ES2835200T3

ES2835200T3 - Uso médico de células que comprenden receptores de células T anti-NY-ESO-1

Info

Publication number: ES2835200T3
Application number: ES19152955T
Authority: ES
Inventors: Maria R Parkhurst; Richard Arthur Morgan; Steven A Rosenberg; Shannon Faith Rosati
Original assignee: United States Department of Health and Human Services
Current assignee: United States Department of Health and Human Services
Priority date: 2012-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2021-06-22
Anticipated expiration: 2033-05-22
Also published as: CA2874486A1; US20150141347A1; US10407485B2; EP3527584B1; CN104507963A; US9487573B2; CN104507963B; US10087230B2; ES2718474T3; ES2998514T3; CA2874486C; PT2852613T; HK1251874A1; JP2015525208A; EP3828197B1; WO2013177247A1; IL235720A0; US20180371050A1; AU2013266421B2; AU2013266421A1

Abstract

Una población de células para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero. en donde la población de células es autóloga o alogénica para el mamífero y la población de células comprende al menos una célula anfitriona que comprende un vector de expresión recombinante, en donde el vector de expresión recombinante comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de células T (TCR) aislado o purificado, en donde el TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de la cadena alfa (CDR) 1 de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, y tiene especificidad antigénica para NYESO- 1 (SEQ ID NO: 1).

Description

Uso médico de células que comprenden receptores de células T anti-NY-ESO-1

Referencia cruzada a una solicitud relacionada

Esta solicitud de patente reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos Núm.

61/650.020, presentada el 22 de mayo de 2012.

Incorporación como referencia de material enviado electrónicamente

Junto con la presente se presenta una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador e identificada de la siguiente manera: un archivo ASCII (texto) de 23.462 bytes llamado "713415ST25.TXT", con fecha del 30 de abril de 2013.

Antecedentes de la invención

La terapia con células adoptivas puede ser un tratamiento eficaz para el cáncer en algunos pacientes. Sin embargo, todavía existen obstáculos para el éxito general de la terapia celular adoptiva. Por ejemplo, solo 50% de las muestras de tumores de melanoma pueden generar células T reactivas a tumores. También puede resultar difícil generar células T reactivas a tumores a partir de cánceres distintos del melanoma. Además, muchos pacientes pueden no tener un tumor que sea susceptible de resección quirúrgica. Por consiguiente, existe la necesidad de receptores de células T para su uso en el tratamiento de pacientes con cáncer.

Robbins et al., 2011 describen variantes del receptor de células T anti-NY-ESO-1 1G4, y muestra que la transferencia adoptiva de células T autólogas transducidas con un vector retroviral que codifica un TCR (una variante de 1 G4) contra NY-ESO-1aa157-165 media en la regresión tumoral en pacientes con melanoma metastásico y sarcoma de células sinoviales.

Breve compendio de la invención

En la presente memoria se describe un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 y que comprende una región variable murina. La descripción también se refiere a polipéptidos y proteínas relacionados, así como a ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas y poblaciones de células relacionados. Adicionalmente, la invención proporciona anticuerpos, o una porción de unión a antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas relacionadas con los TCR de la invención.

En la presente memoria se describen adicionalmente métodos para detectar la presencia de cáncer en un mamífero y métodos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero. El método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células anfitrionas, o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, descritos en la presente memoria, formando así un complejo, y (ii) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.

El método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero descrito en la presente memoria comprende administrar al mamífero cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, o cualquier célula anfitriona o población de células anfitrionas que comprenda un vector recombinante que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son gráficos que muestran la secreción de interferón (IFN)-^ypor células T CD8+ (Figura 1A) o CD4+ (Figura 1B) humanas transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (círculos sombreados) o un TCR anti-NY-ESO-1 humano (círculos sin sombrear) en cultivo conjunto con células dendríticas pulsadas con diversas concentraciones de NY-ESO-1157-165.

Las Figuras 2A y 2B son gráficos que muestran la secreción de IFN-^ypor células T CD8+ (Figura 2A) o CD4+ (Figura 2B) humanas transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (barras sombreadas) o un TCR anti-NY-ESO-1 humano (barras sin sombrear) cultivado solo (medio) o cultivado conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control, células T2 pulsadas con péptido NY-ESO-1157-165, o una de varias líneas de células tumorales 888mel (NY-ESO-1'), Sk23mel (NY-ESO-1'), COA-A2-CEA (NY-ESO-1'), A375mel (NY-ESO-1*), 1363mel (NY-ESO-1+) o COS-A2-ESO (NY-ESO-1+).

En la presente memoria se describe un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 y que comprende una región variable murina. NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer de testículo (CTA), que se expresa únicamente en células tumorales y en células germinales de testículo y placenta que no expresan MHC. NY-ESO-1 se expresa en una variedad de cánceres humanos que incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario y sarcoma de células sinoviales. La proteína NY-ESO-1 puede comprender, consistir o consistir esencialmente en s Eq ID NO: 1.

El TCR puede tener especificidad antigénica para cualquier proteína, polipéptido o péptido NY-ESO-1. El TCR puede tener especificidad antigénica para una proteína NY-ESO-1 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en, SEQ ID NO: 1. El TCR puede tener especificidad antigénica para un péptido NY-ESO-1 157-165 que comprende, consiste de, o que consiste esencialmente en, SLLMWITQC (SEQ ID NO: 2).

La frase "que tiene especificidad antigénica", como se emplea en la presente memoria, significa que el TCR puede unirse específicamente a, y reconocer inmunológicamente, NY-ESO-1, de manera que la unión del TCR a NY-ESO-1 provoca una respuesta inmunitaria.

Los TCR descritos en la presente memoria son capaces de reconocer NY-ESO-1 de una manera dependiente de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Por "manera dependiente de MHC de clase I" como se emplea en la presente memoria significa que el TCR provoca una respuesta inmunitaria al unirse a NY-ESO-1 dentro del contexto de una molécula de MHC de clase I. La molécula de MHC de clase I puede ser cualquier molécula de MHC de clase I conocida en la técnica, p. ej., moléculas HLA-A. La molécula del MHC de clase I puede ser una molécula HLA-A2.

Los TCR descritos en la presente memoria pueden comprender una región variable murina. Los TCR pueden comprender adicionalmente una región constante derivada de cualquier especie adecuada tal como, p. ej., un ser humano o un ratón. Preferiblemente, los TCR comprenden adicionalmente una región constante murina. En una realización especialmente preferida, los TCR de la invención son TCR murinos que comprenden tanto una región variable murina como una región constante murina.

Como se emplea en la presente memoria, el término "murino", cuando se refiere a un TCR o cualquier componente de un TCR descrito en la presente memoria (p. ej., región determinante de complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena alfa y/o cadena beta), significa un TCR (o un componente del mismo) que se obtiene de un ratón, es decir, un TCR (o un componente del mismo) que se originó o fue, en un momento, expresado por una célula T de ratón. De manera deseable, el TCR (o componente del mismo) se expresa en la superficie de una célula anfitriona humana.

Los TCR descritos en la presente memoria proporcionan muchas ventajas, incluso cuando se utilizan para la transferencia de células adoptivas. Por ejemplo, sin estar ligado a una teoría o mecanismo concretos, se cree que debido a que NY-ESO-1 es expresado por células de múltiples tipos de cáncer, los TCR de la invención proporcionan ventajosamente la capacidad de destruir células de múltiples tipos de cáncer y, en consecuencia, tratar o prevenir múltiples tipos de cáncer. Además, sin estar ligado a una teoría o mecanismo concretos, se cree que debido a que NY-ESO-1 es un antígeno de cáncer de testículo que se expresa solo en células tumorales y en células germinales de testículo y placenta que no expresan MHC, los TCR descritos en la presente memoria, se dirige ventajosamente a la destrucción de células cancerosas mientras se minimiza o elimina la destrucción de células normales no cancerosas, reduciendo así, p. ej., minimizando o eliminando la toxicidad. También se cree que los TCR murinos pueden proporcionar una mayor expresión (p. ej., mayor número de TCR) sobre la superficie de una célula anfitriona humana y/o una mayor funcionalidad (medida por, p. ej., liberación de citocinas y citotoxicidad) en comparación con un TCR humano. Sin estar ligado a una teoría concreta del mecanismo, se cree que la expresión y/o funcionalidad mejoradas resulta de una reducción en la mezcla de cadenas de TCR endógenas y exógenas (transducidas) en la célula anfitriona. Por consiguiente, se cree que los TCR murinos pueden reemplazar los TCR endógenos sobre la superficie de una célula anfitriona humana más eficazmente que un TCR humano exógeno. También se cree que los TCR murinos proporcionan un emparejamiento mejorado de cadenas de TCR y/o interacciones mejoradas con el complejo CD3 de la célula anfitriona humana en comparación con los TCR humanos exógenos expresados por una célula anfitriona humana.

En la presente memoria se describe un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tal como una cadena a de un TCR, una cadena p de un TCR, una cadena ^yde un TCR, una cadena 8 de un TCR o una combinación de las mismos. Los polipéptidos del TCR de la invención pueden comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que el TCR tenga especificidad antigénica para NY-ESO-1 y comprenda una región variable murina.

El TCR descrito en la presente memoria puede comprender dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende una región variable que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1, una CDR2 secuencia de amino cidos de la E ID N : 3 DR1 de la cadena a, una ^cDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4 (CDR2 de la cadena a) y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a), y la segunda cadena polipeptídica comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena p), una CDR2 que comprende el aminoácido secuencia de SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena p). A este respecto, el TCR de la invención puede comprender las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-5, 6-8 y 3-8. Preferiblemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3-8.

