ES2836802T3 - Códigos de barras moleculares espacialmente direccionables - Google Patents

Abstract

Un método para determinar el número y las ubicaciones espaciales de una pluralidad de moléculas diana en una muestra, que comprende: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de moléculas diana en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial y una etiqueta molecular, en donde la etiqueta espacial comprende una secuencia de ácido nucleico, y en donde la etiqueta espacial está asociada con una coordenada en una muestra, y en donde la etiqueta molecular comprende una secuencia de ácido nucleico, y en donde las etiquetas moleculares de diferentes códigos de barras estocásticos son diferentes entre sí; generar una biblioteca indexada de las dianas con códigos de barras estocásticos; estimar el número de cada una de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta molecular, en donde estimar el número de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta molecular comprende determinar la información de secuencia de las etiquetas espaciales y etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos y contar el número de marcadores moleculares con secuencias distintas; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta espacial, en donde las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra están en una superficie de la muestra, dentro de la muestra, subcelularmente en la muestra o cualquier combinación de la misma, en donde la muestra es: (i) un tejido, una monocapa celular, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos; y/o (ii) intacta durante la codificación estocástica con barras de la pluralidad de dianas en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Códigos de barras moleculares espacialmente direccionables

ANTECEDENTES

Campo

[0001] La presente descripción se refiere en general al campo de la biología molecular y más particularmente a códigos de barras moleculares.

Descripción de la técnica relacionada

[0002] Los métodos y técnicas tales como la hibridación in situ y la inmunohistoquímica permiten la visualización de las ubicaciones de las moléculas diana dentro de la muestra. Los métodos y técnicas para marcar moléculas diana para amplificación y secuenciación, por ejemplo códigos de barras estocásticos, son útiles para determinar las identidades de las moléculas diana. La determinación de las identidades y ubicaciones de las moléculas diana en la muestra es importante para aplicaciones clínicas, diagnósticos e investigación biomédica. Por tanto, existe la necesidad de métodos y técnicas capaces de correlacionar las identidades de las moléculas diana con las ubicaciones de las moléculas diana dentro de la muestra.

[0003] Castellarnau et al (SMALL, vol. 11, pp. 489-498, 2014) da a conocer códigos de barras de partículas estocásticas con cuentas fluorescentes para el etiquetado de las células individuales para permitir el seguimiento de entre las plataformas de ensayo.

[0004] Fu et al (PNAS, vol. 108, pp. 9026-9031, 2011) da a conocer etiquetado estocástico de moléculas de ácido nucleico en una población para el recuento molecular.

SUMARIO

[0005] En el presente documento se describen métodos para determinar el número y las ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En alguna realización, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial y una etiqueta molecular; estimar el número de cada una de la pluralidad de dianas usando el marcador molecular; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial. El método se puede multiplexar.

[0006] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir la hibridación de la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de dianas para generar objetivos estocásticamente con códigos de barras, y al menos una de la pluralidad de dianas se hibrida con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir generar una biblioteca indexada de las dianas con codificación de barras estocástica. Las etiquetas moleculares de diferentes códigos de barras estocásticos pueden ser diferentes entre sí. La muestra se puede dividir físicamente o permanecer intacta durante la codificación estocástica de barras de la pluralidad de dianas en la muestra. Las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra pueden estar en una superficie de la muestra, dentro de la muestra, subcelularmente en la muestra o cualquier combinación de los mismos. El código de barras estocástico de la pluralidad de dianas en la muestra se puede realizar en la superficie de la muestra, subcelularmente en la muestra, dentro de la muestra o cualquier combinación de los mismos.

[0007] En algunas realizaciones, la etiqueta espacial puede incluir 5-20 nucleótidos. El marcador molecular puede incluir 5-20 nucleótidos. La estimación del número de la pluralidad de dianas usando el marcador molecular puede incluir determinar secuencias de los marcadores espaciales y marcadores moleculares de la pluralidad de marcadores estocásticos y contar el número de marcadores moleculares con secuencias distintas. La determinación de las secuencias de las etiquetas espaciales y las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir secuenciar parte o la totalidad de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. La secuenciación de parte o la totalidad de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir la generación de secuencias, cada una con una longitud de lectura de 100 o más bases. La identificación de las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas puede incluir correlacionar las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras estocásticos con las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra.

[0008] En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir la visualización de la pluralidad de dianas en la muestra. Visualizar la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir mapear la pluralidad de dianas en un mapa de la muestra. El mapeo de la pluralidad de dianas en el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional se pueden generar antes o después de codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra. En algunas realizaciones, el mapa bidimensional y el mapa tridimensional se pueden generar antes o después de lisar la muestra. Lisar la muestra antes o después de generar el mapa bidimensional o el mapa tridimensional puede incluir calentar la muestra, poner en contacto la muestra con un detergente, cambiar el pH de la muestra o cualquier combinación de los mismos.

[0009] En algunas realizaciones, la muestra puede incluir una pluralidad de células y la pluralidad de dianas puede estar asociada con la pluralidad de células. La pluralidad de células puede incluir uno o más tipos de células. Al menos uno de los uno o más tipos de células puede ser célula cerebral, célula cardíaca, célula cancerosa, célula tumoral circulante, célula orgánica, célula epitelial, célula metastásica, célula benigna, célula primaria, célula circulatoria o cualquier combinación de las mismas. La pluralidad de dianas puede incluir ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajero (ARNm), microARN, ARN de interferencia pequeños (ARNip), productos de degradación del ARN, ARN que comprenden cada uno una cola poli(A) y cualquier combinación de los mismos. La codificación estocástica de barras de la pluralidad de dianas en la muestra se puede realizar con un soporte sólido que incluye la pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir decodificar el soporte sólido. El soporte sólido puede incluir una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en diferentes soportes sólidos pueden diferir en al menos un nucleótido.

[0010] En algunas realizaciones, cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una o más de una etiqueta universal y una etiqueta celular, en donde las etiquetas universales pueden ser las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido y etiquetas celulares pueden ser iguales para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido. El marcador universal puede incluir de 5 a 20 nucleótidos. El marcador celular puede incluir de 5 a 20 nucleótidos. El soporte sólido puede incluir la pluralidad de códigos de barras estocásticos en dos o tres dimensiones. Las partículas sintéticas pueden ser cuentas. Las cuentas pueden ser cuentas de gel de sílice, cuentas de vidrio de poro controlado, cuentas magnéticas, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa, cuentas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. El soporte sólido puede incluir un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos.

[0011] En el presente documento se describen métodos para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra en uno o más puntos de tiempo usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial.

[0012] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir codificación estocástica de barras la pluralidad de dianas en la muestra en un momento diferente puntos usando la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta de dimensión, y las etiquetas de dimensión de la pluralidad de códigos de barras estocásticos utilizados para codificar barras estocásticas de la pluralidad de dianas en los diferentes puntos de tiempo pueden ser diferentes. Las etiquetas de dimensión pueden correlacionarse con los diferentes puntos de tiempo.

[0013] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir poner en contacto la muestra con un dispositivo. El dispositivo puede ser una aguja, una matriz de agujas, un tubo, un dispositivo de succión, un dispositivo de inyección, un dispositivo de electroporación, un dispositivo clasificador de células activadas por fluorescencia, un dispositivo de microfluidos o cualquier combinación de los mismos. El dispositivo puede contactar secciones de la muestra a una velocidad específica. La tasa especificada puede correlacionar las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas con uno o más puntos de tiempo. La codificación estocástica con barras la pluralidad de dianas en la muestra se puede realizar con un soporte sólido que incluye una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos.

[0014] En el presente documento se describen partículas sintéticas. En algunas realizaciones, cada partícula sintética incluye: una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en los que cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta celular y una etiqueta molecular; un primer grupo de etiquetas ópticas; un segundo grupo de etiquetas ópticas, en donde cada etiqueta óptica en el primer grupo de etiquetas ópticas comprende un primer resto óptico y cada etiqueta óptica en el segundo grupo de etiquetas ópticas comprende un segundo resto óptico, y en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas es asociado con un código de barras óptico que comprende el primer resto óptico y el segundo resto óptico.

[0015] En algunas realizaciones, las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos son diferentes el uno del otro, y las etiquetas moleculares se seleccionan de un grupo que comprende al menos 100 etiquetas moleculares con secuencias únicas. Las etiquetas celulares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos pueden ser las mismas. El primer resto óptico y el segundo resto óptico se seleccionan de un grupo que comprende dos o más restos ópticos espectralmente distintos. Cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta espacial, en donde las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras estocásticos se diferencian entre sí en al menos un nucleótido.

[0016] En algunas realizaciones, cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende además una etiqueta universal, en donde las etiquetas universales de todos los códigos de barras estocásticos en la partícula son los mismos. La partícula sintética puede ser una perla o una perla magnética. La perla puede ser una perla de gel de sílice, una perla de vidrio de poro controlado, una perla magnética, una Dynabead, una perla de Sephadex/Sepharose, una perla de celulosa, una perla de poliestireno o cualquier combinación de las mismas.

[0017] En el presente documento se describen métodos para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta preespacial; concatenar uno o más bloques de etiquetas espaciales en la etiqueta preespacial para generar una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial.

[0018] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir la hibridación de la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de dianas para generar objetivos estocásticamente con códigos de barras, y al menos una de la pluralidad de dianas se hibrida con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir generar una biblioteca indexada de los objetivos con codificación estocástica con barras. La etiqueta espacial puede incluir 5-20 nucleótidos. La muestra puede incluir una pluralidad de células y la pluralidad de dianas que se pueden asociar con la pluralidad de células. La pluralidad de dianas puede incluir ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajero (ARNm), microARN, ARN de interferencia pequeños (ARNip), productos de degradación del ARN, ARN que comprenden cada uno una cola poli(A) y cualquier combinación de los mismos. La codificación estocástica con barras la pluralidad de dianas en la muestra se puede realizar con un soporte sólido que comprende la pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir decodificar el soporte sólido. El soporte sólido puede incluir una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Las partículas sintéticas pueden ser cuentas.

[0019] En la presente memoria se describen métodos para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: obtener imágenes de la muestra para generar una imagen de muestra; codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar objetivos con códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial.

[0020] En algunas realizaciones, la identificación de la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas utilizando la etiqueta espacial puede incluir la correlación de la imagen de la muestra con las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra. La formación de imágenes de la muestra puede incluir teñir la muestra con una mancha, en donde la mancha puede ser una mancha fluorescente, una mancha negativa, una mancha de anticuerpo o cualquier combinación de las mismas. La formación de imágenes de la muestra puede incluir la formación de imágenes de la muestra utilizando microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía confocal, microscopía de fluorescencia o cualquier combinación de las mismas.

[0021] En algunas realizaciones, la muestra puede incluir un tejido, una monocapa de células, células fijadas, una sección de tejido, o cualquier combinación de los mismos. Correlacionar la imagen de muestra con las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir superponer la imagen de muestra con las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra. La muestra puede incluir una muestra biológica, una muestra clínica, una muestra ambiental, un fluido biológico, un tejido o una célula de un sujeto. El sujeto puede ser un ser humano, un ratón, un perro, una rata o un vertebrado.

[0022] En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir la determinación del genotipo, fenotipo, o una o más mutaciones genéticas del sujeto basado en las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir predecir la susceptibilidad del sujeto a una o más enfermedades. Al menos una de las una o más enfermedades puede ser cáncer o una enfermedad hereditaria. La muestra puede incluir una pluralidad de células y la pluralidad de dianas puede asociarse con la pluralidad de células. La pluralidad de células puede incluir uno o más tipos de células. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir determinar los tipos de células de la pluralidad de células en la muestra. El fármaco puede elegirse basándose en la capacidad de respuesta prevista de los tipos de células de la pluralidad de células de la muestra.

[0023] En el presente documento se describen métodos para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de células individuales. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de células individuales usando una pluralidad de partículas sintéticas, en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas puede incluir una pluralidad de códigos de barras estocásticos, un primer grupo de etiquetas ópticas y un segundo grupo de etiquetas ópticas, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta celular y una etiqueta molecular, en donde cada etiqueta óptica en el primer grupo de etiquetas ópticas puede incluir un primer resto óptico y cada etiqueta óptica en el segundo grupo de etiquetas ópticas puede incluir un segundo resto óptico, y en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas puede asociarse con un código de barras óptico que incluye el primer resto óptico y el segundo resto óptico; detectar el código de barras óptico de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas para determinar la ubicación de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas; y determinar las ubicaciones espaciales de la pluralidad de células individuales basándose en las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas.

[0024] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de células individuales usando la pluralidad de partículas sintéticas pueden incluir poner en contacto la pluralidad de células individuales con la pluralidad de partículas sintéticas, y cada una de la pluralidad de partículas sintéticas puede estar en estrecha proximidad a una sola célula o una pequeña cantidad de células. Cada una de la pluralidad de células individuales puede incluir una pluralidad de dianas, y codificar estocásticamente con barras la pluralidad de células individuales puede incluir hibridar la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de dianas para generar objetivos con codificación estocástica de barras, y al menos una de la pluralidad de dianas se puede hibridar con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos.

[0025] En algunas realizaciones, las etiquetas celulares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en una partícula sintética pueden tener la misma secuencia y las etiquetas celulares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en diferentes partículas sintéticas pueden tener diferentes secuencias. Las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en un código de barras sintético pueden ser diferentes entre sí, y las etiquetas moleculares se pueden seleccionar de un grupo que incluye al menos 100 etiquetas moleculares con secuencias únicas. El primer resto óptico y el segundo resto óptico pueden seleccionarse de un grupo que incluye dos o más restos ópticos espectralmente distintos. La determinación de los códigos de barras ópticos de la pluralidad de partículas sintéticas y la determinación de los códigos de barras ópticos de la pluralidad de partículas sintéticas puede incluir generar una imagen óptica que muestre los códigos de barras ópticos y las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas.

[0026] En algunas realizaciones, la pluralidad de células únicas puede incluir células distribuidas a través de una matriz de pocillos incluyendo pozos, y cada uno de una mayoría de los pozos en la matriz bien contiene a lo sumo una sola célula. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir lisar la pluralidad de células individuales; y generar una biblioteca indexada de dianas con codificación estocástica de barras, en donde cada una de las dianas con código de barras estocástico puede incluir una secuencia de etiqueta celular, una secuencia de etiqueta molecular y al menos una parte de la secuencia complementaria de una de la pluralidad de dianas. Los métodos pueden incluir amplificar las dianas con codificación estocástica de barras de la biblioteca indexada para generar dianas con codificación de barras estocástica amplificados; y secuenciar las dianas con codificación de barras estocástica amplificados para determinar el número de dianas con códigos de barras estocásticos amplificados con secuencias de etiquetas moleculares únicas y una secuencia complementaria idéntica, en donde en el número de dianas con código de barras estocásticamente amplificadas con secuencias de etiquetas moleculares únicas y una secuencia complementaria idéntica pueden ser sustancialmente las mismas que las ocurrencias de dianas con secuencias complementarias de la secuencia complementaria idéntica en la única célula o en el pequeño número de células. La pluralidad de células puede incluir un tejido, una monocapa celular, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos. La amplificación de las moléculas diana marcadas puede incluir amplificación puente, amplificación con un cebador específico de gen, un cebador universal, un cebador oligo (dT) o cualquier combinación de los mismos.

[0027] En el presente documento se describen métodos para identificar células distintas en dos o más muestras. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir: codificar estocásticamente con barras una pluralidad de dianas en las dos o más muestras usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta espacial y una etiqueta molecular; estimar el número de la pluralidad de dianas en las dos o más muestras usando el marcador molecular; y distinguir las dos o más muestras entre sí utilizando la etiqueta espacial, en donde la pluralidad de dianas asociados con códigos de barras estocásticos con diferentes etiquetas espaciales puede ser de diferentes muestras.

[0028] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en las dos o más muestras puede incluir la hibridación de la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de dianas para generar dianas estocásticamente con códigos de barras, y al menos una de la pluralidad de dianas se puede hibridar a uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en las dos o más muestras puede incluir generar una biblioteca indexada de los objetivos con códigos de barras estocásticamente. La etiqueta espacial puede incluir 5-20 nucleótidos. El marcador molecular puede incluir 5­ 20 nucleótidos. Cada una de las dos o más muestras puede incluir una pluralidad de células y la pluralidad de dianas puede asociarse con la pluralidad de células. La pluralidad de dianas puede incluir ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajero (ARNm), microARN, ARN de interferencia pequeños (ARNip), productos de degradación del ARN, ARN que incluyen cada uno una cola poli(A) y cualquier combinación de los mismos. La codificación estocástica con barras de la pluralidad de dianas en las dos o más muestras se puede realizar con un soporte sólido que incluye una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Las partículas sintéticas pueden ser cuentas. Las cuentas pueden ser cuentas de gel de sílice, cuentas de vidrio de poro controlado, cuentas magnéticas, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa, cuentas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas.

[0029] En el presente documento se describen kits para determinar el número y las ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir: una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en los que cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta espacial, en donde las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras estocásticos se diferencian entre sí en al menos un nucleótido; e instrucciones para usar la pluralidad de códigos de barras estocásticos. La pluralidad de códigos de barras estocásticos se puede asociar a un soporte sólido. El soporte sólido puede incluir una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de partículas sintéticas.

[0030] En algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de partículas sintéticas puede incluir un primer grupo de etiquetas ópticas y un segundo grupo de etiquetas ópticas, y cada etiqueta óptica en el primer grupo de etiquetas ópticas puede incluir un primer resto óptico, cada etiqueta óptica en el segundo grupo de etiquetas ópticas puede incluir un segundo resto óptico, y el primer resto óptico y el segundo resto óptico pueden seleccionarse de un grupo que incluye dos o más restos ópticos espectralmente distintos. Cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir uno o más de una etiqueta molecular, una etiqueta universal y una etiqueta celular, en donde las etiquetas universales y las etiquetas celulares de todos los códigos de barras estocásticos en el soporte sólido pueden ser iguales.

[0031] En algunas realizaciones, el soporte sólido puede incluir la pluralidad de códigos de barras estocásticos en dos dimensiones o tres dimensiones. La pluralidad de partículas sintéticas puede ser cuentas. Las cuentas pueden ser cuentas de gel de sílice, cuentas de vidrio de poro controlado, cuentas magnéticas, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa, cuentas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. Las partículas sintéticas pueden ser cuentas magnéticas. El soporte sólido puede incluir un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los kits pueden incluir un tampón. Los kits pueden incluir un cartucho. El soporte sólido se puede precargar sobre un sustrato. Los kits pueden incluir uno o más reactivos para una reacción de transcripción inversa. Los kits pueden incluir uno o más reactivos para una reacción de amplificación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra un ejemplo de realización no limitativo para determinar ubicaciones espaciales de distintas dianas en una muestra.

La figura 2 ilustra un código de barras estocástico ejemplar no limitativo.

La figura 3 muestra un flujo de trabajo ejemplar no limitativo de códigos de barras estocásticos y conteo digital.

La figura 4 es una ilustración esquemática que muestra un proceso ejemplar no limitativo para generar una biblioteca indexada de las dianas con códigos de barras estocásticos a partir de una pluralidad de dianas.

La figura 5 ilustra una realización ejemplar no limitativa para determinar ubicaciones espaciales de dianas en una muestra manteniendo la orientación fisiológica de secciones de la muestra.

La figura 6 ilustra una realización ejemplar no limitativa para determinar ubicaciones espaciales de dianas en una muestra por puntos de tiempo.

La figura 7 ilustra una realización no limitante ejemplar para determinar localizaciones espaciales de las dianas en una muestra mediante la aleatorización de la orientación de las secciones de la muestra.

La figura 8 muestra un ejemplo esquemático no limitativo de litografía de etiquetas.

La figura 9 muestra una realización ejemplar no limitativa para determinar ubicaciones espaciales de dianas en una muestra usando litografía de etiquetas.

La figura 10 muestra un ejemplo de realización no limitativo para distinguir las dianas de una muestra para una pluralidad de muestras.

La figura 11 muestra una realización ejemplar no limitativa para distinguir la localización subcelular de dianas en una célula.

La figura 12 ilustra una realización ejemplar no limitativa para la cola de homopolímeros.

La figura 13 muestra un instrumento ejemplar no limitativo utilizado en los métodos de la divulgación. La figura 14 ilustra una arquitectura ejemplar no limitativa de un sistema informático que puede usarse en conexión con las realizaciones de la presente divulgación.

La figura 15 ilustra una arquitectura ejemplar no limitativa que muestra una red con una pluralidad de sistemas informáticos para su uso en los métodos de la divulgación.

La figura 16 ilustra una arquitectura ejemplar no limitativa de un sistema informático multiprocesador que utiliza un espacio de memoria de dirección virtual compartida de acuerdo con los métodos de la divulgación.

Las figuras 17A-C representan un cartucho ejemplar no limitativo para su uso en los métodos de la divulgación.

Las figuras 18A-B muestran diferentes disposiciones de etiquetas ópticas en la superficie de una partícula sintética.

La figura 19 muestra la hibridación de oligonucleótidos en la primera etapa de codificación del Ejemplo 4.

La figura 20 es una tabla de búsqueda que muestra el contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la primera placa.

La figura 21 muestra los oligonucleótidos monocatenarios en las diversas regiones de las partículas sintéticas después de la polimerización, ligación y desnaturalización del ADN dúplex en el primer paso de codificación.

La figura 22 muestra la hibridación de oligonucleótidos en la segunda etapa de codificación del Ejemplo 4.

La figura 23 es una tabla de búsqueda que muestra el contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la segunda placa.

La figura 24 muestra los oligonucleótidos monocatenarios en las diversas regiones de las partículas sintéticas después de la polimerización, ligación y desnaturalización del ADN dúplex en la segunda etapa de codificación.

La figura 25 muestra la hibridación de oligonucleótidos en la tercera etapa de codificación del ejemplo 4.

La figura 26 es una tabla de búsqueda que muestra el contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la tercera placa.

La figura 27 muestra los oligonucleótidos monocatenarios en las diversas regiones de las partículas sintéticas después de la polimerización, ligación y desnaturalización del ADN dúplex en la tercera etapa de codificación.

La figura 28 es una ilustración esquemática de una partícula sintética ejemplar no limitante que se recubre con códigos de barras de ADN y el código de barras que se puede resolver espectralmente.

La figura 29 muestra una combinación ejemplar del código de barras que se puede resolver espectralmente, PS1-9, de una partícula sintética.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0033] En la siguiente descripción detallada, la referencia se hace a los dibujos adjuntos, que forman una parte del mismo. En los dibujos, los símbolos similares identifican típicamente componentes similares, a menos que el contexto indique lo contrario. Las realizaciones ilustrativas descritas en la descripción detallada, dibujos y reivindicaciones no pretenden ser limitantes. Se pueden utilizar otras realizaciones y se pueden realizar otros cambios, sin apartarse del alcance de la materia aquí presentada. Se entenderá fácilmente que los aspectos de la presente divulgación, como se describe en general en este documento y se ilustra en las figuras, se pueden disponer, sustituir, combinar, separar y diseñar en una amplia variedad de configuraciones diferentes, todas las cuales se contemplan explícitamente en este documento y forman parte de la divulgación en este documento. La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas.

[0034] En un aspecto, la revelación proporciona un método para determinar el número y la localización espacial de una o más dianas en una muestra que comprende: poner en contacto la localización espacial en la muestra con uno o más códigos de barras más estocásticos, en donde cada código de barras estocástico comprende una etiqueta espacial y una etiqueta molecular; estimar el número de una o más dianas en la ubicación espacial usando la etiqueta molecular; e identificar la ubicación espacial de una o más dianas usando la etiqueta espacial. En algunas realizaciones, el contacto comprende hibridar el código de barras estocástico con una o más dianas. En algunas realizaciones, la hibridación comprende la hibridación de una o más dianas de modo que cada una de las una o más dianas se hibrida con un código de barras estocástico único. En algunas realizaciones, las etiquetas moleculares de los códigos de barras estocásticos son diferentes. En algunas realizaciones, la muestra se divide físicamente durante el contacto. En algunas realizaciones, la muestra está intacta durante el contacto. En algunas realizaciones, el contacto se realiza en la superficie de la muestra. En algunas realizaciones, el contacto se realiza dentro de la muestra. En algunas realizaciones, el contacto se realiza de forma subcelular en la muestra. En algunas realizaciones, la ubicación espacial es subcelular. En algunas realizaciones, el contacto se realiza sobre un sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden conocido. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden desconocido. En algunas realizaciones, el método comprende además decodificar el sustrato. En algunas realizaciones, la etiqueta espacial comprende de 5 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, la estimación comprende generar una molécula de código de barras diana. En algunas realizaciones, la molécula de código de barras diana compromete la secuencia de un código de barras estocástico al que está asociada. En algunas realizaciones, la estimación comprende además determinar la secuencia de la etiqueta espacial y la etiqueta molecular. En algunas realizaciones, el método comprende además contar las apariciones de distintas secuencias del marcador molecular. En algunas realizaciones, el recuento se usa para estimar el número de una o más dianas. En algunas realizaciones, la determinación comprende secuenciar los códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende la secuenciación con longitudes de lectura de al menos 100 bases. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciar con longitudes de lectura de al menos 500 bases. En algunas realizaciones, la identificación comprende correlacionar la etiqueta espacial con la ubicación espacial en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además visualizar el número de una o más dianas en la ubicación espacial. En algunas realizaciones, la visualización comprende mapear el número de una o más dianas en un mapa de la muestra. En algunas realizaciones, la visualización comprende obtener imágenes de la muestra en un punto de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: obtener imágenes de la muestra antes del contacto, imágenes de la muestra después del contacto, imágenes de la muestra antes de lisar la muestra, imágenes de la muestra después de lisar la muestra. En algunas realizaciones, la formación de imágenes produce una imagen que se utiliza para construir un mapa de una representación física de la muestra. En algunas realizaciones, el mapa es bidimensional. En algunas realizaciones, el mapa es tridimensional. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sola célula. En algunas realizaciones, la muestra comprende una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la pluralidad de células comprende uno o más tipos de células diferentes. En algunas realizaciones, el uno o más tipos de células se seleccionan del grupo que consiste en: células del cerebro, células del corazón, células cancerosas, células tumorales circulantes, células de órganos, células epiteliales, células metastásicas, células benignas, células primarias y células circulatorias o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra comprende un tejido sólido. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto seleccionado del grupo que consiste en: un ser humano, un mamífero, un perro, una rata, un ratón, un pez, una mosca, un gusano, una planta, un hongo, una bacteria, un virus, vertebrados e invertebrados. En algunas realizaciones, la o las dianas son moléculas de ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido ribonucleico se seleccionan del grupo que consiste en: ARNm, microARN, productos de degradación de ARNm y ácidos ribonucleicos que comprenden una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las dianas son moléculas de ácido desoxirribonucleico. En algunas realizaciones, el contacto se realiza con un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender una pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, cada código de barras estocástico de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial. En algunas realizaciones, las etiquetas espaciales en diferentes soportes sólidos difieren en al menos un nucleótido. En algunas realizaciones, el código de barras estocástico comprende además una etiqueta universal y una etiqueta celular. En algunas realizaciones, la etiqueta universal y la etiqueta celular son iguales para todos los códigos de barras estocásticos en el soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende códigos de barras estocásticos en dos dimensiones. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende códigos de barras estocásticos en tres dimensiones. En algunas formas de realización, los soportes sólidos comprenden un cordón. En algunas realizaciones, la perla se selecciona del grupo que consiste en: perla de gel de sílice, perla de vidrio de poro controlado, perla magnética, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa y cuentas de poliestireno, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la perla comprende una perla magnética. En algunas realizaciones, el soporte sólido es semisólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un polímero, una matriz o un hidrogel. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un dispositivo de matriz de agujas. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un anticuerpo. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende poliestireno.

[0035] En un aspecto, la divulgación proporciona un método para determinar localizaciones espaciales de una o más dianas en una muestra por medir el tiempo que comprende: poner en contacto la localización espacial en la muestra con uno o más códigos de barras estocásticos, en uno o más puntos de tiempo, en donde cada código de barras estocástico comprende una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de una o más dianas en la muestra, en donde el uno o más puntos de tiempo se correlaciona con la ubicación espacial. En algunas realizaciones, los códigos de barras estocásticos en diferentes puntos de tiempo comprenden etiquetas de diferentes dimensiones. En algunas realizaciones, las etiquetas de dimensión se correlacionan con uno o más puntos de tiempo. En algunas realizaciones, el contacto se realiza mediante un dispositivo. En algunas realizaciones, el dispositivo es un dispositivo seleccionado del grupo que consta de: una aguja, una matriz de agujas, un tubo, un dispositivo de succión, un dispositivo de inyección, un dispositivo de electroporación, un dispositivo clasificador de células activado por fluorescencia y un dispositivo de microfluidos o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el dispositivo contacta las secciones a una velocidad especificada. En algunas realizaciones, la velocidad especificada se usa para correlacionar el punto de tiempo con la ubicación espacial. En algunas realizaciones, el contacto comprende hibridar uno o más códigos de barras estocásticos con una o más dianas. En algunas realizaciones, la hibridación comprende la hibridación de una o más dianas de modo que cada una de las una o más dianas se hibrida con un código de barras estocástico único. En algunas realizaciones, uno o más códigos de barras estocásticos comprenden una etiqueta molecular. En algunas realizaciones, la etiqueta molecular es diferente para cada uno de los uno o más códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la muestra se divide físicamente durante el contacto. En algunas realizaciones, la muestra está intacta durante el contacto. En algunas realizaciones, el contacto se realiza en la superficie de la muestra. En algunas realizaciones, el contacto se realiza dentro de la muestra. En algunas realizaciones, el contacto se realiza de forma subcelular en la muestra. En algunas realizaciones, la ubicación espacial es subcelular. En algunas realizaciones, la puesta en contacto se realiza sobre un sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden conocido. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden desconocido. En algunas realizaciones, el método comprende además decodificar el sustrato. En algunas realizaciones, la etiqueta espacial comprende de 5 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además estimar el número de una o más dianas usando el código de barras estocástico. En algunas realizaciones, la estimación comprende generar una molécula de código de barras diana. En algunas realizaciones, la molécula de código de barras diana comprende la secuencia de un código de barras estocástico al que está asociada. En algunas realizaciones, la estimación comprende además determinar la secuencia de la etiqueta espacial y una etiqueta molecular. En algunas realizaciones, el método comprende además contar las apariciones de distintas secuencias del marcador molecular. En algunas realizaciones, el recuento se usa para estimar el número de una o más dianas. En algunas realizaciones, la determinación comprende secuenciar los códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende la secuenciación con longitudes de lectura de al menos 100 bases. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciar con longitudes de lectura de al menos 500 bases. En algunas realizaciones, la identificación comprende correlacionar la etiqueta espacial con la ubicación espacial en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además visualizar el número de una o más dianas en la ubicación espacial. En algunas realizaciones, la visualización comprende mapear el número de una o más dianas en un mapa de la muestra. En algunas realizaciones, la visualización comprende obtener imágenes de la muestra en un punto de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: obtener imágenes de la muestra antes del contacto, imágenes de la muestra después del contacto, imágenes de la muestra antes de lisar la muestra, imágenes de la muestra después de lisar el muestra. En algunas realizaciones, la formación de imágenes produce una imagen que se utiliza para construir un mapa de una representación física de la muestra. En algunas realizaciones, el mapa es bidimensional. En algunas realizaciones, el mapa es tridimensional. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sola célula. En algunas realizaciones, la muestra comprende una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la pluralidad de células comprende uno o más tipos de células diferentes. En algunas realizaciones, el uno o más tipos de células se seleccionan del grupo que consiste en: células del cerebro, células del corazón, células cancerosas, células tumorales circulantes, células de órganos, células epiteliales, células metastásicas, células benignas, células primarias y células circulatorias o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra comprende un tejido sólido. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto seleccionado del grupo que consiste en: un ser humano, un mamífero, un perro, una rata, un ratón, un pez, una mosca, un gusano, una planta, un hongo, una bacteria, un virus, vertebrados e invertebrados. En algunas realizaciones, la o las dianas son moléculas de ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido ribonucleico se seleccionan del grupo que consiste en: ARNm, microARN, productos de degradación de ARNm y ácidos ribonucleicos que comprenden una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las dianas son moléculas de ácido desoxirribonucleico. En algunas realizaciones, el contacto se realiza con un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, cada código de barras estocástico de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial. En algunas realizaciones, las etiquetas espaciales en diferentes soportes sólidos difieren en al menos un nucleótido. En algunas realizaciones, el código de barras estocástico comprende además una etiqueta universal, una etiqueta celular y una etiqueta molecular. En algunas realizaciones, la etiqueta universal y la etiqueta celular son las mismas para todos los códigos de barras estocásticos sobre un soporte sólido. En algunas realizaciones, los soportes sólidos comprenden códigos de barras estocásticos en dos dimensiones. En algunas realizaciones, los soportes sólidos comprenden códigos de barras estocásticos en tres dimensiones. En algunas formas de realización, los soportes sólidos comprenden un cordón. En algunas realizaciones, la perla se selecciona del grupo que consiste en: perla de gel de sílice, perla de vidrio de poro controlado, perla magnética, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa y cuentas de poliestireno, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la perla comprende una perla magnética. En algunas realizaciones, el soporte sólido es semisólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un polímero, una matriz o un hidrogel. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un dispositivo de matriz de agujas. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un anticuerpo.

[0036] En un aspecto, la revelación proporciona un método para determinar la localización espacial de una o más dianas en una muestra que comprende: poner en contacto una o más ubicaciones espaciales de la muestra con uno o más códigos de barras más estocásticos, en donde cada código de barras estocástico comprende una pre-etiqueta espacial; concatenar uno o más bloques de etiquetas espaciales en la etiqueta preespacial, generando así una etiqueta espacial; e identificar una o más ubicaciones espaciales de una o más dianas en la muestra correlacionando una longitud de la etiqueta espacial con una ubicación espacial en la muestra. En algunas realizaciones, las etiquetas espaciales en distintas ubicaciones espaciales tienen diferentes longitudes. En algunas realizaciones, el contacto comprende hibridar el código de barras estocástico con una o más dianas. En algunas realizaciones, la hibridación comprende hibridar una o más dianas de modo que cada una de las una o más dianas se hibrida con un código de barras estocástico único. En algunas realizaciones, la etiqueta preespacial comprende una etiqueta molecular. En algunas realizaciones, la etiqueta molecular es diferente para cada uno de los uno o más códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la muestra se divide físicamente durante el contacto. En algunas realizaciones, la muestra está intacta durante el contacto. En algunas realizaciones, el contacto se realiza en la superficie de la muestra. En algunas realizaciones, el contacto se realiza dentro de la muestra. En algunas realizaciones, el contacto se realiza subcelularmente en la muestra. En algunas realizaciones, la ubicación espacial es subcelular. En algunas realizaciones, el contacto se realiza sobre un sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden conocido. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden desconocido. En algunas realizaciones, el método comprende además decodificar el sustrato. En algunas realizaciones, la etiqueta espacial comprende de 5 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el método comprende además estimar el número de dianas distintas utilizando los códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la estimación comprende generar una molécula de código de barras diana. En algunas realizaciones, la molécula de código de barras diana comprende la secuencia de un código de barras estocástico al que está asociada. En algunas realizaciones, la estimación comprende además determinar la secuencia de la etiqueta espacial y una etiqueta molecular. En algunas realizaciones, el método comprende además contar las apariciones de distintas secuencias del marcador molecular. En algunas realizaciones, el recuento se usa para estimar el número de una o más dianas. En algunas realizaciones, la determinación comprende secuenciar los códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende la secuenciación con longitudes de lectura de al menos 100 bases. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciar con longitudes de lectura de al menos 500 bases. En algunas realizaciones, la identificación comprende correlacionar la etiqueta espacial con la ubicación espacial en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además visualizar el número de una o más dianas en la ubicación espacial. En algunas realizaciones, la visualización comprende mapear el número de una o más dianas en un mapa de la muestra. En algunas realizaciones, la visualización comprende obtener imágenes de la muestra en un punto de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: obtener imágenes de la muestra antes del contacto, imágenes de la muestra después del contacto, imágenes de la muestra antes de lisar la muestra, imágenes de la muestra después de lisar la muestra. En algunas realizaciones, la formación de imágenes produce una imagen que se utiliza para construir un mapa de una representación física de la muestra. En algunas realizaciones, el mapa es bidimensional. En algunas realizaciones, el mapa es tridimensional. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sola célula. En algunas realizaciones, la muestra comprende una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la pluralidad de células comprende uno o más tipos de células diferentes. En algunas realizaciones, el uno o más tipos de células se seleccionan del grupo que consiste en: células del cerebro, células del corazón, células cancerosas, células tumorales circulantes, células de órganos, células epiteliales, células metastásicas, células benignas, células primarias y células circulatorias o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra comprende un tejido sólido. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto seleccionado del grupo que consiste en: un ser humano, un mamífero, un perro, una rata, un ratón, un pez, una mosca, un gusano, una planta, un hongo, una bacteria, un virus, vertebrados e invertebrados. En algunas realizaciones, la o las dianas son moléculas de ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido ribonucleico se seleccionan del grupo que consiste en: ARNm, microARN, productos de degradación de ARNm y ácidos ribonucleicos que comprenden una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las dianas son moléculas de ácido desoxirribonucleico. En algunas realizaciones, el contacto se realiza con un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede comprender una pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, cada código de barras estocástico de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial. En algunas realizaciones, las etiquetas espaciales en diferentes soportes sólidos difieren en al menos un nucleótido. En algunas realizaciones, el código de barras estocástico comprende además una etiqueta universal y una etiqueta celular. En algunas realizaciones, la etiqueta universal y la etiqueta celular son iguales para todos los códigos de barras estocásticos en el soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende códigos de barras estocásticos en dos dimensiones. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende códigos de barras estocásticos en tres dimensiones. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un cordón. En algunas realizaciones, la perla se selecciona del grupo que consiste en: perla de gel de sílice, perla de vidrio de poro controlado, perla magnética, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa y cuentas de poliestireno, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la perla comprende una perla magnética. En algunas realizaciones, el soporte sólido es semisólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un polímero, una matriz o un hidrogel. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un dispositivo de matriz de agujas. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un anticuerpo.

[0037] En un aspecto, la revelación proporciona un método para identificar células distintas en una población de células que comprenden: poner en contacto dos o más muestras a un sustrato, en donde el sustrato comprende uno o más tipos de códigos de barras estocásticos, en donde cada tipo de los tipos de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial diferente, y donde cada código de barras estocástico comprende una etiqueta molecular; estimar el número de una o más dianas en la pluralidad de muestras usando el marcador molecular; y distinguir una muestra de las dos o más muestras por las etiquetas espaciales, donde las dianas asociadas con diferentes etiquetas espaciales se originan a partir de diferentes muestras. En algunas realizaciones, el contacto comprende hibridar el código de barras estocástico con una o más dianas. En algunas realizaciones, la hibridación comprende la hibridación de una o más dianas de modo que cada una de las una o más dianas se hibrida con un código de barras estocástico único. En algunas realizaciones, las etiquetas moleculares de los códigos de barras estocásticos son diferentes. En algunas realizaciones, las dos o más muestras se dividen físicamente entre sí durante el contacto. En algunas realizaciones, las dos o más muestras pueden estar intactas durante el contacto. En algunas realizaciones, el contacto se realiza en la superficie de dos o más muestras. En algunas realizaciones, el contacto se realiza dentro de las dos o más muestras. En algunas realizaciones, el contacto se realiza de forma subcelular en las dos o más muestras. En algunas realizaciones, la ubicación espacial es subcelular. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden conocido. En algunas realizaciones, el sustrato comprende uno o más códigos de barras estocásticos en un orden desconocido. En algunas realizaciones, el método comprende además decodificar el sustrato. En algunas realizaciones, la etiqueta espacial comprende de 5 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, la estimación comprende generar una molécula de código de barras diana. En algunas realizaciones, la molécula de código de barras diana comprende la secuencia de un código de barras estocástico al que está asociada. En algunas realizaciones, la estimación comprende además determinar la secuencia de la etiqueta espacial y la etiqueta molecular. En algunas realizaciones, el método comprende además contar las apariciones de distintas secuencias del marcador molecular. En algunas realizaciones, el recuento se usa para estimar el número de una o más dianas. En algunas realizaciones, la determinación comprende secuenciar los códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende la secuenciación con longitudes de lectura de al menos 100 bases. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciar con longitudes de lectura de al menos 500 bases. En algunas realizaciones, el método comprende además visualizar el número de una o más dianas en la ubicación espacial. En algunas realizaciones, la visualización comprende mapear el número de una o más dianas en un mapa de la muestra. En algunas realizaciones, la visualización comprende obtener imágenes de la muestra en un punto de tiempo seleccionado del grupo que consiste en: obtener imágenes de la muestra antes del contacto, imágenes de la muestra después del contacto, imágenes de la muestra antes de lisar la muestra, imágenes de la muestra después de lisar la muestra. En algunas realizaciones, la formación de imágenes produce una imagen que se utiliza para construir un mapa de una representación física de la muestra. En algunas realizaciones, el mapa es bidimensional. En algunas realizaciones, el mapa es tridimensional. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sola célula. En algunas realizaciones, la muestra comprende una pluralidad de células. En algunas realizaciones, la pluralidad de células comprende uno o más tipos de células diferentes. En algunas realizaciones, el uno o más tipos de células se seleccionan del grupo que consiste en: células cerebrales, células cardíacas, células cancerosas, células tumorales circulantes, células de órganos, células epiteliales, células metastásicas, células benignas, células primarias y células circulatorias, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la muestra comprende un tejido sólido. En algunas realizaciones, la muestra se obtiene de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto seleccionado del grupo que consiste en: un ser humano, un mamífero, un perro, una rata, un ratón, un pez, una mosca, un gusano, una planta, un hongo, una bacteria, un virus, vertebrados e invertebrados. En algunas realizaciones, la o las dianas son moléculas de ácido ribonucleico. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido ribonucleico se seleccionan del grupo que consiste en: ARNm, microARN, productos de degradación de ARNm y ácidos ribonucleicos que comprenden una cola de poli(A), o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las dianas son moléculas de ácido desoxirribonucleico. En algunas realizaciones, el contacto se realiza con un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende una pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, cada código de barras estocástico de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial. En algunas realizaciones, las etiquetas espaciales en diferentes soportes sólidos difieren en al menos un nucleótido. En algunas realizaciones, el código de barras estocástico comprende además una etiqueta universal y una etiqueta celular. En algunas realizaciones, la etiqueta universal y la etiqueta celular son iguales para todos los códigos de barras estocásticos en el soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende códigos de barras estocásticos en dos dimensiones. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende códigos de barras estocásticos en tres dimensiones. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un cordón. En algunas realizaciones, la perla se selecciona del grupo que consiste en: perla de gel de sílice, perla de vidrio de poro controlado, perla magnética, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa y cuentas de poliestireno, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la perla comprende una perla magnética. En algunas realizaciones, el soporte sólido es semisólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un polímero, una matriz o un hidrogel. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un dispositivo de matriz de agujas. En algunas realizaciones, el soporte sólido comprende un anticuerpo.

[0038] En un aspecto, la divulgación proporciona un kit que comprende: uno o más tipos de códigos de barras estocásticos, en donde cada código de barras estocástico del uno o más tipos de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial, en donde las etiquetas espaciales de los uno o más tipos de los códigos de barras estocásticos difieren en al menos un nucleótido; e instrucciones de uso. En algunas realizaciones, el uno o más tipos de códigos de barras estocásticos están unidos a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el uno o más tipos de códigos de barras estocásticos están unidos a un sustrato. En algunas realizaciones, el kit comprende además un tampón. En algunas realizaciones, el kit comprende además un cartucho. En algunas realizaciones, el uno o más soportes están precargados sobre un sustrato. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para una reacción de transcripción inversa. En algunas realizaciones, el kit comprende además reactivos para una reacción de amplificación.

