ES2833230T3 - Composiciones que comprenden AVV que expresan construcciones y usos de doble anticuerpo del mismo - Google Patents

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Abstract

Un virus adenoasociado recombinante (AAV) con una cápside AAV que comprende un ácido nucleico heterólogo empaquetado que expresa dos anticuerpos funcionales en una célula, donde el AAV recombinante comprende: una repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV; un primer casete de expresión que codifica al menos un primer marco abierto de lectura (ORF) para una primera inmunoglobulina bajo el control de de secuencias reguladoras de control que dirigen su expresión; un segundo casete de expresión que comprende un segundo ORF, un conector y un tercer ORF bajo el control de secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión del mismo, donde el segundo y el tercer ORF se codifican para un segundo y tercer constructo de inmunoglobulina; y una ITR 3' de AAV, conforme a lo cual se codifican una cadena ligera de inmunoglobulina, una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones que comprenden AVV que expresan construcciones y usos de doble anticuerpo del mismo
INCORPORACIÓN POR REFERENCIA DE MATERIAL ENTREGADO EN FORMATO ELECTRÓNICO
[0001] El solicitante incorpora a la presente, por referencia, el Listado de secuencias archivado en formato electrónico. Este archivo está etiquetado como "14-7032PCT_Seq Listing_ST25.txt".
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Se ha probado la eficacia terapéutica de los anticuerpos monoclonales con respecto al cáncer y otras enfermedades. La terapia con anticuerpos actual suele implicar la administración repetida y regímenes de tratamiento a largo plazo, asociados con diversas desventajas, como niveles séricos incongruentes y una duración limitada de la eficacia por administración que hace necesaria la readministración, conllevando un alto coste. El uso de anticuerpos como herramientas de diagnóstico y modalidades terapéuticas ha ido en aumento en los últimos años. El primer anticuerpo monoclonal aprobado por la FDA para el tratamiento del cáncer, Rituxan® (Rituximab) se aprobó en 1997 para el tratamiento de pacientes con linfoma no Hodgkin y al poco, en 1995, se aprobó e1Herceptin®, un anticuerpo monoclonal humanizado para el tratamiento de pacientes con cáncer de pecho metastásico. Hay numerosas terapias prometedoras, basadas en anticuerpos, en diversas fases de desarrollo clínico. Dado el éxito de las distintas terapias con anticuerpos monoclonales, se ha sugerido que la siguiente generación de biofármacos estará formada por cócteles, esto es, mezclas, de anticuerpos.
[0003] Una limitación a la extensa aplicación clínica de la tecnología de anticuerpos es que se suelen necesitar grandes cantidades de anticuerpos para obtener eficacia terapéutica y que los costes asociados con la producción son considerables. Las células de ovario de hámster chino (CHO), y las células de mieloma SP20 y NS02 son las líneas celulares de mamífero más comúnmente empleadas para la producción a escala comercial de proteínas humanas glicosiladas como los anticuerpos. Los resultados obtenidos de la producción de líneas celulares de mamíferos oscilan típicamente entre 50-250 mg/L para cultivos de 5-7 días en un fermentador por lotes y 300-1000 mg/L en 7-12 días en fermentadores por lotes alimentados.
[0004] El virus adenoasociado (AAV) es un vector deseable para la inserción de genes terapéuticos dado su perfil de seguridad y su capacidad de expresión génica in vivo a largo plazo. Los vectores de AAV recombinante (rAAV) se han empleado con anterioridad para expresar anticuerpos de cadena sencilla y de longitud completa in vivo. Dada la limitada capacidad de empaquetado del transgén por parte del AAV, ha supuesto un desafío técnico a la hora de obtener un sistema estrictamente regulado para expresar cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos empleando el vector AAV para generar anticuerpos de longitud completa.
[0005] Sigue habiendo necesidad en la técnica de insertar dos anticuerpos en una composición única para uso terapéutico.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0006] En la presente se proporciona un virus adenoasociado recombinante (AAV) con una cápside AAV que comprende un ácido nucleico heterólogo empaquetado que expresa dos anticuerpos funcionales en una célula. En una realización, el AAV recombinante contiene un ORF que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, un segundo ORF que codifica una primera cadena pesada de inmunoglobulina, y un tercer ORF que codifica una segunda cadena pesada, conforme a lo cual los constructos de anticuerpos funcionales expresados poseen dos cadenas pesadas diferentes con diferentes especificidades que comparten una cadena ligera. En una realización, los dos anticuerpos con diferentes especificidades están coexpresados con un tercer anticuerpo biespecífico con las especificidades de los dos anticuerpos monoespecíficos.
[0007] En una realización, el rAAV comprende: una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV; un primer casete de expresión que codifica al menos un primer marco abierto de lectura (ORF) para una primera inmunoglobulina bajo el control de secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión del mismo; un segundo casete de expresión que comprende un segundo ORF, un conector, y un tercer ORF bajo el control de secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión del mismo, donde el segundo y el tercer ORF se codifican para un segundo y tercer constructo de inmunoglobulina; y una ITR 3' de AAV.
[0008] Se proporciona una composición farmacéutica que comprende un AAV recombinante que expresa al menos dos constructos de anticuerpos funcionales y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, los al menos dos anticuerpos funcionales poseen diferentes especificidades. Opcionalmente, también hay un anticuerpo biespecífico coexpresado.
[0009] Se proporciona una composición que comprende anticuerpos funcionales con diferentes especificidades, donde cada uno de los anticuerpos posee la misma cadena ligera y una cadena pesada diferente. La fuente de la cadena ligera es distinta de la fuente de la cadena pesada para uno o dos de los anticuerpos. En una realización, se expresan dos anticuerpos monoespecíficos funcionales y un anticuerpo bifuncional. En una realización, el ratio de anticuerpos es de aproximadamente 25: aproximadamente 50: aproximadamente 25, homodiméricos: biespecíficos: homodiméricos.
[0010] Se proporciona un método para insertar dos anticuerpos funcionales en un sujeto que comprende administrar AAV recombinante al sujeto.
[0011] Sin embargo, otros aspectos y ventajas de la invención se harán obvios a partir de la siguiente descripción detallada de la misma.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0012]
La Fig. 1A es un dibujo que ilustra una disposición ejemplar para un vector que expresa dos constructos de anticuerpos monoespecíficos que contienen una primera y una segunda cadena pesada y una cadena ligera, que puede ser de un anticuerpo heterólogo para uno o ambos de los anticuerpos a partir del cual se originan la primera y la segunda cadena pesada, y un tercer anticuerpo biespecífico. Esta disposición utiliza un potenciador compartido que es bidireccional y separa un primer casete de expresión y un segundo casete de expresión. Se ilustran tres marcos abiertos de lectura (ORF). L hace referencia a un conector. pA1 hace referencia a una primera poli(A) y pA2 hace referencia a una segunda poli(A). MP1 hace referencia a un primer promotor mínimo y MP2 hace referencia a un segundo promotor mínimo. La poli(A) y el MP pueden ser los mismos o diferentes para cada casete de expresión.
La Fig. 1B es un dibujo que ilustra una disposición ejemplar alternativa para un vector que expresa dos constructos de anticuerpos que contienen una primera y una segunda cadena pesada y una cadena ligera, que puede ser de un anticuerpo heterólogo para uno o ambos de los anticuerpos a partir del cual se originan la primera y la segunda cadena pesada, y un tercer anticuerpo biespecífico. Esta disposición utiliza una poli(A) compartida. E1 hace referencia a un primer potenciador y E2 hace referencia a un segundo potenciador. Estos pueden ser los mismos o distintos potenciadores para cada uno de los casetes de expresión. De forma similar, MP1 y MP2 pueden ser los mismos o diferentes.
La Fig. 2 ilustra una molécula de ácido nucleico portada por un plásmido para su empaquetado en una cápside de AAV, que se utiliza para la coexpresión de una cadena pesada de anti-TSG 101, una cadena pesada de gripe FI6, y una cadena ligera de FI6. Estas cadenas de anticuerpos utilizan un líder heterólogo de interleucina 2 (IL2). El potenciador CMV humano se empleó junto con promotores CMV. El casete de expresión bicistrónica contiene un sitio de reconocimiento de furina y una secuencia de conector 2A que separa el ORF que contiene las regiones FI6 VL y CL del ORF que contienen la cadena pesada FI6. La poli(A) para el casete de expresión de la derecha es una poliA quinasa timidina corta. La poli(A) para el casete de expresión de la izquierda es una secuencia de poli(A) sintética.
La Fig. 3 ilustra la capacidad de unión de un anticuerpo FI6v3k2 coexpresado con un anticuerpo C05 de un AAV8 recombinante preparado según se describe aquí. Los resultados demuestran la unión prevista a la HA de longitud completa y al tronco de la HA característica de FI6 y la unión a la HA y solo a la cabeza de la Ha (no al tronco) característica de C05.
Las Fig. 4A-4B ilustran la capacidad de unión de un anticuerpo FI6v3k2 coexpresado con un anticuerpo 1A6 (anti-TSG 101) de un AAV8 recombinante preparado según se describe aquí. La Fig. 4A es un diagrama de barras que muestra que la unión a la proteína A captura el anticuerpo monoclonal total de la mezcla (se presenta el control negativo en la barra de la izquierda, y la muestra de anticuerpos en la barra de la derecha). La Fig. 4B es una gráfica que muestra que la unión al péptido TSG101 captura solo MAB que contiene una cadena pesada de 1A6 (línea superior). Estos datos demuestran que cuando se coexpresa con FI6v3k2, el anticuerpo 1A6 retenía la especificidad de unión del anticuerpo a partir del cual se originaban sus cadenas pesadas.
La Fig. 5 ilustra niveles de expresión sistémica en ratones a los que se les ha administrado FI6 coexpresado de un vector AAV con un segundo anticuerpo a dosis de 1 x 1011 copias del genoma (GC) o 1 x 1010 GC.
Las Fig. 6A-6B ilustran la evaluación del AAV9.BiD.FI6v3_CR8033mAb insertado por vía intramuscular (IM) a 1 x 1011 GC para la protección contra la exposición a la cepa de influenza PR8. La Fig. 6A es una gráfica de líneas que muestra el cambio porcentual en peso. El círculo representa el constructo AAV9 con un promotor bidireccional que expresa anticuerpos monoclonales sintéticos FI6v3 y CR8033 con la misma cadena ligera heteróloga. El cuadrado representa un control positivo, esto es, AAV9 que expresa un solo tipo de anticuerpo FI6 también insertado a 1 x 1011 GC, y el triángulo representa animales que no han recibido tratamiento. La Fig. 6B muestra la supervivencia tras la exposición.
Las Fig. 7A-7B ilustran la evaluación del AAV9.BiD.FI6v3_CR8033mAb insertado por vía intramuscular (IM) a 1 x 1011 GC para la protección contra la cepa de influenza B/Lee/40. La Fig. 7A es una gráfica de líneas que muestra el cambio porcentual en peso. El círculo representa el constructo AAV9 con un promotor bidireccional que expresa FI6 sintético y anticuerpos monoclonales CR8033 con la misma cadena ligera heteróloga. El cuadrado representa un control positivo, esto es, AAV9 que expresa un solo tipo de anticuerpo CR8033 también insertado a 1 x 1011 GC, y el triángulo representa animales que no han recibido tratamiento. La Fig. 7b muestra la supervivencia tras la exposición.
La Fig. 8A es un gráfico que muestra la protección en un modelo de ratón tras la administración de un AAV que expresa anticuerpos monoclonales FI6v3 y TCN, expresados por peso del ratón durante varios días. La línea superior (diamantes) representa una dosis de 25 microgramos (mg/mL) y la línea inferior representa 0,4 mg/mL.
La Fig. 8B es un gráfico que muestra la protección en un modelo de ratón tras la administración de un AAV que expresa anticuerpos monoclonales FI6v3 en IA6, expresados por peso del ratón durante varios días. La línea superior (diamantes) representa una dosis de 263,2 microgramos (mg/mL) y la línea inferior representa 36,5 mg/mL.
La Fig. 8C es un gráfico que muestra la protección en un modelo de ratón tras la administración de un AAV que expresa anticuerpos monoclonales FI6v3 y CR8033, expresados por peso del ratón durante varios días. La línea superior (diamantes) representa una dosis de 126,3 microgramos (mg/mL) y la línea inferior representa 6,9 mg/mL.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0013] En la presente se proporciona un vector que inserta dos anticuerpos monoespecíficos funcionales mediante la coexpresión de dos cadenas pesadas diferentes y una única cadena ligera que, cuando se expresan en una célula, forman dos anticuerpos monoespecíficos funcionales con diferentes especificidades, esto es, que reconocen diferentes antígenos (o ligandos). Puede expresarse también un tercer anticuerpo funcional expresado y biespecífico, con la cadena pesada de cada uno de los dos anticuerpos monoespecíficos. Típicamente, el tercer anticuerpo se expresa en un nivel inferior al de los dos anticuerpos monoespecíficos. Puede utilizarse un vector in vivo para la producción eficiente de composiciones que utilicen los al menos dos anticuerpos o puede diseñarse una célula huésped que produzca anticuerpos que contenga los casetes de expresión para las dos cadenas pesadas diferentes y para la cadena ligera de tipo único. Así, la invención también comprende una célula huésped que expresa una mezcla de dos anticuerpos monoespecíficos, donde cada anticuerpo tiene una especificidad distinta, pero contiene la misma cadena ligera, y un tercer anticuerpo biespecífico. En una realización deseada, el vector está diseñado para insertar tres constructos de anticuerpos distintos en un sujeto al que se le ha administrado el vector.
[0014] En una realización, el vector es un AAV recombinante con una cápside AAV en el que hay una molécula de ácido nucleico empaquetada que contiene, a su vez, secuencias que codifican dos cadenas pesadas diferentes y una única cadena ligera que, cuando se coexpresa, forma dos anticuerpos monoespecíficos funcionales, esto es, un primer anticuerpo con una primera cadena pesada y la cadena ligera, y un segundo anticuerpo con la segunda cadena pesada y la cadena ligera, y un tercer anticuerpo que posee una de cada de las cadenas pesadas y la misma cadena ligera para formar un anticuerpo biespecífico.
