ES2837625T3 - Evento de algodón tolerante a herbicidas pdab4468.19.10.3 - Google Patents

Evento de algodón tolerante a herbicidas pdab4468.19.10.3 Download PDF

Info

Publication number
ES2837625T3
ES2837625T3 ES13741550T ES13741550T ES2837625T3 ES 2837625 T3 ES2837625 T3 ES 2837625T3 ES 13741550 T ES13741550 T ES 13741550T ES 13741550 T ES13741550 T ES 13741550T ES 2837625 T3 ES2837625 T3 ES 2837625T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
cotton
dna
event
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13741550T
Other languages
English (en)
Inventor
Yunxing Cui
Raina King
Tina Kaiser
Andrew Robinson
Dayakar Pareddy
Sandra Toledo
Leon Braxton
David Anderson
Terry Wright
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Corteva Agriscience LLC
Original Assignee
Dow AgroSciences LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow AgroSciences LLC filed Critical Dow AgroSciences LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2837625T3 publication Critical patent/ES2837625T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/36—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a singly bound oxygen or sulfur atom attached to the same carbon skeleton, this oxygen or sulfur atom not being a member of a carboxylic group or of a thio analogue, or of a derivative thereof, e.g. hydroxy-carboxylic acids
    • A01N37/38—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a singly bound oxygen or sulfur atom attached to the same carbon skeleton, this oxygen or sulfur atom not being a member of a carboxylic group or of a thio analogue, or of a derivative thereof, e.g. hydroxy-carboxylic acids having at least one oxygen or sulfur atom attached to an aromatic ring system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N39/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing aryloxy- or arylthio-aliphatic or cycloaliphatic compounds, containing the group or, e.g. phenoxyethylamine, phenylthio-acetonitrile, phenoxyacetone
    • A01N39/02—Aryloxy-carboxylic acids; Derivatives thereof
    • A01N39/04—Aryloxy-acetic acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/34—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • A01N43/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom six-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds
    • A01N57/20—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Abstract

Una semilla de algodón que comprende en su genoma un evento transgénico aad-12/pat que tiene una secuencia de ADN que es al menos 95% idéntica a los restos 1.355 - 7.741 de SEQ ID NO: 21, en donde el genoma también comprende una secuencia de ADN de diagnóstico seleccionada del grupo que consiste en los restos 1329-1380 de SEQ ID NO: 1 y los restos 143-194 de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Evento de algodón tolerante a herbicidas pdab4468.19.10.3
La presente invención se refiere a una semilla de algodón, una planta de algodón y una parte de una planta de algodón que comprende en su genoma un evento transgénico como se define en las reivindicaciones adjuntas. Adicionalmente, la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado y una molécula de ADN que tienen cualquiera de las secuencias definidas en las reivindicaciones, así como a un método para cultivar una cosecha de algodón resistente a un herbicida definido en las reivindicaciones.
Antecedentes
El gen que codifica AAD-12 (ariloxialcanoato dioxigenasa-12) es capaz de impartir niveles comerciales de tolerancia a los herbicidas de ácido fenoxiacético, 2,4-D y MCPA, y a los herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir y fluroxipir, cuando se expresa en plantas transgénicas. El gen que codifica PAT (fosfinotricina acetiltransferasa) es capaz de impartir tolerancia al herbicida fosfinotricina (glufosinato) cuando se expresa en plantas transgénicas. PAT se ha expresado con éxito en algodón para su uso como marcador seleccionable en la producción de cultivos transgénicos y para impartir niveles comerciales de tolerancia al herbicida glufosinato en plantas transgénicas.
Se sabe que la expresión de transgenes en plantas está influenciada por su ubicación en el genoma de la planta, quizás debido a la estructura de la cromatina (p. ej., heterocromatina) o la proximidad de elementos reguladores transcripcionales (p. ej., potenciadores) cerca del sitio de integración (Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477, 1988). Al mismo tiempo, la presencia del transgén en diferentes lugares del genoma influirá en el fenotipo general de la planta de diferentes formas. Por esta razón, a menudo es necesario escrutar una gran cantidad de eventos transgénicos para identificar un evento transgénico específico caracterizado por la expresión óptima de un gen de interés introducido. Por ejemplo, se ha observado en plantas y en otros organismos que puede haber una amplia variación en los niveles de expresión de un gen introducido entre eventos. También puede haber diferencias en los patrones de expresión espaciales o temporales, por ejemplo, diferencias en la expresión relativa de un transgén en varios tejidos vegetales, que pueden no corresponder a los patrones esperados de los elementos reguladores de la transcripción presentes en la construcción del gen introducido. Por esta razón, es común producir cientos o miles de eventos diferentes y seleccionar esos eventos para un solo evento que tenga los niveles y patrones de expresión transgénica deseados con fines comerciales. Un evento que tiene niveles o patrones deseados de expresión transgénica es útil para introducir el transgén en otros antecedentes genéticos mediante cruzamiento sexual utilizando métodos de reproducción convencionales. La progenie de tales cruzamientos mantiene las características de expresión transgénica del transformante original. Esta estrategia se utiliza para garantizar una expresión genética fiable en una serie de variedades que están bien adaptadas a las condiciones de cultivo locales.
Es deseable poder detectar la presencia de un evento en particular para determinar si la progenie de un cruzamiento sexual contiene un transgén o un grupo de transgenes de interés. Además, un método para detectar un evento en particular sería útil para cumplir con las regulaciones que requieren la aprobación previa a la comercialización y el etiquetado de alimentos o fibras derivadas de plantas de cultivos recombinantes, por ejemplo, o para su uso en el seguimiento ambiental, seguimiento de rasgos en cultivos en el campo, o seguimiento de productos derivados de una cosecha de cultivos, así como para asegurar el cumplimiento de las partes sujetas a términos regulatorios o contractuales.
Es posible detectar la presencia de un evento transgénico mediante cualquier método de detección de ácido nucleico conocido en la técnica que incluye, pero no se limita a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la hibridación del ADN utilizando sondas de ácido nucleico. Estos métodos de detección generalmente se enfocan a elementos genéticos utilizados frecuentemente, tales como promotores, terminadores, genes marcadores, etc., porque para muchas construcciones de ADN, la región codificante es intercambiable. Como resultado, tales métodos pueden no ser útiles para discriminar entre diferentes eventos, particularmente aquellos producidos utilizando la misma construcción de ADN o construcciones muy similares a menos que se conozca la secuencia de ADN del ADN flanqueante adyacente al ADN heterólogo insertado. Por ejemplo, un ensayo de PCR específico para eventos se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos 2006/0070139 para el evento de maíz Da S-59122-7. Sería deseable tener un método simple y discriminativo para la identificación del evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Descripción
Las realizaciones de la presente invención se definen en las reivindicaciones adjuntas. La presente descripción puede referirse adicionalmente a realizaciones que van más allá del alcance de las reivindicaciones. En la medida en que la descripción se refiere a un objeto de estudio no incluido en el alcance de las reivindicaciones, esto debe considerarse como ilustrativo, pero no como parte de la invención. La presente descripción describe un nuevo evento de transformación de algodón transgénico tolerante a herbicidas, designado como evento de algodón pDAB4468.19.10.3, que comprende aad-12 y pat, como se describe en el presente documento, insertado en un sitio específico dentro del genoma de una célula de algodón. Se ha depositado una semilla de algodón representativa en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) con el Núm. de Acceso identificado en el párrafo [0032]. El ADN de las plantas de algodón que contienen este evento incluye las secuencias de unión/flanqueantes descritas en este documento que caracterizan la ubicación del ADN insertado dentro del genoma del algodón. SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 son diagnósticas para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Más concretamente, las secuencias que rodean las uniones en los pb 1354/1355 de SEQ iD NO: 1 y pb 168/169 de SEQ ID NO: 2 son diagnósticas para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. El párrafo siguiente describe ejemplos de secuencias que comprenden estas uniones que son características del ADN de plantas de algodón que contienen el evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
En una realización, la descripción proporciona una planta de algodón, o parte de la misma, que es tolerante a herbicidas de ácido fenoxiacético tales como 2,4-D y MCPA. En otra realización, la descripción proporciona una planta de algodón, o parte de la misma, que es tolerante a los herbicidas de ácido piridiloxiacético tales como triclopir y fluroxipir. En una realización adicional, la descripción proporciona una planta de algodón que tiene un genoma que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304­ 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas. En otra realización, la descripción proporciona semillas de tales plantas.
En otra realización, la descripción proporciona una planta de algodón, o parte de la misma, que es tolerante a compuestos que se convierten en herbicidas auxínicos de fenoxiacetato tales como 2,4-D y MCPA (p. ej., 2,4-DB, MCPB, etc.). En una realización adicional, la descripción proporciona una planta de algodón, o parte de la misma, que es tolerante a compuestos que se convierten en herbicidas de ácido piridiloxiacético tales como triclopir y fluroxipir (p. ej., triclopirB, fluroxipirB, etc.). El radical de ácido butírico presente en los herbicidas fenoxiacetato auxina y ácido piridiloxiacético se convierte mediante p-oxidación en la forma fitotóxica de los herbicidas. Las formas de ácido butanoico de los herbicidas no son herbicidas en sí mismas. Se convierten a su forma ácida respectiva por p-oxidación dentro de plantas susceptibles (es decir, plantas de algodón), y es la forma de ácido acético del herbicida la que es fitotóxica. Los herbicidas de ácido butanoico no perjudican a las plantas incapaces de una rápida p-oxidación. Sin embargo, las plantas que son capaces de una rápida p-oxidación y pueden convertir el herbicida de ácido butanoico en forma acética son posteriormente protegidas por a AD-12. Por consiguiente, la descripción proporciona una planta de algodón que tiene un genoma que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos, que son diagnósticas de la presencia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. En otra realización, la descripción proporciona semillas de tales plantas.
En otra realización, la descripción proporciona un método para controlar malas hierbas en un cultivo de algodón que comprende aplicar herbicidas de ácido fenoxiacético tales como 2,4-D y MCPA, al cultivo de algodón, donde el cultivo de algodón comprende plantas de algodón que tienen un genoma que contiene una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143-194 de SEQ ID NO: 2; pb 118-219 de SEQ ID NO: 2; pb 68-269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1-369 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos, que son diagnósticas de la presencia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. En otra realización, la descripción proporciona un método para controlar las malas hierbas en un cultivo de algodón que comprende la aplicación de herbicidas de ácido piridiloxiacético, tales como triclopir y fluroxipir, al cultivo de algodón, donde el cultivo de algodón comprende plantas de algodón que tienen un genoma que contiene una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143-194 de SEQ ID NO: 2; pb 118-219 de SEQ ID NO: 2; pb 68-269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1-369 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos, que son diagnósticas de la presencia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. La presencia del gen aad-12 en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 imparte tolerancia a herbicidas de ácido fenoxiacético y herbicidas de ácido piridiloxiacético.
En otra realización, la descripción proporciona un método para controlar malas hierbas en un cultivo de algodón que comprende aplicar herbicida glufosinato al cultivo de algodón, comprendiendo dicho cultivo de algodón plantas de algodón que tienen un genoma que contiene una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329­ 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143-194 de SEQ ID NO: 2; pb 118-219 de SEQ ID NO: 2; pb 68-269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1-369 de SEQ ID NO: 2, y sus complementos, que son diagnósticas de la presencia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. La presencia del gen pat pDAB4468.19.10.3 en el evento de algodón imparte tolerancia al herbicida glufosinato.
En otra realización, la descripción proporciona un método para detectar el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 en una muestra que comprende ADN de algodón, comprendiendo dicho método:
(a) poner en contacto dicha muestra con un primer cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia flanqueante dentro de los pb 1 - 1354 de SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma, y un segundo cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia de inserto dentro de pb 1355 - 1672 de SEQ ID NO: 1 o el complemento de la misma; y
(b) analizar un amplicón generado entre dichos cebadores; o
(c) poner en contacto dicha muestra con un primer cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia de inserto dentro de los pb 1 - 168 de SEQ ID NO: 2 o el complemento de la misma, y un segundo cebador de al menos 10 pb de longitud que se une selectivamente a una secuencia flanqueante dentro de pb 169 - 2898 de SEQ ID NO: 2 o el complemento de la misma; y
(d) analizar un amplicón generado entre dichos cebadores.
En otra realización, la descripción proporciona un método para detectar el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 que comprende:
(a) poner en contacto dicha muestra con un primer cebador que se une selectivamente a una secuencia flanqueante seleccionada del grupo que consiste en pb 1 - 1354 de SEQ ID NO: 1 y pb 169 - 2898 de SEQ ID NO: 2, y complementos de la misma; y un segundo cebador que se une selectivamente a SEQ ID NO: 3, o el complemento de la misma;
(b) someter dicha muestra a la reacción en cadena de la polimerasa; y
(c) analizar un amplicón generado entre dichos cebadores.
En otra realización, la descripción proporciona un método de reproducción de una planta de algodón que comprende: cruzar una primera planta con una segunda planta de algodón para producir una tercera planta de algodón, comprendiendo dicha primera planta ADN que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas; y someter a ensayo dicha tercera planta de algodón para determinar la presencia de ADN que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254­ 1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas.
En otra realización, la descripción proporciona una molécula de ADN aislada que es diagnóstica del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Tales moléculas incluyen, además de SEQ ID NO: 1 y 2, moléculas de al menos 50 pb de longitud que comprenden una secuencia de polinucleótidos que abarca la unión pb 1354/1355 de SEQ ID NO: 1, y moléculas de al menos 50 pb de longitud que comprende una secuencia de polinucleótidos que abarca la unión pb 168/169 de SEQ ID NO: 2. Los ejemplos son pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154 - 1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas.
En otra realización, la descripción proporciona fibra , grano, semilla, aceite de semilla o harina de semilla de algodón que comprende el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 en dicha fibra, grano, semilla, aceite de semilla o harina de semilla como lo demuestra dicha fibra, grano , semilla, aceite de semilla o harina de semilla que comprende ADN que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304­ 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas.
Las realizaciones de la descripción también incluyen células de plantas de algodón y partes de plantas que incluyen, pero no se limitan a, polen, óvulos, flores, brotes, raíces y hojas, y núcleos de células vegetativas, células de polen, semillas, aceite de semillas y harina de semillas, y óvulos, que contienen el evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
En algunas realizaciones, el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se puede combinar con otros rasgos, que incluyen, por ejemplo, otros genes de tolerancia a herbicidas y/o proteínas inhibidoras de insectos y secuencias reguladoras de la transcripción (es decir, interferencia de ARN, ARNdh, factores de transcripción, etc.). Los rasgos adicionales pueden apilarse en el genoma de la planta a través del fitomejoramiento, la retransformación de la planta transgénica que contiene el evento de algodón pDAB4468.19.10.3, o la adición de nuevos rasgos a través de la integración dirigida a través de la recombinación homóloga.
Otras realizaciones incluyen la escisión de secuencias de polinucleótidos que comprenden el evento de algodón pDAB4468.19.10.3, incluyendo, por ejemplo, el casete de expresión génica de pat. Tras la escisión de una secuencia de polinucleótidos, el evento modificado puede redirigirse a un sitio cromosómico específico en donde se apilan secuencias de polinucleótidos adicionales con el evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
En una realización, la presente descripción abarca un sitio diana cromosómico de algodón ubicado en el cromosoma 3 del subgenoma A entre las secuencias flanqueantes expuestas en SEQ ID NOS: 1 y 2.
En una realización, la presente descripción abarca un método para fabricar una planta de algodón transgénica que comprende insertar un ácido nucleico heterólogo en una posición en el cromosoma 3 del subgenoma A entre las secuencias genómicas expuestas en SEQ ID NO: 1 y 2, es decir, entre pb 1 - 1354 de SEQ ID NO: 1 y pb 169 - 2898 de SEQ ID NO: 2.
Además, las realizaciones de la descripción también proporcionan ensayos para detectar la presencia del evento sujeto en una muestra (de fibras de algodón, por ejemplo). Los ensayos pueden basarse en la secuencia de ADN de la construcción recombinante, insertada en el genoma del algodón, y en las secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción. También se proporcionan kits y condiciones útiles para realizar los ensayos.
Las realizaciones de la descripción también se refieren en parte a la clonación y análisis de las secuencias de ADN de las regiones limítrofes que resultan de la inserción de ADN-T de pDAB4468 en líneas de algodón transgénicas. Estas secuencias son únicas. Basándose en las secuencias de inserción y unión, se pueden generar y se generaron cebadores específicos de eventos. El análisis de PCR demostró que estos eventos pueden identificarse mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos de eventos. Por tanto, estos y otros procedimientos relacionados pueden utilizarse para identificar de forma única las líneas de algodón que comprenden el evento de la descripción objeto.
