ES2586210T3 - Proteínas de dedo de zinc no canónicas optimizadas - Google Patents

Abstract

Una proteína de dedo de zinc que comprende un dedo de zinc no canónico (no-C2H2), en donde el dedo de zinc no canónico tiene una parte helicoidal implicada en la unión al ADN y en donde al menos un dedo de zinc comprende la secuencia Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)1-10 (SEQ ID NO:3), donde XA, XB, XC y XD puede ser cualquier aminoácido e His-(XC)3-5-Cys(XD)1-10 comprende una de las secuencias como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO:14-80, 83-87 y 89-92 y adicionalmente en donde la proteína de dedo de zinc se modifica genéticamente para unirse a una secuencia diana.

Description

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Descripción detallada

En la presente memoria se desvelan composiciones que comprenden polipéptidos de unión a dedos de zinc (ZFP) que contienen dedos de zinc no canónicos de formato Cys-Cys-His-Cys como se reivindica. Puesto que la coordinación de zinc proporciona la energía de plegamiento principal para los dedos de zinc, el ajuste de restos de coordinación de zinc proporciona un medio fácil para modificar la estabilidad y la estructura del dedo, que influye sobre una diversidad de características funcionales importantes de las proteínas con dedos de zinc, incluyendo, por ejemplo, la semivida celular, interacciones con otros factores celulares, la especificidad y afinidad de unión del ADN y la orientación relativa de dominios funcionales.

Se ha mostrado que las proteínas con dedos de zinc, que comprenden dedos de zinc no canónicos, tales como los desvelados en las solicitudes de patente de Estados Unidos nos. 20030108880, 20060246567 y 20060246588, se unen al ADN y alteran la transcripción. Sin embargo, cuando se incorporan en nucleasas con dedos de zinc (ZFN, véase, por ejemplo, la solicitud de patente de Estados Unidos publicación N.º 2005/0064474), estas proteínas con dedos de zinc no canónicas previamente descritas pueden presentar, algunas veces, actividad subóptima en la escisión del ADN diana.

En la presente memoria se describen proteínas con dedos de zinc que comprenden uno o más dedos de zinc CCHC como se reivindica, en los que se han alterado secuencias específicas que rodean el par C terminal de los restos que coordinan el zinc. En la presente memoria también se describen proteínas de fusión, por ejemplo, nucleasas con dedos de zinc (ZFN), que comprenden estos de dedos de zinc no canónicos optimizados, en los que las ZFN escinden el ADN diana a tasas comparables a las de la escisión obtenida usando las ZFN que comprenden dedos de zinc (CCHH) canónicos

Como se desvela en la presente memoria, los polipéptidos de fusión pueden potenciar o suprimir la transcripción de un gen y/o escindir una secuencia diana. También se proporcionan polinucleótidos que codifican dedos de zinc no canónicos optimizados y polinucleótidos que codifican proteínas de fusión que comprenden uno o más dedos de zinc no canónicos optimizados. Adicionalmente se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de los polipéptidos de unión a nucleótidos de dedos de zinc descritos en la presente memoria o sus fragmentos funcionales; o una cantidad terapéuticamente eficaz de una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos de unión a nucleótidos de dedos de zinc o sus fragmentos funcionales, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente se proporcionan composiciones agrícolas que comprenden una cantidad eficaz desde el punto de vista agronómico de cualquiera de los polipéptidos de unión a nucleótidos de dedos de zinc descritos en la presente memoria o sus fragmentos funcionales; o una cantidad eficaz desde el punto de vista agronómico de una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos de unión a nucleótidos de dedos de zinc modificados o sus fragmentos funcionales, en combinación con un transportador aceptable desde el punto de vista agrícola. También se proporcionan métodos de exploración para obtener un polipéptido de unión a nucleótidos de dedos de zinc modificados que se unen a una secuencia genómica.

Las secuencias genómicas incluyen las que están presentes en cromosomas, episomas, genomas organulares (por ejemplo, mitocondria, cloroplasto), cromosomas artificiales y cualquier otro tipo de ácido nucleico presente en una célula tal como, por ejemplo, secuencias amplificadas, cromosomas pequeños dobles y los genomas de bacterias y virus endógenos o infecciosos. Las secuencias genómicas pueden ser normales (es decir, de tipo silvestre) o mutantes; las secuencias mutantes pueden comprender, por ejemplo, inserciones, deleciones, sustituciones, translocaciones, reordenamientos y/o mutaciones puntuales. Una secuencia genómica también puede comprender uno de los diversos alelos diferentes.