[0015] Un "anticuerpo funcional" puede ser un anticuerpo o una inmunoglobulina que se una a una diana seleccionada (p. ej., un antígeno en una célula cancerígena o un patógeno, como un virus, una bacteria o un parásito) con suficiente afinidad de unión para dar lugar a un resultado fisiológico deseado, que puede ser protector (p. ej., inmunización pasiva) o terapéutico.
[0016] El vector AAV aquí proporcionado puede contener 1, 2, o 3 marcos abiertos de lectura (ORF) para hasta diez dominios de inmunoglobulina. Tal y como se utiliza aquí, un "dominio de inmunoglobulina" hace referencia a un dominio de una cadena pesada o una cadena ligera de anticuerpo según se define con referencia a un anticuerpo de longitud completa convencional. Más específicamente, un anticuerpo de longitud completa contiene un polipéptido de cadena pesada (H) que contiene a su vez cuatro dominios: una región variable N-terminal (VH) y tres regiones constantes C-terminales (CHI, CH2 y CH3) y un polipéptido de cadena ligera (L) que contiene dos dominios: una región variable N-terminal (VL) y una región constante C-terminal (CL). Una región Fc contiene dos dominios (CH2 - CH3). Una región Fab puede contener un dominio constante y uno variable para cada una de las cadenas pesada y ligera.
[0017] En un vector AAV aquí descrito, pueden expresarse dos polipéptidos de cadena pesada de longitud completa (de 4 dominios cada uno) y un polipéptido de cadena ligera (de dos dominios). En una realización deseable, los dos polipéptidos de cadena pesada tienen diferentes especificidades, esto es, van dirigidos a diferentes dianas. Así, los vectores son útiles solos o en combinación, para expresar mezclas de anticuerpos.
[0018] Tal y como se utiliza aquí, "diferentes especificidades" indica que los constructos de inmunoglobulina indicados (p. ej., un anticuerpo de longitud completa, una cadena pesada u otro constructo capaz de unir una diana específica) se unen a un sitio diana diferente. Idóneamente, en un constructo dual de anticuerpos expresado, las dos especificidades ni se solapan ni interfieren y pueden, opcionalmente, mejorarse mutuamente. Dos constructos de anticuerpos (inmunoglobulina) tal y como se describen aquí confieren diferente especificidad mediante la unión a un sitio diana diferente en el mismo patógeno o sitio diana (p. ej., una proteína de virus o tumor). Dichos antígenos diana diferentes pueden ser distintas cepas del mismo tipo viral (p. ej., dos cepas de gripe diferentes), o dos antígenos distintos (p. ej., un antiviral y anticancerígeno, dos constructos anticancerígenos diferentes, entre otros). Por ejemplo, un primer polipéptido de cadena pesada puede combinarse con la cadena ligera para formar un constructo de anticuerpos con una primera especificidad, el segundo polipéptido de cadena pesada puede combinarse con la cadena ligera para formar un segundo constructo de anticuerpos con una segunda especificidad, y la primera y la segunda cadena pesada puede combinarse con la cadena ligera para formar un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos pueden opcionalmente ir dirigidos a diferentes sitios antigénicos (epítopos) en una única diana (p.ej., diferentes sitios diana en un patógeno viral, bacteriano, fúngico o parasitario seleccionado) o a diferentes dianas. Por ejemplo, las cadenas pesadas de los dos anticuerpos pueden ir dirigidos al virus de influenza y pueden estar coexpresadas para formar dos anticuerpos monoespecíficos (p.ej., pueden seleccionarse cadenas pesadas de los virus de influenza FI6, CR8033 y C05) y expresadas con una cadena ligera seleccionada, y un anticuerpo biespecífico. Los ejemplos de anticuerpos adecuados de influenza y otros constructos de anticuerpos para combatir patógenos de transmisión por vía aérea y un método para insertarlos se describen en, por ejemplo, WO 2012/145572A1. Los anticuerpos también pueden estar dirigidos a distintas dianas (p. ej., un anticuerpo antiviral, incluidas las infecciones virales crónicas, las infecciones virales asociadas a los cánceres, o distintas proteínas superficiales que combaten las células neoplásicas u otras dianas. Los ejemplos de dianas virales adecuadas incluyen la proteína de la hemaglutinina de influenza u otras proteínas virales, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus del papiloma humano (VPH), el virus de Epstein-Barr, el virus del herpes humano, el virus respiratorio sincitial, entre otros. Así, la invención es particularmente adecuada para su uso en tratamientos terapéuticos y profilaxis pasiva, para los cuales son deseables las combinaciones de anticuerpos.
[0019] El término "inmunoglobulina" se emplea aquí incluyendo anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos. Pueden existir diversas formas de anticuerpos entre las que se incluyen, por ejemplo, los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales, los anticuerpos de dominios únicos camelizados, anticuerpos intracelulares ("intracuerpos"), anticuerpos recombinantes, anticuerpos multiespecíficos (biespecíficos), fragmentos de anticuerpos, como, Fv, Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, fragmentos de anticuerpos variables de cadena sencilla (scFv), tándem/bis scFv, Fc, pFc', scFvFc (o scFv-Fc), disulfuro Fv (dsfv), anticuerpos biespecíficos (bc-scFv) como anticuerpos BiTE; anticuerpos de camélido, anticuerpos de superficie acondicionada, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, anticuerpos de dominio único (sdAb, también llamado NANOBODY®), anticuerpos quiméricos, anticuerpos quiméricos que comprendan al menos una región constante humana, y similares. "Fragmento de anticuerpos" hace referencia a, al menos, una porción de la región variable de la inmunoglobulina que se une a su diana, p. ej., la célula tumoral. En una realización, la inmunoglobulina es un IgG. Con todo, pueden seleccionarse otros tipos de inmunoglobulina. En otra realización, el subtipo de IgG seleccionado es un IgG1. Sin embargo, pueden seleccionarse otros isótopos. Además, puede seleccionarse cualquier alotipo de IgG1.
[0020] El término "heterólogo" cuando se utiliza en relación a una proteína o a un ácido nucleico indica que la proteína o el ácido nucleico comprenden dos o más secuencias o subsecuencias que no se encuentran en la misma relación la una con respecto a la otra en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, con dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para formar un nuevo ácido nucleico funcional. Por ejemplo, en una realización, el ácido nucleico cuenta con un promotor de un gen dispuesto para dirigir la expresión de una secuencia de codificación de un gen diferente. Así, con referencia a la secuencia de codificación, el promotor es heterólogo. El término "cadena ligera heteróloga" hace referencia a una cadena ligera que contiene un dominio variable y/o un dominio constante de un anticuerpo que posee una especificidad de diana diferente de la especificidad de la cadena pesada.
[0021] Los dos o más ORF transportados por la molécula de ácido nucleico empaquetados dentro del vector pueden estar expresados a partir de dos casetes de expresión, pudiendo ser uno o ambos bicistrónicos. Dado que los casetes de expresión contienen cadenas pesadas de dos anticuerpos diferentes, es deseable introducir una variación de secuencia entre las dos secuencias de cadena pesada para minimizar la posibilidad de recombinación homóloga. Típicamente, hay suficiente variación entre los dominios variables de ambos anticuerpos (VH-Ab1 y VH-Ab2). Sin embargo, es deseable garantizar que haya una variación de secuencia de codificación suficiente entre las regiones constantes del primer anticuerpo (Ab1) y el segundo anticuerpo (Ab2), más preferiblemente en cada una de las regiones CH1, CH2, y CH3. Por ejemplo, en una realización, las regiones constantes de la cadena pesada de un primer anticuerpo pueden tener la secuencia de nt 1 a 705 de SEQ ID NO: 1 (que codifica aminoácidos 1 - 233 de SEQ ID NO: 2) o una secuencia que sea de aproximadamente el 95 % a aproximadamente el 99 % idéntico al mismo sin que ninguno introduzca ningún cambio en los aminoácidos. En una realización, la variación en la secuencia de estas regiones se introduce en forma de codones sinónimos (esto es, se introducen variaciones de la secuencia de ácido nucleico sin cambio alguno a nivel de los aminoácidos). Por ejemplo, la segunda cadena pesada puede tener regiones constantes que sean en al menos un 15 %, al menos un 25 %, al menos un 35 %, divergentes (esto es, aproximadamente de un 65 % a aproximadamente un 85 % idénticas) en CH1, CH2 y/o CH3.
[0022] Una vez seleccionadas la diana y la inmunoglobulina, las secuencias de codificación para la inmunoglobulina seleccionada (p. ej., pueden obtenerse y/o sintetizarse una o varias cadenas ligeras y/o pesadas. Los métodos para secuenciar un ácido nucleico (p. ej., ARN o ADN) son conocidos para los expertos en la técnica. En cuanto se conoce la secuencia de ácido nucleico, se puede deducir el aminoácido y, por ello, hay dos programas informáticos disponibles en el mercado, así como empresas de servicios que realizan la traducción inversa de las secuencias de aminoácidos a secuencias de codificación de ácido nucleico. Véase, p. ej., backtranseq de EMBOSS, http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/; Gene Infinity (http://www.geneinfinity.org/sms/sms_backtranslation.html): ExPasy (http://www.expasy.org/tools/). En una realización, las secuencias de codificación de ARN, y/o ADNc están diseñadas para la expresión óptima en células humanas. Los métodos para sintetizar ácidos nucleicos son conocidos para los expertos en la técnica y pueden utilizarse para todos o para porciones de los constructos de ácido nucleico aquí descritos.
[0023] Las regiones de codificación de codones optimizados pueden diseñarse mediante métodos diferentes. Esta optimización puede llevarse a cabo empleando métodos disponibles en línea (p. ej., GeneArt,), métodos publicados o una empresa que proporcione servicios de optimización de codones, p. ej., como DNA2.0 (Menlo Park, CA). Se describe un algoritmo de optimización de codones, p. ej., en la Solicitud de patente estadounidense n.° WO 2015/012924, Véanse también, p. ej., la Publicación de patente estadounidense n.° 2014/0032186 y la Publicación de patente estadounidense n.° 2006/0136184. Idóneamente, se modifica la longitud total del marco abierto de lectura (ORF) para el producto. Sin embargo, en algunas realizaciones, solo puede modificarse un fragmento del ORF. Empleando uno de estos métodos, se pueden aplicar las frecuencias a cualquier secuencia de polipéptidos, y se puede producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificante de codones optimizados que codifique el polipéptido.
[0024] Hay varias opciones disponibles para llevar a cabo los cambios en los codones o para sintetizar las regiones codificantes de codones optimizados diseñadas aquí descritas. Dichas modificaciones o síntesis pueden llevarse a cabo empleando manipulaciones biológicas moleculares rutinarias y estándar conocidas para quienes están familiarizados con la técnica. En un enfoque, se sintetizan mediante métodos estándar una serie de pares de oligonucleótidos complementarios de 80-90 nucleótidos de longitud cada uno y que abarcan la longitud de la secuencia deseada. Estos pares de oligonucleótidos se sintetizan de forma que al anillarse forman fragmentos de doble hebra de 80-90 pares de bases, que contienen extremos cohesivos, p. ej., cada oligonucleótido del par se sintetiza para extender 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más bases más allá de la región complementaria al otro oligonucleótido del par. Los extremos de hebra simple de cada par de oligonucleótidos están diseñados para anillarse con el extremo de hebra simple de otro par de oligonucleótidos. Se deja que se anillen los pares de oligonucleótidos, y luego se deja que aproximadamente entre cinco y seis de estos fragmentos de doble hebra se anillen entre sí mediante los extremos cohesivos de hebra simple, y luego se ligan juntos y se clonan en un vector de clonación bacteriano estándar, por ejemplo, un vector TOPO® adquirible de Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif. A continuación, se secuencia el constructo mediante métodos estándar. Varios de estos constructos constan de 5 a 6 fragmentos de 80 a 90 fragmentos de pares de bases ligados entre sí, esto es, fragmentos de unos 500 pares de bases, se preparan de forma que toda la secuencia deseada se representa en una serie de constructos plásmidos. Los insertos de estos plásmidos se cortan a continuación con las enzimas de restricción adecuadas y se ligan entre sí para formar el constructo final. Luego se clona el constructo final en un vector de clonación bacteriano estándar y se secuencia. Los métodos adicionales se harán obvios de forma inmediata para los expertos en la técnica. Además, la síntesis de los genes está disponible en el mercado.
[0025] Opcionalmente, pueden introducirse sustituciones de aminoácidos en una región constante de cadena pesada para incrementar la diversidad de la secuencia entre las dos cadenas pesadas de anticuerpos y/o con otro fin. Hay métodos y programas informáticos para preparar dichos alineamientos que son bien conocidos para los expertos en la técnica. También pueden escribirse las sustituciones como (aminoácido identificado por un código de una sola letra)-posición n.°- (aminoácido identificado por un código de una sola letra) conforme a lo cual el primer aminoácido es el aminoácido sustituido y el segundo aminoácido es el aminoácido sustituto en la posición especificada. Los términos "sustitución" y "sustitución de un aminoácido" y "sustitución de aminoácidos" tal y como se utilizan aquí hacen referencia a una sustitución de un aminoácido de una secuencia de aminoácidos por otro, donde el último es distinto del aminoácido sustituido. Los métodos para sustituir un aminoácido son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen, sin límite, mutaciones de la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos. Se describen los métodos para realizar sustituciones de aminoácidos en IgG, p. ej., para WO 2013/046704.
