ES2835731T3

ES2835731T3 - Uso de pectina o sacáridos relacionados con la pectina para mejorar la eficacia de las cepas de rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) para promover el crecimiento y la salud en las plantas

Info

Publication number: ES2835731T3
Application number: ES15778849T
Authority: ES
Inventors: Mark R Liles; Joseph Kloepper
Original assignee: Auburn University
Current assignee: Auburn University
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2021-06-23
Anticipated expiration: 2035-09-30
Also published as: WO2016054222A1; US20200009200A1; US20250031703A1; BR112017006629B1; CN107205403B; US12089598B2; EP3200590B1; US20170202888A1; CN107205403A; BR112017006629A2; CA3000621C; US20220095628A1; EP3200590A1; CA3000621A1; US10888593B2

Abstract

Un inoculante que comprende: (a) una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina seleccionada de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, pectina esterasa, altronato deshidratasa, altronato oxidorreductasa, uronato isomerasa, manonato deshidratasa, D-manonato oxidorreductasa, 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa, represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato, transportador de hexuronato, y sus combinaciones y (b) un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina que comprende pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato, o sus mezclas, en donde la PGPR es Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de pectina o sacáridos relacionados con la pectina para mejorar la eficacia de las cepas de rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) para promover el crecimiento y la salud en las plantas

Campo

El contenido descrito actualmente se refiere al campo de las rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR). En particular, el presente contenido se refiere al uso de la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para mejorar la eficacia de las RPCP con relación a la promoción del crecimiento y la salud en las plantas.

Antecedentes

Los microorganismos asociados a las plantas se han examinado extensivamente por su papel en la supresión natural e inducida de las enfermedades transmitidas por el suelo. Entre los muchos grupos de tales organismos se encuentran las bacterias asociadas a las raíces, que generalmente representan un subgrupo de las bacterias del suelo. Las rizobacterias son un subgrupo de las bacterias totales de la rizosfera que tienen la capacidad, al reintroducirse en las semillas o en las partes vegetativas de la planta (tal como las piezas de las semillas de patata), de colonizar el sistema de las raíces en desarrollo en presencia de la microflora competitiva del suelo. La colonización de las raíces se examina típicamente al cuantificar las poblaciones bacterianas en la superficie de las raíces; sin embargo, algunas rizobacterias también pueden entrar en las raíces y establecer al menos una fase endofítica limitada. Por lo tanto, la colonización de las raíces puede verse como un continuo desde la rizosfera al rizoplano hasta los tejidos internos de las raíces.

Las rizobacterias que ejercen un efecto beneficioso sobre la planta que se coloniza se denominan "rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas" o "PGPR". Las PGPR pueden beneficiar al hospedador al causar la promoción del crecimiento de la planta o el control biológico de la enfermedad. La misma cepa de PGPR puede causar tanto la promoción del crecimiento como el control biológico. Entre los patógenos transmitidos por el suelo que se muestran son afectados negativamente por las PGPR Aphanomyces spp., Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis, Phytophthora spp., Pythium spp., Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Thielaviopsis basicola, y Verticillium spp. En la mayoría de estos casos, el control biológico resulta de la producción bacteriana de metabolitos que inhiben directamente al patógeno, tales como antibióticos, cianuro de hidrógeno, sideróforos quelantes de hierro, y enzimas que degradan la pared celular. La promoción del crecimiento de las plantas por las PGPR también puede ser un mecanismo indirecto de control biológico, que conduce a una reducción en la probabilidad de que una planta contraiga una enfermedad cuando la promoción del crecimiento resulta en acortar el tiempo que una planta está en un estado susceptible, por ejemplo en el caso donde las PGPR causan una velocidad de emergencia de las plántulas mejorada, reduciendo de esta manera el tiempo susceptible para el amortiguamiento de pre-emergencia. Un mecanismo alternativo para el control biológico por las PGPR es la resistencia sistémica inducida. Las PGPR y el uso de las mismas se describen en la técnica anterior. {Ver, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 8,445,255; 6,524,998; 5,935,839; 5,640,803; 5,503,652; y 5,503,651

Además de su asociación observada en la naturaleza con las plantas, las PGPR también pueden utilizarse como probióticos para animales con el fin de mejorar el crecimiento o la salud de los animales. Por ejemplo, el Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AP193 se ha descrito como un probiótico para los peces. (Ver la solicitud publicada de los Estados Unidos núm. 2012/0328572).

En los cerdos, se han usado los probióticos para tener una influencia positiva en el equilibrio de la microbiota intestinal, la integridad del epitelio intestinal y la maduración del tejido asociado al intestino. (Ver Corcionivoshi y otros, Animal Science and Biotechnologies, 2010, 43(1)). En las aves de corral, se han usado los probióticos para mantener el equilibrio microbiano digestivo y para reducir las bacterias patógenas potenciales lo que resulta en un crecimiento mejorado, la producción de huevos, y la conversión alimenticia. {Ver id.). En el ganado bovino, se han usado los probióticos para prevenir y combatir los trastornos digestivos tal como la diarrea durante la lactancia, para influir en el metabolismo ruminal de los nutrientes, lo que ayuda a mantener la salud y mejorar el rendimiento productivo. {Ver id.). En las ovejas, se han usado los probióticos para prevenir y combatir las afecciones patológicas que surgen del equilibrio digestivo. {Ver id.).

El documento US 7,422,737 B1 describe los portadores sólidos celulares que comprenden microorganismos viables capaces de controlar los patógenos vegetales.

El documento US 6,280,719 B1 describe los agentes de biocontrol antifúngicos que mejoran el crecimiento vegetal y reducen las enfermedades vegetales por la supresión de los patógenos fúngicos.

Por lo tanto, son convenientes nuevas composiciones y métodos de uso para las PGPR en la promoción del crecimiento y la salud en los vegetales y los animales.

Resumen

La invención proporciona un inoculante que comprende: (a) una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina que se selecciona de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, pectina esterasa, altronato deshidratasa, altronato oxidorreductasa, uronato isomerasa, manonato deshidratasa, D-manonato oxidorreductasa, 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa, represor transcripcional del operón de utilización de hexuronato, transportador de hexuronato, y sus combinaciones y (b) un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina que comprende pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato, o sus mezclas, en donde la PGPR es Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum.

La invención también proporciona un método para mejorar el crecimiento o la salud vegetal, el método que comprende: (a) tratar plantas, semillas, o suelo con una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina que se selecciona de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, pectina esterasa, altronato deshidratasa, altronato oxidorreductasa, uronato isomerasa, manonato deshidratasa, D- manonato oxidorreductasa, 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa, represor transcripcional del operón de utilización de hexuronato, transportador de hexuronato, y sus combinacionesA y (b) tratar plantas, semillas, o suelo con un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina que comprende pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato, o sus mezclas, en donde la PGPR es Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum.

Se describen composiciones y métodos que incluyen o utilizan rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) para mejorar el crecimiento y la salud en las plantas. Las composiciones y métodos incluyen o utilizan una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina, y un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina.

Las composiciones descritas pueden incluir inoculantes que comprenden: (a) una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina; y (b) un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina. La PGPR es Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum. La pectina o los sacáridos relacionados con la pectina incluyen sacáridos derivados de la pectina tales como pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato, o sus mezclas. Opcionalmente, la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina funcionan como un portador para la PGPR y/o el inoculante que incluye un portador distinto de la pectina o el sacárido relacionado con la pectina.

Las composiciones descritas pueden usarse para tratar plantas, semillas, y suelos con el fin de mejorar el crecimiento o la salud de las plantas. Las composiciones descritas pueden formularse como una composición de tratamiento de plantas, un recubrimiento para las semillas, o una composición de enmienda del suelo.

También se describen los métodos de uso de la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para mejorar la eficacia de la PGPR con respecto a la promoción del crecimiento o la salud en las plantas. Los métodos descritos para mejorar el crecimiento o la salud de las plantas pueden incluir: (a) tratar plantas, semillas, o suelo con una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina y (b) tratar las plantas, semillas, o suelo con un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina, donde las plantas, semillas, o suelo pueden tratarse con la PGPR y el sacárido simultáneamente o se tratan con la PGPR y el sacárido no simultáneo en cualquier orden.

También se describen métodos de uso de la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para preparar composiciones e inoculantes como se describe en la presente descripción. Los métodos pueden incluir la combinación de PGPR y pectina, que se ha extraído del material de la planta que contiene pectina, o los sacáridos relacionados con la pectina para preparar las composiciones y los inoculantes descritos. Opcionalmente, un portador puede combinarse con la PGPR y la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para preparar las composiciones y los inoculantes descritos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Filogenia de la PGPR Bacillus spp. evaluada en el Ejemplo 1. (Panel A) Vecino que se une al árbol filogenético basado en secuencias gyrB mediante el uso de B. cereus ATCC 14579T como un grupo externo. (Panel B) Árbol filogenético de máxima probabilidad de las 25 cepas del grupo B. subtilis basadas en la secuencia de 729,383 pb del genoma del núcleo. Dos clústeres que pertenecen a B. amyloliquefaciens subsp. plantarum y B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens se indican entre paréntesis.

Figura 2. La distribución de las diferentes categorías de los subsistemas de cuatro genomas de núcleos diferentes específicos para el género Bacillus (n=81), B. subtilis subgrupo (n=53), especie B. amyloliquefaciens (n=32) y subsp. plantarum (n=28). (Panel A) Los recuentos totales para los genes dentro de las diferentes categorías de los subsistemas para cada uno de los genomas del núcleo. (Panel B) El porcentaje de abundancia relativa de los genes dentro de las diferentes categorías de los subsistemas para cada uno de los genomas del núcleo. (Panel C) Categorías de las funciones codificadas por los genes específicos 73 de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum presentes en el genoma del núcleo de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum pero ausente en el genoma del núcleo a nivel de la especie B. amyloliquefaciens. El número al lado de cada subgrupo de la figura circular representa el número de genes que codifican la función.

Figura 3. Actividades antimicrobianas del Bacilo sp. API93 y sus mutantes AsrfAA, defectuoso en la expresión de la surfactina, AdfnD, defectuoso en la expresión de dificidina, y Asfp, defectuoso en la expresión de múltiples metabolitos secundarios (que incluye la dificidina) contra los patógenos de las plantas Pseudomonas syringe pv. tabaci, Rhizobium radiobacter, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria y Xanthomonas axonopodis pv. campestris como se demostró con un ensayo de difusión en agar.

Figura 4. Espectros de LC-MS para los metabolitos de los sobrenadantes libres de células de (A) B. amyloliquefaciens API93 tipo salvaje, y (B) su mutante isogénico dfnD, cuando crecen en TSB durante 72 horas. Note que en el modo de ion negativo solo se detectó la forma desprotonada de la oxidificidina en los sobrenadantes de cultivos bacterianos a una m/z de 559,3.

Figura 5. Expresión de una actividad de pectina liasa por la PGPR cepa Bap AP193. Note el halo despejado alrededor del crecimiento de la cepa Bap debido a la degradación de la pectina.

Figura 6. Uso de pectina al 1 % como una única fuente C por las cepas PGPR AP143 y AP193 en el medio TSS. El pequeño aumento en ODeoo por la cepa HD73 no PGPR se debió a los nutrientes residuales presentes en el cultivo de TSB previo.

Descripción detallada

El contenido descrito de la invención, como se define en las reivindicaciones, puede describirse mediante el uso de varios términos como se describe más abajo.

A menos que se especifique o se indique de cualquier otra manera por el contexto, los términos "un", "una", y "el" significan "uno o más". Por ejemplo, debe interpretarse que "un azúcar" significa "uno o más azúcares" a menos que se especifique o se indique de cualquier otra manera por el contexto.

Como se usa en la presente descripción, "alrededor de", "aproximadamente", "sustancialmente", y "significativamente" se comprenderán por los expertos en la técnica y variará en cierta extensión en el contexto en el cual se usan. Si hay usos del término que no están claros para los expertos en la técnica, dado el contexto en el que se usa, "alrededor de" y "aproximadamente" significarán más o menos <10 % del término particular y "sustancialmente" y "significativamente" significarán más o menos >10 % del término particular.

Como se usa en la presente descripción, los términos "incluye" e "que incluye" tienen el mismo significado que los términos "comprende" y "que comprende". Los términos "comprende" y "que comprende" deben interpretarse como términos transitorios "abiertos" que permiten la inclusión de componentes adicionales además de los componentes que se enumeran en las reivindicaciones. Los términos "consiste" y "que consiste de" deben interpretarse como términos transitorios "cerrados" que no permiten la inclusión de componentes adicionales distintos de los componentes que se enumeran en las reivindicaciones. El término "que consiste esencialmente de" debe interpretarse que está parcialmente cerrado y que permite la inclusión solamente de componentes adicionales que no alteran fundamentalmente la naturaleza del contenido reivindicado.

El término "planta" como se utiliza en la presente descripción debe interpretarse de manera amplia y puede incluir angiospermas y gimnospermas, dicotiledóneas y monocotiledóneas, y árboles. Los ejemplos de angiospermas dicotiledóneas pueden incluir tomate, tabaco, algodón, semilla de colza, habas, soja, pimientos, lechugas, guisantes, alfalfa, trébol, col, brócoli, coliflor, coles de Bruselas), rábano, zanahoria, remolacha, berenjena, espinaca, pepino, calabazas, melón, melón cantalupo, y girasoles. Los ejemplos de angiospermas monocotiledóneas pueden incluir espárragos, maíz dulce y de campo, cebada, trigo, arroz, sorgo, cebolla, mijo perla, centeno, avena y caña de azúcar. Las plantas leñosas pueden incluir árboles frutales, acacia, aliso, álamo, haya, abedul, liquidámbar, sicómoro, álamo, sauce, abeto, pino, píceas, alerce, cedro y cicuta.

El término "animal", como se utiliza en la presente descripción debe interpretarse de manera amplia y puede incluir mamíferos y no mamíferos. Los mamíferos pueden incluir mamíferos humanos y no humanos, tales como vacas, cerdos, ovejas. Los no mamíferos pueden incluir aves {por ejemplo, pollos, pavos, patos) y pescado.

Los presentes inventores han identificado una colección de rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) que son capaces de mejorar el crecimiento de las plantas, y también tienen una actividad de control de plagas y enfermedades. A partir de un análisis de las secuencias del genoma de las cepas PGPR más eficientes de Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum, los inventores identificaron algunas funciones codificadas genéticamente que siempre están presentes dentro de estas cepas PGPR Bacillus y no están presentes en otras especies Bacillus que no están relacionadas con las plantas. En particular, estas cepas PGPR pueden usar azúcares derivados de la pectina de las plantas como fuente de carbono y/o energía. Al suplementar la pectina en las semillas de las plantas que están inoculadas con esporas de Bacillus, o al suplementar la cantidad de pectina disponible para la cepa PGPR Bacillus después de la germinación de la semilla, esto resultará en una mejora de 1) la colonización de la cepa Bacillus de la rizosfera de la planta y/o 2) mejor persistencia del Bacillus dentro de la rizosfera de la planta y/o 3) mejor rendimiento del crecimiento de la planta en respuesta a la administración de la cepa PGPR pectina y/o 4) mejor control biológico de la enfermedad (por ejemplo, bacterias, hongos, virus) o plagas (por ejemplo, nemátodos) como resultado de la administración de la cepa PGPR pectina.

PGPR

El término "rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas" o "PGPR" se refiere a un grupo de bacterias que colonizan las raíces de las plantas y, al hacerlo, promueven el crecimiento de las plantas y/o reducen la enfermedad o el daño de los depredadores. Las bacterias que son PGPR pueden pertenecer a los géneros que incluyen Actinobacter, Alcaligenes, Bacillus, Burkholderia, Buttiauxella, Enterobacter, Klebsiella, Kluyvera, Pseudomonas, Rahnella, Ralstonia, Rhizobium, Serratia, Stenotrophomonas, Paenibacillus, y Lysinibacillus. La PGPR utilizada en los métodos y la composición descritos se selecciona del género Bacillus.

El género Bacillus como se usa en la presente descripción, se refiere a un género de bacterias Gram positivas, en forma de varilla, que son miembros de la división Firmicutes. Bajo condiciones ambientales de estrés, las bacterias Bacillus producen endosporas ovaladas que pueden permanecer latentes durante períodos prolongados. Las bacterias Bacillus pueden caracterizarse e identificarse en base a la secuencia de nucleótidos de su ARNr 16S o un fragmento del mismo (por ejemplo, aproximadamente un fragmento de 1000 nt, 1100 nt, 1200 nt, 1300 nt, 1400 nt, o 1500 nt de la secuencia de nucleótidos del ARNr 16S o el ADNr). Las bacterias Bacillus pueden incluir B. acidiceler, B. acidicola, B. acidiproducens, B. aeolius, B. aerius, B. aerophilus, B. agaradhaerens, B. aidingensis, B. akibai, B. alcalophilus, B. algicola, B. alkalinitrilicus, B. alkalisediminis, B. alkalitelluris, B. altitudinis, B. alveayuensis, B. amyloliquefaciens, B. anthracis, B. aquimaris, B. arsenicus, B. aryabhattai, B. asahii, B. atrophaeus, B. aurantiacus, B. azotoformans, B. badius, B. barbaricus, B. bataviensis, B. beijingensis, B. benzoevorans, B. beveridgei, B. bogoriensis, B. boroniphilus, B. butanolivorans, B. canaveralius, B. carboniphilus, B. cecembensis, B. cellulosilyticus, B. cereus, B. chagannorensis, B. chungangensis, B. cibi, B. circulans, B. clarkii, B. clausii, B. coagulans, B. coahuilensis, B. cohnii, B. decisifrondis, B. decolorationis, B. drentensis, B. farraginis, B. fastidiosus, B. firmus, B. flexus, B. foraminis, B. fordii, B. fortis, B. fumarioli, B. funiculus, B. galactosidilyticus, B. galliciensis, B. gelatini, B. gibsonii, B. ginsengi, B. gins engihumi, B. graminis, B. halmapalus, B. halochares, B. halodurans, B. hemicellulosilyticus, B. herbertsteinensis, B. horikoshi, B. horneckiae, B. horti, B. humi, B. hwajinpoensis, B. idriensis, B. indicus, B. infantis, B. infernus, B. isabeliae, B. isronensis, B. jeotgali, B. koreensis, B. korlensis, B. kribbensis, B. krulwichiae, B. lehensis, B. lentus, B. licheniformis, B. litoralis, B. locisalis, B. luciferensis, B. luteolus, B. macauensis, B. macyae, B. mannanilyticus, B. marisflavi, B. marmarensis, B. massiliensis, B. megaterium, B. methanolicus, B. methylotrophicus, B. mojavensis, B. muralis, B. murimartini, B. mycoides, B. nanhaiensis, B. nanhaiisediminis, B. nealsonii, B. neizhouensis, B. niabensis, B. niacini, B. novalis, B. oceanisediminis, B. odysseyi, B. okhensis, B. okuhidensis, B. oleronius, B. oshimensis, B. panaciterrae, B. patagoniensis, B. persepolensis, B. plakortidis, B. pocheonensis, B. polygoni, B. pseudoalcaliphilus, B. pseudofirmus, B. pseudomycoides, B. psychr osaccharolyticus, B. pumilus, B. qingdaonensis, B. rigui, B. ruris, B. safensis, B. salarius, B. saliphilus, B. schlegelii, B. selenatarsenatis, B. selenitireducens, B. seohaeanensis, B. shackletonii, B. siamensis, B. simplex, B. siralis, B. smithii, B. soli, B. solisalsi, B. sonorensis, B. sporothermodurans, B. stratosphericus, B. subterraneus, B. subtilis, B. taeansis, B. tequilensis, B. thermantarcticus, B. thermoamylovorans, B. thermocloacae, B. thermolactis, B. thioparans, B. thuringiensis, B. tripoxylicola, B. tusciae, B. vallismortis, B. vedderi, B. vietnamensis, B. vireti, B. wakoensis, B. weihenstephanensis, B. xiaoxiensis, y mezclas o combinaciones de las mismas.

Las PGPR y los inoculantes de la misma descritos en la presente descripción pueden incluir B. amyloliquefaciens o una especie de Bacillus que está estrechamente relacionada con el B. amyloliquefaciens. Una especie de Bacillus que está estrechamente relacionada con el B. amyloliquefaciens puede definirse como una especie que tiene una secuencia de ADNr 16S que comprende una SEQ ID NO: 26 o que comprende una secuencia de ADNr 16S que tiene al menos alrededor del 98 % o el 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:26. La PGPR que se usa en la invención reivindicada es el B. amyloliquefaciens subespecie plantarum. El B. amyloliquefaciens subespecie plantarum es una subespecie de B. amyloliquefaciens que coloniza las raíces de las plantas y presenta típicamente actividad amilasa. Las cepas de PGPR adecuadas para los métodos y composiciones descritos pueden incluir cepas de PGPR que tienen un gen gyrB que presenta identidad de secuencia con el gen gyrB de las cepas de Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum. En alguna modalidad, la cepa PGPR que se utiliza en los métodos y composiciones descritos, tiene un gen gyrB que tiene al menos alrededor del 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótidos de la SEQ ID NO:25, que es la secuencia de polinucleótidos del gen gyrB de las cepas de Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum.

