ES2246502T3 - Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. - Google Patents

Abstract

UN RATON TRANSGENICO QUE POSEE UN GENOMA QUE COMPRENDE UN TRANSGEN DEL MINILOCUS DE LA CADENA PESADA DE INMUNOGLOBULINA HUMANA, SIENDO CAPAZ EL TRANSGEN DE REORDENARSE Y ACTIVARSE EN EL RATON, DE MODO QUE SE PRODUCEN DOS O MAS ISOTIPOS DE CADENA PESADA HUMANA REORDENADOS.

Description

Animales no humanos transgénicos capaces de producir anticuerpos heterólogos.

Campo técnico

La invención se refiere a ratones transgénicos capaces de producir anticuerpos heterólogos. También se describen en este documento transgenes usados para producir tales animales transgénicos, células B inmortalizadas capaces de producir anticuerpos heterólogos, métodos y vectores para romper loci de inmunoglobulinas endógenas, métodos para generar un repertorio de segmentos génicos de región variable de inmunoglobulinas sintéticas y métodos para inducir la producción de anticuerpos heterólogos.

Antecedentes de la invención

Uno de los impedimentos principales con los que se enfrenta el desarrollo de aplicaciones in vivo para anticuerpos monoclonales en seres humanos es la inmunogenicidad intrínseca de inmunoglobulinas no humanas. Los pacientes responden a dosis terapéuticas de anticuerpos monoclonales de roedores fabricando anticuerpos contra las secuencias de inmunoglobulina de roedor. Estos anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA) neutralizan los anticuerpos terapéuticos y pueden producir toxicidad aguda. La respuesta de HAMA es menos dramática en pacientes inmunodeficientes. Por lo tanto, la inmunogenicidad intrínseca no ha impedido el uso de anticuerpos monoclonales de roedor para el tratamiento del rechazo de injertos, lo cual implica la atenuación temporal de la respuesta inmune del paciente. Los anticuerpos de roedor también pueden ser útiles para tratar ciertos linfomas que implican inmunodeficiencias. Sin embargo, incluso los pacientes inmunodeficientes pueden crear una respuesta de HAMA que conduce a una reducción de la seguridad y la eficacia.

La presente tecnología para generar anticuerpos monoclonales implica la pre-exposición, o cebado, de un animal (normalmente una rata o ratón) con un antígeno. Esta pre-exposición conduce a la formación de células B esplénicas que secretan moléculas de inmunoglobulina con alta afinidad por el antígeno. Después se fusionan células de bazo de un animal cebado con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales, secretoras de anticuerpo. Se seleccionan clones de hibridoma individuales para identificar las células que producen inmunoglobulinas dirigidas contra un antígeno particular.

Se ha propuesto la modificación por ingeniería genética de genes de anticuerpo individuales. Se ha informado sobre dos estrategias de ingeniería genética: anticuerpos quiméricos y trasplante de regiones determinantes de complementariedad (CDR). La estrategia más simple, los anticuerpos quiméricos, se aprovechan del hecho de que las porciones variable y constante de una molécula de anticuerpo están codificadas por exones distintos. Por medio de una simple fusión de exones de las regiones variables de un gen de un anticuerpo de ratón reorganizado con exones de una región constante humana, se puede obtener un gen de anticuerpo híbrido (Morrison, S.L., et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855). El principal problema que surge con esta estrategia es que aunque se elimina la región Fc de ratón altamente inmunogénica, las secuencias Fab de ratón restantes siguen siendo inmunogénicas (Bruggemann, et al. (1989), J. Exp. Med., 170, 2153-2157). La estrategia de transplante de CDR usa un modelo de ordenador para generar un anticuerpo completamente artificial en el cual las únicas regiones de ratón son las implicadas en la unión del antígeno (Riechmann, L., et al. (1988), Nature, 322, 323-327). Cada una de estas estrategias requiere la caracterización previa de un anticuerpo monoclonal de roedor dirigido contra el antígeno de interés, y ambas requieren la generación de una línea celular transfectada estable que produzca altos niveles del anticuerpo modificado por ingeniería genética.

Otra estrategia para la producción de anticuerpos humanos es una propuesta que implica la construcción de bibliotecas de expresión bacteriana que contienen secuencias de ADNc de inmunoglobulinas (Orlandi, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833-3837, y Huse, et al. (1989), Science, 246, 1275-1281). Esta técnica supuestamente sólo se ha usado para generar fragmentos de anticuerpo derivados de secuencias de ADNc de ratón.

Varios experimentos han informado sobre el uso de líneas celulares transfectadas para determinar las secuencias de ADN específicas requeridas para el reorganización de genes de Ig (revisado por Lewis y Gellert (1989), Cell, 59, 585-588). Estos informes han identificado secuencias probables y han concluido que la accesibilidad de estas secuencias a los enzimas recombinasas usados para la reorganización está modulada por la trascripción (Yancopoulos y Alt (1985), Cell, 40, 271-281). Las secuencias para la unión V(D)J, según se dice, constan de un heptámero casi palindrómico altamente conservado y un nanómero rico en AT peor conservado separados por un espaciador de 12 o 23 pares de bases (pb) (Tonegawa (1983), Nature, 302, 575-581; Hesse, et al. (1989), Genes in Dev., 3, 1053-1061). Según parece, sólo tiene lugar una recombinación eficaz entre sitios que contienen las secuencias señal de recombinación con regiones espaciadores de diferente longitud.

También se ha informado sobre la producción de ratones transgénicos que contienen diversas formas de genes de inmunoglobulinas. Se han usado genes de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulinas de ratón reorganizados para producir ratones transgénicos. Estos transgenes, según parece, son capaces de excluir el reorganización de genes de Ig endógena. Véase, por ejemplo, Weaver et al. (1985), Cell, 42, 117-127; Iglesias, et al. (1987), Nature, 330, 482-484; Storb et al. (1985), Banbury Reports, 20, 197-207; Neuberger et al. (1989), Nature, 338, 350-352 ; Hagman et al. (1989), J. Exp. Med., 169, 1911-1929; y Storb (1989) en Immunoglobulin Genes, Academic Press, T. Honjo, F.W. Alt y T.H. Rabbitts eds. páginas 303-326. Además, se han expresado genes de Ig humana funcionalmente reorganizados que incluyen la región constante \mu o \gammal en ratones transgénicos. Yamamura et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2152-2156; Nussenzweig, et al. (1987), Science, 236, 816-819. En el caso del gen de la cadena pesada reorganizado \mu, se ha informado sobre la exclusión alélica de loci de genes de inmunoglobulinas endógenas.

Sin embargo, no siempre se produce exclusión alélica en todas las células B transgénicas. Véase, por ejemplo, Rath, et al, (1989), J. Immunol., 143, 2074-2080 (construcción del gen \mu reorganizado); Manz, et al. (1988), J. Exp. Med., 168, 1363-1381 (transgenes \mu que carecían de exones transmembrana no previnieron el reorganización de los genes endógenos); Ritchie, et al. (1984), Nature, 312, 517-520 y Storb, et al. (1986), Immunol. Rev., 89, 85-102 (ratones transgénicos que expresan el transgen \kappa reorganizado capaz de formar un complejo de cadena pesada/ligera estable sólo reorganizan los genes \kappa endógenos en células B que no pueden reorganizar correctamente el gen de la cadena pesada endógena); y Manz, et al. (1988), J. Exp. Med., 168, 1363-1381 (ratones transgénicos que contienen el gen \kappa que codifica una cadena ligera incapaz de combinarse con cadenas pesadas, muestran sólo un bajo nivel de exclusión alélica). Véase también, Nussenzweig, et al. (1988), Nature, 336, 446-450); Durdik, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2346-2350; y Shimizu, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8020-8023.

También se ha informado sobre una mutación somática en una construcción del gen \kappa de ratón de 15 kb en ratones transgénicos hiperinmunizados (O'Brien, et al. (1987), Nature, 326, 405-409; Storb (1989) en Immunoglobulin Genes, Academic Press, T. Honjo, F.W. Alt, y T.H. Rabbitts, eds. páginas 303-326) y en la porción variable del transgen de cadena pesada \mu (Durdik, et al, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2346-2350).

El reorganización de genes de Ig, aunque se ha estudiado en células de cultivo de tejidos, no se ha examinado de forma extensa en ratones transgénicos. Sólo se han publicado un puñado de informes que describen construcciones de ensayo de reorganización introducidas en ratones [Buchini, et al. (1987), Nature, 326, 409-411 (transgen \gamma de pollo no reorganizado); Goodhart, et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4229-4233) (gen \kappa de ratón no reorganizado); y Bruggemann, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6709-6713 (cadena pesada ratón-humano híbrida)]. Sin embargo, los resultado de estos experimentos han sido variables produciendo, en algunos casos, reorganizaciones incompletas o mínimas del transgen.

En base a lo anterior, está claro que existe la necesidad de anticuerpos monoclonales heterólogos, por ejemplo, anticuerpos de origen humano, derivados de una especie distinta de la humana. De esta manera, es un objeto de la presente invención proporcionar una fuente de anticuerpos monoclonales que pueda usarse desde un punto de vista terapéutico en la especie en particular para la cual se han diseñado.

De acuerdo con el objeto anterior, se proporcionan ratones transgénicos que son capaces de producir un anticuerpo humano.

También pueden proporcionarse células B a partir de estos ratones transgénicos que son capaces de expresar anticuerpo heterólogos. Estas células B pueden inmortalizarse para proporcionar una fuente de anticuerpo monoclonal específico para un antígeno particular.

De acuerdo con lo anterior, pueden obtenerse células de hibridoma que son capaces de producir estos anticuerpos monoclonales heterólogos.

Los ratones transgénicos de la invención se producen proporcionando transgenes de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizados heterólogos.

Además, para producir los ratones transgénicos de la invención pueden emplearse métodos para romper loci de inmunoglobulina endógena en los ratones transgénicos.

La producción de anticuerpos heterólogos en los ratones transgénicos mencionados anteriormente puede inducirse por métodos descritos en este documento.

Pueden construirse uno o más transgenes adecuados para la invención usando un repertorio de segmentos génicos de región variable de inmunoglobulina generado de acuerdo con métodos descritos en este documento.

Sumario de la invención

De acuerdo con los objetos anteriores, la invención proporciona un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgen que comprende secuencias de ADN que codifican las regiones variable humana (V), de diversidad (D), de unión (J) y constante de una proteína Ig humana, estando dichas secuencias unidas de forma operativa a secuencias reguladoras de la transcripción y capaces de experimentar un reorganización génico in vivo, cuando se integran en un animal transgénico no humano, para producir un gen reorganizado que codifica un polipéptido de cadena pesada humana, comprendiendo también dicha construcción una región donadora de cambio \mu en posición 5' con respecto a una región constante \mu y una región aceptora de cambio \gamma humana entre la región constante \mu y una región constante \gamma humana, estando dichas secuencias de cambio unidas de forma operativa para efectuar el cambio in vivo y para la producción de una cadena polipeptídica pesada \gamma humana. En las células B del ratón transgénico se encuentran transgenes de cadena pesada de inmunoglobulina heterólogos reorganizados de forma funcional.

Pueden introducirse transgenes de inmunoglobulina no reorganizados de cadena pesada y/o ligera heterólogos en un ratón hospedador para producir un animal no humano transgénico que contenga un gen de inmunoglobulina heterólogo de cadena pesada y ligera o un animal intermedio que contenga uno o el otro transgen. Cuando se incorporan dentro de la línea germinal de estos animales intermedios, los cruces entre uno que contiene el transgen de cadena pesada y otro que contiene el transgen de cadena ligera producen animales no humanos transgénicos que contienen los dos transgenes de inmunoglobulina heterólogos de cadena pesada y ligera.

Los transgenes de la invención incluyen un transgen de cadena pesada que comprende ADN que codifica al menos un segmento génico variable, un segmento génico de diversidad, un segmento génico de unión y un segmento génico de región constante. El transgen de cadena ligera de inmunoglobulina comprende ADN que codifica al menos un segmento génico variable, un segmento génico de unión y un segmento génico de región constante. Los segmentos génicos que codifican la cadena ligera y los segmentos génicos de cadena pesada son heterólogos al ratón transgénico, ya que proceden de, o corresponden a un ADN que codifica segmentos génicos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana (es decir, proceden de una especie que no es el ratón transgénico). De acuerdo con la presente invención, el transgen se construye de modo que los segmentos génicos individuales no estén reorganizados, es decir, no estén reorganizados para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina funcional. Estos transgenes no reorganizados permiten la recombinación de los segmentos génicos (reorganización funcional) y la mutación somática de las cadenas pesadas de inmunoglobulina reorganizadas resultantes dentro del ratón transgénico cuando se expone al antígeno.

En estas construcciones transgénicas, las diferentes secuencias reguladoras, por ejemplo, secuencias promotores, potenciadores, regiones de cambio de clase, señales de recombinación y similares, comprenden secuencias correspondientes derivadas del ADN humano heterólogo. De forma alternativa, estas secuencias reguladoras pueden incorporarse en el transgen procedente de la misma especie o de una especie relacionada con el ratón usado en la invención. Por ejemplo, pueden combinarse segmentos génicos de inmunoglobulina humana en un transgen con una secuencia potenciadora de inmunoglobulina de roedor para uso en el ratón transgénico.

Los ratones transgénicos de acuerdo con la invención pueden emplearse para obtener anticuerpos de alta afinidad como se indica a continuación. El ratón transgénico que contiene transgenes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina no reorganizados en la línea germinal - que experimentan unión VDJ durante la diferenciación de las células D - se pone en contacto con un antígeno para inducir la producción de un anticuerpo heterólogo en una célula B de repertorio secundario. Esta inducción causa mutación somática en los transgenes de cadena pesada reorganizados contenidos en las células B de repertorio primario para producir un anticuerpo heterólogo que tiene alta afinidad y especificidad por el antígeno.

Estas células B productoras de anticuerpo pueden inmortalizarse por transformación con un virus o con un oncogen que contenga una construcción de ADN, o de forma alternativa, pueden inmortalizarse por fusión con una línea celular de mieloma para forma hibridomas secretores de anticuerpo. En cualquier caso, pueden seleccionarse clones que tengan suficiente afinidad y especificidad por un antígeno particular para proporcionar una fuente de anticuerpo monoclonal que tenga baja inmunogenicidad en la especie de la que proceden los segmentos génicos de inmunoglobulina de los transgenes (es decir, humanos).

En este documento se describen vectores y métodos para romper los loci de inmunoglobulinas endógenas en el animal no humano que se usará en la invención. Estos vectores y métodos utilizan un transgen, preferiblemente un vector de selección positiva-negativa, que se construye de modo que se dirija a la rotura funcional de una clase de segmentos génicos que codifican una cadena pesada de inmunoglobulina endógena para el ratón usando en la invención. Estos segmentos génicos endógenos incluyen segmentos génicos de la región de diversidad, de la región de unión y de la región constante. El vector de selección positiva-negativa se pone en contacto con al menos una célula madre embrionaria del ratón, después de lo cual pueden seleccionarse células en las que se haya integrado el vector de selección positiva-negativa en el genoma del ratón por medio de recombinación homóloga. Después del trasplante, el ratón transgénico resultante es substancialmente incapaz de dar origen a una respuesta inmune mediada por inmunoglobulina como resultado de la integración homóloga del vector. Estos animales no humanos con inmunodeficiencia posteriormente pueden usarse para estudios de deficiencias inmunes o pueden usarse como los receptores de transgenes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas heterólogas.

También se describen métodos para generar un repertorio de segmentos génicos de región variable sintética que se usarán en los transgenes adecuados para uso en la invención. El método comprende generar una población de ADN de segmentos V de inmunoglobulina, donde cada uno de los ADN de los segmentos V codifica un segmento V de inmunoglobulina y contiene en cada extremo un sitio de reconocimiento de escisión de una endonucleasa de restricción. La población de los ADN de segmentos V de inmunoglobulina posteriormente se concatena para formar un repertorio de segmentos V de inmunoglobulina sintética.

Los ratones transgénicos adicionalmente pueden contener transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina heterólogos reorganizados de forma funcional en la línea germinal del animal transgénico. Estos animales contienen células B de repertorio primario que expresan estos transgenes de cadena ligera reorganizados. Estas células B son capaces de experimentar mutación somática cuando entran en contacto con un antígeno para formar un anticuerpo heterólogo con alta afinidad y especificidad por el antígeno.

De esta manera, la invención también incluye ratones transgénicos que contienen células de la línea germinal con transgenes de cadena pesada y ligera, donde el transgen reorganizado es un transgen de cadena ligera de inmunoglobulina y el transgen no reorganizado es un transgen de cadena pesada de inmunoglobulina.

Pueden emplearse métodos para producir anticuerpos heterólogos en un ratón transgénico que contenga células B de repertorio primario con transgenes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas heterólogos reorganizados. Estos ratones transgénicos puede obtenerse a partir de cualquier ratón transgénico mencionado anteriormente. De esta manera, los ratones transgénicos que contienen transgenes de cadena pesada y ligera no reorganizados, y los ratones transgénicos que contienen transgenes de cadena ligera reorganizados y transgenes de cadena pesada no reorganizados en la línea germinal del animal, contienen, cada uno, células B de repertorio primario que tienen transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina heterólogos. Puede producirse un primer anticuerpo heterólogo deseado que sea capaz de unirse a un primer antígeno. Se sabe que los transgenes de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina reorganizados en las células B de repertorio primario de estos animales producen anticuerpos de repertorio primario que tienen suficiente afinidad por un segundo antígeno conocido. En este método, el ratón transgénico puede entrar en contacto, de forma secuencial o simultánea, con el primer y el segundo antígeno para inducir la producción del primer anticuerpo heterólogo por mutación somática de los transgenes reorganizados. Las células B de repertorio secundario producidas de esta manera se manipulan después como se ha descrito previamente para inmortalizar la producción del anticuerpo monoclonal deseado capaz de unirse al primer antígeno.

Para generar el ratón transgénico de acuerdo con la presente invención pueden emplearse plásmidos. Estos plásmidos son útiles para clonar fragmentos de ADN grandes (por ejemplo, fragmentos genómicos de inmunoglobulinas), y tienen un origen de replicación (ORI), una región de control de copias (por ejemplo, ROP, o la región de control de copias de pACYC177, u otros conocidos por los especialistas en la técnica), y un sitio de clonación. Los plásmidos también incluyen un terminador de la transcripción (por ejemplo, trpR u otros conocidos por los especialistas en la técnica) cadena abajo de los promotores derivados del plásmido endógenos tales como el gen de resistencia a la ampicilina (amp^{R}). El terminador de la trascripción se localiza cadena arriba del sitio de clonación, de manera que los transcritos que se originan en el motor terminan cadena arriba del sitio de clonación. Preferiblemente, el sitio de clonación está flanqueado por sitios de restricción poco frecuentes, que son sitios constituidos por 7, 8 o más nucleótidos, en lugar de los 6 o menos nucleótidos que forman los sitios de restricción más comunes; por ejemplo, Not I, Sfi I y Pac I. Los sitios de restricción poco comunes también incluyen sitios que contienen secuencias de nucleótidos que aparecen con poca frecuencia en las secuencias de ADN de origen natural; es decir, con una frecuencia menor de aproximadamente una vez cada 8.000- 10.000 nucleótidos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa las regiones determinantes de complementariedad CDR1, CDR2 y CDR3 y las regiones estructurales FR1, FR2, FR3 y FR4 en el ADN genómico no reorganizado y en el ARN mensajero expresado a partir de un gen de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado.

La figura 2 representa el locus de la cadena \lambda humana.

La figura 3 representa el locus de la cadena \kappa humana.

La figura 4 representa el locus de la cadena pesada humana.

Las figuras 5 y 6 representan la estrategia para la generación de un repertorio de segmentos V sintéticos.

La figura 7 representa la estrategia de rotura funcional de loci de inmunoglobulina endógenos.

La figura 8 representa la respuesta secundaria mediada por células T que conduce a la maduración de las células B.

La figura 9 representa la mutación somática y la expansión clonal de células B en respuesta a dos antígenos diferentes.

La figura 10 representa una construcción transgénica que contiene un gen de IgM reorganizado ligado a un fragmento de 25 kb que contiene las regiones constantes \gamma3 y \gamma1 humana seguidas de un fragmento de 700 pb que contiene la secuencia potenciadora 3' de la cadena de rata.

La figura 11 es un mapa de restricción del locus de la cadena \kappa humana que representa los fragmentos a usar para formar un transgen de cadena ligera por medio de recombinación homóloga in vivo.

La figura 12 representa la construcción de pGP1.

La figura 13 representa la construcción del polienlazador contenido en pGP1.

La figura 14 representa los fragmentos usados para construir un transgen de cadena pesada humana de la invención.

La figura 15 representa la construcción de pHIG1 y pCON1.

La figura 16 representa los fragmentos C\gamma1 humanos que se insertan en pRE3 (potenciador 3' de rata) para formar pREG2.

La figura 17 representa la construcción de pHIG3' y PCON.

La figura 18 representa el fragmento que contiene los segmentos de la región D humana usado en la construcción de los transgenes de la invención.

La figura 19 representa la construcción de pHIG2 (plásmido que contiene el segmento D).

La figura 20 representa los fragmentos que cubren los segmentos génicos humano J\kappa y humano C\kappa usados en la construcción de un transgen de la invención.

La figura 21 representa la estructura de pE\mu.

La figura 22 representa la construcción de pKapH.

Las figuras 23A a 23D representan la construcción de un vector de selección positiva-negativo para la rotura funcional del locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno de ratón.

Las figuras 24A a 24C representan la construcción de un vector de selección positiva-negativa para la rotura funcional de loci de cadena ligera de inmunoglobulina endógena en ratón.

Las figuras 25a a e representan la estructura de un vector dirigido hacia la cadena ligera kappa.

Las figuras 26a a f representan la estructura de un vector dirigido a la cadena pesada de ratón.

La figura 27 representa el mapa del vector pGPE.

La figura 28 representa la estructura del vector pJM2.

La figura 29 representa la estructura del vector pCOR1.

La figura 31 representa la estructura de p\gammae2.

La figura 32 representa la estructura de pVGE1.

La figura 33 representa los resultados del ensayo de expresión de Ig humana en un ratón transgénico pHC1.

La figura 34 representa la estructura de pJCK1.

La figura 35 representa la construcción de una región variable de cadena pesada sintética.

La tabla 1 representa la secuencia del vector pGPe.

La tabla 2 representa la secuencia del gen V_{H}49.8.

Descripción detallada

El diseño de un ratón transgénico que responda a la estimulación por antígenos extraños con un repertorio de anticuerpos humanos heterólogos, requiere que los transgenes de inmunoglobulina heterólogos contenidos en el animal transgénico funcionen correctamente a lo largo de la vía del desarrollo de células B. Como consecuencia, los transgenes se construyen de manera que produzcan uno o todos los puntos siguientes: (1) alto nivel de expresión y específica del tipo celular, (2) reorganización génica funcional, (3) activación y respuesta a la exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señales, (6) cambio de clase, (7) hipermutación somática, y (8) dominio del locus del anticuerpo transgénico durante la respuesta inmune.

Como será evidente a partir de la siguiente descripción, no es necesario cumplir todos los criterios anteriores. Por ejemplo, en los ratones transgénicos en los que los loci de inmunoglobulina endógena se rompen de forma funcional, el transgen no necesita activar la exclusión alélica. Además, cuando el transgen comprende un gen de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado de manera funcional, el segundo criterio del reorganización génica funcional es innecesario para ese transgen de cadena ligera que ya está reorganizado. Como antecedentes sobre inmunología molecular, véase, Fundamental Immunology, 2ª edición (1989), Paul William E., ed. Raven. Press, N.Y.

La Estructura y Generación de Anticuerpos

Las inmunoglobulinas, también conocidas como anticuerpos, son un grupo de glicoproteínas presentes en el suero y en los fluidos tisulares de todos los mamíferos. Se producen en grandes cantidades por células plasmáticas (también denominadas en este documento "células B de repertorio secundario") que se desarrollan a partir de linfocitos B precursores (denominados en este documento "células B de repertorio primario"). Estas células B de repertorio primario llevan unida a su membrana una inmunoglobulina que es similar a la producida por las células B de repertorio secundario completamente diferenciadas. Se requiere el contacto entre las células B de repertorio primario y un antígeno extraño para la inducción de la formación de anticuerpos.

La estructura básica de todas las inmunoglobulinas se basa en una unidad que consta de dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas unidas a través de puentes disulfuro. Cada cadena ligera comprende dos regiones conocidas como la región variable de la cadena ligera y la región constante de la cadena ligera. De forma similar, la cadena pesada de la inmunoglobulina comprende dos regiones denominadas región variable de la cadena pesada y región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada o ligera está codificada por secuencias genómicas denominadas segmentos génicos de región constante de cadena pesada o ligera. El uso de un segmento génico de cadena pesada particular define la clase de inmunoglobulina. Por ejemplo, en humanos, los segmentos génicos de la región constante \mu definen la clase IgM de anticuerpos, mientras que el uso de un segmento génico de la región constante \gamma, \gamma2, \gamma3 o \gamma4 define las clases IgG de anticuerpos así como las subclases de IgG desde la IgG1 a la IgG4.

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas conjuntamente contienen el dominio de unión al antígeno del anticuerpo. Debido a la necesidad de diversidad en esta región del anticuerpo para permitir la unión a una amplia serie de antígenos, el ADN que codifica la región variable del repertorio primario o inicial comprende varios segmentos de ADN diferentes derivados de familias de segmentos génicos de región variable específicos. En el caso de la región variable de la cadena ligera, estas familias comprenden segmentos génicos variables (V) y segmentos génicos de unión (J). De esta manera, la región variable inicial de la cadena ligera está codificada por un segmento génico V y un segmento génico J, estando seleccionado cada uno entre la familia de segmentos génicos V y J contenidos en el ADN genómico del organismo. En el caso de la región variable de la cadena ligera, el ADN que codifica la región variable del repertorio inicial o primario de la cadena pesada comprende un segmento génico V de cadena pesada, un segmento génico de diversidad de la cadena pesada (D) y un segmento génico J, estando seleccionado cada uno entre las familias de segmentos génicos de inmunoglobulinas V, D y J apropiados en el ADN genómico.

