibida. Por otro lado, las ratas que recibieron cápsulas CCA retuvieron 61,4 ± 2,0% y 60,6 ± 2,1% de la dosis recibida, respectivamente. Esto corresponde a un aumento significativo en la retención del 26,6%, en comparación con la retención del grupo tratado con CCC (p <0,05).

Detalles experimentales

Animales

[0059] Todos los animales fueron tratados de acuerdo a la Ley de Protección de los Animales de Israel bajo la supervisión de la Ben-Gurion University Animal Care and Use Program. Cincuenta y una ratas de dos meses de edad Wistar macho (Harlan-Teklad, Jerusalén, Israel), que pesan 240 ± 15 g, se alojaron al azar en 12 jaulas de acero inoxidable en una habitación medioambientalmente controlada (23°C de temperatura, 12:12 h ciclo luz:oscuro). Las ratas fueron alimentadas con gránulos de pienso para ratas de laboratorio adecuadas en nutrientes ad libitum (Koffolk, Petah-Tikva, Israel) y tuvieron acceso libre al agua durante 48 h. Cuatro días antes del comienzo del experimento, se reemplazó la dieta regular por una dieta baja en calcio que contenía 0,24 ± 0,05% de calcio (0,675 ± 0,05% de fosfato), especialmente preparada mezclando dos tipos de alimentos que contenían, respectivamente, 0,01% de calcio (0,3% de fosfato; Harlan-Teklad) y 1% de calcio (0,8% de fosfato; Koffolk). Los dos tipos de alimentos se trituraron por separado en un molino para producir dos polvos que se mezclaron en seco en una proporción de 4:1, respectivamente, hasta una homogeneización fina. El polvo homogeneizado se extruyó para formar nuevos gránulos de alimentos.

[0060] Diecisiete horas antes de la administración de la cápsula, las ratas se pesaron y se tomaron muestras de sangre (línea de base). A continuación, las ratas se colocaron en jaulas metabólicas individuales y se las privó de alimento y agua hasta 3 h después de la administración de la cápsula. Tres y 24 h después de la dosificación, se administraron a cada rata ~ 10 g de gránulos de alimentos bajos en calcio (calcio al 0,01%; Harlan-Teklad). Se permitió agua destilada ad libitum comenzando tres horas después de la administración de la cápsula.

Administración de cápsulas de gelatina a animales

[0061] Se sedó ligeramente a cada rata durante 30 segundos con isoflurano (Minrad) diluido 1:4 (v:v) con propilenglicol (BioLab). Se administró una sola cápsula que contenía una preparación específica de carbonato de calcio (es decir, CCC, CCA o CCA-C; n=17 para cada grupo) por vía intragástrica a cada una de las ratas experimentales usando una jeringa de acero inoxidable para ratas (Aparato de Harvard).

Muestreo de sangre de animales y análisis químico

[0062] Las muestras de sangre de 120 a 150 pL fueron tomadas de la vena de la cola de cada rata 17 h antes de la administración de la cápsula (tiempo 0) y 2, 3, 6, 10, 24 y 34 h después de la administración. Las muestras de sangre se centrifugaron inmediatamente durante 10 minutos a 3000 g usando una centrífuga de mesa (Hettich Zentrifugen, Bach, Suiza). Se transfirieron muestras duplicadas (30 pl) del suero sobrenadante a viales de plástico que contenían líquido de centelleo (Zinsser Analytic, Berkshire, Reino Unido) y se midió la radiactividad usando un contador de centelleo líquido (Tri-Carb 2100TR, PerkinElmer, Boston, MA). La radiactividad plasmática de la dosis dada se normalizó de acuerdo con la radiactividad medida y la dosis radiactiva específica que recibió cada rata [(cpmx 100 en suero) / (cpm total x volumen de muestra)].

Heces de animales y de muestreo y análisis de orina)

[0063] Las heces y la orina se recogieron durante la fase de inanición 17 h durante el periodo de aclimatación (línea de base) y durante las 34 h completas del experimento para evaluar el calcio. Se transfirieron muestras de orina (500 pl) a viales de plástico llenos de líquido de centelleo. Las heces se secaron durante la noche a 70°C en un horno. Las muestras se molieron en un mortero hasta una fina homogeneización. Se colocaron muestras de heces (200 mg) en 5 ml de solución de 1 N NaOH (Gadot, Netanya, Israel), se incubaron durante 3 horas a 80°C y se centrifugaron durante 10 minutos a 3600 g. Se transfirieron muestras duplicadas del sobrenadante (30 pl) a viales de plástico que contenían líquido de centelleo. Se midió la radiactividad de las muestras de orina y heces usando un contador de centelleo líquido. Valores de retención se calcularon restando la radiactividad medida en las heces y la orina de la dosis dada [(entrada - excreción de heces y orina) / (ingesta x 100%)].

Cálculos farmacocinéticos de muestras de animales

[0064] El análisis no compartimental de la concentración de calcio de una rata individual versus los datos de tiempo se ha realizado mediante software WinNonLin 5.2 (Pharsight, Mountain View, CA).

Análisis estadístico

[0065] Una forma de análisis de varianza (ANOVA) se realizó en valores de retención, resultados farmacocinéticos y los resultados de solubilidad utilizando el software Statistica 6.1 (StaSoft, Tulsa, OK).

[0066] La prueba t pareada y la prueba t de Student se realizaron utilizando el software Prism 5.

[0067] Un valor p <0,05 se consideró significativo.

[0068] Los resultados del ensayo anterior confirmaron que CCA estable tiene mayor absorción gastrointestinal de CCC en un modelo animal.

Ensayo 2: Absorción gastrointestinal de calcio en hipoparatiroidismo

[0069] El experimento con el objetivo de evaluar la biodisponibilidad gastrointestinal de la fuente de calcio que comprende carbonato de calcio amorfo (CCA) estable en el tratamiento de la mala absorción de calcio se lleva a cabo. Se realiza un estudio aleatorizado, de dos fases, adaptativo y luego cruzado, abierto, que compara el suplemento de carbonato de calcio amorfo (CCA) con los suplementos de calcio cristalino (CCS) disponibles comercialmente en el tratamiento del hipoparatiroidismo primario.

[0070] El principal objetivo de la primera fase del ensayo es una prueba del concepto de que el tratamiento con dosis más pequeñas de calcio elemental a partir de CCA en comparación con suplemento de calcio cristalino (CCS) puede mantener los valores diana de calcio en suero (corregidos para albúmina) (7,0-10,0 mg/dL).

[0071] El objetivo secundario de la primera etapa es la de evaluar la dosis de CCA suficiente. El objetivo secundario adicional es determinar el efecto de los alimentos sobre la absorción de CCA.

[0072] El principal objetivo de la segunda fase del ensayo es probar la hipótesis de que el tratamiento con dosis más pequeñas de calcio elemental a partir de CCA en comparación con CCS pueden mantener los valores diana de calcio en suero (corregidos para la albúmina) (7,0 a 10,0 mg/dL). El objetivo secundario de la primera etapa es probar la hipótesis de que el tratamiento con dosis menores de calcio elemental de CCA en comparación con CCS no provoca un aumento de la hipercalciuria en sujetos con hipoparatiroidismo. El objetivo secundario adicional es probar la hipótesis de que el tratamiento con dosis más pequeñas de calcio elemental de CCA en comparación con CCS reduce los efectos secundarios relacionados con el alto consumo de calcio.

Selección de población de estudio

[0073] La población de estudio incluye veinte (20) sujetos con hipoparatiroidismo primario, 10 sujetos para cada fase.

Producto de investigación

[0074] El carbonato de calcio amorfo estable utilizado en el estudio es un CCA sintético estabilizado por bajas concentraciones de fosfoserina y citrato (menos de 0,5% en el producto final), proporcionado por Amorphical Ltd. Serina fosforilada y el ácido cítrico orgánico son no tóxicos, naturalmente abundantes e incluso consumidos como un suplemento dietético independiente sin efectos adversos reportados cuando se toma por vía oral.

[0075] La Tabla 2 resume el análisis químico de CCA, evaluado de acuerdo con los parámetros de la Farmacopea de los Estados Unidos de carbonato de calcio, usando emisión atómica de plasma acoplado inductivamente (ICP-AE), espectroscopia ultravioleta (UV), pérdida por ignición (LOI) y fotómetro de llama. A menos que se especifique lo contrario, la precisión de los valores medidos es del ±10%.

Tabla 2: Análisis químico de CCA amórfico.

Producto de control - nivel de atención

[0076] Tratamiento de pacientes con hipoparatiroidismo implica la corrección de la hipocalcemia mediante la administración de calcio y vitamina D (Cusano et al, 2012; Fong y Kahn, 2012). La suplementación oral se inicia con calcio elemental (1-2 g 3 veces al día) y calcitriol (0,25-1 |jg 2 o 3 veces al día) para el manejo inmediato del hipoparatiroidismo posquirúrgico. En pacientes con riesgo de hipocalcemia grave y/o prolongada, el calcio elemental se inicia a una dosis de 2 g 3 veces al día y calcitriol a una dosis de 0,5 jg 3 veces al día. Hay varios tipos de suplementos de calcio. Está disponible con o sin receta. Todos ellos moderan el rendimiento nervioso y muscular y facilitan la función cardíaca normal (Straub, 2007):

- Carbonato de calcio (Tums extra strength, Cal-plus, Caltrate, Os-Cal 500) - Entre todas las formulaciones de suplementos de calcio disponibles, el carbonato de calcio es uno de los suplementos de calcio más concentrados con 40% de calcio elemental. Existen muchas preparaciones disponibles comercialmente. Es necesario ajustar la dosis diaria total de calcio elemental para minimizar la dosis diaria de vitamina D y mantener a los pacientes asintomáticos. El calcio ionizado se absorbe mejor en un ambiente ácido; 400 mg de calcio elemental equivalen a 1 g de carbonato de calcio.

- Citrato de calcio (Citracal, Cal-Cytrate 250) - 210 mg de calcio elemental equivalen a 1 g de citrato de calcio. - Gluconato de calcio (Kalcinato) - Disponible para uso intravenoso. Infundir lentamente durante 5 a 10 minutos; 10 ml de gluconato de calcio contienen aproximadamente 90 mg de calcio elemental; 1000 mg de gluconato de calcio equivalen a 90 mg de calcio elemental.

[0077] En el presente estudio, los pacientes en el grupo de control continúan consumiendo sus suplementos de calcio regulares y por lo tanto se tratan con estándar de atención.

Dosificación y administración

Fase 1

[0078] Los sujetos elegibles reciben tabletas de CCA. Cada dosis del producto en investigación del estudio consta de 50 o 200 mg de calcio elemental de CCA en cada tableta.

Fase II

[0079] Los sujetos elegibles reciben tabletas CCA en un diseño de estudio cruzado. El brazo de control se trata con un estándar de cuidado (tomando su suplementación regular de calcio). Cada dosis del producto de investigación del estudio consta de 50 o 200 mg de calcio elemental de CCA en cada tableta.

Tabla 3: Dosis del tratamiento del estudio

[0080] El mecanismo de acción y el efecto de CCA aún no se han revelado. Por lo tanto, la selección de la dosis y las condiciones favorables de absorción (alimentación/ayuno) se basa en los resultados de la fase I del estudio. Si bien la dosis final debe determinarse específicamente para cada paciente, se espera que sea posible determinar un factor de conversión entre CCA y CCS que permitirá una conversión fácil entre ambas fórmulas.

[0081] La dosis de calcio en el brazo de control se determina de acuerdo con el historial médico y la rutina de medicación conocida de todos los pacientes.

[0082] La administración de tabletas se lleva a cabo 3 veces al día durante todo el período de tratamiento por el sujeto. La administración de IP se documenta en los Formularios de Informe de Casos (CRF) en cada visita a los Registros de administración de IP del Centro de Investigación Clínica (CRC). Los envases con comprimidos no utilizados se devuelven a la unidad de CRC en días de visita, contados y documentados en los CRF.

Asignación de sujetos a tratamiento

[0083] Los sujetos son asignados a uno de los grupos de tratamiento al azar de acuerdo con una lista de aleatorización. La aleatorización se realiza mediante aleatorización en bloques.

Cegamiento

[0084] Este es un estudio de etiqueta abierta. Los sujetos, los investigadores y cualquier personal involucrado en la evaluación, monitoreo, análisis y manejo de datos de los sujetos no están cegados a la asignación de formulación del sujeto. El Patrocinador es responsable de preparar, dispensar y etiquetar el IP del producto en investigación.

Diseño del estudio

[0085] El estudio consta de dos fases:

Fase I

[0086] Diez (10) sujetos previamente diagnosticados y tratados crónicamente para el hipoparatiroidismo primario están inscritos. La ingesta diaria de CCS se reemplaza gradualmente por una cantidad reducida de calcio elemental de CCA. Cinco (5) sujetos consumen CCA antes de comer y los otros cinco (5) sujetos consumen CCA después de comer. La seguridad y la eficacia del tratamiento se controlan de cerca durante esta fase.

[0087] La absorción de CCA se evalúa usando el calcio sérico semanal corregido para pruebas de valor de albúmina (CA). La excreción de calcio en orina se prueba en la selección y al final de la fase I.

[0088] Fase II - Diez (10) nuevos sujetos previamente diagnosticados y tratados crónicamente para hipoparatiroidismo primario están inscritos.

[0089] Los sujetos se asignaron aleatoriamente a uno de los siguientes tratamientos durante 6 semanas:

1. Estándar de cuidado - la misma formulación de calcio elemental y de dosificación que se utilizó rutinariamente antes del estudio.

2. CCA: la dosis establecida de calcio elemental de CCA (basada en el factor de conversión y las condiciones de alimentación/ayuno que se encuentran en la fase I del estudio).

[0090] Las dos formulaciones se administran con la dosificación diaria regular de vitamina D (1-alfa D3).

[0091] Al final del tratamiento, cada grupo recibe la formulación alternativa durante otras 6 semanas.

[0092] La absorción superior de CCA se evalúa usando análisis de sangre semanales para calcular los valores de CA en suero. La excreción de calcio en la orina se analiza en la selección y al final de cada tratamiento.

[0093] La siguiente es una descripción detallada de los procedimientos del estudio:

Los sujetos elegibles son tratados como sigue:

Fase I

[0094] I-Día -21 (+/-17) Cribado: sujetos con un hipoparatiroidismo primario diagnosticado (ver sección 4.1 para definiciones), y que reciben tratamiento con suplementos de calcio y vitamina D al menos 1 año antes del comienzo del estudio y no tienen enfermedad renal o hepática importante, están invitados al CCR. En la clínica, los sujetos son entrevistados, se documenta su historial médico y su medicación actual y firman un formulario de consentimiento informado (ICF). Se remite a los sujetos para que realicen análisis de sangre para determinar los niveles séricos de calcio, P, creatinina y albúmina. Se realiza el cálculo del calcio corregido por albúmina (CA). Se instruye a los sujetos para que realicen una recolección de orina de 24 horas para Ca, P y creatinina. Se pide a los sujetos que llenen un diario de alimentos y medicamentos durante 3 días consecutivos para evaluar su ingesta diaria de calcio en la dieta. Las mujeres en edad fértil se someten a una prueba de embarazo en orina. Los sujetos elegibles, que cumplen con todos los criterios de inclusión y no tienen ninguno de los criterios de exclusión, se inscriben en el estudio.