De forma alternativa o adicional, el TCR puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a) o 10 (la región variable de una cadena p), o tanto SEQ ID NO: 9 como 10. Preferiblemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9 y 10.

Alternativa o adicionalmente, el TCR puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena p de un TCR. Cada una de las cadenas a y p del TCR de la invención puede comprender independientemente cualquier secuencia de aminoácidos. Preferiblemente, la cadena a comprende la región variable de una cadena a como se expuso anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11. Un TCR de este tipo puede emparejarse con cualquier cadena p de un TCR. Preferiblemente, la cadena p del TCR comprende la región variable de una cadena p como se ha expuesto anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. El TCR de la invención, por lo tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12, o tanto SEQ ID NO: 11 como 12. Preferiblemente, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11 y 12.

También se describe en la presente memoria un polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en la presente memoria. El término "polipéptido", como se emplea en la presente memoria, incluye oligopéptidos y se refiere a una cadena sencilla de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos.

Con respecto a los polipéptidos, la porción funcional puede ser cualquier parte que comprenda aminoácidos contiguos del TCR del que forma parte, siempre que la porción funcional se una específicamente a NY-ESO-1. El término "porción funcional" cuando se utiliza en referencia a un TCR se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR descrito en la presente memoria, cuya parte o fragmento conserva la actividad biológica del TCR del cual es parte (el TCR parental). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR que conservan la capacidad de unirse específicamente a NY-ESO-1, o detectan, tratan o previenen el cáncer, en un grado similar, en el mismo grado o en un grado mayor, como el TCR parental. En referencia al TCR parental, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% o más del TCR parental.

La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi terminal de la porción, o en ambos extremos, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR parental. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren en la función biológica de la porción funcional, p. ej., se unen específicamente a NY-ESO-1, tienen la capacidad de detectar cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR parental.

El polipéptido puede comprender una porción funcional de una o ambas cadenas a y p de los TCR, tal como una porción funcional que comprende una o más de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región o regiones variables de la cadena a y/o cadena p de un TCR. A este respecto, el polipéptido puede comprender una porción funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena a), 7 (CDR2 de cadena p), 8 (CDR3 de cadena p) o una combinación de las mismas. Preferiblemente, el polipéptido comprende una porción funcional que comprende SEQ ID NO: 3-5, 6-8, o la totalidad de SEQ ID NO: 3-8. Más preferiblemente, el polipéptido comprende una porción funcional que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8.

Alternativa o adicionalmente, el polipéptido puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR de la invención que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a) o 10 (la región variable de una cadena p), o tanto SEQ ID NO: 9 como 10. Preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10.

Alternativa o adicionalmente, el polipéptido puede comprender la longitud completa de una cadena a o p de uno de los TCR descritos en la presente memoria. A este respecto, el polipéptido de la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12. Alternativamente, el polipéptido puede comprender ambas comprender ambas secuencias de amino cidos de E ID N : 11 y 12.

La descripción proporciona adicionalmente una proteína aislada o purificada que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Por "proteína" se entiende una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas.

La proteína descrita en la presente memoria puede comprender una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. La proteína descrita en la presente memoria puede, por ejemplo, comprender una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. En este caso, la proteína de la invención puede ser un TCR. Alternativamente, si, p. ej., la proteína comprende una única cadena polipeptídica que comprende SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12, o si la primera y/o segunda cadenas polipeptídicas de la proteína comprenden adicionalmente otras secuencias de aminoácidos, p. ej., una secuencia de aminoácidos que codifica una inmunoglobulina o una porción de la misma, la proteína puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos descritos en la presente memoria. El otro polipéptido puede codificar cualquier molécula peptídica o proteica, o una porción de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, una inmunoglobulina, CD3, CD4, c D8 , una molécula del MHC, una molécula CD1, p. ej., CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.

La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido y/o del otro polipéptido. Los métodos adecuados para preparar proteínas de fusión se conocen en la técnica e incluyen, p. ej., métodos recombinantes. Véase, p. ej., Choi et al., Mol. Biotechnol. 31: 193-202 (2005).

En algunas realizaciones, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (que incluyen porciones funcionales y variantes funcionales) se pueden expresar como una única proteína que comprende un péptido conector que conecta la cadena a y la cadena p. Se puede utilizar cualquier péptido conector adecuado para conectar la cadena a y la cadena p en los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas porciones funcionales y variantes funcionales) de la invención. En una realización, el péptido conector es un péptido de picornavirus 2A. A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales) pueden comprender adicionalmente un péptido conector que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEC ID NO: 13. El péptido conector puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR, polipéptido y/o proteína recombinantes en una célula anfitriona. Tras la expresión de la construcción que incluye el péptido conector por una célula anfitriona, el péptido conector se puede escindir, dando como resultado cadenas a y p separadas.

La proteína descrita en la presente memoria puede ser un anticuerpo recombinante que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, "anticuerpo recombinante" se refiere a una proteína recombinante (p. ej., modificada genéticamente) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una porción del mismo. El polipéptido de un anticuerpo, o porción del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) o un fragmento Fc, Fab o F(ab)2' de un anticuerpo, etc. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o porción del mismo, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. Alternativamente, la cadena polipeptídica de un anticuerpo, o porción del mismo, puede existir como un polipéptido, que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o porción del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en la presente memoria.

En la presente memoria se describen variantes funcionales de los TCR, polipéptidos y proteínas descritos en la presente memoria. El término "variante funcional" como se emplea en la presente memoria se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un TCR, polipéptido o proteína parental, cuya variante funcional conserva la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína de la que es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritos en la presente memoria (el TCR, polipéptido o proteína original) que conservan la capacidad de unirse específicamente a NY-ESO-1 en un grado similar, en el mismo grado o, en un mayor grado, que el TCR, polipéptido o proteína parentales. En referencia al TCR, polipéptido o proteína parentales, la variante funcional puede ser, p. ej., al menos aproximadamente 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica en secuencia de aminoácidos al TCR, polipéptido o proteína parentales.

La variante funcional puede comprender, p. ej., la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína parentales con al menos una sustitución conservativa de aminoácidos. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que qumicas o sicas. Por ejemplo, la sustituci n de amino cidos conservativa puede ser un amino cido cido sustituido por otro aminoácido ácido (p. ej., Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituida por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (p. ej., Ala , Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido alcalino sustituido por otro aminoácido alcalino (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína parental con al menos una sustitución de aminoácidos no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservativa no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución de aminoácidos no conservativa potencia la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el TCR, polipéptido o proteína parentales.

El TCR, polipéptido o proteína pueden consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en la presente memoria, de modo que los otros componentes de la variante funcional, p. ej., otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional. A este respecto, el TCR, polipéptido o proteína pueden, p. ej., consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 12, o tanto SEQ ID NO: 11 como 12. Asimismo, por ejemplo, los TCR, polipéptidos o proteínas pueden consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9 o 10, o tanto SEC ID NO: 9 como 10. Además, los TCR, polipéptidos o proteínas pueden consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), 8 (CDR3 de cadena p), o cualquier combinación de las mismos, p. ej., SEQ ID NO: 3-5, 6-8 o 3-8.

Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales) pueden tener cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los TCR, polipéptidos o proteínas (o porciones funcionales o variantes funcionales de los mismos) conserven su actividad biológica, p. ej., la capacidad de unirse específicamente a NY-ESO-1, detectar cáncer en un mamífero o tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede tener de 50 a 5000 aminoácidos de longitud, tal como como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud. A este respecto, los polipéptidos también incluyen oligopéptidos.

Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas porciones funcionales y variantes funcionales) de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Tales aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, p. ej., ácido aminociclohexano carboxílico, norleucina, ácido aamino n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometilcisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, anaftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4--tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentano carboxílico, ácido a-aminociclohexano carboxílico, ácido aaminocicloheptano carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a, pdiaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.

Los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales) pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse mediante, p. ej., un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.

Cuando los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales) están en forma de sal, preferiblemente, los polipéptidos están en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, tales como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y los ácidos orgánicos, tales como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.

El TCR, el polipéptido y/o la proteína (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden obtener mediante métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados de la síntesis de novo de polipéptidos y proteínas se describen en referencias, tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwoood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; y la Patente de Estados Unidos Núm. 5.449.752. Asimismo, los polipéptidos y las proteínas se pueden producir de forma recombinante utilizando los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria utilizando métodos recombinantes convencionales. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994. Además, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) se pueden aislar y/o purificar a partir de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, p. ej., un ratón, un ser humano, etc. Los protenas descritos en la presente memoria incluidas las porciones uncionales y variantes uncionales de los mismos) se pueden ser sintetizados comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

En la presente memoria se describen adicionalmente productos conjugados, p. ej., bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas de la invención (incluida cualquiera de las porciones funcionales o variantes de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células anfitrionas o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos. Los productos conjugados, así como los métodos para sintetizar conjugados en general, son conocidos en la técnica (véanse, p. ej., Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) y Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)).

Se proporciona adicionalmente un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria (incluidas porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos).

Por "ácido nucleico", como se emplea en la presente memoria, se incluyen "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, sintetizado u obtenido (p. ej. , aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster que se encuentra entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. Generalmente se prefiere que el ácido nucleico no comprenda inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se comenta en la presente memoria, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria son recombinantes. Como se emplea en la presente memoria, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas al unir segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de los descritos en el apartado (i) más arriba. Para los propósitos de la presente memoria, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos se pueden construir basándose en síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., Sambrook et al., más arriba y Ausubel et al., más arriba. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diversas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (p. ej., derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden adquirir en empresas tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas, o porciones funcionales o variantes funcionales de los mismos. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en SEQ ID No : 19 (cadena a de tipo salvaje) o SEQ ID NO: 20 (cadena p de tipo salvaje) o tanto SEQ ID NO: 19 como 20.