El Repertorio Primario

El proceso para la generación del ADN que codifica los genes de las cadenas pesada y ligera de las inmunoglobulinas tiene lugar principalmente durante el desarrollo de las células B. Antes de la unión de los diversos segmentos génicos de las inmunoglobulinas, los segmentos génicos V, D, J y constante (C) se encuentran, en la mayor parte de los casos, en grupos de segmentos génicos V, D, J y C en los precursores de células B de repertorio primario. Generalmente, todos los segmentos génicos de una cadena pesada o ligera están localizados relativamente próximos en un único cromosoma. Este ADN genómico antes de la recombinación de los diversos segmentos génicos de inmunoglobulinas se denomina en este documento ADN genómico "no reorganizado". Durante la diferenciación de las células B, se recombina uno de cada uno de los miembros de la familia apropiada de los segmentos génicos V, D, J (o sólo V y J en el caso de los genes de cadena ligera) para formar genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera reorganizados de forma funcional. Esta reorganización funcional es de los segmentos de región variable para formar ADN que codifica una región variable funcional. Este proceso de reorganización de segmentos génicos parece ser secuencial. Primero se realiza la unión entre D y J de cadena pesada, seguido de uniones de V a DJ de cadena pesada y de uniones de V a J de cadena ligera. El ADN que codifica esta forma inicial de una región variable funcional en una cadena ligera y/o pesada se denomina "ADN reorganizado funcionalmente" o "ADN reorganizado". En el caso de la cadena pesada, este ADN se denomina "ADN de cadena pesada reorganizado" y en el caso de la cadena ligera, este ADN se denomina "ADN de cadena ligera reorganizado". Se usa una terminología similar para describir las reorganizaciones funcionales de los transgenes de la invención.

La recombinación de segmentos génicos de la región variable para formar regiones variables de las cadenas pesada y ligera funcionales está mediada por secuencias señal de recombinación (RSS) que flanquean a segmentos V, D y J competentes desde un punto de vista recombinatorio. Las RSS necesarias y suficientes para dirigir la recombinación comprenden un heptámero simétrico en díadas, un nonámero rico en AT y una región espaciadora intermedia de 12 o 23 pares de bases. Estas señales están conservadas entre los diferentes loci y especies que realizan recombinación D-J (o V-J) y son funcionalmente intercambiables. Véase Oettinger, et al. (1990), Science, 248, 1517-1523 y referencias citadas en dicho texto. El heptámero comprende la secuencia CACAGTG o su análogo seguida de un espaciador de secuencia no conservada y después de un nonámero que tiene la secuencia ACAAAAACC o su análogo. Estas secuencias se encuentran en el segmento génico J o en el lado cadena abajo de cada segmento génico V y D. De nuevo, inmediatamente antes de los segmentos D y J de la línea germinal hay dos secuencias señal de recombinación, primero el nonámero y después otra vez el heptámero separado de nuevo por una secuencia no conservada. Las secuencias heptamérica y nonamérica que siguen a un segmento V_{J},V_{H} o D son complementarias a las que preceden a los segmentos J_{L}, D o J_{H} con los que se van a recombinar. Los espaciadores entre las secuencias heptamérica y nonamérica tienen una longitud de doce pares de bases o tienen una longitud comprendida entre 22 y 24 pares de bases.

Además de la reorganización de los segmentos V, D y J, se genera una diversidad adicional en el repertorio primario de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina por medio de una recombinación variable entre los segmentos V y J en la cadena ligera y entre los segmentos D y J de la cadena pesada. Esta recombinación variable se genera por una variación en el lugar exacto en el cual se unen dichos segmentos. Esta variación en la cadena ligera ocurre típicamente en el último codón del segmento génico V y en el primer codón del segmento J. Se produce una imprecisión similar en la unión en el cromosoma de la cadena pesada entre los segmentos D y J_{H} y puede tener una extensión de hasta 10 nucleótidos. Además, pueden insertarse varios nucleótidos entre los segmentos génicos D y J_{H} y entes los segmentos génicos V_{H} y D que no estén codificados por el ADN genómico. La adición de estos nucleótidos es conocida como diversidad de la región N.

Tras la reorganización de VJ y/o VDJ, la transcripción de la región variable reorganizada y uno o más segmentos génicos de la región constante localizados cadena abajo de la región variable reorganizada produce un transcrito de ARN primario que después del ayuste de ARN apropiado tiene como resultado un ARNm que codifica una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina de longitud completa. Estas cadenas pesada y ligera incluyen una secuencia señal líder para que tenga lugar la secreción y/o inserción de la inmunoglobulina en la región de transmembrana de la célula B. El ADN que codifica esta secuencia señal está contenido en el primer exón del segmento V usado para formar la región variable de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina. En el ARNm también están presentes secuencias reguladoras apropiadas para controlar la traducción del ARNm para producir los polipéptidos de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina codificados que, tras la asociación apropiada entre sí, formarán una molécula de anticuerpo.

El efecto neto de estas reorganizaciones en los segmentos génicos de región variable y la recombinación variable que puede tener lugar durante esta unión es la producción de un repertorio de anticuerpos primarios. Generalmente, cada célula B que se ha diferenciado hasta este estado produce un sólo anticuerpo de repertorio primario. Durante este proceso de diferenciación, tienen lugar sucesos celulares que suprimen la reorganización funcional de los segmentos génicos que no están contenidos en los genes de Ig reorganizados de forma funcional. El proceso por el cual las células B diploides mantienen esta mono-especificidad se denomina exclusión alélica.

El Repertorio Secundario

Inmediatamente están disponibles clones de células B que expresan inmunoglobulinas procedentes del conjunto de secuencias que comprenden el repertorio primario para responder a antígenos extraños. Debido a la diversidad limitada generada por la unión simple VJ y VDJ, los anticuerpos producidos por la denominada respuesta primaria tienen una afinidad relativamente baja. Dos tipos diferentes de células B constituyen esta repuesta inicial: los precursores de las células formadoras de anticuerpos primarios y los precursores del células B de repertorio secundario (Linton, et al. (1989), Cell, 59, 1049-1059). El primer tipo de células B madura produciendo células plasmáticas secretoras de IgM en respuesta a ciertos antígenos. Las otras células B responden a la exposición inicial al antígeno entrando en una vía de maduración dependiente de células T. Es durante esta maduración de las células B dependiente de células T cuando se genera un segundo nivel de diversidad por un proceso denominado mutación somática (también denominado algunas veces hipermutación). Estas células B de repertorio primario usan las moléculas de inmunoglobulina presentes en sus superficies para unir e internalizar el antígeno extraño. Si el antígeno extraño es una proteína o esta unido físicamente a otro antígeno proteico, ese antígeno proteico se procesa y se presenta en la superficie celular por una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) a una célula T auxiliar que, a su vez, induce la maduración de las células B. Lanzavecchia (1985), Nature, 314, 537. Esta maduración general de la célula B se conoce como la respuesta secundaria.

Durante la maduración dependiente de células T de clones de células B estimulados por antígeno, la estructura de la molécula de anticuerpo en la superficie celular cambia de dos maneras: la región constante cambia a un subtipo no IgM y la secuencia de la región variable se modifica por substituciones múltiples de un solo aminoácido para producir una molécula de anticuerpo de mayor afinidad. Es este proceso de mutación somática, seguido de la selección de clones de mayor afinidad, el que genera inmunoglobulinas altamente específicas y que se unen fuertemente caracterizadas por la respuesta inmune mediada por Ig.

Como se ha indicado previamente, cada región variable de una cadena pesada o ligera de Ig contiene un dominio de unión al antígeno. Se ha determinado por secuenciación de aminoácidos y de ácidos nucleicos que la mutación somática durante la respuesta secundaria tiene lugar a través de la región V, incluyendo las 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) también denominadas regiones hipervariables 1, 2 y 3. La CDR1 y CDR2 están localizadas dentro del segmento génico variable, mientras que la CDR3 es en gran parte el resultado de la recombinación entre segmentos génicos V y J o segmentos génicos V, D y J. Las porciones de la región variable que no constan de CDR1, 2 o 3 normalmente se denominan regiones estructurales designadas FR1, FR2, FR3 y FR4. Véase la figura 1. Durante la hipermutación, el ADN reorganizado muta para dar origen a nuevos clones con moléculas de Ig alteradas. Los clones con mayores afinidades por el antígeno extraño se expanden selectivamente por células T auxiliares, dando lugar a la maduración de afinidad del anticuerpo expresado. La selección clonal típicamente tiene como resultado la expresión de clones que contienen la nueva mutación en las regiones CDR1, 2 y/o 3. Sin embargo, también pueden ocurrir mutaciones fuera de estas regiones que influyen sobre la especificidad y la afinidad del dominio de unión al antígeno.

Animales Transgénicos No-Humanos Capaces de Producir Anticuerpos Heterólogos

Pueden producirse ratones transgénicos de la invención introduciendo al menos uno de los transgenes de inmunoglobulina descritos más adelante en este documento en un cigoto o en un embrión en sus primeras fases de desarrollo de un ratón. Los ratones que se usan en la invención son capaces de reorganizar segmentos génicos de inmunoglobulinas para producir una respuesta primaria de anticuerpos que, además, son capaces de producir una respuesta secundaria por medio de mutación somática de estos genes de Ig reorganizados. Los ratones son particularmente útiles ya que su sistema inmune se ha estudiado mucho, incluyendo la organización genómica de los loci de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas de ratón. Véase, por ejemplo, Immunoglobulin Genes, Academic Press, T. Honjo, F.W. Alt y T. H. Rabbitts, eds. (1989).

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas y dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas unidas por medio de puentes disulfuro. Cada una de las cadenas polipeptídicas pesadas y ligeras contiene una región variable (generalmente la porción amino terminal de la cadena polipeptídica) que contiene un dominio de unión que interacciona con el antígeno. Cada una de las cadenas polipeptídicas pesadas o ligeras también comprende una región constante de las cadenas polipeptídicas (generalmente la porción carboxilo terminal) de la que algunas secuencias median la unión de la inmunoglobulina a tejidos del hospedador incluyendo diversas células del sistema inmune, algunas células fagocíticas y el primer componente (C1q) del sistema clásico del complemento.

Como se usa en este documento, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación al organismo transgénico no humano productor de dicho anticuerpo. Se define como un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ADN codificante correspondiente a la encontrada en un organismo que no es el animal transgénico no humano. De esta forma, antes de la reorganización de un transgen que contiene diversos segmentos génicos de cadena pesada o ligera, estos segmentos génicos pueden identificarse fácilmente, por ejemplo, por hibridación o secuenciación de ADN, como procedentes de una especie de organismo diferente de la del animal transgénico. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, se usan diversos segmentos génicos del genoma humano en transgenes de cadena pesada en una forma no reorganizada. Estos transgenes se introducen en ratones. Los segmentos génicos no reorganizados del transgen de cadena pesada tienen secuencias de ADN únicas para la especie humana que son distinguibles de los segmentos génicos de inmunoglobulina endógena en el genoma del ratón. Pueden detectarse fácilmente en su forma no reorganizada en la línea germinal y en células somáticas que no son células B y en su forma reorganizada en las células B.

Ciertos segmentos específicos de transgenes de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizados correspondientes a segmentos VJ reorganizados de manera funcional, contienen secuencias de ADN de inmunoglobulinas que son también fácilmente distinguibles de los segmentos génicos de inmunoglobulinas endógenas de ratón.

Estas diferencias en la secuencia de ADN también se reflejan en la secuencia de aminoácidos codificada por dichos transgenes de inmunoglobulina humana en comparación con los codificados por células B de ratón. De esta manera, pueden detectarse secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina humana en los animales transgénicos no humanos de la invención con anticuerpos específicos para epítopos de inmunoglobulina codificados por segmentos génicos de inmunoglobulina humana.

Las células B transgénicas que contienen transgenes no reorganizados de origen humano recombinan de forma funcional los segmentos génicos apropiados para formar regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas reorganizadas de forma funcional. Debe entenderse que la mayor parte del ADN de estos transgenes reorganizados no corresponderá exactamente con la secuencia de ADN de los segmentos génicos a partir de los que se obtuvieron estos transgenes reorganizados. Esto se debe principalmente a las variaciones introducidas durante la recombinación variable y debido a las mutaciones introducidas por hipermutación durante la respuesta secundaria. Independientemente de estas modificaciones en la secuencia de ADN (así como en la de aminoácidos), será fácilmente evidente que el anticuerpo codificado por estos transgenes reorganizados tiene una secuencia de ADN y/o de aminoácidos que es heteróloga a la que se encuentra normalmente en el ratón usado para la práctica de la invención.

La expresión "identidad substancial", cuando se refiere a polipéptidos, indica que el polipéptido o la proteína en cuestión muestra al menos una identidad de aproximadamente el 30% con una proteína entera de origen natural o una porción de la misma, normalmente una identidad de al menos aproximadamente el 70%, y preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente el 95%. Como se usa en este documento, las expresiones "aislado", "substancialmente puro" y "substancialmente homogéneo" se usan de forma intercambiable en este documento y describen una proteína polipeptídica que se ha separado de componentes que la acompañan de forma natural. Típicamente, una proteína monomérica es substancialmente pura cuando al menos aproximadamente del 60 al 75% de una muestra presenta un solo esqueleto polipeptídico. Pequeñas variantes o modificaciones químicas típicamente comparten la misma secuencia polipeptídica. Una proteína substancialmente pura constituirá típicamente más de aproximadamente un 85-90% de una muestra de proteína, más habitualmente aproximadamente un 95% y preferiblemente tendrá una pureza mayor de aproximadamente el 99%. La pureza u homogeneidad de la proteína puede indicarse de varias maneras bien conocidas en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de proteína, seguido de visualización de una única banda polipeptídica en un gel de poliacrilamida después de la tinción. Para ciertos fines, será necesaria una alta resolución y se utilizará HPLC o un medio similar de purificación. Un polipéptido carece substancialmente de componentes que se asocian con él naturalmente cuando está separado de los contaminantes nativos que lo acompañan en su estado natural. De esta manera, un polipéptido que se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que procede de manera natural carecerá substancialmente de los componentes con los que está asociado de forma natural.

Transgenes Reorganizados

Según se usa en este documento, un "transgen de cadena pesada de inmunoglobulina no reorganizado" comprende ADN que codifica al menos un segmento génico variable, un segmento génico de diversidad, un segmento génico de unión y un segmento génico de región constante. Cada uno de los segmentos génicos de dicho transgen de cadena pesada derivan de, o tiene una secuencia que corresponde al ADN que codifica segmentos génicos de cadena pesada de inmunoglobulina de una especie que no es el animal no humano en el que se introduce dicho transgen. De forma similar, como se usa en este documento, un "transgen de cadena ligera de inmunoglobulina no reorganizado" comprende ADN que codifica al menos un segmento génico variable, un segmento génico de unión y al menos un segmento génico de región constante en el que cada segmento génico de dicho transgen de cadena ligera deriva de, o tiene una secuencia correspondiente al ADN que codifica segmentos génicos de cadena ligera de inmunoglobulina de una especie que no es el animal no humano en el que se introduce dicho transgen de cadena ligera.

Estos transgenes de cadena pesada y ligera en este aspecto de la invención contienen los segmentos génicos identificados anteriormente en una forma no reorganizada. De esta manera, entre los segmentos V, D y J en el transgen de cadena pesada y entre los segmentos V y J del transgen de cadena ligera se encuentran interpuestas secuencias señal de recombinación (RSS) apropiadas. Además, estos transgenes también incluyen señales de ayuste de ARN apropiadas para unir un segmento génico de región constante a la región variable reorganizada VJ o VDJ.

En la medida en que el transgen de cadena pesada contiene más de un segmento génico de región C, por ejemplo C\mu y C\gammal procedente del genoma humano, como se explica más adelante, se incorporan "regiones de cambio" cadena arriba de cada uno de los segmentos génicos de región constante y cadena abajo de los segmentos génicos de región variable para permitir la recombinación entre estas regiones constantes para permitir un cambio de clase de inmunoglobulina, por ejemplo, de IgM a IgG. Estos transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina también contienen secuencias de control de la transcripción que incluyen regiones promotoras situadas cadena arriba de los segmentos génicos de región variable que contienen motivos OCTA y TATA.

Además de promotores, se usan otras secuencias reguladoras con función principalmente en las células de la línea B. De esta manera, por ejemplo, se usa una secuencia potenciadora de cadena ligera situada preferiblemente entre los segmentos génicos J y de región constante en el transgen de cadena ligera para potenciar la expresión del transgen, facilitando de esta manera la exclusión alélica. En el caso del transgen de cadena pesada, también se emplean potenciadores reguladores.

Aunque las secuencias de control reguladoras promotoras y potenciadoras anteriores se han descrito de forma genérica, estas secuencias reguladoras pueden ser heterólogas al ratón procediendo del ADN genómico humano del cual se obtienen los segmentos génicos de inmunoglobulina del transgen heterólogo. De forma alternativa, estos segmentos génicos reguladores proceden de las secuencias reguladoras correspondientes del genoma de ratón que contiene el transgen de cadena pesada y ligera. Estas secuencias reguladoras se usan para maximizar la transcripción y la traducción del transgen para inducir la extrusión alélica y para proporcionar niveles relativamente altos de expresión transgénica.

De acuerdo con la invención, cada uno de los segmentos génicos de inmunoglobulina contenidos en los transgenes de Ig de cadena pesada procede de, o tiene secuencias correspondientes al ADN genómico, ADNc o porciones del mismo de un ser humano. De esta manera, estos segmentos génicos son heterólogos al ratón en el cual se va a introducir el transgen. Como consecuencia, cuando estos segmentos génicos se reorganizan funcionalmente e hipermutan en el ratón transgénico, el anticuerpo heterólogo codificado por estos transgenes pesados tendrá una secuencia de aminoácidos y una estructura secundaria y terciaria general que proporciona una utilidad específica contra un antígeno deseado cuando se usa terapéuticamente en seres humanos. Además, estos anticuerpos muestran una inmunogenicidad substancialmente reducida en comparación con anticuerpos que son "extraños" para el "ser humano".

Los ratones transgénicos que llevan estos transgenes de cadena pesada y ligera son capaces de organizar una respuesta inmune mediada por Ig contra un antígeno específico administrado al animal. Dentro del ratón se producen células B que son capaces de producir anticuerpos humanos heterólogos. Tras la inmortalización, y la selección de un anticuerpo monoclonal apropiado (Mab), por ejemplo, un hibridoma, se proporciona una fuente de anticuerpo monoclonal humano terapéutico. Estos Mab humanos tienen una inmunogenicidad reducida significativamente cuando se administran terapéuticamente a seres humanos.

Los ejemplos de antígenos que pueden usarse para generar anticuerpos heterólogos en los animales transgénicos de la invención que contienen transgenes de inmunoglobulina humana incluyen antígenos bacterianos, antígenos virales y antígenos tumorales, así como antígenos humanos de células B y T particulares asociados con el rechazo de injertos o autoinmunidad.

Cambio de Clase

El uso de regiones constantes \mu o \delta se determina principalmente por un ayuste alternativo, permitiendo que se coexpresen IgM e IgD en una sola célula. Los otros isotipos de cadena pesada (\gamma, \alpha y \varepsilon) sólo se expresan de forma nativa tras un suceso de reorganización génica que elimina los exones C\mu y C\delta. Este proceso de reorganización génica, denominado cambio de clase, se produce por recombinación entre los denominados segmentos de cambio localizados inmediatamente cadena arriba de cada gen de cadena pesada (excepto \delta). Los segmentos de cambio individuales tienen una longitud comprendida entre 2 y 10 kb, y consisten principalmente en secuencias repetidas cortas. El punto exacto de recombinación es diferente para cada suceso individual de cambio de clase.

La capacidad de una construcción transgénica para cambiar isotipos durante la maduración de las células B no se ha ensayado directamente en ratones transgénicos; sin embargo, los transgenes deberían realizar esta función. Durdik et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2346-2350) microinyectaron una construcción génica de cadena pesada \mu de ratón reorganizada y descubrieron que en cuatro líneas de ratón independientes, una alta proporción de las células B transgénicas expresaban la región variable codificada por el transgen asociada con IgG en lugar de con IgM. De esta manera, parece ser que el cambio de isotipo se ha producido entre el transgen y la región constante \delta endógena presente en otro cromosoma.

Según se usa en este documento, por lo tanto, la expresión secuencia de cambio se refiere a las secuencias de ADN responsables de la recombinación de cambio. Una secuencia "donadora de cambio", típicamente una región de cambio \mu, estará en posición 5' (es decir, cadena arriba) de la región de la construcción a eliminar durante la recombinación de cambio. La región "aceptora de cambio" estará entre la región de la construcción que se elimina y la región constante de reemplazo (por ejemplo, \mu, \varepsilon, etc.). Como no hay un sitio específico donde tenga lugar siempre la recombinación, la secuencia génica final típicamente no será predecible a partir de la construcción.

La región de cambio (S) del gen \mu, S, se localiza aproximadamente de 1 a 2 kb en posición 5' con respecto a la secuencia codificante y está compuesta de numerosas repeticiones en tándem de secuencias de la forma (GAGCT)_{n} (GGGGT), donde n normalmente es de 2 a 5, pero puede variar hasta 17. (Véase T. Nikaido, et al. (1981): Nature, 292: 845-848).

Se han encontrado secuencias de cambio similares repetidas internamente que abarcan varios kilobases en posición 5' de los otros genes C_{H}. La región S_{\alpha} se secuenciado y se ha descubierto que consta de unidades de homología de 80 pb repetidas en tándem, mientras que S_{\gamma2a}, S_{\gamma2b} y S_{\gamma3} contienen unidades de homología de 49 pb repetidas muy similares entre sí. (Véase, P. Szurek, et al. (1985): J. Immunol, 135:620-626 y T. Nikaido, et al (1982): J. Biol. Chem., 257 :7322-7329). Todas las regiones S secuenciadas incluyen numerosas apariciones de los pentámeros GAGCT y GGGGT que son los elementos básicos repetidos del gen S_{\mu} (T. Nikaido, et al. (1982): J. Biol. Chem., 257: 7322-7329); en las otras regiones S estos pentámeros no se repiten en tándem de forma tan precisa como en S_{\mu}, sino que en su lugar se incluyen en unidades repetidas mayores.

La región S_{\gamma1} tiene una estructura adicional de orden mayor: dos secuencias repetidas directas rodean a cada uno de dos grupos de repeticiones en tándem de 49 pb. (Véase M. R. Mowatt, et al (1986): J. Immunol., 136: 2674-2683). Se han encontrado regiones de cambio de genes de cadena H humana muy similares a sus homólogas de ratón. Generalmente, a diferencia de lo que ocurre con la maquinaria enzimática de recombinación V-J, la maquinaria de cambio aparentemente puede acomodar diferentes alineaciones de las regiones homólogas repetidas de precursores S de la línea germinal y después unir las secuencias en diferentes posiciones dentro de la alineación. (Véase, T. H. Rabbits, et al. (1981): Nucleic Acid Res., 9:4509-4524 y J. Ravetch, et al. (1980): Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:6734-6738).

La inducción del cambio de clase parece estar asociada con transcritos estériles que se inician cadena arriba de los segmentos de cambio (Lutzker et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 8, 1849; Stavnezer et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 7704; Esser y Radbruch 1989 EMBO J., 8, 483; Berton et al. 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2829; Rothman et al. 1990 Int. Immunol. 2, 621). Por ejemplo, la inducción observada del transcrito estéril de \gamma1 por IL-4 y la inhibición por IFN-\gamma se correlacionan con la observación de que IL-4 promueve el cambio de clase a \gamma1 en células B en cultivo, mientras que IFN-\gamma inhibe la expresión de \gamma1. Entonces, idealmente, las construcciones transgénicas que se pretende que experimenten un cambio de clase deberían incluir todas las secuencias de actuación cis necesarias para regular estos transcritos estériles. Un método alternativo para la obtención de cambio de clase en ratones transgénicos (\delta\mu y \varepsilon\mu) implica la inclusión de las secuencias de repetición directa de 400 pb que flanquean al gen \mu humano (Yasui et al. 1989 Eur. J. Immunol., 19, 1399). La recombinación homóloga entre estas dos secuencias elimina el gen \mu en células B que solo expresan IgD.

Anticuerpos Monoclonales

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por diversas técnicas con las que estarán familiarizados los especialistas en la técnica. En resumen, se inmortalizan células de bazo de un animal inmunizado con un antígeno deseado, normalmente por fusión con una célula de mieloma (véase Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519 (1976)). Los métodos alternativos de inmortalización incluyen la transformación con el virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de células únicas inmortalizadas se seleccionan para la producción de anticuerpos de especificidad y afinidad deseada por el antígeno, y la producción de los anticuerpos monoclonales producidos por estas células puede potenciarse por diversas técnicas, incluyendo la inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. En Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988), por ejemplo, se describen diversas técnicas útiles en estos campos, incluyendo: inmunización de animales para producir inmunoglobulinas; producción de anticuerpos monoclonales; marcaje de inmunoglobulinas para su uso como sondas; purificación por inmunoafinidad; e inmunoensayos.

El Repertorio Primario Transgénico A. Los Loci de Inmunoglobulina Humana

Un importante requisito para la función transgénica es la generación de un repertorio de anticuerpos primario que sea suficientemente diverso como para desencadenar una respuesta inmune secundaria frente a una amplia serie de antígenos. El tamaño de los loci de inmunoglobulina humana que codifican los diversos segmentos génicos de las cadenas pesada y ligera es bastante grande. Por ejemplo, en el genoma humano, los tres loci separados para el locus de cadena ligera \lambda, el locus de cadena ligera \kappa y el locus de cadena pesada juntos ocupan más de 5 Mb de ADN o casi el 0,2% del genoma completo. Cada locus consta de múltiples segmentos variables que se recombinan durante el desarrollo de las células B con un segmento de región de unión (y el locus de cadena pesada con segmentos de región de diversidad) para formar exones de la región V completos. Estos genes de cadena ligera reorganizados constan de 3 exones: un exón péptido señal, un exón de región variable y un exón de región constante. El gen de cadena pesada reorganizado es algo más complejo. Consta de un exón de péptido señal, un exón de región variable y una serie en tándem de regiones de región constante de múltiples dominios, estando codificada cada una de ellas por varios exones. Cada uno de los genes de región constante codifica la porción constante de una clase de inmunoglobulinas diferente. Durante el desarrollo de las células B, las regiones constantes próximas a la región V se eliminan llevando a la expresión de nuevas clases de la cadena pesada. Para cada clase de cadena pesada, el ayuste de patrones alternativos de ARN da lugar tanto a inmunoglobulinas transmembrana como a inmunoglobulinas secretadas.

Aproximadamente el 40% de las moléculas de anticuerpo de suero humano contienen cadenas ligeras \lambda. La estructura de este locus, que se localiza en el cromosoma 22, es la menos caracterizada (fig. 2). Consta de un número desconocido de segmentos V cadena arriba de una serie en tándem de 6 genes de región constante, cada uno de los cuales está unido a un solo segmento J. Además, se han aislado dos segmentos más de región constante con segmentos J asociados, aunque su unión con el resto del grupo \lambda no se ha establecido y no se sabe si se usan. E. Selsing, et al., "Immunoglobulin Genes", Academic Press, T. Honjo, F.W. Alt y T.H. Rabbitts, eds. (1989).

El locus de cadena ligera \kappa se extiende sobre tres grupos en el cromosoma 2 (fig. 3). Los dos primeros grupos, que cubren 850 y 250 kb respectivamente, contienen sólo segmentos génicos de región variable. El tercer grupo, que abarca aproximadamente 1 Mb, contiene aproximadamente 40 segmentos génicos V cadena arriba de un grupo de 5 segmentos J seguidos de un único segmento génico de región constante. Se han identificado un total de 84 segmentos génicos V, y se cree que aproximadamente la mitad de ellos son pseudogenes (Zachau (1989) en Immunoglobulin Genes, Academic Press, T. Honjo, F. W. Alt y T.H. Rabbitts, eds. páginas 91-110).