Una realización proporciona un método para controlar malas hierbas en un cultivo de algodón que comprende aplicar herbicida de ácido fenoxiacético al cultivo de algodón, comprendiendo dicho cultivo de algodón plantas de algodón que comprenden ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de la SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de este método, el herbicida de ácido fenoxiacético es 2,4-D. En otro aspecto de este método, el herbicida de ácido fenoxiacético es MCPA.
Una realización proporciona un método para controlar las malas hierbas en un cultivo de algodón que comprende aplicar herbicida de ácido piridiloxiacético al cultivo de algodón, comprendiendo dicho cultivo de algodón plantas de algodón que comprenden un ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pb 1329­ 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118-219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ iD NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2. En un aspecto adicional de este método, el herbicida de ácido piridiloxiacético es triclopir. En un aspecto adicional de este método, el herbicida de ácido piridiloxiacético es fluroxipir.
Una realización proporciona un método para controlar malas hierbas en un cultivo de algodón que comprende la aplicación de herbicida glufosinato al cultivo de algodón, comprendiendo dicho cultivo de algodón plantas de algodón que comprenden ADN que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pb 1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de la SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2.
Una realización proporciona una secuencia de ADN aislada que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2.
Una realización proporciona un método de reproducción de una planta de algodón que comprende: cruzar una primera planta con una segunda planta de algodón para producir una tercera planta de algodón, comprendiendo dicha primera planta ADN que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329 - 1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas; y someter a ensayo dicha tercera planta de algodón para determinar la presencia de ADN que comprende una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de las mismas.
Una realización proporciona una molécula de ADN aislada que comprende una secuencia de unión que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154 - 1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de la misma.
Una realización proporciona una semilla de algodón que comprende en su genoma una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en los restos 1329-1380 de la SEQ ID NO: 1; restos 1304-1405 de SEQ ID NO: 1; restos 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; restos 1154-1555 de SEQ ID NO: 1; restos 1054-1655 de SEQ ID NO: 1; restos 143-194 de SEQ ID NO: 2; restos 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; restos 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; y restos 1 - 369 de SEQ ID NO: 2, y complementos de la misma. Una realización adicional proporciona una semilla de algodón que comprende en su genoma el evento de algodón AAD-12/PAT pDAB4468.19.10.3 y que tiene una semilla de algodón representativa depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Núm. de Acceso PTA-12457. Una realización adicional proporciona una planta de algodón producida cultivando una semilla de algodón de cualquiera de estas dos realizaciones. Una realización adicional proporciona una semilla de algodón producida por esta planta de algodón, en donde dicha semilla comprende en su genoma el evento de algodón AAD-12/PAT pDAB4468.19.10.3 presente en una semilla de algodón depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de acceso PTA-12457. Una realización adicional proporciona una parte de esta planta de algodón, en donde dicha parte se selecciona del grupo que consiste en polen, óvulo, flores, cápsulas, brotes, raíces y hojas, y dicha parte comprende dicho evento. Una realización adicional proporciona una composición derivada de la planta de algodón o una parte de la misma, en donde dicha composición es un producto básico seleccionado del grupo que consiste en harina de algodón, fibra de algodón y aceite de algodón.
En una realización adicional, la planta de algodón comprende una secuencia de ADN que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con los restos 1.355 - 7.741 de SEQ ID NO: 21. Una realización proporciona una planta de algodón descendiente de la planta de la realización anterior, en donde dicha planta exhibe tolerancia al ácido fenoxiacético, ácido piridiloxiacético y herbicidas a base de glufosinato, y dicha tolerancia se debe a la expresión de una proteína codificada en dicho evento o dicho genoma.
Una realización adicional proporciona una semilla de algodón que comprende un genoma que comprende una secuencia de ADN que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 21. Una realización adicional proporciona una planta producida cultivando esta semilla de algodón.
Una realización proporciona una planta de algodón transgénica o parte de la misma que comprende el evento de algodón pDAB4468.19.10.3, en donde se han depositado semillas de algodón representativas que comprenden el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de acceso PTA-12457.
Depósito de semillas
Como parte de esta descripción, se han depositado al menos 2500 semillas de una línea de algodón que comprende el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y se han puesto a disposición del público sin restricción (pero sujetas a derechos de patente), con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. El depósito, designado como Núm. de Depósito de ATCC PTA-12457, se realizó en nombre de Dow AgroSciences LLC el 23 de enero de 2012. Este depósito se realizó y se mantendrá de acuerdo con y bajo los términos del Tratado de Budapest con respecto a los depósitos de semillas a los efectos del procedimiento de patente.
Breve descripción de las secuencias
SEQ ID NO:1 es la secuencia limítrofe que flanquea el ADN 5' para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Los nucleótidos 1 - 1354 son secuencia genómica. Los nucleótidos 1355-1672 son secuencia de inserto.
SEQ ID NO:2 es la secuencia limítrofe que flanquea el ADN 3' para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Los nucleótidos 1 - 168 son secuencia de inserto. Los nucleótidos 169-2898 son secuencia genómica.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de ADN de la cadena T de pDAB4468, que se anota a continuación en la Tabla 1. SEQ ID NO:4 es el cebador oligonucleotídico 3endG1 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 3'.
SEQ ID NO:5 es el cebador oligonucleotídico 3endG2 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 3'.
SEQ ID NO:6 es el cebador oligonucleotídico 3endG3 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 3'.
SEQ ID NO:7 es el cebador oligonucleotídico 5endG1 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:8 es el cebador oligonucleotídico 5endG2 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:9 es el cebador oligonucleotídico 5endG3 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:10 es el cebador oligonucleotídico 5endT1 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:11 es el cebador oligonucleotídico 5endT2 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5 '.
SEQ ID NO:12 es el cebador oligonucleotídico 5endT3 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:13 es el cebador oligonucleotídico 3endT1 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 3'.
SEQ ID NO:14 es el cebador oligonucleotídico 3endT2 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 3'.
SEQ ID NO:15 es el cebador oligonucleotídico 3endT3 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 3'.
SEQ ID NO:16 es el cebador oligonucleotídico BACG6 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:17 es el cebador oligonucleotídico UbiRev para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:18 es el cebador de oligonucleótidos GHBACA6 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:19 es el cebador oligonucleotídico AAD3B1 para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:20 es el cebador oligonucleotídico 5endPLs para la confirmación del ADN genómico limítrofe 5'.
SEQ ID NO:21 es la secuencia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3, que incluye la secuencia flanqueante genómica 5', el inserto de hebra T de pDAB4468 y la secuencia flanqueante genómica 3'.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 es un mapa plasmídico de pDAB4468 que contiene casetes de expresión génica aad-12 y pat.
La FIG. 2 representa las ubicaciones del cebador para confirmar la secuencia limítrofe 5' y 3' del evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Modos para llevar a cabo la invención
A continuación, se describen los modos para llevar a cabo la invención y, adicionalmente, la descripción abarca el objeto de estudio que no entra dentro de la definición de las reivindicaciones. Cabe señalar que la invención solo está definida por el alcance de las reivindicaciones. El objeto de estudio que va más allá de su alcance no es parte de la invención y debe considerarse ilustrativo. Ambos extremos de la inserción del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se han secuenciado y caracterizado. Se desarrollaron ensayos específicos para eventos. El evento ha sido mapeado en el genoma del algodón (cromosoma 3 del subgenoma A). El evento se puede introducir en otras líneas de élite. Como se mencionó anteriormente en la sección de Antecedentes, la introducción e integración de un transgén en el genoma de una planta implica algunos eventos aleatorios (de ahí el nombre "evento" para una inserción dada que se expresa). Es decir, con muchas técnicas de transformación tales como la transformación con Agrobacterium, la transformación biolística (es decir, pistola de genes) y la transformación mediada por carburo de silicio (es decir, WHISKERS), es impredecible en qué parte del genoma se insertará un transgén. Por tanto, identificar el ADN genómico flanqueante de la planta en ambos lados del inserto es importante para identificar una planta que tiene un evento de inserción dado. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores de PCR que generen un amplicón de PCR a través de la región de unión del inserto y el genoma del anfitrión. Este amplicón de PCR se puede utilizar para identificar un tipo de evento de inserción único o distinto.
En el presente documento se proporcionan definiciones y ejemplos para ayudar a describir las realizaciones de la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica a poner en práctica esas realizaciones. A menos que se indique lo contrario, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante. Se utiliza la nomenclatura para las bases de ADN como se establece en 37 CFR §1.822.
Como se utiliza en este documento, el término "progenie" denota la descendencia de cualquier generación de una planta parental que comprende el evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Un "evento" transgénico se produce mediante la transformación de células vegetales con ADN heterólogo, es decir, una construcción de ácido nucleico que incluye los transgenes de interés, la regeneración de una población de plantas resultante de la inserción del transgén en el genoma de la planta y la selección de una planta particular caracterizada por la inserción en una ubicación particular del genoma. El término "evento" se refiere al transformante original y la progenie del transformante que incluyen el ADN heterólogo. El término "evento" también se refiere a la progenie producida por un cruzamiento sexual entre el transformante y otra variedad que incluye el ADN genómico/transgénico. Incluso después del retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN transgénico insertado y el ADN genómico flanqueante (ADN genómico/transgénico) del progenitor transformado están presentes en la progenie del cruzamiento en la misma ubicación cromosómica. El término "evento" también se refiere al ADN del transformante original y su progenie que comprende el ADN insertado y la secuencia genómica flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado, que se esperaría que se transfiriera a una progenie que recibe ADN insertado, incluido el transgén de interés como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el ADN insertado (p. ej., el transformante original y la progenie resultante de la autofecundación) y una línea parental que no contiene el a Dn insertado.
Una "secuencia de unión" o "secuencia limítrofe" abarca el punto en el que el ADN insertado en el genoma se conecta al ADN del genoma nativo del algodón que flanquea el punto de inserción, siendo suficiente la identificación o detección de una u otra secuencia de unión en el material genético de una planta para ser un diagnóstico del evento. Se incluyen las secuencias de ADN que abarcan las inserciones en los eventos de algodón descritos en este documento y longitudes similares de ADN flanqueante. En este documento se proporcionan ejemplos específicos de tales secuencias de diagnóstico; sin embargo, otras secuencias que se solapan con las uniones de las inserciones, o las uniones de las inserciones y la secuencia genómica, también son diagnósticas y podrían utilizarse de acuerdo con las realizaciones de la descripción.
Las realizaciones de la descripción se relacionan en parte con la identificación de eventos utilizando tales secuencias flanqueantes, de unión e inserción. Los cebadores y amplicones de PCR relacionados se incluyen en realizaciones de la descripción. De acuerdo con las realizaciones de la descripción objeto, los métodos de análisis de PCR que utilizan amplicones que se extienden a través del ADN insertado y sus bordes pueden utilizarse para detectar o identificar variedades o líneas de algodón transgénicas comercializadas derivadas de las líneas de algodón transgénicas patentadas objeto.
Las secuencias flanqueantes/de unión son diagnósticas para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Basándose en estas secuencias, se generaron cebadores específicos de eventos. El análisis de PCR demostró que estas líneas de algodón pueden identificarse en diferentes genotipos de algodón mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos para los eventos. Por tanto, estos y otros procedimientos relacionados se pueden utilizar para identificar de forma única estas líneas de algodón. Las secuencias identificadas en el presente documento son únicas.
Las técnicas de detección de las realizaciones de la descripción objeto son especialmente útiles junto con el fitomejoramiento, para determinar qué plantas descendientes comprenden un evento dado, después de que una planta parental que comprende un evento de interés se cruza con otra línea de plantas en un esfuerzo por impartir uno o más rasgos adicionales de interés a la progenie. Estos métodos de análisis de PCR benefician a los programas de reproducción del algodón, así como al control de calidad, especialmente para las semillas de algodón transgénicas comercializadas. Ahora también se pueden fabricar y utilizar kits de detección por PCR para estas líneas de algodón transgénicas. Esto también es beneficioso para el registro y la administración de productos.
Además, se pueden utilizar secuencias de algodón/genómicas flanqueantes para identificar específicamente la ubicación genómica de cada inserto. Esta información se puede utilizar para crear sistemas de marcadores moleculares específicos para cada evento. Estos se pueden utilizar para estrategias de reproducción aceleradas y para establecer datos de vinculación.
Aún más, la información de la secuencia flanqueante se puede utilizar para estudiar y caracterizar los procesos de integración transgénica, las características del sitio de integración genómica, la clasificación de eventos, la estabilidad de los transgenes y sus secuencias flanqueantes y la expresión génica (especialmente relacionada con el silenciamiento génico, patrones de metilación transgénica, efectos de posición, y elementos potenciales relacionados con la expresión, tales como MARS [regiones de anclaje a matriz] y similares).
A la luz de toda la descripción objeto, debería quedar claro que las realizaciones de la descripción objeto incluyen semillas disponibles bajo el número de depósito ATCC identificado en el párrafo [0032]. Las realizaciones de la descripción también incluyen una planta de algodón tolerante a herbicidas cultivada a partir de una semilla depositada con el número de depósito ATCC identificado en el párrafo [0032]. Las realizaciones de la descripción también incluyen partes de dicha planta, tales como hojas, muestras de tejido, semillas producidas por dicha planta, polen y similares (donde estas partes de la planta comprenden aad-12y pat, y SEQ ID NOS: 1 y 2).
Además, las realizaciones de la descripción también incluyen plantas descendientes y/o progenie de plantas cultivadas a partir de la semilla depositada, preferiblemente una planta de algodón resistente a herbicidas en donde dicha planta tiene un genoma que comprende una secuencia de unión/flanqueante detectable como se describe en el presente documento. Como se utiliza en este documento, el término "algodón" significa Gossypium hirsutum e incluye todas las variedades del mismo que se pueden cultivar con una planta de algodón.
Una planta de algodón tolerante a herbicidas de una realización de la descripción se puede cultivar cruzando sexualmente una primera planta de algodón parental que consiste en una planta de algodón cultivada a partir de semillas de cualquiera de las líneas mencionadas en este documento, y una segunda planta de algodón parental, produciendo así una pluralidad de primeras plantas de progenie; a continuación seleccionando una primera planta de progenie que sea resistente al glufosinato; autofecundación de la primera planta progenie, produciendo así una pluralidad de segundas plantas progenie; y después seleccionando de las plantas de la segunda progenie una planta que sea resistente al glufosinato. Estas etapas pueden incluir adicionalmente el retrocruzamiento de la primera planta de progenie o la segunda planta de progenie con la segunda planta de algodón parental o una tercera planta de algodón parental. A continuación, se puede plantar una cosecha de algodón que comprende semillas de algodón de una realización de la descripción, o su progenie.
Asimismo, debe entenderse que también se pueden aparear dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos añadidos, segregantes e independientes. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes exógenos agregados. También se contemplan el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento con una planta no transgénica, al igual que la propagación vegetativa. Se conocen en la técnica otros métodos de reproducción comúnmente utilizados para diferentes rasgos y cultivos. La reproducción por retrocruzamiento se ha utilizado para transferir genes de un rasgo altamente heredable, simplemente heredado, a un cultivar homocigoto deseable, que es el parental recurrente. La fuente del rasgo que se transferirá se denomina padre donante. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del padre recurrente (p. ej., cultivar) y el rasgo deseable transferido del padre donante. Después del cruzamiento inicial, los individuos que poseen el fenotipo del padre donante se seleccionan y cruzan repetidamente (retrocruzan) con el padre recurrente. Se espera que la planta resultante tenga los atributos del padre recurrente (por ejemplo, cultivar) y el rasgo deseable transferido del padre donante.
Asimismo, una planta de algodón tolerante a herbicidas de una realización de la descripción se puede transformar con transgenes adicionales utilizando métodos conocidos en la técnica. Se pueden utilizar técnicas de transformación tales como transformación con Agrobacterium, la transformación biolística (es decir, pistola de genes) y transformación mediada por carburo de silicio (es decir, WHISKERS), para introducir transgenes adicionales en el genoma del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. La selección y caracterización de plantas transgénicas que contienen los transgenes recién insertados se puede completar para identificar plantas que contienen un integrante estable del nuevo transgén además de los genes aad-12 y pat de realizaciones de la descripción.