En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos puede tener codones optimizados. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo concretos, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficacia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar la sustitución de un codón nativo por otro codón que codifica el mismo aminoácido, pero puede ser traducido por el ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentando así la eficacia de traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que interferirían en la traducción, aumentando así la eficacia de la traducción. En una realización, la secuencia de nucleótidos con codones optimizados puede comprender, consistir o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 15 (cadena a con codones optimizados), SEQ ID NO: 16 (cadena p con codones optimizados), SEQ ID NO: 21 (región variable con codones optimizados de la cadena a), SEQ ID NO: 22 (región variable con codones como 20, o tanto E ID n : 16 como 19.

En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica los TCR, polipéptidos y proteínas (incluidas porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) puede comprender adicionalmente una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los péptidos conectores descritos en la presente memoria con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización, el péptido conector puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 14.

También se describe en la presente memoria un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 70% o más, p. ej., aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria.

La secuencia de nucleótidos alternativamente puede comprender una secuencia de nucleótidos que es degenerada respecto a SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, tanto SEQ ID NO: 15 como 16, tanto SEQ ID NO: 19 como 20, tanto SEQ ID NO: 21 como 22, tanto SEQ ID NO: 15 como 20, o tanto SEQ ID NO: 16 como 19. Preferiblemente, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 15, 16, 19, 20, 21 o 22, SEQ ID NO: 15 y 16, SEQ ID NO: 19 y 20, SEQ ID NO: 21 y 22, SEQ ID NO: 15 y 20, o SEQ ID NO: 16 y 19, o una secuencia de nucleótidos que es degenerada respecto a la misma.

También se describe en la presente memoria un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria o una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria.

La secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas preferiblemente hibrida en condiciones muy rigurosas. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que contuviera solo unos pocos emparejamientos erróneos dispersos de una secuencia aleatoria que tuviera unas pocas regiones pequeñas (p. ej., 3-10 bases) que coincidirían con la secuencia de nucleótidos. Estas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento completo de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirían, por ejemplo, condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl aproximadamente 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Tales condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si lo hicieran, el emparejamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y la hebra molde o diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención. Generalmente se aprecia que las condiciones se pueden hacer más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

Los ácidos nucleicos se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. A este respecto, la descripción proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Para los fines de la presente memoria, el término "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótidos o polinucleótidos modificada genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula anfitriona, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, proteína, polipéptido o péptido se expresen dentro de la célula. Los vectores de la invención no son de origen natural en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluidos, entre otros, ADN y ARN, que pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender conexiones internucleotídicas de origen natural y de origen no natural, o ambos tipos de conexiones. Preferiblemente, los nucleótidos o enlaces internucleotídicos alterados o no naturales no obstaculizan la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado y se puede utilizar para transformar o transfectar cualquier célula anfitriona adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambos, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo que consta de la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden utilizar vectores de bacteriófagos, tales como AGPT10, AGPT11, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas animales incluyen pEUK- l, pMAM y pMAMneo lontech . Preeriblemente, el vector de expresi n recombinante es un vector viral, p. ej., un vector retroviral o un vector lentiviral.

Los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar utilizando técnicas convencionales de ADN recombinante descritas, p. ej., en Sambrook et al., más arriba, y Ausubel et al., más arriba. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden prepararse para contener un sistema de replicación funcional en una célula anfitriona procariota o eucariota. Los sistemas de replicación se pueden obtener, p. ej., de ColEl, plásmido de 2pm, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.

Deseablemente, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de célula anfitriona (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en la que se va a introducir el vector, según corresponda y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células anfitrionas transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un anfitrión auxótrofo para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo conectado operablemente a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido o proteína (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria, o que hibrida con, la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido o proteína. La selección de promotores, p. ej., fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos del desarrollo, está dentro del conocimiento práctico normal del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro del conocimiento práctico del experto. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión transitoria, para la expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar para la expresión constitutiva o para la expresión inducible. Adicionalmente, se puede hacer que los vectores de expresión recombinantes incluyan un gen suicida.

Como se emplea en la presente memoria, el término "gen suicida" se refiere a un gen que hace que muera la célula que expresa el gen suicida. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, p. ej., un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando la célula entra en contacto o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, e incluyen, p. ej., el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), la citosina desaminasa, la purina nucleósido fosforilasa y la nitrorreductasa.

Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una parte de la cadena alfa situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una parte de la cadena beta. A este respecto, una realización proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una CDR1a, CDR2a, CDR3a, CDR1p, CDR2p y CDR3p, y la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1a, CDR2a y CDR3a está situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1p, CDR2p y CDR3p. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1p, CDR2p y CDR3p puede estar situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1a, CDR2a y CDR3a.

El vector de expresión recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena alfa y una región variable de la cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa está situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta puede estar situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa. Alternativamente, el vector de expresión recombinante puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena alfa y una cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa está situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta puede estar situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. El vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta puede comprender SEQ ID NO: 17.

porci n de la cadena ala situada 3' respecto a la secuencia de nucle tidos que codiica toda o una porci n de la cadena beta. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo concretos, se cree que un TCR, polipéptido o proteína (o porción funcional o variante de los mismos) codificados por un vector de expresión recombinante en el que la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa está situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta proporciona mejor funcionalidad y reconocimiento de antígeno en comparación con un TCR, polipéptido o proteína (o porción funcional o variante funcional de los mismos) codificados por un vector de expresión recombinante en el que la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una parte de la cadena alfa está situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una parte de la cadena beta. A este respecto, una realización proporciona un vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una CDR 1a, CDR2a, CDR3a, CDRlp, CDR2p y CDR3p, y la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1a, CDR2a y CDR3a está situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos. que codifica cDR1p, CDR2p y CDR3p. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1p, CDR2p y CDR3p puede estar situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica CDR1a, CDR2a y CDR3a. En otra realización, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una región variable de la cadena alfa y una región variable de la cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa está situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena beta puede estar situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la región variable de la cadena alfa. En otra realización más de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena alfa y una cadena beta, y la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa está situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta. Asimismo, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta puede estar situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. El vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena alfa situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica toda o una porción de la cadena beta puede comprender SEQ ID NO: 18.

El vector de expresión recombinante puede comprender una etiqueta de ADN. La etiqueta de ADN puede distinguir el vector de expresión recombinante de otro vector que codifica la misma secuencia de proteína. La etiqueta de ADN puede no estar incluida dentro de la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR de la invención (incluidas las porciones funcionales y variantes funcionales del mismo), polipéptido o proteína y, por lo tanto, puede no afectar a su expresión. Los vectores de expresión recombinantes que incluyen la etiqueta de ADN permiten poner la misma secuencia de nucleótidos en varias poblaciones de células diferentes y, posteriormente, distinguir entre esas poblaciones en función del vector que contienen.

La descripción proporciona adicionalmente una célula anfitriona que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en la presente memoria. Como se emplea en la presente memoria, el término "célula anfitriona" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula anfitriona puede ser una célula eucariótica, p. ej., una planta, animal, hongos o algas, o puede ser una célula procariótica, p. ej., bacterias o protozoos. La célula anfitriona puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, p. ej., un ser humano. La célula anfitriona puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células anfitrionas adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células E. coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con el fin de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula anfitriona es preferiblemente una célula procariótica, p. ej., una célula DH5a. Con el fin de producir un TCR, polipéptido o proteína recombinantes, la célula anfitriona es preferiblemente una célula de mamífero. Lo más preferiblemente, la célula anfitriona es una célula humana. Si bien la célula anfitriona puede ser de cualquier tipo de célula, se puede originar a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, la célula anfitriona puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Preferiblemente, la célula anfitriona puede ser una célula T.

Para los fines de la presente memoria, la célula T puede ser cualquier célula T, como una célula T cultivada, p. ej., una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivada, p. ej., Jurkat, SupTI, etc., o una célula T célula obtenida de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, la célula T se puede obtener de numerosas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, timo u otros tejidos o fluidos. Las células T también se pueden enriquecer o purificar. La célula T puede ser una célula T humana. La célula T puede ser una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, incluidos, entre otros, células T dobles positivas CD4+/CD8+, células T auxiliares CD4+, p. ej., células Thi y Th2, células T CD8+, células T citotóxicas, células de linfocitos infiltrantes de tumores, células T de memoria, células T vírgenes y similares. Preferiblemente, la célula T puede ser una célula T CD8+ o una célula T CD4+.

Se describe adicionalmente en la presente memoria una población de células que comprende al menos una célula anfitriona descrita en la presente memoria. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula anfitriona que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, p. ej., una célula anfitriona (p. ej., una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de una célula T, p. ej., una célula B, un macrófago, un cerebral, etc. Alternativamente, la poblaci n de c lulas puede ser una poblaci n sustancialmente homog nea, en la que la población comprende principalmente células anfitrionas (p. ej., que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula anfitriona que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización, la población de células es una población clonal que comprende células anfitrionas que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en la presente memoria.

La descripción proporciona adicionalmente un anticuerpo, o una parte de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a una porción funcional de cualquiera de los TCR descritos en la presente memoria. Preferiblemente, la porción funcional se une específicamente a NY-ESO-1, p. ej., la porción funcional que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), 8 (CDR3 de cadena p), SEQ ID NO: 9, SeQ ID NO: 10, o una combinación de los mismos, p. ej., 3-5, 6-8, 3-8 o 9-10. Más preferiblemente, la porción funcional comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8. En una realización preferida, el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo que está formado por las 6 CDR (CDR1-3 de la cadena alfa y CDR1-3 de la cadena beta). El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina conocido en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, p. ej., IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen natural, p. ej., un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, p. ej., ratón, conejo, cabra, caballo, pollo, hámster, ser humano, etc. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado genéticamente, p. ej., un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Asimismo, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez por la porción funcional del TCR de la invención. De manera deseable, el anticuerpo es específico para la porción funcional del TCR de la invención, de manera que existe una reacción cruzada mínima con otros péptidos o proteínas.