Aproximadamente 25 kb cadena abajo de la región CK hay un "elemento de deleción \kappa" (\kappade). La secuencia de \kappade recombina con secuencias que están cadena arriba, causando la deleción de la región constante \kappa en células B que expresan la cadena ligera \lambda. Esto da lugar a la exclusión isotípica en células que reorganizan de forma satisfactoria tanto los genes \kappa como los \lambda.

El locus de cadena pesada humana es el más largo y el más diverso. Consta de aproximadamente de 200 segmentos génicos V que abarcan 2 Mb, aproximadamente 30 segmentos génicos D que abarcan aproximadamente 40 kb, 6 segmentos J agrupados dentro de una extensión de 3 kb y 9 segmentos génicos de región constante que se extienden sobre aproximadamente 300 kb. El locus completo abarca aproximadamente 2,5 Mb de la porción distal del brazo largo del cromosoma 14 (fig. 4). Los segmentos V de cadena pesada pueden agruparse en 6 familias basándose en la similitud de secuencia. Hay aproximadamente 60 miembros de la familia V_{H}1, 30 segmentos V_{H}2, 80 segmentos V_{H}3, 30 segmentos V_{H}1, 3 segmentos V_{H}5 y un segmento V_{H}6. Berman, J. E., et al. (1988), EMBO J., 7, 727-738. En el locus de cadena pesada humana, los miembros de las familias V individuales están entremezclados, a diferencia de lo que ocurre en el locus de ratón donde los segmentos V relacionados están agrupados. El único miembro de la familia V_{H}6 es el más próximo a los segmentos V, localizándose dentro de 90 kb de los segmentos génicos de región constante. Sato, T., et al. (1988), Biochem. Biophys. Res. Comm., 154, 265-271. Parece ser que todos los segmentos funcionales D y J están en esta región de 90 kb (Siebenlist, et al. (1981), Nature, 294, 631-635; Matsuda, et al. (1988), EMBO J., 7, 1047-1051; Buluwela, et al. (1988), EMBO J., 7, 2003-2010; Ichihara, et al. (1988), EMBO J., 7, 4141-4150; Berman, et al. (1988), EMBO J., 7, 727-738).

B. Transgenes de Fragmentos Génicos 1. Transgen de Cadena Pesada

De acuerdo con la invención, los ratones transgénicos tiene un genoma que incluye o un transgen de cadena pesada de inmunoglobulina que comprende ADN genómico no reorganizado de seres humanos. Preferiblemente, el transgen de cadena pesada comprende un fragmento NotI que tiene una longitud comprendida entre 670 y 830 kb. La longitud de este fragmento es ambigua porque el sitio de restricción 3' no se ha mapeado de forma precisa. Sin embargo, se sabe que está situado entre los segmentos génicos \alpha1 y \Psi\alpha (véase la figura 4). Este fragmento contiene miembros de las 6 familias de V_{H} conocidas, los segmentos génicos D y J, así como las regiones constantes \mu, \delta, \gamma3, \gamma1 y \alpha1. Berman, et al. (1988), EMBO J., 7, 727-738. Una línea de ratón transgénico que contiene este transgen expresa correctamente todas las clases de cadena pesada requeridas para el desarrollo de las células B así como un repertorio suficientemente grande de regiones variables para desencadenar una respuesta secundaria para la mayoría de los antígenos.

2. Transgen de Cadena Ligera

De forma similar, puede construirse un fragmento genómico que contenga todos los segmentos génicos necesarios y las secuencias reguladoras de un locus de cadena ligera humana. Esta construcción se describe en los ejemplos.

C. Transgenes Generados Intracelularmente por Recombinación In Vivo

No es necesario aislar todo o parte del locus de cadena pesada en un solo fragmento de ADN. De esta forma, por ejemplo, el fragmento NotI de 670-830 kb del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana puede formarse in vivo en el ratón durante la transgénesis. Esta construcción transgénica in vivo se produce introduciendo dos o más fragmentos de ADN solapantes dentro de un núcleo embrionario del animal no humano. Las porciones solapantes de los fragmentos de ADN tienen secuencias de ADN que son substancialmente homólogas. Tras la exposición a las recombinasas contenidas en el núcleo embrionario, los fragmentos de ADN solapantes se recombinan de forma homóloga en la orientación apropiada para formar el fragmento de cadena pesada NotI de 670-830 kb.

Sin embargo, debe entenderse que la construcción transgénica in vivo puede usarse para formar cualquier número de transgenes de inmunoglobulina que debido a su tamaño son difíciles o imposibles de obtener de otra manera o de manipular por la presente tecnología. De esta manera, la construcción de transgenes in vivo es útil para generar transgenes de inmunoglobulina que son mayores que los fragmentos de ADN que pueden manipularse por vectores YAC (Murray y Szostak (1983), Nature, 305, 189-193). Esta construcción de transgenes in vivo puede usarse para introducir en un animal no humano substancialmente los loci de inmunoglobulina completos procedentes de una especie que no es el animal transgénico no humano. De esta manera, aunque varios grupos han construido satisfactoriamente bibliotecas que contienen fragmentos de ADN de 50-200 kb en vectores YAC (Burke, et al. (1987), Science, 236, 806-812; Traver, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5898-5902) y han usado condensación de poliamina para producir bibliotecas YAC con un tamaño que varía de 200 a aproximadamente 1000 kb (McCormick, et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9991-9995), es de esperar que múltiples fragmentos solapantes que cubren substancialmente más que el fragmento NotI de 670-830 kb de los loci de región constante de inmunoglobulina humana produzcan fácilmente transgenes mayores por los métodos descritos en este documento.

Además de formar transgenes de inmunoglobulina genómicos, también puede utilizarse la recombinación homologa in vivo para formar transgenes de "minilocus" como se describe en los ejemplos.

Cuando se utiliza la construcción transgénica in vivo, cada fragmento de ADN solapante preferiblemente tiene una secuencia de ADN substancialmente homóloga solapante entre la porción final de un fragmento de ADN y la porción final de un segundo fragmento de ADN. Estas porciones solapantes de los fragmentos de ADN preferiblemente comprenden de aproximadamente 500 pb a aproximadamente 2000 pb, más preferiblemente de 1,0 kb a 2,0 kb. También se describe la recombinación homóloga de fragmentos de ADN solapantes para formar transgenes in vivo en la Solicitud de Patente de Estados Unidos cedida comúnmente titulada "Intracelular Generation of DNA by Homologous Recombination of DNA Fragments" ("Generación Intracelular de ADN por Recombinación Homóloga de Fragmentos de ADN") presentada el 29 de agosto de 1990, bajo U.S.S.N. 07/574.747.

D. Transgenes de Minilocus

Según se usa en este documento, la expresión "minilocus de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de ADN (que puede estar dentro de una secuencia mayor), normalmente de menos de aproximadamente 150 kb, típicamente con una longitud comprendida entre aproximadamente 25 y 100 kb, que contiene al menos uno de cada uno de los siguientes: un segmento génico variable (V) funcional, un segmento de región de unión (J) funcional, un segmento génico de región constante (C) funcional, y si es un minilocus de la cadena pesada, un segmento de región de diversidad (D) funcional, de modo que dicha secuencia de ADN contenga al menos una discontinuidad substancial (por ejemplo, una deleción, normalmente de al menos aproximadamente 2 a 5 kb, preferiblemente de 10-25 kb o más, con respecto a la secuencia de ADN genómico homólogo). Un transgen de minilocus de cadena ligera será al menos de 25 kb de longitud, típicamente de 50 a 60 kb. Un transgen de cadena pesada típicamente será de aproximadamente 70 a 80 kb de longitud, preferiblemente de al menos aproximadamente 60 kb, con dos regiones constantes unidas de forma operativa a regiones de cambio, frente a al menos aproximadamente 30 kb con una sola región constante y regiones de cambio incompletas. Además, los elementos individuales del minilocus preferiblemente están en la configuración de la línea germinal y pueden experimentar reorganización génica en las células pre-B de un animal transgénico para expresar moléculas de anticuerpo funcionales con diversas especificidades de antígeno codificadas completamente por los elementos del minilocus.

De acuerdo con la presente invención, los transgenes de cadena pesada de inmunoglobulina usados comprenden uno o más de cada uno de los siguientes segmentos génicos: V, D, J y C. En el transgen de minilocus se incorpora al menos uno de cada segmento génico del tipo apropiado. Con respecto a los segmentos C para el transgen de cadena pesada, el transgen contiene al menos un segmento génico \mu y al menos un segmento génico \lambda, más preferiblemente \lambda3 o \lambda1. Esta preferencia es para permitir el cambio de clase entre las formas IgM e IgG de la inmunoglobulina codificada para proporcionar mutación somática y la producción de una forma secretable de inmunoglobulina no IgM de alta afinidad. También pueden usarse otros segmentos génicos de región constante tales como los que codifican para la producción de IgD, IgA e IgE.

Los segmentos de la región J de cadena pesada en el ser humano comprenden 6 segmentos J funcionales y 3 pseudogenes agrupados en un tramo de ADN de 3 kb. Dado su tamaño relativamente compacto y la capacidad de aislar estos segmentos junto con el gen \mu y la porción 5' del gen \delta en un solo fragmento SFiI/SpeI de 23 kb (Sado, et al. (1988), Biochem. Biophys. Res. Comm., 154, 264271), es preferible usar todos los segmentos génicos de la región J en la construcción del mini-locus. Como este fragmento abarca la región entre los genes \mu y \delta, es probable que contenga todos los elementos reguladores unidos en cis en 3' requeridos para la expresión de \mu. Además, como este fragmento incluye la región J completa, contiene el potenciador de cadena pesada y la región de cambio \mu (Mills, et al. (1983), Nature, 306, 809; Yancopoulos y Alt (1986), Ann. Rev. Immunol., 4, 339-368). También contiene los sitios de inicio de la transcripción que desencadenan la unión de VDJ para formar células B de repertorio primario (Yancopoulos y Alt (1985), Cell, 40, 271-281). De forma alternativa, puede usarse un fragmento BssHII/SpeIl de 36 kb, que incluye parte de la región D, en lugar del fragmento SfiI/SpeIl de 23 kb. El uso de este fragmento aumenta la cantidad de secuencias flanqueantes 5' para facilitar la unión eficaz de D a J.

La región D humana consta de 4 a 5 subregiones homólogas de 9 kb, unidas en tándem (Siebenlist, et al. (1981), Nature, 294, 631-635). Cada subregión contiene hasta 10 segmentos D individuales. Algunos de estos segmentos se han localizado en el mapa cromosómico y se muestran en la fig. 4. Se usan dos estrategias diferentes para generar una región D de minilocus. La primera estrategia implica usar solo los segmentos D localizados en un tramo corto contiguo de ADN que incluye una o dos de las subregiones D repetidas. Un candidato es un solo fragmento de 15 kb que contiene 12 segmentos D individuales. Esta pieza de ADN consta de 2 fragmentos EcoRI contiguos y se ha secuenciado por completo (Ichihara, et al. (1988), EMBO J., 7, 4141-4150). Doce segmentos D deberían ser suficientes para un repertorio primario. Sin embargo, dada la naturaleza dispersa de la región D, una estrategia alternativa es ligar conjuntamente varios fragmentos que contienen el segmento D no contiguos para producir una pieza menor de ADN con un mayor número de segmentos.

Para construir el transgen de minilocus de cadena pesada se usa al menos uno, y preferiblemente más de un segmento génico V. Se aísla una pieza de ADN de 10-15 kb que contiene uno o dos segmentos V no reorganizados conjuntamente con secuencias flanqueantes. Se selecciona un clon que contenga este ADN usando una sonda generada a partir de secuencias 5' únicas determinadas a partir de la región V transcrita de un hibridoma humano caracterizado de modo que produce un anticuerpo anti-citomegalovirus (Newkirk et al. (1988) J. Clin. Invest., 81, 1511-1518). Se usa la secuencia 5' no traducida del ARNm de cadena pesada para construir una sonda nucleotídica única (preferiblemente de aproximadamente 40 nucleótidos de longitud) para aislar el segmento V de la línea germinal original que generó este anticuerpo. El uso de un segmento V que se sabe que se incorpora en un anticuerpo contra un antígeno conocido no sólo asegura que este segmento V es funcional, sino que ayuda en el análisis de la participación del transgen en repuestas inmunes secundarias. Este segmento V se fusiona con la región D de minilocus y fragmentos de la región constante, descritos previamente, para producir un transgen de minilocus de cadena pesada.

De forma alternativa, puede aislarse un tramo contiguo y grande de ADN que contenga múltiples segmentos de región V a partir de una biblioteca YAC. En piezas de ADN de diferente tamaño que contienen diferentes números de segmentos de región V, puede ensayarse la capacidad para proporcionar un repertorio de anticuerpos humanos en la construcción del transgen de minilocus. También es posible construir un fragmento grande a partir de varios fragmentos que contienen segmentos V no contiguos usando vectores YAC (Murray y Szostak (1983), Nature, 305, 189-193), plásmidos basados en el factor F (O'Conner, et al. (1989), Science, 244, 1307-1312) o la construcción in vivo mencionada anteriormente usando recombinación de fragmentos solapantes. De forma alternativa, puede usarse un repertorio sintético de región V (descrito a continuación en este documento).

De forma similar, puede construirse un transgen de minilocus de cadena ligera a partir del locus de inmunoglobulina \lambda o \kappa humana. La construcción de un minilocus de cadena ligera \kappa es muy similar a la construcción del minilocus de cadena pesada, excepto porque es mucho más simple debido a su menor tamaño y a su menor complejidad. El locus \kappa humano contiene sólo un segmento de región constante, y este segmento, junto con los potenciadores 5' y 3' y los cinco segmentos J funcionales, puede aislarse en un solo fragmento de ADN de 10 kb. Este fragmento se inyecta conjuntamente con una región V de minilocus construida como se describe para el minilocus de cadena pesada.

De esta manera, por ejemplo, puede formarse una construcción de un transgen de minilocus de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, de aproximadamente 75 kb, que codifica las secuencias de las regiones V, D, J y de la región constante, a partir de una pluralidad de fragmentos de ADN, de los que al menos 2, 3 o 4 son una secuencia de la región V, una secuencia de la región D, una secuencia de las regiones J y constante, una secuencia de las regiones D, J y constante o una secuencia de la región constante, siendo cada secuencia substancialmente homóloga a secuencias génicas humanas. Las secuencias están unidas de forma operativa a secuencias reguladoras de la transcripción y pueden experimentar reorganización. También se produce recombinación de cambio con dos o más secuencias de región constante (es decir, \mu y \gamma) situadas de manera apropiada y regiones de cambio. Una construcción transgénica de cadena ligera ejemplar formada de forma similar a partir de una pluralidad de fragmentos de ADN, substancialmente homólogos a ADN humano y capaces de experimentar reorganización, incluirá al menos dos, tres o cuatro fragmentos de ADN que codifican las regiones V, D y constante, comprendiendo cada fragmento una secuencia de la región V, una secuencia de la región J y de la región constante, o una secuencia de la región constante.

E. Métodos para Determinar Segmentos Génicos V Funcionales y para Generar un Repertorio de Segmentos V Sintéticos

De las diversas familias de segmentos génicos, es decir, segmentos génicos de las regiones V, D, J y C, el número de segmentos génicos V generalmente supera en mucho al número de segmentos génicos correspondientes para los segmentos génicos de las regiones D, J y C. Por analogía con el sistema de conejo en el que un único segmento génico V se utiliza por aproximadamente el 90% de los anticuerpos producidos (Knight y Becker (1990), Cell, 60, 963-970), es posible producir transgenes pesados y ligeros que contienen un número limitado de segmentos génicos de la región V, y nada más que un segmento génico de la región V. Por lo tanto, es deseable disponer de un método para determinar qué segmentos génicos de la región V se utilizan en un organismo en particular, tal como el ser humano, cuando se genera una respuesta inmune mediada por inmunoglobulina. De acuerdo con esta estrategia, un solo segmento génico V, cuando se combina con los segmentos génicos J o DJ, es capaz de proporcionar suficiente diversidad en CDR3 para la generación de un repertorio primario que, tras una mutación somática, puede proporcionar una diversidad adicional a lo largo de la región variable, por ejemplo, en CDR1 y CDR2, para la producción de anticuerpos de alta afinidad.

De esta manera, pueden usarse métodos y vectores para determinar qué segmentos del gen V se utilizan comúnmente en un organismo durante una respuesta inmune. Este método se basa en la determinación de los segmentos V que se encuentran en el ADNc sintetizado a partir del ARN poliA+ de células B. Estos métodos y vectores también pueden usarse para facilitar la construcción de un repertorio de segmentos V sintéticos.

En las figuras 5 y 6 se representa el perfil de esta estrategia para identificar segmentos V de cadena pesada y para generar un repertorio de segmentos V sintéticos. Esto es aplicable de forma similar para identificar segmentos V de cadena ligera con una modificación apropiada. La primera etapa es la construcción de un vector de clonación. El material de partida preferido es un fragmento de ADN (de aproximadamente 2 kb) que contiene un segmento V no reorganizado junto con las secuencias flanqueantes 5' y 3'. Este fragmento se clona en un plásmido, tal como pGP1 o pGP2 descritos a continuación que contienen un sitio de polienlazador flanqueado por sitios de restricción de corte poco frecuente denominados "w" y "z" en las figuras 5 y 6 (los polienlazadores y los sitios de restricción de pGP1 y de pGP2 se describen en los ejemplos). Después se usa mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para introducir dos nuevos sitios de restricción "x" e "y" (generalmente, cada uno de aproximadamente 6 nucleótidos de longitud). El sitio de restricción "x" se sitúa a aproximadamente 20 nucleótidos del extremo 3' del intrón, entre la señal y el exón del segmento V. El sitio de restricción "y" se sitúa a aproximadamente 20 nucleótidos en dirección 3' de la unión con el segmento V, dentro del espaciador de 23 pb entre las secuencias señal de recombinación heptamérica y nonamérica. Cortando el plásmido resultante con los enzimas "x" e "y" se retira el segundo exón (segmento V), dejando las secuencias flanqueantes 5', el promotor de la región V, el exón del péptido señal, el intrón, un hueco flanqueado por extremos "x" e "y", la mitad exterior de la secuencia señal de recombinación y las secuencias flanqueantes 3'. Este plásmido se denomina pVH1.

La segunda etapa es la síntesis de cuatro conjuntos de cebadores oligonucleotídicos, de P1 a P4. P1 y P2 son oligómeros no únicos que tienen aproximadamente 50 nucleótidos cada uno y que se usan para cebar la síntesis de ADNc de doble cadena. P1 empieza (yendo de 5' a 3') con aproximadamente 20 nucleótidos de secuencia homóloga a la cadena antisentido de la secuencia señal de recombinación en pVH1 (incluyendo la secuencia de reconocimiento del enzima de restricción "y"), y continúa con aproximadamente 30 nucleótidos de secuencia antisentido que hibridan con aproximadamente los últimos 30 nucleótidos de la región estructural 3 de VH (FR3). Se incorporan bases aleatorias en aproximadamente los últimos 30 nucleótidos para generar de ese modo un conjunto de cebadores que hibridan con todas las diferentes familias de VH. El segundo oligonucleótido, P2, está en la orientación con sentido, y es homólogo a aproximadamente 50 nucleótidos empezando desde el sitio de restricción "x" en pVH1. Esto incluye el sitio de restricción "x", aproximadamente los últimos 20 nucleótidos del intrón y aproximadamente los primeros 30 nucleótidos de FR1. De nuevo, aproximadamente los últimos 30 nucleótidos no son únicos, para acomodar diferentes segmentos de la región VH. Los oligonucleótidos P3 y P4 son homólogos a aproximadamente los primeros 20 nucleótidos de P1 y P2, respectivamente. Estos oligos son únicos, de manera que impiden la introducción de nuevas mutaciones en los segmentos V y se usan para amplificar el ADNc de doble cadena por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las porciones 3' terminales de los cebadores P1 y P2 que son capaces de hibridar y de cebar la síntesis de los segmentos variables de locus de cadena pesada o ligera de inmunoglobulina pueden determinarse fácilmente por un especialista en la técnica. Por ejemplo, se han publicado las secuencias de nucleótidos de varios genes VH humanos, véase por ejemplo Berman, J. E., et al. (1988), EMBO J., 7, 727-738 y Kabat, E.A., et al. (1987), Sequences of Protein of Immunological Interests, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Washington, D.C. De forma similar, cuando se usan para identificar y/o generar segmentos V del locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, las porciones de secuencia apropiadas en posición 3' de los cebadores P1 y P2 pueden determinarse fácilmente a partir de las secuencias publicadas. Véase, por ejemplo, Kabat, E.A., et al., supra. En general, las posiciones de nucleótidos que están conservadas entre diversos segmentos V también están conservadas en la porción 3' de los cebadores P1 y P2. Para las posiciones nucleotídicas en las que se observa variación entre segmentos variables, estas posiciones nucleotídicas en los correspondientes cebadores P1 y P2 se han variado de forma similar para proporcionar cebadores P1 y P2 que comprenden un grupo de cebadores capaces de hibridar con diferentes segmentos VH o VL.

La siguiente etapa es usar estos cebadores oligonucleotídicos para generar una biblioteca de secuencias de ADNc de la región V de cadena pesada humana en el vector pHV1. P1 se usa para cebar la síntesis de la primera cadena de ADNc a partir del ARN poliA+ de células B humanas. El ARN se somete a hidrólisis básica, y la síntesis de la segunda cadena se ceba con P2. Después se purifica el ADNc de doble cadena de longitud completa en un gel de acrilamida, se electroeluye y se usa como plantilla para la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores oligonucleotídicos P3 y P4. De forma alternativa, el ADNc se sintetiza primero por métodos convencionales y este ADNc se usa como plantilla para el reactor cebado con P1. Después, el producto amplificado (aproximadamente 0,3 kb) se purifica en gel, se escinde con enzimas de restricción "x" e "y" y se clona en pVH1.

La biblioteca de ADNc resultante representa una biblioteca genómica sintética de segmentos de región variable y ofrece tres ventajas sobre una biblioteca genómica convencional de segmentos variables. En primer lugar, esta biblioteca no contiene pseudogenes, mientras que una biblioteca convencional podría contener hasta el 50% de secuencias de pseudogenes. En segundo lugar, la biblioteca sintética es más compacta que una biblioteca convencional, conteniendo un segmento V funcional por cada 2 kb de ADN, en lugar de un segmento funcional por cada 20 kb. Finalmente, esta estrategia deja las secuencias promotoras del segmento V accesibles para su manipulación.

Esta biblioteca de ADNc puede sesgarse hacia segmentos V de la línea germinal particulares debido a la expresión diferencial. Las dos fuentes de sesgo son: (i) proporciones diferenciales de recombinación del segmento V, y (ii) selección diferencial de clones de células B que expresan el segmento V. La primera fuente de sesgo se trata de dos formas. En primer lugar, se elimina el tejido fetal como fuente de ARN de células B, ya que el sesgo es más pronunciado en el repertorio de inmunoglobulinas fetales. En segundo lugar, los cebadores semialeatorios, P1 y P2, se dividen en grupos, de los que cada uno presenta hibridación cruzada selectivamente con diferentes familias del segmento V. Después, estos cebadores se usan para generar de 4 a 6 bibliotecas separadas, asegurando de este modo que están representadas todas las familias de la región V. La segunda fuente de sesgo, la selección diferencial de clones de células B, también se trata de dos maneras análogas. En primer lugar, se usa una fuente de ARN que incluye la fracción mínima de células B seleccionadas por antígeno. Se evitan los ganglios linfáticos y el bazo. La médula ósea adulta es una fuente de células B no seleccionadas. Sin embargo, puede contener una alta proporción de secuencias de pseudogenes transcritas a partir de células pre-B. Otra fuente de ARN es la sangre entera. El noventa por ciento de las células B en circulación son células inmaduras que expresan \mu o \mu y \delta, y han migrado recientemente a la médula ósea. Sin embargo, el nivel de células que expresan IgG seleccionadas por antígeno puede variar dependiendo del estado inmune del individuo. Por lo tanto, en el ARN poliA+ aislado se comprueban las secuencias de células B seleccionadas por hibridación de la transferencia de Northern con sondas específicas. En caso de que sea más práctico usar ARN de bazo, y si este ARN contiene una alta fracción de secuencias de IgG, se usa una segunda estrategia para minimizar el sesgo de la selección. La síntesis de la primera cadena de ADNc se ceba con un cebador de aproximadamente 40 nucleótidos del exón 2 de la región constante que es específico para los transcritos de IgM. Después, la síntesis de la segunda cadena se ceba con P2, y una tercera vuelta de síntesis se ceba con P1. El ADNc de esta tercera vuelta de síntesis proporciona la plantilla para la amplificación por PCR usando P3 y P4.

Una vez que se ha generado la biblioteca de región variable, pueden identificarse los segmentos V usados en la presente invención por técnicas convencionales, por ejemplo, por medio de secuenciación y/o hibridación con oligonucleótidos con especificidad de familia o de segmento, así como por amplificación diferencial por métodos de PCR. Esta caracterización de la biblioteca de segmentos V proporciona información sobre la frecuencia y la distribución de la utilización de segmentos V en un organismo particular y, como consecuencia, la identificación de segmentos V que pueden usarse en la construcción de los diversos transgenes de la invención. De esta manera, en la construcción del transgen de minilocus descrito anteriormente pueden usarse uno o más segmentos génicos V predominantes. Adicionalmente, los clones seleccionados a partir de esta biblioteca pueden usarse para identificar fragmentos genómicos que contienen segmentos V usados frecuentemente para facilitar la identificación de fragmentos genómicos que contienen un segmento V deseado particular.

Además, puede construirse un repertorio de segmentos V sintéticos por concatenación de las secuencias de la biblioteca. En la producción de ratones transgénicos comúnmente se generan grandes series en tándem de transgenes repetidos que contienen cientos de copias de la secuencia inyectada. Estas series en tándem normalmente son bastante estables. Sin embargo, para asegurar la estabilidad de la región V sintética, preferiblemente se introducen bloques de ADN aleatorio entre cada segmento de región V de 2 kb. Estos bloques de ADN aleatorio se preparan digiriendo y después religando ADN genómico, para prevenir de este modo la inserción de elementos reguladores dominantes. El ADN genómico preferiblemente se digiere con cuatro enzimas de restricción de corte frecuente: AluI, DpnI, HaeIII y RsaI. Esta digestión produce fragmentos de extremos romos con una longitud media de 64 nucleótidos. Se eluyen fragmentos en el intervalo de tamaños de 50 a 100 nucleótidos de un gel de acrilamida y se religan. El ADN religado se digiere parcialmente con MboI y se fracciona por tamaños. Los fragmentos en el intervalo de 0,5 a 2 kb se clonan en el sitio BamHI o BglII del polienlazador del vector usado para generar pVH1.