[0026] El término "sustitución de aminoácidos" y sus sinónimos arriba descritos comprenden la modificación de una secuencia de aminoácidos mediante la sustitución de un aminoácido por otro, el aminoácido sustituto. La sustitución puede ser una sustitución conservadora. El término "conservador", en referencia a dos aminoácidos, significa que los aminoácidos comparten una propiedad común reconocida por un experto en la técnica. El término "no conservador", en referencia a dos aminoácidos, significa que los aminoácidos presentan diferencias en, al menos, una propiedad común reconocida por un experto en la técnica. Por ejemplo, dichas propiedades pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales no ácidas hidrofóbicas, aminoácidos con cadenas laterales hidrofóbicas (que pueden dividirse en ácidas y no ácidas), aminoácidos con cadenas laterales alifáticas hidrofóbicas, aminoácidos con cadenas laterales aromáticas hidrofóbicas, aminoácidos con cadenas laterales neutrales polares, aminoácidos con cadenas laterales eléctricamente cargadas, aminoácidos con cadenas laterales ácidas eléctricamente cargadas, y aminoácidos con cadenas laterales básicas eléctricamente cargadas. Tanto los aminoácidos presentes de manera natural como los presentes de manera no natural son conocidos en la técnica y pueden emplearse como aminoácidos sustitutos en las realizaciones. Así, una sustitución de aminoácido conservadora puede implicar el cambio de un primer aminoácido con una cadena lateral hidrofóbica por un aminoácido diferente con una cadena lateral hidrofóbica; mientras que una sustitución de aminoácido no conservadora puede implicar el cambio de un primer aminoácido con una cadena lateral ácida hidrofóbica por un aminoácido diferente con una cadena lateral diferente, p. ej., una cadena lateral básica hidrofóbica o una cadena lateral hidrofílica. Además, un experto en la técnica puede determinar otros cambios conservadores o no conservadores. En otras realizaciones, la sustitución en una posición dada será de un aminoácido o un grupo de aminoácidos, que será obvia para un experto en la técnica, para alcanzar un objetivo aquí identificado.
[0027] Para expresar un domino de inmunoglobulina seleccionado, puede diseñarse una molécula de ácido nucleico que contenga codones que hayan sido seleccionados para la expresión óptima de los polipéptidos de inmunoglobulina en una especie de mamíferos seleccionada, p. ej., humanos. Además, la molécula de ácido nucleico puede incluir una secuencia líder heteróloga para cualquier cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo seleccionado, que codifica el péptido señal líder de IL-2 mutada o salvaje fusionado corriente arriba de los polipéptidos de cadena pesada formados por regiones variables y constantes. Sin embargo, puede sustituirse otra secuencia líder heteróloga para uno o ambos de los péptidos señal de IL-2. Los péptidos señal/líder pueden ser los mismos o distintos para cada uno de los constructos de inmunoglobulina de cadena ligera y cadena pesada. Estas pueden ser secuencias señal presente de forma nativa en una inmunoglobulina (p. ej., IgG), o que pueden proceder de una fuente heteróloga. Dichas fuentes heterólogas pueden ser una citoquina (p. ej., IL-2, IL12, IL18, o similares), insulina, albúmina, D-glucuronidasa, proteasa alcalina o los péptidos señal secretores de fibronectina, entre otros.
[0028] Tal y como se utiliza aquí, un "casete de expresión" hace referencia a una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un primer marco abierto de lectura (ORF) y opcionalmente un segundo ORF. Un ORF puede contener dos, tres o cuatro dominios de anticuerpos. Por ejemplo, el ORF puede contener una cadena pesada de longitud completa. Alternativamente, un ORF puede contener uno o dos dominios de anticuerpos. Por ejemplo, el ORF puede contener un dominio variable de cadena pesada y un dominio constante de cadena pesada sencilla. Por ejemplo, el ORF puede contener una región variable de cadena ligera y una constante de cadena ligera. Así, puede diseñarse un casete de expresión para que sea bicistrónico, esto es, para que contenga secuencias reguladoras que dirijan la expresión de los ORF del mismo desde secuencias reguladoras compartidas. En este ejemplo, los dos ORF están típicamente separados por un conector. En la técnica se conocen los conectores idóneos, como un sitio interno de unión a la ribozima (IRES) y/o un conector péptido autoescindible furina 2a (F2a), [véase, p. ej., Radcliffe and Mitrophanous, Gene Therapy (2004), 11, 1673-1674]. Idóneamente, los ORF están unidos operablemente a las secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión en una célula diana. Dichas secuencias reguladoras de control pueden incluir un poliA, un promotor, y un potenciador. Para facilitar la coexpresión del vector AAV, al menos uno de entre el potenciador y/o la secuencia poliA puede ser compartido por los casetes de expresión primero y segundo.
[0029] En una realización, el rAAV en el que está empaquetada la cápside AAV seleccionada, una molécula de ácido nucleico que comprende: una ITR 5', un primer casete de expresión, un potenciador bidireccional y un segundo casete de expresión, donde el potenciador bidireccional Separa los casetes de expresión primero y segundo, y una ITR 3'. La Fig. 1A se incluye aquí como ejemplo de esta realización. Por ejemplo, en dicha realización, un primer promotor para un primer casete de expresión se encuentra a la izquierda del potenciador bidireccional, seguido de, al menos, un marco abierto de lectura, y una secuencia poliA, y un segundo promotor. Además, un segundo promotor para el segundo casete de expresión se encuentra a la derecha del potenciador bidireccional, seguido de, al menos, un segundo marco abierto de lectura y una poliA. Los promotores primero y segundo y las secuencias poliA primera y segunda pueden ser iguales o diferentes. Pueden seleccionarse un promotor mínimo y/o una poliA mínima para conservar espacio. Típicamente, en esta realización, cada promotor se encuentra en posición ya sea adyacente (bien a la izquierda o a la derecha (o 5' o 3')) a la secuencia del potenciador y las secuencias poliA se encuentran en posición adyacente a las ITR, con los ORF en el medio. Mientras que la Fig. 1A es ilustrativa, el orden de los ORF puede variar y, por ende, los dominios de inmunoglobulina pueden estar codificados. Por ejemplo, las secuencias variables y constantes de cadena ligera pueden encontrarse a la izquierda del potenciador y las dos cadenas pesadas pueden estar codificadas por los ORF ubicados a la derecha del potenciador. Alternativamente, una de las cadenas pesadas puede encontrarse a la izquierda del potenciador y los ORF a la derecha del potenciador codifican una segunda cadena pesada y una cadena ligera. Alternativamente, la configuración opuesta es posible, y el casete de expresión a la izquierda del potenciador puede ser bicistrónica. Alternativamente, según qué dominios estén codificados, ambos casetes de expresión pueden ser monocistrónicos (p. ej., codificando dos inmunoadesinas), o ambos pueden ser bicistrónicos (p. ej., codificando dos FAB completos).
[0030] En otra realización, el rAAV lleva empaquetada la cápside AAV seleccionada, una molécula de ácido nucleico que comprende: una ITR 5', un primer casete de expresión, una poliA que funciona bidireccionalmente y un segundo casete de expresión, donde el poliA bidireccional se separa y funciona para el primer y el segundo casete de expresión, y una ITR 3'. La Fig. 1B se incluye aquí como ejemplo de esta realización. En esta realización, un primer potenciador y un primer promotor (o combinación potenciador/promotor) se encuentra a la derecha de la ITR 5', seguido del/de los ORF y del poliA bidireccional. El segundo casete de expresión está separado del primer casete de expresión por el poliA bidireccional y se transcribe en sentido contrario. En este casete de expresión, el potenciador y el promotor (o la combinación promotor/potenciador) se encuentran adyacentes a la ITR 3' y el/los ORF son adyacentes al poliA bidireccional. Mientras que la Fig. 1B es ilustrativa, el orden de los ORF puede variar, al igual que los dominios de inmunoglobulina, por ende. Por ejemplo, las secuencias variables y constantes de cadena ligera pueden encontrarse a la izquierda del poliA y las dos cadenas pesadas pueden estar codificadas por uno o varios ORF ubicados a la derecha del poliA. Alternativamente, una de las cadenas pesadas puede encontrarse a la izquierda del poliA y los ORF a la derecha del poliA codifican una segunda cadena pesada y una cadena ligera. Alternativamente, la configuración contraria es posible, y el casete de expresión a la izquierda del poliA puede ser bicistrónico. Alternativamente, según qué dominios estén codificados, ambos casetes de expresión pueden ser monocistrónicos (p. ej., codificando dos inmunoadesinas), o ambos pueden ser bicistrónicos.
[0031] Opcionalmente, la configuración de expresión ejemplificada en las Fig. 1A y 1B y descrita aquí puede utilizarse para coexpresar otros constructos de inmunoglobulina. Por ejemplo, dos inmunoadesinas (IA) pueden ser expresadas desde dos casetes de expresión monocistrónicos. Una inmunoadesina incluye una forma de anticuerpo que se expresa como un marco abierto de lectura único que contiene una unidad (esto es, v H unido a VL o VL unido a VH) de fragmento variable de cadena sencilla (scFv) fusionada a un dominio Fc (CH2-CH3), (p. ej., VH-VL-CH2-CH3 o VL-VH-CH2-CH3). Alternativamente, podrían expresarse hasta cuatro scFvs desde dos casetes de expresión bicistrónicos. En otra alternativa, una IA puede ser coexpresada con un anticuerpo de longitud completa. En otra alternativa, una FAB completa puede ser coexpresada con un anticuerpo de longitud completa o dos FAB completas pueden ser coexpresadas. En otra realización pueden coexpresarse otras combinaciones de anticuerpo de longitud completa, IA, o fragmentos de FAB.
[0032] Pueden seleccionarse secuencias reguladoras de control adecuadas y obtenerse de diversas fuentes. En una realización, un promotor mínimo y/o un poliA mínimo pueden utilizarse para conservar el tamaño.
[0033] Tal y como se utiliza aquí, el término "promotor mínimo" significa una secuencia corta de ADN en una caja TATA y otras secuencias que sirven para especificar el sitio de iniciación de la transcripción, al que se añaden los elementos reguladores para la expresión del control. En una realización, un promotor hace referencia a una secuencia de nucleótidos que incluye un promotor mínimo más elementos reguladores que pueden controlar la expresión de una secuencia codificadora o ARN funcional. Este tipo de secuencia promotora consta de elementos corriente arriba proximales y más distales, siendo los últimos a menudo denominados potenciadores. En una realización, el promotor mínimo es un promotor mínimo de citomegalovirus (CMV). En otra realización, el promotor mínimo se deriva de CMV humano (hCMV) como el promotor mínimo derivado del promotor temprano inmediato de hCMV (véase, US 20140127749, y Gossen and Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 5547-5551). En otra realización, el promotor mínimo se deriva de una fuente viral, como, por ejemplo: los promotores tempranos o tardíos SV40, los promotores tempranos inmediatos de citomegalovirus (CMV), o los promotores tempranos del Virus del Sarcoma de Rous (RSV); o de promotores de células eucariotas, por ejemplo, el promotor de la beta-actina (Ng, Nuc. Acid Res. 17:601-615, 1989; Quitsche et al., J. Biol. Chem. 264:9539-9545, 1989), el promotor de GADPH (Alexander, M. C. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:5092-5096, 1988, Ercolani, L. et al., J. Biol. Chem. 263:15335-15341, 1988), el promotor del TK-1 (timidina quinasa), los promotores de HSP (proteínas de choque térmico), el promotor de UbB o UbC, PGK, el promotor de Ef1-alfa o cualquier promotor de eucariotas que contenga una caja TATA (Solicitud estadounidense de patente publicada n.° 2014/0094392). En otra realización, el promotor mínimo incluye un minipromotor, como el minipromotor CLDN5 descrito en la Solicitud de patente estadounidense publicada n. 2014/0065666. En otra realización, el promotor mínimo es un promotor de Timidina quinasa (TK). En otra realización, el promotor mínimo es tejido-específico, como un promotor mínimo TnlSlow de los promotores específicos de células musculares, un promotor TnlFast mínimo o un promotor de quinasa creatina muscular (Solicitud de patente estadounidense publicada n.° 2012/0282695).
[0034] En una realización, la señal de poliadenilación (poli(A)) es una señal poli(A) mínima, esto es, una secuencia mínima necesaria para una poliadenilación eficiente. En una realización, la poli(A mínima) es una poli(A) sintética, como la descrita en Levitt et al, Genes Dev., 1989 Jul, 3(7):1019-25; y Xia et al, Nat Biotechnol. 2002 Oct; 20(10):1006-10. Epub 2002 Sep 16. En otra realización, la poli(A) se deriva de la poli(A) beta-globina de conejo. En una realización, el poliA actúa bidireccionalmente (An et al, 2006, PNAS, 103(49): 18662-18667. En otra realización, la poli(A) se deriva de la secuencia de señal de poliA temprana de SV40.
[0035] Tal y como se describe en la presente, en una realización, un potenciador sencillo, o el mismo potenciador, pueden regular la transcripción de múltiples genes heterólogos en el constructo plásmido. Varios potenciadores adecuados para su uso en la invención son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el potenciador temprano CMV, el potenciador Hoxc8, nPE1 y nPE2. Los potenciadores adicionales útiles aquí se describen en Andersson et al, Nature, 2014 March, 507(7493):455-61. Otros elementos potenciadores pueden incluir, p. ej., un potenciador apolipoproteína, un potenciador de pez cebra, un elemento potenciador GFAP, y potenciadores tejido-específicos como los descritos en WO 2013/1555222, elemento regulador post-transcripcional post-hepatitis de marmota. Adicional o alternativamente, pueden seleccionarse otros, p. ej., el promotor de (IE)-PDGR temprano inmediato de citomegalovirus humano híbrido (HCMV) u otros promotores - elementos potenciadores. Para potenciar la expresión, los otros elementos pueden ser intrones (como intrón promega o intrón de inmunoglobulina globina humana de pollo quimérico). Otros promotores y potenciadores útiles aquí pueden encontrarse en la base de datos Mammalian Promoter/Enhancer Database, disponible para consulta en http://promoter.cdb.rik- en.jp/.
