ES2836599T3 - Método para fragmentar un ácido nucleico para secuenciación - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar un ácido nucleico para secuenciación, que comprende: a) amplificar una plantilla de ácido nucleico Utilizando una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP, produciendo de esta forma moléculas de ácido nucleico producto que contiene metilcitosinas; b) digerir las moléculas de ácido nucleico producto con una endonucleasa de restricción de la familia MspJI, escindiendo de esta forma las moléculas de ácido nucleico producto en sitios que son adyacentes a al menos parte de la metilcitosina y produciendo fragmentos de las moléculas de ácido nucleico producto que contienen salientes 5' de cuatro bases; y c) ligar directamente adaptadores de doble hebra que tienen un saliente 5' de cuatro bases sobre los salientes de los fragmentos para producir productos ligados al adaptador
Description
DESCRIPCIÓN
Método para fragmentar un ácido nucleico para secuenciación
REFERENCIA CRUZADA
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente del Reino Unido número de serie 1421003.3.
ANTECEDENTES
Un flujo de trabajo de secuenciación típico procede a través de las siguientes fases: a) fragmentar el ADN objetivo para crear fragmentos; b) ligar adaptadores a los fragmentos; c) amplificar los fragmentos ligados al adaptador, y d) secuenciar los productos de amplificación. En algunos métodos, las fases de fragmentación y ligación están mediadas por una transposasa (véase, por ejemplo, Caruccio, Methods Mol Biol. 2011; 733:241-55). En otros métodos, la fragmentación se realiza mecánicamente (por ejemplo, mediante sonicación o cizallamiento) o usando una enzima fragmentasa de ADN de doble hebra "dsDNA". En estos métodos (por ejemplo, los métodos mecánicos o de fragmentasa), una vez que se ha fragmentado el ADN, los extremos se pulen y se ligan al adaptador.
Los métodos que se basan en la fragmentación mecánica y las enzimas que generan roturas del dsDNA (por ejemplo, NEBNext dsDNA Fragmentase, New England Biolabs) requieren fases adicionales para preparar los fragmentos para la ligación. Por ejemplo, en ambos casos, los extremos de los fragmentos deben pulirse utilizando una polimerasa y, en algunos casos, los fragmentos pulidos deben tratarse con una quinasa para garantizar que todos los extremos 5' estén fosforilados. Además, en muchos protocolos, los fragmentos tienen cola dA antes de la ligación. Estos pasos adicionales agregan una complejidad técnica significativa al protocolo.
Los métodos de fragmentación actuales que dependen de una enzima (por ejemplo, Transposasa o fragmentasa de dsDNA) también son limitados porque son muy sensibles a la proporción de enzima a DNA en la reacción. Si se incluye demasiado ADN, la plantilla está poco fragmentada. Si se incluye muy poco ADN, la plantilla está demasiado fragmentada. Esto significa que la cantidad de la plantilla de ADN debe cuantificarse cuidadosamente antes de la fragmentación y el tiempo de reacción y la cantidad de enzima deben controlarse cuidadosamente para obtener un nivel deseado de fragmentación. Finalmente, las reacciones basadas en enzimas son impulsadas por un exceso de enzima y deben detenerse rápidamente para evitar una fragmentación excesiva. Esto a menudo implica la adición de un tampón de parada, que puede afectar negativamente las fases de procesamiento posteriores o requerir pasos de limpieza adicionales. Además, cuando se procesan varias muestras, puede resultar difícil garantizar que el tiempo de reacción de fragmentación sea uniforme en todas las muestras.
Además, los métodos mediados por transposasa también tienen una cierta tendencia a ciertos sitios de inserción (ver, por ejemplo, Green et al Mobile DNA 2012, 3: 3) y, como tal, la fragmentación no es verdaderamente aleatoria. Los métodos mediados por transposasa también se basan en secuencias conservadas de 'brazo' que contienen elementos de secuencia que son necesarios para la formación del complejo transposón-brazo y la reacción de fragmentación / ligación. Esto dificulta la personalización de las secuencias del adaptador. Si bien en teoría es posible agregar códigos de barras moleculares y las 5' similares de las secuencias de brazo (fuera de los sitios de unión de la transposasa), esta modificación agrega carga de secuencia a las lecturas de secuencia resultante, acortando de manera efectiva la longitud de las lecturas de secuencia.
Peters et al. (Nature. 2012 487: 190-5) desarrollaron un protocolo llamado Fragmentación enzimática aleatoria controlada (CoRE) para fragmentar el ADN de forma aleatoria. Este protocolo implica incorporar dUTP en un producto utilizando una ADN polimerasa y a continuación tratando el producto (que contiene uracilo) con uracilo ADN glicosilasa (UDG) y una endonucleasa (endonucleasa IV) para fragmentar el producto. La proporción de dUTP / dTTP controla la longitud promedio del fragmento después del tratamiento con endonucleasa. Sin embargo, el protocolo de Peters requiere múltiples pasos enzimáticos, incluido el tratamiento con: (1) fosfatasa alcalina de camarón (SAP), (2) Ud G, (3) EndoIV, (4) ADN polimerasa I de E. coli, (5) SAP y (6) ligasa. Además, la capacidad de una polimerasa para incorporar dUTP varía mucho de una polimerasa a otra polimerasa y, de hecho, hay muchas polimerasas, incluidas las ADN polimerasas de corrección de pruebas, que no pueden incorporar dUTP. Por tanto, el método de Peter tiene una utilidad limitada.
Wei-Hua Chen et al., Nucleic Acids Research, 2013, vol. 41, n° 8 e93 describe un método para secuenciar fragmentos largos que comprende un método / fases para preparar el ácido nucleico objetivo (TNA) en el que se incorporan 5mCTP en el t Na mediante amplificación usando un cebador universal que comprende 5mCTP. Los amplicones se digieren y los fragmentos separados generados se ligan con adaptadores. Sin embargo, Wei-Hua Chen et al. no describe la incorporación de 5mC en toda la secuencia.
Drmanac (documento US2011033854) describe un método de múltiples etapas para convertir un fragmento "largo" en una población de fragmentos más pequeños, de extremos romos, que pueden ligarse a adaptadores, amplificarse y secuenciarse. El método Drmanac implica reemplazar nucleótidos con análogos de nucleótidos,
crear nucleótidos "separados" (es decir, ácidos nucleicos que contienen mellas o separaciones), y trasladar (es decir, copiar) las separaciones utilizando la otra hebra como plantilla, para producir fragmentos de extremos romos.
En algunos casos, Drmanac realiza su método incorporando dUTP y dmCTP en el fragmento "largo" utilizando una polimerasa, desglicosilando las uridinas (utilizando UDG), eliminando los nucleótidos desglicosilados (utilizando una endonucleasa), haciendo rupturas bicatenarias cerca de los mCTP (utilizando McrBC), y a continuación trasladando el producto digerido utilizando una polimerasa de desplazamiento de hebra en fragmentos de extremos romos (ver Fig.2 y párr. 82). A continuación, se ligan los adaptadores y los fragmentos se pueden amplificar y secuenciar. Las variaciones del método de Drmanac incluyen tratamientos con una quinasa y / o fosfatasa alcalina, así como pulido y colas A.
Además de ser difícil de implementar dado que es un proceso técnicamente complejo y de varias fases, el método de Drmanac también adolece de una serie de problemas graves, en particular para muchas aplicaciones de secuenciación.
Por ejemplo, el método Drmanac es complicado por el hecho de que, si bien el paso de traducción del nick puede, en teoría, realizarse utilizando una polimerasa de corrección de pruebas (es decir, el tipo que sería más adecuado para aplicaciones de secuenciación ya que tienen una mayor fidelidad, por ejemplo, Pfu), la utilización de dicha polimerasa conduciría a la degradación de los salientes 3' no protegidos. Esto dará lugar a problemas con la ligación y, además, llevará a productos que pueden autoligarse (por ejemplo, circularizar). Drmanac señala que, alternativamente, se podría utilizar una polimerasa sin corrección de pruebas (por ejemplo, Taq). Sin embargo, tal como resultaría evidente, la utilización de una polimerasa sin corrección de pruebas puede llevar a un producto que contenga muchos errores. Además, con respecto al uso de polimerasas sin corrección de pruebas en su método, el propio Drmanac afirma que el proceso puede ser difícil de controlar y, a menudo, generará una población mixta de extremos 3', lo que dará como resultado un rendimiento bajo de la ligación de adaptador a inserto. Drmanac propone resolver algunos de estos problemas utilizando adaptadores especiales, ddNTP, factor de cola A y / o un tratamiento de fosfatasa alcalina, agregando de manera efectiva aún más fases a un método ya complicado.