[0095] A los sujetos se les informa por teléfono o en el sitio de si son elegibles para entrar en el estudio.

[0096] I-Día 0: Los sujetos elegibles llegan al CRC donde se les pregunta sobre cualquier cambio en su estado médico desde su última visita. Se realizan análisis de sangre para definir los valores basales de calcio sérico, P y albúmina. Se realiza el cálculo de CA en la línea de base.

[0097] Los sujetos reciben un paquete de tabletas de CCA, cada tableta contiene 50 o 200 mg de calcio elemental (según la cantidad diaria total de suplemento de calcio, suministro para 14 días 5 tabletas de repuesto). El reemplazo de CCS por CCA se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

NTDC = ITDC - [0.1 xf'TDC (mg CCS)] + [0.05*ITDC (mg ACC)] *ITDC - Ingesta diaria total inicial de calcio (mg)

**NTDC - Nueva ingesta diaria total de calcio (mg)

[0098] 10% (en mg) de la ingesta diaria total de calcio elemental se reemplaza por un 5% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial). La ingesta diaria de vitamina D sigue siendo la misma.

[0099] El cálculo para el número de tabletas por día se lleva a cabo específicamente para cada sujeto (de acuerdo con la dosis diaria de los suplementos de calcio) por el médico.

[0100] Los sujetos son instruidos para tomar la cantidad de tabletas CCA al día, de acuerdo con su NTDC individual calculado:

1. Cinco sujetos son instruidos para tomar comprimidos por la mañana después de una comida, al mediodía después de una comida y por la noche después de una comida.

2. Se indica a cinco sujetos que tomen los comprimidos por la mañana antes de comer, al mediodía antes de comer y por la noche antes de comer.

[0101] Los sujetos son instruidos para continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0102] I-Día 3 (±1): los sujetos llegan al CCR y se analizan sus niveles de calcio, P y albúmina en suero. El cálculo de Ca se realiza para excluir hipocalcemia (Ca<7,0 mg/dL). Si los valores de CA están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dl), los sujetos continúan tomando las dosis de calcio que se les indicaron en el día 0. Si los valores de CA están por debajo de 7,0 mg/dl o por encima de 10,0 mg/dl, Se realizan cambios en la ingesta de calcio, de acuerdo con la decisión del médico.

[0103] I-Día 7 (± 1): los sujetos llegan al CCR y se analizan sus niveles de calcio, P y albúmina en suero. El cálculo de CA se realiza:

a. Factor de conversión 0,5:

Si CA=valor inicial, entonces el 20% (en mg, calculado de la ingesta diaria total inicial) de calcio elemental se reemplaza por el 10% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC ⁼ ITDC - [0.2*ITDC (mg CCS)] [0.I*ITDC (mg ACC)]

b. Factor de conversión 0,75:

Si CA < valor inicial, entonces el 10% (en mg, calculado de la ingesta diaria total inicial) se reemplaza por el 7,5% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC = ITDC - [0.1 *ITDC (mg CCS)] [0.075*ITDC (mg ACC)]

CA <7,00 mg/dl obliga al final del tratamiento.

c. Factor de conversión 0,25:

Si CA > valor inicial, entonces el 10% (en mg, calculado de la ingesta diaria total inicial) se reemplaza por 2,5% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC = ITDC [0.1*ITDC (mg CCS)] ⁺ [0.025*ITDC (mgACC)]

[0104] A los sujetos se les pregunta sobre los efectos secundarios o reacciones adversas que puedan haber ocurrido y los cambios en las medicaciones concomitantes desde su última visita. Se pregunta a los sujetos sobre los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión). Los sujetos reciben instrucciones sobre las nuevas dosis de CCA y se les recuerda que tomen la cantidad de comprimidos al día de acuerdo con su NTDC calculado individualmente), por la mañana, al mediodía y por la noche, antes o después de una comida (según su asignación). Se recuerda a los sujetos que continúen con el consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0105] I-Día 10 (± 1): los sujetos llegan al CCR y se analizan sus niveles de calcio, P y albúmina en suero. El cálculo de CA se realiza para excluir hipocalcemia (Ca <7,0 mg/dL). Si los niveles de CA están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dl), los sujetos continúan tomando las dosis de calcio que se les indicaron el I-día 7. Si los niveles de CA están por debajo de 7,0 mg/dl o por encima de 10,0 mg/dl, se realizan cambios en la ingesta de calcio, de acuerdo con la decisión del médico.

[0106] I-Día 14 (± 1): Los sujetos llegan al CRC y se analizan sus niveles de calcio, P y albúmina en suero. El cálculo de CA se realiza para excluir hipocalcemia (Ca <7,0 mg/dL). Si ninguna de las fórmulas de conversión (a-c, I-Día 7) dio como resultado valores de calcio sérico dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dL), el estudio se termina.

[0107] A los sujetos se les pregunta sobre los efectos secundarios o reacciones adversas que puedan haber ocurrido y los cambios en las medicaciones concomitantes desde su última visita. Se pregunta a los sujetos sobre los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0108] El 50% de la suplementación diaria inicial de CCS se reemplaza por CCA basado en el factor de conversión encontrado en I-día 7 (fórmulas a-c):

a. Factor de conversión 0,5: el 50% (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial) de calcio elemental se reemplaza por el 25% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial)

N'TDC = ITDC - [O.SxITDC (mg CCS)] ⁺ [0.25*ITDC (mgACC)J

b. Factor de conversión 0,75: el 50% (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial) de calcio elemental se reemplaza por el 37,5% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC = ITDC [0.5*ITDC (mg CCS)] [0.375*ITDC (mgACC)J

c. Factor de conversión 0,25: el 50% (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial) de calcio elemental se reemplaza por el 12,5% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC = ITDC - [O.SxITDC (mg CCS)] + [O.I25xlTDC (mgACC)]

[0109] Los sujetos reciben un paquete de tabletas de CCA, cada tableta contiene 50 o 200 mg de calcio elemental (de acuerdo con su NTDC calculado individualmente, suministro para 14 días 5 tabletas de repuesto). Los sujetos reciben instrucciones sobre las nuevas dosis de CCA y se les recuerda que deben tomar la cantidad de comprimidos al día de acuerdo con su NTDC calculado individualmente, por la mañana, al mediodía y por la noche, antes o después de una comida (según su asignación inicial). Se recuerda a los sujetos que continúen con el consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo. I-Día 21 (± 1): los sujetos llegan al c Cr y se analizan sus niveles séricos de calcio, P y albúmina. Los cálculos de CA se realizan para excluir la hipocalcemia (Ca <7,0 mg/dL). Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se pregunta a los sujetos sobre los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión). Si los niveles de CA son inferiores a 7,0 mg/dl o superiores a 10,0 mg/dl, el sujeto se excluye del estudio (según la decisión del médico). Si los niveles de CA están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dL), se realiza un reemplazo completo de la suplementación diaria de CCS con CCA, basado en el factor de conversión encontrado en el I-Día 7 (fórmulas a-c):

a. Factor de conversión 0,5: el 100% (en mg) de la ingesta diaria total inicial de calcio elemental se reemplaza por el 50% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC ⁼ ITDC [ITDC (mg CCS)] ⁺ [O.SxITDC (mg ACQ]

b. Factor de conversión 0,75: el 100% (en mg) de la ingesta diaria total inicial de calcio elemental se reemplaza por el 75% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC = ITDC [ITDC (mg CCS)] ⁺ [0. 75x¡TDC (mgACC)]

c. Factor de conversión 0,25: el 100% (en mg) de la ingesta diaria total inicial de calcio elemental se reemplaza por el 25% de calcio elemental de CCA (en mg, calculado a partir de la ingesta diaria total inicial).

NTDC ⁼ ITDC-[ITDC (mg CCS)] ⁺ [0.25xITDC (mgACC)]

[0110] Los sujetos reciben instrucciones sobre las nuevas dosis de CCA y se les recuerda que deben tomar la cantidad de comprimidos al día de acuerdo con su NTDC calculado individualmente, por la mañana, al mediodía y por la noche, antes o después de una comida (según su asignación inicial). Se recuerda a los sujetos que continúen con el consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo. Los sujetos reciben un recipiente para realizar la recolección de orina de 24 horas antes de su próxima visita programada.

[0111] I-Día 27 (± 1) por teléfono: A los sujetos se les recuerda a realizar la recolección de orina de 24 horas.

[0112] I-Día 28 (± 1) - Terminación de la fase I: Los sujetos llegan al CCR y se analizan sus niveles séricos de calcio, P y albúmina. Se realiza el cálculo de CA. Los sujetos proporcionan el recipiente de recolección de orina de 24 horas para Ca, P y creatinina para evaluar la calciuria. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia y depresión).

[0113] Los resultados de la Fase I se examinan antes de decidir si o no a embarcarse en la parte de cruce del estudio previsto para la Fase II. Los datos de la Fase I se resumen, mostrando para cada sujeto, por rama y en general la relación entre los niveles de CA por la cantidad de reemplazo de CCA de CCS recibido.

Fase II

[0114] Diez (10) nuevos sujetos previamente diagnosticados y tratados crónicamente para el hipoparatiroidismo primario están inscritos.

[0115] A los sujetos se les asignaron aleatoriamente a uno de los siguientes tratamientos durante 6 semanas:

1. Estándar de la atención (CCS) - la misma dosis de calcio elemental que se utilizó rutinariamente antes del estudio.

2. CCA: la dosis establecida de calcio elemental de CCA (basada en el factor de conversión y las condiciones de alimentación/ayuno que se encuentran en la etapa I del estudio).

[0116] Las dos formulaciones se administran con la dosificación diaria regular de vitamina D (1 -alfa D3).

[0117] Al final del tratamiento, cada grupo recibe la formulación alternativa durante otras 6 semanas.

[0118] La absorción superior de CCA se evalúa mediante análisis de sangre semanales a valores de CA suero calcular. La excreción de calcio en la orina se analiza en la selección y al final de cada tratamiento. II-Día-21 (+/-17) Cribado: sujetos con un diagnóstico de hipoparatiroidismo primario y que habían estado recibiendo suplementos de calcio y vitamina D al menos 1 año antes del comienzo del estudio y no tenían enfermedad renal o hepática importante, están invitados a la CRC.

[0119] En la clínica, los sujetos son entrevistados, su historia médica y su medicación actual se documentan y se firma un formulario de consentimiento informado (ICF). Se remite a los sujetos para que realicen análisis de sangre para determinar los niveles de calcio, P y albúmina. Se realiza el cálculo de CA. Se instruye a los sujetos para que realicen una recolección de orina de 24 horas para determinar los niveles de Ca, P y creatinina. Se pide a los sujetos que llenen un diario de alimentos y medicamentos durante 3 días consecutivos para evaluar su ingesta diaria de calcio. Las mujeres en edad fértil se someten a una prueba de embarazo en orina. Los sujetos elegibles, que cumplen con todos los criterios de inclusión y no tienen ninguno de los criterios de exclusión, se inscriben en el estudio.

[0120] Los sujetos son informados por teléfono o in situ si son elegibles para participar en el estudio.

[0121] II-Día 0: Los sujetos elegibles llegan a la CRC, donde se les pregunta sobre cualquier cambio en su estado de salud desde su última visita. Se realizan análisis de sangre para definir los valores basales de calcio sérico, P y albúmina. Los valores de CA se calculan al inicio del estudio.

[0122] Los sujetos se asignan aleatoriamente a uno de los siguientes tratamientos:

1. Estándar de atención (CCS) - la misma dosis de calcio elemental que se usó de forma rutinaria antes del estudio.

2. CCA - la dosis establecida de calcio elemental de CCA (basada en el factor de conversión y las condiciones de alimentación/ayuno que se encuentran en la etapa I del estudio).

[0123] Los sujetos que fueron asignados al brazo de tratamiento de CCA, reciben un recipiente con tabletas de CCA, cada tableta contiene 200 mg de calcio elemental (suministro para 35 días 5 tabletas de repuesto). Los sujetos asignados al grupo de tratamiento con CCS continúan tomando su suplemento de calcio de rutina.

[0124] La dosificación exacta de los suplementos de calcio se determina para cada sujeto de acuerdo el historial médico conocido.

[0125] Los sujetos son instruidos para continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0126] II-Día 3 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. El cálculo de CA se realiza para excluir hipocalcemia (Ca<7,0 mg/dL). Si los valores de Ca están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dl), los sujetos continúan tomando las dosis de calcio que se les indicaron en el día II-0. Si los niveles de CA están por debajo de 7,0 mg/dL o por encima de 10,0 mg/dL, se realizan cambios en la ingesta de calcio, de acuerdo con la decisión del médico.

[0127] II-Día 7 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y sus niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. Se realiza el cálculo de CA. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión). Si es necesario, se realizan ajustes de la ingesta de CCA o CCS.

[0128] A los sujetos se les recuerda a tomar la suplementación con calcio de acuerdo con sus instrucciones de asignación.

[0129] A los sujetos se les recuerda a continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0130] II-Día 10 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. El cálculo de CA se realiza para excluir hipocalcemia (Ca <7,0 mg/dL). Si los niveles de Ca están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dl), los sujetos continúan tomando las dosis de calcio que se les indicó el día II. Si los niveles de CA están por debajo de 7,0 mg/dL o por encima de 10,0 mg/dL, se realizan cambios en la ingesta de calcio, de acuerdo con la decisión del médico.

[0131] II-Día 14 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. Se realiza el cálculo de CA. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0132] A los sujetos se les recuerda a tomar la suplementación con calcio de acuerdo con sus instrucciones de asignación.

[0133] A los sujetos se les recuerda a continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0134] II-Día 21 (± 1): los sujetos llegan al CCR y se analizan su calcio sérico, P y albúmina. Se realiza el cálculo de Ca . Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0135] A los sujetos se les recuerda a tomar la suplementación de calcio de acuerdo con las instrucciones.

[0136] A los sujetos se les recuerda a continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0137] Los sujetos reciben un recipiente para realizar la recolección de orina de 24 horas antes de su próxima visita programada.

[0138] II-Día 34 (± 1) por teléfono: A los sujetos se les recuerda llevar a cabo la recogida de orina de 24 horas.

[0139] II-Día 35 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. Se realiza el cálculo de CA. Los sujetos proporcionan el recipiente con recolección de orina de 24 horas para Ca, P y creatinina para evaluar la calciuria. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita.

[0140] Se preguntó a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio en suero (tetania, facial muecas, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0141] Los sujetos previamente asignados al brazo de tratamiento de CCS reciben un paquete de tabletas de CCA, cada tableta contiene 200 mg de calcio elemental (suministro para 35 días 5 tabletas de repuesto). A los sujetos previamente asignados al grupo de tratamiento de CCA se les indica que reanuden su suplementación regular de CCS.

[0142] La dosificación exacta de la suplementación de calcio para cada sujeto se determina mediante el historial médico conocido.