Los métodos de prueba de anticuerpos para determinar la capacidad de unirse a cualquier porción funcional del TCR son conocidos en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión de anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitivos (véase, p. ej., Janeway et al., más abajo).

Se conocen en la técnica métodos adecuados para preparar anticuerpos. Por ejemplo, los métodos de hibridoma convencionales son descritos, p. ej., por Kohler y Milstein, en Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Alternativamente, otros métodos, tales como los métodos de EBV-hibridoma (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)) y sistemas de expresión de vectores de bacteriófagos (véase, p. ej., Huse et al., Science, 246, 1275 81 (1989)) son conocidos en la técnica. Adicionalmente, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen, p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352).

Además, la presentación de fagos se puede utilizar para generar el anticuerpo descrito en la presente memoria. A este respecto, se pueden generar bibliotecas de fagos que codifican dominios de anticuerpos variables de unión a antígenos (V) utilizando biología molecular convencional y técnicas de ADN recombinante (véase, p. ej., Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001)). Los fagos que codifican una región variable con la especificidad deseada se seleccionan para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridomas, de manera que los anticuerpos que tienen las características de los anticuerpos monoclonales son secretados por la célula (véanse, p. ej., Janeway et al., más arriba, Huse et al., más arriba y la Patente de Estados Unidos Núm. 6.265.150).

Los ratones transgénicos pueden producir anticuerpos que son transgénicos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada específicos. Tales métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.545.806 y 5.569.825 y Janeway et al., más arriba.

Los métodos para generar anticuerpos humanizados son bien conocidos en la técnica y son descritos en detalle, p. ej., por Janeway et al., más arriba, las Patentes de Estados Unidos Núm. 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la Patente Europea Núm. 0239400 B1 y la Patente del Reino Unido Núm. 2188638. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar utilizando la tecnología de reconstrucción de la superficie de anticuerpos descrita en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).

La descripción también proporciona porciones de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente memoria. La porción de unión al antígeno puede ser cualquier porción que tenga al menos un sitio de unión al antígeno, tal como Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.

consiste en un ragmento Fab truncado que comprende el dominio variable V de una cadena pesada de anticuerpo conectada a un dominio V de una cadena de anticuerpo ligero a través de un péptido sintético utilizando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, p. ej., Janeway et al., más arriba). De manera similar, se pueden preparar los fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (ver, p. ej., Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpos de la descripción, sin embargo, no se limitan a estos tipos ilustrativos de fragmentos de anticuerpos.

Asimismo, el anticuerpo, o la porción de unión al antígeno del mismo, se puede modificar para que comprenda un marcador detectable, tal como, p. ej., un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).

Los TCR, polipéptidos, proteínas (incluidas porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas (incluidas poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas porciones de unión a antígenos de los mismos) se pueden aislar y/o purificarse. El término "aislado", como se emplea en la presente memoria, significa haber sido retirado de su entorno natural. El término "purificado" como se emplea en la presente memoria significa haber aumentado en pureza, en donde "pureza" es un término relativo, y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente 50%, puede ser superior a 60%, 70% u 80%, o puede ser de 100%.

Los TCR, polipéptidos, proteínas (incluidas las porciones funcionales y variantes de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas (incluidas las poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas las porciones de unión a antígenos de los mismos), todos los cuales se denominan colectivamente "materiales de TCR" en lo sucesivo, se pueden formular en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, porciones funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células anfitrionas (incluidas las poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluidas las porciones de unión a antígenos de los mismos), y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria que contienen cualquiera de los materiales de TCR pueden comprender más de un material de TCR, p. ej., un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR combinado con otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, p. ej., asparraginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los utilizados convencionalmente y está limitado solo por consideraciones químico-físicas, tales como la solubilidad y falta de reactividad con el compuesto o compuestos activos, y por la vía de administración. Los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en la presente memoria, p. ej., vehículos, coadyuvantes, excipientes y diluyentes, son bien conocidos por los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que sea químicamente inerte para el agente o agentes activos y uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del portador estará determinada en parte por el material de TCR concreto, así como por el método concreto utilizado para administrar el material de TCR. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las siguientes formulaciones para administración parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal e interperitoneal son ilustrativas y de ninguna manera son limitantes. Se puede utilizar más de una vía para administrar los materiales de TCR y, en ciertos casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones inyectables isotónicas estériles acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. El material de TCR se puede administrar en un diluyente fisiológicamente aceptable en un portador farmacéutico, tal como un líquido o una mezcla de líquidos estériles, que incluyen agua, solución salina, dextrosa acuosa y soluciones azucaradas relacionadas, un alcohol, tal como etanol o alcohol hexadecílico, un glicol, tal como propilenglicol o polietilenglicol, dimetilsulfóxido, glicerol, cetales tales como 2,2-dimetil-1,3-dioxolano-4-metanol, éteres, poli(etilenglicol) 400, aceites, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos o glicéridos o glicéridos de ácidos grasos acetilados con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como un jabón o un detergente, agente de suspensión, tal como pectina, carbómeros, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa, o agentes emulsionantes y otros coadyuvantes farmacéuticos.

Los aceites que se pueden utilizar en las formulaciones parenterales incluyen aceites de petróleo, animales, maz, oliva, vaselina y mineral. Los cidos grasos adecuados para uso en ormulaciones parenterales incluyen cido oleico, ácido esteárico y ácido isoesteárico. El oleato de etilo y el miristato de isopropilo son ejemplos de ésteres de ácidos grasos adecuados.

Los jabones adecuados para su uso en formulaciones parenterales incluyen sales grasas de metales alcalinos, amonio y trietanolamina, y los detergentes adecuados incluyen (a) detergentes catiónicos tales como, por ejemplo, haluros de dimetil dialquil amonio y haluros de alquilpiridinio, (b) detergentes aniónicos tales como, por ejemplo, alquil-, aril- y olefino-sulfonatos, alquil-, olefino-, éter- y monoglicérido-sulfatos y -sulfosuccinatos, (c) detergentes no iónicos tales como, por ejemplo, óxidos de aminas grasas, alcanolamidas de ácidos grasos y copolímeros de polioxietilenpolipropileno, (d) detergentes anfóteros tales como, por ejemplo, alquil-p-aminopropionatos y sales de amonio cuaternario de 2-alquil-imidazolina, y (e) mezclas de los mismos.

Las formulaciones parenterales contendrán típicamente de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 25% en peso del material de TCR de la invención en solución. Se pueden utilizar conservantes y tampones. Para minimizar o eliminar la irritación en el lugar de la inyección, tales composiciones pueden contener uno o más tensioactivos no iónicos que tengan un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de aproximadamente 12 a aproximadamente 17. La cantidad de tensioactivo en tales formulaciones variará típicamente de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% en peso. Los tensioactivos adecuados incluyen ésteres de ácidos grasos de sorbitán y polietilenglicol, tales como monooleato de sorbitán y los aductos de óxido de etileno de alto peso molecular con una base hidrófoba, formados por la condensación de óxido de propileno con propilenglicol. Las formulaciones parenterales se pueden presentar en envases sellados de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado secado mediante congelación (liofilizado) que requiere solo la adición del excipiente líquido estéril, p. ej., agua, para inyectables, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporánea a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles del tipo descrito anteriormente.

También se describen en la presente memoria formulaciones inyectables. Los requisitos de los portadores farmacéuticos eficaces para composiciones inyectables son bien conocidos por los expertos en la técnica (véase, p. ej., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Filadelfia, PA, Banker and Chalmers, ed., páginas 238-250 (1982), y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a ed., páginas 622-630 (1986)). Preferiblemente, cuando se administran células, p. ej., células dendríticas, las células se administran mediante inyección.

Un experto en la técnica apreciará que, además de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, los materiales de TCR descritos en la presente memoria se pueden formular como complejos de inclusión, tales como complejos de inclusión de ciclodextrina o liposomas.

La cantidad o dosis del material TCR administrado debe ser suficiente para producir, p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal durante un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material TCR debe ser suficiente para unirse a NY-ESO-1, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período de aproximadamente 2 horas o más, p. ej., de 12 a 24 o más horas, desde el tiempo de administración. En determinadas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso mayor. La dosis estará determinada por la eficacia del material de TCR concreto y el estado del animal (p. ej., ser humano), así como el peso corporal del animal (p. ej., ser humano) que se vaya a tratar.

Se conocen en la técnica muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la invención, se podría utilizar un ensayo que comprende comparar el grado en que las células diana se lisan o el IFN-y es secretado por las células T que expresan el TCR, polipéptido o proteína tras la administración de una dosis determinada de dichas células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos de los cuales cada uno recibe una dosis diferente de células T, para determinar una dosis inicial que se administrará a un mamífero. El grado en el que se lisan las células diana o se secreta IFN-y tras la administración de una determinada dosis se puede analizar mediante métodos conocidos en la técnica, incluidos, p. ej., los métodos descritos en la presente memoria como Ejemplo 3.

La dosis del material TCR también estará determinada por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR concreto. Normalmente, el médico a cargo decidirá la dosis del material de TCR con el que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el material de TCR que se administrará, la vía de administración y la gravedad de la afección que se está tratando. A modo de ejemplo y sin pretender limitar la invención, la dosis del material TCR puede ser de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal del sujeto que se vaya a tratar/día, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día.