Las cepas adecuadas de B. amyloliquefaciens subespecie plantarum para usar en las composiciones y métodos descritos pueden incluir Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AS43.3, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum TrigoCorl448, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum UCMB5033, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum UCMB5113, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum EBL11, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum W2, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum UCMB5036, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum IT-45, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum UASWS BA1, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum LFB 112, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CAUB946, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum M27, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B1895, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum SQR9, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AH159-1, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum DC-12, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum YAU B9601-Y2, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum Y2, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum EGD_AQ14, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum NAU-B3, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum CC178, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AP79, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AP71; Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum API 43, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum API 93, Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AB01, y Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum GB03.

Las cepas de PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir cepas de PGPR que expresen una o más proteínas asociadas con el metabolismo de la pectina. La cepa PGPR expresa una o más proteínas asociadas con el metabolismo de la pectina, que puede incluir proteínas codificadas por un gen seleccionado del grupo que consiste en uxaA (altronato deshidratasa), uxaB (altronato oxidorreductasa), uxaC (uronato isomerasa), uxaA (manonato deshidratasa, uxuB (D-manonato oxidorreductasa), kdgA (4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa), kdgK (2-deshidro-3-desoxigluconocinasa), exuR (represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato), exuT (transportador de hexuronato) y sus combinaciones. En algunas modalidades, la cepa PGPR expresa una o más enzimas pectinasas seleccionadas de un grupo que consiste de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, y pectina esterasa.

El gen uxaA codifica una enzima que es una altronato deshidratasa (EC:4.2.1.7) que convierte el D-altronato a 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato y agua. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese la altronato deshidratasa. La SEQ ID NO:1 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la altronato deshidratasa. La SEQ ID NO:2 proporciona la secuencia de aminoácidos para la altronato deshidratasa.

El gen uxaB codifica una enzima que es una altronato oxidorreductasa (EC:5.3.1.12) que convierte el D-altronato y el NAD+ a D-tagaturonato y NADH. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese la altronato oxidorreductasa. La SEQ ID NO:3 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la altronato oxidorreductasa. La SEQ ID NO:4 proporciona la secuencia de aminoácidos para la altronato oxidorreductasa.

El gen uxaC codifica una enzima que es una uronato isomerasa (EC: 1.3.1.12) que convierte el D-glucuronato a D-fructuronato y que convierte el D-galacturonato a D-tagaturonato. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese uronato isomerasa. La SEQ ID NO:5 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la altronato oxidorreductasa. La SEQ ID NO:6 proporciona la secuencia de aminoácidos para la altronato oxidorreductasa.

El gen uxuA codifica una enzima que es una manonato deshidratasa (EC:4.2.1.8) que convierte el D-manonato a 2-deshidro-3-desoxi-D-gluconato. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese manonato deshidratasa. La SEQ ID NO:7 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la manonato deshidratasa. La SEQ ID NO:8 proporciona la secuencia de aminoácidos para la manonato deshidratasa.

El gen uxuB codifica una enzima que es una D-manonato oxidorreductasa (EC: 1.1.1.57) que convierte el D-manonato y el NAD+ a D-fructuronato y NADH. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese D-manonato oxidorreductasa. La SEQ ID NO:9 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la altronato oxidorreductasa. La SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de aminoácidos para la altronato oxidorreductasa.

El gen kdgA codifica una enzima que es una 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16) que convierte el 4-hidroxi-2-oxoglutarato a piruvato y glioxilato, y que convierte el 2-deshidro-3-desoxi-6-fosfato-D-gluconato a piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa. La SEQ ID NO: 11 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa. La SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de aminoácidos para la 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa.

El gen kdgK codifica una enzima que es la 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa (EC 2.7.1.45) que fosforila el 2-ceto-3-desoxigluconato (KDG) para producir el 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato (KDPG). Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa. La SEQ ID NO: 13 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para la 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa. La SEQ ID NO: 14 proporciona la secuencia de aminoácidos para la 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa.

El gen exuR codifica un represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese un represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato. La SEQ ID NO: 15 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para un represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato. La SEQ ID NO: 16 proporciona la secuencia de aminoácidos para un represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato.

El gen exuT codifica un transportador de hexuronato que muestra actividad de transportador transmembrana de hexuronato. Por lo tanto, las cepas PGPR y los inoculantes de las mismas adecuados para los métodos y las composiciones descritos en la presente descripción pueden incluir una cepa PGPR que exprese un transportador de hexuronato. La SEQ ID NO: 17 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para un transportador de hexuronato. La SEQ ID NO: 18 proporciona la secuencia de aminoácidos para un transportador de hexuronato.

En algunas modalidades, la cepa PGPR puede expresar una o más enzimas pectinasas seleccionadas de un grupo que consiste de pectina liasa (EC 4.2.2.10), pectato liasa (EC 4.2.2.2), poligalacturonasa (EC 3.2.1.15), y pectina esterasa (EC 3.1.1.11). La SEQ ID NO:19 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para un precursor de la pectato liasa. La SEQ ID N0:20 proporciona la secuencia de aminoácidos para un precursor de la pectato liasa. La SEQ ID NO:21 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para una proteína similar a la pectina liasa. La SEQ ID NO:22 proporciona la secuencia de aminoácidos para una proteína similar a la pectina liasa. La SEQ ID NO:23 proporciona la secuencia de polinucleótidos que codifica para una pectina liasa. La SEQ ID NO:24 proporciona la secuencia de aminoácidos para una pectina liasa.

El "porcentaje de identidad de secuencia" puede determinarse por el alineamiento de dos secuencias de longitud equivalente mediante el uso de la herramienta de búsqueda de alineamiento local básico (BLAST) disponible en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (es decir, "bl2seq" como se describió en Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-25. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre la SEQ ID NO: 1 y otra secuencia para comparar puede determinarse por el alineamiento de estas dos secuencias mediante el uso del programa BLAST en línea que se proporciona en el sitio web de NCBI.

El "porcentaje de identidad de secuencia" entre dos secuencias de desoxirribonucleótidos también puede determinarse mediante el uso del modelo de distancia de 2 parámetros de Kimura que corrige para múltiples aciertos, que toma en cuenta las velocidades de sustitución transicionales y transversales, mientras que asume que las cuatro frecuencias de nucleótidos son iguales y que las velocidades de sustitución no varían entre los sitios (Nei y Kumar, 2000) como se implementó en el programa MEGA 4 versión 4.0. (Tamura K, Dudley J, Nei M & Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599), preferentemente versión 4.0.2 o superior. Las penalizaciones por abertura de espacios y extensión se establecen en 15 y 6,66 respectivamente. Los espacios terminales no se penalizan. El conmutador de secuencias divergentes de retardo se establece en 30. La puntuación de peso de la transición es de 35 a 0,5, como un equilibrio entre una falta de coincidencia completa y una puntuación de un par coincidente. La matriz de peso de ADN usada es la matriz de puntuación de IUB, donde x y n son coincidencias con cualquier símbolo de ambigüedad de IUB, y todas las coincidencias puntúan 1,9, y todas las faltas de coincidencias puntúan O.

Pectina y sacáridos relacionados con la pectina

Las composiciones y los métodos descritos incluyen o utilizan pectina o azúcares derivados de la pectina con el fin de mejorar la eficacia de las PGPR con respecto a la promoción del crecimiento y la salud de las plantas. La "pectina" es un heteropolisacárido que se encuentra de forma nativa en las paredes celulares primarias de las plantas terrestres, que tiene un peso molecular típico de 60-130 000 g/mol, que varía en base al origen de la pectina y las condiciones de extracción. Como se usa en la presente, "pectina" incluye la pectina extraída que se ha extraído de su condición nativa (por ejemplo, pectina extraída de las paredes celulares primarias de las plantas terrestres).

La pectina o los sacáridos relacionados con la pectina utilizados en la composición y los métodos descritos pueden aislarse o sustancialmente purificarse. Los términos "aislado" o "sustancialmente purificado" se refieren a la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina que se han eliminado de un ambiente natural y se han aislado o separado, y tienen al menos un 60 % libre, preferentemente al menos un 75 % libre, y con mayor preferencia al menos 90 % libre, aún con mayor preferencia al menos 95 % libre, y con la máxima preferencia al menos 100 % libre de otros componentes con los que estaban asociados naturalmente, cuyos otros componentes pueden incluir la celulosa.

Aunque la composición de la pectina puede variar entre las plantas, la pectina típicamente tiene una composición en la que el ácido D-galacturónico es el principal constituyente monomérico (es decir, típicamente el ácido D-galacturónico representa >50 % de los componentes monoméricos de la pectina). Los residuos D-galacturónicos de la pectina pueden sustituirse opcionalmente con D-xilosa o D-apiosa para formar xilogalacturonano y apiogalacturonano, respectivamente, ramificándose a partir de un residuo de ácido D-galacturónico. Las llamadas "pectinas ramnogalacturonanos" contienen una cadena principal de disacáridos repetidos de ácido D-galacturónico y L-ramnosa.

En la naturaleza, la mayoría de los grupos carboxilo del ácido galacturónico en la pectina están esterificados con metanol (es decir, >50 % y hasta el 80 % de los grupos carboxilo del ácido galacturónico en la pectina están esterificados con metanol). Durante la extracción, este porcentaje puede disminuir donde la extracción puede resultar en la hidrólisis del enlace éster, y las pectinas extraídas pueden categorizarse como pectinas con alto contenido de éster frente a bajo contenido de éster, que tienen <50 % de los residuos de ácido galacturónico esterificados. Las unidades de ácido galacturónico no esterificado pueden ser ácidos libres (es decir, grupos carboxilo) o sales con sodio, potasio, o calcio (es decir, sales de galacturonato).

En la naturaleza, el ácido D-galacturónico puede sintetizarse a partir de los derivados del ácido D-gluconórico (por ejemplo, a partir del UDP-D-glucuronato a través de la 4-epimerización) y a la inversa, el ácido D-galacturónico en la pectina puede metabolizarse para formar derivados del ácido D-gluconórico (por ejemplo, 5-deshidro-4-desoxi-D-glucuronato a través de la lisis del oligogalacturonato). Como se usa en la presente, los sacáridos relacionados con la pectina incluyen los sacáridos derivados de la pectina tales como pectina hidrolizada, ácido D-galacturónico (o sales de D-galacturonato), y ácido D-gluconórico (o sales de D-gluconorato), o sus combinaciones.

Las composiciones y los métodos descritos en la presente descripción incluyen o utilizan un sacárido que es un sustrato para una enzima o un transportador codificado por un gen que se selecciona del grupo que consiste en uxaA (altronato deshidratasa), uxaB (altronato oxidorreductasa), uxaC (uronato isomerasa), uxuA (manonato deshidratasa), uxuB (D-manonato oxidorreductasa), kdgA (4- hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa), kdgK (2-deshidro-3-desoxigluconocinasa), exuR (represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato), exuT (transportador de hexuronato) y sus combinaciones. Las composiciones y los métodos descritos en la presente descripción pueden incluir o utilizar un sacárido que es un sustrato para una enzima pectinasa. (por ejemplo, una enzima pectinasa que se selecciona de un grupo que consiste de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, y pectina esterasa).

Los sacáridos pueden derivarse de la pectina, tal como el D-galacturonato y el D-glucuronato. El sacárido puede comprender una mezcla de azúcares o el sacárido puede comprender un heteropolisacárido. En modalidades en las que el sacárido es una mezcla heterogénea de azúcares o el sacárido es un heteropolisacárido, preferentemente las unidades monoméricas de D-galacturonato, las unidades monoméricas de D-glucuronato, o la suma de las unidades monoméricas de D-galacturonato y las unidades monoméricas de D-glucuronato representan >50 %, >60 %, >70 %, >80 %, >90 %, o >95 % de las unidades monoméricas totales en la mezcla heterogénea de azúcares o del heteropolisacárido.

La pectina y las sustancias relacionadas con la pectina descritas pueden incluir pectina sintética. La pectina sintética puede incluir pectina sintetizada por la polimerización de monómeros de pectina (por ejemplo, ácido urónico) in vitro para formar una sustancia similar a la pectina denominada pectina sintética. (Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 2,156,223. Además, la pectina y las sustancias relacionadas con la pectina descritas pueden incluir ácidos poliurónicos de origen natural y no natural.

Inoculantes

Las PGPR descritas actualmente se formulan como un inoculante para una planta. El término "inoculante" significa una preparación que incluye un cultivo aislado de una PGPR y opcionalmente un portador. Los inoculantes que comprenden la PGPR y los portadores se conocen en la técnica. (Ver, por ejemplo, Bashan, "Inoculants of Plant Growth-Promoting Bacteria for use in Agriculture," Biotechnology Advances, Vol. 16, No. 4, pp. 729-770, 1998). Los inoculantes de PGPR pueden administrarse a las plantas (por ejemplo a las raíces de las plantas), a las semillas (por ejemplo, como un recubrimiento para la semilla o en el momento en que se planta la semilla), o al suelo (por ejemplo, al suelo que rodea a las plantas a tratar).

Un inoculante de PGPR puede describirse como una formulación que contiene una o más especies de PRPR en un material portador, que puede ser un portador orgánico, un portador inorgánico, o un portador sintetizado a partir de moléculas definidas. Opcionalmente, el portador puede estar estéril o esterilizarse antes de formularse con la PGPR para formar el inoculante de PGPR. Preferentemente, el portador no es tóxico, es biodegradable y no contaminante. En los inoculantes descritos que comprenden un sacárido de pectina, el sacárido de pectina puede funcionar opcionalmente como un portador u, opcionalmente, los inoculantes pueden comprender un portador distinto del sacárido de pectina.

El portador del inoculante de PGPR es el vehículo de suministro de la PGPR viva a la planta, las semillas o el suelo. El portador representa la mayor porción en volumen o peso del inoculante. Los portadores adecuados pueden incluir líquidos, polvos (porejemplo, que tienen un diámetro promedio de partícula efectivo de 0,075 a 0,25 mm), granulados (porejemplo, que tienen un diámetro promedio de partícula efectivo de 0,35 a 1,18 mm), y suspensiones que tienen la capacidad de suministrar un número suficiente de células de PGPR viables a la planta, a las semillas o al suelo. Preferentemente, el portador extiende la vida útil de la PGPR (por ejemplo, de manera que la PGPR tenga una vida útil de al menos 1 o 2 años a temperatura ambiente). Los ejemplos de portadores incluyen turba, carbón, arcillas, material inorgánico de suelo, materiales de desecho de las plantas, composta, estiércol de corral, harina de soja, aceite de soja, aceite de cacahuete, salvado de trigo, materiales inertes tal como vermiculita, perlita, fosfato, poliacrilamida, perlas de alginato, bacterias secadas al aceite. En algunas modalidades, la PGPR puede estar encapsulada por un portador, por ejemplo, donde el portador es un carbohidrato que forma una matriz alrededor de la PGPR.

El inoculante incluye una cantidad adecuada de la PGPR con relación al portador. En algunas modalidades, el inoculante incluye 102-1012 ufc de PGPR por mL de portador (o por gramo de portador), o 104-1010 ufc de PGPR por mL de portador (o por gramo de portador), o 106-108 ufc de PGPR por mL de portador (o por gramo de portador). La composición puede incluir aditivos adicionales que incluyen agentes reguladores, surfactantes, adyuvantes, o agentes de recubrimiento.

La PGPR utilizada en la composición y los métodos descritos puede aislarse o sustancialmente purificarse. Los términos "aislado" o "sustancialmente purificado" se refieren a las PGPR que se han eliminado de un ambiente natural y se han aislado o separado, y que están al menos en un 60 % libres, preferentemente al menos un 75 % libres y con mayor preferencia al menos un 90 % libres, aún con mayor preferencia al menos 95 % libres, y con la máxima preferencia al menos 100 % libres de otros componentes con los que estaban naturalmente asociados. Un "cultivo aislado" se refiere a un cultivo de la PGPR que no incluye cantidades significativas de otros materiales tales como otros materiales que normalmente se encuentran en el suelo en el que crece la PGPR y/o del que normalmente puede obtenerse la PGPR. Un "cultivo aislado" puede ser un cultivo que no incluye cualquiera otra especie biológica, microorganismo, y/o bacteria en cantidades suficientes para interferir con la replicación del "cultivo aislado". Los cultivos aislados de PGPR pueden combinarse para preparar un cultivo mixto de PGPR.

Métodos de tratamiento de plantas, semillas o suelo

También se describen los métodos de uso de la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para mejorar la eficacia de la PGPR con respecto a la promoción del crecimiento o la salud en las plantas. Los métodos descritos pueden incluir la administración de los inoculantes descritos más arriba que comprenden una PGPR y un sacárido de pectina a las plantas, las semillas o el suelo. Los métodos para mejorar el crecimiento o la salud de las plantas comprenden: (a) tratar las plantas, las semillas, o el suelo con una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina que se selecciona de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, pectina esterasa, altronato deshidratasa, altronato oxidorreductasa, uronato isomerasa, manonato deshidratasa, D-manonato oxidorreductasa, 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa, represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato, transportador de hexuronato, y sus combinaciones, y (b) tratar las plantas, las semillas, o el suelo con un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina {por ejemplo, pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato o las sus mezclas), en donde la PGPR es el Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum, y donde las plantas, las semillas, o el suelo pueden tratarse con la PGPR y el sacárido simultáneamente o en cualquier orden (es decir, la PGPR puede administrarse antes, simultáneamente con, o después que se administra el sacárido). La PGPR y el sacárido de pectina pueden formularse como un inoculante y administrarse simultáneamente para tratar las plantas (por ejemplo, se administra a las raíces de las plantas), a las semillas (por ejemplo, como un recubrimiento para las semillas), o al suelo (por ejemplo, como una enmienda al suelo).

Los métodos descritos pueden utilizarse para mejorar el crecimiento o la salud de las plantas al controlar las plagas del suelo. Las plagas del suelo controladas por los métodos descritos pueden incluir nemátodos e insectos herbívoros. Los métodos descritos pueden utilizarse para mejorar el crecimiento o la salud de las plantas al controlar o tratar una enfermedad. Las enfermedades controladas o tratadas por los métodos descritos pueden incluir una enfermedad bacteriana, una enfermedad fúngica, y una enfermedad viral.

La PGPR y el sacárido de pectina descritos actualmente pueden administrarse como un inoculante para el tratamiento de las plantas. Los métodos de tratamiento contemplados en la presente descripción pueden incluir el tratamiento de una planta directamente, que incluye el tratamiento de las hojas, los tallos, o las raíces de la planta directamente. Los métodos de tratamiento contemplados en la presente descripción pueden incluir el tratamiento de las semillas de la planta, por ejemplo, el recubrimiento de las semillas antes de que se planten para producir una planta tratada. Los métodos contemplados en la presente descripción también pueden incluir el tratamiento de una planta indirectamente, por ejemplo, al tratar el suelo o el ambiente que rodea la planta (por ejemplo, aplicaciones granulares o líquidas en el surco). Los métodos de tratamiento adecuados pueden incluir la aplicación de un inoculante que incluye la PGPR y el sacárido a través de la pulverización a alta o baja presión, la inundación y/o la inyección. Las semillas de las plantas pueden tratarse por la aplicación de la pulverización a baja o alta presión, el recubrimiento, la inmersión, y/o la inyección. Después que las semillas de las plantas se han tratado de esta manera, las semillas pueden plantarse y cultivarse para producir plantas. Las plantas propagadas a partir de tales semillas pueden tratarse adicionalmente con una o más aplicaciones. Las concentraciones adecuadas de aplicación pueden determinarse empíricamente. En algunas modalidades donde la PGPR y el sacárido de pectina se aplican como una pulverización a las plantas, las concentraciones adecuadas de aplicación pueden incluir la pulverización de 106-1018 unidades formadoras de colonias (ufc) por hectárea de plantas, más comúnmente de 107-1015 ufc por hectárea. Para las semillas recubiertas, en algunas modalidades, las concentraciones adecuadas de aplicación pueden estar entre 102-108 ufc por semilla, preferentemente de 104-107 ufc por semilla. En otras modalidades, la PGPR y el sacárido de pectina pueden aplicarse como una inmersión de las raíces de las plántulas o como una inundación del suelo a una concentración de alrededor de 102-1012 ufc/mL, 104-1010 ufc/mL, o alrededor de 106 108 ufc/mL.

Métodos para la preparación de las composiciones y los inoculantes descritos

En la presente descripción se describen los métodos de uso de la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para preparar las composiciones y los inoculantes como se describe en la presente descripción. Los métodos pueden incluir la combinación de PGPR y pectina, que se ha extraído del material de la planta que contiene pectina, o los sacáridos relacionados con la pectina para preparar las composiciones y los inoculantes descritos. Opcionalmente, un portador puede combinarse con la PGPR y la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina para preparar las composiciones y los inoculantes descritos.