La biblioteca de secuencia aleatoria se combina con la biblioteca de segmentos V sintéticos para crear un repertorio de segmentos V sintéticos. Los insertos de la biblioteca de secuencias aleatorias se liberan con los enzimas "w" y "z", y se purifican a partir de secuencias del vector. Los insertos procedentes de la biblioteca de segmentos V sintéticos se aíslan cortando con "w" y "z". Antes de purificar los insertos del segmento V, este ADN se trata con fosfatasa intestinal de ternero, para prevenir el autoligamiento. Los insertos del segmento V después se ligan conjuntamente con los insertos aleatorios para generar una serie en tándem alternativa que comprende un repertorio de segmentos V sintéticos. Esta mezcla de ligamiento se selecciona por tamaños en un gradiente de sacarosa, y la fracción de 50-100 kb
se microinyecta conjuntamente con, por ejemplo, una construcción de microlocus D-J-constante. Inyectando directamente el repertorio de segmentos V sintéticos sin que intervenga una etapa de clonación, es posible aprovechar el hecho de que las series en tándem de fragmentos inyectados se inserten en un sitio único. En este caso, estas series en tándem no son completamente redundantes, sino que conducen a una diversidad adicional. De forma alternativa, el repertorio de segmentos V sintéticos puede combinarse con un minilocus D-J-C para formar un transgen de cadena pesada.

De forma similar, puede construirse un repertorio de segmentos de cadena ligera de inmunoglobulina sintéticos usando los cebadores apropiados para el locus de cadena ligera.

Rotura Funcional de Loci de Inmunoglobulina Endógena

Se espera que la expresión de transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina reorganizados satisfactoriamente tenga un efecto dominante por medio de la supresión de la reorganización de los genes de inmunoglobulina endógena en el animal transgénico no humano. Sin embargo, otra forma para generar un animal no humano carente de anticuerpos endógenos es por mutación de los loci de inmunoglobulina endógena. Usando la tecnología de células madre embrionarias y recombinación homóloga, se puede eliminar fácilmente el repertorio de inmunoglobulinas endógenas. A continuación se describe la descripción funcional de los loci de inmunoglobulinas de ratón. Los vectores y métodos descritos, sin embargo, pueden adaptarse fácilmente para su uso en otros animales no humanos.

En resumen, esta tecnología implica la inactivación de un gen, por recombinación homóloga, en una línea celular pluripotente que es capaz de diferenciarse en tejido celular germinal. Una construcción de ADN que contiene una copia alterada de un gen de inmunoglobulina de ratón se introduce en los núcleos de células madre embrionarias. En una porción de las células, el ADN introducido se recombina con la copia endógena del gen de ratón, substituyendo ésta por la copia alterada. Las células que contienen la lesión genética nuevamente introducida por ingeniería genética se inyectan en un embrión de ratón hospedador, que se reimplanta en una hembra receptora. Algunos de estos embriones desarrollan ratones quiméricos que poseen células germinales completamente derivadas de la línea celular mutante. De esta manera, cruzando los ratones quiméricos es posible obtener una nueva línea de ratones que contenga la lesión genética introducida (revisado por Capecchi (1989),Science, 244, 1288-1292).

Debido a que el locus \lambda de ratón contribuye sólo al 5% de las inmunoglobulinas, es suficiente la inactivación de la cadena pesada y/o de los loci de cadena ligera \kappa. Hay tres formas para romper cada uno de estos loci: deleción de la región J, deleción del potenciador del intrón J-C y rotura de secuencias codificantes de la región constante por la introducción de un codón de terminación (codón stop). La última opción es la más directa en términos del diseño de construcciones de ADN. La eliminación del gen \mu interrumpe la maduración de las células B, impidiéndose de este modo el cambio de clase a cualquiera de los segmentos de cadena pesada funcional. La estrategia para anular estos loci se resume a continuación.

Para romper los genes \mu y \kappa de ratón, se han usado vectores de dirección basados en el diseño empleado por Jaenisch y colaboradores (Zijlstra, et al., (1989) Nature, 342, 435-438) para la interrupción satisfactoria del gen de la \beta2-microglobulina de ratón. El gen de resistencia a la neomicina (neo) del plásmido pMCIneo se inserta en la región codificante del gen diana. La inserción de pMCIneo usa una secuencia hibrida promotor/potenciador viral para dirigir la expresión de neo. Este promotor es activo en células madre embrionarias. Por lo tanto, neo puede usarse como un marcador seleccionable para la integración de la construcción de anulación (knock-out). El gen de la timidina quinasa (tk) de HSV se añade al extremo de la construcción como marcador de selección negativa contra sucesos de inserción aleatoria (Zijlstra, et al., supra).

Los vectores de dirección para la rotura del locus de cadena pesada se ilustran en la figura 7. La estrategia primaria para la rotura del locus de cadena pesada es la eliminación de la región J. Esta región es bastante compacta en el ratón, abarcando sólo 1,3 kb. Para construir un vector de dirección a un gen, se aísla un fragmento KpnI de 15 kb que contiene todos los exones de región constante A secretada a partir de una biblioteca genómica de ratón. La región J de 1,3 kb se reemplaza por el inserto de 1,1 kb de pMCIneo. Después se añade el gen tk de HSV en el extremo 5' del fragmento KpnI. La integración correcta de esta construcción, por medio de recombinación homóloga, dará lugar a la substitución de la región J_{H} de ratón por el gen neo (figura 7). Los recombinantes se seleccionan por PCR usando un cebador basado en el gen neo y un cebador homólogo a las secuencias 5' de ratón del sitio KpnI en la región D.

De forma alternativa, el locus de cadena pesada se anula por rotura de la región codificante del gen \mu. Esta estrategia implica el mismo fragmento KpnI de 15 kb usado en la estrategia anterior. El inserto de 1,1 kb de pMCIneo se inserta en el único sitio BamHI del exón II, y se añade el gen tk de HSV al extremo 3' de KpnI. Después se seleccionan los sucesos de doble entrecruzamiento a ambos lados del inserto neo, que eliminan el gen tk. Éstos se detectan a partir de grupos de clones seleccionados por amplificación por PCR. Uno de los cebadores de PCR deriva de secuencias de neo y el otro de secuencias de ratón fuera del vector de dirección. La rotura funcional de los loci de inmunoglobulina de ratón se presenta en los ejemplos.

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Animales Transgénicos No Humanos que Contienen Transgenes de Cadena Pesada y Ligera de Inmunoglobulina Reorganizados

Una premisa subyacente de los ratones transgénicos descritos previamente que contienen transgenes de minilocus de Ig no reorganizados es que es posible generar un repertorio de anticuerpos completo sin incluir todos los segmentos génicos variables encontrados en el locus de inmunoglobulina natural. Teóricamente, es posible reducir el número de secuencias diferentes que contribuyen al repertorio primario sin reducir el repertorio secundario. Siempre que haya suficiente diversidad en el repertorio primario para desencadenar una respuesta dependiente de células T para cualquier antígeno determinado, la hipermutación somática debe ser capaz de suministrar un anticuerpo de alta afinidad contra este antígeno.

Este concepto se considera una fase adicional en las circunstancias descritas a continuación sólo con fines de referencia donde se genera un repertorio completo de anticuerpos heterólogos completamente por mutación somática. El sitio de combinación con el antígeno se crea por la interfase entre el dominio amino terminal de cadena pesada y el domino amino terminal de cadena ligera. Los restos CDR1, 2 y 3 de cada uno de estos dominios que interaccionan con el antígeno están localizados en tres bucles diferentes que conectan cadenas \beta. Como se ha descrito previamente, estas regiones tienen la mayor diversidad de secuencia entre diferentes moléculas de anticuerpo que reconocen diferentes antígenos. De esta manera, el repertorio de anticuerpos se determina por diversidad de secuencia en CDR1, 2 y 3. La diversidad en CDR1, 2 y 3 que da lugar a un repertorio de anticuerpos completo se origina a partir de tres fuentes: diversidad recombinatoria, diversidad de unión y mutación somática. La diversidad recombinatoria en CDR1 y CDR2 se origina a partir de la elección de segmentos V diferentes que contienen diferentes secuencias CDR1 y CDR2. La diversidad recombinatoria en CDR3 se origina por la elección de diferentes segmentos D y J. La diversidad de unión contribuye sólo a la diversidad de CDR3, mientras que la mutación somática, que actúa a lo largo de la región V completa, contribuye a la diversidad en las tres regiones determinantes de complementariedad. La diversidad recombinatoria y de unión conjuntamente constituyen la diversidad del repertorio primario (figura 1). De esta forma, la unión VDJ genera un conjunto de células B primarias que expresan IgM.

Cualquier repertorio primario de células B que expresan una molécula de IgM en la superficie celular con una cierta afinidad mínima por un antígeno extraño, internaliza este antígeno como IgM y termina el ciclo en la superficie celular. Después, el antígeno se procesa y los péptidos asociados se presentan en la superfície celular por moléculas del MHC de clase II. Si se presenta suficiente antígeno extraño en la superficie de la célula, éste desencadena una respuesta de células T que, a su vez, desencadena la maduración de las células B dependiente de células T. Ésta es la denominada respuesta secundaria (figura 8). Parte de esta respuesta implica la hipermutación de la porción variable de los genes de inmunoglobulina. De esta manera, un clon de células B que experimenta una respuesta secundaria constantemente produce nuevos clones con moléculas de inmunoglobulina alterada. Los clones con mayores afinidades por el antígeno extraño se expanden de forma selectiva debido a las células T auxiliares, dando lugar a la maduración de la afinidad del anticuerpo expresado. Debido a que la hipermutación somática tiene lugar a lo largo de la región V completa, no hay limitación teórica para el proceso de maduración de afinidad.

Teniendo en cuenta lo anterior, la diversidad de CDR1 y 2 no es necesaria para generar una respuesta de anticuerpos completa. Es más, la diversidad en CDR3, creada por la unión VJ y VDJ, proporciona la afinidad mínima suficiente para desencadenar la maduración dependiente de células T para producir anticuerpos de alta afinidad para un gran número de antígenos diferentes. De esta manera, pueden emplearse métodos para generar un amplio repertorio de anticuerpos sin diversidad primaria. Esta diversidad se basa en la mutación somática para la generación de diversidad de anticuerpos. Durante el proceso de maduración de la afinidad, la mutación somática produce un gran número de clones con afinidades menores, en lugar de mayores, para el antígeno de estimulación. La mayoría de estos clones no se seleccionan y mueren. Sin embargo, si uno de estos clones tiene afinidad por un antígeno nuevo que también está presente, este clon se expande y experimenta una maduración de la afinidad por el nuevo antígeno (figura 9). En consecuencia, un ratón transgénico con cadenas pesadas y ligeras humanas reorganizadas se combina para formar un anticuerpo que tiene una baja afinidad por un antígeno conocido. Si a este animal se le inyecta el antígeno conocido, sus células B experimentan una respuesta secundaria que conduce a la producción de anticuerpos de alta afinidad por ese antígeno. Sin embargo, si a este ratón se le inyecta primero una mezcla del antígeno conocido y un nuevo antígeno, y entonces se expone posteriormente al nuevo antígeno solo, se producen anticuerpos de alta afinidad contra el nuevo antígeno por el proceso de ramificación descrito anteriormente. Esta estrategia tiene dos ventajas principales: en primer lugar, las construcciones transgénicas son fáciles de generar; y en segundo lugar, los transgenes reorganizados son capaces de excluir alélica e isotípicamente la reorganización de los genes endógenos de ratón, haciendo de esta manera que no sea necesario eliminar esos genes por recombinación homóloga como se ha descrito previamente.

La primera etapa de esta estrategia es el aislamiento de genes de cadena pesada y ligera reorganizados a partir de un hibridoma humano que expresa un anticuerpo IgM dirigido contra un antígeno conocido. El hibridoma ideal reconoce un antígeno fácilmente disponible que es capaz de generar una buena respuesta de células T de ratón. En la actualidad hay varios de estos hibridomas humanos, incluyendo varios que reaccionan con antígenos prometedores tales como el toxoide tetánico, pseudomonas o bacterias gram negativas (revisado por James y Bourla (1987), J. Immunol. Methods., 100, 5-40). El gen de cadena pesada reorganizado completo se aísla en una pieza única de ADN (de aproximadamente 20 kb), mientras que el gen de cadena ligera \kappa reorganizado, incluyendo el potenciador 3', se aísla en un segundo fragmento de ADN (de aproximadamente 20 kb). Cada uno de estos fragmentos se reconstruye a partir de clones aislados de una biblioteca del fago \lambda obtenida a partir de ADN aislado del hibridoma. Se generan dos construcciones, una construcción de cadena pesada y una construcción de cadena ligera.

La construcción de cadena pesada (figura 10) comprende el fragmento del hibridoma de 20 kb, que contiene el gen de IgM reorganizado, ligado a un fragmento de 25 kb que contiene las regiones constantes \gamma3 y \gamma1 humanas seguidas de un fragmento de 700 pb que contiene el potenciador 3' de cadena pesada de rata (Petterson et al. (1990), Nature, 344, 165-168). La construcción de cadena ligera consta de la pieza de ADN de 20 kb intacta que contiene la cadena \kappa reorganizada y el potenciador 3'. Estas dos construcciones se inyectan conjuntamente de manera que se integran en un solo sitio del genoma de ratón. La expresión del ARNm del transgen se ensaya en los ratones transgénicos por análisis de transferencia de Northern. Después se realiza el análisis por FACS en muestras de sangre de la cola del ratón para detectar la expresión en la superficie de las células de la proteína codificada por el transgen. Después, los ratones se inmunizan con el antígeno reconocido por el hibridoma original. Se realizan análisis por ELISA y por FACS con sangre de la cola para detectar el cambio de clase. Finalmente, se ensaya la capacidad de los ratones para responder a varios antígenos diferentes por medio de la coinyección de un panel de antígenos conjuntamente con el antígeno original. Se analiza sangre de la cola por ELISA para detectar la producción de anticuerpos IgG humanos de alta afinidad dirigidos contra antígenos individuales.

Para usar este ratón transgénico para generar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno determinado, preferiblemente ese antígeno primero se inyecta conjuntamente con el antígeno asociado con el hibridoma a partir del cual se aislaron los genes. Este antígeno asociado con hibridoma se denomina coantígeno (algunas veces antígeno secundario) y el nuevo antígeno simplemente el antígeno (o antígeno primario). Si es posible, el antígeno secundario se entrecruza químicamente con el antígeno primario antes de la inyección. Esto hace que el primer antígeno se internalice y se presente por las células B presentadoras del transgen primario, asegurando de esta manera la existencia de un grupo de células T auxiliares activadas que reconocen el primer antígeno. Un programa de inmunización típico es el siguiente. Día 1: se les inyecta a los ratones i.p. el primer antígeno mezclado con, o entrecruzado con, el segundo antígeno en adyuvante completo de Freund. Día 14: se inyecta el primer antígeno (sin el segundo antígeno) i.p. en adyuvante incompleto de Freund. Día 35: se repite la inyección con el primer antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Día 45: ensayo de la respuesta de anticuerpos por ELISA en muestras de sangre de la cola. Día 56: se repite la inyección de los animales que responden bien con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Día 59: fusión de los bazos de los animales con buena respuesta.

De forma alternativa, el antígeno reconocido por el hibridoma a partir del cual se aislaron los genes de Ig, se usa como inmunógeno. Después se aíslan nuevos hibridomas transgénicos a partir del animal inmunizado que expresa versiones mutadas somáticamente del anticuerpo original. Estos nuevos anticuerpos tendrán una afinidad mayor por el antígeno original. Este procedimiento de "remodelación" del anticuerpo también puede aplicarse a genes de anticuerpo generados por injerto de CDR (Pub. P.E. Nº. 239400, publicada el 30 de septiembre de 1987) o aislados a partir de bibliotecas de expresión bacterianas (W. D. Huse et al (1989) Science, 246, 1275) o de fagos (T. Clackson et al. (1991) Nature, 352, 624).

Animales No Humanos Transgénicos que Contienen Transgenes de Cadena Pesada y/o Ligera de Inmunoglobulina Reorganizados o No Reorganizados

Las realizaciones previas describían el uso de transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina completamente reorganizados o completamente no reorganizados para producir animales transgénicos no humanos capaces de producir un anticuerpo heterólogo. Sin embargo, la presente invención también incluye ratones transgénicos que contienen al menos un transgen de inmunoglobulina reorganizado y al menos un transgen de inmunoglobulina no reorganizado y pueden producirse utilizando cualquiera de los transgenes no reorganizados y reorganizados mencionados anteriormente en combinación para proporcionar transgenes de cadena pesada y ligera al ratón transgénico. En este aspecto, el transgen no reorganizado comprende un transgen genómico o de minilocus de cadena pesada de inmunoglobulina y el transgen reorganizado comprende un transgen de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.

La combinación del transgen reorganizado y el transgen no reorganizado proporciona un nivel intermedio de diversidad dentro de las células B de repertorio primario. De esta manera, aunque la diversidad primaria en CD1, CD2 y CD3 en el transgen reorganizado se fija en la célula B de repertorio primario, la diversidad primaria en CDR1, CDR2 y CDR3 producidas por la reorganización del transgen no reorganizado proporciona una población de repertorio primario de células B que tienen una mayor diversidad potencial que el clon de células B obtenido cuando se usan transgenes de cadena pesadas y ligera reorganizados. Esta diversidad primaria proporciona una diversidad secundaria ampliada cuando estas células responden a un antígeno extraño por medio de mutación somática.

Ácidos Nucleicos

En los ácidos nucleicos, la expresión "homología substancial" indica que dos ácidos nucleicos, o secuencias designadas de los mismos, cuando se alinean óptimamente y se comparan, son idénticos, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos aproximadamente el 80% de los nucleótidos, normalmente en al menos aproximadamente del 90 al 95%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente del 98 al 99,5% de los nucleótidos. De forma alternativa, existe una homología substancial cuando los segmentos hibridan en condiciones de hibridación selectiva con el complementario de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o es "substancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares o de otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandeo con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros métodos bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York (1987).

Las composiciones de ácidos nucleicos de la presente invención, aunque a menudo están en una secuencia nativa (con la excepción de sitios de restricción modificados y similares) procedente de ADNc, ADN genómico o mezclas de éstos, pueden estar mutadas de acuerdo con técnicas convencionales para proporcionar secuencias génicas. En el caso de las secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de aminoácidos cuando se desee. En particular, se contemplan secuencias de ADN substancialmente homólogas o derivadas de secuencias nativas V, D, J, constantes, de cambio y otras secuencias descritas en este documento (en las que "derivado" indica que una secuencia es idéntica o se ha modificado a partir de otra secuencia).

Un ácido nucleico está "unido de forma operativa" cuando está situado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador se une de forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, unido de forma operativa significa que las secuencias de ADN que se están uniendo están contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, están contiguas y en fase de lectura. En el caso de las secuencias de cambio, unidas de forma operativa indica que las secuencias son capaces de efectuar recombinación de cambio.

Realizaciones Preferidas Específicas

Una realización preferida de la invención es un ratón que contiene una sola copia del transgen descrito en el ejemplo 14 (pHC2) cruzado con un ratón que contiene una sola copia del transgen descrito en el ejemplo 16, y la descendencia cruzada con el animal en el que se ha delecionado JH descrito en los ejemplos 9 y 12. Los animales se cruzan hasta la homocigosis para cada una de estos tres rasgos. Estos animales tienen el siguiente genotipo: una copia única (por serie haploide de cromosomas) de un minilocus no reorganizado de cadena pesada humana (descrito en el ejemplo 14), una copia única (por serie haploide de cromosomas) de una construcción de cadena ligera \kappa humana reorganizada (descrita en el ejemplo 16), y una deleción en cada locus de cadena pesada de ratón endógena que elimina todos los segmentos JH funcionales (descrita en los ejemplos 9 y 12). Estos animales se cruzan con ratones que son homocigotos para la deleción de los segmentos JH (ejemplos 9 y 12) para producir una descendencia que es homocigota para la deleción JH y hemicigota para las construcciones de cadena pesada y ligera humanas. A los animales resultantes se les inyectan antígenos y se usan para la producción de anticuerpos monoclonales humanos contra estos antígenos.

Las células B aisladas de dicho animal son monoespecíficas con respecto a las cadenas pesadas y ligeras humanas ya que contienen sólo una única copia de cada gen. Además, serán monoespecíficas con respecto a las cadenas pesadas humanas o de ratón, ya que ninguna de las copias endógenas de los genes de cadena pesada de ratón es funcional en virtud de la deleción que abarca la región JH introducida como se describe en los ejemplos 9 y 12. Además, una fracción substancial de las células B será monoespecífica con respecto a las cadenas ligeras humanas o de ratón, ya que la expresión de la copia única del gen de cadena ligera \kappa humana reorganizada excluirá alélica e isotípicamente la reorganización de los genes de cadena \kappa y lambda de ratón endógenos en una fracción significativa de células B.

Los ratones transgénicos de la realización preferida mostrarán producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, de forma ideal substancialmente similar al de un ratón nativo. De esta manera, por ejemplo, cuando los genes de Ig endógena se han inactivado, los niveles de inmunoglobulina total varían de aproximadamente 0,1 a 10 mg/ml de suero, preferiblemente de 0,5 a 5 mg/ml, idealmente son de al menos aproximadamente 1,0 mg/ml. Cuando en el ratón transgénico se ha introducido un transgen capaz de efectuar un cambio de IgM a IgG, la relación en el suero del ratón adulto entre IgG e IgM es preferiblemente de aproximadamente 10:1. Por supuesto, la relación entre IgG e IgM será mucho menor en el ratón inmaduro. En general, más de aproximadamente el 10%, preferiblemente del 40 al 80% de las células B de bazo y de ganglio linfático expresan exclusivamente proteína IgG humana.

Idealmente, el repertorio se aproximará al mostrado por un ratón no transgénico, normalmente será al menos aproximadamente un 10% mayor, preferiblemente del 25 al 50% o más. Generalmente, se producirán al menos aproximadamente un millar de inmunoglobulinas diferentes (de manera ideal IgG), preferiblemente de 10^{4} a 10^{6} o más, dependiendo principalmente del número de regiones V, J y D diferentes introducidas en el genoma de ratón. Estas inmunoglobulinas reconocerán típicamente aproximadamente la mitad o más de las proteínas altamente antigénicas, incluyendo, pero no de forma limitante: citocromo C de paloma, lisozima de pollo, mitógeno de fitolaca, albúmina de suero bovino, hemocianina de lapa californiana, hemaglutinina del virus de la influenza, proteína A de Staphylococcus, mioglobina de esperma de ballena, neuraminidasa del virus de la influenza y proteína represora lambda. Algunas de las inmunoglobulinas mostrarán una afinidad por antígenos preseleccionados de al menos aproximadamente 10^{-7} M^{-1}, preferiblemente de 10^{-8} M^{-1} a 10^{-9} M^{-1} o mayor.

Aunque lo anterior describe una realización preferida del ratón transgénico de la invención, se definen otras realizaciones por la descripción de este documento y, más particularmente, por los transgenes descritos en los ejemplos. La presente invención abarca dos de las siguientes categorías (I y II) de ratones transgénicos, mientras que las otras dos categorías adicionales (III y IV) se proporcionan sólo como referencia.

I. Ratones transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina de cadena pesada no reorganizada y cadena ligera reorganizada.

II. Ratones transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina de cadena pesada no reorganizada y cadena ligera no reorganizada.

III. Ratones transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina de cadena pesada reorganizada y cadena ligera no reorganizada, y

IV. Ratones transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada reorganizada y cadena ligera reorganizada.

De estas categorías de animal transgénico, el orden de preferencia con respecto a la invención es el siguiente
I > II.

Dentro de cada una de estas categorías de animal transgénico, se prevén varias combinaciones posibles. Estas combinaciones comprenden las siguientes:

Categoría I

(a) Animal de los ejemplos 1 y 2 o 19 y 20 cruzado con animal del ejemplo 7 o 16.

(b) Fragmento del ejemplo 1 o 19 inyectado conjuntamente con el fragmento del ejemplo 7 o 16.

(c) Animal del ejemplo 5 (H, I o J) o 14, 17 o 21 cruzado con animal del ejemplo 7 o 16.

(d) Construcción del ejemplo 5(H) o 14 coinyectada con la construcción del ejemplo 7 o 16.

(e) Todos los anteriores cruzados con el animal del ejemplo 9 o 11, o 12 o 13. Son realizaciones particularmente preferidas todos los cruces anteriores con animales del ejemplo 9, 12 o 13.

Categoría II

(a) Animal del ejemplo 1, 2, 19 o 20 cruzado con el animal del ejemplo 6, 3, 4, 16, 22 o 23.

(b) Fragmento del ejemplo 1 o 19 inyectado conjuntamente con el fragmento del ejemplo 2 o 20.

(c) Animales de los ejemplos 5 (H, I o J) o 14, 17 o 21 cruzado con el animal del ejemplo 6 (B, C o D) o 16.

(d) Construcción 5(H) o 14 inyectada conjuntamente con la construcción 6(B) o 16.

(e) Animal del ejemplo 1, 2, 19 o 20 cruzado con el animal del ejemplo 6 (B, C o D) o 16.

(f) Animal del ejemplo 3, 4, 22 o 23 cruzado con el animal del ejemplo 5 (H, I o J) o 14, 17 o 21.

(g) Todos los anteriores cruzados con el animal del ejemplo 9, 10, 11, 12 o 13.

Categoría III

(a) Animal del ejemplo 3, 4, 22 o 23 cruzado con el animal del ejemplo 8 o 15.

(b) Fragmento 3 o 23 inyectado conjuntamente con el fragmento del ejemplo 8 o 15.

(c) Animal del ejemplo 6 (B, C o D) o 16 cruzado con el animal del ejemplo 8 o 15.

(d) Construcción del ejemplo 6 (B) o 15 inyectada conjuntamente con la construcción del ejemplo 8 o 15.

(e) Todos los anteriores cruzados con el animal del ejemplo 9 a 13.

Categoría IV

(a) Animal del ejemplo 7 o 16 cruzado con el animal del ejemplo 8 o 15.

(b) Construcción del ejemplo 7 o 16 inyectado conjuntamente con la construcción del ejemplo 8 o 15.

(c) Todos los anteriores cruzados con el animal del ejemplo 9 a 13.

Lo que viene a continuación se presenta a modo de ejemplo y no debe considerarse una limitación del alcance de las reivindicaciones.

Métodos y materiales

Los ratones transgénicos se obtienen de acuerdo con Hogan, et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory.

Las células madre embrionarias se manipulan de acuerdo con procedimientos publicados (Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, E.J. Robertson, ed. IRL Press, Washington, D.C., 1987; Zjilstra, et al., (1989), Nature, 342, 435-438; y Schwartzberg, P., et al. (1989), Science, 246, 799-803).

Los procedimientos de clonación de ADN se realizan de acuerdo con J. Sambrook, et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Los oligonucleótidos se sintetizan en un sintetizador de oligonucleótidos de Applied Bio Systems de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el fabricante.