Un experto normal en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR se pueden modificar de diversas formas, de modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR se incrementa mediante la a un radical de direccionamiento. La pr ctica de conjugar compuestos, p. ej., materiales de T R, con radicales de direccionamiento es conocida en la técnica. Véanse, p. ej., Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) y la Patente de Estados Unidos Núm. 5.087.616. El término "radical de direccionamiento", como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce y se une específicamente a un receptor de la superficie celular, de modo que el radical de direccionamiento dirige el suministro de los materiales de TCR a una población de células sobre cuya superficie es expresado el receptor. Los radicales de direccionamiento incluyen, entre otros, anticuerpos o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas y cualquier otro ligando natural o no natural, que se une a los receptores de la superficie celular (p. ej., Receptor del Factor de Crecimiento Epitelial (EGFR), receptor de células T (TCR), receptor de células B (BCR), CD28, Receptor del Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas (PDGF), receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR), etc.). El término "puente", como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier agente o molécula que une mediante puentes los materiales de TCR al radical de direccionamiento. Un experto en la técnica reconoce que los sitios en los materiales de TCR, que no son necesarios para la función de los materiales de TCR, son sitios ideales para anclar un puente y/o un resto de direccionamiento, siempre que el puente y/o el radical de direccionamiento, una vez anclado a los materiales de TCR de la invención, no interfiera en la función de los materiales de TCR, es decir, la capacidad de unirse a NY-ESO-1 o de detectar, tratar o prevenir el cáncer.

Alternativamente, los materiales de TCR se pueden modificar en una forma de depósito, de modo que la forma en que se liberan los materiales de TCR en el organismo al que se administra se controla con respecto al tiempo y la ubicación dentro del organismo (véase, p. ej., la Patente de Estados Unidos Núm. 4.450.150). Las formas de depósito de los materiales de TCR pueden ser, por ejemplo, una composición implantable que comprende los materiales de TCR y un material poroso o no poroso, tal como un polímero, en donde los materiales de TCR están encapsulados o difundidos por todo el material y/o la degradación del material no poroso. A continuación, el depósito se implanta en la ubicación deseada dentro del organismo y los materiales de TCR se liberan del implante a una velocidad predeterminada.

Se contempla que las composiciones farmacéuticas, los TCR (incluidas las porciones funcionales o variantes de los mismos), los polipéptidos, las proteínas, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células anfitrionas o las poblaciones de células de la invención puedan utilizarse en métodos para tratar o prevenir el cáncer. Sin estar ligados a una teoría o mecanismo concretos, se cree que los TCR de la invención se unen específicamente a NY-ESO-1, de modo que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionados, o porción funcional o variante de los mismos) cuando es expresado por una célula es capaz de mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa NY-ESO-1. A este respecto, la descripción se refiere a un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas descritos en la presente memoria o cualquier célula anfitriona o población de células que comprendan un vector recombinante que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en la presente memoria, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, como se emplean en la presente memoria, no implican necesariamente 100% o tratamiento o prevención completos. Más bien, existen diversos grados de tratamiento o prevención que un experto en la técnica reconoce que tiene un beneficio o efecto terapéutico potencial. A este respecto, los métodos pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, p. ej., cáncer, que está siendo tratado o prevenido. Además, para los propósitos de la presente, "prevención" puede abarcar el retraso de la aparición de la enfermedad, o un síntoma o condición de la misma.

También se proporciona un método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del cáncer con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células anfitrionas, poblaciones de células o anticuerpos de la invención, o porciones de unión a antígenos de los mismos, descritos en la presente memoria, formando así un complejo y detectando el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.

Con respecto al método de detección del cáncer en un mamífero, la muestra de células del cáncer puede ser una muestra que comprende células completas, sus productos lisados o una fracción de los productos lisados de células completas, p. ej., una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteína completa, o una fracción de ácido nucleico.

A los efectos del método de detección, el contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al mamífero. Preferiblemente, el contacto es in vitro.

Asimismo, la detección del complejo puede ocurrir a través de varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, poblaciones de c lulas o anticuerpos, o porciones de uni n a antgenos de los mismos, descritos en la presente memoria, se pueden marcar con un marcador detectable tal como, p. ej., un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).

Para los fines de los métodos descritos en la presente memoria, en donde se administran células anfitrionas o poblaciones de células, las células pueden ser células alogénicas o autólogas para el mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas para el mamífero.

Con respecto a los métodos descritos en la presente memoria, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluido cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer de ano, canal anal o anorrectal, cáncer de ojo, cáncer de la vía biliar intrahepática, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de cavidad oral, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de riñón (p. ej., carcinoma de células renales (CCR)), cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, sarcoma de células sinoviales, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Preferiblemente, el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario, o sarcoma de células sinoviales.

El mamífero al que se hace referencia en la presente memoria puede ser cualquier mamífero. Como se emplea en la presente memoria, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluidos, entre otros, mamíferos del orden Rodentia, como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluidos Félidos (gatos) y Canidos (perros). Es más preferido que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, incluidos los Bóvidos (vacas) y los Suidos (cerdos) o del orden Perisodáctila, incluidos los Équidos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Antropoides (humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención.

Líneas celulares

Se generaron líneas de melanoma 1300mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), 624,38mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), A375mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), 938mel (NY-ESO-1+, HLA-AZ), 888mel (NY-ESO-1-, HLA-A2-), SK23mel (NY-ESO-1-, HLA-A2+), 1359mel (NY-ESO-1+, HLA-A2-), 1359-A2mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), 624mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+) y 1390mel (NY-ESO-1+, HLA-A2+), a partir de lesiones tumorales resecadas y se cultivaron en medio RIO que consistía en RPMI 1640 con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, L-glutamina de 2 mmoles/L, 50 unidades/mL de penicilina y HEPES de 50 pg/mL (Invitrogen) y 25 mmoles/L (GIBCO, Invitrogen). Otras líneas celulares utilizadas incluyeron: la línea celular de cáncer de cuello uterino Caski (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC CRL-1550) la línea celular de osteosarcoma Saos2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC HTB-85) y la línea celular de neuroblastoma SK NAS-A2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC CRL-2137), la línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas H1299A2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), la línea celular de carcinoma de mama MDA-MB-435S-A2 (NY-ESO-1+, HLA-A2+), (ATCC® HTB-129), de las cuales las tres fueron transducidas con la construcción retroviral para expresar HLA-A * 0201 (Navuaux et al., J. Virol., 70: 5701-05 (1996), Parkhurst et al., Clin. Cancer Res., 15: 169-180 (2009).), Robbins et al., J. Immunol., 180: 6116-31 (2008), Wargo et al., Cancer Immunol. Immunother., 58: 394 (2009)), COS-A2-ESO, que se transdujo con un vector retroviral que expresaba el gen NY-ESO-1, y COS-A2-CEA, que se transdujo con un vector retroviral que expresaba el gen CEA.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la identificación de clones de células T anti-NY-ESO-1 murinas.

Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 con 100 pg de péptido (NY-ESO-1157-165) y 120 pg de péptido auxiliar (péptido central del virus de la hepatitis B (HBVc): 128-140) en 100 pl de adyuvante incompleto de Freund (AIF) por vía subcutánea (s.c.) en la base de la cola (50 pg de péptido NY-ESO-1157-165 en cada uno de los dos lados de la cola), seguido de un refuerzo una semana después con la misma inmunización.

Día 0: Una semana después de la segunda inmunización, se recolectaron y estimularon los esplenocitos in vitro con uno de los siguientes: (i) esplenocitos HLA-A2+ activados con LPS (3000 rad) ("blastos LPS") pulsados con 1 pg/ml 0,01 jg ml de p ptido.

Día 7: Se evaluó la reactividad específica de los cultivos masivos mediante la secreción de IFNy tras el cultivo conjunto con una de las líneas de células tumorales indicadas en la Tabla 1. Los resultados se muestran en la Tabla 1 (IFN-y (pg/ml) después de 1 estimulación masiva; “np"= no probado). Debido a que la liberación de citocinas a veces fue muy alta en respuesta a las células T2 cargadas con el péptido del VHB, los valores subrayados para las dianas tumorales indican el doble de los valores de fondo obtenidos con el medio solo y los tumores negativos, y los valores subrayados para los péptidos indican el doble de los valores de fondo obtenidos con T2 y péptido de HBV.

TABLA 1

Día 11: Se clonaron cultivos masivos reactivos de péptido/tumor a 10 células/pocillo en las siguientes condiciones (10 placas por condición): (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 jg/ml de péptido: 5x104 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3000 rad): 5x104 células/pocillo; y (iii) 10 CU/ml de IL-2.

Días 25-30. Se seleccionaron pocillos con crecimiento positivo y se reestimularon en placas de 48 pocillos bajo las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 jg/ml de péptido: 2x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) 10 CU/ml de IL-2.

Días 37-44: Se evaluó la reactividad específica de los clones a través de la secreción de IFNy en el cultivo conjunto con las líneas de células tumorales establecidas en la Tabla 2. Las células tumorales se trataron con IFN^y(20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes del ensayo.

Los esplenocitos estimulados con esplenocitos HLA-A2+ activados con LPS (3.000 rad) pulsados con 1 jg/ml de péptido de cebado y 10 jg/ml de p2-microgobulina humana el día 0 produjeron 8 de 960 pocillos con crecimiento positivo. Los datos de los dos clones más reactivos se muestran en la Tabla 2 (estimulación masiva posterior a 1; IFN-y (pg/ml)).

TABLA 2

Días 46-49: Los clones de interés se reestimularon en placas de 24 pocilios en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 0,01 pg/ml de péptido: 5x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) 10 CU/ml de IL-2. Los clones reestimulados se congelaron instantáneamente para la preparación de ARN.