[0039] En un aspecto, la descripción proporciona un método que comprende: la formación de imágenes de una muestra en contacto a un sustrato que comprende una pluralidad de sondas, produciendo de este modo una imagen; lisar la muestra liberando así ácidos nucleicos de la muestra; analizar los ácidos nucleicos de la muestra en lugares del sustrato; correlacionar ubicaciones en la imagen con datos del análisis para identificar una ubicación espacial de un ácido nucleico en una muestra. En algunas realizaciones, la formación de imágenes comprende teñir la muestra. En algunas realizaciones, la tinción comprende una tinción con una tinción seleccionada del grupo que consiste en: una tinción fluorescente, una tinción negativa y un anticuerpo tinte, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la formación de imágenes usa una técnica seleccionada del grupo que consiste en: microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía confocal y microscopía de fluorescencia. En algunas realizaciones, la realización de análisis inmunhistológico produce una imagen. En algunas realizaciones, la muestra comprende una monocapa celular. En algunas realizaciones, la muestra comprende células fijas. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sección de tejido. En algunas realizaciones, la lisis se realiza calentando la muestra, poniendo en contacto la muestra con un detergente o cambiando el pH de la muestra, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos con los oligo(dT)s. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos poliadenilados. En algunas realizaciones, el método comprende además homopolímeros que forman colas de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificación en puente. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador específico de gen. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador universal. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador oligo(dT). En algunas realizaciones, el método comprende además detectar los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la detección comprende hibridar una o más sondas con los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, una o más sondas comprenden un marcador fluorescente. En algunas realizaciones, una o más sondas pueden ser 4 sondas. En algunas realizaciones, el análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos en una micromatriz. En algunas realizaciones, la correlación comprende superponer la imagen con los datos. En algunas realizaciones, la correlación comprende mapear la ubicación xy de una característica en el sustrato sobre la imagen. En algunas realizaciones, las sondas comprenden oligo(dT). En algunas realizaciones, las sondas comprenden sondas específicas de genes. En algunas realizaciones, las sondas comprenden una combinación de sondas oligo(dT) y sondas específicas de genes. En algunas realizaciones, las sondas específicas de genes son específicas de genes para al menos 2 genes.

[0040] En un aspecto, la divulgación proporciona un método para el diagnóstico de un sujeto que comprende: la formación de imágenes de una muestra del sujeto en contacto con un sustrato que comprende una pluralidad de sondas, produciendo de este modo una imagen; lisar la muestra liberando así ácidos nucleicos de la muestra; analizar los ácidos nucleicos de la muestra en lugares del sustrato; diagnosticar al sujeto en base a la imagen y los datos del análisis. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un ratón, un perro, una rata o un vertebrado. En algunas realizaciones, el diagnóstico comprende identificar diferentes tipos de células de la muestra. En algunas realizaciones, el diagnóstico comprende determinar si diferentes tipos de células responden a una terapia. En algunas realizaciones, el diagnóstico comprende determinar un genotipo de una o más células en la muestra. En algunas realizaciones, el método comprende además tratar al sujeto. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende administrar un fármaco al sujeto. En algunas realizaciones, el fármaco se elige basándose en la capacidad de respuesta prevista a los tipos celulares identificados de la muestra. En algunas realizaciones, la formación de imágenes comprende teñir la muestra. En algunas realizaciones, la tinción comprende la tinción con una tinción seleccionada del grupo que consiste en: una tinción fluorescente, una tinción negativa y una tinción de anticuerpo, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la formación de imágenes usa una técnica seleccionada del grupo que consiste en: microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía confocal y microscopía de fluorescencia. En algunas realizaciones, la realización de análisis inmunhistológico produce una imagen. En algunas realizaciones, la muestra comprende una monocapa celular. En algunas realizaciones, la muestra comprende células fijas. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sección de tejido. En algunas realizaciones, la lisis se realiza calentando la muestra, poniendo en contacto la muestra con un detergente o cambiando el pH de la muestra, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos con los oligo(dT)s. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos comprenden ácidos nucleicos poliadenilados. En algunas realizaciones, el método comprende además homopolímeros que forman colas de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificación en puente. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador específico de gen. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador universal. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador oligo(dT). En realizaciones sónicas, el método comprende además detectar los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la detección comprende hibridar una o más sondas con los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, una o más sondas comprenden un marcador fluorescente. En algunas realizaciones, una o más sondas pueden ser 4 sondas. En algunas realizaciones, el análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos en una micromatriz. En algunas realizaciones, las sondas comprenden oligo(dT). En algunas realizaciones, las sondas comprenden sondas específicas de genes. En algunas realizaciones, las sondas comprenden una combinación de sondas oligo(dT) y sondas específicas de genes. En algunas realizaciones, las sondas específicas de genes son específicas de genes para al menos 2 genes.

[0041] En un aspecto, la descripción proporciona un método que comprende: la formación de imágenes de una muestra en contacto con un primer sustrato que comprende una pluralidad de sondas, produciendo de este modo una imagen; lisar la muestra liberando así ácidos nucleicos de la muestra para hibridar con la pluralidad de sondas; analizar los ácidos nucleicos de la muestra en lugares del sustrato; y replicar el primer sustrato haciendo así un sustrato replicado. En algunas realizaciones, las sondas del primer sustrato comprenden oligo(dT). En algunas realizaciones, las sondas del primer sustrato comprenden cebadores específicos de genes. En algunas realizaciones, las sondas del sustrato replicado comprenden cebadores específicos de genes para otra ubicación en el mismo gen que los cebadores específicos de genes en el primer sustrato. En algunas realizaciones, la replicación comprende poner en contacto el primer sustrato con un sustrato replicado. En algunas realizaciones, la replicación comprende hibridar ácidos nucleicos del primer sustrato al sustrato replicado. En algunas realizaciones, la formación de imágenes comprende teñir la muestra. En algunas realizaciones, la tinción comprende la tinción con una tinción seleccionada del grupo que consiste en: una tinción fluorescente, una tinción negativa y una tinción de anticuerpo, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la formación de imágenes usa una técnica seleccionada del grupo que consiste en: microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía confocal y microscopía de fluorescencia. En algunas realizaciones, la realización de análisis inmunhistológico produce una imagen. En algunas realizaciones, la muestra comprende una monocapa celular. En algunas realizaciones, la muestra comprende células fijas. En algunas realizaciones, la muestra comprende una sección de tejido. En algunas realizaciones, la lisis se realiza calentando la muestra, poniendo en contacto la muestra con un detergente o cambiando el pH de la muestra, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el análisis comprende hibridar los ácidos nucleicos con los oligo(dT)s. En algunas realizaciones, el método comprende además homopolímeros que forman colas de los ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, el método comprende además amplificar los ácidos nucleicos para generar amplicones. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificación en puente. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador específico de gen. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador universal. En algunas realizaciones, la amplificación comprende amplificar con un cebador oligo(dT). En algunas realizaciones, la replicación comprende hibridar los amplicones sobre el sustrato replicado.

Definiciones

[0042] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos usados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto ordinario en la técnica en el campo a la que pertenece esta descripción.

Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ella” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Cualquier referencia a "o" en el presente documento pretende abarcar "y/o" a menos que se indique lo contrario.

[0043] Como se usa en este documento, el término "adaptador" puede significar una secuencia para facilitar la amplificación o secuenciación de ácidos nucleicos asociados. Los ácidos nucleicos asociados pueden comprender ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos asociados pueden comprender una o más de etiquetas espaciales, etiquetas de destino, etiquetas de muestra, etiquetas de indexación, códigos de barras, códigos de barras estocásticos o etiquetas moleculares. Los adaptadores pueden ser lineales. Los adaptadores pueden ser adaptadores preadenilados. Los adaptadores pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Se pueden ubicar uno o más adaptadores en el extremo 5’ o 3' de un ácido nucleico. Cuando los adaptadores comprenden secuencias conocidas en los extremos 5’ y 3', las secuencias conocidas pueden ser secuencias iguales o diferentes. Un adaptador ubicado en los extremos 5’ y/o 3' de un polinucleótido puede ser capaz de hibridar con uno o más oligonucleótidos inmovilizados en una superficie. Un adaptador puede, en algunas realizaciones, comprender una secuencia universal. Una secuencia universal puede ser una región de secuencia de nucleótidos que es común a dos o más moléculas de ácido nucleico. Las dos o más moléculas de ácido nucleico también pueden tener regiones de secuencia diferente. Así, por ejemplo, los adaptadores 5’ pueden comprender secuencias de ácido nucleico idénticas y/o universales y los adaptadores 3' pueden comprender secuencias idénticas y/o universales. Una secuencia universal que puede estar presente en diferentes miembros de una pluralidad de moléculas de ácido nucleico puede permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes usando un solo cebador universal que es complementario a la secuencia universal. De manera similar, al menos una, dos (p. ej., un par) o más secuencias universales que pueden estar presentes en diferentes miembros de una colección de moléculas de ácido nucleico pueden permitir la replicación o amplificación de múltiples secuencias diferentes usando al menos una, dos (p. ej., un par) o más cebadores universales únicos que son complementarios a las secuencias universales. Por tanto, un cebador universal incluye una secuencia que puede hibridar con dicha secuencia universal. Las moléculas portadoras de la secuencia de ácido nucleico diana pueden modificarse para unir adaptadores universales (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico no diana) a uno o ambos extremos de las diferentes secuencias de ácido nucleico diana. El uno o más cebadores universales unidos al ácido nucleico diana pueden proporcionar sitios para la hibridación de cebadores universales. El uno o más cebadores universales unidos al ácido nucleico diana pueden ser iguales o diferentes entre sí.

[0044] Tal como se utiliza aquí, el término "asociado" o "asociado con" puede significar que dos o más especies son identificables como co-situadas en un punto en el tiempo. Una asociación puede significar que dos o más especies están o estuvieron dentro de un contenedor similar. Una asociación puede ser una asociación informática, en donde, por ejemplo, se almacena información digital sobre dos o más especies y se puede utilizar para determinar que una o más de las especies se coubicaron en un momento determinado. Una asociación también puede ser una asociación física. En algunas realizaciones, dos o más especies asociadas están "atadas", "unidas" o "inmovilizadas" una a otra o a una superficie sólida o semisólida común. Una asociación puede referirse a medios covalentes o no covalentes para unir etiquetas a soportes sólidos o semisólidos tales como cuentas. Una asociación puede ser un enlace covalente entre un objetivo y una etiqueta.

[0045] Tal como se utiliza aquí, el término "complementario" puede referirse a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una posición dada de un ácido nucleico es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido de otro ácido nucleico, entonces los dos ácidos nucleicos se consideran complementarios entre sí en esa posición. La complementariedad entre dos moléculas de ácido nucleico monocatenario puede ser "parcial", en donde sólo se unen algunos de los nucleótidos, o puede ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. Se puede decir que una primera secuencia de nucleótidos es el "complemento" de una segunda secuencia si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a la segunda secuencia de nucleótidos. Se puede decir que una primera secuencia de nucleótidos es el "complemento inverso" de una segunda secuencia, si la primera secuencia de nucleótidos es complementaria a una secuencia que es inversa (es decir, el orden de los nucleótidos está invertido) de la segunda secuencia. Como se usa en este documento, los términos "complemento", "complementario" y "complemento inverso" pueden usarse indistintamente. Se entiende por la divulgación que si una molécula puede hibridar con otra molécula, puede ser el complemento de la molécula que hibrida.

[0046] Como se usa en este documento, el término "recuento digital" puede referirse a un método para estimar un número de moléculas diana en una muestra. El conteo digital puede incluir el paso de determinar una cantidad de etiquetas únicas que se han asociado con los objetivos en una muestra. Esta metodología estocástica transforma el problema de contar moléculas de localizar e identificar moléculas idénticas a una serie de preguntas digitales de sí/no con respecto a la detección de un conjunto de etiquetas predefinidas.

[0047] Como se usa en este documento, el término "etiqueta" o "etiquetas" puede referirse a los códigos de ácido nucleico asociados con una diana dentro de una muestra. Un marcador puede ser, por ejemplo, un marcador de ácido nucleico. Un marcador puede ser un marcador total o parcialmente amplificable. Un marcador puede ser un marcador total o parcialmente secuenciable. Un marcador puede ser una parte de un ácido nucleico nativo que se puede identificar como distinto. Una etiqueta puede ser una secuencia conocida. Un marcador puede comprender una unión de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, una unión de una secuencia nativa y no nativa. Como se usa en este documento, el término "etiqueta" puede usarse indistintamente con los términos "índice", "etiqueta" o "etiqueta-marca". Las etiquetas pueden transmitir información. Por ejemplo, en diversas realizaciones, las etiquetas se pueden usar para determinar la identidad de una muestra, la fuente de una muestra, la identidad de una célula y/o una diana.

[0048] Como se usa en este documento, el término "reservorios de no-agotamiento" puede referirse a un grupo de códigos de barras estocásticos hecho de muchas etiquetas diferentes. Un depósito que no se agota puede comprender un gran número de códigos de barras estocásticos diferentes de modo que cuando el depósito que no se agota está asociado con un grupo de dianas, es probable que cada diana esté asociada con un código de barras estocástico único. La unicidad de cada molécula diana marcada puede determinarse mediante las estadísticas de elección aleatoria y depende del número de copias de moléculas diana idénticas en la colección en comparación con la diversidad de marcadores. El tamaño del conjunto resultante de moléculas diana etiquetadas se puede determinar mediante la naturaleza estocástica del proceso de códigos de barras, y el análisis del número de códigos de barras estocásticos detectados permite calcular el número de moléculas diana presentes en la colección o muestra original. Cuando la relación entre el número de copias de una molécula diana presente y el número de códigos de barras estocásticos únicos es baja, las moléculas diana etiquetadas son muy únicas (es decir, existe una probabilidad muy baja de que más de una molécula diana haya sido etiquetada con una etiqueta dada).

[0049] Como se usa en este documento, un "ácido nucleico" puede en general referirse a una secuencia de polinucleótidos, o fragmento del mismo. Un ácido nucleico puede comprender nucleótidos. Un ácido nucleico puede ser exógeno o endógeno a una célula. Un ácido nucleico puede existir en un entorno sin células. Un ácido nucleico puede ser un gen o un fragmento del mismo. Un ácido nucleico puede ser ADN. Un ácido nucleico puede ser ARN. Un ácido nucleico puede comprender uno o más análogos (por ejemplo, estructura alterada, azúcar o nucleobase). Algunos ejemplos no limitantes de análogos incluyen: 5-bromouracilo, ácido peptídico nucleico, ácido xenonucleico, morfolinos, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos de glicol, ácidos nucleicos treosa, didesoxinucleótidos, cordicepina, 7-deaza-GTP, fluoróforos (por ejemplo, rodamina o fluoresceína ligada al azúcar), nucleótidos que contienen tiol, nucleótidos ligados a biotina, análogos de bases fluorescentes, islas CpG, metilo-7-guanosina, nucleótidos metilados, inosina, tiouridina, pseudouridina, dihidrouridina, queuosina y wiosina. "Ácido nucleico", "polinucleótido", "polinucleótido diana" y "ácido nucleico diana" se pueden utilizar indistintamente.

[0050] Un ácido nucleico puede comprender una o más modificaciones (por ejemplo, una modificación de base, una modificación de la cadena principal), para proporcionar el ácido nucleico con una característica nueva o mejorada (por ejemplo, estabilidad mejorada). Un ácido nucleico puede comprender una etiqueta de afinidad de ácido nucleico. Un nucleósido puede ser una combinación de base-azúcar. La porción de base del nucleósido puede ser una base heterocíclica. Las dos clases más comunes de dichas bases heterocíclicas son las purinas y las pirimidinas. Los nucleótidos pueden ser nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosil, el grupo fosfato puede estar unido al resto hidroxilo 2’, 3' o 5’ del azúcar. Al formar ácidos nucleicos, los grupos fosfato pueden unirse covalentemente nucleósidos adyacentes entre sí para formar un compuesto polimérico lineal. Los extremos respectivos de este compuesto polimérico lineal pueden unirse adicionalmente para formar un compuesto circular; sin embargo, los compuestos lineales son generalmente adecuados. Además, los compuestos lineales pueden tener complementariedad interna de bases de nucleótidos y, por lo tanto, pueden plegarse de manera que se produzca un compuesto total o parcialmente bicatenario. Dentro de los ácidos nucleicos, los grupos fosfato se pueden denominar comúnmente como formadores de la cadena principal internucleosídica del ácido nucleico. El enlace o la cadena principal puede ser un enlace fosfodiéster de 3’ a 5'.

[0051] Un ácido nucleico puede comprender una cadena principal modificada y/o enlaces internucleósido modificados. Las cadenas principales modificadas pueden incluir aquellas que retienen un átomo de fósforo en la cadena principal y aquellas que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. Cadenas principales de ácidos nucleicos modificados adecuados que contienen un átomo de fósforo en los mismos pueden incluir, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, fosfotriésteres de aminoalquilo, metilo y otro fosfonato de alquilo tal como fosfonatos de 3'-alquileno, fosfonatos de 5'-alquileno, fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-aminofosforamidato y aminoalquil fosforamidatos, fosforodamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilofosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, selenofosfatos y boranofosfatos que tienen enlaces 3’-5’ normales, análogos enlazados 2'-5' y aquellos que tienen polaridad invertida en los que uno o más enlaces internucleotídicos es un enlace 3’ a 3', 5’ a 5' o 2’ a 2'.

[0052] Un ácido nucleico puede comprender cadenas principales de polinucleótidos que se forman por alquilo de cadena corta o enlaces internucleósidos cicloalquilo, heteroátomo mixto y vínculos alquilo o internucleósido cicloalquilo, o uno o más enlaces internucleósidos de cadena más corta heteroatómico o heterocíclico. Estos pueden incluir aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la porción de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metileno formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de riboacetilo; cadenas principales que contienen alqueno; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadena principal de amida; y otros que tienen partes componentes mezcladas de N, O, S y CH2.

[0053] Un ácido nucleico puede comprender un mimético de ácido nucleico. El término "mimético" puede pretender incluir polinucleótidos en los que solo el anillo de furanosa o tanto el anillo de furanosa como el enlace internucleotídico se reemplazan con grupos que no son de furanosa, el reemplazo de solo el anillo de furanosa también se puede referir como un sustituto de azúcar. El resto de base heterocíclico o un resto de base heterocíclico modificado se puede mantener para la hibridación con un ácido nucleico diana apropiado. Uno de estos ácidos nucleicos puede ser un ácido nucleico peptídico (PNA). En un PNA, la cadena principal de azúcar de un polinucleótido se puede reemplazar con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Los nucleótidos se pueden retener y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal. La cadena principal en los compuestos de PNA puede comprender dos o más unidades de aminoetilglicina unidas que dan al PNA una cadena principal que contiene amida. Los restos de base heterocíclicos se pueden unir directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal.

[0054] Un ácido nucleico puede comprender una estructura de cadena principal de morfolino. Por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender un anillo morfolino de 6 miembros en lugar de un anillo de ribosa. En algunas de estas realizaciones, un enlace fosforodiamidato u otro enlace internucleósido que no sea fosfodiéster puede reemplazar un enlace fosfodiéster.

[0055] Un ácido nucleico puede comprender unidades de morfolino vinculadas (es decir, ácido nucleico morfolino) que tienen bases heterocíclicas unidas al anillo morfolino. Los grupos de enlace pueden unir las unidades monoméricas de morfolino en un ácido morfolino nucleico. Los compuestos oligoméricos no iónicos basados en morfolino pueden tener menos interacciones no deseadas con proteínas celulares. Los polinucleótidos basados en morfolino pueden ser imitaciones no iónicas de ácidos nucleicos. Se pueden unir una variedad de compuestos dentro de la clase de morfolino usando diferentes grupos de enlace. Una clase adicional de mimético de polinucleótidos puede denominarse ácidos ciclohexenil nucleicos (CeNA). El anillo de furanosa normalmente presente en una molécula de ácido nucleico se puede reemplazar con un anillo de ciclohexenilo. Los monómeros de fosforamidita protegidos con CeNA DMT se pueden preparar y usar para la síntesis de compuestos oligoméricos usando la química de la fosforamidita. La incorporación de monómeros de CeNA en una cadena de ácido nucleico puede aumentar la estabilidad de un híbrido de ADN/ARN. Los oligoadenilatos de CeNA pueden formar complejos con complementos de ácido nucleico con una estabilidad similar a la de los complejos nativos. Una modificación adicional puede incluir ácidos nucleicos bloqueados (LNA) en los que el grupo 2'-hidroxilo está unido al átomo de carbono 4’ del anillo de azúcar formando así un enlace 2'-C, 4'-C-oximetileno formando así un resto de azúcar bicíclico. El enlace puede ser un metileno (-CH2-), grupo que une el átomo de oxígeno 2’ y el átomo de carbono 4' en donde n es 1 o 2. Los análogos de LNA y LNA pueden mostrar estabilidades térmicas dúplex muy altas con ácido nucleico complementario (Tm = 3 a 10°C), estabilidad frente a la degradación 3'-exonucleolítica y buenas propiedades de solubilidad.

[0056] Un ácido nucleico también puede incluir nucleobase (a menudo denominado simplemente como "base") modificaciones o sustituciones. Como se usa en este documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" pueden incluir las bases de purina, (por ejemplo, adenina (A) y guanina (G)), y las bases de pirimidina, (por ejemplo, timina (T), citosina (C) y uracilo (U)). Las nucleobases modificadas pueden incluir otras nucleobases sintéticas y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5- halouracilo y citosina, 5-propinilo (-C = C-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinil de bases de pirimidina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina. Las nucleobases modificadas pueden incluir pirimidinas tricíclicas tales como fenoxazina citidina (1 H-pirimido (5,4-b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1 H-pirimido(5,4-b)(1,4)benzotiazina-2(3H)-ona), abrazaderas G como una citadina de fenoxazina sustituida (p. ej. 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido(5,4-(b)(1,4)benzoxazin-2(3H)-ona), citadina de carbazol (2H-pirimido(4,5-b)indol-2-ona), citidina de piridoindol (H-pirido(3',':4,5)pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona).

[0057] Como se usa en el presente documento, el término "muestra" puede referirse a una composición que comprende dianas. Las muestras adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen células, tejidos, órganos u organismos.

[0058] Como se usa en este documento, el término "dispositivo de muestreo" o "dispositivo" pueden referirse a un dispositivo que puede tomar una sección de una muestra y/o colocar la sección sobre un sustrato. Un dispositivo de muestra puede referirse, por ejemplo, a una máquina clasificadora de células activadas por fluorescencia (FACS), una máquina clasificadora de células, una aguja de biopsia, un dispositivo de biopsia, un dispositivo de corte de tejido, un dispositivo de microfluidos, una cuadrícula de cuchillas y/o un micrótomo.

[0059] Como se usa en este documento, el término "soporte sólido" se puede referir a las superficies sólidas o semisólidas discretas a la que una pluralidad de códigos de barras estocásticos puede estar unidos. Un soporte sólido puede abarcar cualquier tipo de esfera, bola, cojinete, cilindro sólido, poroso o hueco, u otra configuración similar compuesta de plástico, cerámica, metal o material polimérico (por ejemplo, hidrogel) sobre el que se puede inmovilizar un ácido nucleico. (por ejemplo, de forma covalente o no covalente). Un soporte sólido puede comprender una partícula discreta que puede ser esférica (por ejemplo, microesferas) o tener una forma irregular o no esférica, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o en forma de disco, y similares. Puede usarse un soporte sólido de manera intercambiable con el término "perla". Un soporte sólido puede referirse a un "sustrato". Un sustrato puede ser un tipo de soporte sólido. Un sustrato puede referirse a una superficie sólida o semisólida continua sobre la que se pueden realizar los métodos de la divulgación. Un sustrato puede referirse a una matriz, un cartucho, un chip, un dispositivo y un portaobjetos, por ejemplo. Como se usa en este documento, "soporte sólido" y "sustrato" se usan a veces de manera intercambiable.

[0060] Tal como se utiliza aquí, el término "etiqueta espacial" puede referirse a una etiqueta que puede estar asociada con una posición en el espacio.

[0061] Como se usa en este documento, el término "código de barras estocástico" puede referirse a una secuencia de polinucleótido que comprende etiquetas. Un código de barras estocástico puede ser una secuencia de polinucleótidos que se puede utilizar para el etiquetado estocástico. Los códigos de barras estocásticos se pueden utilizar para cuantificar dianas dentro de una muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden usar para controlar los errores que pueden ocurrir después de que una etiqueta se asocia con una diana. Por ejemplo, se puede utilizar un código de barras estocástico para evaluar errores de secuenciación o amplificación. Un código de barras estocástico asociado con una diana puede denominarse diana de código de barras estocástico o diana de etiqueta de código de barras estocástico.

[0062] Como se usa en este documento, el término "código de barras estocástico" puede referirse al etiquetado aleatorio (por ejemplo, códigos de barras) de ácidos nucleicos. El código de barras estocástico puede utilizar una estrategia de Poisson recursiva para asociar y cuantificar etiquetas asociadas con dianas.

[0063] Tal como se utiliza aquí, el término "diana" puede referirse a una composición que puede estar asociada con un código de barras estocástico. Los ejemplos de dianas adecuadas para el análisis mediante los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen oligonucleótidos, ADN, ARN, ARNm, microARN, ARNt y similares. Las dianas pueden ser monocatenarias o bicatenarias. En algunas realizaciones, las dianas pueden ser proteínas. En algunas realizaciones, las dianas son lípidos.

[0064] Como se usa en este documento, el término "transcriptasas inversas" puede referirse a un grupo de enzimas que tienen actividad de transcriptasa inversa (es decir, que la síntesis catalizadora de ADN a partir de una plantilla de ARN). En general, tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, transcriptasa inversa retroviral, transcriptasa inversa retrotransposón, transcriptasas inversas retroplasmidas, transcriptasas inversas retron, transcriptasas inversas bacterianas, transcriptasa inversa derivada de intrones del grupo II y mutantes, variantes o derivados de las mismas. Las transcriptasas inversas no retrovirales incluyen transcriptasas inversas de retrotransposón no LTR, transcriptasas inversas de retroplasmido, transciptasas inversas de retrón y transcriptasas inversas de intrón del grupo II. Los ejemplos de transcriptasas inversas de intrones del grupo II incluyen la transcriptasa inversa del intrón LI.LtrB de Lactococcus lactis, la transcriptasa inversa del intrón Thermosynechococcus alarga la transcriptasa inversa del intrón TeI4c o la transcriptasa inversa del intrón Geobacillus stearothermophilus Gsl-IIC. Otras clases de transcriptasas inversas pueden incluir muchas clases de transcriptasas inversas no retrovirales (es decir, retrones, intrones del grupo II y retroelementos que generan diversidad, entre otros).

[0065] Como se usa en este documento, el término "plantilla de conmutación" puede referirse a la capacidad de una transcriptasa inversa para cambiar de una plantilla de secuencia de ácido nucleico inicial al extremo 3' final de una nueva plantilla de secuencia de ácido que tiene poco nucleico o ninguna complementariedad al extremo 3’ del ácido nucleico sintetizado a partir de la plantilla inicial. Se pueden hacer copias de ácido nucleico de un polinucleótido diana usando cambio de plantilla. El cambio de plantilla permite, por ejemplo, preparar una copia de ADN utilizando una transcriptasa inversa que cambia de una plantilla de secuencia de ácido nucleico inicial al extremo 3’ de una nueva plantilla de secuencia de ácido nucleico que tiene poca o ninguna complementariedad con el extremo 3' del ADN. sintetizado a partir de la plantilla inicial, lo que permite la síntesis de un producto de ADN continuo que une directamente una secuencia adaptadora a una secuencia de oligonucleótidos diana sin ligación. El cambio de molde puede comprender la ligadura de un adaptador, una cola de homopolímero (por ejemplo, poliadenilación), un cebador aleatorio o un oligonucleótido con el que la polimerasa puede asociarse.

Códigos de barras estocásticos con etiquetas espaciales y etiquetas de dimensión

[0066] Se describen aquí métodos, composiciones, dispositivos, sistemas y kits para códigos de barras estocásticos espaciales. Algunas realizaciones divulgadas en el presente documento proporcionan métodos que determinan el número y las ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. Los métodos incluyen, en algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos incluye una etiqueta espacial y una etiqueta molecular; estimando el número de cada una de la pluralidad de dianas usando el marcador molecular; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial. En algunas realizaciones, el método puede multiplexarse. La muestra puede comprender una pluralidad de células y la pluralidad de dianas puede asociarse con la pluralidad de células.

[0067] Se describe aquí los métodos para determinar las ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra en uno o más puntos de tiempo usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial. Codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra en diferentes puntos de tiempo usando la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir una etiqueta de dimensión, y las etiquetas de dimensión de la pluralidad de códigos de barras estocásticos utilizados para codificar barras estocásticas de la pluralidad de dianas en los diferentes puntos de tiempo pueden ser diferentes. Las etiquetas de dimensión pueden correlacionarse con los diferentes puntos de tiempo.

[0068] El código de barras estocástico espacial puede referirse al código de barras estocástico de una pluralidad de moléculas diana en células individuales para determinar la orientación espacial de las moléculas diana. Como se muestra en la Figura 1, la divulgación proporciona un método para correlacionar información en el espacio físico real con información en el espacio químico Una muestra que comprende una muestra bidimensional o tridimensional (por ejemplo, una célula) 105 se puede dividir en múltiples secciones, por ejemplo 110/111/112/113. En algunas realizaciones, las secciones 110/111/112/113 pueden dividirse físicamente y luego dividirse químicamente basándose en la división física. En algunas realizaciones, las secciones 110/111/112/113 se pueden dividir químicamente sin división física. En algunas realizaciones, las secciones 110/111/112/113 se pueden separar físicamente 115 de la muestra 105. Cada sección 110/111/112/113 se puede colocar en un recipiente separado 120 sobre un sustrato 125.

Las secciones 110/111/112/113 en el sustrato 125 puede estar sujeto a códigos de barras estocásticos. El código de barras estocástico puede comprender etiquetar distintas dianas en cada sección 110/111/112/113 con un código de barras diferente. En algunas realizaciones, el código de barras diferente comprende una etiqueta espacial. Las secciones pueden etiquetarse estocásticamente, amplificarse y/o contarse digitalmente, en donde el número de dianas distintas puede estimarse a partir del conteo digital de diferentes códigos de barras. La información en la etiqueta espacial de los diferentes códigos de barras puede corresponder a una ubicación en la muestra 105. De esta manera, el método puede usarse para determinar el número de dianas distintas en una muestra 105 en ubicaciones físicas distintas.

[0069] Los métodos, dispositivos y sistemas descritos aquí se pueden usar para una variedad de aplicaciones en básico de investigación, la investigación biomédica, pruebas ambientales, y diagnósticos clínicos. Ejemplos de aplicaciones para los dispositivos y sistemas de métodos descritos incluyen, pero no se limitan a, genotipado, perfil de expresión génica, detección e identificación de células raras, diagnóstico de una enfermedad o condición, determinación del pronóstico de una enfermedad o condición, determinación de un curso de tratamiento de una enfermedad o afección, y seguimiento de la respuesta al tratamiento de una enfermedad o afección, y comprensión de los procesos de desarrollo biológico. Por ejemplo, los métodos de la divulgación pueden usarse para análisis de transcriptoma completo, análisis de células raras (p. ej., células tumorales circulantes), análisis de terapia de células T del receptor de antígeno quimérico (CAR-T) (p. ej., determinación de células específicas que responden a CART). terapia versus no respondedores) y neurociencia (por ejemplo, terapias y diagnósticos para, por ejemplo, autismo, esquizofrenia, trastorno bipolar, enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer). En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir tratar al sujeto. El tratamiento del sujeto puede incluir la administración de un fármaco al sujeto.

[0070] Un código de barras estocástico puede referirse a una secuencia de polinucleótidos que puede ser utilizada para etiquetar estocásticamente (por ejemplo, código de barras, etiqueta) una diana. Un código de barras estocástico puede comprender una o más etiquetas. Las etiquetas ejemplares pueden incluir una etiqueta universal, una etiqueta celular, una etiqueta molecular, una etiqueta de muestra, una etiqueta de placa, una etiqueta espacial y/o una etiqueta preespacial. La figura 2 ilustra un código de barras estocástico ejemplar con una etiqueta espacial de la divulgación. Un código de barras estocástico 204 puede comprender una amina 5’ que puede unir el código de barras estocástico a un soporte sólido 205. El código de barras estocástico puede comprender una etiqueta universal, una etiqueta de dimensión, una etiqueta espacial, una etiqueta celular y/o una etiqueta molecular. La etiqueta universal puede ser la etiqueta más de 5’. El marcador molecular puede ser el marcador más 3’. La etiqueta espacial, la etiqueta de dimensión y la etiqueta celular pueden estar en cualquier orden. En algunas realizaciones, la etiqueta universal, la etiqueta espacial, la etiqueta de dimensión, la etiqueta celular y la etiqueta molecular están en cualquier orden. El código de barras estocástico puede comprender una región de unión a la diana. La región de unión a la diana puede interactuar con una diana en una muestra. La diana puede ser, o comprender, ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajero (ARNm), microARN, ARN de interferencia pequeños (ARNip), productos de degradación del ARN, ARN que comprenden cada uno una cola poli(A) y cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la pluralidad de dianas puede incluir ácidos desoxirribonucleicos (ADN).

[0071] Por ejemplo, una región de unión a la diana puede comprender una secuencia de oligo(dT) que puede interactuar con colas de poli(A) de mARNs. En algunas realizaciones, las etiquetas del código de barras estocástico (por ejemplo, etiqueta universal, etiqueta de dimensión, etiqueta espacial, etiqueta celular y etiqueta molecular) pueden estar separadas por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos.

[0072] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra incluye la hibridación de la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de dianas para generar dianas estocásticamente con códigos de barras, y al menos una de la pluralidad de dianas se hibrida a uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Una parte o la totalidad de la pluralidad de dianas se pueden hibridar con la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cada una de la pluralidad de dianas se hibrida con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, cada uno de al menos dos, tres, cuatro, cinco, diez, veinte, cincuenta, cien o mil de la pluralidad de dianas se hibrida con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Un código de barras estocástico puede comprender una o más etiquetas universales. Una o más etiquetas universales pueden ser las mismas para todos los códigos de barras estocásticos en el conjunto de códigos de barras estocásticos adjuntos a un soporte sólido dado. En algunas realizaciones, una o más etiquetas universales pueden ser las mismas para todos los códigos de barras estocásticos unidos a una pluralidad de cuentas. En algunas realizaciones, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación. Cebadores de secuenciación se pueden utilizar para la secuenciación de los códigos de barras estocásticos que comprende un marcador universal de cebadores de secuenciación (por ejemplo, cebadores de secuenciación universales) puede comprender de secuenciación de cebadores asociados con alto rendimiento de secuenciación de plataformas. En algunas realizaciones, un marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con un cebador de PCR. En algunas realizaciones, el marcador universal puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación y un cebador de PCR. La secuencia de ácido nucleico del marcador universal que es capaz de hibridar con un cebador de secuenciación o PCR puede denominarse sitio de unión del cebador. Una etiqueta universal puede comprender una secuencia que se puede utilizar para iniciar la transcripción del código de barras estocástico. Una etiqueta universal puede comprender una secuencia que se puede utilizar para la extensión del código de barras estocástico o una región dentro del código de barras estocástico. Un marcador universal puede tener al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador universal puede comprender al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Un marcador universal puede tener como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, un enlazador escindible o un nucleótido modificado puede ser parte de la secuencia de marcaje universal para permitir que el código de barras estocástico sea escindido del soporte.

[0073] Un código de barras estocástico puede comprender una etiqueta de dimensión. Una etiqueta de dimensión puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre una dimensión en donde se produjo el etiquetado estocástico. Por ejemplo, una etiqueta de dimensión puede proporcionar información sobre el momento en donde una diana fue codificada estocásticamente con barras. Una etiqueta de dimensión se puede asociar con un tiempo de código de barras estocástico en una muestra. Se puede activar una etiqueta de dimensión en el momento del etiquetado estocástico. Se pueden activar etiquetas de diferentes dimensiones en diferentes momentos. La etiqueta de dimensión proporciona información sobre el orden en donde las dianas, grupos de dianas y/o muestras se codificaron estocásticamente con barras. Por ejemplo, una población de células puede tener un código de barras estocásticamente en la fase G0 del ciclo celular. Las células pueden volver a pulsarse con códigos de barras estocásticos en la fase G1 del ciclo celular. Las células pueden volver a pulsarse con códigos de barras estocásticos en la fase S del ciclo celular, y así sucesivamente. Los códigos de barras estocásticos en cada pulso (por ejemplo, cada fase del ciclo celular) pueden comprender etiquetas de diferentes dimensiones. De esta manera, la etiqueta de dimensión proporciona información sobre qué dianas se etiquetaron en qué fase del ciclo celular. Las etiquetas de dimensión pueden interrogar muchos tiempos biológicos diferentes. Los tiempos biológicos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan al ciclo celular, la transcripción (por ejemplo, el inicio de la transcripción) y la degradación de la transcripción. En otro ejemplo, una muestra (por ejemplo, una célula, una población de células) se puede marcar estocásticamente antes y/o después del tratamiento con un fármaco y/o terapia. Los cambios en el número de copias de distintas dianas pueden ser indicativos de la respuesta de la muestra al fármaco y/o la terapia.

[0074] Una etiqueta de dimensión puede ser activable. Una etiqueta de dimensión activable se puede activar en un momento específico. La etiqueta activable puede, por ejemplo, activarse constitutivamente (por ejemplo, no apagarse). La etiqueta de dimensión activable puede activarse, por ejemplo, de forma reversible (por ejemplo, la etiqueta de dimensión activable se puede encender y apagar). La etiqueta de dimensión puede ser, por ejemplo, activable de forma reversible al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. La etiqueta de dimensión puede activarse de forma reversible, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. En algunas realizaciones, el marcador de dimensión se puede activar con fluorescencia, luz, un evento químico (p. ej., escisión, ligación de otra molécula, adición de modificaciones (p. ej., pegilado, sumoilado, acetilado, metilado, desacetilado, desmetilado), un evento fotoquímico (por ejemplo, photocaging), y la introducción de un nucleótido no natural.

[0075] La etiqueta de dimensión puede, en algunas realizaciones, ser idéntica para todos los códigos de barras estocásticos unidos a un soporte sólido dado (por ejemplo, cuenta), pero diferente para diferentes soportes sólidos (por ejemplo, cuentas). En algunas realizaciones, al menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% de códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la etiqueta de la misma dimensión. En algunas realizaciones, al menos el 60% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de dimensión. En algunas realizaciones, al menos el 95% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta de dimensión.

[0076] No puede haber tantos como 106 o secuencias de etiquetas de dimensión más únicas representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, cuentas). Una etiqueta de dimensión puede tener al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una etiqueta de dimensión puede ser como máximo de aproximadamente 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos o más nucleótidos de longitud. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Una etiqueta de dimensión puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.

[0077] Un código de barras estocástico puede comprender una etiqueta espacial. Una etiqueta espacial puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información sobre la orientación espacial de una molécula diana que está asociada con el código de barras estocástico. Una etiqueta espacial se puede asociar con una coordenada en una muestra. La coordenada puede ser una coordenada fija. Por ejemplo, se puede fijar una coordenada en referencia a un sustrato. Una etiqueta espacial puede hacer referencia a una cuadrícula de dos o tres dimensiones. Se puede fijar una coordenada en referencia a un punto de referencia. El hito puede identificarse en el espacio. Un hito puede ser una estructura de la que se puede crear una imagen. Un hito puede ser una estructura biológica, por ejemplo, un hito anatómico. Un hito puede ser un hito celular, por ejemplo, un orgánulo. Un hito puede ser un hito no natural, como una estructura con un identificador identificable, como un código de color, código de barras, propiedad magnética, fluorescentes, radiactividad o un tamaño o forma únicos. Una etiqueta espacial se puede asociar con una partición física (por ejemplo, un pozo, un recipiente o una gota). En algunas realizaciones, se utilizan múltiples etiquetas espaciales juntas para codificar una o más posiciones en el espacio.

[0078] La etiqueta espacial puede ser idéntica para todos los códigos de barras estocásticos unidos a un soporte sólido dado (por ejemplo, cuenta), pero diferente para diferentes soportes sólidos (por ejemplo, cuentas). En algunas realizaciones, al menos el 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% o 100% de códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial. En algunas realizaciones, al menos el 60% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial. En algunas realizaciones, al menos el 95% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta espacial.

[0079] No puede haber hasta 106 o más únicas secuencias de etiqueta espaciales representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, cuentas). Una etiqueta espacial puede tener al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una etiqueta espacial puede ser como máximo alrededor de 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos o más nucleótidos de longitud. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Una etiqueta espacial puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.

[0080] Códigos de barras estocásticos pueden comprender un marcador celular. Un marcador celular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información para determinar qué ácido nucleico diana se originó a partir de qué célula. En algunas realizaciones, la etiqueta celular es idéntica para todos los códigos de barras estocásticos unidos a un soporte sólido dado (p. ej., cuenta), pero diferente para diferentes soportes sólidos (p. ej., cuentas). En algunas realizaciones, al menos 60%, 70%, 80%, 85%), 90%, 95%), 97%, 99% o 100% de códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta celular En algunas realizaciones, al menos el 60% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta celular. En alguna realización, al menos el 95% de los códigos de barras estocásticos en el mismo soporte sólido pueden comprender la misma etiqueta celular.

[0081] No puede haber hasta 106 o más únicas secuencias de etiquetas celulares representadas en una pluralidad de soportes sólidos (por ejemplo, cuentas). Un marcador celular puede tener al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una etiqueta celular puede ser como máximo alrededor de 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos o más nucleótidos de longitud. Un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nucleótidos. Un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 10 y aproximadamente 150 nucleótidos. Un marcador celular puede comprender entre aproximadamente 20 y aproximadamente 125 nucleótidos de longitud.

[0082] La etiqueta celular puede comprender además un único conjunto de subsecuencias de ácido nucleico de longitud definida, por ejemplo, 7 nucleótidos cada uno (equivalente al número de bits utilizados en algunos códigos de corrección de error de Hamming), que puede ser diseñado para proporcionar la capacidad de corrección de errores. El conjunto de subsecuencias de corrección de errores comprende 7 secuencias de nucleótidos que pueden diseñarse de manera que cualquier combinación de secuencias por pares en el conjunto exhiba una "distancia genética" definida (o número de bases no emparejadas), por ejemplo, un conjunto de subsecuencias de corrección de errores. Las secuencias se pueden diseñar para que presenten una distancia genética de 3 nucleótidos. En este caso, la revisión de las secuencias de corrección de errores en el conjunto de datos de secuencia para moléculas de ácido nucleico diana marcadas (descritas más detalladamente a continuación) puede permitir detectar o corregir errores de secuenciación o amplificación. En algunas realizaciones, la longitud de las subsecuencias de ácido nucleico utilizadas para crear códigos de corrección de errores puede variar, por ejemplo, pueden tener una longitud de 3 nucleótidos, 7 nucleótidos, 15 nucleótidos o 31 nucleótidos. En algunas realizaciones, se pueden usar subsecuencias de ácidos nucleicos de otras longitudes para crear códigos de corrección de errores.

[0083] En algunas realizaciones, los códigos de barras estocásticos pueden comprender un marcador molecular. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona información de identificación para el tipo específico de especie de ácido nucleico diana hibridada con el código de barras estocástico. Un marcador molecular puede comprender una secuencia de ácido nucleico que proporciona un contador para la aparición específica de la especie de ácido nucleico diana hibridada con el código de barras estocástico (por ejemplo, región de unión a la diana). En algunas realizaciones, un conjunto diverso de marcadores moleculares se une a un soporte sólido dado (por ejemplo, una cuenta). En algunas realizaciones, puede haber como mucho 105 o más únicas secuencias de etiquetas moleculares unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, cuenta). En algunas formas de realización, no puede haber tanto como 104 o más únicas secuencias de etiquetas moleculares unidas a un determinado soporte sólido (por ejemplo, cuenta). En algunas realizaciones, no puede haber tanto como 103 o más secuencias de etiquetas moleculares únicas unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, cuenta). En algunas realizaciones, puede haber tanto como 102 o más únicas secuencias de etiquetas moleculares unidas a un soporte sólido dado (por ejemplo, cuenta). Un marcador molecular puede ser al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Un marcador molecular puede tener como máximo alrededor de 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o menos nucleótidos de longitud.

[0084] Códigos de barras estocásticos pueden comprender una región de unión de dianas. En algunas realizaciones, las regiones de unión a la diana pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que hibrida específicamente con una diana (por ejemplo, ácido nucleico diana, molécula diana, por ejemplo, un ácido nucleico celular a analizar), por ejemplo con una secuencia genética específica. En algunas realizaciones, una región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que puede unirse (por ejemplo, hibridar) a una ubicación específica de un ácido nucleico diana específico. En algunas realizaciones, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridación específica con un saliente del sitio de la enzima de restricción (por ejemplo, un saliente del extremo pegajoso EcoRI). El código de barras estocástico puede entonces ligarse a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción.

