ES2836134T3 - Procedimiento para la detección de aberraciones cromosómicas - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí mediante hibridación in situ mediante la detección de regiones de cromosomas y/o del ADN en una muestra biológica, caracterizado porque la hibridación in situ se lleva a cabo como hibridación in situ en interfase, porque la hibridación in situ se lleva a cabo con al menos tres sondas de hibridación específicas de locus diferentes entre sí, marcadas respectivamente con una primera etiqueta de detección, en cuyo caso para generar al menos una señal mixta mediante dos o más etiquetas de detección distintas entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus, al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección diferente de la primera etiqueta de detección, referida a las respectivas sondas de hibridación específicas de locus, de modo que se genera un modelo de señales, y porque las aberraciones cromosómicas presentes se identifican por medio del modelo de señales y/o se asignan a una región de cromosomas y/o de ADN.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la detección de aberraciones cromosómicas

La presente invención se refiere al campo técnico de los procedimientos de detección de anomalías cromosómicas o aberraciones cromosómicas.

En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí mediante hibridación in situ. Además, la presente invención se refiere a una composición adecuada para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, así como a sus usos de acuerdo con la invención. Además, los usos de al menos tres sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí y marcadas con marcadores de detección son otro objeto de la presente invención. Finalmente, es objeto de la presente invención un kit para la detección de aberraciones cromosómicas.

Muchas enfermedades tumorales se fundamentan en mutaciones cromosómicas estructurales y numéricas, tales como translocaciones, inversiones, duplicaciones de segmentos, deleciones, inserciones, duplicaciones, aneuploidías y amplificaciones. La detección de estas modificaciones como marcador predictivo, de pronóstico o de diagnóstico diferencial tiene lugar, por norma general, mediante hibridaciones in situ (ISH).

La hibridación in situ se basa en la hibridación o el emparejamiento de bases complementarias de cadenas sencillas de ácido nucleico, en particular cadenas sencillas de ADN, de modo que se pueden detectar secuencias de ácidos nucleicos específicas en una muestra, en particular en un tejido o preparado celular. Para ello, las sondas marcadas de forma directa o indirecta, preparadas de forma sintética, se hibridan con cadenas sencillas de ácidos nucleicos de la muestra y, a continuación, se detectan.

Para los fines de detección pueden llegar a emplearse, entre otros, segmentos de ácidos nucleicos marcados por fluorescencia o sondas de hibridación marcadas por fluorescencia (ISH fluorescentes (FISH)). Además de esto, pueden llegar a emplearse sondas marcadas con antígenos, en particular, sondas marcadas con haptenos que, a continuación, se hacen visibles por medio de anticuerpos mediante reacciones de color, de modo que es posible un análisis por microscopía óptica ((ISH de campo claro (BrISH), ISH cromogénica (CISH), ISH con plata (SISH)).

La ventaja de las FISH es que múltiples regiones genómicas pueden detectarse simultáneamente y de forma claramente diferenciable entre sí. Para esto, los segmentos de ácidos nucleicos que se dirigen a diferentes regiones genómicas, o bien son específicos para estas se marcan o se acoplan respectivamente con diferentes colorantes de fluorescencia, que se diferencian entre sí en su espectro de absorción y/o emisión. Si tales sondas multicolores que comprenden sondas individuales separadas y diferentes, se utilizan, por ejemplo, en preparados de cromosomas en metafase o en preparados de núcleo celular en interfase, entonces los colores individuales pueden representarse de manera separada uno de otro mediante el uso de filtros de microscopio específicos que conducen intervalos de longitudes de onda de la luz exactamente definidos para la excitación de los colorantes sobre el preparado, así como intervalos de longitudes de onda exactamente definidos de la luz emitida por los colorantes hacia el analizador (el denominado conjunto de filtros de paso banda sencilla). Además de esto, existen también filtros o conjuntos de filtros que permiten la representación simultánea de diferentes colorantes de fluorescencia y, por consiguiente, de varios fragmentos de ácidos nucleicos. En el caso de dos colorantes de fluorescencia diferentes se habla, por ejemplo, de un conjunto de filtros de paso banda dual.

Sin embargo, a la representación simultánea se le establecen límites claros, dado que por cada región genómica que es detectada por una sonda específica solo puede utilizarse un marcador. Además, los intervalos de absorción y emisión de los colorantes se encuentran a menudo tan próximos uno junto a otro que no pueden ser separados uno de otro mediante los conjuntos de filtros de microscopio. Por estos motivos, de manera habitual en la FISH se analizan simultáneamente solo dos colores (naranja/rojo y verde), o bien tres colores (naranja/rojo y verde simultáneamente o bien conjuntamente con una contra-tinción azul del núcleo (DAPI)). Aproximadamente las mismas limitaciones que se exponen para FISH son válidas también para la BrISH. Aquí, el estado de la técnica es el uso de dos haptenos, la mayoría de las veces elegidos del grupo de biotina, dinitrofenilo (DNP) y digoxigenina, y dos enzimas acopladas a anticuerpos, la mayoría de las veces fosfatasa alcalina y peroxidasa.

Las restricciones mencionadas en la representación simultánea, o bien el análisis, tienen una influencia determinante en la combinación, o bien el ajuste de las sondas para la detección de aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas que pueden llevarse a cabo para el diagnóstico de tumores con células que se encuentran en la interfase solamente con las denominadas sondas específicas de locus, en cuyo caso ocasionalmente, en paralelo a la detección de mutaciones cromosómicas numéricas, también se utilizan las denominadas sondas específicas para secuencias repetitivas.

Por sondas específicas de locus se entienden aquellas sondas que se dirigen a segmentos de ADN seleccionados de un cromosoma, la mayoría de las veces genes individuales o genes contiguos, con un tamaño en total de hasta aproximadamente 1.000 kb y se designan como sondas específicas de un gen o como sondas de copia única ('single copy'). Sondas específicas para secuencias repetitivas son sondas que se dirigen a secuencias repetitivas y, por lo tanto, se dirigen a regiones con un tamaño de varios 1.000 kb. Estas sondas también comprenden, por ejemplo, sondas centrómeros o alfa-satélites.

En relación con la detección de translocaciones e inversiones existen, en principio, dos técnicas determinantes y combinaciones de sondas o composiciones fundamentales de sondas: el principio de la generación de señales de fusión (los denominados enfoques de color dual-fusión dual) (documento WO 02/092130 A2), por una parte, así como de la separación de señales de fusión (los denominados enfoques de separación de color dual o escisión de color dual) por otra parte. En la exposición que sigue de estos dos principios y en los modelos de señales derivados se ha de tener en cuenta que una célula normal es, por norma general, diploide; es decir, cada uno de los alelos se presenta por duplicado. Dado que, en el caso de aberraciones, por norma general, solo se ve afectado respectivamente uno de los dos alelos, junto a la señal aberrante también es visible, por norma general, además, la señal normal del alelo que no ha sido afectado por la aberración. Para una mejor comprensión, a continuación, no se describe siempre explícitamente el modelo de señales de la señal normal.

En el caso de los enfoques de color dual-fusión dual, la región de un primer punto de ruptura del cromosoma es flanqueado de modo proximal y distal por segmentos de ácidos nucleicos del mismo color (por ejemplo, naranja); la región de un segundo punto de ruptura, es decir, del participante recíproco en la translocación es flanqueado de forma proximal y distal por segmentos de ácidos nucleicos de un segundo color (por ejemplo, verde). La situación normal, es decir, sin rupturas cromosómicas en la región de los dos participantes en la translocación se caracteriza en este caso por una señal verde y una señal naranja separada en el espacio.

En el caso de una translocación recíproca se producen rupturas dentro de los puntos de ruptura de los dos participantes en la translocación, y la región proximal de uno de los participantes en la translocación se fusiona con la región distal del otro participante, y viceversa. Por consiguiente, se generan dos pares de señales verde/naranjas, denominadas también señales de fusión, dado que a menudo se solapan las señales de diferente color. El inconveniente de estas técnicas de sondas es que las señales de fusión solo se forman si los puntos de ruptura de los dos participantes en la translocación se encuentran en la región de los segmentos de ácidos nucleicos marcados respectivos. En el caso de translocaciones que solo afectan a uno de los dos participantes, no se generan señales de fusión. En este caso, se produce únicamente la formación de una señal adicional con el color de la señal que es característico para el participante afectado por la translocación. Esto significa que se genera una señal verde adicional si el punto de ruptura de la translocación se encontrase en la región que fue cubierta por los ácidos nucleicos marcados con el fluorocromo verde. El inconveniente de esta composición de sondas es que por medio de los dos colores utilizados solo se marcan las dos regiones del punto de ruptura de la misma translocación o inversión y, por consiguiente, solo se puede detectar una translocación o inversión específica.

En el caso de los enfoques de separación de dos colores, la región de un punto de ruptura es flanqueada de forma proximal y distal por segmentos de ácidos nucleicos marcados de forma diferente o marcados con color (por ejemplo, distal naranja, proximal verde). La situación normal, es decir, sin ruptura cromosómica de esta región, se caracteriza en este caso por una señal de fusión. En una situación aberrante, es decir, si se produce una ruptura cromosómica entre los segmentos de la sonda, las señales se separan entre sí en el espacio. La diferencia entre la situación normal y la situación aberrante se caracteriza, por lo tanto, por la distancia de las señales coloreadas de modo distinto. Con este procedimiento no son posibles afirmaciones sobre participantes implicados en la translocación. Únicamente permite sacar la conclusión de que ha tenido lugar una transposición cromosómica específica. El inconveniente de esta combinación de sondas es que por medio de los dos colores utilizados solo se puede detectar una única región del punto de ruptura y, por consiguiente, únicamente una translocación o inversión específica.

En lo que afecta a deleciones, aneuploidías y amplificaciones, se emplea habitualmente solo una técnica determinante y una combinación fundamental de sondas que se refiere, por lo general, a sondas específicas de locus. Sin embargo, bajo determinadas circunstancias, también se amplían sondas específicas de locus mediante las denominadas sondas específicas de secuencias repetitivas tales como, por ejemplo, sondas de centrómeros o alfa-satélites: el principio de la detección de la ganancia o pérdida de señales mediante la aparición de deleciones, aneuploidías y amplificaciones tiene lugar habitualmente en los denominados enfoques de sonda de color dual. También en el caso de este principio que se describe en lo que sigue, y en los modelos de señales derivados del mismo, debe prestarse atención al hecho de que una célula normal por regla general es diploide, es decir, cada alelo se presenta por duplicado.

En el caso de enfoques de sonda de color dual, dos áreas cromosómicas diferentes se marcan con fragmentos de ácido nucleico marcados de forma diferente o marcados con colores (por ejemplo, región genómica 1 o región diana 1 en naranja, región genómica 2 o región diana 2 en verde). La situación normal, es decir sin ganancia o pérdida de estas regiones, se caracteriza por dos señales naranjas y dos verdes. En una situación aberrante, es decir si se produce una ganancia o pérdida de las regiones genómicas en las regiones diana 1 y/o 2, son visibles menos señales verdes y/o naranjas en caso de pérdida, y más señales son visibles en caso de ganancia. Con fuertes amplificaciones de genes o amplificaciones de regiones genómicas, pueden ser visibles muchas señales adicionales, que también pueden representarse como agrupaciones.

Con los procedimientos estándar mencionados anteriormente y las composiciones estándar que utilizan dos señales estándar o dos colores estándar, solo se puede detectar una (posible) aberración en el caso de cambios estructurales y un máximo de dos aberraciones diferentes (posibles) por procedimiento en el caso de mutaciones cromosómicas numéricas.

Además de las aplicaciones de dos colores enumeradas anteriormente, en los análisis FISH también se utilizan sondas de tres colores, rara vez de cuatro colores y muy rara vez de cinco colores. Por definición, los procedimientos que utilizan simultáneamente al menos tres ligandos o fluorocromos diferentes, sin contra-tinción, para marcar las sondas, son procedimientos FISH multicolores (procedimientos mFISH). Además de los colores fluorescentes estándar mucho más fuertes naranja/rojo y verde, los otros colores más débiles disponibles, por ejemplo, se utiliza dorado o amarillo dorado o dorado, rojo o azul. Por lo tanto, en general, las sondas FISH de cuatro colores, por ejemplo, solo se utilizan para la detección de deleciones o amplificaciones, porque aquí, principalmente al marcar las sondas sobre secuencias repetitivas para amplificar las intensidades de color, se puede utilizar, por ejemplo, azul y oro. Tales procedimientos se describen, entre otros, en los documentos EP 1035215 B1, WO 2007/028031 A1 y e P 0549709 B1.

Además, en el estado de la técnica se describen enfoques de FISH triples que abordan la detección de diferentes eventos de translocación que pueden agruparse uno al lado del otro en una región cromosómica (es decir, se ven afectados diferentes genes que están en las proximidades). Para la evaluación correspondiente del modelo de señal, se analizan solo dos colores que detectan una sola aberración, en cuyo caso es irrelevante el tercer color. Se utilizan tres sondas específicas de locus diferentes, cada una marcada con una etiqueta diferente.

En lo que se refiere a la ISH de campo claro (BrISH) con el uso de más de dos colores, en el estado de la técnica se describe al respecto la realización de una hibridación in situ triple cromogénica que, en general, se dirige a la detección de tres regiones cromosómicas repetitivas. Según el estado actual de la técnica, las translocaciones se detectan mediante BrlSH solo utilizando dos haptenos y, por consiguiente, dos colorantes. En la solicitud de patente WO 2012/150022 A1 se describe un procedimiento que da a conocer la aplicación de tres sondas diferentes mediante el método de BrlSH utilizando los tres marcadores biotina, digoxigenina y DNP que conducen a tres colores diferentes, para la detección de inversiones.

El documento US 6 576 421 B1 describe un procedimiento para la detección de translocaciones asociadas con el cáncer, en el que se utilizan tres sondas, de las cuales dos se hibridan en un lado de un punto de ruptura sobre un cromosoma de fusión y la tercera sonda sobre el otro lado del punto de ruptura. Cada una de las sondas está marcada con un marcador que se diferencia de los de las otras sondas.

El documento US 6344 315 B1 da a conocer procedimientos para la tinción de material cromosómico en interfase, en los que se utiliza una sonda de ácidos nucleicos que presenta una longitud mayor que 50.000 bases y en los que, por ejemplo, para la realización de un procedimiento Fis H se utiliza una sonda ABL marcada con biotina que es detectada de forma indirecta con el fluorocromo Texas Rojo y una sonda BCR marcada con digoxigenina que es detectada indirectamente con el fluorocromo FITC.

El documento WO 93/21345 A1 describe procedimientos para la detección de una deleción de un gen, en los que se utilizan dos sondas que están provistas de marcadores fluorescentes distinguibles entre sí.

El documento WO 2005/111235 A2 describe un procedimiento que comprende el uso de tres colores para fines de detección. Sin embargo, la región cromosómica que es marcada por el tercer marcador de una sonda no se ve afectada directamente por una modificación, de modo que en el caso de una variación en la estructura del cromosoma se elimina la primera señal de fusión, de modo que se genera una nueva señal de escisión y una nueva señal de fusión. Este procedimiento emplea sondas que están marcadas respectivamente solo con una etiqueta. Además, con estos procedimientos solo se puede detectar una posible translocación que se establece por las sondas.

El documento WO 02/093130 A3 da a conocer un procedimiento para la detección de translocaciones cromosómicas utilizando dos o, alternativamente, cuatro etiquetas o colorantes que respectivamente flanquean de modo distal y proximal los puntos de ruptura de ambos puntos de ruptura implicados en una translocación. Este procedimiento no ofrece posibilidad alguna de detectar más de una translocación en la región del punto de ruptura que es flanqueada por las sondas.

En conjunto, se puede establecer, por consiguiente, que con los procedimientos conocidos del estado de la técnica no es posible detectar al mismo tiempo, o bien de forma simultánea, de una manera eficaz varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí en células, o bien en tejidos, mediante la hibridación in situ.