Las células de hibridoma y los anticuerpos se manipulan de acuerdo con "Antibodies: A Laboratory Manual", Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

Ejemplo 1 Transgen genómico de cadena pesada de Ig humana

Este ejemplo describe la clonación y microinyección de un transgen genómico de cadena pesada de inmunoglobulina humana que se microinyecta en un cigoto murino.

Se aíslan núcleos a partir de tejido de placenta humana recién obtenida como describen Marzluff, W.F., et al. (1985), "Transcription and Translation. A Practical Approach", B.D. Hammes y S.J. Higgins, eds, pág. 89-129, IRL Press, Oxford). Los núcleos aislados (o espermatocitos humanos lavados con PBS) se incluyen en una matriz de agarosa de bajo punto de fusión y se lisan con EDTA y proteinasa \kappa para exponer el ADN de alto peso molecular, que se digiere después en la agarosa con el enzima de restricción NotI como describe M. Finney en Current Protocolos in Molecular Biology (F. Ausubel, et al., eds. John Wiley & Sons, Supl. 4, 1988, Sección 2.5.1).

Después, el ADN digerido con NotI se fracciona por electroforesis en gel de campo pulsado como se describe en Anand, R. et al., (1989), Nucl. Acids Res., 17, 3425-3433. Se ensayan fracciones enriquecidas en el fragmento NotI por hibridación de Southern para detectar una o más de las secuencias codificadas por este fragmento. Estas secuencias incluyen los segmentos de cadena pesada D, segmentos J y regiones constantes \mu y \gamma1 junto con representantes de las 6 familias VH (aunque Berman, et al. (1988), supra identifican este fragmento como un fragmento de 670 kb procedente de células HeLa, nosotros hemos descubierto que es un fragmento de 830 kb procedente de ADN de placenta y esperma humano). Las fracciones que contienen este fragmento NotI (véase la figura 4) se juntan y se clonan en el sito NotI del vector pYACNN en células de levadura. El plásmido pYACNN se prepara por digestión de pYAC-4 Neo (Cook, H. et al. (1988), Nucleic Acids Res., 16, 11817) con EcoRI y por ligamiento en presencia del oligonucleótidos 5' -AAT TGC GGC CGC - 3'.

Los clones YAC que contienen el fragmento NotI de cadena pesada se aíslan como se describe en Brownstein, et al. (1989), Science, 244, 1348-1351, y Green, E., et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1213-1217. El inserto NotI clonado se aísla del ADN de levadura de alto peso molecular por electroforesis en gel de campo pulsado como se describe en M. Finney, op. cit.. El ADN se condensa por la adición de espermina 1 mM y se microinyecta directamente en el núcleo de embriones de una sola célula descritos previamente.

Ejemplo 2 Transgen genómico discontinuo de cadena pesada de Ig

Un fragmento SpeI de 110 kb de ADN genómico humano que contiene VH6, segmentos D, segmentos J, la región constante \mu y parte de la región constante \gamma (véase la figura 4) se aísla por clonación en YAC como se describe en el ejemplo 1.

Se aísla un fragmento NotI de 570 kb cadena arriba del fragmento NotI de 670-830 kb descrito anteriormente, que contiene múltiples copias de VI hasta V5, como se ha descrito (Berman, et al. (1988), supra). Se detectan dos fragmento NotI de 570 kb. Cada uno de ellos contiene múltiples segmentos V).

Los dos fragmentos se inyectan conjuntamente en el núcleo de un embrión de una sola célula de ratón como se describe en el ejemplo 1.

La inyección conjunta de dos fragmentos de ADN diferentes normalmente dará lugar a la integración de los dos fragmentos en el mismo sitio de inserción dentro del cromosoma. Por lo tanto, aproximadamente el 50% de los animales transgénicos resultantes que contienen al menos una copia de cada uno de los dos fragmentos tendrá el fragmento del segmento V insertado cadena arriba del fragmento que contiene la región constate. De estos animales, el 50% realizará la unión de V a DJ por inversión de ADN y el 50% lo hará por deleción, dependiendo de la orientación del fragmento NotI de 570 kb en relación con la posición del fragmento SpeI de 110 kb. El ADN se aísla a partir de los animales transgénicos resultantes y se ensaya la capacidad para expresar moléculas de inmunoglobulina humana de los animales que, según se ha descubierto, contienen los dos transgenes por hibridación de transferencia de Southern (especialmente, los animales que contienen tanto segmentos V humanos múltiples como genes de la región constante humana).

Ejemplo 3 Transgen Genómico de Cadena Ligera \kappa de Ig Humana Formado por Recombinación Homóloga In Vivo

En Lorenz, W., et al. (1987), Nucl. Acids Res., 15, 9667-9677 se ha descrito un mapa de la cadena ligera \kappa humana y se representa en la figura 11.

Se aísla un fragmento (a) de XhoI a NotI de 450 kb que incluye todos los siguientes: C\kappa, el potenciador 3', todos los segmentos J y al menos cinco segmentos V diferentes (a) y se microinyecta en el núcleo de embriones de una sola célula como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 4 Transgen Genómico de Cadena Ligera \kappa de Ig Humana Formado por Recombinación Homóloga In Vivo

Se aísla como se describe en el ejemplo 1 (véase la figura 11) un fragmento (b) de MluI a NotI de 750 kb que incluye todo lo anterior más al menos 20 segmentos V más y se digiere con BssHII para producir un fragmento de aproximadamente 400 kb (c).

El fragmento (a) de XhoI a NotI de 450 kb más el fragmento (c) de MluI a BssHII de 400 kb tienen una secuencia solapada definida por los sitios de restricción BssHII y XhoI mostrados en la figura 11. La recombinación homóloga de estos dos fragmentos tras la microinyección de un cigoto de ratón da lugar a un transgen que contiene al menos unos 15-20 segmentos V adicionales además de los encontrados en el fragmento XhoI/NotI de 450 kb (ejemplo 3).

Ejemplo 5 Construcción de Minilocus de Cadena Pesada A. Construcción de pGP1 y pGP2

Se digiere pBR322 con EcoRI y con StyI y se liga con los oligonucleótidos siguientes para generar pGP1 que contiene un inserto de 147 pares de bases con los sitios de restricción mostrados en la figura 13. El solapamiento general de estos oligos también se muestra en la figura 13.

Los oligonucleótidos son:

1

Este plásmido contiene un polienlazador grande flanqueado por sitios de corte NotI raros para construir grandes insertos que pueden aislarse a partir de secuencias del vector para microinyección. El plásmido se basa en pBR322 que tiene un número relativamente bajo de copias en comparación con los plásmidos basados en pUC (pGP1 retiene la región de control de número de copias de pBR322 cerca del origen de replicación). Un número bajo de copias reduce la toxicidad potencial de las secuencias insertadas. Además, pGP1 contiene una secuencia de terminación de la transcripción fuerte derivada de trpA (Christie, G.E., et al. (1981), Proc. Natl .Acad. Sci. USA) insertada entre el gen de resistencia a ampicilina y el polienlazador. Esto además reduce la toxicidad asociada con ciertos insertos previniendo la transcripción en translectura iniciada a partir de los promotores de ampicilina.

El plásmido pGP2 deriva de pGP1 introduciendo un sitio de restricción adicional (SfiI) en el polienlazador. pGP1 se digiere con MluI y SpeI para cortar las secuencias de reconocimiento en la porción de polienlazador del plásmido.

Al pGP1 digerido de esta manera se ligan los siguientes oligopéptidos adaptadores para formar pGP2.

2

pGP2 es idéntico a pGP1 excepto porque contiene un sitio Sfi I adicional localizado entre los sitios MluI y SpeI. Esto permite que los insertos se escindan por completo con SfiI así como con NotI.

B. Construcción de pRE3 (potenciador 3' de rata)

En las construcciones de cadena pesada se incluye una secuencia potenciadora localizada cadena abajo de la región constante de rata.

Se aísla y se clona el potenciador 3' de la región de cadena pesada descrito por S. Pettersson, et al., (1990), Nature, 344, 165-168). La secuencia potenciadora 3' de IGH de rata se amplifica por PCR usando los siguientes oligonucleótidos:

3

El ADN de doble cadena formado de esta manera que codifica el potenciador 3' se corta con BamHI y SphI y se clona en pGP2 cortado con BamHI/SphI para producir pRE3 (potenciador 3' de rata).

C. Clonación de la región J-\mu humana

Se clona una porción substancial de esta región combinando dos o más fragmentos aislados a partir de insertos del fago lambda. Véase la figura 14.

Se aísla un fragmento BamHI/HindIII de 6,3 kb que incluye todos los segmentos J humanos (Matsuda, et al., (1988), EMBO J., 7, 1047-1051; Ravetech, et al. (1981), Cell, 27, 583-591) a partir de una biblioteca de ADN genómico humano usando el oligonucleótido GGA CTG TGT CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATG TCT GGG GCC AAG.

De forma similar, se aísla un fragmento HindIII/BamII de 10 kb adyacente que contiene el potenciador, y los exones codificantes de la región de cambio y la región constante (Yasui, et al. (1989), Eur. J. Immunol., 19, 1399-1403) usando el oligonucleótido:

CAC CAA GTT GAC CTG CCT GGT CAC AGA CCT GAC CAC CTA TGA

De manera similar, se aísla un fragmento BamHI 3' adyacente de 1,5 kb usando el inserto del clon pMUM como sonda (pMUM es un fragmento EcoRI/HindIII de 4 kb aislado a partir de una biblioteca de ADN genómico humano con el oligonucleótido:

4

exón 1 de membrana mu) y se clona en pUC19.

pGP1 se digiere con BamHI y con BglII seguido de tratamiento con fosfatasa alcalina intestinal de ternero.

Los fragmentos (a) y (b) de la figura 14 se clonan en el pGP1 digerido. Después se aísla un clon que está orientado de modo que el sitio BamHI 5' se destruya por la fusión BamHI/Bgl. Se identifica como pMU (véase la figura 15). pMU se digiere con BamHI y se inserta el fragmento (c) de la figura 14. La orientación se comprueba por digestión con HindIII. El plásmido resultante pHIG1 (figura 15) contiene un inserto de 18 kb que codifica segmentos J y C\mu.

D. Clonación de la región C\mu

pGP1 se digiere con BamHI y con HindIII seguido del tratamiento con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (figura 14). El fragmento (b) de la figura 14 tratado de esta manera y el fragmento (c) de la figura 14 se clonan en pGP1 cortado con BamHI/HindIII. La orientación apropiada del fragmento (c) se comprueba por digestión con HindIII para forman pCON1 que contiene un inserto de 12 kb que codifica la región C\mu.

Considerando que pHIG1 contiene segmentos J, secuencias de cambio y secuencias \mu en su inserto de 18 kb con un sitio SfiI 3' y un sitio SpeI 5' en un polienlazador flanqueado por sitios NotI, se usará para segmentos VDJ reorganizados. pCON1 es idéntico excepto porque carece de región J y contiene sólo un inserto de 12 kb. Más adelante se describirá el uso de pCON1 en la construcción de un fragmento que contiene segmentos VDJ reorga-
nizados.

E. Clonación de región constante \gamma-1 (pREG2)

La clonación de la región humana \gamma-1 se representa en la figura 16.

Yamamura, et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2152-2156 informaron sobre la expresión de \gamma-1 humana unida a la membrana a partir de una construcción transgénica que se había delecionado parcialmente en la integración. Sus resultados indican que el sitio BamHI 3' delimita una secuencia que incluye la copia transmembrana reorganizada y cambiada del gene gamma con un intrón V-C de menos de 5 kb. Por lo tanto, en el gen no reorganizado ni cambiado, la región de cambio completa se incluye en una secuencia que empieza a menos de 5 kb del extremo 5' del primer exón constante de \gamma-1. Por lo tanto, se incluye en el fragmento HindIII 5' de 5,0 kb (Ellison, J.W., et al. (1982), Nucleic Acids Res., 10, 4071-4079). Takahashi, et al., (1982), Cell, 29, 671-679 también notifican que este fragmento contiene la secuencia de cambio, y este fragmento conjuntamente con el fragmento de HindIII a BamHI de 7,7 kb debe incluir todas las secuencias que necesitamos para la construcción transgénica.

Se identifican clones de fagos que contienen la región \gamma-1 y se aíslan usando el siguiente oligonucleótido que es específico para el tercer exón de \gamma-1 (CH3).

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5

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Un fragmento de HindIII a BglII de 7,7 kb (fragmento (a) de la figura 16) se clona en pRE3 cortado con HIndIII/BglII para formar pREG1. El fragmento HindIII cadena arriba de 5,3 kb (fragmento (b) de la figura 16) se clona en pREG1 digerido con HindIII para formar pREG2. La orientación correcta se confirma por digestión con BamHI/SpeI.

F. Combinación de C\gamma y C\mu

El plásmido pHIG1 descrito previamente contiene segmentos J humanos y los exones de la región constante C\mu. Para proporcionar un transgen que contenga los segmentos del gen de región constante C\mu, se digirió pHIG1 con SfiI (figura 15). El plásmido pREG2 también se digirió con SfiI para producir un inserto de 13,5 kb que contenía exones de la región C\gamma humana y la secuencia potenciadora 3' de rata. Estas secuencias se combinaron para producir el plásmido pHIG3' (figura 17) que contenía los segmentos J humanos, la región constante C\mu humana, la región constante C\gamma1 humana y el potenciador 3' de rata contenidos en un inserto de 31,5 kb.

Se construye un segundo plásmido que codifica C\mu humana y C\gamma1 humana sin los segmentos J digiriendo pCON1 con SfiI y combinándolo con el fragmento SfiI que contiene la región C\gamma humana y el potenciador 3' de rata por digestión de pREG2 con SfiI. El plásmido resultante, pCON (figura 17) contiene un inserto NotI/SpeI de 26 kb que contiene C\mu humana, \gamma1 humana y la secuencia del potenciador 3' de rata.

G. Clonación del segmento D

La estrategia para clonar los segmentos D humanos se representa en la figura 18. Se identifican clones de fago de la biblioteca genómica humana que contiene los segmentos D y se aíslan usando sondas específicas para secuencias de la región de diversidad (Y. Ichihara, et al., (1988), EMBO J., 7, 4141-4150). Se usan los siguientes oligonucleótidos:

6

Un fragmento XhoI de 5,2 kb (fragmento (b) de la figura 18) que contiene DLR1, DXP1, DXP'1 y DA1, se aísla a partir de un clon de fago identificado con el oligo DXP1.

Un fragmento XbaI de 3,2 kb (fragmento (c) en la figura 18) que contiene DXP4, DA4 y DK4 se aísla a partir de un clon de fago identificado con el oligo DXP4.

Los fragmentos (b), (c) y (d) de la figura 18 se combinan y se clonan en el sitio XbaI/XhoI de pGP1 para formar pHIG2 que contiene un inserto de 10,6 kb.

Esta clonación se realiza de forma secuencial. En primer lugar, el fragmento (b) de 5,2 kb de la figura 18 y el fragmento (d) de 2,2 kb de la figura 18 se tratan con fosfatasa alcalina intestinal de ternero y se clonan en pGP1 digerido con XhoI y con XbaI. Los clones resultantes se seleccionan con los insertos de 5,2 y 2,2 kb. La mitad de los clones con un resultado positivo en los ensayos con los insertos de 5,2 y 2,2 kb tienen el inserto 5,2 kb en la orientación adecuada según se determina por digestión con BamHI. Después, se clona el fragmento XbaI de 3,2 kb de la figura 18 en este plásmido intermedio que contiene los fragmentos (b) y (d) para formar pHIG2 (figura 9). Este plásmido contiene segmentos de diversidad clonados en el polienlazador con un sitio único SfiI 5' y un sitio único SpeI 3'. El polienlazador completo está flanqueado por sitios NotI.

H. Construcción de Minilocus de Cadena Pesada

A continuación se describe la construcción de un minilocus de cadena pesada humana que contiene uno o más segmentos V.

Se aísla un segmento V no reorganizado correspondiente al identificado como el segmento V contenido en el hibridoma de Newkirk, et al. (1988), J. Clin. Invest., 81, 1511-1518, usando el siguiente oligonucleótido:

7

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Se determina un mapa de restricción del segmento V no reorganizado para identificar los sitios de restricción únicos que proporcionan tras la digestión un fragmento de ADN que tiene una longitud aproximada de 2 kb que contiene el segmento V no reorganizado junto con las secuencias flanqueantes 5' y 3'. Las secuencias cebadoras 5' incluirán promotores y otras secuencias reguladoras, mientras que la secuencia flanqueante 3' proporciona secuencias de recombinación necesarias para la unión V-DJ. Este inserto del segmento V de aproximadamente 3,0 kb se clona en el polienlazador de pGB2 para formar pVH1.

pVH1 se digiere con SfiI y el fragmento resultante se clona en el sitio SfiI de pHIG2 para formar pHIG5'. Puesto que pHIG2 contiene sólo segmentos D, el plásmido resultante pHIG5' contiene un único segmento V junto con segmentos D. El tamaño del inserto contenido en pHIG5 es de 10,6 kb más el tamaño de el inserto del segmento V.

El inserto de pHIG5 se escinde por digestión con NtoI y SpeI y se aísla. pHIG3', que contiene segmentos J, C\mu y C\gamma1, se digiere con SpeI y con NotI y se aísla el fragmento 3' de ... kb que contiene estas secuencias y la secuencia del potenciador 3' de rata. Estos dos fragmentos se combinan y se ligan en pGP1 digerido con NotI para producir pHIG que contiene el inserto que codifica un segmento V, nueve segmentos D, seis segmentos J funcionales, C\mu, C\gamma y el potenciador 3' de rata. El tamaño de este inserto es de aproximadamente 43 kb más el tamaño del inserto del
segmento V.

I. Construcción de Minilocus de Cadena Pesada por Recombinación Homóloga

Como se indica en la sección previa, el inserto de pHIG es de aproximadamente 43 a 45 kb cuando se emplea un único segmento V. Ese tamaño de inserto está en el límite o cerca del límite de los que pueden clonarse fácilmente en vectores plasmídicos. Para proporcionar el uso de un número mayor de segmentos V, a continuación se describe la recombinación homóloga in vivo de fragmentos de ADN solapantes que tras recombinación homóloga en un cigoto o en una célula ES forman un transgen que contiene la secuencia potenciadora 3' de rata, la C\mu humana, la C\gamma1 humana, los segmentos J humanos, segmentos D humanos y una multiplicidad de segmentos V humanos.

Un fragmento BamHI/HindIII de 6,3 kb que contiene los segmentos J humanos (véase el fragmento (a) de la figura 14) se clona en pHIG5' digerido con MluI/SpeI usando los siguientes adaptadores:

8

El resultante es un plásmido denominado pHIG5'O (solapamiento). El inserto contenido en este plásmido contiene segmentos V, D y J humanos. Cuando se usa el segmento único V de pVH1, el tamaño de este inserto es de aproximadamente 17 kb más 2 kb. Este inserto se aísla y se combina con el inserto de pHIG3' que contiene las secuencias humanas J, C\mu, \gamma1 y del potenciador 3' de rata. Ambos insertos contienen segmentos J humanos que proporcionan aproximadamente 6,3 kb de solapamiento entre los dos fragmentos de ADN. Cuando se inyectan conjuntamente en el cigoto de ratón, tiene lugar una recombinación homóloga in vivo que genera un transgen equivalente al inserto contenido en pHIG.

Esta estrategia proporciona la adición de una multiplicidad de segmentos V dentro del transgen formado in vivo. Por ejemplo, en lugar de incorporar un único segmento V en pHIG5', se clonan una multiplicidad de segmentos V contenidos en (1) ADN genómico aislado, (2) ADN ligado derivado de ADN genómico, o (3) ADN que codifica un repertorio de segmentos V sintéticos; dentro de pHIG2 en el sitio SfiI para generar pHIG5' V_{N}. Después, se clona el fragmento (a) de segmentos J de la figura 14 en pHIG5' V_{N} y se aísla el inserto. Este inserto contiene ahora una multiplicidad de segmentos V y de segmentos J que solapan con los segmentos J contenidos en el inserto aislado a partir de pHIG3'. Cuando se introducen conjuntamente en el núcleo de un cigoto de ratón, tiene lugar una recombinación homóloga para generar in vivo el transgen que codifica segmentos V múltiples y segmentos J múltiples, segmentos D múltiples, la región C\mu, la región C\gamma1 (todas de origen humano) y la secuencia potenciadora 3' de rata.

J. Construcción de un Minilocus de Cadena Pesada por Inyección Conjunta de Fragmentos de la Región VH Sintética Conjuntamente con una Construcción DJC de Cadena Pesada

Se generan fragmentos sintéticos de la región V_{H} y se aíslan como se ha descrito previamente. Estos fragmentos se inyectan conjuntamente con el inserto NotI purificado del plásmido pHIG (o una versión de pHIG que no contiene ningún segmento V). Los fragmentos de ADN inyectados conjuntamente se insertan en un único sitio en el cromosoma. Algunos de los animales transgénicos resultantes contendrán insertos transgénicos que tienen las regiones V sintéticas localizadas en posición adyacente y cadena arriba de las secuencias de la construcción pHIG. Esos animales tendrán un repertorio primario de cadena pesada humana mayor que los animales descritos en el ejemplo 5 (H).

Ejemplo 6 Construcción de Minilocus de Cadena Ligera A. Construcción de pE\mu1

La construcción de pE\mu1 se representa en la figura 21. El potenciador de la cadena pesada de ratón se aísla del fragmento de XbaI a EcoRI de 678 pb (J. Banerji, et al. (1983), Cell, 33, 729-740) a partir de clones de fago usando el oligo:

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9

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Este fragmento E\mu se clona en pGP1 digerido con EcoRV/XbaI rellenando los extremos romos en el sitio EcoRI. El plásmido resultante se denomina pEmu1.

B. Construcción del Minilocus de Cadena Ligera \kappa

La construcción \kappa contiene al menos un segmento V\kappa humano, los cinco segmentos J\kappa humanos, el potenciador J-C\kappa humano, el exón de la región constante \kappa humana y, de forma ideal, el potenciador 3' \kappa humano (K. Meyer, et al. (1989), EMBO J., 8, 1959-1964). El potenciador \kappa en el ratón está a 9 kb cadena abajo de C\kappa. Sin embargo, aún no se ha identificado en el ser humano. Además, la construcción contiene una copia de los potenciadores J-C\mu de la cadena pesada de ratón.

El minilocus se construye a partir de cuatro fragmentos componentes:

(a) un fragmento SmaI de 16 kb que contiene el exón C\kappa humano y el potenciador humano 3' por analogía con el locus de ratón (fragmento (a) en la figura 20);

(b) un fragmento SmaI 5' adyacente de 5 kb, que contiene los cinco segmentos J (fragmento (b) en la figura 20);

(c) el potenciador intrónico de cadena pesada de ratón aislado a partir de pE\mu1 (esta secuencia se incluye para inducir la expresión de la construcción de cadena ligera lo antes posible en el desarrollo de las células B. Como los genes de la cadena pesada se transcriben antes que los genes de la cadena ligera, este potenciador de cadena pesada presumiblemente está activo en una etapa anterior que el potenciador intrónico \kappa); y

(d) un fragmento que contiene uno o más segmentos V.

La preparación de esta construcción es como sigue. Se digiere ADN de placenta humana con SmaI y se fracciona en gel de agarosa por electroforesis. De forma similar, se digiere ADN de placenta humana con BamHI y se fracciona por electroforesis. La fracción de 16 kb se aísla a partir del gel digerido con SmaI y la región de 11 kb se aísla de forma similar a partir del gel que contiene el ADN digerido con BamHI.

La fracción SmaI de 16 kb se clona en lambda FIX II (Stratagene, La Jolla, California) que se ha digerido con XhoI, y se trata con el fragmento klenow de la ADN polimerasa para rellenar el producto de la digestión de restricción de XhoI. El ligamiento de la fracción SmaI de 16 kb destruye los sitios SmaI y deja intactos los sitios XhoI.

La fracción BamHI de 11 kb se clona en \lambda EMBL3 (Stratagene, La Jolla, California) que se digiere con BamHI antes de la clonación.

Los clones de cada biblioteca se sondaron con el oligo específico de C\kappa:

10

un inserto XhoI de 16 kb que se subclonó en pE\mu1 cortado con XhoI, de manera que C\kappa está adyacente al sitio SmaI. El plásmido resultante se denominó pKap1. Véase la figura 22.

El oligonucleótido específico de C\kappa anterior se usa para sondar la biblioteca \lambda EMBL3/BamHI para identificar un clon de 11 kb correspondiente al fragmento (d) de la figura 20. Un fragmento SmaI de 5 kb (fragmento (b) de la figura 20) se subclona y posteriormente se inserta en pKap1 digerido con SmaI. Los plásmidos que contienen la orientación correcta de los segmentos J, C\kappa y el potenciador E\mu se denominan pKap2.

Después de esto, se subclonan uno o más segmentos V\kappa en el sitio MluI de pKap2 para producir el plásmido pKapH que codifica los segmentos V\kappa humanos, los segmentos J\kappa humanos, los segmentos C\kappa humanos y el potenciador E\mu humano. Este inserto se escinde por digestión de pKapH con NotI y se purifica por electroforesis en gel de agarosa. El inserto purificado de esta manera se microinyecta en el pronúcleo de un cigoto de ratón como se ha descrito previamente.

C. Construcción de Minilocus de Cadena Ligera \kappa por Recombinación Homóloga In Vivo

El fragmento BamHI de 11 kb (fragmento (d) de la figura 20) se clona en pGP1 digerido con BamHI de manera que el extremo 3' esté hacia el sitio SfiI. El plásmido resultante se denomina pKAPint. Uno o más segmentos V\kappa se insertan en el polienlazador entre los sitios BamHI y SpeI en pKAPint para formar pKapHV. El inserto de pKapHV se escinde por digestión con NotI y se purifica. El inserto de pKap2 se escinde por digestión con NotI y se purifica. Cada uno de estos fragmentos contiene regiones de homología, ya que el fragmento de pKapHV contiene una secuencia de 5 kb de ADN que incluye los segmentos J\kappa que es substancialmente homóloga al fragmento SmaI de 5 kb contenido en el inserto obtenido a partir de pKap2. De este modo, estos insertos son capaces de recombinarse de forma homóloga cuando se microinyectan en un cigoto de ratón para formar un transgen que codifica V\kappa, J\kappa y C\kappa.

D. Construcción del Minilocus de Cadena Ligera \kappa por Inyección Conjunta de Fragmentos de Región V\kappa Sintética Junto con Construcciones JC de Cadena Ligera

Se generan fragmentos sintéticos de la región V\kappa y se aíslan como se ha descrito previamente. Estos fragmentos de ADN se inyectan conjuntamente con el inserto NotI purificado del plásmido pKap2 o del plásmido pKapH. Los fragmentos de ADN inyectados conjuntamente se insertan en un único sitio del cromosoma. Algunos de los transgénicos resultantes contendrán insertos del transgen que tienen regiones V sintéticas localizadas adyacentes y cadena arriba de las secuencias en la construcción pKap2 o pKapH. Estos animales tendrán un repertorio primario de cadena ligera \kappa humana mayor que los descritos en el ejemplo 6(B).