Los métodos pueden incluir la combinación de 102-1012 ufc de PGPR por mL de portador (o por gramo de portador), o 104-1010 ufc de PGPR por mL de portador (o por gramo de portador), o 106-108 ufc de PGPR por mL de portador (o por gramo de portador). Los métodos pueden incluir la combinación de pectina, que se ha extraído del material de la planta que contiene pectina, o los sacáridos relacionados con la pectina que pueden combinarse con la PGPR y, opcionalmente un portador, para preparar las composiciones y los inoculantes descritos, en donde la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina están presentes en las composiciones y los inoculantes preparados a una concentración de al menos alrededor de 0,1 %, 0,5 %, 1,0 %, 1,5 %, o 2,0 % (p/p o p/v) a aproximadamente 0,5 %, 1,0 %, 1,5 %, 2,0 %, o 5,0 % (p/p o p/v). Los métodos pueden incluir la combinación de la PGPR y la pectina a una concentración de aproximadamente al menos aproximadamente 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, o 1014 ufc de PGPR por gramo de pectina o los sacáridos relacionados con la pectina, a aproximadamente 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1013, 1014, 1015 ufc de PGPR por gramo de pectina o los sacáridos relacionados con la pectina {por ejemplo, intervalos tales como de 107 a 1012 ufc de PGPR por gramo de pectina o los sacáridos relacionados con la pectina que se contemplan en la presente descripción). En los métodos, los aditivos adicionales que incluyen los agentes reguladores, los surfactantes, los adyuvantes, y los agentes de recubrimiento pueden combinarse con la PGPR, la pectina o los sacáridos relacionados con la pectina, y el portador opcional con el fin de preparar las composiciones y los inoculantes descritos.

Las composiciones y los inoculantes preparados por los métodos descritos más arriba, también se contemplan en la presente descripción.

EJEMPLOS

Los ejemplos siguientes son ilustrativos y no pretenden limitar el alcance del contenido reivindicado. Se hace referencia a Hossain y otros, "Deciphering the conserved genetic loci implicated in plant disease through comparative genomics of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum strains," Frontiers in Plant Science, 2015 Aug 17;6:631 doi:

10.3389/fpls.2015.00631. Colección electrónica 2015, (en lo sucesivo a la que se hace referencia como, "Hossain y otros, Frontiers Plant Science 2015).

Ejemplo 1: Descifrar los loci genéticos conservados implicados en la enfermedad de la planta a través de la genómica comparativa de la cepa Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum

Resumen

Para comprender las actividades de promoción del crecimiento y de inhibición de enfermedades de las cepas de rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR), se secuenciaron y analizaron los genomas de 12 cepas del grupo Bacillus subtilis con actividad de PGPR. Estas cepas de B. subtilis mostraron una alta diversidad genómica, mientras que los genomas de las cepas B. amyloliquefaciens (un miembro del grupo B. subtilis) están altamente conservadas. Una matriz BLASTp por pares reveló que la similitud de la familia de genes entre los genomas Bacillus varían de 32- 90 %, con 2,839 genes dentro del genoma del núcleo de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Los análisis genómicos comparativos de las cepas B. amyloliquefaciens identificaron genes que están vinculados con el control biológico y la colonización de las raíces y/o las hojas, que incluye 73 genes asociados de forma única con las cepas de la subespecie plantarum que tienen funciones predichas relacionadas con la señalización, el transporte, la producción de metabolitos secundarios, y la utilización de fuentes de carbono. Aunque las cepas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum contienen clúster de genes que codifican muchos metabolitos secundarios diferentes, solo los clúster biosintéticos de policétidos que codifican la dificidina y la macrolactina se conservan dentro de esta subespecie. Para evaluar su papel en el biocontrol de los patógenos en las plantas, los genes implicados en la biosíntesis de los metabolitos secundarios se eliminaron en la cepa B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, revelando que la expresión de dificidina es crítica en la reducción de la severidad de la enfermedad, causada por Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria en las plantas de tomate. Este ejemplo define las características genómicas de las cepas PGPR y las vincula con la actividad de biocontrol y con la colonización del hospedador.

Introducción

Las bacterias asociadas con las raíces de las plantas que ejercen efectos beneficiosos sobre el crecimiento y el desarrollo de las plantas se denominan rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) (Kloepper y Schroth, 1978; Kloepper y otros, 2004). Los Bacillus y las Pseudomonas spp. son predominantes entre los diversos géneros bacterianos que se han vinculado con la actividad PGPR (Podile y Kishore, 2006). Los miembros del grupo B. subtilis, que incluyen B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. mojavensis, B. vallismortis, B. sonorensis, y B. tequilensis se han identificado como cepas PGPR por su capacidad para estimular el crecimiento de las plantas y suprimir los patógenos dentro de la rizosfera y la filosfera (Kloepper y otros, 2004; Hao y otros, 2012; Kim y otros, 2012). Las cepas de B. amyloliquefaciens se usan ampliamente por sus efectos positivos sobre el crecimiento de las plantas (Idriss y otros, 2002). Reva y otros. (Reva y otros, 2004) reportaron que siete Bacillus aislados de plantas o del suelo están estrechamente relacionados pero son distintos del tipo de cepa B. amyloliquefaciens DSM7T. Además, estas cepas son más competentes para la colonización de la rizosfera que otros miembros del grupo B. subtilis. GB03 (Nakkeeran y otros, 2005), INR7 (Kokalis-Burelle y otros, 2002) y FZB42 (Chen y otros, 2007a) son cepas PGPR dentro del grupo Bacillus subtilis que se han usado ampliamente en diferentes formulaciones comerciales para promover el crecimiento de las plantas.

Además de promover el crecimiento de las plantas, las cepas PGPR pueden mostrar un control biológico de las enfermedades de las plantas. La antibiosis, a través de la producción de compuestos bioactivos inhibidores, y la resistencia sistémica inducida son mecanismos de control biológico ampliamente reportados de la cepa PGPR del Bacillus spp. (Ryu y otros, 2004). Las cepas PGPR Bacillus spp. producen diversos compuestos antimicrobianos que incluyen antibióticos (Emmert y otros, 2004), compuestos orgánicos volátiles (COV) (Yuan y otros, 2012), y lipopéptidos (Ongena y otros, 2007) que están asociados con la actividad de biocontrol observada contra los patógenos en las plantas. Por ejemplo, el B. amyloliquefaciens NJN-6 produce 11 COV que proporcionan una actividad antifúngica contra el Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Yuan y otros, 2012). De manera similar, las cepas B. subtils producen lipopéptidos (porejemplo surfactina y fengicina), que inducen la resistencia sistémica en las plantas de frijoles (Ongena y otros, 2007). Las cepas PGPR generalmente necesitan colonizar extensamente las raíces de las plantas para ejercer los efectos promotores del crecimiento de las plantas mediante el uso de mecanismos tanto directos como indirectos (Lugtenberg y Kamilova, 2009), no se requiere una colonización extensa de las raíces para la resistencia sistémica inducida (RSI) (Kamilova y otros, 2005). En algunas cepas PGPR, la colonización de las raíces es un prerrequisito para la actividad de biocontrol a través de la antibiosis (Chin y otros, 2000). Por ejemplo, el B. amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 ejerce las actividades de promoción del crecimiento a través de una colonización eficiente de las raíces de las plantas (Fan y otros, 2011). Previamente, se ha demostrado que la sobreexpresión de los genes involucrados en la fosforilación de DegU, un regulador de la respuesta de dos componentes de la cepa B. amyloliquefaciens SQR9, influye positivamente en la colonización de las raíces, así como también en otras actividades promotoras del crecimiento de las cepas PGPR para controlar la enfermedad de la marchitez del pepino (Xu y otros, 2014). Además, la capacidad de colonización de las raíces de un colonizador de raíces deficiente puede mejorarse por la clonación de los genes que se requieren para una colonización eficiente de las raíces (Dekkers y otros, 2000). La colonización competitiva de las raíces por la PGPR está controlada por muchos genes y/o clúster genéticos (Dietel y otros, 2013), por lo que la identificación de estos loci genéticos involucrados en la colonización competitiva de las raíces es un desafío si faltan secuencias genómicas para esas cepas PGPR (Lugtenberg y Kamilova, 2009). El análisis de las cepas PGPR adicionales ayudará a dilucidar los mecanismos de la colonización competitiva de las raíces, la antibiosis y la RSI de las cepas PGPr y formará una base para la ingeniería genética y otras estrategias para aumentar la capacidad promotora del crecimiento de las plantas de estas bacterias.

En este Ejemplo, secuenciamos los genomas de 12 grupos de Bacillus subtilis aislados de diversos lugares. Análisis genómico comparativo de las cepas PGPR y las cepas de control del grupo B. subtilis sin ninguna actividad de biocontrol reportada contra los patógenos de las plantas que proporciona información sobre las características genómicas involucradas en la actividad de la PGPR. La cepa PGPR AP193, que inhibe el crecimiento de los patógenos bacterianos de las plantas y los animales (Ran y otros, 2012), es un candidato ideal para evaluar la contribución relativa de los genes que se predice que están involucrados en la biosíntesis de los metabolitos secundarios bioactivos que podrían contribuir a la actividad de biocontrol, específicamente la dificidina (mutante djhD), la surfactina (mutantes rfAA), así como también todos los policétidos y lipopéptidos producidos por la síntesis no ribosomal de péptidos, que incluye la dificidina (mutante sfp). Los mutantes se probaron entonces para determinar su capacidad para inhibir los patógenos de las plantas. in vitro y controlar la enfermedad de las manchas bacterianas en el tomate.

Materiales y métodos

Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento. Las cepas bacterianas y los plásmidos usados en este Ejemplo se enumeran en la Tabla 1. Las cepas de E. coli y Bacillus se cultivaron en el medio Luria-Bertani (LB); sin embargo, para la preparación de las células electrocompetentes, el Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum AP193 se cultivó en el medio NCM (17,4 g de K2HPO4, 11,6 g de NaCl, 5 g de glucosa, 5 g de triptona, 1 g de extracto de levadura, 0,3 g de citrato trisódico, 0,05 g de MgSC>4-7H20 y 91,1 g de sorbitol en 1 L de agua desionizada, pH 7,2). Para la producción de los metabolitos secundarios, los cultivos de Bacillus se hicieron crecer durante 48 h a 30 °C en caldo de soja tríptico (TSB). Además, la ampicilina (100 pg/mL), el cloranfenicol (12,5 pg/mL) o la eritromicina (200 pg/mL para E. coli o 5 pg/mL para Bacillus) se usaron como agentes selectivos en los medios de crecimiento como se requirió.

Secuenciación, ensamblaje y anotación. La secuenciación de la próxima generación del genoma del Bacillus spp. se realizó mediante el uso de las plataformas de secuenciación Illumina y Roche 454. Se prepararon bibliotecas indexadas de Illumina para las cepas AP71, AP79 y AB01 mediante el uso del estuche de preparación de muestras de ADN de Nextera (Epicentre, Madison, WI) y las secuencias se generaron mediante el uso de un estuche de secuenciación de extremos emparejados de 2 x 250 MiSeq de Illumina. Las bibliotecas de Illumina con código de barras para las cepas AP143, AP193 y AP254 se construyeron mediante el uso de un estuche de preparación de muestras de ADN NxSeq® (Lucigen, Middleton, WI) y se secuenciaron en EnGenCore (Univ. de Carolina del Sur) mediante el uso de la plataforma de pirosecuenciación 454. La construcción y secuenciación de las bibliotecas de ADN genómico para el Bacillus subtilis GB03, el Bacillus pumilus INR7, el B. mojavensis KCTC 3706T, el B. tequilensis KCTC 13622T, el Bacillus siamensis KCTC 13613T y el B. sonorensis KCTC 13918T se llevaron a cabo en el Centro Nacional de Instrumentos para la Gestión Ambiental (Seúl, República de Corea), mediante el uso de la plataforma de secuenciación Illumina HiSeq 2000. Las lecturas de secuencia se recortaron por la calidad y luego se ensamblaron de novo mediante el uso del CLC Genomics Workbench (CLCBio, Cambridge, MA). La predicción y la anotación de los genes se realizaron mediante el uso de GeneMark (Lukashin y Borodovsky, 1998) y el servidor de anotaciones RAST (Aziz y otros, 2008), respectivamente. La identidad de los marcos de lectura abiertos individuales (ORF) de los clúster de genes de la biosíntesis de los metabolitos secundarios se confirmó por BLASTx contra la base de datos del GenBank. Las lecturas de la secuencia del genoma para las cepas AB01, AP71, AP79, AP143, AP193, AP254, GB03 (Choi y otros, 2014), INR7 (Jeong y otros, 2014), KCTC 3706T, KCTC 13613T (Jeong y otros, 2012), KCTC 13918T, y KCTC 13622T se depositaron en el Archivo de lectura corta (SRA) en NCBI bajo los números de acceso SRR1176001, SRR1176002, SRR1176003, SRR1176004, SRR1176085, y SRR1176086, SRR1034787, SRR1141652, SRR1141654, SRR1144835, SRR1144836, y SRR1144837, respectivamente.

Determinación del promedio de la identidad de nucleótidos. Los promedios de las identidades de nucleótidos (ANI) entre los genomas se calcularon mediante el uso de una calculadora ANI que estima el ANI de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Goris y otros, 2007).

Análisis filogenético de las especies Bacillus. Para el análisis filogenético, se recuperó de los datos de la secuencia, la secuencia del gen gyrB para cada cepa (en la Figura 1 se presenta una lista de las 25 cepas). Las cepas AS43.3, FZB42, YAU B9601-Y2, CAU b 946, y 5B6 se usaron como cepas representativas del B. amyloliquefaciens subsp. plantarum; las cepas DSM7, LL3 y TA208 se usaron como cepas representativas del B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens. El árbol filogenético gyrB se infirió con MEGA5.05 (Tamura y otros, 2011) mediante el uso de los métodos Neighbor-Joining (Saitou y Nei, 1987) y de Máxima Posibilidad (ML) (Felsenstein, 1981). Todas las posiciones que contenían espacios o datos faltantes se eliminaron del conjunto de datos final, lo que resultó en las posiciones de 1911 pb de la secuencia gyrB. Usamos 729,383 pb de ADN para representar el genoma conservado del núcleo que se encuentra en 25 cepas del grupo B. subtilis, para generar un árbol filogenómico mediante el uso de RAxML (v 7.2.7) (Pfeiffer y Stamatakis. 2010). El árbol filogenómico se visualizó entonces con iTOL (http://itol.embl.de) (Letunic y Bork, 2011).

Matriz BLAST. El algoritmo de la matriz BLAST se usó para la comparación por pares del proteoma de la cepa PGPR del Bacillus, mediante el uso de los métodos descritos anteriormente (Friis y otros, 2010). La matriz BLAST determina el porciento promedio de similitud entre los proteomas al medir la relación de las familias de genes conservados compartidos entre las cepas con el número total de las familias de genes dentro de cada cepa. El número absoluto de las familias de genes combinados y compartidos por cada cepa se mostró en la salida de la matriz. Esta matriz muestra el número de proteínas compartidas entre cada proteoma.

Análisis del genoma del núcleo. El genoma del núcleo de las 13 cepas de Bacillus spp. se generó mediante el uso de secuencias codificantes y no codificantes. Las secuencias del genoma completo de estas cepas se alinearon mediante el uso del Mauve progresivo (Darling y otros, 2004), que identifica y alinea los bloques localmente colineales (LCB) en el formato XMFA. Los LCB de las alineaciones se colectaron mediante el uso de stripSubsetLCBs (http://gel. ahabs.wisc.edu/mauve/snapshots/), mediante el uso de longitudes mínimas de 500 pb. Todos los LCB se concatenaron y se convirtieron al formato multifasta mediante el uso de un script Perl. El mismo protocolo se usó para obtener todas las secuencias del núcleo, con la excepción de que las longitudes mínimas de los LCB fueron de 50 pb, en lugar de 500 pb. El genoma del núcleo del Bacillus spp. se obtuvo a partir del alineamiento comparativo de todos los genomas completos del Bacillus spp. disponibles en el GenBank a partir de agosto de 2014 (n=81 genomas). El genoma del núcleo del grupo B. subtilis se obtuvo a partir del análisis comparativo de 53 genomas completos de las cepas B. subtilis que incluían 41 genomas obtenidos a partir del GenBank y 12 genomas secuenciados de PGPR en este Ejemplo. Los genomas a nivel de especie de B. amyloliquefaciens y los genomas a nivel de núcleo de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum- se generaron a partir de 32 genomas de B. amyloliquefaciens y 28 de subsp. plantarum. Los genomas del núcleo se exportaron al CLC Genomics Workbench (v 4.9) para la evaluación de los alineamientos y las anotaciones mediante el uso del servidor RAST (Aziz y otros, 2008). La lista de las cepas Bacillus spp. usadas para la determinación del genoma del núcleo se proporcionan en la Tabla 2. Adicionalmente, para identificar los genes del núcleo específicos de GPR, las lecturas de la secuencia sin procesar de las cepas PGPR secuenciadas en este Ejemplo se mapearon secuencialmente como referencia contra la secuencia del genoma de la cepa no PGPR B. subtilis subsp. subtilis str. 168 de acuerdo con los métodos descritos anteriormente (Hossain y otros, 2013).

Identificación de los genes del núcleo presentes de forma única en las cepas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Las secuencias del genoma alineadas de 32 cepas B. amyloliquefaciens y 28 cepas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum (que se incluyen dentro de las cepas B. amyloliquefaciens) se analizaron mediante el uso de CLC Genomics Workbench para obtener los respectivos genomas del núcleo a nivel de especie y subespecie. Lecturas de las secuencias recortadas de la subespecie.

La cepa plantarum AP193 se mapeó como referencia contra el genoma del núcleo de la subsp. plantarum para obtener las lecturas de las secuencias específicas del genoma del núcleo. Los parámetros del mapeo de referencia fueron los siguientes: costo de no coincidencia =2, costo de inserción =3, costo de deleción =3, fracción de longitud =0,5, y similitud = 0,8. Las lecturas de las secuencias mapeadas del genoma del núcleo de la subsp. plantarum entonces se mapearon contra el genoma del núcleo de la especie amyloliquefaciens para obtener las lecturas de las secuencias no mapeadas. Estas lecturas de las secuencias no mapeadas, representativas del genoma del núcleo de la subsp. plantarum que está ausentes en el genoma del núcleo a nivel de especie amyloliquefaciens, se ensamblaron de novo mediante el uso de CLC Genomics Workbench, a continuación los cóntigos resultantes se cargaron a RAST para la predicción de los genes y la anotación. Cada ORF, codificada exclusivamente por el genoma del núcleo plantarum, se confirmó además su singularidad mediante el uso del análisis BLASTn contra las secuencias del genoma de 28 cepas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum y cuatro cepas B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens enumeradas en la Tabla 1 complementaria.

Predicción de los clúster de genes de la biosíntesis de metabolitos secundarios en la cepa PGPR AP193. Los clúster de genes de la biosíntesis de metabolitos secundarios para la cepa AP193 se predijeron mediante el uso de la herramienta de identificación de metabolitos secundarios antiSMASH (Blin y otros, 2013). La PCR en etapas con cebadores se usó para llenar los espacios entre los cóntigos que contienen los clúster de genes que codifican la biosíntesis de metabolitos secundarios. La predicción de genes y la anotación se llevaron a cabo por GeneMark (Lukashin y Borodovsky, 1998) y BLASTx (NCBI), respectivamente.

Manipulación de ADN y construcción de plásmidos para la mutagénesis de la cepa PGPR AP193. El ADN cromosómico se aisló con el estuche de aislamiento de ADN bacteriano E.Z.N.A. (Omega Biotek, Atlanta, GA) y los plásmidos se aislaron con el mini estuche para plásmidos E.Z.N.A. II (Omega Biotek). Los cebadores usados en este Ejemplo se enumeran en la Tabla 2. Las construcciones de eliminación de genes se ensamblaron mediante el uso de empalmes a través del solapamiento de la extensión de PCR (Horton y otros, 1989). Los productos ensamblados se purificaron en gel con el estuche de extracción de fragmentos de ADN Gel/PCR (IBI), se digirieron con las enzimas de restricción apropiadas, y se clonaron en un vector pNZT1 para construir los plásmidos de suministro para el reemplazo de genes.