[0143] A los sujetos se les recuerda a continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0144] II-Día 38 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y el calcio en suero, P y albúmina niveles se ponen a prueba. El cálculo de CA se realiza para excluir hipocalcemia (Ca <7,0 mg/dL). Si los niveles de CA están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dl), los sujetos continúan tomando las dosis de calcio que se les indicaron el día II 35. Si los niveles de CA son inferiores a 7,0 mg/dl o superiores a 10,0 mg/dl, se realizan cambios en la ingesta de calcio, de acuerdo con la decisión del médico.

[0145] II-Día 42 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. Se realiza el cálculo de CA. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión). Si es necesario, se realizan ajustes de la ingesta de CCA o CCS.

[0146] A los sujetos se les recuerda tomar la suplementación con calcio de acuerdo con sus instrucciones de asignación.

[0147] A los sujetos se les recuerda continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0148] II-Día 45 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. El cálculo de CA se realiza para excluir hipocalcemia (Ca <7,0 mg/dL). Si los niveles de Ca están dentro del intervalo diana deseado (7,0-10,0 mg/dl), los sujetos continúan tomando las dosis de calcio que se les indicaron el día II 42. Si los niveles de CA están por debajo de 7,0 mg/dl o por encima de 10,0 mg/dl, Se realizan cambios en la ingesta de calcio, de acuerdo con la decisión del médico.

[0149] II-Día 49 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. Se realiza el cálculo de CA. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0150] A los sujetos se les recuerda a tomar la suplementación con calcio de acuerdo con sus instrucciones de asignación.

[0151] A los sujetos se les recuerda continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo.

[0152] II-Día 56 (± 1): Los sujetos llegan a la CRC y los niveles de calcio en suero, P y albúmina son probados. Se realiza el cálculo de CA. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0153] A los sujetos se les recuerda tomar la suplementación con calcio de acuerdo con sus instrucciones de asignación.

[0154] A los sujetos se les recuerda continuar su consumo de medicamentos de rutina durante el ensayo. Los sujetos reciben un recipiente para realizar la recolección de orina de 24 horas antes de su próxima visita programada.

[0155] II-Día 69 (± 1) por teléfono: A los sujetos se les recuerda llevar a cabo la recogida de orina de 24 horas.

[0156] II-Día 70 (± 1) - Terminación de la fase II: Los sujetos llegan al CRC y se analizan sus niveles de calcio, P y albúmina en suero. Se realiza el cálculo de CA. Los sujetos proporcionan el recipiente con recolección de orina de 24 horas para Ca, P y creatinina para evaluar la calciuria. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido y los cambios en los medicamentos concomitantes desde su última visita. Se les pregunta a los sujetos acerca de los síntomas y signos relacionados con un cambio en los niveles de calcio sérico (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión).

[0157] Se puede realizar una visita no programada en cualquier momento durante el estudio a petición del sujeto o según lo considere necesario el investigador. Se registra la fecha y el motivo de la visita no programada. Todas las evaluaciones son opcionales y se realizarán a discreción del investigador.

[0158] La visita de interrupción temprana se produce si hay un sujeto que termina su participación en el estudio antes de tiempo (por las razones especificadas en la Sección 7.4) y es similar a la terminación de la visita (día 28 en la fase I, el día 70 en la fase II).

[0159] Los procedimientos del estudio se resumen en las tablas 4 y 5.

Fase I

[0160]

Tabla 4: Fase I programa de procedimientos.

(Continuación)

Fase II

Procedimientos previos al estudio (cribado)

[0162] Las siguientes evaluaciones de cribado se realizan en el cribado de cada sujeto:

- Firmar un formulario de consentimiento informado

- Historial médico del sujeto

- Medicación actual del sujeto

- Entrevistas al sujeto

- Prueba de embarazo (para mujeres en edad fértil)

- Diario de alimentos y medicamentos durante 3 días consecutivos

- Cumplimiento de los criterios de inclusión/exclusión

Procedimientos previos a la dosis

[0163] Las siguientes evaluaciones se realizan para cada sujeto:

- Análisis de sangre del sujeto para el cálculo del valor de CA en suero, P y albúmina

- 24 horas de recogida de orina para el calcio, P y creatinina

Pruebas de estudio

Análisis de sangre

[0164] Los análisis de sangre se realizan para cada sujeto en cada visita CRC desde el día 0 y en adelante: Fase I: Día 0, 3, 7, 10, 14, 21, 28.

[0165] Fase II: Día 0, 3, 7, 10, 14, 21, 35, 38, 42, 45, 49, 56, 70.

Ensayos de recogida de orina de 24 horas

[0166] La prueba de orina de 24 horas se realiza a:

Fase I: Terminación del estudio (día 28)

Fase II: Día 35 y la terminación del estudio (día 70)

Síntomas y signos relacionados con la hipocalcemia

[0167] Se hace una lista de preguntas dirigidas a identificar los síntomas e indicios relacionados con hipocalcemia durante las siguientes visitas CRC:

Fase I: Día 7, 14, 21, 28

Fase II: Día 7, 14, 21, 35, 42, 49, 56, 70

Medidas del estudio

Análisis de sangre: cálculo de calcio (ca) corregido por albúmina, niveles séricos de fósforo y albúmina

Calcio y albúmina:

[0168] La evaluación inicial de la hipocalcemia generalmente se basa en la medición del calcio sérico total corregido por la concentración de albúmina. Los valores normales de CA oscilan entre 8,5 y 10,2 mg/dL. En sujetos con hipoparatiroidismo, los valores diana de CA deseados son 7,0-10,0 mg/dL.

[0169] La relación entre el calcio sérico total y la albúmina se define por la siguiente regla: la concentración total en suero de calcio cae por 0,8 mg/dl por cada caída de 1-g/dl en concentración de suero de albúmina. Esta regla asume que la albúmina normal es igual a 4,0 g/dL y el calcio normal es 10,0 mg/dL.

[0170] Cálculo: Calcio (corregido, mmol/L) = Calcio (medido, mmol/L) {(40 - albúmina (g/L)) x 0,02}

Fósforo (P):

[0171] La prueba de fósforo sérico mide la cantidad de fosfato en la sangre. Los valores normales oscilan entre 2,4 y 4,1 mg/dL.

Pruebas de 24 horas de recogida de orina

[0172] Para una colección de orina de 24 horas, toda la orina durante un período de tiempo de 24 horas deben ser recogidos. La muestra de orina debe incluir la última orina, 24 horas después de comenzar la recolección.

Calcio:

[0173] Los resultados del ensayo pueden reflejar la ingesta alimentaria:

Tabla 6: Calcio en orina

[0174] nivel de calcio en la orina> 300 mg/24 horas o> 4 mg/kg de peso/24 horas se considera como hipercalciuria. Creatinina:

[0175] Una prueba de aclaramiento de creatinina se realiza en una muestra de orina recogida durante 24 horas. Se utiliza para determinar la tasa de filtración glomerular, que ayuda a medir lo bien que funciona el riñón.

Tabla 7: Creatinina en orina

Fósforo:

[0176] La prueba de orina de fosfato mide la cantidad de fosfato en una muestra de orina recogida durante 24 horas (prueba de orina de 24 horas). El fosfato es un ión cargado que contiene el fósforo mineral.

Tabla 8: Fosfato en orina

[0177] Los resultados de una prueba para medir el fosfato en la orina rara vez son útiles por sí solos. Siempre deben interpretarse junto con los resultados de otras pruebas. Los niveles de calcio y fosfato a menudo se miden al mismo tiempo.

Evaluación de los síntomas e indicios relacionados con la hipocalcemia

[0178] A los sujetos se les pide que respondan a las preguntas de la presencia de síntomas y signos relacionados con hipocalcemia (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, y depresión).

[0179] Las respuestas de los sujetos están documentadas en el CRF.

Seguridad del tratamiento

Niveles séricos de calcio, P y albúmina

[0180] Los valores normales de CA oscilan entre 8,5 y 10,2 mg/dl. En sujetos con hipoparatiroidismo, los valores diana de CA deseados son 7,0-10,0 mg/dL. La evaluación inicial de la hipocalcemia generalmente se basa en la medición del calcio sérico total corregido por la concentración de albúmina, de acuerdo con la siguiente fórmula: Calcio (corregido, mmol/L) = Calcio (medido, mmol/L) {(40 - albúmina (g/L)) x 0,02}.

[0181] El análisis de fósforo en suero mide la cantidad de fosfato en la sangre. Los valores normales oscilan entre 2,4 y 4,1 mg/dL.

Calcio en la orina, P y las pruebas de creatinina

[0182] Nivel de calcio en la orina > 300 mg/24 horas o > 4 mg/kg de peso/24 horas se considera como hipercalciuria.

[0183] Los niveles normales de creatinina en orina en los hombres (menores de 40 años) son 107-139 mililitros por minuto (ml/min) o 1,8-2,3 mililitros por segundo (ml/seg) y en las mujeres (menores de 40 años) son 87-107 ml/min o 1,5-1,8 ml/seg. Los valores de depuración de creatinina normalmente disminuyen con la edad (los valores normales disminuyen en 6,5 ml/min por cada 10 años después de los 20 años). La medición de calcio en orina se expresa en relación con la creatinina.

[0184] Un intervalo de referencia normal para la proporción de calcio en la orina (mg/dL): creatinina en orina (mg/dL) es <0,14.

[0185] Los niveles de fosfato normales son 0,4-1,3 gramos (g) por muestra de orina de 24 horas.

Complicaciones

[0186] Los síntomas y signos relacionados con hipocalcemia (tetania, muecas faciales, parestesias, dolores musculares, arritmia, depresión) están documentados.

Análisis estadístico

[0187] Este es un estudio prospectivo de dos etapas en donde se evalúa CCA como un reemplazo para CCS en sujetos con hipoparatiroidismo. La eficacia se evalúa por el grado en que dosis más pequeñas de CCA que reemplazan dosis más grandes de CCS pueden proporcionar el calcio suplementario requerido por las personas con hipoparatiroidismo. La seguridad se evalúa mediante los eventos adversos (EA), incluidos los relacionados con las excreciones de calcio en la orina. Plan y análisis estadísticos se llevan a cabo por TechnoSTAT Ltd.

Consideraciones de diseño

[0188] Se trata de un estudio de dos fases en donde la primera fase evalúa un factor de conversión predeterminado a partir de CCS a CCA en sujetos con hipoparatiroidismo. Durante esta fase, proporciones progresivamente mayores de CCS se reemplazan con CCA dependiendo de la respuesta del sujeto, de ahí la naturaleza adaptativa de esta fase.

[0189] Si la primera fase de la prueba demuestra la seguridad del factor de conversión, se inicia la segunda fase. La segunda fase comprende un ensayo cruzado con sujetos recién reclutados; es decir, sujetos que no participaron en la primera fase del ensayo. Cada uno de estos sujetos se asigna al azar en bloques en una proporción de 1:1 al control CCS o al tratamiento CCA. En la segunda etapa del cruce, cada sujeto recibe la formulación alternativa que no recibió en la primera etapa.

[0190] La duración del estudio por sujeto que participa en la fase I es de 49 días desde la selección (día-21) hasta la finalización (día 28) y 91 días desde la selección (día-21) hasta la finalización (día 70) por sujeto que participa en la fase II.

[0191] Las visitas a la CRC tiene lugar en los días 0 (línea de base), 3, 7, 10, 14, 21 y 28 (al final de la fase I) y en los días 0 (línea de base), 3, 7, 10, 14, 21, 35, 38, 42, 45, 49 y 70 (final de la fase II) para la fase I y la fase II, respectivamente.

[0192] Los análisis de sangre y de orina y cuestionario clínico se llevan a cabo durante las visitas de los sujetos en la clínica.

Conjunto de análisis

Población de seguridad

[0193] La población de seguridad se compone de todos los pacientes en ambas etapas de estudio para los que se administraron CCA o CCC como parte de los procedimientos del ensayo.

Población de eficacia

[0194] La población de eficacia consiste en sujetos de fase II sin grandes violaciónes de entrada que puedan afectar a los resultados, para los cuales hay línea de base y al menos algunos datos post-tratamiento sobre los niveles de CA en suero. El grado en que es probable que una infracción de entrada afecte el resultado lo determina un revisor ciego al resultado (es decir, revisión ciega).

[0195] El tratamiento de los valores que faltan: sólo se utilizan datos observados; los datos faltantes no se imputan. Puntos finales de seguridad

[0196] La incidencia global de acontecimientos adversos relacionados con el producto.

[0197] Todos los eventos adversos y eventos adversos graves se recogen y se informan.

Eficacia primaria

[0198]

- En la Fase I: Cambio en la dosis de calcio elemental de CCA logrando la normalización en el suero CA y los niveles de calcio en la orina

- En la Fase II: Suero de CA y los niveles de calcio en la orina

Eficacia secundaria

[0199] Los criterios de eficacia secundaria incluyen:

- Efectos secundarios asociados con niveles de calcio

- Síntomas relacionados con hipocalcemia

- Niveles de fósforo en suero

Análisis de datos

Visión general

[0200] Los análisis de seguridad y disposición del sujeto se llevan a cabo en la población de seguridad. Los análisis de eficacia se realizan en la población de eficacia. Los resultados de la fase I y II se analizan y presentan por separado.

[0201] Los datos se resumen en tablas que enumeran la media, la desviación estándar mediana, mínimo, máximo y el número de sujetos para los datos continuos, o en las tablas enumerando la cantidad de propiedades y el porcentaje para los datos categóricos en su caso. Las tablas se presentan por grupo de estudio, a lo largo del tiempo y en general. En la Fase I, los brazos del estudio consisten en la ingesta de CCA antes o después de las comidas. En la Fase II, los brazos del estudio consisten en CCS o CCA.

[0202] Todos los análisis estadísticos se realizan y apéndices de datos se crean utilizando el sistema de SAS®. Se evalúan los efectos del incumplimiento, los abandonos y las posibles covariables como la edad y el sexo para determinar el impacto en la aplicabilidad general de los resultados de este estudio.

Disposición del sujeto

[0203] Se tabula la disposición del sujeto; se resume el número de sujetos inscritos, expuestos, terminados prematuramente y completados.

[0204] Se prepara una lista de abandonos incluyendo motivo de la suspensión, y el tiempo de la interrupción.

Seguridad

[0205] Los análisis de seguridad son de carácter descriptivo y narrativo, con SAE y AE codificados usando MedDRA y tabulados por sistema corporal, término preferido, el brazo de estudio, la gravedad y relación con el procedimiento. Se proporcionan estadísticas descriptivas y tablas de análisis de turnos, que indican cambios entre valores "normales" y "anormales", según corresponda para las pruebas de laboratorio.

Análisis de eficacia primaria: Fase I

[0206] Los datos de la fase I se resumen numérica y gráficamente, mostrando para cada sujeto, por brazo y en general la relación entre los niveles de calcio por cantidad de reemplazo CCA de CCS recibido. Los niveles de CCA y CA en suero se describen a lo largo del tiempo para cada individuo, por brazo y en general, numéricamente, por tablas de turnos y gráficamente.

Análisis de eficacia primaria: Fase II

[0207] Los niveles séricos de CA se resumen numérica y gráficamente por brazo a lo largo del tiempo y para las diferencias entre brazos a lo largo del tiempo para puntos de tiempo paralelos, emparejados (D0, D35; D3, D38; D7, D42; D10, D45; D14, D49; D21, D56). Las diferencias en los niveles de CA entre los brazos en puntos de tiempo paralelos se comparan mediante la prueba t pareada o la prueba de intervalo de signos de Wicoxon, según la distribución de las diferencias.