Ejemplo 7 Aislamiento de Clones Genómicos Correspondientes a Copias Reorganizadas y Expresadas de Genes de Cadena Ligera \kappa de Inmunoglobulina

Este ejemplo describe la clonación de genes de cadena ligera \kappa de inmunoglobulina desde células cultivadas que expresan una inmunoglobulina de interés. Estas células pueden contener múltiples alelos de un gen de inmunoglobulina determinado. Por ejemplo, un hibridoma podría contener cuatro copias del gen de cadena ligera \kappa, dos copias de la línea celular compañera de fusión y dos copias de la célula B original que expresa la inmunoglobulina de interés. De estas cuatro copias, sólo una codifica la inmunoglobulina de interés, a pesar del hecho de que varias de ellas pueden haberse reorganizado. El procedimiento descrito en este ejemplo permite la clonación selectiva de la copia expresada de cadena ligera \kappa.

A. ADNc de Doble Cadena

Se usan células del hibridoma humano, o del linfoma, o de otra línea celular que sintetice la forma de superficie celular o secretada o ambas de IgM con una cadena ligera \kappa para el aislamiento del ARN poli A+. Después, el ARN se usa para la síntesis de ADNc cebado con oligo dT usando el enzima transcriptasa inversa. Después, se aísla el ADNc monocatenario y se añaden restos G al extremo 3' usando el enzima polinucleótido terminal transferasa. Después se purifica el ADNc monocatenario con cola G y se usa como plantilla para la síntesis de la segunda cadena (catalizada por el enzima ADN polimerasa) usando el siguiente oligonucleótido como cebador:

11

El ADNc de doble cadena se aísla y se usa para determinar la secuencia de nucleótidos del extremo 5' de los ARNm que codifican las cadenas ligera y pesada de la molécula de inmunoglobulina expresada. Después se aíslan los clones genómicos de estos genes expresados. El procedimiento para clonar el gen de cadena ligera expresado se describe en la parte B presentada a continuación.

B. Cadena Ligera

El ADNc de doble cadena descrito en la parte A se desnaturaliza y se usa como plantilla para un tercer ciclo de síntesis de ADN usando el siguiente cebador oligonucleotídico:

12

Este cebador contiene secuencias específicas para la porción constante del mensajero de cadena ligera \kappa (TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA) así como secuencias únicas que pueden usarse como cebador para la amplificación por PCR de la cadena de ADN de nueva síntesis (GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG). La secuencia se amplifica por PCR usando los dos cebadores oligonucleotídicos siguientes:

13

Después se purifica la secuencia amplificada por PCR por electroforesis en gel y se usa como plantilla para reacciones de secuenciación didesoxi usando el siguiente oligonucleótido como cebador:

5' - GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG - 3'

Después se usarán los primeros 42 nucleótidos de la secuencia para sintetizar una sonda única para el aislamiento del gen a partir del cual se transcribió el mensajero de la inmunoglobulina. Este segmento de ADN sintético de 42 nucleótidos se denominará a partir de ahora o-kappa.

Después, una mancha de transferencia de Southern del ADN aislado a partir de la línea celular que expresa la inmunoglobulina y digerido de forma individual y en combinaciones de parejas con varias endonucleasas de restricción diferentes, incluyendo SmaI, se sonda con el oligonucleótido o-kappa único marcado con ^{32}P. Se identifica un único sitio para la endonucleasa de restricción cadena arriba del segmento V reorganizado.

Posteriormente, el ADN de la línea celular que expresa la Ig se corta con SmaI y con un segundo enzima (BamHI o KpnI si hay un sitio SmaI dentro del segmento V). Cualquier extremo no romo resultante se trata con el enzima ADN polimerasa de T4 para dar extremos romos a las moléculas de ADN. Después se añaden enlazadores que codifican sitios de restricción (BamHI, EcoRI o XhoI dependiendo de qué sitio no existe en el fragmento) y se cortan con el correspondiente enzima de enlazador para dar fragmentos de ADN con extremos BamHI, EcoRI o XhoI. Después el ADN se fracciona por tamaño en electroforesis en gel de agarosa y la fracción que incluye el fragmento de ADN que cubre los segmentos V expresados se clona en lambda EMBL3 o en lambda FIX (Stratagene, La Jolla, California). Los clones que contienen el segmento V se aíslan usando la sonda única o-kappa. El ADN se aísla a partir de clones positivos y se subclona en el polienlazador de pKap1. El clon resultante se denomina pRKL.

Ejemplo 8 Aislamiento de Clones Genómicos Correspondientes a Copias Expresadas Reorganizadas de Genes \mu de Cadena Pesada de Inmunoglobulina

Este ejemplo describe la clonación de genes \mu de cadena pesada de inmunoglobulina a partir de células cultivadas que expresan una inmunoglobulina de interés. El procedimiento descrito en este ejemplo permite la clonación selectiva de la copia expresada de un gen de cadena pesada \mu.

Se prepara ADNc de doble cadena y se aísla como se describe en la parte A del ejemplo 7. El ADNc de doble cadena se desnaturaliza y se usa como plantilla para un tercer ciclo de síntesis de ADN usando el siguiente cebador oligonucleotídico:

14

Este cebador contiene secuencias específicas para la porción constante del mensajero de cadena pesada \mu (ACA GGA GAC GAG GGG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC) así como secuencias únicas que pueden usarse como cebador para la amplificación por PCR de la cadena de ADN de nueva síntesis (GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG). La secuencia se amplifica por PCR usando los dos cebadores oligonucleotídicos siguientes:

15

Después se purifica la secuencia amplificada por PCR por electroforesis en gel y se usa como plantilla para reacciones de secuenciación didesoxi usando el siguiente oligonucleótido como cebador:

5' - GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG - 3'

Después se usan los primeros 24 nucleótidos de la secuencia para sintetizar una única sonda para el aislamiento del gen a partir del cual se transcribió el mensajero de la inmunoglobulina. Este segmento de 42 nucleótidos sintético de ADN se denominará a partir de ahora o-mu.

Después, una transferencia de Southern de ADN aislado a partir de la línea celular que expresa Ig y digerido individualmente y en combinaciones de parejas con varias endonucleasas de restricción diferentes incluyendo MluI (MluI es un enzima de corte poco frecuente que escinde entre el segmento J y mu CH1), se sonda con el oligonucleótido único o-mu marcado con ^{32}P. Se identifica un único sitio de restricción para endonucleasa cadena arriba del segmento V reorganizado.

Después, el ADN procedente de la línea celular que expresa Ig se corta con MluI y un segundo enzima. Después, los enlazadores adaptadores MluI o SpeI se ligan en los extremos y se cortan para convertir el sitio cadena arriba en un sitio MluI o SpeI. Después, el ADN se fracciona por tamaño por electroforesis en gel de agarosa y la fracción que incluye el fragmento de ADN que abarca el segmento V expresado se clona directamente en el plásmido pGPI. Los clones que contienen el segmento V se aíslan usando la sonda única o-mu, y el inserto se subclona en el plásmido pCON2 cortado con MluI o con MluI/SpeI. El plásmido resultante se denomina pRMGH.

Ejemplo 9 Deleción del Gen de Cadena Pesada de Ratón por Recombinación Homóloga

Este ejemplo describe la deleción del gen de cadena pesada de ratón endógena por recombinación homóloga en células madre embrionarias (ES) (Zjilstra, et al. (1989), Nature, 342, 435-438) seguido del transplante de esas células ES en un embrión en estado de blastocisto de ratón de modo que las células ES colonicen la línea germinal del ratón quimérico resultante (Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, E.J. Robertson, ed., IRL press, Washington, D.C., 1987).

La construcción de una secuencia de ADN que recombinará de forma homóloga en el cromosoma del ratón de manera que se delecionen los segmentos J de cadena pesada, eliminándose de este modo la posibilidad de una reorganización génica satisfactoria en el locus de la cadena pesada. El diseño de esta construcción se describe a continuación.

El plásmido pGP1 se digiere con las endonucleasas de restricción BamHI y BglII y los fragmentos resultantes se religan para formar el plásmido pGP1d1. Después, este plásmido se usa para construir la denominada construcción génica knockout.

Para obtener secuencias homólogas a la región diana deseada del genoma de ratón, se aíslan clones genómicos de ratón a partir de una biblioteca de fagos derivada de tejido no linfoide (tal como hígado) usando la sonda oligonucleotídica específica de J_{H}:

16

Se aísla un fragmento de KpnI a EcoRI de 3,5 kb que hibrida con esta sonda a partir del ADN derivado de clones de fago positivos. Este fragmento se subclona en pGP1d1 digerido con KpnI/EcoRI para formar el plásmido pMKO1.

Después se aíslan los genes de resistencia a neomicina (Neo) y de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple para selección por fármacos de recombinantes (M. Capecchi (1989), Science, 244, 1288-1292) como sigue. El plásmido pGEM7 (KJ1) (M.A. Rudnicki, 3/15/89) se digiere con HindIII y los extremos se convierten en romos con la forma klenow de la ADN polimerasa I. Después, el ADN se corta con EcoRI y el fragmento pGKneo se aísla y se clona en pMKO1 cortado con SphI/NaeI usando el siguiente oligonucleótido como adaptador:

5' - AATTGTAC - 3'

El plásmido resultante se denomina pMKO2. Este plásmido contiene el gen de resistencia a neomicina flanqueado por secuencias que flanquean los segmentos J_{H} de ratón. Este plásmido solo puede usarse para la deleción del gen de cadena pesada. De forma alternativa, puede añadirse el gen TK del herpes a la construcción para mejorar la frecuencia de sucesos de recombinación homóloga en clones resistentes a Neo (M. Capecchi (1989), Science, 244, 1288-1292). Esto se hace como sigue. Se aísla el fragmento PGKTK de EcoRI a HindIII del plásmido pGEM7 (TK) (M. A. Rudnicki) y se clona en el sitio KpnI de pMKO2 usando los siguientes oligonucleótidos como adaptadores:

17

El plásmido resultante se denomina pMKO3.

Para mejorar de forma adicional la eficacia total de la recombinación homóloga, se añade después a la construcción un segmento grande de ADN que es homólogo a la secuencia diana. Un fragmento de EcoRI de 13 kb que hibrida con el oligonucleótido específico de C\mu descrito a continuación:

18

Este fragmento de 12 kb incluye los exones que codifican C\mu, o una porción substancial de este fragmento que incluye el extremo EcoRI 5', aislado a partir de una biblioteca de fagos genómica de ratón y subclonado en el sitio EcoRI de pMKO3. El plásmido resultante se denomina pMKO4.

El inserto de pMKO4 se aísla por digestión con NotI y se introduce por electroporación en células ES. Se aíslan los clones recombinantes homólogos usados para generar un ratón delecionado en J_{H} como se describe en Zjilstra, et al. (1989), Nature, 342, 435-438.

Ejemplo 10 Deleción del Gen de Cadena Ligera de Ratón por Recombinación Homóloga

Este ejemplo describe la deleción del gen de cadena ligera de ratón endógena por recombinación homóloga en células madre embrionarias (véase el ejemplo previo).

Se construye una secuencia de ADN que recombina de forma homóloga dentro del cromosoma de ratón para delecionar el exón de la región constante de cadena ligera \kappa. El diseño de esta construcción se describe a continuación.

Se aísla un fragmento de timidina quinasa de BamHII a EcoRI de 2 kb obtenido a partir de pGEM7(TK)Sal (M. A. Rudnicki, Whitehead Institute) y se subclona en pGP1 digerido con BamHI/SfiI usando el siguiente adaptador oligonucleotídico:

5' - AATTTTG - 3'

El plásmido resultante se denomina pKKO1.

Para obtener secuencias homólogas a la región diana deseada del genoma de ratón, se aíslan clones genómicos de ratón a partir de una biblioteca de fagos derivada de tejido no linfoide (tal como hígado) usando el oligo específico de cadena ligera \kappa de ratón denominado o-MKC presentado a continuación:

19

Se aísla ADN a partir de un clon positivo y se aísla un fragmento BglII de 2,3 kb (P.S. Neumaier y H.G. Zachau (1983), Nucl. Acids. Res., 11, 3631-3656) que hibrida con la sonda o-MK3. La secuencia de la sonda o-MK3 es la siguiente:

20

Este fragmento BglII de 2,3 kb se subclona en pKKO1 digerido con BamHI de modo que el extremo 3' del fragmento esté adyacente al sitio SfiI del polienlazador. El plásmido resultante se denomina pKKO2.

El fragmento de ADN de SphI a Hpa I de 4 kb que hibrida con el oligonucleótido o-MKC se aísla a partir de un clon de fago positivo y se subclona en el plásmido pKKO2 digerido con EcoRV y SPhI. El plásmido resultante se denomina pKKO3.

Se aísla un fragmento de SalI a EcoRI de 2 kb de pGEM7(KJ1) Sal (M. A. Rudnicki, 3/15/89) y se clona en el sitio BssHII del plásmido pKKO3 usando adaptadores de enlazadores. Esto se realiza ligando en primer lugar una mezcla de los tres siguientes oligonucleótidos con el fragmento de SalI a EcoRI de 2 kb:

21

Después, la mezcla de ligamiento se digiere con el enzima BssHII y se liga al plásmido pKKO3 digerido con BssHII. El plásmido resultante se denomina pKKO4.

El inserto de pKKO4 se aísla digiriendo con NotI y se introduce por electroporación en células ES. Se aíslan clones de recombinación homóloga y se usan para generar un ratón en el que se ha delecionado C\kappa como se describe en Zjilstra, et al. (1989), Nature, 342, 435-438.

Ejemplo 11 Inactivación del Gen de Cadena Ligera Kappa de Ratón por Recombinación Homóloga

Este ejemplo describe la inactivación del locus kappa endógeno de ratón por recombinación homóloga en células madre embrionarias (ES) seguido de la introducción del gen mutado en la línea germinal de ratón por inyección de células ES diana que llevan un alelo kappa inactivo en embriones de ratón en estadio temprano (blastocistos).

La estrategia es delecionar J\kappa y C\kappa por recombinación homóloga con un vector que contiene secuencias de ADN homólogas al locus kappa de ratón en el que se deleciona un segmento de 4,5 kb del locus, que abarca el gen J\kappa y los segmentos C\kappa, y se substituye por el marcador seleccionable neo.

Construcción del vector de dirección a kappa

El plásmido pGEM7 (KJ1) (M. A. Rudnicki, Whitehead Institute) contiene el gen de resistencia a neomicina (neo), usado para la selección por fármaco de células ES transfectadas, bajo el control transcripcional del promotor de la fosfoglicerato quinasa de ratón (pgk) (fragmento XbaI/I/TaqI; Adra, C. N. et al., (1987) Gene, 60, 65-74) en el vector de clonación pGEM-72f(+). El plásmido también incluye un sitio de poliadenilación heterólogo para el gen neo derivado de la región 3' del gen pgk de ratón (fragmento PvuII/HindIII; Boer, P. H., et al., (1990) Biochemical Genetics, 28, 299-308). Este plásmido se usó como punto de partida para la construcción del vector de dirección a kappa. La primera etapa fue la inserción de secuencias homólogas al locus kappa 3' del casete de expresión de neo.

Se aislaron secuencias de cadena kappa de ratón (figura 25a) a partir de una biblioteca de fago genómica derivada de ADN de hígado usando sondas oligonucleotídicas específicas para el locus C\kappa:

5' - GGC TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG - 3'

y para el segmento génico J\kappa5:

5'- CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGT AAG - 3'

Se aisló un fragmento BglII/SacI de 8 kb que se extendía en posición 3' del segmento C\kappa de ratón a partir de un clon de fago positivo en dos piezas, como un fragmento BglII/SacI de 1,2 kb y un fragmento SacI de 6,8 kb, y se subclonó en pGEM7 (KJ1) digerido con BglII/SacI para generar el plásmido pNEO-K3' (figura 25b).

También se aisló un fragmento EcoRI/SphI de 1,2 kb que se extendía en posición 5' de la región J\kappa a partir de un clon de fago positivo. Se ligó un adaptador SphI/XbaI/BglII/EcoRI en el sitio SphI de este fragmento y el fragmento EcoRI resultante se ligó en pNEO-K3' digerido con EcoRI, en la misma orientación de 5' a 3' que el gen neo y las secuencias kappa 3' cadena abajo, para generar pNEO-K5'3' (figura 25c).

Después se incluyó en la construcción el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV) para permitir el enriquecimiento de clones ES que llevaban recombinantes homólogos, según se describe en Mansour et al. ((1988) Nature, 336, 348-352). El cassette TK de HSV se obtuvo a partir del plásmido pGEM7 (TK) (M. A. Rudnicki), que contiene las secuencias estructurales para el gen TK de HSV separado por el promotor pgk de ratón y secuencias de poliadenilación como se ha descrito anteriormente para pGEM7 (KJ1). El sitio EcoRI de pGEM7 (TK) se modificó para obtener un sitio BamHI y después se escindió el cassette TK como un fragmento BamHI/HindIII y se subclonó en pGP1b para generar pGP1b-TK. Este plásmido se linealizó en el sitio XhoI y el fragmento XhoI de pNEO-K5'3', que contenía el gen neo flanqueado por secuencias genómicas 5'de J\kappa y 3' de C\kappa, se insertó en pGP1b-TK para generar el vector de dirección J/C KI (figura 25d). La supuesta estructura del locus kappa genómico después de la recombinación homóloga con J/C K1 se muestra en la figura 25e.

Generación y análisis de células ES con inactivación dirigida de un alelo kappa

Se cultivaron células ES AB-1 sobre capas de células nodrizas SNL76/7 mitóticamente inactivas (McMahon, A. P. y Bradley, A. (1990) Cell, 62, 1073-1085) esencialmente como se ha descrito (Robertson, E. J., (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), pág. 71-112).

El vector J/C K1 de inactivación de cadena kappa se digirió con NotI y se introdujo por electroporación en células AB-1 por los métodos descritos (Hasty, P. R., et al. (1991) Nature, 350, 243-246). Las células sometidas a electroporación se dispusieron en placas de 100 mm de diámetro a una densidad de 2-5 x 10^{6} células/placa. Después de 24 horas, se añadió al medio G418 (200 \mug/ml de componente activo) y FIAU (0,5 \muM), y se permitió que los clones resistentes al fármaco se desarrollaran durante 10-11 días. Se seleccionaron clones, se tripsinizaron, se dividieron en dos porciones y se expandieron de forma adicional. Después se congeló la mitad de las células derivadas de cada clon y en la otra mitad se analizó la recombinación homóloga entre el vector y las secuencias diana.

El análisis de ADN se realizó por hibridación de transferencia de Southern. El ADN se aisló a partir de los clones como se ha descrito (Laird, P. W. et al., (1991) Nucl. Acids. Res., 19) digiriendo con XbaI y sondado con el fragmento EcoRI/XbaI de 800 pb indicado en la figura 25e como sonda de diagnóstico. Esta sonda detecta un fragmento XbaI de 3,7 kb en el locus de tipo silvestre y una banda diagnóstica de 1,8 kb en un locus que se ha recombinado de forma homóloga con el vector de dirección (véanse las figuras 25a y 25e). De los 358 clones resistentes a G418 y FIAU analizados por análisis de transferencia de Southern, 4 mostraron la banda XbaI de 1,8 kb indicativa de una recombinación homóloga en el locus kappa. Estos 4 clones se digirieron adicionalmente con los enzimas BglII, SacI y PstI para verificar que el vector se integraba de forma homóloga en uno de los alelos kappa. Cuando se sondaba con el fragmento de diagnóstico EcoRI/XbaI de 800 pb, los productos de digestión BglII, SacI y PstI del ADN de tipo silvestre producían fragmentos de 4,1, 5,4 y 7 kb, respectivamente, mientras que la presencia de un alelo kappa dirigido podría estar indicada por los fragmentos de 2,4, 7,5 y 5,7 kb, respectivamente (véanse las figuras 25a y 25e). Los 4 clones positivos detectados por la digestión con XbaI mostraron los fragmentos de restricción BglII, SacI y PstI esperados, diagnósticos de una recombinación homóloga en cadena ligera kappa.

Generación de ratones portadores de la cadena kappa inactivada

Los 4 clones de ES dirigidos descritos en la sección previa se inyectaron en blastocistos C57Bl/6J como se ha descrito (Bradley, A. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), pág. 113-151) y se transfirieron a los úteros de hembras pseudopreñadas para generar ratones quiméricos que representen una mezcla de células derivadas de la aportación de las células ES y del blastocisto hospedador. Los animales quiméricos se identifican visualmente por la presencia de coloración del pelaje agouti, derivada de la línea celular ES, sobre el fondo negro de C57Bl/6J. Las células ES AB1 son una línea celular XY, de esta manera, las quimeras machos se cruzan con hembras C57BL/BJ y se controla en la descendencia la presencia del color del pelaje agouti dominante. La descendencia agouti es indicativa de la transmisión en la línea germinal del genoma ES. La heterocigosis de la descendencia agouti para la inactivación de cadena kappa se verifica por análisis de transferencia de Southern de ADN a partir de biopsias de la cola usando la sonda diagnóstica utilizada para identificar clones ES diana. Después se realizan emparejamientos entre hermanos y hermanas de heterocigotos para generar ratones homocigotos para la mutación de la cadena kappa.

Ejemplo 12 Inactivación del Gen de Cadena Pesada de Ratón por Recombinación Homóloga

Este ejemplo describe la inactivación del locus de cadena pesada de inmunoglobulina murina endógena por recombinación homóloga en células madre embrionarias (ES). La estrategia es delecionar los segmentos J de cadena pesada endógena por recombinación homóloga con un vector que contiene secuencias de cadena pesada en el que se ha delecionado la región J_{H} y se ha substituido por el gen del marcador seleccionable neo.

Construcción de un vector de dirección a la cadena pesada

Se aislaron secuencias de cadena pesada de ratón que contenían la región J_{H} (figura 26a) a partir de una biblioteca genómica de fago derivada de la línea celular ES D3 (Gossler, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 83, 9065-9069) usando una sonda oligonucleotídica específica de J_{H}4:

5' - ACT ATG CTA TGG ACT ACT GGG GTC AAG GAA CCT CAG TCA CCG -3'

Se aisló un fragmento genómico SacI/StuI de 3,5 kb, que abarcaba la región JH, a partir de un clon de fago positivo y se subclonó en puc18 digerido con SacI/SmaI. El plásmido resultante se denominó puc18 J_{H}. El gen de resistencia a neomicina (neo), usado para la selección por fármaco de células ES transfectadas, se obtuvo a partir del plásmido pGEM7 (KJ1). El sitio HindIII en pGEM7 (KJ1) se convirtió en un sitio SalI por la adición de un adaptador sintético, y el cassette de expresión de neo se escindió por digestión con XbaI/SalI. Después, los extremos del fragmento neo se convirtieron en romos por tratamiento con la forma Klenow de la ADN polI y el fragmento neo se subclonó en el sitio NaeI de puc18 J_{H}, generando el plásmido puc18 J_{H}-neo (figura 26b).

Se realizó una construcción adicional del vector de dirección en un derivado del plásmido pGP1b. pGP1b se digirió con el enzima de restricción NotI y se ligó con el siguiente oligonucleótido como adaptador:

5' - GGC CGC TCG ACG ATA GCC TCG AGG CTA TAA ATC TAG AAG AAT TCC AGC AAA GCT TTG
GC - 3'

El plásmido resultante, denominado pGMT, se usó para preparar la construcción de dirección a la cadena pesada de inmunoglobulina de ratón.

En la construcción se incluyó el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV) para permitir el enriquecimiento en clones ES que llevan recombinantes homólogos, como se describe en Mansour et al. ((1988) Nature 336, 348-352). El gen TK de HSV se obtuvo a partir del plásmido pGEM7 (TK) por digestión con EcoRI y HindIII. El fragmento ADN de TK se subclonó entre los sitios EcoRI y Hind III de pGMT, creando el plásmido pGMT-TK (figura 26c).

Para proporcionar una amplia región de homología con la secuencia diana, se obtuvo un fragmento XbaI/XhoI genómico de 5,9 kb, situado en posición 5' de la región J_{H},a partir de un clon de fago genómico positivo por digestión limitada del ADN con XhoI y digestión parcial con XbaI. Según se destaca en las figuras 26a y 26b, este sitio XbaI no está presente en el ADN genómico, sino que más bien deriva de las secuencias del fago que flanquean directamente el inserto de cadena pesada genómica clonada en el clon de fago positivo. El fragmento se subclonó en pGMT-TK digerido con XbaI/XhoI, para generar el plásmido pGMT-TK-J_{H}5' (figura 26d).

La etapa final de la construcción implicó la escisión del fragmento EcoRI de 3 kb de puc18 J_{H}-neo que contenía el gen neo y secuencias genómicas flanqueantes. Este fragmento se hizo romo por la polimerasa de Klenow y se subclonó en el sitio XhoI de pGMT-TK-J_{H}5' convertido en romo de forma similar. La construcción resultante, J_{H}K01 (figura 26e), contiene 6,9 kb de las secuencias genómicas que flanquean el locus J_{H}, con una deleción de 2,3 kb que ocupa la región J_{H} en la que se ha insertado el gen neo. La figura 25f muestra la estructura de un alelo de cadena pesada endógena tras la recombinación homóloga con la construcción de dirección.

\newpage

Ejemplo 13 Generación y análisis de células ES diana

Se cultivaron células ES AB-1 (McMahon, A.P. y Bradley, A. (1990) Cell 62, 1073-1085) en capas de células nodriza SNL76/7 mitóticamente inactivas esencialmente como se ha descrito (Robertson, E.J. (1987) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E.J. Robertson, ed. (Oxford: IRL Press), pág. 71-112).

El vector de inactivación de cadena pesada J_{H}K01 se digirió con NotI y se introdujo por electroporación en células AB-1 por los métodos descritos (Hasty, P.R., et al. (1991) Nature 350, 243-246). Las células sometidas a electroporación se pusieron en placas de 100 mm a una densidad de 2-5 x 10^{6} células/placa. Después de 24 horas, se añadieron al medio G418 (200 mg/ml de componente activo) y FIAU (0,5 mM), y se permitió que los clones resistentes al fármaco se desarrollaran durante 8-10 días. Se escogieron clones, se tripsinizaron, se dividieron en dos porciones y se expandieron adicionalmente. Después, la mitad de las células obtenidas a partir de cada clon se congelaron y se analizó la recombinación homóloga entre las secuencias del vector y diana en la otra mitad de las células.

El análisis del ADN se realiza por hibridación de transferencia de Southern. Se aísla ADN a partir de los clones como se ha descrito (Laird, P.W. et al., (1991) Nucl. Acids Res., 19), se digiere con HindIII y se sonda con el fragmento EcoRI/StuI de 500 pb denominado sonda de diagnóstico en la figura 26f. Esta sonda detecta un fragmento HindIII de 2,3 kb en el locus de tipo silvestre, mientras que una banda de 5,3 kb es diagnóstica de un locus diana que se ha recombinado de forma homóloga con el vector de dirección (véanselas figuras 26a y f). Se realizan digestiones adicionales con los enzimas SpeI, StuI y BamHI para verificar la rotura dirigida del alelo de la cadena pesada.