[0085] En algunas realizaciones, una región diana de unión puede comprender una secuencia de ácido nucleico no específica. Una secuencia de ácido nucleico diana no específica puede referirse a una secuencia que puede unirse a múltiples ácidos nucleicos diana, independientemente de la secuencia específica del ácido nucleico diana. Por ejemplo, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia multimérica aleatoria o una secuencia oligodT que se hibrida con la cola de poli(A) en moléculas de ARNm. Una secuencia aleatoria de multímeros puede ser, por ejemplo, una secuencia aleatoria de dímeros, trímeros, cuatrámeros, pentámeros, hexámeros, septámeros, octámeros, nonámeros, decámeros o multímeros superiores de cualquier longitud. En algunas realizaciones, la región de unión de destino es la misma para todos los códigos de barras estocásticos adjuntos a una cuenta determinada. En algunas realizaciones, las regiones de unión a la diana para la pluralidad de códigos de barras estocásticos unidos a una cuenta dada pueden comprender dos o más secuencias de unión a la diana diferentes. Una región de unión a la diana puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud. Una región de unión a la diana puede tener como máximo aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más nucleótidos de longitud.

[0086] Un código de barras estocástico puede comprender una propiedad de orientación que puede ser utilizada para orientar (por ejemplo, alineación) los códigos de barras estocásticos. Un código de barras estocástico puede comprender un resto para el enfoque isoeléctrico. Los diferentes códigos de barras estocásticos pueden comprender diferentes puntos de enfoque isoeléctrico. Cuando estos códigos de barras estocásticos se introducen en una muestra, la muestra puede someterse a un enfoque isoeléctrico para orientar los códigos de barras estocásticos de una manera conocida. De esta manera, la propiedad de orientación se puede utilizar para desarrollar un mapa conocido de códigos de barras estocásticos en una muestra. Las propiedades de orientación ejemplares pueden incluir movilidad electroforética (por ejemplo, basada en el tamaño del código de barras estocástico), punto isoeléctrico, giro, conductividad y/o autoensamblaje. Por ejemplo, los códigos de barras estocásticos con una propiedad de orientación de autoensamblaje, pueden autoensamblarse en una orientación específica (por ejemplo, nanoestructura de ácido nucleico) tras la activación.

[0087] Un código de barras estocástico puede comprender una propiedad de afinidad. Una etiqueta espacial puede comprender una propiedad de afinidad. Una propiedad de afinidad puede incluir un resto químico y/o biológico que puede facilitar la unión del código de barras estocástico a otra entidad (por ejemplo, receptor celular). Por ejemplo, una propiedad de afinidad puede comprender un anticuerpo. Un anticuerpo puede ser específico para un resto específico (por ejemplo, receptor) en una muestra. Un anticuerpo puede guiar el código de barras estocástico a un tipo de célula o molécula específica. Las dianas en y/o cerca del tipo de célula o molécula específicos pueden marcarse estocásticamente. Una propiedad de afinidad también puede proporcionar información espacial además de la secuencia de nucleótidos de la etiqueta espacial porque el anticuerpo puede guiar el código de barras estocástico a una ubicación específica. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal. Se puede humanizar un anticuerpo. Un anticuerpo puede ser quimérico. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo de fusión.

[0088] Un anticuerpo, puede referirse a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada por inmunoglobulina normal de procesos recombinatorios de fragmentos génicos) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una porción inmunológicamente activa (es decir, unirse específicamente) de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.

[0089] Un anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo puede ser una porción de un anticuerpo tal como F(ab')², Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Un fragmento de anticuerpo puede unirse con el mismo antígeno que reconoce el anticuerpo de longitud completa. Un fragmento de anticuerpo puede incluir fragmentos aislados que consisten en las regiones variables de los anticuerpos, tales como los fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas de polipéptido monocatenario recombinantes en las que las regiones variables ligeras y pesadas están conectadas por un enlazador peptídico ("proteínas scFv"). Los anticuerpos ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos para anticuerpos para células cancerosas, anticuerpos para virus, anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular (CD8, CD34, CD45) y anticuerpos terapéuticos.

Soportes sólidos

[0090] Los códigos de barras estocásticos descritos en este documento se pueden asociar a (por ejemplo, unirse a) un soporte sólido (por ejemplo, una cuenta). En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra se puede realizar con un soporte sólido que incluye una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede incluir una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Las etiquetas espaciales de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en diferentes soportes sólidos pueden diferir en al menos un nucleótido. El soporte sólido puede incluir, por ejemplo, la pluralidad de códigos de barras estocásticos en dos o tres dimensiones. Las partículas sintéticas pueden ser cuentas. Las cuentas pueden ser cuentas de gel de sílice, cuentas de vidrio de poro controlado, cuentas magnéticas, cuentas de Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa, cuentas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas. El soporte sólido puede incluir un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los puertos de soporte sólidos pueden flotar libremente. En algunas realizaciones, los soportes sólidos se pueden incrustar en una matriz semisólida o sólida. Los códigos de barras estocásticos pueden no estar asociados a soportes sólidos. Los códigos de barras estocásticos pueden ser nucleótidos individuales. Los códigos de barras estocásticos se pueden asociar a un sustrato.

[0091] Como se usa en este documento, los términos "atado", "unido", y "inmovilizado" se utilizan indistintamente, y se puede referir a medios covalentes o no covalentes para unir los códigos de barras estocásticos a un soporte sólido. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de diferentes soportes sólidos como soportes sólidos para adjuntar códigos de barras estocásticos presintetizados o para la síntesis en fase sólida in situ de códigos de barras estocásticos.

[0092] En algunas realizaciones, un soporte sólido es una cuenta. Una cuenta puede abarcar uno o más tipos de esferas, bolas, cojinetes, cilindros sólidos, porosos o huecos u otra configuración similar en donde se pueda inmovilizar un ácido nucleico (por ejemplo, covalentemente o no covalentemente). La cuenta puede estar compuesta, por ejemplo, de plástico, cerámica, metal, material polimérico o cualquier combinación de los mismos. Una cuenta puede ser, o comprender, una partícula discreta que es esférica (por ejemplo, microesferas) o que tiene una forma no esférica o irregular, como cúbica, cuboide, piramidal, cilíndrica, cónica, oblonga o en forma de disco, y similares. En algunas realizaciones, una cuenta puede tener forma no esférica.

[0093] Las cuentas pueden comprender una variedad de materiales que incluyen, entre otros, materiales paramagnéticos (por ejemplo, magnesio, molibdeno, litio y tantalio), materiales superparamagnéticos (por ejemplo, nanopartículas de ferrita (Fe3O4; magnetita), materiales ferromagnéticos (por ejemplo, hierro, níquel, cobalto, algunas aleaciones de los mismos y algunos compuestos de metales de tierras raras), cerámica, plástico, vidrio, poliestireno, sílice, metilestireno, polímeros acrílicos, titanio, látex, sefarosa, agarosa, hidrogel, polímero, celulosa, nailon, y cualquier combinación de los mismos.

[0094] El diámetro de las cuentas puede variar, por ejemplo, ser al menos aproximadamente 100 nm, 500 nm, 1 pm, 5 pm, 101 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 35 pm, 40 pm, 45 pm o 50 pm. En algunas realizaciones, el diámetro de las cuentas puede ser como máximo de aproximadamente 100 nm, 500 nm, 1 pm, 5 pm, 10 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 35 pm, 40 pm, 45 pm o 50 pm. En algunas realizaciones, el diámetro de la cuenta puede estar relacionado con el diámetro de los pocillos del sustrato. Por ejemplo, el diámetro de la cuenta puede ser al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% más largo o más corto que el diámetro del pozo. En algunas realizaciones, el diámetro de la cuenta puede ser como máximo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% más largo o más corto que el diámetro del pocillo. El diámetro de la cuenta se puede relacionar con el diámetro de una célula (por ejemplo, una sola célula atrapada por un pocillo del sustrato). El diámetro del cordón puede ser de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250% o 300% o más largo o más corto que el diámetro de la célula. El diámetro del cordón puede ser como máximo 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250% o 300% o más largo o más corto que el diámetro de la célula.

[0095] Una cuenta se puede unir a y/o incrustar en un sustrato. Una cuenta se puede unir y/o incrustar en un gel, hidrogel, polímero y/o matriz. La posición espacial de una cuenta dentro de un sustrato (por ejemplo, gel, matriz, andamio o polímero) puede identificarse usando la etiqueta espacial presente en el código de barras estocástico en la cuenta que puede servir como dirección de ubicación.

[0096] Los ejemplos de cuentas pueden incluir, pero no se limitan a, cuentas de estreptavidina, cuentas de agarosa, cuentas magnéticas, Dynabeads®, microcuentas MACS®, cuentas conjugadas con anticuerpos (por ejemplo, microcuentas anti-inmunoglobulina), cuentas conjugadas con proteína A, cuentas conjugadas con proteína G, cuentas conjugadas con proteína A/G, cuentas conjugadas con proteína L, cuentas conjugadas con oligo(dT), cuentas de sílice, cuentas similares a sílice, microcuentas de anti-biotina, microcuentas de antifluorocromo y cuentas magnéticas con terminación carboxilo ScMag™.

[0097] Una cuenta puede asociarse con (por ejemplo, impregnarse con) los puntos cuánticos o colorantes fluorescentes para que sea fluorescente en el canal óptico de uno de fluorescencia o múltiples canales ópticos. Una cuenta se puede asociar con óxido de hierro u óxido de cromo para hacerla paramagnética o ferromagnética. Las cuentas pueden ser identificables. Por ejemplo, se puede obtener una imagen de una cuenta con una cámara. Una cuenta puede tener un código detectable asociado con la cuenta. Por ejemplo, una cuenta puede comprender un código de barras estocástico. Una cuenta puede cambiar de tamaño, por ejemplo, debido al hinchamiento en una solución orgánica o inorgánica. Una cuenta puede ser hidrofóbica. Una cuenta puede ser hidrofílica. Una cuenta puede ser biocompatible.

[0098] Un soporte sólido (por ejemplo, cuenta) puede visualizarse. El soporte sólido puede comprender una etiqueta de visualización (por ejemplo, tinte fluorescente). Un soporte sólido (por ejemplo, una cuenta) se puede grabar con un identificador (por ejemplo, un número). El identificador se puede visualizar mediante la formación de imágenes de las cuentas.

[0099] Un soporte sólido puede referirse a un material insoluble, semisoluble, o insoluble. Un soporte sólido puede denominarse ''funcionalizado'' cuando incluye un enlazador, un andamio, un bloque de construcción u otro resto reactivo unido al mismo, mientras que un soporte sólido puede estar "no funcionalizado" cuando carece de dicho resto reactivo unido al mismo. El soporte sólido puede emplearse libre en solución, tal como en un formato de pocillo de microtitulación; en un formato de flujo continuo, como en una columna; o en una varilla de nivel.

[0100] El soporte sólido puede comprender una membrana, papel, plástico, superficie recubierta, superficie plana, vidrio, portaobjetos, chips, o cualquier combinación de los mismos. Un soporte sólido puede tomar la forma de resinas, geles, microesferas u otras configuraciones geométricas. Un soporte sólido puede comprender chips de sílice, partículas sintéticas, nanopartículas, placas y matrices. Los soportes sólidos pueden incluir cuentas (p. ej., gel de sílice, vidrio de poro controlado, cuentas magnéticas, Dynabeads, resina Wang; resina Merrifield, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa, cuentas de poliestireno, etc.), capilares, soportes planos como filtros de fibra de vidrio, superficies de vidrio, superficies metálicas (acero, plata dorada, aluminio, silicio y cobre), soportes de vidrio, soportes de plástico, soportes de silicona, chips, filtros, membranas, placas de micropocillos, portaobjetos o los materiales plásticos similares que incluyen placas o membranas multipocillo (por ejemplo, formadas de polietileno, polipropileno, poliamida, difluoruro de polivinilideno), obleas, peines, alfileres o agujas (por ejemplo, matrices de alfileres adecuados para síntesis combinatoria o análisis) o cuentas en una serie de hoyos o pozos de nanolitros de superficies planas como obleas (por ejemplo, obleas de silicio), obleas con hoyos con o sin fondos de filtro.

[0101] En algunas realizaciones códigos de barras estocásticos de la divulgación pueden estar unidos a una matriz de polímero (por ejemplo, gel, hidrogel). La matriz de polímero puede penetrar el espacio intracelular (por ejemplo, alrededor de orgánulos). La matriz polimérica se puede bombear por todo el sistema circulatorio.

[0102] Un soporte sólido puede ser una molécula biológica. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser un ácido nucleico, una proteína, un anticuerpo, una histona, un compartimento celular, un lípido, un carbohidrato y similares. Los soportes sólidos que son moléculas biológicas pueden amplificarse, traducirse, transcribirse, degradarse y/o modificarse (p. ej., pegilar, sumoilar). Un soporte sólido que es una molécula biológica puede proporcionar información espacial y temporal además de la etiqueta espacial que se adjunta a la molécula biológica. Por ejemplo, una molécula biológica puede comprender una primera confirmación cuando no se modifica, pero puede cambiar a una segunda confirmación cuando se modifica. Las diferentes conformaciones pueden exponer los códigos de barras estocásticos de la divulgación a las dianas. Por ejemplo, una molécula biológica puede comprender códigos de barras estocásticos que son inaccesibles debido al plegamiento de la molécula biológica. Tras la modificación de la molécula biológica (por ejemplo, acetilación), la molécula biológica puede cambiar de conformación para exponer los marcadores estocásticos. El momento de la modificación puede proporcionar otra dimensión de tiempo al método de código de barras estocástico de la divulgación.

[0103] En otro ejemplo, la molécula biológica que comprende códigos de barras estocásticos de la divulgación puede ser localizada en el citoplasma de una célula. Tras la activación, la molécula biológica puede moverse al núcleo, después de lo cual puede tener lugar el código de barras estocástico. De esta manera, la modificación de la molécula biológica puede codificar información adicional de espacio-tiempo para las dianas identificadas por los códigos de barras estocásticos.

[0104] Una etiqueta de dimensión puede proporcionar información sobre el espacio-tiempo de un evento biológico (por ejemplo, división celular). Por ejemplo, se puede agregar una etiqueta de dimensión a una primera célula, la primera célula se puede dividir generando una segunda célula hija, la segunda célula hija puede comprender todas, algunas o ninguna de las etiquetas de dimensión. Las etiquetas de dimensión se pueden activar en la célula original y la célula hija. De esta manera, la etiqueta de dimensión puede proporcionar información sobre el tiempo del código de barras estocástico en distintos espacios.

Micromatrices

[0105] En algunas realizaciones, un soporte/sustrato sólido puede referirse a una micromatriz. Una micromatriz puede comprender una pluralidad de polímeros, por ejemplo, oligómeros, sintetizados in situ o pre-sintetizados y depositados sobre un sustrato en un patrón de matriz. Las micromatrices de oligómeros fabricados mediante síntesis de ADN en fase sólida pueden tener densidades de oligómeros que se acercan a 106/micrón2. Como se usa en el presente documento, los oligómeros unidos al soporte pueden denominarse "sondas", que funcionan para unirse o hibridar con una muestra de material de ADN o ARN sometido a prueba. Sin embargo, los términos pueden usarse indistintamente en los que los oligonucleótidos unidos a la superficie como dianas y la muestra de solución de ácidos nucleicos como sondas. Además, algunos investigadores unen la muestra diana bajo prueba al sustrato de la micromatriz y ponen las sondas de oligómeros en solución para la hibridación. Cualquiera de la "diana" o las "sondas" puede ser la que va a ser evaluada por la otra (por tanto, cualquiera de las dos podría ser una mezcla desconocida de polinucleótidos a evaluar mediante la unión con la otra). Todas estas iteraciones están dentro del alcance de esta discusión aquí. Sólo con el propósito de simplificar, en este documento la sonda es el oligonucleótido unido a la superficie de secuencia conocida y la diana es el resto en una fase móvil (típicamente fluida), para ser detectado por las sondas unidas a la superficie. La pluralidad de sondas y/o dianas en cada ubicación de la matriz puede denominarse "característica de ácido nucleico" o "característica". Una característica se define como un locus en donde se inmovilizan un gran número de sondas y/o dianas que tienen la misma secuencia de nucleótidos.

[0106] Dependiendo de la composición de la muestra diana, la hibridación de las características de la sonda puede ocurrir o no en todas las ubicaciones de las características de la sonda y puede ocurrir en diversos grados en las diferentes ubicaciones de las características de la sonda.

[0107] Una "matriz" se puede referir a una colección de moléculas creada intencionalmente que se pueden preparar sintética o biosintéticamente. Las moléculas de la matriz pueden ser idénticas o diferentes entre sí. La matriz puede asumir una variedad de formatos, por ejemplo, bibliotecas de moléculas solubles; bibliotecas de compuestos unidos a cuentas de resina, chips de sílice u otros soportes sólidos. La placa de matriz o un cuerpo de placa que tiene una pluralidad de matrices en donde cada matriz puede estar separada de las otras matrices por una barrera física resistente al paso de líquidos y formando un área o espacio, denominado pozo.

[0108] La densidad de los micromatrices puede ser mayor de 500, 5.000, 50.000, o 500.000 sondas diferentes por cm2. El tamaño de característica de las sondas puede ser menor de 500, 150, 25, 9 o 1 pm2. Las ubicaciones de las sondas se pueden determinar o descifrar. Por ejemplo, en algunas matrices, las ubicaciones específicas de las sondas se conocen antes de los ensayos de unión. En algunas otras matrices, las ubicaciones específicas de las sondas se desconocen hasta después de los ensayos. Las sondas se pueden inmovilizar sobre un sustrato, opcionalmente, a través de un enlazador, cuentas, etc.

[0109] La matriz puede comprender características compone de oligo(dT)sondas. La matriz puede comprender características compuestas por sondas específicas de genes. En algunas realizaciones, la matriz es una micromatriz. En algunas realizaciones, la matriz es una matriz de soportes sólidos (por ejemplo, cuentas). En algunas formas de realización, la matriz es plana. En algunas realizaciones, la matriz tiene características topográficas.

Sustratos

[0110] Un sustrato puede referirse a un tipo de soporte sólido. Un sustrato puede referirse a un soporte sólido que puede comprender códigos de barras estocásticos de la divulgación. Un sustrato puede comprender una pluralidad de micropocillos. Un micropocillo puede comprender una pequeña cámara de reacción de volumen definido. Un micropocillo puede atrapar una o más células. Un micropocillo puede atrapar solo una célula. Un micropocillo puede atrapar uno o más soportes sólidos. Un micropocillo puede atrapar solo un soporte sólido. En algunas realizaciones, un micropocillo atrapa una sola célula y un solo soporte sólido (por ejemplo, una cuenta).

[0111] Los micropocillos de la matriz se pueden fabricar en una variedad de formas y tamaños. Las geometrías de pozo apropiadas pueden incluir, entre otras, cilíndricas, cónicas, hemisféricas, rectangulares o poliédricas (por ejemplo, geometrías tridimensionales compuestas por varias caras planas, por ejemplo, columnas hexagonales, columnas octagonales, pirámides triangulares invertidas, pirámides cuadradas invertidas, pirámides pentagonales invertidas, pirámides hexagonales invertidas o pirámides truncadas invertidas). Los micropocillos pueden tener una forma que combine dos o más de estas geometrías. Por ejemplo, un micropocillo puede ser parcialmente cilíndrico, teniendo el resto la forma de un cono invertido. Un micropocillo puede incluir dos cilindros uno al lado del otro, uno de mayor diámetro (por ejemplo, que corresponde aproximadamente al diámetro de las cuentas) que el otro (por ejemplo, que corresponde aproximadamente al diámetro de las células), que están conectados por un canal vertical (que es, paralela a los ejes de los cilindros) que se extiende en toda la longitud (profundidad) de los cilindros. La abertura del micropocillo puede estar en la superficie superior del sustrato. La apertura del micropocillo puede estar en la superficie inferior del sustrato. El extremo cerrado (o el fondo) del micropocillo puede ser plano. El extremo cerrado (o parte inferior) del micropocillo puede tener una superficie curva (por ejemplo, convexa o cóncava). La forma y/o el tamaño del micropocillo se pueden determinar basándose en los tipos de células o soportes sólidos que quedarán atrapados dentro de los micropocillos.

[0112] Las dimensiones de los micropocillos se pueden caracterizar en términos del diámetro y la profundidad del pocillo. Como se usa en este documento, el diámetro del micropocillo se refiere al círculo más grande que se puede inscribir dentro de la sección transversal plana de la geometría del micropocillo. El diámetro de los micropocillos puede oscilar entre aproximadamente 1 vez y aproximadamente 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos que deben quedar atrapados dentro de los micropocillos. El diámetro del micropocillo puede ser al menos 1 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos que queden atrapados dentro de los micropocillos. El diámetro de los micropocillos puede ser como máximo 10 veces, máximo 5 veces, máximo 4 veces, máximo 3 veces, máximo 2 veces, máximo 1,5 veces o máximo 1 vez el diámetro de que las células o soportes sólidos queden atrapados dentro de los micropocillos. El diámetro de los micropocillos puede ser aproximadamente 2,5 veces el diámetro de las células o de los soportes sólidos que deben quedar atrapados dentro de los micropocillos.

[0113] El diámetro de los micropocillos se puede especificar en términos de dimensiones absolutas. El diámetro de los micropocillos puede oscilar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 micrómetros. El diámetro del micropocillo puede ser de al menos 5 micrómetros, al menos 10 micrómetros, al menos 15 micrómetros, al menos 20 micrómetros, al menos 25 micrómetros, al menos 30 micrómetros, al menos 35 micrómetros, al menos 40 micrómetros, al menos 45 micrómetros, o al menos 50 micrómetros. El diámetro del micropocillo puede ser como máximo 50 micrómetros, como máximo 45 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 35 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 25 micrómetros, como máximo 20 micrómetros, como máximo 15 micrómetros, como máximo 10 micrómetros, o como máximo 5 micrómetros. El diámetro de los micropocillos puede ser de aproximadamente 30 micrómetros.

[0114] En algunas realizaciones, el diámetro de cada micropocillo puede ser, o puede ser de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, nanómetros. En algunas realizaciones, el diámetro de cada micropocillo puede ser, o puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80., 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número entre dos de estos valores, micrómetro. En algunas realizaciones, el diámetro de cada micropocillo puede ser, o puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80., 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número entre dos de estos valores, minímetro.

[0115] La profundidad de los micropocillos se puede elegir para proporcionar un atrapamiento eficaz de células y soportes sólidos. La profundidad de los micropocillos se puede elegir para proporcionar un intercambio eficaz de tampones de ensayo y otros reactivos contenidos dentro de los pocillos. La relación de diámetro a altura (es decir, relación de aspecto) puede elegirse de modo que una vez que una célula y un soporte sólido se asienten dentro de un micropocillo, no se desplacen por el movimiento del fluido por encima del micropocillo. En algunas realizaciones, la altura del micropocillo puede ser menor que el diámetro de la cuenta. Por ejemplo, la altura del micropocillo puede ser de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100% del diámetro de la cuenta. La cuenta puede sobresalir fuera del micropocillo.

[0116] Las dimensiones de la microplaca pueden ser elegidas de tal manera que la cúpula tiene suficiente espacio para acomodar un soporte sólido y una célula de varios tamaños sin ser desalojada por el movimiento del fluido por encima del micropocillo. La profundidad de los micropocillos puede oscilar entre aproximadamente 1 vez y aproximadamente 10 veces el diámetro de las células o soportes sólidos que deben quedar atrapados dentro de los micropocillos. La profundidad del micropocillo puede ser al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces o al menos 10 veces el diámetro de que las células o soportes sólidos queden atrapados dentro de los micropocillos. La profundidad de los micropocillos puede ser como máximo de 10 veces, como máximo de 5 veces, como máximo de 4 veces, en la mayoría de 3 veces, como máximo 2 veces, como máximo 1,5 veces, o como máximo 1 vez el diámetro de las células o soportes sólidos que quedarán atrapados dentro de los micropocillos. La profundidad de los micropocillos puede ser aproximadamente 2,5 veces el diámetro de las células o los soportes sólidos que deben quedar atrapados dentro de los micropocillos.

[0117] La profundidad de los micropocillos se puede especificar en términos de dimensiones absolutas. La profundidad de los micropocillos puede oscilar entre aproximadamente 10 y aproximadamente 60 micrómetros. La profundidad del micropocillo puede ser de al menos 10 micrómetros, al menos 20 micrómetros, al menos 25 micrómetros, al menos 30 micrómetros, al menos 35 micrómetros, al menos 40 micrómetros, al menos 50 micrómetros o al menos 60 micrómetros. La profundidad del micropocillo puede ser como máximo 60 micrómetros, como máximo 50 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 35 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 25 micrómetros, como máximo 20 micrómetros o como máximo 10 micrómetros. La profundidad de los micropocillos puede ser de unos 30 micrómetros.

[0118] En algunas realizaciones, la profundidad de cada micropocillo puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, nanómetros. En algunas realizaciones, la profundidad de cada micropocillo puede ser, o puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80., 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número entre dos de estos valores, micrómetros. En algunas realizaciones, la profundidad de cada micropocillo puede ser, o puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80., 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número entre dos de estos valores, minímetros.

[0119] El volumen de los micropocillos utilizados en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación pueden variar, por ejemplo intervalo de aproximadamente 200 micrómetros3 a alrededor de 120.000 micrómetros3. El volumen del micropocillo puede ser de al menos 200 micrómetros3, al menos 500 micrómetros3, al menos 1.000 micrómetros3, al menos 10.000 micrómetros3, al menos 25.000 micrómetros3, al menos 50.000 micrómetros3, al menos 100.000 micrómetros3, o al menos 120.000 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede ser como máximo 120.000 micrómetros3, como máximo 100.000 micrómetros3, como máximo 50.000 micrómetros3, como máximo 25.000 micrómetros3, como máximo 10.000 micrómetros3, como máximo 1.000 micrómetros3, como máximo 500 micrómetros3 o como máximo 200 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede ser de aproximadamente 25.000 micrómetros3. El volumen de los micropocillos puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 18.000 micrómetros3 a aproximadamente 30.000 micrómetros3).

[0120] En algunas realizaciones, cada uno de los micropocillos puede tener un volumen de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, nanolitros. En algunas realizaciones, cada uno de los micropocillos puede tener un volumen de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, microlitros. En algunas realizaciones, cada uno de los micropocillos puede tener un volumen de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, minilitros.

[0121] Los volúmenes de los micropocillos utilizados en los métodos, dispositivos y sistemas de la presente descripción pueden ser caracterizados adicionalmente en términos de la variación en el volumen de un micropocillo a otro coeficiente de variación (expresado como un porcentaje) para el volumen de micropocillos puede oscilar entre aproximadamente el 1% y aproximadamente el 10%. El coeficiente de variación para el volumen de micropocillos puede ser al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 6%, al menos 7%, al menos 8%, al menos el 9% o al menos el 10%. El coeficiente de variación para el volumen de los micropocillos puede ser como máximo 10%, como máximo 9%, como máximo 8%, como máximo 7%, como máximo 6%, como máximo 5%, como máximo 4%, como máximo 3%, como máximo como máximo 2% o como máximo 1%. El coeficiente de variación para el volumen de los micropocillos puede tener cualquier valor dentro de un intervalo comprendido por estos valores, por ejemplo, entre aproximadamente el 1,5% y aproximadamente el 6,5%. En algunas realizaciones, el coeficiente de variación del volumen de los micropocillos puede ser de aproximadamente un 2,5%.

[0122] La relación del volumen de los micropocillos a la zona de superficie de las cuentas (o a la zona de superficie de un soporte sólido al que los oligonucleótidos de código de barras estocásticos se pueden unir) utilizados en los métodos, dispositivos, y sistemas de la presente divulgación puede variar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 1,520 micrómetros. La relación puede ser de al menos 2,5, al menos 5, al menos 10, al menos 100, al menos 500, al menos 750, al menos 1.000 o al menos 1.520. La relación puede ser como máximo 1.520, como máximo 1.000, como máximo 750, como máximo 500, como máximo 100, como máximo 10, como máximo 5 o como máximo 2,5. En algunas realizaciones, la relación puede ser de aproximadamente 67,5. La relación entre el volumen de los micropocillos y el área de la superficie de la cuenta (o el soporte sólido utilizado para la inmovilización) puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 30 a aproximadamente 120).

[0123] Los pocillos de la matriz de micropocillos pueden estar dispuestos en una sola dimensión, matriz bidimensional o tridimensional. Se puede lograr una matriz tridimensional, por ejemplo, apilando una serie de dos o más matrices bidimensionales (es decir, apilando dos o más sustratos que comprenden matrices de micropocillos).

[0124] El patrón y el espaciamiento entre los micropocillos se puede elegir para optimizar la eficiencia de captura de una sola célula y soporte sólido único (por ejemplo, cuenta) en cada pozo, así como para maximizar el número de pocillos por unidad de área de la matriz. Los micropocillos se pueden distribuir según una variedad de patrones aleatorios o no aleatorios. Por ejemplo, se pueden distribuir de forma completamente aleatoria a través de la superficie del sustrato de la matriz, o se pueden disponer en una cuadrícula cuadrada, una cuadrícula rectangular, una cuadrícula hexagonal o similar. La distancia de centro a centro (o espaciamiento) entre pozos puede variar de aproximadamente 15 micrómetros a aproximadamente 75 micrómetros. En otras realizaciones, la separación entre pozos es de al menos 15 micrómetros, al menos 20 micrómetros, al menos 25 micrómetros, al menos 30 micrómetros, al menos 35 micrómetros, al menos 40 micrómetros, al menos 45 micrómetros, al menos 50 micrómetros, al menos 55 micrómetros, al menos 60 micrómetros, al menos 65 micrómetros, al menos 70 micrómetros o al menos 75 micrómetros. El espaciado de los micropocillos puede ser como máximo 75 micrómetros, como máximo 70 micrómetros, como máximo 65 micrómetros, como máximo 60 micrómetros, como máximo 55 micrómetros, como máximo 50 micrómetros, como máximo 45 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 35 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 25 micrómetros, como máximo 20 micrómetros o como máximo 15 micrómetros. El espaciamiento de los micropocillos puede ser de aproximadamente 55 micrómetros. El espaciamiento de los micropocillos puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 18 micrómetros hasta aproximadamente 72 micrómetros).

[0125] En algunas realizaciones, los micropocillos pueden estar separados entre sí por no más de 0,01, 0,1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, micrómetros. En algunas realizaciones, los micropocillos pueden estar separados entre sí por no más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o un número entre dos de estos valores, minímetros.

[0126] En algunas realizaciones, la matriz de micropocillos puede comprender 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número entre dos de estos valores, pozos por pulgada2. En algunas realizaciones, la matriz de micropocillos puede comprender 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número entre dos de estos valores, pozos por cm2.

[0127] La matriz de micropocillos puede comprender características de superficie entre los micropocillos que están diseñadas para ayudar células de guía y soportes sólidos en los pocillos y/o evitar que se deposite en las superficies entre los pozos. Los ejemplos de características superficiales adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, características superficiales abovedadas, estriadas o puntiagudas que rodean los pozos o se extienden a horcajadas sobre la superficie entre pozos.

[0128] El número total de pocillos en la matriz de micropocillos se puede determinar mediante el patrón y el espaciamiento de los pocillos y las dimensiones generales de la matriz. El número de micropocillos en la matriz puede variar, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 96 a aproximadamente 5.000.000 o más. El número de micropocillos en la matriz puede ser de al menos 96, al menos 384, al menos 1.536, al menos 5.000, al menos 10.000, al menos 25.000, al menos 50.000, al menos 75.000, al menos 100.000, al menos 500.000, al menos 1.000.000, o al menos 5.000.000. El número de micropocillos en la matriz puede ser como máximo 5.000.000, como máximo 1.000. 000, como máximo 75.000, como máximo 50.000, como máximo 25.000, como máximo 10.000, como máximo 5.000, como máximo 1.536, como máximo 384 o como máximo 96 pozos. El número de micropocillos en la matriz puede ser aproximadamente 96. El número de micropocillos puede ser aproximadamente 150.000. El número de micropocillos en la matriz puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 100 a 325.000).

[0129] Matricies de micropocillos se pueden fabricar usando cualquiera de un número de técnicas de fabricación. Ejemplos de métodos de fabricación que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, técnicas de micromecanizado a granel tales como fotolitografía y grabado químico húmedo, grabado con plasma o grabado profundo con iones reactivos; micromoldeado y micrograbado; micromaquinado láser; impresión 3D u otros procesos de fabricación de escritura directa utilizando materiales curables; y técnicas similares.

[0130] Las matrices de micropocillos se pueden fabricar a partir de varios materiales de sustrato. La elección del material puede depender de la elección de la técnica de fabricación y viceversa. Los ejemplos de materiales adecuados pueden incluir, entre otros, silicio, sílice fundida, vidrio, polímeros (por ejemplo, agarosa, gelatina, hidrogeles, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros olefínicos cíclicos (COP), copolímeros olefínicos cíclicos (COL), tereftalato de polietileno (PET), resinas epoxi, resinas a base de tiol-eno, metales o películas metálicas (p. ej., aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio) y similares. Puede ser deseable un material hidrófilo para la fabricación de matrices de micropocillos (p. ej., para mejorar la humectabilidad y minimizar la unión no específica de células y otro material biológico). También se pueden usar materiales hidrófobos que se pueden tratar o recubrir (por ejemplo, mediante tratamiento con plasma de oxígeno o injerto de una capa superficial de óxido de polietileno). El uso de materiales hidrófilos porosos para la fabricación de la matriz de micropocillos puede ser deseable en orden de facilitar la evacuación/ventilación capilar de las burbujas de aire atrapadas en el dispositivo. La matriz de micropocillos se puede fabricar con un solo material. La matriz de micropocillos puede comprender dos o más materiales diferentes que se han unido o enlazado mecánicamente.

[0131] Matrices de micropocillos se pueden fabricar utilizando sustratos de cualquiera de una variedad de tamaños y formas. Por ejemplo, la forma (o huella) del sustrato dentro del cual se fabrican los micropocillos puede ser de forma cuadrada, rectangular, circular o irregular. La huella del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser similar a la de una placa de microvaloración. La huella del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser similar a la de los portaobjetos de microscopio estándar, por ejemplo, aproximadamente 75 mm de largo x 25 mm de ancho (aproximadamente 3” de largo x 1" de ancho), o aproximadamente 75 mm de largo x 50 mm de ancho (aproximadamente 3” de largo x 2” de ancho). El espesor del sustrato dentro del cual se fabrican los micropocillos puede oscilar entre aproximadamente 0,1 mm de espesor y aproximadamente 10 mm de espesor, o más. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser de al menos 0,1 mm de espesor, al menos 0,5 mm de espesor, al menos 1 mm de espesor, al menos 2 mm de espesor, al menos 3 mm de espesor, al menos 4 mm de espesor, al menos 5 mm de espesor, al menos 6 mm de espesor, al menos 7 mm de espesor, al menos 8 mm de espesor, al menos 9 mm de espesor, o al menos 10 mm de espesor. El grosor del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser como máximo de 10 mm de grosor, como máximo de 9 mm de grosor, como máximo de 8 mm de grosor, como máximo de 7 mm de grosor, como máximo de 6 mm de grosor, como máximo de 5 mm de grosor, como máximo de 4 mm de grosor, como máximo 3 mm de espesor, como máximo 2 mm de espesor, como máximo 1 mm de espesor, como máximo 0,5 mm de espesor, o como máximo 0,1 mm de espesor. El espesor del sustrato de la matriz de micropocillos puede ser de aproximadamente 1 mm de espesor. El espesor del sustrato matriz de micropocillos puede ser cualquier valor dentro de estos intervalos, por ejemplo, el espesor del sustrato matriz de micropocillos puede ser entre aproximadamente 0,2 mm y unos 9,5 mm.

[0132] Una variedad de tratamientos de superficie y la superficie de las técnicas de modificación se puede utilizar para alterar las propiedades de las superficies de la matriz de micropocillos. Los ejemplos pueden incluir, entre otros, tratamientos con plasma de oxígeno para hacer que las superficies de los materiales hidrófobos sean más hidrófilas, el uso de técnicas de grabado en húmedo o en seco para suavizar (o dar rugosidad) las superficies de vidrio y silicio, adsorción o injerto de óxido de polietileno u otras capas de polímero. (como pluronic), o albúmina de suero bovino a las superficies del sustrato para hacerlas más hidrófilas y menos propensas a la adsorción inespecífica de biomoléculas y células, el uso de reacciones de silano para injertar grupos funcionales químicamente reactivos en superficies de vidrio y silicio que de otro modo serían inertes, etc. Se pueden usar técnicas de fotodeprotección para activar selectivamente grupos funcionales químicamente reactivos en ubicaciones específicas en la estructura de la matriz, por ejemplo, la adición selectiva o activación de grupos funcionales químicamente reactivos tales como aminas primarias o grupos carboxilo en las paredes internas de los micropocillos se pueden usar para acoplar covalentemente sondas de oligonucleótidos, péptidos, proteínas u otras biomoléculas a las paredes de los micropocillos. La elección del tratamiento de superficie o de la modificación de la superficie utilizada puede depender tanto del tipo de propiedad de la superficie que se desee como del tipo de material del que está hecha la matriz de micropocillos.

[0133] Las aberturas de micropocillos se pueden sellar, por ejemplo, durante las etapas de lisis celular para evitar la hibridación cruzada de ácido nucleico diana entre micropocillos adyacentes un micropocillo (o matriz de micropocillos) se pueden sellar o cubrieron usando, por ejemplo, una membrana flexible o una hoja de material sólido (es decir, una placa o plato) que se sujeta contra la superficie del sustrato de la matriz de micropocillos, o una cuenta adecuada, donde el diámetro de la cuenta es mayor que el diámetro del micropocillo.

[0134] Un sello formado utilizando una membrana flexible o una lámina de material sólido puede comprender, por ejemplo, membranas de nanoporos inorgánicos (por ejemplo, óxidos de aluminio), membranas de diálisis, portaobjetos de vidrio, los cubreobjetos, películas elastoméricas (por ejemplo, PDMS), o películas de polímero hidrófilo (por ejemplo, una película de polímero recubierta con una película delgada de agarosa que se ha hidratado con tampón de lisis).

[0135] Los soportes sólidos (por ejemplo, cuentas) utilizados para la limitación de los micropocillos puede comprender cualquiera de los soportes sólidos (por ejemplo, cuentas) de la descripción. En algunas realizaciones, los soportes sólidos son cuentas de dextrano reticuladas (por ejemplo, Sephadex). El dextrano reticulado puede oscilar entre aproximadamente 10 micrómetros y aproximadamente 80 micrómetros. Las cuentas de dextrano reticulado utilizadas para el remate pueden ser de 20 micrómetros a aproximadamente 50 micrómetros. En algunas realizaciones, las cuentas pueden ser al menos aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% más grandes que el diámetro de los micropocillos. Las cuentas utilizadas para tapar pueden ser como máximo aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% más grandes que el diámetro de los micropocillos.

[0136] El sello o la tapa puede permitir que el tampón pase en y fuera de los pocillos, mientras que la prevención de macromoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos) migre fuera del pozo. Se puede bloquear una macromolécula de al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos de migrar dentro o fuera del micropocillo por el sello o la tapa. Se puede bloquear una macromolécula de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos de migrar dentro o fuera del micropocillo por el sello o la tapa.

[0137] Los soportes sólidos (por ejemplo, cuentas) se pueden distribuir entre un sustrato. Los soportes sólidos (por ejemplo, cuentas) pueden distribuirse entre los pocillos del sustrato, retirarse de los pocillos del sustrato o transportarse de otro modo a través de un dispositivo que comprende una o más matrices de micropocillos mediante centrifugación u otros medios no magnéticos. Un micropocillo de un sustrato puede precargarse con un soporte sólido. Un micropocillo de un sustrato puede contener al menos 1, 2, 3, 4 o 5, o más soportes sólidos. Un micropocillo de un sustrato puede contener como máximo 1,2, 3, 4 o 5 o más soportes sólidos. En algunas realizaciones, un micropocillo de un sustrato puede contener un soporte sólido.

[0138] Las células individuales y los granos pueden ser compartimentadas usando alternativas a los micropocillos, por ejemplo, un único soporte sólido y una sola célula podrían estar contenidas dentro de una sola gota en una emulsión (por ejemplo, en una gotita digital de sistema de microfluidos).

[0139] Las células podrían potencialmente estar confinadas dentro de cuentas porosas que comprenden a sí mismas la pluralidad de códigos de barras estocásticos atados. Las células individuales y los soportes sólidos pueden compartimentarse en cualquier tipo de recipiente, microcontenedor, cámara de reacción, recipiente de reacción o similar.

[0140] Códigos de barras estocásticos de células individuales, o pueden llevarse a cabo sin el uso de micropocillos. Los ensayos de códigos de barras estocásticos de célula única se pueden realizar sin el uso de ningún contenedor físico. Por ejemplo, el código de barras estocástico sin un contenedor físico se puede realizar incrustando células y cuentas muy próximas entre sí dentro de una capa de polímero o de gel para crear una barrera de difusión entre diferentes pares de células/cuentas. En otro ejemplo, el código de barras estocástico sin un contenedor físico se puede realizar in situ, in vivo, en un tejido sólido intacto, en una célula intacta y/o subcelularmente.

[0141] Las matrices de micropocillos pueden ser un componente consumible del sistema de ensayo. Las matrices de micropocillos se pueden reutilizar. Las matrices de micropocillos se pueden configurar para su uso como un dispositivo independiente para realizar ensayos manualmente, o se pueden configurar para que comprendan un componente fijo o extraíble de un sistema de instrumentos que proporcione la automatización total o parcial del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones de los métodos descritos, las bibliotecas basadas en cuentas de códigos de barras estocásticos pueden depositarse en los pocillos de la matriz de micropocillos como parte del procedimiento de ensayo. En algunas realizaciones, las cuentas pueden precargarse en los pocillos de la matriz de micropocillos y proporcionarse al usuario como parte, por ejemplo, de un kit para realizar códigos de barras estocásticos y recuento digital de dianas de ácido nucleico.

[0142] En algunas realizaciones, se pueden proporcionar dos conjuntos de micropocillos acoplados, uno precargado con cuentas que se mantienen en su lugar mediante un primer imán, y el otro para uso del usuario en la carga de células individuales. Después de la distribución de las células en la segunda matriz de micropocillos, las dos matrices se pueden colocar cara a cara y el primer imán se retira mientras se usa un segundo imán para extraer las cuentas de la primera matriz hacia los micropocillos correspondientes de la segunda matriz, asegurando así que las cuentas descansen sobre las células en la segunda matriz de micropocillos y minimizando así la pérdida por difusión de moléculas diana después de la lisis celular, mientras maximiza la unión eficiente de moléculas diana a los códigos de barras estocásticos en la cuenta.

[0143] En algunas realizaciones, un sustrato no incluye micropocillos. Por ejemplo, las cuentas se pueden ensamblar (por ejemplo, autoensamblar). Las cuentas pueden autoensamblarse en una monocapa. La monocapa puede estar sobre una superficie plana del sustrato. La monocapa puede estar sobre una superficie curva del sustrato. La monocapa de cuentas se puede formar mediante cualquier método, como la evaporación del alcohol.

Sustratos tridimensionales

[0144] Una matriz tridimensional puede tener cualquier forma. Un sustrato tridimensional puede estar hecho de cualquier material utilizado en un sustrato de la divulgación. En algunas realizaciones, un sustrato tridimensional comprende un origami de ADN. Las estructuras de origami de ADN incorporan ADN como material de construcción para hacer formas a nanoescala. El proceso de origami de ADN puede implicar el plegado de una o más hebras de ADN largas y "andamiaje" en una forma particular utilizando una pluralidad de hebras de ADN básico diseñadas racionalmente. Las secuencias de las hebras básicas pueden diseñarse de modo que se hibriden con porciones particulares de las hebras del andamio y, al hacerlo, fuerza a las hebras del andamio a una forma particular. El origami de ADN puede incluir una hebra de andamio y una pluralidad de hebras de grapas diseñadas racionalmente. La hebra de la estructura puede tener cualquier secuencia suficientemente no repetitiva.

[0145] Las secuencias de las hebras básicas se pueden seleccionar de modo que el origami de ADN tenga al menos una forma a la que se puedan unir etiquetas estocásticas. En algunas realizaciones, el origami de ADN puede tener cualquier forma que tenga al menos una superficie interna y al menos una superficie exterior. Una superficie interior puede ser cualquier área de la superficie del origami de ADN que esté impedida estéricamente de interactuar con la superficie de una muestra, mientras que una superficie exterior es cualquier área de superficie del origami de ADN que no está impedida estéricamente de interactuar con la superficie de una muestra. En algunas realizaciones, el origami de ADN tiene una o más aberturas (por ejemplo, dos aberturas), de modo que las partículas (por ejemplo, soportes sólidos) pueden acceder a una superficie interna del origami de ADN. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el origami de ADN tiene una o más aberturas que permiten partículas menores de 10 micrómetros, 5 micrómetros, 1 micrómetro, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 100 nm, 75 nm, 50 nm, 45 nm o 40 nm para entrar en contacto con una superficie interna del origami de ADN.