[0036] Los constructos aquí descritos pueden contener además otras secuencias reguladoras o de control del a expresión como, p. ej., incluir secuencias adecuadas de potenciadores y promotores de iniciación y terminación de la transcripción; señales de procesamiento del ARN eficientes como las señales de empalme y poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el mRNA citoplasmático; secuencias que potencian la eficiencia de traslación (p. ej., secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y, si se desea, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. Puede seleccionarse un promotor de entre un promotor constitutivo, un promotor tejido-específico, un promotor para células específicas, un promotor sensible a factores fisiológicos, o un promotor regulable [véanse, p. ej., WO 2011/126868 y WO 2013/049492].
[0037] Estas secuencias de control están "operablemente unidas" a las secuencias genéticas del constructo de inmunoglobulina. Tal y como se utiliza aquí, el término, "operablemente unido" hace referencia a las secuencias de control de la expresión contiguas al gen de interés y a las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.
[0038] Entre los ejemplos de promotores constitutivos adecuados para controlar la expresión de dominios de anticuerpos se incluyen, sin límite, la p-actina de pollo (CB) o los promotores beta-actina de otras especies, el promotor del citomegalovirus humano (CMV), los promotores tempranos y tardíos del virus simio 40 (SV40), el promotor U6, los promotores metalotioneínas, el promotor EFla, el promotor ubiquitina el promotor de hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), el promotor de dihidrofolato reductasa (DHFR) (Scharfmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4626-4630 (1991), el promotor de la adenosín deaminasa, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK), el promotor de piruvato quinasa, el promotor de mutasa fosfoglicerol, el promotor de p-actina (Lai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10006­ 10010 (1989), UbB, UbC, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus, el promodor de timidina quinasa del virus del Herpes Simplex y otros promotores constitutivos conocidos para los expertos en la técnica. Entre los ejemplos de promotores tejido-específicos o específicos de células adecuados para su uso en la presente invención se incluyen, sin límite, la endotelina-I (ET -I) y Flt-I, que son específicos para las células endoteliales, FoxJ1 (dirigido a las células ciliadas).
[0039] Los promotores inducibles adecuados para controlar la expresión de los dominios de anticuerpos incluyen los promotores sensibles a agentes exógenos (p. ej., agentes farmacológicos) o a factores fisiológicos. Estos elementos de respuesta incluyen, sin límite, un elemento de respuesta hipóxica (HRE) que une HIF-Ia y p, un elemento de respuesta a iones metálicos como el descrito por Mayo et al. (1982, Cell 29:99-108); Brinster et al. (1982, Nature 296:39-42) y Searle et al. (1985, Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489); o un elemento de respuesta al choque térmico como el descrito por Nouer et al. (en: Heat Shock Response, ed. Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., ppI67-220, 1991)
[0040] En una realización, la expresión de un marco abierto de lectura es controlada por un promotor regulable que proporciona un estrecho control de la transcripción del ORF (gen), p. ej., un agente farmacológico o factores de transcripción activados por un agente farmacológico o, en realizaciones alternativas, factores fisiológicos. Entre los ejemplos de promotores regulables que son complejos de factores de transcripción dependientes de ligando que pueden emplearse se incluyen, sin límite, miembros de la superfamilia de receptores nucleares activados por sus respectivos ligandos (p. ej., glucocorticoide, estrógeno, progestina, retinoide, ecdisona y sus análogos y miméticos) y rTTA activado por tetraciclina. Entre los ejemplos de dichos sistemas se incluye, sin límite, la tecnología de transcripción ARGENT™ (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, Mass.). Ejemplos de dichos sistemas de promotores se describen, p. ej., en WO 2012/145572.
[0041] Otros promotores pueden incluir, p. ej., el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV), el promotor/potenciador temprano de SV40, el promotor de poliomavirus JC, los promotores de proteína básica de mielina (MBP) o proteína ácida fibrilar glial (GFAP), el promotor asociado a la latencia (LAP) del virus de1Herpes Simplex (HSV-1), el promotor de repetición terminal larga (LTR) del virus de sarcoma de Rous (RSV), el promotor específico de neuronas (NSE), el promotor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), hSYN, el promotor de la hormona concentradora de melanina (MCH), CBA, el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), el promotor de metaloproteína de la matriz (MPP), y el promotor de beta-actina de pollo. Los promotores pueden ser los mismos o diferentes para cada casete de expresión.
[0042] Para su uso en la producción de un vector viral AAV (p. ej., un (r) AAV recombinante), los casetes de expresión pueden ser transportados en cualquier vector adecuado, p. ej., un plásmido que se inserte en una célula huésped empaquetadora. Los plásmidos útiles para esta invención pueden diseñarse de tal forma que sean idóneos para replicación y empaquetado en células procariotas, células de mamífero, o ambas. Las técnicas de transfección adecuadas y las células huésped empaquetadoras son conocidas y/o pueden ser diseñadas fácilmente por un experto en la técnica.
[0043] Los métodos para generar y aislar AAV idóneos para su uso como vectores son conocidos en la técnica. Véase, de forma general, p. ej., Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning et al., 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vectortechnology," J. Gene Med. 10:717-733; y las referencias abajo citadas.
Para empaquetar un transgén en viriones, las ITR son los únicos componentes AAV necesarios en cis en el mismo constructo que la molécula de ácido nucleico que contiene los casetes de expresión. Los genes cap y rep pueden proporcionarse en trans.
[0044] Tal y como se ha descrito más arriba, el término "aproximadamente", utilizado para modificar un valor numérico, significa una variación del 610 %, a menos que se especifique lo contrario.
[0045] Tal y como se utiliza a lo largo de toda esta especificación y las reivindicaciones, los términos "comprender" y "contener" y sus variantes, incluidas "comprende", "comprendiendo/que comprende", "contiene" y "conteniendo/que contiene", entre otras variantes, incluyen otros componentes, elementos, números enteros, fases y similares. Los términos "consta de' o "que consta de' excluyen otros componentes, elementos, números enteros, fases y similares.
[0046] Los términos "idéntico" o "identidad" porcentual en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, hacen referencia a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o tienen un porcentaje especificado de residuos de aminoácidos o nucleótidos que son los mismos (esto es, aproximadamente un 70 % de identidad, preferiblemente un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o una identidad superior en una región especificada (p. ej., cualquiera de los ORF modificados proporcionados aquí cuando se comparan y alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación o región diseñada) medidos empleando un algoritmo de comparación de secuencias BLAST o BLAST 2.0 con los parámetros por defecto abajo descritos, o mediante alineamiento manual e inspección visual (véase, p. ej., la página web de NCBI o similares). Como ejemplo adicional, las secuencias de polinucleótidos pueden compararse empleando Fasta, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta proporciona alineamientos y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias problema y de búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico puede determinarse utilizando Fasta con sus parámetros de fábrica (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) según se proporciona en GCG Versión 6.1. En general, estos programas se utilizan con los ajustes de fábrica, aunque un experto en la técnica puede modificar estos ajustes según sea necesario. Alternativamente, un experto en la técnica puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione, al menos, el nivel de identidad o alineamiento proporcionado por los algoritmos y programas referenciados. Esta definición también hace referencia, o puede aplicarse, al complemento de una secuencia. La definición incluye también secuencias que tienen deleciones y/o adiciones, así como aquellas que tienen sustituciones. Según se describe más abajo, los algoritmos preferidos pueden explicar los huecos y similares. preferiblemente, existe identidad en una región que es, al menos, de aproximadamente 25, 50, 75, 100, 150, 200 aminoácidos o nucleótidos de longitud, y a menudo en una región que es de 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500 aminoácidos o nucleótidos de longitud o en la longitud completa de las secuencias de un aminoácido o ácido nucleico.
[0047] Típicamente, cuando se prepara un alineamiento en base a una secuencia de aminoácidos, el alineamiento contiene inserciones y deleciones que se identifican así con respecto a una secuencia de referencia AAV y la numeración de los residuos de aminoácido se basa en una escala de referencia proporcionada para el alineamiento. Sin embargo, cualquier secuencia AAV dada puede tener menos residuos de aminoácidos que la escala de referencia. En la presente invención, cuando se habla de la secuencia parental, el término "la misma posición" o "la posición correspondiente" hace referencia al aminoácido ubicado en el mismo número de residuo en cada una de las secuencias, con respecto a la escala de referencia para las secuencias alineadas. Sin embargo, cuando se quita del alineamiento, cada una de las proteínas puede tener estos aminoácidos ubicados en distintos números de residuo. Los alineamientos se realizan empleando bien cualquiera de los diversos Programas de Alineamiento Múltiple de Secuencias públicos o disponibles en el mercado. Los programas de alineamiento de secuencias están disponibles para secuencias de aminoácidos, p. ej., los programas "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAK-ER", "MEME" y "Match-Box". En general, cualquiera de estos programas se utiliza con los ajustes de fábrica, aunque un experto en la técnica puede modificar estos ajustes según sea necesario. Alternativamente, un experto en la técnica puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione, al menos, el nivel de identidad o alineamiento proporcionado por los algoritmos y programas referenciados. Véase, p. ej., J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999).
[0048] En una realización, los casetes de expresión aquí descritos están diseñados en un elemento genético (p. ej. un plásmido lanzadera) que transfiere las secuencias del constructo de inmunoglobulina transportados en el mismo a una célula huésped empaquetadora para la producción de un vector viral. En una realización, el elemento genético seleccionado puede ser insertado en una célula empaquetadora de AAV mediante cualquier método adecuado, incluidos la transfección, la electroporación, la inserción de liposomas, las técnicas de fusión de membrana, los pellets recubiertos de ADN de alta velocidad, la fusión de infección viral y protoplastos. También pueden realizarse células empaquetadoras de AAV estables. Alternativamente, los casetes de expresión pueden emplearse para generar un vector viral distinto de AAV, o para producir mezclas de anticuerpos in vitro. Los métodos utilizados para realizar dichos constructos son conocidos por los expertos en manipulación de ácidos nucleicos e incluyen técnicas de ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, p. ej., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Green and Sambrook, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012).
Vectores AAV
[0049] Un vector AAV recombinante (partícula viral AAV) puede comprender, empaquetados en una cápside AAV, una molécula de ácido nucleico que contiene una ITR 5' de AAV, los casetes de expresión aquí descritos y una ITR 3' de AAV. Tal y como se describe aquí, un casete de expresión puede contener elementos reguladores para uno o varios marcos abiertos de lectura en cada casete de expresión, y la molécula de ácido nucleico puede contener opcionalmente elementos reguladores adicionales.
[0050] El vector AAV puede contener una repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV de longitud completa y una ITR 3' de longitud completa. Se ha descrito una versión acortada de la ITR 5', llamada AITR, en la que se eliminan la secuencia D y el sitio de resolución terminal (trs). La abreviatura "sc" significa autocomplementario. "AAV autocomplementario" hace referencia a un constructo en el que una región codificadora transportada por una secuencia de ácido nucleico de AAV recombinante se ha diseñado para formar una plantilla de ADN de doble hebra intramolecular. Al infectarse, en vez de esperar a la síntesis mediada celularmente de la segunda hebra, las dos mitades complementarias de scAAV se asociarán para formar una unidad de ADN de doble hebra (dsDNA) lista para su replicación y transcripción inmediatas. Véase, p. ej., D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254. Los AAV autocomplementario se describen en, p. ej., las patentes estadounidenses n.° 6,596,535; 7,125,717; y 7,456,683.
[0051] Si ha de producirse un AAV pseudotipado, las ITR se seleccionan de una fuente que difiere de la fuente de AAV de la cápside. Por ejemplo, pueden seleccionarse ITR de AAV2 para su uso con una cápside AAV que tenga una eficiencia particular para un receptor celular, tejido diana o diana viral seleccionados. En una realización, las secuencias de ITR de AAV2, o su versión eliminada (AITR), se utilizan por comodidad y para acelerar la aprobación reglamentaria. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otras fuentes de a Av . Si la fuente de las ITR es de a AV2 y la cápside AAV es de otra fuente de AAV, el vector resultante puede denominarse pseudotipado. Sin embargo, pueden utilizarse otras fuentes de ITR de AAV.
[0052] Se han descrito diversas cápsides de AAV. Se han descrito ampliamente los métodos para generar vectores AAV en la literatura y los documentos sobre pacientes, incluidos, p. ej., WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2. La fuente de cápsides de AAV puede seleccionarse de entre una AAV que se dirija a un tejido deseado. Por ejemplo, el AAV idóneo puede incluir AAV9 [US 7,906,111; US 2011-0236353-A1], rh10 [WO 2003/042397] y/o hu37 [véase, p. ej., US 7,906,111; US 2011-0236353-A1]. Sin embargo, otros AAV, incluidos, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, Aa V6, AAV7, AAV8, [patente estadounidense 7790449; patente estadounidense 7282199] y otros. Sin embargo, pueden seleccionarse otras fuentes de cápsides de AAV y otros elementos virales, así como otros constructos de inmunoglobulina y otros elementos de vector.
[0053] Se proporciona un vector viral AAV de hebra simple. Los métodos para generar y aislar vectores virales AAV adecuados para inserción en un sujeto son conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la patente estadounidense 7790449; la patente estadounidense 7282199; WO 2003/042397; WO 2005/033321, w O 2006/110689; y la patente estadounidense 7588772 B2]. En un sistema, una línea celulares productoras es temporalmente transfectada con un constructo que codifica el transgén flanqueado por los ITR y un constructo o constructos que codifican rep y cap. En un segundo sistema, una línea celular de empaquetado que proporciona establemente rep y cap es temporalmente transfectada con un constructo que codifica el transgén flanqueado por los ITR. En cada uno de estos sistemas, los viriones de AAV se producen en respuesta a la infección con adenovirus o herpesvirus ayudante, siendo necesaria la separación de los rAAVs de los virus contaminantes. Más recientemente se han desarrollado sistemas que no requieren infección con virus ayudante para recuperar el AAV - las funciones del ayudante necesarias (esto es, adenovirus E1, E2a, VA, y E4 o herpesvirus UL5, UL8, UL52, y UL29, y polimerasa de herpesvirus) también son proporcionadas, en trans, por el sistema. En estos sistemas más nuevos, las funciones del ayudante pueden ser llevadas a cabo por la transfección temporal de las células con constructos que codifican las funciones necesarias del ayudante, o las células pueden diseñarse para contener de forma estable genes que codifican las funciones del ayudante, cuya expresión puede controlarse a nivel transcripcional o postranscripcional. En otro sistema, el transgén flanqueado por las ITR y los genes rep/cap se introduce en células de insecto por infección con vectores basados en baculovirus. Para revisiones de estos sistemas de producción, véase, de forma general, p. ej., Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929, Los métodos para producir y usa estos y otros sistemas de producción de AAV también se describen en las siguientes patentes estadounidenses, 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; y 7,439,065.