Metilación de plásmidos in vitro mediante el uso de extractos libres de células de Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum API93. Para metilar los plásmidos antes de su transformación en el B. amyloliquefaciens subsp. plantarum AP193, el método desarrollado para el Lactobacillus plantarum se usó con las menores modificaciones (Alegre y otros, 2004). Las células de un cultivo nocturno de 100 mL de la cepa AP193 (ODeoo = 1,3-1,5) se sedimentaron por centrifugación (8000 xg), se lavaron con 100 mL de solución reguladora PENP refrigerada (fosfato de potasio 10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 50 mM y PMSF 0,2 mM, pH 7,0), y a continuación se resuspendieron a un volumen final de 4 mL. Las células se rompieron al realizar dos ráfagas (amplitud 50, pulso 3 y vatios 25-30) durante 5 min cada una con una pausa de 2 min, mediante el uso de un sonicador Vibra-Cell, y se enfriaron con hielo para evitar el sobrecalentamiento. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación (8000 x g) a 4 °C y el extracto se colectó mediante decantación. Se mezclaron alícuotas de tres mL del extracto con 3 mL de glicerol (100 % v/v) y 0,6 mL de albúmina de suero bovino (1 mg/mL), a continuación se almacenaron a -20 °C.

El ensayo de modificación del ADN se realizó en un volumen final de 100 uL de lo siguiente: 53 pL de solución reguladora TNE [Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 50 mM, EDTA 10 mM], 10 pL de S-adenosilmetionina (0,8 mM), 2 pL de BSA (5 mg/mL), 25 pL de extracto libre de células derivado de la cepa API93 y 10 pL de ADN plasmídico extraído de E. coli K12 ER2925 (0,5-1 pg/pL). La mezcla se incubó a 37 °C durante 16 h. El ADN metilado se extrajo con un estuche de limpieza y concentración de ADN (Zymo Research, CA), a continuación se resuspendió en agua y se almacenó a -20 °C.

Electrotransformación de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum API93. Para la preparación de las células electrocompetentes, la cepa API93 se cultivó durante la noche en TSB, a continuación se diluyó 100 veces en NCM para inocular un subcultivo. El cultivo se hizo crecer a 37 °C en un agitador rotatorio hasta que la DO600 alcanzó 0,7. El cultivo celular se enfrió en hielo durante 15 min y se sometió a centrifugación a 8000 x g durante 5 min a 4 °C. Después de lavar cuatro veces con la solución reguladora ETM helada (sorbitol 0,5 M, manitol 0,5 M y glicerol al 10 %), las células electrocompetentes se resuspendieron en 1/100 del volumen del cultivo original (Zhang y otros, 2011). Para la electroporación, se mezclaron 100 pL de las células con 100 ng del ADN plasmídico en una cubeta de electroporación helada (espacio entre los electrodos 1 mm). Las células se expusieron a un único pulso de 21 kV/cm generado por Gene-Pulser (Bio-Rad Laboratories) con la resistencia y la capacitancia fijadas como 200 Q y 3 pF, respectivamente. Las células se diluyeron inmediatamente en 1 mL de medio de recuperación (NCM más manitol 0,38 M) (Zhang y otros, 2011) y se agitaron suavemente a 30 °C o 37 °C durante 3 h para permitir la expresión de los genes de resistencia a los antibióticos. A continuación, las alícuotas del cultivo de recuperación se extendieron sobre agar LB suplementado con los antibióticos apropiados.

Procedimiento de recombinación de reemplazo en dos etapas para la modificación del genoma de la cepa API93. Una recombinación de reemplazo en dos etapas se realizó como se describió anteriormente, con las menores modificaciones (Zakataeva y otros, 2010). Para integrar el plásmido en el cromosoma de la AP193, debe ocurrir un único entrecruzamiento entre el gen objetivo y la secuencia homóloga en el plásmido. Para hacer esto, la API93 que contenía un plásmido de suministro con la construcción de la deleción se cultivó primero en caldo LB durante 24 h a 37 °C (una temperatura no permisiva para la replicación del plásmido). A continuación, el cultivo se diluyó en serie, se sembró en placas de agar LB con eritromicina, y se incubó a 37 °C. Los clones se cribaron por PCR de las colonias mediante el uso de dos conjuntos de cebadores. Cada conjunto de cebadores hibrida secuencias específicas de uno de los fragmentos homólogos y de la región cromosómica justo fuera del otro fragmento homólogo. Si los productos de PCR tenían un tamaño reducido, con relación al genotipo de tipo salvaje para cualquiera de los conjuntos de los cebadores, esto indicó la integración cromosómica exitosa del plásmido. En la segunda etapa, los clones del integrante se cultivaron con aireación en LB a 30 °C durante 24-48 h para iniciar el segundo evento de entrecruzamiento único, dando como resultado la escisión del plásmido, al producir clones sensibles a la eritromicina (EmS) con un alelo parental o un muíante en el cromosoma. La PCR de las colonias se usó para examinar la presencia de las mutaciones deseadas mediante los conjuntos de cebadores que flanquean la secuencia eliminada.

Construcción de mutantes de la cepa API 93 defectuosos en la biosíntesis de metabolitos secundarios. Todas las cepas mutantes generadas en este Ejemplo se indican en la Tabla 1. La interrupción del gen dfnD se logró de la siguiente manera: Los fragmentos de ADN correspondientes a las posiciones -867 a 247 y 643 a 1570 con respecto a los sitios de iniciación de la traducción dfnD se amplificaron por PCR mediante el uso de ADN genómico API93 como molde. A continuación, los dos fragmentos se ensamblaron mediante PCR de fusión. Durante la fusión se introdujo una mutación de desplazamiento del marco para asegurar la interrupción completa del gen. La construcción de la deleción se digirió con Xhol y Spel, a continuación se clonó en pNZT1, produciendo pNZ-dif. El plásmido se metiló in vitro como se describió anteriormente y se introdujo en la cepa AP193 por electroporación. Una vez introducido en la cepa API93, el plásmido pNZ-dif generó el mutante isogénico API93AdfnD por una recombinación de reemplazo en dos etapas.

Para generar el mutante de deleción sfp, los fragmentos de ADN correspondientes a las posiciones -781 a 29, con respecto al sitio de iniciación de la traducción sfp, y 95 a 935, con respecto al sitio de terminación de la traducción sfp, se amplificaron por PCR mediante el uso de a Dn genómico API 93 como molde, se ensamblaron por PCR de fusión, se digirieron con Hindlll y PstI, y se clonaron en pNZT1 para construir pNZ-sfp. El plásmido pNZ-sfp se usó para generar el mutante AP193A sfp mediante el uso de los procedimientos descritos anteriormente.

El mutante AsrfAA se obtuvo de la siguiente manera: Los fragmentos de ADN correspondientes a las posiciones 5375 a 6091 y 6627 a 7366, con respecto al sitio de iniciación de la traducción srfAA, se amplificaron por PCR, se fusionaron por PCR de fusión, se digirieron con Hindlll y PstI y se clonaron en pNZT1 como pNZ-srf. De manera similar, se introdujo una mutación de desplazamiento del marco durante la fusión de los fragmentos cadena arriba y cadena abajo de la secuencia de deleción objetivo para asegurar la interrupción completa del gen. El plásmido pNZ-srf se usó para generar el mutante API 93 AsrfAA mediante el uso de los procedimientos descritos anteriormente.

Actividades antimicrobianas in vitro de la cepa PGPR API 93 y sus mutantes contra los patógenos de las plantas. Los patógenos de las plantas Pseudomonas syringe pv. tabaci, Rhizobium radiobacter, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria, y Xanthomonas axonopodis pv. campestris se cultivaron en TSB hasta que el ODeoo alcanzó 1,0. La cepa API93 de tipo salvaje, así como también los tres mutantes isogénicos A dfnD, Asfp, y AsrfAA desarrollados en este Ejemplo, se cultivaron a 30 °C en TSB durante 48 h a 220 rpm. Los cultivos se centrifugaron a 10000 x g durante 2 min y luego se pasó el sobrenadante a través de un filtro de nailon de 0,2 pm (VWR, PA). Para los ensayos de antibiosis, se esparcieron 100 pL de un cultivo nocturno para cada patógeno de las plantas en placas TSA (Thermo Scientific, NY) por separado y luego se usaron perforadores de corcho estériles (10 mm de diámetro) para perforar pocillos en las placas de agar. El sobrenadante filtrado de API93 y sus tres mutantes se añadieron por separado para llenar los pocillos. Las placas se dejaron secar y luego se incubaron a 30 °C durante toda la noche. Las zonas de inhibición se midieron y se compararon entre los mutantes y la cepa API93 de tipo salvaje para determinar sus actividades antimicrobianas contra los patógenos de las plantas.

Análisis LC-MS de los sobrenadantes bacterianos. Los cultivos bacterianos se cultivaron en 2 mL de TSB durante 72 horas y luego las células se eliminaron por centrifugación a 10000 x g durante 10 min, seguido por una filtración 0,2 pm del sobrenadante del cultivo. Las muestras se analizaron por inyección directa de m/z 50-1200 en una cromatografía líquida de ultra alta presión/espectrómetro de masas-QTof (Waters Acquity UPLC y Q-Tof Premier, Milford, MA) operado a un voltaje de pulverización de 3,03 kv y la temperatura de la fuente de 100 °C. El análisis de MS se realizó en modo de iones negativos con una fase móvil de acetonitrilo al 95 %, agua al 5 % y ácido fórmico al 0,1 %.

Antibiosis in vivo de la cepa AP193 y sus mutantes contra un patógeno de las plantas. Las semillas de tomate Rutgers (Park Seed, Estados Unidos) se sembraron en bandejas de poliestireno. Tres semanas después de la siembra, las plántulas se trasplantaron a una maceta cuadrada de 4,5 pulgadas con sustrato comercial para macetas (Sunshine mix, Sun Gro Horticulture, Agawam, Maine). Tres días después del trasplante, las plantas se rociaron con agua estéril o suspensiones de células PGPR (106UFC/mL) que se habían lavado tres veces antes de resuspender en agua estéril y se normalizaron a un ODeoo =1,0 antes de diluirse en serie. Las plantas inoculadas con PGPR se colocaron en una cámara de rocío al 100 % de humedad en la oscuridad durante dos días a 24 °C y luego se transfirieron al invernadero. Un día después, las plantas se inocularon por desafío con X. axonopodis pv. vesicatoria por pulverización aproximadamente 10 mL de una suspensión de patógenos 107 UFC/mL sobre cada planta. Las plantas inoculadas con patógenos se colocaron en la cámara de rocío durante dos días y luego se colocaron en el invernadero. Las plantas se regaron una vez al día. Las valoraciones de la severidad de la enfermedad y la cosecha se realizaron después de 14 días de la inoculación por desafío. Para valorar la severidad de la enfermedad, se seleccionaron cuatro hojas compuestas de la parte inferior de cada planta. La severidad de la enfermedad de cada una de las hojas compuestas se determinó al valorar la severidad de la enfermedad de cada folíolo y calculando la valoración promedio de la hoja compuesta. Los folíolos se valoraron mediante el uso de una escala de valoración de 0-4, donde 0=folíolo sano, 1= <20 % del área necrótica del folíolo, 2= 20 50 % del área necrótica del folíolo, 3= 51-80 % del área necrótica del folíolo, 4= 80-100 % del área necrótica del folíolo. Además, se determinaron los pesos secos de los brotes y las raíces. El diseño experimental fue un bloque completo aleatorio con diez réplicas por tratamiento. El experimento se realizó dos veces.

Análisis de datos. Todos los datos se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA), y los medios de tratamiento se separaron mediante el uso de la prueba de diferencia menos significativa de Fisher (LSD) a P=0,05 mediante el uso de sAs 9.3 (SAS Institute, Gary, NC, Estados Unidos).

Resultados

Estadísticas del genoma y relación genética de las especies Bacillus. Las secuencias del genoma de 12 cepas PGPR diferentes Bacillus spp. se determinaron mediante el uso de la secuenciación de próxima generación. Las estadísticas resumidas para cada secuencia del genoma de Bacillus spp. y sus ensamblajes se presentan en la Tabla 2. Los tamaños aproximados de los genomas de Bacillus spp. variaron de 2,95-4,43 Mpb con un tamaño promedio del genoma de 3,93 Mpb, que es similar al tamaño promedio del genoma de 4,09 Mpb del genoma completo de B. subtilis disponible en GenBank (Abril, 2015). El contenido por ciento G+C de las 12 cepas PGPR de Bacillus spp. variaron de 41,3- 46,6 %, promediando 45,15 %, que es similar al contenido por ciento promedio G+C de las secuencias genómicas B. subtilis disponibles en GenBank (43,72 %) (marzo, 2015). Las identidades de nucleótidos promedio por pares (ANI), un estándar recientemente propuesto para la definición de las especies en procariotas (Richter y Rossello-Mora, 2009), se calcularon para 13 cepas PGPR de Bacillus para determinar su relación entre especies entre las especies Bacillus. Los valores ANI para las cepas PGPR de Bacillus spp. AB01, AP71, AP79, AP143, A p 193 y GB03 contra B. amyloliquefaciens FZB42 (Chen y otros, 2007a) fueron superiores al 98 % (no se muestran los datos), lo que indica que estas cepas PGPR están afiliadas a las especies B. amyloliquefaciens. El ANI del 98,88 % de la cepa PGPR AP254 para la cepa 168 de B. subtilis subsp. subtilis sugiere que AP254 está afiliado con B. subtilis (no se muestran los datos). La comparación ANI por pares de las cepas PGPR INR7, KCTC 3706T, KCTC 13613T, KCTC 13918T y KCTC 13622T entre sí producen valores de ANI inferiores al 95 % (no se muestran los datos) lo que sugiere que están distantemente relacionados entre sí y representan diversas especies Bacillus.

Relación filogenética de las cepas Bacillus. Un análisis filogenético basado en las secuencias del gen gyrB mostró suficiente resolución entre los taxones Bacillus y fue consistente con las comparaciones ANI. Las cepas AP71, AP79, AP143, AP193, AB01 y GB03 se agruparon junto con las cepas de referencia de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum con un soporte de alta carga, lo que indica que están afiliadas a la subsp. plantarum. Las tres cepas de B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7, TA208 y LL3 se agruparon como un único clado, se separaron de las cepas de la subsp. plantarum, al apoyar la división de las dos subespecies en B. amyloliquefaciens (Borriss y otros, 2011). La colocación de la cepa AP254 con la cepa 168 B. subtilis subsp. subtilis como un único clado con un fuerte soporte de alta carga sugiere su afiliación con los miembros del grupo B. subtilis (Figura 1A). El árbol filogenético basado en los genes gyrB construido mediante el uso de métodos de Máxima Posibilidad (ML) también fue concordante con la filogenia construida mediante el uso de los métodos de unión de vecinos (no se muestran los datos). Además de la filogenia basada en gjr5, construimos un árbol filogenómico mediante el uso de 729,383 pb de las secuencias del genoma del núcleo presentes dentro del genoma de 25 grupos B. subtilis aislados para proporcionar una colocación filogenética más refinada de las cepas PGPR. La topología y la asignación de las cepas a los clados en la filogenia gyrB fue similar a la del árbol filogenómico (Figura 1B). Una diferencia notable es que la topología del árbol con respecto a la posición de la cepa B. siamensis KCTC13613 difiere significativamente entre el árbol basado en gjr5 y el árbol filogenómico, con la filogenia basada en gyrB colocando a KCTC13613 en un clado separado mientras que el árbol filogenómico lo incluyó dentro de un grupo monofilético que incluye las cepas de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum.

Matriz BLAST. Las comparaciones de los proteomas de todo el genoma de 13 cepas PGPR Bacillus mediante el uso de un enfoque BLASTp de todos contra todos demostraron que las cepas PGPR Bacillus spp. son muy diversas, como lo indica la similitud de la familia de genes entre los genomas PGPR Bacillus spp. que varían entre 32-90 % (no se muestran los datos). Consistente con el análisis filogenético, se encontró una alta similitud entre las cepas AP71, AP79, AP193, AB01, GB03 y FZB42, con una similitud proteómica que varía entre el 70-90 %.

Análisis del genoma del núcleo. El análisis del alineamiento de la secuencia del genoma mediante el uso de Mauve progresiva determinó que el genoma del núcleo de 13 cepas PGPR Bacillus spp. contienen 1,407,980 pb de ADN genómico que codifica 1,454 ORF (no se muestran los datos). La comparación de las secuencias del genoma del núcleo del género Bacillus, subgrupo B. subtilis, especies B. amyloliquefaciens, y subespecies plantarum demostraron que a medida que aumenta el número de genomas, disminuye el número de subsistemas diferentes dentro de cada genoma del núcleo respectivo (Figura 2A-C). El mayor número de subsistemas en cada una de las categorías del genoma del núcleo, excepto para el genoma del núcleo del género Bacillus, se dedicó al metabolismo de los carbohidratos. Estos hallazgos sugieren que las cepas del género Bacillus usan diversas fuentes de carbono. Además, el genoma del núcleo del género Bacillus tiene más subsistemas dedicados al metabolismo del ARN, ADN y las proteínas en comparación con el metabolismo de los carbohidratos (Figura 2A-C).

El alineamiento del genoma de 28 cepas diferentes de la subsp. plantarum, que incluye seis cepas de la subsp. plantarum secuenciadas en este Ejemplo, identificó 2,550,854 pb de la secuencia del genoma del núcleo que se predice que codifique 2,839 ORF. El alineamiento del genoma de 32 cepas de B. amyloliquefaciens, que incluye 28 cepas de la subsp. plantarum, identificó 2,418,042 pb de la secuencia del genoma del núcleo que se predice que codifique 2,773 ORF.

El alineamiento del genoma de 53 cepas del grupo B. subtilis, que incluye las 12 cepas secuenciadas en este Ejemplo, identificó 578,872 pb de la secuencia del genoma del núcleo que se predice que codifique 674 ORF. El número de genes que codifican proteínas presentes dentro del genoma de Bacillus spp. (-4,000) y el bajo número de ORF (674) codificados por sus genomas del núcleo sugiere una gran cantidad de plasticidad genómica entre los genomas Bacillus que experimentan adquisiciones y pérdidas frecuentes de genes. Se observó que el genoma del núcleo B. amyloliquefaciens estaba desprovisto de elementos genéticos móviles, tales como profagos, elementos transponibles y plásmidos (no se muestran los datos). Además, el genoma del núcleo B. subtilis también estaba desprovisto de genes o clúster genéticos vinculados con la adquisición y el metabolismo del hierro, la biosíntesis de metabolitos secundarios, la transducción de señales y el metabolismo del fósforo (Figura 2A-C).

En este Ejemplo, el genoma del núcleo del género Bacillus también se determinó al analizar todas las secuencias genómicas completas del género Bacillus actualmente disponible en GenBank. Determinamos que el género Bacillus contiene 194,686 pb de la secuencia del núcleo predicha para codificar 201 ORF diferentes. Las funciones predichas presentes en todas las cepas Bacillus se limitan a las siguientes características del subsistema: síntesis de cofactores, síntesis de vitaminas, biogénesis de pigmentos y grupos prostéticos, biogénesis de la pared celular y la cápsula, transporte de membrana, metabolismo del ARN, metabolismo de nucleósidos, metabolismo de proteínas, regulación y señalización celular, metabolismo del ADN, respiración, aminoácidos y sus derivados, metabolismo del azufre y utilización de carbohidratos

Análisis comparativo de los genes del núcleo presentes de forma única en B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. La comparación de los genomas específicos PGPR con los no PGPR B. subtilis subsp. subtilis str. 168 no identificó ningún otro gen además de los genes esenciales de mantenimiento que se conservaron dentro de los genomas de las cepas PGPR (no se muestran los datos). El análisis comparativo de los genomas del núcleo de 28 especies B. amyloliquefaciens subsp. plantarum y 32 especies B. amyloliquefaciens identificaron 193,952 pb de secuencias que están presentes dentro del genoma del núcleo de la subsp. plantarum pero ausentes en el genoma del núcleo de B. amyloliquefaciens. Entre estos loci genéticos había 73 genes compartidos por todas las 28 cepas plantarum pero no estaban presentes en ninguna cepa de la subsp. amyloliquefaciens. Las funciones putativas de estos genes incluyen el transporte (7 genes), la regulación (7 genes), la señalización (1 gen), la degradación del carbono (10 genes), la síntesis de metabolitos secundarios (19 genes) y las proteínas hipotéticas (12 genes) (Figura 2C). Algunos de estos productos génicos pueden estar involucrados en las interacciones con las plantas y en la competencia en la rizosfera de las cepas de la subsp. plantarum {por ejemplo, la utilización de la pectina). Por ejemplo, los genes necesarios para la captación y el uso del D-galacturonato y el D-glucuronato se comparten entre los genomas de las cepas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Éstas incluyen uxuA (manonato deshidratasa (EC 4.2.1.8)), kdgA (4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa (EC 4.1.3.16)), kdgK (2-deshidro-3-desoxigluconato quinasa (EC 2.7.1.45)), exuT (transportador de hexuronato), exuR (represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato), y uxuB (D-manonato oxidorreductasa (EC 1.1.1.57)). Además, los genes requeridos para la biosíntesis de los policétidos dificidina y macrolactina se encontraron consistentemente en las cepas PGPR subsp. plantarum , lo que sugiere su relevancia en las actividades de biocontrol de estas cepas.