Además, muchas, si no la mayoría de las polimerasas (incluidas las polimerasas termoestables con la máxima fidelidad) no incorporan dUTP de manera eficiente o no reconocen las plantillas que contienen dUTP, lo que significa que la fase inicial del método de Drmanac (es decir, producir un fragmento "largo" que contiene uridina y metilcitosina), solo se puede implementar utilizando un número limitado de polimerasas, muchas de las cuales tienen una alta tasa de error.
Por último, McrBC es una enzima de restricción bastante inusual ya que corta en una posición variable no especificada entre dos citosinas metiladas, y el tipo de extremos que produce son desconocidos y pueden variar de un sitio a otro. Como tales, para implementar el método de Drmanac, esos sitios tendrían que pulirse rellenando los salientes 5' y masticando los salientes 3', lo que complica aún más el método de Drmanac y, además, daría lugar a "huecos" en la secuencia. Además, McrBC se escinde de manera óptima cuando la separación entre las metilcitosinas citosinas adyacentes es relativamente próxima (es decir, de 55 bp a 103 bp). Esto hace que McrBC sea menos eficiente para producir fragmentos para la mayoría de las aplicaciones de secuenciación (que generalmente requieren fragmentos más largos).
El método descrito en el presente documento carece de al menos algunas de las deficiencias enumeradas anteriormente y, dependiendo de cómo se implemente el método, puede tener otras ventajas tal como se describe a continuación.
RESUMEN
En el presente documento, entre otras cosas, se proporciona un método para preparar un ácido nucleico para secuenciación. En algunas formas de realización, el método comprende: a) amplificar una plantilla de ácido nucleico utilizando una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP, generando de esta manera moléculas de ácido nucleico del producto que contienen metilcitosinas; b) digerir las moléculas de ácido nucleico del producto con una endonucleasa de restricción dependiente de metilación, por ejemplo, una endonucleasa de restricción de la familia MspJI, escindiendo de esta forma las moléculas de ácido nucleico del producto en sitios que son adyacentes a al menos algunas de las metilcitosinas y produciendo fragmentos de moléculas de ácido nucleico del producto; y c) ligar directamente adaptadores de doble hebra sobre los salientes de los fragmentos para producir productos ligados al adaptador. En algunas formas de realización, el método puede comprender adicionalmente: d) amplificar los fragmentos utilizando cebadores que hibridan con los adaptadores para producir productos de amplificación. También se proporcionan kits.
Dependiendo de cómo se implemente el método, el método puede tener ciertas ventajas sobre los métodos convencionales. Por ejemplo:
- la longitud de los fragmentos producidos por el método depende únicamente de la proporción de 5-metil dCTP por dCTP en la mezcla de dNTP, no de la concentración de ADN en la muestra o de la cantidad de enzima utilizada (que es el caso para otros métodos);
- el método no está limitado por las polimerasas que pueden utilizarse y, como tal, el método puede llevarse a cabo utilizando virtualmente cualquier polimerasa, incluidas las polimerasas termoestables de alta fidelidad;
- el método no es un procedimiento complicado de varias fases que utiliza varias enzimas incompatibles;
de hecho, después de la fase de amplificación inicial, toda la reacción, incluida la ligación del adaptador, se puede implementar en un solo tubo sin la adición de nuevos reactivos;
- el método es eficaz porque la digestión por endonucleasas de restricción de la familia MspJI produce inherentemente salientes de 4 bases, que son sustratos de ligación muy eficaces en relación con los extremos romos;
- el método sólo rara vez produce fragmentos en los que los extremos opuestos son complementarios, lo que significa que esos fragmentos simplemente no se circularizarán durante la ligación del adaptador; y - el método se puede adaptar fácilmente para producir fragmentos que tienen unas longitudes más adecuadas para aplicaciones de secuenciación.
Estas y otras ventajas pueden resultar evidentes a la vista de la siguiente descripción.
En primer lugar, la longitud de los fragmentos se determina mediante la relación de 5-metil dCTP por dCTP en la primera fase de amplificación. Suponiendo que la digestión se completa, la longitud de los fragmentos no es sensible a la cantidad de ADN en la reacción, al tiempo de reacción o a la cantidad de enzima utilizada. Como tal, una vez que se ha determinado una proporción adecuada de 5-metil dCTP por dCTP para una muestra, se puede utilizar la misma proporción para otras muestras, incluso para otras muestras que tienen una concentración diferente de ADN o ADN de una concentración de ADN desconocida. Si se requieren fragmentos más largos o más cortos (o, alternativamente, si la muestra es muy rica en A / T o rica en G / C), entonces la proporción de 5-metil dCTP por dCTP puede simplemente ajustarse o pueden utilizarse diferentes enzimas de restricción, o combinaciones de diferentes enzimas de restricción. Las consideraciones de longitud y contenido de A / T o G / C pueden encontrarse al analizar genomas o regiones genómicas particulares o cuando se utilizan diferentes plataformas de secuenciación.
Además, debido a que las polimerasas de corrección de pruebas pueden incorporar 5-metil dCTP, el primer paso de amplificación puede realizarse utilizando una enzima de alta fidelidad. La utilización de una enzima de alta fidelidad para la amplificación de una plantilla al comienzo del protocolo puede ser de vital importancia en algunas aplicaciones de secuenciación ya que, sin una amplificación de alta fidelidad, a menudo es imposible determinar si una posible variación de secuencia corresponde a una mutación de baja frecuencia en la muestra (es decir, una "variante minoritaria") o a un denominado "error de PCR" (es decir, un error causado por la incorporación incorrecta de un nucleótido durante la polimerización). La capacidad para fragmentar de forma controlada un producto de ADN que se ha generado mediante amplificación de alta fidelidad resulta muy deseable.
Además, a un nivel práctico, la reacción de la endonucleasa de restricción se puede finalizar mediante inactivación por calor y debido a que no se requieren fases de tratamiento enzimático adicionales entre la fragmentación y la ligación, la reacción de ligación puede realizarse en el mismo tampón que la digestión. Además, no se requiere ningún equipo especializado ni costoso para llevar a cabo el método, y los adaptadores se pueden personalizar según sea necesario, por ejemplo, para que las lecturas de secuenciación vayan directamente a una secuencia de código de barras molecular, reduciendo así el costo de secuenciación y aumentando de manera efectiva la longitud de las lecturas de secuenciación.
Además, tal como se ha indicado anteriormente, el número de puntos de ruptura de fragmentación se puede controlar variando la proporción de 5-metil dCTP y dCTP en la reacción de amplificación. Por lo tanto, el número de puntos de ruptura (que, a su vez, determina el tamaño medio del fragmento) se puede ajustar para que sea óptimo para un genoma, una región genómica, una plataforma de secuenciación y / o un número de puntos de ruptura de fragmentación determinados diferentes necesarios para la corrección de errores, según se desee. Por ejemplo, algunos protocolos de análisis de secuencias implican agrupar las lecturas de secuencias en función de sus puntos de interrupción de fragmentación. Tal como se ha señalado anteriormente, el método se puede ajustar para proporcionar un número óptimo de "extremos" por kilobase de objetivo. La disponibilidad de más extremos permite que las lecturas de secuencia se agrupen en más grupos y eso, a su vez, hace que la secuenciación sea más precisa.
Otras implementaciones, formas de realización y ventajas pueden resultar evidentes a partir de la descripción que sigue a continuación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El experto en la materia comprenderá que los dibujos, descritos a continuación, tienen únicamente fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
La Fig. 1 ilustra esquemáticamente algunos de los principios generales del presente método. Tal como se entenderá, a excepción de las moléculas de plantilla utilizadas al comienzo del método, las moléculas de ácido nucleico ilustradas en esta figura son moléculas de doble hebra.
La Fig. 2 ilustra esquemáticamente algunos de los productos de reacción potenciales que se producen cuando la digestión y la ligación se realizan en la misma reacción.
La Fig. 3 es un gel que muestra amplicones de PCR generados a partir de reacciones que incluyen cantidades variables de 5-metil dCTP. Los números debajo de cada columna corresponden al porcentaje de 5-metil dCTP usado, por lo que '2' significa 2% de 5-metil dCTP con 98% de dCTP. 'NTC' es el control sin molde de PCR. La escalera de tamaño es una escalera de 2 troncos de NEB.
La Fig. 4 es un gel que muestra los productos generados fragmentando los amplicones de PCR de la Fig. 2a con una gama de enzimas de restricción, tanto individualmente como en combinación.
La Fig. 5 es un gel que muestra los productos de PCR indexados generados tras la ligación del adaptador y la amplificación de los fragmentos del gel de la Fig. 4.
DEFINICIONES
Antes de que se describa con más detalle la presente invención objeto, debe entenderse que esta invención no se limita a las formas de realización particulares descritas en el presente documento, sino que está definida por las reivindicaciones adjuntas. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente formas de realización particulares y no pretende ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente descripción, a continuación, se describen los métodos y materiales preferidos.