Las moléculas de ADN de las realizaciones de la presente descripción pueden utilizarse como marcadores moleculares en un método de reproducción asistida por marcadores (MAB). Las moléculas de ADN de las realizaciones de la presente descripción se pueden utilizar en métodos (tales como marcadores AFLP, marcadores RFLP, marcadores RAPD, SNP y SSR) que identifican rasgos útiles agronómicamente ligados genéticamente, como se conoce en la técnica. Los rasgos de tolerancia a herbicidas pueden rastrearse en la progenie de un cruzamiento con una planta de algodón de realizaciones de la descripción objeto (o progenie de la misma y cualquier otro cultivo o variedad de algodón) utilizando los métodos MAB. Las moléculas de ADN son marcadores para este rasgo, y los métodos MAB que son bien conocidos en la técnica se pueden utilizar para rastrear el rasgo de tolerancia a herbicidas en plantas de algodón donde al menos una línea de algodón de realizaciones de la descripción objeto, o su progenie, era padre o antepasado. Los métodos de las realizaciones de la presente descripción pueden utilizarse para identificar cualquier variedad de algodón que tenga el evento sujeto.
Los métodos de las realizaciones de la presente descripción incluyen un método para producir una planta de algodón tolerante a herbicidas en donde dicho método comprende la reproducción con una planta de una realización de la presente descripción. Más específicamente, dichos métodos pueden comprender cruzar dos plantas de realizaciones de la descripción objeto, o una planta de una realización de la descripción objeto y cualquier otra planta. Los métodos preferidos comprenden adicionalmente seleccionar la progenie de dicho cruzamiento analizando dicha progenie en busca de un evento detectable de acuerdo con una realización de la descripción objeto y el comportamiento varietal favorable (p. ej., rendimiento). Por ejemplo, las realizaciones de la descripción objeto se pueden utilizar para rastrear el evento objeto a través de ciclos de reproducción con plantas que comprenden otros rasgos deseables, tales como rasgos agronómicos, tolerancia o resistencia a enfermedades, tolerancia o resistencia a nematodos y fecha de madurez. Las plantas que comprenden el evento objeto y el rasgo deseado pueden detectarse, identificarse, seleccionarse y utilizarse rápidamente en rondas adicionales de reproducción, por ejemplo. El evento/rasgo objeto también se puede combinar mediante reproducción, y rastrear de acuerdo con las realizaciones de la descripción objeto, con uno o varios rasgos adicionales de resistencia a insectos y/o con rasgos adicionales de tolerancia a herbicidas. Las realizaciones de esto último son plantas que comprenden el evento sujeto combinado con el genes c ry lF y crylAc, que confieren resistencia a Pseudoplusia includens (falsa medidora en soja), Anticarsia gemmatalis (oruga de las leguminosas), Epinotia aporema, Omoides indicatus, Rachiplusia nu, Spodoptera frugiperda, Spodoptera cosmoides, Spodoptera eridania, Heliothis virescens, Heliocoverpa zea, Spilosoma virginica y Elasmopalpus lignosellus, o con un gen que codifica resistencia al herbicida dicamba.
Por tanto, las realizaciones de la descripción objeto se pueden combinar con, por ejemplo, rasgos que codifican la resistencia al glifosato (p. ej., planta resistente o EPSPS, GOX, GAT bacterianos), resistencia al glufosinato (p. ej., dsm-2, bar), acetolactato sintasa (ALS) que inhibe la resistencia a herbicidas (p. ej., imidazolinonas [tales como imazetapir], sulfonilureas, triazolopirimidina sulfonanilida, pirmidiniltiobenzoatos y otros agentes químicos [Csr1, SurA et al.]), resistencia al bromoxinilo (p. ej., Bxn), resistencia a inhibidores de la enzima HPPD (4-hidroxilfenil-piruvatodioxigenasa), resistencia a inhibidores de fitoeno desaturasa (PDS), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema II (p. ej., psbA), resistencia a herbicidas inhibidores del fotosistema I, resistencia a herbicidas inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa IX (PPO) (p. ej., PPO-1), resistencia a herbicidas de fenilurea (p. ej., CYP76B1), enzimas degradantes de dicamba (véase, p. ej., el documento US 20030135879), y otros podrían apilarse solos o en múltiples combinaciones para proporcionar la capacidad de controlar o prevenir eficazmente los cambios de malas hierbas y/o la resistencia a cualquier herbicida de las clases antes mencionadas.
Además, el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se puede combinar con uno o más rasgos de entrada (p. ej., resistencia a insectos, resistencia a patógenos o tolerancia al estrés, et al.) o salida (p. ej., mayor rendimiento, perfil de aceite mejorado, calidad de fibra mejorada, et al.) adicionales. Por tanto, las realizaciones de la descripción objeto pueden utilizarse para proporcionar un paquete agronómico completo de calidad de cultivo mejorada con la capacidad de controlar de manera flexible y rentable cualquier número de plagas agronómicas.
En la técnica se han descrito métodos para integrar una secuencia de polinucleótidos dentro de un sitio cromosómico específico de una célula vegetal mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, la integración específica del sitio como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2009/0111188 A1, describe el uso de recombinasas o integrasas para mediar en la introducción de una secuencia de polinucleótidos donante en una diana cromosómica. Además, la Solicitud de Patente Internacional Núm. WO 2008/021207, describe la recombinación homologa mediada por dedos de zinc para integrar una o más secuencias de polinucleótidos donantes dentro de ubicaciones específicas del genoma. El uso de recombinasas tales como FLP/FRT como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 6.720.475, o CRE/LOX como se describe en la Patente de Estados Unidos Núm. 5.658.772, se puede utilizar para integrar una secuencia de polinucleótidos en un sitio cromosómico específico. Finalmente, el uso de meganucleasas para dirigir polinucleótidos del donante a una ubicación cromosómica específica fue descrita por Puchta et al., en PNAS USA 93 (1996) págs. 5055-5060.
Otros métodos para la integración específica del sitio dentro de las células vegetales son generalmente conocidos y aplicables (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pág. 155-159). Además, los sistemas de recombinación específicos de sitio que se han identificado en varios organismos procarióticos y eucarióticos inferiores pueden aplicarse para su uso en plantas. Los ejemplos de tales sistemas incluyen, pero no se limitan a: el sistema de recombinasa R/RS del plásmido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191 -203), y el sistema Gin/gix del fago Mu (Maeser y Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
En algunas realizaciones de la presente descripción, es deseable integrar o apilar uno o más nuevos transgenes en la proximidad de un evento transgénico existente. El evento transgénico puede considerarse un locus genómico preferido que se seleccionó en función de características únicas, tales como un sitio de inserción único, segregación mendeliana normal y expresión estable, y una combinación superior de eficacia, incluida la tolerancia a herbicidas y el rendimiento agronómico en, y a través de, múltiples ubicaciones ambientales. Los transgenes recién integrados deberían mantener las características de expresión transgénica de los transformantes existentes. Además, el desarrollo de ensayos para la detección y confirmación del evento recién integrado se superaría ya que las secuencias genómicas flanqueantes y la ubicación cromosómica del evento recién integrado ya están identificadas. Finalmente, la integración de un nuevo transgén en una ubicación cromosómica específica que está vinculada a un transgén existente aceleraría la introgresión de los transgenes en otros trasfondos genéticos por cruzamiento sexual utilizando métodos de reproducción convencionales.
En algunas realizaciones de la presente descripción, es deseable escindir secuencias de polinucleótidos de un evento transgénico. Por ejemplo, la escisión transgénica como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2011/0191877, emplea nucleasas con dedos de zinc para eliminar una secuencia de polinucleótidos, que consiste en un casete de expresión génica, de un evento transgénico integrado cromosómicamente. La secuencia de polinucleótidos que se elimina puede ser un marcador seleccionable. Tras la escisión y eliminación de una secuencia de polinucleótidos, el evento transgénico modificado puede ser reorientado mediante la inserción de una secuencia de polinucleótidos. La escisión de una secuencia de polinucleótidos y la posterior reorientación del evento transgénico modificado proporciona ventajas tales como la reutilización de un marcador seleccionable o la capacidad de superar cambios no deseados en el transcriptoma de la planta que resultan de la expresión de genes específicos.
En este documento se describe un sitio específico en el cromosoma 3 del subgenoma A dentro del genoma del algodón que es excelente para la inserción de ácidos nucleicos heterólogos. Por tanto, las realizaciones de la descripción objeto proporcionan métodos para introducir ácidos nucleicos heterólogos de interés en este sitio diana preestablecido o en las proximidades de este sitio diana. Las realizaciones de la descripción objeto también abarcan una semilla de algodón y/o una planta de algodón que comprende cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga insertada en el sitio diana descrito o en la vecindad general de tal sitio. Una opción para lograr dicha integración dirigida es eliminar y/o sustituir un inserto diferente en lugar del casete pat de expresión ilustrado en el presente documento. A este respecto, la recombinación homóloga dirigida, por ejemplo y sin limitación, puede utilizarse de acuerdo con las realizaciones de la descripción objeto.
Como se utiliza en el presente documento, el ''apilamiento'' de genes, eventos o rasgos se refiere a la combinación de rasgos deseados en una línea transgénica. Los fitomejoradores acumulan rasgos transgénicos haciendo cruzamientos entre padres que tienen cada uno un rasgo deseado y luego identificando descendientes que tienen ambos rasgos deseados. Otra forma de apilar genes es transfiriendo dos o más genes al núcleo celular de una planta al mismo tiempo durante la transformación. Otra forma de apilar genes es volver a transformar una planta transgénica con otro gen de interés. Por ejemplo, el apilamiento de genes se puede utilizar para combinar dos o más rasgos diferentes, incluidos, por ejemplo, dos o más rasgos de insectos diferentes, uno o más rasgos de resistencia a insectos y uno o más rasgos de resistencia a enfermedades, dos o más rasgos de resistencia a herbicidas, y/o uno o más rasgos de resistencia a insectos y uno o más rasgos de resistencia a herbicidas. El uso de un marcador seleccionable además de un gen de interés también puede considerarse apilamiento de genes.
"Recombinación homóloga" se refiere a una reacción entre cualquier par de secuencias de nucleótidos que tienen sitios correspondientes que contienen una secuencia de nucleótidos similar a través de la cual las dos secuencias de nucleótidos pueden interactuar (recombinarse) para formar una nueva secuencia de ADN recombinante. Cada uno de los sitios de secuencia de nucleótidos similar se denomina en el presente documento "secuencia de homología". Generalmente, la frecuencia de recombinación homóloga aumenta a medida que aumenta la longitud de la secuencia de homología. Por tanto, aunque puede producirse una recombinación homóloga entre dos secuencias de nucleótidos que son menos que idénticas, la frecuencia (o eficacia) de la recombinación disminuye a medida que aumenta la divergencia entre las dos secuencias. La recombinación se puede lograr utilizando una secuencia de homología en cada una de las moléculas donante y diana, generando así un producto de recombinación de "un solo cruzamiento". Alternativamente, se pueden colocar dos secuencias de homología en cada una de las secuencias de nucleótidos diana y donante. La recombinación entre dos secuencias de homología en el donante con dos secuencias de homología en la diana genera un producto de recombinación de "doble cruzamiento". Si las secuencias de homología en la molécula donante flanquean una secuencia que se va a manipular (p. ej., una secuencia de interés), la recombinación de doble cruzamiento con la molécula diana dará como resultado un producto de recombinación en donde la secuencia de interés reemplaza a una secuencia de ADN que estaba originalmente entre las secuencias de homología en la molécula diana. El intercambio de la secuencia de ADN entre la diana y el donante a través de un evento de recombinación de doble cruzamiento se denomina "reemplazo de secuencia".
Una planta preferida, o una semilla, de las realizaciones de la descripción objeto comprende en su genoma operativo secuencias de nucleótidos aad-12 y pat, como se identifican en el presente documento, junto con al menos 20-500 o más nucleótidos flanqueantes contiguos en ambos lados del inserto, como se identifica en el presente documento. A menos que se indique lo contrario, la referencia a las secuencias flanqueantes se refiere a aquellas identificadas con respecto a SEQ ID NOS: 1 y 2. Se podría esperar que todas o parte de estas secuencias flanqueantes se transfieran a la progenie que recibe el ADN insertado como resultado de un cruzamiento sexual de una línea parental que incluye el evento.
Las realizaciones de la descripción objeto incluyen cultivos de tejidos de células regenerables de una planta de una realización de la descripción objeto. También se incluye una planta regenerada a partir de dicho cultivo de tejidos, particularmente cuando dicha planta es capaz de expresar todas las propiedades morfológicas y fisiológicas de una variedad ilustrada. Las plantas preferidas de las realizaciones de la presente descripción tienen todas las características fisiológicas y morfológicas de una planta que crece a partir de la semilla depositada. Las realizaciones de esta descripción comprenden adicionalmente la progenie de dicha semilla y la semilla que posee los rasgos de calidad de interés.
Como se emplea en el presente documento, una "línea" es un grupo de plantas que muestran poca o ninguna variación genética entre individuos para al menos un rasgo. Tales líneas pueden crearse mediante varias generaciones de autopolinización y selección, o propagación vegetativa a partir de un único progenitor utilizando técnicas de cultivo de tejidos o células.
Como se utiliza en el presente documento, los términos "cultivar" y "variedad" son sinónimos y se refieren a una línea que se utiliza para la producción comercial.
"Estabilidad" o "estable" significa que, con respecto al componente dado, el componente se mantiene de generación en generación y, preferiblemente, durante al menos tres generaciones.
"Utilidad comercial" se define como tener buen vigor de la planta y alta fertilidad, de modo que los agricultores pueden producir el cultivo utilizando equipo agrícola convencional, y el aceite con los componentes descritos se puede extraer de la semilla utilizando equipo convencional de trituración y extracción.
"Agronómicamente élite" significa que una línea tiene características agronómicas deseables tales como rendimiento, madurez, resistencia a enfermedades y similares, además de la tolerancia a herbicidas debida al evento o eventos sujeto. Todas y cada una de estas características agronómicas y puntos de datos pueden utilizarse para identificar tales plantas, ya sea como un punto o en cualquier extremo o en ambos extremos de una gama de características utilizadas para definir tales plantas.
Como reconocerá un experto en la técnica a la luz de esta descripción, las realizaciones preferidas de los kits de detección, por ejemplo, pueden incluir sondas y/o cebadores dirigidos y/o que comprenden "secuencias de unión" o "secuencias de transición" (donde la secuencia flanqueante genómica del algodón se encuentra con la secuencia de inserción). Por ejemplo, esto incluye sondas polinucleotídicas, cebadores y/o amplicones diseñados para identificar una o ambas secuencias de unión (donde el inserto se encuentra con la secuencia flanqueante). Un diseño común consiste en tener un cebador que hibrida en la región flanqueante y un cebador que hibrida en el inserto. A menudo, tales cebadores tienen cada uno una longitud de al menos 15 restos aproximadamente. Con esta disposición, los cebadores pueden utilizarse para generar/amplificar un amplicón detectable que indica la presencia de un evento de una realización de la descripción objeto. Estos cebadores pueden utilizarse para generar un amplicón que abarca (e incluye) una secuencia de unión como se indicó anteriormente.
El cebador o cebadores que "se posan" en la secuencia flanqueante no están diseñados típicamente para hibridar más allá de aproximadamente 1200 bases más allá de la unión. Por tanto, los cebadores flanqueantes típicos estarían diseñados para comprender al menos 15 restos de cualquier hebra dentro de 1200 bases en las secuencias flanqueantes desde el comienzo del inserto. Es decir, los cebadores que comprenden una secuencia de un tamaño apropiado de (o que se hibrida con) los pares de bases 154-1672 de SEQ ID NO: 1 y/o los pares de bases 1-1369 de SEQ ID NO: 2 están dentro del alcance de las realizaciones de la descripción objeto. Los cebadores de inserto también se pueden diseñar en cualquier lugar del inserto, pero los pares de bases 1 - 6387 de SEQ ID NO: 3, se pueden utilizar, por ejemplo, no exclusivamente para tal diseño de cebador.
Un experto en la técnica también reconocerá que los cebadores y las sondas pueden diseñarse para hibridar, en un intervalo de condiciones de hibridación y/o PCR convencionales en donde el cebador o la sonda no son perfectamente complementarios a la secuencia ejemplificada. Es decir, se puede tolerar cierto grado de emparejamiento erróneo o degeneración. Para un cebador de aproximadamente 20 nucleótidos, por ejemplo, típicamente no se necesita que se unan uno o dos o más nucleótidos a la hebra opuesta si la base mal emparejada es interna o se encuentra en el extremo del cebador que está opuesto al amplicón. A continuación, se proporcionan varias condiciones de hibridación apropiadas. Los análogos de nucleótidos sintéticos, tales como la inosina, también se pueden utilizar en sondas. También se pueden utilizar sondas de ácido peptidonucleico (PNA), así como sondas de ADN y ARN. Lo que es importante es que tales sondas y cebadores sean diagnósticos (capaces de identificar y distinguir de forma única) la presencia de un evento de una realización de la descripción objeto.