Una clasificación simultánea o bien paralela de regiones de ADN, o bien de cromosomas, definidas en el marco de la hibridación in situ solo se conoce hasta ahora en el caso de procedimientos para la detección de cromosomas enteros con un tamaño en seres humanos entre aproximadamente 50 Mpb y 250 Mpb o regiones cromosómicas mayores, por ejemplo, brazos de cromosomas, utilizando las denominadas 'sondas de pintura de cromosomas enteros' (Whole Chromosome Painting Probes, WCP) o sondas de pintura de cromosomas parciales (Partial Chromosome Painting Probes, PCP). Con las técnicas fundamentales, por ejemplo, mFISH (FISH multiplex), SKY-FISH (cariotipado espectral), FISH multicolor, COBRA-FISH (FISH Combined Binary Ratio labeling o etiquetado por relación binaria combinada) o también FISH de 24 colores, pueden marcarse y diferenciarse aprovechando aproximadamente cuatro a siete colorantes de fluorescencia diferentes, en conjunto veinticuatro 'sondas de pintura de cromosomas' ('Chromosome Painting Probes') diferentes. En un procedimiento similar, en una denominada FISH de 42 colores se pueden marcar de manera diferente las sondas específicas de los brazos del cromosoma de todos los cromosomas. Los procedimientos antes mencionados son adecuados, sin embargo, solo para células que se encuentran en la metafase. Los procedimientos antes mencionados solo son posibles, dado que con las sondas utilizadas en los mismos solo pueden evaluarse regiones genómicas/cromosómicas en metafases al menos esencialmente sin transposición de material cromosómico. Con procedimientos de este tipo no es posible un análisis de las células en la interfase que, en general, solo permite un análisis del material genético de tumores sólidos. Además de esto, las sondas que llegan a emplearse en este caso pueden ser detectadas de forma relativamente sencilla, dado que se dirigen a grandes regiones. La evaluación de estos análisis no puede tener lugar de forma manual, es decir, teniendo en cuenta las señales en el microscopio de fluorescencia, sino únicamente de forma basada en ordenador por medio de un software de evaluación adecuado.

Los métodos y combinaciones de sondas conocidos actualmente en el estado de la técnica para BrlSH y FISH en relación con mutaciones cromosómicas, o bien aberraciones cromosómicas, estructurales y numéricas, en particular en relación con tumores o bien enfermedades cancerígenas, están ligados con determinadas desventajas. Así, no existen composiciones de sondas específicas de locus y procedimientos que permitan una detección y discriminación segura, sencilla y rápida de varias mutaciones cromosómicas, o bien aberraciones cromosómicas, estructurales y/o numéricas, potenciales, diferentes.

En particular, en el caso de las mutaciones cromosómicas estructurales no es en absoluto posible o solo lo es con dificultad el análisis simultáneo o paralelo de varias mutaciones cromosómicas diferentes que no se provocan, es decir, que no intercambian material cromosómico alguno o bien que no son recíprocas, en particular en enfoques de fraccionamiento en los que se fundamentan.

Por lo tanto, la presente invención tiene por objetivo proporcionar un procedimiento o bien una composición que sea adecuado o adecuada para la detección o el análisis de mutaciones cromosómicas, o bien de aberraciones cromosómicas y que evite al menos em gran parte o al menos atenúe los inconvenientes del estado de la técnica precedentemente descritos.

En particular, la presente invención tiene por objetivo proporcionar un procedimiento que posibilite una detección fiable y simultánea de varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular aberraciones cromosómicas independientes entre sí (es decir, no recíprocas), principalmente en una tanda. De igual manera, la presente invención tiene por objetivo proporcionar un procedimiento que, además de esto, posibilite también la asignación de aberraciones cromosómicas a una determinada región del cromosoma o bien del a Dn .

Descripción

Para el logro del objetivo expuesto antes, la presente invención propone un procedimiento para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, de acuerdo con la reivindicación 1; otras formas de realización ventajosas son objeto de las reivindicaciones dependientes correspondientes.

Además, es objeto de la presente invención una composición para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí de acuerdo con la reivindicación independiente correspondiente, o bien una composición para uso en el tratamiento profiláctico o bien terapéutico o bien en el diagnóstico o bien en el pronóstico de enfermedades relacionadas con aberraciones cromosómicas.

De nuevo, otro objeto de la presente invención es el uso de una composición según la presente invención de acuerdo con la reivindicación independiente correspondiente.

Además, la presente invención se refiere al uso de al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, de acuerdo con la reivindicación independiente correspondiente. Además, es objeto de la presente invención el uso de al menos una sonda de hibridación específica de locus marcada con al menos dos marcadores de detección de acuerdo con la reivindicación independiente respectiva.

Finalmente, es objeto de la presente invención un kit o bien kit de partes o conjunto para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí; otras propiedades ventajosas son objeto de la reivindicación subordinada respectiva.

Se sobreentiende que en lo sucesivo las formas de realización, configuraciones o similares particulares en lo que sigue, que solo se describen en relación con un aspecto de la invención, son válidas también de manera correspondiente en relación con los otros aspectos de la invención, sin que esto requiera una mención expresa. Además, en el caso de todos los datos cuantitativos relativos o bien porcentuales, en particular referidos al peso, mencionados más adelante, se ha de tener en cuenta que estos se han de elegir por parte del experto en la materia en el marco de la presente invención de manera que en la suma de las sustancias constitutivas, sustancias activas, aditivos o bien coadyuvantes o similares respectivos resulte siempre 100% o bien 100% en peso. Sin embargo, esto se sobreentiende por parte del experto en la materia.

Por lo demás, es válido que el experto en la materia pueda desviarse de los datos numéricos, de intervalos o cuantitativos listados más adelante, referidos a la aplicación o condicionados por el caso particular, sin abandonar el marco de la presente invención.

Además, es válido que todos los datos de parámetros o similares mencionados más adelante pueden determinarse o bien calcularse básicamente con procedimientos de determinación normalizados o explícitamente indicados, o bien con procedimientos de determinación corrientes per se para el experto en la materia.

Para la solución del problema expuesto antes, la presente invención - conforme a un primer aspecto de acuerdo con la invención - propone un procedimiento para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas, preferiblemente aberraciones cromosómicas estructurales mediante hibridación in situ por detección de regiones de cromosomas y/o del ADN en una muestra biológica, preferiblemente en una o varias células y/o en uno o varios núcleos celulares, en cuyo caso la hibridación in situ se lleva a cabo como hibridación in situ en interfase, y la hibridación in situ se lleva a cabo con al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus diferentes entre sí, marcadas respectivamente con una primera etiqueta de detección, en cuyo caso, para generar al menos una señal mixta mediante dos o más sondas de detección diferentes entre sí que se encuentran en una sonda de hibridación específica para locus, al menos una de las sondas de hibridación específica para locus se marca con al menos otra etiqueta de detección distinta de la primera etiqueta de detección, referida a la respectiva sonda de hibridación específica para locus, de modo que se genera un modelo de señales, y en cuyo caso se identifican aberraciones cromosómicas presentes por medio del modelo de señales y/o se asignan a una región del cromosoma y/o del ADN.

Con otras palabras, la presente invención se fundamenta en el principio base de posibilitar, mediante la generación deliberada de señales mixtas en modelos de señales generados mediante hibridaciones in situ en interfase, la detección paralela o bien simultánea de varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular, aberraciones cromosómicas independientes entre sí, es decir, no recíprocas, en una muestra biológica, así como su asignación a una región detectada de cromosomas o bien de ADN.

En particular, por consiguiente, en el marco de la presente invención puede estar previsto que en el caso de las aberraciones cromosómicas se trate de aberraciones cromosómicas independientes entre sí. Expresado con otras palabras, conforme a la invención puede estar previsto que las aberraciones cromosómicas no sean dependientes una de otra. De igual manera, puede estar previsto que las aberraciones cromosómicas no sean recíprocas.

De acuerdo con una forma de realización particular de la presente invención, se prefiere, además, que las aberraciones cromosómicas no estén relacionadas con aberraciones cromosómicas recíprocas o bien independientes entre sí, o bien no estén asociadas con las mismas.

La presente invención está ligada a numerosas ventajas y particularidades que se discuten más adelante de una manera no limitante y que se han de evaluar como un indicio de la patentabilidad de la presente invención.

En el marco de la presente invención se ha conseguido, en conjunto y de manera totalmente sorprendente, proporcionar un procedimiento para la detección de aberraciones cromosómicas que, en el marco de una hibridación in situ en interfase, permita, por una parte, una detección inequívoca de varias aberraciones cromosómicas estructurales o bien numéricas posibles y, por otra parte, la diferenciación inequívoca de estas aberraciones cromosómicas o bien la asignación inequívoca de las aberraciones cromosómicas detectadas a determinadas regiones de cromosomas o bien del ADN en un único enfoque de hibridación. En particular, en el caso de las aberraciones cromosómicas se puede tratar de aberraciones cromosómicas independientes entre sí que no se condicionan o bien que no son recíprocas. Hasta ahora, esto no era posible en el estado de la técnica, en particular en el marco de hibridaciones in situ en interfase.

Con el procedimiento de acuerdo con la invención se pueden analizar claramente de manera más rápida y eficaz, por consiguiente, principalmente muestras biológicas a investigar en cuanto a aberraciones cromosómicas, tales como, por ejemplo, cortes de tejidos, en particular tejidos tumorales, dado que una muestra individual puede ser examinada simultáneamente o bien en una tanda en varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí. Además de esto, posibles aberraciones cromosómicas detectadas pueden ser asignadas a una región del ADN, o bien del cromosoma, definida o determinada.

Además, por medio del procedimiento de acuerdo con la invención se puede reducir de manera significativa la cantidad de muestra necesaria para la detección de aberraciones cromosómicas. Esto es particularmente ventajoso ante los antecedentes de que la extracción de tejido para fines de investigación, en particular en relación con el diagnóstico, o bien el reconocimiento, o análisis continuo de enfermedades cancerígenas, que mientras tanto tiene lugar habitualmente mediante biopsia con aguja fina, la cual permite únicamente la extracción de una cantidad limitada de muestra; por el contrario, las biopsias abiertas, que permiten también la extracción de cantidades mayores de tejido, se llevan a cabo de manera crecientemente menos frecuente.

Además, en virtud de la elevada eficiencia del procedimiento de acuerdo con la invención se reduce la cantidad necesaria de materiales en ocasiones costosos tales como enzimas, colorantes de fluorescencia y similares, para la realización de la hibridación in situ, de modo que el procedimiento es también ventajoso en relación con aspectos económicos y ecológicos.

Para una mejor comprensión de la presente invención se definen a continuación las terminologías y las denominaciones centrales del procedimiento de acuerdo con la invención:

De acuerdo con la invención, por la expresión de las aberraciones cromosómicas, denominadas de manera sinónima también como anomalías cromosómicas, se entienden, en particular, aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas. En el caso de aberraciones cromosómicas estructurales se presentan variaciones en la estructura de un cromosoma de modo que éstas se pueden designar también como mutación cromosómica. En particular, en este caso se puede tratar de inversiones, translocaciones, deleciones, duplicaciones de segmentos, inserciones, duplicaciones, o bien amplificaciones. Por el contrario, aberraciones cromosómicas numéricas conducen a una modificación del número de cromosomas. De manera sinónima se utiliza también la expresión mutación del genoma. En el caso de aberraciones cromosómicas o bien mutaciones del genoma, numéricas puede tratarse, en particular, de aneuploidías o bien poliploidías. El procedimiento de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la detección de aberraciones cromosómicas estructurales.

La hibridación in situ empleada de acuerdo con la invención se basa en la hibridación o bien el emparejamiento de bases complementarias de cadenas sencillas de ácidos nucleicos, en particular cadenas sencillas de ADN, de modo que, en una muestra, tal como un tejido o un preparado celular, se pueden detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos. En el marco de la hibridación in situ se hibridan sondas de hibridación marcadas de forma directa o indirecta producidas de forma sintética, en particular específicas de locus, con cadenas sencillas de ácidos nucleicos de la sonda y, a continuación, se detectan.

Básicamente, la hibridación in situ puede tener lugar o bien puede realizarse en diferentes estadios del ciclo celular de las células o los núcleos celulares examinados, en cuyo caso se ha establecido una realización en la metafase, cuando los cromosomas se presentan en estado condensado, o en la interfase, cuando los cromosomas se presentan descondensados. En función del objetivo o de la finalidad de la hibridación in situ no siempre es posible una realización en cromosomas condensados en la metafase; en particular, por ejemplo, en el caso de la investigación de las células de tumores sólidos en aberraciones cromosómicas. De acuerdo con la invención, por lo tanto, está previsto llevar a cabo la hibridación in situ en células o en núcleos celulares que se encuentren en la interfase.

Por sondas de hibridación específicas de locus se entienden en el marco de la presente invención para una determinada región del cromosoma o de la región del ADN sondas específicas o bien complementarias a una región del cromosoma o de la región del ADN determinadas del material de ADN o del material genético en una muestra a investigar. Habitualmente, las sondas de hibridación utilizadas de acuerdo con la invención se basan en ácidos nucleicos o segmentos de ácidos nucleicos y son capaces de unirse específicamente, o bien de hibridarse, a la región del cromosoma o a la región del ADN a detectar. La región del cromosoma o bien la región del ADN a detectar puede presentar una longitud variable. En particular, puede estar previsto que una región del cromosoma o región del ADN a detectar comprenda, parcialmente o por completo, un único gen, o bien un gen individual. De igual manera, puede estar también previsto que una región del cromosoma, o bien región del ADN, a detectar comprenda, parcialmente o por completo, varios genes, preferiblemente genes contiguos, preferiblemente dos genes.

En lo que afecta a la configuración de acuerdo con la invención de las sondas de hibridación, en especial puede estar particularmente previsto que una sonda de hibridación específica de locus se base en varios, en particular en una pluralidad de fragmentos de ácidos nucleicos (sinónimamente también fragmentos de sonda) que en su conjunto se designan como una sonda de hibridación específica de locus. Además de esto, es posible - aun cuando menos preferido - que las sondas de hibridación específicas de locus se basen solo en un único fragmento de ácido nucleico, o bien se formen mediante un único fragmento de ácido nucleico.

Etiquetas de detección designan en el marco de la presente invención materiales, o bien sustancias, que se acoplan para fines de determinación, o bien de detección, a ácidos nucleicos, o bien a segmentos de ácidos nucleicos, en particular sondas de hibridación. La elección de etiquetas de detección adecuadas se encuentra en el conocimiento habitual del experto en la materia y no requiere de explicaciones adicionales en este punto. Los fragmentos de ácidos nucleicos marcados con etiquetas de detección y unidos, o bien hibridados, al fragmento de ADN, o bien cromosoma, a determinar, o bien a detectar, mediante hibridación in situ pueden ser detectados directa o indirectamente por parte del experto en la materia mediante procedimientos tales como, por ejemplo, microscopía de fluorescencia, o bien tras reacción principalmente enzimática, o bien mediante visualización por medio de sustratos colorantes que han reaccionado enzimáticamente mediante microscopia de campo claro. En particular, mediante las etiquetas de detección en las sondas de hibridación específicas de locus, en el marco de la hibridación in situ se genera un modelo de señales que sirve como base para la investigación de una muestra en cuanto a posibles aberraciones cromosómicas.

Además, la expresión "etiqueta de detección" utilizada de acuerdo con la invención se refiere más adelante a la clase, o bien al tipo de etiqueta de detección, y no al dato numérico de moléculas de etiquetas de detección; es decir que formulaciones tales como "al menos una etiqueta de detección" se refieren a un tipo determinado de una etiqueta de detección, o bien a la elección determinada de una etiqueta de detección. La expresión "varias etiquetas de detección" se refiere, por consiguiente, asimismo a la elección de etiquetas de detección diferentes entre sí de tipo diferente y no al número empleado de moléculas de etiquetas de detección. El hecho de que en el marco del marcaje de sondas de hibridación éstas sean acopladas habitualmente con más de una molécula de etiqueta de detección lo sobreentiende el experto en la materia.

Las sondas de hibridación específicas de locus empleadas de acuerdo con la invención, en particular fragmentos de sondas, o bien fragmentos de ácidos nucleicos, se hibridan, por consiguiente, específicamente a una región del ADN, o bien del cromosoma, elegida del material genético en una sonda y generan un modelo de señales en base a la etiqueta de detección acoplada en el marco de la hibridación in situ. Por un modelo de señales se entiende en el marco de la presente invención la totalidad de todas las señales generadas mediante la hibridación in situ en base a las sondas de hibridación específicas de locus marcadas con etiquetas de detección.