Debe observarse que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un / una ", y "el / la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de dichos anticuerpos y la referencia a "una región de estructura" incluye referencia a una o más regiones de estructura y equivalentes de las mismas conocidas por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
Las publicaciones descritas en este documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de la invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.
"Locus genético", "locus" o "locus de interés" en referencia a un genoma o polinucleótido objetivo, significa una subregión o segmento contiguo del genoma o polinucleótido objetivo. Tal como se utiliza en este documento, locus genético, locus o locus de interés puede referirse a la posición de un nucleótido, un gen o una parte de un gen en un genoma, incluido el ADN mitocondrial u otro ADN no cromosómico (por ejemplo, plásmido bacteriano), o puede referirse a cualquier parte contigua de la secuencia genómica, esté o no dentro de un gen o asociado con él. Un locus genético, un locus o un locus de interés puede ser desde un solo nucleótido hasta un segmento de unos cuantos cientos o miles de nucleótidos de longitud o más. En general, un locus de interés tendrá una secuencia de referencia asociada (véase la descripción de la "secuencia de referencia" a continuación).
Los términos "pluralidad", "población" y "colección" se utilizan indistintamente para referirse a algo que contiene al menos 2 miembros. En ciertos casos, una pluralidad, población o colección puede tener al menos 10, al menos 100, al menos 1.000, al menos 10.000, al menos 100.000, al menos 106, al menos 107, al menos 108 o al menos 10 9 o más miembros.
El término "adaptador" se refiere a una secuencia que se añade (por ejemplo, mediante ligación) a un ácido nucleico. Un adaptador puede tener una longitud de 5 a 100 bases y puede proporcionar, por ejemplo, un sitio de unión del cebador de amplificación, un sitio de unión del cebador de secuenciación y / o un código de barras molecular como por ejemplo una secuencia de identificación de muestra o una secuencia de identificación de molécula. Puede añadirse un adaptador al extremo 5', al extremo 3' o a ambos extremos de la molécula de ácido
nucleico. Los adaptadores de doble hebra contienen un extremo de doble hebra que está ligado a un ácido nucleico. Un adaptador puede tener un saliente o puede ser romo. Tal como se describirá con mayor detalle a continuación, se puede añadir un adaptador de doble hebra a un fragmento ligando sólo una hebra del adaptador al fragmento. La secuencia de la hebra no ligada del adaptador puede añadirse al fragmento utilizando una polimerasa. Los adaptadores en Y y los adaptadores de bucle son tipos de adaptadores de doble hebra.
El término "secuencia de identificación de muestra", "índice de muestra", "identificador multiplex" o "MID" es una secuencia de nucleótidos que se adjunta a un polinucleótido objetivo, donde la secuencia identifica la fuente del polinucleótido objetivo (es decir, la muestra de cuya muestra se deriva el polinucleótido objetivo). En uso, cada muestra se etiqueta con una secuencia de identificación de muestra diferente (por ejemplo, se agrega una secuencia a cada muestra, en que las diferentes muestras se agregan a diferentes secuencias) y las muestras etiquetadas se combinan. Después de secuenciar la muestra combinada, la secuencia del identificador de muestra se puede utilizar para identificar la fuente de las secuencias. Puede añadirse una secuencia de identificación de muestra al extremo 5' de un polinucleótido o al extremo 3' de un polinucleótido. En ciertos casos, parte de la secuencia del identificador de la muestra puede estar en el extremo 5' de un polinucleótido y el resto de la secuencia del identificador de la muestra puede estar en el extremo 3' del polinucleótido. Cuando un polinucleótido tiene una secuencia de identificador de muestra en ambos extremos, conjuntamente, las secuencias de identificación de muestra 3 'y 5' identifican la muestra. En muchos ejemplos, la secuencia de identificación de la muestra es solo un subconjunto de las bases que se adjuntan a un oligonucleótido objetivo.
El término "secuencia de identificación de la molécula" (que también puede denominarse "contrasecuencia" o "VeriTag" en algunos casos) es una secuencia de nucleótidos que se puede adjuntar a los fragmentos de ácido nucleico de una muestra de manera que la secuencia de nucleótidos, sola o en combinación con otras características de los fragmentos, por ejemplo, sus puntos de ruptura de fragmentación, puede utilizarse para distinguir entre las diferentes moléculas de fragmentos en la muestra o una parte de la misma. La complejidad de una población de secuencias de identificador de moléculas utilizadas en cualquier implementación puede variar dependiendo de una variedad de parámetros, por ejemplo, el número de fragmentos en una muestra y / o la cantidad de muestra que se utiliza en una fase posterior. Por ejemplo, en ciertos casos, la secuencia del identificador de la molécula puede ser de baja complejidad (por ejemplo, puede estar compuesta por una mezcla de 8 a 1024 secuencias). En otros casos, la secuencia del identificador de la molécula puede ser de alta complejidad (por ejemplo, puede estar compuesta de 1025 a 1 M o más secuencias). En ciertas formas de realización, una población de secuencias de identificador de moléculas puede comprender una región de base degenerada (DBR) que comprende uno o más (por ejemplo, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o 5 a 30 o más) nucleótidos seleccionados entre R, Y, S, W, K, M, B, D, H, V, N (tal como se define en el código IUPAC), o una variante del mismo. En algunas formas de realización, se puede preparar una población de secuencias de identificador de moléculas mezclando oligonucleótidos de una secuencia definida. En estas formas de realización, la secuencia de identificador de molécula en cada uno de los oligonucleótidos puede corregirse por error. En los métodos descritos en el presente documento, la secuencia de identificador de molécula puede utilizarse para distinguir entre los diferentes fragmentos en una parte de una muestra inicial, en que la parte se ha eliminado de la muestra inicial. Las secuencias de identificador de molécula se pueden utilizar junto con otras características de los fragmentos (por ejemplo, las secuencias del extremo de los fragmentos, que definen los puntos de ruptura) para distinguir entre los fragmentos. Las secuencias de identificador de molécula se describen en (Casbon Nuc. Acids Res. 2011, 22 e81) y se ha demostrado que aumentan la sensibilidad de la detección de variantes minoritarias en el VIH (Jabara et al 2011), frotis de Papanicolaou (Kinde et al. 2013) y RNA-Seq (Shiroguchi et al. 2012).
El término "punto de ruptura de fragmentación" pretende hacer referencia al sitio en el que se escinde un ácido nucleico para producir un fragmento. Dos fragmentos que tienen los mismos puntos de ruptura de fragmentación tienen las mismas secuencias en sus extremos (excluyendo cualquier secuencia adaptadora que se haya agregado a los fragmentos).
El término "variante minoritaria" se define como una variante que está presente con una frecuencia inferior al 20%, con respecto a otras moléculas de la muestra. En algunos casos, una variante minoritaria puede ser un primer alelo de una secuencia objetivo polimórfica, en que, en una muestra, la proporción de moléculas que contienen el primer alelo de la secuencia objetivo polimórfica en comparación con las moléculas que contienen otros alelos de la secuencia objetivo polimórfica es 1:10 o menos, 1: 100 o menos, 1: 1.000 o menos, 1: 10.000 o menos, 1: 100.000 o menos o 1: 1M o menos. Las variantes minoritarias del VIH resistente a fármacos se describen en Gianella et al. (J Infect Dis. (2010) 202: 657-666).
El término "carga de secuencia" se utiliza para referirse a las bases en una lectura de secuencia que proviene de adaptadores o cebadores que no contienen información útil (por ejemplo, bases que no son parte del fragmento objetivo o un código de barras molecular como un identificador de molécula o identificador de muestra). Estas bases no son informativas y generalmente se recortan antes del análisis, lo que lleva a una lectura de secuencia más corta.
El término "cantidad definida" puede medirse en moles, peso o volumen si un volumen contiene una concentración conocida de ácido nucleico. La concentración de ácido nucleico en una muestra se puede determinar utilizando cualquier método adecuado.
El término "amplificación" pretende hacer referencia tanto a métodos de amplificación isotérmica como a métodos que requieren termociclado (por ejemplo, PCR). La amplificación requiere aumentar la concentración relativa de una o más secuencias en una muestra al menos 10 veces, en relación con los componentes no amplificados de la muestra.
El término "plantilla de ácido nucleico" pretende hacer referencia a la molécula de ácido nucleico inicial que se copia durante la amplificación.
El término "con cola", en el contexto de un cebador con cola, se refiere a un cebador que tiene una región (por ejemplo, una región de al menos 12-50 nucleótidos) en su extremo 5' que no hibrida con el mismo objetivo que el extremo 3' del cebador.