USOS Y REGÍMENES
[0054] El rAAV, preferiblemente suspendido en un portador fisiológicamente compatible, puede administrarse a un paciente mamífero humano o no humano. Los portadores idóneos pueden ser fácilmente seleccionados por un experto en la técnica en base a la indicación a la que va dirigido el virus de transferencia. Por ejemplo, un portador idóneo incluye el salino, que puede formularse con diversas soluciones tamponadas (p. ej., salino tamponado con fosfato). Otros portadores ejemplares incluyen el salino estéril, la lactosa, la sacarosa, la maltosa y el agua. La selección del portador no es una limitación de la presente invención. Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del rAAV y el portador o portadores, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, como conservantes o estabilizadores químicos.
[0055] Los métodos para utilizar estos rAAV, p. ej., para inmunización pasiva, se describen en, p. ej., WO 2012/145572. Otros métodos de inserción y usos serán obvios para los expertos en la técnica. Por ejemplo, un régimen tal y como se describe aquí, puede comprender, además de una o más de las combinaciones aquí descritas, la combinación adicional con uno o más fármacos de molécula pequeña, un agente quimioterápico, potenciadores de la función inmune, radiación, cirugía y similares.
Un fármaco biológico, tal y como se describe aquí, se basa en un péptido, polipéptido, proteína, enzima, molécula de ácido nucleico, vector (incluidos los vectores virales) o similares.
[0056] En una terapia de combinación, el constructo de inmunoglobulina insertado a través de AAV aquí descrito se administra antes, durante o después de comenzar la terapia con otro agente, o cualquier otra combinación de dichos períodos, esto es, antes y durante, antes y después, durante y después o antes, durante y después de comenzar la terapia. Por ejemplo, el AAV puede administrarse entre 1 y 30 días, preferiblemente 3 y 20 días, más preferiblemente entre 5 y 12 días antes de comenzar la terapia de radiación. En otra realización de la invención, la quimioterapia se administra de forma concurrente con o, más preferiblemente, subsiguiente a la terapia (de anticuerpos) con inmunoglobulina mediada por AAV. En otras realizaciones, las composiciones de la invención pueden combinarse con otros productos biológicos, p. ej., fármacos de anticuerpos monoclonales recombinantes, conjugados anticuerpo-fármaco, o similares. Además, pueden utilizarse en dichos regímenes combinaciones de diferentes constructos de inmunoglobulina insertados a través de AAV como las comentadas más arriba.
[0057] Cualquier método o ruta idóneos para administrar composiciones que contengan AAV tal y como se describe aquí, y, opcionalmente, para coadministrar otros fármacos o terapias activos junto con los anticuerpos mediados por AAV aquí descritos. Las rutas de administración incluyen, por ejemplo, la administración sistémica, oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular.
[0058] Las dianas de los constructos de inmunoglobulina aquí descritos pueden seleccionarse de entre diversos patógenos, incluidos, p. ej., agentes infecciosos bacterianos, virales, fúngicos y parasitarios. Entre las dianas idóneas pueden además incluirse los antígenos del cáncer o asociados al cáncer o similares. Además, otras dianas pueden incluir una condición autoinmune, como la artritis reumatoide (AR) o la esclerosis múltiple (EM).
[0059] Ejemplos de dianas virales incluyen el virus de la influenza de la familia orthomyxovirudae, que incluye: Influenza A, Influenza B, e Influenza C. Los virus tipo A son los patógenos humanos más virulentos. Los estereotipos de influenza A que se han asociado con pandemias incluyen H1N1, que provocó la gripe española en 1918, y la gripe porcina en 2009; H2N2, que provocó la gripe asiática en 1957; H3N2, que provocó la gripe de Hong Kong en 1968; H5N1, que provocó la gripe aviar en 2004; H7N7; H1N2; H9N2; H7N2; H7N3; y H10N7.
[0060] Se han descrito anticuerpos de amplia neutralización contra la influenza A. Tal y como se utiliza aquí, un "anticuerpo de amplia neutralización" hace referencia a un anticuerpo neutralizante que puede neutralizar múltiples cepas de múltiples subtipos. Por ejemplo, el CR6261 [The Scripps Institute/ Crucell] ha sido descrito como un anticuerpo monoclonal que se une a una amplia gama de virus de la influenza, incluidos el de la "gripe española" de 1918 (SC1918/H1) y un virus de la clase H5N1 de la gripe asiática que pasó de un pollo a un ser humano en Vietnam en 2004 (Viet04/H5). El CR6261 reconoce una región hélice altamente conservada en el tronco proximal a la membrana de hemaglutinina, la proteína predominante en la superficie del virus de la influenza. Este anticuerpo se describe en WO 2010/130636. Otro anticuerpo neutralizante, el F10 [XOMA Ltd] se ha descrito como útil contra H1N1 y H5N1. [Sui et al, Nature Structural and Molecular Biology (Sui, et al. 2009, 16(3):265-73)] Pueden seleccionarse otros anticuerpos contra la influenza, como, p. ej., el Fab28 y el Fab49. Véanse, p. ej., WO 2010/140114 y WO 2009/115972. También pueden seleccionarse fácilmente otros anticuerpos como los descritos en WO 2010/010466, en la publicación de patente estadounidense US/2011/076265, y en WO 2008/156763.
[0061] Otros virus patogénicos diana incluyen arenavirus (incluidos los virus funina, machupo y Lassa), filovirus (incluidos los virus de Marburgo y del Ébola), hantavirus, picornavirus (incluidos rinovirus, echovirus), coronavirus, paramixovirus, morbillivirus, virus sincitial respiratorio, togavirus, coxsackievirus, parvovirus B19, parainfluenza, adenovirus, reovirus, variola (Variola major (viruela)) y Vaccinia (viruela bovina) de la familia poxvirus, y varicella-zoster (pseudorrabia).
[0062] Las fiebres hemorrágicas virales están provocadas por miembros de la familia arenaviridae (fiebre de Lassa) (la cual está también asociada a la coriomeningitis linfocítica (LCM)), filovirus (virus del Ébola), y hantavirus (puremala). Los picornavirus (una subfamilia de rinovirus), están asociados con el resfriado común en humanos. La familia del coronavirus, que incluye diversos virus no humanos como el virus de la bronquitis infecciosa (aves), el virus de la gastroenteritis transmisible porcina (cerdos), el virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdos), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos), el coronavirus entérico felino (gatos), el coronavirus canino (perros). Los coronavirus respiratorios humanos se han asociado putativamente con el resfriado común, la hepatitis no A, B o C, y el síndrome respiratorio agudo repentino (SARS). La familia de los paramixovirus incluye el virus parainfluenza tipo 1, virus parainfluenza tipo 3, virus parainfluenza bobina tipo 3, rubulavirus (virus de las paperas, virus parainfluenza tipo 2, virus parainfluenza tipo 4, virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), rinderpest, morbillivirus, que incluye el sarampión y el moquillo canino, y el neumovirus, que incluye el virus sincitial respiratorio (RSV). La familia de los parvovirus incluye el parvovirus felino (enteritis felina), el virus de la panleucopenia felino, el parvovirus canino y el parvovirus porcino. La familia de los adenovirus incluye los virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que provocan enfermedad respiratoria.
[0063] También puede seleccionarse para su uso en la presente invención constructo de anticuerpos neutralizantes contra un patógeno bacteriano. En una realización, el constructo de anticuerpos neutralizantes va dirigido contra la propia bacteria. En otra realización, el constructo de anticuerpos neutralizantes va dirigido contra una toxina producida por la bacteria. Ejemplos de patógenos de transmisión por vía aérea incluyen, p. ej., Neisseria meningitidis (meningitis), Klebsiella pneumonia (neumonía), Pseudomonas aeruginosa (neumonía), Pseudomonas pseudomallei (neumonía), Pseudomonas mallei (neumonía), Acinetobacter (neumonía), Moraxella catarrhalis, Moraxella lacunata, Alkaligenes, Cardiobacterium, Haemophilus influenzae (gripe), Haemophilus parainfluenzae, Bordetella pertussis (tos ferina), Francisella tularensis (neumonía/fiebre), Legionella pneumonia (enfermedad de los legionarios), Chlamydia psittaci (neumonía), Chlamydia pneumoniae (neumonía), Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis (TB)), Mycobacterium kansasii (TB), Mycobacterium avium (neumonía), Nocardia asteroides (neumonía), Bacillus anthracis (ántrax), Staphylococcus aureus (neumonía), Streptococcus pyogenes (escarlatina), Streptococcus pneumoniae (neumonía), Corynebacteria diphtheria (difteria), Mycoplasma pneumoniae (neumonía).
[0064] El agente causante del ántrax es una toxina producida por el Bacillius anthracis. Se han descrito los anticuerpos neutralizantes contra el antígeno protector (PA), uno de los tres péptidos que forman el toxoide. Los otros dos polipéptidos constan del factor letal (LF) y del factor edema (FE). Los anticuerpos neutralizantes anti-PA se han descrito como efectivos en inmunización pasiva contra el ántrax. Véase, p. ej., patente estadounidense número 7,442,373; R. Sawada-Hirai et al, J Immune Based Ther Vaccines. 2004; 2: 5. (on-line 2004 May 12). Además, se han descrito y/o pueden ser generados otros anticuerpos neutralizantes de la toxina de ántrax. Del mismo modo, pueden usarse anticuerpos neutralizantes contra otras bacterias y/o toxinas bacterianas para generar un constructo antipatógeno insertado mediante AAV tal y como se describe aquí.
[0065] Otras enfermedades infecciosas pueden estar causadas por hongos de transmisión por vía aérea, incluidos, p. ej., especies de Aspergillus, Absidia co- rymbifera, Rhixpus stolonifer, Mucor plumbeaus, Cryptococcus neoformans, Histoplasm capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, especies de Penicillium, Micropolyspora faeni, Thermoactinomyces vulgaris, Alternaria aternate, especies de Cladosporium, Helminthosporium, y especies de Stachybotrys.
[0066] Además, la inmunización pasiva puede utilizarse para prevenir las infecciones por hongos (p. ej., pie de atleta), tiña o virus, bacterias, parásitos, hongos y otros patógenos que pueden transmitirse por contacto directo. Asimismo, hay diversas condiciones que afectan a las mascotas, al ganado y a demás animales domésticos y a otros animales. Por ejemplo, en perros, la infección de las vías respiratorias superiores por aspergilosis nasosinusal provoca una enfermedad grave. En los gatos, la enfermedad respiratoria de las vías altas o el complejo respiratorio felino que se origina en la nariz provoca morbidez y mortandad si no se trata. El ganado es susceptible de sufrir infecciones causadas por rinotraqueítis bovina infecciosa (comúnmente llamada IBR o nariz roja), enfermedad vírica contagiosa y grave del ganado. El ganado tiene también tendencia a contraer el virus respiratorio sincitial bovino (BRSV), que provoca enfermedad respiratoria leve a grave y puede reducir la resistencia a otras enfermedades. Otros patógenos y enfermedades serán obvios para un experto en la técnica. Véase, p. ej., US 5,811,524, que describe la generación de anticuerpos neutralizantes del virus sincitial respiratorio (RSV). Las técnicas descritas aquí son aplicables a otros patógenos. Dichos anticuerpos pueden utilizarse intactos o con sus secuencias (andamio) modificadas para generar un constructo de anticuerpos neutralizantes recombinante o artificial. Dichos métodos ya se han descrito [véase, p. ej., WO 2010/13036; WO 2009/115972; WO 2010/140114].
[0067] Las inmunoglobulinas antineoplásicas tal y como se describen aquí pueden suministrar un receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER), como HER2. Por ejemplo, trastuzumab es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante IgG1 kappa que se une de forma selectiva con alta afinidad en un ensayo basado en células (Kd = 5 nM) al dominio extracelular de la proteína del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. El producto disponible en el mercado se ha producido en un cultivo celular CHO. Véase, p. ej. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00072. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras 1 y 2 y de las cadenas pesadas 1 y 2 de trastuzumab, así como las secuencias obtenidas de un estudio de la estructura por rayos X de trastuzumab, se proporcionan en esta base de datos con el número de identificación de la muestra DB00072. Véase también, 212-Pb-TCMC-trastuzumab [Areva Med, Bethesda, MD]. Otro anticuerpo de interés incluye, p. ej., pertuzumab, un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante que ataca el dominio de dimerización extracelular (Subdominio II) de la proteína 2 del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). Consta de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras con 448 y 214 residuos respectivamente. Aprobado por la FDA, 8 de junio de 2012. Las secuencias de aminoácidos de su cadena pesada y su cadena ligera se proporcionan, p. ej., en www.drugbank.ca/drugs/DB06366 (los sinónimos incluyen 2C4, MOAB 2C4, anticuerpo monoclonal 2C4, y rhuMAb-2C4) en esta base de datos bajo el número de identificación de la muestra DB06366. Además de HER2, pueden seleccionarse otras dianas de HER.
[0068] Por ejemplo, MM-121/SAR256212 es un anticuerpo monoclonal completamente humano que ataca el receptor de HER3 [Network Biology, Merrimack] y que se ha descrito como útil en el tratamiento del cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), el cáncer de mama y el cáncer de ovario. El SAR256212 es un anticuerpo monoclonal completamente humano en estudio de investigación que ataca al receptor de HER3 (ErbB3) [Sanofi Oncology]. Otro anticuerpo anti-Her3/EGFR es el RG7597 [Genentech], descrito como útil en cánceres de cabeza y cuello. También puede utilizarse otro anticuerpo, el margetuximab (o MGAH22), un anticuerpo monoclonal Fc-optimizado de última generación (mAb) dirigido al HER [MacroGenics].