[0146] El origami de ADN puede cambiar de forma (conformación) en respuesta a uno o más estímulos ambientales determinados. Por lo tanto, un área del origami de ADN puede ser una superficie interna cuando el origami de ADN adquiere algunas conformaciones, pero puede ser una superficie externa cuando el dispositivo adquiere otras conformaciones. En algunas realizaciones, el origami de ADN puede responder a ciertos estímulos ambientales asumiendo una nueva conformación.

[0147] En algunas realizaciones, las hebras cortadas del origami de ADN se pueden seleccionar de manera que el origami de ADN tenga sustancialmente forma de barril o tubo. Las grapas del origami de ADN se pueden seleccionar de modo que la forma de barril esté cerrada en ambos extremos o abierta en uno o ambos extremos, permitiendo así que las partículas entren en el interior del barril y accedan a su superficie interior. En determinadas realizaciones, la forma de barril del origami de ADN puede ser un tubo hexagonal.

[0148] En algunas realizaciones, las hebras básicas del origami de ADN se pueden seleccionar de manera que el origami de ADN tenga un primer dominio y un segundo dominio, en donde el primer extremo del primer dominio se une al primer extremo del segundo dominio mediante una o más bisagras de ADN monocatenario, y el segundo extremo del primer dominio está unido al segundo dominio del segundo dominio mediante uno o más enlaces moleculares. La pluralidad de grapas se puede seleccionar de modo que el segundo extremo del primer dominio quede desapegado del segundo extremo del segundo dominio si todos los enlaces moleculares entran en contacto con sus respectivos estímulos externos. Los enlaces se pueden formar a partir de dos o más soportes de grapas, que incluyen al menos una hebra de grapas que tiene al menos un dominio de unión al estímulo que puede unirse a un estímulo externo, como un ácido nucleico, un lípido o una proteína, y al menos otra hebra cortada que tiene al menos un dominio de enganche que se une al dominio de unión al estímulo. La unión del dominio de unión al estímulo al dominio de cierre apoya la estabilidad de una primera conformación del ADN origami.

[0149] Las etiquetas espaciales se pueden entregar a una muestra en tres dimensiones. Por ejemplo, una muestra se puede asociar con una matriz, en donde la matriz tiene etiquetas espaciales distribuidas o distribuibles en tres dimensiones. Una matriz tridimensional puede ser un andamio, un sustrato poroso, un gel, una serie de canales o similares.

[0150] Un modelo tridimensional de etiquetas espacial puede estar asociado con una muestra mediante la inyección de las muestras en ubicaciones conocidas con la muestra, por ejemplo, usando un robot. Se puede utilizar una sola aguja para inyectar en serie etiquetas espaciales a diferentes profundidades en una muestra. Una serie de agujas puede inyectar etiquetas espaciales a diferentes profundidades para generar una distribución tridimensional de etiquetas.

[0151] En algunas realizaciones, un soporte sólido tridimensional puede ser un dispositivo. Por ejemplo, un dispositivo de matriz de agujas (por ejemplo, un dispositivo de matriz de agujas de biopsia) puede ser un sustrato. Los códigos de barras estocásticos de la divulgación se pueden adjuntar al dispositivo. La colocación del dispositivo en y/o sobre una muestra puede acercar los códigos de barras estocásticos de la divulgación a las dianas dentro y/o sobre la muestra. Diferentes partes del dispositivo pueden tener códigos de barras estocásticos con diferentes etiquetas espaciales. Por ejemplo, en un dispositivo de matriz de agujas, cada aguja del dispositivo se puede recubrir con códigos de barras estocásticos con diferentes etiquetas espaciales en cada aguja. De esta manera, las etiquetas espaciales pueden proporcionar información sobre la ubicación de las dianas (por ejemplo, la ubicación en la orientación de la matriz de agujas).

Sondas

[0152] El soporte/sustrato sólido de la divulgación puede comprender una pluralidad de sondas. Las sondas pueden tener al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos en longitud. Las sondas pueden tener como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más nucleótidos en longitud.

[0153] Las sondas pueden ser sondas oligo(dT). Las sondas pueden ser cualquier secuencia homopolimérica (por ejemplo, poli(A), poli(C), poli(G), poli(U)).

[0154] Las sondas pueden ser específicas de gen. Las sondas pueden apuntar a cualquier ubicación de un gen (por ejemplo, 3’ UTR, 5' UTR, región codificante, promotor). Las sondas sobre el sustrato pueden ser específicas de un gen para una pluralidad de genes. Por ejemplo, un sustrato puede comprender sondas que son específicas de genes para al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más genes. Un sustrato puede comprender sondas que son específicas de genes para al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más genes. La pluralidad de sondas específicas de genes se puede dispersar por todo el sustrato de manera uniforme. La pluralidad de sondas específicas de genes se puede dispersar por todo el sustrato en ubicaciones discretas. Puede haber un número equivalente de sondas específicas de genes para cada gen. Puede haber un número desigual de sondas específicas de genes para cada gen. Por ejemplo, una o más sondas específicas de genes se pueden representar en el sustrato al menos en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80% o más en comparación con una o más de otras sondas específicas de genes. Se pueden representar una o más sondas específicas de genes en el sustrato como máximo en un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 u 80% o más en comparación con una o más de otras sondas específicas de genes.

[0155] El sustrato puede comprender una pluralidad de sondas específicas de genes para una pluralidad de genes y una pluralidad de sondas oligo(dT). La combinación de sondas específicas de genes y sondas oligo(dT) puede ser útil para los métodos de amplificación puente de la divulgación. La proporción de una sonda específica de genes a una sonda oligo(dT) puede ser al menos 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5 o más. La proporción de una sonda específica de gen a una sonda oligo(dT) puede ser como máximo 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5 o más. La proporción de una sonda de oligo(dT) a una sonda específica de gen puede ser al menos 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5 o más. La proporción de una sonda de oligo(dT) a una sonda específica de genes puede ser como máximo 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 o 1:5 o más.

[0156] Las sondas sobre el sustrato de duplicados puede comprender cualquiera de las sondas, o combinación de sondas de la divulgación. Las sondas en el sustrato replicado pueden ser las mismas que las del sustrato inicial. Las sondas en el sustrato replicado pueden ser diferentes del sustrato inicial. Por ejemplo, las sondas en el sustrato inicial pueden ser específicas de un gen para una primera ubicación de un gen. Las sondas en el portaobjetos replicado pueden ser específicas de un gen para una segunda ubicación en el mismo gen. De esta forma, las sondas pueden usarse para identificar (por ejemplo, generar y/o detectar) múltiples amplicones del mismo gen. Los múltiples amplicones pueden comprender diferentes características genéticas, como SNP. La identificación de múltiples amplicones en el mismo gen puede ser útil para la identificación de SNP y/o eventos de movilidad genética (por ejemplo, truncamientos, translocaciones, transposiciones).

[0157] En algunas realizaciones, las sondas en el sustrato inicial pueden ser oligo(dT) y las sondas en el duplicado sustrato pueden ser genespecíficas o una combinación de genespecíficas y oligo(dT).

Síntesis de los códigos de barras estocásticos sobre soportes sólidos y sustratos

[0158] Un código de barras estocástico puede ser sintetizado en un soporte sólido (por ejemplo, cuenta). Los códigos de barras estocásticos pre-sintetizados (p. ej., que comprenden la amina 5’ que puede unirse al soporte sólido) se pueden unir a soportes sólidos (p. ej., cuentas) mediante cualquiera de una variedad de técnicas de inmovilización que involucran pares de grupos funcionales en el soporte sólido y el código de barras estocástico. El código de barras estocástico puede comprender un grupo funcional. El soporte sólido (por ejemplo, una cuenta) puede comprender un grupo funcional. El grupo funcional de código de barras estocástico y el grupo funcional de soporte sólido pueden comprender, por ejemplo, biotina, estreptavidina, amina(s) primaria(s), carboxilo(s), hidroxilo(s), aldehído(s), cetona(s) y cualquier combinación del mismo. Un código de barras estocástico se puede anclar a un soporte sólido, por ejemplo, mediante el acoplamiento (p. ej., usando 1-etilo-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) un grupo amino 5’ en el código de barras estocástico al grupo carboxilo del soporte sólido funcionalizado. Los códigos de barras estocásticos no acoplados residuales se pueden eliminar de la mezcla de reacción realizando varios pasos de enjuague. En algunas realizaciones, el código de barras estocástico y el soporte sólido se unen indirectamente mediante moléculas enlazadoras (por ejemplo, moléculas de hidrocarburo funcionalizadas cortas o moléculas de óxido de polietileno) usando químicas de unión similares. Los enlazadores pueden ser enlazadores escindibles, por ejemplo enlazadores lábiles a ácido o enlazadores fotoescindibles.

[0159] Los códigos de barras estocásticos pueden sintetizarse en soportes sólidos (por ejemplo, cuentas) utilizando cualquiera de una serie de técnicas de oligonucleótidos en fase sólida de síntesis, tales como la síntesis de fosfodiéster, síntesis de fosfotriéster, síntesis de triéster de fosfito, y la síntesis de la fosforamidita. Los nucleótidos individuales se pueden acoplar de manera escalonada al código de barras estocástico unido en crecimiento. Se puede acoplar una secuencia (o bloque) corta y pre-sintetizada de varios oligonucleótidos al código de barras estocástico unido en crecimiento.

[0160] Los códigos de barras estocásticos se pueden sintetizar intercalando reacciones de acoplamiento por pasos o en bloque con una o más rondas de síntesis de grupo dividido, en las que el grupo total de cuentas de síntesis se divide en varios grupos individuales más pequeños que luego se someten cada uno a una reacción de acoplamiento diferente, seguida de recombinación y mezcla de los grupos individuales para aleatorizar la secuencia de código de barras estocástico en crecimiento en el grupo total de cuentas. La síntesis de grupo dividido es un ejemplo de un proceso de síntesis combinatoria en donde se sintetiza un número máximo de compuestos químicos utilizando un número mínimo de pasos de acoplamiento químico. La diversidad potencial de la biblioteca de compuestos así creada está determinada por el número de bloques de construcción únicos (por ejemplo, nucleótidos) disponibles para cada paso de acoplamiento y el número de pasos de acoplamiento usados para crear la biblioteca. Por ejemplo, una síntesis de agrupación dividida que comprende 10 rondas de acoplamiento utilizando 4 nucleótidos diferentes en cada paso producirá 4¹⁰ = 1.048.576 secuencias de nucleótidos únicas. En algunas realizaciones, la síntesis de agrupación dividida se puede realizar usando métodos enzimáticos tales como reacciones de ligación o extensión de polimerasa en lugar de acoplamiento químico. Por ejemplo, en cada ronda de una reacción de extensión de la polimerasa de grupo dividido, los extremos 3’ de los códigos de barras estocásticos atados a las cuentas en un grupo dado pueden hibridarse con los extremos 5' de un conjunto de cebadores semi-aleatorios, por ejemplo, cebadores que tienen una estructura de 5’-(M)^k-(X)ⁱ-(N)^j-3', donde (X)ⁱ es una secuencia aleatoria de nucleótidos que tiene i nucleótidos de longitud (el conjunto de cebadores que comprende todas las combinaciones posibles de (X)ⁱ), (N)^j es un nucleótido específico (o serie de j nucleótidos), y (M)^k es un nucleótido específico (o serie de k nucleótidos), en donde se añade un desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP) diferente a cada grupo e incorporado en los oligonucleótidos atados por la polimerasa.

[0161] El número de códigos de barras estocásticos conjugados a, o sintetizados en un soporte sólido puede comprender al menos 100, 1000, 10000, o 1000000 o más códigos de barras estocásticos. El número de códigos de barras estocásticos conjugados o sintetizados en un soporte sólido puede comprender como máximo 100, 1000, 10000 o 1000000 o más códigos de barras estocásticos. El número de oligonucleótidos conjugados o sintetizados en un soporte sólido, como una cuenta, puede ser al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces mayor que el número de ácidos nucleicos diana. en una célula. El número de oligonucleótidos conjugados o sintetizados en un soporte sólido como una cuenta puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces más que el número de ácidos nucleicos diana. en una célula. Al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% del código de barras estocástico puede estar unido por un ácido nucleico diana. Como máximo, el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% del código de barras estocástico puede estar unido por un ácido nucleico diana. Al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más ácidos nucleicos diana diferentes pueden ser capturados por el código de barras estocástico en el soporte sólido. Como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más ácidos nucleicos diana diferentes pueden ser capturados por el código de barras estocástico en el soporte sólido.

[0162] En algunas realizaciones, los códigos de barras estocásticos pueden ser sintetizados mediante la distribución al azar una mezcla de ADN de cadena simple sobre un substrato pre-recubierto con cebadores. El ADN monocatenario puede hibridar con los cebadores. Se puede realizar una amplificación puente para convertir los ADN monocatenarios en un grupo. La secuenciación se puede realizar para determinar la secuencia del ADN en cada grupo en el sustrato. Se puede aplicar una muestra al sustrato, seguida de los métodos de códigos de barras estocásticos de la divulgación.

[0163] En algunas realizaciones, los códigos de barras se pueden sintetizar usando tamaño y/o movilidad electroforética. Por ejemplo, se puede preparar una mezcla de códigos de barras estocásticos y separarlos en dos dimensiones mediante electroforesis en gel. El gel puede ser el sustrato.

Métodos de códigos de barras estocásticos

[0164] La descripción proporciona métodos para estimar el número de dianas diferentes en lugares distintos en una muestra física (por ejemplo, tejido, órgano, tumor, célula). Los métodos pueden comprender colocar los códigos de barras estocásticos muy cerca de la muestra, lisar la muestra, asociar distintas dianas con los códigos de barras estocásticos, amplificar las dianas y/o contar digitalmente las dianas. El método puede comprender además analizar y/o visualizar la información obtenida de las etiquetas espaciales en los códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, los métodos comprenden visualizar la pluralidad de dianas en la muestra. El mapeo de la pluralidad de dianas en el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional se pueden generar antes o después de codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra. Visualizar la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir mapear la pluralidad de dianas en un mapa de la muestra. El mapeo de la pluralidad de dianas en el mapa de la muestra puede incluir generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra. El mapa bidimensional y el mapa tridimensional se pueden generar antes o después de codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra, en algunas realizaciones, el mapa bidimensional y el mapa tridimensional se pueden generar antes o después de lisar la muestra. Lisar la muestra antes o después de generar el mapa bidimensional o el mapa tridimensional puede incluir calentar la muestra, poner en contacto la muestra con un detergente, cambiar el pH de la muestra o cualquier combinación de los mismos.

[0165] La figura 3 ilustra una realización ejemplar del método de código de barras estocástico de la divulgación. Una muestra (por ejemplo, sección de una muestra, rebanada fina y célula) puede ponerse en contacto con un soporte sólido que comprende un código de barras estocástico. Las dianas de la muestra se pueden asociar con los códigos de barras estocásticos. Los soportes sólidos se pueden recoger. La síntesis de ADNc se puede realizar sobre el soporte sólido. La síntesis de ADNc se puede realizar a partir del soporte sólido. La síntesis de ADNc puede incorporar la información de la etiqueta de las etiquetas en el código de barras estocástico en la nueva molécula diana de ADNc que se sintetiza, generando así una molécula de código de barras diana. Las moléculas de código de barras diana se pueden amplificar usando PCT. La secuencia de las dianas y las etiquetas del código de barras estocástico en la molécula de código de barras diana se puede determinar mediante métodos de secuenciación.

Contactar una muestra y un código de barras estocástico

[0166] La descripción proporciona métodos para poner en contacto una muestra (por ejemplo, células) a un sustrato de la descripción. Una muestra que comprende, por ejemplo, una célula, un órgano o una sección delgada de tejido, puede ponerse en contacto con códigos de barras estocásticos. Las células pueden ponerse en contacto, por ejemplo, mediante flujo por gravedad en donde las células pueden sedimentar y crear una monocapa. La muestra puede ser una sección delgada de tejido. La sección delgada se puede colocar sobre el sustrato. La muestra puede ser unidimensional (por ejemplo, formar una superficie plana). La muestra (por ejemplo, células) se puede esparcir a través del sustrato, por ejemplo, haciendo crecer/cultivar las células sobre el sustrato.

[0167] Cuando los códigos de barras estocásticos están muy cerca de las dianas, los objetivos pueden hibridar con el código de barras estocástico. Los códigos de barras estocásticos pueden contactarse en una proporción no agotable de modo que cada diana distinta pueda asociarse con un código de barras estocástico distinto de la divulgación. Para asegurar una asociación eficiente entre la diana y el código de barras estocástico, las dianas se pueden reticular con el código de barras estocástico.

Lisis celular

[0168] Después de la distribución de células y códigos de barras estocásticos, las células pueden lisarse para liberar las moléculas diana. La lisis celular se puede realizar por cualquiera de una variedad de medios, por ejemplo, por medios químicos o bioquímicos, por choque osmótico o por medio de lisis térmica, lisis mecánica o lisis óptica. Las células se pueden lisar mediante la adición de un tampón de lisis celular que comprende un detergente (por ejemplo, SDS, dodecilsulfato de litio, Triton X-100, Tween-20 o NP-40), un disolvente orgánico (por ejemplo, metanol o acetona) o enzimas digestivas. (p. ej. proteinasa K, pepsina o tripsina) o cualquier combinación de los mismos. Para aumentar la asociación de una diana y un código de barras estocástico, la velocidad de difusión de las moléculas diana se puede alterar, por ejemplo, reduciendo la temperatura y/o aumentando la viscosidad del lisado.

[0169] En algunas realizaciones, la muestra puede ser lisada utilizando un papel de filtro. El papel de filtro puede empaparse con un tampón de lisis en la parte superior del papel de filtro. El papel de filtro se puede aplicar a la muestra con presión, lo que puede facilitar la lisis de la muestra y la hibridación de las dianas de la muestra con el sustrato.

[0170] En algunas realizaciones, la lisis puede realizarse por lisis mecánica, lisis de calor, la lisis óptica, y/o lisis química. La lisis química puede incluir el uso de enzimas digestivas como proteinasa K, pepsina y tripsina. La lisis se puede realizar mediante la adición de un tampón de lisis al sustrato. Un tampón de lisis puede comprender Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 o 1 M o más de Tris HCl. Un tampón de lisis puede comprender como máximo aproximadamente 0,01,0,05, 0,1,0,5 o 1 M o más de Tris HCL. Un tampón de lisis puede comprender aproximadamente Tris HCl 0,1 M. El pH del tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. El pH del tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más. En algunas realizaciones, el pH del tampón de lisis es de aproximadamente 7,5. El tampón de lisis puede comprender una sal (por ejemplo, LiCl). La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser de al menos aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. La concentración de sal en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 0,1, 0,5 o 1 M o más. En algunas realizaciones, la concentración de sal en el tampón de lisis es aproximadamente 0,5M. El tampón de lisis puede comprender un detergente (por ejemplo, SDS, dodecilsulfato de litio, tritón X, tween, NP-40). La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7% o más. La concentración del detergente en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 0,0001, 0,0005, 0,001,0,005, 0,01,0,05, 0,1,0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7% o más. En algunas realizaciones, la concentración del detergente en el tampón de lisis es aproximadamente 1% de dodecilsulfato de litio. El tiempo empleado en el método de lisis puede depender de la cantidad de detergente utilizada. En algunas realizaciones, cuanto más detergente se usa, menos tiempo se necesita para la lisis. El tampón de lisis puede comprender un agente quelante (por ejemplo, EDTA, EGTA). La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser al menos aproximadamente 1,5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. La concentración de un agente quelante en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1,5, 10, 15, 20, 25 o 30 mM o más. En algunas realizaciones, la concentración de agente quelante en el tampón de lisis es de aproximadamente 10 mM. El tampón de lisis puede comprender un reactivo reductor (por ejemplo, betamercaptoetanol, DTT). La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser de al menos aproximadamente 1,5, 10, 15 o 20 mM o más. La concentración del reactivo reductor en el tampón de lisis puede ser como máximo aproximadamente 1,5, 10, 15 o 20 mM o más. En algunas realizaciones, la concentración de reactivo reductor en el tampón de lisis es de aproximadamente 5 mM. En algunas realizaciones, un tampón de lisis puede comprender aproximadamente TrisHCl 0,1 M, aproximadamente pH 7,5, LiCl aproximadamente 0,5 M, dodecil sulfato de litio aproximadamente al 1%, EDTA aproximadamente 10 mM y DTT aproximadamente 5 mM.

[0171] La lisis se puede realizar a una temperatura de aproximadamente 4, 10, 15, 20, 25 o 30°C. La lisis se puede realizar durante aproximadamente 1, 5, 10, 15 o 20 o más minutos. Una célula lisada puede comprender al menos aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácido nucleico diana. Una célula lisada puede comprender como máximo aproximadamente 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000 o 700000 o más moléculas de ácido nucleico diana.

Unión de los códigos de barras estocásticos a moléculas de ácido nucleico diana

[0172] Después de la lisis de las células y la liberación de moléculas de ácido nucleico de los mismos, las moléculas de ácido nucleico pueden aleatoriamente asociarse con los códigos de barras estocásticos del soporte sólido co­ localizado. La asociación puede comprender la hibridación de una región de reconocimiento de diana de un código de barras estocástico con una porción complementaria de la molécula de ácido nucleico diana (por ejemplo, el oligo(dT) del código de barras estocástico puede interactuar con una cola poli(A) de una diana). Las condiciones de ensayo utilizadas para la hibridación (por ejemplo, pH del tampón, fuerza iónica, temperatura, etc.) se pueden elegir para promover la formación de híbridos estables específicos. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico liberadas de las células lisadas pueden asociarse con la pluralidad de sondas en el sustrato (por ejemplo, hibridar con las sondas en el sustrato). Cuando las sondas comprenden oligo(dT), las moléculas de ARNm pueden hibridar con las sondas y someterse a transcripción inversa. La porción de oligo(dT) del oligonucleótido puede actuar como un cebador para la síntesis de la primera hebra de la molécula de ADNc.

[0173] La unión puede comprender además la unión de una región de reconocimiento de diana de un código de barras estocástico y una parte de la molécula de ácido nucleico diana. Por ejemplo, la región de unión a la diana puede comprender una secuencia de ácido nucleico que puede ser capaz de hibridación específica con un saliente de un sitio de restricción (por ejemplo, un saliente de extremo adhesivo EcoRI). El procedimiento de ensayo puede comprender además tratar los ácidos nucleicos diana con una enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI) para crear un saliente del sitio de restricción. El código de barras estocástico puede entonces ligarse a cualquier molécula de ácido nucleico que comprenda una secuencia complementaria al saliente del sitio de restricción. Se puede usar una ligasa (por ejemplo, ADN ligasa de T4) para unir los dos fragmentos.

[0174] Las dianas marcadas de una pluralidad de células (o una pluralidad de muestras) (por ejemplo, las moléculas diana de código de barras) pueden agruparse posteriormente, por ejemplo mediante la recuperación de los códigos de barras estocásticos y/o las cuentas a las que las moléculas diana de código de barras están adjuntas. La recuperación de colecciones basadas en soportes sólidos de moléculas de códigos de barras diana adjuntas se puede implementar mediante el uso de cuentas magnéticas y un campo magnético aplicado externamente. Una vez que se han agrupado las moléculas de código de barras diana, todo el procesamiento posterior puede proceder en un solo recipiente de reacción. El procesamiento adicional puede incluir, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa, reacciones de amplificación, reacciones de escisión, reacciones de disociación y/o reacciones de extensión de ácido nucleico. Pueden realizarse reacciones de procesamiento adicionales dentro de los micropocillos, es decir, sin reunir primero las moléculas de ácido nucleico diana marcadas de una pluralidad de células.

Transcripción inversa

[0175] La descripción proporciona un método para crear un conjugado diana-código de barras estocástico usando la transcripción inversa. El conjugado diana-código de barras puede comprender el código de barras estocástico y una secuencia complementaria de la totalidad o una porción del ácido nucleico diana (es decir, una molécula de ADNc con código de barras estocástico). La transcripción inversa de la molécula de ARN asociada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa junto con la transcriptasa inversa. El cebador de transcripción inversa puede ser un cebador oligo-dT, un cebador hexanucleotídico aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico de la diana. Los cebadores oligo-dT pueden tener, o pueden tener, aproximadamente 12-18 nucleótidos de longitud y se unen a la cola de poli(A) endógena en el extremo 3’ del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la diana típicamente ceban selectivamente el ARNm de interés.

[0176] En algunas realizaciones, la transcripción inversa de la molécula de ARN marcada puede ocurrir mediante la adición de un cebador de transcripción inversa. En algunas realizaciones, el cebador de transcripción inversa es un cebador oligo(dT), un cebador hexanucleotídico aleatorio o un cebador oligonucleotídico específico de diana. Generalmente, los cebadores de oligo(dT) tienen una longitud de 12-18 nucleótidos y se unen a la cola poli(A) endógena en el extremo 3’ del ARNm de mamífero. Los cebadores de hexanucleótidos aleatorios pueden unirse al ARNm en una variedad de sitios complementarios. Los cebadores de oligonucleótidos específicos de la diana típicamente ceban selectivamente el ARNm de interés.

[0177] La transcripción inversa puede ocurrir varias veces para producir múltiples moléculas de marcado con ADNc. Los métodos descritos en este documento pueden comprender realizar al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de transcripción inversa. El método puede comprender la realización de al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de transcripción inversa.

Amplificación

[0178] Una o más reacciones de amplificación de ácidos nucleicos se pueden realizar para crear múltiples copias de las moléculas de ácido nucleico diana marcadas. La amplificación se puede realizar de forma multiplexada, en donde se amplifican simultáneamente múltiples secuencias de ácido nucleico diana. La reacción de amplificación se puede utilizar para agregar adaptadores de secuenciación a las moléculas de ácido nucleico. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una parte de una etiqueta de muestra, si está presente. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una parte del marcador celular y/o molecular. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos una parte de una etiqueta de muestra, una etiqueta celular, una etiqueta espacial, una etiqueta molecular, un ácido nucleico diana o una combinación de los mismos. Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar 0,5%, 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 100% o un intervalo o un número entre dos cualesquiera de estos valores, de la pluralidad de ácidos nucleicos. El método puede comprender además realizar una o más reacciones de síntesis de ADNc para producir una o más copias de ADNc de moléculas de código de barras diana que comprenden una etiqueta de muestra, una etiqueta celular, una etiqueta espacial y/o una etiqueta molecular.

[0179] En algunas realizaciones, la amplificación se puede realizar usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Como aquí utilizado, PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea del cebador de cadenas complementarias de ADN. Como se usa en el presente documento, la PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, que incluyen, entre otras, RTPCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital y PCR de ensamblaje.

[0180] La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos no basados en PCR. Ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen, pero no se limitan a, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA), SDA en tiempo real, amplificación de círculo rodante, o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen múltiples ciclos de amplificación de transcripción de ARN dirigida por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar dianas de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR) y una replicasa Qp (Qp), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación dirigida por oligonucleótidos usando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en donde un cebador se hibrida con una secuencia de ácido nucleico y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, amplificación por desplazamiento de cadena utilizando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad exonucleasa 5’, amplificación por círculo rodante y amplificación por extensión de ramificación (RAM). En algunas realizaciones, la amplificación no produce transcripciones circularizadas.

[0181] En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento comprenden además la realización de una cadena de la polimerasa de reacción en el ácido nucleico marcado (por ejemplo, marcado con ARN, ADN-etiquetado, etiquetado-cADN) para producir un amplicón marcado estocásticamente. El amplicón marcado puede ser una molécula de doble hebra. La molécula de doble hebra puede comprender una molécula de ARN de doble hebra, una molécula de ADN de doble hebra o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas hebras de la molécula de doble hebra pueden comprender un marcador de muestra, un marcador espacial, un marcador celular y/o un marcador molecular. El amplicón marcado estocásticamente puede ser una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos de la divulgación pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.

[0182] La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales pueden incluir, entre otros, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicol (GNA) y ácido nucleico treosa (TNA). Pueden añadirse nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales puede usarse para identificar productos como ciclos específicos o puntos de tiempo en la reacción de amplificación.

[0183] La realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. El uno o más cebadores pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores pueden aparearse con al menos una parte de la pluralidad de dianas marcadas estocásticamente. El uno o más cebadores pueden aparearse con el extremo 3’ o el extremo 5' de la pluralidad de dianas marcadas estocásticamente. El uno o más cebadores pueden aparearse con una región interna de la pluralidad de dianas marcadas estocásticamente. La región interna puede ser al menos alrededor de 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos de los extremos 3’ de la pluralidad de dianas marcadas estocásticamente. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores específicos de genes.

[0184] El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. La imprimación universal puede aparearse a un sitio de unión de imprimación universal. El uno o más cebadores personalizados se pueden hibridar con una primera etiqueta de muestra, una segunda etiqueta de muestra, una etiqueta espacial, una etiqueta celular, una etiqueta molecular, una diana o cualquier combinación de los mismos. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado puede diseñarse para amplificar una o más dianas. Las dianas pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. Las dianas pueden comprender un subconjunto del total de dianas etiquetadas estocásticamente en una o más muestras. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 96 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 960 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos 9600 o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores personalizados se pueden hibridar con dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes. Los dos o más ácidos nucleicos marcados diferentes pueden corresponder a uno o más genes.

[0185] Cualquier esquema de amplificación se puede utilizar en los métodos de la presente divulgación. Por ejemplo, en un esquema, la primera ronda de PCR puede amplificar moléculas unidas a la cuenta usando un cebador específico de gen y un cebador contra la secuencia del cebador de secuenciación 1 universal de Illumina. La segunda ronda de PCR puede amplificar los primeros productos de PCR utilizando un cebador específico de gen anidado flanqueado por la secuencia del cebador de secuenciación 2 de Illumina y un cebador contra la secuencia del cebador de secuenciación 1 universal de Illumina. La tercera ronda de PCR agrega P5 y P7 y el índice de muestra para convertir los productos de PCR en una biblioteca de secuenciación de Illumina. La secuenciación mediante secuenciación de 150 pb x 2 puede revelar la etiqueta celular y el índice molecular en la lectura 1, el gen en la lectura 2 y el índice de la muestra en la lectura del índice 1.

[0186] En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos se pueden eliminar del sustrato usando escisión química. Por ejemplo, se puede usar un grupo químico o una base modificada presente en un ácido nucleico para facilitar su eliminación de un soporte sólido. Por ejemplo, se puede usar una enzima para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, un ácido nucleico puede eliminarse de un sustrato mediante una digestión con endonucelasa de restricción. Por ejemplo, el tratamiento de un ácido nucleico que contiene un dUTP o ddUTP con uracil-d-glicosilasa (UDG) puede usarse para eliminar un ácido nucleico de un sustrato. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede eliminar de un sustrato usando un enyme que realiza la escisión de nucleótidos, como una enzima de reparación de escisión de bases, como una endonucleasa apurínica/apirimidínica (AP). En algunas realizaciones, se puede eliminar un ácido nucleico de un sustrato usando un grupo fotoescindible y luz. En algunas realizaciones, se puede usar un enlazador escindible para eliminar un ácido nucleico del sustrato. Por ejemplo, el conector escindible puede comprender al menos uno de biotina/avidina, biotina/estreptavidina, biotina/neutravidina, Ig-proteína A, un enlazador foto-lábil, lábil en medio ácido o base grupo de engarce, o un aptámero.

[0187] Cuando las sondas son específicas de gen, las moléculas pueden hibridar con las sondas y transcribirse y/o amplificarse de forma inversa. En algunas realizaciones, después de que se ha sintetizado el ácido nucleico (por ejemplo, transcrito de forma inversa), puede amplificarse. La amplificación se puede realizar de forma multiplex, en donde se amplifican simultáneamente múltiples secuencias de ácido nucleico diana. La amplificación puede agregar adaptadores de secuenciación al ácido nucleico.

[0188] En algunas realizaciones, la amplificación se puede realizar en el sustrato, por ejemplo, con la amplificación puente. Los ADNc pueden tener colas de homopolímero para generar un extremo compatible para la amplificación en puente usando sondas oligo(dT) en el sustrato. En la amplificación en puente, el cebador que es complementario al extremo 3’ del ácido nucleico molde puede ser el primer cebador de cada par que se une covalentemente a la partícula sólida. Cuando una muestra que contiene el ácido nucleico molde se pone en contacto con la partícula y se realiza un solo ciclo térmico, la molécula molde se puede hibridar con el primer cebador y el primer cebador se alarga en la dirección de avance mediante la adición de nucleótidos para formar una molécula dúplex que consta de la molécula plantilla y una cadena de ADN recién formada que es complementaria a la plantilla. En la etapa de calentamiento del siguiente ciclo, la molécula dúplex se puede desnaturalizar, liberando la molécula plantilla de la partícula y dejando la hebra de ADN complementaria unida a la partícula a través del primer cebador. En la etapa de hibridación de la etapa de hibridación y alargamiento que sigue, la hebra complementaria puede hibridar con el segundo cebador, que es complementario a un segmento de la hebra complementaria en una ubicación eliminada del primer cebador. Esta hibridación puede hacer que la hebra complementaria forme un puente entre el primer y el segundo cebadores asegurados al primer cebador por un enlace covalente y al segundo cebador por hibridación. En la etapa de alargamiento, el segundo cebador se puede alargar en la dirección inversa mediante la adición de nucleótidos en la misma mezcla de reacción, convirtiendo así el puente en un puente de doble hebra. Entonces comienza el siguiente ciclo, y el puente bicatenario puede desnaturalizarse para producir dos moléculas de ácido nucleico monocatenario, cada una con un extremo unido a la superficie de la partícula mediante los cebadores primero y segundo, respectivamente, con el otro extremo de cada uno sin unir. En la etapa de hibridación y alargamiento de este segundo ciclo, cada hebra puede hibridar con un cebador complementario adicional, no utilizado previamente, en la misma partícula, para formar nuevos puentes de hebra única. Los dos cebadores no utilizados anteriormente que ahora se hibridan se alargan para convertir los dos nuevos puentes en puentes de doble hebra.

[0189] Las reacciones de amplificación pueden comprender amplificar al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o 100% de la pluralidad de ácidos nucleicos.

[0190] La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender métodos basados en PCR o métodos no basados en PCR. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación exponencial de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación de los ácidos nucleicos marcados puede comprender la amplificación lineal de los ácidos nucleicos marcados. La amplificación se puede realizar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR puede referirse a una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión simultánea del cebador de hebras complementarias de ADN. La PCR puede abarcar formas derivadas de la reacción, que incluyen, entre otras, RT-PCR, PCR en tiempo real, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR multiplexada, PCR digital, PCR de supresión, PCR semisupresora y PCR de ensamblaje.

[0191] En algunas realizaciones, la amplificación de los ácidos nucleicos marcados comprende métodos no basados en PCR. Ejemplos de métodos no basados en PCR incluyen, pero no se limitan a, amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación mediada por transcripción (TMA), amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), en tiempo real SDA, amplificación de círculo rodante o amplificación de círculo a círculo. Otros métodos de amplificación no basados en PCR incluyen múltiples ciclos de amplificación de transcripción de ARN dirigida por ARN polimerasa dependiente de ADN o síntesis y transcripción de ADN dirigida por ARN para amplificar objetivos de ADN o ARN, una reacción en cadena de ligasa (LCR), una Qp replicasa (QJ3), uso de sondas palindrómicas, amplificación por desplazamiento de cadena, amplificación impulsada por oligonucleótidos utilizando una endonucleasa de restricción, un método de amplificación en donde un cebador se hibrida con una secuencia de ácido nucleico y el dúplex resultante se escinde antes de la reacción de extensión y amplificación, cadena amplificación por desplazamiento utilizando una polimerasa de ácido nucleico que carece de actividad exonucleasa 5’, amplificación por círculo rodante y/o amplificación por extensión de ramificación (RAM).

[0192] En algunas realizaciones, los procedimientos divulgados en el presente documento comprenden además la realización de una reacción en cadena de polimerasa anidada en el amplicón amplificado (por ejemplo, blanco). El amplicón puede ser una molécula bicatenaria. La molécula de doble hebra puede comprender una molécula de ARN de doble hebra, una molécula de ADN de doble hebra o una molécula de ARN hibridada con una molécula de ADN. Una o ambas hebras de la molécula de doble hebra pueden comprender una etiqueta de muestra o una etiqueta de identificación molecular. Alternativamente, el amplicón puede ser una molécula monocatenaria. La molécula monocatenaria puede comprender ADN, ARN o una combinación de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden comprender ácidos nucleicos sintéticos o alterados.

[0193] En algunas realizaciones, el método comprende amplificar repetidamente el ácido nucleico marcado para producir múltiples amplicones. Los métodos descritos en este documento pueden comprender realizar al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 reacciones de amplificación. Alternativamente, el método comprende realizar al menos aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 reacciones de amplificación.

[0194] La amplificación puede comprender además la adición de uno o más ácidos nucleicos de control a una o más muestras que comprenden una pluralidad de ácidos nucleicos. La amplificación puede comprender además añadir uno o más ácidos nucleicos de control a una pluralidad de ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos de control pueden comprender un marcador de control.

[0195] La amplificación puede comprender el uso de uno o más nucleótidos no naturales. Los nucleótidos no naturales pueden comprender nucleótidos fotolábiles y/o activables. Los ejemplos de nucleótidos no naturales incluyen, pero no se limitan a, ácido nucleico peptídico (PNA), morfolino y ácido nucleico bloqueado (LNA), así como ácido nucleico glicol (GNA) y ácido nucleico treosa (TNA). Pueden añadirse nucleótidos no naturales a uno o más ciclos de una reacción de amplificación. La adición de nucleótidos no naturales puede usarse para identificar productos como ciclos específicos o puntos de tiempo en la reacción de amplificación.

[0196] La realización de una o más reacciones de amplificación puede comprender el uso de uno o más cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender uno o más oligonucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender al menos aproximadamente 7-9 nucleótidos. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender menos de 12-15 nucleótidos. El uno o más cebadores se pueden hibridar con al menos una porción de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores se pueden hibridar con el extremo 3’ y/o el extremo 5' de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden aparearse con una región interna de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. La región interna puede ser al menos alrededor de 50, 100, 150, 200, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 1000 nucleótidos de los extremos 3’ de la pluralidad de ácidos nucleicos marcados. El uno o más cebadores pueden comprender un panel fijo de cebadores. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores personalizados. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de control. El uno o más cebadores pueden comprender al menos uno o más cebadores de genes de mantenimiento. El uno o más oligonucleótidos pueden comprender una secuencia seleccionada de un grupo que consta de secuencias en la Tabla 23. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal. La imprimación universal puede aparearse a un sitio de unión de imprimación universal. El uno o más cebadores personalizados pueden aparearse con la primera etiqueta de muestra, la segunda etiqueta de muestra, la etiqueta de identificación molecular, el ácido nucleico o un producto del mismo. El uno o más cebadores pueden comprender un cebador universal y un cebador personalizado. El cebador personalizado puede diseñarse para amplificar uno o más ácidos nucleicos diana. Los ácidos nucleicos diana pueden comprender un subconjunto de los ácidos nucleicos totales en una o más muestras. En algunas realizaciones, los cebadores son las sondas unidas a la matriz de la divulgación.

[0197] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra comprende además la generación de una biblioteca indexada de las dianas con barras codificadas estocásticamente.

Las etiquetas moleculares de diferentes códigos de barras estocásticos pueden ser diferentes entre sí. La generación de una biblioteca indexada de las dianas con codificación de barras estocástica incluye generar una pluralidad de polinucleótidos indexados a partir de la pluralidad de dianas en la muestra. Por ejemplo, para una biblioteca indexada de las dianas con códigos de barras estocásticos que comprenden una primera diana indexada y una segunda diana indexada, la región de etiqueta del primer polinucleótido indexado puede diferir de la región de etiqueta del segundo polinucleótido indexado en al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco nucleótidos. En algunas realizaciones, generar una biblioteca indexada de las dianas con codificación de barras estocástica incluye poner en contacto una pluralidad de dianas, por ejemplo moléculas de ARNm, con una pluralidad de oligonucleótidos que incluyen una región poli(T) y una región marcadora; y llevar a cabo una síntesis de la primera hebra usando una transcriptasa inversa para producir moléculas de ADNc marcadas de una sola hebra, cada una de las cuales comprende una región de ADNc y una región marcadora, en donde la pluralidad de dianas incluye al menos dos moléculas de ARNm de diferentes secuencias y la pluralidad de oligonucleótidos incluye al menos dos oligonucleótidos de diferentes secuencias. La generación de una biblioteca indexada de las dianas con codificación de barras estocástica puede comprender además amplificar las moléculas de cADN marcadas de una sola hebra para producir moléculas de cADN marcadas de doble hebra; y realizar una PCR anidados en las moléculas de ADNc marcadas de doble cadena para producir amplicones marcados. En algunas realizaciones, el método puede incluir generar un amplicón marcado con adaptador.

[0198] Códigos de barras estocásticos pueden utilizar los códigos de barras de ácidos nucleicos o etiquetas para etiquetar moléculas de ácido nucleico individual (por ejemplo, ADN o ARN). En algunas realizaciones, implica la adición de códigos de barras o etiquetas de ADN a moléculas de ADNc a medida que se generan a partir de ARNm. Se puede realizar una PCR anidados para minimizar el sesgo de amplificación de la PCR. Se pueden agregar adaptadores para la secuenciación usando, por ejemplo, secuenciación de próxima generación (NGS).

[0199] La Figura 4 es una ilustración esquemática que muestra un proceso ejemplar no limitante de generar una biblioteca indexada de las dianas con codificación de barras estocástica, por ejemplo ARNm. Como se muestra en el paso 1, el proceso de transcripción inversa puede codificar cada molécula de ARNm con una etiqueta molecular única, una etiqueta espacial y un sitio de PCR universal. En particular, las moléculas de ARN 402 se pueden transcribir de forma inversa para producir moléculas de ADNc marcadas 404, incluida una región de ADNc 406, mediante la hibridación estocástica de un conjunto de etiquetas de identificación molecular 410 con la región de la cola poli(A) 408

de las moléculas de ARN 402. Cada una de las etiquetas 410 de identificación molecular puede comprender una región de unión a la diana, por ejemplo, una región 412 de poli(dT), una región 414 de marca y una región 416 de PCR universal.

[0200] En algunas realizaciones, la etiqueta espacial puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el marcador molecular puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende además una o más de una etiqueta universal y una etiqueta celular, en donde las etiquetas universales son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido y las etiquetas celulares son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido. En algunas realizaciones, el marcador universal puede incluir de 3 a 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el marcador celular comprende de 3 a 20 nucleótidos.

[0201] En algunas realizaciones, la región de la etiqueta 414 puede incluir una etiqueta molecular 418 y una etiqueta espacial 420. En algunas realizaciones, la región de etiqueta 414 puede incluir una o más de una etiqueta universal, un etiqueta de dimensión, y una etiqueta celular. La etiqueta molecular 418 puede ser, o puede ser aproximadamente,

1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. La etiqueta espacial 420 puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. La etiqueta universal puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90, 100 o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. Las etiquetas universales pueden ser las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido y las etiquetas celulares son las mismas para la pluralidad de códigos de barras estocásticos en el soporte sólido. La etiqueta de dimensión puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 100 o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud.

[0202] En algunas realizaciones, la región de etiqueta 414 puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40,

50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, diferentes etiquetas, como una etiqueta molecular 418 y una etiqueta espacial 420. Cada etiqueta puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, de nucleótidos de longitud. Un conjunto de etiquetas de identificación molecular 410 puede contener 10 , 20, 40 , 50 , 70 , 80 , 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 1014, 1015, 1020, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, etiquetas de identificación molecular

410. Y el conjunto de etiquetas de identificación molecular 410 puede, por ejemplo, contener cada una una región marcadora única 414. Las moléculas de ADNc marcadas 404 pueden purificarse para eliminar el exceso de etiquetas de identificación molecular 410. La purificación puede comprender la purificación de cuentas Ampure.

[0203] Como se muestra en el paso 2, los productos del proceso de transcripción inverso en el paso 1 se pueden agrupar en 1 tubo y amplificado por PCR con un 1° grupo de cebador de PCR y un 1° cebador universal PCR. La combinación es posible debido a la región marcadora única 414. En particular, las moléculas de ADNc marcadas 404 pueden amplificarse para producir amplicones 422 marcados por PCR anidados. La amplificación puede comprender amplificación por PCR múltiple. La amplificación puede comprender una amplificación por PCR multiplex con 96 cebadores multiplex en un solo volumen de reacción. En algunas realizaciones, la amplificación por PCR multiplex puede utilizar 10, 20, 40, 50, 70, 80, 90, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1020, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, cebadores multiplex en un solo volumen de reacción. La amplificación puede comprender un 1° cebador de PCR 424 de cebadores personalizados 426A-C dirigiendo genes específicos y un cebador universal 428. Los cebadores personalizados 426 pueden hibridar a una región dentro de la porción de ADNc de 406' de la molécula de ADNc marcado 404. El cebador universal 428 se puede hibridar con la región de PCR universal 416 de la molécula de ADNc marcado 404.