Análisis secundarios

[0208] Los efectos secundarios asociados con un cambio son niveles séricos de calcio, así como los síntomas relacionados con hipocalcemia están descritos por el brazo tanto en Fase I como Fase II. Los niveles de fósforo sérico se describen por brazo a lo largo del tiempo en la Fase I y la Fase II, así como por las diferencias entre los brazos en momentos paralelos en la Fase II. Las tablas de cambio se proporcionan por brazo para ambas Fases.

Análisis intermedio

[0209] No existe un análisis intermedio planificado formalmente dentro de ninguna de las dos fases del estudio. Sin embargo, los datos de seguridad, que incluyen niveles séricos de CA y fósforo, se controlan de forma continua.

[0210] Los resultados de la Fase I se examinan antes de decidir si o no a embarcarse en la parte de cruce del estudio previsto para la Fase II.

Gestión de datos

[0211] Los datos de investigación se registran en CRF de papel. Los CRF se llenan solo para los sujetos inscritos (no los fallos de detección). Mediante su firma en el CRF, el investigador certifica que los datos recopilados de cada paciente son exactos, completos y legibles.

[0212] Todos los datos generados en la investigación clínica actual se gestionan de acuerdo con los procedimientos estándar TechnoSTAT. Los datos y otra documentación del estudio se archivan durante un mínimo de 6 años después de la finalización de la investigación.

Seguridad

Definición de eventos adversos

[0213] Un evento adverso es cualquier signo médico desfavorable (incluyendo un hallazgo anormal de laboratorio), síntoma o enfermedad asociada temporalmente con el uso de las direcciones IP si es o no se consideraron IP relacionados. Una nueva condición o el empeoramiento de una condición preexistente se considera un EA. Todos los hallazgos anormales que se consideren clínicamente significativos deben registrarse como eventos adversos.

[0214] Los casos de situación médica aguda (que se evalúan dentro de las 48 horas desde el inicio del estudio) que son considerados significativos por el Investigador Principal (tales como hormigueo, entumecimiento alrededor de la boca, calambres, ansiedad, contracciones musculares, convulsiones, estridor, psicosis, náuseas, vómitos, pérdida de apetito, estreñimiento, dolor de estómago, sed, sequedad de boca y aumento de la micción) se documentan en el Formulario de informe de caso (CRF) y el sujeto está excluido del experimento.

[0215] En todos los casos, la etiología de la EA debe, en lo posible, ser identificada y el Patrocinador notificado por la grabación en el FCI.

[0216] La relación del evento adverso con el IP se define de la siguiente manera:

Tabla 9: La relación del evento adverso con el IP

[0217] Evento adverso grave (EAG) es cualquier evento adverso que:

- Condujo a la muerte.

- Resultó en una enfermedad o lesión potencialmente mortal.

- Resultó en un deterioro permanente de una estructura corporal o función corporal.

- Hospitalización requerida del paciente o prolongación de la hospitalización existente.

- Resultó en una intervención médica o quirúrgica para prevenir el deterioro permanente de la estructura o función corporal.

- Condujo a sufrimiento fetal, muerte fetal, anomalía congénita o defecto de nacimiento.

Definiciones de intensidad de eventos adversos

[0218] Las siguientes definiciones deben ser utilizadas por el médico investigador para describir la intensidad de los eventos adversos.

[0219] Las siguientes son las únicas definiciones que deberían utilizarse para describir la intensidad evento adverso. Solo se debe utilizar una definición de gravedad para cada evento adverso (p. ej., "leve a moderado" no es aceptable).

Tabla 10: Intensidad del evento adverso

Valores anormales de laboratorio

[0220] Se documenta una anormalidad de laboratorio clínico si se cumple cualquiera de las siguientes condiciones:

- La anormalidad de laboratorio está presente en una prueba repetida

- La anormalidad es de un grado que requiere manejo activo (p. ej., cambio de dosis, interrupción del tratamiento, evaluaciones de seguimiento más frecuentes, etc).

[0221] Los valores normales de laboratorio son:

- Calcio sérico (corregido por albúmina): 7,0 a 10,0 mg/dL

- Fósforo sérico: 2,4 - 4,1 mg/dL

- Calcio en orina: > 300 mg/24 horas

- Creatinina en orina: 40 a 300 mg/dl

- Fosfato en orina: 0,4-1,3 gramos (g)

[0222] los resultados anormales de laboratorio que no están dentro del intervalo de referencia normal se registran y se tratan.

Registro de eventos adversos

[0223] Todos los siguientes datos deben registrarse en el CRF del sujeto para cada evento adverso:

- Descripción completa del evento adverso.

- Fecha y hora de inicio.

- Fecha y hora de resolución.

- Gravedad del evento, que debe evaluar el médico investigador de acuerdo con las definiciones de la Sección 16.2.

- El médico investigador evalúa la relación con los PI del estudio.

- Acción tomada (si corresponde).

- Resultado y detalles de cualquier seguimiento posterior.

Efectos secundarios previstos (eventos adversos)

[0224] La siguiente es una lista de eventos adversos posibles de productos en investigación CCA. La lista se basa en la experiencia previa del uso de CCA natural y los efectos relacionados con las formas cristalinas de consumo de calcio:

- Eructos

- Gases

- Estreñimiento

- Náuseas

- Vómitos

- Pérdida del apetito

- Aumento de la micción

- Daño renal

- Confusión

- Ritmo cardíaco irregular.

Ensayo 3: Absorción ósea de calcio en individuos que consumen corticosteroides

[0225] Se lleva a cabo el experimento con el objetivo de evaluar la biodisponibilidad de la fuente de calcio que comprende carbonato de calcio estable amorfo (CCA) para la mineralización ósea en los sujetos que padecen de enfermedades, trastornos y condiciones asociadas con mala absorción de calcio. Un estudio multicéntrico controlado, prospectivo, aleatorizado, paralelo, doble ciego, activo se lleva a cabo, comparando el efecto de carbonato de calcio amorfo (CCA) versus calcio cristalino de carbonato (CCC) en la densidad mineral ósea de los pacientes tratados crónicamente con corticosteroides.

[0226] El objetivo primario del ensayo es evaluar la eficacia del tratamiento con calcio de CCA en comparación con CCC sobre la preservación de la densidad mineral ósea en pacientes expuestos a tratamientos prolongados con corticosteroides. El objetivo secundario es evaluar el efecto de CCA en comparación con CCC sobre la prevalencia de fracturas durante el período de estudio. El objetivo secundario adicional es evaluar el efecto de CCA en comparación con CCC sobre biomarcadores del metabolismo óseo. El objetivo adicional del ensayo es evaluar el perfil de seguridad de CCA en esta población.

Selección de población de estudio

[0227] La población de estudio incluye sesenta (60) sujetos que tomaron la terapia continua con corticosteroides a largo plazo, treinta (30) sujetos en cada grupo de tratamiento.

Descripción del producto de investigación

[0228] El carbonato de calcio estable amorfo utilizado en el estudio es un CCA sintético estabilizado por bajas concentraciones de fosfoserina y citrato (menos de 0,5% en el producto final), proporcionados por Amorphical Ltd, como se describe anteriormente.

Descripción del producto de control

[0229] El producto de control contenido en cada cápsula de 500 mg de carbonato de calcio cristalino (200 ±5 mg de calcio elemental) y 167 mg de sacarosa. El nivel de calcio elemental en el producto de control fue igual al nivel de calcio elemental en el grupo de tratamiento para evaluar el efecto del carbonato de calcio amorfo en comparación con el carbonato de calcio cristalino.

Posología y administración

[0230] Los sujetos elegibles han recibido aleatoriamente uno de los dos tratamientos. Cada dosis del suplemento del estudio consistió en 667 mg de CCA o 500 mg de CCC en cada cápsula.

Tabla 11: Dosis del tratamiento del estudio

[0231] La selección de la dosis se basa en la ingesta diaria recomendada de calcio elemental para sujetos de 19 a 50 años (1000 mg/día). La dosis de calcio en el control se iguala a los niveles de calcio elemental en el producto CCA. Asignación de sujetos a tratamiento

[0232] Los sujetos son asignados a uno de los grupos de tratamiento al azar de acuerdo con una lista de aleatorización. La asignación al azar a cada uno de los dos brazos del estudio se realiza mediante la asignación al azar en bloques dentro del centro.

Cegamiento

[0233] Los tratamientos orales de calcio administrados en el ensayo clínico están cegados. Los sujetos, los investigadores y cualquier personal involucrado en la evaluación, monitoreo, análisis y manejo de datos de los sujetos están cegados a la asignación de la formulación del sujeto, excepto el patrocinador que es responsable de preparar, dispensar y etiquetar el producto en investigación. Las etiquetas ciegas se adhieren a los viales antes de la dosificación por parte del patrocinador no ciego.

Procedimientos de aleatorización

[0234] El estudio es doble ciego y por lo tanto el personal del CRC y el sujeto se mantienen cegados a las asignaciones de código largo del estudio. Antes de la administración, a cada sujeto se le asigna un número individual y se trata de acuerdo con la lista de aleatorización predeterminada generada por computadora. Se utiliza un algoritmo generado por computadora para asignar el sujeto a los grupos de tratamiento. Las composiciones de tratamiento son preparadas por el patrocinador y las etiquetas se colocan en los viales antes del envío. Se indica a los farmacéuticos del hospital que distribuyan los productos al CRC de acuerdo con las listas de asignación de cohortes.

Diseño del estudio

[0235] Sesenta (60) pacientes que están comenzando actualmente a largo plazo (>6 meses) de tratamiento glucocorticosteroide se asignaron aleatoriamente a uno de dos grupos (n=30). Los pacientes del grupo de tratamiento reciben carbonato de calcio amorfo (CCA) y los del grupo de control activo reciben carbonato de calcio cristalino (CCC). Ambas formulaciones se complementan con vitamina D según sea necesario, según la decisión del médico. Los parámetros de seguridad se evalúan a lo largo de la prueba.

[0236] Los pacientes que admiten a la CRC debido a diversas condiciones médicas se evalúan de forma rutinaria. Los sujetos que están comenzando un tratamiento a largo plazo con glucocorticosteroides debido a su afección médica se consideran candidatos para el ensayo y se les invita al CRC para la detección.

[0237] Cribado (día -7) - Los sujetos firman un formulario de consentimiento informado (ICF). Se realizan pruebas de química y hematología: se miden sodio, potasio, hemoglobina, velocidad de sedimentación, calcio de leucocitos (total, corregido por albúmina), fosfato, fosfatasa alcalina, creatinina y albúmina. Además, se analizan la PTH, la 25-hidroxivitamina D y la hormona estimulante de la tiroides (TSH) en suero. Se mide la excreción urinaria de calcio y creatinina. La salud general se examina mediante la historia clínica y los exámenes físicos.

[0238] Los sujetos elegibles, cumpliendo todos los criterios de inclusión y ninguno de los criterios de exclusión están inscritos en el estudio.

[0239] A los sujetos se les informa por teléfono o en el sitio si son elegibles para entrar en el estudio.

[0240] Visita 1 (día 0): se invita a los sujetos elegibles al CRC. La exploración DEXA se realiza al inicio del estudio. Las DMO se miden para la columna lumbar (L2-4), el cuello femoral y todo el cuerpo. Se documentan las pruebas de fracturas existentes. Se miden los niveles séricos de albúmina, calcio (Ca), fósforo y creatinina (Cr), así como Ca y Cr urinarios. Los marcadores bioquímicos del metabolismo óseo (osteocalcina sérica (OCN), P1NP (propéptico N-terminal de procolágeno total tipo 1), fosfatasa alcalina de tipo óseo (BAP) y niveles urinarios de N-telopéptido reticulado de colágeno tipo I (NTX)) son medidos. Los sujetos reciben al azar paquetes de tabletas, cada cápsula contiene 200 mg de calcio elemental (210 tabletas para 42 días 20 tabletas de repuesto, un total de 230 tabletas) con una de las formulaciones (CCA o CCC). Se indica a los sujetos que tomen 5 cápsulas al día durante las primeras 6 semanas (días 0-42), 2 tabletas por la mañana y 3 tabletas por la noche, después de una comida. Para minimizar los riesgos de efectos secundarios relacionados con el calcio, se indica a los sujetos que toman calcio con regularidad que dejen de consumir suplementos de calcio durante todo el ensayo. Se aconseja a los sujetos que tomen suplementos de vitamina D3 en base a la decisión de los médicos. Se pide a los sujetos que lleven un diario para registrar su uso de glucocorticoides.

[0241] Visita 2 (día 42±3) - A los sujetos se les pregunta sobre efectos secundarios o adversos que pueden haber ocurrido. Se pregunta a los sujetos sobre cualquier evento de fractura que haya ocurrido desde su última visita al CRC. Los sujetos completan el cuestionario TSQM con el representante del CRC. Los sujetos reciben paquetes adicionales de tabletas, cada una de las cuales contiene 200 mg de calcio elemental (un total de 210 tabletas, suministro para 42 días 20 tabletas de repuesto) de la misma formulación (CCA o CCC) que se recibió en la visita anterior. Se recuerda a los sujetos que tomen 5 comprimidos al día durante las próximas 6 semanas (días 42-84), 2 comprimidos por la mañana y 3 comprimidos por la noche, después de una comida. Para minimizar los riesgos de efectos secundarios relacionados con el calcio, se recuerda a los sujetos que toman calcio con regularidad que dejen de consumir suplementos de calcio durante todo el ensayo. Se aconseja a los sujetos que tomen suplementos de vitamina D3 según la decisión de los médicos. Se pide a los sujetos que lleven un diario para registrar su uso de glucocorticoides.

[0242] Visita 3 - (Día 84±3) - Se realiza la exploración DEXA. Las DMO se miden para la columna lumbar (L2-4), el cuello femoral y todo el cuerpo. Se miden los niveles séricos de albúmina, calcio (Ca), fósforo y creatinina (Cr) antes de la dosis, así como Ca y Cr urinarios. También se miden los marcadores bioquímicos del metabolismo óseo. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido. Se pregunta a los sujetos sobre cualquier evento de fractura que haya ocurrido desde su última visita al CRC. Los sujetos reciben paquetes adicionales de comprimidos, cada uno con 200 mg de calcio elemental (un total de 210 cápsulas, suministro para 42 días 20 comprimidos de repuesto) con la misma formulación recibida en el día 0. Se indica a los sujetos que tomen 5 comprimidos al día durante las siguientes 6 semanas (días 84-126) 2 comprimidos por la mañana y 3 comprimidos por la noche, después de una comida. Para minimizar los riesgos de efectos secundarios relacionados con el calcio, se recuerda a los sujetos que toman calcio con regularidad que dejen de consumir suplementos de calcio durante todo el ensayo. Se aconseja a los sujetos que tomen suplementos de vitamina D3 según la decisión de los médicos. Se pide a los sujetos que lleven un diario para registrar su uso de glucocorticoides.