Clúster de genes que codifican la biosíntesis de metabolitos secundarios y la competencia natural en la cepa AP193. Debido a nuestras observaciones de las interacciones beneficiosas entre la cepa PGPR AP193 y los hospederos tanto vegetales como animales (Ran y otros, 2012), seleccionamos esta cepa para un análisis más intensivo del genoma. El ensamblaje de las secuencias del genoma de la cepa API93 de novo resultó en 152 cóntigos mayores de 1 kb, con una longitud combinada de 4,121,826 pb. El análisis de las secuencias de los cóntigos de AP193, mediante el uso del programa de predicción de metabolitos secundarios antiSMASH, sugiere que los clúster de genes que estaban presentes son responsables de la síntesis de tres policétidos diferentes: bacillaene, macrolactina y dificidina. Con el fin de proporcionar secuencias completas para estas trayectorias de biosíntesis, los espacios entre los cóntigos 5 y 6, los cóntigos 33 y 38, así como también los cóntigos 27 y 28 se rellenaron mediante el uso de PCR, seguido de una secuenciación de ADN. Cada uno de los clúster de genes en la API93 son colineales con sus contrapartes en B. amyloliquefaciens FZB42; una colonizadora de raíces de las plantas naturalmente competente B. amyloliquefaciens aislada con la capacidad de promover el crecimiento de las plantas y suprimir los patógenos de las plantas (Chen y otros, 2007a). El porciento de identidades de los aminoácidos de las proteínas codificadas por esos clúster estaba dentro del intervalo de 98-100 % en comparación con los de FZB42. También se detectaron en el genoma de AP193 clúster de genes de la biosíntesis de metabolitos secundarios implicados en la síntesis no ribosomal de lipopéptidos cíclicos, surfactinas, fengicina y bacilomicina D y del dipéptido antimicrobiano bacilisina presente en FZB42. El porciento de identidades de los aminoácidos de las proteínas de AP193 codificadas en esos clúster eon los homólogos de FZB42 varió del 98 % al 100 %. La falta de competencia natural de la cepa PGPR API93 nos llevó a determinar la presencia de genes relacionados con la competencia dentro de esta cepa. Buscamos en las secuencias del genoma API93 la presencia de genes relacionados con la competencia que se encuentran dentro del genoma de FZB42, y observamos que todos los genes requeridos para codificar los componentes estructurales del sistema de competencia que se encuentran en la cepa FZB42 están presentes dentro del genoma de AP193 con el 98 al 100 % de identidad (no se muestran los datos); sin embargo, los genes comQ, comX, y comP que están involucrados en la regulación de la detección de cuórum en B. amyloliquefaciens FZB42 (Chen y otros, 2007a) estaban ausentes dentro del genoma de la cepa API93 (no se muestran los datos). La ausencia de comQ, comX, y comP puede ser responsable de la falta de competencia natural para la cepa AP193.

Los metabolitos secundarios de API93 inhiben el crecimiento de múltiples patógenos bacterianos en las plantas in vitro. Las actividades antimicrobianas de la cepa AP193 y sus mutantes AP193AdfnD (deficiente en la producción de dificidina), AP193Asr£4A (deficiente en la producción de surfactina), y API 93Asfp (incapaz de producir policétido o lipopéptido debido a una deleción del gen sfp que codifica 4'-fosfopanteteinil transferasa) se probaron contra los patógenos de las plantas Pseudomonas syringe pv. tabaci, Rhizobium radiobacter, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria, y Xanthomonas axonopodis pv. campestris. La cepa de tipo salvaje AP193 demostró una fuerte actividad antimicrobiana, mientras que el mutante API93AV/? carecía del efecto inhibitorio contra estos patógenos de las plantas (Figura 3), lo que resalta la contribución de los lipopéptidos y/o policétidos en la bioactividad de la AP193. Esto también indica que el dipéptido bacilisina, cuya síntesis es independiente de Sfp, no está involucrado en la actividad antagonista expresada in vitro. El mutante API93AsrfAA confirió una actividad antimicrobiana similar a la del tipo salvaje a P. syringe pv. tabaci, R. radiobacter, X. axonopodis pv. vesicatoria, y X. axonopodis pv. campestris (Figura 3), lo que sugiere que la surfactina no tiene un papel putativo en la actividad antibacteriana de API93 contra estos patógenos de las plantas bajo las condiciones probadas en este Ejemplo. Estos hallazgos también demostraron que la surfactina no influye en la biosíntesis de los compuestos antimicrobianos en AP193 ni inhibe las actividades antibacterianas de los compuestos antibacterianos producidos por la API93. La dificidina actúa como el principal antibiótico en el antagonismo de AP193 contra los patógenos de las plantas P. syringe pv. tabaci, R. radiobacter, X. axonopodis pv. vesicatoria, y X. axonopodis pv. campestris como lo indica la falta del efecto inhibitorio del mutante AP193A<dfnD contra estos patógenos de las plantas (Figura 3).

Además, confirmamos que los mutantes AP193A dfnD y A sfp carecían de síntesis de dificidina al realizar el análisis LC-MS de los sobrenadantes del cultivo TSB libres de células de API93 de tipo salvaje y cada uno de estos mutantes. Como se reportó previamente, sólo la forma desprotonada de la oxidificidina fue detectable en los sobrenadantes bacterianos mediante el uso de EM en el modo negativo ([M-H]" = 559,3) (Chen y otros, 2006), con una masa molecular de 559,3 detectada en los sobrenadantes del cultivo de API 93 de tipo salvaje pero no observada en el cultivo del mutante A dfnD (Figura 4) o del mutante A sfp (no se muestran los datos). El mutante AsrfAA mostró la síntesis de dificidina como en el cultivo de API93 de tipo salvaje (no se muestran los datos). Estos hallazgos demuestran la importancia de la dificidina en la actividad de biocontrol de las cepas subsp. plantarum contra los patógenos de las plantas.

Los metabolitos secundarios de la cepa API 93 controlan la mancha bacteriana causada por X. axonopodis pv. vesicatoria en las plantas de tomate. Para determinar el papel de los compuestos bioactivos producidos por la cepa API93 en proporcionar protección contra las enfermedades de las plantas, la cepa de tipo salvaje API93 y sus mutantes AP193AdfnD, AP193Asfp y AP\93AsrfAA se aplicaron a las plantas de tomate varios días antes de que esas plantas fueran subsecuentemente inoculadas con el patógeno de las plantas X. axonopodis pv. vesicatoria. Tanto el AP193 de tipo salvaje como AV\93AsrfAA redujeron significativamente (P <0,05) la severidad de la enfermedad de la mancha bacteriana en las plantas de tomate en comparación con el control de la enfermedad (Tabla 3). Adicionalmente, la aplicación de la cepa AP193 aumentó significativamente el peso en seco de las raíces de las plantas (Tabla 3). A diferencia de AP193 de tipo salvaje y su mutante API 93 AsrfA A, las cepas API93 Asfp y API93 Adfnl) no protegen las plantas de tomate de la mancha bacteriana severa causada por X. axonopodis pv. vesicatoria ni mejoran el crecimiento de las plantas (Tabla 3), lo que respalda además la importancia de la dificidina para la protección de las enfermedades de las plantas. Estos hallazgos están de acuerdo con el patrón de antibiosis in vitro de la cepa de tipo salvaje API93 y sus mutantes API 93 Adfnl), API93AsJp y API93 AsrfA A demostrados contra el patógeno de las plantas X. axonopodis pv. vesicatoria.

Discusión

Las cepas PGPR Bacillus spp. se usan en todo el mundo para mejorar el rendimiento de los cultivos y para proteger contra las enfermedades de las plantas. En este Ejemplo, se secuenciaron 12 genomas de PGPR, que incluye B. subtilis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens, B. mojavensis, B. siamensis, B. sonorensis, y B. tequilensis. Estos datos se analizaron mediante el uso de ANI, filogenias basadas en gyrB- y filogenias basadas en el genoma del núcleo para resolver la afiliación taxonómica de las cepas Bacillus spp. Nuestros hallazgos demuestran que la mitad de las cepas secuenciadas en este Ejemplo están afiliadas con B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, incluida la cepa GB03 que anteriormente se designó como B. subtilis. Previamente, la cepa B. siamensis tipo KCTC 13613T se propuso como una nueva especie (Sumpavapol y otros, 2010), pero el análisis filogenómico basado en el genoma del núcleo de Bacillus (Figura 1) reveló que el B. siamensis KCTC 13613T, en cambio, está afiliada con B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Este hallazgo soporta los resultados de Jeong y otros (Jeong y otros, 2012) que determinaron la estrecha afiliación de la cepa B. siamensis tipo KCTC 13613T con B. amyloliquefaciens subsp. plantarum basado en el ANI. Estos hallazgos también soportan el uso continuado de los enfoques filogenómicos basados en el genoma del núcleo para proporcionar una mejor resolución filogenética que los análisis que usan un único gen de mantenimiento {por ejemplo, gyrB). Las filogenias basadas en gyrB y las secuencias del genoma del núcleo demuestran que B. amyloliquefaciens subsp. plantarum son muy similares, pero la comparación de sus proteomas demuestra que están estrechamente relacionados, aunque son distintos, y pueden ejercer actividades de promoción del crecimiento de las plantas a través de diferentes mecanismos.

La cepa B. amyloliquefaciens subsp. plantarum AB01 se aisló del intestino del bagre del canal (Ran y otros, 2012), pero su afiliación con las cepas asociadas a las plantas puede sugerir una presencia transitoria dentro del tracto gastrointestinal de un pez; sin embargo, dado que el alimento para peces es a base de soja, es probable que la dieta a base de plantas también fuera un factor en el crecimiento de esta cepa dentro del intestino del pez. De manera similar, se encontró que la cepa B. siamensis tipo KCTC 13613T está estrechamente relacionada con B. amyloliquefaciens subsp. plantarum y se aisló del cangrejo salado, en lugar de una fuente asociada a las plantas. La eficacia de las cepas AB01, AP193, y otras cepas asociadas a las plantas como los probióticos en los peces muestra la capacidad de biocontrol de los patógenos de animales y plantas, así como también una superposición en la colonización del hospedador (Ran y otros, 2012).

Con los rápidos avances en las tecnologías de secuenciación, ahora es posible extender el análisis genómico más allá de los genomas individuales para analizar los genomas del núcleo (Medini y otros, 2008). En este Ejemplo, se realizaron análisis genómicos del núcleo en las cepas PGPR de especies afiliadas al grupo B. subtilis. Este análisis identificó 73 genes presentes exclusivamente entre todas las cepas de subsp. plantarum que están ausentes en las cepas subsp. amyloliquefaciens. Este pequeño número de genes específicos de la subsp. plantarum está de acuerdo con un reporte previo que identificó 130 genes específicos de la subsp. plantarum que usan un número limitado de secuencias genómicas de las cepas de la subsp. plantarum (He y otros, 2012). De estos 73 genes específicos plantarum identificados en este Ejemplo, se predice que muchos son importantes para las funciones asociadas a las plantas y al suelo. Por ejemplo, los genes que se requieren para el uso del D-galacturonato y el D-glucuronato se encontraron en el conjunto de genes del núcleo específicos de B. amyloliquefaciens subsp. plantarum. Esta observación es consistente con la ausencia de estos genes en el genoma de B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 (Ruckert y otros, 2011), una cepa sin actividad PGPR reportada. La pectina, un polímero complejo que se encuentra en los tejidos de las plantas, se descompone en D-glucuronato y D-galacturonato que luego sirve como fuente de carbono para el crecimiento bacteriano (Nemoz y otros, 1976). Esta pectina podría servir potencialmente como una fuente de nutrientes para la colonización eficiente de las raíces de PGPR a través de la absorción competitiva de nutrientes. Por lo tanto, la presencia de los genes que permiten la utilización de D-galacturonato y D-glucuronato podría ser ventajosa para B. amyloliquefaciens subsp. plantarum para la actividad promotora del crecimiento de las plantas a través de una colonización eficiente de las raíces.

Dado que muchas de las cepas PGPR son del grupo B. subtilis, la estimación del genoma del núcleo se amplió para incluir un mayor número de cepas B. subtilis. El aumento del número de genomas Bacillus subtilis analizados a 53 dio como resultado un genoma del núcleo de 579,166 pb que se predice que codifique 674 ORF. Este menor número de genes predichos refleja la diversidad genómica entre los grupos B. subtilis. Este hallazgo demuestra que el número de ORF encontrado en el genoma del núcleo del grupo B. subtilis está cerca del número de ORF B. subtilis que se consideran como indispensables para el crecimiento en medios complejos (610 ORF) (http: //www.minibacillus.org/project#genes).

Para validar la participación de un gen en los procesos relacionados con las plantas, es esencial construir mutantes isogénicos que carezcan de estos genes. Por lo tanto, delecionamos genes de la cepa PGPR API93 para evaluar el papel de los clúster de genes de la biosíntesis de metabolitos secundarios en el control biológico de los patógenos de las plantas. Para hacer esto, un vector lanzadera metilado pNZT1 (Zakataeva y otros, 2010) con construcciones de deleción de genes suministró modificaciones genéticas dirigidas a API93. demostrando la eficacia de la metilación in vitro de plásmidos por medio de un extracto libre de células para eludir un sistema de restricción que se presumió haber evitado la transformación mediante electroporación.

La dificidina es un éster fosfato de polienolactona macrocítico de 22 miembros altamente insaturados con actividad antibacteriana de amplio espectro (Zimmerman y otros, 1987). La dificidina expresada por la cepa FZB42, junto con el dipéptido bacilisina, son antagonistas contra Erwinia amylovora - el agente causante de la enfermedad del fuego bacteriano en los árboles de la huerta (Chen y otros, 2009). Este Ejemplo que usa un mutante isogénico API 93A</////) demostró por primera vez que la dificidina sola, no junto con ningún otro policétido o dipéptido, ejerce una actividad antibacteriana in vitro contra los patógenos de las plantas, tales como Pseudomonas syringe pv. tabaci, Rhizobium radiobacter, Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria y Xanthomonas axonopodis pv. campestris. También demostramos, mediante el uso del mutante isogénico AP193Adf«D, que la expresión de dificidina es la responsable del control de la enfermedad de las manchas bacterianas en las plantas de tomate causada por X. axonopodis pv. vesicatoria. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la dificidina es el metabolito secundario de la cepa API93 más importante para el control biológico de las enfermedades de las plantas debida a los patógenos bacterianos. Además, la construcción de la deleción de genes sfp permitió la investigación de múltiples metabolitos secundarios producidos por AP193 y sus contribuciones individuales a la actividad de biocontrol. El mutante de deleción sfp perdió la actividad antagonista contra cada patógeno que era susceptible a la cepa API 93 de tipo salvaje. Se espera que los mutantes con la deleción sfp pierdan la capacidad de sintetizar dificidina además de otros metabolitos. Debido a que la falta de la actividad antimicrobiana de API 93Asfp es consistente con la del mutante API93Ac////D, esto sugiere que la dificidina es el metabolito primario responsable de la inhibición in vitro de los patógenos bacterianos. Por el contrario, el mutante de surfactina retuvo la actividad antimicrobiana contra todos los patógenos de las plantas probados, lo que demuestra que la surfactina no es crítica en la actividad antibiótica in vitro ni influye en la síntesis o secreción de otros metabolitos secundarios de la biosíntesis en esta cepa Bacillus spp.; sin embargo, la surfactina puede influir en la actividad promotora del crecimiento de las plantas, ya que se ha observado que la surfactina de B. subtilis provoca RSI en las plantas (Ongena y otros, 2007) y se expresa en las células de las plantas colonizadas por FZB42 (Fan y otros, 2011).

Al estudiar las contribuciones de los loci genéticos que se conservan entre las cepas PGPR de alto rendimiento, continuamos descubriendo las contribuciones relativas de los genes en la colonización de las plantas, la promoción del crecimiento y/o el control biológico de los patógenos. En particular, la investigación futura de los genes relacionados con la absorción y el uso de azúcares derivados de la pectina ayudará a determinar la importancia relativa de estos genes para la colonización de las plantas y la persistencia dentro de este microbioma. Análisis genómico comparativo de Bacillus spp. Las cepas PGPR han conducido a una mejor comprensión de los productos génicos y proporcionan una base para desarrollar estrategias de aplicación que resulten en una mayor promoción del crecimiento de las plantas y la actividad de biocontrol.

Tablas

Tabla 1. Cepas bacterianas y plásmidos usados en este Ejemplo.

Tabla 2. Resumen de los proyectos de genomas de las especies Bacillus secuenciadas usadas en este Ejemplo

Tabla 3. Efectos de las cepas de rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) sobre la severidad de la enfermedad de las manchas bacterianas y el crecimiento de las plantas

Cepa ab Severidad de la Peso en seco del Peso en seco de enfermedadc tallo (g) la raíz (g)

Control de 2,11a 2,07 bc 0,378 c enfermedades

AP193 1,30 b 2,18 b 0,453 a AP193AsrfAA 1,48 b 2,16 b 0,423 abc AP193Asfp 2,31 a 2,18 b 0,405 abc AP193Adif 2,06 a 2,00 c 0,389 bc Control saludable 0,00 c 2,38 a 0,435 ab

LSD 0.35 0.15 0.050

Nota:

a. El diseño experimental fue un bloque completo aleatorio con diez réplicas por tratamiento.

El experimento se realizó dos veces. Los valores seguidos por la misma letra no fueron

diferentes significativamente (P=0,05) de acuerdo con el LSD protegido de Fischer.

b. Había una planta en cada réplica. Las plantas se rociaron con la suspensión de PGPR

(106UFC/mL) una semana después del trasplante, y se inocularon por desafío con las

soluciones de patógenos (107UFC/mL) tres días después de la inoculación de PGPR.

c. Las valoraciones de la severidad de la enfermedad y la cosecha se hicieron 14 días

después. Para valorar la severidad de la enfermedad, se seleccionaron cuatro hojas

compuestas de la parte inferior de cada planta. La severidad de la enfermedad de cada una

de las hojas compuestas se determinó al valorar la severidad de la enfermedad de cada folíolo

y calculando la valoración promedio de la hoja compuesta. El foliolo se valoró mediante el uso

de una escala de valoración de 0-4, donde 0=foliolo sano, 1= <20 % del área necrótica del

foliolo, 2 = 20-50 % del área necrótica del foliolo, 3= 51-80 % del área necrótica del foliolo, 4 =

80-100 % del área necrótica del foliolo, o muerte completa del foliolo.

Referencias

Alegre, M.T., Rodríguez, M.C., y Mesas, J.M. (2004). Transformation of Lactobacillus plantarum by electroporation with in vitro modified plasmid DNA. FEMS Microbiol Lett 241, 73-77. doi: 10.1016/j.femsle.2004.10.006.

Aziz, R.K., Bartels, D. Best, A.A., Dejongh, M., Disz, T., Edwards, R.A., Formsma, K., Gerdes, S., Glass, E.M., Kubal, M., Meyer, F., Olsen, G.J., Olson, R., Osterman, A.L., Overbeek, R.A., Mcneil, L.K., Paarmann, D., Paczian, T., Parrello, B., Pusch, G.D., Reich, C., Stevens, R., Vassieva, O., Vonstein, V., Wilke, A., y Zagnitko, O. (2008). The RAST server: Rapid annotations using subsystems technology. BMC Genomics 9:75. doi: Artn75 Doi 10.1186/1471-2164-9-75.

Blin, K., Medema, M.H., Kazempour, D., Fischbach, M.A., Breitling, R., Takano, E., y Weber, T. (2013). antiSMASH 2.0— a versatile platform for genome mining of secondary metabolite producers. Nucleic Acids Res 41, W204-W212. doi: 10.1093/nar/gkt449.

Borriss, R., Chen, X.H., Rueckert, C., Blom, J., Becker, A., Baumgarth, B., Fan, B., Pukall, R., Schumann, P., Sproer, C., Junge, H., Vater, J., Puhler, A., y Klenk, H.P. (2011). Relationship of Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome sequence comparisons. Int J Syst Evol Microbiol 61, 1786-1801. doi: 10.1099/ijs.0.023267-0.

Chen, X.H., Koumoutsi, A., Scholz, R., Eisenreich, A., Schneider, K., Heinemeyer, I., Morgenstern, B., Voss, B., Hess, W.R., Reva, O., Junge, H., Voigt, B., Jungblut, P.R., Vater, J., Sussmuth, R., Liesegang, H., Strittmatter, A., Gottschalk, G., y Borriss, R. (2007a). Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat Biotechnol 25, 1007- 1014. doi: 10.1038/nbtl325.

Chen, X.H., Koumoutsi, A., Scholz, R., Eisenreich, A., Schneider, K., Heinemeyer, I., Morgenstern, B., Voss, B., Hess, W.R., Reva, O., Junge, H., Voigt, B., Jungblut, P.R., Vater, J., Sussmuth, R., Liesegang, H., Strittmatter, A., Gottschalk, G., and Borriss, R. (2007b). Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat. Biotechnol. 25, 1007-1014. doi: 10.1038/nbtl325.