Generalidades

La práctica de los métodos, así como la preparación y uso de las composiciones desveladas en la presente memoria, emplean, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de la cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados como los que están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican por completo en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y la tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; las series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego;Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman y A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definiciones

Las expresiones "ácido nucleico" "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en conformación lineal o circular, y tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Para los fines de la presente descripción, estas expresiones no deben

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En la materia se conocen técnicas para determinar la identidad de secuencia de ácidos nucleicos y aminoácidos. Típicamente, dichas técnicas incluyen la determinación de la secuencia de nucleótidos del ARNm para un gen y/o la determinación de la secuencia de aminoácidos codificada por la misma, y comparar estas secuencias con una segunda secuencia de nucleótidos o de aminoácidos. También pueden determinarse secuencias genómicas y compararse de esta manera. En general, identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido con nucleótido o de aminoácido con aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos, respectivamente. Dos o más secuencias (de polinucleótidos o de aminoácidos) pueden compararse determinando su porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad de dos secuencias, bien secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas dividido entre la longitud de la secuencias más cortas y multiplicado por 100. Un alineamiento aproximado para las secuencias de ácido nucleico se proporciona en el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo puede aplicarse a secuencias de aminoácidos usando la matriz de puntuación desarrollada por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 supl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., EE.UU., y normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Una implementación ejemplar de este algoritmo para determinar el porcentaje de identidad de una secuencia se proporciona en el grupo Genetics Computer (Madison, WI) en la aplicación de utilidad "BestFit". Los parámetros por defecto para este método se describen en el Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, versión 8 (1995) (disponible en el Grupo Genetics Computer, Madison, WI). Un método ejemplar de establecimiento del porcentaje de identidad en el contexto de la presente descripción es el uso del paquete de programas MPSRCH registrado por la universidad de Edimburgo, desarrollado por F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Para este juego de paquetes puede emplearse el algoritmo de Smith-Waterman en donde se usan parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización de 12 por apertura de hueco, penalización de uno por extensión de hueco y un hueco de seis). A partir de los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la identidad de secuencia. Generalmente, en la técnica se conocen otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias, por ejemplo, otro programa de alineamiento es BLAST, usado con parámetros por defecto. Por ejemplo, pueden usarse BLASTN y BLASTP con los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; valor de corte = 60; esperado =10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificado mediante= PUNTUACIÓN MÁS ALTA; Base de datos = no redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones CDS de GenBank + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas pueden encontrarse en internet. Con respecto a las secuencias descritas en la presente memoria, el intervalo de grados de identidad de secuencia deseados es de aproximadamente del 35 % al 100 % y cualquier valor entero entre ellos. Típicamente el porcentaje de identidad entre las secuencias es una identidad de secuencia de al menos 35 %-40 %; 40 % -45 %; 45 %-50 %; 50 %-60 %; 60 %-70 %; 70 -75 %, preferentemente 80 -82 %, más preferentemente 85 -90 %, incluso más preferentemente 92 %, aún más preferentemente 95 % y lo más preferentemente de 98 %.

Como alternativa, el grado de similitud de secuencia entre polinucleótidos puede determinarse por hibridación de polinucleótidos en condiciones que permitan la formación de dúplex estables entre regiones homólogas, seguido por la digestión con una o más nucleasas específicas de cadena sencilla y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos ácidos nucleicos, o dos secuencias polipeptídicas son sustancialmente homólogas entre sí cuando las secuencias presentan una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70 % -75 %, preferentemente 80 % -82 %, más preferentemente 85 %-90 %, incluso más preferentemente 92 %, aún más preferentemente 95 % y lo más preferentemente 98 %, sobre una longitud definida de las moléculas, determinado usando los métodos anteriores. Como se emplea en la presente memoria, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran una identidad completa con una secuencia de ADN o polipeptídica específica Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden identificarse en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas, tal y como se definen para este sistema particular. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de los conocimientos del experto en técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editores B.D. Hames y S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

La hibridación selectiva de dos fragmentos de ácido nucleico puede determinarse de la siguiente manera. El grado de identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico afecta a la eficiencia y a la fuerza de acontecimientos de hibridación entre dichas moléculas. Una secuencia de ácido nucleico parcialmente idéntica inhibirá al menos parcialmente la hibridación de una secuencia completamente idéntica a una molécula diana. La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente idéntica puede evaluarse usando ensayos de hibridación que son muy conocidos en la técnica (por ejemplo, transferencia (de ADN) de Southern, transferencia (de ARN) de Northern, hibridación en solución, o similares véase Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.). Dichos ensayos pueden realizarse usando diversos grados de selectividad, por ejemplo, usando condiciones que varían de una baja a una alta rigurosidad. Si se emplean condiciones de baja rigurosidad, la ausencia de unión inespecífica puede evaluarse usando una sonda secundaria que carece incluso de un grado parcial de identidad de secuencia (por ejemplo, una sonda que tenga una identidad de secuencia de menos de aproximadamente el 30 % con la molécula diana), de tal manera que, en ausencia de acontecimientos de unión inespecífica, la sonda secundaria no se hibridará con la diana.