A este respecto, en el marco de la presente invención se ha demostrado sorprendentemente que, mediante el marcaje de sondas de hibridación específicas de locus con al menos dos etiquetas de detección diferentes entre sí, en el modelo de señales se puedan generar señales mixtas bien detectables y, además de esto, bien diferenciables de las restantes señales, las cuales permiten la asignación de una aberración cromosómica separada a una región detectada del ADN, o bien del cromosoma. En el caso de una señal mixta en el sentido de la invención se trata, por consiguiente, de una señal que es generada por al menos dos, pero igualmente también por varias etiquetas de detección diferentes entre sí que se encuentran en una sonda de hibridación específica de locus. Dado que las señales mixtas son generadas por los al menos dos, en particular varias etiquetas de detección de una sonda de hibridación específica de locus, éstas también son visibles, o bien se mantienen, en el caso de aberraciones cromosómicas en el modelo de señales de la hibridación in situ en el caso de aberraciones cromosómicas. Más adelante se explican con más detalle formas de realización, o bien configuraciones posibles de las sondas de hibridación específicas de locus para la generación de señales mixtas.

Formas de realización preferidas del procedimiento de acuerdo con la invención se exponen en detalle a continuación: De acuerdo con una primera forma de realización de acuerdo con la invención, puede estar previsto que las primeras etiquetas de detección de las sondas de hibridación específicas de locus empleadas sean respectivamente iguales. De acuerdo con una segunda forma de realización de acuerdo con la invención, igualmente preferida, puede estar previsto que las sondas de hibridación específicas de locus empleadas estén marcadas con primeras etiquetas de detección respectivamente diferentes entre sí.

Con otras palabras, de acuerdo con la invención puede estar previsto que las sondas de hibridación específicas de locus empleadas - de forma puramente a modo de ejemplo y no limitativa - presenten como primera etiqueta de detección, por ejemplo, el mismo colorante de fluorescencia o el mismo hapteno.

De igual manera, las sondas de hibridación específicas de locus empleadas presentan, por ejemplo - y asimismo no de forma limitante - colorantes de fluorescencia diferentes entre sí, haptenos diferentes entre sí o similares como respectivamente una primera etiqueta de detección. Un marcaje con primeras etiquetas de detección diferentes entre sí se ha manifestado ventajoso, en particular en relación con la detección de aberraciones cromosómicas que van acompañadas de rupturas del cromosoma tales como translocaciones, o bien inversiones.

Además de esto, en lo que se refiere a la detección de aberraciones cromosómicas de acuerdo con la invención, según la invención en la muestra se detectan y/o se determinan al menos dos, en particular varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí de una pluralidad de posibles aberraciones cromosómicas.

De igual manera, puede estar previsto que en la muestra se determinen al menos dos, en particular varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí de una pluralidad de posibles aberraciones cromosómicas de forma paralela, en particular simultánea.

De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, puede estar previsto que el procedimiento de acuerdo con la invención se lleve a cabo como procedimiento múltiple para la determinación simultánea de varias aberraciones cromosómicas diferentes entre sí.

Una particular ventaja - tal como ya se ha expuesto antes - del procedimiento de acuerdo con la invención con respecto a los procedimientos conocidos en el estado de la técnica para la detección de aberraciones cromosómicas mediante hibridación in situ estriba, por consiguiente, en que ahora ya se pueden examinar muestras, en particular sobre la base de células, o bien de núcleos celulares, que se encuentran en la interfase, en un único enfoque de hibridación de manera simultánea, o bien paralela, en cuanto a varias posibles aberraciones cromosómicas con la asignación de éstas a una determinada región del ADN, o bien del cromosoma.

A este respecto, puede estar previsto, en particular, que sean identificadas aberraciones cromosómicas en el modelo de señales mediante la al menos una señal mixta, en particular varias señales mixtas, o bien que sean asociadas a las regiones del cromosoma y/o del ADN a detectar. A este respecto, se remite en particular a la Fig. 7, de la cual se puede deducir a modo de ejemplo la detección de acuerdo con la invención de aberraciones cromosómicas en forma de amplificaciones. De acuerdo con la Fig. 7, se examinan cuatro regiones del cromosoma diferentes, en cuyo caso se emplean cuatro sondas de hibridación diferentes entre sí, de las cuales tres están marcadas con al menos una etiqueta de detección adicional para la generación de señales mixtas específicas respectivamente (véase la Fig. 7a)). Sobre la base del marcaje de tres de las cuatro regiones del cromosoma con una señal mixta respectivamente específica puede asociarse el "racimo" generado mediante la amplificación de una región detectada del cromosoma en el modelo de señales de una sonda de hibridación, o bien de una región detectada del cromosoma (véase la Fig. 7b)).

De acuerdo con la invención, por consiguiente, puede estar previsto, en particular, que el marcaje de otras sondas de hibridación específicas de locus tenga lugar con la al menos otra etiqueta de detección de modo que las sondas de hibridación específicas de locus marcadas con al menos una etiqueta de detección adicional generen respectivamente señales mixtas diferentes entre sí en el modelo de señales.

De igual manera, puede estar previsto - en particular, para el caso de que se tengan que detectar aberraciones cromosómicas que no resultan de rupturas del cromosoma, tales como amplificaciones como deleciones - que el marcaje de sondas de hibridación específicas de locus adicionales tenga lugar con al menos otro etiqueta de detección, de modo que mediante cada una de las sondas de hibridación específica de locus marcada con otra etiqueta de detección en el modelo de señales se genere una señal mixta específica para una región del cromosoma y/o del ADN. A este respecto, en el marco de la presente invención se prefiere, por consiguiente, que cada una de las regiones detectadas por una sonda de hibridación específica de locus pueda ser asignada a una señal específica, en particular a una señal mixta dentro del modelo de señales.

Además, de acuerdo con la invención se prefiere que el marcaje de otras sondas de hibridación específicas de locus con la al menos una etiqueta de detección adicional tenga lugar de modo que a cada una de las aberraciones cromosómicas a detectar en el modelo de señales se asigne una región detectada del cromosoma y/o del ADN por medio de una señal mixta específica.

En lo que concierne al número de las sondas de hibridación específicas de locus marcadas con al menos una etiqueta de detección adicional, este es variable y depende, en particular, del número de las aberraciones cromosómicas a detectar, o bien a examinar:

De acuerdo con la invención, se prefiere que al menos dos, en particular al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, de preferencia al menos cinco, de manera particularmente preferida al menos seis, de manera muy particularmente preferida al menos siete de otras sondas de hibridación específicas de locus sean marcadas con al menos otra etiqueta de detección distinto de la primera. De igual manera, puede estar previsto que, mediante al menos dos, en particular al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, de preferencia al menos cinco, de manera particularmente preferida al menos seis, de manera muy particularmente preferida al menos siete de otras sondas de hibridación específicas de locus en el modelo de señales se generen señales mixtas específicas respectivamente para una región del cromosoma y/o del ADN.

Este modo de proceder de acuerdo con la invención, antes expuesto, es adecuado, en particular, para el caso de que se deban detectar aberraciones cromosómicas que no resulten de roturas del cromosoma, tales como amplificaciones o deleciones. Sobre la base de un aumento del número de sondas de hibridación marcadas con al menos otra, preferiblemente varias etiquetas de detección, que respectivamente generan una señal mixta individual, también puede aumentar, por consiguiente, el número de aberraciones cromosómicas a detectar, o bien a determinar al mismo tiempo.

De acuerdo con otra forma de realización especial de la presente invención, es además posible detectar aberraciones cromosómicas que resulten de rupturas del cromosoma tales como, por ejemplo, translocaciones o inversiones y asignarlas a una región determinada del cromosoma, o bien del ADN:

De acuerdo con esta forma de realización de acuerdo con la invención puede estar previsto que respectivamente dos sondas de hibridación específicas de locus flanqueen un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura, en cuyo caso las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento del cromosoma, en particular la región del punto del ruptura, están marcadas con etiquetas de detección diferentes entre sí, de modo que mediante las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento del cromosoma, en particular la región del punto de ruptura se genere una señal de fusión en el modelo de señales, en particular para el caso de que no se presente aberración cromosómica alguna.

"Flanquear" en este contexto significa preferiblemente que el extremo de una sonda de hibridación, que se acerca más al segmento cromosómico o al área del punto de ruptura, se híbrida con una base que está a una distancia de 0 a 1 Mbp del segmento del cromosoma o la región del punto de ruptura, en particular a una distancia de 0 a 500 kb, preferiblemente una distancia de 0 a 100 kb, preferiblemente una distancia de 0 a 10.000 bp y de manera particularmente preferida una distancia de 0 a 1.000 bp.

Con otras palabras, de acuerdo con esta forma de realización de la presente invención está previsto que las regiones de ADN, o bien del cromosoma, a detectar se encuentren distales y proximales a segmentos del cromosoma específicamente elegidos, en particular regiones del punto de ruptura potenciales sobre un cromosoma. En este caso, puede estar previsto, en particular, que el segmento del cromosoma dispuesto en posición distal, o bien proximal, sea detectado con una sonda de hibridación adicional, marcada con al menos otra etiqueta de detección distinta de la primera etiqueta de detección.

Por una región del punto de ruptura se entienden en el marco de la presente invención aquellas regiones de un cromosoma que pueden verse afectadas por rupturas del cromosoma. Como consecuencia de rupturas del cromosoma pueden producirse aberraciones cromosómicas en base a transposiciones estructurales, en particular translocaciones, o bien inversiones. Para una serie de enfermedades se conocen respectivamente aberraciones cromosómicas específicas para la enfermedad que se basan en rupturas del cromosoma, en particular translocaciones, o bien inversiones. Por medio del procedimiento de acuerdo con la invención pueden examinarse, por consiguiente, varias regiones del punto de ruptura, en particular conocidas, en el material genético de una muestra, en particular de una muestra de tejido, en cuanto a la presencia de aberraciones cromosómicas.

En el caso de esta forma de realización de acuerdo con la invención, mediante las dos sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente una región del punto de ruptura, por consiguiente, se genera una señal de fusión, la cual es generada en base a las dos etiquetas de detección diferentes entre sí de la primera y segunda sonda de hibridación específica de locus, en particular para el caso de que no se presente aberración cromosómica alguna.

A diferencia de las señales mixtas ya previamente descritas, que son generadas por diferentes etiquetas de detección de una sonda de hibridación específica de locus, las señales de fusión son generadas por sondas de hibridación específicas de locus distintas entre sí que se presentan hibridadas en la muestra en estrecha proximidad una de otra en el material genético, o bien el ADN.

Con otras palabras, por consiguiente, en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención se genera una señal de fusión para el caso de que en un punto de ruptura flanqueado no se presente aberración cromosómica alguna y las sondas de hibridación específicas de locus que se emplean se hibridan en la sonda en estrecha proximidad con el material genético, o bien el ADN. Por el contrario, si en la región de un punto de ruptura está presente una aberración cromosómica, las sondas de hibridación específicas de locus empleadas ya no pueden estar en estrecha proximidad en virtud de la transposición estructural de un segmento de ADN. En lugar de una señal de fusión, en el modelo de señales se detectan luego dos señales individuales (también denominadas de manera sinónima "Split-Signal" ("señal dividida")) que son preferiblemente distintas entre sí.

Además de esto, las sondas de hibridación marcadas con al menos otra etiqueta de detección diferente de la primera etiqueta de detección generan señales mixtas a base de la primera etiqueta de detección y de la al menos otra etiqueta de detección de la sonda de hibridación respectiva. Estas pueden formar, por consiguiente, una señal mixta y de fusión con una segunda sonda de hibridación que flanquea un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura en el modelo de señales, para el caso de que no se presente aberración cromosómica alguna. En el caso de aberraciones cromosómicas, por el contrario, sobre la base de las sondas de hibridación que flanquean en células, o bien núcleos celulares normales un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura, de las que al menos una está marcada con una etiqueta de detección adicional, se genera en el modelo de señales una señal individual, así como una señal individual que va acompañada de una señal mixta.

En el marco de la presente invención es posible, por consiguiente, por medio de las señales mixtas a base de las sondas de hibridación específicas de locus marcadas con al menos una etiqueta de detección adicional, asignar aberraciones cromosómicas a regiones del punto de ruptura definidas, o bien regiones detectadas del cromosoma, o bien del ADN.

Por consiguiente, de acuerdo con la invención se prefiere si respectivamente la sonda de hibridación marcada con al menos una etiqueta de detección adicional, distinta de la primera, genera una señal mixta y de fusión con la segunda sonda de hibridación específica de locus que flanquea un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura en el modelo de señales, en particular para el caso de que no esté presente aberración cromosómica alguna.

Además de esto, puede estar previsto que la sonda de hibridación marcada con al menos una etiqueta de detección adicional diferente del primero y la segunda sonda de hibridación específica de locus que flanquea un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura, generen respectivamente una señal individual en el modelo de señales, en particular en donde la sonda de hibridación marcada con al menos una etiqueta de detección adicional genera además, una señal mixta en el modelo de señales, en particular para el caso de que esté presente una aberración cromosómica.

En particular, en el marco del procedimiento de acuerdo con la invención puede estar previsto, por consiguiente, que en el modelo de señales se asignen aberraciones cromosómicas mediante señales mixtas a una región detectada del cromosoma y/o del ADN, y/o a un segmento del cromosoma, en particular la región del punto de ruptura.

De acuerdo con esta forma de realización preferida del procedimiento de acuerdo con la invención es posible, por consiguiente, representar, o bien marcar, una serie de regiones del punto de ruptura potenciales mediante la hibridación in situ en interfase de manera simultánea en una muestra individual. Para el caso de que no haya tenido lugar aberración cromosómica alguna en los puntos de ruptura marcados, en el modelo de señales se generan señales de fusión, mientras que, por el contrario, la aparición de señales individuales, o bien de señales divididas, indica la presencia de aberraciones cromosómicas. En base a las señales mixtas adicionalmente generadas, pueden asignarse señales individuales, o bien señales divididas, a una sonda de hibridación determinada y, por consiguiente, a una región determinada del punto de ruptura (véase la Fig. 1).

En particular, en el marco de la presente invención puede estar previsto que se empleen al menos seis, preferiblemente al menos ocho, de preferencia al menos diez, de manera particularmente preferida al menos doce, todavía más preferiblemente al menos catorce sondas de hibridación específicas de locus diferentes, en cuyo caso respectivamente dos sondas de hibridación específicas de locus flanquean respectivamente a un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura, o bien que a lo sumo se empleen veinticuatro sondas de hibridación específicas de locus diferentes, en cuyo caso respectivamente dos sondas de hibridación específicas de locus flanquean respectivamente a un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura.

Además, de acuerdo con la invención se prefiere si el marcaje de otras sondas de hibridación específicas de locus tenga lugar con al menos otra etiqueta de detección diferente de la primera de modo que, en el modelo de señales, por medio de señales de fusión y mixtas, pueda identificarse y/o asignarse cada uno de los segmentos del cromosoma flanqueados, en particular la región del punto de ruptura y/o cada una de las regiones del cromosoma y/o ADN a detectar.

A este respecto, de acuerdo con la invención, se prefiere particularmente si una primera región del punto de ruptura a investigar está flanqueada por dos sondas de hibridación que respectivamente presenten solo una etiqueta de detección, de modo que esta región del punto de ruptura en el modelo de señales sea visible únicamente mediante una señal de fusión, o bien dos señales individuales o divididas. Por el contrario, mediante el marcaje de al menos una de las dos sondas de hibridación flanqueantes con al menos otra etiqueta de detección adicional en el modelo de señales, a cada una de las regiones del punto de ruptura a investigar se asigna una señal mixta específica, o bien individual, de modo que en el modelo de señales se pueda representar en conjunto, de forma diferenciable entre sí, una pluralidad de regiones del cromosoma, o bien del ADN, principalmente regiones del punto de ruptura.