Cabe señalar que pueden producirse errores en la amplificación por PCR que podrían dar lugar a errores de secuenciación mínimos, por ejemplo. Es decir, a menos que se indique lo contrario, las secuencias enumeradas en el presente documento se determinaron generando amplicones largos a partir de ADN genómicos de algodón y a continuación clonando y secuenciando los amplicones. No es inusual encontrar ligeras diferencias y discrepancias mínimas en las secuencias generadas y determinadas de esta manera, dadas las muchas rondas de amplificación que son necesarias para generar suficiente amplicón para la secuenciación a partir de los ADN genómicos. Un experto en la técnica debería reconocer y ser advertido de que cualquier ajuste necesario debido a estos tipos de errores de secuenciación o discrepancias comunes están dentro del alcance de las realizaciones de la descripción objeto.
También debe tenerse en cuenta que no es infrecuente que se elimine alguna secuencia genómica, por ejemplo, cuando se inserta una secuencia durante la creación de un evento. Por tanto, también pueden aparecer algunas diferencias entre las secuencias flanqueantes objeto y las secuencias genómicas enumeradas en GENBANK, por ejemplo.
Los componentes del "inserto" de la secuencia de ADN se ilustran en las Figuras y se describen con más detalle a continuación en los Ejemplos. Las secuencias de polinucleótidos de ADN de estos componentes, o fragmentos de los mismos, pueden utilizarse como cebadores o sondas de ADN en los métodos de las realizaciones de la presente descripción.
En algunas realizaciones de la descripción, se proporcionan composiciones y métodos para detectar la presencia de la región de inserción transgénica/genómica, en plantas y semillas y similares, de una planta de algodón. Se proporcionan secuencias de ADN que comprenden la secuencia de unión de la región de inserción de transgén/genómica 5' objeto proporcionada en este documento (entre los pares de bases 1354/1355 de SEQ ID NO: 1), segmentos de las mismas y complementos de las secuencias ilustradas y cualquier segmento de las mismas. Se proporcionan secuencias de ADN que comprenden la secuencia de unión de la región de inserción 3' de transgén/genómica objeto proporcionada en este documento (entre los pares de bases 168/169 de SEQ ID NO: 2), segmentos de las mismas y complementos de las secuencias ejemplificadas y cualquier segmento de las mismas. La secuencia de unión de la región de inserción abarca la unión entre el ADN heterólogo insertado en el genoma y el ADN de la célula de algodón que flanquea el sitio de inserción. Tales secuencias pueden ser diagnósticas para el evento dado.
Basándose en estas secuencias de inserto y limítrofes, se pueden generar cebadores específicos de eventos. El análisis de PCR demostró que las líneas de algodón de las realizaciones de la presente descripción pueden identificarse en diferentes genotipos de algodón mediante el análisis de los amplicones de PCR generados con estos conjuntos de cebadores específicos de eventos. Estos y otros procedimientos relacionados se pueden utilizar para identificar de forma única estas líneas de algodón. Por tanto, los amplicones de PCR derivados de tales pares de cebadores son únicos y pueden utilizarse para identificar estas líneas de algodón.
En algunas realizaciones, las secuencias de ADN que comprenden un fragmento contiguo de la nueva región de inserción transgénica/genómica son un aspecto de esta descripción. Se incluyen secuencias de ADN que comprenden una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia de inserción transgénica y una longitud suficiente de polinucleótidos de la secuencia genómica del algodón de una o más de las plantas de algodón mencionadas anteriormente y/o secuencias que son útiles como secuencias cebadoras para la producción de un producto amplicón diagnóstico para una o más de estas plantas de algodón.
Las realizaciones relacionadas pertenecen a secuencias de ADN que comprenden al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más nucleótidos contiguos de una porción transgénica de una secuencia de ADN identificada en el presente documento (tal como SEQ ID NO: 1 y segmentos de la misma), o complementos de la misma, y una longitud similar de secuencia de ADN de algodón flanqueante de estas secuencias, o complementos de la misma. Estas secuencias son útiles como cebadores de ADN en métodos de amplificación de ADN. Los amplicones producidos utilizando estos cebadores son diagnósticos de cualquiera de los eventos relacionados con el algodón a los que se hace referencia en este documento. Por tanto, las realizaciones de la descripción también incluyen los amplicones producidos por tales cebadores de ADN.
Las realizaciones de esta descripción también incluyen métodos para detectar la presencia de ADN, en una muestra, que corresponde al evento del algodón al que se hace referencia en este documento. Tales métodos pueden comprender: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con un conjunto de cebadores que, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN del evento de algodón, produce un amplicón que es diagnóstico para el evento o los eventos mencionados; (b) realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo así el amplicón; y (c) detectar el amplicón.
Otros métodos de detección de realizaciones de la descripción objeto incluyen un método para detectar la presencia de un ADN, en una muestra, correspondiente a dicho evento, en donde dicho método comprende: (a) poner en contacto la muestra que comprende ADN con una sonda que hibrida bajo condiciones de hibridación rigurosas con ADN de dicho evento de algodón y que no hibrida en las condiciones de hibridación rigurosas con una planta de algodón de control (ADN sin evento de interés); (b) someter la muestra y la sonda a estrictas condiciones de hibridación; y (c) detectar la hibridación de la sonda con el ADN.
En otras realizaciones adicionales, la descripción objeto incluye métodos para producir una planta de algodón que comprende el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 de una realización de la descripción objeto, en donde dicho método comprende las etapas de: (a) cruzar sexualmente una primera línea de algodón parental (que comprende un casete de expresión de una realización de la presente descripción, que confiere tolerancia a 2,4-D y glufosinato a plantas de dicha línea) y una segunda línea de algodón parental (que carece de estos rasgos de tolerancia a herbicidas) produciendo así una pluralidad de plantas progenitoras; y (b) seleccionar una planta de progenie mediante el uso de marcadores moleculares. Tales métodos pueden comprender opcionalmente la etapa adicional de retrocruzar la planta de la progenie con la segunda línea de algodón parental para producir una planta de algodón de reproducción auténtica que comprenda los rasgos tolerantes a herbicidas.
Según otro aspecto de la descripción, se proporcionan métodos para determinar la cigosidad de la descendencia de un cruzamiento con dicho evento. Dichos métodos pueden comprender poner en contacto una muestra, que comprende ADN de algodón, con un conjunto de cebadores de una realización de la descripción objeto. Dichos cebadores, cuando se utilizan en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de dicho evento de algodón, producen un primer amplicón que es diagnóstico para dicho evento de algodón. Tales métodos comprenden adicionalmente realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo así el primer amplicón; detectar el primer amplicón; y poner en contacto la muestra que comprende ADN de algodón con un segundo conjunto de cebadores (dicho segundo conjunto de cebadores, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácido nucleico con ADN genómico de plantas de algodón, produce un segundo amplicón que comprende una secuencia endógena del ADN genómico de algodón nativo que no contiene la secuencia polinucleotídica de dicho evento); y realizar una reacción de amplificación de ácido nucleico, produciendo así el segundo amplicón. Los métodos comprenden adicionalmente detectar el segundo amplicón y comparar el primero y el segundo amplicones en una muestra, en donde la presencia de ambos amplicones indica la cigosidad de la inserción del transgén.
Pueden desarrollarse kits de detección de ADN utilizando las composiciones descritas en el presente documento y métodos bien conocidos en la técnica para la detección de ADN. Los kits son útiles para la identificación del ADN del evento de algodón objeto en una muestra y se pueden aplicar a métodos para cultivar plantas de algodón que contienen este ADN. Los kits contienen secuencias de ADN complementarias a los amplicones, por ejemplo, descritos en el presente documento, o secuencias de ADN complementarias al ADN contenido en los elementos genéticos transgénicos de los eventos objeto. Estas secuencias de ADN se pueden utilizar en reacciones de amplificación de ADN o como sondas en un método de hibridación de ADN. Los kits también pueden contener los reactivos y materiales necesarios para la realización del método de detección.
Una "sonda" es una molécula de ácido nucleico aislada a la que se une un marcador detectable convencional o una molécula informadora (tal como un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima). Tal sonda puede hibridar con una hebra de un ácido nucleico diana, en el caso de las realizaciones de la presente descripción, con una hebra de ADN genómico de uno de dichos eventos de algodón, ya sea de una planta de algodón o de una muestra que incluye ADN del evento. Las sondas de acuerdo con las realizaciones de la presente descripción incluyen no sólo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino también poliamidas y otros materiales de sonda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y pueden utilizarse para detectar la presencia de esa secuencia de ADN diana.
Los "cebadores" son ácidos nucleicos aislados/sintetizados que se hibridan con una hebra de ADN diana mediante hibridación de ácidos nucleicos para formar un híbrido entre el cebador y la hebra de ADN diana, y a continuación se extienden a lo largo de la hebra de ADN diana mediante una polimerasa. p. ej., una ADN polimerasa. Los pares de cebadores de las realizaciones de la presente descripción se refieren a su uso para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos convencionales de amplificación de ácido nucleico.
Las sondas y los cebadores tienen generalmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27 ,28 , 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 ,52 ,53 , 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 , 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102 , 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127 , 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177 , 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202 , 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323,
Figure imgf000014_0001
324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392,
Figure imgf000014_0002
393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431,432, 433, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441,442, 443, 444, 445, 446,447, 448, 449, 450, 451,452, 453, 454, 455, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471 , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 481,482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491,492, 493, 494, 495, 496,497, 498, 499, 500 o 1000, o 2000, o 5000 polinucleótidos o más de longitud. Tales sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia diana en condiciones de hibridación rigurosas. Preferiblemente, las sondas y cebadores de acuerdo con las realizaciones de la presente descripción tienen una similitud de secuencia completa con la secuencia diana, aunque se pueden diseñar sondas que difieren de la secuencia diana y que conservan la capacidad de hibridar con secuencias diana mediante métodos convencionales.
Los métodos para preparar y utilizar sondas y cebadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los pares de PCR-cebador se pueden obtener a partir de una secuencia conocida, por ejemplo, utilizando programas informáticos destinados a ese fin.
Los cebadores y sondas basados en el ADN flanqueante y las secuencias de inserción descritas en este documento pueden utilizarse para confirmar (y, si es necesario, corregir) las secuencias descritas mediante métodos convencionales. p. ej., volviendo a clonar y secuenciando tales secuencias.
Las sondas de ácido nucleico y los cebadores de las realizaciones de la presente descripción hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. Puede utilizarse cualquier método convencional de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos para identificar la presencia de ADN de un evento transgénico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o sus fragmentos son capaces de hibridar específicamente con otras moléculas de ácido nucleico en determinadas circunstancias. Como se emplea en el presente documento, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridar específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácido nucleico antiparalela, de doble hebra. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si presenta una complementariedad completa. Como se emplea en el presente documento, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Las moléculas que muestran una complementariedad completa generalmente hibridan entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas entre sí en condiciones convencionales de "alta rigurosidad". Sambrook et al., 1989, describen las condiciones convencionales de alta rigurosidad.
Se dice que dos moléculas exhiben "complementariedad mínima" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas entre sí en condiciones al menos convencionales de "baja rigurosidad".
Sambrook et al., 1989., describen las condiciones convencionales de baja rigurosidad para que una molécula de ácido nucleico sirva como cebador o sonda, sólo necesita exhibir una complementariedad mínima de secuencia para poder formar una estructura de doble hebra estable bajo las concentraciones particulares de disolvente y sal empleadas.
El término "condición rigurosa" o "condiciones de rigurosidad" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico con un ácido nucleico diana (es decir., con una secuencia de ácido nucleico particular de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico discutido en Sambrook et al., 1989, en 9.52-9.55.
Véase también, Sambrook et al., 1989 en 9.47-9.52 y 9.56-9.58.
Dependiendo de la aplicación prevista, se pueden utilizar condiciones variables de condiciones rigurosas o degeneración de la secuencia de polinucleótidos de una sonda o cebador para lograr grados variables de selectividad
de hibridación hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, normalmente se emplean condiciones relativamente rigurosas para la hibridación de una secuencia de polinucleótidos con una segunda secuencia de polinucleótidos, p. ej., se seleccionarán condiciones de sal relativamente baja y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M de NaCl a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Las condiciones rigurosas, por ejemplo, podrían implicar el lavado de filtro de hibridación al menos dos veces con tampón de lavado de alta rigurosidad (0,2X SSC, SDS al 0,1%, 65°C).
Las condiciones de rigurosidad apropiadas que promueven la hibridación del ADN, por ejemplo, cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6,0X a aproximadamente 45°C, seguido de un lavado de SSC 2,0X a 50°C, son conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la concentración de sal en la etapa de lavado se puede seleccionar entre una rigurosidad baja de aproximadamente 2,0X SSC a 50°C hasta una rigurosidad alta de aproximadamente 0,2X SSC a
50°C. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse desde condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, hasta condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o bien la temperatura o la concentración de sal se pueden mantener constantes mientras que se cambia la otra variable. Tales condiciones selectivas toleran poco o ningún emparejamiento erróneo entre la sonda y el molde o la hebra diana. La detección de secuencias de ADN mediante hibridación es bien conocida por los expertos en la técnica, y las enseñanzas de las Patentes de Estados Unidos Núm.
4.965.188 y 5.176.995 son ilustrativas de los métodos de análisis de hibridación.
En una realización particularmente preferida, un ácido nucleico de una realización de la presente descripción hibridará específicamente con uno o más de los cebadores (o amplicones u otras secuencias) ilustrados o sugeridos en este documento, incluidos complementos y fragmentos de los mismos, en condiciones de alta rigurosidad. En un aspecto de la presente descripción, una molécula de ácido nucleico marcadora de una realización de la presente descripción tiene la secuencia de ácido nucleico que se expone en el presente documento en una de las secuencias ilustradas, o complementos y/o fragmentos de la misma.
En otro aspecto de la presente descripción, una molécula marcadora de ácido nucleico de una realización de la presente descripción comparte entre 80% y 100% o 90% y 100% de identidad de secuencia con tales secuencias de ácido nucleico. En un aspecto adicional de la presente descripción, una molécula de ácido nucleico marcadora de una realización de la presente descripción comparte entre 95% y 100% de identidad de secuencia con dicha secuencia.
Tales secuencias se pueden utilizar como marcadores en métodos de mejoramiento vegetal para identificar la progenie de cruzamientos genéticos. La hibridación de la sonda con la molécula de ADN diana puede detectarse mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica; estos pueden incluir, pero no se limitan a, marcadores fluorescentes, marcadores radiactivos, marcadores basados en anticuerpos y marcadores quimioluminiscentes.
Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, por PCR) utilizando un par de cebadores de amplificación particular, las "condiciones rigurosas" son condiciones que permiten que el par de cebadores hibride solo con la secuencia de ácido nucleico diana con la que un cebador que tiene la correspondiente secuencia de tipo salvaje (o su complemento) se uniría y preferiblemente produciría un producto de amplificación único, el amplicón.
El término "específico para (una secuencia diana)" indica que una sonda o cebador se hibrida en condiciones rigurosas de hibridación solo con la secuencia diana en una muestra que comprende la secuencia diana.