[0069] Alternativamente, puede dirigirse a otros marcadores de la superficie celular de células epiteliales humanas y/u otros antígenos o receptores tumorales. Ejemplos de otras dianas de marcadores de la superficie celular incluyen, p. ej., 5T4, CA-125, CEA (p. ej., atacado por labetuzumab), CD3, CD19, CD20 (p. ej., atacado por rituximab), CD22 (p. ej., atacado por epratuzumab o veltuzumab), CD30, CD33, CD40, CD44, CD51 (también integrina avp3), CD133 (p. ej., células de glioblastoma), CTLA-4 (células de glioblastoma, Ipilimumab utilizado en el tratamiento, p. ej., del neuroblastoma) , Chemokine (C-X-C Motif) Receptor 2 (CXCR2) (expresado en diferentes regiones del cerebro; p. ej., el anticuerpo anti-CXCR2 (extracelular) #ACR-012 (Alomene Labs)); EpCAM, la proteína de activación de fibroblastos (FAP) [véase, p. ej., WO 2012020006 A2, cánceres de cerebro], receptor alfa de folato (p. ej., tumores cerebrales ependimarios en niños, cánceres de cabeza y cuello), receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGFR1) (véase, p. ej., WO2012125124A1 para la discusión del tratamiento de cánceres con anticuerpos anti-FGFR1), FGFR2 (véanse, p. ej., los anticuerpos descritos en WO2013076186A y WO2011143318A2), FGFR3 (véanse, p. ej., los anticuerpos descritos en US8187601 y WO2010111367A1), FGFR4 (véanse, p. ej., los anticuerpos anti-FGFR4 descritos en WO2012138975A1), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) (véanse, p. ej., los anticuerpos en WO2010119991A3), integrina asp1, receptor IGF-1, gangliósido GD2 (véanse, p. ej., los anticuerpos descritos en WO2011160119A2), gangliósido GD3, glicoproteína transmembrana NMB (GPNMB) (asociada a los gliomas, entre otros, y diana del anticuerpo glembatumumab (CR011), mucina, MUC1, fosfatidilserina (p. ej., atacada por bavituximab, Peregrine Pharmaceuticals, Inc], células del carcinoma prostático, PD-L1 (p. ej., nivolumab (BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), un gG4 completamente humano, p. ej., el melanoma metastásico], el receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas, alfa (PDGFR a) o CD140, glicoproteína 72 asociada a tumores (TAG-72), tenascina C, receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAIL-R2), factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF)-A (p. ej., atacado por bevacizumab) y VEGFR2 (p. ej., atacado por ramucirumab).
[0070] Otros anticuerpos y sus dianas incluyen, p. ej., APN301 (hu14.19-IL2), un anticuerpo monoclonal [melanoma maligno y neuroblastoma en niños, Apeiron Biologics, Vienna, Austria]. Véase, también, p. ej., el anticuerpo monoclonal, 8H9, descrito como útil para el tratamiento de tumores sólidos, incluido el cáncer de cerebro metastásico. El anticuerpo monoclonal 8H9 es un anticuerpo IgG1 de ratón con especificidad para el antígeno B7H3 [United Therapeutics Corporation]. Este anticuerpo de ratón puede ser humanizado. Pero pueden utilizarse en la invención otros constructos de inmunoglobulina dirigidos al antígeno B7-H3 y/o B7-H4. Otro anticuerpo es el S58 (anti-GD2, neuroblastoma). Cotara™ [Perregrince Pharmaceuticals] es un anticuerpo monoclonal descrito para el tratamiento del glioblastoma recurrente. Otros anticuerpos pueden incluir, p. ej., avastin, ficlatuzumab, medi-575, y olaratumab. Pero pueden seleccionarse otros constructos de inmunoglobulina o anticuerpos monoclonales para su uso en la invención. Véase, p. ej., Medicines in Development Biologics, 2013 Report, pp. 1 - 87, a publication of PhRMA's Communications & Public Affairs Department. (202) 835-3460.
[0071] Por ejemplo, los inmunogenes pueden seleccionarse de entre diversas familias de virus. Un ejemplo de familias de virus contra las cuales sería deseable una respuesta inmune incluye la familia picornavirus, que incluye los géneros rinovirus, que son responsables de aproximadamente el 50 % de los casos de resfriado común; los géneros enterovirus, que incluye los poliovirus, coxsackievirus, echovirus, y los enterovirus humanos como el virus de la hepatitis A; y los géneros aptovirus, responsable de las enfermedades de los pies y la boca, principalmente en animales no humanos. Dentro de la familia picornavirus de los virus, los antígenos diana incluyen VP1, VP2, VP3, VP4, y VPG. Otra familia de virus incluye la familia calcivirus, que comprende el grupo de virus Norwalk, que son un importante agente causante de la gastroenteritis epidémica. Pero otra familia de virus cuyo uso es deseable para atacar los antígenos diana para inducir las respuestas inmunes en animales humanos y no humanos es la familia togavirus, que incluye los géneros alfavirus, que incluye virus Sindbis, virus RossRiver, y el virus de la encefalitis equina venezonala, occidental y oriental, y rubivirus, incluido el virus Rubella. La familia flaviviridae incluye el dengue, la fiebre amarilla, la encefalitis japonesa, la encefalitis de San Luis y los virus de la encefalitis por picadura de garrapata. Se pueden generar otros antígenos diana a partir de la Hepatitis C o de la familia coronavirus, que incluye diversos virus no humanos como el virus de la bronquitis infecciosa (aves), el virus de la gastroenteritis transmisible porcina (cerdos), el virus de la encefalomielitis hemaglutinante porcina (cerdos), el virus de la peritonitis infecciosa felina (gatos), el coronavirus entérico felino, el coronavirus canino (perros), y los coronavirus respiratorios humanos, que pueden provocar el resfriado común y/o la hepatitis no A, B o C. Dentro de la familia coronavirus, los antígenos diana incluyen el E1 (también llamado M o proteína matriz), E2 (también llamado S o proteína espícula), E3 (también llamado HE o hemaglutina-elterosa) glicoproteína (no presente en todos los coronavirus), o N (nucleocápside). Pero pueden dirigirse otros antígenos contra la familia rhabdovirus, que incluye los géneros vesiculovirus (p. ej., el virus de la estomatitis vesicular), y los géneros lyssavirus (p. ej., la rabia).
[0072] Dentro de la familia del rhabdovirus, pueden derivarse antígenos idóneos de la proteína G o de la proteína N. La familia filoviridae, que incluye los virus de la fiebre hemorrágica, como los virus de Marburgo y del Ébola, puede ser una fuente adecuada de antígenos. La familia paramyxovirus incluye el virus parainfluenza tipo 1, el virus parainfluenza tipo 3, el virus parainfluenza bobina tipo 3, rubulavirus (virus de las paperas, virus parainfluenza tipo 2, virus parainfluenza tipo 4, virus de la enfermedad de Newcastle (pollos), rinderpest, morbillivirus, que incluye el sarampión y el moquillo canino, y el neumovirus, que incluye el virus sincitial respiratorio. El virus influenza se clasifica dentro de la familia orthomyxovirus y es una fuente idónea de antígenos (p. ej., la proteína HA, la proteína N1). La familia bunyavirus incluye los géneros bunyavirus (encefalitis de California, La Crosse), phlebovirus (fiebre del Valle del Rift), hantavirus (el puremala es un virus de fiebre la hemahagina), nairovirus (enfermedad ovina de Nairobi) y varios bungavirus no asignados. La familia arenavirus proporciona una fuente de antígenos contra LCM y el virus de la fiebre Lassa. La familia reovirus incluye los géneros reovirus, rotavirus (que provoca gastroenteritis aguda en niños), orbivirus, y cultivirus (fiebre por picadura de garrapata de Colorado, Lebombo (humanos), encefalosis equina, lengua azul).
[0073] La familia retrovirus incluye la subfamilia oncorivirinal, que comprende enfermedades humanas y veterinarias como el virus de la leucemia felina, HTLVI y HTLVII, lentivirinal (que incluye el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la anemia infecciosa equina, y spumavirinal. Entre los lentivirus, se han descrito muchos antígenos idóneos ya pueden seleccionarse fácilmente como dianas. Los ejemplos de antígenos IVH y VIS adecuados incluyen, sin límite, las proteínas gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef, y Rev, así como varios fragmentos de las mismas. Por ejemplo, fragmentos adecuados de la proteína Env pueden incluir cualquiera de sus subunidades, como gp120, gp160, gp4, o fragmentos más pequeños de la misma, p. ej., de al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud. De forma similar, pueden seleccionarse fragmentos de la proteína tat. [Véase la patente estadounidense 5.891.994 y la patente estadounidense 6.193.981.] Véanse también, las proteínas de VIH y VIS descritas en D.H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (March 2001), y R.R. Amara, et al, Science, 292:69-74 (6 April 2001). En otro ejemplo, pueden usarse péptidos o proteínas inmunogénicas de VIH y/o VIS para formar proteínas de fusión u otras moléculas inmunogénicas. Véanse, p. ej., los regímenes de inmunización y las proteínas de fusión Tat y/o Nef VIH-1 descritos en WO 01/54719, publicado el 2 de agosto de 2001, y WO 99/16884, publicado el 8 de abril de 1999. La invención no está limitada a los péptidos o a las proteínas inmunogénicas de VIH y/o VIS aquí descritos. Además, se han descrito o podrían ser realizadas fácilmente por un experto en la técnica diversas modificaciones a estas proteínas. Véase, p. ej., la proteína gag modificada que se describe en la patente estadounidense 5.972.596.
[0074] La familia papovavirus incluye la subfamilia de los polyomavirus (virus BKU y JCU) y la subfamilia de los papilomavirus (asociados a cánceres o progresiones malignas de papiloma). La familia de los adenovirus incluye los virus (EX, AD7, ARD, O.B.) que provocan enfermedad respiratoria y/o enteritis. La familia de los parvovirus incluye el parvovirus felino (enteritis felina), el virus de la panleucopenia felino, el parvovirus canino y el parvovirus porcino. La familia herpesvirus incluye la subfamilia alphaherpesvirinae, que comprende los géneros simplexvirus (HSVI, HSVII), varicellovirus (pseudorrabia, varicella-zoster) y la subfamilia betaherpesvirinae, que incluye los géneros citomegalovirus (HCMV, muromegalovirus) y la subfamilia gammaherpesvirinae, que incluye los géneros lymphocryptovirus, EBV (linfoma de Burkitts), rinotraqueítis infecciosa, el virus de la enfermedad de Marek, y el rhadinovirus. La familia poxvirus incluye la subfamilia chordopoxvirinae, que comprende los géneros orthopoxvirus (Variola (viruela) y Vaccinia (viruela bovina)), parapoxvirus, avipoxvirus, capripoxvirus, leporipoxvirus, suipoxvirus, y la subfamilia entomopoxvirinae. La familia hepadnavirus incluye el virus de la Hepatitis B. Un virus sin clasificar que puede ser una fuente idónea de antígenos es el virus de la Hepatitis delta. Otras fuentes virales pueden incluir el virus de la enfermedad de bursitis infecciosa de las aves y el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino. La familia alphavirus incluye el virus de la arteritis equina y varios virus de la Encefalitis.
[0075] Otras dianas patogénicas para anticuerpos pueden incluir, p. ej., bacterias, hongos, microorganismos parasitarios o parásitos multicelulares que infectan a los vertebrados humanos y no humanos, o de una célula cancerígena o tumoral. Los ejemplos de patógenos bacterianos incluyen los cocos gram-positivos patogénicos, que incluyen neumococos; estafilococos y estreptococos. Los cocos gram-negativos patogénicos incluyen meningococo; gonococo. Los bacilos entéricos gram-negativos patogénicos incluyen enterobacteriaceae; pseudomonas, acinetobacteria y eikenella; melioidosis; salmonella; shigella; haemophilus; moraxella; H. ducreyi (que provoca chancroide); brucella; Franisella tularensis (que provoca tularemia); yersinia (pasteurella); streptobacillus moniliformis y spirillum; Los bacilos grampositivos incluyen listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathiae; Corynebacterium diphtheria (difteria); cólera; B. anthracis (ántrax); donovanosis (granuloma inguinal); y bartonelosis. Las enfermedades ocasionadas por bacterias anaeróbicas patogénico incluyen tétanos; botulismo; otros clostridios; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Las enfermedades espiroquetales patogénicas incluyen sífilis; treponematosis: sífilis pian, pinta y endémica; y leptospirosis. Otras infecciones causadas por bacterias patogénicas superiores y hongos patogénicos Incluyen actinomycosis; nocardiosis; criptococosis, blastomicosis, histoplasmosis y cocidioidomicosis; candidiasis, aspergilosis, y mucormicosis; esporotricosis; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, torulopsosis, micetoma y cromomicosis; y dermatofitosis. Las infecciones por Rickettsia incluyen la fiebre del Tifus, la fiebre de las Montañas Rocosas, la fiebre Q, y Rickettsiosis. Los ejemplos de infecciones por Chlamydia y micoplasma incluyen: neumonías por micoplasma; linfogranuloma venéreo; psittacosis; e infecciones perinatales por Chlamydia. Las eucariotas patogénicas comprenden los protozoos patogénicos y los helmintos y las infecciones producidas así incluyen: amebiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; Pneumocystis carinii; Trichans; Toxoplasma gondii; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquistosomiasis; infecciones ocasionadas por nemátodos; infecciones ocasionadas por tremátodos o duelas; e infecciones ocasionadas por céstodos (tenia).