De acuerdo con una forma de realización particularmente preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, puede estar previsto que

(a) una primera sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección A y una segunda sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección B flanqueen un segmento del cromosoma, en particular una región del punto de ruptura, y en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ generen una señal de fusión A-B,

(b) 2 a 12 sondas de hibridación específicas de locus adicionales flanqueen hasta seis segmentos del cromosoma adicionales, en particular regiones del punto de ruptura, en cuyo caso asimismo respectivamente una de las dos sondas de hibridación específicas de locus que flanquean un segmento del cromosoma, en particular la región del punto de ruptura, está marcada con una etiqueta de detección A, y respectivamente una de las dos sondas de hibridación específicas de locus que flanquean un segmento del cromosoma, en particular la región del punto de ruptura, esté marcada con una etiqueta de detección B, de modo que las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento del cromosoma, en particular la región del punto de ruptura, generan una señal de fusión A-B en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ, y

c) al menos una, preferiblemente varias de las sondas de hibridación específicas de locus están marcadas con al menos otra etiqueta de detección X, de modo que las sondas de hibridación específicas de locus marcadas con al menos otra etiqueta de detección generan señales de fusión y mixtas A-B/X en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ,

en cuyo caso, en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ se modifican las señales de fusión y mixtas A-B/X, en el caso de aberraciones cromosómicas, para obtener señales mixtas A/X y/o B/X, y/o

en cuyo caso, en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ las señales de fusión A-B se modifican, en el caso de aberraciones cromosómicas, para obtener señales individuales A y/o B,

de modo que, mediante el modelo de señales generado mediante la hibridación in situ, se asignan aberraciones cromosómicas a una región del cromosoma y/o del ADN y/o a un segmento del cromosoma, en particular a la región del punto de ruptura, flanqueado por dos sondas de hibridación específicas de locus.

En lo que afecta además de esto a la etiqueta de detección X, prevista en la forma de realización previamente descrita, ésta puede estar formada por una única etiqueta de detección, en particular una etiqueta de detección X¹.

Además de esto, puede estar previsto que la etiqueta de detección X esté formada por varias etiquetas de detección diferentes entre sí, preferiblemente elegidas del grupo de las etiquetas de detección X¹, X², .... y/o Xn, en cuyo caso el índice "n" representa un número natural entero de 1 a 20, en particular de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5. A este respecto, puede estar previsto, además, que las etiquetas de detección X¹, X² , .... y/o Xn para la generación de señales mixtas diferentes entre sí, particularmente específicas, se empleen en relaciones diferentes entre sí.

De acuerdo con una forma de realización adicional, también es posible que la etiqueta de detección X esté formada por varias etiquetas de detección diferentes entre sí, preferiblemente elegidas del grupo de las etiquetas de detección

X¹, X² , X³ , X⁴ , X⁵ y/o Xa. A este respecto, se prefiere que las etiquetas de detección X¹, X², X³ , X⁴ , X generación de señales mixtas diferentes entre sí, particularmente específicas, se empleen en relaciones diferentes entre sí.

Por consiguiente, en el marco de la presente invención se ha conseguido de manera sorprendente que incluso sobre la base de unas pocas etiquetas de detección individuales se pueda generar una pluralidad de señales mixtas específicas, marcando para la generación de señales mixtas las sondas de hibridación específicas de locus con al menos otra etiqueta de detección para la generación de señales mixtas, con varias etiquetas de detección diferentes entre sí.

En particular, de acuerdo con la invención puede estar previsto que para la generación de señales mixtas en el marco del marcaje de sondas de hibridación específicas de locus se empleen varias etiquetas de detección, en particular dos a seis, diferentes entre sí, en relaciones (cuantitativas) respectivamente diferentes entre sí. A modo de ejemplo - y de ningún modo de forma limitante - una sonda de hibridación específica de locus puede presentar - junto a la primera etiqueta de detección - tres etiquetas de detección adicionales, en cuyo caso la fracción de la primera etiqueta de detección es de 20%; la fracción de la segunda etiqueta de detección es de 60% y la fracción de la tercera etiqueta de detección es de 20%, referido a las tres otras etiquetas de detección.

De acuerdo con otra forma de realización de la presente invención, además puede estar previsto que

(a) una primera sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección A y una segunda sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección B flanqueen un primer segmento del cromosoma, en particular una primera región del punto de ruptura y generen una señal de fusión A-B en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ,

(b) una tercera sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección A, y una cuarta sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección B, flanqueen un segundo segmento del cromosoma, en particular una segunda región del punto de ruptura y generen en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ una señal de fusión A-B, y

(c) la tercera sonda de hibridación específica de locus y/o la cuarta sonda de hibridación específica de locus estén marcadas con otra etiqueta de detección X¹ y en el modelo de señales generado mediante hibridación in situ generen señales de fusión y mixtas A-B/X¹,

en cuyo caso, en el modelo de señales, las aberraciones cromosómicas del primer segmento del cromosoma, en particular de la primera región del punto de ruptura, son identificadas mediante señales individuales A y/o B y/o en cuyo caso, en el modelo de señales, las aberraciones cromosómicas del segundo segmento del cromosoma, en particular de la segunda región del punto de ruptura, son identificadas mediante señales mixtas A X y/o B/X¹, y/o son asignadas al segundo segmento del cromosoma, en particular a la segunda región del punto de ruptura.

En lo que concierne al modo de proceder para el análisis de aberraciones cromosómicas en el modelo de señales generado mediante la hibridación in situ se ha manifestado particularmente eficiente si en una primera etapa se detectan y/o analizan las señales de fusión generadas por parte de las primeras etiquetas de detección, y en una etapa subsiguiente, en el caso de la aparición de señales individuales, tiene lugar una detección y/o un análisis de las señales mixtas y su asignación a las regiones detectadas del cromosoma y/o del ADN.

En particular, esto puede tener lugar de manera que primero en el caso del análisis del modelo de señales se utilice un filtro a través del cual sean visibles únicamente las señales generadas por las primeras etiquetas de detección, es

decir, las señales de fusión, o bien las señales individuales potenciales. Dado que solo en el caso de la aparición de señales individuales en el modelo de señales se presentan aberraciones cromosómicas, las cuales requieren de un análisis continuo, en particular se representan mediante el uso de otro filtro, en particular de un filtro adecuado para la representación de las señales mixtas, incluso de las señales mixtas por medio de las cuales - en visualización conjunta con la posición de las señales de fusión, o bien individuales, en el modelo de señales - se pueden asociar aberraciones cromosómicas a una región específica del cromosoma, o bien del ADN.

Además, de acuerdo con una forma de realización particular del procedimiento de acuerdo con la invención puede estar previsto que la detección del modelo de señales tenga lugar mediante un análisis sustentado por ordenador. Esto es particularmente ventajoso si para la generación de señales mixtas, las sondas de hibridación están marcadas con más de al menos una etiqueta de detección adicional, preferiblemente al menos dos etiquetas de detección adicionales, preferiblemente varias etiquetas de detección adicionales en relaciones entre sí diferentes o definidas. Los análisis sustentados por ordenador también permiten la diferenciación de señales mixtas que no pueden ser diferenciadas una de otra a simple vista o, en el caso de observación, al microscopio de fluorescencia, por medio de mediciones de las porciones de color o de colores fundamentales.

De acuerdo con la invención, por consiguiente, puede estar previsto, en particular, que la detección de translocaciones, o bien de inversiones, tenga lugar utilizando hasta veinticuatro sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso respectivamente dos sondas de hibridación específicas de locus flanquean de manera distal y proximal a una región respectiva del punto de ruptura, y al mismo tiempo son marcadas sondas de hibridación específicas de locus individuales de estos pares de sondas con otras etiquetas de detección. Preferiblemente, por consiguiente, en una tanda pueden examinarse hasta doce regiones del punto de ruptura diferentes con hasta doce tandas de desmonte diferentes para la representación de hasta doce translocaciones, o bien inversiones. La detección de una translocación específica tiene lugar a través de la identificación de las separaciones de los pares de sondas, o bien de las señales de fusión de los pares de sondas y por medio de los respectivos colores mixtos, o bien señales mixtas.

Asimismo, con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invención es posible detectar translocaciones e inversiones utilizando hasta veinticuatro sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso respectivamente dos sondas flanquean de modo distal y proximal a una región del punto de ruptura respectiva; estos pares de sondas están marcados respectivamente con los mismos marcadores A y B, en cuyo caso una sonda está marcada respectivamente con la etiqueta A y la otra sonda respectivamente con la etiqueta B, y sondas individuales de estos pares de sondas están marcadas al mismo tiempo con otras etiquetas de detección X. La detección de una translocación y/o inversión específica tiene lugar a través de la modificación de señales de fusión y mixtas A-B/X específicas en el caso de una aberración cromosómica para obtener señales mixtas A/X y/o B/X nuevas y separadas. En este caso, opcionalmente incluso puede no utilizarse un marcador X adicional en un par de sondas, de modo que solo para este par de sondas resulten las señales A y/o B habituales separadas en el caso de la aberración fundamental.

Por consiguiente, por vez primera también es posible que en un primer análisis de varias mutaciones cromosómicas diferentes, potencialmente detectables, solo de las señales A y B aprovechando sistemas de filtración específicos, por ejemplo, filtros dobles para las señales A y B, que únicamente visualizan las señales A y B, pero no otras etiquetas X, puede afirmarse rápidamente en primer lugar si en general ha tenido lugar una separación (break apart) de las señales de fusión A-B y si, en general, se presenta una translocación, o bien una inversión. Solo en el caso de la aparición positiva de señales separadas A, o bien B, tiene lugar entonces la evaluación de las señales mixtas con participación de la etiqueta X y, por tanto, la asignación inequívoca de la translocación fundamental.

Más adelante se describen además otras particularidades, o bien posibilidades de ejecución, del procedimiento de acuerdo con la invención que son válidas de manera correspondiente para todas las formas de realización del procedimiento de acuerdo con la invención previamente expuestas:

En lo que se refiere a las distintas regiones del cromosoma, o bien del ADN, a detectar, mediante una sonda de hibridación específica de locus individual respectivamente, en el marco de la presente invención éstas presentan preferiblemente una longitud menor que 5 Mpb, en particular menor que 2 Mpb, preferiblemente menor que 1 Mpb, preferiblemente menor que 750 kpb, de manera particularmente preferida menor que 500 kpb. De igual manera, puede estar previsto que la región del cromosoma y/o del ADN a detectar mediante una sonda de hibridación específica de locus individual presente una longitud de al menos 500 pb, en particular de al menos 1 kpb, preferiblemente de al menos 5 kpb, de preferencia de al menos 10 kpb. Finalmente, también puede estar previsto que la región del cromosoma y/o del ADN a detectar mediante una sonda de hibridación específica de locus individual presente una longitud en el intervalo de 500 pb a 5 Mpb, en particular en el intervalo de 1 kpb a 2 Mpb, preferiblemente en el intervalo de 5 kpb a 1 Mpb, preferiblemente en el intervalo de 10 kpb a 750 kpb, de manera particularmente preferida en el intervalo de 10 kpb a 500 kpb.

En lo que concierne, además de esto, a la configuración adicional de las sondas de hibridación específicas de locus empleadas de acuerdo con la invención, éstas se presentan preferiblemente en forma de segmentos de ácidos nucleicos, en particular en forma de polinucleótidos, polinucleótidos modificados, fragmentos de ácidos nucleicos modificados, oligonucleótidos y/u oligonucleótidos. En lo que se refiere especialmente a los fragmentos de ácidos nucleicos modificados se puede tratar, en particular, de ácidos nucleicos bloqueados (locked nucleic acids, LNA) o ácidos nucleicos peptídicos (PNA).

De acuerdo con una primera forma de realización de la presente invención puede estar previsto, además, que las sondas de hibridación específicas de locus sean formadas respectivamente por un fragmento de ácido nucleico individual que cubre respectivamente la región a detectar del cromosoma y/o del ADN.

De acuerdo con otra forma de realización y además de esto preferida de la presente invención, también puede estar previsto que las sondas de hibridación específicas de locus sean formadas respectivamente por una pluralidad de fragmentos de ácidos nucleicos ("fragmentos de sondas") que respectivamente cubren la región a detectar del cromosoma y/o del ADN. A este respecto se prefiere, además, que los fragmentos individuales de ácidos nucleicos ("fragmentos de sondas") de una sonda de hibridación específica de locus presenten una longitud en el intervalo de 5 a 2.000 pb, en particular en el intervalo de 10 a 1.500 pb, preferiblemente en el intervalo de 50 a 1.000 pb.

En lo que concierne además de esto a la generación de señales mixtas mediante el marcaje de sondas de hibridación específicas de locus con al menos otra etiqueta de detección, distinta de la primera, para la generación deliberada de señales mixtas, ésta puede tener lugar de manera diferente:

De acuerdo con una primera forma de realización al respecto de la presente invención puede estar previsto que, para la generación de señales mixtas, los fragmentos de ácidos nucleicos ("fragmentos de sondas") de una sonda de hibridación específica de locus estén marcados, además de con la primera etiqueta de detección, con otra etiqueta de detección diferente de la primera etiqueta de detección. Sondas de hibridación marcadas de este modo generan, por consiguiente, una señal mixta que únicamente se basa en dos etiquetas de detección diferentes entre sí.

Además de esto, de acuerdo con otra forma de realización de la presente invención - en particular ante los antecedentes de aumentar la anchura de banda de señales mixtas específicas, o bien de aumentar el número de señales mixtas específicas, o bien diferentes entre si - puede estar previsto que para la generación de señales mixtas los fragmentos de ácidos nucleicos ("fragmentos de sondas") de una sonda de hibridación específica de locus estén marcados, además de con la primera etiqueta de detección, con varios, en particular dos a veinte, preferiblemente dos a diez, de preferencia dos a seis etiquetas de detección diferentes de la primera etiqueta de detección. En este caso, puede estar previsto, en particular, que las etiquetas de detección se empleen en cantidades diferentes entre sí. De acuerdo con la invención puede estar previsto, por consiguiente, que para la generación de señales mixtas en el marco del marcaje de sondas de hibridación específicas de locus se empleen varias etiquetas de detección diferentes entre sí en relaciones respectivamente diferentes entre sí. Por ejemplo - y de ningún modo de forma limitante - una sonda de hibridación específica de locus puede presentar - además de la primera etiqueta de detección - tres etiquetas de detección adicionales, y en este caso la fracción de la primera etiqueta de detección asciende a 20%, la fracción de la segunda etiqueta de detección a 60% y la fracción de la tercera etiqueta de detección a 20%, referido a las otras tres etiquetas de detección.

De acuerdo con esta forma de realización puede estar previsto, por consiguiente, que las sondas de hibridación presenten, además de la primera etiqueta de detección, al menos dos, preferiblemente varias etiquetas de detección diferentes entre sí. Mediante el empleo de las distintas etiquetas de detección en relaciones diferentes entre sí puede aumentarse en conjunto el número de señales mixtas específicas, en particular diferenciables entre sí, lo cual posibilita a su vez la detección de un mayor número de aberraciones cromosómicas detectables.

En el contexto del marcaje de sondas de hibridación específicas de locus puede estar previsto básicamente, además, de acuerdo con la invención, que fragmentos individuales de ácidos nucleicos de una sonda específica para la hibridación estén marcados solamente con una etiqueta de detección. En este caso, se puede tratar de la primera etiqueta de detección y/o de cualquier otra etiqueta de detección (véase la Fig. 2 I)).

Expresado de otro modo, por consiguiente, es posible, de acuerdo con la invención, que una primera porción de los fragmentos de ácidos nucleicos de una sonda de hibridación específica de locus esté marcada solo con la primera etiqueta de detección y otras porciones de los fragmentos de ácidos nucleicos de una sonda de hibridación específica de locus estén marcadas respectivamente con otra etiqueta de detección, diferente de la primera etiqueta de detección. La generación de señales mixtas puede tener lugar, por consiguiente, de acuerdo con una forma de realización de la presente invención, gracias a la presencia de etiquetas de detección, diferentes entre sí, que forman la señal mixta, en fragmentos de ácidos nucleicos diferentes entre sí de una sonda específica para la hibridación (véase la Fig. 2 I)). Además, puede estar previsto que fragmentos de ácidos nucleicos individuales de una sonda específica para la hibridación estén marcados con varias etiquetas de detección diferentes entre sí, en particular en este caso se puede tratar de la primera etiqueta de detección y/o de cualquier otra etiqueta de detección (véase la Fig. 2 II)).