El término "mezcla de dNTP" pretende hacer referencia a una mezcla de desoxirribonucleótidos que corresponden a G, A, T y C que pueden incorporarse mediante una polimerasa en una hebra polinucleotídica en crecimiento. Una mezcla de dNTP puede contener dGTP, dATP, dTTP y dmCTP (5-metil dCTP y / o hidroximetil dCTP) así como otros desoxirribonucleótidos, por ejemplo, dCTP. En uso, los dNTP pueden tener cada uno una concentración de trabajo de 50 pM a 1 mM (por ejemplo, 100 pM a 500 pM, o 150 pM a 300 pM).
El término "tratar" se refiere a poner en contacto un producto (por ejemplo, ADN) con un reactivo (por ejemplo, una enzima), en condiciones adecuadas para que el reactivo provoque un cambio en (por ejemplo, fragmentación) del producto.
El término "endonucleasa de restricción dependiente de metilación" pretende hacer referencia a una enzima que se escinde en o adyacente a un sitio de reconocimiento que contiene una citosina metilada. Estas enzimas escinden el ADN si la citosina en el sitio está metilada y no escinden el ADN si la citosina no está metilada. Las endonucleasas de restricción dependientes de metilación incluyen, pero no se limitan a: endonucleasas de restricción de la familia MspJI (que se describen a continuación), endonucleasas de restricción TypelIM como por ejemplo enzimas Dpnl, Glal, Glul, Bisl, Blsl y Pcsl, y enzimas TypelV como por ejemplo McrBC. Véase, por ejemplo, el documento US8507239.
El término "endonucleasa de restricción de la familia MspJl" pretende referirse a una endonucleasa de restricción dependiente de metilación que se escinde en un sitio que está 10-20 bases (por ejemplo, N 12 / N 16) aguas abajo de la metilcitosina. Esta familia de enzimas se describe en Cohen-Karni (Proc. Natl. Acad. Sci. 2011 108: 11040 5), WO2010075375 y US8.507.239, que describen ejemplos de enzimas, métodos mediante los cuales las enzimas pueden identificarse y ensayarse, condiciones de reacción y actividades enzimáticas. Las endonucleasas de restricción de la familia MspJl ejemplares incluyen MspJl, SgrTl, FspEl, LpnPl, AsbpHl, Sgel, LpnPl y Rlal, aunque otras son también conocidas y pueden utilizarse en el presente método. La referencia a una enzima, por ejemplo, un miembro de la familia MspJl, ya sea de forma genérica o por su nombre, pretende hacer referencia a una endonucleasa de restricción en estado natural, así como a variantes de esas endonucleasas que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 95% a la endonucleasa de restricción en estado natural y que se escinde de una manera dependiente de metilación.
El término "adyacente a los nucleótidos de metilcitosina" pretende referirse a un sitio que está dentro de las 20 bases de una metilcitosina. Esta terminología se utiliza porque las endonucleasas de restricción de la familia MspJl se escinden aguas abajo de sus sitios de reconocimiento, y el sitio de reconocimiento contiene una metilcitosina.
El término "secuencia aleatoria" pretende hacer referencia a una secuencia compuesta por N, en que N puede ser cualquier nucleótido. Por ejemplo, un saliente de cuatro bases de secuencia aleatoria tiene la secuencia NNNN, en que las N pueden ser independientemente cualquier nucleótido. Los adaptadores de doble hebra que contienen un saliente de una secuencia aleatoria, colectivamente, tienen un saliente compuesto por N y los adaptadores individuales tienen salientes diferentes.
El término "secuencia variable" pretende hacer referencia a una colección de secuencias diferentes. Por ejemplo, un saliente de cuatro bases de secuencia variable tiene la secuencia que puede tener al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 500 o al menos 1.000 o más salientes diferentes.
El término "ligación directa" pretende referirse a una ligación en la que una molécula se liga a otra molécula sin tener que rellenar ni pulir ninguno de los extremos antes de la ligación. Por ejemplo, dos moléculas de doble hebra que tienen salientes complementarios de cuatro bases en 4' pueden ligarse directamente entre sí. Dos moléculas que se "rellenan" o "pulen" utilizando una ADN polimerasa y / o exonucleasa antes de la ligación no se ligan "directamente" entre sí.
El término "secuenciación", tal como se utiliza en este documento, se refiere a un método mediante el cual se obtiene la identidad de al menos 10 nucleótidos consecutivos (por ejemplo, la identidad de al menos 20, al menos 50, al menos 100 o al menos 200 o más nucleótidos consecutivos) de un polinucleótido.
El término "secuenciación de próxima generación" se refiere a las llamadas plataformas de secuenciación por síntesis o secuenciación por ligación en paralelo empleadas actualmente por Illumina, Life Technologies y Roche, etc. Los métodos de secuenciación de próxima generación también pueden incluir métodos de secuenciación de nanoporos o métodos basados en la detección electrónica como la tecnología Ion Torrent comercializada por Life Technologies o métodos de escisión de bases fluorescentes como por ejemplo los comercializados por Pacific Biosciences.
El término "genoma microbiano" se refiere a material genético (ADN o ARN) que es de origen microbiano (por ejemplo, de una bacteria, virus o patógeno eucariota como Plasmodium, Leishmania o Trypanosoma) que puede utilizarse como plantilla. Un microbio puede tener, por ejemplo, una relación huésped-patógeno con un mamífero. En otros casos, el genoma microbiano puede derivarse del microbioma asociado con el huésped. El término "genoma microbiano" pretende incluir genomas de ADN y genomas de ARN (que se pueden transcribir de forma inversa fácilmente a ADN y a continuación amplificar mediante RT-PCR).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE FORMAS DE REALIZACIÓN EJEMPLARES
En el presente documento, entre otras cosas, se proporciona un método para preparar un ácido nucleico para secuenciación. En algunas formas de realización, el método comprende: a) amplificar una plantilla de ácido nucleico utilizando una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP, generando de esta manera moléculas de ácido nucleico del producto que contienen metilcitosinas; b) digerir las moléculas de ácido nucleico del producto con una endonucleasa de restricción dependiente de metilación, por ejemplo, una endonucleasa de restricción de la familia MspJI, escindiendo de esta forma las moléculas de ácido nucleico del producto en sitios que son adyacentes a al menos algunas de las metilcitosinas y produciendo fragmentos de las moléculas de ácido nucleico producto; y c) ligar adaptadores de doble hebra en los extremos de los fragmentos para producir productos ligados a adaptadores. En algunas formas de realización, el método puede comprender adicionalmente: d) amplificar los fragmentos utilizando cebadores que hibridan con los adaptadores para producir productos de amplificación. También se proporcionan kits.
Algunas de las características generales del presente método se ilustran esquemáticamente en la Fig. 1. Haciendo referencia a la Fig. 1, ciertas formas de realización del método pueden comprender: amplificar una plantilla de ácido nucleico 2 utilizando una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP, produciendo así moléculas de ácido nucleico del producto 8 que contienen metilcitosinas (mC). Este paso de amplificación puede realizarse mediante amplificación isotérmica o mediante PCR, por ejemplo, utilizando los cebadores 4 y 6. En algunos casos, la mezcla de nucleótidos puede contener tanto 5-metil dCTP como dCTP, en cuyo caso las moléculas del producto 8 tendrán tanto citosinas como metilcitosinas, en que las metilcitosinas ocupan diferentes posiciones "C" en diferentes moléculas, tal como se muestra en la Fig. 1. Solo se muestran dos moléculas de producto en la Fig. 1. Tal como se reconocerá, las moléculas de ácido nucleico de producto 8 pueden estar compuestas por al menos 103, por ejemplo, al menos 104, al menos 105, al menos 106, al menos 107 o más moléculas en las que una parte de las posiciones C son metilcitosinas. Cada molécula de producto puede contener, como promedio, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 500, o al menos 1000 o más metilcitosinas (que pueden ocupar al menos 0,1%, al menos al menos 0,5%, al menos 1%, al menos 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 50% o al menos 70%, hasta el 100% del total de posiciones "C"). Tal como se describirá con mayor detalle a continuación, uno o más de los cebadores 4 y 6 pueden contener una o más metilcitosinas. Los cebadores utilizados pueden contener una mezcla de cebadores metilados y no metilados. En algunos casos, la fase de amplificación puede comprender circularizar el producto y amplificarlo utilizando amplificación de círculo rodante. En determinadas formas de realización, la mezcla de nucleótidos puede no contener dCTP. Sin embargo, en muchas formas de realización, la mezcla de dNTP puede contener tanto 5-metil dCTP como dCTP, en que la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la mezcla de nucleótidos puede estar en el intervalo de 1: 1000 a 1000: 1, por ejemplo, 1: 100 a 100: 1 o 1:10 a 10: 1. Por ejemplo, la relación molar de 5-metil dCTP opr dCTP en la mezcla de nucleótidos puede estar en el intervalo de 1: 1000 a 1: 100, 1: 100 a 1:10, 1:10 a 1: 1, 1: 1 a 1:10, 1: 10 a 1: 100 o 1: 100 a 100: 1000.