[0076] Muchos de estos organismos y/o toxinas así producidos han sido identificados por los centros de control de enfermedades [Centres for Disease Control (CDC), Department of Health and Human Services, USA] como agentes con potencial para uso en ataques biológicos. Por ejemplo, algunos de estos agenes biológicos incluyen Bacillus anthracis (ántrax), Clostridium botulinum y su toxina (botulismo), Yersinia pestis (peste), variola major (viruela), Francisella tularensis (tularemia), y fiebres hemorrágicas virales [filovirus (p. ej., Ébola, Marburgo], y arenavirus [p. ej., Lassa, Machupo]), todos ellos actualmente clasificados como agentes de Categoría A; Coxiella burnetti (fiebre Q); especies de Brucella (brucelosis), Burkholderia mallei (muermo), Burkholderia pseudomallei (meloidosis), Ricinus communis y su toxina (toxina ricina), Clostridium perfringens y su toxina (toxina épsilon), especies de Staphylococcus y sus toxinas (enterotoxina B), Chlamydia psittaci (psitacosis), ataques contra la seguridad del agua (p. ej., Vibrio cholerae, crytosporidium parvum), fiebre del tifus (rickettsia powazelii), y encefalitis viral (alfavirus, p. ej., encefalitis equina venezolana; encefalitis equina oriental; encefalitis equina occidental), todos los cuales están actualmente clasificados como agentes de Categoría B; y el virus Nipan y los hantavirus, que están actualmente clasificados como agentes de categoría C. Además, pueden identificarse otros organismos que están clasificados de ese modo o de forma diferente y/o utilizarse para tales fines en el futuro. Se comprenderá fácilmente que los vectores virales y otros constructos aquí descritos son útiles para suministrar antígenos a partir de esos organismos, virus, sus toxinas u otros subproductos, que evitarán y/o tratarán la infección u otras reacciones adversas con esos agentes biológicos.
[0077] Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no constituyen limitación de la invención aquí descrita.
EJEMPLO 1: GENERACIÓN DE VECTORES QUE CONTIENEN CASETES DE COEXPRESIÓN DE ANTICUERPOS DE LONGITUD COMPLETA
[0078] Se prepararon una serie de cis-plásmidos para su uso para generar una partícula viral de AAV que contiene una molécula de ácido nucleico para inserción en una célula diana huésped. Las moléculas de ácido nucleico comprenden secuencias de ITR 5' y 3' ITR de AAV2 y cada término, un potenciador de CMV compartido flanqueado por dos casetes de expresión en sentidos opuestos, donde un primer casete de expresión es controlado por un primer promotor de CMV mínimo y un segundo casete de expresión es controlado por un segundo promotor de CMV mínimo. Todas las secuencias ubicadas entre los ITR de AAV2 fueron sintetizadas de novo por un proveedor comercial (GeneArt). Todas las secuencias para los dominios variables de inmunoglobulina estaban flanqueadas por enzimas de restricción únicas para permitir un barajado conveniente de los dominios variables deseados. Para crear constructos con secuencias de cadena ligera heteróloga (kgl), se sintetizó de novo una secuencia de codificación que codificaba una cadena ligera germinal (IGKV4-1*01) y se utilizó para sustituir la secuencia ligera variable FI6.
[0079] Se ilustra una lanzadera de coexpresión de anticuerpos ejemplar en la Fig. 2. Esta lanzadera contiene a la izquierda del potenciador un primer casete de expresión que contiene, de derecha a izquierda, un promotor mínimo de CMV, una secuencia líder IL2 heteróloga unida a un dominio pesado variable (VH) de anticuerpo (1A6) anti-TSG101, un dominio CH'1, y un dominio CH'2-3 que se ha optimizado para expresión en humanos, y una poliA sintética. A la derecha del potenciador se encuentra un promotor mínimo de CMV, una secuencia líder IL2 heteróloga, un dominio de cadena ligera variable (anticuerpo anti-influenza) FI6k2 y un dominio constante de cadena ligera, un sitio de escisión de furina, el conector 2a del virus de la enfermedad boca-pie, una secuencia líder IL2, Fi6v3 VH, CH1, CH2-3, y una secuencia de poliA corta quinasa timidina. Las designaciones CH hacen referencia al alotipo de anticuerpo conocido G1m17,1.
[0080] SEQ ID NO: 1 proporciona secuencias de las regiones constantes de FI6. Las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera de aminoácidos de FI6 se proporcionan en SEQ ID NO: 2.
[0081] El cis-plásmido de FIG2 se utilizó en un método de transfección triple según se ha descrito previamente en, p. ej., la solicitud de patente estadounidense n.° 12/226,558, para generar vectores de AAV8 y AAV9 que se emplearon en subsiguientes estudios aquí descritos. El plásmido resultante, pN509_ACE Fi6-1A6 MAB_p3160, es de 7722 bp de longitud, y su secuencia se proporciona en SEQ ID NO: 3. También se proporcionan las secuencias codificadas para la cadena ligera variable (VL) de FI6 [SEQ ID NO:4], cadena pesada variable de FI6 [SEQ ID NO: 5], CH1 (SEQ ID NO: 6), CH2-3 [SEQ ID NO: 7].
[0082] Se generaron cis-plásmidos de coexpresión de anticuerpos similares mediante la subclonación de un anticuerpo de gripe estacional (CR8033) o un anticuerpo de gripe pandémica (C05), o un anticuerpo anti-M2e (TCN-032) en el lugar del dominio variable pesado de 1A6 en la Fig. 2 empleando sitios de restricción única preposicionados que permiten el barajado de los dominios variables. Estos cis-plásmidos se emplearon, a su vez, en la transfección triple (p. ej., realizada tal y como se describe en la Solicitud de patente estadounidense n.° 12/226,588) para generar vectores de AAV8 y AAV9 empleados para estudios subsiguientes. Las secuencias para el transporte de MAB pN510_ACE Fi6-C05 se proporcionan en SEQ ID NO:8; la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable se proporciona en SEQ ID NO: 9, la cadena ligera constante se proporciona en SEQ ID NO: 10, la cadena pesada variable de Fl6 se proporciona en SEQ ID NO: 11, el CH1 se proporciona en SEQ ID NO: 12 y el CH2-3 se proporciona en SEQ ID NO: 13.
[0083] Las secuencias para el transporte de MAB pN514_ACE Fi6-C05 se proporcionan en SEQ ID NO:19; la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera constante se proporciona en SEQ ID NO: 20, la cadena pesada variable de FI6 se proporciona en SEQ ID NO: 21, el CH1 se proporciona en SEQ ID NO: 22 y el CH2-3 se proporciona en SEQ ID NO: 23. Estas lanzaderas se emplearon a su vez para generar vectores de AAV8 y AAV9 que se utilizaron para estudios subsiguientes.
EJEMPLO 2: CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS EXPRESADOS A PARTIR DE VECTORES DE AAV8 QUE COEXPRESAN ANTICUERPO MONOCLONAL F16 (MAB) Y MAB IA6
[0084] Se realizaron una serie de ensayos ELISA para caracterizar los niveles de expresión y evaluar la unión del FI6 del MAB coexpresado con el MAB IA6 a partir de cis-plásmido generado tal y como se describe en el Ejemplo 1 tras la transfección en células HEK 293. Se sintetizó el péptido TSG101 utilizando química f-Moc mediante Mimotopos. Todos los antígenos de gripe se obtuvieron de un proveedor comercial, Immune Technologies, Inc. La proteína A se adquirió de Sigma-Aldrich y se utilizó para monitorizar la expresión de IgG1 totalmente humano. La detección de IgG1 humano en los sobrenadantes del cultivo tisular se midió mediante ELISA de captura de proteína A o antígeno específico. Las placas ELISA de alta fijación se recubrieron con 2 mg/ml de proteínas HA o péptidos, o con 5 mg/ml de proteína A diluida en PBS e incubada durante la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron 5-8 veces y se bloquearon con 1 mM EDTA, PBS inactivado por calor al 5 %, Tween 20 al 0,07 % en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los sobrenadantes del cultivo tisular se añadieron a las placas en varias diluciones en duplicados y se incubaron a 37 °C durante una hora. Las placas se lavaron, se bloquearon y se añadió anticuerpo IgG anti-humano Cabra AffiniPure Bioconjugado SP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) en dilución 1:10.000. Tras una hora, se lavaron las placas y se añadió conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano picante (HRP) en dilución 1:30.000. Tras una hora, se lavaron las placas y se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La reacción se paró tras 30 minutos a temperatura ambiente utilizando ácido sulfúrico 2N y se leyeron las placas a 450 nm utilizando un lector de placas BioTek mQuant (Winooski, VT, USA).
[0085] Tal y como se esperaba, no se observó fijación del FI6 al péptido TSG101, e1HA (B/Malaysia/2506/2/004), o e1HA (solo región cabeza de la cepa influenza A/Brisbane/59/2007). Se observa fijación de FI6 para esta misma cepa de influenza cuando está presente el HA de longitud completa, así como para la cepa de influenza HA(dTM)(A/Beijing/01/2009, H1N1)). Tal y como se esperaba, también se observa fijación de FI6 para la proteína A.
[0086] De acuerdo con informes publicados, el FI6 producido de acuerdo con los métodos de la técnica anterior se fija a HA de longitud completa y al tronco de la HA, pero no a la región solo cabeza. Estos datos demuestran que el anticuerpo monoclonal FI6 coexpresado retiene su perfil de fijación característico.
EJEMPLO 3: CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS EXPRESADOS A PARTIR DE VECTORES DE AAV8 QUE COEXPRESAN EL ANTICUERPO MONOCLONAL F16 (MAB) Y EL MAB DE LA GRIPE PANDÉMICA C05
[0087] La posibilidad de detección diferencial de dos anticuerpos monoclonales diferentes se evaluó en un ensayo de captura. Se evaluó la fijación de los anticuerpos monoclonales FI6 y C05 coexpresados a partir de un cis-plásmido preparado tal y como se describe en el Ejemplo 1 y transfectados en células HEK293. Se espera que el FI6 se fije a HA de longitud completa y al tronco de la HA, pero no a la región solo cabeza. Los resultados del estudio de fijación ilustrados en la Fig. 3 demuestran que los anticuerpos coexpresados retienen su fijación característica. Más concretamente, se observó la unión prevista a la HA de longitud completa y al tronco de la HA característica de FI6 y la unión a la HA y solo a la cabeza de la HA (no al tronco) característica de C05. Se realizaron ensayos ELISA tal y como se describe en el Ejemplo 2.
EJEMPLO 4: CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS EXPRESADOS A PARTIR DE VECTORES DE AAV8 QUE COEXPRESAN ANTICUERPO MONOCLONAL F16 (MAB) Y UN SEGUNDO MAB DE LONGITUD COMPLETA
[0088] Los ratones RAG KO macho de 6-8 semanas de edad (The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME, USA) se alojaron en condiciones libres de patógenos en los laboratorios Translational Research Laboratories de la Universidad de Pennsylvania. Todos los protocolos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee. Se sacrificó a los ratones por asfixia con dióxido de carbono y se confirmó su muerte por dislocación cervical. Para administrar el vector, se anestesió a los ratones con una mezcla de 70 mg/kg de peso corporal de ketamina y 7 mg/kg de peso corporal de xilacina mediante una inyección intraperitoneal (IP). Los vectores se diluyeron en salino tamponado con fosfato (PBS) y las inyecciones IM se aplicaron utilizando una jeringuilla Hamilton. El suero se recogió semanalmente mediante sangrados retro-orbitales. La detección de IgG1 humano en los sobrenadantes del cultivo tisular se midió mediante ELISA de captura de proteína A. Las placas ELISA de alta fijación se recubrieron con 5 mg/ml de proteína A diluida en PBS e incubada durante la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron 5-8 veces y se bloquearon con 1 mM EDTA, PBS inactivado por calor al 5 %, Tween 20 al 0,07 % en PBS. Las muestras séricas de ratón se inactivaron por calor y se añadieron a las placas en varias diluciones en duplicados y se incubaron a 37 °C durante una hora. Las placas se lavaron, se bloquearon y se añadió anticuerpo IgG anti-humano Cabra AffiniPure Bioconjugado SP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) en dilución 1:10.000. Tras una hora, se lavaron las placas y se incubaron con conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano picante (HRP) en dilución 1:30.000. Tras una hora, se lavaron las placas y se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La reacción se paró tras 30 minutos a temperatura ambiente utilizando ácido sulfúrico 2N y se leyeron las placas a 450 nm utilizando un lector de placas BioTek mQuant (Winooski, VT, USA).
[0089] La Fig. 5 ilustra los niveles de expresión sistémicos para IgG1 totalmente humano en ratones a los que se ha administrado un vector AAV que coexpresa FI6 con un anticuerpo IA6. Los ratones fueron inyectados por vía intramuscular a dosis de 1 x 1011 copias del genoma (GC) o 1 x 1010 GC. Se evaluaron los niveles de expresión los días 7, 15, 21,28, 34, 42, 49 y 56 y se midieron a una concentración de microgramos/mL. Se observó un aumento en la expresión dependiente de la dosis.
EJEMPLO 5: CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS EXPRESADOS A PARTIR DE VECTORES DE AAV8 QUE COEXPRESAN EL ANTICUERPO MONOCLONAL FI6 (MAB) Y TRES ANTICUERPOS MONOCLONALES DE LONGITUD COMPLETA DIFERENTES
[0090] Las tablas que aparecen más abajo muestran los niveles de expresión en ratones a los que se les ha administrado un vector AAV que coexpresa FI6 con anticuerpo monoclonal de longitud completa CR8033, C05 o 1A6. Los ratones knockout (KO) fueron inyectados por vía intramuscular a dosis de 1 x 1011 copias del genoma (GC) o 1 x 1010 GC tal y como se describe en el ejemplo anterior. Se evaluaron los niveles de expresión semanalmente los días 7, 15, 21, 28, 34, 42, y 49 y se midieron a una concentración de microgramos/mL. Se observó un aumento en la expresión dependiente de la dosis para los anticuerpos expresados. El antígeno de captura utilizado para el ensayo es proteína A ELISA, tal y como se describe en el ejemplo anterior.