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Cuando se utiliza un sistema de detección basado en hibridación, se selecciona una sonda de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico de referencia y después por selección de condiciones apropiadas, la sonda y la secuencia de referencia se hibridan, o se unen, selectivamente entre sí para formar una molécula bicatenaria. Una molécula de ácido nucleico que es capaz de hibridarse selectivamente con una secuencia de referencia en condiciones de hibridación moderadamente rigurosas se hibrida típicamente en condiciones que permiten la detección de una secuencia de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de longitud que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 70% con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionado. Típicamente, las condiciones de hibridación rigurosas permiten la detección de secuencias de ácido nucleico diana de al menos aproximadamente 10-14 nucleótidos de longitud que tiene una identidad de secuencia de más de aproximadamente 90 -95 % con la secuencia de la sonda de ácido nucleico seleccionada. Las condiciones de hibridación útiles para la hibridación de la secuencias de la sonda/referencia, en donde la sonda y la secuencia de referencia tienen un grado específico de identidad de secuencia, pueden determinarse como se sabe en la técnica (véase, por ejemplo, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editores B.D. Hames y S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

Los expertos en la técnica conocen bien las condiciones de hibridación. La rigurosidad de la hibridación se refiere al grado al cual las condiciones de hibridación no favorecen la formación híbridos que contienen nucleótidos mal emparejados, correlacionándose una rigurosidad elevada con una menor tolerancia para los híbridos con emparejamiento erróneo. Los factores que afectan a la rigurosidad de la hibridación son muy conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, temperatura, pH, fuerza iónica y la concentración de disolventes orgánicos tales como, por ejemplo, formamida y dimetilsulfóxido. Como saben los expertos en la técnica, la rigurosidad de la hibridación aumenta a temperaturas más altas, a una fuerza iónica más baja y a concentraciones de disolvente más bajas.

Con respecto a las condiciones rigurosas para la hibridación, es bien conocido en la técnica que puedan emplearse numerosas condiciones equivalentes para establecer una rigurosidad particular modificando, por ejemplo, los siguientes factores: la longitud y la naturaleza de las secuencias, la composición de las bases de las diferentes secuencias, la concentración de las sales y de otros componentes de la solución de hibridación, la presencia o ausencia de agentes bloqueantes en las soluciones de hibridación (por ejemplo, sulfato de dextrano y polietilenglicol), la temperatura de la reacción de hibridación y los parámetros del tiempo, así como diferentes condiciones de lavado. La selección de un conjunto particular de condiciones de hibridación se selecciona siguiendo los métodos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y).

"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Para los propósitos de la presente descripción "recombinación homóloga (RH)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en las células. Este proceso requiere homología entre las secuencias de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" para reparar el molde de una molécula "diana" (es decir, la que sufrió la rotura bicatenaria), y se conoce con nombres tales como "conversion génicas sin retrocruzamiento" o "conversión génica de un segmento corto", porque conduce a la transferencia de información genética desde el donante a la diana. Sin desear limitarse a ninguna teoría particular, dicha transferencia puede implicar la corrección de los emparejamientos erróneos del ADN heteroduplex que forman entre la diana rota y el donante y/o la "hibridación de cadena dependiente de la síntesis", en donde el donante se usa para volver a sintetizar la información genética que formará parte de la diana, y/o los procesos relacionados. Dicha RH especializada a menudo da lugar a una alteración de la secuencia de la molécula diana de tal manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido diana.

"Escisión" se refiere a la rotura del esqueleto covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una serie de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiester. Es posible la escisión tanto monocatenaria como bicatenaria, y la escisión bicatenaria puede producirse como resultado de dos acontecimientos de escisión distintos monocatenarios. La escisión del ADN puede dar lugar a la producción de extremos romos o de extremos cohesivos. En determinadas realizaciones, se usan polipéptidos de fusión para la escisión del ADN bicatenario diana.

Un "dominio de escisión" comprende una o más secuencias polipeptídicas que poseen actividad catalítica para la escisión del ADN. Un dominio de escisión puede estar incluido en una sola cadena polipeptídica o la actividad de escisión puede resultar de la asociación de dos (o más) polipéptidos.

Un "semidominio de escisión" es una secuencia polipeptídica que, junto con un segundo polipéptido (idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (por ejemplo, actividad de escisión bicatenaria).

Las expresiones "dominio de escisión" y "semidominio de escisión" incluyen dominios de tipo silvestre y partes o mutantes de dominios de escisión o semidominios de escisión que conservan la capacidad de multimerizar (por ejemplo, dimerizar) para formar un dominio de escisión funcional.