Las moléculas de ácido nucleico producto 8 pueden tener cualquier longitud dependiendo de cómo se implemente el método. En algunas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico producto 8 pueden tener una longitud de 500 bp a 20 kb, aunque en muchos casos se pueden utilizar fragmentos que tienen una longitud de al menos 500 kb, por ejemplo, de 1 kb a 15 kb o de 1 kb a 5 kb. En algunas formas de realización, si las moléculas de ácido nucleico producto 8 se preparan mediante amplificación por círculo rodante, pueden tener una longitud de hasta 100 kb o más. En ciertos casos (y dependiendo de la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP utilizada, el método puede utilizarse para proporcionar fragmentos de un intervalo de tamaño definido (por ejemplo, Un intervalo mediano en el tamaño de, por ejemplo, 200 bp a 500 bp o 250 bp a 750 bp, etc.) cuando se utiliza junto con ADN de mamífero, independientemente de la concentración de ese ADN en la muestra.
En ciertas formas de realización, la reacción de amplificación inicial puede multiplexarse de modo que la reacción de amplificación inicial dé como resultados múltiples (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6 o más) amplicones diferentes, en que cada amplicón es una secuencia objetivo diferente en la plantilla.
La plantilla de ácido nucleico 2 utilizada en el método puede estar en cualquier concentración y puede ser de cualquier fuente adecuada. En formas de realización particulares, el molde de ácido nucleico puede comprender ADN genómico de un eucariota, por ejemplo, humano, mono, rata, pez, insecto o planta, etc., en particular de un mamífero, o de un microbio, por ejemplo, virus o bacteria. La concentración de la plantilla puede variar mucho y no es necesario conocerla antes de iniciar el método. En algunas formas de realización, puede haber 1, 2, 3, 4, 5, hasta 10, hasta 100, hasta 500, hasta 1.000, hasta 5.000, hasta 10.000, hasta 50.000 o hasta 100.000 moléculas de la plantilla inicial en la muestra.
Los métodos para extraer ADN y ARN de diversas muestras, por ejemplo, muestras clínicas, forenses y ambientales, son bien conocidos en la técnica. Las muestras incluyen, pero no se limitan a, frotis de piel, biopsia de piel, saliva, frotis de dientes, raspado de dientes, frotis de mejilla, frotis de garganta, esputo, muestra endogástrica, heces, orina, vaginal, cervical, endocervical, endometrial, frotis nasal, pulmón, biopsia de órganos y biopsia de tejidos. Una muestra también puede ser un fluido corporal. Los fluidos corporales de interés incluyen, pero no se limitan a, líquido amniótico, humor acuoso, humor vítreo, sangre (por ejemplo, sangre entera, sangre fraccionada, plasma, suero, etc.), leche materna, líquido cefalorraquídeo (LCR), cerumen (cera de las orejas), quilo, timbre, endolinfa, perilinfa, heces, ácido gástrico, jugo gástrico, linfa, moco (incluyendo drenaje nasal y flema), líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, pus, lagañas, saliva, sebo (aceite de la piel), semen, esputo, sudor, líquido sinovial, lágrimas, vómito y orina. Los métodos para extraer ADN total de dichas muestras son bien conocidos.
En casos particulares, la plantilla puede ser un ADN, un virus de ARN o un virus de transcripción inversa, por ejemplo, reovirus, rotavirus, enterovirus, rinovirus, hepatovirus, cardiovirus, aftovirus, poliovirus, parechovirus, erbovirus, kobuvirus, teschovirus, coxsackie, virus norwalk, virus de la rubéola, alfavirus, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus del dengue, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C, isavirus, thogotovirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio, virus de la peste bovina, virus del moquillo canino, virus de la encefalitis de California, hantavirus, virus de la rabia, virus del Ébola, virus de Marburg, corona virus, astrovirus, virus de la enfermedad de Borna, arterivirus, virus de la arteritis equina, virus de la hepatitis E, retrovirus (por ejemplo, VIH-1 y VIH-2) y virus de la hepatitis B.
La polimerasa utilizada en la fase de amplificación inicial puede ser cualquier tipo de ADN polimerasa. Las ADN polimerasas pueden tener actividad exonucleasa 5 'a 3' y / o 3 'a 5'. Las ADN polimerasas de "corrección de pruebas" se definen habitualmente como aquellas con actividades de exonucleasa 3 'a 5'. Si este paso es isotérmico, entonces se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0, Bst LF o phi29. Si la amplificación inicial se realiza mediante PCR, entonces debe utilizarse una polimerasa termoestable o de origen bacteriano o de arqueas (o una variante de la misma). Los ejemplos de polimerasas termoestables que no se revisan (es decir, polimerasas termoestables que no tienen una actividad exonucleasa 3 'a 5') incluyen, pero no se limitan a Taq y Tth. Los ejemplos de polimerasas termoestables de revisión incluyen, pero no se limitan a, Pfu (Agilent), Pwo (Roche), Tgo (Roche), VENT ™ (NEB), DEEP VENT ™ (NEB), KOD HiFi (Novagen), PFX50 ™ (Invitrogen), HERCULASE II ™ (Agilent), PLATINUM PFX ™ (Life Technologies) y ProofStart (Qiagen). Estas polimerasas, en promedio, producen de 4 a 8 veces menos errores que la polimerasa Taq. Otros ejemplos de polimerasas termoestables de revisión incluyen, entre otros, PHUSION ™ (NEB), PFUULTRA ™ (Agilent), PFUULTRA ™ II (Agilent), IPROOF ™ (BioRad) y KAPAHIFI ™ (Kapa Biosystems). Estas polimerasas, como promedio, producen al menos 20 veces menos errores que la polimerasa Taq y pueden amplificar fácilmente fragmentos de hasta 15 kb.
En determinadas formas de realización, se puede añadir 5-metil dCTP a una reacción de RT-PCR de modo que la transcriptasa inversa incorpore metilcitosinas en el cDNA de la primera hebra, y la ADN polimerasa incorpore metilcitosinas en las hebras que se copian del cDNA de la primera hebra.
Una vez que se han producido las moléculas de ácido nucleico producto 8, se tratan con una endonucleasa de restricción dependiente de metilación, por ejemplo, una endonucleasa de restricción de la familia MspJI, escindiendo de esta forma las moléculas de ácido nucleico del producto en los sitios que son adyacentes a al menos parte de la metilcitosina y produciendo fragmentos 10 de las moléculas de ácido nucleico del producto. Este paso se puede realizar utilizando MspJI, SgrTI, FspEI, LpnPI, AsbpHI y RlaI, u otra endonucleasa de restricción de la familia MspJI adecuada. Las condiciones de reacción para la utilización de estas enzimas son conocidas y, en ciertos casos, se puede utilizar una parte relativamente pequeña de la reacción de amplificación en la digestión.
Tal como se muestra en la Fig. 1, la endonucleasa de restricción escinde las moléculas del ácido nucleico producto 8 en sitios que están en las metilcitosinas o adyacentes a ellas, fragmentando de esta forma las moléculas de ácido nucleico producto 8. No todos los sitios que contienen metitosina pueden escindirse en esta fase ya que la enzima utilizada puede tener una preferencia de secuencia (por ejemplo, MspJI tiene preferencia por mCNNG / A).
Como tales, algunos fragmentos 10 pueden contener metilcitosinas internas, pero éstas no interfieren con el procesamiento futuro. Además, tal como se ha mencionado anteriormente, las moléculas de ácido nucleico producto 8 pueden ser digeridas (simultáneamente o en serie), por varias endonucleasas de restricción dependientes de metilación diferentes, por ejemplo, endonucleasas de restricción de la familia MspJI, produciendo de esta forma fragmentos más pequeños según se desee. Dependiendo de la longitud de las moléculas de ácido nucleico producto 8 y de la cantidad de 5-metil dCTP utilizada, los fragmentos producidos pueden tener un tamaño promedio en el intervalo de 150 bp a 1 kb, por ejemplo, 300 bp a 700 bp, de longitud. Este intervalo de tamaño es preferible porque se puede cubrir en una sola lectura de secuenciación (ya sea como una sola lectura o utilizando secuenciación por pares).