[0204] Como se muestra en el paso 3 de la Figura 4, los productos de amplificación por PCR en el paso 2 se pueden amplificar con un grupo de cebadores de PCR anidados y un 2° cebador universal PCR. La PCR anidados puede minimizar el sesgo de amplificación de la PCR. En particular, los amplicones 422 anidados marcados con PCR pueden amplificarse adicionalmente mediante PCR anidada. La PCR anidados puede comprender PCR multiplex con el grupo de cebadores de PCR anidadoa 430 de cebadores de PCR anidados 432A-C y un 2° cebador universal de PCR 428' en un solo volumen de reacción. El grupo de cebadores de PCR anidado 428 puede contener, o contener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, o un número o un intervalo entre cualquiera de estos valores, diferentes cebadores de PCR anidados 430.

Los cebadores de PCR anidados 432 pueden contener un adaptador 434 e hibridar a una región dentro de la porción de ADNc 406" del amplicón 422 marcado. El cebador universal 428' puede contener un adaptador 436 y se hibridan con la región PCR universal 416 del amplicón etiquetado 422. Por lo tanto, la etapa 3 produce amplicón de adaptador marcado 438. En algunas realizaciones, cebadores de PCR anidados 432 y el 2° cebador universal de PCR 428' puede no contener los adaptadores 434 y 436. Los adaptadores 434 y 436 pueden ligarse a los productos de la PCR anidados para producir amplicón etiquetado por adaptador 438.

[0205] Como se muestra en el paso 4, los productos PCR de la etapa 3 pueden ser amplificados por PCR para la secuenciación usando cebadores de amplificación de la biblioteca. En particular, los adaptadores 434 y 436 pueden usarse para realizar uno o más ensayos adicionales en el amplicón 438 marcado con adaptador. Los adaptadores 434 y 436 pueden hibridarse con los cebadores 440 y 442. El uno o más cebadores 440 y 442 pueden ser cebadores de amplificación por PCR. El uno o más cebadores 440 y 442 pueden ser cebadores de secuenciación. El uno o más adaptadores 434 y 436 se pueden usar para una mayor amplificación de los amplicones 438 etiquetados con adaptador. El uno o más adaptadores 434 y 436 se pueden usar para secuenciar el amplicón 438 etiquetado con adaptadores. El cebador 442 puede contener un índice de placa 444, de modo que que los amplicones generados usando el mismo conjunto de etiquetas 408 de identificación molecular pueden secuenciarse en una reacción de secuenciación usando NGS.

Secuenciación

[0206] En algunas realizaciones, la estimación del número de la pluralidad de dianas utilizando la etiqueta molecular incluye la determinación de secuencias de las etiquetas espaciales y etiquetas moleculares de la pluralidad de las etiquetas estocásticas y contando el número de las etiquetas moleculares con secuencias distintas. La determinación de las secuencias de las etiquetas espaciales y las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir secuenciar parte o la totalidad de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. La secuenciación de parte o la totalidad de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir la generación de secuencias, cada una con una longitud de lectura de 100 o más bases.

[0207] La determinación del número de diferentes ácidos nucleicos etiquetados estocásticamente puede comprender determinar la secuencia de la diana etiquetada, la etiqueta espacial, la etiqueta molecular, la etiqueta de la muestra y la etiqueta celular o cualquier producto del mismo (por ejemplo, amplicones etiquetados, moléculas de ADNc etiquetadas). Una diana amplificada puede someterse a secuenciación. Determinar la secuencia del ácido nucleico marcado estocásticamente o cualquier producto del mismo puede comprender realizar una reacción de secuenciación para determinar la secuencia de al menos una parte de una etiqueta de muestra, una etiqueta espacial, una etiqueta celular, una etiqueta molecular, al menos una parte de la diana marcada estocásticamente, un complemento del mismo, un complemento inverso del mismo o cualquier combinación de los mismos.

[0208] La determinación de la secuencia de un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico amplificado, ácido nucleico marcado, copia de ADNc de un ácido nucleico marcado, etc.) se puede realizar usando una variedad de métodos de secuenciación que incluyen, entre otros, secuenciación por hibridación. (SBH), secuenciación por ligadura (SBL), secuenciación cuantitativa incremental de adición de nucleótidos fluorescentes (QIFNAS), ligadura y escisión por pasos, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET), balizas moleculares, digestión con sonda informadora TaqMan, pirosecuenciación, secuenciación fluorescente in situ (FISSEQ), cuentas FISSEQ, secuenciación de oscilación, secuenciación multiplex, secuenciación de colonias polimerizadas (POLONY); secuenciación de círculo rodante de nanogrid (ROLONY), ensayos de ligadura de oligonucleótidos específicos de alelos (p. ej., ensayo de ligadura de oligonucleótidos (OLA), molécula de plantilla única OLA utilizando una sonda lineal ligada y una lectura de amplificación de círculo rodante (RCA), sondas de candado ligadas o plantilla única molécula OLA usando una sonda de candado circular ligada y una lectura de amplificación de círculo rodante (RCA)), y similares.

[0209] En algunas realizaciones, la determinación de la secuencia del ácido nucleico marcada o cualquier producto del mismo comprende la secuencia de extremo emparejado, secuenciación de nanoporos, el rendimiento de alta secuenciación, secuenciación escopeta, secuenciación de tinción-terminador, la secuencia de ADN de cebadores múltiples, cebador con paseo, secuenciación didesoxi de Sanger, secuenciación Maxim-Gilbert, pirosecuenciación, secuenciación verdadera de una sola molécula o cualquier combinación de las mismas. Alternativamente, la secuencia del ácido nucleico marcado o cualquier producto del mismo puede determinarse mediante microscopía electrónica o una matriz de transistores de efecto de campo químico sensible (chemFET).

[0210] Métodos de secuenciación de gran procesamiento, tales como secuenciación de matriz cíclica utilizando plataformas como Roche 454, Illumina Solexa, ABI-SOLiD, ION Torrent, Complete Genomics, Pacific Bioscience, Helicos, o la plataforma Polonator, pueden también ser utilizados. En alguna realización, la secuenciación puede comprender la secuenciación de MiSeq. En alguna realización, la secuenciación puede comprender la secuenciación de HiSeq.

[0211] Las dianas estocásticamente marcadas pueden comprender ácidos nucleicos que representan desde aproximadamente 0,01% de los genes del genoma de un organismo a aproximadamente 100% de los genes de genoma de un organismo. Por ejemplo, aproximadamente el 0,01% de los genes del genoma de un organismo hasta aproximadamente el 100% de los genes del genoma de un organismo pueden secuenciarse usando una región complementaria diana que comprende una pluralidad de multímeros capturando los genes que contienen una secuencia complementaria de la muestra. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos marcados comprenden ácidos nucleicos que representan desde aproximadamente el 0,01% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo hasta aproximadamente el 100% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo. Por ejemplo, aproximadamente el 0,501% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo hasta aproximadamente el 100% de las transcripciones del transcriptoma de un organismo se pueden secuenciar utilizando una región complementaria diana que comprende una cola de poli-T capturando los ARNm de la muestra.

[0212] La determinación de las secuencias de las etiquetas espaciales y las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir secuenciar 0,00001%, 0,0001%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 100% o cualquier número o intervalo entre dos de estos valores, de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. La determinación de las secuencias de las etiquetas espaciales y las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir la secuenciación 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 10 16, 10 17, 10 18, 10 19, 1020, o cualquier número o oscilar entre dos de estos valores, de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. La secuenciación de parte o la totalidad de la pluralidad de códigos de barras estocásticos puede incluir la generación de secuencias, cada una con una longitud de lectura de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o cualquier número o intervalo entre dos de estos valores, de nucleótidos o bases.

[0213] La secuenciación puede comprender secuenciar al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado. La secuenciación puede comprender secuenciar al menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado. La secuenciación puede comprender secuenciar al menos aproximadamente 1,500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más nucleótidos o pares de bases del ácido nucleico marcado.

[0214] La secuenciación puede comprender al menos aproximadamente 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000 o más lecturas de secuenciación por ejecución. En algunas realizaciones, la secuenciación comprende secuenciar al menos aproximadamente 1.500; 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6.000; 7.000; 8.000; 9.000; o 10.000 o más lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender menos de o igual a aproximadamente 1.600.000.000 de lecturas de secuenciación por ejecución. La secuenciación puede comprender menos de o igual a aproximadamente 200.000.000 de lecturas por ejecución.

Muestras

[0215] Una muestra para su uso en el método de la divulgación puede comprender una o más células. Una muestra puede referirse a una o más células. En algunas realizaciones, la pluralidad de células puede incluir uno o más tipos de células. Al menos uno de los uno o más tipos de células puede ser célula cerebral, célula cardíaca, célula cancerosa, célula tumoral circulante, célula orgánica, célula epitelial, célula metastásica, célula benigna, célula primaria, célula circulatoria o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las células son células cancerosas extirpadas de un tejido canceroso, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de cerebro, cánceres de piel melanoma y no melanoma, y similares. En algunas realizaciones, las células se derivan de un cáncer pero se recogen de un fluido corporal (por ejemplo, células tumorales circulantes). Los ejemplos no limitantes de cánceres pueden incluir adenoma, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, carcinoma de células pequeñas, carcinoma indiferenciado de células grandes, condrosarcoma y fibrosarcoma. La muestra puede incluir un tejido, una monocapa celular, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos. La muestra puede incluir una muestra biológica, una muestra clínica, una muestra ambiental, un fluido biológico, un tejido o una célula de un sujeto. La muestra se puede obtener de un ser humano, un mamífero, un perro, una rata, un ratón, un pez, una mosca, un gusano, una planta, un hongo, una bacteria, un virus, un vertebrado o un invertebrado.

[0216] En algunas realizaciones, las células son células que han sido infectadas con virus y contener oligonucleótidos virales. En algunas realizaciones, la infección viral puede ser causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en virus de ADN de doble hebra (por ejemplo, adenovirus, virus del herpes, virus de la viruela), virus de ADN de hebra simple (+ hebra o "sentido") (por ejemplo, parvovirus), virus ARN bicatenarios (p. ej., reovirus), virus ARN monocatenarios (+ hebra o sentido) (p. ej. picornavirus, togavirus), virus ARN monocatenarios (- hebra o antisentido) (p. ej. ortomixovirus, rabdovirus), monocatenarios (virus de ARN (+ hebra o sentido) con un intermedio de ADN en su ciclo de vida) virus ARN-RT (por ejemplo, retrovirus) y virus de ADN-RT de doble cadena (por ejemplo, hepadnavirus). Los virus ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, SARS, VIH, coronavirus, Ébola, Malaria, Dengue, Hepatitis C, Hepatitis B e Influenza.

[0217] En algunas realizaciones, las células son bacterias. Estas pueden incluir bacterias grampositivas o gramnegativas. Los ejemplos de bacterias que pueden analizarse utilizando los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen, pero no se limitan a, Actinomedurae, Actinomyces israelii, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Corynebacterium, Enterococccus faecalis, Listeria monocytogenes, Nocardia, Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae y similares. Bacterias Gram negativas incluyen, pero no se limitan a, felis Afipia, Bacteriodes, Bartonella bacilliformis, Bortadella pertussis, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrentis, Brucella, Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter, Escherichia coli, Francisella tularensis, Gardnerella vaginalis, Haemophilus aegyptius, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenziae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, meningitidia Neisseria, Porphyromonas gingivalis, Providencia sturti, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Enteridis, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella boydii, Streptobacillus moniliformis, Streptococcus pyogenes, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis y similares. Otras bacterias pueden incluir Myobacterium avium, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Bartonella henseiae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae, Rickettsia akari, Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rickettsia, Rickettsia, Rickettsia, Rickettsia. chafensis, Enterococcus faecium, Meningococci y similares.

[0218] En algunas formas de realización, las células son hongos. Los ejemplos no limitantes de hongos que pueden analizarse usando los métodos, dispositivos y sistemas descritos incluyen, pero no se limitan a, Aspergilli, Candidae, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococci y combinaciones de los mismos.

[0219] En algunas realizaciones, las células son protozoos u otros parásitos. Los ejemplos de parásitos que se analizarán usando los métodos, dispositivos y sistemas de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, Balantidium coli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis, Encephalitozoa, Entamoeba histolytica, Enterocytozoon bieneusi, Giardia lamblia, Leishmaniae, Plasmodiimaniae, Toxoplasma gondii, Trypanosomae, ameba trapezoidal, gusanos (p. ej., Helmintos), en particular gusanos parásitos, incluidos, entre otros, Nematoda (gusanos redondos, p. ej., Tricocéfalos, anquilostomas, oxiuros, ascáridos, filaridos y similares), Cestoda (p. ej., tenias).

[0220] Tal como se utiliza aquí, el término "célula" puede referirse a una o más células. En algunas realizaciones, las células son células normales, por ejemplo, células humanas en diferentes etapas de desarrollo, o células humanas de diferentes órganos o tipos de tejidos (por ejemplo, glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas, células epiteliales, células endoteliales, neuronas, células gliales, fibroblastos, células del músculo esquelético, células del músculo liso, gametos o células del corazón, pulmones, cerebro, hígado, riñón, bazo, páncreas, timo, vejiga, estómago, colon, intestino delgado). En algunas realizaciones, las células pueden ser células madre humanas indiferenciadas o células madre humanas que se han inducido a diferenciarse. En algunas realizaciones, las células pueden ser células humanas fetales. Las células fetales humanas se pueden obtener de una madre embarazada del feto. En algunas realizaciones, las células son células raras. Una célula rara puede ser, por ejemplo, una célula tumoral circulante (CTC), una célula epitelial circulante, una célula endotelial circulante, una célula endometrial circulante, una célula madre circulante, una célula madre, una célula madre indiferenciada, una célula madre cancerosa, una célula de la médula ósea, una célula progenitora., célula espumosa, célula mesenquimatosa, trofoblasto, célula del sistema inmunológico (huésped o injerto), fragmento celular, orgánulo celular (por ejemplo, mitocondrias o núcleos), célula infectada con patógenos y similares.

[0221] En algunas realizaciones, las células son células no humanas, por ejemplo, otros tipos de células de mamíferos (por ejemplo, ratón, rata, cerdo, perro, vaca, o caballo). En algunas realizaciones, las células son otros tipos de células animales o vegetales. En otras realizaciones, las células pueden ser cualquier célula procariota o eucariota.

[0222] En algunas realizaciones, una primera muestra de células se obtiene de una persona que no tenga una enfermedad o condición, y una segunda muestra de células se obtiene de una persona que tiene la enfermedad o condición. En algunas realizaciones, las personas son diferentes. En algunas realizaciones, las personas son las mismas, pero las muestras de células se toman en diferentes momentos. En algunas realizaciones, las personas son pacientes y las muestras de células son muestras de pacientes. La enfermedad o afección puede ser un cáncer, una infección bacteriana, una infección viral, una enfermedad inflamatoria, una enfermedad neurodegenerativa, una enfermedad fúngica, una enfermedad parasitaria, un trastorno genético o cualquier combinación de los mismos.

[0223] En algunas realizaciones, las células adecuadas para su uso en los métodos descritos actualmente pueden variar en tamaño desde aproximadamente 2 micrómetros hasta aproximadamente 100 micrómetros de diámetro. En algunas realizaciones, las células pueden tener diámetros de al menos 2 micrómetros, al menos 5 micrómetros, al menos 10 micrómetros, al menos 15 micrómetros, al menos 20 micrómetros, al menos 30 micrómetros, al menos 40 micrómetros, al menos 50 micrómetros, al menos 60 micrómetros, al menos 70 micrómetros, al menos 80 micrómetros, al menos 90 micrómetros o al menos 100 micrómetros. En algunas realizaciones, las células pueden tener diámetros de como máximo 100 micrómetros, como máximo 90 micrómetros, como máximo 80 micrómetros, como máximo 70 micrómetros, como máximo 60 micrómetros, como máximo 50 micrómetros, como máximo 40 micrómetros, como máximo 30 micrómetros, como máximo 20 micrómetros, como máximo 15 micrómetros, como máximo 10 micrómetros, como máximo 5 micrómetros o como máximo 2 micrómetros. Las células pueden tener un diámetro de cualquier valor dentro de un intervalo, por ejemplo, de aproximadamente 5 micrómetros a aproximadamente 85 micrómetros. En algunas realizaciones, las células tienen diámetros de aproximadamente 10 micrómetros.

[0224] En algunas realizaciones, las células se clasifican antes de asociar una célula con una cuenta. Por ejemplo, las células se pueden clasificar mediante clasificación de células activadas por fluorescencia o clasificación de células activadas magnéticamente, o más generalmente mediante citometría de flujo. Las células se pueden filtrar por tamaño. En algunas realizaciones, un retenido contiene las células que se asociarán con la cuenta. En algunas realizaciones, el flujo continuo contiene las células que se asociarán con la cuenta.

[0225] Una muestra puede referirse a una pluralidad de células. La muestra puede referirse a una monocapa de células. La muestra puede referirse a una sección delgada (por ejemplo, una sección delgada de tejido). La muestra puede referirse a una colección de células sólidas o semisólidas que se pueden colocar en una dimensión en una matriz.

Resolución de etiquetas espaciales

[0226] Los métodos de la divulgación se refieren a la relación entre la resolución de etiquetas espaciales y el tamaño y/o espaciado de los códigos de barras estocásticos (por ejemplo, células). Cuando las muestras son más grandes que el espaciado de las etiquetas espaciales, la resolución de los objetivos en la muestra puede ser mayor. Cuando las muestras son más pequeñas que el espaciado de las etiquetas espaciales, la resolución de la ubicación de las dianas en la muestra puede ser menor.

[0227] Los códigos de barras estocásticos se pueden espaciar a una distancia de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100% de la dimensión más larga de la muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden espaciar a una distancia máxima de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% de la dimensión más larga de la muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden espaciar a una distancia de al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% de la dimensión más corta de la muestra. Los códigos de barras estocásticos se pueden espaciar a una distancia máxima de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100% de la dimensión más corta de la muestra.

[0228] Una muestra puede asociar con uno o más tipos de códigos de barras estocásticos, en donde cada tipo de código de barras estocástico comprende una etiqueta espacial diferente. Una muestra puede asociarse con al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más tipos de códigos de barras estocásticos (por ejemplo, diferentes etiquetas espaciales). Una muestra puede asociarse con como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más tipos de códigos de barras estocásticos (por ejemplo, diferentes etiquetas espaciales). El número de tipos de códigos de barras estocásticos a los que se puede asociar una muestra puede estar relacionado con el espaciado de los códigos de barras en relación con el tamaño de la muestra.

[0229] En algunas realizaciones, los métodos de la descripción se refieren a la relación entre la resolución de etiquetas espaciales y el espaciado de las muestras. Cuando las muestras están muy separadas (p. ej., sobre un sustrato), la resolución espacial de las dianas en la muestra puede ser mayor porque la difusión entre muestras puede no contaminar las muestras. Cuando las muestras están muy juntas (por ejemplo, en un sustrato), la resolución espacial de las dianas en la muestra puede ser menor porque la difusión de las dianas entre las muestras puede contaminar una muestra vecina.

[0230] Las muestras pueden espaciarse al menos 1, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más micrómetros aparte. Las muestras pueden tener una separación máxima de 1, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más micrómetros. Las muestras pueden estar espaciadas al menos 1, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más milímetros. Las muestras pueden tener una separación máxima de 1, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más milímetros. Las muestras se pueden espaciar al menos 1, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más metros. Las muestras pueden estar espaciadas como máximo 1, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más metros.

[0231] Las dianas de una muestra pueden difundir al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más nanómetros. Las dianas de una muestra pueden difundirse como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 o más nanómetros. Las dianas de una muestra pueden difundir al menos 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 o más milímetros. Las dianas de una muestra pueden difundirse como máximo 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 o más milímetros.

Métodos para la identificación espacial de un ácido nucleico en una muestra

[0232] Se describen en el presente documento métodos para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de dianas en una muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: obtener imágenes de la muestra para generar una imagen de muestra; codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos para generar dianas con códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial. La identificación de la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial puede incluir correlacionar la imagen de muestra con las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra. La formación de imágenes de la muestra puede incluir teñir la muestra con un tinte, en donde el tinte es un tinte fluorescente, un tinte negativo, un tinte de anticuerpo o cualquier combinación de los mismos. La formación de imágenes de la muestra puede incluir la formación de imágenes de la muestra utilizando microscopía óptica, microscopía electrónica, microscopía confocal, microscopía de fluorescencia o cualquier combinación de los mismos. Correlacionar la imagen de muestra con las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir superponer la imagen de muestra con las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra. La muestra puede incluir una muestra biológica, una muestra clínica, una muestra ambiental, un fluido biológico, un tejido o una célula de un sujeto. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir determinar el genotipo, fenotipo o una o más mutaciones genéticas del sujeto basándose en las etiquetas espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir predecir la susceptibilidad del sujeto a una o más enfermedades. Al menos una de las una o más enfermedades puede ser cáncer o una enfermedad hereditaria. La muestra puede incluir una pluralidad de células y la pluralidad de dianas puede asociarse con la pluralidad de células. La pluralidad de células puede incluir uno o más tipos de células. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir determinar los tipos de células de la pluralidad de células en la muestra. El fármaco puede elegirse basándose en la capacidad de respuesta prevista de los tipos de células de la pluralidad de células de la muestra.

Formación de imágenes

[0233] La muestra en contacto con el sustrato se puede analizar (por ejemplo, con inmunohistoquímica, tinción y/o formación de imágenes). Los métodos ejemplares de inmunohistoquímica pueden comprender un paso de hacer reaccionar una sustancia biológica de sonda marcada obtenida mediante la introducción de una marca en una sustancia capaz de reconocer una sustancia biológica a detectar en una sección de tejido, para visualizar la sustancia biológica que se detectará presente en la sección de tejido mediante una reacción de unión específica entre las sustancias biológicas.

[0234] Para las muestras de histología, las partes de tejido pueden ser fijadas en un fijador adecuado, típicamente formalina, y embebidas en cera de parafina fundida. El bloque de cera se puede cortar en un micrótomo para producir una fina rebanada de parafina que contiene el tejido. La rodaja de muestra se puede aplicar a un sustrato, secar al aire y calentar para hacer que la muestra se adhiera al portaobjetos de vidrio. La parafina residual se puede disolver con un disolvente adecuado, típicamente xileno, tolueno u otros. Estos disolventes denominados desparafinadores pueden eliminarse con un reactivo de tipo lavado-deshidratante antes de la tinción. Las rebanadas se pueden preparar a partir de muestras congeladas, se fijan brevemente en formalina al 10% y luego se infunden con reactivo deshidratante. El reactivo deshidratante se puede eliminar antes de teñir con un tinte acuoso.

[0235] En algunas realizaciones, la técnica de tinción de Papanicolaou se puede utilizar (por ejemplo, una mancha progresiva y/o hematoxilina [H&E], es decir, una mancha regresiva). La tinción HE (hematoxilina-eosina) utiliza hematoxilina y eosina como tinte. La hematoxilina es un tinte azul-violeta y tiene la propiedad de teñir tejidos basófilos como núcleos celulares, tejidos óseos, parte de los tejidos del cartílago y componentes serosos. La eosina es un tinte de rojo a rosa y tiene la propiedad de teñir tejidos eosinofílicos como el citoplasma, los tejidos conectivos del tejido blando, los glóbulos rojos, la fibrina y los gránulos endocrinos.

[0236] La inmunohistoquímica (IHC) puede denominarse "tinción inmunológica'' debido al proceso de desarrollo del color para visualizar una reacción antígeno-anticuerpo que de otro modo es invisible (de aquí en adelante, el término "tinción inmunohistoquímica" puede usarse para inmunohistoquímica). La tinción de lectina es una técnica que puede utilizar una propiedad de la lectina de unirse a una cadena de azúcar específica de una manera no inmunológica y específica para detectar una cadena de azúcar en una muestra de tejido utilizando lectina.

[0237] La tinción con HE, la inmunohistoquímica y la tinción con lectina se pueden usar para detectar una ubicación de, por ejemplo, células cancerosas en una muestra celular. Por ejemplo, cuando se desea confirmar la ubicación de las células cancerosas en una muestra celular, un patólogo, para determinar la presencia o ausencia de células cancerosas en la muestra celular, puede preparar secciones de tejido y colocarlas sobre un sustrato de la divulgación. La sección de la matriz puede someterse a tinción HE, formación de imágenes o cualquier análisis inmunohistoquímico para obtener su información morfológica y/o cualquier otra característica de identificación (como la presencia o ausencia de células raras). La muestra se puede lisar y la presencia o ausencia de moléculas de ácido nucleico se puede determinar usando los métodos de la divulgación. La información del ácido nucleico puede compararse (por ejemplo, compararse espacialmente) con la imagen, indicando así la ubicación espacial de los ácidos nucleicos en una muestra.

[0238] En algunas realizaciones, el tejido se tiñó con un promotor de tinción (por ejemplo, un potenciador de penetración química). Ejemplos de potenciadores de penetrantes químicos tisulares que facilitan la penetración de la mancha en el tejido incluyen, entre otros, polietilenglicol (PEG), tensioactivos como polioxietilenosorbitanos, éteres de polioxietileno (polioxietilensorbitano monolaurato (Tween 20) y otros derivados de Tween, polioxietileno 23 éter laurílico (Brij 35), T riton X-100, Brij 35, Nonidet P-40, sustancias similares a detergentes como lisolecitinas, saponinas, detergentes no iónicos como TRITON® X-100, etc., disolventes apróticos como dimetil sulfóxido (DMSO), éteres como tetrahidrofurano, dioxano, etc.; ésteres como acetato de etilo, acetato de butilo, acetato de isopropilo; hidrocarburos como tolueno, disolventes clorados como diclorometano, dicloroetano, clorobenceno, etc.; cetonas como acetona, nitrilos tales como acetonitrilo, y/u otros agentes que aumentan la permeabilidad celular de la membrana.

[0239] En algunas realizaciones, una composición se proporciona que facilita la tinción de una muestra de tejido de mamífero. La composición puede comprender un tinte, tal como hematoxilina, o hematoxilina y eosina-Y, al menos un potenciador penetrante químico tisular, tal como un tensioactivo, un disolvente aprótico y/o PEG, o cualquier combinación de los mismos.

[0240] En algunas realizaciones, se forma la imagen de la muestra (por ejemplo, ya sea antes o después de IHC o sin IHC). Las imágenes pueden comprender microscopía como imágenes de campo brillante, iluminación oblicua, imágenes de campo oscuro, tinción de dispersión, contraste de fase, contraste de interferencia diferencial, microscopía de reflexión de interferencia, microscopía de fluorescencia, confocal, electrónica, microscopía electrónica de transmisión, microscopía electrónica de barrido e iluminación de un solo plano, o cualquier combinación de los mismos. La formación de imágenes puede comprender el uso de una tinción negativa (por ejemplo, nigrosina, molibdato de amonio, acetato de uranilo, formiato de uranilo, ácido fosfotúngstico, tetróxido de osmio). La formación de imágenes puede comprender el uso de metales pesados (por ejemplo, oro, osmio) que pueden dispersar electrones.

[0241] La formación de imágenes puede comprender la formación de imágenes de una parte de la muestra (por ejemplo, un portaobjetos/matriz). La formación de imágenes puede comprender la formación de imágenes de al menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de la muestra. La formación de imágenes puede comprender la formación de imágenes como máximo el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% de la muestra. La obtención de imágenes se puede realizar en pasos discretos (por ejemplo, es posible que no sea necesario que la imagen sea contigua). La formación de imágenes puede comprender tomar al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más imágenes diferentes. La formación de imágenes puede comprender tomar como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más imágenes diferentes.

Detección

[0242] La superficie del sustrato se puede poner en contacto con una o más dianas en condiciones que promueven unión específica, de alta afinidad (es decir, la hibridación) de la diana a una o más de las sondas. Los ácidos nucleicos diana pueden hibridar con ácidos nucleicos complementarios de los marcadores ópticos de oligonucleótidos conocidos y, por lo tanto, se puede obtener información sobre las muestras diana. Las dianas se pueden marcar con una etiqueta detectable ópticamente, como una etiqueta fluorescente o un fluoróforo, de modo que las dianas sean detectables con un equipo de exploración después de un ensayo de hibridación. Las dianas se pueden marcar antes, durante o incluso después del protocolo de hibridación, dependiendo del sistema de marcado elegido, de modo que el fluoróforo se asociará sólo con dianas hibridadas unidas a sonda.

[0243] Las dianas (por ejemplo, moléculas, moléculas amplificadas) se pueden detectar, por ejemplo, usando la detección de sondas (por ejemplo, sondas fluorescentes). La matriz se puede hibridar con al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sondas de detección. La matriz se puede hibridar con como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más sondas de detección. En algunas realizaciones, la matriz se hibrida con 4 sondas de detección.

[0244] Las sondas de detección pueden comprender una secuencia complementaria a una secuencia de un gen de interés. La longitud de la sonda de detección puede ser de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. La longitud de la sonda de detección puede ser como máximo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 o más nucleótidos. Las sondas de detección pueden comprender una secuencia que sea perfectamente complementaria a una secuencia en un gen de interés (por ejemplo, una diana). Las sondas de detección pueden comprender una secuencia que es imperfectamente complementaria a una secuencia en un gen de interés (por ejemplo, una diana). Las sondas de detección pueden comprender una secuencia con al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más apareamientos erróneos con la secuencia del gen de interés. Las sondas de detección pueden comprender una secuencia con como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más apareamientos erróneos con la secuencia del gen de interés.

[0245] Las sondas de detección pueden comprender un marcador detectable. Los marcadores detectables ejemplares pueden comprender un fluoróforo, cromóforo, molécula pequeña, nanopartícula, hapteno, enzima, anticuerpo y propiedad magnética, o cualquier combinación de los mismos.

[0246] Pueden formarse imágenes de sondas hibridadas. La imagen se puede usar para determinar el nivel de expresión relativo de los genes de interés basándose en la intensidad de la señal detectable (por ejemplo, señal fluorescente). Pueden usarse microscopios o lectores de fluorescencia láser de barrido para adquirir imágenes digitales de la luz emitida desde el sustrato (por ejemplo, micromatrices). Se puede escanear una fuente de luz enfocada (generalmente un láser) a través del sustrato hibridado haciendo que las áreas hibridadas emitan una señal óptica, como fluorescencia. Los datos de fluorescencia específicos del fluoróforo se pueden recopilar y medir durante la operación de escaneo, y luego se puede reconstruir una imagen del sustrato mediante algoritmos, software y hardware de computadora apropiados. Las ubicaciones esperadas o previstas de las características del ácido nucleico de la sonda se pueden combinar con las intensidades de fluorescencia medidas en esas ubicaciones, para producir los datos que luego se utilizan para determinar los niveles de expresión génica o la secuencia de ácido nucleico de las muestras diana. El proceso de recopilación de datos de las ubicaciones esperadas de la sonda se puede denominar "extracción de características". Las imágenes digitales pueden estar compuestas por varios miles a cientos de millones de píxeles que normalmente varían en tamaño de 5 a 50 micrones. Cada píxel de la imagen digital se puede representar mediante un número entero de 16 bits, lo que permite 65.535 valores de escala de grises diferentes. El lector puede adquirir secuencialmente los píxeles del sustrato escaneado y escribirlos en un archivo de imagen que se puede almacenar en el disco duro de una computadora. Los sustratos pueden contener varias muestras de ADN de sonda marcadas con fluorescencia diferentes en cada ubicación de punto. El escáner escanea repetidamente todo el sustrato con un láser de la longitud de onda adecuada para excitar cada una de las muestras de ADN de la sonda y almacenarlas en sus archivos de imagen separados. Los archivos de imagen se analizan y posteriormente se visualizan con la ayuda de una computadora programada.

[0247] El sustrato se puede formar con un escáner láser confocal. El escáner puede escanear el portaobjetos del sustrato para producir una imagen para cada tinte utilizado escaneando secuencialmente con un láser de una longitud de onda adecuada para el tinte en particular. Cada tinte puede tener un espectro de excitación conocido y un espectro de emisión conocido. El escáner puede incluir un divisor de haz que refleja un rayo láser hacia una lente diana que, a su vez, enfoca el haz en la superficie del portaobjetos para provocar una emisión esférica de fluorescencia. Una parte de la emisión puede viajar de regreso a través de la lente y el divisor de haz. Después de viajar a través del divisor de haz, el haz de fluorescencia puede reflejarse en un espejo, viaja a través de un filtro de emisión, una lente detectora de enfoque y un orificio central.

Correlación entre el sondeo y datos de imágenes

[0248] Los datos de la exploración de sustrato pueden correlacionarse con la imagen de la muestra no lisada sobre el sustrato. Los datos se pueden superponer generando así un mapa. Se puede construir un mapa de la ubicación de las dianas a partir de una muestra usando información generada usando los métodos descritos en este documento. El mapa se puede utilizar para localizar una ubicación física de una diana. El mapa se puede utilizar para identificar la ubicación de varias dianas. Los objetivos múltiples pueden ser la misma especie de diana, o las dianas múltiples pueden ser varias dianas diferentes. Por ejemplo, se puede construir un mapa de un cerebro para mostrar la cantidad y ubicación de múltiples dianas.

[0249] El mapa se puede generar a partir de datos de una sola muestra. El mapa se puede construir utilizando datos de múltiples muestras, generando así un mapa combinado. El mapa se puede construir con datos de decenas, cientos y/o miles de muestras. Un mapa construido a partir de múltiples muestras puede mostrar una distribución de dianas asociadas con regiones comunes a las múltiples muestras. Por ejemplo, los ensayos replicados se pueden mostrar en el mismo mapa. Se pueden mostrar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas) en el mismo mapa. Se pueden mostrar como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas) en el mismo mapa. La distribución espacial y el número de dianas se pueden representar mediante una variedad de estadísticas.

[0250] La combinación de datos de múltiples muestras puede aumentar la resolución de ubicación del mapa combinado. La orientación de múltiples muestras se puede registrar mediante puntos de referencia comunes y/o posiciones xy en la matriz, en donde las mediciones de ubicación individuales a través de muestras son al menos en parte no contiguas. Multiplexar el enfoque anterior permitirá mapas de alta resolución de ácidos nucleicos diana en una muestra.

[0251] El análisis de los datos y la correlación pueden ser útiles para determinar la presencia y/o ausencia de un determinado tipo de célula (por ejemplo, de células raras, de células de cáncer). La correlación de datos puede ser útil para determinar las proporciones relativas de ácidos nucleicos diana en distintas ubicaciones dentro de una célula o dentro de una muestra.

[0252] Los métodos y composiciones descritos en este documento pueden ser diagnósticos acompañantes para un profesional médico (por ejemplo, un patólogo) en donde un sujeto puede ser diagnosticado por buscar visualmente una imagen de patología en y la correlación de la imagen para la expresión genética (por ejemplo, identificación de la expresión de oncogenes). Los métodos y composiciones pueden ser útiles para identificar una célula de una población de células y determinar la heterogeneidad genética de las células dentro de una muestra. Los métodos y composiciones pueden ser útiles para determinar el genotipo de una muestra.

[0253] La divulgación proporciona métodos para hacer réplicas de sustratos. Los sustratos se pueden volver a analizar con diferentes sondas para diferentes genes de interés o para elegir selectivamente genes específicos. Por ejemplo, se puede colocar una muestra sobre un sustrato que comprende una pluralidad de sondas de oligo(dT). Los ARNm pueden hibridar con las sondas. Los sustratos replicados que comprenden sondas oligo(dT) se pueden poner en contacto con el portaobjetos inicial y hacer réplicas de los ARNm. Los sustratos replicados que comprenden sondas específicas de genes de ARN pueden ponerse en contacto con el portaobjetos inicial para hacer una replicación.

[0254] El ARNm se puede transcribir de forma inversa en ADNc. El ADNc puede tener una cola de homopolímero y/o amplificarse (por ejemplo, mediante amplificación en puente). La matriz se puede contactar con una matriz replicada. La matriz replicada puede comprender sondas específicas de genes que pueden unirse a los ADNc de interés. La matriz replicada puede comprender sondas poliA que pueden unirse a ADNc con una secuencia de poliadenilación.

[0255] El número de repeticiones que se pueden realizar pueden ser de al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 o más. El número de réplicas que se pueden realizar puede ser como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más.

[0256] En algunas realizaciones, el sustrato inicial comprende una pluralidad de sondas de genes específicos y el sustrato duplicado comprende las mismas sondas de genes específicos, o diferentes sondas que corresponden a los mismos genes que las sondas de genes específicos.

La codificación de barras estocástica con separación física de muestras

[0257] En algunas realizaciones, la muestra se puede dividir físicamente o puede ser intacta durante codificación de barras estocástica de la pluralidad de dianas en la muestra. Las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra pueden estar en una superficie de la muestra, dentro de la muestra, subcelularmente en la muestra o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la codificación de barras estocástica de la pluralidad de dianas en la muestra se puede realizar en la superficie de la muestra, subcelularmente en la muestra, dentro de la muestra o cualquier combinación de los mismos.

[0258] Una muestra puede separarse físicamente en diferentes recipientes. La separación física se puede lograr mediante disección, por ejemplo, cortando físicamente una muestra. La separación física se puede lograr seccionando, por ejemplo seccionando con un micrótomo. La separación física se puede lograr mediante el uso de una cuadrícula de cuchillas (por ejemplo, un sustrato en donde los bordes de los recipientes en el sustrato sean afilados de manera que puedan cortar una muestra, y en donde las piezas de la muestra cortada puedan caer en los recipientes sobre el sustrato). Una cuadrícula de cuchillas puede separar y aislar físicamente simultáneamente las partes de las muestras.

[0259] El proceso de separación física puede conservar información sobre la muestra separada físicamente. La preservación de la información puede ocurrir asociando una parte conocida de la muestra con una etiqueta espacial y/o contenedor particular. Los contenedores pueden comprender etiquetas espaciales que se pueden usar para representar las relaciones físicas originales presentes antes de que se separara la muestra. A continuación, las etiquetas espaciales pueden asociarse con dianas dentro de las partes de las muestras separadas físicamente. De esta manera, las dianas de una ubicación identificable dentro de la muestra pueden etiquetarse estocásticamente y contarse digitalmente.

[0260] En un ejemplo básico, una muestra, por ejemplo, un tejido sólido, puede ser atravesada a lo largo de un plano sagital medio. La mitad derecha del órgano se puede colocar en un recipiente. La mitad izquierda del órgano se puede colocar en un segundo recipiente. Se puede asociar un grupo de etiquetas no agotables con las dianas en cada contenedor. Las etiquetas se pueden utilizar para etiquetar estocásticamente dianas dentro de la muestra. Las etiquetas pueden comprender una etiqueta espacial que se puede utilizar para identificar qué dianas estaban en cada contenedor. Los objetivos etiquetados de cada recipiente se pueden recombinar para su análisis. El análisis puede incluir un paso de amplificación. Las dianas marcadas amplificadas se pueden secuenciar o hibridar en una matriz para su análisis. Los datos generados a partir del análisis pueden incluir un recuento estocástico del número de dianas iniciales y, para cada dianas, información espacial sobre si la dianas estaba a la izquierda o a la derecha de la bisección sagital media.

[0261] Una muestra se puede separar físicamente en más de dos secciones. Una muestra se puede dividir en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secciones. Una muestra se puede dividir en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más secciones como máximo. Una muestra se puede dividir en cientos de secciones. Una muestra se puede dividir en al menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 o más secciones. Una muestra se puede dividir en como máximo 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 o más secciones. Una muestra se puede dividir en miles de secciones. Una muestra se puede dividir en al menos 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000 o 90000 o más secciones. Una muestra se puede dividir en como máximo 1000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000 o 90000 o más secciones. Una muestra se puede dividir en 16, 32, 48, 96 o 384 secciones. Cuanto mayor sea el número de secciones en las que se divide la muestra, mayor será la resolución espacial impartida por las etiquetas espaciales.

[0262] Las secciones (por ejemplo, del tejido sólido y/o que comprende las dianas) pueden estar dispuestas de tal manera que una relación física de las secciones es similar a la relación física entre los contenedores sobre un sustrato (por ejemplo, una cuadrícula). Por ejemplo, una diana que se encuentra en una sección "superior derecha" de una muestra se puede ubicar en un contenedor "superior derecho". Esto puede permitir que una muestra se aplique directamente a un sustrato para preservar la relación física entre las secciones de la muestra (por ejemplo, tejido sólido). La Figura 5 ilustra cómo un tejido sólido 505 se puede dividir en secciones 510 (por ejemplo, secciones 1-10). Las secciones se pueden colocar sobre un sustrato 515 (por ejemplo, una cuadrícula). Las secciones 510 del tejido sólido 505 se pueden colocar en una ubicación específica dentro del sustrato 515, donde la ubicación específica es un mapa replicado del tejido sólido 505. La colocación de secciones de un tejido sólido sobre el sustrato se puede realizar en dos o tres dimensiones. La Figura 5 ilustra una realización ejemplar de un sustrato bidimensional. En algunas realizaciones, el sustrato puede ser tridimensional. Decenas, cientos, miles o millones de secciones de una muestra pueden reflejarse en las ubicaciones físicas de los contenedores en el sustrato.

[0263] Si se conoce la ubicación de la primera sección en la muestra, entonces esa información puede asociarse con las dianas dentro del contenedor que contiene la sección. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 5, después de que las secciones 510 del tejido sólido 505 se hayan colocado en recipientes sobre el sustrato 515, las dianas de las secciones pueden ser etiquetadas estocásticamente, amplificadas y/o contadas. La información (por ejemplo, el número de tipos de moléculas) que surge del contenedor aa en la cuadrícula 515 puede corresponder 520 a la sección física (por ejemplo, la ubicación) 1 del tejido sólido 505. De manera similar, la información que surge del contenedor ab del sustrato 515 puede corresponder 520 a la sección física 4 del tejido sólido 505.

[0264] En algunas realizaciones, los métodos de la divulgación se pueden usar para identificar la superficie de una muestra. Por ejemplo, se pueden agregar etiquetas espaciales a la superficie de la muestra (por ejemplo, tejido sólido). La muestra puede lisarse, etiquetarse estocásticamente con las etiquetas espaciales, amplificarse y/o contarse digitalmente. Las dianas que estaban en la superficie de la muestra se pueden distinguir de las dianas en el interior de la muestra, según la etiqueta espacial. Identificar la superficie de una muestra y/o distinguir entre el interior y el exterior de una muestra puede ser útil para determinar los límites de un tejido sólido (p. ej., un tumor), determinar si la resección de un tejido sólido se realizó por completo y/o identificar límites de diferentes estructuras fisiológicas o tipos de células.

[0265] Las etiquetas espaciales se pueden asociar con una muestra espacialmente intacta. Por ejemplo, una aguja, o una serie de agujas, puede insertar etiquetas espaciales en una muestra intacta. Las etiquetas espaciales se pueden insertar en una muestra intacta de diversas formas, que incluyen, entre otras, inserción de agujas, inserción de clavijas, inserción a través de capilares sanguíneos, inyección, electroporación, transducción y transformación. La muestra intacta puede entonces ser lisada para códigos de barras estocásticos, amplificación, y recuento digital.

Código de barras estocástico con separación física de muestras combinada con separación de tiempo

[0266] En algunas realizaciones, codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra puede incluir poner en contacto la muestra con un dispositivo. El dispositivo puede ser una aguja, una matriz de agujas, un tubo, un dispositivo de succión, un dispositivo de inyección, un dispositivo de electroporación, un dispositivo clasificador de células activadas por fluorescencia, un dispositivo de microfluidos o cualquier combinación de los mismos. El dispositivo puede contactar secciones de la muestra a una velocidad específica. La tasa especificada puede correlacionar las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas con uno o más puntos de tiempo.

[0267] Los recipientes sobre un sustrato se pueden llenar en un orden que refleje una ubicación física. Las etiquetas espaciales se pueden combinar con una sección como parte de la colección de muestras. Por ejemplo, se podría usar un dispositivo de muestreo que comprenda un dispositivo de succión para extraer una muestra en un patrón predefinido. A medida que la sección de la muestra viaja a través del dispositivo de succión, se pueden asociar etiquetas espaciales con la sección. La adición en serie de las etiquetas espaciales puede identificar dónde estaba el dispositivo de succión en el espacio en el momento de la sección.