De acuerdo con esta forma de realización de la presente invención puede estar previsto, por consiguiente, que las etiquetas de detección, distintas entre sí, que forman la señal mixta, se presenten en los mismos fragmentos de ácidos nucleicos de una sonda específica para la hibridación, o bien se presenten conjuntamente sobre los fragmentos de ácidos nucleicos de una sonda específica para la hibridación (la denominada "sonda mixta") (véase la Fig. 2 II)). Además de esto, en el contexto también puede estar previsto combinar entre sí las dos formas de realización antes mencionadas para la generación de señales mixtas; es decir, que una parte de los fragmentos de ácidos nucleicos que configuran una señal mixta de una sonda de hibridación específica de locus esté marcada solamente con una etiqueta de detección y que otra o varias partes adicionales de los fragmentos de ácidos nucleicos de una sonda específica para la hibridación estén marcadas con al menos dos etiquetas de detección diferentes.

Además de esto, también es posible generar señales mixtas cuando entre fragmentos de ácidos nucleicos hibridados individuales de una sonda de hibridación específica de locus marcada con al menos una etiqueta de detección adicional esté presente una separación de como máximo 3 Mpb, en particular de como máximo 2,5 Mpb, preferiblemente de como máximo 2 Mpb, de preferencia de como máximo 1 Mpb, de manera particularmente preferida de como máximo 500 kb, todavía más preferiblemente de como máximo 200 kb. Expresado de otro modo, por consiguiente también es posible, de acuerdo con la invención, generar una señal mixta cuando entre los distintos fragmentos de ácidos nucleicos hibridados de una sonda de hibridación específica de locus marcada con al menos una etiqueta de detección adicional se presente en estado hibridado un "hueco" de como máximo 3 Mpb, en particular de como máximo 2,5 Mpb, preferiblemente de como máximo 2 Mpb, de preferencia de como máximo 1 Mpb, de manera particularmente preferida de como máximo 500 kb, todavía más preferiblemente de como máximo 200 kb (véase la Fig. 2 III)).

Por consiguiente, se pueden generar señales mixtas, en particular, mediante el uso de "etiquetas mixtas" de una sonda individual. En particular, para la generación de las señales mixtas específicas para una región cromosómica o un segmento genómico opcionalmente pueden marcarse I) todos los fragmentos de una sonda u opcionalmente también solo fragmentos individuales de una sonda con varias etiquetas o pueden estar marcados II) segmentos iguales respectivamente con etiquetas diferentes o pueden estar marcados III) segmentos alternantes con diferentes etiquetas, de modo que también aquí finalmente solo sea visible, o bien detectable, una señal mixta (véanse las Figs. 2 I a III)). También pueden surgir etiquetas mixtas y señales mixtas en el sentido del procedimiento de acuerdo con la invención si algunos o todos los fragmentos mencionados antes en I) a III) se solapan solo parcialmente.

También pueden resultar etiquetas mixtas en el sentido del procedimiento de acuerdo con la invención cuando fragmentos individuales o grupos de fragmentos de una sonda, que están marcados con al menos una etiqueta y otros fragmentos individuales o grupos de fragmentos de la sonda que están marcados con al menos otra etiqueta, presentan una distancia de 2 Mpb, opcionalmente 1 Mpb, opcionalmente 500 kb y opcionalmente 200 kb.

Por consiguiente, también pueden generarse etiquetas mixtas y señales mixtas en el sentido del procedimiento de acuerdo con la invención cuando se utilicen dos o más sondas de igual secuencia o casi de igual secuencia; es decir, dos o más sondas que estén dirigidas a las mismas regiones cromosómicas específicas o los mismos segmentos genómicos, pero estén marcadas con diferentes etiquetas, en cuyo caso las sondas mencionadas también pueden coincidir solo en un 95%, opcionalmente 90%, opcionalmente 80%, opcionalmente 70%, opcionalmente 60%, opcionalmente 50%, y las diferencias resultan mediante variaciones de secuencia de secuencias básicamente similares o mediante un solapamiento parcial solamente de zonas individuales de las sondas.

La elección de etiquetas de detección adecuadas como tales para la realización se encuentra dentro del conocimiento habitual del experto en la materia y tiene lugar en función del procedimiento empleado para la realización de la hibridación in situ. Habitualmente, mediante la elección de etiquetas de detección adecuadas puede tener lugar un marcaje directo o un marcaje indirecto de las sondas de hibridación.

Resultados particularmente buenos se obtienen en el contexto de la presente invención cuando las etiquetas de detección se eligen del grupo de colorantes; sustratos colorantes; colorantes de quimioluminiscencia, en particular acridinio; radioisótopos; etiquetas de espín; enzimas, en particular fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, peroxidasa de soja y/o beta-galactosidasa: haptenos, en particular digoxigenina, biotina, 2,4-dinitrofenol, 5(6)-carboxifluoresceína, rodamina, bromodesoxiuridina, acetilaminofluoreno, trinitrofenol, derivados de trinitrofenol, estradiol y/o 2,4-dinitrofenol; puntos cuánticos; perlas; aminohexileno; pirenos; y/o colorantes de fluorescencia, en particular fluoresceína, derivado de fluoresceína, 5(6)-carboxifluoresceína, cumarina, derivado de cumarina, rodamina, derivado de rodamina, tetrametilrodamina, lisamina, Texas Rojo, AMCA, TRITC, colorante IR, colorante Alexa, colorante Dyomics, ficoeritrinas, cascada azul, Oregón Verde 488, Pacífico Azul y/o rodamina verde.

En lo que se refiere a la realización de la hibridación in situ como tal, ésta puede tener lugar de distinta manera. En particular, de acuerdo con una primera forma de realización preferida de la hibridación in situ, puede estar previsto que ésta tenga lugar bajo el marcaje directo de las sondas de hibridación, en particular mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH).

De igual manera, puede estar previsto que la hibridación in situ tenga lugar marcando las sondas de hibridación con colorantes de fluorescencia, en particular para el intervalo de emisión visible, infrarrojo y/o ultravioleta, preferiblemente para las regiones de emisión verde, naranja/rojo, rojo, oro y/o azul.

De acuerdo con otra forma de realización preferida de la hibridación in situ puede estar previsto igualmente que ésta tenga lugar bajo marcaje indirecto de las sondas de hibridación, en particular mediante la hibridación in situ de campo claro (BrISH).

Además, puede estar previsto de acuerdo con la invención que la hibridación in situ tenga lugar marcando las sondas de hibridación con haptenos, en particular biotina, digoxigenina y/o DNP, y detectando a continuación mediante fosfatasa alcalina acoplada a anticuerpos, peroxidasa acoplada a anticuerpos y/o beta-galactosidasa acoplada a anticuerpos.

En lo que concierne al análisis de hibridaciones in situ basadas en fluorescencia, éstas tienen lugar preferiblemente utilizando conjuntos de filtros específicos individuales, o bien múltiples, que permiten, en particular, la representación dirigida de señales de fusión y mixtas.

Además de esto, puede ser ventajoso, en particular en el caso de la generación de señales mixtas a base de más de al menos una etiqueta de detección adicional, en particular en el caso de la generación de etiquetas mixtas a base de al menos dos etiquetas de detección adicionales, preferiblemente varias etiquetas de detección adicionales en relaciones diferentes, o bien definidas entre sí, realizar una evaluación mediante análisis sustentado por ordenador. Además de esto, también puede estar previsto, en particular, mediante análisis sustentado por ordenador, proporcionar imágenes superpuestas que permiten una representación común de los modelos de señales de diferentes conjuntos de filtro, individuales, o bien múltiples.

Básicamente, con el procedimiento de acuerdo con la invención se puede detectar una pluralidad de diferentes tipos de aberraciones cromosómicas. En particular, el procedimiento de acuerdo con la invención puede emplearse para la detección de translocaciones, inversiones, duplicaciones de segmentos, deleciones, inserciones, duplicaciones, aneuploidías y amplificaciones, en particular translocaciones y/o inversiones.

En el contexto del procedimiento de acuerdo con la invención puede estar previsto en este caso que las aberraciones cromosómicas estén relacionadas con enfermedades, en particular tumores malignos, preferiblemente carcinomas, sarcomas y/o leucemias.

Los genes a examinar en cuanto a aberraciones cromosómicas potenciales se eligen preferiblemente del grupo de ALK, ROS1, RET, NRG1, NTRK1, CARS, EML4, FGFR2, FGFR3, KIF5B, TGF, BCR, ABL, ALK, BCL2, BCL6, BIRC3, CCND1, EGR1, ETV6, FGFR1, FGFR3, IGH, KMT2A, MYC, PML, RARA, RUNX1, RUNX1T1, EWSR1, CHOP, FUS, COL1A1, DDIT3, JAZF1, NR4A3, FOXO1, FUS, PAX3, PAX7, PDGFB, SS18, TFE3, USP6, WT1, HER2/ERBB2, FGFR1, ALK, CCND1, CDK4, CD274, PDCD1 LG2, EGR1, EGFR, ESR1, ETV1, FGF3,4,19, FGFR2, FGFR3, FHIT (RCC), KRAS, MDM2, MDM4, MET, MYB, MYC, MYCN, PIK3CA, PTEN, SMARCB1, SOX2, TERT, TOP2A, TP53, TYMS y/o VHL.

Resultados particularmente buenos se alcanzan en el contexto del procedimiento de acuerdo con la invención cuando el procedimiento de acuerdo con la invención se emplea para la detección de inversiones y/o translocaciones:

En el contexto de una forma de realización preferida de la presente invención, el procedimiento de acuerdo con la invención se emplea para la detección de diferentes translocaciones y/o inversiones, en particular en tumores de pulmón, en cuyo caso se ven afectados, particularmente, los genes A l K, ROS1, RET, NRG1, NTRK1, CARS, EML4, FGFR2, FGFR3, KIF5B y/o TGF. Además, puede estar previsto que el procedimiento de acuerdo con la invención se emplee para la detección de diferentes translocaciones y/o inversiones, en particular en linfomas y leucemias, en cuyo caso se ven afectados, particularmente, los genes b Cr , ABL, ALK, Bc L2, BCL6, BIRC3, CCND1, EGR1, ETV6, FGFR1, FGFR3, IGH, KMT2A, MYC, PML, RARA, RUNX1 y/o RUNX1T1.

De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, el procedimiento de acuerdo con la invención se emplea para la detección de diferentes translocaciones y/o inversiones, en particular en sarcomas, en cuyo caso se ven afectados, particularmente, los genes: EWSR1, CHOP, FUS, COL1A1, DDIT3, JAZF1, NR4A3, FOXO1, FUS, PAX3, PAX7, PDGFB, SS18, TFE3, USP6 y/o WT1.

De acuerdo con la invención también puede estar previsto que el procedimiento de acuerdo con la invención se emplee para la detección de inversiones y/o translocaciones, en cuyo caso se ven afectados particularmente los genes ALK y ROS1.

Además de esto, en el contexto de la presente invención se consiguen resultados extraordinarios cuando el procedimiento de acuerdo con la invención se emplea para la detección de amplificaciones y/o deleciones: Para la detección de amplificaciones, o bien de deleciones, pueden emplearse hasta veinticuatro diferentes sondas específicas de locus, en cuyo caso una sonda se dirige respectivamente a una región genómica respectiva, y en cuyo caso las distintas sondas están marcadas con etiquetas diferentes en diferentes combinaciones y relaciones. Por medio de las señales mixtas resultantes en el modelo de señales se pueden diferenciar inequívocamente entre sí las diferentes sondas específicas de locus. Por consiguiente, en un procedimiento se pueden examinar hasta veinticuatro eventos diferentes de amplificación y/o deleción de las regiones genómicas afectadas. La detección de una amplificación o deleción específica tiene lugar a través del recuento de las señales mixtas o de los colores mixtos diferentes.

Preferiblemente, el procedimiento de acuerdo con la invención se emplea para la detección de diferentes amplificaciones y deleciones, en particular en tumores de mama, intestino y pulmón, en cuyo caso se ven afectados particularmente los genes HER2/ERBB2, FGFR1, ALK, CCND1, CDK4 , CD274, PDCD1LG2, EGR1, EGFR, ESR1, ETV1, FGF3,4,19, FGFR2, FGFR3, FHIT (RCC), KRAS, MDM2, MDM4, MET, MYB, MYC, MYCN, PIK3CA, PTEN, SMARCB1, SOX2, TERT, TOP2A, TP53, TYMS y/o VHL

Por consiguiente, en conjunto, en el contexto de la presente invención se encontró, sorprendentemente, que utilizando sondas específicas de locus con etiquetas mixtas resultan señales mixtas bien detectables y evaluables y de forma de segura, que permiten identificar inequívocamente regiones cromosómicas afectadas por una aberración. Por consiguiente, el procedimiento de acuerdo con la invención permite por vez primera y de manera sorprendente la detección de varias mutaciones cromosómicas estructurales y/o numéricas diferentes. Esto no es posible con el estado de la técnica.

Otro objeto de la presente invención es - de acuerdo con un segundo aspecto de acuerdo con la invención - una composición para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas, preferiblemente aberraciones cromosómicas estructurales, mediante hibridación in situ, en particular mediante la detección de regiones del cromosoma y/o del ADN en una muestra biológica, preferiblemente en una o varias células y/o en uno o varios núcleos celulares, en particular mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en cuyo caso la composición comprende al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación, específicas de locus, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con un primera etiqueta de detección, y en cuyo caso al menos una de las sondas de hibridación especifica de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la sonda de hibridación específica de locus respectiva, y en cuyo caso se puede generar una señal mixta por medio de las dos o más etiquetas de detección diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus.

De igual manera, de acuerdo con este aspecto de acuerdo con la invención, es objeto de la presente invención una composición para uso en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico y/o en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades relacionadas con aberraciones cromosómicas, en particular tumores malignos, preferiblemente carcinomas, sarcomas y/o leucemias, de manera particularmente preferida tumores de pulmón, linfomas, leucemias, sarcomas, carcinomas de mama y/o cáncer de intestino; la composición comprende al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con un primera etiqueta de detección, y en cuyo caso al menos una de las sondas de hibridación especifica de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la respectiva sonda de hibridación especifica de locus.

A este respecto, puede estar previsto, en particular, que se determinen o se empleen las composiciones de acuerdo con la invención para llevar a cabo un procedimiento tal como se describió antes.

Con respecto a más detalles sobre este aspecto de la invención, puede hacerse referencia a las formas de realización anteriores con respecto a los aspectos restantes de acuerdo con la invención que son correspondientemente válidos también en relación con este aspecto de la invención.

Además, es objeto de la presente invención - según un tercer aspecto de la invención - el uso de una composición, en particular como se describió anteriormente, para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas, preferiblemente aberraciones cromosómicas estructurales, por medio de hibridación in situ, en particular mediante la detección de regiones cromosómicas y/o de ADN en una muestra biológica, preferiblemente en una o más células y/o en uno o más núcleos celulares, en particular mediante el procedimiento descrito anteriormente y en cuyo caso se puede generar una señal mixta mediante dos o más etiquetas de detección diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus.

Con respecto a más detalles sobre este aspecto de la invención, es posible remitirse a las anteriores formas de realización con respecto a los aspectos restantes de acuerdo con la invención que también son correspondientemente válidos en relación con este aspecto de la invención.

De acuerdo con un cuarto aspecto de acuerdo con la invención, otro objeto de la presente invención es, además, el uso de al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con un primera etiqueta de detección, en cuyo caso al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la sonda de hibridación especifica de locus respectiva, para la detección de aberraciones cromosómicas, en particular aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas, mediante hibridación in situ, en particular mediante detección de regiones del cromosoma y/o del ADN en una muestra biológica, preferiblemente en una o varias células y/o en uno o varios núcleos celulares, preferiblemente por medio de un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, y en el que se puede generar una señal mixta mediante dos o más etiquetas de detección, diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus.

De igual manera, de acuerdo con este aspecto de la invención, es objeto de la presente invención el uso de al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con un primera etiqueta de detección, en cuyo caso al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la respectiva sonda de hibridación específica de locus, preferiblemente en el contexto de un procedimiento de acuerdo con la invención antes descrito, en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades relacionadas con aberraciones cromosómicas, en particular tumores malignos, preferiblemente carcinomas, sarcomas y/o leucemias, de manera particularmente preferida tumores de pulmón, linfomas, leucemias, sarcomas, carcinomas de mama y/o cáncer de intestino.

Con respecto a más detalles sobre este aspecto de la invención, es posible remitirse a las formas de realización anteriores con respecto a los aspectos restantes de acuerdo con la invención que también son correspondientemente válidos en relación con este aspecto de la invención.