Chen, X.H., Scholz, R., Borriss, M., Junge, H., Mogel, G., Kunz, S., y Borriss, R. (2009). Difficidin and bacilysin produced by plant-associated Bacillus amyloliquefaciens are efficient in controlling fire blight disease. J Biotechnol 140, 38-44. doi: 10.1016/j.jbiotec.2008.10.015.

Chen, X.H., Vater, J., Piel, J., Franke, P., Scholz, R., Schneider, K., Koumoutsi, A., Hitzeroth, G., Grammel, N., Strittmatter, A.W., Gottschalk, G., Sussmuth, R.D., y Borriss, R. (2006). Structural and functional characterization of three polyketide synthase gene clusters in Bacillus amyloliquefaciens FZB 42. J Bacteriol 188, 4024-4036. doi: 10.1128/JB.00052-06.

Chin, A., F., W.T., Bloemberg, G.V., Mulders, I.H., Dekkers, L.C., y Lugtenberg, B.J. (2000). Root colonization by phenazine-l-carboxamide-producing bacterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 is essential for biocontrol of tomato foot and root rot. Mol Plant Microbe Interact 13,1340-1345.

Choi, S.K., Jeong, H., Kloepper, J.W., y Ryu, C.M. (2014). Genome Sequence of Bacillus amyloliquefaciens GB03, an Active Ingredient of the First Commercial Biological Control Product. Genome Announc 2, 01092-01014.

Darling, A.C., Mau, B., Blattner, F.R., y Perna, N.T. (2004). Mauve: multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements. Genome Res 14, 1394-1403. doi: 10.1101/gr.2289704.

Dekkers, L.C., Mulders, I.H., Phoelich, C.C., Chin, A.W.T.F., Wijfjes, A.H., y Lugtenberg, B.J. (2000). The sss colonization gene of the tomato-Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici biocontrol strain Pseudomonas fluorescens WCS365 can improve root colonization of other wild-type pseudomonas spp.bacteria. Mol Plant Microbe Interact 13, 1177-1183. doi: 10.1094/MPMI.2000.13.11.1177.

Dietel, K., Beator, B., Budiharjo, A., Fan, B., y Borriss, R. (2013). Bacterial Traits Involved in Colonization of Arabidopsis thaliana Roots by Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Plant Pathol J 29, 59-66.

Emmert, E.a.B., Klimowicz, A.K., Thomas, M.G., y Handelsman, J. (2004). Genetics of Zwittermicin A Production by Bacillus cereus. Appl Environ Microbiol 70, 104-113. doi: 10.1128/aem.70.1.104-113.2004.

Fan, B., Chen, X.H., Budiharjo, A., Bleiss, W., Vater, J., y Borriss, R. (2011). Efficient colonization of plant roots by the plant growth promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42, engineered to express green fluorescent protein. J Biotechnol 151, 303-311. doi: 10.1016/j.jbiotec.2010.12.022.

Felsenstein, J. (1981). Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. J Mol Evol 17, 368-376. Friis, C., Wassenaar, T.M., Javed, M.A., Snipen, L., Lagesen, K., Hallin, P.F., Newell, D.G., Toszeghy, M., Ridley, A., Manning, G., y Ussery, D.W. (2010). Genomic characterization of Campylobacter je juni strain Ml. PLoS One 5, el2253. doi: 10.1371/journal.pone.0012253.

Goris, J., Konstantinidis, K.T., Klappenbach, J.A., Coenye, T., Vandamme, P., y Tiedje, J.M. (2007). DNA-DNA hybridization values and their relationship to whole- genome sequence similarities. Int J Syst Evol Microbiol 57, 81-91. Hao, K., He, P., Blom, J., Rueckert, C., Mao, Z., Wu, Y., He, Y., y Borriss, R. (2012). The genome of plant growth-promoting Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum strain YAU B9601-Y2 contains a gene cluster for mersacidin synthesis. J Bacteriol 194, 3264-3265. doi: 10.1128/JB.00545-12.

He, P., Hao, K., Blom, J., Ruckert, C., Vater, J., Mao, Z., Wu, Y., Hou, M., He, P., He, Y., y Borriss, R. (2012). Genome sequence of the plant growth promoting strain Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum B9601-Y2 and expression of mersacidin and other secondary metabolites. J Biotechnol 164, 281-291.

Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K., y Pease, L.R. (1989). Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene 77, 61-68.

Hossain, M.J., Waldbieser, G.C., Sun, D., Capps, N.K., Hemstreet, W.B., Carlisle, K., Griffin, M.J., Khoo, L., Goodwin, A.E., Sonstegard, T.S., Schroeder, S., Hayden, K., Newton, J.C., Terhune, J.S., y Liles, M.R. (2013). Implication of lateral genetic transfer in the emergence of Aeromonas hydrophila isolates of epidemic outbreaks in channel catfish. PLoS One 8, e80943. doi: 10.1371/journal.pone.0080943.

Idriss, E.E., Makarewicz, O., Farouk, A., Rosner, K., Greiner, R., Bochow, H., Richter, T., y Borriss, R. (2002). Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect. Microbiology 148, 2097-2109.

Jeong, H., Choi, S.K., Kloepper, J.W., y Ryu, C.M. (2014). Genome Sequence of the Plant Endophyte Bacillus pumilus INR7, Triggering Induced Systemic Resistance in Field Crops. Genome Announc 2, 01093-01014.

Jeong, H., Jeong, D.-E., Kim, S.H., Song, G.C., Park, S.-Y., Ryu, C.-M., Park, S.-H., y Choi, S.-K. (2012). Draft Genome Sequence of the Plant Growth-Promoting Bacterium Bacillus siamensis KCTC 13613T. J Bacteriol 194, 4148-4149. doi: 10.1128/jb.00805-12.

Kamilova, F., Validov, S., Azarova, T., Mulders, I., y Lugtenberg, B. (2005). Enrichment for enhanced competitive plant root tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ Microbiol 7, 1809-1817.

Kim, B.K., Chung, J.H., Kim, S.Y., Jeong, H., Kang, S.G., Kwon, S.K., Lee, C.H., Song, J.Y., Yu, D.S., Ryu, C.M., y Kim, J.F. (2012). Genome sequence of the leaf- colonizing Bacterium Bacillus sp. strain 5B6, isolated from a cherry tree. J Bacterio! 194, 3758-3759. doi: 10.1128/JB.00682-12.

Kloepper, J.W., Ryu, C.M., y Zhang, S. (2004). Induced Systemic Resistance and Promotion of Plant Growth by Bacillus spp. Phytopathology 94, 1259-1266. doi: 10.1094/PHYTO.2004.94.11.1259.

Kloepper, J.W., y Schroth, M.N. (1978). Plant growth-promoting rhizobacteria on radishes. Proceedings o f the 4th International Conference on Plant Pathogenic Bacteria. Station de Pathologie Vegetale et Phytobacteriologie, INRA, Angers, France 2,879-882.

Kokalis-Burelle, N., Vavrina, C.S., Rosskopf, E.N., y Shelby, R.A. (2002). Field evaluation of plant growth-promoting Rhizobacteria amended transplant mixes and soil solarization for tomato and pepper production in Florida. Plant and Soil 238, 257-266.

Letunic, I., y Bork, P. (2011). Interactive Tree Of Life v2: online annotation and display of phylogenetic trees made easy. Nucleic Acids Res 39, W475-W478. doi: 10.1093/nar/gkr201.

Lugtenberg, B., y Kamilova, F. (2009). Plant-Growth-Promoting Rhizobacteria. Annu Rev Microbiol 63, 541-556. doi: doi: 10.114 6/annurev.micro.62.081307.162918.

Lukashin, A.V., y Borodovsky, M. (1998). GeneMark.hmm: new solutions for gene finding. Nucleic Acids Res 26, 1107 1115.

Medini, D., Serruto, D., Parkhill, J., Relman, D.A., Donati, C., Moxon, R., Falkow, S., y Rappuoli, R. (2008). Microbiology in the post-genomic era. Nat Rev Microbiol 6, 419-430. doi: 10.1038/nrmicrol901.

Nakkeeran, S., Fernando, W.G.D., y Siddiqui, Z.A. (2005). "Plant growth promoting rhizobacteria formulations and its scope in commercialization for the management of pests and diseases," in PGPR: Biocontrol and Biofertilization, ed. Z.A. Siddiqui. (Dordrecht, The Netherlands: Springer), 257-296.

Nemoz, G., Robert-Baudouy, J., y Stoeber, F. (1976). Physiological and genetic regulation of the aldohexuronate transport system in Escherichia coli. J Bacteriol 127, 706-718.

Ongena, M., Jourdan, E., Adam, A., Paquot, M., Brans, A., Joris, B., Arpigny, J.L., y Thonart, P. (2007). Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants. Environ Microbiol 9, 1084 1090. doi: 10.1111/j. 1462-2920.2006.01202.x.

Pfeiffer, W., y Stamatakis, A. (2010). "Hybrid MPI/Pthreads Parallelization of the RAxML Phylogenetics Code. En: Ninth IEEE International Workshop on High Performance Computational Biology (HiCOMB 2010).". (Atlanta, USA).

Podile, A.R., y Kishore, G.K. (2006). "Plant growth-promoting rhizobacteria," en Plant-Associated Bacteria, ed. S.S. Gnanamanickam. (Netherlands: Springer), pp. 195-230.

Ran, C., Carrias, A., Williams, M.A., Capps, N., Dan, B.C., Newton, J.C., Kloepper, J.W., Ooi, E.L., Browdy, C.L., Terhune, J.S., y Liles, M.R. (2012). Identification of Bacillus strains for biological control of catfish pathogens. PLoS One 7, e45793. doi: 10.137 l/journal.pone.0045793.

Reva, O.N., Dixelius, C., Meijer, J., y Priest, F.G. (2004). Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Ecol 48, 249-259. doi: 10.1016/j.femsec.2004.02.003.

Richter, M., y Rossello-Mora, R. (2009). Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic species definition. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 19126-19131. doi: 10.1073/pnas.0906412106.

Ruckert, C., Blom, J., Chen, X., Reva, O., y Borriss, R. (2011). Genome sequence of B. amyloliquefaciens type strain DSM7(T) reveals differences to plant-associated B. amyloliquefaciens FZB42. J Biotechnol 155, 78-85. doi: 10.1016/j.jbiotec.2011.01.006.

Ryu, C.-M., Farag, M.A., Hu, C.-H., Reddy, M.S., Kloepper, J.W., y Pare, P.W. (2004). Bacterial Volatiles Induce Systemic Resistance in Arabidopsis. Plant Physiol 134,1017-1026. doi: 10.1104/pp. 103.026583.

Saitou, N., y Nei, M. (1987). The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evo 4,406-425.

Sumpavapol, P., Tongyonk, L., Tanasupawat, S., Chokesajjawatee, N., Luxananil, P., y Visessanguan, W. (2010). Bacillus siamensis sp. nov., isolated from salted crab (poo-khem) in Thailand. Int J Syst Evol Microbio! 60, 2364-2370. doi: 10.1099/ijs.0.018879-0.

Tamura, K., Peterson, D., Peterson, N., Stecher, G., Nei, M., y Kumar, S. (2011). MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol Biol Evo 28, 2731-2739.

Xu, Z., Zhang, R., Wang, D., Qiu, M., Feng, H., Zhang, N., y Shen, Q. (2014). Enhanced control of cucumber wilt disease by Bacillus amyloliquefaciens SQR9 by altering the regulation of Its DegU phosphorylation. Appl Environ Microbio! 80, 2941-2950. doi: 10.1128/AEM.03943-13.

Yuan, J., Raza, W., Shen, Q., y Huang, Q. (2012). Antifungal Activity of Bacillus amyloliquefaciens NJN-6 Volatile Compounds against Fusarium oxysporum f. sp. cubense. Appl Environ Microbiol 78, 5942-5944. doi: 10.1128/aem.01357-12.

Zakataeva, N.P., Nikitina, O.V., Gronskiy, S.V., Romanenkov, D.V., y Livshits, V.A. (2010). A simple method to introduce marker-free genetic modifications into the chromosome of naturally nontransformable Bacillus amyloliquefaciens strains. Appl Microbiol Biotechnol 85,1201-1209. doi: 10.1007/s00253-009-2276-l.

Zhang, G.-Q., Bao, P., Zhang, Y., Deng, A.-H., Chen, N., y Wen, T.-Y. (2011). Enhancing electro-transformation competency of recalcitrant Bacillus amyloliquefaciens by combining cell-wall weakening and cell-membrane fluidity disturbing. Anal Biochem 409,130-137. doi: http://dx.doi.Org/10.1016/i.ab.2010.10.013.

Zimmerman, S.B., Schwartz, C.D., Monaghan, R.L., Pelak, B.A., Weissberger, B., Gilfillan, E.C., Mochales, S., Hernandez, S., Currie, S.A., Tejera, E., y otros. (1987). Difficidin and oxydifficidin: novel broad spectrum antibacterial antibiotics produced by Bacillus subtilis. I. Production, taxonomy and antibacterial activity. J Antibiot (Tokyo) 40, 1677-1681.

Ejemplo 2 - Propuesta de subvención para la "Estimulación con pectina del crecimiento de plantas y control de enfermedades por rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas" presentada a la estación experimental agrícola de Alabama

Resumen

Se han identificado rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) que controlan las enfermedades de las plantas y promueven el crecimiento general de las plantas. "Rizobacteria" significa bacterias que colonizan las raíces y, por lo tanto, la colonización de las raíces por las cepas PGPR es esencial para la promoción del crecimiento de las plantas. Las raíces de las plantas exudan diversos compuestos orgánicos, que incluye los azúcares, y el éxito de la colonización bacteriana depende de la absorción de los nutrientes de las plantas hospederas a través de la actividad enzimática extracelular. Las cepas de Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum {Bap) colonizan las raíces de las plantas y se han usado como biofertilizantes o agentes de biocontrol durante las últimas décadas. Algunas de las cepas PGPR de mejor rendimiento Bap de Auburn se han sometido a un análisis genómico comparativo, que indica que el uso de la pectina es un rasgo conservado entre estas cepas secuenciadas. Como un componente estructural de la pared celular de las plantas, se sabe mucho sobre la bioquímica de la pectina y la síntesis de las plantas; sin embargo, se sabe poco sobre el posible papel de la pectina en la colonización de las raíces. De hecho, el paradigma científico corriente considera la utilización de la pectina como una función expresada por los patógenos de las plantas, y no como una característica potencialmente útil expresada por las cepas PGPR asociadas a las plantas. Ahora tenemos evidencia experimental de que nuestras cepas PGPR de mejor rendimiento Bap pueden obtener carbono y energía a través de 1) la producción de una enzima(s) pectinolítica extracelular que degrada la pectina de las plantas en azúcares de hexuronato, 2) el transporte de azúcares derivados de la pectina y, 3) la utilización de estos azúcares derivados de la pectina para la respiración bacteriana. Mientras que estas cepas PGPR Bap se comportan consistentemente bien en condiciones de laboratorio o de invernadero, los pruebas de campo son más variables en la eficacia de las PGPR. Nuestra hipótesis es que la suplementación de los niveles de pectina en las semillas o en la rizosfera de las plantas mejorará la eficacia de las cepas PGPR para estimular el crecimiento de las plantas y el control de enfermedades. Nuestros objetivos específicos para probar esta hipótesis son: i) Cribar una gran colección de cepas Bap para la degradación y utilización de la pectina como única fuente de C, ii) Conducir un análisis genómico comparativo que incluye cepas Bap que carecen de la capacidad para la utilización de la pectina (ver Ejemplo 1 más arriba), y iii) Evaluar la suplementación con pectina junto con la cepa Bap (con y sin la capacidad de usar la pectina) para la promoción del crecimiento de la soja y el control de las enfermedades. La información derivada de este estudio proporcionará, por primera vez, una comprensión de las capacidades de promoción del crecimiento de las cepas PGPR influenciadas por la disponibilidad de la pectina. Los resultados de estos experimentos proporcionarán los datos preliminares necesarios para presentar propuestas competitivas de financiación externa a las agencias federales, particularmente el USDA y el NSF, en las que podríamos extender estos resultados a entornos de campo con múltiples especies de cultivos. El uso práctico de esta información podría permitir soluciones sostenibles para el control biológico de los patógenos agrícolas y promover el crecimiento de las plantas.

Introducción

Existe una necesidad creciente de alternativas ecológicamente sostenibles y eficaces al uso de antibióticos en la agricultura. La Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos ha aplicado políticas para reducir el uso de antibióticos en el ganado, las aves de corral y los cultivos (1), y se espera que estas políticas se vuelvan más estrictas en los Estados Unidos y en otros países. Esto ha impulsado la búsqueda de métodos sostenibles, como las estrategias probióticas descritas en esta propuesta, para el control de patógenos agrícolas y la mejora del crecimiento del animal y de las plantas sin depender de los antibióticos. Las rizobacterias que promueven el crecimiento de las plantas (PGPR) han demostrado ser prometedoras como agentes probióticos para el control biológico de las enfermedades y como biofertilizantes (2-5). Mientras que muchas especies de bacterias se clasifican como cepas PGPR, las especies de Bacillus se han estudiado de cerca debido a su actividad formadora de esporas que confiere una vida útil más prolongada y una mayor viabilidad en las formulaciones comerciales de biocontrol. Dentro de este género, el Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum (Bap) ha surgido recientemente como una especie de PGPR especialmente efectiva que carece de todo potencial para la patogénesis (6, 7). En la Universidad de Auburn, el profesor Kloepper ha recopilado un gran número (>300) de PGPR aisladas que muestran actividades de biocontrol y/o promoción del crecimiento de las plantas, de las cuales 59 se han identificado como cepas Bap. Trabajando en colaboración con el Prof. Liles, se han identificado cepas PGPR específicas Bap (gracias al soporte previo de a A e S y NSF) que tienen la capacidad de controlar la enfermedad en el bagre del canal (8) y se están usando en los ensayos controlados en estanques de producción de bagre este verano. Por lo tanto, existe un interés en usar las cepas PGPR como alternativas a los antibióticos en los cultivos y los animales de interés agrícola, de esta manera aumentar su efectividad en estas aplicaciones de agricultura y acuicultura.

Las cepas PGPR se consideran bioestimulantes, ya que son inoculantes microbianos que tienen interacciones probióticas beneficiosas con su planta hospedera (9). Por ejemplo, los inoculantes microbianos pueden solubilizar el fósforo y/o fijar nitrógeno que luego puede absorberse por las raíces de las plantas, estimulando directamente el crecimiento de las plantas. Existe una amplia literatura sobre el uso de inoculantes bacterianos para la fijación de nitrógeno (10), y muchas cepas de Bacillus spp. se han identificado como bacterias solubilizantes de fosfato con potencial comercial como biofertilizantes (11). Además, se ha encontrado que las cepas PGPR producen muchos metabolitos secundarios que tienen actividad antibiótica contra los patógenos bacterianos y/o fúngicos (12-14), y pueden inducir también el control de la enfermedad de la planta a través de la producción de compuestos que inducen la resistencia sistémica adquirida de las plantas (SAR; mediada por ácido salicílico) y los mecanismos de resistencia sistémica inducida (ISR; dependiente del ácido jasmónico) (15-17). De hecho, la colección de cepas PGPR secuenciadas Bap del laboratorio de Kloepper incluye cepas que se ha descubierto que inducen tanto la promoción del crecimiento de las plantas como el control de la enfermedad.

Los primeros estudios reportados sobre la bacterización de las semillas con propósitos agrícolas datan del uso de inoculantes de Rhizobium en las leguminosas en 1895 (18). En una variedad de estudios soviéticos e indios realizados durante los años 1960 y principios de 1970 (18) se observaron aumentos en el rendimiento de los cultivos de cereales después de la aplicación de inoculantes bacterianos. Sin embargo, los estudios de campo produjeron consistentemente rendimientos más bajos que los estudios de invernadero, lo que sugiere que la población microbiana introducida disminuyó rápidamente después de la inoculación en el suelo (18). Esta disminución se debió probablemente a la incapacidad de las cepas PGPR para competir con la microbiota normal de la rizosfera. A pesar de las dificultades inherentes al uso de inoculantes bacterianos, se estima que el mercado de bioestimulantes en América del Norte crecerá de $ 270 millones en el 2013 a $ 490 millones en el 2018, a una velocidad del 12,4 % anual (19). Por lo tanto, existe un gran interés en las estrategias que puedan mejorar la eficacia de las cepas PGPR para mejorar la productividad agrícola y reducir las enfermedades debido a las bacterias, hongos, nemátodos y virus.