[0268] Por ejemplo, como se muestra en la Figura 6, un tejido sólido 605 se puede dividir en secciones 610 con un dispositivo de muestreo. Las secciones 610 se pueden transportar a un sustrato 615 según el orden en donde se obtuvieron de la muestra. Por ejemplo, la sección 1 se puede colocar en un recipiente en el sustrato 615 que corresponde al tiempo 1 (T1). El contenedor que corresponde a T1 puede comprender una etiqueta de tiempo (ver más abajo). Las dianas en las secciones pueden etiquetarse estocásticamente, amplificarse y/o contarse. La información (por ejemplo, número de tipos de moléculas) que surge del contenedor T1 en el sustrato 615 puede corresponder 620 a la sección física (por ejemplo, la ubicación) 1 del tejido sólido 605. De manera similar, la información que surge del contenedor T4 del sustrato 615 puede corresponder 620 a la sección física 4 del tejido sólido 605. La etiqueta de tiempo puede indicar la ubicación física de la sección en la muestra comparando la velocidad a la que el dispositivo de muestreo procesa cada sección desde la muestra hasta el sustrato. La obtención de las secciones por el dispositivo de muestreo se puede realizar en serie. Las etiquetas de tiempo se pueden agregar a las secciones y/o contenedores en serie antes de agregar las secciones, simultáneamente con la adición de la sección al contenedor, o después de que la sección se agrega al contenedor.

[0269] Por ejemplo, un dispositivo de matriz de agujas puede inyectar soportes sólidos que comprenden códigos de barras estocásticos con etiquetas espaciales en un tejido sólido. A medida que la aguja se retrae, el soporte sólido queda en el tejido. A medida que la aguja se retrae hacia arriba en una columna de tejido sólido, se pueden colocar una serie de soportes sólidos en el tejido (por ejemplo, a lo largo de una columna). La tasa de movimiento del dispositivo puede correlacionarse con el tiempo que el dispositivo estuvo en una posición específica. De esta forma, el tiempo que una etiqueta espacial estuvo asociada con una diana puede ser indicativo de su posición en la muestra.

[0270] En otro ejemplo, el dispositivo de muestreo puede comprender un chip microfluídico. El dispositivo de muestreo puede ser capaz de tomar una sección de una muestra y colocarla en un chip de microfluidos. Dentro del chip de microfluidos, la sección se puede encapsular en una emulsión (por ejemplo, una gota). La emulsión puede comprender un código de barras estocástico con una etiqueta espacial. La emulsión se puede colocar en un recipiente de sustrato. La ubicación en el sustrato en donde se coloca la emulsión puede ser indicativa de la ubicación física de la sección en la muestra debido a la información contenida en la etiqueta de tiempo.

Representación no física de contenedores

[0271] La descripción proporciona un método para estimar el número de moléculas en una ubicación específica de una muestra. El método puede comprender dividir la muestra en secciones y etiquetar estocásticamente las secciones con un código de barras de manera que contengan información sobre la ubicación física de las secciones. El código de barras estocástico no tiene que ocurrir en contenedores que tengan una relación física similar a la muestra, como se describe en Figuras 5 y 6. Los envases no tienen una relación física similar a la muestra. El método no necesita hacer uso de contenedores. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 7, la muestra 605 se puede dividir en secciones 710. Las secciones 710 se pueden colocar en uno o más contenedores ubicados aleatoriamente en un sustrato 715, en donde la ubicación de la sección no tiene relación física con la estructura física, forma y/o morfología de la muestra 705. La colocación de secciones de un tejido sólido sobre el sustrato se puede realizar en dos o tres dimensiones. La Figura 7 ilustra una realización ejemplar de un sustrato bidimensional. En algunas realizaciones, el sustrato puede ser tridimensional. Decenas, cientos, miles o millones de secciones de una muestra pueden reflejarse en las ubicaciones físicas de los contenedores en el sustrato.

[0272] Si se conoce la ubicación de la primera sección en la muestra, entonces esa información puede asociarse con dianas dentro del contenedor que contiene la sección. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 7, después de que las secciones 710 del tejido sólido 705 se hayan colocado en recipientes sobre el sustrato 715, las dianas de las secciones pueden etiquetarse estocásticamente, amplificarse y/o contarse. La información (por ejemplo, número de tipos de moléculas) que surge del contenedor aa en la cuadrícula 715 puede corresponder 720 a una sección física (por ejemplo, ubicación) del tejido sólido 605 (el contenedor aa corresponde a la sección 5, aunque está ubicado donde la sección 1 de la muestra).

La adición de códigos de barras estocásticos a las muestras

[0273] Las muestras y/o secciones de muestras pueden ser añadidas a los recipientes sobre un sustrato en paralelo. Un dispositivo de muestreo puede obtener muestras espacialmente conocidas en paralelo y luego usarse para asociar las muestras con una etiqueta espacial. Por ejemplo, se puede obtener una serie de biopsias. Las biopsias se pueden asociar con etiquetas en el dispositivo que obtiene las biopsias. Las biopsias se pueden asociar con etiquetas después de que las biopsias se colocan en contenedores. En algunas realizaciones, se usa una matriz de agujas para obtener muestras.

[0274] Las etiquetas espaciales se pueden combinar con una muestra como parte de la colección de muestras. Por ejemplo, podría usarse un dispositivo de succión para extraer una muestra en un patrón predefinido. A medida que la muestra viaja a través del dispositivo de succión, se pueden asociar etiquetas espaciales con la muestra. La adición en serie de la etiqueta puede identificar dónde estaba el dispositivo de succión en el espacio en el momento de la recolección.

[0275] Por ejemplo, se puede resecar un tumor sólido. El tumor resecado tiene su exterior marcado con etiquetas espaciales, por ejemplo, rociando la muestra, sumergiendo la muestra o contactando la muestra con una composición que comprende una etiqueta espacial.

Codificación de barras espacial de las células específicas

[0276] En algunas realizaciones, las etiquetas espaciales se entregan a una ubicación específica de la diana. La ubicación diana puede referirse a una ubicación en el cuerpo, un tipo específico de célula y/o un compartimento subcelular. Una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que se sabe que se dirige a un órgano específico del cuerpo. Por ejemplo, una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que se procesa en el hígado, una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que puede cruzar la barrera hematoencefálica, una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que se puede absorber por capilares sanguíneos. La molécula a la que se asocia una etiqueta espacial puede acercar la etiqueta espacial a una ubicación en el cuerpo de interés. La ubicación del cuerpo de interés puede aislarse, etiquetarse estocásticamente con la etiqueta espacial, amplificarse y/o contarse digitalmente para obtener información sobre el número de dianas en la ubicación de interés.

[0277] Una etiqueta espacial puede asociarse con una molécula conocida para apuntar a una célula específica. Por ejemplo, una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que se dirige a una célula inmunitaria (por ejemplo, una molécula de dirección). Una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que se dirige a un virus. Una etiqueta espacial se puede asociar con una molécula que se dirige a la barrera hematoencefálica. La molécula puede ser una molécula de dirección que puede llevar la etiqueta espacial a una ubicación en una muestra (por ejemplo, un sujeto).

[0278] Una etiqueta espacial puede asociarse con una molécula conocida para dirigirse a un compartimento subcelular específico. Por ejemplo, una etiqueta espacial se puede asociar con una vesícula que puede comprender una etiqueta de ubicación, tal como para el retículo endoplásmico. La vesícula puede entregar la etiqueta espacial muy cerca del retículo endoplásmico. El retículo endoplásmico puede aislarse, etiquetarse estocásticamente con la etiqueta espacial, amplificarse y/o contarse digitalmente.

[0279] Los compartimentos subcelulares ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, mitocondrias, complejo de Golgi, pared celular, retículo endoplásmico, núcleo, nucleolo, lisosomas, complejos de proteínas (por ejemplo, APC, lincARN) y similares. Las moléculas de direccionamiento ejemplares pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias de localización nuclear, secuencias de exportación nuclear, señales de localización de cloroplasto, señales de localización mitocondrial y similares. En algunas realizaciones, la molécula de dirección puede comprender una vesícula. Los ejemplos de vesículas pueden incluir liposomas, microsomas, puntos nano, puntos cuánticos, nanopartículas y cápsides virales, o cualquier combinación de los mismos.

Método de la etiqueta de la litografía

[0280] Los métodos de la descripción pueden permitir la construcción de una etiqueta espacial después de que la etiqueta ha sido constreñida dentro y/o en contacto con una muestra. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta preespacial; concatenar uno o más bloques de etiquetas espaciales en la etiqueta preespacial para generar una etiqueta espacial; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de dianas usando la etiqueta espacial.

[0281] La Figura 8 muestra una realización ejemplar del método de litografía de etiquetas de la divulgación. Una diana 804 puede asociarse con una etiqueta preespacial 805. Una etiqueta preespacial 805 puede comprender una secuencia de nucleótidos que puede hibridar con dianas de interés (p. ej., secuencia de nucleótidos específica u oligo(dT)) 810. La etiqueta preespacial 805 puede comprender una secuencia de consenso activable 815. La secuencia de consenso activable 815 puede ser una secuencia de nucleótidos que puede unirse a otra secuencia de nucleótidos o base. Por ejemplo, una secuencia activable 815 puede ser un sitio de restricción, un sitio para la ligadura de TA y/o un nucleótido fotoactivable. La secuencia de consenso activable 815 se puede vincular a un bloque de etiqueta espacial 820/821. Un bloque de etiqueta espacial 820/821 puede comprender una secuencia de nucleótidos que es indicativa de una ubicación espacial 825. Un bloque de etiqueta espacial puede comprender la vinculación de secuencias 830. Las secuencias de enlazamiento 830 pueden interactuar con la secuencia de consenso activable 815 y/o otras secuencias de enlace en los bloques de etiquetas espaciales 820. Por ejemplo, un primer grupo (Grupo I) de bloques de etiquetas espaciales 820/821 puede comprender una secuencia de enlace primera (A') y una segunda (B). La primera secuencia de enlace (A’) puede interactuar con la secuencia de consenso activable 815 en la etiqueta preespacial 705. Un segundo grupo (Grupo II) de bloques de etiqueta espacial 821 puede comprender una secuencia de enlace primera (B') y segunda (A). La primera secuencia de enlace (B’) puede interactuar con la segunda secuencia de enlace (B) del primer grupo de bloques de etiquetas espaciales 821. De esta manera, los bloques de etiquetas espaciales 820/821 pueden unirse entre sí.

Etiquetas preespaciales, bloques de etiquetas espaciales y etiquetas espaciales

[0282] Una etiqueta preespacial puede comprender una secuencia que puede asociarse con una diana de interés. Una etiqueta preespacial puede asociarse con un ácido nucleico, que incluye, entre otros, ADN, ARNm, fragmentos de ARN, regiones específicas de genes y elementos reguladores (por ejemplo, promotor, potenciador). Una secuencia que puede unirse a una diana de interés puede comprender una región específica de un gen (p. ej., una secuencia de nucleótidos que está adaptada para unirse a una región específica de un gen) o una región de unión no específica (p. ej., oligo(dT), hexámero aleatorio, oligómero aleatorio). Una secuencia que puede asociarse con una diana de interés puede tener al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos de longitud. Una secuencia que puede asociarse con una diana de interés puede tener al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos de longitud.

[0283] Un marcador preespacial puede comprender un marcador molecular, un marcador celular y/o un marcador de muestra. Una etiqueta preespacial puede comprender una secuencia que puede asociarse (por ejemplo, hibridar) con una diana. Una etiqueta preespacial se puede asociar con un soporte sólido. Una etiqueta preespacial se puede asociar con un sustrato.

[0284] Una etiqueta preespacial puede comprender una secuencia de consenso activable. Una secuencia de consenso activable puede comprender una secuencia que puede activarse para unirse a un bloque de etiqueta espacial. Una secuencia de consenso activable puede ser una secuencia escindible (p. ej., sitio de escisión de endonucleasa de restricción), una secuencia que se puede marcar y/o una secuencia que se puede ligar. Una secuencia de consenso activable puede comprender un resto químico que puede activarse. Por ejemplo, la fracción química puede comprender un fluoróforo que se puede excitar, una fracción fotoescindible, una fracción que responde a los imanes y una fracción de unión (por ejemplo, biotina/estreptavidina).

[0285] Una secuencia de consenso activable puede comprender al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. Una secuencia de consenso activable puede comprender como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos.

[0286] Una etiqueta pre-espacial puede comprender una secuencia que se puede asociar con una diana de interés, una molecular etiqueta, una etiqueta de muestra y/o una secuencia de consenso activable. En algunas realizaciones, una etiqueta preespacial comprende una secuencia que puede asociarse con una diana de interés, una etiqueta molecular, una etiqueta de muestra y/o una secuencia de consenso activable.

[0287] Una etiqueta preespacial puede ser al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1516, 17, 18, 19, 20, 21, 222, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o más nucleótidos de longitud. Una etiqueta preespacial puede ser como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19, 20, 21,222, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 o más nucleótidos de longitud.

[0288] Un bloque de etiqueta espacial puede comprender una secuencia de nucleótidos. La secuencia puede comprender al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. La secuencia puede comprender como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. Un bloque de etiquetas espaciales se puede vincular a otro bloque de etiquetas espaciales (por ejemplo, anterior). Los bloques de etiquetas espaciales se pueden unir entre sí, por ejemplo, mediante química (por ejemplo, química de clic), ligadura, síntesis de agrupación dividida, química combinatoria y/o química fotoactivable.

[0289] Por ejemplo, un primer grupo de bloques de la etiqueta espacial puede comprender dos secuencias finales pegajosas, en donde la cadena con sentido tiene una primera secuencia de extremo cohesivo, y la cadena antisentido tiene una segunda secuencia de extremo cohesivo en los extremos 5' de cada hebra. Un segundo grupo de bloques de etiquetas espaciales puede comprender dos secuencias finales pegajosas, en las que la hebra sentido tiene la segunda secuencia final adherente complementaria y la hebra antisentido tiene la primera secuencia terminal adherente complementaria. El primer grupo se puede ligar al segundo grupo. Solo puede ocurrir una ligadura. Posteriormente, el primer grupo puede contactarse con la etiqueta espacial en crecimiento. El primer grupo puede ligarse al extremo pegajoso del segundo grupo. Solo puede ocurrir una ligadura. De esta manera, se puede producir una etiqueta espacial litográficamente sobre una muestra.

[0290] El enlace de bloques de etiquetas espaciales se puede realizar antes, durante y/o después de poner en contacto la etiqueta preespacial con una diana de interés. Las etiquetas preespaciales se pueden asociar con objetivos antes, durante y/o después de la vinculación con bloques de etiquetas espaciales utilizando medios químicos tales como reticulación, hibridación para ayudar a la asociación entre la etiqueta preespacial y la diana. Esto puede reducir la disociación y/o la difusión de las etiquetas preespaciales lejos de las dianas.

[0291] El enlace de bloques de etiquetas espaciales se puede realizar de manera geométrica de modo que la longitud resultante de la etiqueta espacial corresponda a la forma geométrica en donde los bloques de etiquetas espaciales estaban vinculados. La Figura 9 muestra una realización ejemplar de una forma geométrica de unir bloques de etiquetas espaciales. Por ejemplo, a medida que uno se mueve de izquierda a derecha en una muestra, los bloques de etiquetas espaciales se pueden agregar cada vez más a la etiqueta preespacial, generando así etiquetas espaciales con diferentes longitudes. La longitud de la etiqueta espacial puede corresponder a una ubicación física en la muestra. Una muestra 905 puede dividirse en secciones 910. Las secciones pueden contactarse con una etiqueta preespacial. La etiqueta preespacial puede contactarse con un número entero de bloques de etiquetas espaciales. Por ejemplo, las secciones de la fila se contactan con un bloque de etiqueta espacial. Las secciones de la fila b se ponen en contacto con dos bloques de etiquetas espaciales. Las secciones de la fila c se ponen en contacto con tres bloques de etiquetas espaciales. Las secciones de la fila d se ponen en contacto con cuatro bloques de etiquetas espaciales. Moviéndose de derecha a izquierda, las secciones de la columna A pueden contactarse con un bloque de etiqueta espacial, las secciones de la columna B pueden contactarse con dos bloques de etiqueta espacial. Las secciones de la columna C pueden contactarse con tres bloques de etiquetas espaciales. El número de bloques de etiquetas espaciales en cada sección puede ser una representación de su ubicación en una primera dimensión (y, vertical) y un espacio de segunda dimensión (x horizontal) dentro de la muestra.

[0292] Las secciones pueden ser contactadas con los bloques de etiquetas espaciales en cualquier orden. Las secciones solo pueden ser contactadas por filas. Las secciones solo pueden ser contactadas por columnas. Las secciones pueden contactarse primero por filas y luego por columnas. Las secciones pueden contactarse primero por columnas y luego por filas.

[0293] Las secciones se pueden etiquetar estocásticamente, amplificar y/o contar digitalmente. La longitud de la etiqueta espacial puede proporcionar información sobre la ubicación x e y de la sección en la muestra. En la realización mostrada en la Figura 7, la etiqueta espacial más corta corresponde a la esquina superior izquierda y la etiqueta espacial más larga corresponde a la esquina inferior derecha.

Métodos para determinar la ubicación espacial de dianas

[0294] Se describen en este documento métodos para identificar células distintas en dos o más muestras. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con barras una pluralidad de dianas en las dos o más muestras usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial y una etiqueta molecular; estimar el número de la pluralidad de dianas en las dos o más muestras usando el marcador molecular; y distinguir las dos o más muestras entre sí utilizando la etiqueta espacial, donde la pluralidad de dianas asociados con códigos de barras estocásticos con diferentes etiquetas espaciales son de diferentes muestras.

[0295] Códigos de barras estocásticos de la pluralidad de dianas en las dos o más muestras puede incluir la hibridación de la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de dianas para generar dianas estocásticamente con códigos de barras, y al menos una de la pluralidad de dianas puede ser hibridada con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos. Codificar estocásticamente con barras la pluralidad de dianas en las dos o más muestras puede incluir generar una biblioteca indexada de las dianas con códigos de barras estocásticamente.

[0296] Cada una de las dos o más muestras puede incluir una pluralidad de células y la pluralidad de dianas están asociadas con la pluralidad de células. La codificación estocástica con barras de la pluralidad de dianas en las dos o más muestras se puede realizar con un soporte sólido que comprende una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos.

Identificación de células específicas en una población de células

[0297] Etiquetas espaciales pueden ser utilizadas para identificar y etiquetar muestras distintas (por ejemplo, células) en una población mixta de muestras (por ejemplo, células). Las muestras pueden ser, por ejemplo, células en una población mixta de células.

[0298] La Figura 10 ilustra una realización ejemplar del método de identificación de distintas células con una etiqueta espacial. Una muestra, por ejemplo, que comprende una población mixta de células 1015/1020 puede ponerse en contacto con un sustrato 10905, en donde el sustrato 1005 comprende una distribución de diferentes grupos de etiquetas espaciales 1010/1011/1012. Las dianas de una célula individual 1015 pueden estar físicamente cerca de un primer grupo de las mismas etiquetas espaciales 1010. Las dianas de una célula individual diferente 1020 pueden estar físicamente más distantes del primer grupo de etiquetas espaciales 1010, pero pueden estar cerca en el espacio físico de otras etiquetas espaciales 1012 (por ejemplo, un segundo grupo de etiquetas espaciales). Las células se pueden lisar, marcar estocásticamente, amplificar y/o contar digitalmente. La etiqueta espacial se puede utilizar luego como un código para distinguir entre dianas de diferentes células individuales.

[0299] Las dianas se pueden asociar con las etiquetas espaciales más cercanas. Las etiquetas espaciales pueden ser cualquier etiqueta espacial de la divulgación (por ejemplo, etiquetas preespaciales, etiquetas espaciales). Las dianas se pueden asociar con etiquetas espaciales que tengan al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 micrómetros más desde el borde exterior de la muestra (por ejemplo, célula). Las dianas se pueden asociar con etiquetas espaciales que tengan como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 micrómetros más desde el borde exterior de la muestra (por ejemplo, célula).

Identificación de localización espacial de dianas en una muestra

[0300] La descripción proporciona métodos para determinar la localización subcelular de las dianas en una célula. La Figura 11 ilustra cómo se puede obtener información subcelular usando etiquetas espaciales. Una muestra (por ejemplo, una célula) 1105 puede ponerse en contacto con un sustrato 1009 que comprende uno o más grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113. Los grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113 se pueden distribuir sobre la superficie de un sustrato. Los grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113 pueden distribuirse sobre recipientes (por ejemplo, micropocillos) del sustrato. Los grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113 se pueden distribuir en la muestra 1105. Los grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113 puede disponerse de manera que la muestra (por ejemplo, una célula) 1105 contacte con múltiples grupos distintos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113. La muestra 1005 puede reticularse, separarse físicamente, lisarse, etiquetarse estocásticamente con los distintos grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113, amplificarse y/o contarse digitalmente. Debido a que puede conocerse la ubicación de los distintos grupos de etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113, la ubicación de las dianas en la célula puede correlacionarse con la identificación de las etiquetas espaciales 1110/1111/1112/1113. De esta forma, las etiquetas espaciales se pueden utilizar para identificar la ubicación espacial de las dianas en una muestra.

Métodos para códigos de barras ópticos y códigos de barras ópticos

[0301] Aquí se describen métodos para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de células individuales. En algunas realizaciones, los métodos incluyen: codificar estocásticamente con códigos de barras la pluralidad de células individuales utilizando una pluralidad de partículas sintéticas, en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas comprende una pluralidad de códigos de barras estocásticos, un primer grupo de etiquetas ópticas y un segundo grupo de etiquetas ópticas, en las que cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta celular y una etiqueta molecular, en donde cada etiqueta óptica en el primer grupo de etiquetas ópticas comprende un primer resto óptico y cada etiqueta óptica en el segundo grupo de etiquetas ópticas comprende un segundo resto óptico, y en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas está asociada con un código de barras óptico que comprende el primer resto óptico y el segundo resto óptico; detectar el código de barras óptico de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas para determinar la ubicación de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas; y determinar las ubicaciones espaciales de la pluralidad de células individuales basándose en las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas.

Partículas sintéticas con códigos de barras y códigos de barras estocásticos ópticos

[0302] Se dan a conocer en el presente documento partículas sintéticas (por ejemplo, cuentas y cuentas magnéticas) asociadas con (por ejemplo, unidas con) los códigos de barras y etiquetas estocásticos ópticos. Por ejemplo, una partícula sintética puede tener una o más regiones de etiquetas ópticas en las que las etiquetas ópticas están asociadas con la partícula sintética. En algunas realizaciones, cada partícula sintética puede tener, o tener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre estos dos valores, regiones de etiquetas ópticas. El tamaño de la región de la etiqueta óptica puede variar, por ejemplo, una región de la etiqueta óptica puede ser de unas pocas micras a decenas de micras de ancho, largo o diámetro. En algunas realizaciones, el ancho, la longitud o el diámetro de la región de la etiqueta óptica puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 micrones, o un número o un intervalo entre dos de estos valores. En algunas realizaciones, la longitud de la región de la etiqueta óptica puede ser, o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 micrones, o un número o un intervalo entre dos de estos valores. Para una partícula sintética con más de una región de etiqueta óptica, cada una de las regiones de etiqueta óptica puede tener el mismo tamaño o tamaños diferentes. Por ejemplo, al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, de las regiones de etiquetas ópticas pueden tener diferentes tamaños. Por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, de las regiones de etiquetas ópticas pueden tener el mismo tamaño.

[0303] Puede variar la disposición de las regiones de etiquetas ópticas. Los ejemplos no limitantes de la disposición de las regiones de etiquetas ópticas incluyen un formato longitudinal, un formato vertical, una forma de cuadrícula, un formato circular o cualquier combinación de los mismos. La forma de las regiones de la etiqueta óptica también puede variar. Por ejemplo, las regiones de etiqueta óptica pueden tener forma de óvalo, rectángulo, triángulo, diamante o cualquier combinación de los mismos. Las regiones de etiquetas ópticas pueden agruparse o separarse entre sí. Por ejemplo, dos regiones de etiquetas ópticas pueden estar separadas entre sí por, o aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 micrones, o un número o un intervalo entre dos de estos valores.

[0304] Las regiones de etiquetas ópticas pueden ocupar sustancialmente toda la superficie de la partícula sintética, o parte de la superficie de la partícula sintética. En algunas realizaciones, las regiones de etiqueta óptica pueden ocupar, u ocupar aproximadamente, 0,00001%, 0,0001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99,9%, o un número o intervalo entre dos de estos valores, de la superficie sintética de la partícula. Las regiones de etiquetas ópticas pueden incluir etiquetas ópticas. En algunas realizaciones, una región de etiqueta óptica puede tener una etiqueta (OL) adherida a la superficie de la partícula sintética. El número de etiquetas ópticas en cada una de las regiones de etiquetas ópticas puede variar, por ejemplo, ser o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000. En algunas realizaciones, una etiqueta óptica comprende una secuencia de sonda.

[0305] En algunas realizaciones, cada partícula sintética puede incluir 9 tipos de etiquetas ópticas, OL1-9, unidas a la superficie de la partícula sintética. En algunas realizaciones, cada partícula sintética puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,

9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o un número o intervalo entre dos de estos números, tipos de etiquetas ópticas. Para cada partícula sintética, OL1-9 puede ser igual o diferente. En algunas realizaciones, cada tipo de etiquetas ópticas se une a la partícula sintética en una región de etiqueta óptica. En algunas realizaciones, al menos una de las regiones de marcadores ópticos de la partícula sintética comprende más de un tipo de marcadores ópticos. En algunas realizaciones, dos, tres, cuatro, cinco o más tipos de etiquetas ópticas están presentes en una región de etiqueta óptica.

[0306] Un marcador óptico puede comprender una secuencia de oligonucleótidos. El marcador óptico puede comprender un oligonucleótido. En algunas realizaciones, el marcador óptico puede comprender dos o más oligonucleótidos con la misma secuencia. La etiqueta óptica puede ser aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de marcadores ópticos pueden ser, o ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0307] En algunas realizaciones, OL1-3 se puede utilizar para codificar la etiqueta celular de parte 1 correspondiente a primeras 96 etiquetas celulares únicas en la primera etapa de codificación; OS4-6 se puede usar para codificar la parte 2 de la etiqueta celular correspondiente a segundas 96 etiquetas celulares únicas en el segundo paso de división;

y OL7-9 se puede utilizar para codificar la parte 3 de la etiqueta celular correspondiente a una tercera parte de 96 etiquetas celulares únicas en el tercer paso de división. En algunas realizaciones, los OL codifican 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,

8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o un número entre dos de estos valores las partes de la etiqueta celular.

En algunas realizaciones, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o un número entre dos de estos valores, se pueden utilizar etiquetas ópticas para codificar una parte de una etiqueta celular. En algunas realizaciones, cada parte de una etiqueta celular puede representar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 10000000, 100000000, 1000000000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, etiquetas celulares únicas.

Un código de barras óptico de una partícula sintética puede incluir las etiquetas ópticas en la partícula sintética. El código de barras óptico de una partícula sintética puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o un número entre dos de estos valores, etiquetas ópticas.

[0308] En algunas realizaciones, una etiqueta óptica puede comprender un resto óptico, por ejemplo un fluoróforo o un cromóforo. En algunas realizaciones, cada nucleótido de un marcador óptico puede asociarse con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos. Los restos ópticos espectralmente distintos incluyen restos ópticos con espectros de emisión distinguibles incluso si su espectro de emisión puede solaparse.

[0309] Los ejemplos no limitantes de restos ópticos incluyen derivados de xanteno: fluoresceína, rodamina, Oregon green, eosina, y rojo de Texas; Derivados de cianina: cianina, indocarbocianina, oxacarbocianina, tiacarbocianina y merocianina; Derivados de la escuareína y escuaraínas de anillo sustituido, incluidos los colorantes Seta, SeTau y Square; Derivados del naftaleno (derivados del dansilo y prodan); Derivados de cumarina; derivados de oxadiazol: piridiloxazol, nitrobenzoxadiazol y benzoxadiazol; Derivados del antraceno: antraquinonas, incluyendo DRAQ5, DRAQ7 y CyTRAK Orange; Derivados del pireno: azul cascada; Derivados de oxazina: rojo Nilo, azul Nilo, violeta de cresilo, oxazina 170; Derivados de la acridina: proflavina, acridina naranja, acridina amarilla; Derivados de arilmetina: auramina, violeta cristal, verde malaquita; y derivados de tetrapirrol: porfina, ftalocianina, bilirrubina. Otros ejemplos no limitantes de restos ópticos incluyen hidroxicumarina, aminocumarina, metoxicumarina, azul cascada, azul pacífico, naranja pacífico, amarillo lucifer, NBD, R-ficoeritrina (PE), conjugados PE-Cy5, conjugados PE-Cy7, rojo 613, PerCP, TruRed, FluorX, Fluoresceína, Bo DIPY-FL, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3,5, Cy5, Cy5,5, Cy7, TRITC, X-Rodamina, Lisamina Rodamina B, Rojo de Texas, Aloficocianina (APC), conjugados de APC-Cy7, Hoechst 33342, DAPI, Hoechst 33258, SYTOX Blue, Cromomicina A3, Mitramicina, YOy O-1, Bromuro de etidio, Acridina naranja, SYTOX Verde, TOTO-1,

TO-PRO-1, TO-PRO: Monómero de cianina, naranja tiazol, CyTRAK naranja, yoduro de propidio (Pl), LDS 751, 7-AAD, SYTOX naranja, TOTO-3, TO-PRO-3, DRAQ5, DRAQ7, lndo-1, Fluo-3, Fluo-4, DCFH, DHR, y SNARF.

[0310] La longitud de onda de excitación de los restos ópticos puede variar, por ejemplo, ser, o ser aproximadamente,

10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260,

270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490,

500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720,

730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950,

960, 970, 980, 990, 1000 nanómetros, o un número o un intervalo entre dos de estos valores. La longitud de o emisión de los restos ópticos también puede variar, por ejemplo, ser o ser aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160., 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300,

310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650,

660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, nanómetros, o un número o una gama entre dos cualesquiera de estos valores.

[0311] Los pesos moleculares de los restos ópticos pueden variar, por ejemplo ser, o ser de ap

20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220,

270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 440, 450, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610,

620, 630, 670, 680, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870,

910, 920, 970, 980, 990, 1000 Daltons (Da), o un número o intervalo entre dos de estos valores. Los pesos moleculares de los restos ópticos también pueden variar, por ejemplo, ser o ser aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 kilo Daltons

(kDa), o un número o intervalo entre dos de estos valores.

[0312] El grupo de restos ópticos espectralmente distintos puede, por ejemplo, incluir cinco fluoróforos diferentes, cinco cromóforos diferentes, una combinación de cinco fluoróforos y cromóforos, una combinación de cuatro fluoróforos diferentes y un no fluoróforo, una combinación de cuatro cromóforos y un no cromóforo, o una combinación de cuatro fluoróforos y cromóforos y un no fluoróforo no cromóforo. En algunas realizaciones, los restos ópticos pueden ser uno de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000,

8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, de restos espectralmente distintos.

[0313] En algunas realizaciones, cada una de una pluralidad de partículas sintéticas tiene un código de barras óptico único. Por ejemplo, la pluralidad de partículas sintéticas puede incluir, incluir aproximadamente o incluir más de 1,2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, partículas sintéticas, cada una con un código de barras óptico único. Algunas de una pluralidad de partículas sintéticas pueden tener el mismo código de barras óptico. La pluralidad de partículas sintéticas puede incluir, incluir aproximadamente o incluir más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 200,

300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, partículas sintéticas algunas de las cuales con los mismos códigos de barras ópticos.

[0314] Además de las "etiquetas ópticas," sustancialmente toda la superficie de partículas sintéticas o alguna parte de la superficie de la partícula sintética se puede unir con códigos de barras estocásticos. Por ejemplo, los códigos de barras estocásticos pueden ocupar 0,00001%, 0,0001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%,

20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 99,9%, o un número o intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, de la superficie de la partícula sintética. Los códigos de barras estocásticos pueden ser, o ser aproximadamente, 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud.

Métodos para cargar etiquetas espaciales en un sustrato

[0315] Las etiquetas espaciales se pueden colocar previamente en un sustrato. Se puede preimprimir una superficie de sustrato con códigos de barras estocásticos. En otras palabras, se pueden conocer las coordenadas de cada código de barras estocástico en la superficie del sustrato. Los códigos de barras estocásticos pueden imprimirse previamente de cualquier forma geométrica. En algunas realizaciones, un soporte sólido que comprende códigos de barras estocásticos se puede colocar previamente en un sustrato. En algunas realizaciones, las coordenadas de los códigos de barras estocásticos en un sustrato pueden ser desconocidas. La ubicación de los códigos de barras estocásticos puede ser generada por el usuario. Cuando se desconoce la ubicación de los códigos de barras estocásticos en un sustrato, se puede decodificar la ubicación de los códigos de barras estocásticos.

Métodos para la codificación de soportes sólidos

[0316] Se describen aquí métodos para crear soportes sólidos codificados, tales como partículas sintéticas codificadas, para la determinación de localizaciones espaciales de una pluralidad de células individuales. Cada partícula sintética puede contener 9 "regiones de anclaje”. En algunas realizaciones, cada partícula sintética puede contener, o contener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50,

60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos estos valores, regiones de anclaje. Cada región de anclaje puede tener un tamaño de unas pocas micras a decenas de micras de ancho. En algunas realizaciones, cada región de anclaje puede tener un tamaño de 1,2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000,

6000, 7000, 8000, 9000, 10000 o un número o un intervalo entre dos de estos valores, micrones de tamaño.

[0317] La disposición de las regiones de anclaje puede variar. Los ejemplos no limitantes de la disposición de las regiones de anclaje incluyen un formato longitudinal, un formato vertical, una forma de cuadrícula, un formato circular o cualquier combinación de los mismos. La forma de las regiones de anclaje también puede variar. Por ejemplo, las regiones de anclaje pueden tener forma ovalada, rectangular, triangular, romboidal o cualquier combinación de las mismas. Las regiones de anclaje se pueden agrupar o separar unas de otras. Por ejemplo, dos regiones de anclaje pueden estar separadas entre sí por, o aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 micrones, o un número o un intervalo entre dos de estos valores.

[0318] Las regiones de anclaje pueden ocupar sustancialmente toda la superficie de la partícula sintética, o parte de la superficie de la partícula sintética. En algunas realizaciones, las regiones de anclaje pueden ocupar, u ocupar aproximadamente, 0,00001%, 0,0001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 99,9%, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, de la superficie de la partícula sintética. Las regiones de anclaje pueden incluir etiquetas ópticas. En algunas realizaciones, una región de anclaje puede tener una etiqueta óptica (OL) unida a la superficie de la partícula sintética. El número de etiquetas ópticas en cada una de las regiones de anclaje puede variar, por ejemplo, ser o ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000. En algunas realizaciones, una etiqueta óptica comprende una secuencia de sonda. Las regiones de anclaje con etiquetas ópticas unidas se pueden denominar regiones de etiquetas ópticas.

[0319] Cada región de anclaje puede tener una etiqueta óptica única (OL) unida a la superficie de la partícula sintética. En algunas realizaciones, cada partícula sintética puede incluir 9 tipos de marcadores ópticos, OL1-9, unidos a la superficie de la partícula sintética. En algunas realizaciones, cada partícula sintética puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos de estos números, tipos de etiquetas ópticas. Para cada partícula sintética, OL1 -9 puede ser igual o diferente. En algunas realizaciones, cada tipo de etiquetas ópticas se une a la partícula sintética en una región de anclaje. En algunas realizaciones, al menos una de las regiones de anclaje de la partícula sintética comprende más de un tipo de etiquetas ópticas. En algunas realizaciones, están presentes dos, tres, cuatro, cinco o más tipos de etiquetas ópticas en una región de anclaje.

[0320] Un marcador óptico puede comprender una secuencia de oligonucleótidos. El marcador óptico puede comprender un oligonucleótido. En algunas realizaciones, el marcador óptico puede comprender dos o más oligonucleótidos con la misma secuencia. La etiqueta óptica puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos de marcadores ópticos pueden ser, o pueden ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0321] En algunas realizaciones, OL1-3 se puede utilizar para codificar la etiqueta celular parte 1 correspondiente a primeras 96 etiquetas celulares únicas en la primera etapa de codificación; OS4-6 se puede usar para codificar la parte 2 de la etiqueta celular correspondiente a segundas 96 etiquetas celulares únicas en el segundo paso de división; y OL7-9 se puede usar para codificar la parte 3 de la etiqueta celular correspondiente a una tercera parte de 96 etiquetas celulares únicas en el tercer paso de división. En algunas realizaciones, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o un número entre dos de estos valores, las etiquetas ópticas se pueden utilizar para codificar una parte de una etiqueta celular. En algunas realizaciones, cada parte de una etiqueta celular corresponde a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000, 10000000, 10000000, 100000000, 1000000000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, etiquetas celulares únicas. Un código de barras óptico de una partícula sintética puede incluir las etiquetas ópticas en la partícula sintética. El código de barras óptico de una partícula sintética puede incluir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000 o un número entre dos de estos valores, etiquetas ópticas.

[0322] Además de la "etiqueta óptica" que constituye el código de barras óptico, toda la superficie de la partícula sintética o parte de la superficie de la partícula sintética se puede unir con la secuencia universal (US) con el extremo 3’ hacia arriba, es decir, el extremo 3' del oligonucleótido no está unido a la partícula sintética. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos OL pueden ser extremos 5’ arriba y no 3'. Si los oligonucleótidos OL están 5’ arriba, los restos ópticos se pueden añadir mediante el método de ligación. La secuencia universal puede ocupar 0,00001%, 0,0001%, 0,01%, 0,1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99,9%, o un número o intervalo entre dos de estos valores, de la superficie de la partícula sintética. La secuencia universal puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0323] Para las etiquetas celulares que comprenden cada una tres partes, que codifican las partículas sintéticas pueden incluir tres etapas de codificación. La etiqueta celular puede incluir la parte 1 de la etiqueta celular, la parte 2 de la etiqueta celular y la parte 3 de la etiqueta celular. En algunas realizaciones, la etiqueta celular puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000 o un número o un intervalo entre dos de estos valores, partes. La codificación de las partículas sintéticas puede incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000 o un número o un intervalo entre dos de estos valores, pasos de codificación.

[0324] En la primera etapa de codificación/el primer paso de división, las partículas sintéticas pueden ser distribuidas a través de 96 pocillos de una primera placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pocillo. En algunas realizaciones, la primera placa puede incluir 96, 394, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número entre dos cualesquiera de estos valores, pocillos. Cada pocillo puede contener 4 tipos de oligonucleótidos, posiblemente incluyendo la secuencia universal (US) y tres tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo adicional de oligonucleótidos puede incluir un marcador óptico con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. Los tres tipos adicionales de oligonucleótidos codifican una parte marcadora celular. En algunas realizaciones, cada pocillo puede contener, o contener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 6070, 80, 90, 100, 1000, o un número de intervalo entre dos de estos valores, tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo de oligonucleótidos puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Cada parte celular puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0325] El primer tipo de oligonucleótidos cada uno puede contener una región complementaria con la secuencia universal (US), seguido de la parte 1 de la etiqueta celular (1 de 96), seguido de una secuencia de engarce (enlazador 1). La región complementaria a la secuencia universal puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. El enlazador 1 puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0326] El segundo tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL1 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de los 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. La etiqueta óptica puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos. Los restos ópticos espectralmente distintos incluyen restos ópticos con espectros de emisión distinguibles incluso si su espectro de emisión puede solaparse.

[0327] El tercer tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL2 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo 3. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos.

[0328] El cuarto tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL3 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos.

[0329] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la primera placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pozo, una polimerasa tal como ADN polimerasa y una ligasa tal como una ligasa de ADN se pueden introducir en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia universal con la parte 1 del marcador celular y las secuencias del enlazador 1. La ADN ligasa puede unir covalentemente los restos ópticos en los oligonucleótidos OL.

[0330] En la segunda etapa de codificación incluyendo grupo y segunda escisión, partículas sintéticas de todos los pocillos de la primera placa pueden agruparse, y se dividen en cada uno de los 96 pocillos de una segunda placa. En algunas realizaciones, la segunda placa puede incluir 96, 394, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número entre dos cualesquiera de estos valores, pocillos. Cada pocillo puede contener 4 tipos de oligonucleótidos, posiblemente incluyendo la secuencia universal (US) y tres tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo adicional de oligonucleótidos puede incluir un marcador óptico con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. Los tres tipos adicionales de oligonucleótidos codifican una parte marcadora celular. En algunas realizaciones, cada pocillo puede contener, o contener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 6070, 80, 90, 100, 1000, o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo de oligonucleótidos puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Cada parte celular puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0331] El primer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir enlazador 1, seguido de la parte 2 de la etiqueta celular (1 de 96, por ejemplo), seguido por otra secuencia de engarce (enlazador 2). El enlazador 2 puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0332] El segundo tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL4 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. La etiqueta óptica puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos. Restos ópticos espectralmente distintos incluyen restos ópticos con espectros de emisión distinguible incluso si pueden solaparse los espectros de emisión.

[0333] El tercer tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL5 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo 5 ni en el extremo 3. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos.

[0334] El cuarto tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL6 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos.

[0335] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la segunda placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pozo, una polimerasa tal como ADN polimerasa y una ligasa tal como una ligasa de ADN se pueden introducir en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia universal con la parte 2 del marcador celular y las secuencias del enlazador 2. La ADN ligasa puede unir covalentemente los restos ópticos en los oligonucleótidos Ol .

[0336] En la tercera etapa de codificación incluyendo grupo y tercera división, partículas sintéticas de todos los pocillos de la segunda placa pueden agruparse, y se dividen en cada uno de los 96 pocillos de una tercera placa. En algunas realizaciones, la tercera placa puede incluir 96, 394, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número entre dos cualesquiera de estos valores, pocillos. Cada pocillo puede contener 4 tipos de oligonucleótidos, posiblemente incluyendo la secuencia universal (US) y tres tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo adicional de oligonucleótidos puede incluir un marcador óptico con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. Los tres tipos adicionales de oligonucleótidos codifican una parte marcadora celular. En algunas realizaciones, cada pocillo puede contener, o contener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 6070, 80, 90, 100, 1000, o un número de intervalo entre dos de estos valores, tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo de oligonucleótidos puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Cada parte celular puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0337] El primer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir el enlazador 2, seguido por la parte 3 de la etiqueta celular (1 de 96), seguido por el índice molecular (randómeros) y oligo(dA). El índice molecular puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. El oligo(dA) puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0338] El segundo tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL7 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. La etiqueta óptica puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos. Los restos ópticos espectralmente distintos incluyen restos ópticos con espectros de emisión distinguibles incluso si el espectro de emisión puede solaparse.

[0339] El tercer tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL8 con un pequeño 7' de extensión, y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos.

[0340] El cuarto tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL9 con una pequeña extensión 5', y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de restos ópticos espectralmente distintos.

[0341] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la tercera placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pozo, una polimerasa tal como ADN polimerasa y una ligasa tal como una ligasa de ADN se pueden introducir en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia universal con la secuencia de la parte 3 del marcador celular. La ADN ligasa puede unir covalentemente el resto óptico a los oligonucleótidos OL.

[0342] En la ia etapa de codificación incluyendo grupo y segunda división, partículas sintéticas de todos los pocillos de la (i-1)a placa pueden agruparse, y se divide en cada uno de los 96 pozos de la ia placa. En algunas realizaciones, la ia placa puede incluir 96, 394, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número entre dos de estos valores, pozos. Cada pocillo puede contener m tipos de oligonucleótidos, posiblemente incluyendo la secuencia universal (US) y j tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo adicional de oligonucleótidos puede incluir un marcador óptico con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. El resto óptico puede ser parte de un oligonucleótido. Los j tipos adicionales de oligonucleótidos codifican una parte marcadora celular. En algunas realizaciones, cada pocillo puede contener, o contener aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 6070, 80, 90, 100, 1000, o un número de intervalo entre dos de estos valores, tipos adicionales de oligonucleótidos. Cada tipo de oligonucleótidos puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud. Cada parte celular puede ser, o puede ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, o un número o intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0343] El primer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir enlazador (i-1), seguido de la Parte I de la etiqueta celular (1 de 96, por ejemplo), seguido por otra secuencia de engarce (enlazador i). El enlazador i y el enlazador (i-1) pueden ser, o pueden ser aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 10000, o un número o un intervalo entre dos de estos valores, nucleótidos de longitud.

[0344] Cada uno de los j tipos adicionales de oligonucleótidos pueden incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a Olm con una pequeña extensión 5', y una cadena complementaria más corta a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo, en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la etiqueta óptica está en el extremo de 5, o ni en el extremo de 5 ni en el extremo de 3. La etiqueta óptica puede ser, o puede ser aproximadamente, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, o un número o un intervalo entre dos cualesquiera de estos valores, nucleótidos de longitud. El resto óptico se puede seleccionar de un grupo de k restos ópticos espectralmente distintos. Los restos ópticos espectralmente distintos incluyen restos ópticos con espectros de emisión distinguibles incluso si el espectro de emisión puede solaparse.