Como se utiliza en el presente documento, "ADN amplificado" o "amplicón" se refiere al producto de la amplificación de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico diana que es parte de un molde de ácido nucleico. Por ejemplo, para determinar si la planta de algodón resultante de un cruzamiento sexual contiene ADN genómico de evento transgénico de la planta de algodón de una realización de la presente descripción, el ADN extraído de una muestra de tejido de la planta de algodón puede someterse a un método de amplificación de ácido nucleico utilizando un par de cebadores que incluye un cebador derivado de la secuencia flanqueante en el genoma de la planta adyacente al sitio de inserción del ADN heterólogo insertado, y un segundo cebador derivado del ADN heterólogo insertado para producir un amplicón que es diagnóstico de la presencia del ADN del evento. El amplicón tiene una longitud y una secuencia que también es diagnóstica para el evento. La longitud del amplicón puede variar desde la longitud combinada de los pares de cebadores más un par de bases de nucleótidos, y/o la longitud combinada de los pares de cebadores más aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
Figure imgf000015_0001
58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99', 100, 101, 102 ,104, 105 , 107. 110 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421,422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451,452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471,472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500, 750, 1000,, 1250, 1500, 1750, 2000 o más pares de bases de nucleótidos (más o menos cualquiera de los incrementos enumerados anteriormente). Alternativamente, se puede obtener un par de cebadores de la secuencia flanqueante en ambos lados del ADN insertado para producir un amplicón que incluye la secuencia de nucleótidos del inserto completa. Un miembro de un par de cebadores derivado de la secuencia genómica de la planta puede ubicarse a una distancia de la secuencia de ADN insertada. Esta distancia puede variar desde un par de bases de nucleótidos hasta aproximadamente veinte mil pares de bases de nucleótidos. El uso del término "amplicón" excluye específicamente los dímeros de cebadores que pueden formarse en la reacción de amplificación térmica del ADN.
La amplificación de ácidos nucleicos se puede lograr mediante cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácidos nucleicos conocidos en la técnica, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conocen en la técnica una variedad de métodos de amplificación y se describen, entre otras, en la Patente de Estados Unidos Núm. 4.683.195 y la Patente de Estados Unidos Núm. 4.683.202. Se han desarrollado métodos de amplificación por PCR para amplificar hasta 22 kb de ADN genómico. Estos métodos, así como otros métodos conocidos en la técnica de la amplificación de ADN, pueden utilizarse en la práctica de las realizaciones de la presente descripción. La secuencia del inserto de ADN del transgén heterólogo o la secuencia genómica flanqueante de un evento de algodón sujeto se puede verificar (y corregir si es necesario) amplificando dichas secuencias del evento utilizando cebadores derivados de las secuencias proporcionadas en este documento seguido de secuenciación de ADN convencional del amplicón de PCR o del ADN clonado.
El amplicón producido por estos métodos puede detectarse mediante una pluralidad de técnicas. La electroforesis en gel de agarosa y la tinción con bromuro de etidio es un método bien conocido para detectar amplicones de ADN. Otro de estos métodos es el Genetic Bit Analysis, en el que se diseña un oligonucleótido de ADN que solapa tanto la secuencia de ADN genómico flanqueante adyacente como la secuencia de ADN insertada. El oligonucleótido se inmoviliza en los pocillos de una placa de micropocillos. Después de la PCR de la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un producto de PCR monocatenario se puede hibridar con el oligonucleótido inmovilizado y servir como molde para una reacción de extensión de una sola base utilizando una ADN polimerasa y ddNTP marcados específicos para la siguiente base esperada. El análisis de un producto unido se puede completar cuantificando la cantidad de señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia del inserto/secuencia flanqueante debido a la amplificación, hibridación y extensión de una sola base con éxito.
Otro método es la técnica de pirosecuenciación descrita por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que solapa la unión de ADN genómico adyacente y del ADN del inserto. El oligonucleótido está diseñado para hibridar con un producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y otro en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Los DNTP se añaden individualmente y la incorporación da como resultado una señal de luz que se mide. Una señal luminosa indica la presencia del inserto transgénico/secuencia flanqueante debido a la amplificación, hibridación y extensión de una o varias bases con éxito.
La polarización por fluorescencia es otro método que puede utilizarse para detectar un amplicón de una realización de la presente descripción. Siguiendo este método, se diseña un oligonucleótido que solapa la unión del ADN flanqueante genómico y el insertado. El oligonucleótido se hibrida con el producto de PCR monocatenario de la región de interés (un cebador en el ADN insertado y otro en la secuencia de ADN genómico flanqueante) y se incuba en presencia de una ADN polimerasa y un ddNTP marcado con fluorescencia. La extensión de una sola base da como resultado la incorporación del ddNTP. La incorporación del ddNTP marcado con fluorescencia se puede medir como un cambio de polarización utilizando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia del inserto transgénico/secuencia flanqueante debido a la amplificación, hibridación y extensión de una sola base con éxito.
TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, California) es un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN. Brevemente, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que solapa la unión de ADN flanqueante genómico y del inserto. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN del inserto y otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Durante la amplificación específica, el mecanismo de corrección de pruebas de la ADN polimerasa Taq libera el radical fluorescente del radical de extinción en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de inserción flanqueante/transgénica debido a la amplificación e hibridación satisfactorias.
Se han descrito Balizas Moleculares para su uso en la detección de secuencias de polinucleótidos. En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótidos FRET que solapa la unión del ADN genómico flanqueante y del inserto. La estructura única de la sonda FRET da como resultado que contenga una estructura secundaria que mantiene los radicales fluorescentes y de extinción muy próximos. La sonda FRET y los cebadores de PCR (un cebador en la secuencia de ADN del inserto y otro en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Después de una amplificación por PCR satisfactoria, la hibridación de la sonda FRET con la secuencia diana da como resultado la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los radicales fluorescentes y de extinción. Se produce una señal fluorescente. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia genómica flanqueante/inserto de transgén debido a la amplificación e hibridación satisfactorias.
Habiendo descrito una ubicación en el genoma del algodón que es excelente para una inserción, las realizaciones de la descripción objeto también comprenden una semilla de algodón y/o una planta de algodón que comprende al menos un inserto pDAB4468.19.10.3 que no es de algodón en la vecindad general de esta ubicación genómica. Una opción es sustituir un inserto diferente en lugar del del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 ilustrado en el presente documento. En general, la recombinación homóloga dirigida, por ejemplo, se emplea en realizaciones particulares.
Este tipo de tecnología es el objeto de, por ejemplo, el documento WO 03/080809 A2 y la correspondiente solicitud de Estados Unidos publicada (documento US 20030232410). Por tanto, las realizaciones de la descripción objeto incluyen plantas y células vegetales que comprenden un inserto heterólogo (en lugar de o con copias múltiples de los genes aad-12 o pat), flanqueados por todas o una parte reconocible de las secuencias flanqueantes identificadas en el presente documento (pb 1 - 1354 de SEQ ID NO: 1 y pb 169 - 2898 de SEQ ID NO: 2). Una copia adicional (o copias adicionales) de un gen aad-12 o pat también podría ser la diana para la inserción de esta o estas maneras.
Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar procedimientos para poner en práctica realizaciones de la descripción y para demostrar ciertas realizaciones preferidas de la descripción. A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de disolventes son en volumen a menos que se indique lo contrario.
Se utilizan las siguientes abreviaturas a menos que se indique lo contrario.
pb par de bases
°C grados Celsius
ADN ácido desoxirribonucleico
EDTA ácido etilendiaminotetraacético
kb kilobase
gg microgramo
gL microlitro
mL mililitro
M masa molar
PCR reacción en cadena de la polimerasa
PTU unidad de transcripción vegetal o casete de expresión
SDS dodecil sulfato de sodio
SSC una solución tampón que contiene una mezcla de cloruro de sodio y citrato de sodio, pH 7.0 TBE una solución tampón que contiene una mezcla de base Tris, ácido bórico y EDTA, pH 8,3 Ejemplos
Ejemplo 1: Transformación y selección del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 con aad-12 y pat
Se generó algodón transgénico (Gossypium hirsutum) que contenía el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 a través de transformación mediada por Agrobacterium y se seleccionó utilizando medio que contenía glufosinato. Se utilizó la cepa de Agrobacterium desarmada EHA101 (Hood et al., 1993), que portaba el vector binario pDAB4468 (FIG. 1) que contenía el marcador seleccionable, pat, y el gen de interés, aad-12, dentro de la región de ADN de la hebra T, se utilizó para iniciar la transformación de la variedad de planta de algodón, Coker 310. La secuencia de la hebra T de ADN para pDAB4468 se proporciona en SEQ ID NO: 3, y se anota a continuación en la Tabla 1.
Tabla 1: Elementos genéticos ubicados en pDAB4468.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Ejemplo 2: Caracterización de la proteína AAD-12 del evento de algodón pDAB4468.19.10.3
Se caracterizaron las propiedades bioquímicas de la proteína AAD-12 recombinante derivada del evento de algodón transgénico pDAB4468.19.10.3. Se utilizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) cuantitativo para caracterizar las propiedades bioquímicas de la proteína y confirmar la expresión de la proteína AAD-12.
Los niveles de proteína AAD-12 se determinaron en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Se aislaron muestras de tejido de hojas de algodón de las plantas de prueba y se prepararon para el análisis de expresión. La proteína AAD-12 se extrajo de tejidos de plantas de algodón con una solución de Tris-HCl que contenía el detergente Brij-56™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El tejido vegetal se centrifugó; el sobrenadante acuoso se recogió, se diluyó con tampón apropiado según fuera necesario y se analizó utilizando un kit ELISA AAD-12 (Beacon Diagnostics, East Falmouth, MA) en formato sándwich. El kit se utilizó siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante.
Se realizó un análisis de detección para investigar la estabilidad de la expresión y la heredabilidad tanto verticalmente (entre generaciones) como horizontalmente (entre linajes de la misma generación) en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. La expresión de la proteína AAD-12 del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 fue estable (no segregante) y uniforme en todos los linajes.
Se determinaron los niveles de expresión de la proteína AAD-12 comparados verticalmente (entre generaciones) para plantas de algodón cultivadas en invernadero pDAB4468.19.10.3. Los niveles de expresión fueron uniformes y estables en las generaciones T3-T4 con niveles de expresión promedio de aproximadamente 110-125 ng/cm2 de proteína AAD-12 aislada.
Se determinaron los niveles de expresión de la proteína AAD-12 comparados horizontalmente (entre linajes de la misma generación) para plantas de algodón cultivadas en el campo pDAB4468.19.10.3. Se realizaron estudios de nivel de expresión de campo en varias plantas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 que comprendían la generación T4. Los niveles promedio de expresión de proteínas fueron uniformes y estables a aproximadamente 50­ 150 ng/cm2 de proteína AAD-12 aislada.
Ejemplo 3: Clonación y caracterización de regiones limítrofes flanqueantes genómicas del evento de algodón pDA B4468.19.10.3
Se aislaron, clonaron y caracterizaron las regiones limítrofes flanqueantes genómicas que son adyacentes al inserto de la hebra T del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Para caracterizar las regiones limítrofes y describir el sitio de inserción genómica, se aislaron las regiones flanqueantes genómicas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3, que comprendían 1.354 pb de la secuencia limítrofe flanqueante genómica 5' (SEQ ID NO: 1) y 2.730 pb de la secuencia limítrofe flanqueante genómica 3' (SEQ ID NO: 2). Se descubrió que la secuencia limítrofe flanqueante genómica 5' contenía una secuencia altamente repetitiva que producía dificultades técnicas cuando se confirmaba la secuencia del genoma de la secuencia limítrofe flanqueante genómica 5'. La secuencia limítrofe 3' se confirmó utilizando cebadores específicos del transgén y cebadores genómicos.
Las secuencias limítrofes flanqueante genómicas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se compararon con la base de datos de nucleótidos del NCBI para confirmar que estas regiones tenían su origen en el algodón. Un análisis mediante BLAST del límite flanqueante 3' indicó que la secuencia se alineó parcialmente con un solo clon BAC (Gossypium hirsutum MX008C17). Además, la búsqueda BLAST indicó que el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 estaba localizado dentro del genoma del algodón en el cromosoma 3 del subgenoma A. En general, la caracterización de la secuencia limítrofe flanqueante genómica del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 indicó que estaba presente una copia de la hebra T de pDAB4468 dentro del genoma del algodón.
Ejemplo 3.1: Confirmación de secuencias genómicas de algodón
Para confirmar la secuencia del sitio de inserción genómica del evento de algodón pDAB4468.19.10.3, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con diferentes pares de cebadores (FIG. 2 y Tabla 2 y Tabla 3). Se utilizaron como molde ADN genómico del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y otras líneas de control de algodón transgénicas o no transgénicas. Para las reacciones se utilizó el kit LA Taq PCR® (TaKaRa, Japón).
Tabla 2: Secuencias y cebadores de PCR utilizados para analizar el evento de algodón pDAB4468.19.10.3
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Tabla 3: Condiciones de PCR y mezcla de reacción para la amplificación de regiones limítrofes
y secuencias específicas del evento en el evento de algodón pDA4468.19.10.3
Figure imgf000020_0002
Las secuencias limítrofes flanqueantes genómicas 5' se amplificaron y secuenciaron por PCR. Estas reacciones utilizaron cebadores específicos del casete de expresión aad-12, (por ejemplo, 5endT 1 ,5endT2 y 5endT3) y cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia limítrofe del extremo 5' clonada obtenida del genoma del algodón (por ejemplo, 5endG1 y 5endG2 y 5endG3) para amplificar un segmento de ADN genómico que abarca el gen aad-12 y secuencia limítrofe flanqueante genómica del extremo 5'. De manera similar, para la confirmación de la secuencia limítrofe flanqueante genómica 3' clonada, se utilizaron cebadores específicos del casete de expresión pat, (por ejemplo, 3endT 1 ,3endT2 y 3endT3) y cebadores diseñados de acuerdo con la secuencia limítrofe del extremo 3' clonado (por ejemplo, 3endG1, 3endG2 y 3endG3) para amplificar un segmento de ADN genómico que abarca el gen pat y la secuencia limítrofe flanqueante genómica del extremo 3'. Los fragmentos de ADN del tamaño esperado se amplificaron a partir del ADN genómico del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 con cada par de cebadores (un cebador ubicado en límite flanqueante del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y un cebador específico del transgén). Las muestras de control (otras líneas de algodón transgénicas o algodón no transgénico, control Coker 310) no produjeron amplicones de PCR utilizando estos cebadores. Los amplicones de PCR se subclonaron en plásmidos y se secuenciaron. Estos datos se utilizaron para determinar las secuencias limítrofes flanqueante genómicas 5' y 3' ubicadas adyacentes al inserto de la hebra T del evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Ejemplo 4: Evento de algodón pDAB4468.19.10.3 Caracterización por Transferencia Southern
Se utilizó el análisis de transferencia Southern para establecer el patrón de integración del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Estos experimentos generaron datos que demostraron la integración e integridad de los transgenes aad-12, y pat dentro del genoma del algodón. El evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se caracterizó como un evento de integración simple y de longitud completa que contenía una única copia del casete de expresión aad-12 y pat del plásmido pDAB4468.
Los datos de la transferencia Southern sugirieron que un fragmento de la hebra T se insertaba en el genoma del evento de algodón pDAB4468. Se realizó un análisis de transferencia Southern detallado utilizando una sonda específica para los genes aad-12 y pat, contenidos en la región de integración de la cadena T de pDAB4468, y enzimas de restricción descriptivas que tienen sitios de escisión ubicados dentro del plásmido y producen fragmentos de hibridación internos al plásmido o fragmentos que atraviesan la unión del plásmido y el ADN genómico del algodón (fragmentos limítrofes). Los pesos moleculares indicados a partir de la hibridación Southern para la combinación de las enzimas de restricción y las sondas fueron únicos para el evento y establecieron su patrón de identificación. Estos análisis también mostraron que el fragmento de la hebra T de pDAB4468 se había insertado en el ADN genómico del algodón sin reordenamientos de los casetes de expresión aad-12 o pat.
Ejemplo 4.1: Recolección de muestras de hojas de algodón y aislamiento de ADN genómico
El ADN genómico se extrajo del tejido de la hoja cosechado de plantas de algodón individuales que contenían el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Además, se aisló ADNg de una planta de algodón convencional, Coker 310, que contiene el fondo genético que es representativo de la línea de algodón utilizada para la transformación y no contiene los genes aad-12 y pat. El ADN genómico individual se extrajo de tejido de hoja liofilizado siguiendo un protocolo del fabricante modificado utilizando el QIAGEN DNEASY® Mini Prep DNA Extraction Kit® (Qiagen, CA). Después de la extracción, el ADN se cuantificó espectrofluorométricamente utilizando el reactivo Pico Green® (Invitrogen, Carlsbad, CA) y utilizando la instrumentación NANODROP® (Invitrogen). A continuación, el ADN se visualizó en un gel de agarosa para confirmar los valores del análisis Pico Green® y determinar la calidad del ADN.