Ejemplo 2

Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 y se recolectaron, estimularon y evaluaron los esplenocitos para determinar la reactividad específica como se describe en el Ejemplo 1.

Día 11: Los cultivos masivos se reestimularon en placas de 24 pocillos en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 001 pg/ml de péptido: 4x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) 10 CU/ml de IL-2.

Día 19: Se evaluó la reactividad específica de los cultivos masivos (después de dos estimulaciones) a través de la secreción de IFN-y en el cultivo conjunto con las líneas de células tumorales que se muestran en la Tabla 3. Las células tumorales se trataron con IFNy (20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes del ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 3 (IFN-y (pg/ml)).

TABLA 3

Día 21: Los cultivos masivos se reestimularon en placas de 24 pocilios en las siguientes condiciones: (i) células T2 irradiadas (18.000 rad) pulsadas con 1, 0,1 o 001 ug/ml de péptido: 5x105 células/pocillo; (ii) alimentadores de esplenocitos C57BL/6 irradiados (3000 rad): 1x106 células/pocillo; y (iii) 10 CU/ml de IL-2.

Día 30: Se evaluó la reactividad específica de los cultivos masivos (después de tres estimulaciones) a través de la secreción de IFN-y tras el cultivo conjunto con las líneas de células tumorales que se muestran en la Tabla 4. Las células tumorales se trataron con IFN^y(20 ng/ml) y factor de necrosis tumoral alfa (3 ng/ml) durante la noche antes del ensayo. Los resultados se muestran en la Tabla 4 (IFN-y (pg/ml); * indica cultivos masivos que se clonaron después de tres estimulaciones masivas).

TABLA 4

Día 33: Se clonaron los cultivos masivos reactivos de péptido/tumor seleccionados (después de tres estimulaciones) a 10 células/pocillo como se describe para el Día 11 del Ejemplo 1.

Días 45-48: Los pocillos con crecimiento positivo se seleccionaron para determinar la reactividad del péptido a través c lulas tumorales se trataron con IFN^y20 ngml y actor de necrosis tumoral ala 3 ngml . ml durante la noche antes del ensayo.

Los esplenocitos estimulados con esplenocitos HLA-A2+ activados con LPS (3000 rad) pulsados con 1 pg/ml de péptido de cebado y 10 pg/ml de p2-microgobulina humana el día 0 produjeron 33 de los 960 pocillos con crecimiento positivo. Los datos para los cuatro clones más reactivos (números 2, 5, 6 y 8) se muestran en la Tabla 5 (después de 3 estimulaciones masivas; IFN-y (pg/ml)). Los esplenocitos estimulados con células T2 (17.000 rad) pulsados con 1 pg/ml de péptido produjeron 104 de 960 pocillos con crecimiento positivo. Los datos de los cuatro clones más reactivos (números 1, 50, 51 y 63) se muestran en la Tabla 5.

5cu <

da 21 de este ejemplo. Los clones reestimulados se congelaron instant neamente para la preparaci n de ARN.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra el aislamiento de un TCR anti-NY-ESO-1 murino y la reactividad específica del TCR aislado contra NY-ESO-1.

Se aisló el TCR de cinco clones (a saber, los clones B, H, 5, 6, 1, 50 y 63). La secuencia de nucleótidos (ARN) que codifica el TCR de cada clon se aisló, se secuenció y se transfectó a células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de los pacientes 1 y 2. Las células transfectadas se estimularon con OKT3 e IL-2 y se cultivaron solas (medio) o se cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control (VHB), células T2 pulsadas con péptido N Y -E S O -W m COA-A2-CEA (NY-ESO-1-), COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), o una de varias líneas celulares de tumores de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-eSo -1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), 1390 (NY-ESO-1+) o 624 (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy. Los resultados se muestran en la Tabla 6 (IFNy (pg/ml)).

E -1 espec ica m s alta y se eligi para un estudio adicional.

La secuencia de nucleótidos (ARN) que codifica el TCR TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12) se transfectó a PBMC humanas de los pacientes 3 y 4. Las células transfectadas se seleccionaron positivamente para las células CD8+ y CD4+, se estimularon con OKT3 e IL- 2, y se cultivaron solas (medio) o se cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control (VHB), células T2 pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1157-165, COS-A2-eSo (NY-ESO-1+), COA-A2-CEA (NY-ESO-1-), o una de varias líneas celulares de tumores de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+) o 624 (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFN^yy los resultados se muestran en la Tabla 7 (IFN^y(pg/ml)).

h-5LÜ

<

TABLA 7 reconocieron espec icamente las c lulas tumorales de melanoma NY-E -1+, seg n se midi mediante la secreción de IFNy.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T CD8+ y CD4+ humanas transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murinotras el cultivo conjunto con células dendríticas pulsadas con péptido NY-ESO-1.

Se transfectaron células T humanas CD8+ (Figura 1A) o CD4+ (Figura 1B) con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) o un TCR anti-NY-ESO-1. Las células transfectadas se cultivaron conjuntamente con células dendríticas pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1157-165 y se midió la secreción de IFNy.

Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) fueron reactivas contra las células dendríticas pulsadas con péptido NY-ESO-1157-165, según se midió por la secreción de IFNy. Las células T humanas CD8+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) fueron más reactivas contra las células dendríticas pulsadas con péptido NY-ESO-1157-165, según se midió por la secreción de IFNy, en comparación con las células CD8+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 humano.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino tras el cultivo conjunto con células tumorales de melanoma.

Se transfectaron células T humanas CD8+ (Figura 2A) o CD4+ (Figura 2B) con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) o un anti-NY-ESO- humano. 1 TCR. Las células transfectadas se cultivaron solas (medio) o se cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control, células T2 pulsadas con NY-ESO-1157-165 péptido, COA-A2-CEA (NY-ESO-1'), COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), o una de varias líneas celulares de tumores de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-EsO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), o 1363mel (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy.

Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, las células T humanas CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (^sE^qID NO: 11 y 12)) reconocieron específicamente el tumor de melanoma NY-ESO-1+ células, medido por la secreción de IFNy. Los linfocitos T humanos CD8+ y CD4+ transfectados con un TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26 (SEQ ID NO: 11 y 12)) fueron más reactivos contra las líneas de células tumorales NY-ESO-1+, según lo medido por IFNy secreción, en comparación con las células CD8+ y CD4+ transfectadas con un TCR anti-NY-ESO-1 humano.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células T CD8+ y CD4+ humanas transfectadas con una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje o con codones optimizados que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino tras el cultivo conjunto con células tumorales de melanoma.

Se transfectó una secuencia de nucleótidos (ARN) de tipo salvaje (SEQ ID NO: 19 y 20) o con codones optimizados (SEQ ID NO: 15 y 16) que codificaba el TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) a PBMC humanas CD8+ o CD4+ de los pacientes 5 y 6. Las células transfectadas se seleccionaron positivamente para las células CD8+ y CD4+, se estimularon con OKT3 e IL-2, y se cultivaron solas (medio) o cultivaron conjuntamente con células t2 pulsadas con péptido de control (HBVc), células T2 pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1157-165, COA-A2-CEA (NY-ESO-1-), COS-A2-ESO (NY-ESO-1+), o una de varias líneas celulares de tumores de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), A375 (NY-ESO-1+), o 624mel (NY-ESO-1+). Se midió la secreción de IFNy. Los resultados se muestran en la Tabla 8 (IFNy (pg/ml)).

nucle tidos de tipo salvaje o de cod n optimizado que codiica un T R anti-NY-E -1 murino TRAV6DTRBV26 reconocieron específicamente las células de tumor de melanoma NY-ESO-1+, medido por la secreción de IFNy.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra la reactividad de células T CD8+ humanas transfectadas con una secuencia de nucleótidos de tipo salvaje que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino tras el cultivo conjunto con células tumorales de melanoma y que no son de melanoma.

Se sometió a electroporación una secuencia de nucleótidos (ARN) (SEQ ID NO: 19 y 20) que codifica el TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) a células T humanas CD8+ de los pacientes 7 y 8. Las células no transfectadas (simulación) o las células transfectadas se seleccionaron positivamente para las células T CD8+, se estimularon con OKT3 e IL-2, y se cultivaron solas (medio) o se cultivaron conjuntamente con células T2 pulsadas con péptido de control (HBVc); células T2 pulsadas con diversas concentraciones de péptido NY-ESO-I157-165; COA-A2-C^eA (NY-ESO-1-); COS-A2-ESO (NY-ESO-1+); una de varias líneas celulares de tumor de melanoma 888mel (NY-ESO-1-), Sk23mel (NY-ESO-1-), A375mel (NY-ESO-1+), 1363mel (NY-ESO-1+), A375 (NY-ESO-1+); línea celular de sarcoma osteogénico Saos2 (NY-ESO-1+); línea celular de glioma LN-18 (NY-ESO-1+); línea celular de sarcoma de Ewing TC-71 (NY-ESO-1+); líneas celulares de neuroblastoma SKN AS (NY-ESO-1+) o SKN AS-A2 (NY-ESO-1+); o líneas celulares de cáncer de mama MDA 453S (NY-ESO-1+) o MDA 453S-A2 (NY-^eS^o-1+). Se midió la secreción de IPN^y. Los resultados se muestran en la Tabla 9 (IPN^y(pg/ml)).

TABLA 9

Como se muestra en la Tabla 9, las células T humanas CD8+ transfectadas con una secuencia de nucleótidos que el sarcoma osteog nico, el sarcoma de Ewing, el neuroblastoma y c lulas tumorales de c ncer de mama, medidas por la secreción de IFNy.

Ejemplo 8

Este ejemplo demuestra la preparación de vectores de expresión recombinantes que codifican un TCR anti-NY-ESO-1 murino.