De acuerdo con un quinto aspecto según la invención, también es objeto de la presente invención, además, el uso de al menos una sonda de hibridación específica de locus marcada con al menos dos etiquetas de detección, junto con al menos una, en particular al menos dos, preferiblemente al menos tres sondas de hibridación específicas de locus adicionales, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con al menos un primera etiqueta de detección, para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas, preferiblemente aberraciones cromosómicas estructurales, mediante hibridación in situ, en particular mediante detección de regiones del cromosoma y/o del ADN en una muestra biológica, preferiblemente en una o varias células y/o en uno o varios núcleos celulares, preferiblemente por medio de un procedimiento tal como el descrito anteriormente, y en cuyo caso se puede generar una señal mixta mediante dos o más etiquetas de detección, diferentes entre sí, ubicados en una sonda de hibridación específica de locus.

Con respecto a más detalles sobre este aspecto de la invención, es posible remitirse a las anteriores formas de realización con respecto a los aspectos restantes de acuerdo con la invención que también son correspondientemente válidos en relación con este aspecto de la invención.

Finalmente, según un sexto aspecto de acuerdo con la invención, es objeto de la presente invención un kit, o bien kit de partes o conjunto, para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí, en particular aberraciones cromosómicas estructurales y/o numéricas, preferiblemente aberraciones cromosómicas estructurales, mediante hibridación in situ, en particular mediante detección de regiones del cromosoma y/o del ADN en una muestra biológica, preferiblemente en una o varias células y/o en uno o varios núcleos celulares, que comprende al menos dos, particularmente al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con un primera etiqueta de detección, en cuyo caso al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la respectiva sonda de hibridación específica de locus, en particular en cuyo caso el kit se determina y/o se emplea para llevar a cabo el procedimiento expuesto antes, y en cuyo caso se puede generar una señal mixta mediante dos o más etiquetas de detección, diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus. A este respecto, puede estar previsto, en particular, que las al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, se presenten en una composición común, en particular en una composición tal como se expuso anteriormente. De igual manera, puede estar previsto que las al menos tres, preferiblemente al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, se presenten separadas una de otra en composiciones separadas.

Con respecto a más detalles sobre este aspecto de la invención, es posible remitirse a las formas de realización anteriores con respecto a los aspectos restantes de acuerdo con la invención que también son correspondientemente válidas en relación con este aspecto de la invención.

Breve descripción de las figuras

A continuación, se describe con mayor detalle la presente invención por medio de dibujos y ejemplos. Estos muestran: La Fig. 1: representación esquemática de un procedimiento de acuerdo con la invención para la detección de dos translocaciones.

La Fig. 2: representación esquemática de un procedimiento de acuerdo con la invención que se refiere al uso de varias etiquetas para la representación de etiquetas mixtas y señales mixtas.

La Fig. 3: esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH cuádruple "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Dual-Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH.

La Fig. 4: esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH cuádruple "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH.

La Fig. 5: esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH séxtuple "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 & RET Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH.

La Fig. 6: esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH séxtuple "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 & RET Break Apart Single-Mix II NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH.

La Fig. 7: representación esquemática de un procedimiento de acuerdo con la invención para la detección de cuatro aberraciones numéricas.

La Fig. 8: Representación esquemática de un procedimiento según la invención para la detección de siete translocaciones o amplificaciones.

La Fig. 9: Análisis FISH para detectar una translocación de la región ROS1 en 6q22 utilizando la sonda FISH cuádruple “ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe” de ZytoVision GmbH.

La Fig. 10: Análisis CISH para detectar una translocación de la región ALK en 2p23 usando la sonda CISH cuádruple “ZytoDot SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-MIX NG-FISH Probe” de ZytoVision GmbH.

La Fig. 11: Análisis FISH para detectar la amplificación de la región ERBB2 usando la sonda FISH quíntuple “ZytoLight SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck™ NG-FISH probe” de ZytoVision.

Descripción más detallada de las figuras

La Fig. 1 muestra una representación esquemática de un procedimiento de acuerdo con la invención, para la detección de dos translocaciones utilizando cuatro sondas y tres etiquetas, en cuyo caso una sonda está marcada al mismo tiempo con dos etiquetas. La figura muestra el modelo de señales en el caso de células normales, así como en el caso de células con translocación del gen ALK en 2p23 o del gen ROS1 en 6q22. Ambas regiones del punto de ruptura (ALK y ROS1) son flanqueadas respectivamente por la etiqueta A o B de la sonda ISH cuádruple y proporcionan respectivamente una señal de fusión A-B. Un lado de la región del punto de ruptura de ALK es flanqueado además de esto también con la etiqueta C, de modo que se produce una etiqueta mixta A/C.

En la interfase de una célula normal (sin aberraciones ALK o ROS1), los loci del gen ROS1 son marcados por señales de fusión A-B y los loci del gen ALK son marcados por señales de fusión A-B que van acompañadas de señales mixtas A/C. En la interfase de una célula afectada por una translocación ALK, el gen ALK afectado por la translocación es marcado por una señal separada de la etiqueta B, así como de una señal mixta A/C separada de la anterior. En la interfase de una célula afectada por una translocación ROS1, el gen ROS1 afectado por la translocación es marcado mediante una señal separada de la etiqueta A, así como de una señal separada de la etiqueta B.

La Fig. 2 muestra una representación esquemática de un procedimiento de acuerdo con la invención que se refiere al uso de varias etiquetas para la representación de etiquetas mixtas y señales mixtas. Por bien de la visión de conjunto, se representan solamente dos etiquetas. Pueden surgir señales mixtas que son específicas para una sonda específica de locus y, por consiguiente, para una región cromosómica o un segmento genómico, si I) los fragmentos de una sonda son marcados con etiquetas respectivamente diferentes y/o II) todos los fragmentos de una sonda u, opcionalmente, también solo los fragmentos individuales de una sonda son marcados con varias etiquetas y/o III) los fragmentos alternantes son marcados con diferentes etiquetas, de modo que también aquí finalmente solo se puede visualizar, o bien detectar, una señal mixta. En este caso, todos o también solo los fragmentos individuales según I) a III) pueden transponerse, o bien solaparse (no representados) y pueden formarse también etiquetas mixtas cuando los fragmentos individuales o grupos de fragmentos de I) a III) presenten una distancia de hasta 2 Mpb, por ejemplo, en el "hueco" representado.

La Fig. 3 muestra un esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH cuádruple correspondiente "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Dual-Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision. La sonda se compone de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1, polinucleótidos marcados en naranja (absorción a 547 nm y emisión a 572 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1, así como polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que en la región 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal y contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK.

Al utilizar conjuntos de filtro adecuados, las señales de hibridación para el gen ALK no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas, que se componen de señales mixtas de fluorescencia verde/azules y naranja/azules. Las señales de hibridación para el gen ROS1 no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas.

En la interfase de una célula normal (sin aberraciones ALK o ROS1) aparecen cuatro señales de fusión verde-naranjas al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda dual verde-naranja, dos señales azules al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda sencilla, así como al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda triple, dos señales de fusión verde-naranjas y dos señales de fusión y mixtas verde-naranja/azules (véase la Fig. 3a). Un locus 2p23 afectado por una translocación ALK está caracterizado por una señal mixta verde/azul separada y una señal mixta naranja/azul separada (véase la Fig. 3b).

Un locus 6q22 afectado por una translocación ROS1 está caracterizado por una señal verde separada y por una señal naranja separada (véase la Fig. 3c).

Al utilizar conjuntos adecuados de filtro paso banda dual para señales verdes y naranjas, las señales verdes y naranjas separadas de las mismas permiten solo afirmar en principio que básicamente está presente una translocación ALK o ROS1. Una diferenciación posiblemente relevante desde un punto de vista diagnóstico entre una translocación ALK o ROS1 solo puede tener lugar incorporando las señales de fluorescencia azules. Si las señales verdes separadas solapan a señales azules (señales mixtas verde/azules), o bien las señales naranjas separadas solapan a las señales azules (señales mixtas naranja/azules), esto indica una translocación ALK. Si las señales verdes y naranjas separadas no se solapan con señales azules, esto indica una translocación ROS1.

La Fig. 4 muestra un esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH cuádruple correspondiente "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision. La sonda se compone de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1, polinucleótidos marcados en naranja (absorción a 547 nm y emisión a 572 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1, así como polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que en la región 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK.

Al utilizar conjuntos de filtro adecuados, las señales de hibridación para el gen ALK no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas, que se componen de señales mixtas de fluorescencia verdes y naranja/azules. Las señales de hibridación para el gen ROS1 no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas.

En la interfase de una célula normal (sin aberraciones ALK o ROS1) aparecen cuatro señales de fusión verde/naranjas al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda dual verde-naranja, dos señales azules al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda sencilla, así como al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda triple, dos señales de fusión verde-naranjas y dos señales de fusión y mixtas verde-naranja/azules (véase la Fig. 4a). Un locus 2p23 afectado por una translocación ALK está caracterizado por una señal verde separada y una señal mixta naranja/azul separada (véase la Fig. 4b).

Un locus 6q22 afectado por una translocación ROS1 está caracterizado por una señal verde separada y por una señal naranja separada (véase la Fig. 4c).

Al utilizar conjuntos adecuados de filtro paso banda dual para señales verdes y naranjas, las señales verdes y naranjas separadas de las mismas permiten, por consiguiente, solo afirmar en principio que básicamente está presente una translocación ALK o ROS1. Una diferenciación posiblemente relevante desde un punto de vista diagnóstico entre una translocación ALK o ROS1 solo puede tener lugar entonces incorporando las señales de fluorescencia azules. Si las señales naranjas separadas solapan a señales azules (señales mixtas naranja/azules), esto indica una translocación ALK. Si las señales naranjas separadas no se solapan con señales azules, esto indica una translocación ROS1. La Fig. 5 muestra un esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH séxtuple correspondiente "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 & RET Break Apart Dual-Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision. La sonda se compone de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK, en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1 y en 10q11 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de RET, polinucleótidos marcados en naranja (absorción a 547 nm y emisión a 572 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK, en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1 y en 10q11 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de RET, así como polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que están dirigidos en la región 2p23 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK y en 10q11 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de RET.

Al utilizar conjuntos adecuados de filtro, las señales de hibridación para el gen ALK no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas, que se componen de señales mixtas de fluorescencia verdes y naranja/azules. Las señales de hibridación para el gen RET no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas, que se componen de señales mixtas verde/azules y señales naranjas. Las señales de hibridación para el gen ROS1 no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas.

En la interfase de una célula normal (sin aberraciones ALK, ROS1 o RET) aparecen seis señales de fusión verdenaranjas al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda dual verde-naranja, cuatro señales azules al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda sencilla, así como al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda triple, dos señales de fusión verde-naranjas, dos señales de fusión y mixtas verde-naranja/azules y dos señales de fusión y mixtas verde/azul-naranjas (véase la Fig. 5a).

Un locus 2p23 afectado por una translocación ALK está caracterizado por una señal verde separada y una señal mixta naranja/azul separada (véase la Fig. 5b).

Un locus 6q22 afectado por una translocación ROS1 está caracterizado por una señal verde separada y por una señal naranja separada (véase la Fig. 5c).

Un locus 10q11 afectado por una translocación RET está caracterizado por una señal naranja separada y por una señal mixta verde/azul separada (véase la Fig. 5d).

Al utilizar conjuntos adecuados de filtro paso banda dual para señales verdes y naranjas, las señales verdes y naranjas separadas de las mismas permiten, por consiguiente, solo afirmar en principio que básicamente está presente una translocación ALK, ROS1 o RET. Una diferenciación posiblemente relevante desde un punto de vista diagnóstico entre una translocación ALK, ROS1 o RET solo puede tener lugar entonces incorporando las señales de fluorescencia azules. Si las señales naranjas separadas solapan a las señales azules (señales mixtas naranja/azules), esto indica una translocación ALK. Si las señales verdes separadas solapan a las señales azules (señales mixtas verde/azules), esto indica una translocación RET. Si las señales naranjas separadas ni las señales verdes separadas no se solapan con señales azules, esto indica una translocación ROS1.

La Fig. 6 muestra un esquema de modelos de señales al utilizar una sonda FISH séxtuple correspondiente "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 & RET Break Apart Dual-Mix II NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH. La sonda se compone de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK, en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1 y en 10q11 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de RET, polinucleótidos marcados en rojo (absorción a 580 nm y emisión a 599 nm) que en 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK, en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1 y en 10q11 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de RET, polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que en la región 2p23 están dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK, así como polinucleótidos marcados en amarillo oro (absorción a 532 nm y emisión a 553 nm) que en la región 10q11 están dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de RET.

Al utilizar conjuntos de filtro adecuados, las señales de hibridación para el gen ALK no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-rojas, que se componen de señales mixtas de fluorescencia verdes y rojas/azules. Las señales de hibridación para el gen RET no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-rojas, que se componen de señales mixtas verde/amarillo oro y señales rojas. Las señales de hibridación para el gen ROS1 no reorganizado aparecen en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-rojas.

En la interfase de una célula normal (sin aberraciones ALK, ROS1 o RET) aparecen seis señales de fusión verde-rojas al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda dual verde-rojos, dos señales azules al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda sencilla, así como dos señales amarillo oro al utilizar un conjunto adecuado de filtros de paso banda sencilla (véase la Fig. 6a).

Un locus 2p23 afectado por una translocación ALK está caracterizado por una señal verde separada y una señal mixta roja/azul separada (véase la Fig. 6b).

Un locus 6q22 afectado por una translocación ROS1 está caracterizado por una señal verde separada y por una señal roja separada (véase la Fig. 6c).

Un locus 10q11 afectado por una translocación RET está caracterizado por una señal roja separada y por una señal mixta verde/amarillo oro separada (véase la Fig. 6d).

Al utilizar conjuntos adecuados de filtro paso banda dual para señales verdes y rojas, señales verdes y rojas separadas de las mismas permiten, por consiguiente, solo afirmar en principio que básicamente está presente una translocación ALK, ROS1 o RET. Una diferenciación posiblemente relevante desde un punto de vista diagnóstico entre una translocación ALK, ROS1 o RET solo puede tener lugar entonces incorporando las señales de fluorescencia azules, o bien amarillo oro. Si las señales rojas separadas solapan a las señales azules (señales mixtas rojo/azules), esto indica una translocación ALK. Si las señales verdes separadas solapan a las señales amarillo oro (señales mixtas verde/amarillo oro), esto indica una translocación RET. Si ni las señales rojas separadas ni las señales verdes separadas se solapan con señales azules, o bien amarillo oro, esto indica una translocación ROS1.

La Fig. 7 muestra una representación esquemática de un procedimiento de acuerdo con la invención para la detección de cuatro aberraciones numéricas utilizando cuatro sondas y cuatro etiquetas, en cuyo caso tres sondas están marcadas al mismo tiempo respectivamente con dos etiquetas, y las etiquetas utilizadas para la combinación se diferencian entre sí en el caso de estas tres sondas. Se muestra el modelo de señales en el caso de células normales, así como en el caso de células con la amplificación del gen MET en 7q31. La región 17q11.2-q12 del gen ERBB2 está cubierta con la etiqueta A, la región 7p12 del gen EGFR está cubierta con la etiqueta A y, además de esto, con la etiqueta D, de modo que se produce una etiqueta mixta A/D, la región 8p11.23-p11.22 del gen FGFR1 está cubierta con la etiqueta A y, además de esto, con la etiqueta C, de modo que se produce una etiqueta mixta A/C, así como la región 7q31 del gen MET está cubierta con la etiqueta A y, además de esto, con la etiqueta B, de modo que se produce una etiqueta mixta A/B.

En la interfase de una célula normal (sin aberración numérica ERBB2, EGFR, FGFR1 o MET), todos los loci están marcados por señales de la etiqueta A. Una co-localización de una señal de la etiqueta A con una señal de la etiqueta B conduce a una etiqueta mixta A/B y marca el locus del gen MET. Según esto, la etiqueta mixta A/C marca el locus del gen FGRF1 y la etiqueta mixta A/D marca el locus del gen EGFR. El locus del gen ERBB2 se caracteriza porque no se produce una co-localización con otra etiqueta. En la interfase de una célula con una amplificación del gen MET se produce un aumento de señales de la etiqueta A que se co-Iocalizan con señales de la etiqueta B y, por consiguiente, un aumento de señales de la etiqueta mixta A/B.