[0243] Visita 4 - (Día 126±3) - A los sujetos se les pregunta sobre los efectos secundarios o reacciones adversas que puedan haber ocurrido. Se pregunta a los sujetos sobre cualquier evento de fractura que haya ocurrido desde su última visita al CRC. Los sujetos reciben paquetes adicionales de tabletas, cada cápsula contiene 200 mg de calcio elemental (un total de 210 tabletas, suministro para 42 días 12 tabletas de repuesto) de la misma formulación (CCA o CCC) que se recibió en la visita anterior. Se recuerda a los sujetos que tomen 5 comprimidos al día durante las próximas 6 semanas (días 126-168), 2 comprimidos por la mañana y 3 comprimidos por la noche, después de una comida. Para minimizar los riesgos de efectos secundarios relacionados con el calcio, se recuerda a los sujetos que toman calcio con regularidad que dejen de consumir suplementos de calcio durante todo el ensayo. Se aconseja a los sujetos que tomen suplementos de vitamina D3 según la decisión de los médicos. Se pide a los sujetos que lleven un diario para registrar su uso de glucocorticoides y que lo lleven consigo a la próxima visita.

[0244] Visita 5 - (Día 168±1) - Se realiza la exploración DEXA. Las DMO se miden para la columna lumbar (L2-4), el cuello femoral y todo el cuerpo. Se miden los niveles séricos de albúmina, calcio (Ca), fósforo y creatinina (Cr) antes de la dosis, así como Ca y Cr urinarios. También se miden los marcadores bioquímicos del metabolismo óseo. Se pregunta a los sujetos sobre cualquier evento de fractura que haya ocurrido desde su última visita al CRC. Los sujetos completan el cuestionario TSQM con el representante del CRC. Se pregunta a los sujetos sobre los efectos secundarios o EA que puedan haber ocurrido.

Medidas de resultado

[0245]

- Preservación de la densidad mineral ósea (DMO) - la DMO se define mediante una exploración por absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA). Los resultados de DEXA se presentan como puntaje Z (comparando los resultados de un escaneo específico con otras personas de la misma edad, peso, etnia y género). Una puntuación Z de menos de -1,5 plantea la preocupación de que otros factores además del envejecimiento contribuyan a la pérdida ósea.

- Prevalencia de fracturas: los eventos de fractura se documentan en cada visita.

- Aumento de los marcadores de formación de hueso

- Reducción en los marcadores de resorción ósea

- Evaluación de los efectos secundarios de calcio:

Análisis de seguridad

[0246] Los análisis de seguridad son de carácter descriptivo y narrativo. Los criterios de valoración de seguridad son los eventos adversos (EA) y los EA graves (AAG), relacionados o no con el tratamiento del estudio. También se incluyen los niveles de calcio sérico y los niveles de calcio y creatinina en orina.

Análisis de eficacia

[0247] El punto final de eficacia primaria es la preservación de la DMO, por valores de Z calculados por DEXA. Las hipótesis se prueban mediante una prueba t de grupos independientes en valores brutos si estos se distribuyen aproximadamente a lo normal. La transformación logarítmica se utiliza para normalizar los datos, si los datos se desvían sustancialmente de lo normal. Si después de aplicar este último los datos todavía se desvían de lo normal, se usa la prueba no paramétrica de Wilcoxon Rank. El ensayo se considera exitoso si la puntuación Z es significativamente menor en el tratamiento en relación con el control.

[0248] Los siguientes son los criterios de valoración de eficacia secundaria del estudio:

- Reducción de la frecuencia de fracturas

- Dominios de TSQM (Treatment Satisfaction Questionnaire for Medication): Un cuestionario psicométricamente robusto y validado de 14 elementos que consta de cuatro escalas validadas: la escala de eficacia, la escala de efectos secundarios, la conveniencia y la escala de satisfacción global.

Ensayo 4: Absorción gastrointestinal de calcio en poblaciones susceptibles al desarrollo de osteoporosis.

[0249] El objetivo del presente estudio fue evaluar la absorción gastrointestinal de calcio de la fuente de CCA en población susceptible al desarrollo de trastornos relacionados con la pérdida ósea. El ensayo es un estudio clínico que utilizó la técnica de isótopos de calcio de estabilidad dual realizada en mujeres posmenopáusicas.

[0250] Diez mujeres posmenopáusicas (datos demográficos en la Tabla 12), con no más de 5 años a partir de la menopausia se incluyeron en el estudio. Todos los sujetos, que mostraban un IMC de 18-29, estaban aparentemente sanos y no padecían ninguna enfermedad médica importante o trastorno óseo metabólico. Los criterios de exclusión incluyeron mujeres que, sobre la base de un consumo diario de alimentos, tienen una ingesta diaria estimada de calcio >1100 mg a través de la dieta combinada (tanto de suplementos como de alimentos), deficiencia de vitamina D exhibida por valores < 20 ng/pl en el suero, hipercalcemia, nefrolitiasis, enfermedad inflamatoria intestinal, mala absorción, diarrea crónica, uso de antibióticos en el último mes y mujeres que padecen enfermedades digestivas, hepáticas, renales o inflamatorias. Las mujeres que tomaron esteroides orales, anticonvulsivos, bifosfonatos, compuestos de estrógeno, calcitonina o teriparatida en los últimos 6 meses también fueron excluidas del estudio. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada mujer después de la aprobación del protocolo por el Comité Ético del Centro Médico Sourasky, Tel-Aviv, Israel.

Tabla 12: Datos demográficos de 10 mujeres que participaron en el estudio

[0251] El análisis de absorción fraccional reveló que los 10 sujetos mostraron una elevación significativa en la absorción de calcio cuando se les administró CCA en lugar de CCC.

[0252] El análisis de la prueba t emparejada de los resultados obtenidos de 9 mujeres que recibieron las cápsulas después del desayuno mostró una elevación significativa de la absorción fraccional de calcio para CCA. El incremento medio de la absorción relativa de calcio de CCA vs. CCC para cada mujer fue 2,1 veces (p <0,01; Figura 2).

[0253] En general, como dos grupos de tratamiento separados, hubo una elevación 1,9 en absorción fraccional de calcio cuando las mujeres se administraron con CCA en comparación con CCC (p<0,05; Figura 3).

[0254] Una de las diez mujeres que recibieron las cápsulas con el estómago vacío después de una noche presentó rápidamente una elevación de 4,6 fold en absorción fraccional de calcio (Figura 4).

Detalles experimentales

Preparación y etiquetado de cápsulas y solución de CaCh

[0255] CCA (Amorphical Ltd) se marcó intrínsecamente disolviendo una cantidad apropiada en HCl al 32% junto con 44CaCO³ (enriquecido al 96,1%, CMR, Moscú, Rusia), después de lo cual se volvió a precipitar en polvo de CCA que contenía 192 mg de calcio elemental (600 mg de polvo) marcado con 15 mg de 44Ca por tratamiento. En general, 3 lotes de 44CCA fueron preparados y enviados a espectrometría de ionización térmica de sector magnético (MAT 261; Finnigan, Bremen, Alemania) para análisis de relación molar 44:42, y a medición del contenido de calcio por absorción atómica (Servicios de Investigación Analítica, Universidad BenGurion, Beersheva, Israel). Se realizaron pruebas adicionales para evaluar el contenido amorfo de cada lote: difracción de rayos X (XRD; The Nanotechnology Institution, Ben-Gurion University), espectroscopía polarizada cuantitativa (QPS), microscopía óptica polarizada (POM) y sequedad. CCC (Zifroni Chemicals Suppliers Ltd., Rishon-Lezion, Israel) se etiquetó intrínsecamente homogeneizando una cantidad adecuada con 44CaCO³ (enriquecido al 96%, CMR, Moscú, Rusia) para alcanzar CCC en polvo que contenía 192 mg de calcio elemental (480 mg de polvo) etiquetados con 15 mg de 44Ca por tratamiento. Para igualar el volumen de las cápsulas de CCA, se añadió sacarosa (120 mg por tratamiento; FAGRON Gmbh & Co. KG, Rotterdam, Países Bajos) a cada cápsula. Se preparó un lote de 44CCC y se envió a espectrometría de ionización térmica de sector magnético (MAT 261; Finnigan, Bremen, Alemania) para análisis de relación molar 44:42.

[0256] Los procedimientos de preparación de la solución isotópica i.v. de 42CaCh i. v. se llevaron a cabo por Concept for Pharmacy Ltd. Kfar-Saba, Israel, bajo el flujo laminar para garantizar la esterilidad. La cantidad apropiada de 42CaCO³ (enriquecido al 96,3%, CMR, Moscú, Rusia) se disolvió en HCl al 37% y se mezcla con 0,45% de NaCl. El pH se ajustó con 10N NaOH a 5,5. La solución se hizo pasar a través de un filtro de esterilización de 0,22 p en un recipiente estéril. Se transfirieron dosis individuales (1,5 mg 42 Ca/dosis) a viales estériles para su uso posterior. Se enviaron alícuotas para pruebas de esterilidad y pirogenicidad (Aminolab, NesZiona, Israel) y para la medición del contenido de calcio por absorción atómica (Servicios de Investigación Analítica, Universidad Ben-Gurion, Beersheva, Israel) antes de su uso. Todas las soluciones intravenosas del estudio fueron estériles y libres de pirógenos.

Recolección y análisis de orina

[0257] Después de cada administración de cápsulas, se realizó una recolección de orina cronometrada de 24 horas para mediciones de calcio, sodio, potasio, urea, creatinina y análisis de isótopos estables. Los análisis de absorción de calcio se realizaron en el Baylor College of Medicine de Houston, Texas, EE.UU., siguiendo métodos previamente publicados (Yergey et al 1994). Se utilizó oxalato de amonio para precipitar isótopos de calcio en las muestras de orina (Yergey et al 1980). La cantidad de calcio extraído se usó luego para las mediciones de la relación de isótopos de calcio. Esta cantidad se determinó usando espectrometría de ionización térmica de sector magnético (MAT 261; Finnigan, Bremen, Alemania).

Cálculos farmacocinéticos de muestras humanas

[0258] Absorción fraccional (a²⁴h) de calcio de la dieta se calculó como se describe en (Yergey et al 1994). En resumen, la relación a²⁴h es una representación aritméticamente válida de la relación de las áreas bajo las curvas de desaparición del plasma para los dos marcadores.

Análisis estadístico

[0259] Se realizó el análisis estadístico de varianza tal como se describe en el ensayo 1.

[0260] Los resultados del ensayo anterior confirmaron que CCA estable tiene mayor absorción gastrointestinal de CCC ambos en modelos humanos, susceptibles al desarrollo de trastornos relacionados con los huesos. Tal absorción mejorada puede ser beneficiosa en los casos en que se requiera una mayor ingesta de calcio para mantener la densidad mineral ósea, ya que la absorción de calcio cristalino es limitada y el exceso de calcio puede provocar efectos adversos.

Ensayo 5: Prevención o retraso de la pérdida ósea en trastornos asociados a la pérdida de densidad mineral ósea.

[0261] El objetivo del presente ensayo fue evaluar la disponibilidad de calcio de la fuente de CCA comprendiendo varios estabilizadores (P-Ser, ácido cítrico o sacarosa), para el proceso de mineralización de los huesos evaluados por densidad femoral y vertebral mineral ósea (DMO) en el modelo de rata de osteoporosis (ovariectomía; OVX).

[0262] En el estudio, se ensayaron cuatro grupos de ratas (3 ovariectomizadas y 1 simulado). Los animales se trataron de acuerdo con la Tabla 13.

[0263] La Tabla 14 presenta el consumo medio de alimento y el peso corporal de las ratas durante el ensayo.

[0264] Se observó un aumento de peso significativo en los tres grupos de OVX en comparación con el simulado.

[0265] Esto es a pesar del hecho de que el consumo de alimentos fue menor entre todos los grupos de OVX en comparación con el grupo simulado.

Tabla 13: Asignación de ratas según el tratamiento

Tabla 14: Consumo medio de alimento y peso corporal total de las ratas al inicio y al final del experimento

[0266] Como se esperaba en este modelo, la exploración por micro-TC del fémur de los grupos OVX reveló una reducción significativa en la densidad mineral ósea trabecular (Tb.DMO) y otros parámetros morfométricos, es decir: volumen óseo/volumen tisular (BV/TV), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th); y una elevación significativa en la separación trabecular (Tb.Sp). Además, los 3 grupos OVX fueron significativamente diferentes de los animales simulados en todos los parámetros de orientación y topología de la microarquitectura femoral, es decir: factor de hueso trabecular (TBPf), índice de modelo estructural (SMI) y grado de anisotropía (DA) (Tabla 15).

[0267] Los resultados del escaneo micro-CT de vértebra de 4 L muestran que el grupo simulado fue significativamente más alto en comparación con todos los demás grupos OVX solo en los parámetros de DMO, BV/TV y Tb.N y significativamente más bajo en los parámetros de microarquitectura TBPf y SMI (Tabla 15).

[0268] En contraste con el DMO trabecular, no se observaron diferencias entre todos los grupos en el hueso cortical DMO (Ct. DMO) tanto del fémur como la vértebra (Tabla 15).

[0269] En todos los parámetros ensayados por el micro-CT, no se observó diferencia entre el CCA+P-Ser, CCA+CIT y los grupos CCA+SUC tanto en el fémur como la vértebra (Tabla 6), lo que indica que el compuesto que estabiliza el CCA por sí solo no tiene ningún efecto sobre la DMO ni sobre parámetros morfométricos o microarquitectónicos óseos adicionales.

Tabla 15: Topología morfométrica y microarquitectura y parámetros de orientación estudiados por micro-CT

Detalles experimentales

Animales

[0270] Cuarenta ratas hembra Sprague Dawley de 16-17 semanas (Harían Inc., Jerusalén, Israel) con un peso corporal medio de 247 ± 14 g se alojaron en grupo en 14 jaulas (2-3 ratas/jaula) y se aclimataron en condiciones ambientales controladas (21 ± 2°C y ciclo de luz oscura de 12 horas).

[0271] Durante 7 días de aclimatación, las ratas se alimentaron con dieta estándar de laboratorio que contiene 1% de calcio elemental (n° Chow 2018SC Rat, Harlan Inc. Jerusalén, Israel) y agua desionizada adlibitum.

[0272] Tras el periodo de aclimatación de 7 días, las ratas se anestesiaron usando inyección intraperitoneal (IP) de solución anestésica (0,1 ml/100 g) que contenía ketamina (Fort Dodge AH Ltd. Overland Park, Ee .UU) y xilazina (Eurovet AH Ltd. Bladel, Reino Unido).

[0273] Las ratas se asignaron al azar y se operaron de acuerdo con sus cuatro grupos asignados: Simulación (simulación-ovariectomizadas; alimentadas con dieta estándar de laboratorio que contenía 1% de calcio elemental de CCC) y otros tres grupos fueron ovariectomizados (OVX) usando un enfoque dorsal bilateral de acuerdo con a Lasota y Danowska-Klonowska (2004) Rocz Akad Med Bialymst 49 Suppl 1:129-131, y dividido en OVX-CCA+PS, OVX-CCA+CIT y OVX-CCA+SUC. Después de la operación, se proporcionó a las ratas un período de recuperación de 7 días en las mismas condiciones que el período de aclimatación, dieta estándar de laboratorio ad libitum y agua desionizada que contenía 1,5 ml/40o ml de dipirona (Vitamed Ltd, Binyamina, Israel) y 1 mg/kg Enrofloxacina (Buyer Ltd. Leverkusen, Alemania).