Un vector retroviral que comprendía ADN que codificaba TCR anti-NY-ESO-1 humano de tipo salvaje (1G4), TCR 1G4 que tenía una doble sustitución dentro de la cadena CDR3a en la que leucina y tirosina se sustituían por treonina en la posición 95 (1G4-LY) (Robbins et al., J. Clin. Oncol., 29: 917-924 (2011); Robbins et al., J. Immunol., 180: 6116-6131 (2008)), o TCR anti-NY-ESO-1 murino (TRAV6D/TRBV26) (SEQ ID NO: 11 y 12) se clonaron en un esqueleto retroviral MSGVI y se transformaron en células TOP10. Un péptido de picornavirus 2A (SEQ ID NO: 13) conectó las cadenas alfa y beta. Se prepararon dos vectores que codificaban el ^tC^rTRAV6D/TRBV26 murino: uno contenía la secuencia de nucleótidos que codificaba la cadena alfa ubicada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codificaba la cadena beta (mESOap) (SEQ ID NO: 17), y uno contenía la secuencia de nucleótidos que codificaba la cadena beta ubicada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codificaba la cadena alfa (mESOpa) (SEQ ID NO: 18). La presencia de los insertos que codificaban las cadenas alfa y beta del TCR se confirmó mediante digestión con las enzimas de restricción Ncol y Not I. Se generó ADN a partir de un clon para cada uno de los TCR humanos y murinos mediante maxiprep.

El ADN de los vectores 1G4 TCR y 1G4-LY se transfectó a células 293GP para recoger el sobrenadante y transducir PBL en experimentos de transducción posteriores. Como control se utilizó un vector que codificaba GFP.

Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra la eficacia de transducción de un TCR anti-NY-ESO-1 murino.

Se estimularon linfocitos de sangre periférica (PBL) con OKT3 el día 0 (S1). Los PBL se transdujeron con el vector de TCR 1G4, 1G4-LY, mESOap o mESOpa del Ejemplo 8 los Días 3 y 4. Los Días 7-11, se evaluó la eficacia de transducción mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Para la FACS se utilizaron un anticuerpo que reconocía la región variable del TCR murino (VB13.1) y un anticuerpo que reconocía la región constante del TCR murino (mB). La FACS se realizó de 7 a 11 días después de la primera estimulación (S1D7-S1D11). Los resultados se resumen en la Tabla 10 a continuación.

TABLA 10

Como se muestra en la Tabla 10, los PBL transducidos con el vector de TCR mESOap o mESOpa se transdujeron con una eficacia similar en comparación con los vectores que codificaban los TCR 1G4 y 1G4-LY.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino.

Se estimularon PBL de cinco donantes y no se transdujeron o se transdujeron con vectores que codificaban GFP o los TCR 1G4-LY, mESOap o mESOpa como se describe en el Ejemplo 9. Se cultivaron conjuntamente PBL transducidos con una de las diversas líneas de células tumorales enumeradas en la Tabla 11A o 11B más abajo o con células T2 pulsadas con péptido SSX, sin péptido (T2) o una de las diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1157-165 enumeradas en la Tabla 12 a continuación. La secreción de IFN^yse midió mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) del sobrenadante de 24 horas de los cultivos conjuntos. El ELISA se realizó 6, 7 o 10 días después de la primera estimulación (S1D6, S1D7 y S1D10). Los resultados se muestran en las Vp13.1+ mp+.

TABLA 11A

TABLA 11B

TABLA 12

Las células transducidas con los vectores mESOap o mESOpa TCR reconocieron específicamente las líneas de células tumorales diana NY-ESO-1+/HLA-A*0201+ pero no las líneas celulares HLA-A*0201"/NY-ESO-1+ o HLA-A*0201+/NY-ESO-1" según se midió por la secreción de IFNy (Tablas 11A y 11B). Las células transducidas con los vectores de TCR mESOap o mESOpa reconocieron específicamente las células T2 pulsadas con el péptido NY-ESO-1 según se midió por la secreción de IFN^y(Tabla l2). El reconocimiento específico de NY-ESO-1 fue uniforme entre las células de cinco donantes diferentes. La funcionalidad de las células transducidas con el TCR anti-NY-ESO-1 murino fue comparable a la de las células transducidas con el TCR anti-NY-ESO-1 humano. La funcionalidad de las células transducidas con el vector de TCR mESOpa fue ligeramente superior en comparación con la de las células transducidas con el vector de TCR mESOap. Los PBL transducidos con los vectores de TCR mESOap o mESOpa reconocieron las células T2 pulsadas con tan solo 1 ng/ml, lo que indica que ambos mTCR son receptores de avidez relativamente alta. El cultivo conjunto de PBL que expresaban los vectores de TCR mESOap o mESOpa con células T2 de control que no fueron pulsadas con ningún péptido produjo niveles de fondo de IFN-^y. Las células del Paciente 1 transducidas con el TCR mESOpa tenían niveles más altos de secreción de IFN-^yen comparación con las células transducidas con el TCR mESOap para el mismo nivel de péptido. Las células del paciente 2 transducidas con el TCR mESOpa tenían niveles más altos de secreción de IFN-^yen comparación con las células transducidas con el TCR mESOap para el mismo nivel de péptido para concentraciones de péptido de 1 ug/ml, 100 ng/ml y 0,1 ng/ml.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino mantienen la expresión del TCR anti-NY-ESO-1 murino después de la expansión del número de células.

Los PBL de dos donantes se estimularon y no se transdujeron o se transdujeron con vectores que codificaban GFP o los TCR 1G4, 1G4-LY, mESOap o mESOpa como se describe en el Ejemplo 9. El número de PBL se expandió como describen Riddell et al., en Science, 257:238-241 (1992) y Dudley et al., en Cancer J. Sci. Am., 6:69-77 (2000). Generalmente, el número de PBL se expandió hasta 3 log utilizando OKT3 soluble, células alimentadoras irradiadas e IL-2 a dosis altas. La expresión de TCR anti-NY-ESO-1 murino mediante números expandidos (expandidos una vez) de células se midió mediante FACS dos veces (los días 10 y 20). Los resultados se resumen en la Tabla 13 (% VB13.1, células mB+ después de la expansión).

TABLA13

Como se muestra en la Tabla 13, el PBL transducido con el vector de TCR mESOap o mESOpa mantuvo la expresión del TCR anti-NY-ESO-1 murino después de la expansión del número de células.

Ejemplo 12

Este ejemplo demuestra que las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino mantienen la funcionalidad después de la expansión del número de células transducidas.

Se estimularon PBL de dos donantes y no se transdujeron o se transdujeron con vectores que codificaban GFP o los TCR 1G4-LY, mESOap o mESOpa como se describe en el Ejemplo 9. El número de células transducidas se expandió como se describe en el Ejemplo 11. Se cultivaron PBL expandidos transducidos solos (medio) o se cultivaron conjuntamente con una de las diversas líneas de células tumorales enumeradas en la Tabla 14 a continuación o con células T2 pulsadas con péptido SSX, sin péptido (T2) o una de las diversas concentraciones de péptido NY-ESO-1157-165 enumeradas en la Tabla 15 a continuación. La secreción de IFNy se midió mediante ELISA nueve días después de la segunda estimulación (S2D9). Los resultados se muestran en las Tablas 14 y 15 (IFNy pg/ml; Dilución 1:10).

TABLA 14

TABLA 15

La funcionalidad de las células transducidas expandidas también se evaluó mediante un ensayo de liberación de cromo. Las células transducidas expandidas (células efectoras) se cultivaron conjuntamente con células de melanoma diana, células 624,38 (Tabla 16A) o células A375 (Tabla 16B) en diversas proporciones de células efectoras: diana (E:T) y se midió el porcentaje de células diana lisadas. Los resultados se muestran en las Tablas 16A y 16B (porcentaje de células diana lisadas).

TABLA 16A

TABLA 16B

Como se muestra en las Tablas 14, 15, 16A y 16B, las células transducidas con un vector que codifica un TCR anti-NY-ESO-1 murino mantuvieron la funcionalidad después de la expansión del número de células transducidas.

Ejemplo 13

Este ejemplo demuestra un método de producción de clones de células de empaquetamiento para la producción de TCR mESOpa para una posible aplicación clínica.

Se utilizó ADN para el vector de TCR mESOpa para producir clones de células de empaquetamiento de vector retroviral en las condiciones requeridas para una posible aplicación clínica. Se utilizó sobrenadante de seis clones de células productoras de PG13 para transducir PBL. El análisis FACS de los PBL transducidos utilizando el anticuerpo anti-cadena p de TCR de ratón reveló que cada clon producía virus que mediaba la transducción de TCR positiva (Tabla 17). Para evaluar el reconocimiento específico de las células tumorales, los PBL modificados genéticamente con mTCR de cada clon de células productoras de PG13 se cultivaron conjuntamente con un panel de líneas celulares derivadas de melanoma y tumor de pulmón HLA-A*0201+ y HLA-A*0201" (Tabla 17). El IFN-gamma se midió mediante ELISA. Una comparación de los seis clones productores de mTCR PG13 mostró que las células T transducidas con el clon C1 liberaron altos niveles de IFN-^yen respuesta a HLA-A*0201+/NY-ESO-1+ la célula tumoral se dirigió a H1299-A2 y demostró la mayor eficacia de transducción (Tabla 17). Estas respuestas fueron específicas ya que se liberaron niveles de fondo de IFN-y en respuesta a las líneas celulares NY-ESO-1+/HLA-A*0201" y a las líneas celulares NY-ESO-1"/HLA-A*0201+ por cada clon (Figura 2). Basándose en este análisis, se seleccionó el clon C1 para la producción de un banco de células maestras para la posterior producción de sobrenadante retroviral de buenas prácticas de fabricación (BPF).