Ejemplo 4.2: Digestión y separación de ADNg
Para la caracterización por transferencia Southern del evento de algodón pDAB4468.19.10.3, se digirieron diez microgramos (10 pg) de ADN genómico. El ADN genómico del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y la línea de algodón no transgénica, Coker 310, se digirió añadiendo aproximadamente 10 unidades de enzima de restricción seleccionada por pg de ADN y el tampón de reacción correspondiente a cada muestra de ADN. Cada muestra se incubó a aproximadamente 37°C durante la noche. Las enzimas de restricción Nsil, Ncol, SbflI, SwaI, y Ndel se utilizaron individualmente para las reacciones de digestión (New England Biolabs, Ipswich, MA). Además, se preparó una muestra de control de hibridación positiva combinando ADN plasmídico, pDAB4468, con ADN genómico de la variedad de algodón no transgénica, Coker 310. El cóctel de ADN plasmídico/ADN genómico se digirió utilizando los mismos procedimientos y enzima de restricción que las muestras de prueba. Después de que las digestiones se incubaron durante la noche, se añadió NaCl hasta una concentración final de 0,1 M para detener la reacción de digestión con enzimas de restricción. Las muestras de ADN digeridas se precipitaron con isopropanol. El sedimento de ADN precipitado se resuspendió en 15 pl de tampón de carga 3X (azul de bromofenol al 0,01%, EDTA 10,0 mM, glicerol al 5,0%, Tris 1,0 mM, pH 7,5). Las muestras de ADN y el marcador de tamaño molecular se sometieron a electroforesis a través de geles de agarosa al 0,85% con 0,4X tampón TAE (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a 45 voltios durante aproximadamente 18-22 horas para lograr la separación de los fragmentos. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el ADN se visualizó bajo luz ultravioleta (UV).
Ejemplo 4.3: Transferencia Southern y tratamiento de membranas
El análisis de transferencia Southern se realizó esencialmente como describen Memelink, J., Swords, K., Harry J., Hoge, C., (1994) Southern, Northern and Western Blot Analysis. Plant Mol. Biol. Manual F1: 1-23. Brevemente, después de la separación electroforética y la visualización de los fragmentos de ADN, los geles se desnaturalizaron con IX Solución de Desnaturalización (NaOH 1,5 M, EDTA 20 mM) durante exactamente 20 minutos, y luego se lavaron con IX Solución de Neutralización (NaPO41,5 M, pH 7,8) durante al menos 20 minutos. La transferencia Southern se realizó durante la noche sobre membranas de nailon utilizando un sistema de mecha con IX Solución de transferencia (pirofosfato de sodio 0,25 M, pH 10). Después de la transferencia, el ADN se unió a la membrana calentando a 65°C durante 1 hora o mediante entrecruzamiento con UV seguido de un breve lavado de la membrana con IX Solución de transferencia. Este procedimiento produjo membranas de transferencia Southern listas para la hibridación.
Ejemplo 4.4: Mareaje e hibridación de sondas de ADN
Los fragmentos de ADN unidos a la membrana de nailon se detectaron utilizando una Sonda radiomarcada con P32. Las sondas se generaron mediante un método basado en PCR utilizando cebadores específicos para elementos genéticos y siguiendo el procedimiento convencional del fabricante con la polimerasa Taq HOTSTAR® (Qiagen, CA). Se marcaron 50 ng de ADN de sonda específico para cada elemento del gen y 25 ng de 1Kb Plus Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) con P32 utilizando READY TO g O LABELING BEADS® (Amersham, Piscataway, NJ) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sondas se purificaron utilizando la columna de centrifugación Nucleotide G-50® de Amersham siguiendo el protocolo del fabricante.
Antes de la adición de la sonda radiomarcada con P32, las transferencias de membranas de nailon que contenían ADN fijado se bloquearon con Tampón de bloqueo: (SDS al 2%, BSA al 0,5%, EDTA 1 mM, ortofenantrolina 1 mM) durante al menos 2 horas a temperatura ambiente en un agitador, y a continuación se hibridaron previamente con 10 ml de Perfect HYB Plus Buffer® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) a 65°C durante al menos 1 hora en un horno de hibridación. Las sondas marcadas purificadas se desnaturalizaron en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y se colocaron en hielo durante 5 minutos y a continuación se añadieron a las membranas bloqueadas y prehibridadas y se colocaron durante la noche a 65°C en un horno de hibridación.
Después de la hibridación de la sonda, la solución de la sonda se descartó a residuos radiactivos. Las membranas se lavaron dos veces en su tubo de hibridación original con 1 X tampón de lavado Ribowash™: (fosfato de sodio 200 mM, pirofosfato de sodio 50 mM, EDTA 10 mM, SDS al 2%, pH a 7,8) durante 15 minutos cada lavado en un horno de hibridación a 65°C. Cada lavado se descartó al residuo líquido radiactivo siguiendo los procedimientos operativos convencionales. Las membranas se retiraron del tubo y se colocaron en una bandeja de aclarado limpia y se lavaron una vez más en una incubadora con agitador a 65°C durante 15 minutos más. Las membranas se envolvieron en una envoltura de plástico, se colocaron en un casete de película y se expusieron a una pantalla de imagen de fósforo durante 1 a 3 días. Las imágenes se obtuvieron utilizando BioRad Personal FX Phosphor Imager® siguiendo las pautas del equipo y el soporte lógico.
Las sondas utilizadas para la hibridación se describen en la Tabla 4. Se utilizó 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA) para determinar el tamaño del fragmento de hibridación en las transferencias Southern.
Tabla 4: Longitud de las sondas utilizadas en el análisis Southern del evento de algodón pDAB4468.19.10.3
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 4.5: Resultados de la transferencia Southern
En la Tabla 5 se proporcionan los tamaños de fragmentos esperados y observados con un producto digerido y una sonda en particular, basándose en los sitios de enzimas de restricción conocidos del casete de expresión de los genes aad-12y pat. Los tamaños esperados de los fragmentos se basan en el mapa de plásmido de pDAB4468 y los tamaños de los fragmentos observados son resultados aproximados de estos análisis y se basan en la correspondencia de la banda con los tamaños indicados de 1 Kb Plus DNA Ladder.
Se identificaron dos tipos de fragmentos a partir de estos productos digeridos e hibridaciones: fragmentos internos donde los sitios enzimáticos conocidos flanquean la región de la sonda y están completamente contenidos dentro de la región de inserción del casete de expresión de aad-12 y fragmentos limítrofes donde se encuentra un sitio enzimático conocido en un extremo de la región de la sonda y se espera un segundo sitio en el genoma del algodón. Los tamaños de los fragmentos limítrofes varían según el evento debido a que, en la mayoría de los casos, los sitios de integración de los fragmentos de ADN son únicos para cada evento. Los fragmentos limítrofes proporcionan un medio para localizar un sitio de enzima de restricción en relación con el ADN integrado y para evaluar el número de inserciones de ADN. Los análisis de transferencia Southern completados en varias generaciones de líneas de algodón que contienen el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 produjeron datos que sugirieron que se insertó un casete de expresión de aad-12 intacto, debajo número de copias del plásmido pDAB4468 en el genoma del algodón dando como resultado el evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Las enzimas de restricción Nsil y SwaI unen y escinden sitios de restricción únicos dentro del plásmido pDAB4468. Posteriormente, estas enzimas fueron seleccionadas para caracterizar el inserto genético aad-12 en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Se predijo que los fragmentos limítrofes de más de 6,3 Kb o más de 4,3 Kb hibridarían con la sonda después de la digestión, respectivamente (Tabla 5). Se observaron bandas de hibridación de aad-12 sencillas de aproximadamente 7,0 Kb y aproximadamente 5,5 Kb cuando se utilizaron Nsil, y SwaI, respectivamente. Además, la enzima de restricción Ncol fue seleccionada para caracterizar el inserto genético aad-12. El plásmido utilizado para producir el evento de algodón pDAB4468.19.10.3, pDAB4468, contenía un sitio de restricción Ncol en el casete de expresión del plásmido pDAB4468, y dos sitios adicionales en la zona de la "cadena principal" del plásmido pDAB4468. Se predijo que un fragmento limítrofe de más de 2,8 Kb hibridaría con la sonda después de la digestión (Tabla 5). Se observó una banda de hibridación de aad-12 sencilla de aproximadamente 9,75 Kb. La hibridación de la sonda con bandas de este tamaño sugiere la presencia de un único sitio de inserción para el gen aad-12 en el genoma del algodón del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Se seleccionaron tres combinaciones de enzimas de restricción, Nde, Nsil+Ncoly Nsil+Sbfl, para liberar un fragmento que contenía varias regiones del casete de expresión de aad-12 y el casete de expresión de pat (Tabla 5). La enzima de restricción Ndel incluye elementos del casete de expresión de aad-12 del promotor Ubi10 al terminador UTR AtuORF23. Se observó un fragmento pronosticado de 3,5 Kb en transferencias probadas con la sonda aad-12 después del producto digerido de Ndel. La doble digestión con Nsil y Ncol incluye elementos de casete de expresión de aad-12 y pat. Se observó un fragmento pronosticado de 3,5 Kb en transferencias probadas con la sonda aad-12 después de la doble digestión enzimática (Tabla 5). La doble digestión con Nsil y Sbfl contiene elementos del casete de expresión tanto de aad-12 como de pat. Se observó un fragmento pronosticado de 4,8 Kb en transferencias sondeadas con aad-12 después de la doble digestión enzimática (Tabla 5).
Además, se observaron bandas de hibridación en transferencias que se sondearon con una sonda pat y se digirieron con las digestiones de enzimas de restricción descritas anteriormente (Nsil, Ncol, Swal, Ndel, Nsil+Ncol y Nsil+Sbfl). Las transferencias resultantes produjeron fragmentos que indicaban que el casete de expresión de pat estuvo presente en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. La Tabla 5 enumera los tamaños de fragmentos esperados que se basan en el mapa plasmídico de pDAB4468, además de los tamaños de fragmentos observados que resultaron de las transferencias Southern sondeadas con pat. Estos resultados obtenidos para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 indican que se insertaron un casete de expresión de aad-12 y un casete de expresión de pat del plásmido pDAB4468 en el genoma de algodón del evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Ejemplo 4.6: Ausencia de secuencias de la cadena principal
También se realizó un análisis de transferencia Southern para verificar la ausencia del gen de resistencia a espectinomicina (specR), el elemento Ori Rep y la proteína de inicio de replicación trfA (elemento trf A) en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Después de la digestión con Nsil y de la hibridación con una sonda específica de specR, se observó una banda de tamaño esperado de aproximadamente 12 Kb en la muestra de control positivo (pDAB4468 más Coker 310) pero ausente en las muestras del control negativo y el evento de algodón pDAB4468.19.10.3. De manera similar, se detectó una banda de tamaño esperado de aproximadamente 7,25 Kb en la muestra de control positivo (pDAB4468 más Coker 310) pero ausente en las muestras del control negativo y el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 después de la digestión con Ncol y de la hibridación con una mezcla de sonda específica de OriRep y la sonda específica de trfA. Estos datos indican la ausencia del gen de resistencia a espectinomicina, el elemento Ori Rep y la proteína de inicio de la replicación trfA en el evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Tabla 5: Fragmentos de Hibridación Previstos y Observados en Análisis de Transferencia Southern. 1. Los tamaños de fragmentos esperados se basan en el mapa de plásmido de pDAB4468. 2. Los tamaños de los fragmentos observados se consideran aproximadamente a partir de estos análisis y se basan en los tamaños indicados de los Fragmentos de Peso Molecular de ADN marcados con P32.
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
Ejemplo 5: Tolerancia a 2,4-D en ensayos de campo
La tolerancia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 a las aplicaciones de post-emergencia del herbicida ácido fenoxiacético, 2,4-D, se estudió en ensayos de campo durante la temporada de crecimiento de 2010. La tolerancia a herbicidas se evaluó después de una sola aplicación de post-emergencia de 2,4-D aplicado al evento de algodón pDAB4468.19.10.3 de 2-4 hojas. La aplicación de 2,4-D a plantas de algodón en esta etapa de desarrollo representa un momento de aplicación de herbicidas que normalmente se utiliza para lograr un control satisfactorio de malas hierbas por parte de los cultivadores de algodón.
La tolerancia a 2,4-D se midió evaluando las plantas de algodón para detectar lesiones 0-1 día después de la aplicación (DDA), 7-8 DDA, 12-16 DDA y 24-32 DDA. Las mediciones para el incremento de tiempo de 0 a 1 día se tomaron de 6 a 24 horas después de la aplicación. La lesión se evaluó asignando una calificación de daño visual porcentual utilizando una escala de porcentaje lineal (1-100%) donde 0% representa ninguna lesión visible por herbicida y 100% representa la muerte de la planta. Las calificaciones fueron una puntuación compuesta para cualquier sintomatología por herbicida, incluida epinastia, clorosis, necrosis de las hojas y muerte de las plantas. La sintomatología por herbicida presente en 0-1 DDA fue principalmente epinastía y los síntomas en evaluaciones posteriores fueron principalmente clorosis y necrosis.
Los ensayos de campo se llevaron a cabo en once lugares de los Estados Unidos en zonas típicas productoras de algodón de Alabama, Arkansas, California, Georgia, Louisiana, Mississippi, Carolina del Norte, Carolina del Sur y Tennessee. Los ensayos se diseñaron con cuatro repeticiones por tratamiento. Cada réplica estuvo separada por un callejón de suelo desnudo de 3,04 m a 4,57 m (10 a 15 pies) de ancho. El tamaño de la parcela para los tratamientos individuales fue de 2 hileras por 6,09 m (20 pies) de largo, con hileras típicamente espaciadas de 91,44 cm a 101,6 cm (36 a 40 pulgadas). Los tratamientos experimentales consistieron en algodón pDAB4468.19.10.3 rociado con 2,4-D amina (Weedar 64™, NuFarm, Burr Ridge, IL) a 0, 1120, 2240 o 4480 gramos de equivalente ácido por hectárea (g ea/ha) aplicado a 56,78 litros (15 galones) por acre de solución de pulverización final. En estos experimentos no se incluyó un tratamiento de comparación de algodón no transformado, ya que se sabe que el tratamiento con 2,4-D a dosis mucho más bajas que la dosis más baja probada (1120 g ea/ha) provoca la muerte de la planta.
La Tabla 6 presenta los medios de tratamiento para las lesiones visuales resultantes de la aplicación post-emergencia de 2,4-D. Con la excepción de la epinastia transitoria 0-1 DDA, no se observó daño por herbicida agronómicamente significativo en estos experimentos. El tratamiento con 2,4-D a 4480 g ea/ha (que representa una tasa que se anticipa que será >4 veces la requerida para el control de malas hierbas de amplio espectro) dio como resultado un daño mínimo al cultivo más allá del intervalo de evaluación de 7-8 DDA y demuestra la tolerancia robusta del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 a 2,4-D.
Tabla 6: Porcentaje de daño visual para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 después de la aplicación post­ emergencia de 2,4-D.
Figure imgf000026_0001
Ejemplo 6: Tolerancia al glufosinato en ensayos de campo
La tolerancia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 a las aplicaciones de post-emergencia de glufosinato se estudió en ensayos de campo durante la temporada de crecimiento de 2010. La tolerancia a los herbicidas se evaluó después de una sola aplicación de post-emergencia de glufosinato aplicado al evento de algodón pDAB4468.19.10.3 de 6-8 hojas, que representa un momento de aplicación de herbicida que se utiliza típicamente con glufosinato para lograr un control de malezas satisfactorio.
La tolerancia al glufosinato se midió evaluando las plantas de algodón para detectar daños a los 2-4 días después de la aplicación (DDA), 7-9 DDA, 13-19 DDA y 22-29 DDA. La lesión se evaluó asignando una calificación de daño visual porcentual utilizando una escala de porcentaje lineal (1 -100) donde 0% representa ninguna lesión visible por herbicida y 100% representa la muerte de la planta. Las calificaciones fueron una puntuación compuesta para cualquier sintomatología por herbicida, incluida la clorosis, la necrosis de las hojas, el retraso del crecimiento y la muerte de las plantas. La sintomatología por herbicida (cuando estaba presente) fue principalmente clorosis y necrosis.