Una vez que se han producido los fragmentos 10, se ligan a adaptadores de doble hebra, en que los adaptadores se ligan en los extremos de los fragmentos, para producir productos ligados al adaptador 14. Los adaptadores de doble hebra utilizados en este paso deben tener salientes que sean compatibles con los extremos de los fragmentos generados en la digestión previa. Las secuencias de los salientes generados por la digestión del producto 8 por la enzima dependiente de metilación dependen de la secuencia de la plantilla de ácido nucleico y la enzima de restricción utilizada para la digestión. Por tanto, se pueden predecir las secuencias de los salientes de los fragmentos. Como tales, en algunas formas de realización, los adaptadores de doble hebra usados en este paso pueden diseñarse específicamente para tener salientes que sean compatibles con los extremos predichos de los fragmentos. En algunas formas de realización, los adaptadores de doble hebra pueden contener un saliente de secuencia variable o aleatoria. Hasta ahora, todas las endonucleasas de restricción de la familia MspJI producen un saliente 5' de cuatro bases y, como tales, en algunas formas de realización, los adaptadores de doble hebra utilizados en esta fase pueden diseñarse específicamente para tener cuatro salientes 5' de base que sean compatibles con los extremos de los fragmentos mencionados anteriormente. En estas formas de realización, los adaptadores de doble hebra pueden contener un saliente de 4 bases de secuencia variable.
Debido a que la digestión con una endonucleasa de restricción de la familia MspJI da como resultado inherentemente moléculas de ácido nucleico de producto que contienen un saliente de una longitud definida, los adaptadores de doble hebra también contienen un saliente 5' de la misma longitud. Por ejemplo, si la endonucleasa de restricción de la familia MspJI da como resultados inherentemente salientes 5' de cuatro bases, entonces los adaptadores de doble hebra también contienen un saliente 5' de cuatro bases (que puede ser de secuencia variable).
Si se utilizan otras endonucleasas de restricción, los adaptadores pueden rediseñarse según sea necesario. Los adaptadores proporcionan sitios de unión para los cebadores de PCR que se utilizan en el siguiente paso del método y, como tales, suelen tener al menos 12 bp de longitud (por ejemplo, al menos 15 bp o al menos 20 bp de longitud). En ciertos casos, puede usarse un adaptador Y, por ejemplo, un adaptador que contiene: una región bicatenaria y una región monocatenaria en la que los oligonucleótidos no son complementarios. En estos casos, el extremo de la región de doble hebra se liga a los fragmentos, y cada hebra del producto se marca asimétricamente porque tiene la secuencia de una hebra del adaptador Y en un extremo y la otra hebra del Y -adaptador en el otro extremo. En otras formas de realización, se puede utilizar un adaptador de bucle (tal tal como se describe en el documento US 8.420.319).
En ciertos casos, el adaptador puede contener adicionalmente una secuencia de identificación de molécula, que ayuda a distinguir las moléculas ligadas entre sí después de que hayan sido amplificadas. En ciertos casos, la secuencia del identificador de la molécula puede corregir errores, lo que significa que incluso si hay un error (por ejemplo, si la secuencia del código de barras molecular está mal sintetizada, mal interpretada o distorsionada en virtud de los diversos pasos de procesamiento, lo que lleva a la determinación de la secuencia del código de barras molecular), el código aún se puede interpretar correctamente. Pueden encontrarse descripciones de secuencias de corrección de errores ejemplares a lo largo de la literatura (por ejemplo, US20100323348 y US20090105959).
Dicha secuencia de identificador de molécula y cualquier otra secuencia adicional, por ejemplo, promotores de ARN polimerasa, identificadores de muestras, etc., deben colocarse entre el extremo que está ligado a los fragmentos y los sitios de unión del cebador. Si se utiliza una secuencia de identificador de molécula, puede ser de complejidad relativamente baja (por ejemplo, puede estar compuesta por una mezcla de 8 a 1024 secuencias diferentes). Alternativamente, en algunas formas de realización, la secuencia del identificador de la molécula puede ser de alta complejidad, dependiendo del número de fragmentos exclusivos que requieren identificación.
En ciertos casos, la ligasa y los adaptadores se pueden agregar directamente a la digestión. En estas formas de realización, la a) endonucleasa de restricción se inactiva por calor, por ejemplo, calentando a una temperatura deseada durante un período de tiempo antes de que b) se agreguen adaptadores y ligasa a la reacción, y c) la reacción se produce a una temperatura adecuada para ligar los adaptadores a los fragmentos.
En determinadas formas de realización, las fases de fragmentación y ligación se pueden combinar en una sola reacción, reduciendo de esta forma el tiempo y el número de fases requeridas para generar fragmentos ligados al adaptador. En una forma de realización, las moléculas de ácido nucleico se tratan con endonucleasas de restricción sensibles a metilo y ligasa en la misma reacción. Durante la reacción, las endonucleasas de restricción escinden las moléculas de ácido nucleico en sitios que son adyacentes a la metil citosina y estos sitios se ligan a continuación
a adaptadores de doble hebra. Los fragmentos ligados podrían potencialmente ser re-digeridos por las enzimas de restricción a medida que avanza la reacción y dar como resultado muy pocos o ningún producto ligado. Sin embargo, este no es el caso y, al final de la reacción, la mayoría de los productos son moléculas de ácido nucleico ligadas que contienen el fragmento de interés flanqueado por adaptadores. Esto puede explicarse por uno de los siguientes tres mecanismos: a) la molécula ligada al adaptador mellada es resistente a la digestión; b) se establece un equilibrio entre la ligasa y las endonucleasas de restricción en el que la reacción de ligación es más eficaz; c) después de la digestión, se pueden generar fragmentos que no contienen sitios de reconocimiento metilados y estos serán resistentes a una digestión adicional después de la ligación.
Debido a que un fragmento de restricción debe ligarse en ambos extremos para poder amplificarse y secuenciarse, la representación de los fragmentos que se originan en los extremos del amplicón parental puede ser a veces menor que la representación de los que se originan en el medio. En una forma de realización, la profundidad de secuenciación en las regiones en los extremos de los amplicones se puede mejorar incorporando una o más citosinas metiladas (u otros ácidos nucleicos modificados) en los cebadores de RT-PCR. Las citosinas metiladas dentro de los cebadores se colocan en posiciones que generan sitios de reconocimiento para una enzima de restricción sensible a la metilación, de modo que los amplicones generados tengan sitios de corte adicionales en cada extremo y, por lo tanto, es más probable que se liguen y secuencien. Las citosinas metiladas pueden estar en las colas 5' de los cebadores. El grado de aumento de la fragmentación en los extremos de los amplicones se puede ajustar mezclando los cebadores metilados con los cebadores no metilados equivalentes en proporciones variables.
Finalmente, y de manera opcional, los fragmentos 14 pueden amplificarse utilizando cebadores que hibridan con los adaptadores, produciendo de esta forma productos de amplificación 20. Tal como se muestra en la Fig. 1, los cebadores utilizados para amplificar los fragmentos 14 tienen una cola 5' que proporciona compatibilidad con una plataforma de secuenciación particular. En determinadas formas de realización, el método puede comprender además productos de amplificación de secuencia 20. Uno o más de los cebadores utilizados en este paso pueden contener adicionalmente un identificador de muestra. Si los cebadores utilizan un identificador de muestra, los productos de diferentes muestras se pueden combinar antes de la secuenciación.
En algunas formas de realización, los fragmentos 14 se pueden secuenciar directamente sin amplificarlos. En estas formas de realización, el adaptador (o una secuencia que se agrega al adaptador extendiendo el fragmento utilizando un oligonucleótido como plantilla) puede tener una secuencia que sea compatible con la utilización en una plataforma de secuenciación de próxima generación tal como se describe a continuación.
Tal como resultará evidente, los adaptadores ligados a los fragmentos y / o los cebadores utilizados para la amplificación pueden ser compatibles con la utilización en una plataforma de secuenciación de próxima generación, por ejemplo, el método de terminación reversible de Illumina, el método de pirosecuenciación de Roche (454), la secuenciación de Life Technologies por ligación (la plataforma SOLiD) o la plataforma Ion Torrent de Life Technologies. Ejemplos de dichos métodos se describen en las siguientes referencias: Margulies et al. (Nature 2005437: 376-80); Ronaghi et al. (Analytical Biochemistry 1996242: 84-9); Shendure (Science 2005309: 1728); Imelfort et al. (Brief Bioinform. 2009 10:609-18); Fox et al. (Methods Mol Biol. 2009;553:79-108); Appleby et al. (Methods Mol Biol.2009; 513: 19-39) y Morozova (Genomics. 2008 92:255-64 ). El presente método puede utilizarse en cualquier plataforma de secuenciación, incluidas aquellas que se basan en secuenciación por síntesis (es decir, extendiendo un cebador que se hibrida con una plantilla).
A continuación, se describe una implementación del método. Esta implementación utiliza una ADN polimerasa de corrección de pruebas como por ejemplo Phusion, que no incorpora dUTP pero sí incorpora 5-metil-dCTP (2'-desoxi-5-metilcitidina 5'-trifosfato). En esta implementación, la relación de dCTP / dmCTP puede utilizarse para controlar la longitud del fragmento.