La Fig. 8 muestra una representación esquemática de un procedimiento según la invención para la detección de siete translocaciones o amplificaciones utilizando 14 sondas y cinco etiquetas cada una, en cuyo caso una sonda está marcada con dos etiquetas al mismo tiempo y la relación cuantitativa de las dos etiquetas es diferente por sonda. Cada una de las sondas flanquea una región de punto de ruptura ('Breakpoint') o se dirigen a una región de amplificación ('Amplification'), así como a otra región en el mismo cromosoma (por ejemplo, la región del centrómero), como se muestra en la parte superior izquierda o superior derecha de la Fig. 8. Las dos sondas de un cromosoma están marcadas con dos etiquetas diferentes y una etiqueta igual (por ejemplo, sonda 1: 25% verde, 75% azul y sonda 2: 25% amarillo y 75% azul). Las dos sondas, cada una de las cuales flanquea una región de punto de ruptura, por lo tanto, respectivamente dan como resultado señales de fusión y mixtas de tres etiquetas en una célula que no se ve afectada por una translocación. Por lo tanto, las dos sondas que se dirigen cada una a una región de amplificación y a una región adicional en el mismo cromosoma producen respectivamente señales mixtas separadas en una célula que no se ve afectada por la amplificación (a menos que la distancia entre las dos sondas sea tan pequeña, que surjan señales de fusión y mixtas). Al variar la relación cuantitativa entre las dos etiquetas con las que se marca una sonda, se generan diferentes señales mixtas, de modo que un gran número de sondas con las mismas etiquetas se pueden marcar de forma diferencial (por ejemplo, en el ejemplo mostrado, 4 sondas para las regiones de punto de ruptura 1 a 4: 25% a 75%; 50% a 50%; 75% a 25% y 100% a 0%).

En la interfase de una célula normal (sin translocaciones), las regiones de punto de ruptura de un gen están marcadas por señales mixtas A-B y C-B, que se combinan para formar señales de fusión A/B/C. En la interfase de una célula normal (sin amplificaciones), las regiones de amplificación de un gen son causadas por las señales mixtas A-B y otras regiones en el mismo cromosoma, por ejemplo, regiones del centrómero marcadas por las señales mixtas C-B. En la interfase de una célula afectada por una translocación, el gen afectado por la translocación está marcado por una señal separada de la etiqueta A-B y una señal mixta separada C-B. En la interfase de una célula afectada por una amplificación, el gen afectado por la amplificación está marcado por una señal mixta amplificada de un par de etiquetas, por ejemplo, A-B.

La Fig. 9 muestra un análisis FISH para detectar una translocación de la región ROS1 en 6q22 usando la sonda FISH cuádruple "ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe" de ZytoVision. La sonda consta de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm), que en 2p23 se dirigen contra secuencias ubicadas proximales a la región del punto de ruptura ALK y en secuencias 6q22 ubicadas proximales a la región del punto de ruptura ROS1, polinucleótidos marcados en naranja (absorción a 547 nm y emisión a 572 nm), que en 2p23 están dirigidos contra secuencias distales a la región del punto de ruptura ALK y en secuencias 6q22 distales a la región del punto de ruptura ROS1, así como polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm), que se dirigen en la región 6q22 proximales a la región del punto de ruptura ROS1.

Si se utilizan conjuntos de filtros adecuados, las señales de hibridación para los genes ROS1 y/o ALK no reorganizados aparecen como señales de fusión de fluorescencia verde-naranja y para un gen ROS1 y/o ALK reorganizado como una señal verde separada y naranja separada (véase fig. 9A, que muestra las señales fluorescentes verde y naranja). Las señales verdes específicas de ROS1 se co-localizan con las señales de fluorescencia azul (véase fig. 9B, que muestra las señales de fluorescencia azul), de modo que el gen ROS1 no reorganizado se compone de señales de fluorescencia mixtas naranja y verde /azul. Las señales de hibridación para el gen ALK no reorganizado aparecen como señales de fusión de fluorescencia verde-naranja, sin señales mixtas con señales de fluorescencia azul. El locus 6q22 afectado por una translocación de ROS1 se indica mediante una señal verde separada y una naranja separada (flechas en la Fig. 9A y C). La señal verde separada se solapa con una señal azul. Esta señal mixta verde/azul indica ROS1, no ALK, como el gen afectado por la translocación (véase fig. 9C, que muestra las señales fluorescentes azul, verde y naranja). El modelo de señal se puede hacer claramente visible con conjuntos de filtros adecuados.

La Fig. 10 muestra un análisis CISH para detectar una translocación de la región ALK en 2p23 usando la sonda CISH cuádruple "ZytoDot SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-MIX NG-FISH Probe" de ZytoVision. La sonda consta de polinucleótidos marcados con digoxigenina que en 2p23 se dirigen contra secuencias ubicadas proximales a la región del punto de ruptura ALK y en 6q22 contra secuencias ubicadas proximales a la región del punto de ruptura de ROS1, polinucleótidos marcados con DNP que en 2p23 se dirigen contra secuencias distales a la región del punto de ruptura ALK y en 6q22 se dirigen contra secuencias ubicadas distales a la región del punto de ruptura ROS1, así como polinucleótidos marcados con biotina que en la región 6q22 se dirigen contra las secuencias ubicadas distales a la región del punto de ruptura ROS1. Las marcas se detectaron utilizando anticuerpos primarios (no marcados) (Anti-DIG/Anti-DNP/Anti-BIO), que se detectan mediante anticuerpos conjugados con enzima, polimerizados secundarios (polímero HRP/polímero AP/beta-GAL), así como la conversión enzimática de los sustratos (AP-RED/HRPGREEN/beta-GAL-BLUE), lo cual conduce a la aparición de señales fuertes, permanentes, rojas (R), verdes (G) y azules (B), que pueden representarse mediante microscopia óptica, por ejemplo, con una lente seca de 40x. La Fig. 11 muestra un análisis FISH para detectar la amplificación de la región ERBB2 usando la sonda FISH quíntuple "ZytoLight SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck™ NG-FISH Probe" de ZytoVision. La sonda consta de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que se dirigen contra la región 17q11.2-q12 del gen ERBB2, la región 7p12 del gen EGFR, la región 8p11.23-p11.22 del gen FGFR1, la región 7q31 del gen MET y la región 3q26.3-q27 del gen SOX2 están dirigidas y formadas por polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que se dirigen contra la región de la Gen EGFR y gen SOX2, polinucleótidos marcados en amarillo dorado (absorción a 532 nm y emisión a 553 nm), que están dirigidos contra la región del gen FGFR1 y polinucleótidos marcados en rojo (absorción a 580 nm y emisión a 599 nm), que se dirigen contra la región del gen MET y el gen SOX2.

Cuando se utilizan conjuntos de filtros adecuados de paso de banda único, se muestran 9 señales verdes individuales y un grupo de señales verdes, que ocupa el área de varias señales verdes individuales (véase fig. 11A), 4 señales azules (véase fig. 11B), 2 señales amarillo dorado (véase fig. 11C) y 4 señales rojas (véase fig. 11D).

Superponiendo las imágenes (véase figura 11E) se muestra que una sola señal verde y el racimo de señales verdes no se colocalizan con señales de otro color (flechas). En el caso de la señal verde individual se trata de un gen ERBB2 no amplificado, el racimo de señales verdes identifica una amplificación del gen ERBB2. Las señales mixtas de colocalización verdes/azules identifican dos copias del gen EGFR, las señales mixtas de co-localización verde/amarillas doradas identifica dos copias del gen FGFR1, las señales mixtas de co-localización verde/rojas identifican dos copias del gen MET y las señales mixtas de co-localización verdes/azules/rojas identifican dos copias del gen SOX2 (véase fig. 11E).

Ejemplos de realización:

Para demostrar con más profundidad las propiedades del procedimiento según la invención se llevaron a cabo, además, las hibridaciones in situ descritas a continuación:

Ejemplo 1: Análisis FISH para la detección de aberraciones numéricas múltiples en diferentes tipos de células utilizando la sonda FISH quíntuple "SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck™ NGFISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH

La realización del FISH se efectuó en cortes de 3 a 5 pm de grosor de preparados de carcinoma de pulmón y de mama incrustados en parafina fijada con formalina (FFPE) sin o con una amplificación del gen ERBB2 previamente diagnosticada que se cultivan en portaobjetos de vidrio revestidos y se mantienen en el horno a 58°C durante la noche.

Para la eliminación de la parafina, los preparados se calentaron primeramente durante 10 minutos a 70 °C en una placa calefactora y, a continuación, se incubaron dos veces respectivamente durante 10 minutos a temperatura ambiente (TA) en 100% de xileno. Después, los preparados se rehidrataron mediante una serie en etanol decreciente (respectivamente 5 minutos a TA en etanol desnaturalizado al 96%, 96%, 90%, 70%) e incubación en agua purísima (dos veces respectivamente durante dos minutos a TA). A la permeabilización de las células sigue un tratamiento previo con calor durante 15 minutos a 98 °C en solución cítrica de pre-tratamiento térmico (ZytoVision GmbH), seguido de dos etapas de incubación adicionales durante dos minutos en agua purísima a TA. El tratamiento previo proteolítico se efectuó mediante goteo de una solución de pepsina (solución de pepsina, ZytoVision GmbH) sobre los preparados, y subsiguiente incubación en una cámara húmeda a 37 °C durante 25 minutos. Tras la subsiguiente incubación durante 5 min en Wash Buffer SSC (regulador de pH) (ZytoVision GmbH), los preparados se deshidrataron (respectivamente un minuto a TA en agua purísima, etanol al 70%, 90%, 96%). Después del secado al aire de los preparados se aplicaron directamente sobre los cortes, mediante pipeta, respectivamente 10 pl de la sonda FISH ZytoLight SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck™ NG-FISH Probe (ZytoVision GmbH).

En el caso de la sonda se trata de una mezcla a base de cinco sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso la mezcla consistió en polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que estaban dirigidos contra la región 17q11.2-q12 del gen ERBB2, la región 7p12 del gen Eg Fr , la región 8p11.23-p11.22 del gen FGFR1, la región 7q31 del gen MET y la región 3q26.3-q27 del gen SOX2, así como de polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que estaban dirigidos contra la región del gen EGFR y del gen SOX2, polinucleótidos marcados en amarillo oro (absorción a 532 nm y emisión a 553 nm) que estaban dirigidos contra la región del gen FGFR1 y polinucleótidos marcados en rojo (absorción a 580 nm y emisión a 599 nm) que estaban dirigidos contra la región del gen MET y del gen SOX2. A continuación, los portaobjetos se colocaron libres de burbujas de aire y los cantos se sellaronn con Fixogum (Marabu). Después de la desnaturalización de los preparados durante diez minutos a 75 °C sobre una placa calefactora, la hibridación se llevó a cabo en un horno calentador en una cámara húmeda precalentada a 37 °C durante la noche (aproximadamente 16 horas).

Después de la hibridación, se retiró el Fixogum y los preparados se incubaron durante tres minutos a 37 °C en regulador de pH de lavado (1 x Wash Buffer A, ZytoVision GmbH) en una cubeta de vidrio. Después de retirar los cubreobjetos se efectuó un lavado riguroso respectivamente dos veces durante cinco minutos a 37 °C en regulador de pH de lavado (125 x Wash Buffer A, ZytoVision GmbH). A continuación, los preparados se deshidrataron en una serie de etanol creciente (respectivamente un minuto a TA en 70%, 90%, 96%) y se secaron, en cuyo caso los preparados fueron protegidos de la luz directa. Tras la aplicación de la contra-tinción (20 pl de solución DAPI DuraTect (ZytoVision GmbH)) se colocaron los cubreobjetos exentos de burbujas de aire y los preparados se incubaron protegidos frente a la luz durante al menos 30 minutos a TA.

A continuación, tuvo lugar la evaluación en el microscopio de fluorescencia (Axio Scope.A1 con unidad de iluminación HXP 120V, Carl Zeiss Microscopy GmbH) utilizando conjuntos de filtro adecuados (conjunto de filtro Sp. Green HC mFISH; conjunto de filtro Sp. Red HC mFISH; conjunto de filtro Sp. Aqua HC mFlSH; conjunto de filtro ZyGold HC mFISH (todos de AHF Analysentechnik AG)).

En las preparaciones sin amplificación de ERBB2, se encontraron diez señales verdes en cada uno de los núcleos celulares cuando se utilizó el filtro verde (o más señales verdes en el caso de una amplificación de ERBB2, véase fig.

11A). Usando el filtro ZyGold, se observaron dos señales de color amarillo dorado por núcleo celular, cuya posición espacial era idéntica a la de dos señales verdes (como en la Fig. 11 C). Usando el filtro rojo, se observaron cuatro señales rojas por núcleo celular, cuya posición espacial era idéntica a la de cuatro señales verdes (como se muestra en la Fig. 11 D). Usando el filtro aqua, se observaron respectivamente cuatro señales aqua por núcleo celular, cuya posición espacial era idéntica a la de cuatro señales verdes y, en el caso de dos señales, también idéntica a dos señales rojas (como en la Fig. 11 D). El modelo de señal se podría interpretar de la siguiente manera: dos señales verdes sin localización espacialmente idéntica de señales de un color diferente identificaron las dos copias del gen ERBB2 de una célula diploide. Dos señales verdes con localización espacialmente idéntica de dos señales aqua identificaron las dos copias del gen EGFR, dos señales verdes con localización espacialmente idéntica de dos señales de color amarillo dorado identificaron las dos copias del gen FGFR1, dos señales verdes con localización espacialmente idéntica de dos señales rojas identificaron las dos copias del gen MET y dos señales verdes con localización espacialmente idéntica de dos señales rojas y dos aqua identificaron las dos copias del gen SOX2.

En los núcleos celulares de las preparaciones con amplificación de ERBB2 se mostró un modelo de señal comparable al ejemplo descrito anteriormente, con la excepción de que además de nueve señales verdes, se observó un racimo de señales verdes o modelo de señales que consta de unas quince señales inseparablemente espaciadas de manera estrecha (véase figura 11A). Este modelo de señales verdes no se co-localizó con señales de un color diferente y, por lo tanto, identificó una amplificación del gen ERBB2.

Ejemplo 2: Análisis FISH para la detección de translocaciones de las regiones ALK, o bien ROS1, en diferentes tipos de células utilizando la sonda FISH cuádruple "Zytolight ALK & ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH_

La realización del FISH tuvo lugar en cortes de 3 a 5 |jm de grosor de células incrustadas en parafina fijada con formalina (FFPE) de las líneas celulares HeLa (ATCC® Cc L-2™), HCC78 (proporcionada por el Profesor Schildhaus, Gotinga) y H3122 (proporcionada por el Prof. Schildhaus, Gotinga) que se cultivaron en portaobjetos de vidrio revestidos y se mantuvieron en el horno a 58°C durante una noche.

Para la eliminación de la parafina, los preparados se calentaron primeramente durante 10 min a 70 °C en una placa calefactora y, a continuación, se incubaron dos veces respectivamente durante 10 min a temperatura ambiente (TA) en 100% de xileno. Después, los preparados se re-hidrataron mediante una serie en etanol decreciente (respectivamente cinco min a TA en etanol desnaturalizado al 96%, 96%, 90%, 70%) e incubación en agua purísima (dos veces respectivamente durante dos minutos a TA). A la permeabilización de las células siguió un tratamiento previo con calor durante 15 minutos a 98 °C en solución cítrica de pre-tratamiento térmico (ZytoVision GmbH), seguido de dos etapas de incubación adicionales durante dos minutos en agua purísima a TA. El tratamiento previo proteolítico tuvo lugar mediante goteo de una solución de pepsina (solución de pepsina, ZytoVision GmbH) sobre los preparados, y subsiguiente incubación en una cámara húmeda a 37 °C durante 15 minutos. Tras la subsiguiente incubación durante cinco minutos en regulador de pH de lavado SSC (regulador de pH de lavado SSC, ZytoVision GmbH), los preparados se deshidrataron (respectivamente un minuto a TA en agua purísima, etanol al 70%, 90%, 96%). Después de que las muestras se hubieran secado al aire, se aplicaron respectivamente 10 j l de la sonda FISH ZytoLight SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe (ZytoVision GmbH) directamente a los cortes mediante una pipeta.