"Cromatina" es la estructura nucleoproteica que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteínas, que incluyen las proteínas cromosómicas histónicas y no

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histónicas. La mayor parte de la cromatina celular eucariota existe en forma nucleosomas, en donde un núcleo del nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados a un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN enlazador (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre los núcleos del nucleosoma. Una molécula de histona H1 se asocia generalmente al ADN enlazador. Para los fines de la presente descripción, el término "cromatina" significa que incluye todos los tipos de nucleoproteínas celulares, tanto procariotas como eucariotas. La cromatina celular incluye cromatina cromosómica y la episómica.

Un "cromosoma" es un complejo de cromatina que comprende toda o una parte del genoma de una célula. El genoma de una célula se caracteriza a menudo por su cariotipo, que es el conjunto de todos los cromosomas que comprende el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, un complejo de nucleoproteína u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no forma parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y determinados genomas víricos.

Una "región accesible" es un sitio en la cromatina celular al cual puede unirse un sitio diana presente en el ácido nucleico mediante una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin desear ligarse a ninguna teoría particular, se piensa que una región accesible es una que no está empaquetada en una estructura nucleosómica. La estructura distinta de una región accesible a menudo puede detectarse por su sensibilidad a sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas.

Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia de ácido nucleico que define una parte de un ácido nucleico al cual se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para que se produzca la unión. Por ejemplo, la secuencia 5'-GAATTC-3' es un sitio diana para la endonucleasa de restricción Eco RI.

Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que puede introducirse en una célula mediante uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. "La presencia normal en la célula" se determina con respecto a la fase de desarrollo y a las condiciones ambientales particulares de la célula. Por tanto, por ejemplo, una molécula que solo está presente durante el desarrollo embrionario de músculo es una molécula exógena, con respecto a una célula de músculo adulto. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula que no ha experimentado choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena no funcional o una versión no funcional de una molécula endógena normalmente funcional.

Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, tal como generada mediante un proceso químico combinatorio, o una macromolécula tal como una proteína, un ácido nucleico, un hidrato de carbono, un lípido, una glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser mono o bicatenarios; lineales, ramificados o circulares y pueden tener cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los que pueden formar dúplex, así como los ácidos nucleicos que forman triplex. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de unión a ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión a ADN metilado, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína exógena o un ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma de infección vírico, una cadena T de Agrobacterium tumefaciens, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que no está normalmente presente en la célula. Sin embargo, los ácidos nucleicos o polinucleótidos exógenos, pueden contener secuencias que son homólogas o idénticas a secuencias endógenas. Con respecto a una región genómica endógena particular, una "secuencia exógena" se refiere a una secuencia de nucleótidos que no está presente en esa región. Dicha secuencia exógena puede estar presente en otra localización cromosómica endógena o puede no estar presente en todo el genoma. Por tanto, un polinucleótido exógeno puede contener secuencias tanto exógenas como endógenas: por ejemplo, un transgén flanqueado por secuencias homólogas a una región genómica. Dichos ácidos nucleicos exógenos se usan en métodos de integración y recombinación dirigida como se describe más adelante. Los expertos en la técnica conocen métodos de introducción de moléculas exógenas en células e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores de virus.

Por otro lado, una molécula "endógena" es una que está normalmente presente en una célula particular en una fase de desarrollo particular en condiciones ambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico de origen natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

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Las secuencias parciales de aminoácidos (incluyendo y C terminal al 3er resto de coordinación de zinc) de dedos de zinc no canónicos ejemplares se muestran en las tablas 1, 2, 3 y 4. La materia objeto de la invención se refiere solo a los dedos de zinc definidos en las reivindicaciones. En todas las tablas, los dos restos de coordinación de zinc (H y C) más C-terminales (es decir, el tercero y el cuarto) están subrayados. Las alteraciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones, deleciones) en comparación con la secuencia del dedo no canónico de "tipo silvestre" (fila 2 de las tablas 1 y 3) se muestran con doble subrayado.

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que comprende tres subsitios de 4 nucleótidos solapantes.

La selección de una secuencia en la cromatina celular para la unión mediante un dominio de dedo de zinc (por ejemplo, un sitio diana) puede realizarse, por ejemplo, de acuerdo con los métodos desvelados en la patente de Estados Unidos n.º 6.453.242 (17 de septiembre, 2002) de mismo propietario que la presente, que también desvela métodos para el diseño de ZFP que se unen a una secuencia seleccionada. Será obvio para los expertos en la técnica, que para la selección de un sitio diana también pueda usarse inspección visual simple de una secuencia de nucleótidos. Por consiguiente, en los métodos descritos en la presente memoria puede usarse cualquier medio para la selección del sitio diana.