Después de la PCR, los productos de la PCR se pueden digerir utilizando una endonucleasa de restricción adecuada, que incluye FspEI, LpnPI, MspJI y SgeI. Todas estas son endonucleasas de restricción de tipo IIS dependientes de metilación de la familia MspJI que tienen secuencias de reconocimiento que incluyen 5-metilcitosina y producen un saliente 5' de cuatro nucleótidos de secuencia aleatoria. Por ejemplo, FspEI reconoce el residuo 5mC en la secuencia CmC y genera un saliente 5 'de cuatro nucleótidos cortando la hebra superior 12 nucleótidos aguas abajo del 5mC y cortando la hebra inferior 16 nucleótidos aguas abajo del 5mC. En algunos casos, la enzima de restricción se puede digerir en tampón de PCR. El ADN fragmentado tiene las siguientes características:
5- P- NNNN-------------- OH-3
3-OH-------------- NNNN -P -5
A continuación, el saliente puede ligarse a una secuencia adaptadora con el formato:
5 -OH- NNNNXXXXXXXXCTGTCTCTTATACACATCT -OH-3 (SEQ ID NO: 1)
3 -OH- XXXXXXXXGACAGAGAATATGTGTAGA -OH-5 (SEQ ID NO: 2)
donde 5-XXXXXXXX-3 es una secuencia de identificador de molécula y 5-AGATGTGTATAAGAGACAG-3 (SEQ ID NO: 3) proporciona un sitio de unión del cebador para una posterior amplificación. Como opción (y tal como se muestra en este ejemplo), el adaptador no tiene fosfatos de 5' a fin de evitar la autoligación. En teoría, la reacción de ligación se puede realizar en el mismo tampón que la digestión. La longitud de la secuencia del identificador de la molécula puede variar dependiendo de la aplicación. Después de la digestión, se liga un exceso de adaptadores al ADN fragmentado para producir un producto mellado de la estructura:
lnick 50H-AGAT GT GT AT AAGAGACAGXXXXXXXXGG-N NNN --- NNNN CCXXXXXXXXCTGTCTCTTATACACATCT-OH3 30H-TCTACACATATTCTCTGTCXXGAATXX NNNNN — NNNN CCXXXXXXXXCTGTCTCTTATACACATCT-OH3 30H-TCTACACATATTCTCTGTCXXGXX ID NO: 4; hebra inferior SEQ ID NO: 5)
El material ligado se amplifica por PCR utilizando cebadores que tienen colas 5' que proporcionan compatibilidad con una plataforma de secuenciación de próxima generación. En un método ejemplar para utilizar con la plataforma de secuenciación de Illumina, las secuencias de cebadores relevantes son las siguientes:
cebador i5 (SEQ ID NO: 6): 5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC [i5] TCGTCGGCAGCGTC AGAT GT GT ATAAGAGACAG -3
cebador i7 (SEQ ID NO: 7): 5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [i7] GTCTCGTGGGCTCG GAGAT GT GT AT AAGAGACAG -3
en que [i5] e [i7] son secuencias de índice que distinguen diferentes muestras entre sí, y las secuencias subrayadas se hibridan con los adaptadores, y las colas 5' son compatibles con el flujo de trabajo de secuenciación de Illumina.
En este ejemplo, el perfil cíclico tiene una incubación inicial a 72 °C (sin desnaturalización) para reparar las mellas en los productos de ligación. En ciclos posteriores, la supresión de PCR favorece a los amplicones con i7 / i5 en lugar de i7 / i7 o i5 / i5. La amplificación produce un amplicón de PCR que es compatible con el flujo de trabajo típico de la plataforma de secuenciación de Illumina.
Se observa que el método descrito anteriormente puede implementarse en ciertos casos utilizando nucleótidos distintos de 5-metil dCTP. Por ejemplo, varias endonucleasas de restricción, en particular varias endonucleasas de restricción dependientes de metilación, también son dependientes de la hidroximetilación ya que son capaces de digerir ADN que contiene metilcitosina o hidroximetilcitosina. Como tal, en ciertos casos, el método puede implementarse de la siguiente manera: a) amplificar una plantilla de ácido nucleico utilizando una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP o 5-hidroximeti dCTP (o una mezcla de los mismos), produciendo de esta forma moléculas de ácido nucleico producto que contiene metilcitosinas y / o hidroximetilcitosina; b) digerir las moléculas de ácido nucleico producto con una endonucleasa dependiente de metilación o dependiente de hidroximetilación (por ejemplo, una endonucleasa de restricción de la familia MspJI), escindiendo así las moléculas de ácido nucleico producto en sitios que están en o adyacentes a al menos algunas de las hidroximetilcitosinas y / o metilcitosinas y produciendo fragmentos de las moléculas de ácido nucleico producto; c) ligar adaptadores de doble hebra en los extremos de los fragmentos para producir productos ligados al adaptador; y d) amplificar los fragmentos utilizando cebadores que hibridan con los adaptadores para producir productos de amplificación. También se proporciona un método que comprende: a) una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP; b) una o más endonucleasas de restricción dependientes de hidroximetilo (por ejemplo, endonucleasas de restricción de la familia MspJI); y c) adaptadores de doble hebra. Los principios generales descritos anteriormente se pueden aplicar a este método y kit alternativo. Además, el método descrito anteriormente puede implantarse utilizando adaptadores de una sola hebra (es decir, adaptadores que no contienen salientes que son compatibles con los fragmentos).
Kits
También se proporciona en esta descripción un kit para practicar el método objeto, tal como se ha descrito anteriormente. Un kit objeto puede contener al menos: a) una concentración de dNTP que contiene al menos 5 metil dCTP); b) una o más endonucleasas de restricción dependientes de metilación (por ejemplo, familia MspJI), tal como se ha descrito anteriormente; y c) adaptadores de doble hebra (por ejemplo, adaptadores de doble hebra que contienen un saliente 5' de 4 bases de secuencia aleatoria) tal como se ha descrito anteriormente. El (los) dNTP (s) en la concentración puede (n) estar en forma concentrada (por ejemplo, un concentrado de 5x o 10x) en relación con la concentración de trabajo descrita anteriormente y, como tal, cada dNTP puede estar en una concentración de 500 |jM a 50 mM (por ejemplo, 1 mM a 10 mM, o 1,5 mM a 5 mM). Los adaptadores de doble hebra pueden comprender un saliente 5' de cuatro bases (que puede ser de secuencia variable, tal como se ha descrito anteriormente).
Además, el kit también puede comprender reactivos para realizar la amplificación (por ejemplo, polimerasa (por ejemplo, una polimerasa de corrección de pruebas), nucleótidos y tampón, etc.) y otras enzimas y / o reactivos para realizar el método, por ejemplo, una endonucleasa de restricción, ligasa, un cebador, por ejemplo, un cebador que contiene metilcitosina, etc. Los diversos componentes del kit pueden estar presentes en contenedores separados o ciertos componentes compatibles pueden combinarse previamente en un solo contenedor, según se
desee. En ciertos casos, la concentración de dNTP contiene tanto 5-metil dCTP como dCTP. En estas formas de realización, la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la concentración de nucleótidos puede estar en el intervalo de 0,01 a 99,9 o 99,9 a 0,01. Por ejemplo, la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la mezcla de nucleótidos puede estar en el intervalo de 1: 1000 a 1: 100, 1: 100 a 1:10, 1:10 a 1: 1, 1: 1 a 1:10, 1:10 a 1: 100 o 1: 100 a 100: 1000. En algunas formas de realización, la concentración de dNTP contiene dGTP, dATP, dTTP, dCTP y 5-metil dCTP, en que la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la concentración de nucleótidos se describe anteriormente.
En ciertos casos, la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la concentración de nucleótidos del kit se puede formular para proporcionar fragmentos de un intervalo de tamaño particular (por ejemplo, un intervalo medio en el tamaño de, por ejemplo, 200 bp a 500 bp o 250 bp a 750 bp, etc.) cuando se utiliza junto con ADN de mamífero. En algunos casos, el recipiente que alberga la mezcla de dNTP puede estar etiquetado con un intervalo de tamaño de productos esperados.