Tratamiento experimental

[0274] Al final del período de recuperación, las ratas se alojaron en grupo (2 ratas/jaula) de acuerdo con la asignación de grupo, bajo las mismas condiciones controladas de la habitación como se describe anteriormente. Los gránulos de comida asignados (descritos en la Tabla 13) y el agua desionizada se proporcionaron ad libitum durante todo el período de tratamiento (90 días). El consumo de alimentos y el peso corporal se registraron semanalmente (descrito en la Tabla 14). Para el análisis histomorfométrico dinámico, se inyectó IP a todas las ratas con colorante de fluorocromo Calceína (20 mg/kg de masa corporal; Sigma-Aldrich, Israel) los días 76 y 86. El día 90, las ratas se alojaron individualmente en jaulas metabólicas y se las privó de alimento y agua durante 18h. La orina se recogió de cada embudo metabólico y se almacenó a -80°C para análisis futuros del marcador bioquímico de resorción ósea al final del experimento (tiempo 90). Inmediatamente después del muestreo de orina, muestras de suero se extrajeron para la evaluación de la formación de marcador bioquímico de día 90. Todas las ratas se sacrificaron por CO². Fémures derechos y 4as vértebras lumbares se diseccionaron, se envolvieron con almohadillas empapadas con tampón de solución salina y se mantuvieron en -80°C para la medición de la micro-TC ósea. Las 5as vértebras lumbares se almacenaron en las mismas condiciones que los fémures derechos para ensayos mecánicos. Las tibias derechas se disecaron y se colocaron inmediatamente durante 24 h a 4°C en una solución de formaldehído al 3,7% (F1636, Sigma-Aldrich, Israel) para las mediciones histomorfométricas estructurales y dinámicas.

Cribado de tomografía micro-computarizada (^TC)

[0275] La microarquitectura trabecular y ósea cortical de fémures derechos y 4as vértebras lumbares fueron analizados en un escáner pCT (SkyScan 1174, Kartuizersweg Kontich, Bélgica). La calibración del escáner para la densidad mineral ósea (DMO) se realizó de acuerdo con las instrucciones de fabricación utilizando una varilla fantasma de rata designada con densidades de 0,25 y 0,75 g/cm3 (Skyscan, Kartuizersweg Kontich, Bélgica).

[0276] Antes del análisis de escaneo, fémures y 4as vértebras lumbares fueron retirados de -80°C y se colocaron en un plástico (de acuerdo con la orientación de fabricación). Se escaneó la región distal de cada fémur en busca de parámetros óseos trabeculares y corticales a una resolución isotrópica de 13,8 pm. La reconstrucción se llevó a cabo empleando un algoritmo modificado utilizando el software Skyscan Nrecon (ver. 1.6.4, Skyscan). El volumen de interés (VOI) se estableció en 0,8 mm por debajo de la placa de crecimiento y se extendió distalmente 1,5 mm. Los segmentos trabeculares y corticales dentro del VOI se extrajeron representando los contornos del elipsoide cada ~5 cortes utilizando el software de análisis de TC proporcionado con el escáner (ver. 1.11 Skyscan). DMO trabecular y cortical, volumen óseo (BV/TV,%), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th, pm), separación trabecular (Tb.Sp, pm) junto con los parámetros microarquitectónicos del factor de patrón óseo trabecular (TBPf) y el índice del modelo de estructura (SMI) se calcularon automáticamente mediante el software del analizador CT (ver. 1.11 Skyscan).

[0277] La 4a vértebra lumbar de cada rata se escaneó en una resolución isotrópica de 13,8 pm y VOI se estableció para cubrir 1,25 mm de sección transversal gruesa desde el centro del cuerpo vertebral para la evaluación de los parámetros trabeculares y corticales en el mismo procedimiento como se describió anteriormente para los fémures.

Ensayo 6: Aumento de la densidad mineral ósea en trastornos metabólicos relacionados con el hueso

[0278] Los inventores han realizado un estudio con el objetivo de evaluar los efectos del carbonato de calcio amorfo (CCA) sobre la densidad mineral ósea y la fracción ósea en trastornos óseos metabólicos, y específicamente osteoporosis como se presenta en el modelo de rata ovariectomizada (OVX) en donde el CCA se administra en combinación con una medicación estándar para la osteoporosis. En el presente ensayo, se probaron cinco grupos de ratas (4 OVX y 1 simulada). Después de la operación, todas las ratas se dejaron sin tratar (alimentadas con una dieta estándar de laboratorio) para desarrollar osteopenia durante un período de 2 meses. Al final del período de inducción, los animales fueron tratados con mezclas alimenticias especiales en forma de gránulos de dos fuentes de calcio diferentes: carbonato de calcio amorfo (CCA) o carbonato de calcio cristalino (CCC) (Tabla 16). Los gránulos de las dos mezclas contenían ~ 1% de calcio elemental según lo confirmado por un aparato de absorción atómica (Varian AA240, Palo Alto, CA, EE.UU) sin vitamina D añadida, excepto por las cantidades encontradas en los gránulos de alimentos originales (22 UI de vitamina D/g). Además, los animales fueron inyectados i.v. (3 veces/semana) con solución salina o de 2 pg/kg de alendronato (ALN) de acuerdo con su asignación de grupo, como se describe en la Tabla 16.

Tabla 16: Asignación de ratas según el tratamiento

[0279] La Tabla 17 presenta el consumo medio de alimento y el peso corporal de las ratas durante el ensayo. Se observó un aumento de peso significativo en todas las ratas o Vx en comparación con las simuladas. Esto a pesar de que el consumo de alimentos fue similar entre todos los grupos.

Tabla 17: Consumo medio de alimento y peso corporal total de las ratas

[0280] Una reconstrucción microarquitectura esquemática tridimensional micro-CT (pCT) de un fémur distal representante y la cuarta vértebra de cada grupo se presenta en la Figura 5. La reconstrucción de la metáfisis trabecular femoral, así como el cuerpo vertebral permite la diferenciación de tres grupos distintos: el primer grupo comprende la simulación con la región ósea trabecular más alta observada (Fig. 5A), el segundo grupo comprende el OVX-CCC con la región ósea trabecular más baja (Fig. 5B) en comparación con todos los demás grupos, un tercer grupo que comprende OVX-CCA y OVX-CCC+ALN con un modesto aumento en la región del hueso trabecular en comparación con el CCC (Figs. 5C y 5D) y un cuarto grupo que comprende OVX-CCA+ALN con un aumento aditivo en la región del hueso trabecular en comparación con el tercer grupo (Figura 5E).

[0281] Las diferencias entre los cuatro grupos observados también se reflejan en la densidad mineral ósea (DMO) trabecular y en el análisis morfométrico de metáfisis fémur y 4a vértebra lumbar presentada en la Fig. 6 y la Tabla 18.

[0282] Como se ilustra en la Fig. 6A-B, la DMO femoral trabecular del grupo de simulación fue significativamente mayor en comparación con los cuatro grupos OVX. Dentro de los grupos OVX, la DMO trabecular femoral y vertebral del grupo tratado con CCA (Figs. 6A-B) fue mayor en comparación con la DMO trabecular del CCC en un 22% y 39%, respectivamente. La DMO trabecular femoral y vertebral del grupo tratado con CCC+ALN fue mayor en comparación con la DMO trabecular de la CCC en un 49% y un 72%, respectivamente. La DMO trabecular femoral y vertebral del grupo tratado con CCA+ALN fue mayor en comparación con la DMO trabecular del CCC en un 75% y 105%, respectivamente, y la adición de CCA a ALN en lugar de CCC aumentó la DMO en 26% y 33% en el fémur y vértebra respectivamente, lo que representa un efecto positivo aditivo sobre los valores de DMO para CCA en combinación con ALN.

[0283] En contraste con el DMO trabecular, no se observaron diferencias entre todos los grupos en el hueso cortical DMO (Ct. DMO) tanto del fémur y la vértebra (Tabla 18).

Tabla 18: Análisis de microarquitectura morfométrica obtenida mediante uTC

[0284] El análisis morfométrico de la metáfisis distal del fémur y el 4° cuerpo vertebral mostró una disminución significativa en la fracción de hueso trabecular (BV/TV) en todos los grupos ovariectomizados en comparación con la simulación. Dentro de los fémures y vértebras de los grupos OVX, la c Ca presentó una fracción de hueso trabecular significativamente mayor en comparación con el grupo CCC en un 34% y 23%, respectivamente. También se obtuvieron resultados similares para el grupo CCC+ALN, que presentó un aumento del 37% en el fémur y del 46% en la vértebra en comparación con CCC. La CCA en combinación con ALN resultó en un aumento del 56% en el fémur y del 71% en la vértebra en comparación con CCC, y en un aumento del 19% y 25% en el fémur y vértebra, respectivamente, en comparación con grupo ALN CCC, que nuevamente representa un efecto aditivo sobre el aumento en los valores de BV/TV para CCA en combinación con ALN (Fig. 6C-D).

[0285] Una disminución significativa en el número trabecular (Tb.N) en todos los grupos ovariectomizados en comparación con la simulación también se observó tanto en el fémur y la vértebra. Dentro de los fémures y vértebras de los grupos OVX, CCA presentó un mayor número trabecular en comparación con el grupo CCC en una media del 17%. Se obtuvieron resultados superiores para el grupo CCC+ALN, que presentó un aumento de 50% en promedio, en la vértebra del fémur en comparación con CCC. CCA en combinación con ALN resultó en un aumento promedio del 62% en el fémur y vértebra en comparación con CCC, y en un aumento promedio del 13% en el fémur y vértebra, en comparación con el grupo ALN+CCC, lo que representa un efecto aditivo en aumento en los valores de Tb.N para CCA en combinación con ALN (Tabla 18).

[0286] Un aumento significativo en la separación trabecular (Tb.Sp) en todos los grupos ovariectomizados en comparación con la simulación se observó tanto en el fémur como la vértebra. Dentro de los fémures y vértebras de los grupos OVX, CCA presentó menor número de separación en comparación con el grupo CCC en un promedio de 11%. Se obtuvieron resultados inferiores para el grupo CCC+ALN, que presentó una disminución de 38% en promedio, en el fémur y vértebra en comparación con CCC. c Ca en combinación con ALN resultó en una disminución similar del 54% en el fémur y las vértebras en comparación con la CCC, y en una disminución promedio del 16% en el fémur y las vértebras, en comparación con el grupo ALN+CCC, lo que respalda aún más el efecto aditivo de CCA en combinación con ALN (Tabla 18).

[0287] El análisis del espesor trabecular (Tb.Th) no reveló cambios entre todos los grupos de estudio en el fémur, y solo cambios leves en la vértebra, manifestados por un aumento de solo el 12% en el espesor trabecular en el grupo de simulación en comparación con CCC, un aumento del 9% en el grupo CCA en comparación con el grupo CCC, solo un aumento del 2% después del tratamiento con ALN en comparación con CCC solo y un pequeño efecto aditivo de CCA en combinación con ALN reflejado por un aumento del 11% en los valores de Tb.Th, similar al grupo de simulación (Tabla 18).

[0288] El análisis de la microarquitectura de los parámetros de topología y orientación: factor de patrón de hueso trabecular (TBPf) e índice de modelo estructural (SMI) reveló que la intervención de la ovariectomía dio lugar a un aumento en los valores de TBPf y SMI tanto en fémur como en vértebra. En el fémur, el tratamiento con CCA resultó en una mayor disminución de los valores de TBPf y SMI que CCC+ALN, lo que tuvo solo un ligero efecto sobre estos parámetros en esta región. Sin embargo, en la vértebra, el tratamiento con CCA resultó en una disminución menor en los valores de TBPf y SMI en comparación con CCC+ALN. El tratamiento con CCA+ALN resultó en una disminución aditiva promedio del 12% en el fémur y del 37% en la vértebra para los valores de TBPf y SMI en comparación con el tratamiento con CCC (Tabla 18).

Detalles experimentales

Animales

[0289] Cincuenta y tres ratas hembra Sprague Dawley de 16 semanas de edad (Harlan Inc., Jerusalén, Israel) con una media corporal de peso de 246 ± 17 g se alojaron por grupos en 26 jaulas (2-3 ratas/jaula) y se aclimataron en condiciones ambientales controladas (21 ± 2°C y ciclo de luz oscura de 12 horas).

[0290] Durante 7 días de aclimatación, las ratas se alimentaron con dieta estándar de laboratorio que contiene 1% de calcio elemental (comida para ratas n° 2018SC, Harlan Inc. Jerusalén, Israel) y agua desionizada ad libitum.

[0291] Para la administración de las diferentes fuentes de calcio, los gránulos alimenticios especiales estaban preparados. Se molieron finamente gránulos de roedores con bajo contenido de calcio que contenían 0,02% de calcio (comida para ratas n° TD95027 Harlan Inc., Jerusalén, Israel) y se mezclaron por separado con dos fuentes de calcio diferentes. Una mezcla de CCC que contiene 1% de calcio elemental de carbonato de calcio cristalino (carbonato de calcio precipitado Socal®) y una mezcla de CCA que contiene 1% de calcio elemental de carbonato de calcio amorfo estable (que contiene 1% de fosfoserina y 2% de citrato; Amorphical Ltd., Beer- Sheva, Israel). Cada mezcla se peletizó por separado y se mantuvo en una bolsa sellada a temperatura ambiente.

[0292] Después del periodo de aclimatación de 7 días, las ratas se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal (IP) de solución anestésica (0,1 ml/100 g) que contenía ketamina (Fort Dodge AH Ltd. Overland Park, EE.UU)y xilazina (Eurovet AH Ltd. Bladel, Reino Unido).

[0293] Las ratas fueron asignadas al azar y operadas de acuerdo con sus cinco grupos asignados: Simulación (ovariectomizados con simulación; n=9), y otros cuatro grupos fueron ovariectomizados (OVX) por un enfoque dorsal bilateral según Lasota y Danowska-Klonowska (2004) Rocz Akad Med Bialymst 49 Suppl 1:129-131, y se dividieron en OVX-CCC (n=10), OVX-ACC (n=10), OVX-CCC+ALN (n=12) y OVX-CCA+ALN (n=12). Después de la operación, se proporcionó a las ratas un período de recuperación de 3 días durante el cual se trataron con agua desionizada que contenía 1,5 ml/400 ml de dipirona (Vitamed Ltd, Binyamina, Israel) y 1 mg/kg de enrofloxacina (Buyer Ltd. Leverkusen, Alemania). Los animales se dejaron sin tratar en las mismas condiciones que en el período de aclimatación, dieta estándar de laboratorio ad libitum durante 2 meses para desarrollar osteopenia.

[0294] Después de 2 meses, las ratas comenzaron el tratamiento en función de su asignación como se describe en la Tabla 16 para un período de 4 meses. Los gránulos suplementarios asignados y el agua desionizada se proporcionaron ad libitum durante todo el período de tratamiento. El consumo de alimentos y el peso corporal se registraron semanalmente (Tabla 17). Al final del período de tratamiento, todas las ratas se sacrificaron por CO². Fémures derechos y 4as vértebras lumbares fueron disecadas, envueltas con almohadillas empapadas con tampón de solución salina y se mantienen en -80°C para la medición de exploración ósea de micro-CT.