Ejemplo 14 Transgen del Minilocus de Cadena Pesada A. Construcción de vectores plasmídicos para la clonación de secuencias grandes de ADN 1. pGP1a

El plásmido pBR322 se digirió con EcoRI y con StyI y se ligó con los siguientes oligonucleótidos:

22

El plásmido resultante, pGP1a, se diseña para clonar construcciones de ADN muy grandes que pueden escindirse por el enzima de restricción de corte poco frecuente NotI. Contiene un sitio de restricción NotI cadena abajo (en relación con el gen de resistencia a ampicilina, AmpR) de una señal de terminación de la transcripción fuerte derivada del gen trpA (Christie, G.E. et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4180). Esta señal de terminación reduce la toxicidad potencial de secuencias codificantes insertadas en el sitio NotI eliminando la transcripción en translectura desde el gen AmpR. Además, este plásmido es de bajo número de copias en relación con los plásmidos pUC, ya que retiene la región de control del número de copias de pBR322. El bajo número de copias reduce adicionalmente la toxicidad potencial de secuencias insertadas y reduce la selección frente a insertos grandes debido a la replicación del ADN.

2. pGP1b

pGP1a se digirió con NotI y se ligó con los siguientes oligonucleótidos:

23

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El plásmido resultante, pGP1b, contiene una corta región de polienlazador corta flanqueada por sitios NotI. Esto facilita la construcción de insertos grandes que pueden escindirse por digestión con NotI.

3. pGPe

Los siguientes oligonucleótidos:

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se usaron para amplificar el potenciador 3' de cadena pesada de inmunoglobulina (S. Petterson, et al. (1990) Nature, 344, 165-168) a partir de ADN de hígado de rata por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa.

El producto amplificado se digirió con BamHI y con SphI y se clonó en pNN03 digerido con BamHI/SphI (pNN03 es un plásmido derivado de pUC que contiene un polienlazador con los siguientes sitios de restricción, enumerados por orden: NotI, BamHI, NcoI, ClaI, EcoRV, XbaI, SacI, XhoI, SphI, PstI, BglII, EcoRI, SmaI, KpnI, HindIII y NotI). El plásmido resultante, pRE3, se digirió con BamHI y con HindIII, y el inserto que contenía el potenciador 3' de la cadena pesada de Ig de rata se clonó en pGP1b digerido con BamHI/HindIII. El plásmido resultante, pGPe (figura 27 y tabla 1), contiene varios sitios de restricción únicos en los cuales pueden clonarse secuencias y posteriormente escindirse conjuntamente con el potenciador 3' por digestión con NotI.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Secuencia del vector pGPe

25

B. Construcción del transgen del minilocus que expresa IgM, pIGM1 1. Aislamiento de clones de región constante J-\mu y construcción de pJM1

Se analizó una biblioteca de ADN genómico de placenta humana clonado en el vector de fago \lambdaEMBL3/
SP6/T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) con el oligonucleótido específico de región J de cadena pesada humana:

26

y se aisló el clon de fago \lambda1.3. Se aisló un fragmento HindIII/KpnI de este clon de 6 kb, que contenía los seis segmentos J así como el segmento D DHQ52 y el potenciador intrónico J-\mu de cadena pesada. La misma biblioteca se analizó con el oligonucleótido específico de \mu humano:

27

y se aisló el clon de fago \lambda2.1. A partir de este clon se aisló un fragmento HindIII/XhoI de 10,5 kb que contenía la región de cambio \mu y todos los exones de la región constante \mu. Estos dos fragmentos se ligaron conjuntamente con pNN03 digerido con KpnI/XhoI para obtener el plásmido pJM1.

2. pJM2

Se aisló un fragmento XhoI de 4 kb a partir del clon de fago \lambda2.1 que contiene secuencias inmediatamente cadena abajo de las secuencias en pJM1, incluyendo el denominado elemento \Sigma\mu implicado en la deleción de \mu en ciertas células B que expresan IgD (H. Yasui et al. (1989) Eur. J. Immunol. 19, 1399). Este fragmento se trató con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y se ligó con pJM1 cortado con XhoI y tratado con Klenow. El plásmido resultante, pJM2 (figura 28), había perdido el sitio interno XhoI pero conservaba el sitio NhoI 3' debido a la reacción incompleta del enzima Klenow. pJM2 contiene la región J humana completa, el potenciador intrónico J-\mu de cadena pesada, la región de cambio \mu y todos los exones de la región constante \mu, así como las dos repeticiones directas de 0,4 kb, \sigma\mu y \Sigma\mu, implicadas en la deleción de \mu.

3. Aislamiento de clones de la región D y construcción de pDH1

Se usó el siguiente oligonucleótido específico de la región D humana:

28

para seleccionar los clones de la región D de la biblioteca genómica de placenta humana. Se aislaron los clones de fago \lambda4.1 y \lambda4.3. Se aisló un fragmento XhoI de 5,5 kb, que incluía los elementos D, D_{\kappa1}, D_{N1} y D_{M2} (Y. Ichihara et al. (1988) EMBO J., 7, 4141) a partir del clon del fago \lambda4.1. Se aisló un fragmento adyacente cadena arriba de 5,2 kb, que incluía los elementos D, D_{LR1}, D_{XP1}, D_{XP-1} y D_{A1}, a partir del clon de fago \lambda4.3. Cada uno de estos fragmentos XhoI de región D se clonó en el sitio Sa1I del vector plasmídico pSP72 (Promega, Madison, WI) para destruir así el sitio XhoI que unía las dos secuencias. Después se escindió el fragmento cadena arriba con XhoI y SmaI, y el fragmento cadena abajo con EcoRV y XhoI. Los fragmentos aislados resultantes se ligaron entre sí con pSP72 digerido con SalI para dar el plásmido pDH1. pDH1 contiene un inserto de 10,6 kb que incluye al menos 7 segmentos D y puede escindirse con XhoI (5') y EcoRV (3').

4. pCOR1

El plásmido pJM2 se digirió con Asp718 (un isoesquizómero de KpnI) y el saliente se rellenó con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Después, el ADN resultante se digirió con ClaI y se aisló el inserto. Este inserto se ligó con el inserto XhoI/EcoRV de pDH1 y con pGPe digerido con XhoI/ClaI para generar pCOR1 (figura 29).

5. pVH251

Un fragmento genómico HindIII de 10,3 kb que contenía los dos segmentos de región variable de cadena pesada humana V_{H}251 y V_{H}105 (C.G. Humphries et al. (1988) Nature 331, 446) se subclonó en pSP72 para dar el plásmido pVH251.

6. pIGM1

El plásmido pCOR1 se digirió parcialmente con XhoI y el inserto XhoI/SalI aislado de pVH251 se clonó en el sito XhoI cadena arriba para generar el plásmido pIGM1. pIGM1 contiene 2 segmentos de región variable humana funcionales, al menos 8 segmentos D humanos, los 6 segmentos J_{H} humanos, el potenciador de J-\mu humano, el elemento \sigma\mu humano, la región de cambio \mu humana, todos los exones que codifican \mu humana y el elemento \Sigma\mu humano, conjuntamente con el potenciador 3' de cadena pesada de rata, de modo que todos estos elementos de secuencia pueden aislarse en un único fragmento a partir de las secuencias del vector por digestión con NotI y microinyectarse en pronúcleos de embriones de ratón para generar animales transgénicos.

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C. Construcción del transgen de minilocus que expresa IgM e IgG, pHC1 1. Aislamiento de clones de región constante \gamma

El siguiente oligonucleótido, específico para genes de región constante g de Ig humana:

29

se usó para analizar la biblioteca genómica humana. Se aislaron los clones de fago 129.4 y \lambda29.5. Un fragmento HindIII de 4 kb del clon de fago \lambda29.4, que contenía una región de cambio \gamma, se usó para sondar una biblioteca de ADN genómico de placenta humana clonado en el vector de fago lambda FIX^{TM} II (Stratagene, La Jolla, CA). Se aisló el clon de fago \lambdaSg1.13. Para determinar la subclase de los diferentes clones \gamma, se realizaron reacciones de secuenciación didesoxi usando subclones de cada uno de los tres clones de fago como molde y el siguiente oligonucleótido como cebador:

oligo-67 5'-tga gcc cag aca ctg gac -3'

Se determinó que los dos clones de fago \lambda29.5 y \lambdaS\gamma1.13 eran de subclase \gamma1.

2. p\gammae1

Un fragmento HindIII de 7,8 kb del clon de fago \lambda29.5, que contenía la región codificante \gamma1, se clonó en pUC18. El plásmido resultante, pLT1, se digirió con XhoI, se trató con Klenow y se religó para destruir el sitio XhoI interno. El clon resultante, pLT1xk, se digirió con HindIII, se aisló el inserto y se clonó en pSP72 para generar el clon plasmídico pLT1xks. La digestión de pLT1xks en un sitio XhoI del polienlazador y en un sitio BamHI derivado de secuencia humana genera un fragmento de 7,6 kb que contiene los exones que codifican la región constante \gamma1. Este fragmento XhoI/BamHI de 7,6 kb se clonó conjuntamente con un fragmento BamHI adyacente de 4,5 kb cadena abajo del clon de fago \lambda29.5 en pGPe digerido con XhoI/BamHI para generar el clon plasmídico p\gammae1. p\gammae1 contiene todos los exones que codifican la región constante \gamma1, junto con 5 kb de secuencias cadena abajo, unidas al potenciador 3' de cadena pesada de rata.

3. p\gammae2

Un fragmento HindIII de 5,3 kb que contiene la región de cambio \gamma1 y el primer exón del transcrito improductivo previo al cambio (P. Sideras et al. (1989) International Immunol. 1, 631) se aisló a partir del clon de fago \lambdaS\gamma1.13 y se clonó en pSP72 con el sitio XhoI del polienlazador adyacente al extremo 5' del inserto, para generar el clon plasmídico pS\gamma1s. El inserto XhoI/SalI de pS\gamma1s se clonó en p\gammae1 digerido con XhoI para generar el clon plasmídico p\gammae2 (figura 31). p\gammae2 contiene todos los exones codificantes de la región constante \gamma1, y los exones de la región de cambio cadena arriba y del transcrito improductivo, junto con 5 kb de secuencias cadena abajo, unidos al potenciador 3' de cadena pesada de rata. Este clon contiene un sitio único XhoI en el extremo 5' del inserto. El inserto completo, junto con el sitio XhoI y el potenciador 3' de rata, pueden escindirse a partir de las secuencias del vector por digestión con NotI.

4. pHC1

El plásmido pIGM1 se digirió con XhoI y el inserto de 43 kb se aisló y se clonó en pge2 digerido con XhoI para generar el plásmido pHC1. pHC1 contiene 2 segmentos de región variable humana funcionales, al menos 8 segmentos D humanos, los 6 segmentos J_{H} humanos, el potenciador J-\mu humano, el elemento \sigma\mu humano, la región de cambio \mu humana, todos los exones codificantes de la región \mu humana, el elemento \Sigma\mu humano y la región constante \gamma1 humana, incluyendo la región de cambio asociada y los exones asociados al transcrito improductivo, conjuntamente con el potenciador 3' de cadena pesada de rata, de modo que todos estos elementos de secuencia pueden aislarse en un solo fragmento a partir de las secuencias del vector por digestión con NotI y microinyectarse en pronúcleos de embrión de ratón para generar animales transgénicos.

D. Construcción del transgen de minilocus que expresa IgM e IgG, pHC2 1. Aislamiento del gen de región V de cadena pesada humana VH49.8

La biblioteca lambda de ADN genómico de placenta humana (FIX^{TM} II, Stratagene, La Jolla, CA) se analizó con el siguiente oligonucleótido específico de la familia VH1 humana:

30

Se aisló el clon de fago \lambda49.8 y un fragmento XbaI de 6,1 kb que contenía el segmento variable VH49.8 se subclonó en pNNO3 (de modo que el sitio ClaI del polienlazador está cadena abajo de VH49.8 y el sitio XhoI del polienlazador está cadena arriba) para generar el plásmido pVH49.8. Se secuenció una región de 800 pb de este inserto y se descubrió que VH49.8 tenía una fase de lectura abierta y señales de ayuste y de recombinación intactas, indicando de esta manera que el gen es funcional (tabla 2).

TABLA 2 Secuencia del gen V_{H}49.8 de la familia V_{H}I humana

31

2. pV2

Un fragmento genómico XbaI de 4 kb que contenía el gen V_{H}4-21 de la familia V_{H}IV humana (I. Sanz et al. (1989) EMBO J., 8, 3741), subclonado en el plásmido pUC12, se escindió con SmaI y con HindIII, y se trató con el fragmento Klenow de la polimerasa I. Después, el fragmento de extremos romos se clonó en pVH49.8 digerido con ClaI y tratado con Klenow. El plásmido resultante, pV2, contiene el gen de cadena pesada humana VH49.8 unido cadena arriba de VH4-21 en la misma orientación, con un sitio único SalI en el extremo 3' del inserto y un sitio único XhoI en el extremo 5'.

3. pS\gamma1-5'

Un fragmento XbaI/HindIII de 0,7 kb (que representa secuencias inmediatamente cadena arriba, y adyacentes, al fragmento que contiene la región de cambio \gamma1 de 5,3 kb en el plásmido p\gammae2) conjuntamente con el fragmento XbaI de 3,1 kb cadena arriba próximo se aislaron a partir del clon de fago \lambdaSg1.13 y se clonaron en el vector pUC18 digerido con HindIII/XbaI. El plásmido resultante, pS\gamma1-5', contiene un inserto de 3,8 kb que representa secuencias cadena arriba del sitio de iniciación del transcrito improductivo encontrado en células B antes del cambio al isotipo \gamma1 (P. Sideras et al. (1989) International Immunol., 1, 631). Como el transcrito está implicado en la iniciación del cambio de isotipo, y las secuencias de actuación en cis a menudo son importantes para la regulación de la transcripción, estas secuencias se incluyen en las construcciones transgénicas para promover la expresión correcta del transcrito improductivo y la recombinación de cambio asociada.

4. pVGE1

El inserto pS\gamma1-5' se escindió con SmaI y con HindIII, se trató con el enzima Klenow y se ligó con el siguiente oligonucleótido enlazador:

5' - ccg gtc gac cgg - 3'

El producto de ligamiento se digirió con SalI y se ligó a pV2 digerido con SalI. El plásmido resultante, pVP, contiene 3,8 kb de secuencias 5' flanqueantes de cambio \gamma1 unidas cadena abajo de los dos segmentos génicos variables humanos VH49.8 y VH4-21 (véase la tabla 2). El inserto pVP se aísla por digestión parcial con SalI y digestión completa con XhoI, seguido de purificación del fragmento de 15 kb en un gel de agarosa. Después, el inserto se clona en el sitio XhoI de p\gammae2 para generar el clon plasmídico pVGE1 (figura 32). pVGE1 contiene dos segmentos génicos variables de cadena pesada humana cadena arriba del gen constante \gamma1 humano y la región de cambio asociada. Puede usarse un sitio único SalI entre las regiones variable y constante para la clonación en segmentos génicos D, J y \mu. El potenciador 3' de cadena pesada de rata está unido al extremo 3' del gen \gamma1 y el inserto entero está flanqueado por sitios NotI.

5. pHC2

El clon plasmídico pVGE1 se digiere con SalI y el inserto XhoI de pIGM1 se clona en él. El clon resultante, pHC2, contiene 4 segmentos de región variable humana funcionales, al menos 8 segmentos D humanos, los 6 segmentos J_{H} humanos, el potenciador J-m humano, el elemento \sigma\mu humano, la región de cambio \mu humana, todos los exones que codifican \mu humana, el elemento \Sigma\mu humano y la región constante \gamma1 humana, incluyendo la región de cambio asociada y los exones asociados al transcrito improductivo, conjuntamente con secuencias flanqueantes de 4 kb cadena arriba del sitio de iniciación del transcrito improductivo. Estas secuencias humanas se unen al potenciador 3' de cadena pesada de rata, de modo que todos los elementos de secuencia pueden aislarse en un fragmento único a partir de las secuencias del vector por digestión con NotI, y microinyectarse en pronúcleos de embrión de ratón para generar animales transgénicos. Puede usarse un sitio único XhoI en el extremo 5' del inserto para la clonación en segmentos génicos variables humanos adicionales para expandir adicionalmente la diversidad recombinatoria de este minilocus de cadena pesada.

E. Ratones transgénicos

Los insertos NotI de los plásmidos pIGM1 y pHC1 se aislaron de las secuencias de los vectores por electroforesis en gel de agarosa. Los insertos purificados se microinyectaron en los pronúcleos de embriones de ratón (C57BL/6 x CBA)F2 fertilizados y los embriones supervivientes se transfirieron a hembras pseudopreñadas como se describe en Hogan et al. (B. Hogan, F. Costantini y E. Lacy, Methods of Manipulating the Mouse Embryo, 1986, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). En los ratones que se desarrollaron a partir de los embriones inyectados, se analizó la presencia de secuencias transgénicas por análisis de transferencia de Southern del ADN de la cola. El número de copias del transgen se estimó por la intensidad de la banda en relación con patrones de control que contenían cantidades conocidas de ADN clonado. Entre las 3 y las 8 semanas de edad, se aisló el suero de estos animales y se ensayó la presencia de las IgM e IgG1 humanas codificadas por el transgen por ELISA como describen Harlow y Lane (E. Harlow y D. Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Se recubrieron pocillos de placas de microvaloración con anticuerpos monoclonales de ratón específicos para IgM humana (clon AF6, =0285, AMAC, Inc. Westbrook, ME) y para IgG1 humana (clon JL512, =0280, AMAC, Inc. Westbrook, ME). Se diluyeron de forma seriada muestras de suero en los pocillos y se detectó la presencia de inmunoglobulinas específicas con Ig (polivalente) de cabra anti-humana conjugada con fosfatasa alcalina y aislada por afinidad que se había adsorbido previamente para minimizar la reactividad cruzada con inmunoglobulinas de ratón. La figura 33 muestra los resultados de un ensayo de ELISA para la presencia de IgM e IgG1 humanas en el suero de dos animales desarrollados a partir de embriones inyectados con el inserto transgénico del plásmido pHC1. Uno de los animales (nº 18) resultó negativo para el transgen por análisis de transferencia de Southern, y no mostró niveles detectables de IgM o de IgG1 humanas. El segundo animal (nº 38) contenía aproximadamente 5 copias del transgen, según se evaluó por transferencia de Southern, y mostró niveles detectables tanto de IgM como de IgG1 humanas. Los resultados de los ensayos ELISA de 11 animales desarrollados a partir de embriones en los que se había inyectado el transgen se resumen en la siguiente tabla (tabla 3).

TABLA 3 Detección de IgM y de IgG1 humanas en el suero de animales transgénicos por ensayo ELISA

		Nº copias aproximadas
N^{o} del animal	transgen inyectado	del transgen (por célula)	IgM humana	IgG1 humana
6	pIGM1	1	++	-
7	pIGM1	0	-	-
9	pIGM1	0	-	-
10	pIGM1	0	-	-
12	pIGM1	0	-	-
15	pIGM1	10	++	-
18	pHC1	0	-	-
19	pHC1	1	-	-
21	pHC1	< 1	-	-
26	pHC1	2	++	+
38	pHC1	5	++	+

La tabla 3 muestra una correlación entre la presencia de ADN transgénico integrado y la presencia de inmunoglobulinas codificadas por el transgen en el suero. Dos de los animales que, según se descubrió, contenían el transgen pHC1 no expresaban niveles detectables de inmunoglobulinas humanas. Ambos eran animales con un bajo número de copias y puede que no contuvieran copias completas de los transgenes, o los animales podían ser mosaicos genéticos (indicado por la copia < 1 estimada para el animal nº 21), y las células que contienen el transgen pueden no haber poblado la estirpe hematopoyética. De forma alternativa, los transgenes pueden haberse integrado en localizaciones genómicas que no conducen a su expresión. La detección de IgM humana en el suero de transgénicos pIGM1, y de IgM e IgG1 humanas en los transgénicos pHC1, indica que las secuencias transgénicas funcionan correctamente para dirigir la unión VDJ, la transcripción y el cambio de isotipo.

Ejemplo 15 Transgenes de Cadena Pesada Reorganizados A. Aislamiento de Segmentos VDJ de Cadena Pesada Humana Reorganizados

Dos bibliotecas de ADN genómico de leucocitos humanos clonado en el vector de fago 1EMBL3/SP6/T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) se analizan con un fragmento PacI/HindIII de \lambda1.3 de 1 kb que contiene el potenciador intrónico J-\mu de cadena pesada humana. Los clones positivos se ensayan por hibridación con una mezcla de los siguientes oligonucleótidos específicos de V_{H}:

32

Los clones que hibridan con las dos sondas V y J-\mu se aíslan y se determina la secuencia de ADN del segmento VDJ reorganizado.

B. Construcción de transgenes de cadena pesada humana reorganizados

Se subclonan fragmentos que contienen segmentos VJ funcionales (fase de lectura abierta y señales de ayuste) en el vector plasmídico pSP72 de modo que el sitio XhoI derivado del plásmido sea adyacente al extremo 5' de la secuencia del inserto. Un subclon que contiene un segmento VDJ funcional se digiere con XhoI y PacI (PacI, un enzima de corte poco habitual, que reconoce un sitio próximo al potenciador intrónico J-m) y el inserto se clona en pHC2 digerido con XhoI/PacI para generar una construcción transgénica con un segmento VDJ funcional, el potenciador intrónico J-\mu, el elemento de cambio \mu, los exones que codifican la región constante \mu y la región constante \gamma1, incluyendo las secuencias asociadas con el transcrito improductivo, la secuencia de cambio \gamma1 y los exones codificantes. Esta construcción transgénica se escinde con NotI y se microinyecta en los pronúcleos de embriones de ratón para generar animales transgénicos como se ha descrito anteriormente.

Ejemplo 16 Transgenes de Cadena Ligera A. Construcción de vectores plasmídicos 1. Vector plasmídico pGP1c

El vector plasmídico pGP1a se digiere con NotI y se liga con los siguientes oligonucleótidos en:

33

El plásmido resultante, pGP1c, contiene un polienlazador con sitios de restricción XmaI, XhoI, SalI, HindIII y BamHI flanqueados por sitios NotI.

2. Vector plasmídico pGP1d

El vector plasmídico pGP1a se digiere con NotI y se liga con los siguientes oligonucleótidos en:

34

El plásmido resultante, pGP1d, contiene un polienlazador con sitios de restricción SalI, HindIII, ClaI, BamHI y XhoI flanqueados por sitios NotI.

B. Aislamiento de clones J\kappa y C\kappa

Una biblioteca de ADN genómico de placenta humana clonada en el vector de fago \lambdaEMBL3/SP6/T7 (Clonetech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA) se analizó con el oligonucleótido específico de región J de cadena ligera kappa humana:

35

y se aislaron los clones de fago 136.2 y 136.5. Un fragmento XhoI de 7,4 kb que incluía el segmento J\kappa1 se aisló a partir de 136.2 y se subclonó en el plásmido pNN03 para generar el clon plasmídico p36.2. Un fragmento XhoI cercano de 13 kb que incluye los segmentos JK de 2 a 5 conjuntamente con el segmento génico C\kappa se aisló a partir del clon de fago 136.5 y se subclonó en el plásmido pNN03 para generar el clon plasmídico p36.5. Estos dos clones conjuntamente incluyen la región que empieza 7,2 kb cadena arriba de J\kappa1 y acaba 9 kb cadena abajo de C\kappa.

C. Construcción de transgenes de cadena ligera reorganizados 1. pCK1, un vector C\kappa para expresar segmentos variables reorganizados

El inserto XhoI de 13 kb del clon plasmídico p36.5 que contiene el gen C\kappa, conjuntamente con 9 kb de secuencias cadena abajo, se clona en el sitio SalI del vector plasmídico pGP1c con el extremo 5' de el inserto adyacente al sitio XhoI del plásmido. El clon resultante pCK1 puede aceptar fragmentos clonados que contienen segmentos VJ\kappa reordenados en el sitio único XhoI 5'. Después, el transgen puede escindirse con NotI y purificarse a partir de las secuencias del vector por electroforesis en gel. La construcción transgénica resultante contendrá el potenciador intrónico J-C\kappa humano y puede contener el potenciador 3' \kappa humano.

2. pCK2, un vector C\kappa con potenciadores de cadena pesada para expresar segmentos variables reorganizados

Un fragmento XbaI de 0,9 kb de ADN genómico de ratón que contiene el potenciador intrónico J-\mu de cadena pesada de ratón (J. Banerji et al., (1983) Cell 33, 729-740) se subclonó en pUC18 para generar el plásmido pJH22.1. Este plásmido se linealizó con SphI y los extremos se rellenaron con el enzima klenow. Después, el ADN tratado con klenow se digirió con HindIII y se ligó a un fragmento MluI(klenow)/HindIII del clon de fago \lambda1.3 (ejemplo anterior), que contenía el potenciador intrónico J-\mu de cadena pesada humana (A. Hayday et al., (1984) Nature 307, 334-340). El plásmido resultante, pMHE1, que consta de los potenciadores intrónicos J-\mu de cadena pesada de ratón y humana se ligó conjuntamente con pUC18 de modo que se escindieran en un único fragmento BamHI/HindIII. Este fragmento de 2,3 kb se aisló y se clonó en pGP1c para generar pMHE2. pMHE2 se digirió con SalI y en él se clonó el inserto XhoI de p36.5 de 13 kb. El plásmido resultante, pCK2, es idéntico a pCK1, excepto porque los potenciadores intrónicos J-\mu de cadena pesada de ratón y humana están fusionados al extremo 3' del inserto del transgen. Para modular la expresión del transgen final, pueden generarse construcciones análogas con diferentes potenciadores, es decir, el potenciador 3' kappa o de cadena pesada de ratón o de rata (K. Meyer y M.S. Neuberger, (1989) EMBO J., 8, 1959-1964; S. Petterson, et al. (1990) Nature, 344, 165-168).

2. Aislamiento de segmentos variables de cadena ligera kappa reorganizados

Se analizaron dos bibliotecas de ADN genómico de leucocito humano clonadas en el vector de fago \lambdaEMBL3/
SP6/T7 (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), conteniendo la región J de cadena ligera kappa humana el fragmento XhoI/SmaI de p36.5 de 3,5 kb. Se ensayó la hibridación de los clones positivos con el siguiente oligonucleótido específico de V\kappa:

36

Se aislaron los clones que hibridaban tanto con la sonda V como con la sonda J y se determinó la secuencia de ADN del segmento VJ\kappa reorganizado.

3. Generación de ratones transgénicos que contiene construcciones de cadena ligera humana reorganizada

Se subclonan fragmentos que contienen segmentos VJ funcionales (fase de lectura abierta y señales de ayuste) en los sitios únicos XhoI de los vectores pCK1 y pCK2 para generar transgenes de cadena ligera kappa reorganizados. Las construcciones transgénicas se aíslan a partir de secuencias del vector por digestión con NotI. El inserto purificado en gel de agarosa se microinyecta en pronúcleos de embriones de ratón para generar animales transgénicos. Los animales que expresan cadena kappa humana se cruzan con animales transgénicos que contienen minilocus de cadena pesada (ejemplo 14) para generar ratones que expresen anticuerpos completamente humanos.