Nuestros laboratorios han realizado un estudio genómico comparativo de nuestra cepa PGPR más eficiente Bap, y pudimos identificar 73 genes que estaban presentes consistentemente dentro de todos los 28 genomas estudiados (que incluyen algunas cepas publicadas por otros grupos), pero no presentes en otras cepas de B. amyloliquefaciens que se sabía que no tenían actividad PGPR (Figura 2C). Es importante destacar que encontramos que los genes relacionados con la captación (exuT) y la utilización (uxuB) de los azúcares derivados de la pectina (18) siempre se observaron dentro de estas cepas PGPR Bap. Esto llevó a nuestra hipótesis clave de que la suplementación con pectina podría aumentar la capacidad de colonización de las raíces y la actividad metabólica de las cepas B. amyloliquefaciens subsp. plantarum, de esta manera resulta en una mayor eficacia de estas cepas PGPR en términos del crecimiento de las plantas y biocontrol de la enfermedad.

Existe una base de conocimientos significativa para la bioquímica de la pectina y la biosíntesis de plantas que pueden beneficiar este proyecto. Henri Braconnot descubrió la pectina en 1825, y la pectina ha sido bien caracterizada como un heteropolisacárido principal de las paredes celulares primarias de las plantas, además de la celulosa y la hemicelulosa (20). Por ejemplo, la pared celular primaria del Sicomoro está compuesta por 34 % de pectina, 24 % de hemicelulosa, 23 % de celulosa, y 19 % de glucoproteína rica en hidroxiprolina (21). La pectina se encuentra en sus niveles más altos dentro de las frutas, las hojas, y las raíces de las plantas, por lo que esto es consistente con el potencial de la pectina para proporcionar una fuente necesaria de nutrientes derivados de la raíz por las cepas PGPR. La pectina también se encuentra en la lámina media entre las células, donde ayuda a unir las células, y la disponibilidad y la estructura de la pectina varía entre las especies de plantas (22). Los materiales pécticos se encuentran en los pelos de las raíces y tienen una capa más gruesa en los suelos arcillosos que en los suelos arenosos, y la duración de la pectina en las raíces puede depender de la actividad enzimática bacteriana en la rizosfera del suelo (23).

La degradación de la pectina ocurre a través de enzimas pectinolíticas denominadas pectina liasas que se encuentran en las bacterias, los hongos y las plantas superiores (24). Se sabe que las bacterias secretan pectinas liasas para degradar la pectina de las plantas. Esta trayectoria se reportó por primera vez en E. coli (25) y después se describió en Bacillus subtilis (26), pero además de nuestro estudio de genómica comparativa (manuscrito en revisión) y dos informes de anotaciones del genoma Bap (27, 28) no hay evidencia experimental de la utilización de la pectina por las cepas Bap o la importancia de la pectina en su eficacia como PGPR. La actividad pectinolítica se ha demostrado en los siguientes géneros bacterianos: Achromobacter, Arthrobacter, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Erwinia, Pseudomonas, y Xanthomonas (29, 30). Muchas de estas bacterias se reconocen como patógenos de las plantas, y la degradación de la pectina es una característica de la enfermedad de la podredumbre suave causada por Erwinia spp.; por lo tanto, la competencia por la pectina como fuente de nutrientes dentro de las rizosferas de las plantas podría ser uno de los mecanismos por los cuales las cepas PGPR Bap antagonizan a los patógenos de las plantas sin causar por sí mismas daños a las plantas. Tenemos evidencia experimental de que nuestras cepas Bap secuenciadas codifican y expresan una actividad de pectina liasa (Figura 5). Se necesitan experimentos adicionales para determinar si la expresión de la pectina liasa es un rasgo común entre todas nuestras cepas PGPR Bap disponibles (ver Enfoques).

Al producir y secretar pectinas liasas, las bacterias pueden degradar la pectina y absorber los azúcares derivados de la pectina D-glucuronato, D-galacturonato y D-manosa (31). Los azúcares glucuronato y galacturonato pueden absorberse por las bacterias a través de un transportador de hexuronato CexuT) sistema que codifica una hexuronato permeasa. A partir de nuestro estudio genómico comparativo hemos encontrado que el gen exuT se conserva entre todos las cepas PGPR secuenciadas Bap (n=28 con secuencias de genoma en proyecto). Subsecuentemente diseñamos un conjunto de cebadores de PCR dirigido al gen exuT en la cepa Bap y se usó este conjunto de cebadores para cribar las 59 cepas PGPR conocidas Bap de la colección de Auburn (en base a un análisis filogenético mediante el uso de ARNr 16S y secuencias de genes gyrB); de estos 59 cepas Bap, se encontraron 57 cepas positivas por PCR para exuT. La presencia de este transportador entre un gran porcentaje de estas cepas soporta la hipótesis de que la captación de pectina es una función crítica para las cepas Bap. Es posible que el resultado negativo de la PCR para dos cepas fuese un falso negativo (aunque esto se repitió 3 veces) o represente genes exuT que no se reconocen por el conjunto de cebadores. Por esta razón, es importante evaluar la utilización actual de la pectina como única fuente de C (ver el Objetivo 1 en la sección Enfoque).

Además de la absorción de los azúcares derivados de la pectina, también es crítico que las bacterias que utilizan la pectina tengan la trayectoria de degradación para usar los azúcares de hexuronato como fuente de C y de energía. Los genes uxuB codifican una D-fructuronato oxidorreductasa que es una de las enzimas responsables de la degradación intracelular del glucuronato y el galacturonato en 2-ceto 3- desoxigluconato (KDG) en las bacterias E. coli y Erwinia chrysanthemi (32), y el KDG se metaboliza posteriormente a piruvato y 3-fosfogliceraldehído. Al igual que con el exuT, identificamos el uxuB como un gen que se conserva universalmente entre las 28 cepas PGPR secuenciadas Bap. Igualmente, recientemente cribamos la colección más grande de 59 cepas PGPR de Auburn Bap para la presencia del gen uxuB y se encontró que 54 cepas resultaron positivas para uxuB. No sabemos si las 5 cepas que resultaron negativas por PCR para uxuB carecen de la capacidad de utilización de la pectina como única fuente de C (ver Objetivo 1 en la sección Enfoque). La identificación de las cepas PGPR específicas que carecen de la capacidad de captar o usar pectina como única fuente de C será útil porque luego podemos usar esta cepa(s) como control negativo que presumiblemente no respondería a la disponibilidad de pectina exógena adicional.

El glucuronato, el galacturonato y la manosa pueden usarse como fuentes primarias de carbono y energía por las bacterias tales como Erwinia chrysanthemi (31, 33). Dado que la adquisición de carbono es esencial para la generación de energía bacteriana y la biosíntesis (34), formulamos la hipótesis de que una mayor disponibilidad de pectina podría promover la supervivencia, la persistencia y la actividad metabólica de las cepas PGPR Bap cepas dentro de la rizosfera de las plantas, lo que mejora el crecimiento de las plantas y el control de la enfermedad. ¿Quizás una mejor eficacia de la PGPR se correlaciona con la cantidad de pectina disponible dentro de las raíces o las semillas de determinadas especies de plantas? En esta propuesta nos centramos en la cuestión de si la pectina suministrada de forma exógena puede inducir una mejor eficacia de la PGPR, y en las propuestas extramuros posteriores podríamos explorar las diferencias entre el contenido de pectina de las especies de plantas {por ejemplo, en los mutantes genéticos de Arabidopsis thaliana que carecen de la síntesis de pectina en comparación con los niveles de pectina de plantas de tipo salvaje) y si esto se correlaciona con la eficacia de la PGPR para promover el crecimiento de las plantas y el control de la enfermedad. Sólo hay un informe en la literatura concerniente al uso de pectina cruda suministrada de forma exógena para estimular el crecimiento de bacterias asociadas a las plantas, en el caso del Azospirillum fijador de nitrógeno aislado que tuvo una abundancia incrementada en los suelos suplementados con pectina (35). Sin embargo, en esta investigación no se intentó evaluar ningún beneficio para las plantas en términos de promoción del crecimiento o control de la enfermedad. Por lo tanto, la enmienda de la pectina junto con una cepa PGPR en las semillas o las raíces de las plantas podría ser una forma innovadora de promover el crecimiento de las plantas y reducir la enfermedad, y reducir la variabilidad inherente en los ensayos de campo de las cepas PGPR.

Racional y significativo

Existe un ímpetu creciente para encontrar los medios sostenibles de mejoramiento animal y la salud de las plantas en la agricultura sin recurrir al uso de antibióticos. Las recientes iniciativas federales para reducir el uso de antibióticos y encontrar los métodos alternativos para mejorar la salud animal y de las plantas son muy sinérgicas con esta propuesta de investigación. Antes de presentar las propuestas de financiación federal, necesitamos probar la hipótesis de que la suplementación con pectina puede aumentar la eficacia de las cepas PGPR en la inducción del crecimiento de las plantas y el control de la enfermedad. Por lo tanto, esta propuesta de la AAES es esencial para poder hacer avanzar esta investigación a una etapa en la que sea competitiva para el apoyo externo. Existen múltiples formas en las que el conocimiento de las funciones de la pectina en las interacciones entre las bacterias y las plantas pueden beneficiar la aplicación práctica de las cepas PGPR: 1) La suplementación de la pectina en las semillas podría mejorar la colonización de la rizosfera por PGPR, lo que podría conducir a beneficios más significativos en el crecimiento de las plantas y la reducción de la enfermedad 2) La persistencia de las cepas PGPR dentro de las rizosferas de las plantas podría mejorar mediante lavados periódicos de la rizosfera con la pectina, 3) El control de la enfermedad mediado por cepas PGPR ocurre a través de múltiples mecanismos (antagonismo directo, SAR e ISR), que podrían mejorarse calibrando el tiempo de inoculación de la PGPR y la pectina para reducir mejor la presión de la enfermedad de los patógenos en las plantas.

Enfoque

Nuestro enfoque experimental se centrará primero en ampliar nuestro conocimiento del uso de la pectina a todas las 59 cepas PGPR Bap de la colección Auburn del Prof. Kloepper. Nuestra cribado preliminar basado en PCR soporta la hipótesis que la pectina es una fuente importante de C y energía para la mayoría de las cepas PGPR Bap, y los experimentos en el Objetivo 1 proporcionarán evidencia directa de la utilización de la pectina por estas cepas. Es importante señalar que también se espera que el Objetivo 1 indique algunos cepas Bap que no tienen la capacidad de utilizar pectina. Predecimos que estas cepas incompetentes con la pectina estarán en desventaja competitiva para la colonización de las raíces, y entonces será importante incluir estas cepas como controles negativos en el Objetivo 3 para la comparación con las cepas que utilizan pectina. Para comprender la base genética de la incompetencia con la pectina, en el Objetivo 2 elegiremos una cepa representativa BAp que es negativa en la actividad de la pectina liasa y/o la utilización de la pectina como única fuente de C (resultado del Objetivo 1) para la secuenciación del genoma y las comparaciones genómicas con otras cepas Bap. Esto proporcionará información útil sobre los cambios genéticos específicos que se han producido en la pequeña minoría de las cepas Bap que carecen de la capacidad de utilizar pectina, e indica qué otros carbohidratos derivados de las plantas se utilizan en estas cepas. De manera más importante, el Objetivo 3 probará la hipótesis general de que la suplementación de los niveles de pectina en las semillas o en la rizosfera de las plantas mejorará la eficacia de las cepas PGPR Bap en la estimulación del crecimiento de las plantas y el control de la enfermedad. Usaremos múltiples cepas Bap, que incluye al menos una cepa que carece de la capacidad de utilizar pectina, y aplicará un intervalo de concentraciones de pectina como enmiendas de las semillas o lavados de la rizosfera.

Objetivo 1: Cribar una gran colección de cepas Bap para la actividad de la pectina liasa y la utilización de la pectina como única fuente de C.

Hipótesis: La mayoría de las cepas Bap expresarán la actividad de la pectina liasa y podrán utilizar la pectina como única fuente de carbono.

Métodos

Objetivo 1.1: Prueba de las cepas Bap para la actividad de la pectina liasa: Se usará medio de agar-pectato para determinar la actividad de la pectina liasa de la cepa Bap. Las bacterias se cultivarán a partir de criopreservados a -80 °C en agar de soja tríptico (TSA) a 28 °C durante toda la noche, y se usará una colonia aislada para inocular un cultivo de caldo de soja tríptico (TSB) de 2 mL que se incubará a 28 °C con agitación a 250 rpm durante toda la noche. A continuación, se pipeteará una alícuota de 1 mL del cultivo nocturno en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y las células bacterianas se lavarán tres veces sometiendo el cultivo a centrifugación a 10 000 x g durante 5 min y luego resuspendiendo el sedimento bacteriano en 1 x solución salina regulada con fosfato (PBS) y repitiendo el proceso. Para proporcionar un inóculo uniforme, la resuspensión bacteriana se usará para inocular 1 x PBS en un tubo de cultivo de 2 mL y medir la turbidez de la suspensión bacteriana con un espectrofotómetro hasta que la densidad óptica a 600 nm sea aproximadamente 0,5. Esta suspensión bacteriana normalizada se usará para inocular 20 microlitros de suspensión por triplicado en un medio de agar-pectato (36) usado para la determinación de la actividad de la pectina liasa. Las placas de medio agar-pectato se incubarán a 28 °C durante toda la noche y luego se verterá bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB) al 1 % sobre la superficie de la placa, con una zona clara presente alrededor de la colonia bacteriana (Figura 5) que se formará después de 30 min lo que indica actividad de la pectina liasa. La magnitud de la zona de aclaramiento se medirá en mm y se registrará en una hoja de cálculo de Excel, determinándose el promedio de las zonas de aclaramiento para cada uno de los cultivos Bap.

Objetivo 1.2: Prueba de las cepas Bap para el uso de la pectina como única fuente de C: La capacidad de cada una de las 59 cepas Bap para utilizar la pectina como única fuente de C se evaluarán mediante el uso de un medio mínimo de sales Tris-Spizizen (TSS) (37) como medio base suplementado con pectina de las plantas al 1 % (fuente de cítricos). Cada uno de los cultivos bacterianos se preparará como para los ensayos de pectina liasa con suspensiones bacterianas lavadas en 1 x PBS, normalizadas a un ODeoo = 0,5, y luego se usarán 100 microlitros de una dilución 1:100 para inocular 1,9 mL de TSS cultivos de pectina al 1 %, por triplicado. Los cultivos de caldo se incubarán a 28 °C con agitación y se tomarán lecturas de DO600 durante un período de 36 horas. En un experimento preliminar, observamos que dos de nuestras cepas PGPR previamente secuenciadas Bap, AP143 y AP193, podrían utilizar pectina como fuente de C para el crecimiento (Figura 6). Como control negativo, una cepa no PGPR Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki HD73 se obtuvo a partir de la colección de cultivos del USDA ARS (Ames, Iowa) que se identificó como una cepa que no utiliza pectina en base a su secuencia del genoma. No se observó que esta cepa creciera usando pectina como única fuente de C (Figura 6).

Resultados potenciales: Las cepas Bap que se ha confirmado que contienen los genes exuT y uxuB expresarán la actividad de la pectina liasa y crecerán usando pectina como única fuente de C. Algunas cepas mostrarán una zona más grande de aclaramiento en los experimentos de pectina liasa, y se usará cualquier cepa de alta expresión en los experimentos subsecuentes.

Puede haber cepas que no crecen usando pectina como única fuente de C, y una de estas cepas puede usarse en el Objetivo 2 para la genómica comparativa y en el Objetivo 3 como control negativo.

Problemas potenciales: Es posible que a pesar de tener los genes necesarios, una cepa no exprese fenotípicamente la actividad de la pectina liasa o la utilización de la pectina bajo condiciones in vitro. Con base en los resultados preliminares, no esperamos que esto sea un problema, y sabemos que tenemos al menos dos cepas, AP143 y AP193, que se identificaron previamente como cepas PGPR de alto rendimiento, se sometieron a la secuenciación del genoma y se ha demostrado que se degradan y usan pectina como fuente de C.

Objetivo 2: Conducir un análisis genómico comparativo que incluye la cepa(s) Bap que carecen de la capacidad de la utilización de la pectina

Hipótesis: Una cepa(s) Bap incapaz de usar la pectina tendrá(n) reordenamientos genómicos en las trayectorias responsables de la degradación y/o la utilización de la pectina.

Métodos

Objetivo 2.1: Determinar la secuencia del genoma para la(s) cepa(s) que carece(n) de la utilización de la pectina: Con base en los resultados del Objetivo 1, seleccionaremos la(s) cepa(s) Bap para la secuenciación del genoma que no tienen ninguna evidencia de la degradación de la pectina y/o la utilización de la pectina. Con base en los resultados del cribado basado en PCR de los genes exuT y uxuB (ver más arriba), esperamos que algunas cepas sean negativas para la utilización de la pectina como única fuente de C. Cada cepa se cultivará en escala media (-100 mL de TSB) a 28 °C hasta que el cultivo alcance un ODeoo de 0,5-0,8. El aislamiento del ADN genómico se llevará a cabo mediante el uso de un método de batido de perlas severo (MoBio, Carlsbad, California) con el fin de lograr un rendimiento suficiente de ADNg a partir de bacterias grampositivas. El ADNg se cuantificará mediante el uso de un fluorómetro Qubit. Si logramos ADNg de alta calidad > 50 ng para cada cepa, entonces usaremos un estuche de etiquetado Nextera (Illumina, San Diego, CA) para la preparación de sub-bibliotecas con códigos de barras (de cualquier otra manera, se adoptará el estuche Nextera XT que puede usar tan solo 1 ng de ADNg). Incluiremos no más de 5 cepas por ejecución de la secuenciación MiSeq de Illumina (disponible en el edificio de Rouse Life Sciences), y usaremos una concentración final de 12 pM de las bibliotecas de códigos de barras agrupadas junto con un aumento del 1 % del control interno PhiX. Los datos de la secuencia se exportarán en formato .fastq desde MiSeq y se importarán a CLC Genomics Workbench (CLC bio, Cambridge, MA). Recortaremos las secuencias por la calidad (ajuste de recorte 0,01), seguido de un ensamble de novo. Si los cóntigos grandes no resultan del ensamblaje, evaluaremos diferentes criterios de ensamblaje mediante el uso de ensambladores CLC Genomics, Ray y VelvetOptimiser, con el fin de identificar los cóntigos más grandes posibles para cada cepa. Con base en nuestra experiencia anterior con la secuenciación de próxima generación y el ensamblaje de los genomas bacterianos, esperamos excelentes resultados cuando se alcanza una cobertura > 80x.

Objetivo 2.2: Analizar los genomas para las trayectorias de utilización de las pectinas y los carbohidratos: Las secuencias del genoma bacteriano se anotarán al exportar el conjunto completo de cóntigos para cada cepa en el servidor RAST (http://rast.nmpdr.org/). La salida de RAST indicará la presencia de las trayectorias de utilización de los carbohidratos predichas. Además, compararemos manualmente el conjunto completo de cóntigos del genoma para cada cepa con los genes requeridos para la pectina liasa (pelB), el transporte de hexuronato (exuT) y la utilización de hexuronato (uxuB) obtenidos de la cepa Bap API 93 mediante el uso de las comparaciones por pares de tBLASTx en NCBI. Estos análisis indicarán la presencia de genes específicos si están presentes en un genoma incluso si el cribado previo basado en PCR fue inefectivo debido a diferencias en la secuencia de los genes en el sitio de hibridación del cebador. Además, compararemos la arquitectura genómica de cada cepa que no utiliza pectina con la de API93 y otros genomas secuenciados Bap para consultar la región local que rodea cada trayectoria de utilización de la pectina. Esto podría indicar si la naturaleza del defecto en la utilización de la pectina se relaciona con la regulación transcripcional (cambio en la región promotora), mutaciones puntuales en loci genéticos específicos, o deleción genética completa o reordenamiento de las trayectorias de utilización de la pectina.

Resultados potenciales: Un proyecto del genoma para las cepas Bap que carecen de la capacidad de degradar y/o utilizar la pectina, y la anotación de los genes y las regiones genómicas implicadas en cada trayectoria.

Problemas potenciales: Tenemos una experiencia considerable en la realización de las ejecuciones de secuenciación MiSeq (> 20 en Auburn), pero puede haber variabilidad con respecto al rendimiento de la secuenciación obtenido por cepa. Para mitigar esto, intentaremos lograr al menos una cobertura del genoma 100x en la cepa, y también presupuestar dos ejecuciones de secuenciación en caso de que haya algún problema con la primera ejecución de secuenciación.

Objetivo 3: Evaluar la suplementación con la pectina junto con la cepa Bap para la promoción del crecimiento de la soja y el control de la enfermedad

Hipótesis: Suplementar los niveles de pectina en las plántulas de soja mejorará la eficacia de las cepas PGPR Bap en la estimulación del crecimiento de las plantas y el control de la enfermedad.