Tomografía micro-computarizada (^TC)

[0295] La microarquitectura trabecular y ósea cortical de fémures derechos y 4as vértebras lumbares fueron analizados en un escáner pCT (SkyScan 1174, Kartuizersweg Kontich, Bélgica). La calibración del escáner para la densidad mineral ósea (DMO) se realizó de acuerdo con las instrucciones de fabricación utilizando una varilla fantasma de rata designada con densidades de 0,25 y 0,75 g/cm3 (Skyscan, Kartuizersweg Kontich, Bélgica).

[0296] Antes del análisis de escaneo, fémures y 4as vértebras lumbares fueron retirados de -80°C y se colocaron en un plástico (de acuerdo con las directrices de fabricación). Se escaneó la región distal de cada fémur en busca de parámetros óseos trabeculares y corticales a una resolución isotrópica de 13,8 |jm. La reconstrucción se llevó a cabo empleando un algoritmo modificado utilizando el software Skyscan Nrecon (ver. 1.6.4, Skyscan). El volumen de interés (VOl) se estableció en 0,8 mm por debajo de la placa de crecimiento y se extendió distalmente 1,5 mm. Los segmentos trabeculares y corticales dentro del VOI se extrajeron representando los contornos del elipsoide cada ~ 5 cortes utilizando el software de análisis CTan proporcionado con el escáner (ver. 1.11 Skyscan).

[0297] DMOtrabecular y cortical, volumen óseo (BV/TV,%), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th, jm), separación trabecular (Tb.Sp, jm ) junto con los parámetros microarquitectónicos del factor de patrón óseo trabecular (TBPf) y el índice del modelo de estructura (SMI) se calcularon automáticamente mediante el software del analizador de TC (ver. 1.11 Skyscan).

[0298] La 4a vértebra lumbar de cada rata se escaneó en un 13,8 jm resolución isotrópica y VOI se estableció para cubrir 1,25 mm de sección transversal gruesa desde el centro del cuerpo vertebral para la evaluación de los parámetros trabeculares y corticales en el mismo procedimiento como se describió anteriormente para los fémures.

[0299] Los resultados del ensayo anterior confirmaron que CCA estable tiene mayor efecto sobre la densidad mineral ósea y otros parámetros óseos que la CCC. Además, la administración de c Ca en combinación con medicación estándar para el tratamiento de la pérdida ósea resultó en un efecto aditivo en comparación con CCC, permitiendo la disminución de la dosis de bisfosfonatos y confirmando que CCA altamente biodisponible puede usarse para aumentar la densidad mineral ósea y tratar trastornos óseos metabólicos, enfermedades y afecciones solas o junto con los medicamentos conservadores.

Ensayo 7: Prevención o retraso de la aparición de trastornos metabólicos óseos

[0300] Los inventores han realizado un estudio con el objetivo de evaluar el efecto del calcio del carbonato cálcico amorfo estable (CCA) en comparación con el carbonato cálcico cristalino (CCC), sobre la prevención de trastornos del metabolismo óseo y específicamente osteoporosis como se presenta en el modelo de rata ovariectomizada (OVX).

[0301] En el estudio, se ensayaron cinco grupos de ratas (4 ovariectomizadas y 1 simulado). Los animales OVX fueron alimentados con mezclas especiales de alimentos en forma de gránulos de cuatro fuentes diferentes de calcio: carbonato de calcio cristalino comercial que sirvió como control (mezcla A), CCA natural (Gastrolith en polvo) (mezcla B), CCA sintético (que comprende trazas de fosfoserina) (mezcla C) y citrato de calcio cristalino comercial (mezcla D). El grupo simulado se administró con la misma comida que el control. Los gránulos de las cuatro mezclas contenían ~ 0,5% de calcio elemental según lo confirmado por el aparato de absorción atómica (Varian AA240, Palo Alto, CA, EE.UU) Y se describe en la Tabla 19 sin vitamina D añadida, excepto por las cantidades encontradas en los gránulos de alimentos originales (22 UI de vitamina D/g).

Tabla 19: calcio Elemental contenido (% en peso) de la fuente de calcio y gránulos especializados según se midió por absorción atómica

[0302] Se obtuvo el origen del calcio de: cristalino comercial CaCO³ (carbonato), polvo de gastrolito de los cangrejos de río australiano Cherax quadricarinatus (gastrolito), carbonato de calcio amorfo estable sintético (CCA) y citrato de calcio a partir de un suplemento comercial (citrato). Los valores se representan como media.

[0303] La Tabla 20 presenta el consumo medio de alimento y el peso corporal de las ratas durante el ensayo.

[0304] Un aumento de peso significativo se observó en todas las ratas OVX en comparación con el tratamiento simulado. Esto a pesar de que el consumo de alimentos fue similar entre todos los grupos.

Tabla 20: Consumo medio de alimento y peso corporal total de las ratas al inicio y al final del experimento

[0305] Una reconstrucción tridimensional de microarquitectura esquemática de pCT de un fémur distal representativo y cuarta vértebra de cada grupo se presenta en la Figura 7. La reconstrucción de la metáfisis trabecular femoral, así como el cuerpo vertebral permite la diferenciación de tres grupos distintos: el primer grupo comprende la simulación con la región ósea trabecular más alta observada (Fig. 7A), el segundo grupo comprende el Control OVX y el Citrato con la región ósea trabecular más baja (Figs.7B y 7E) en comparación con la simulación, y un tercer grupo que comprende OVX Gast y CCA con una modesta disminución en la región del hueso trabecular en comparación con la simulación (Figs. 7C y 7D).

[0306] Las diferencias entre los tres grupos observados también se reflejan en la densidad mineral ósea trabecular (DMO) y en el análisis morfométrico del fémur metáfisis y 4a vértebra lumbar presentados en la Fig. 8, Fig. 9 y en la Tabla 21.

[0307] Como se ilustra en la Fig. 8A, el DMO trabecular femoral del grupo de simulación fue significativamente mayor en comparación con los cuatro grupos OVX: el Control, Gast, CCA y Citrato con diferencias significativas de 64%, 45%, 50% y 63%, respectivamente. También se obtuvieron valores comparables en DMO vertebral trabecular, presentada en la Fig. 8B, del grupo de simulación en comparación con los cuatro grupos OVX. Dentro de los grupos OVX, DMO trabecular femoral y vertebral de Gast y CCA (Figs. 8A y 8B) fueron significativamente mayores en comparación con DMO trabecular del Control en un 56% y 38% en el fémur y 38% y 32% en la vértebra, respectivamente. No se observaron diferencias significativas en DMO trabecular femoral y vertebral del Citrato en comparación con el Control. La comparación entre los grupos Gast y CCA reveló diferencias estadísticas del 13% a favor de Gast sobre el CCA en DMO femoral trabecular y ninguna diferencia en DMO vertebral trabecular.

[0308] En contraste con DMO trabecular, no se observaron diferencias significativas entre todos los grupos en DMO cortical del hueso (Ct. DMO) tanto del fémur como la vértebra (Tabla 21).

Tabla 21: Análisis morfométrico y densidad mineral ósea cortical (Ct.DMO) obtenida por |iTC

[0309] El análisis morfométrico de la metáfisis del fémur distal y el 4° cuerpo vertebral (Fig. 9 y Tabla 21) mostró una disminución significativa en la fracción de hueso trabecular (BV/TV) y su número (Tb.N) en todos los grupos ovariectomizados en comparación con la simulación. El grupo de control fue significativamente menor en un 65% en promedio en el fémur distal (Fig. 9A y Tabla 21A) y en un 60% en la vértebra (Fig. 3B y Tabla 3B) en comparación con la simulación. Mientras que el promedio de los grupos OVX Gast y CCA en el fémur distal fue más bajo en solo un 41% y 49% en comparación con la simulación, y más bajo en un 40% y 41% en la vértebra, respectivamente. Dentro de los fémures de los grupos OVX, Gast y CCA presentaron una fracción de hueso trabecular y un número trabecular significativamente mayores en comparación con el Control en un promedio de 65% y 49%, respectivamente. También se obtuvieron resultados similares en la vértebra lumbar de los grupos Gast y CCA con un promedio más alto de 48% y 47% en comparación con Control, respectivamente. No se observaron diferencias significativas en la fracción de hueso trabecular y su número entre el Citrato y el Control.

[0310] La comparación entre los fémures de los grupos Gast y CCA reveló una diferencia significativa en la fracción ósea, el grosor trabecular y la separación trabecular. De acuerdo con los resultados presentados en la Fig. 9A y la Tabla 21A, los fémures del grupo Gast exhibieron una fracción ósea significativamente mayor del 16%, un grosor trabecular mayor del 9% y una separación trabecular menor del 24% en comparación con el c Ca . También se observó un espesor trabecular significativamente mayor del 12% en la vértebra de Gast en comparación con CCA pero no se observaron diferencias significativas en el resto de los parámetros morfométricos entre Gast y CCA (Fig. 9b y Tabla 21B).

[0311] Las diferencias entre los grupos en la estructura de microarquitectura se enfatizan más en el análisis histomorfométrico estructural no descalcificado de la tibia proximal, presentado en la Tabla 22A. De acuerdo con los resultados presentados en la Tabla 22A, todos los grupos de OVX, a saber, el Control, Gast, CCA y Citrato presentaron valores de fracción de hueso trabecular y trabéculas condensadas significativamente más bajas en comparación con la simulación (con un promedio de 55%, 19%, 32% y 55%, respectivamente). Además, la separación trabecular fue significativamente mayor en todos los grupos de OVX en comparación con la simulación (Tabla 22A) en un 130% para el Control, 30% para Gast, 60% para CCA y 148% para Citrato. Dentro de los grupos OVX, Gast y CCA presentaron una fracción de hueso trabecular y un número trabecular significativamente mayores con un promedio de 80% y 50%, y una separación trabecular menor de 44% y 31%, en comparación con el Control, respectivamente. El grupo de citrato presentó un espesor trabecular significativo mayor del 13% en comparación con el Control. La comparación de los parámetros histomorfométricos estructurales entre los grupos Gast y CCA reveló una diferencia significativa en la fracción ósea, el número trabecular y la separación trabecular. Según la Tabla 22A, el grupo Gast presentó mayor fracción ósea y número trabecular del 19% y 21%, en comparación con CCA y un valor de separación trabecular menor del 20% en comparación con CCA, respectivamente.

Tabla 22: Análisis histomorfométrico de secciones no descalcificadas de las tibias proximales

[0312] Los resultados del análisis de histomorfometría dinámica se presentan en la Tabla 22B. Según los resultados, no se observaron diferencias significativas en la tasa de formación de hueso a la superficie del hueso (BFR/BS) y la superficie de mineralización a la superficie del hueso (EM/BS) de los grupos de control de OVX y citrato en comparación con la simulación. Por otro lado, la tasa de formación ósea de o Vx Gast y CCA fue 53% y 50% mayor, en comparación con la simulación, y EM/BS de OVX Gast y CCA presentaron elevaciones similares de 44% y 38%, respectivamente en comparación con la simulación. Dentro de los grupos OVX, Gast y CCA presentaron una tasa de formación ósea significativamente más alta de 38% y 35%, y una MS/BS significativamente más alta de 40% y 33%, en comparación con el control, respectivamente. El grupo de citrato OVX no presentó diferencias significativas con respecto al control, pero una tasa de formación ósea estadísticamente más baja del 28% de Gast y del 26% de CCA. El Ms /BS del grupo de citrato de OVX fue similar al del grupo de control y significativamente menor en un 29% y 26% de los grupos de Gast y CCA, respectivamente.

[0313] La tasa de aposición mineral (MAR) no reveló diferencias significativas en todos los grupos OVX en comparación con la simulación, y no hay diferencias de la OVX Gast, CCA y citrato en comparación con el control. La evaluación del kit de EIA del recambio óseo mediante el marcador de formación de osteocalcina sérica (OC) y el marcador de resorción de desoxipiridinolina en orina (DPD) de cada grupo al final del experimento (día 90) se presentan en la Tabla 23. Ambos marcadores se evaluaron para la línea de base antes de la aleatorización (en el día 0, no se muestran los datos).

Tabla 23: Evaluación del marcador de formación de osteocalcina (OC) sérica y marcador de resorción de desoxipiridinolina (DPD) en orina para cada grupo en el día 90

[0314] En el día 90, se observaron niveles de DPD significativamente más altos en todos los grupos de OVX en comparación con el grupo de simulación, excepto para el grupo CCA que presentó una diferencia no significativa de la simulación, y un nivel de DPD significativamente más bajo de los grupos de control (39%) y citrato (48%). El grupo Gast presentó menor nivel del Control (19%) y mayor nivel de DPD del CCA (32%). Los niveles de DPD de Gast no fueron estadísticamente más bajos que los del Citrato pero presentaron una diferencia del 31%. En el marcador OC sérico, no se observaron cambios significativos entre ninguno de los grupos.

[0315] Los resultados de los análisis de resistencia mecánica de la 5a vértebra lumbar se presentan en la Figura 10. De acuerdo con los resultados, las propiedades de resistencia mecánica del control OVX, Gast y Citrato fueron significativamente más bajas en comparación con la simulación en un promedio de 41%, 40% y 40%, respectivamente. Considerando que, los valores de resistencia mecánica del grupo CCA fueron significativamente más bajos en un promedio del 17% en comparación con la simulación. Estas diferencias fueron estadísticamente significativas en la mayoría de los parámetros evaluados, excepto para el parámetro de fuerza última que no fue estadísticamente diferente (Figura 10D). Dentro de los grupos OVX, el grupo CCA presentó valores significativamente más altos en comparación con el Control en cada parámetro probado: fuerza máxima (Figura 10A), energía a fuerza máxima (Figura 10B), tenacidad (Figura 10C) y energía para ceder (Figura 10D) en un promedio de 37%, 49%, 29% y 65%, respectivamente. Estas diferencias también se reflejan en los valores más altos de OVX CCA en comparación con los grupos Gast y Citrato con un promedio de 42% y 37%, respectivamente. Los grupos OVX Gast y Citrato no presentaron ninguna diferencia estadística con el Control o entre ellos en ninguno de los parámetros de resistencia mecánica probados.

[0316] El análisis de micro-CT de la 4a vértebra lumbar mostró que el factor de patrón de hueso trabecular (TBPf) es mucho menor (91% de media) en el grupo de tratamiento simulado que en el control OVX, OVX-gastrolito y grupos de citrato OVX. Sin embargo, el TBPf del grupo simulado fue más bajo (61%) que lo que se midió para el grupo OVX-CCA. Dentro de los grupos OVX, el TBPf de los grupos OVX-CCA fue significativamente menor que el de los grupos de control OVX, OVX-citrato y OVX-gastrolito en un promedio del 33% (Figura 10E; p<0,001). La evaluación del índice de modelo estructural (SMI) apunta a la misma tendencia, siendo significativamente menor en el grupo simulado, en comparación con los grupos de control OVX, OVX-gastrolito y OVX-citrato (43% en promedio). Sin embargo, el SMI del grupo simulado fue más bajo (30%) que lo que se midió para el grupo OVX-CCA. Aquí, los valores obtenidos con el grupo OVX-CCA fueron significativamente más bajos que los medidos para los grupos de control OVX y citrato OVX (14% en promedio). Al mismo tiempo, los valores de SMI obtenidos con el grupo OVX-CCA se redujeron en relación con el índice medido con el grupo OVX-gastrolito (Figura 10F; p<0,001). El último parámetro microarquitectónico medido, a saber, el grado de anisotropía (DA), fue menor en el grupo simulado, en comparación con los grupos de control OVX, OVX-gastrolito y OVX-citrato, en un 22% en promedio. No se observaron diferencias significativas en DA entre los grupos simulados y OVX-CCA, o entre todos los grupos OVX, aunque OVX-CCA mostró valores más bajos que los medidos con los otros grupos OVX (Figura 10G; p<0,001).