Como no todas las combinaciones VJ\kappa pueden ser capaces de formar complejos de cadena pesada-ligera estables con un espectro amplio de combinaciones VDJ de cadena pesada diferentes, se generan varias construcciones transgénicas de cadena ligera diferentes, usando cada una un clon VJ\kappa reorganizado diferente, y los ratones transgénicos resultado de estas construcciones se cruzan con ratones que expresan el transgen de minilocus de cadena pesada. Se aíslan linfocitos de sangre periférica, bazo y ganglio linfático de los animales transgénicos dobles (con construcciones tanto para cadena ligera como para cadena pesada), se tiñen con anticuerpos fluorescentes específicos para cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas humanas y de ratón (Pharmingen, San Diego, CA) y se analizan por citometría de flujo usando un analizador FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Para la generación de anticuerpos monoclonales humanos, se seleccionan construcciones de transgenes de cadena ligera reorganizados que producen el nivel más alto de complejos de cadenas pesada/ligera humanas en la superficie del mayor número de células B, y no afectan negativamente al compartimiento celular inmune (ensayado por análisis por citometría de flujo con anticuerpos específicos de las subpoblaciones de células B y T).

D. Construcción de transgenes de minilocus de cadena ligera no reorganizados 1. pJCK1, un vector que contiene J\kappa y C\kappa para construir transgenes de minilocus

El inserto XhoI de p36.5 de 13 kb que contiene C\kappa se trata con el enzima klenow y se clona en el plásmido pGP1d digerido con HindIII y tratado con klenow. Se selecciona un clon plasmídico de modo que el extremo 5' del inserto sea adyacente al sitio ClaI derivado del vector. El plásmido resultante, p36.5-1d, se digiere con ClaI y se trata con klenow. Después, el inserto XhoI de p36.2 de 7,4 kb que contiene J\kappa1 se trata con klenow y se clona en p36.5-1d tratado con ClaI y con klenow. Se selecciona un clon en el que el inserto p36.2 esté en la misma orientación que el inserto p36.5. Este clon, pJCK1 (figura 34), contiene la región J\kappa humana completa y C\kappa, conjuntamente con 7,2 kb de secuencias cadena arriba y 9 kb de secuencias cadena abajo. El inserto también contiene el potenciador intrónico J-C\kappa humano y puede contener un potenciador 3' \kappa humano. El inserto está flanqueado por un sitio único SalI 3' con el fin de clonar secuencias flanqueantes 3' adicionales tales como potenciaciones de cadena pesada o de cadena ligera. Un sitio único XhoI se localiza en el extremo 5' del inserto con el fin de clonar en él segmentos génicos de V\kappa no reorganizados. Los sitios únicos SalI y XhoI están flanqueados a su vez por sitios NotI que se usan para aislar la construcción transgénica completa de las secuencias del vector.

2. Aislamiento de segmentos génicos V\kappa no reorganizados y generación de animales transgénicos que expresan proteína de cadena ligera de Ig humana.

El oligonucleótido específico de V\kappa, oligo-65 (descrito anteriormente), se usa como sonda de una biblioteca de ADN genómico de placenta humana clonada en el vector de fago 1EMBL3/SP6/T7 (Clonetech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA). Se secuencian los segmentos de genes variables de los clones resultantes y se seleccionan los clones que parecen ser funcionales. Los criterios para juzgar la funcionalidad incluyen: fases de lectura abierta, secuencias aceptoras y donadoras de ayuste intactas y secuencia de recombinación intacta. Se clonan fragmentos de ADN que contienen segmentos génicos variables seleccionados en el sitio único XhoI del plásmido pJCK1 para generar construcciones de minilocus. Los clones resultantes se digieren con NotI, se aíslan los insertos y se inyectan en pronúcleos de embrión de ratón para generar animales transgénicos. Los transgenes de estos animales experimentarán unión de V a J en células B en desarrollo. Los animales que expresan cadena kappa humana se cruzan con animales transgénicos que contienen el minilocus de cadena pesada (ejemplo 14) para generar ratones que expresen anticuerpos completamente humanos.

Ejemplo 17 Región Variable de Cadena Pesada Sintética

Este ejemplo se resume en la figura 35.

A. Construcción del Vector de Clonación pVHf 1. pGP1f

El plásmido pGP1a (ejemplo previo) se digiere con NotI y los siguientes oligonucleótidos se ligan con él:

37

El plásmido resultante, pGP1f, contiene sitios SphI, XhoI e HindIII flanqueados por sitios NotI y SfiI.

2. pVHf

El segmento génico variable V_{H}251 de la familia V_{H}-V humana (C.G. Humphries et al. (1988) Nature, 331, 446) conjuntamente con aproximadamente 2,4 kb de secuencias flanqueantes 5' y aproximadamente 1,4 kb de secuencias flanqueantes 3', se aisló en un fragmento SphI/HindIII de 4,2 kb del clon plasmídico pVH251 (ejemplo previo) y se clonó en el vector plasmídico pSelect^{TM}-1 (Promega Corp. Madison, WI). Las secuencias flanqueantes 5', conjuntamente con el promotor, el primer exón y el primer intrón de V_{H}251, se amplifican por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir esta plantilla usando los siguientes oligonucleótidos:

38

Las secuencias flanqueantes 3' se amplifican por PCR usando los siguientes oligonucleótidos:

Las secuencias 5' amplificadas se digieren con SphI y con XhoI, y las secuencias 3' se digieren con HindIII y con XhoI. Los fragmentos resultantes se clonan conjuntamente en el plásmido pGP1f para generar el plásmido pVHf. El plásmido pVHf contiene los elementos reguladores de actuación cis que controlan la transcripción de V_{H}251, conjuntamente con la secuencia señal que codifica el primer exón. pVHf se usa como un cassette de expresión para secuencias variables de cadena pesada. Estas secuencias se clonan en el plásmido digerido con KasI/XhoI como se describe más adelante.

B. Aislamiento de Secuencias Codificantes del Gen Variable 1. Amplificación de secuencias de ADNc de genes V_{H} expresados

Se aísla ARN poli(A)^{+} a partir de linfocitos de sangre periférica (PBL) humana. La primera cadena del ADNc se sintetiza con la transcriptasa inversa, usando como cebador oligo-(dT). La primera cadena del ADNc se aísla y se le introduce una cola con oligo (dG) usando la terminal transferasa. Después, se amplifican específicamente las secuencias 5' de los transcritos de IgM por una modificación del método de Frohman et al., (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998). El oligo-(dC)13 y el siguiente oligonucleótido:

oligo-69 5' -gga att ctc aca gga gac gag - 3'

se usan como cebadores 5' y 3', respectivamente, en una reacción en cadena de la polimerasa con la primera cadena de ADNc de PBL con cola de dG. El oligo-69 es complementario a secuencias que codifican los aminoácidos 11-17 del dominio constante de IgM. Por lo tanto, estos cebadores amplificarán fragmentos de ADN de aproximadamente 0,6 kb que incluyen secuencias de genes V_{H} expresadas.

2. Retroconversión de secuencias de ADNc en forma de línea germinal

El siguiente oligonucleótido:

39

se hibrida con secuencias 5' de IgM amplificadas por PCR y desnaturalizadas. El oligo-"c" incluye una secuencia no degenerada de 21 nucleótidos que incluye un sitio KasI, seguida de una secuencia degenerada de 30 nucleótidos que es homóloga al extremo 5' del segundo exón de muchos segmentos V_{H} humanos (Genbank; Los Alamos, NM). El cebador se prolonga con la ADN polimerasa y el producto se aísla del cebador no usado por fraccionamiento por tamaño. Después se desnaturaliza el producto y se hibrida con el siguiente oligonucleótido:

40

El oligo-"d" incluye una secuencia no degenerada de 30 nucleótidos que incluye un sitio XhoI y parte de la secuencia de recombinación de V con DJ, seguido de una secuencia degenerada de 21 nucleótidos que es complementaria a la secuencia que codifica los siete últimos aminoácidos de la región estructural tres de muchos segmentos génicos variables humanos. Después, se prolonga el oligonucleótido hibridado con ADN polimerasa y el producto se aísla del cebador no usado por fraccionamiento por tamaño. Se realizan ciclos individuales de síntesis de ADN seguido de la eliminación de los cebadores para asegurar la integridad de la secuencia de fragmentos génicos variables individuales. El producto de la extensión del cebador oligo-"d" se amplifica por PCR usando los dos oligonucleótidos siguientes como cebadores:

41

El producto de PCR resultante de 0,36 kb se purifica por electroforesis en gel y se digiere con los enzimas de restricción KasI y XhoI. Después, los productos de digestión se clonan en pVHf digerido con KasI/XhoI para generar una biblioteca de secuencias génicas variables expresadas en configuración de línea germinal. El ligamiento en el sito KasI de pVHF reproduce el sitio aceptor de ayuste del extremo 5' del segundo exón, mientras que el ligamiento en el sitio XhoI reproduce la señal de recombinación del extremo 3' del segmento del gen variable. Se usan versiones alternativas de oligonucleótidos degenerados "c" y "d" para amplificar poblaciones diferentes de genes variables y para generar bibliotecas en configuración de línea germinal que representan las diferentes poblaciones (Genbank; Los Alamos, NN).

C. Construcción de Locus Sintético

Se desarrolla la biblioteca completa de genes V_{H} sintéticos en configuración germinal conjuntamente y se aíslan el ADN plasmídico. El plásmido pVHf de número medio de copias, que incluye un potente terminador de la transcripción entre el gen de resistencia a ampicilina y el sitio de clonación, se diseña para minimizar la expansión de clones particulares dentro de la biblioteca. El ADN plasmídico se digiere con SfiI, se trata con fosfatasa intestinal de ternero para retirar los grupos fosfato 5', y después se digiere con NotI. La fosfatasa intestinal de ternero se retira antes de la digestión con NotI, de modo que sólo se desfosforilan los extremos SfiI. Después el ADN digerido se aísla de las secuencias del vector por electroforesis en gel de agarosa y se liga con los oligonucleótidos siguientes:

42

El oligo-"h" está fosforilado mientras que el oligo-"g" no está fosforilado a la izquierda. La reacción de ligamiento se realiza con un gran exceso molar de oligonucleótidos de modo que todos los extremos NotI del fragmento génico V se ligarán con los oligonucleótidos y no con otros fragmentos de región V. Debido a que los extremos SfiI no son compatibles entre sí, los segmentos V se concatenarán en la misma orientación, de modo que cada segmento V estará separado del siguiente segmento V por una única unidad espaciadora oligonucleotídica.

Los concatómeros grandes se separan por tamaño en electroforesis y se aíslan en geles de agarosa. Después, los concatómeros fraccionados por tamaño se inyectan de forma conjunta directamente en pronúcleos de embrión de ratón conjuntamente con los fragmentos de ADN que contienen D-J-C (tales como las inserciones pHC1 o pHC2) para generar animales transgénicos con repertorios primarios grandes. De forma alternativa, los concatómeros se clonan en un vector plasmídico tal como pGPf.

Ejemplo 18 Generación de Anticuerpos Específicos de Subpoblaciones de Receptores de Células Linfoides

La inoculación de ratones con inmunoglobulinas (receptores de células B) xenogénicas (es decir, humanas) o con receptores de células T conduce predominantemente a la generación de anticuerpos de ratón dirigidos contra epítopos particulares (epítopos dominantes) compartidos por todas o la mayoría de las inmunoglobulinas o de los receptores de células T de una especie determinada, pero que difieren entre especies. Por lo tanto, es difícil aislar anticuerpos que distingan entre subpoblaciones particulares de receptores de células B o T (por ejemplo, idiotipos o familias de región variable). Sin embargo, el ratón transgénico que exprese inmunoglobulinas humanas (descrito en los ejemplos anteriores) será inmunológicamente tolerante a los epítopos de células B compartidos y, por lo tanto, será útil para la generación de anticuerpos que distingan entre subpoblaciones de inmunoglobulinas humanas. Este concepto se extiende a la generación de ratones transgénicos que expresan secuencias que codifican el receptor de células T humanas y al cruce de estos ratones con el ratón transgénico para inmunoglobulina humana. En estos ratones se inoculan aislados que contienen proteínas del receptor de células T humanas y se generan anticuerpos monoclonales que reconocen subpoblaciones de receptores de células T.

Ciertos estudios han demostrado que hay una variabilidad limitada de receptores de antígenos de células T implicados en ciertas enfermedades autoinmunes (T.F. Davies et al. (1991) New England J. Med., 325, 238). Debido a esta variabilidad limitada, es posible generar anticuerpos monoclonales humanos que reconozcan específicamente la subpoblación de células T humanas que es autorreactiva.

A. Generación de anticuerpos específicos de subpoblaciones de células B

En ratones transgénicos que expresan inmunoglobulina humana se inoculan inmunoglobulinas aisladas a partir de un donante sano o de un paciente con una malignidad de células B que expresa un alto nivel de un único tipo de inmunoglobulina (Miller et al., (1982) New Eng. J. Med. 306, 517-522). Se generan hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales como describen Harlow y Lane (E. Harlow y D. Lane. Antibodies: A Laboratory Manual, 1988. Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York). Se seleccionan hibridomas individuales que secretan anticuerpos humanos que reconocen de forma específica subpoblaciones de células B.

B. Ratones transgénicos que expresan secuencias del receptor de células T humano

Se coinyectan fragmentos de ADN que contienen los genes \alpha y \beta del receptor de células T humanas (TCR) intacto y completamente reorganizado en pronúcleos de embrión de ratón para generar animales transgénicos. Se ensaya la expresión en los animales transgénicos de ambos transgenes en la superficie de sus células T por análisis FACS. Se seleccionan los animales que expresan sólo bajos niveles de cadenas \alpha y \beta de TCR en una fracción de sus células T. Sólo se requieren bajos niveles de expresión para obtener tolerancia inmunológica, y un alto nivel de expresión podría desestabilizar el sistema inmune del animal e interferir con la capacidad para generar una respuesta inmune requerida para la generación de anticuerpos monoclonales. De forma alternativa, debido a que no se requiere una correcta expresión específica de tejido o de tipo celular para obtener tolerancia inmunológica, se insertan clones de ADNc de cadenas \alpha y \beta de TCR en cassettes de expresión transgénica (T. Choi et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 11; 3070-3074) bajo el control de señales de transcripción distintas a las de TCR. Las construcciones transgénicas de ADNc de cadenas \alpha y \beta de TCR se inyectan conjuntamente en pronúcleos de embrión de ratón para generar animales transgénicos. La expresión ectópica de las cadenas de TCR no tendrá como resultado la expresión en la superficie celular, ya que el TCR es un complejo multicadena (H. Clevers et al., 1988 Ann. Rev. Immunol., 6, 629-662); sin embargo, no se requiere la expresión en la superficie celular para la presentación antigénica (Townsend et al., (1986) Nature, 324, 575-577) ni para la inducción de tolerancia.

Se cruzan ratones transgénicos para las cadenas \alpha y \beta del receptor de células T con ratones transgénicos que expresan inmunoglobulina humana para generar ratones útiles para generar anticuerpos monoclonales humanos que reconozcan subpoblaciones específicas de células T humanas. Estos ratones se inoculan con proteínas derivadas de células T aisladas a partir de un donante sano o de un paciente con una malignidad de células T que expresa un solo tipo de TCR. Se generan hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales y se seleccionan hibridomas individuales que secretan anticuerpos humanos que reconocen específicamente subpoblaciones de células B.

Ejemplo 19 Transgen Genómico de Cadena Pesada de Ig Humana

Este ejemplo describe la clonación de un transgen genómico de cadena pesada de inmunoglobulina humana que después se introduce en la línea germinal murina por medio de microinyección en cigotos o por integración en células ES.

Se aíslan núcleos a partir de tejido de placenta humana recién obtenida como describen Marzluff, W.F., et al. (1985), Transcription and Translation: A Practical Approach, B.D. Hammes y S.J. Higgins, eds, pág. 89-129, IRL Press, Oxford). Los núcleos aislados (o espermatozoides humanos lavados con PBS) se incluyen en bloques de agarosa de bajo punto de fusión al 0,5% y se lisan con proteinasa K a 1 mg/ml en EDTA 500 mM, SDS al 1% para los núcleos, o con proteinasa K a 1 mg/ml en EDTA 500 mM, SDS al 1%, DTT 10 mM para los espermatozoides a 50ºC durante 18 horas. La proteinasa K se inactiva incubando los bloques en PMSF a 40 \mug/ml en TE durante 30 minutos a 50ºC, y después lavando extensamente con TE. Después, se digiere el ADN en la agarosa con el enzima de restricción NotI como describe M. Finney en Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, supl. 4, 1988, por ejemplo, Sección 2.5.1).

Después, el ADN digerido con NotI se fracciona por electroforesis en gel de campo pulsado como describen Anand, R. et al. (1989), Nucl. Acids Res., 17, 3425-3433. Las fracciones enriquecidas en el fragmento NotI se ensayan por hibridación de Southern para detectar una o más de las secuencias codificadas por este fragmento. Estas secuencias incluyen los segmentos D de cadena pesada, los segmentos J y las regiones constantes \gamma1 conjuntamente con representantes de las 6 familias de V_{H} (aunque este fragmento se identifica como el fragmento de 670 kb de células HeLa de Berman et al. (1988), supra, hemos descubierto que éste es un fragmento de 830 kb del ADN de placenta humana y de esperma). Las fracciones que contienen este fragmento NotI (véase la figura 4) se ligan en el sitio de clonación NotI del vector pYACNN como se ha descrito (McCormick, M. et al. (1990), Technique 2, 65-71). El plásmido pYACNN se prepara por digestión de pYACneo (Clontech) con EcoRI y ligamiento en presencia del oligonucleótido 5' - AAT TGC GGC CGC - 3'

Los clones YAC que contienen el fragmento NotI de cadena pesada se aíslan como se describe en Traver et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5898-5902. El inserto NotI clonado se aísla a partir del ADN de levadura de alto peso molecular por electroforesis en gel de campo pulsado como se describe en M. Finney, op. cit. El ADN se condensa por la adición de espermina 1 mM y se microinyecta directamente en el núcleo de embriones de una sola célula descritos previamente. De forma alternativa, el ADN se aísla por electroforesis en gel de campo pulsado y se introduce en células ES por lipofección (Gnirke et al. (1991), EMBO J., 10, 1629-1634), o el YAC se introduce en células ES por fusión de esferoplastos.

Ejemplo 20 Transgen de Cadena Pesada de Ig Genómica Discontinuo

Un fragmento SpeI de 85 kb de ADN genómico humano, que contiene V_{H}6, segmentos D, segmentos J, la región constante \mu y parte de la región constante \gamma (véase la figura 4), se ha aislado por clonación en YAC esencialmente como se describe en el ejemplo 1. Se aísla como se ha descrito un YAC que lleva un fragmento de la región variable de la línea germinal, tal como un fragmento NotI de 570 kb cadena arriba del fragmento NotI de 670-830 kb descrito anteriormente que contiene múltiples copias de V_{1} a V_{5}. (Berman et al. (1988), supra. detectaron dos fragmentos Notl de 570 kb, que contenían cada uno múltiples segmentos V.) Los dos fragmentos se inyectan conjuntamente en el núcleo de un embrión de una sola célula de ratón como se describe en el ejemplo 1.

Típicamente, la inyección conjunta de dos fragmentos de ADN diferentes da lugar a la integración de ambos fragmentos en el mismo sitio de inserción en el cromosoma. Por lo tanto, aproximadamente el 50% de los animales transgénicos resultantes que contienen al menos una copia de cada uno de los dos fragmentos tendrá el fragmento del segmento V insertado cadena arriba del fragmento que contiene la región constante. De estos animales, aproximadamente el 50% realizará la unión de V a DJ por inversión de ADN y aproximadamente el 50% por deleción, dependiendo de la orientación del fragmento NotI de 570 kb en relación con la posición de fragmento SpeI de 85 kb. Se aísla ADN de los animales transgénicos resultantes y, en los animales en los que se descubre por hibridación de transferencia de Southern que contienen ambos transgenes (especialmente, los animales que contienen tanto múltiples segmentos V humanos como genes de la región constante humana), se ensaya la capacidad para expresar moléculas de inmunoglobulina humana de acuerdo con técnicas convencionales.

Ejemplo 21 Unión de Fragmentos de YAC Solapantes

Dos YAC que llevan una región de solapamiento se unen en una levadura por recombinación meiótica como se describe en Silverman et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9913-9917, para obtener secuencias que llevan un único YAC grande a partir de los dos YAC más pequeños. Los dos YAC se alinean con respecto a los brazos, de modo que el YAC unido contendrá un brazo del vector centromérico y un bazo del vector no centromérico. Si es necesario, el inserto se clona de nuevo en el vector usando sitios de restricción únicos en los extremos del inserto. Si el inserto no es un fragmento de restricción único, se insertan sitios únicos en los brazos del vector por transformación oligonucleotídica de levaduras, como se describe en Guthrie y Fink, op. cit. Para la unión de YAC que llevan secuencias no contiguas que no solapan, se crea un solapamiento como sigue. La región 3' terminal del YAC 5' y la región 5' terminal del YAC 3' se subclonan, se unen in vitro para crear un fragmento de unión y se reintroducen en uno o en los dos YAC por recombinación homóloga (Guthrie y Fink, op. cit.). Después, los dos YAC se recombinan meióticamente como se describe en Silverman et al., op. cit. Los YAC unidos se introducen en ratones, por ejemplo, como en el ejemplo 1.

Ejemplo 22 Transgen de Cadena Ligera \kappa de Ig Humana Genómica

En Lorenz W. et al. (1987), Nucl. Acids Res., 15, 9667-9677 se ha descrito un mapa de la cadena ligera humana \kappa que se representa en la figura 11. Se aísla un fragmento de XhoI a NotI de 450 kb que incluye toda la C\kappa, el potenciador 3', todos los segmentos J y al menos cinco segmentos V diferentes (a), o un fragmento de MluI a Notl de 750 kb que incluye todo lo anterior más al menos 20 segmentos V más (b) y se introduce en cigotos o en células ES como se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 23 Transgen de Cadena Ligera \kappa de Ig Humana Genómica Formado por Recombinación Homóloga In Vivo

El fragmento de MluI a NotI de 750 kb se digiere con BssHII para producir un fragmento de aproximadamente 400 kb (c). El fragmento de XhoI a NotI de 450 kb (a) y el fragmento de MluI a BssHII de aproximadamente 400 kb (c) tienen una secuencia solapante definida por los sitios de restricción BssHII y XhoI mostrados en la figura 11. La recombinación homóloga de estos dos fragmentos tras la microinyección en un cigoto de ratón da lugar a un transgen que contiene al menos unos 15-20 segmentos V adicionales más que los encontrados en el fragmento XhoI/NotI de 450 kb (ejemplo 22).

Ejemplo 24 Identificación de secuencias de región variable funcionalmente reorganizadas en células B transgénicas

Se usa un antígeno de interés para inmunizar (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988)) un ratón con los siguientes rasgos genéticos: homocigosis en el locus de cadena pesada endógena para una deleción de J_{H} (ejemplos 9 y 12); hemicigosis para una única copia de transgen de minilocus de cadena pesada humana reorganizado (ejemplos 5 y 14); y hemicigosis para una sola copia de un transgen de cadena ligera kappa humana reorganizada (ejemplos 7 y 16).

Tras el programa de inmunización, se retira el bazo y se usan las células esplénicas para generar hibridomas. Se usan células de un clon de hibridoma individual que secreta anticuerpos reactivos con el antígeno de interés para preparar ADN genómico. Se digiere una muestra del ADN genómico con varios enzimas de restricción diferentes que reconocen secuencias únicas de seis pares de bases y se fraccionan en un gel de agarosa. Se usa hibridación de transferencia de Southern para identificar dos fragmentos de ADN en el intervalo de 2-10 kb, uno de los cuales contiene la copia única de las secuencias VDJ de cadena pesada humana reorganizadas y el otro contiene la copia única de la secuencia VJ de cadena ligera humana reorganizada. Estos dos fragmentos se fraccionan por tamaño en gel de agarosa y se clonan directamente en pUC18. Después, los insertos clonados después se subclonan respectivamente en cassettes de expresión de cadena pesada y ligera que contienen secuencias de región constante.

El clon plasmídico p\gammae1 (ejemplo 14) se usa como un cassette de expresión de cadena pesada y las secuencias VDJ reorganizadas se clonan en el sitio XhoI. El clon plasmídico pCK1 se usa como cassette de expresión de cadena ligera y las secuencias VJ reorganizadas se clonan en el sitio XhoI. Los clones resultantes se usan conjuntamente para transfectar células SP_{0} para producir anticuerpos que reaccionen con el antígeno de interés (M.S. Co et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2869).

De forma alternativa, se aísla ARNm a partir de las células de hibridoma clonadas descritas anteriormente, y se usa para sintetizar ADNc. Después, las secuencias VDJ y VJ de cadena pesada y ligera humana expresadas se amplifican por PCR y se clonan (J.W. Larrich et al. (1989) Biol. Technology, 7:934-938). Después de haber determinado la secuencia de nucleótidos de estos clones, se sintetizan oligonucleótidos que codifican los mismos polipéptidos y se generan vectores de expresión sintéticos como se describe en C. Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 84:5454-5458.

Por lo anterior, será obvio que de acuerdo con la invención se proporciona un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye un transgen que comprende secuencias de ADN que codifican las regiones variable (V), de diversidad (D), de unión (J) y constante humanas de una proteína Ig humana, estando dichas secuencias unidas de forma operativa a secuencias reguladoras de la transcripción y capaces de experimentar reorganización génica in vivo, cuando se integran en un animal transgénico no humano, para producir un gen reorganizado que codifica un polipéptido de cadena pesada humana, comprendiendo también dicha construcción una región 5' donadora de cambio \mu procedente de una región constante \mu y una región aceptora de cambio \gamma humana entre la región constante \mu y una región constante \gamma humana, estando dichas secuencias de cambio unidas de forma operativa para efectuar un cambio de clase in vivo y para la producción de polipéptidos de cadena pesada \gamma humana.

Claims (1)

1. Un ratón transgénico que tiene un genoma que incluye una construcción transgénica que comprende secuencias de ADN que codifican las regiones variable (V), de diversidad (D), de unión (J) y constante humanas de una proteína Ig humana, estando dichas secuencias unidas de forma operativa a secuencias reguladoras de la transcripción y capaces de experimentar reorganización génica in vivo, cuando se integran en un animal transgénico no humano, para producir un gen reorganizado que codifica un polipéptido de cadena pesada humana, comprendiendo también dicha construcción una región 5' donadora de cambio \mu procedente de una región constante \mu y una región aceptora de cambio \gamma humana entre la región constante \mu y una región \gamma humana, estando dichas secuencias de cambio unidas de forma operativa para efectuar el cambio de clase in vivo y la producción de polipéptidos de cadena pesada \gamma humana.