Los ensayos de campo se llevaron a cabo en once lugares de los Estados Unidos en áreas típicas productoras de algodón de Alabama, Arkansas, California, Georgia, Louisiana, Mississippi, Carolina del Norte, Carolina del Sur y Tennessee. Los ensayos se diseñaron con cuatro repeticiones por tratamiento. Cada réplica estuvo separada por un callejón de suelo desnudo de 3,04 m a 4,57 m (10 a 15 pies) de ancho. El tamaño de la parcela para los tratamientos individuales fue de 2 hileras por 6,09 m (20 pies) de largo, con hileras típicamente espaciadas de 91,44 cm a 101,6 cm (36 a 40 pulgadas). Los tratamientos experimentales consistieron en algodón pDAB4468.19.10.3 rociado con glufosinato de amonio (Ignite 280 SL™, Bayer, Research Triangle, NC) a 0, 542, 1084 o 2168 gramos de equivalente ácido por hectárea (g ea/ha) aplicado a 56,78 litros (15 galones) por 0,405 ha (1 acre) de solución de pulverización final. En estos experimentos no se incluyó un tratamiento de comparación de algodón no transformado, ya que se esperaría que el tratamiento con glufosinato a dosis mucho más bajas que la dosis más baja probada (542 g ea/ha) provocara la muerte de la planta.
La Tabla 7 presenta los medios de tratamiento para las lesiones visuales resultantes de la aplicación post-emergencia de glufosinato. Con la excepción de la clorosis transitoria en las parcelas tratadas con 2168 g ea/ha (> 4 veces la tasa de uso típica) a 2-4 y 7-9 DDA, no se observó daño por herbicida agronómicamente significativo en estos experimentos. El tratamiento con glufosinato a 2168 g ae/ha (que representa una tasa que se prevé que sea >4 veces la requerida para el control de malezas de amplio espectro) dio como resultado un daño mínimo en el cultivo más allá del intervalo de evaluación de 7-9 DDA y demuestra la tolerancia robusta del evento de algodón pDAB4468.19.10.3.
Tabla 7: Porcentaje de daño visual para el evento de algodón pDADB4468.19.10.3 después de la aplicación post­ emergencia de glufosinato.
Figure imgf000027_0001
Ejemplo 7: Tolerancia a tric lop ir y flu rox ip ir en ensayos de invernadero
La tolerancia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 a las aplicaciones de post-emergencia de los herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir y fluroxipir, se estudió en ensayos de invernadero. La tolerancia a herbicidas se evaluó después de una sola aplicación post-emergencia de triclopir o fluroxipir.
Las semillas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se trataron térmicamente en un baño de agua a 82,5°C durante 1 minuto y a continuación se plantaron en medio metro mix 360 y se cultivaron en un invernadero. Las temperaturas en el invernadero promediaron 27°C y el fotoperiodo se estableció en 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad, con máxima intensidad de luz. Las plantas se dejaron crecer hasta la etapa de desarrollo de las 3 hojas y se realizó un estudio no aleatorizado con tres repeticiones y tres tratamientos para cada herbicida. Las plantas se rociaron en un rociador de pista calibrado para suministrar 187 L/ha de las formulaciones comerciales de triclopir (Garlon 4™, Dow AgroSciences, Indianapolis, IN) y fluroxipir (Starane™, Dow AgroSciences, Indianapolis, IN). Se utilizó una variedad de algodón Coker 310 no transformado como control negativo. La evaluación de la lesión visual se tomó 3 DDA (días después de la aplicación) y 11 DDA comparando cada dosis de herbicida. La lesión se evaluó visualmente como porcentaje de follaje epinástico de plantas de algodón utilizando una escala de porcentaje lineal (1-100%) donde 0% representa ninguna lesión visible por herbicida y 100% representa la muerte de la planta.
El evento de algodón pDAB4468.19.10.3 proporciona tolerancia a niveles de fluroxipir hasta 280 g ea/ha por 3 DDA (Tabla 8). Además, el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 proporciona tolerancia a triclopir (Tabla 8). A los 3 DDA, las plantas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 demostraron niveles moderados de tolerancia al triclopir, pero a los 11 DDA las plantas se habían recuperado de la respuesta epinástica inicial y proporcionaron una tolerancia robusta en comparación con el control no transformado. El estudio resultante demuestra que el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 proporciona tolerancia a los herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir y fluroxipir.
Tabla 8: Porcentaje de daño visual después de la aplicación post-emergencia de los herbicidas triclopyr y fluroxypyr.
Figure imgf000027_0002
Figure imgf000028_0001
Las medias seguidas de la misma letra no difieren significativamente (P = ,05, Student - Newman-Keuls).
Ejemplo 8: Caracterización agronómica del evento de algodón pDAB4468.19.10.3
Las características agronómicas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se cuantificaron en ensayos de campo realizados en ubicaciones geográficamente diferentes a lo largo del cinturón algodonero en 2010. Estos estudios compararon el rendimiento agronómico del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 (con y sin aplicaciones de herbicidas 2,4-D y glufosinato) con el control no transgénico cercano a isolina, Coker 310. No se observaron diferencias no deseadas agronómicamente significativas entre el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y las plantas de control Coker 310. Los resultados de estos ensayos de campo demostraron que el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 fue agronómicamente equivalente a las plantas de control Coker 310 y que la presencia del inserto de hebra T de pDAB4468 no alteró el comportamiento agronómico esperado del evento de algodón pDAB4468.19.10. 3. Además, el rendimiento agronómico del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 no se alteró como resultado de la aplicación de herbicidas, 2,4-D y glufosinato, en comparación con las plantas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 que no fueron rociadas con los tratamientos herbicidas.
Se realizaron evaluaciones de las características agronómicas para determinar el vigor de la plántula, el % de emergencia de la planta, el inicio de la flor, los nudos después de la flor blanca (NAWF) y la determinación del rendimiento utilizando los criterios indicados en la Tabla 9. La fibra recolectada se envió al Instituto de Investigación de Fibras y Biopolímeros en Lubbock, Texas, para la evaluación de fibras utilizando el Instrumento de Alto Volumen (HVI).
Tabla 9: Características agronómicas evaluadas en ensayos de rendimiento.
Figure imgf000028_0002
Figure imgf000029_0001
Las semillas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y las semillas de la línea de control cercana a isolina, Coker 310, se sembraron a una tasa de 80 semillas por hilera de 6,10 m (20 pies) con un espaciado entre hileras de 86,36 cm-96,52 cm (34-38 pulgadas). Este diseño de plantación se repitió cuatro veces en cada sitio. Cada sitio se organizó en un diseño de bloques aleatorizados completo (CRBD) que constaba de 3 bloques sin pulverizar y 4 bloques pulverizados para cada réplica. Las plantas se rociaron con los herbicidas 2,4-D y glufosinato utilizando tasas y métodos de aplicación de campo convencionales como se describió anteriormente. Las dos filas centrales (filas 2 y 3) se utilizaron para medir las características agronómicas y evaluar las plantas. Las características agronómicas medidas fueron equivalentes para el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 en comparación con las plantas de control cercanas a isolina Coker 310 para todas las características agronómicas medidas y analizadas estadísticamente. Se identificó una excepción para los resultados del "% de emergencia de la planta" dentro de las parcelas rociadas con herbicida del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Sin embargo, los puntos de datos del "% de emergencia de las plantas" se tomaron antes de la aplicación de cualquier herbicida y la variabilidad en esta medición se atribuye a factores ambientales. No se observaron diferencias no deseadas agronómicamente significativas entre el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y las plantas de control Coker 310. Estos ensayos de campo demostraron que el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 era agronómicamente equivalente a las plantas de control Coker 310 y que la presencia del inserto de hebra T de pDAB4468 no alteró el comportamiento agronómico esperado del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Además, el rendimiento agronómico del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 no se alteró como resultado de la aplicación de herbicidas, 2,4-D y glufosinato, en comparación con las plantas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 que no fueron rociadas con los tratamientos herbicidas.
Tabla 10: Datos estadísticos para eventos tratados (rociados con herbicida) y no tratados (no rociados con herbicida) en comparación con una planta de algodón de control cercana a isolina.
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000030_0001
Ejemplo 9: Secuencia completa del evento de algodón pDAB4468.19.10.3
SEQ ID NO: 21 proporciona la secuencia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Esta secuencia contiene la secuencia flanqueante genómica 5', el inserto de hebra T de pDAB4468 y las secuencias flanqueantes genómicas 3'. Con respecto a SEQ ID NO: 21, los restos 1 - 1.354 son la secuencia flanqueante genómica 5', los restos 1.355 -7.741 son restos del inserto de cadena T pDAB4468 y los restos 7.742 - 10.471 son la secuencia flanqueante 3'. La secuencia de unión o transición con respecto al extremo 5' del inserto se produce así en los restos 1.354/1.355 de SEQ ID NO: 21. La secuencia de unión o transición con respecto al extremo 3' del inserto se produce por tanto en los restos 7.741/7.742 de SEQ ID NO: 21.
Cabe señalar que la secuencia real del inserto de hebra T del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 puede desviarse ligeramente de SEQ ID NO: 21 en generaciones posteriores de plantas que se obtienen a partir del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Durante el proceso de introgresión, no es infrecuente que se produzcan algunas deleciones u otras alteraciones del inserto. Los expertos en la técnica esperarían encontrar ligeras diferencias y discrepancias mínimas en las secuencias de generaciones posteriores de plantas que se obtienen a partir del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Por tanto, el segmento relevante de la secuencia de plásmido proporcionada en este documento podría comprender algunas variaciones mínimas en las generaciones posteriores de plantas que se obtienen a partir del evento de algodón pDAB4468.19.10.3. Por consiguiente, una planta que comprende un polinucleótido que tiene algún intervalo de identidad con la secuencia del inserto objeto está dentro del alcance de las realizaciones de la descripción objeto. Una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 21 está dentro del alcance de las realizaciones de la descripción objeto. La secuencia de las secuencias flanqueantes más la secuencia del inserto se puede confirmar con referencia a la semilla depositada. Por tanto, pueden identificarse algunas diferencias entre SEQ ID NO: 21 y el inserto de hebra T real de generaciones posteriores de plantas que se obtienen a partir del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 y están dentro del alcance de las realizaciones de la presente descripción.
Ejemplo 10: Tolerancia a los ácidos butanoicos de triclopir y fluroxipir en ensayos de invernadero
La tolerancia del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 a las aplicaciones de post-emergencia de herbicidas que comprenden un resto de ácido butanoico, triclopir-B y fluroxipir-B, se estudió en ensayos de invernadero. La tolerancia a herbicidas se evaluó después de una sola aplicación de post-emergencia de las dos moléculas.
Las semillas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 se trataron térmicamente en un baño de agua a 82,5°C durante 1 minuto y a continuación se plantaron en medio metro mix 360 y se cultivaron en un invernadero. Las temperaturas en el invernadero promediaron 27°C y el fotoperiodo se estableció en 16 horas de luz y ocho horas de oscuridad, con máxima intensidad de luz. Se permitió que las plantas crecieran hasta la etapa de desarrollo de 2-3 hojas y se realizó un estudio no aleatorio con cuatro repeticiones y tres tratamientos para cada herbicida. Se adquirieron herbicidas de ácido piridiloxiacético que comprendían un resto de ácido butanoico adicional, fluroxipir-B y triclopir-B, y se aplicaron a las plantas de algodón. Cada uno de los ingredientes activos se formuló en una solución de acetona al 97% y DMSO al 3%. Además, se añadió un concentrado de aceite de cultivo hasta una concentración final del 1,25%. Las plantas se rociaron en un rociador de orugas calibrado para entregar 187 L/ha del material técnico formulado. Se utilizó una variedad de algodón Coker 310 no transformado como control negativo. La evaluación de la lesión visual se tomó 6 HAA (horas después de la aplicación), 1 DDA (días después de la aplicación), 3DDA, 6DDA y 14 DDA comparando cada dosis de herbicida. La lesión se evaluó visualmente como porcentaje de follaje epinástico de plantas de algodón utilizando una escala de porcentaje lineal (1-100%) donde 0% representa ninguna lesión visible por herbicida y 100% representa la muerte de la planta.
El evento de algodón pDAB4468.19.10.3 proporciona tolerancia a concentraciones variables de fluroxipir-b y triclopirb (Tabla 11 y Tabla 12). A las 6 HAA, las plantas del evento de algodón pDAB4468.19.10.3 demostraron niveles moderados de tolerancia a triclopir-b y fluroxipir-b, pero a las 14 DDA las plantas se habían recuperado de la respuesta epinástica inicial y proporcionaron una tolerancia robusta en comparación con el control no transformado. El estudio resultante demuestra que el evento de algodón pDAB4468.19.10.3 proporciona tolerancia a las formas butanoicas de los herbicidas de ácido piridiloxiacético, triclopir-b y fluroxipir-b.
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Una semilla de algodón que comprende en su genoma un evento transgénico aad-12/pat que tiene una secuencia de ADN que es al menos 95% idéntica a los restos 1.355 - 7.741 de SEQ ID NO: 21, en donde el genoma también comprende una secuencia de ADN de diagnóstico seleccionada del grupo que consiste en los restos 1329-1380 de SEQ ID NO: 1 y los restos 143-194 de SEQ ID NO: 2.
2. La semilla de algodón de la reivindicación 1, habiéndose depositado una semilla de algodón representativa en la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de acceso PTA-12457.
3. Una planta de algodón que comprende en su genoma un evento transgénico aad-12/pat que tiene una secuencia de ADN que es al menos 95% idéntica a los restos 1.355 - 7.741 de SEQ ID NO: 21, en donde el genoma también comprende una secuencia de ADN de diagnóstico seleccionada del grupo que consiste en los restos 1329-1380 de SEQ ID NO: 1 y los restos 143-194 de SEQ ID NO: 2.
4. Una parte de la planta de algodón de la reivindicación 3, en donde la parte se selecciona del grupo que consiste en polen, óvulo, flores, cápsulas, brotes, raíces y hojas; y donde la parte comprende la secuencia de ADN de diagnóstico.
5. La planta de algodón de la reivindicación 3, en donde dicha planta exhibe tolerancia a herbicidas de ácido fenoxiacético, ácido piridiloxiacético y glufosinato, y dicha tolerancia se debe a la expresión de una proteína codificada en dicho genoma.
6. Un polinucleótido aislado que comprende una o más secuencias de ADN seleccionadas del grupo que consiste en pb 1329-1380 de SEQ ID NO: 1; pb 1304 - 1405 de SEQ ID NO: 1; pb 1254-1455 de SEQ ID NO: 1; pb 1154 - 1555 de SEQ ID NO: 1; pb 1054-1655 de SEC ID NO: 1; pb 143 - 194 de SEQ ID NO: 2; pb 118 - 219 de SEQ ID NO: 2; pb 68 - 269 de SEQ ID NO: 2; pb 1 - 369 de SEQ ID NO: 2; y sus complementos.
7. Una molécula de ADN aislada que comprende un polinucleótido que tiene al menos 95% de identidad con los restos 1355 - 7741 de SEQ ID NO: 21.
8. Un método para cultivar un cultivo de algodón que comprende la planta de algodón de la reivindicación 3, comprendiendo el método aplicar herbicida de ácido fenoxiacético o herbicida de ácido piridiloxiacético o herbicida glufosinato a la cosecha de algodón, en donde preferiblemente dicho herbicida de ácido fenoxiacético es 2,4-D o MCPA y dicho herbicida de ácido piridiloxiacético es triclopir o fluroxipir.