Las proteínas de dedo de zinc de múltiples dedos pueden construirse uniendo dedos de zinc individuales obtenidos, por ejemplo, por diseño o selección. Como alternativa, los módulos de unión que constan de dos dedos de zinc pueden unirse entre sí, usando o enlazadores inter-dedo canónicos o canónicos, más largos (véase anteriormente) para generar proteínas con cuatro y seis dedos de zinc. Dichos dos módulos de dos dedos pueden obtenerse, por ejemplo, seleccionando dos dedos adyacentes, que se unen a una secuencia diana particular de seis nucleótidos, en el contexto de una proteína de múltiples dedos (generalmente de tres dedos). Véase, por ejemplo, el documento WO 98/53057 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.º 2003/0119023.

Como alternativa, pueden construirse módulos de dos dedos por ensamblaje de dedos de zinc individuales.

Por tanto, los dominios de dedos de zinc descritos en la presente memoria pueden usarse individualmente o en diversas combinaciones para construir proteínas de dedo de zinc de múltiples dedos que se unan a cualquier sitio diana.

La distancia entre secuencias (por ejemplo, sitios de diana) se refiere al número de nucleótidos o pares de nucleótidos que intervienen entre dos secuencias, medido a partir de los bordes de las secuencias más próximas entre sí.

En realizaciones que utilizan ZFN, por ejemplo, en las que la escisión depende de la unión de dos moléculas de fusión de dominio de dos dedos de zinc/semidominio de escisión para separar sitios diana, los dos sitios diana pueden estar en cadenas de ADN opuestas. En otras realizaciones, ambos sitios diana están en la misma cadena de ADN. Véase, por ejemplo, el documento WO 2005/084190.

Los polinucleótidos que codifican dedos de zinc o proteínas de dedos de zinc también están dentro del alcance de la presente descripción. Estos polinucleótidos pueden construirse usando técnicas convencionales e insertarse en un vector, y el vector puede introducirse en una célula (véase más adelante para una descripción adicional con respecto a vectores y a métodos para la introducción de polinucleótidos en células) de tal manera que la proteína codificada se expresa en la célula.

Proteínas de fusión

También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden uno o más componentes de dedos de zinc no canónicos.

Las moléculas de fusión se construyen mediante métodos bioquímicos de clonación y conjugación, que son muy conocidos por los expertos en la técnica. Las moléculas de fusión comprenden una ZFP que contiene CCHC y, por ejemplo, un dominio de escisión, un semidominio de escisión, un dominio de activación transcripcional, un dominio de represión transcripcional, un componente de un complejo de remodelación de la cromatina, un dominio aislante, un fragmento funcional de cualquiera de estos dominios; y/o cualquiera de las combinaciones de dos o más dominios funcionales o sus fragmentos.

En determinadas realizaciones, las moléculas de fusión comprenden una proteína de dedo de zinc de plantas modificada y al menos dos dominios funcionales (por ejemplo, un dominio aislante o un dominio de proteína de unión a metilo y, adicionalmente, un dominio de activación o de represión transcripcional).

Las moléculas de fusión también comprenden opcionalmente una señal de localización nuclear (tal como, por ejemplo, la del antígeno T del SV40 o la SLN (señal de localización nuclear) de maíz Opaco-2) y una etiqueta epitópica (tal como, por ejemplo, FLAG o hemaglutinina). Las proteínas de fusión (y los ácidos nucleicos que las codifican) se diseñan de tal manera que la fase de lectura traduccional está conservada entre los componentes de la fusión.

Los expertos en la técnica conocen métodos para diseñar y construir proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican). Por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 6.453.242 y 6.534.261 de propiedad conjunta, se describen métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión que comprenden proteínas de dedos de zinc (y los polinucleótidos que las codifican).

Los polipéptidos que codifican dichas proteínas de fusión también están dentro del alcance de la presente descripción. Estos polinucleótidos pueden construirse usando técnicas convencionales e insertarse en un vector y el

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de escisión se incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas de asentamiento (homing). Véase, por ejemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Se conocen otras enzimas que escinden ADN (por ejemplo, la nucleasa S1; la nucleasa de judía mungo; la DNasa pancreática I; la nucleasa microcócica; la endonucleasa HO de levadura; véase también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Una o más de estas enzimas (o sus fragmentos funcionales) pueden usarse como una fuente de dominios y semidominios de escisión.