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EJEMPLO 6: EL EFECTO ANTIVIRAL SE CONFIERE MEDIANTE ANTICUERPOS DE LONGITUD COMPLETA DUALES EXPRESADOS DESDE UN VECTOR AAV9 Y/IO AAV8 ÚNICO INTRAMUSCULARMENTE
A. AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb y exposición a influenza A
[0091] Los ratones BALB/c fueron inyectados por vía intramuscular con AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb insertado intramuscularmente (IM) a 1 x 1011 GC. Dos semanas después, los ratones se expusieron por vía intranasal a 5LD50 de PR8 (influenza A) adaptado al ratón. El círculo representa el constructo AAV9 con un promotor bidireccional que expresa anticuerpos monoclonales sintéticos FI6 y CR8033 con la misma cadena ligera heteróloga. El cuadrado representa un control positivo, esto es, AAV9 que expresa un solo tipo de anticuerpo FI6 también insertado a 1 x 1011 GC, y el triángulo representa animales que no han recibido tratamiento. La Fig. 6B muestra la supervivencia tras la exposición. La administración de AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb a 1011 GC/dosis ratón permitió la protección parcial con un retraso significativo en la pérdida de peso.
AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb y exposición a influenza B
[0092] Para la inyección del vector de AAV9: se anestesió a los ratones BALB/c hembra mediante inyección intramuscular de una mezcla 100 mg/kg de ketamina / 10 mg/kg de xilacina en PBS, y se inyectó el vector AAV9.BiD.FI6_CR8033mAb por vía intramuscular (IM) a 1 x 1011 GC por ratón. El vector BiD se comparó a un AAV9 que expresa un solo tipo de anticuerpo CR8033 también insertado a 1 x 1011 GC, y un control negativo (animales que no han recibido tratamiento). La Fig. 7b muestra la supervivencia tras la exposición. Para la exposición a influenza, dos semanas tras el tratamiento con el vector, los ratones tratados con AAV y los que no habían recibido tratamiento fueron pesados y se codificaron por colores sus colas, se los anestesió tal y como se describe arriba, se los suspendió por sus incisivos con sus patas traseras apoyadas en una plataforma, y se les administró por vía intranasal 5LD50 de B/Lee/40 (influenza B) en un volumen total de 50ml de PBS tal y como se describe arriba. Se pesó a los ratones a diario y se los monitorizó para signos de enfermedad o sufrimiento. Los animales que exhibían signos comportamentales de sufrimiento o pérdida del 30 % de su peso corporal inicial fueron eutanasiados mediante asfixia por CO2.
[0093] La Fig. 7A es una gráfica de líneas que muestra el cambio porcentual en peso. Estos datos muestran que el efecto protector completo fue conferido por los anticuerpos expresados duales a esta dosis. La Fig. 7B muestra la supervivencia tras la exposición.
Vectores AAV8.FI6-TCN032, AAV8.FI6-1A6, y AAV8.FI6-CR8033 administrados IM y exposición a PR8 de influenza A adaptada al ratón.
[0094] Estos vectores se realizaron tal y como se describe en el Ejemplo 1. Los ratones RAG KO macho de 6-8 semanas de edad (The Jackson Laboratory Bar Harbor, ME, USA) se alojaron en condiciones libres de patógenos en los laboratorios Translational Research Laboratories de la Universidad de Pennsylvania. Todos los protocolos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Institutional Animal Care and Use Committee. Para administrar el vector, se anestesió a los ratones con una mezcla de 70 mg/kg de peso corporal de ketamina y 7 mg/kg de peso corporal de xilacina mediante una inyección intraperitoneal (IP). Los vectores se diluyeron en salino tamponado con fosfato (PBS) y las inyecciones IM se aplicaron utilizando una jeringuilla Hamilton. El suero se recogió semanalmente mediante sangrados retro-orbitales.
[0095] La detección de IgG1 humano en los sobrenadantes del cultivo tisular se midió mediante ELISA de captura de proteína A. Las placas ELISA de alta fijación se recubrieron con 5 mg/ml de proteína A diluida en PBS e incubada durante la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron 5-8 veces y se bloquearon con 1 mM EDTA, PBS inactivado por calor al 5 %, Tween 20 al 0,07 % en PBS. Las muestras séricas de ratón se inactivaron por calor y se añadieron a las placas en varias diluciones en duplicados y se incubaron a 37 °C durante una hora. Las placas se lavaron, se bloquearon y se añadió anticuerpo IgG anti-humano Cabra AffiniPure Bioconjugado SP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA, USA) en dilución 1:10.000. Tras una hora, se lavaron las placas y se incubaron con conjugado de estreptavidina peroxidasa de rábano picante (HRP) en dilución 1:30.000. Tras una hora, se lavaron las placas y se añadió 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La reacción se paró tras 30 minutos a temperatura ambiente utilizando ácido sulfúrico 2N y se leyeron las placas a 450 nm utilizando un lector de placas BioTek mQuant (Winooski, VT, USA).
[0096] Con referencia a la Fig. 8C, en todos los paneles, los niveles de expresión se indican el día 56 tras la administración del vector. Un par de días después del último sangrado orbital, el día 56, los ratones fueron pesados y se codificaron por colores sus colas, se los anestesió tal y como se describe arriba, se los suspendió por sus incisivos con sus patas traseras apoyadas en una plataforma, y se les administró por vía intranasal 5LD50 de PR8 (influenza A) adaptado al ratón en un volumen total de 50ml de PBS tal y como se describe arriba. Se pesó a los ratones a diario y se los monitorizó para signos de enfermedad o sufrimiento. Los animales que exhibían signos comportamentales de sufrimiento o pérdida del 30 % de su peso corporal inicial fueron eutanasiados mediante asfixia por CO2 y se confirmó su muerte por dislocación cervical. La Fig. 8A muestra que la expresión sistémica de una cantidad tan ínfima como 25 mg/ml de anticuerpo anti-influenza es suficiente para proporcionar protección en la exposición a PR8, pero la expresión de 0,4 mg/ml es insuficiente para proporcionar protección.
AAV9. FI6_IA6 mAbs y exposición a Influenza A
[0097] Se evaluaron un vector AAV9 que expresa el FI6 artificial y una inmunoadesina anti-VIH, IA6, para protección contra la exposición a la influenza A, tal y como se ha descrito más arriba. La Fig. 8B muestra que la expresión de 36,5 mg/ml de anticuerpo anti-influenza es suficiente para proporcionar una protección completa contra la exposición a PR8. La Fig. 8C muestra que la expresión de 6,9 ug/ml de anticuerpos anti-influenza no es suficiente para la protección contra la exposición a PR8.
EJEMPLO 8 - GENERACIÓN DE VECTORES QUE CONTIENEN DOS CASETES DE COEXPRESIÓN DE INMUNOADESINA
[0098] Usando un vector lanzadera similar al ilustrado en la Fig. 2, se han generado vectores que contienen dos inmunoadesinas.
[0099] En una realización, se creó un vector que contiene las inmunoadesinas FI6 y C05. Las secuencias de un plásmido que transporte los casetes de expresión de inmunoadesina FI6 y C05 se proporcionan en SEQ ID NO: 36; con las secuencias codificadas traducidas proporcionadas en SEQ ID NO: 37 (cadena pesada variable FI6), SEQ ID NO: 38 (cadena ligera variable FI6), y SEQ Id NO: 39 (CH2-3). Estas secuencias y sus características se incorporan por referencia.
[0100] En otra realización, se creó un vector que contiene las inmunoadesinas FI6 y CR8033. Las secuencias de un plásmido que contiene las inmunoadesinas FI6 y CR8033 se proporcionan en SEQ ID NO:40; con las secuencias codificadas traducidas proporcionadas en SEQ ID NO: 41 (VH FI6) y SEQ ID NO: 42 (cadena ligera variable FI6). Estas secuencias y sus características se incorporan por referencia.
[0101] El AAV se puede generar a partir de los plásmidos lanzadera de inmunoadesina descritos más arriba usando técnicas conocidas para los expertos en la técnica.
[0102] Los plásmidos lanzadera ilustrativos adicionales son los siguientes.
[0103] Se proporciona la secuencia de un plásmido pN512_ACE FI6v3kg1-1A6 MAB_p3184 que contiene una cadena ligera de línea germinal kappa que es heteróloga para la fuente de las dos cadenas pesadas, 1A6 y FI6v3 en SEQ ID NO: 14. Se proporcionan las secuencias codificadas traducidas en SEQ ID NO: 15 (ligera constante), SEQ ID NO: 16 (FI6 pesada variable), SEQ ID NO: 17 (CHI), y SEQ ID NO: 18 (CH2-3).
[0104] Se proporcionan las secuencias de un vector intermedio que transporta las inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada TCN032 en SEQ ID NO: 30. Las secuencias de aminoácidos traducidas codificadas mediante este plásmido incluyen la cadena pesada TCN032 en SEQ ID NO: 31; la secuencia CH1 en SEQ ID NO: 32; la cadena FI6 VH en SEQ ID NO: 33; la secuencia CH1 en SEQ ID NO: 34 y la secuencia CH2-3 en SEQ ID NO: 35.
[0105] Se proporciona la secuencia de un plásmido que transporta las cadenas pesadas TCN032 y FI6 y coexpresa dos anticuerpos que tienen estas especificidades en SEQ ID NO: 43. Los aminoácidos traducidos de la cadena pesada variable TCN032 se encuentran en Se Q ID NO: 44, el CH1 se encuentra en SEQ ID NO: 45, la bisagra CH2'-CH3' se encuentra SEQ ID NO: 46, la Fi6 VH se encuentra en SEQ ID NO: 47, el CH1 se encuentra en SEQ ID NO: 48, el CH2-3 está en SEQ ID NO: 49, y el gen de resistencia a la ampicilina está en SEQ ID NO: 50. Estas secuencias y sus características se incorporan aquí por referencia.
(Texto libre Listado de secuencias)
[0106] La siguiente información se proporciona para secuencias que contienen texto libre con el identificador numérico <223>.
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Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un virus adenoasociado recombinante (AAV) con una cápside AAV que comprende un ácido nucleico heterólogo empaquetado que expresa dos anticuerpos funcionales en una célula, donde el AAV recombinante comprende:
una repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV;
un primer casete de expresión que codifica al menos un primer marco abierto de lectura (ORF) para una primera inmunoglobulina bajo el control de de secuencias reguladoras de control que dirigen su expresión;
un segundo casete de expresión que comprende un segundo ORF, un conector y un tercer ORF bajo el control de secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión del mismo, donde el segundo y el tercer ORF se codifican para un segundo y tercer constructo de inmunoglobulina; y
una ITR 3' de AAV, conforme a lo cual se codifican una cadena ligera de inmunoglobulina, una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina.
2. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el AAV recombinante expresa además un anticuerpo biespecífico.
3. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el AAV recombinante comprende un potenciador bidireccional ubicado entre el primer casete de expresión y el segundo casete de expresión.
4. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el primer ORF codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, el segundo ORF codifica una primera cadena pesada de inmunoglobulina y el tercer ORF codifica una segunda cadena pesada, conforme a lo cual los constructos de anticuerpos funcionales expresados poseen dos cadenas pesadas diferentes con diferentes especificidades que comparten una cadena ligera.
5. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde al menos uno de entre el segundo y el tercer ORF contienen secuencias de codificación de Fc modificadas.
6. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el conector del segundo casete comprende un conector seleccionado desde un IRES o un F2A.
7. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde las secuencias reguladoras de control para el primer casete de expresión y/o el segundo casete comprenden un promotor mínimo.
8. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde las secuencias reguladoras de control para el primer casete de expresión y/o el segundo casete comprenden un poliA sintético o mínimo.
9. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el primer casete de expresión es bicistrónico y comprende más ORF.
10. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, donde cada uno de los ORF comprende un scFv.
11. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde el vector comprende un poliA bidireccional entre el primer casete de expresión y el segundo casete de expresión.
12. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, donde el primer casete de expresión comprende un potenciador y un promotor mínimo.
13. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 12, donde el segundo casete de expresión comprende un potenciador y un promotor mínimo.
14. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, donde los casetes de expresión primero y segundo juntos expresan dos FAB.
15. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde los dos anticuerpos monoespecíficos poseen diferentes especificidades.
16. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, donde los dos anticuerpos monoespecíficos son seleccionados independientemente desde un anticuerpo monoclonal, una inmunoadesina, un FAB, un anticuerpo bifuncional, y sus combinaciones.
17. Un virus adenoasociado (AAV) recombinante con una cápside de AAV y en el que hay un ácido nucleico heterólogo empaquetado que expresa dos anticuerpos monoespecíficos funcionales, donde el AAV recombinante expresa un primer anticuerpo monoclonal con una primera especificidad, un segundo anticuerpo monoclonal con una especificidad diferente de la del primer anticuerpo monoclonal, y un anticuerpo biespecífico, y donde el AAV recombinante comprende:
una repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV;
un primer casete de expresión que codifica al menos un primer marco abierto de lectura (ORF) para una primera inmunoglobulina bajo el control de de secuencias reguladoras de control que dirigen su expresión;
un segundo casete de expresión que comprende un segundo ORF, un conector y un tercer ORF bajo el control de secuencias reguladoras de control que dirigen la expresión del mismo, donde el segundo y el tercer ORF se codifican para un segundo y tercer constructo de inmunoglobulina; y
una ITR 3' de AAV, conforme a lo cual se codifican una cadena ligera de inmunoglobulina, una primera cadena pesada de inmunoglobulina y una segunda cadena pesada de inmunoglobulina.
18. Una composición farmacéutica que comprende un AAV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 y un portador farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición para su uso en un método de inserción de dos anticuerpos monoespecíficos funcionales en un sujeto, dicha composición comprende un AAV recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
20. El AAV recombinante de acuerdo con la reivindicación 17, donde el primer ORF codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, el segundo ORF codifica una primera cadena pesada de inmunoglobulina y el tercer ORF codifica una segunda cadena pesada, conforme a lo cual los constructos de anticuerpos funcionales expresados poseen dos cadenas pesadas diferentes con diferentes especificidades que comparten una cadena ligera
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