[0345] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la ia placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pozo, una polimerasa tal como ADN polimerasa y una ligasa tal como una ligasa de ADN puede ser introducida en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia universal con la parte i del marcador celular y las secuencias del enlazador i. La ADN ligasa puede unir covalentemente los restos ópticos en los oligonucleótidos OL. En algunas realizaciones, se pueden añadir restos ópticos a cada uno de los oligonucleótidos OL mediante extensión de polimerasa con nucleótidos marcados con restos ópticos. Para un código de barras óptico que comprende n etiquetas ópticas, posiblemente codificadas por i pasos de codificación, cada uno con j tipos adicionales de oligonucleótidos, cada uno seleccionado de un grupo de k restos ópticos espectralmente distintos, el código de barras óptico puede representar kn = ki,j etiquetas celulares únicas.

[0346] En algunas realizaciones, la primera reacción de codificación con acoplamiento de OS1-3 y 1 de la etiqueta de 96 células parte 1 se puede lograr mediante un proceso enzimático. En algunas realizaciones, la primera reacción de codificación se puede incorporar en el proceso de litografía. En lugar de generar 1 tipo de partícula sintética de núcleo con litografía, se pueden generar 96 tipos de partículas sintéticas mediante litografía. La secuencia universal puede ser reemplazada por uno de los oligonucleótidos de la parte l' del marcador celular 96'. La combinación correspondiente de restos ópticos OS1, OS2 y OS3 se puede unir a las partículas sintéticas durante el proceso de litografía.

Síntesis de partículas sintéticas

[0347] En algunas realizaciones, las partículas sintéticas se generan usando fotolitografía. En algunas realizaciones, las partículas sintéticas se generan usando litografía de parada de flujo. Para generar partículas sintéticas con n oligonucleótidos OL, por ejemplo, 9 oligonucleótidos OL, fabrique un dispositivo de microfluidos (por ejemplo, PDMS o NOA) con n puertos de entrada que converjan en un solo canal, lo que lleva a 1 puerto de salida. En cada uno de los puertos de entrada, alimente una mezcla de, por ejemplo, poli(etilenglicol) diacrilato PEGDA, fotoiniciador, oligonucleótido de secuencia universal modificada con acridita 5’ (US) y oligonucleótido OL modificado por acridita 5’ (oligonucleótido OL1 para puerto de entrada 1, oligonucleótido OL2 para puerto de entrada 2,..., oligonucleótido OLn para el puerto de entrada n). Posteriormente, aplique presión en cada uno de los puertos de entrada. Las n entradas formarán n corrientes paralelas en régimen de flujo laminar. Exponga una región del canal convergente con, por ejemplo, UV a través de una fotomáscara con el contorno de la forma de la partícula sintética. Tras la exposición a UV, los oligonucleótidos de PEGDA y acridita pueden reticularse para formar una partícula sintética de hidrogel sólido, con n regiones cada una con un oligonucleótido OL diferente dispuesto uno al lado del otro. Las partículas sintéticas pueden recogerse en el puerto de salida y usarse para la codificación de soportes sólidos tales como partículas sintéticas.

Métodos para decodificar sustratos

[0348] En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir decodificar el soporte sólido. En algunas realizaciones, el método puede incluir decodificar la pluralidad de partículas sintéticas. Decodificar la pluralidad de partículas sintéticas puede incluir detectar el código de barras óptico de la pluralidad de partículas sintéticas. Los métodos pueden incluir determinar las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas. La detección del código de barras óptico de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas para determinar la ubicación de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas puede incluir generar una imagen óptica que muestre los códigos de barras ópticos y las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas.

[0349] La descripción proporciona métodos para decodificar sustratos (por ejemplo, matrices) que comprenden códigos de barras estocásticos. En algunas realizaciones, los métodos comprenden decodificar el soporte sólido. En algunas realizaciones, la decodificación no se basa únicamente en el uso de firmas ópticas, por ejemplo, códigos de barras ópticos (aunque como se describe aquí, el uso de cuentas con firmas ópticas puede permitir la "reutilización" de las sondas de decodificación), sino más bien en el uso de ácidos nucleicos decodificadores combinatorios que se añaden durante un paso de decodificación. La decodificación se puede realizar con hibridaciones secuenciales. Los ácidos nucleicos decodificadores pueden hibridar con un ácido nucleico que codifica un identificador distinto (sonda de identificación) que se coloca en las cuentas, o con el propio agente bioactivo, por ejemplo, cuando el agente bioactivo es un ácido nucleico, al menos una parte del cual es monocatenario para permitir la hibridación con una sonda de decodificación. Los ácidos nucleicos decodificadores pueden marcarse directa o indirectamente. La decodificación se produce al detectar la presencia de la etiqueta.

[0350] Los ácidos nucleicos que codifican (también denominados sondas identificadoras (IP) o el identificador de ácidos nucleicos) pueden comprender una secuencia de cebador y una secuencia de decodificación adyacente. Cada sonda decodificadora (o decodificadora) puede comprender una secuencia de cebado (a veces denominada en el presente documento como una "secuencia invariante"), que puede hibridar con la secuencia del cebador, y al menos un nucleótido decodificador, generalmente contenido dentro de una secuencia variable. Las sondas decodificadoras se pueden hacer como conjuntos, y cada conjunto comprende al menos cuatro subconjuntos que tienen cada uno un nucleótido decodificador diferente en la misma posición, es decir, la posición de detección (es decir, adenina, timidina (o uracilo, según se desee), citosina y guanina), con cada nucleótido en la posición de detección (nucleótido de detección) que comprende un marcador único, preferiblemente un fluoróforo. Las sondas decodificadoras se pueden agregar en condiciones que permitan la discriminación de complementariedad perfecta y complementariedad imperfecta. Por tanto, la sonda de decodificación que comprende la base correcta para el apareamiento de bases con el nucleótido codificante que se interroga puede hibridar mejor. Las otras sondas de decodificación se pueden lavar. La detección del fluoróforo único asociado con el nucleótido de detección puede permitir la identificación del nucleótido codificante en esa posición. Repitiendo estos pasos con un nuevo conjunto de sondas de decodificación que extienden la posición del nucleótido de detección en una base, se puede dilucidar la identidad del siguiente nucleótido codificante. La decodificación puede utilizar una gran cantidad de sondas. La síntesis combinatoria dividida y mixta se puede utilizar para preparar las sondas de decodificación.

[0351] El análisis de paridad puede utilizarse durante la decodificación para aumentar la robustez y precisión del sistema. El análisis de paridad puede referirse a un paso de decodificación en donde la señal de un elemento particular puede analizarse a través de una pluralidad de etapas de decodificación. Es decir, después de al menos un paso de decodificación, se puede analizar la señal de un elemento de matriz en las etapas de decodificación. La señal de una cuenta particular se puede evaluar en múltiples etapas. Aunque el análisis puede incluir cualquier parámetro que pueda obtenerse de las señales, como evaluar la señal total obtenida en las etapas, se puede analizar la paridad de las señales en las etapas.

[0352] La paridad puede referirse a la lectura digital o modular de señales, es decir, pares o impares, cuando se utilizan señales binarias. La suma de dígitos de las señales en una pluralidad de etapas puede traducirse en una determinación de paridad. La determinación de la paridad puede resultar útil para evaluar el proceso de decodificación. Por ejemplo, los códigos se pueden diseñar para que tengan un número impar de una señal particular, por ejemplo, una señal roja, cuando se ven en todas las etapas o pasos de decodificación, o una pluralidad predeterminada de etapas o pasos de decodificación. La detección de un número par de etapas rojas puede proporcionar una indicación de que se ha producido un error en algún punto de la decodificación. Cuando se obtiene este resultado, el código defectuoso puede descartarse o repetirse el análisis.

[0353] La descripción permite la introducción de una "etapa redundante" en el sistema de decodificación. Una etapa redundante puede referirse a una etapa que sirve como verificación de paridad. Es decir, siguiendo las etapas de decodificación, se puede incluir una etapa adicional para analizar la paridad. Este análisis puede proporcionar una indicación de la competencia o validez de la decodificación. Cuando los códigos se diseñan con una paridad predeterminada, la etapa redundante se puede usar para detectar la paridad de las señales obtenidas del paso de decodificación. La etapa redundante puede detectar errores de paridad porque si ha habido un error en la decodificación, la paridad detectada después de la etapa redundante será diferente de la paridad diseñada en los códigos.

[0354] En algunas realizaciones, la descodificación se puede producir mediante el uso de 8-mer oligonucleótidos ensartados para crear un oligonucleótido de la decodificación con unos 8-meros en él. El oligonucleótido decodificador puede comprender al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más 8-meros en él. El oligonucleótido decodificador puede comprender como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más 8-meros en él. El oligonucleótido decodificador puede hibridar con algunos códigos de barras estocásticos diferentes (por ejemplo, hibridando sus diferentes regiones de 8 meros con diferentes regiones de 8 meros en códigos de barras estocásticos). El oligonucleótido decodificador se puede marcar, fundir y secuenciar de forma fluorescente. Los oligonucleótidos decodificadores se pueden marcar con fluorescencia en diferentes colores. Los oligonucleótidos decodificadores se pueden marcar de forma fluorescente con el mismo color pero con varios niveles de intensidad fluorescente, generando así un mapa de "escala de grises" de una sonda. Repetir esto puede proporcionar un mapa solucionable de dónde se encuentra cada 8 unidades de un código de barras estocástico en relación con los demás. El método puede repetirse al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces. El método puede repetirse como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces.

[0355] En algunas realizaciones, la decodificación se puede realizar mediante secuenciación por síntesis (por ejemplo, usando 454 y/o secuenciación de torrente de iones). La decodificación se puede realizar mediante formación de imágenes de cuentas codificadas ópticamente. Por ejemplo, las cuentas se pueden codificar con puntos cuánticos o fluoróforos que se pueden incrustar en las cuentas. Los puntos cuánticos o fluoróforos se pueden utilizar en el proceso de decodificación. En algunas realizaciones, las cuentas codificadas ópticamente pueden comprender un tinte. El tinte se puede utilizar para distinguir cuentas con diferentes códigos de barras estocásticos. La decodificación puede ocurrir con el uso de soportes sólidos codificados físicamente (por ejemplo, cuentas). Por ejemplo, una cuenta puede estar estampada o grabada con un identificador. El identificador se puede grabar en la cuenta con un láser o con métodos de litografía. En algunas realizaciones, las cuentas se pueden codificar físicamente en función del tamaño y/o la forma. La decodificación puede ocurrir con cuentas codificadas electrónicamente. La decodificación puede utilizar una lectura electrónica para leer el identificador electrónico en las cuentas. Un identificador electrónico puede incluir, por ejemplo, una etiqueta RFID, una resistencia eléctrica y/o una capacitancia eléctrica.

Difusión a través de un sustrato

[0356] Cuando una muestra (por ejemplo, celular) está con código de barras estocástico de acuerdo con los métodos de la descripción, la célula puede ser lisada. En algunas realizaciones, la lisis de una célula puede resultar en la difusión del contenido de la lisis (por ejemplo, el contenido celular) lejos de la ubicación inicial de la lisis. En otras palabras, el contenido de la lisis puede moverse a un área de superficie mayor que el área de superficie ocupada por la célula.

[0357] La difusión de la mezcla de lisis de la muestra (p. ej., que comprende dianas) se puede modular mediante varios parámetros que incluyen, entre otros, la viscosidad de la mezcla de lisis, la temperatura de la mezcla de lisis, el tamaño de los dianas, el tamaño de las barreras físicas. en un sustrato, la concentración de la mezcla de lisis y similares. Por ejemplo, la temperatura de la reacción de lisis se puede realizar a una temperatura de al menos 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 C o más. La temperatura de la reacción de lisis se puede realizar a una temperatura de como máximo 1,2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 C o más. La viscosidad de la mezcla de lisis se puede alterar, por ejemplo, añadiendo reactivos espesantes (por ejemplo, glicerol, cuentas) para ralentizar la velocidad de difusión. La viscosidad de la mezcla de lisis se puede alterar, por ejemplo, añadiendo reactivos diluyentes (por ejemplo, agua) para aumentar la velocidad de difusión. Un sustrato puede comprender barreras físicas (p. ej., pozos, micropocillos, microcolinas) que pueden alterar la velocidad de difusión de las dianas de una muestra. La concentración de la mezcla de lisis se puede alterar para aumentar o disminuir la velocidad de difusión de las dianas de una muestra. La concentración de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 o más veces. La concentración de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 o más veces.

[0358] La velocidad de difusión se puede incrementar. Se puede reducir la velocidad de difusión. La velocidad de difusión de una mezcla de lisis se puede aumentar o disminuir en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces en comparación con una mezcla de lisis sin alterar. La velocidad de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más veces en comparación con una mezcla de lisis inalterada. La velocidad de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% en comparación con una mezcla de lisis inalterada. La velocidad de difusión de una mezcla de lisis puede aumentarse o disminuirse en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% en comparación con una mezcla de lisis inalterada.

Formación de imágenes de muestra

[0359] La divulgación proporciona composiciones, métodos, kits y sistemas para la identificación de la localización espacial de los ácidos nucleicos en una diana de una muestra. La Figura 12 ilustra una realización ejemplar del método de colas de homopolímero de la divulgación. La divulgación proporciona un sustrato 1210 que comprende una pluralidad de sondas 1205 unidas a la superficie del sustrato. El sustrato 1210 puede ser una micromatriz. La pluralidad de sondas 1205 puede comprender un oligo(dT). La pluralidad de sondas 1205 puede comprender una secuencia específica de gen. La pluralidad de sondas 105 puede comprender un código de barras estocástico. Se puede colocar y/o cultivar una muestra (por ejemplo, células) 1215 sobre el sustrato 1210. El sustrato que comprende la muestra se puede analizar 1220, por ejemplo mediante formación de imágenes y/o inmunohistoquímica. La muestra 1215 se puede lisar 1225 sobre el sustrato 1210. Los ácidos nucleicos 1230 de la muestra 1215 pueden asociarse (por ejemplo, hibridar) con la pluralidad de sondas 1205 sobre el sustrato 1210. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos 1230 pueden transcribirse de forma inversa, con cola de homopolímero y/o amplificarse (por ejemplo, con amplificación puente). Los ácidos nucleicos amplificados se pueden interrogar 1235 con sondas de detección 1240 (por ejemplo, sondas fluorescentes). Las sondas de detección 1240 pueden ser sondas específicas de genes. La ubicación de unión de las sondas de detección 1240 sobre el sustrato 1210 puede correlacionarse con la imagen del sustrato, produciendo así un mapa que indica la ubicación espacial de los ácidos nucleicos en la muestra.

[0360] En algunas realizaciones, los métodos de la divulgación pueden comprender hacer 1245 una réplica de 1246 del sustrato original 1210. El sustrato replicado 1246 puede comprender una pluralidad de sondas 1231. La pluralidad de sondas 1231 puede ser la misma que la pluralidad de sondas 1205 en el sustrato original 1210. La pluralidad de sondas 1231 puede ser diferente a la pluralidad de sondas 1205 en el sustrato original 1210. Por ejemplo, la pluralidad de sondas 1205 pueden ser sondas oligo(dT) y la pluralidad de sondas 1231 en el sustrato replicado 1246 pueden ser sondas específicas de genes. El sustrato replicado se puede procesar como el sustrato original, como por ejemplo con sondas de interrogación por detección (por ejemplo, fluorescentes).

Análisis de datos y software de visualización

Análisis de los datos y la visualización de la resolución espacial de las dianas

[0361] La descripción proporciona métodos para estimar el número y posición de las dianas con códigos de barras estocásticos y el recuento digital utilizando etiquetas espaciales. Los datos obtenidos de los métodos de divulgación se pueden visualizar en un mapa. Se puede construir un mapa del número y la ubicación de dianas de una muestra usando información generada usando los métodos descritos en este documento. El mapa se puede utilizar para localizar una ubicación física de una diana. El mapa se puede utilizar para identificar la ubicación de varias dianas. Las dianas múltiples pueden ser la misma especie de diana, o las dianas múltiples pueden ser varias dianas diferentes. Por ejemplo, se puede construir un mapa de un cerebro para mostrar el recuento digital y la ubicación de múltiples dianas.

[0362] El mapa se puede generar a partir de datos de una sola muestra. El mapa se puede construir utilizando datos de múltiples muestras, generando así un mapa combinado. El mapa se puede construir con datos de decenas, cientos y/o miles de muestras. Un mapa construido a partir de múltiples muestras puede mostrar una distribución de recuentos digitales de dianas asociadas con regiones comunes a las múltiples muestras. Por ejemplo, los ensayos replicados se pueden mostrar en el mismo mapa. Se pueden mostrar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas) en el mismo mapa. Se pueden mostrar como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más réplicas (por ejemplo, superpuestas) en el mismo mapa. La distribución espacial y el número de dianas se pueden representar mediante una variedad de estadísticas.

[0363] La combinación de datos de múltiples muestras puede aumentar la resolución de ubicación del mapa combinado. La orientación de múltiples muestras se puede registrar mediante puntos de referencia comunes, en los que las mediciones de ubicación individuales en las muestras son al menos en parte no contiguas. Un ejemplo particular es seccionar una muestra usando un micrótomo en un eje y luego seccionar una segunda muestra a lo largo de un acceso diferente. El conjunto de datos combinado proporcionará ubicaciones espaciales tridimensionales asociadas con recuentos digitales de dianas. La multiplexación del enfoque anterior permitirá mapas tridimensionales de alta resolución de estadísticas de conteo digital.

[0364] En algunas realizaciones del sistema de instrumentos, el sistema comprenderá medios legibles por ordenador que incluyen código para proporcionar análisis de datos para los conjuntos de datos de secuencia generados mediante la realización de ensayos de códigos de barras estocásticos de célula única. Los ejemplos de la funcionalidad de análisis de datos que puede proporcionar el software de análisis de datos incluyen, entre otros, (i) algoritmos para decodificar/demultiplexar la etiqueta de la muestra, la etiqueta celular, la etiqueta espacial y la etiqueta molecular, y los datos de secuencia diana proporcionados mediante la secuenciación de la biblioteca de códigos de barras estocásticos creada al ejecutar el ensayo, (ii) algoritmos para determinar el número de lecturas por gen por célula y el número de moléculas de transcripción únicas por gen por célula, según los datos, y creando tablas de resumen, (iii) análisis estadístico de los datos de secuencia, por ejemplo, para la agrupación de células mediante datos de expresión génica, o para predecir intervalos de confianza para la determinación del número de moléculas de transcripción por gen por célula, etc., (iv) algoritmos para identificar subpoblaciones de células raras, por ejemplo, utilizando análisis de componentes principales, agrupación jerárquica, agrupación de k-medias, mapas autoorganizados, redes neuronales, etc., (v) capacidades de alineación de secuencias para alineación de datos de secuencia génica con secuencias de referencia conocidas y detección de mutaciones, marcadores polimórficos y variantes de empalme, y (vi) agrupamiento automatizado de marcadores moleculares para compensar errores de amplificación o secuenciación. En algunas realizaciones, se puede utilizar software disponible comercialmente para realizar todo o una parte del análisis de datos, por ejemplo, el software Seven Bridges (https://www.sbgenomics.com/) se puede utilizar para compilar tablas del número de copias. de uno o más genes presentes en cada célula para la colección completa de células. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede incluir opciones para generar los resultados de la secuenciación en formatos gráficos útiles, por ejemplo, mapas de calor que indican el número de copias de uno o más genes que ocurren en cada célula de una colección de células. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede comprender además algoritmos para extraer el significado biológico de los resultados de la secuenciación, por ejemplo, correlacionando el número de copias de uno o más genes que ocurren en cada célula de una colección de células con un tipo de célula, un tipo de célula rara o una célula derivada de un sujeto que tiene una enfermedad o afección específica. En alguna realización, el software de análisis de datos puede comprender además algoritmos para comparar poblaciones de células en diferentes muestras biológicas.

[0365] En algunas realizaciones, toda la funcionalidad de análisis de datos puede empaquetarse dentro de un único paquete de software. En algunas realizaciones, el conjunto completo de capacidades de análisis de datos puede comprender un conjunto de paquetes de software. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede ser un paquete autónomo que se pone a disposición de los usuarios independientemente del sistema de instrumentos de ensayo. En algunas realizaciones, el software puede estar basado en la web y puede permitir a los usuarios compartir datos.

[0366] En algunas realizaciones, toda la funcionalidad de análisis de datos puede empaquetarse dentro de un único paquete de software. En algunas realizaciones, el conjunto completo de capacidades de análisis de datos puede comprender un conjunto de paquetes de software. En algunas realizaciones, el software de análisis de datos puede ser un paquete autónomo que se pone a disposición de los usuarios independientemente del sistema de instrumentos de ensayo. En algunas realizaciones, el software puede estar basado en la web y puede permitir a los usuarios compartir datos.

Procesadores del sistema y redes

[0367] En general, la computadora o procesador incluido en los sistemas de instrumentos descritos actualmente, como se ilustra en la Figura 13, puede entenderse además como un aparato lógico que puede leer instrucciones desde el medio 1311 o un puerto de red 1305, que opcionalmente se puede conectar al servidor 1309 que tiene un medio fijo 1312. El sistema 1300, como se muestra en la Figura 13, puede incluir una CPU 1301, unidades de disco 1303, dispositivos de entrada opcionales como el teclado 1315 o el ratón 1316 y el monitor opcional 1307. La comunicación de datos puede lograrse a través del medio de comunicación indicado a un servidor en una ubicación local o remota. El medio de comunicación puede incluir cualquier medio para transmitir o recibir datos. Por ejemplo, el medio de comunicación puede ser una conexión de red, una conexión inalámbrica o una conexión a Internet. Esta conexión puede proporcionar comunicación a través de la World Wide Web. Se prevé que los datos relacionados con la presente divulgación se puedan transmitir a través de dichas redes o conexiones para su recepción o revisión por una parte 1322 como se ilustra en la Figura 13.

[0368] La Figura 14 ilustra una realización ejemplar de una primera arquitectura de ejemplo de un sistema informático.

1400 que se puede usar en conexión con realizaciones de ejemplo de la presente divulgación. Como se muestra en la Figura 14, el sistema informático de ejemplo puede incluir un procesador 1402 para procesar instrucciones. Los ejemplos no limitativos de procesadores incluyen: procesador Intel XeonTM, procesador AMD Opteron™, procesador Samsung RISC ARM 1176JZ (F)-S v1.0™ de 32 bits, procesador ARM Cortex-A8 Samsung S5PC100TM, procesador ARM Cortex-A8 Apple A4TM, Procesador Marvell PXA 930TM, o un procesador funcionalmente equivalente. Se pueden utilizar varios subprocesos de ejecución para el procesamiento en paralelo. En algunas realizaciones, también se pueden usar múltiples procesadores o procesadores con múltiples núcleos, ya sea en un solo sistema informático, en un grupo o distribuidos entre sistemas a través de una red que comprende una pluralidad de computadoras, teléfonos celulares o dispositivos auxiliares de datos personales.

[0369] Como se ilustra en la Figura 14, una memoria caché de alta velocidad 1404 se puede conectar a, o incorporarse en el procesador 1402 para proporcionar una memoria de alta velocidad para obtener instrucciones o datos que han sido recientemente, o que están con frecuencia, utilizados por el procesador 1402. El procesador 1402 está conectado a un puente norte 1406 mediante un bus de procesador 1408. El puente norte 1406 está conectado a la memoria de acceso aleatorio (RAM) 1410 mediante un bus de memoria 1412 y gestiona el acceso a la RAM 1410 mediante el procesador 1402. El puente norte 1406 también está conectado a un puente sur 1414 mediante un bus de chipset 1416. El puente sur 1414 está, a su vez, conectado a un bus periférico 1418. El bus periférico puede ser, por ejemplo, PCI, PCI-X, PCI Express u otro bus periférico. El puente norte y el puente sur a menudo se denominan chipset de procesador y administran la transferencia de datos entre el procesador, la RAM y los componentes periféricos en el bus periférico 118. En algunas arquitecturas alternativas, la funcionalidad del puente norte se puede incorporar al procesador, en lugar de utilizar un chip de puente norte separado.

[0370] En algunas realizaciones, el sistema 1400 puede incluir una tarjeta de acelerador 1422 unida al bus periférico 1418. El acelerador puede incluir matrices de puertas programables (FPGAs) u otro hardware para acelerar cierto procesamiento. Por ejemplo, se puede utilizar un acelerador para la reestructuración adaptativa de datos o para evaluar expresiones algebraicas utilizadas en el procesamiento de conjuntos extendidos.

[0371] El software y los datos se almacenan en el almacenamiento externo 1424 y se pueden cargar en la RAM 1410 o la memoria caché 1404 para su uso por parte del procesador. El sistema 1400 incluye un sistema operativo para gestionar los recursos del sistema; Ejemplos no limitativos de sistemas operativos incluyen: Linux, Windows™, MACOS™, BlackBerry OS™, iOS™ y otros sistemas operativos funcionalmente equivalentes, así como software de aplicación que se ejecuta en la parte superior del sistema operativo para administrar el almacenamiento de datos y la optimización de acuerdo con con ejemplos de realización de la presente invención.

[0372] En este ejemplo, el sistema 1400 también incluye tarjetas de interfaz de red (NIC) 1420 y 1421 conectadas al bus de periféricos para proporcionar interfaces de red al almacenamiento externo, como Network Attached Storage (NAS) y otros sistemas informáticos que se pueden utilizar para procesamiento paralelo distribuido.

[0373] La Figura 15 ilustra un diagrama ejemplar que muestra una red 1500 con una pluralidad de sistemas informáticos 1502a y 1502b, una pluralidad de teléfonos móviles y asistentes de datos personales 1502c y almacenamiento conectado a la red (NAS) 1504a y 1504b. En realizaciones de ejemplo, los sistemas 1512a, 1512b y 1512c pueden gestionar el almacenamiento de datos y optimizar el acceso a los datos para los datos almacenados en el almacenamiento conectado a la red (NAS) 1514a y 1514b. Puede usarse un modelo matemático para los datos y evaluarse usando procesamiento paralelo distribuido a través de los sistemas informáticos 1512a y 1512b, y los sistemas de asistencia de datos personales y de teléfono celular 1512c. Los sistemas informáticos 1512a y 1512b, y los sistemas de asistentes de datos personales y de teléfonos móviles 1512c también pueden proporcionar un procesamiento paralelo para la reestructuración de datos adaptativa de los datos almacenados en el almacenamiento conectado a la red (NAS) 1514a y 1514b. La Figura 15 ilustra solo un ejemplo, y se puede usar una amplia variedad de otras arquitecturas y sistemas informáticos junto con las diversas realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede utilizar un servidor Blade para proporcionar procesamiento paralelo. Los blades del procesador se pueden conectar a través de un plano posterior para proporcionar procesamiento en paralelo. El almacenamiento también se puede conectar al plano posterior o como almacenamiento conectado a la red (NAS) a través de una interfaz de red separada.

[0374] En algunas realizaciones de ejemplo, los procesadores pueden mantener espacios de memoria separados y transmitir datos a través de interfaces de red, soporte u otros conectores para procesamiento paralelo por otros procesadores. En otras realizaciones, algunos o todos los procesadores pueden utilizar un espacio de memoria de direcciones virtuales compartido.

[0375] La Figura 16 ilustra un diagrama de bloques ejemplar de un sistema 1600 de ordenador multiprocesador que usa un espacio de memoria de dirección virtual compartida de acuerdo con una realización ejemplar. El sistema incluye una pluralidad de procesadores 1602a-f que pueden acceder a un subsistema de memoria compartida 1604. El sistema incorpora una pluralidad de procesadores de algoritmos de memoria de hardware programables (MAP) 1606af en el subsistema de memoria 1604. Cada MAP 1606a-f puede comprender una memoria 1608a-f y una o más matrices de puertas programables de campo (FPGA) 1610a-f. El MAP proporciona una unidad funcional configurable y se pueden proporcionar algoritmos particulares o partes de algoritmos a las FPGA 1610a-f para su procesamiento en estrecha coordinación con un procesador respectivo. Por ejemplo, los MAP se pueden utilizar para evaluar expresiones algebraicas con respecto al modelo de datos y para realizar una reestructuración adaptativa de datos en realizaciones de ejemplo. En este ejemplo, todos los procesadores pueden acceder globalmente a cada MAP para estos fines. En una configuración, cada MAP puede utilizar el acceso directo a memoria (DMA) para acceder a una memoria asociada 308a-f, lo que le permite ejecutar tareas de forma independiente y asincrónica del microprocesador respectivo 302a-f. En esta configuración, un MAP puede enviar resultados directamente a otro MAP para la canalización y la ejecución paralela de algoritmos.

[0376] Las arquitecturas y sistemas informáticos anteriores son sólo ejemplos, y una amplia variedad de otro ordenador, teléfono celular, y arquitecturas de asistente de datos personales y sistemas se pueden utilizar en conexión con realizaciones de ejemplo, incluyendo los sistemas que utilizan cualquier combinación de procesadores generales, coprocesadores, FPGA y otros dispositivos lógicos programables, sistema en chips (SOL), circuitos integrados específicos de aplicación (ASIC) y otros elementos de procesamiento y lógicos. En algunas realizaciones, todo o parte del sistema informático se puede implementar en software o hardware. Se puede utilizar cualquier variedad de medios de almacenamiento de datos en conexión con realizaciones de ejemplo, incluyendo memoria de acceso aleatorio, discos duros, memoria flash, unidades de cinta, matrices de discos, almacenamiento conectado a la red (NAS) y otros dispositivos y sistemas de almacenamiento de datos locales o distribuidos.

[0377] En realizaciones de ejemplo, el subsistema de ordenador de la presente divulgación puede ser implementado utilizando módulos de software que se ejecutan en cualquiera de los anteriores u otras arquitecturas y sistemas informáticos. En otras realizaciones, las funciones del sistema se pueden implementar parcial o completamente en firmware, dispositivos lógicos programables como arreglos de puertas programables en campo (FPGA), sistema en chips (SOL), circuitos integrados de aplicación específica (ASIC) u otro procesamiento y elementos lógicos. Por ejemplo, Set Processor and Optimizer se puede implementar con aceleración de hardware mediante el uso de una tarjeta aceleradora de hardware, como una tarjeta aceleradora.

Kits

[0378] En la presente memoria se describen kits para realizar ensayos de códigos de barras estocásticos de célula única. El kit puede comprender uno o más sustratos (por ejemplo, matriz de micropocillos), ya sea como un sustrato independiente (o chip) que comprende una o más matrices de micropocillos, o empaquetado dentro de una o más células de flujo o cartuchos, y una o más suspensiones de soporte, en las que los soportes sólidos individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos adjuntos de la divulgación. En algunas realizaciones, el kit puede comprender además un dispositivo mecánico para montar un sustrato autónomo con el fin de crear pozos de reacción que faciliten el pipeteo de muestras y reactivos en el sustrato. El kit puede comprender además reactivos, por ejemplo, tampones de lisis, tampones de aclarado o tampones de hibridación, para realizar el ensayo de códigos de barras estocásticos. El kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores o tampones) para realizar reacciones de extensión de ácidos nucleicos, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa. El kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores universales, cebadores de secuenciación, cebadores específicos de diana o tampones) para realizar reacciones de amplificación para preparar bibliotecas de secuenciación. El kit puede comprender reactivos para realizar el método de litografía de marcadores de la divulgación (por ejemplo, marcadores preespaciales y reactivos para activar la secuencia de consenso activable).

[0379] El kit puede comprender uno o más moldes, por ejemplo, moldes que comprenden una matriz de micropilares, para sustratos de fundición (por ejemplo, matrices de micropocillos), y uno o más soportes sólidos (por ejemplo, cuenta), en donde las cuentas individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos adjuntos de la divulgación. El kit puede comprender además un material para usar en sustratos de moldeo (por ejemplo, agarosa, un hidrogel, PDMS y similares).

[0380] El kit puede comprender uno o más sustratos que son pre-cargados con soportes sólidos que comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos adjuntos de la descripción. En algunas realizaciones, puede haber un soporte sólido por micropocillo del sustrato. En algunas realizaciones, la pluralidad de códigos de barras estocásticos se puede unir directamente a una superficie del sustrato, en lugar de a un soporte sólido. En cualquiera de estas realizaciones, las matrices de uno o más micropocillos se pueden proporcionar en forma de sustratos (o chips) independientes, o se pueden empaquetar en células de flujo o cartuchos.

[0381] En algunas realizaciones de los kits descritos, el kit puede comprender uno o más cartuchos que incorporan uno o más sustratos. En algunas realizaciones, el uno o más cartuchos pueden comprender además uno o más soportes sólidos precargados, en los que los soportes sólidos individuales dentro de una suspensión comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos adjuntos de la divulgación. En algunas realizaciones, las cuentas se pueden distribuir previamente en una o más matrices de micropocillos del cartucho. En algunas realizaciones, las cuentas, en forma de suspensiones, pueden precargarse y almacenarse dentro de los pocillos de reactivo del cartucho. En algunas realizaciones, el uno o más cartuchos pueden comprender además otros reactivos de ensayo que están precargados y almacenados dentro de los depósitos de reactivo de los cartuchos.

[0382] En el presente documento se describen kits para realizar análisis espacial de ácidos nucleicos en una muestra. El kit puede comprender uno o más sustratos (por ejemplo, matriz) de la divulgación, ya sea como un sustrato independiente (o chip) que comprende una o más matrices. La matriz puede comprender sondas de la divulgación. El kit puede comprender una o más matrices replicadas de la divulgación. Las matrices replicadas pueden comprender sondas específicas de gen u oligo(dT)/poli(A).

[0383] El kit puede comprender además reactivos, por ejemplo tampones de lisis, tampones de enjuague, o tampones de hibridación, para realizar el ensayo. El kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores, dNTP, NTP, inhibidores de RNasa o tampones) para realizar reacciones de extensión de ácido nucleico, por ejemplo, reacciones de transcripción inversa y reacciones de extensión de cebador. El kit puede comprender además reactivos (por ejemplo, enzimas, cebadores universales, cebadores de secuenciación, cebadores específicos de la diana o tampones) para realizar reacciones de amplificación para preparar bibliotecas de secuenciación. El kit puede comprender reactivos para la formación de colas de homopolímeros de moléculas (por ejemplo, una enzima transferasa terminal y dNTP). El kit puede comprender reactivos para, por ejemplo, cualquier escisión enzimática de la divulgación (por ejemplo, Exol nucleasa, enzima de restricción).

[0384] Los kits pueden incluir generalmente instrucciones para llevar a cabo uno o más de los métodos descritos en este documento. Las instrucciones incluidas en los kits se pueden adherir al material de embalaje o se pueden incluir como prospecto. Si bien las instrucciones suelen ser materiales escritos o impresos, no se limitan a ellos. La divulgación contempla cualquier medio capaz de almacenar tales instrucciones y comunicarlas a un usuario final. Dichos medios pueden incluir, pero no se limitan a, medios de almacenamiento electrónicos (por ejemplo, discos magnéticos, cintas, cartuchos, chips), medios ópticos (por ejemplo, CD ROM), etiquetas de RF y similares. Como se usa en este documento, el término "instrucciones" puede incluir la dirección de un sitio de Internet que proporciona las instrucciones.

Dispositivos

Células de flujo

[0385] El sustrato de matriz de micropocillos se puede empaquetar dentro de una célula de flujo que proporciona una interfaz conveniente con el resto del sistema de manejo de fluidos y facilita el intercambio de fluidos, por ejemplo, suspensiones de soporte sólido y celular, tampones de lisis, tampones de aclarado, etc., que se suministran a la matriz de micropocillos y/o gotita de emulsión. Las características de diseño pueden incluir: (i) uno o más puertos de entrada para introducir muestras de células, suspensiones de soporte sólido u otros reactivos de ensayo, (ii) una o más cámaras de matriz de micropocillos diseñadas para proporcionar un llenado uniforme y un intercambio de fluidos eficiente mientras se minimiza el remolinos o zonas muertas, y (iii) uno o más puertos de salida para la entrega de fluidos a un punto de recolección de muestras o un depósito de desechos. El diseño de la célula de flujo puede incluir una pluralidad de cámaras de micromatrices que interactúan con una pluralidad de arreglos de micropocillos de modo que una o más muestras de células diferentes se pueden procesar en paralelo. El diseño de la célula de flujo puede incluir además características para crear perfiles de velocidad de flujo uniformes, es decir, "flujo de tapón", a lo ancho de la cámara de la matriz para proporcionar una entrega más uniforme de células y cuentas a los micropocillos, por ejemplo, mediante el uso de una barrera porosa ubicada cerca de la entrada de la cámara y aguas arriba de la matriz de micropocillos como un "difusor de flujo", o dividiendo cada cámara de matriz en varias subsecciones que cubren colectivamente la misma área total de la matriz, pero a través de las cuales fluye en paralelo la corriente de fluido de entrada dividida. En algunas realizaciones, la célula de flujo puede encerrar o incorporar más de un sustrato de matriz de micropocillos. En algunas realizaciones, el conjunto integrado de célula de flujo/matriz de micropocillos puede constituir un componente fijo del sistema. En algunas realizaciones, el conjunto de célula de flujo/matriz de micropocillos puede retirarse del instrumento.

[0386] En general, las dimensiones de los canales de fluido y la(s) cámara(s) de la matriz en los diseños de célula de flujo se optimizarán para (i) proporcionar una entrega uniforme de células y cuentas a la matriz de micropocillos, y (ii) para minimizar la muestra y consumo de reactivos. En algunas realizaciones, la anchura de los canales de fluido estará entre 50 um y 20 mm. En otras realizaciones, el ancho de los canales de fluido puede ser de al menos 50 um, al menos 100 um, al menos 200 um, al menos 300 um, al menos 400 um, al menos 500 um, al menos 750 um, al menos 1 mm, al menos 2,5 mm, al menos 5 mm, al menos 10 mm, al menos 20 mm, al menos 50 mm, al menos 100 mm o al menos 150 mm. En otras realizaciones más, el ancho de los canales de fluido puede ser como máximo 150 mm, como máximo 100 mm, como máximo 50 mm, como máximo 20 mm, como máximo 10 mm, como máximo 5 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 um, como máximo 500 um, como máximo 400 um, como máximo 300 um, como máximo 200 um, como máximo 100 um o como máximo 50 um. En una realización, la anchura de los canales de fluido es de aproximadamente 2 mm. El ancho de los canales de fluido puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 250 um hasta aproximadamente 3 mm).

[0387] En algunas realizaciones, la profundidad de los canales de fluido estará entre 50 um y 2 mm. En otras realizaciones, la profundidad de los canales de fluido puede ser de al menos 50 um, al menos 100 um, al menos 200 um, al menos 300 um, al menos 400 um, al menos 500 um, al menos 750 um, al menos 1 mm, al menos 1,25 mm, al menos 1,5 mm, al menos 1,75 mm, o al menos 2 mm. En otras realizaciones más, la profundidad de los canales de fluido puede como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 um, como máximo 500 um, como máximo 400 um, como máximo 300 um, como máximo 200 um, como máximo 100 um, o como máximo 50 um. En una realización, la profundidad de los canales de fluido es de aproximadamente 1 mm. La profundidad de los canales de fluido puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, de aproximadamente 800 um a aproximadamente 1 mm).

[0388] Células de flujo se pueden fabricar usando una variedad de técnicas y materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, la célula de flujo se fabricará como una pieza separada y, posteriormente, se sujetará mecánicamente o se unirá permanentemente al sustrato de la matriz de micropocillos. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen mecanizado convencional, mecanizado CNC, moldeo por inyección, impresión 3D, alineación y laminación de una o más capas de películas poliméricas troqueladas o láser, o cualquiera de una serie de técnicas de microfabricación como fotolitografía y grabado químico húmedo, grabado en seco, grabado profundo con iones reactivos o micromecanizado con láser. Una vez que se ha fabricado la parte de la célula de flujo, se puede unir mecánicamente al sustrato de la matriz de micropocillos, por ejemplo, sujetándola contra el sustrato de la matriz de micropocillos (con o sin el uso de una junta), o se puede unir directamente al sustrato de la matriz de micropocillos utilizando cualquiera de una variedad de técnicas (dependiendo de la elección de los materiales utilizados) conocidas por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de unión anódica, unión térmica o cualquiera de una variedad de adhesivos o películas adhesivas, que incluyen adhesivos a base de epoxi, a base de acrílico, a base de silicona, curables por UV, a base de poliuretano o a base de anoacrilato.

[0389] Las células de flujo se pueden fabricar usando una variedad de materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, la elección del material utilizado dependerá de la elección de la técnica de fabricación utilizada y viceversa. Los ejemplos de materiales adecuados incluyen, pero no se limitan a, silicio, sílice fundida, vidrio, cualquiera de una variedad de polímeros, por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros olefínicos cíclicos (COP), copolímeros olefínicos cíclicos (COL), tereftalato de polietileno (PET), resinas epoxi, metales (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio), un material antiadherente como el teflón (PTFE) o una combinación de estos materiales.

Cartuchos

[0390] En algunas realizaciones del sistema, la matriz de micropocillos, con o sin una célula de flujo adjunto, pueden ser empaquetados dentro de un cartucho consumible que hace interfaz con el sistema de instrumentos. Las características de diseño de los cartuchos pueden incluir (i) uno o más puertos de entrada para crear conexiones de fluido con el instrumento o introducir manualmente muestras de células, suspensiones de microesferas u otros reactivos de ensayo en el cartucho, (ii) uno o más canales de derivación, es decir, para medición de muestras de células y suspensiones de cuentas, para evitar el sobrellenado o el reflujo, (iii) uno o más conjuntos integrados de matriz de micropocillos/célula de flujo, o una o más cámaras dentro de las cuales se colocan los sustratos de micromatrices, (iv) bombas en miniatura integradas u otros mecanismos de actuación de fluido para controlar el flujo de fluido a través del dispositivo, (v) válvulas en miniatura integradas (u otros mecanismos de contención) para compartimentar reactivos precargados (por ejemplo, suspensiones de cuentas) o controlar el flujo de fluido a través del dispositivo, (vi) uno o más respiraderos para proporcionar una vía de escape para el aire atrapado, (vii) uno o más depósitos de residuos de muestra y reactivo, (viii) uno o más puertos de salida para crear conexiones de fluido con el instrumento o proporcionando un punto de recolección de muestra procesada, (ix) características de interfaz mecánica para posicionar de manera reproducible el cartucho consumible extraíble con respecto al sistema del instrumento, y para proporcionar acceso de modo que los imanes externos se puedan acercar al conjunto de micropocillos, (x) componentes de control de temperatura integrados o una interfaz térmica para proporcionar un buen contacto térmico con el sistema del instrumento, y (xi) características de la interfaz óptica, por ejemplo, una ventana transparente, para uso en la interrogación óptica de la matriz de micropocillos.

[0391] El cartucho puede diseñarse para procesar más de una muestra en paralelo. El cartucho puede comprender además una o más cámaras de recogida de muestras extraíbles que son adecuadas para interactuar con termocicladores de PCR independientes o instrumentos de secuenciación. El cartucho en sí puede ser adecuado para interactuar con termocicladores de PCR independientes o instrumentos de secuenciación. El término "cartucho", como se usa en esta descripción, puede significar que incluye cualquier conjunto de piezas que contenga la muestra y las cuentas durante la realización del ensayo.

[0392] El cartucho puede comprender además componentes que están diseñados para crear barreras físicas o químicas que impiden la difusión de (o aumento de longitudes de trayectoria y tiempos de difusión para las moléculas grandes) moléculas grandes con el fin de minimizar la contaminación cruzada entre los pocillos. Los ejemplos de tales barreras pueden incluir, pero no se limitan a, un patrón de canales serpentinos utilizados para la entrega de células y soportes sólidos (por ejemplo, cuentas) a la matriz de micropocillos, una placa retráctil o una membrana deformable que se presiona en contacto con la superficie del sustrato de la matriz de micropocillos durante las etapas de lisis o incubación, el uso de cuentas más grandes, por ejemplo, cuentas de Sephadex como se describió anteriormente, para bloquear las aberturas de los micropocillos, o la liberación de un fluido hidrófobo inmiscible de un depósito dentro del cartucho durante la lisis o pasos de incubación, para separar y compartimentar eficazmente cada micropocillo de la matriz.

[0393] Las dimensiones de los canales de fluido y la(s) cámara(s) de la matriz en los diseños de cartucho se pueden optimizar para (i) proporcionar una entrega uniforme de células y cuentas a la matriz de micropocillos, y (ii) para minimizar el consumo de muestra y reactivo. El ancho de los canales de fluido puede tener entre 50 micrómetros y 20 mm. En otras realizaciones, el ancho de los canales de fluido puede ser de al menos 50 micrómetros, al menos 100 micrómetros, al menos 200 micrómetros, al menos 300 micrómetros, al menos 400 micrómetros, al menos 500 micrómetros, al menos 750 micrómetros, al menos 1 mm, al menos 2,5 mm, al menos 5 mm, al menos 10 mm, o al menos 20 mm. En otras realizaciones más, el ancho de los canales de fluido puede ser como máximo 20 mm, como máximo 10 mm, como máximo 5 mm, como máximo 2,5 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 micrómetros, como máximo 500 micrómetros, como máximo 400 micrómetros, como máximo 300 micrómetros, como máximo 200 micrómetros, como máximo 100 micrómetros o como máximo 50 micrómetros. El ancho de los canales de fluido puede ser de aproximadamente 2 mm. El ancho de los canales de fluido puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 250 um hasta aproximadamente 3 mm).