Además de los componentes mencionados anteriormente, los kits objeto pueden incluir adicionalmente instrucciones para utilizar los componentes del kit con el fin de practicar los métodos objeto, es decir, para proporcionar instrucciones para el análisis de muestras. Las instrucciones para practicar los métodos del tema se registran generalmente en un soporte de grabación adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, como por ejemplo papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del contenedor del kit o componentes del mismo (es decir, asociados con el empaquetado o subempaquetado), etc. En otras formas de realización, las instrucciones están presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento adecuado legible por computadora, por ejemplo, CD-ROM, disquete, etc. En otras formas de realización más, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, por ejemplo, a través de Internet. Un ejemplo de esta forma de realización es un kit que incluye una dirección web donde se pueden ver las instrucciones y / o desde donde se pueden descargar las instrucciones. Al igual que con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
EJEMPLOS
El siguiente ejemplo se proporciona con el fin de demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas formas de realización y aspectos de la presente invención y no debe interpretarse como una limitación del alcance de la misma, que es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1
Amplificación de plantilla
Las reacciones en cadena de la polimerasa se establecieron en volúmenes de 100 |jL que contenían 1x tampón Phusion HF (NEB), 0,5 j M de cebador directo (5'-cagggcccctaggaaaaagg-3 SEQ ID NO: 8), 0,5 j M de cebador inverso (5'-ggctgacttcctggatgctt; SEQ ID NO: 9), 0,02 unidades / j L de Polimerasa de ADN Phusion Hot Start Flex (NEB) y 2 pg / j L de plantilla de ADN (clon de ADN del VIH proporcionado por el Programa de reactivos contra el SIDA). Los dNTP se incluyeron a 200 j M para cada uno de dATP, dGTP y dTTP. La concentración combinada de dCTP y 5-metil dCTP fue de 200 j M, y la contribución porcentual de 5 metil dCTP varió del 2% al 8% de la cantidad total de nucleótido "dC" en diferentes reacciones. Por ejemplo, en la reacción al 2%, la concentración de 5-metil dCTP fue de 4 j M y la concentración de dCTP normal fue de 196 j M, dando una concentración total de 200 j M.
Las condiciones del ciclo térmico fueron: 98 °C durante 30 segundos; 31 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 64 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 2 minutos; a continuación 72 °C durante 5 minutos seguido de un mantenimiento a 4 °C. Se analizaron 4 j l de cada reacción en un gel de agarosa al 2% para comprobar el éxito de la amplificación (Fig. 3).
Ejemplo 2
Fragmentación de amplicones
Los amplicones de PCR generados a partir del Ejemplo 1 se cuantificaron en un fluorímetro Qubit. A continuación, cada amplicón se utilizó en 11 reacciones de fragmentación diferentes, cada una de las cuales contenía una enzima de restricción diferente o una combinación de enzimas de restricción tal como se muestra a continuación:
Número de reacción Enzima (s) de restricción
1 FspEI
2 LpnPI
3 MspJI
4 SgeI
5 FspEI y LpnPi
6 FspEI y MspJI
7 FspEI y SgeI
8 LpnPI y MspJI
9 LpnPI y SgeI
10 Sin enzima de restricción (control)
El volumen de cada reacción de digestión fue de 18 pL, que contenía 1x tampón de digestión modificado (25 mM de acetato de potasio, 7,5 mM de acetato de tris, 9 mM de acetato de magnesio, 0,5 mM de DTT), 0,1 mg / ml de BSA, 1x activador enzimático (NEB), 0,167 U / pL de enzima de restricción (concentración total) y 3,36 ng / pL de amplicón.
Los amplicones se digirieron en un termociclador a 37 °C durante 1 hora y las enzimas de restricción se inactivaron a 65 °C durante 20 min y a continuación se almacenaron a 4 °C. Se cargaron 3 pl de cada uno en un gel (Fig. 4) y los 15 pl restantes se utilizaron en las reacciones de ligación descritas a continuación.
Ejemplo 3
Ligación de adaptador
Para preparar los adaptadores para la ligación, las dos hebras de cada uno se hibridaron juntas en volúmenes de 100 pl que contenían 1x NEBuffer 4 (NEB) y 25 pM cada hebra adaptadora. Las mezclas se calentaron a 95 °C durante 5 min y a continuación se enfriaron a 4 °C a una velocidad de -1 °C por minuto. Se hibridaron un total de 96 pares de adaptadores de esta manera, cada uno de los cuales contenía una secuencia de identificación de molécula de 8 nucleótidos diferente, secuencia, que se muestra como 'XXXXXXXX' en el siguiente esquema: 5 '- N N N NXXXXXXXXCTGTCTCTTATACACATCT- 3' (SEQ ID NO: 8)
3 '-XXXXXXXXGACAGAGAATATGTGTAGA- 5' (SEQ ID NO: 9)
Después de la hibridación, se combinaron volúmenes iguales de los 96 adaptadores para generar una mezcla de 25 pM de adaptadores para utilizar en las reacciones de ligación.
Las ligaciones se prepararon en volúmenes de reacción de 30 pL que contenían tampón de ligación modificado 1x (38,75 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 9,5 mM de DTT; 5 mM de MgCl2), 1 mM de ATP, PEG 8000 al 5%, 0,42 pM de adaptadores hibridados, 8 U / pL de ADN ligasa de T4 (NEB) y 15 pL de productos de reacción de digestión. Las ligaciones se analizaron en un termociclador a 16 °C antes de ser almacenadas a 4 °C.
Ejemplo 4
Ligación y fragmentación simultánea
Las fases de fragmentación y ligación se pueden combinar en una sola reacción, reduciendo de esta forma el tiempo y el número de fases necesarias para generar fragmentos ligados al adaptador.
La reacción combinada de fragmentación / ligación se implementó utilizando las siguientes condiciones: 1.5 pL de 10x NEB Tampón 4, 0.15 pL de 100x BSA, 0.5 pL de 30X Activador de Enzimas (NEB), adaptadores recocidos 5 pM 0.25 pL, 100mM ATP 0.15 pL, 0.2 U / pL MspJI (NEB) 0,25 pL, 0,2 U / pL de FspEI (NEB) 0,25 pL, 2000 U / pL 0,25 pL, 0,2 ng / pL de ADN de PCR y 3,95 pL de agua libre de nucleasa. La reacción se incubó durante 20 min a 37 °C.
Claims (15)
1. Un método para preparar un ácido nucleico para secuenciación, que comprende:
a) amplificar una plantilla de ácido nucleico Utilizando una mezcla de dNTP que contiene 5-metil dCTP, produciendo de esta forma moléculas de ácido nucleico producto que contiene metilcitosinas; b) digerir las moléculas de ácido nucleico producto con una endonucleasa de restricción de la familia MspJI, escindiendo de esta forma las moléculas de ácido nucleico producto en sitios que son adyacentes a al menos parte de la metilcitosina y produciendo fragmentos de las moléculas de ácido nucleico producto que contienen salientes 5' de cuatro bases; y
c) ligar directamente adaptadores de doble hebra que tienen un saliente 5' de cuatro bases sobre los salientes de los fragmentos para producir productos ligados al adaptador.
2. El método de la reivindicación 1, que comprende, además:
d) amplificar los fragmentos utilizando cebadores que se hibridan con los adaptadores para producir productos de amplificación.
3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en que la fase de amplificación a) es mediante PCR.
4. El método de cualquier reivindicación anterior, en que las moléculas de ácido nucleico producto de a) tienen al menos 500 bp de longitud.
5. El método de cualquier reivindicación anterior, en que la plantilla de ácido nucleico es un genoma microbiano o un genoma de mamífero.
6. El método de cualquier reivindicación anterior, en que la polimerasa utilizada en la fase de amplificación a) es una polimerasa de corrección de pruebas.
7. El método de cualquier reivindicación anterior, en que la mezcla de dNTP contiene tanto 5-metil dCTP como dCTP.
8. El método de la reivindicación 7, en que la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la mezcla de nucleótidos se encuentra en el intervalo de 0,01 a 99,9.
9. El método de cualquier reivindicación anterior, en que los adaptadores de doble hebra de la fase c) comprenden un saliente 5' de cuatro bases de secuencia aleatoria.
10. El método de cualquier reivindicación anterior, en que la fase de digestión b) comprende la digestión de las moléculas de ácido nucleico producto con una pluralidad de endonucleasas de restricción de la familia MspJI diferentes.
11. El método de cualquier reivindicación anterior, en que los fragmentos producidos en b) se encuentran en el intervalo de 150 bp a 1 kb de longitud.
12. El método de cualquier reivindicación anterior, que comprende además secuenciar los productos ligados al adaptador de c) o los productos de amplificación de los mismos.
13. Un kit que comprende:
a) una concentración de dNTP que contiene al menos 5-metil dCTP;
b) una o más endonucleasas de restricción de la familia MspJI que escinden el ácido nucleico para producir fragmentos que contienen salientes 5' de cuatro bases; y
c) adaptadores de doble hebra que comprenden un saliente 5' de cuatro bases.
14. El kit de la reivindicación 13, en que la concentración de dNTP contiene dGTP, dATP, dTTP, dCTP y 5-metil dCTP, en que la relación molar de 5-metil dCTP por dCTP en la concentración de nucleótidos está en el intervalo de 0,01 a 99,9.
15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 13-14, en que los adaptadores de doble hebra de c) comprenden un saliente 5' de cuatro bases de secuencia aleatoria y / o en que el kit comprende un cebador que comprende metilcitosina.
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