De manera similar, un semidominio de escisión puede proceder de cualquier nucleasa, o de parte de la misma, como se expone anteriormente, siempre que el semidominio de escisión requiera dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión dirigida de ADN genómico si las proteínas de fusión comprenden semidominios de escisión. Como alternativa, puede usarse una sola proteína que comprenda dos semidominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden proceder de la misma endonucleasa, o cada semidominio de escisión puede proceder de una endonucleasa diferente. Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión se disponen, uno con respecto al otro, de tal manera que la unión de las dos proteínas de fusión con sus sitios diana respectivos coloca el semidominio de escisión en una orientación espacial entre sí, lo que permite que los semidominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, por ejemplo, por dimerización. Por tanto, en determinadas realizaciones, los extremos cercanos de los sitios diana se separan por 5-8 pares de nucleótidos o por 15-18 pares de nucleótidos. En realizaciones adicionales, los sitios diana están a una distancia de diez pares de nucleótidos entre sí. Sin embargo, puede intervenir cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos entre dos sitios diana (por ejemplo, de 2 a 50 nucleótidos o más). En general, el punto de escisión se encuentra entre los sitios diana.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y tienen la capacidad de unirse de manera específica de secuencia al ADN (en un sitio de reconocimiento), y escindir el ADN en el sitio de unión o cerca del mismo. Determinadas enzimas de restricción (por ejemplo, de tipo IIS) escinden el ADN en sitios retirados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de escisión y unión separables. Por ejemplo, la enzima Fok I de tipo IIS cataliza la escisión de ADN bicatenario, a 9 nucleótidos desde su sitio de reconocimiento en una cadena y a 13 nucleótidos desde su sitio de reconocimiento en la otra. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:42754279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982. Por tanto, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semidominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno más dominios de unión de dedo de zinc, que pueden o no modificarse por ingeniería genética.

Fok I es un ejemplo de una enzima de restricción de tipo IIS, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570

10.575. Por consiguiente, para los propósitos de la presente descripción, la parte de la enzima Fok I usada en las proteínas de fusión desveladas se considera un semidominio de escisión. Por tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o el reemplazo dirigido de secuencias celulares usando ZFN que comprenden fusiones de dedo de zincFok-I, pueden usarse dos proteínas de fusión, comprendiendo cada una de ellas un semidominio de escisión Fok I, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Como alternativa, también puede usarse una sola molécula polipeptídica que contenga un dominio de unión de dedo de zinc y dos semidominios de escisión Fok I. Los parámetros para la escisión dirigida y la alteración de secuencias dirigida usando fusiones de dedo de zinc-Fok I se proporcionan en cualquier parte en esta descripción y, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.º 2005/0064474.

En realizaciones adicionales, un semidominio de escisión de Fok I puede incluir una o más mutaciones en cualquier resto de aminoácido que afecte a la dimerización. Dichas mutaciones pueden ser útiles para impedir una de un par de fusiones ZFP/FokI a partir de sometimiento a homodimerización que puede conducir a la escisión en secuencias no deseadas. Por ejemplo, todos los restos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de Fok I están suficientemente cerca de la interfaz de dimerización para influir en la dimerización. Por consiguiente, las alteraciones en las secuencias de aminoácidos en una o más de las posiciones anteriormente mencionadas pueden usarse para alterar las propiedades de dimerización del semidominio de escisión. Dichos cambios pueden introducirse, por ejemplo, construyendo una biblioteca que contenga (o que codifique) diferentes restos de aminoácidos en estas posiciones y seleccionando variantes con las propiedades deseadas, o diseñando racionalmente mutantes individuales. Además de impedir la homodimerización, también es posible que algunas de estas mutaciones puedan aumentar la eficiencia de la escisión, en comparación con la obtenida con dos semidominios de escisión de tipo silvestre.

Por lo tanto, para la escisión dirigida usando un par de fusiones ZFP/Fok I, una o las dos proteínas de fusión pueden comprender una o más alteraciones de aminoácidos que inhiben la autodimerización, pero permiten que se produzca la heterodimerización de las dos proteínas de fusión de tal manera que ocurra la escisión en el sitio diana deseado. En determinadas realizaciones, las alteraciones están presentes en ambas proteínas de fusión y las alteraciones tienen efectos aditivos; es decir, homodimerización de cualquier fusión, que conduce a una escisión aberrante, se minimiza o anula, mientras que la heterodimerización de las dos proteínas de fusión se facilita en comparación con la obtenida con semidominios de escisión de tipo silvestre.

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En determinadas realizaciones, el dominio de escisión comprende dos semidominios de escisión, ambos de los cuales son parte de un solo polipéptido que comprende un dominio de unión, un primer semidominio de escisión y un segundo semidominio de escisión. Los semidominios de escisión pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o secuencias de aminoácidos diferentes, siempre que actúen escindiendo el ADN.