[0394] Los canales de fluido en el cartucho pueden tener una profundidad. La profundidad de los canales de fluido en los diseños de cartucho puede estar entre 50 micrómetros y 2 mm. La profundidad de los canales de fluido puede ser de al menos 50 micrómetros, al menos 100 micrómetros, al menos 200 micrómetros, al menos 300 micrómetros, al menos 400 micrómetros, al menos 500 micrómetros, al menos 750 micrómetros, al menos 1 mm, al menos 1,25 mm, al menos 1,5 mm, al menos 1,75 mm o al menos 2 mm. La profundidad de los canales de fluido puede ser como máximo 2 mm, como máximo 1,75 mm, como máximo 1,5 mm, como máximo 1,25 mm, como máximo 1 mm, como máximo 750 micrómetros, como máximo 500 micrómetros, como máximo 400 micrómetros, como máximo 300 micrómetros, como máximo 200 micrómetros, como máximo 100 micrómetros, o en la mayoría de 50 micrómetros. La profundidad de los canales de fluido puede ser de aproximadamente 1 mm. La profundidad de los canales de fluido puede caer dentro de cualquier intervalo limitado por cualquiera de estos valores (por ejemplo, desde aproximadamente 800 micrómetros hasta aproximadamente 1 mm).

[0395] Los cartuchos se pueden fabricar usando una variedad de técnicas y materiales conocidos por los expertos en la técnica. En general, los cartuchos se fabricarán como una serie de componentes separados (Figuras 17A-C) y posteriormente se ensamblarán utilizando cualquiera de una serie de ensamblajes mecánicos o técnicas de unión. Los ejemplos de técnicas de fabricación adecuadas incluyen, pero no se limitan a, mecanizado convencional, mecanizado CNC, moldeo por inyección, termoformado e impresión 3D. Una vez que se han fabricado los componentes del cartucho, se pueden ensamblar mecánicamente usando tornillos, clips y similares, o unir permanentemente usando cualquiera de una variedad de técnicas (dependiendo de la elección de materiales utilizados), por ejemplo, mediante el uso de unión térmica/soldadura o cualquiera de una variedad de adhesivos o películas adhesivas, incluidos los adhesivos a base de epoxi, a base de acrílico, a base de silicona, curables por UV, a base de poliuretano o a base de cianoacrilato.

[0396] Componentes del cartucho se pueden fabricar usando cualquiera de un número de materiales adecuados, incluyendo pero no limitados a silicio, fusionado de sílice, vidrio, cualquiera de una variedad de polímeros, por ejemplo polidimetilsiloxano (PDMS; elastómero), polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polipropileno (PP), polietileno (PE), polietileno de alta densidad (HDPE), poliimida, polímeros de olefinas cíclicas (COP), copolímeros de olefinas cíclicas (COL), tereftalato de polietileno (PET), resinas epoxi, materiales antiadherentes tales como teflón (PTFE), metales (por ejemplo, aluminio, acero inoxidable, cobre, níquel, cromo y titanio) o cualquier combinación de los mismos.

[0397] Las características de entrada y salida del cartucho pueden ser diseñadas para proporcionar conexiones de fluidos convenientes y a prueba de fugas con el instrumento, o pueden servir como reservorios abiertos de pipeteo manual de las muestras y reactivos dentro o fuera del cartucho. Los ejemplos de diseños mecánicos convenientes para los conectores de los puertos de entrada y salida pueden incluir, pero no se limitan a, conectores roscados, conectores de bloqueo Luer, desplazamiento Luer o conectores de punta deslizante, conectores de ajuste a presión y similares. Los puertos de entrada y salida del cartucho pueden comprender además tapas, tapas o cierres con resorte, o membranas de polímero que se pueden abrir o perforar cuando el cartucho se coloca en el instrumento, y que sirven para evitar la contaminación de las superficies internas del cartucho durante el almacenamiento o evitar que los líquidos se derramen cuando se retira el cartucho del instrumento. El uno o más puertos de salida del cartucho pueden comprender además una cámara de recogida de muestras extraíble que es adecuada para interactuar con termocicladores de PCR independientes o instrumentos de secuenciación.

[0398] El cartucho puede incluir bombas en miniatura integradas u otros mecanismos de actuación de fluido para controlar el flujo de fluido a través del dispositivo. Ejemplos de bombas en miniatura adecuadas o mecanismos de accionamiento de fluidos pueden incluir, entre otros, mecanismos de émbolo o jeringa en miniatura accionados electromecánicamente o neumáticamente, bombas de diafragma de membrana accionadas neumáticamente o por un pistón externo, bolsas o vejigas de reactivo accionadas neumáticamente, o bombas electro-osmóticas.

[0399] El cartucho puede incluir válvulas en miniatura para compartimentar reactivos precargados o controlar el flujo de fluido a través del dispositivo. Los ejemplos de válvulas en miniatura adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, "válvulas" de un solo paso fabricadas usando tapones de cera o polímero que pueden fundirse o disolverse, o membranas de polímero que pueden perforarse; válvulas de manguito construidas con membrana deformable y actuación neumática, magnética, electromagnética o electromecánica (solenoide), válvulas unidireccionales construidas con aletas de membrana deformable y válvulas de compuerta en miniatura.

[0400] El cartucho puede incluir orificios de ventilación para proporcionar una vía de escape para el aire atrapado. Los respiraderos se pueden construir de acuerdo con una variedad de técnicas, por ejemplo, usando un tapón poroso de polidimetilsiloxano (PDMS) u otro material hidrófobo que permite la capilaridad del aire pero bloquea la penetración del agua.

[0401] Las características de la interfaz mecánica del cartucho pueden permitir posicionamiento fácilmente desmontable pero de alta precisión y repetible del cartucho con respecto al sistema de instrumentos. Las características de interfaz mecánica adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, clavijas de alineación, guías de alineación, topes mecánicos y similares. Las características de diseño mecánico pueden incluir características de alivio para acercar aparatos externos, por ejemplo, imanes o componentes ópticos, a la cámara de la matriz de micropocillos (Figura 17B).

[0402] El cartucho también puede incluir componentes de control de temperatura o características de interfaz térmica para acoplarse a módulos de control de temperatura. Los ejemplos de elementos de control de temperatura adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, elementos de calentamiento resistivos, fuentes de luz emisoras de infrarrojos en miniatura, dispositivos de calentamiento o enfriamiento Peltier, disipadores de calor, termistores, termopares y similares. Las características de la interfaz térmica se pueden fabricar a partir de materiales que sean buenos conductores térmicos (por ejemplo, cobre, oro, plata, etc.) y pueden comprender una o más superficies planas capaces de hacer un buen contacto térmico con bloques calefactores externos o bloques refrigerantes.

[0403] El cartucho puede incluir características de interfaz óptica para su uso en formación de imágenes ópticas o la interrogación espectroscópica de la matriz de micropocillos. El cartucho puede incluir una ventana ópticamente transparente, por ejemplo, el sustrato de micropocillos en sí o el lado de la célula de flujo o cámara de micromatrices que está opuesto al arreglo de micropocillos, fabricado con un material que cumple con los requisitos espectrales para la técnica de formación de imágenes o espectroscópica utilizada para sondear el matriz de micropocillos. Los ejemplos de materiales de ventana óptica adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, vidrio, sílice fundida, polimetilmetacrilato (PMMA), policarbonato (PC), polímeros de olefinas cíclicas (COP) o copolímeros de olefinas cíclicas (COL).

[0404] Aunque las realizaciones preferidas de la presente invención se han mostrado y descrito en el presente documento, será obvio para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan solamente a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les ocurrirán a los expertos en la técnica sin apartarse de la invención. Se debe entender que diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento se pueden emplear en la práctica de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los métodos y estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones queden cubiertos por ellas.

EJEMPLOS

[0405] Algunos aspectos de las realizaciones discutidas anteriormente se describen con más detalle en los siguientes ejemplos, que no pretenden de ninguna manera limitar el alcance de la presente divulgación.

Ejemplo 1

Métodos para determinar el número de dianas distintas en ubicaciones espaciales en una muestra usando una etiqueta espacial

[0406] La divulgación proporciona métodos para determinar el número de dianas distintos y sus ubicaciones espaciales distintas en una muestra usando una etiqueta espacial en un código de barras estocástico de la divulgación. Un corte fino de tejido se divide en secciones. Las secciones se colocan sobre un sustrato de forma conocida. Las secciones se colocan sobre un sustrato de manera que conserven el orden físico de la sección de tejido. Las secciones se colocan sobre un sustrato de manera que no conserven el orden físico de la sección de tejido. La sección de tejido se pone en contacto con una pluralidad de soportes sólidos. La sección de tejido se pone en contacto con una pluralidad de soportes sólidos de una manera conocida de modo que el usuario sepa qué soporte sólido con qué etiqueta espacial contacta qué sección. Un solo soporte sólido puede entrar en contacto con cada sección del corte fino de tejido. Los soportes sólidos comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos. Los códigos de barras estocásticos comprenden una etiqueta universal, una etiqueta espacial, una etiqueta celular, una etiqueta molecular y una región de asociación de dianas. Se forma una imagen de la sección delgada de tejido con los soportes sólidos. La imagen captura la estructura física del corte fino de tejido e identifica la orientación de los soportes sólidos asociados con el corte fino de tejido. Por ejemplo, los soportes sólidos se pueden grabar con un identificador que puede ser visible en la imagen. La secuencia de la etiqueta espacial en cada uno de los soportes sólidos grabados es conocida previamente.

[0407] Las dianas de la sección fina de tejido se asocian con la región diana-asociación (por ejemplo, a través de su cola poli(A). Las dianas están reticuladas con la región de asociación de dianas. Los soportes sólidos se retiran de la sección delgada de tejido. Las dianas asociadas con la región de asociación de la diana se transcriben de forma inversa usando una transcriptasa inversa, generando así una molécula de código de barras diana que es una transcripción que incorpora las etiquetas del código de barras estocástico en su secuencia de polinucleótidos. La molécula de código de barras diana se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa. La secuencia de la molécula de código de barras diana se determina, por ejemplo, mediante secuenciación. La reacción de secuencia determina la etiqueta espacial, la etiqueta celular, la etiqueta molecular y parte o toda la secuencia de la diana. Se cuenta el número de dianas distintas, en los que las apariciones únicas de una etiqueta molecular específica indican una diana distinta. La secuencia de la etiqueta espacial se utiliza para correlacionar el número de dianas distintos con una posición en el espacio físico del corte fino de tejido. Se genera un mapa que muestra la ubicación y la cantidad de una diana distinta en la sección delgada del tejido. La cantidad de diana distinta se muestra como intensidad colorimétrica.

Ejemplo 2

Métodos para la determinación del número de destino distinto al de una ubicación espacial en una muestra usando una correlación de temporización

[0408] La descripción proporciona métodos para determinar el número de dianas distintas y sus distintas localizaciones espaciales en una muestra usando una etiqueta espacial en un código de barras estocástico de la divulgación y una correlación de tiempo. Un corte fino de tejido se separa en secciones utilizando un dispositivo. El dispositivo coloca las secciones sobre un sustrato de forma conocida. Las secciones se colocan sobre un sustrato de manera que conserven el orden físico de la sección de tejido. Las secciones se colocan sobre un sustrato de manera que no conserven el orden físico de la sección de tejido.

[0409] En algunas realizaciones, un dispositivo toma biopsias de un tejido sólido a una velocidad determinada. El dispositivo coloca las muestras de biopsia en un sustrato en un lugar determinado. La ubicación de la muestra de biopsia está relacionada con la velocidad a la que el dispositivo tomó las muestras de biopsia. Esto está relacionado con el tiempo que el dispositivo estuvo en una ubicación específica para tomar la muestra de biopsia.

[0410] En cualquier caso, la muestra/sección se pone en contacto con una pluralidad de soportes sólidos. La muestra/sección se pone en contacto con una pluralidad de soportes sólidos de una manera conocida de modo que el usuario sepa qué soporte sólido con qué etiqueta espacial contacta qué sección. Un solo soporte sólido puede entrar en contacto con cada sección de la muestra/sección. Los soportes macizos comprenden una pluralidad de códigos de barras estocásticos. Los códigos de barras estocásticos comprenden una etiqueta universal, una etiqueta espacial, una etiqueta celular, una etiqueta molecular y una región de asociación diana. Se crea una imagen de la muestra/sección con los soportes sólidos. La imagen captura la estructura física del corte fino de tejido e identifica la orientación de los soportes sólidos asociados con el corte fino de tejido. Por ejemplo, los soportes sólidos se pueden grabar con un identificador que puede ser visible en la imagen. La secuencia de la etiqueta espacial en cada uno de los soportes sólidos grabados es conocida previamente.

[0411] Las dianas de la sección de la muestra/sección asociada con la región diana-asociación (por ejemplo, a través de su cola poli(A). Las dianas están reticuladas con la región de asociación de dianas. Los soportes sólidos se retiran de la muestra/sección. Las dianas asociadas con la región de asociación de dianas son transcriptasa inversa utilizando una transcriptasa inversa, generando así una molécula de código de barras diana que es una transcripción que incorpora las etiquetas del código de barras estocástico en su secuencia de polinucleótidos. La molécula de código de barras diana se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa. La secuencia de la molécula de código de barras diana se determina, por ejemplo, mediante secuenciación. La reacción de secuencia determina la etiqueta espacial, la etiqueta celular, la etiqueta molecular y parte o toda la secuencia de la diana. Se cuenta el número de dianas distintas, en las que las apariciones únicas de una etiqueta molecular específica indican una diana distinta. La secuencia de la etiqueta espacial se utiliza para correlacionar el número de dianas distintas con un soporte sólido específico, que se correlaciona con un momento específico en donde el soporte sólido se puso en contacto con la muestra/sección. De esta forma, se analizará la posición de las distintas dianas en el espacio físico de la muestra/sección. Se genera un mapa que muestra la ubicación y la cantidad de una diana distinta en la muestra/sección. La cantidad de diana distinta se muestra como intensidad colorimétrica.

Ejemplo 3

Método para determinar el número de dianas distintas en una ubicación espacial en una muestra usando litografía de etiquetas

[0412] La divulgación proporciona métodos para determinar el número de dianas distintas y sus ubicaciones espaciales distintas en una muestra utilizando longitudes de etiquetas espaciales en un código de barras estocástico de la divulgación. Un corte fino de tejido se divide en secciones. Las secciones se colocan sobre un sustrato de forma conocida. Las secciones se colocan sobre un sustrato de manera que conserven el orden físico de la sección de tejido. Las secciones se colocan sobre un sustrato de manera que no conserven el orden físico de la sección de tejido. En algunas realizaciones, el corte fino de tejido no se separa en secciones. En algunas realizaciones, el corte fino de tejido se deja intacto.

[0413] En cualquier caso, el tejido se pone en contacto con una pluralidad de soportes sólidos. Un solo soporte sólido puede entrar en contacto con cada sección del corte fino de tejido. Los soportes sólidos pueden comprender una etiqueta preespacial. La etiqueta preespacial se adjunta al soporte sólido. La etiqueta preespacial comprende una etiqueta celular, una etiqueta molecular y una región de asociación de diana. La etiqueta preespacial comprende una secuencia de consenso activable. La secuencia de consenso activable se activa para unirse a un bloque de etiqueta espacial que comprende una secuencia activable correspondiente. Por ejemplo, la etiqueta preespacial comprende biotina y el bloque de etiqueta espacial comprende avidina en un extremo y biotina en el otro extremo. El bloque de etiqueta espacial es una secuencia de nucleótidos que cuando se concatenan forma una etiqueta espacial.

[0414] La concatenación de la etiqueta espacial se produce de manera geométrica, de manera que se añaden bloques de etiquetas espaciales discretos a etiquetas preespaciales específicas en ubicaciones físicas específicas. Los bloques de etiquetas espaciales se agregan de manera creciente mientras se mueven de arriba hacia abajo a través del corte fino de tejido. A continuación, se añaden bloques de etiquetas espaciales de manera creciente mientras se mueven de izquierda a derecha a través del corte fino de tejido. De esta manera, la longitud de la etiqueta espacial (es decir, que comprende bloques de etiquetas espaciales concatenados) es indicativa de una ubicación física en la muestra de tejido.

[0415] La sección delgada de tejido se forma la imagen con los soportes sólidos antes de que se han vinculado a los bloques de etiqueta espaciales. La imagen captura la estructura física del corte fino de tejido e identifica la orientación de los soportes sólidos asociados con el corte fino de tejido. Por ejemplo, los soportes sólidos se pueden grabar con un identificador que puede ser visible en la imagen. La secuencia de la etiqueta espacial en cada uno de los soportes sólidos grabados es conocida previamente.

[0416] Las dianas en la sección del corte fino de tejido asociado con la región diana-asociación (por ejemplo, a través de su cola poli(A). Las dianas están reticuladas con la región de asociación de dianas. Los soportes sólidos se retiran de la sección delgada de tejido. Las dianas asociadas con la región de asociación de la diana se transcriben de forma inversa usando una transcriptasa inversa, generando así una molécula de código de barras diana que es una transcripción que incorpora las etiquetas del código de barras estocástico en su secuencia de polinucleótidos. La molécula de código de barras diana se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa. La secuencia de la molécula de código de barras diana se determina, por ejemplo, mediante secuenciación. La reacción de secuencia determina la etiqueta espacial, la etiqueta celular, la etiqueta molecular y parte o toda la secuencia de la diana. Se cuenta el número de dianas distintas, en donde las apariciones únicas de una etiqueta molecular específica indican una diana distinta. La longitud de la etiqueta espacial se utiliza para correlacionar el número de dianas distintas con una posición en el espacio físico del corte fino de tejido. Se genera un mapa que muestra la ubicación y la cantidad de una diana distinta en la sección delgada del tejido. La cantidad de la diana distinta se muestra como intensidad colorimétrica.

Ejemplo 4

Métodos combinatorios para generar grandes bibliotecas de partículas sintéticas únicas con códigos de barras de ADN y códigos de barras que se pueden resolver espectralmente

[0417] Este ejemplo demuestra un método combinatorio para generar grandes bibliotecas de al menos 963 partículas sintéticas únicas con códigos de barras de ADN, como códigos de barras estocásticos, y códigos de barras con resolución espectral, como códigos de barras ópticos.

[0418] El método se utiliza para codificar partículas sintéticas. Como se muestra en la Figura 18A, cada partícula sintética puede contener 9 "regiones de anclaje". Cada región de anclaje puede tener un tamaño 1802 de unas pocas micras a decenas de micras de ancho. Las regiones de anclaje pueden disponerse en un formato longitudinal como se muestra en la Figura 18A, o en un formato de cuadrícula como se muestra en la Figura 18B. Las regiones de anclaje pueden ocupar toda la superficie de partículas sintéticas como se muestra en la Figura 18A, o parte de la superficie de partículas sintéticas como se muestra en la Figura 18B. Cada región de anclaje puede tener una etiqueta óptica (OL) única unida a la superficie de la partícula sintética. Las Figuras 18A-B muestran 9 etiquetas ópticas, OL1-9, unidas a la superficie de la partícula sintética. El marcador óptico único puede incluir una secuencia de oligonucleótidos. La etiqueta óptica única puede incluir un resto óptico único. El resto óptico único puede ser un fluoróforo. OL1-3 se puede usar para codificar la parte 1 de la etiqueta celular correspondiente a las primeras 96 etiquetas celulares únicas en el primer paso de codificación. OL4-6 se puede usar para codificar la parte 2 de la etiqueta celular correspondiente a segundas 96 etiquetas celulares únicas en el segundo paso de división. OL7-9 se puede usar para codificar la parte 3 de la etiqueta celular correspondiente a una tercera parte de 96 etiquetas celulares únicas en el tercer paso de división. Además de la “etiqueta óptica”, toda la superficie de la partícula sintética o parte de la superficie de la partícula sintética se puede unir con la secuencia universal (US) Con 3’ hacia arriba, es decir, el extremo 3' del oligonucleótido no está unido a la partícula sintética.

[0419] En la primera etapa de codificación/el primer paso de división, partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de una primera placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pocillo - la Figura 19 muestra la hibridación de oligonucleótidos en la primera etapa de codificación. Cada pocillo puede contener, por ejemplo, 4 tipos de oligonucleótidos. El primer tipo de oligonucleótidos puede contener cada uno una región complementaria a la secuencia universal (US), Seguida de la parte 1 de la marca celular (1 de 96), seguida de una secuencia enlazadora (enlazador 1). El segundo tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL1 con una pequeña extensión 5’ y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes, o 4 fluoróforos diferentes y la posibilidad de no tener fluoróforo. El tercer tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL2 con una pequeña extensión 5’, y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes, o 4 fluoróforos diferentes y la posibilidad de no tener fluoróforo. El cuarto tipo de oligonucleótidos puede incluir cada uno una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL3 con una pequeña extensión 5’ y una hebra más corta complementaria a la extensión de la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes, o 4 fluoróforos diferentes y la posibilidad de tener fluoróforo).

[0420] La Figura 20 es una tabla de búsqueda que muestra el contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la primera placa. El contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la primera placa muestra la correspondencia de la parte 1 del marcador celular y la codificación de OL1-3. El número de restos ópticos en un grupo de restos ópticos espectralmente distintos, es decir, el número de posibilidades de fluoróforos, tiene que ser suficiente para permitir la codificación de al menos el número de partículas sintéticas únicas. Para codificar 96 partículas sintéticas únicas, kn tiene que ser mayor o igual a 96, donde k es el número de restos ópticos en el grupo de restos ópticos espectralmente distintos, n es el número de regiones. En este ejemplo, n de OL1-3 es 3, n de OL4-6 es 3 y n de OL7-9 es 3. Por lo tanto, k tiene que ser al menos 5, con kn = 5A3 = 125 > 96.

[0421] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la primera placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pocillo de ADN polimerasa y ADN ligasa se puede introducir en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia US. Con la parte 2 del marcador celular y las secuencias del enlazador 2. La ADN ligasa puede unir covalentemente la sonda fluorescente a los oligonucleótidos OL.

[0412] La Figura 21 muestra los oligonucleótidos monocatenarios en las diversas regiones de las partículas sintéticas después de la polimerización, ligación y desnaturalización del ADN dúplex en el primer paso de codificación.

[0422] En la segunda etapa de codificación incluyendo grupo y segunda división, partículas sintéticas de todos los pocillos de la primera placa pueden agruparse, y se dividen en cada uno de los 96 pocillos de una segunda placa. La Figura 22 muestra la hibridación de oligonucleótidos en el segundo paso de codificación. Cada pocillo de la segunda placa puede contener 4 tipos de oligonucleótidos. Cada pocillo contiene 4 tipos de oligonucleótidos. El primer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir el enlazador 1, seguido de la parte 2 del marcador celular (1 de 96), seguido de otra secuencia del enlazador (enlazador 2). El segundo tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL4 con una pequeña extensión 5’, y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, tales como 5 fluoróforos diferentes o 4 fluoróforos diferentes y la posibilidad de que no haya fluoróforo. El tercer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL5 con una pequeña extensión 5’ y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes o 4 fluoróforos diferentes y la posibilidad de que no haya fluoróforo. El cuarto tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL6 con una pequeña extensión 5’, y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes o 4 fluoróforos diferentes y la posibilidad de que no haya fluoróforo.

[0423] La Figura 23 es una tabla de búsqueda que muestra el contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la segunda placa. El contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la segunda placa muestra la correspondencia de la parte 2 del marcador celular y la codificación de OL4-6.

[0424] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la segunda placa y se hibridan con los oligonucleótidos en cada pocillo, Se pueden introducir ADN polimerasa y ADN ligasa en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia US. Con la parte 1 del marcador celular y las secuencias del enlazador 1. La ADN ligasa puede unir covalentemente la sonda fluorescente a los oligonucleótidos OL. La Figura 24 muestra los oligonucleótidos monocatenarios en las diversas regiones de las partículas sintéticas después de la polimerización, ligación y desnaturalización del ADN dúplex en la segunda etapa de codificación.

[0425] En la tercera etapa de codificación incluyendo grupo y tercera división, partículas sintéticas de todos los pocillos de la segunda placa pueden agruparse, y se dividen en cada uno de los 96 pocillos de una tercera placa. La Figura 25 muestra la hibridación de oligonucleótidos en el tercer paso de codificación. Cada pocillo de la tercera placa puede contener 4 tipos de oligonucleótidos. Cada pocilio contiene 4 tipos de oligonucleótidos. El primer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir el enlazador 2, seguido de la parte 3 del marcador celular (1 de 96), seguido del índice molecular (aleatorizadores) y oligo(dA). El segundo tipo de oligonucleótidos cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL7 con una pequeña extensión 5’, y una hebra más corta complementaria a la extensión en la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes o 4 fluoróforos y la posibilidad de que no haya fluoróforo. El tercer tipo de oligonucleótido cada uno puede incluir una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL8 con una pequeña extensión 5’, y una hebra más corta complementaria a la extensión de la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes o 4 fluoróforos y la posibilidad de que no haya fluoróforo. El cuarto tipo de oligonucleótidos puede incluir cada uno una estructura dúplex que contiene una hebra complementaria a OL9 con una pequeña extensión 5’, y una hebra más corta complementaria a la extensión de la hebra más larga. La hebra más corta puede incluir una etiqueta óptica con un resto óptico, por ejemplo, un fluoróforo, en el extremo 3’. El fluoróforo puede ser una de cinco posibilidades, como 5 fluoróforos diferentes o 4 fluoróforos y la posibilidad de que no haya fluoróforo.

[0426] La Figura 26 es una tabla de búsqueda que muestra el contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la tercera placa. El contenido de oligonucleótidos en cada uno de los 96 pocillos de la tercera placa muestra la correspondencia de la parte 2 del marcador celular y la codificación de OL4-6.

[0427] Después de que las partículas sintéticas se distribuyen a través de 96 pocillos de la tercera placa y se hibridan con oligonucleótidos en cada pocillo de ADN polimerasa y ADN ligasa se puede introducir en cada pocillo. La ADN polimerasa puede extender la secuencia US. Con la parte 1 del marcador celular y las secuencias del enlazador 1. La ADN ligasa puede unir covalentemente la sonda fluorescente a los oligonucleótidos OL. La Figura 27 muestra los oligonucleótidos monocatenarios en las diversas regiones de las partículas sintéticas después de la polimerización, ligación y desnaturalización del ADN dúplex en la tercera etapa de codificación.

[0428] La Figura 28 muestra una partícula sintética completa recubierta con códigos de barras de ADN y el código de barras que se puede resolver espectralmente. Cada código de barras de ADN, como un código de barras estocástico, puede incluir una secuencia universal, una etiqueta celular, una etiqueta molecular y una región oligo(dT). La etiqueta celular puede incluir la parte 1 de la etiqueta celular, la parte 2 de la etiqueta celular y la parte 3 de la etiqueta celular separadas por el enlazador 1 y el enlazador 2. Cada código de barras que se puede resolver, como un código de barras óptico, puede incluir OL1-9 y los restos ópticos que lo acompañan.

[0429] La Figura 29 muestra una combinación ejemplar del código de barras que se puede resolver espectralmente, OL1 -9, de una partícula sintética. La partícula sintética se puede unir con una combinación única de 9 restos ópticos, como 9 regiones de fluorescencia. La combinación única de restos ópticos corresponde a una secuencia de marcaje celular única. La fluorescencia en cada región de fluorescencia dentro de la partícula sintética se puede detectar usando imágenes fluorescentes y análisis de imágenes. El marcador celular unido con la partícula sintética se puede determinar basándose en las tres tablas de las Figuras 20, 23 y 26. La combinación de las 9 regiones de fluorescencia corresponde al marcador celular 12, 70, 22.

[0430] En total, estos datos demuestran el uso del método de agrupación dividida para codificar partículas sintéticas con etiquetas de ADN y códigos de barras espectrales para generar grandes bibliotecas de partículas sintéticas.

Ejemplo 5

Generación de un mapa de la expresión génica espacial de cortes de tejido

[0431] Este ejemplo demuestra el uso de partículas sintéticas codificadas del Ejemplo 4 para generar mapa de expresión génica espacial de cortes de tejido.

[0432] En primer lugar, las partículas sintéticas codificadas se esparcen aleatoriamente sobre un portaobjetos. En segundo lugar, suspender las partículas sintéticas codificadas. T ras el secado, las partículas sintéticas se inmovilizarán y formarán una monocapa que no se solapa. En tercer lugar, escanee el portaobjetos bajo diferentes canales fluorescentes. En cuarto lugar, analice la imagen para deducir la firma espectral de cada partícula sintética codificada y deduzca la identidad de la etiqueta celular utilizando las tablas de búsqueda. En quinto lugar, coloque una sección delgada de tejido encima del portaobjetos con las partículas sintéticas codificadas. En sexto lugar, coloque un trozo de papel de filtro empapado con tampón de lisis en la parte superior de la sección de tejido y aplique presión, y manténgalo presionado para permitir la lisis celular y la hibridación del ARNm. Séptimo, coloque los reactivos de síntesis de ADNc en la parte superior del portaobjetos para realizar la reacción de síntesis de ADNc. Octavo, coloque los reactivos de PCR en la parte superior del portaobjetos para generar copias del cADN. Alternativamente, las partículas sintéticas codificadas se pueden recuperar en cualquier paso después de la hibridación del ARNm, y las reacciones posteriores se pueden llevar a cabo con partículas sintéticas codificadas en tubos. Noveno, secuenciar los productos de la PCR para determinar el marcador celular, el marcador de la molécula y la identidad genética. Décimo, mapee las moléculas asociadas con cada célula a la ubicación en el portaobjetos. Para cada gen, obtenga una imagen en 2D del número de moléculas diana que se encuentran en una ubicación específica.

[0433] En conjunto, estos datos demuestran el uso de partículas sintéticas codificadas para generar un mapa de la expresión génica espacial de cortes de tejido.

Ejemplo 6

Síntesis de partículas sintéticas

[0434] Este ejemplo demuestra la síntesis de partículas sintéticas mediante litografía de parada de flujo.

[0435] Primero, fabrique un dispositivo de microfluidos (por ejemplo, PDMS o NOA) con 9 puertos de entrada que convergen en un solo canal, lo que lleva a 1 puerto de salida. En segundo lugar, en cada uno de los puertos de entrada, alimente una mezcla de: poli(etilenglicol) diacrilato PEGDA, fotoiniciador, oligonucleótido de secuencia universal modificada con acrdita 5’ (US) y oligonucleótido OL modificado con acridita 5' (oligonucleótido OL1 para el puerto de entrada 1, oligonucleótido OL2 para el puerto de entrada 2,..., oligonucleótido OL9 para el puerto de entrada 9). En tercer lugar, aplique presión en cada uno de los puertos de entrada. Las 9 entradas formarán 9 corrientes paralelas en régimen de flujo laminar. Cuarto, exponer una región del canal convergente con UV a través de una fotomáscara con el contorno de la forma de la partícula sintética. Tras la exposición a los rayos UV, los oligonucleótidos de PEGDA y acridita pueden reticularse para formar una partícula sintética de hidrogel sólido, con 9 regiones cada una con un oligonucleótido OL diferente dispuesto uno al lado del otro. Las partículas sintéticas se pueden recoger en el puerto de salida y usar para el proceso de codificación de grupo dividido descrito en Ejemplo 4.

[0436] En conjunto, estos datos demuestran el uso de la síntesis de partículas sintéticas mediante litografía de flujo de parada.

[0437] En al menos algunas de las realizaciones descritas anteriormente, uno o más elementos utilizados en una forma de realización puede usarse de forma intercambiable en otra realización menos que dicha sustitución no es técnicamente factible. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden realizarse otras diversas omisiones, adiciones y modificaciones a los métodos y estructuras descritas anteriormente sin apartarse del alcance de la materia objeto reivindicada. Todas estas modificaciones y cambios están destinados a caer dentro del alcance del tema en cuestión, según se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0438] Con respecto al uso de sustancialmente cualquier término plural y/o singular en este documento, aquellos que tengan experiencia en la técnica pueden traducir del plural al singular y/o del singular al plural según sea apropiado para el contexto y/o aplicación. Las diversas permutaciones de singular/plural se pueden establecer expresamente en este documento por motivos de claridad.

[0439] Los expertos en la técnica entenderán que, en general, los términos utilizados en este documento, y especialmente en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, los cuerpos de las reivindicaciones adjuntas) se entienden generalmente como términos "abiertos" (por ejemplo, el término "incluyendo" debe interpretarse como "incluye pero no limitado a", el término "tener" debe interpretarse como "tener al menos", el término "incluye" debe interpretarse como "incluye pero no se limita a", etc.). Los expertos en la técnica entenderán además que si se pretende un número específico de una recitación de reivindicación introducida, dicha intención se recitará explícitamente en la reivindicación y, en ausencia de dicha recitación, dicha intención no está presente. Por ejemplo, como ayuda para la comprensión, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las frases introductorias "al menos uno" y "uno o más" para presentar las descripciones de las reivindicaciones. Sin embargo, el uso de tales frases no debe interpretarse en el sentido de que la introducción de una recitación de reivindicación por parte de los artículos indefinidos "un" o "una" limita cualquier reivindicación particular que contenga dicha recitación de reivindicación introducida a realizaciones que contengan solo una de dichas declaraciones, incluso cuando la misma reivindicación incluye las frases introductorias "uno o más" o "al menos uno" y artículos indefinidos como "un" o "una" (por ejemplo, "un" y/o "una" debe interpretarse como "al menos uno" o "uno o más"): lo mismo es válido para el uso de artículos definidos utilizados para introducir recitaciones de reclamaciones. Además, incluso si se recita explícitamente un número específico de una recitación de reivindicación introducida, los expertos en la técnica reconocerán que dicha recitación debe interpretarse en el sentido de al menos el número recitado (por ejemplo, la simple recitación de "dos recitaciones", sin otros modificadores, significa al menos dos recitaciones, o dos o más recitaciones). Además, en aquellos casos en los que una convención análoga a "al menos uno de A, B y C, etc." se utiliza, en general, dicha construcción está pensada en el sentido en que un experto en la técnica entendería la convención (p. ej., "un sistema que tenga al menos uno de A, B y C" incluiría, entre otros, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). En aquellos casos en los que una convención análoga a "al menos uno de A, B o C, etc." se utiliza, en general, dicha construcción está pensada en el sentido en que un experto en la técnica entendería la convención (por ejemplo, "un sistema que tiene al menos uno de A, B o C" incluiría, entre otros, sistemas que tienen A solo, B solo, C solo, A y B juntos, A y C juntos, B y C juntos, y/o A, B y C juntos, etc.). Los expertos en la técnica entenderán además que prácticamente cualquier palabra y/o frase disyuntiva que presente dos o más términos alternativos, ya sea en la descripción, las reivindicaciones o los dibujos, debe entenderse que contempla las posibilidades de incluir uno de los términos, cualquiera de los términos, o ambos términos. Por ejemplo, se entenderá que la frase "A o B" incluye las posibilidades de "A" o "B" o "A y B".

[0440] Además, cuando se describen características o aspectos de la divulgación en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la divulgación por lo tanto, también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.

[0441] Como se entenderá por un experto en la técnica, por cualquier y todos los efectos, como en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos descritos en este documento también abarcan cualquier y todos los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Cualquier intervalo enumerado se puede reconocer fácilmente por describir suficientemente y permitir que el mismo intervalo se divida en al menos mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc. Como ejemplo no limitativo, cada intervalo discutido aquí se puede desglosar fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la técnica, todos los lenguajes tales como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que" y similares incluyen el número mencionado y se refieren a intervalos que posteriormente se pueden dividir en subintervalos como se discutió anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada miembro individual. Así, por ejemplo, un grupo que recoge de 1 a 3 artículos se refiere a grupos que tienen 1,2 o 3 artículos. De manera similar, un grupo que tiene de 1 a 5 artículos se refiere a grupos que tienen 1,2, 3, 4 o 5 artículos, y así sucesivamente.

[0442] Mientras que los diversos aspectos y formas de realización han sido descritas en el presente documento, otros aspectos y realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los diversos aspectos y realizaciones descritas en este documento tienen el propósito de ilustrar y no pretenden ser limitantes, estando indicado el alcance real por las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar el número y las ubicaciones espaciales de una pluralidad de moléculas diana en una muestra, que comprende:

codificar estocásticamente con barras la pluralidad de moléculas diana en la muestra usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial y una etiqueta molecular, en donde la etiqueta espacial comprende una secuencia de ácido nucleico, y en donde la etiqueta espacial está asociada con una coordenada en una muestra, y en donde la etiqueta molecular comprende una secuencia de ácido nucleico, y en donde las etiquetas moleculares de diferentes códigos de barras estocásticos son diferentes entre sí;

generar una biblioteca indexada de las dianas con códigos de barras estocásticos;

estimar el número de cada una de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta molecular, en donde estimar el número de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta molecular comprende determinar la información de secuencia de las etiquetas espaciales y etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos y contar el número de marcadores moleculares con secuencias distintas; e identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta espacial, en donde las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra están en una superficie de la muestra, dentro de la muestra, subcelularmente en la muestra o cualquier combinación de la misma, en donde la muestra es:

(i) un tejido, una monocapa celular, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos; y/o

(ii) intacta durante la codificación estocástica con barras de la pluralidad de dianas en la muestra.

2. El método de la reivindicación 1, en donde codificar estocásticamente con barras la pluralidad de moléculas diana en la muestra comprende hibridar la pluralidad de códigos de barras estocásticos con la pluralidad de moléculas diana para generar moléculas diana con código de barras estocástico, y al menos una de la pluralidad de moléculas diana es hibridada con uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde determinar las secuencias de las etiquetas espaciales y las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende secuenciar algunos o todos de la pluralidad de códigos de barras estocásticos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además visualizar la pluralidad de moléculas diana en la muestra, en donde visualizar la pluralidad de moléculas diana en la muestra comprende mapear la pluralidad de moléculas diana en un mapa de la muestra, y en donde mapear la pluralidad de moléculas diana en el mapa de la muestra comprende generar un mapa bidimensional o un mapa tridimensional de la muestra.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra comprende una pluralidad de células, opcionalmente en donde la pluralidad de células comprende uno o más tipos de células, además opcionalmente en donde al menos uno de los uno o más tipos de células es célula cerebral, célula cardíaca, célula cancerosa, célula tumoral circulante, célula de órgano, célula epitelial, célula metastásica, célula benigna, célula primaria, célula circulatoria o cualquier combinación de las mismas.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la pluralidad de moléculas diana comprende ácidos ribonucleicos (ARN), ARN mensajeros (ARNm), microARN, ARN de interferencia pequeños (ARNip), productos de degradación de ARN, ARN que comprenden cada uno una cola poli(A), ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y cualquier combinación de los mismos.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la codificación estocástica con barras de la pluralidad de moléculas diana en la muestra se realiza con un soporte sólido que comprende la pluralidad de códigos de barras estocásticos, opcionalmente donde el soporte sólido comprende la pluralidad de códigos de barras estocásticos en dos o tres dimensiones, en los que opcionalmente el soporte sólido comprende opcionalmente una pluralidad de partículas sintéticas asociadas con la pluralidad de códigos de barras estocásticos, opcionalmente en donde el soporte sólido comprende un polímero, una matriz, un hidrogel, un dispositivo de matriz de agujas, un anticuerpo, o cualquier combinación de los mismos, y opcionalmente donde las partículas sintéticas son cuentas, opcionalmente donde las cuentas son cuentas de gel de sílice, cuentas de vidrio de poro controlado, cuentas magnéticas, Dynabeads, cuentas de Sephadex/Sepharose, cuentas de celulosa, cuentas de poliestireno o cualquier combinación de las mismas.

8. Un método para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de moléculas diana en una muestra, que comprende:

codificar estocásticamente con barras la pluralidad de moléculas diana en la muestra en uno o más puntos de tiempo usando una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta espacial, en donde la etiqueta espacial comprende una secuencia de ácido nucleico y en donde la etiqueta espacial está asociada con una coordenada en una muestra; e

identificar la ubicación espacial de cada una de la pluralidad de moléculas diana usando la etiqueta espacial secuenciando algunos o todos los códigos de barras estocásticos para obtener información de secuencia de la etiqueta espacial, y en donde las ubicaciones espaciales de la pluralidad de dianas en la muestra están en una superficie de la muestra, dentro de la muestra, subcelularmente en la muestra o cualquier combinación de los mismos;

en donde la muestra es:

(i) un tejido, una monocapa celular, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos; y/o

(ii) intacta durante la codificación estocástica con barras de la pluralidad de dianas en la muestra.

9. El método de la reivindicación 8, en donde codificar estocásticamente con barras la pluralidad de moléculas diana en la muestra usando la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende codificar estocásticamente con barras la pluralidad de moléculas diana en la muestra en diferentes puntos de tiempo usando la pluralidad de códigos de barras estocásticos, opcionalmente donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta de dimensión, y las etiquetas de dimensión de la pluralidad de códigos de barras estocásticos utilizados para codificar barras estocásticas, la pluralidad de moléculas diana en los diferentes puntos de tiempo son diferentes, y opcionalmente las etiquetas de dimensión se correlacionan con los diferentes puntos de tiempo.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en donde la codificación estocástica con barras la pluralidad de dianas comprende poner en contacto secciones de la muestra con un dispositivo a una velocidad especificada, en donde la velocidad especificada correlaciona las ubicaciones espaciales de la pluralidad de moléculas de ácido nucleico diana con uno o más puntos de tiempo.

11. Un método para determinar ubicaciones espaciales de una pluralidad de células individuales, que comprende: codificar estocásticamente con barras la pluralidad de células individuales usando una pluralidad de partículas sintéticas,

en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas puede estar muy cerca de una sola célula o un pequeño número de células,

en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas comprende una pluralidad de códigos de barras estocásticos, un primer grupo de etiquetas ópticas y un segundo grupo de etiquetas ópticas,

en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta celular y una etiqueta molecular etiqueta, en donde las etiquetas celulares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en una partícula sintética tienen la misma secuencia y las etiquetas celulares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en diferentes partículas sintéticas tienen secuencias diferentes, y en donde las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en los códigos de barras sintéticos son diferentes entre sí;

en donde cada etiqueta óptica en el primer grupo de etiquetas ópticas comprende un primer resto óptico y cada etiqueta óptica en el segundo grupo de etiquetas ópticas comprende un segundo resto óptico, y en donde el primer resto óptico y el segundo resto óptico se seleccionan de un grupo que incluye dos o más restos ópticos espectralmente distintos, y

en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas está asociada con un código de barras óptico que comprende el primer resto óptico y el segundo resto óptico;

detectar el código de barras óptico de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas para determinar la ubicación de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas; y

determinar las ubicaciones espaciales de la pluralidad de células individuales basándose en las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la pluralidad de células individuales está presente en un tejido, una monocapa de células, células fijadas, una sección de tejido o cualquier combinación de los mismos.

13. El método de la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde la detección del código de barras óptico de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas para determinar la ubicación de cada una de la pluralidad de partículas sintéticas comprende generar una imagen óptica que muestra los códigos de barras ópticos y las ubicaciones de la pluralidad de partículas sintéticas.

14. Una pluralidad de partículas sintéticas, cada una de las cuales comprende:

una pluralidad de códigos de barras estocásticos, en donde cada uno de la pluralidad de códigos de barras estocásticos comprende una etiqueta celular, que comprende una secuencia de ácido nucleico, y una etiqueta molecular, que comprende una secuencia de ácido nucleico, en donde la las etiquetas de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en una partícula sintética tienen la misma secuencia y las etiquetas celulares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en diferentes partículas sintéticas tienen diferentes secuencias, y en donde las etiquetas moleculares de la pluralidad de códigos de barras estocásticos en una partícula sintética son diferentes de unos y otros;

un primer grupo de etiquetas ópticas;

un segundo grupo de etiquetas ópticas,

en donde cada etiqueta óptica en el primer grupo de etiquetas ópticas comprende un primer resto óptico y cada etiqueta óptica en el segundo grupo de etiquetas ópticas comprende un segundo resto óptico, y en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas es asociada con un código de barras óptico que comprende el primer resto óptico y el segundo resto óptico y en donde el primer resto óptico y el segundo resto óptico se seleccionan de un grupo que comprende dos o más restos ópticos espectralmente distintos.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o la pluralidad de partículas sintéticas de la reivindicación 14, en donde cada una de la pluralidad de partículas sintéticas tiene un código de barras óptico único.