Ejemplo 14

Este ejemplo demuestra la eficacia de transducción de células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13.

Para comparar los respectivos TCR NY-ESO-1 (murino, o mTCR, versus humano, o hTCR (1G4-LY TCR)), se realizó un análisis FACS de PBL transducidos con sobrenadante retroviral de clones de células empaquetadoras utilizando los anticuerpos anti-cadena Vp de TCR de ratón y los anticuerpos anti-Vp13.1 después de una estimulación con OKT3 y después de una segunda expansión a gran escala utilizando el protocolo de expansión rápida (REP) (Tabla 18). Los resultados demostraron que tanto el mTCR como el hTCR tenían porcentajes equivalentes de transducción después de la estimulación, teniendo el mTCR niveles de transducción iguales o mayores después de REP (Tabla 18).

TABLA 18

Ejemplo 15

Este ejemplo demuestra la reactividad de las células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células empaquetadoras del Ejemplo 13.

El reconocimiento de cada TCR se evaluó sometiendo las células T transducidas con mTCR y hTCR a cultivo conjunto con células T2 pulsadas con péptido NY-ESO-1. Tanto el mTCR como el hTCR secretaron específicamente IFN-y al encontrarse con el péptido antigénico de una manera dependiente de la dosis después de una estimulación con OKT3 y después de REP (Tabla 19). Después de una estimulación, tanto el mTCR como el hTCR reconocieron las células T2 pulsadas con tan solo 0,1 ng/ml, lo que indica que ambos mTCR son receptores de avidez relativamente alta. Después de la expansión del número de células, el mTCR liberó niveles más altos de IFN-y en comparación con las células T transducidas con el vector hTCR a cada concentración de péptido (Tabla 19). El cultivo conjunto de PBL que expresaban mTCR contra NY-ESO-1 o Htcr contra NY-ESO-1 con células de control T2 que no fueron pulsadas con ningún péptido produjo niveles de fondo de IFN-^y.

Para evaluar el reconocimiento específico de las células tumorales, los PBL modificados genéticamente con mTCR se cultivaron conjuntamente con un panel de líneas celulares derivadas de melanoma y tumor de pulmón HLA-A*0201+ y HLA-A*0201". Se observó una liberación específica de IFN-y cuando tanto el PBL modificado genéticamente con mTCR como el hTCR se cultivaron conjuntamente con líneas celulares HLA-A*0201+/NY-ESO-1 pero no líneas celulares HLA-A*02017"/NY-ESO-1+ o HLA-A*0201+/NY-ESO-1" (Tabla 20 (se muestran experimentos representativos)).

TABLA 20

Ejemplo 16

Este ejemplo demuestra la lisis específica de células de melanoma por células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células de empaquetamiento del Ejemplo 13.

También se comparó la lisis específica de líneas celulares de melanoma por el mTCR y el hTCR. La capacidad del PBL transducido para lisar las células tumorales HLA-A*0201+/NY-ESO-1+ se midió utilizando un ensayo de bioluminiscencia CYTOTOX-GLO (Promega, Madison, WI). Este ensayo utiliza un sustrato peptídico luminogénico, el sustrato AAF-GLO, para medir la actividad de la proteasa de células muertas, que se libera de las células que han perdido la integridad de la membrana, lo que genera una señal luminiscente de "tipo resplandor" que es proporcional al número de células muertas en la muestra. El sustrato AAF-GLO no puede atravesar la membrana intacta de las células vivas y no genera ninguna señal apreciable de la población de células vivas. En estos ensayos, los PBL modificados con TCR se incubaron conjuntamente con proporciones crecientes de células diana (E:T) en medio AIM-V en placas de 96 pocillos con fondo en U a 37°C durante 4 horas (h). La lisis se midió mediante liberación de eector liberaci n espont nea de la diana ]liberaci n total de la diana - liberaci n espont nea de la diana x 100 , promedio de muestras cuadriplicadas. Se mide poca o ninguna lisis celular como valor negativo.

Como se muestra en la Tabla 21, los PBL transducidos con mTCR y hTCR demostraron una actividad lítica similar contra la línea de células tumorales NY-ESO-1+/HLA-A*0201+ de melanoma 624.38mel. Hubo poca o ninguna lisis de la línea celular HLA-A*0201' 938 mel, y los PBL transducidos con GFP no mostraron reactividad contra ninguna de las células diana (Tabla 21).

TABLA 21

Ejemplo 17

Este ejemplo demuestra la actividad antitumoral de las células transducidas con un TCR mESOpa o TCR humano utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células de empaquetamiento del Ejemplo 13.

También se investigó la actividad antitumoral de los linfocitos T CD4+ transducidos con el mTCR y el hTCR. Los PBL transducidos con hTCR NY-ESO-1 y mTCR NY-ESO-1 se enriquecieron con cuentas magnéticas CD4+, a continuación, se cultivaron conjuntamente durante 16 horas con un panel de líneas celulares derivadas de melanoma y tumor de pulmón HLA-A*0201+ y HLA-A*0201'. Los linfocitos T CD4+ transducidos con el mTCR y el hTCR tuvieron una liberación específica de IFN-^ycuando se cultivaron conjuntamente con las líneas celulares HLA-A*0201+/NY-ESO-1+ pero no con las líneas celulares HLA-A*02017 NY-ESO-1+ (Tabla 22).

TABLA 22

Ejemplo 18

Este ejemplo demuestra el reconocimiento específico de diferentes histologías tumorales por células transducidas con un TCR mESOpa utilizando un sobrenadante retroviral del clon de células de empaquetamiento del Ejemplo 13. Para evaluar el reconocimiento específico de diversas histologías tumorales, se cultivaron conjuntamente PBL transducidos con mTCR NY-ESO-1 con diferentes líneas celulares HLA-A*0201+/ NY-ESO-1+ derivadas de melanoma (A375), cáncer de pulmón de células no pequeñas (H1299-A2), neuroblastoma (SKN AS-A2), cáncer de mama (MDA-435S-A2) y osteosarcoma (Saos2). Se observó una liberación específica de IFN-^y(Tabla 23).

TABLA 23

Ejemplo 19

Este ejemplo demuestra el reconocimiento de células tumorales tratadas con DAC por PBL transducidos con un TCR mESOpa.

El aumento de las concentraciones del agente desmetilante de ADN 5-aza-2'-desoxicitidina (decitabina; DAC) induce la expresión de varios antígenos de cáncer de testículo en las células de cáncer de pulmón (Rao et al., Ther. Tar. and Chem. Bio., 71: 4192-4204 (2011)). Sin estar ligado a una teoría o mecanismo concretos, se cree que la DAC puede, potencialmente, regular por incremento la expresión de NY-ESO-1 en células cancerosas, lo que puede mejorar la capacidad de los TCR para reconocer NY-ESO-1.

Se cultivaron conjuntamente PBL transducidos o no transducidos con mTCR NY-ESO-1 durante 16 horas con las líneas de células diana tumorales de diferentes histologías (mostradas en las Tablas 24A-24B) que habían sido expuestas a DAC a las concentraciones mostradas en las Tablas 24A-24B durante 72 horas. Se midieron los niveles de interferón-gamma. Los resultados se muestran en la Tabla 24A-24B.

TABLA 24A

TABLA 24B

Como se muestra en las Tablas 24A y 24B, el PBL transducido con el TCR mESOpa demostró una mayor reactividad hacia el cáncer de próstata diana tratado con DAC y el cáncer colorrectal, respectivamente, en comparación con las células diana no tratadas.

Ejemplo 20

por PBL transducidos con el T R mE pa o T R humano.

Se cultivaron conjuntamente PBL humanos no transducidos o PBL humanos transducidos con mTCR (mESOpa del clon C1), hTCR (TCR 1G4-LY) o proteína verde fluorescente (GFP) durante 16 horas con células T2 no tratadas o células T2 que se pulsaron previamente con diferentes concentraciones de péptido como se muestra en las Tablas 25A y 25B. Se midió el interferón gamma. Los resultados se muestran en la Tabla 25A y 25B. Como se muestra en las Tablas 25A y 25B, el mTCR reconoce SEQ ID NO: 24 mientras que el hTCR no lo hace. Además, el hTCR reconoce SEQ iD NO: 27 pero el mTCR no.

TABLA 25A Donante K

TABLA 25B Donante L

Claims

1. Una población de células para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero. en donde la población de células es autóloga o alogénica para el mamífero y la población de células comprende al menos una célula anfitriona que comprende un vector de expresión recombinante,

en donde el vector de expresión recombinante comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un receptor de células T (TCR) aislado o purificado,

en donde el TCR comprende la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad de la cadena alfa (CDR) 1 de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8, y tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1 (SEQ ID NO: 1).

2. La población de células para el uso de la reivindicación 1, en donde el TCR tiene especificidad antigénica para NY-ESO-1157-165 (SEQ ID NO: 2).

3. La población de células para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y 10.

4. La población de células para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y 12.

5. La población de células para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la población de células es autóloga para el mamífero.

6. La población de células para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la población de células es alogénica para el mamífero.

7. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la secuencia de nucleótidos tiene codones optimizados.

8. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia de nucleótidos comprende SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, tanto SEQ ID NO: 15 como 16, o tanto SEQ ID NO: 19 como 20.

9. La población de células para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5 está situada 5' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8,

10. La población de células para el uso de la reivindicación 9, en donde el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 17.

11. La población de células para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5 está situada 3' respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ I^dNO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8.

12. La población de células para el uso de la reivindicación 11, en donde el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 18.

13. La población de células para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde las células son humanas.

14. La población de células para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la población de células se combina con un portador farmacéuticamente aceptable.

15. La población de células para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de tiroides, cáncer de ovario o sarcoma de células sinoviales.