Los semidominios de escisión también pueden proporcionarse en moléculas distintas. Por ejemplo, dos polipéptidos de fusión pueden expresarse en una célula, en donde cada polipéptido comprende un dominio de unión y un semidominio de escisión. Los semidominios de escisión pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o secuencias de aminoácidos diferentes, siempre que actúen escindiendo el ADN. Adicionalmente, los dominios de unión se unen a secuencias diana que están típicamente dispuestas de tal manera que, después de la unión de los polipéptidos de fusión, los dos semidominios de escisión se presenten en una orientación espacial entre sí que permita la reconstitución de un dominio de escisión (por ejemplo, por dimerización de los semidominios), colocando de este modo los semidominios uno con respecto al otro para formar un dominio de escisión funcional, dando como resultado la escisión de la cromatina celular en una región de interés. Generalmente, la escisión mediante el dominio de escisión reconstituido se produce en un sitio localizado entre las dos secuencias diana. Una o las dos proteínas pueden modificarse por ingeniería genética para unirse a su sitio diana.

La expresión de dos proteínas de fusión en una célula puede producirse suministrando a la célula las dos proteínas; suministrando a la célula una proteína y un ácido nucleico que codifique una de las proteínas; suministrando a la célula dos ácidos nucleicos, codificando cada uno de ellos una de las proteínas; suministrando a la célula un solo ácido nucleico, que codifique ambas proteínas. En realizaciones adicionales, una proteína de fusión comprende una sola cadena polipeptídica que comprende dos semidominios de escisión y un dominio de unión de dedo de zinc. En este caso, una sola proteína de fusión se expresa en una célula, y sin desear quedar ligado a la teoría, se piensa que el ADN se escinde como resultado de la formación de un dímero intramolecular de los semidominios de escisión.

En determinadas realizaciones, los componentes de una ZFN se disponen de tal manera que el dominio de dedo de zinc esté más cerca del extremo amino de la proteína de fusión, y el semidominio de escisión esté más cerca del extremo carboxilo. Esto refleja la orientación relativa del dominio de escisión en dominios de escisión de dimerización de origen natural tales como los procedentes de la enzima Fok I, en donde el dominio de unión al ADN está más cerca del extremo amino y el semidominio de escisión está más cerca del extremo carboxilo. En estas realizaciones, la dimerización de los semidominios de escisión para formar una nucleasa funcional se lleva a cabo uniendo las proteínas de fusión en sitios sobre cadenas de ADN opuestas, estando los extremos 5' de los sitios de unión próximos entre sí.

En esta orientación, el dedo de zinc más C terminal es proximal al semidominio de escisión de Fok I. Previamente se ha determinado que las proteínas de dedo de zinc no canónicas se unen a sus dianas de ADN de un modo más eficaz cuando está presente un dedo de zinc de tipo CCHC como el dedo más C terminal. Por lo tanto, es posible que la presencia de dedos de zinc de tipo CCHC previamente descritos cerca del semidominio de escisión de Fok I inhiba su función. Si este fuera el caso, los dedos de zinc CCHC optimizados, descrito hasta ahora, aparentemente no exhiben esta actividad inhibidora teórica.

En realizaciones adicionales, los componentes de las proteínas de fusión (por ejemplo, fusiones ZFP-Fok I) se disponen de tal manera que el semidominio de escisión está más cerca del extremo amino de la proteína de fusión, y el dominio de dedo de zinc está más cerca del extremo carboxilo. En estas realizaciones, la dimerización de los semidominios de escisión para formar una nucleasa funcional se lleva a cabo uniendo las proteínas de fusión en sitios en cadenas de ADN opuestas, estando los extremos 3' de los sitios de unión próximos entre sí.

En otras realizaciones adicionales, una primera proteína de fusión contiene el semidominio de escisión más cerca del extremo amino de la proteína de fusión, y el dominio de dedo de zinc más cerca del extremo carboxilo, y una segunda proteína de fusión se dispone de tal manera que el dominio de dedo de zinc esté más cerca del extremo amino de la proteína de fusión, y el semidominio de escisión esté más cerca del extremo carboxilo. En estas realizaciones, ambas proteínas de fusión se unen a la misma cadena de ADN, conteniendo el sitio de unión de la primera proteína de fusión el dominio de dedo de zinc más cerca del extremo carboxilo localizado en el lado 5' del sitio de unión de la segunda proteína de fusión que contiene el dominio de dedo de zinc más cerca del extremo amino. Véase también el documento WO 2005/084190; cuya descripción se incorpora por referencia.

La secuencia de aminoácidos entre el dominio de dedo de zinc y el dominio de escisión (o semidominio de escisión) se indica como "enlazador ZC". El enlazador ZC es para diferenciarse de los enlaces inter-dedo anteriormente mencionados. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 20050064474A1 y 20030232410 y la publicación de patente internacional WO 2005/084190, para detalles acerca de la obtención de enlazadores ZC que optimiza la escisión.