ES13741550T 2012-01-23 2013-01-23 Evento de algodón tolerante a herbicidas pdab4468.19.10.3 Active ES2837625T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261589594P 2012-01-23 2012-01-23
PCT/US2013/022663 WO2013112527A1 (en) 2012-01-23 2013-01-23 Herbicide tolerant cotton event pdab4468.19.10.3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2837625T3 true ES2837625T3 (es) 2021-07-01

Family

ID=48797524

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13741550T Active ES2837625T3 (es) 2012-01-23 2013-01-23 Evento de algodón tolerante a herbicidas pdab4468.19.10.3

Country Status (13)

Country Link
US (3) US9605273B2 (es)
EP (1) EP2806732B1 (es)
CN (4) CN107043816A (es)
AP (1) AP2014007861A0 (es)
AU (2) AU2013205620B2 (es)
BR (2) BR102013001764B1 (es)
ES (1) ES2837625T3 (es)
HU (1) HUE052982T2 (es)
IL (1) IL233658B (es)
MX (2) MX348266B (es)
UY (1) UY34588A (es)
WO (2) WO2013112527A1 (es)
ZA (1) ZA201405436B (es)

Families Citing this family (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102013001764B1 (pt) * 2012-01-23 2022-03-22 Dow Agrosciences Llc Método de detecção do evento de algodão pdab4468.19.10.3 em uma amostra que compreende dna de algodão
WO2014170345A2 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Bayer Cropscience Ag Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
CN104404136A (zh) * 2014-10-30 2015-03-11 中国农业大学 鉴定猪frzb基因中snp位点基因型的方法
EP3081085A1 (en) 2015-04-14 2016-10-19 Bayer CropScience AG Method for improving earliness in cotton
EP3097782A1 (en) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Methods for controlling phytopathogenic nematodes by combination of fluopyram and biological control agents
US11085050B2 (en) 2016-04-20 2021-08-10 Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc Elite event EE-GH7 and methods and kits for identifying such event in biological samples
EP3555056A1 (en) 2016-12-19 2019-10-23 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018153730A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
AU2018247768A1 (en) 2017-04-07 2019-10-03 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018188962A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018202487A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted 5-(haloalkyl)-5-hydroxy-isoxazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018202491A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018219797A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018234139A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 Basf Se 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamides for combating phytopathogenic fungi
WO2019025250A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019038042A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
EP3684761A1 (en) 2017-09-18 2020-07-29 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019101511A1 (en) 2017-11-23 2019-05-31 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019121143A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Substituted cyclopropyl derivatives
WO2019137995A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Basf Se Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
CN111669972A (zh) 2018-01-29 2020-09-15 巴斯夫农业公司 新农业化学制剂
WO2019154665A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
CA3088722A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
WO2019166257A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions of mefentrifluconazole
WO2019219464A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019224092A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Basf Se Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides
JP2021525774A (ja) 2018-06-04 2021-09-27 バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 除草活性二環式ベンゾイルピラゾール
EP3613736A1 (en) 2018-08-22 2020-02-26 Basf Se Substituted glutarimide derivatives
EP3628158A1 (en) 2018-09-28 2020-04-01 Basf Se Pesticidal mixture comprising a mesoionic compound and a biopesticide
JP7443357B2 (ja) 2018-10-23 2024-03-05 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 三環式の殺有害生物化合物
EP3643705A1 (en) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pesticidal compounds
EP3670501A1 (en) 2018-12-17 2020-06-24 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
HRP20230770T8 (hr) 2019-01-11 2024-01-05 Basf Se Kristalni oblici 1-(1,2-dimetilpropil)-n-etil-5-metil-n-piridazin-4-il-pirazol-4-karboksamida
EP3696177A1 (en) 2019-02-12 2020-08-19 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP3769623A1 (en) 2019-07-22 2021-01-27 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
EP3975718A1 (en) 2019-05-29 2022-04-06 Basf Se Mesoionic imidazolium compounds and derivatives for combating animal pests
WO2020244970A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se New carbocyclic pyridine carboxamides
WO2020244969A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se Pyridine derivatives and their use as fungicides
MX2021014864A (es) 2019-06-06 2022-01-18 Basf Se N-(pirid-3-il)carboxamidas fungicidas.
EP3766879A1 (en) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pesticidal pyrazole derivatives
WO2021063735A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se New bicyclic pyridine derivatives
WO2021063736A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se Bicyclic pyridine derivatives
EP3903582A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ii
CN115443267B (zh) 2020-04-28 2025-09-05 巴斯夫欧洲公司 杀害虫化合物
EP3903584A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iv
EP3903583A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors iii
EP3903581A1 (en) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors i
EP3909950A1 (en) 2020-05-13 2021-11-17 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP3945089A1 (en) 2020-07-31 2022-02-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors v
WO2021249800A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
EP3960727A1 (en) 2020-08-28 2022-03-02 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors vi
EP3939961A1 (en) 2020-07-16 2022-01-19 Basf Se Strobilurin type compounds and their use for combating phytopathogenic fungi
WO2022017836A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol
US20240011043A1 (en) 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
WO2022026563A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Inht31 transgenic soybean
US11214811B1 (en) 2020-07-31 2022-01-04 Inari Agriculture Technology, Inc. INIR6 transgenic maize
EP3970494A1 (en) 2020-09-21 2022-03-23 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors viii
WO2022089969A1 (en) 2020-10-27 2022-05-05 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
WO2022090069A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Compositions comprising mefenpyr-diethyl
WO2022090071A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi
WO2022106304A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
US20240043431A1 (en) 2020-12-14 2024-02-08 Basf Se Sulfoximine Pesticides
EP4043444A1 (en) 2021-02-11 2022-08-17 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
AU2022270888A1 (en) 2021-05-03 2023-11-09 Basf Se Additives for enhancing the pesticidal effectiveness of pesticidal microorganisms
EP4091451A1 (en) 2021-05-17 2022-11-23 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
EP4341257A1 (en) 2021-05-18 2024-03-27 Basf Se New substituted quinolines as fungicides
KR20240008857A (ko) 2021-05-18 2024-01-19 바스프 에스이 살진균제로서의 신규한 치환된 피리딘
JP2024519815A (ja) 2021-05-18 2024-05-21 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 殺菌剤としての新規な置換ピリジン
EP4119547A1 (en) 2021-07-12 2023-01-18 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
MX2024001592A (es) 2021-08-02 2024-02-15 Basf Se (3-quinolil)-quinazolina.
AU2022321882A1 (en) 2021-08-02 2024-02-15 Basf Se (3-pirydyl)-quinazoline
EP4140986A1 (en) 2021-08-23 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4140995A1 (en) 2021-08-27 2023-03-01 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4151631A1 (en) 2021-09-20 2023-03-22 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
WO2023072671A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix
WO2023072670A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x
EP4194453A1 (en) 2021-12-08 2023-06-14 Basf Se Pyrazine compounds for the control of invertebrate pests
EP4198033A1 (en) 2021-12-14 2023-06-21 Basf Se Heterocyclic compounds for the control of invertebrate pests
EP4198023A1 (en) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
US20250197358A1 (en) 2022-02-17 2025-06-19 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
EP4238971A1 (en) 2022-03-02 2023-09-06 Basf Se Substituted isoxazoline derivatives
CA3263381A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se PYRAZOLO PESTICIDE COMPOUNDS
EP4342885A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Basf Se N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amine derivatives and similar compounds as pesticides
EP4361126A1 (en) 2022-10-24 2024-05-01 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xv
EP4619393A1 (en) 2022-11-16 2025-09-24 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
EP4619399A1 (en) 2022-11-16 2025-09-24 Basf Se New substituted tetrahydrobenzoxazepine
WO2024104815A1 (en) 2022-11-16 2024-05-23 Basf Se Substituted benzodiazepines as fungicides
CN120202194A (zh) 2022-11-16 2025-06-24 巴斯夫欧洲公司 作为杀真菌剂的取代的四氢苯并二氮杂䓬
EP4389210A1 (en) 2022-12-21 2024-06-26 Basf Se Heteroaryl compounds for the control of invertebrate pests
WO2024165343A1 (en) 2023-02-08 2024-08-15 Basf Se New substituted quinoline compounds for combatitng phytopathogenic fungi
CN120957986A (zh) 2023-03-17 2025-11-14 巴斯夫欧洲公司 用于对抗植物病原性真菌的取代的吡啶基/吡嗪基二氢苯并硫氮杂䓬化合物
EP4455137A1 (en) 2023-04-24 2024-10-30 Basf Se Pyrimidine compounds for the control of invertebrate pests
EP4702006A1 (en) 2023-04-26 2026-03-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors xvi
EP4467535A1 (en) 2023-05-25 2024-11-27 Basf Se Lactam pesticidal compounds
CN121464139A (zh) 2023-07-05 2026-02-03 巴斯夫欧洲公司 用于对抗植物病原性真菌的取代的喹啉基/喹喔啉基二氢吡咯并三嗪化合物
WO2025008227A1 (en) 2023-07-05 2025-01-09 Basf Se Substituted pyridyl/pyrazinyl dihydropyrrolotriazine compounds for combatting phytopath-ogenic fungi
EP4488270A1 (en) 2023-07-06 2025-01-08 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
EP4488269A1 (en) 2023-07-06 2025-01-08 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
EP4488273A1 (en) 2023-07-06 2025-01-08 Basf Se Triazole compounds for the control of invertebrate pests
WO2025031843A1 (en) 2023-08-09 2025-02-13 Basf Se New substituted benzoxazine picolinonitrile compounds for combatting phytopathogenic fungi
CN121646590A (zh) 2023-08-09 2026-03-10 巴斯夫欧洲公司 用于对抗植物病原性真菌的新型取代的苯并氧氮杂䓬吡啶甲腈化合物
WO2025068226A2 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Basf Se Methods for protecting plants using mixtures comprising sulfur and selected terpenes
WO2025078181A1 (en) 2023-10-09 2025-04-17 Basf Se Fungicidal mixture comprising substituted pyridines
AU2024358155A1 (en) 2023-10-09 2026-04-16 Basf Se Fungicidal mixture comprising substituted quinazolyl quinolines
WO2025131902A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Basf Se Methods for protecting plants using mixtures comprising sulfur, selected terpenes and phosphites.
EP4574819A1 (en) 2023-12-22 2025-06-25 Basf Se Diazinone compounds for the control of invertebrate pests
WO2025180964A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Basf Se New substituted benzoxazepine compounds for combatting phytopathogenic fungi
WO2025211272A1 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Nihon Nohyaku Co., Ltd. Pesticidal mixtures comprising an ethylsulfone compound
WO2025223904A1 (en) 2024-04-24 2025-10-30 Basf Se Mixtures of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors with at least one further pesticide i
EP4640052A1 (en) 2024-04-24 2025-10-29 Basf Se Mixtures of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors with at least one further pesticide i
WO2026002763A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Basf Se Pesticidal mixtures and applications of beauveria bassiana and dimpropyridaz
WO2026010930A1 (en) 2024-07-05 2026-01-08 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Use of axmi277 for the control of rotylenchulus reniformis nematode pests
WO2026012814A1 (en) 2024-07-10 2026-01-15 Basf Se Compositions and methods to enhance crop yield and plant health
WO2026021909A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Basf Se New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi
WO2026021912A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Basf Se New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi
WO2026021911A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Basf Se New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi
WO2026021910A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Basf Se New substituted benzothiazine pyridine compounds for combatting phytopathogenic fungi
WO2026037853A1 (en) 2024-08-14 2026-02-19 Basf Se Benzoxazole derivatives as pesticidal compounds
WO2026041702A1 (en) 2024-08-21 2026-02-26 Basf Se Benzoxazole derivatives as pesticidal compounds
EP4710766A1 (en) 2024-09-11 2026-03-18 Basf Se Mixtures of ambruticin with at least one further pesticide
WO2026057375A1 (en) 2024-09-11 2026-03-19 Basf Se Mixtures of ambruticin with at least one further pesticide
WO2026082514A1 (en) 2024-10-18 2026-04-23 Basf Se Pesticidal mixtures and applications of dimpropyridaz
WO2026093251A1 (en) 2024-10-28 2026-05-07 Basf Se Pesticidal compounds and uses thereof

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5176995A (en) 1985-03-28 1993-01-05 Hoffmann-La Roche Inc. Detection of viruses by amplification and hybridization
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5658772A (en) 1989-12-22 1997-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of DNA in plant cells
US20030041357A1 (en) 1996-11-07 2003-02-27 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
US6720475B1 (en) 1997-11-18 2004-04-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modified nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
US6818807B2 (en) * 2001-08-06 2004-11-16 Bayer Bioscience N.V. Herbicide tolerant cotton plants having event EE-GH1
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7323556B2 (en) 2004-09-29 2008-01-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Corn event DAS-59122-7 and methods for detection thereof
NZ608188A (en) * 2005-10-28 2014-10-31 Dow Agrosciences Llc Novel herbicide resistance genes
WO2011066384A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Dow Agrosciences Llc Aad-12 event 416, related transgenic soybean lines, and event-specific identification thereof
KR101439568B1 (ko) 2006-08-11 2014-09-12 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 아연 손가락 뉴클레아제-매개 상동 재조합
ES2586210T3 (es) 2006-12-14 2016-10-13 Sangamo Biosciences, Inc. Proteínas de dedo de zinc no canónicas optimizadas
US7622649B2 (en) 2006-12-22 2009-11-24 Bayer Cropscience Lp Cotton variety STX0502RF
CN101680000B (zh) * 2007-06-11 2014-06-11 拜尔作物科学公司 包含优良事件ee-gh6的抗虫棉花植物及其鉴定方法
AR072107A1 (es) * 2008-06-11 2010-08-04 Dow Agrosciences Llc Construcciones para la expresion de genes de tolerancia a herbicidas, plantas relacionadas y combinaciones de caracteres relacionados
CN102458098A (zh) 2009-04-10 2012-05-16 陶氏益农公司 植物snf1相关蛋白激酶基因
US8598413B2 (en) * 2009-08-19 2013-12-03 Dow AgroSciecnes, LLC. AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1
EP2504454B1 (en) * 2009-11-23 2018-11-21 Bayer CropScience NV Elite event ee-gm3 and methods and kits for identifying such event in biological samples
CA2787674C (en) 2010-01-22 2022-09-06 Dow Agrosciences Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
BR102013001764B1 (pt) * 2012-01-23 2022-03-22 Dow Agrosciences Llc Método de detecção do evento de algodão pdab4468.19.10.3 em uma amostra que compreende dna de algodão

Also Published As

Publication number Publication date
CN104797716A (zh) 2015-07-22
EP2806732A1 (en) 2014-12-03
CN104427863B (zh) 2019-06-28
CN104427863A (zh) 2015-03-18
AU2013205620A1 (en) 2013-08-08
HUE052982T2 (hu) 2021-05-28
US20130189681A1 (en) 2013-07-25
WO2013112527A1 (en) 2013-08-01
CN107043780B (zh) 2026-04-17
CN107043816A (zh) 2017-08-15
UY34588A (es) 2013-09-02
CN104797716B (zh) 2017-04-19
BR102013001764A2 (pt) 2015-07-28
BR102013001764B1 (pt) 2022-03-22
EP2806732A4 (en) 2015-10-07
MX349180B (es) 2017-07-17
WO2013112559A1 (en) 2013-08-01
US9605273B2 (en) 2017-03-28
US9353381B2 (en) 2016-05-31
MX348266B (es) 2017-06-05
US20170191076A1 (en) 2017-07-06
AP2014007861A0 (en) 2014-08-31
AU2013205620A8 (en) 2015-03-19
US10501752B2 (en) 2019-12-10
BR102013001773A2 (pt) 2015-09-08
AU2013205611B2 (en) 2015-02-05
EP2806732B1 (en) 2020-09-23
MX2014008932A (es) 2015-03-09
CN107043780A (zh) 2017-08-15
MX2014008938A (es) 2015-06-02
ZA201405436B (en) 2015-12-23
AU2013205620B2 (en) 2015-03-19
US20130212747A1 (en) 2013-08-15
IL233658B (en) 2018-04-30
IL233658A0 (en) 2014-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10501752B2 (en) Herbicide tolerant cotton event pDAB4468.19.10.3
US11987798B2 (en) Transgenic maize event MON 87419 and methods of use thereof
ES2714432T3 (es) Evento de soja 9582.814.19.1 resistente a insectos y tolerante a herbicidas
US20210054398A1 (en) Cotton transgenic event mon 88701 and methods of use thereof
AU2013205611A1 (en) Herbicide tolerant cotton event pDAB4468.19.10.3
US9896718B2 (en) Herbicide tolerant cotton event pDAB4468.18.07.1
MX2014000533A (es) Evento 8264.42.32.1 de tolerancia apilada a los herbicidas, lineas de soya transgenicas relacionadas y su deteccion.
BR122014009174B1 (pt) métodos para identificar um evento elite ee-gh1 em amostras biológicas, para identificar uma planta transgênica, ou células ou tecidos da mesma compreendendo o evento elite, para confirmar pureza de sementes, para avaliar sementes quanto à presença do evento elite, bem como kit para identificar o evento elite
AU2013205601A1 (en) Herbicide tolerant cotton event pDAB4468.18.07.1
BR122019014603B1 (pt) Polinucleotídeos referente ao evento de tolerância a herbicida empilhado 8264.44.06.1
BR112012012511B1 (pt) Polinucleotídeo e métodos de melhoramento de uma planta de soja, para introgredir um traço de tolerância a herbicida em uma planta de soja, para controlar plantas daninhas com dano reduzido ou nenhum dano a uma cultura, para detectar um evento de soja em uma amostra contendo dna de soja, e para controlar plantas daninhas resistentes ao glifosato com dano reduzido ou nenhum dano a uma cultura
BR112012010778B1 (pt) Polinucleotídeos, cassete de expressão, sonda, inserto transgênico, bem como métodos para controle de ervas daninhas, identificação da sequência em uma amostra, determinação da zigosidade de evento de uma planta de soja, produção de uma planta de soja transgênica e produção de uma proteína em uma célula de planta