En el caso de la sonda se trató de una mezcla a base de cuatro sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso la mezcla se componía de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que en 2p23 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1, polinucleótidos marcados en naranja (absorción a 547 nm y emisión a 572 nm) que en 2p23 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1, así como polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que en la región 6q22 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1. A continuación, los portaobjetos se colocaron libres de burbujas de aire y los cantos se sellaron con Fixogum (Marabu). Después de la desnaturalización de los preparados a lo largo de un tiempo de diez minutos a 75 °C sobre una placa calefactora, la hibridación se llevó a cabo en un horno calentador en una cámara húmeda precalentada a 37 °C durante una noche (aproximadamente 16 horas).

Después de la hibridación, se retiró el Fixogum y los preparados se incubaron durante tres minutos a 37 °C en regulador de pH de lavado (1 x Wash Buffer A, ZytoVision GmbH) en una cubeta de vidrio. Después de separar los cubreobjetos tuvo lugar un lavado riguroso respectivamente dos veces durante cinco minutos a 37 °C en regulador de pH de lavado (1 x Wash Buffer A, ZytoVision GmbH). A continuación, los preparados se deshidrataron y secaron al aire en una serie en etanol creciente (respectivamente un minuto a TA en etanol al 70%, 90%,96%), en cuyo caso las muestras se protegieron de la incidencia de luz directa. Después de aplicar la contratinción (20 j l de DAPI DuraTect Solution, ZytoVision GmbH), se colocaron cubreobjetos libres de burbujas de aire y las preparaciones se incubaron durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz.

A continuación, tuvo lugar la evaluación en el microscopio de fluorescencia (Axio Scope.A1 con unidad de iluminación HXP 120V, Carl Zeiss Microscopy GmbH) utilizando conjuntos de filtro adecuados (conjunto de filtro verde / naranjarojo de banda dual, AHF Analysentechnik; conjunto de filtro Sp. Aqua HC mFISH, AHF Analysentechnik).

En este caso, al utilizar el doble filtro naranja/verde, en los núcleos celulares de la línea celular HeLa, en la mayoría de los núcleos analizados se manifestaron respectivamente seis señales de fusión naranja/verdes; no se observaron señales verdes y/o naranjas individuales. Utilizando el filtro aqua se observaron por cada núcleo celular respectivamente tres señales aqua, cuya posición en el espacio es idéntica a la de tres señales de fusión. El modelo de señales se interpretó, en coincidencia con la bibliografía, como tres copias del gen ALK y tres copias del gen ROS1. No se presentan translocaciones ALK o ROS1.

En los núcleos celulares de la línea celular H3122, para los cuales se describe en la bibliografía una translocación del gen ALK, al utilizar el filtro doble naranja/verde se muestran en la mayoría de los núcleos analizados respectivamente se manifestaron siete señales de fusión naranja/verdes y una señal naranja individual. Utilizando el filtro aqua, por cada núcleo celular se observaron respectivamente dos señales aqua, cuya posición en el espacio era idéntica a la de dos de las señales de fusión. El modelo de señales fue interpretado, en coincidencia con la bibliografía, como seis copias del gen ALK, una de las cuales estaba afectada por una translocación, y dos copias del gen ROS1.

En los núcleos celulares de la línea celular HCC78, para los cuales en la bibliografía se describe una translocación del gen ROS1, al utilizar el filtro doble naranja/verde, en la mayoría de los núcleos analizados se manifestaron respectivamente cuatro señales de fusión naranja/verdes, dos señales naranja individuales y dos señales verdes individuales, es decir, separadas de las anteriores. Utilizando el filtro aqua, por cada núcleo celular se observaron respectivamente cuatro señales aqua, cuya posición en el espacio es idéntica a la de dos de las señales de fusión y las dos señales verdes separadas. El modelo de señales fue interpretado, en coincidencia con la bibliografía, como cuatro copias del gen ROS1, en cuyo caso dos de las mismas estaban afectadas por una translocación, y dos copias del gen ALK.

Ejemplo 3: Análisis FISH para la detección de una translocación de la región ROS1 en 6q22 utilizando la sonda FISH cuádruple ZytoLight SPe C ALK & ROS1Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe" de la compañía Zytovision GmbH

Se llevó a cabo un análisis FISH para la detección de una translocación de la región ROS1 en 6q22 utilizando la sonda FISH cuádruple "ZytoLight SPe C ALK & ROS1 Break Apart Single-Mix NG-FISH Probe" de la compañía Zytovision GmbH. En el caso de la sonda se trató de una mezcla a base de cuatro sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso la mezcla se componía de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm) que en 2p23 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1, polinucleótidos marcados en naranja (absorción a 547 nm y emisión a 572 nm) que en 2p23 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1, así como polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que en la región 6q22 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1.

Al utilizar conjuntos de filtro adecuados aparecieron señales de hibridación para genes ROS1 y/o ALK no reorganizados en forma de señales de fusión de fluorescencia verde-naranjas y para un gen ROS1 y/o ALK reorganizado como una señal verde separada y una señal naranja separada. Señales verdes específicas para ROS1 se co-Iocalizaron en este caso con señales de fluorescencia azules, de modo que el gen ROS1 no reorganizado se compuso de señales mixtas de fluorescencia naranjas y verde/azules. Las señales de hibridación para el gen ALK no reorganizado aparecieron como señales de fusión de fluorescencia verde-naranja sin señales mixtas con señales de fluorescencia azul (Fig. 9A). El locus 6q22 afectado por una translocación de ROS1 se caracterizó mediante una señal verde y una naranja separada (Fig. 9A flechas). En tal caso, la señal verde separada se solapó con una señal azul (señales azules Fig. 9B). Esta señal mixta verde/azul indicaba ROS1, no ALK, como el gen afectado por la translocación. El modelo de señal pudo hacerse claramente visible con conjuntos de filtros adecuados.

Ejemplo 4: Análisis CISH para la detección de una translocación de la región ALK en 2p23 utilizando la sonda CISH cuádruple "ZytoDot SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-MIX NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH

Además, se llevó a cabo un análisis CISH para la detección de una translocación de la región ALK en 2p23 utilizando la sonda CISH cuádruple "ZytoDot SPEC ALK & ROS1 Break Apart Single-MIX NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision GmbH. En el caso de la sonda se trató de una mezcla a base de cuatro sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso la mezcla se compuso de polinucleótidos marcados con digoxigenina, que en 2p23 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de a Lk y en 6q22 contra secuencias situadas de modo proximal a la región del punto de ruptura de ROS1, polinucleótidos marcados con DNP que en 2p23 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ALK y en 6q22 contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1, así como polinucleótidos marcados con biotina que en la región 6q22 estaban dirigidos contra secuencias situadas de modo distal a la región del punto de ruptura de ROS1. La detección de los marcajes tuvo lugar a través de anticuerpos primarios (anti-DIG/anti-DNP/anti-BIO) (no marcados), que fueron detectados por anticuerpos conjugados con enzima polimerizados secundarios (polímero HRP/polímero AP/beta-GAL), así como la reacción enzimática de los sustratos (AP-RED/HRP-GREEN/beta-GALBLUE) que condujo a la formación de fuertes señales permanentes rojas, verdes y azules que pueden ser representadas con el microscopio óptico, por ejemplo, con una lente seca de 40x.

Núcleos celulares diploides, o bien disómicos sin re-organizaciones, o bien translocaciones, de los genes ALK, o bien ROS1, mostraron dos señales, respectivamente compuestos de una señal roja y una señal verde que se encontraron situadas de modo proximal una junto a otra de manera inseparable, o bien se solaparon en parte o se mezclaron y fueron específicas para las dos copias del gen ALK (Fig. 10). Además de esto, se manifestaron 2 señales que se componían respectivamente de una señal roja, una señal verde y una señal azul y se encontraron situadas estrechamente una junto a otra de manera inseparable, o bien se solaparon en parte, o bien se mezclaron y que fueron específicas para las dos copias del gen ROS1.

Núcleos celulares diploides, o bien disómicos con reorganizaciones, o bien translocaciones, de un gen ALK, pero no de los alelos ROS1, mostraron una señal roja-verde que fue específica para el alelo ALK no reorganizado (Fig. 10). Además de esto, mostraron una señal verde individual y una señal roja individual, separada de la anterior, que es específica para un alelo ALK reorganizado (Fig. 10, flecha "G"= verde y "R" = roja). Además de esto, se mostraron dos señales rojas-verdes-azules, que fueron específicas para las dos copias del gen ROS1.

Núcleos celulares diploides, o bien disómicos con reorganizaciones, o bien translocaciones, de un gen ROS1, pero no de los alelos ALK, mostraron una señal roja-verde-azul, que era específica para el alelo ROS1 no reorganizado. Además de esto, mostraron una señal verde individual y una señal roja-azul individual, separada de la anterior, que era específica para un alelo ROS1 reorganizado, así como dos señales rojas-verdes-azules, que eran específicas para las dos copias del gen ALK.

Ejemplo 5: Análisis FISH para la detección de la amplificación de la región ERBB2 utilizando la sonda FISH quíntuple "ZytoLight SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck™ NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision. Finalmente, se llevó a cabo un análisis FISH para la detección de la amplificación de la región ERBB2 utilizando la sonda FISH quíntuple "ZytoLight SPEC ERBB2, EGFR, FGFR1, MET & SOX2 FiveCheck™ NG-FISH Probe" de la compañía ZytoVision. En el caso de la sonda se trató de una mezcla a base de cinco sondas de hibridación específicas de locus, en cuyo caso la mezcla se compuso de polinucleótidos marcados en verde (absorción a 503 nm y emisión a 528 nm), que estaban dirigidos contra la región 17q11.2-q12 del gen ERBB2, la región 7p12 del gen EGFR, la región 8p11.23-p11.22 del gen FGFR1, la región 7q31 del gen MET y la región 3q26.3-q27 del gen SOX2, así como de polinucleótidos marcados en azul (absorción a 426 nm y emisión a 480 nm) que estaban dirigidos contra la región del gen EGFR y del gen SOX2, polinucleótidos marcados en amarillo oro (absorción a 532 nm y emisión a 553 nm), que estaban dirigidos contra la región del gen FGFR1 y polinucleótidos marcados en rojo (absorción a 580 nm y emisión a 599 nm) que estaban dirigidos contra la región del gen MET y del gen SOX2.

Al utilizar conjuntos adecuados de filtros de paso banda sencillos, se manifestaron nueve señales verdes individuales y un racimo de señales verdes que ocupaba la superficie de varias señales verdes individuales, cuatro señales azules, dos señales amarillo oro y cuatro señales rojas.

Mediante la superposición de las imágenes se manifestó que una señal verde individual, así como el racimo de señales verdes no se co-Iocalizaron con señales de otro color. En el caso de la señal verde individual se trató de un gen ERBB2 no amplificado, el racimo de señales verdes identificó una amplificación del gen ERBB2. Señales mixtas verdes/azules de co-Iocalización identificaron dos copias del gen EGFR, señales mixtas verdes/amarillo oro de co-localización identificaron dos copias del gen FGFR1, señales mixtas verdes/rojas de co-Iocalización identificaron dos copias del gen MET y señales mixtas verdes/azules/rojas de co-Iocalización identificaron dos copias del gen SOX2.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí mediante hibridación in situ mediante la detección de regiones de cromosomas y/o del ADN en una muestra biológica, caracterizado porque

la hibridación in situ se lleva a cabo como hibridación in situ en interfase,

porque la hibridación in situ se lleva a cabo con al menos tres sondas de hibridación específicas de locus diferentes entre sí, marcadas respectivamente con una primera etiqueta de detección, en cuyo caso para generar al menos una señal mixta mediante dos o más etiquetas de detección distintas entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus, al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección diferente de la primera etiqueta de detección, referida a las respectivas sondas de hibridación específicas de locus, de modo que se genera un modelo de señales, y

porque las aberraciones cromosómicas presentes se identifican por medio del modelo de señales y/o se asignan a una región de cromosomas y/o de ADN.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la hibridación in situ se lleva a cabo con al menos cuatro sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, cada una marcada con una primera etiqueta de detección.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, en el que las aberraciones cromosómicas son aberraciones cromosómicas mutuamente independientes y/o en el que las aberraciones cromosómicas no son recíprocas.

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcaje de otras sondas de hibridación específicas de locus se lleva a cabo con al menos una etiqueta de detección adicional, en cuyo caso las sondas de hibridación específicas de locus marcadas con otras etiquetas de detección, generan respectivamente señales mixtas diferentes entre sí en el modelo de señal, y/o el marcaje de otras sondas de hibridación específicas de locus se efectúa con la al menos una etiqueta de detección adicional, y mediante cada sonda de hibridación específica de ubicación marcada con al menos una etiqueta de detección adicional en el modelo de señal se genera una señal mixta específica para una región de cromosoma y/o región de ADN.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos otras dos sondas de hibridación específicas de locus se marcan con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dos sondas de hibridación específicas de locus flanquean respectivamente un segmento cromosómico, las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean un segmento cromosómico se marcan con etiquetas de detección diferentes entre sí de modo que se genera una señal de fusión en el modelo de señal por parte de las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento cromosómico.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se genera una señal de fusión en el modelo de señal por parte de las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento cromosómico en el modelo de señal para el caso de que no haya aberración cromosómica.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que se utilizan al menos seis sondas de hibridación diferentes específicas de locus, en cuyo caso dos sondas de hibridación específicas de locus flanquean respectivamente un segmento cromosómico.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 6 a 8, en el que

(a) una primera sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección A y una segunda sonda de hibridación específica de locus marcada con una etiqueta de detección B flanquean un segmento cromosómico y generan una señal de fusión A-B en el modelo de señal generado por medio de hibridación in situ, (b) 2 a 12 sondas de hibridación específicas de locus adicionales flanquean hasta seis segmentos cromosómicos adicionales, en cuyo caso una de las dos sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento cromosómico también se marca con una etiqueta de detección A y una de las dos sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento cromosómico se marca con una etiqueta de detección B, de modo que las sondas de hibridación específicas de locus que flanquean respectivamente un segmento cromosómico genere una señal de fusión A-B en el modelo de señal generado por medio de hibridación in situ y (c) al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección X, de modo que las sondas de hibridación específicas del locus marcadas con al menos una etiqueta de detección adicional generen señales de fusión y mixtas A-B/X en el modelo de señal generado por medio de hibridación in situ, en cuyo caso las señales de fusión y mixtas A-B/X cambian a señales mixtas A/X y/o B/X en el caso de aberraciones cromosómicas, o

en el modelo de señal generado mediante hibridación in situ, las señales de fusión A-B cambian a señales individuales A y/o B en el caso de aberraciones cromosómicas, de modo que las aberraciones cromosómicas por medio del modelo de señal generado mediante hibridación in situ se asignan a una región de cromosoma y/o ADN y/o a un segmento cromosómico flanqueado por dos sondas de hibridación específicas de locus.

10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las sondas de hibridación específicas de locus se forman respectivamente por una multiplicidad de fragmentos de ácido nucleico que cubren respectivamente la región de cromosoma y/o de ADN a detectar.

11. Composición para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí mediante hibridación in situ, en cuyo caso la composición comprende al menos tres sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, marcadas respectivamente con una primera etiqueta de detección, y al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la respectiva sonda de hibridación específica de locus, y en cuyo caso puede generarse una señal mixta por parte de las dos o más etiquetas de detección, diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus.

12. Composición para su uso en el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades relacionadas con aberraciones cromosómicas, y la composición comprende al menos tres sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, cada una marcada con una primera etiqueta de detección, y al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la respectiva sonda de hibridación específica de locus, y puede generarse una señal mixta por parte de las dos o más etiquetas de detección, diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus.

13. Uso de una composición según una de las reivindicaciones 11 a 12 para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí mediante hibridación in situ, en particular mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10.

14. Kit (kit de partes o conjunto) para la detección de al menos dos aberraciones cromosómicas diferentes entre sí mediante hibridación in situ, que comprende al menos tres sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, respectivamente marcada con una primera etiqueta de detección, en cuyo caso al menos una de las sondas de hibridación específicas de locus está marcada con al menos otra etiqueta de detección, diferente de la primera, referida a la sonda de hibridación respectiva, y en cuyo caso se puede generar una señal mixta por parte de las dos o más etiquetas de detección, diferentes entre sí, ubicadas en una sonda de hibridación específica de locus.

15. Kit según la reivindicación 14, en el que las al menos tres sondas de hibridación específicas de locus, diferentes entre sí, están presentes en una composición común.