Detalles experimentales

Animales

[0317] Ciento una ratas hembra Sprague Dawley de 16-17 semanas de edad (Harlan Inc., Jerusalén, Israel) con un peso corporal medio de 250 ± 16 g se alojan por grupos en 33 jaulas (~ 3 ratas/jaula) y se aclimatan en condiciones ambientales controladas (21 ± 2°C y ciclo de luz oscura de 12 horas). Durante 7 días de aclimatación, las ratas fueron alimentadas con una dieta de laboratorio estándar que contenía 1% de calcio elemental (comida de ratas n° 2018SC, Harlan Inc. Jerusalem, Israel) y agua desionizada ad-libitum. Después del período de aclimatación de 7 días, las ratas se alojaron individualmente en jaulas metabólicas y se privaron de alimento y agua durante 18 h. La orina se recogió de cada embudo metabólico y se almacenó a -80°C para el análisis futuro del marcador bioquímico de resorción ósea al inicio del estudio (tiempo 0).

[0318] Para la administración de las diferentes fuentes de calcio, se prepararon gránulos de comida especiales. Se molieron finamente gránulos de roedores con bajo contenido de calcio que contenían 0,02% de calcio (comida para ratas n° TD95027 Harlan Inc., Jerusalén, Israel) y se mezclaron por separado con cuatro fuentes de calcio diferentes. Una mezcla de control que contiene carbonato de calcio de un suplemento comercial (mezcla A), mezcla de Gast que contiene gastrolito en polvo recolectado del cangrejo de río australiano Cherax quadricarinatus (mezcla B) (granja de Ben, Beer Tzofar, Israel), mezcla de CCA que contiene carbonato de calcio amorfo estable y P-serina (PSer) (mezcla C) (Lote n° ETS001, Amorphical Ltd., Beer-sheva, Israel) y la mezcla de citrato que contiene citrato de calcio de un suplemento comercial (mezcla D). Cada mezcla se peletizó por separado y se mantuvo en una bolsa sellada a temperatura ambiente.

[0319] Inmediatamente después del muestreo de la orina, las ratas se anestesiaron usando inyección intraperitoneal (IP) de solución anestésica (0,1 ml/100 g) que contenía ketamina (Fort Dodge AH Ltd. Overland Park, EE.UU) y xilazina (Eurovet AH Ltd. Bladel, Reino Unido). Se tomaron muestras de sangre de la cola de rata (aproximadamente 180 pl) y se centrifugó durante 10 minutos a 3000 g usando una centrífuga de mesa (Hettich Zentrifugen, Bach, Suiza) para la extracción de suero. Las muestras de suero se almacenaron a -80°C para el análisis futuro del marcador bioquímico de formación de hueso al inicio del estudio (Tiempo 0).

[0320] Las ratas se asignaron al azar y se operaron de acuerdo con sus cinco grupos asignados: Simulación (simuladoovariectomizado) alimentado con la mezcla A, y otros cuatro grupos fueron ovariectomizados (OVX) usando un abordaje dorsal bilateral de acuerdo con Lasota y Danowska-Klonowska (2004) Rocz Akad Med Bialymst 49 Suppl 1:129-131, y dividido en OVX Control (alimentado con mezcla A), OVX Gast (alimentado con mezcla B), OVX CCA (alimentado con mezcla C) y OVX Citrato (alimentado con mezcla D). Después de la operación, se proporcionó a las ratas un período de recuperación de 7 días en las mismas condiciones que el período de aclimatación, dieta estándar de laboratorio ad libitum y agua desionizada que contenía 1,5 ml/400 ml de dipirona (Vitamed Ltd, Binyamina, Israel) y 1 mg/kg Enrofloxacina (Buyer Ltd. Leverkusen, Alemania).

Tratamiento experimental

[0321] Al final del período de recuperación, las ratas fueron alojadas en grupo en 47 jaulas (2 ratas/jaula) de acuerdo con el grupo de asignación, en las mismas condiciones controladas de habitación como se describe anteriormente. Los gránulos suplementarios asignados y el agua desionizada se proporcionaron ad-libitum durante todo el período de tratamiento (90 días). El consumo de alimentos y el peso corporal se registraron semanalmente (Tabla 2). Para el análisis histomorfométrico dinámico, se inyectó IP a todas las ratas con colorante de fluorocromo Calceína (20 mg/kg de masa corporal; Sigma-Aldrich, Israel) los días 76 y 86. El día 90, las ratas se alojaron individualmente en jaulas metabólicas y se las privó de alimento y agua durante 18h. La orina se recogió de cada embudo metabólico y se almacenó a -80°C para análisis futuros del marcador bioquímico de resorción ósea al final del experimento (tiempo 90). Inmediatamente después del muestreo de orina, muestras de suero se extrajeron para la evaluación de la formación de marcador bioquímico de día 90 y se almacenan de la misma manera como se describe en el día 0. Todas las ratas se sacrificaron por fémures derechos CO² y 4as vértebras lumbares se disecaron, se envolvieron con almohadillas empapadas con tampón salino y se mantuvieron a -80°C para la medición de la micro-TC ósea. Las 5as vértebras lumbares se almacenaron en las mismas condiciones que los fémures derechos para ensayos mecánicos. Las tibias derechas se disecaron y se colocaron inmediatamente durante 24 h a 4°C en una solución de formaldehído al 3,7% (F1636, Sigma-Aldrich, Israel) para las mediciones histomorfométricas estructurales y dinámicas.

Escaneo de micro-tomografía computarizada (yCT)

[0322] Se analizó la microarquitectura de hueso trabecular y cortical de fémures derechos y 4as vértebras lumbares usando un escáner de ^C T (Skyscan 1174, Kartuizersweg Kontich, Bélgica). La calibración del escáner para la densidad mineral ósea (DMO) se realizó de acuerdo con las instrucciones de fabricación utilizando una varilla fantasma de rata designada con densidades de 0,25 y 0,75 g/cm3 (Skyscan, Kartuizersweg Kontich, Bélgica).

[0323] Antes del análisis de escaneo, fémures y 4as vértebras lumbares fueron retirados de -80°C, se transfirieron a nuevas almohadillas de gasa empapadas con 70% de etanol y se colocaron en un vial de plástico lleno de 70% de etanol (de acuerdo con las directrices de fabricación). Se escaneó la región distal de cada fémur en busca de parámetros óseos trabeculares y corticales a una resolución isotrópica de 13,8 pm. La reconstrucción se llevó a cabo empleando un algoritmo modificado utilizando el software Skyscan Nrecon (ver. 1.6.4, Skyscan). El volumen de interés (VOI) se fijó en 0,5 mm por debajo de la placa de crecimiento y se extendió distalmente durante 1,5 mm. Los segmentos trabeculares y corticales dentro del v O i se extrajeron representando los contornos del elipsoide cada ~ 5 cortes utilizando el software de análisis CTan proporcionado con el escáner (ver. 1.11 Skyscan).

[0324] Se calculó DMO trabecular y cortical, el volumen óseo (BV/TV,%), el número trabecular (Tb.N), el grosor trabecular (Tb.Th, pm) y la separación trabecular (Tb.Sp, pm). automáticamente por el software del analizador CTan (ver. 1.11 Skyscan).

[0325] La 4a vértebra lumbar de cada rata se escaneó en un 13,8 |jm resolución isotrópica y VOI se estableció para cubrir la sección de 2,0 mm de espesor transversal del centro del cuerpo vertebral. Se evaluaron los parámetros óseos trabeculares y corticales en el cuerpo vertebral, configurados para cubrir un VOI de una sección transversal de 2 mm de espesor, comenzando a 0,14 mm por debajo de la placa de crecimiento craneal. Además de los mismos parámetros de hueso trabecular y cortical que se estudiaron para el fémur distal, los parámetros de topología: es decir, factor de patrón de hueso trabecular (TBPf) e índice de modelo estructural (SMI); y el parámetro de orientación trabecular, el grado de anisotropía (DA) también se midieron en el cuerpo vertebral.

Histomorfometría

[0326] Se extrajeron las tibias derechas de la solución de formaldehído y se deshidrataron a través de un gradiente de etanol, se aclararon con xileno (24250521, Bio-Lab Ltd. Haifa, Israel) y se infiltraron con 80% de metacrilato de metilo (MMA; M5599, Sigma Aldrich, Rehovot, Israel) 20% de ftalato de dibutilo (DBP; 61-5062, Merck Ltd, Hohenbrunn, Alemania) durante 3 días a 4°C. Después, las muestras se transfirieron a una solución de MMA DBP peróxido de benozoilo (617008, Merck Ltd, Hohenbrunn, Alemania) durante otros 6 días de infiltración a 4°C. Después del procedimiento de infiltración, las muestras se incrustaron en MMA DBP peróxido de benozoilo al 2,5% bajo un gradiente de temperatura (de 38°C a 50°C durante un período de 4 días). Se cortaron secciones medio sagitales (4 jm ) sin descalcificar de cada muestra utilizando un micrótomo Lecia RM 2025 (Lecia Instruments Ltd, Petach Tikva, Israel) conectado a cuchillos de carburo de tungsteno (hoja desechable; TC65, Rhenium Inc. Bet-Nekufa, Israel). La mayoría de las secciones se tiñeron con tetracromo de McNeal para histomorfometría estructural. Las secciones restantes se dejaron sin teñir para histomorfometría dinámica.

[0327] La medición de la histomorfometría estructural y dinámica de las metáfisis de la tibia proximal se obtuvo usando un sistema de análisis semiautomático (Bioquant OSTEO, ver. 7,20.10, BIOQUANT Image Analysis Corporation Nashville, EE.UU) que está conectado a un microscopio (Nikon Optiphot 2, Kingston, Inglaterra) equipada con fuente de luz fluorescente.

[0328] Parámetros histomorfométricos tales como volumen óseo (BV/TV,%), número trabecular (Tb.N), espesor trabecular (Tb.Th, jm ), la separación trabecular (Tb.Sp, jm ), la tasa de formación ósea/muestra de hueso (BFR/BS), la superficie mineralizante/superficie ósea (MS/BS) y la tasa de aposición mineral (MAR) se calcularon utilizando el análisis de software de Imagen BIOQUANT (Bioquant OSTEO, ver. 7.20.10).

Evaluación de marcadores bioquímicos de recambio óseo

[0329] La concentración de osteocalcina de suero (OC) se determinó mediante un kit de EIA (n° BT-490, Biomedical Technologies Inc. Stoughtone, EE.UU) después de una dilución 1:10 de suero.

[0330] La concentración desoxipiridinolina urinaria (DPD) se determinó mediante el kit de EIA comercial (n° 8007, Qudiel Inc. San Diego, EE.UU) después de una dilución 1:50. Los niveles de DPD se normalizaron a los niveles de creatinina (n° 8009, Qudiel Inc. San Diego, EE.UU).

Resistencia mecánica de la 5a vértebra lumbar

[0331] Las propiedades mecánicas (fuerza de Ultimate, Energía a última fuerza, dureza y energía de rendimiento) se obtuvieron a partir de los ensayos de compresión de 5° cuerpo lumbar vertebral (L5). El cálculo de las propiedades del material se realizó midiendo la altura del cuerpo vertebral y el promedio de los diámetros caudal y craneal utilizando un calibre. El área de la sección transversal (CSA) y el volumen óseo (BV) se obtuvieron por exploración jC T que cubría todo el hueso incluyendo la carcasa tanto trabecular como cortical.

Análisis estadístico

[0332] Los resultados se expresan en el presente documento como media ± SEM. Las pruebas de comparación post hoc ANOVA de una vía y Fisher-LSD se realizaron utilizando el software STATISTICA 6.1 (StaSoft, Tulsa, OK). Se consideró significativo un valor de p<0,05.

[0333] Los resultados del ensayo anterior confirmado que CCA estable tiene mayor efecto sobre la densidad mineral ósea y otros parámetros óseos que CCC en grupo de estudio susceptible al desarrollo de la osteoporosis. La biodisponibilidad superior de CCA permite su uso para prevenir o retrasar la aparición de trastornos, enfermedades y afecciones metabólicas óseas.

[0334] Aunque las realizaciones de la invención se han descrito a modo de ilustración, se entenderá que la invención puede llevarse a cabo con muchas variaciones, modificaciones y adaptaciones, sin exceder el alcance de las reivindicaciones.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende carbonato cálcico amorfo estable (CCA) que comprende al menos un estabilizador para su uso en el tratamiento de la mala absorción de calcio en un sujeto que padece hipoparatiroidismo, en donde dicho estabilizador se selecciona de ácidos carboxílicos, aminoácidos fosforilados, péptidos fosforilados, quitina, fosfórico o ésteres sulfúricos de ácidos hidroxicarboxílicos, compuestos orgánicos portadores de hidroxilo seleccionados de mono-, di-, tri-, oligo- y polisacáridos, y polioles seleccionados entre alcoholes y sacáridos y en los que el 100% (en mg) de la ingesta diaria total inicial de calcio elemental se reemplaza por el 50% del calcio elemental de CCA (en mg, calculado sobre la ingesta diaria total inicial).

2. Composición para uso según la reivindicación 1, en donde el hipoparatiroidismo está asociado con una disminución de la concentración de calcio plasmático por debajo de 8,8 mg/dl.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho estabilizador comprende al menos un componente seleccionado entre ésteres fosfóricos de ácidos hidroxicarboxílicos y los compuestos orgánicos que llevan hidroxilo.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho estabilizador comprende al menos un componente seleccionado de aminoácido fosforilado y polioles.

5. La composición para uso según la reivindicación 4, en donde los aminoácidos fosforilados están presentes en oligopéptidos o polipéptidos.

6. La composición para su uso según la reivindicación 4 o 5, en donde los aminoácidos fosforilados se seleccionan entre fosfoserina y fosfotreonina.

7. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho estabilizador comprende los compuestos orgánicos que contienen hidroxilo y al menos un hidróxido alcalino.

8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el ácido carboxílico se selecciona entre ácido cítrico, ácido tartárico y ácido málico.

9. La composición para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho estabilizador comprende al menos un compuesto seleccionado entre aminoácidos fosforilados, péptidos fosforilados, quitina junto con al menos un péptido y el poliol junto con hidróxido alcalino.

10. Composición para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho CCA se obtiene a partir de gastrolito de crustáceos aislado.

11. La composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dicha composición es una composición farmacéutica.

12. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 11, que comprende además vehículos, adyuvantes, diluyentes o excipientes.