Vectores de expresión

Un ácido nucleico que codifica una o más ZFP o proteínas de fusión ZFP (por ejemplo, ZFN) puede clonarse en un vector para la transformación en células procariotas o eucariotas para la replicación y/o expresión. Los vectores

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D. Análisis de secuencia

Análisis previos del gen IPP2-K en cultivo de células 5XH751 endogámicas y HiII de maíz, habían indicado la presencia de 2-3 genes distintos que comprendían una familia de genes pequeña (Sun et al., in press, Plant Physiology; documento WO2006029296). Por lo tanto, los fragmentos clonados aislados se secuenciaron con el kit

5 de secuenciación CEQ Dye Terminator Cycle de Beckman Coulter (Fullerton, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. En análisis de secuencia de clones múltiples reveló que 2 fragmentos génicos distintos, procedentes de 2 locus distintos y previamente caracterizados del genoma del maíz, se habían aislado de células HiII.

La comparación de las 2 secuencias aisladas de células HiII cultivas indicó que, en las regiones codificantes previstas, existían pequeñas diferencias, tales como polimorfismos mononucleotídicos (SNP, acrónimo de las siglas 10 inglesas single nucleotide polymorphisms) entre los 2 parálogos, mientras que las regiones intrónicas y no codificantes variaban significativamente a nivel nucleotídico. Estas diferencias entre los 2 parálogos se observó porque presentaban regiones de secuencia que podían discriminarse mediante una proteína de unión a ADN dependiente de secuencia, tal como un dominio con dedos de zinc. Un experto en la técnica puede diseñar dominios de unión a ADN con dedos de zinc que se unen a una secuencia génica y no a otra secuencia génica muy

15 similar. La secuencia génica parcial de 1,2 kb que corresponde al parálogo de interés (FIG. 66) se seleccionó como molde para el diseño de una proteína nucleasa con dedos de zinc y posteriormente se sometió a análisis de dominio de unión a ADN con dedos zinc descrito anteriormente.

Ejemplo 14: Diseño de dominios de unión a ADN con dedos de zinc de IPP2-K

Usando sitios diana identificados para IPP2-K, se seleccionaron hélices de reconocimiento para dedos de zinc de 20 IPP2-K. Los diseños de dedos de zinc se muestran a continuación en la tabla 8:

Tabla 8: Diseños de dedos de zinc de IPP2-K

Nombre de ZFN

D1 D2 D3 D4 D5 D6

IPP2-K1072a1

DRSALSR (SEQ ID NO:105) RNDDRKK (SEQ NO:106) ID RSDNLST (SEQ ID NO:107) HSHARIK (SEQ NO:108) ID RSDVLSE (SEQ ID NO:109) QSGNLAR (SEQ ID NO:110)

IPP2-K1072b1

DRSALSR (SEQ ID NO:105) RNDDRKK (SEQ NO:106) ID RSDNLAR (SEQ ID NO:111) TSGSLTR (SEQ NO:112) ID RSDVLSE (SEQ ID NO: 109) QSGNLAR (SEQ ID NO:110)

IPP2-K1072c11

DRSALSR (SEQ ID NO: 105) RNDDRKK (SEQ NO:106) ID TSGNLTR (SEQ ID NO:113) TSGSLTR (SEQ NO:112) ID RSDVLSE (SEQ ID NO:109) QSGNLAR (SEQID NO:110)

IPP2-Kr1065a1

RSDHLSE (SEQ ID NO:114) QSATRKK (SEQ NO:115) ID ERGTLAR (SEQ ID NO:116) RSDALTQ (SEQ NO:117) ID NINGUNO NINGUNO

IPP2-Kr1149a2

RSDSLSA (SEQ ID NO: 118) RSAALAR (SEQ NO:119) ID RSDNLSE (SEQ ID NO: 120) ASKTRTN (SEQ NO:121) ID DRSHLAR (SEQ ID NO:122) NINGUNO

IPP2-K1156a2

RSDHLST (SEQ ID NO:123) QSGSLTR (SEQ NO:124) ID RSDHLSE (SEQ ID NO:114) QNHHRIN (SEQ NO:125) ID TGSNLTR (SEQ ID NO:126) DRSALAR (SEQ ID NO:127)

Los sitios diana de los diseños de dedos de zinc se muestran a continuación en la tabla 9: Tabla 9: Sitios diana de dedos de zinc de IPP2-K

Nombre de ZFN

Sitio diana (5' a 3')

IPP2-K-1072a1

GAACTGGTTGAGTCGGTC (SEQ ID NO:128)

IPP2-K-1072b1

GAACTGGTTGAGTCGGTC (SEQ ID NO:129)

IPP2-K-1072c1

GAACTGGTTGAGTCGGTC (SEQ ID NO:129)

IPP2-K-r1065a1

ATGGCCCCACAG (SEQ ID NO: 130)

IPP2-K-r1149a2

GGCACCCAGGTGTTG (SEQ ID NO: 131)

IPP2-K-1156a2

GTCGATGGTGGGGTATGG (SEQ ID NO:132)

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Claims (1)

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