Métodos:

Objetivo 3.1: Determinar la mejora dependiente de la dosis de pectina del crecimiento de la cepa PGPR:

Es importante determinar primero la concentración de pectina que se usará en los experimentos subsecuentes de crecimiento de las plantas. Con el fin de rastrear la colonización de las cepas, seleccionaremos los mutantes resistentes a rifampicina (50 pg/mL Rif) en TSA y seleccionaremos tres mutantes Rif independientes1* por cepa para usar como réplicas. Las semillas de soja (Park Seed, Hodges, SC) se sembrarán en bandejas de poliestireno y tres semanas después de plantar las plántulas se trasplantarán a una maceta cuadrada de 4,5 pulgadas con un sustrato comercial para macetas (Sunshine mix, Sun Gro Horticulture, Agawam, Maine). Tres días después del trasplante, las plántulas se lavarán con 10 mL de esporas AP193 o HD73 (106 UFC/plántula) aplicada en 1) agua estéril, 2) pectina al 0,01 % (p/v), 3) pectina al 0,1 %, o 4) pectina al 1 %, con cada uno de los 8 grupos de tratamiento (2 cepas x 4 cantidades de pectina) en cuadruplicado para 32 macetas en total. Las plantas serán transferidas al invernadero y regadas diariamente durante 21 días. La suplementación con pectina a las concentraciones indicadas se realizará a intervalos semanales. A los 21 días después de la inoculación, se tomarán muestras de 10 g de suelo rizosférico de cada una de las macetas, y se determinarán los pesos de los brotes secos y las raíces. El suelo se homogeneizará en 90 mL de agua estéril (dilución 10_1) y luego se diluye en serie dilución 10"6 y cada una de las diluciones de 10"1 a 10"6 se depositará sobre las placas TSA para determinar el número de unidades formadoras de colonias RifR (UFC)/g de suelo. Se espera que los resultados de este experimento muestren un aumento dependiente de la dosis de pectina significativo en la cepa AP193 UFC/g de suelo, sin un aumento significativo observado para la cepa HD73 incompetente con la pectina. La dosis más baja de pectina que muestre la inducción más fuerte se usará en el Objetivo. 3.2.

Resultados potenciales: Determinación de la(s) concentración(es) de pectina que dan lugar a un mayor crecimiento de la cepa PGPR Bap cuando se modifica en un sustrato para macetas.

Problemas potenciales: Idealmente, este experimento se realizaría mediante el uso de un suelo agrícola; sin embargo, es extremadamente difícil discriminar entre la microbiota de la rizosfera autóctona y la cepa PGPR inoculada en el suelo. Seleccionamos una mezcla para macetas porque es lo que se usa comúnmente para los cultivos en invernadero, por lo que es relevante para las condiciones usadas por los cultivadores comerciales, mientras que permite también un reconocimiento más fácil de la cepa PGPR que tiene una morfología de colonia única. Para confirmar que los recuentos de UFC se deben a la cepa PGPR inoculada Bap API93, se seleccionarán las colonias representativas para realizar la PCR mediante el uso de un conjunto de cebadores de PCR específicos de la cepa API93 que se ha desarrollado en el laboratorio de Liles (no se muestran los datos).

Objetivo 3.2: Evaluar la inducción de la pectina en la promoción del crecimiento de las plantas mediada por PGPR:

Las plántulas de soja se sembrarán en macetas más grandes de 8 pulgadas que contienen un suelo franco arenoso para macetas al que se añaden 497 mg de fitato por kg. Anteriormente se ha demostrado que la cepa Bap FZB42 puede mediar sus efectos de promoción del crecimiento de las plantas en parte a través de la actividad de la fitasa, y que la adición de fitato al suelo puede ayudar a observar este efecto de promoción del crecimiento de las plantas mediado por PGPR (38). Los grupos de tratamiento incluirán 1) tratamiento sin esporas, 2) 106 UFC/plántula cepa PGPR Bap AP193 y 3) 106 UFC/plántula de otra cepa PGPR Bap que muestra una fuerte actividad de pectina liasa (del Objetivo 1). Las plántulas de cada grupo de tratamiento se ensoparán dos días después de su transferencia al invernadero con agua estéril o pectina (a un % que se determina más arriba), mediante el uso de diez réplicas con un diseño completamente aleatorio. Por lo tanto, habrá 6 grupos de tratamiento x 10 réplicas = 60 macetas en total. La adición de pectina se producirá a intervalos de 1 semana y las plantas se cultivarán durante 4 semanas. El peso en seco y fresco de la raíz y el brote se medirá a la terminación del experimento en el invernadero. La morfología de las raíces se analizará por un escáner de raíces. El peso en seco y fresco de los brotes y la variación de las raíces de cada tratamiento se comparará y analizará mediante el uso de ANOVa a un nivel de significancia del 5 % (programa SAS 9.1).

Resultados potenciales: La adición de pectina a las semillas de soja tratadas con Bap darán como resultado un aumento en el crecimiento de las raíces y los brotes de soja con relación a las plantas no tratadas con pectina. No se observará ningún aumento mediado por la pectina en las plantas sin el inóculo de la cepa PGPR.

Problemas potenciales: Puede haber problemas imprevistos, como un brote de enfermedad, en las plantas experimentales. Tomaremos amplias precauciones para limitar la incidencia de la enfermedad, y planeamos repetir este experimento al menos una vez y más si es necesario. El tiempo del experimento puede necesitar extenderse para lograr diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Podría ser útil incluir otras especies de cultivos (en propuestas extramuros), ya que el contenido de pectina puede variar en diferentes especies de plantas y la suplementación con pectina podría ser más útil en las plantas con un contenido limitado de pectina.

Objetivo 3.3: Evaluar la inducción de la pectina en el control de la enfermedad en las plantas mediada por PGPR:

Evaluaremos el control de la enfermedad en las plantas inducida por pectina mediante el uso de dos patógenos diferentes: Pythium ultimum que causa el marchitamiento de las plántulas antes y después de la emergencia, y Rhizoctonia solani que causa podredumbre de la raíz y lesiones del hipocótilo en el pepino y la soja, respectivamente. Por lo tanto, se completarán dos grupos separados de experimentos, uno con cada patógeno. Las cepas PGPR Bap se aplicarán como esporas de 106 UFC, una tasa común usada con las PGPR como tratamientos comerciales de semillas, a cada semilla de pepino o soja en una bandeja de poliestireno, y se aplicará un ensope de 10 mL de pectina en la dosis usada en el Experimento #2 en el tiempo cero. Incluiremos al menos dos cepas PGPR Bap que se conocen, de los trabajos anteriores en el laboratorio de Kloepper, para inhibir el marchitamiento del Pythium y la podredumbre de la raíz Rhizoctonia y fueron positivos para la utilización de la pectina en el Objetivo #1, junto con dos controles negativos: una cepa no PGPR HD73 y una cepa PGPR no competente en pectina identificada en el Objetivo #1 y secuenciada en el Objetivo #2. Por lo tanto, cada experimento contendrá 8 tratamientos: 2 cepas PGPR previamente demostradas para controlar el patógeno respectivo y dos cepas de control negativo, con y sin suplementación de pectina. Usaremos diez réplicas y los experimentos se realizarán en un diseño completamente aleatorio. Después de 3 días y antes de la germinación de la planta, un cultivo de Pythium ultimum o Rhizoctonia solani, respectivamente, cultivado en agar de patata-dextrosa se homogeneizará dentro del agar, se diluirá con agua estéril y se homogeneizará más, y luego se usará para inocular plántulas con aprox. 106 células/mL en 10 mL. Las plantas inoculadas se colocarán en una cámara de rocío al 100 % de humedad en la oscuridad durante 2 días a 24 °C y luego se trasplantarán a una maceta y se transferirán al invernadero. Las plantas serán regadas diariamente y monitoreadas para el marchitamiento. A los 7 y 14 días después de la inoculación del patógeno, se determinará el recuento de mortalidad de las plantas para cada grupo de tratamiento, y estos datos se compararán y analizarán mediante el uso del ANOVA a un nivel de significancia del 5 % (SAS 9.1).

Resultados potenciales: La adición de pectina a las semillas de pepino y soja tratadas con Bap dará como resultado una mayor protección de las cepas PGPR contra el Pythium ultimum y el marchitamiento mediado por Rhizoctonia solani, respectivamente.

Problemas potenciales: Hay varias variables que podrían afectar este experimento, en particular el momento de la inoculación de la PGPR, la pectina y el patógeno en las plántulas de pepino y soja. En dependencia de los resultados del experimento, es posible que necesitemos cambiar el tiempo y/o la concentración de estos factores al repetir este experimento. Además, debido a que estos patógenos inducen el marchitamiento en un punto temprano del ciclo de vida de la planta, puede haber un número suficiente de células metabólicamente activas Bap presentes en los primeros puntos de tiempo de manera que las enmiendas de pectina son menos necesarias. Si se observa esto, entonces podemos considerar el uso de un desafío alternativo patógeno con las plantas de pepino o soja más maduras.

Referencias

1. Kuehn BM. 2012. FDA aims to curb farm use of antibiotics. JAMA : the journal of the American Medical Association 307:2244-2245.

2. Raupach GS, Kloepper JW. 1998. Mixtures of plant growth-promoting rhizobacteria enhance biological control of multiple cucumber pathogens. Phytopathology 88:1158-1164.

3. Adesemoye AO, Torbert HA, Kloepper JW. 2009. Plant growth- promoting rhizobacteria allow reduced application rates of chemical fertilizers. Microbial ecology 58:921-929.

4. Yan Z, Reddy MS, Ryu CM, Mclnroy JA, Wilson M, Kloepper JW. 2002. Induced systemic protection against tomato late blight elicited by plant growth- promoting rhizobacteria. Phytopathology 92:1329-1333.

5. Ryu CM, Murphy JF, Mysore KS, Kloepper JW. 2004. Plant growth- promoting rhizobacteria systemically protect Arabidopsis thaliana against Cucumber mosaic virus by a salicylic acid and NPR1-independent and jasmonic aciddependent signaling pathway. The Plant journal : for cell and molecular biology 39:381-392.

6. Compaore CS, Nielsen DS, Sawadogo-Lingani H, Berner TS, Nielsen KF, Adimpong DB, Diawara B, Ouedraogo GA, Jakobsen M, Thorsen L. 2013. Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum strains as potential protective starter cultures for the production of Bikalga, an alkaline fermented food. J Appl Microbiol 115:133-146.

7. Avdeeva LV, Dragovoz IV, Korzh Iu V, Leonova NO, Iutinskaia GA, Berezhnaia AV, Kuptsov VN, Mandrik MN, Kolomiets EI. 2014. [Antagonistic activity of Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum IMV B-7404 and BIM B-439D strains towards pathogenic bacteria and micromycetes]. Mikrobiol Z 76:27-33.

8. Ran C, Carrias A, Williams MA, Capps N, Dan BC, Newton JC, Kloepper JW, Ooi EL, Browdy CL, Terhune JS, Liles MR. 2012. Identification of Bacillus strains for biological control of catfish pathogens. PloS one 7:e45793.

9. Calvo P, Nelson, L & Kloepper, J.W. 2014. Agricultura! uses of plant biostimulants. Plant Soil.

10. Bashan Y, de-Bashan LE, Prabhu SR, Hernandez JP. 2014. Advances in plant growth-promoting bacterial inoculant technology: formulations and practical perspectives (1998-2013). Plant Soil 378:1-33.

11. Zaidi S, Usmani S, Singh BR, Musarrat J. 2006. Significance of Bacillus subtilis strain SJ-101 as a bioinoculant for concurrent plant growth promotion and nickel accumulation in Brassica juncea. Chemosphere 64:991-997.

12. He PF, Hao K, Blom J, Rueckert C, Vater J, Mao ZC, Wu YX, Hou MS, He PB, He YQ, Borriss R. 2012. Genome sequence of the plant growth promoting strain Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum B9601-Y2 and expression of mersacidin and other secondary metabolites. Journal of biotechnology 164:281-291.

13. Mariappan A, Makarewicz O, Chen XH, Borriss R. 2012. Two- Component Response Regulator DegU Controls the Expression of Bacilysin in Plant-Growth-Promoting Bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Journal of molecular microbiology and biotechnology 22:114-125.

14. Blom J, Rueckert C, Niu B, Wang Q, Borriss R. 2012. The Complete Genome of Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum CAU B946 Contains a Gene Cluster for Nonribosomal Synthesis of Iturin A. Journal of bacteriology 194:1845-1846.

15. Raupach GS, Kloepper JW. 1998. Mixtures of plant growth-promoting rhizobacteria enhance biological control of multiple cucumber pathogens. Phytopathology 88:1158-1164.

16. Altinok HH, Dikilitas M, Yildiz HN. 2013. Potential of Pseudomonas and Bacillus Isolates as Biocontrol Agents against Fusarium Wilt of Eggplant. Biotechnol Biotec Eq 27:3952-3958.

17. Kloepper JW, Ryu CM, Zhang SA. 2004. Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillus spp. Phytopathology 94:1259-1266.

18. Kloepper JW. 1994. Plant-growth-promoting rhizobacteria (other systems), p. 139 - 154. En Okon Y (ed.), Azospirillum/plant associations. CRC Press, Boca Ratón.

19. Anónimo, fecha de publicación 2013. Biostimulants market - By Active Ingredients, Applications, Crop Types & Geography — Global T rends & Forecasts a 2018. [en línea.]

20. Anónimo, fecha de publicación. Plant Cell walls. University of Georgia, USA [en línea.]

21. Darvill A, McNeil M, Albersheim P, Delmer D. 1980. The primary cell walls of flowering plants. The biochemistry of plants 1:91-162.

22. Srivastava P, Malviya R. 2011. Sources of pectin, extraction and its applications in pharmaceutical industry-An overview. Indian journal of natural products and resources 2:10-18.

23. Howe CG. 1921. Pectic material in root hairs. Botanical gazette:313- 320.

24. Namasivayam E, Ravindar J, Mariappan K, Jiji A, Kumar M, Jayaraj RL. 2011. Production of extracellular pectinase by Bacillus cereus isolated from market solid waste. J Bioanal Biomed 3:070-075.

25. Ashwell G, Wahba AJ, Hickman J. 1960. Uronic acid metabolism in bacteria I. purification and properties of uronic acid isomerase in escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 235:1559-1565.

26. Kloepper J, Metting Jr F. 1992. Plant growth-promoting rhizobacteria as biological control agents. Soil microbial ecology: applications in agricultural and environmental management.:255-274.

27. Niazi A, Manzoor S, Asari S, Bejai S, Meijer J, Bongcam-Rudloff E. 2014. Genome analysis of Bacillus amyloliquefaciens Subsp. plantarum UCMB5113: a rhizobacterium that improves plant growth and stress management. PloS one 9:el04651.

28. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I, Morgenstern B, Voss B, Hess WR, Reva O, Junge H, Voigt B, Jungblut PR, Vater J, Sussmuth R, Liesegang H, Strittmatter A, Gottschalk G, Borriss R. 2007. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature biotechnology 25:1007-1014.

29. Rombouts FM. 1972. Occurrence and properties of bacterial pectate lyases. Landbouwhogeschool te Wageningen.

30. Voragen AGJ. 1972. Characterization of pectin lyases on pectins and methyl oligogalacturonates.

31. Mekjian KR, Bryan EM, Beall BW, Moran CP. 1999. Regulation of Hexuronate Utilization inBacillus subtilis. Journal of bacteriology 181:426-433.

32. Hugouvieux-Cotte-Pattat N, Nasser W, Robert-Baudouy J. 1994. Molecular characterization of the Erwinia chrysanthemi kdgK gene involved in pectin degradation. Journal of bacteriology 176:2386-2392.

33. Hugouvieux-Cotte-Pattat N, Robert-Baudouy J. 1987. Hexuronate catabolism in Erwinia chrysanthemi. Journal of bacteriology 169:1223-1231.

34. Kenneth T. Nutrition and Growth of Bacteria, p. 01-06, libro de texto en línea de bacteriología Libro de texto en línea.

35. Mehanni MMaM, H.A. 2012, p 99 - 111. Egypt Journal of Botany 2nd International Conference, Minia University. 36. Kobayashi T, Koike K, Yoshimatsu T, Higaki N, Suzumatsu A, Ozawa T, Hatada Y, Ito S. 1999. Purification and properties of a low-molecular-weight, high-alkaline pectate lyase from an alkaliphilic strain of Bacillus. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 63:65-72.

37. Shingaki R, Kasahara Y, Iwano M, Kuwano M, Takatsuka T, Inoue T, Kokeguchi S, Fukui K. 2003. Induction of L-formlike cell shape change of Bacillus subtilis under microculture conditions. Microbiology 149:2501-2511.

38. Ramírez CA, Kloepper JW. 2010. Plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB45 depends on inoculum rate and P-related soil properties. Biol Fert Soils 46:835-844.

La invención descrita ilustrativamente en la presente descripción puede ponerse en práctica adecuadamente en la ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, que no se describen específicamente en la presente descripción. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y no se pretende con su uso excluir ningún equivalente de las características que se muestran y describen o porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.

Así, debe entenderse que aunque la presente invención se ha ilustrado por modalidades específicas y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y/o la variación de los conceptos descritos en la presente descripción, y que tales modificaciones y variaciones se consideren dentro del alcance de esta invención como se define en las reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un inoculante que comprende: (a) una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina seleccionada de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, pectina esterasa, altronato deshidratasa, altronato oxidorreductasa, uronato isomerasa, manonato deshidratasa, D-manonato oxidorreductasa, 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa, represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato, transportador de hexuronato, y sus combinaciones y (b) un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina que comprende pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato, o sus mezclas, en donde la PGPR es Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum.

2. El inoculante de la reivindicación 1, en donde el sacárido es un polisacárido que comprende monómeros de D-galacturonato.

3. El inoculante de la reivindicación 1, en donde el sacárido es un heteropolisacárido que comprende monómeros de D-galacturonato que representa al menos el 50 % de todos los monómeros del heteropolisacárido.

4. El inoculante de la reivindicación 3, en donde el heteropolisacárido comprende además uno o más monómeros seleccionados de D-xilosa, D-apiosa, y L-ramnosa.

5. El inoculante de la reivindicación 1, en donde el sacárido es una mezcla heterogénea de polisacáridos o monosacáridos que comprende monómeros de D-galacturonato o monómeros de D-glucuronato, y la suma de los monómeros de D-galacturonato y los monómeros de D-glucuronato en la mezcla representa al menos el 50 % de los monómeros totales de la mezcla.

6. Semillas de plantas recubiertas con el inoculante de la reivindicación 1.

7. Un método para mejorar el crecimiento o la salud de las plantas, el método comprende: (a) tratar las plantas, semillas, o suelo con una rizobacteria que promueve el crecimiento de las plantas (PGPR) que expresa una proteína asociada con el metabolismo de la pectina seleccionada de pectina liasa, pectato liasa, poligalacturonasa, pectina esterasa, altronato deshidratasa, altronato oxidorreductasa, uronato isomerasa, manonato deshidratasa, D-manonato oxidorreductasa, 4-hidroxi-2-oxoglutarato aldolasa, 2-deshidro-3-desoxigluconocinasa, represor transcripcional del operón de utilización del hexuronato, transportador de hexuronato, y sus combinacionesA y (b) tratar las plantas, semillas, o suelo con un sacárido que comprende pectina o un sacárido relacionado con la pectina que comprende pectina hidrolizada, D-galacturonato, D-glucuronato, o sus mezclas, en donde la PGPR es Bacillus amyloliquefaciens subespecie plantarum.

8. El método de la reivindicación 7, en donde:

(i) las plantas, las semillas, o el suelo se tratan simultáneamente con la PGPR y el sacárido; o

(ii) las plantas, las semillas, o el suelo se tratan primero con la PGPR y subsecuentemente las plantas, las semillas, o el suelo se tratan con el sacárido; o

( iii) las plantas, las semillas, o el suelo se tratan primero con el sacárido y subsecuentemente las plantas, las semillas, o el suelo se tratan con la PGPR.

9. El método de la reivindicación 7 u 8, en donde el método mejora el crecimiento o la salud de las plantas al:

(i) controlar las plagas trasmitidas por el suelo seleccionadas de nemátodos e insectos; y/o

(ii) controlar una enfermedad seleccionada de una enfermedad bacteriana, una enfermedad fúngica, y una enfermedad viral.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde:

(i) el sacárido es un polisacárido que comprende monómeros de D-galacturonato; o

(ii) el sacárido es un heteropolisacárido que comprende monómeros de D-galacturonato que representa al menos el 50 % de todos los monómeros del heteropolisacárido, en donde opcionalmente el heteropolisacárido comprende además uno o más monómeros seleccionados de D-xilosa, D-apiosa, y L-ramnosa; o

( iii) el sacárido es una mezcla heterogénea de polisacáridos o monosacáridos que comprende monómeros de D-galacturonato o monómeros de D-glucuronato, y la suma de los monómeros de D-galacturonato y los monómeros de D-glucuronato en la mezcla representa al menos el 50 % de los monómeros totales de la mezcla.