ES2839089T3

ES2839089T3 - Linfocitos citolíticos naturales modificados y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2839089T3
Application number: ES15792972T
Authority: ES
Inventors: Dario Campana; David Shook; Masaru Imamura
Original assignee: National University of Singapore; St Jude Childrens Research Hospital
Current assignee: National University of Singapore; St Jude Childrens Research Hospital
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2015-05-14
Publication date: 2021-07-05
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: KR20210014210A; CA2948462A1; US20190376037A1; KR20240123416A; US10774311B2; US20250320457A1; KR102211120B1; EP3143134B1; EP3805371A1; US20200407686A1; JP2022184852A; AU2023214279A1; US12264335B2; KR20170000388A; CN106459914A; PT3143134T; JP2024045158A; JP7421194B2; US20230220343A1; CN106459914B

Abstract

Un linfocito citolítico natural (NK) que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15), en donde: la totalidad o una porción funcional de la IL-15 se fusiona con la totalidad o una porción de una proteína transmembrana, en donde la IL-15, o porción funcional de la misma, se expresa como un polipéptido unido a la membrana (mblL-15) por la célula NK, en donde la totalidad o una porción de la proteína transmembrana se selecciona de CD8α, CD4, CD3ε, CD3γ, CD3δ, CD3ζ, CD28 y CD137; en donde la célula NK que expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15 muestra una supervivencia y expansión potenciadas en ausencia de IL-2, es capaz de regular la activación y proliferación de células NK y linfocitos T y/o de apoyar el desarrollo de células NK a partir de células madre hematopoyéticas en comparación con una célula NK que no expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15.

Description

DESCRIPCIÓN

Linfocitos citolíticos naturales modificados y usos de los mismos

Antecedentes de la invención

La supervivencia y proliferación de las células NK in vivo requiere estimulación por citocinas, tales como IL-2 e IL-15. Por ejemplo, después de la inyección en ratones inmunodeficientes, las células NK activadas se volvieron indetectables después de 1 semana, pero persistieron hasta un mes si también se administraba IL-2 humana. Por lo tanto, los protocolos clínicos que utilizan infusiones de células NK normalmente dependen de la administración de IL-2 para prolongar la supervivencia de las células NK en los pacientes. Sin embargo, IL-2 puede tener efectos secundarios considerables. Además de fiebre y escalofríos, la administración de IL-2 puede tener consecuencias más graves y potencialmente mortales, tal como el síndrome de extravasación capilar. La disminución de la dosis de IL-2 debería reducir el riesgo de efectos secundarios, pero puede dar como resultado la estimulación de los linfocitos T reguladores que pueden inhibir la función de las células NK y posiblemente anular su efecto anticanceroso.

Por lo tanto, sería importante desarrollar formas alternativas de promover la expansión y actividad de las células NK in vitro y/o in vivo.

Shook et al. (2011), Tissue Antigens 78 (6): 409-415 analiza la modificación por ingeniería de linfocitos citolíticos naturales para la terapia celular del cáncer. El documento US 2013/266551 describe una construcción que consiste en un péptido maduro de IL-15 humano fusionado al péptido señal y al dominio transmembrana de CD8a humano para expresar IL-15 unida a la membrana. El documento US 2006/0093605 se refiere a métodos para activar y expandir preferentemente células NK, métodos que utilizan los efectos estimulantes de IL-15 y el ligando de CD27 para expandir y activar preferentemente células NK en un cultivo mixto que comprende células NK. El documento US 2012/040323 describe moléculas de fusión solubles de IL-15 multiméricas y métodos para preparar y usar las mismas.

Sumario de la invención

La presente invención es como se establece en las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención proporciona lo siguiente:

[1] Un linfocito citolítico natural (NK) que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15), en donde:

la totalidad o una porción funcional de la IL-15 se fusiona con la totalidad o una porción de una proteína transmembrana, en donde la IL-15, o porción funcional de la misma, se expresa como un polipéptido unido a la membrana (mblL-15) por la célula NK,

en donde la totalidad o una porción de la proteína transmembrana se selecciona de CD8a, CD4, CD3e, CD3y, CD36, CD3Z, CD28 y CD137;

en donde la célula NK que expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15 muestra una supervivencia y expansión potenciadas en ausencia de IL-2, es capaz de regular la activación y proliferación de células NK y linfocitos T y/o de apoyar el desarrollo de células NK a partir de células madre hematopoyéticas en comparación con una célula NK que no expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15.

[2] La célula NK de [1] en donde la proteína transmembrana comprende un dominio transmembrana de CD8a.

[3 ] Una célula NK de [1] o [2], en donde la totalidad o una porción funcional de IL-15 se fusiona con un péptido señal de CD8a y un dominio transmembrana de CD8a.

[4] Una célula NK de una cualquiera de [1], [2 o 3], en donde la IL-15, o porción funcional de la misma, es la variante 3 del transcrito de IL-15 de mamíferos o una porción funcional de la misma.

[5] Una célula NK de una cualquiera de [2]-[4], en donde el dominio transmembrana de CD8a está codificado por un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o en donde la IL-15 secretada está codificada por un ácido nucleico que comprende un péptido señal de CD8a.

[6] Un método para producir una célula NK de una cualquiera de [1] a [5], comprendiendo el método:

a) introducir el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 fusionada a la totalidad o a una porción de una proteína transmembrana en la célula NK, en donde la totalidad o una porción de la proteína transmembrana se selecciona de CD8a, CD4, CD3e, CD3y, CD35, CD3Z, CD28 y CD137; y b) mantener la célula NK en condiciones en las que se expresa la totalidad o una porción funcional de la IL-15,

produciendo así una célula NK que expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15.

[7] El método de [6] en donde el ácido nucleico se introduce en la célula NK mediante la transducción de la célula NK con un vector.

[8] El método de [7] en donde el vector es un vector vírico, preferentemente un vector retrovírico.

[9] El método de una cualquiera de [6] a [8], que comprende además poner en contacto las células NK con IL-2.

[10] Un linfocito citolítico natural (NK) que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de [6]-[8].

[11] Una composición que comprende la célula NK de una cualquiera de [1]-[5] o [10].

[12] Una composición de acuerdo con [11], en donde la composición es una composición farmacéutica que además comprende la totalidad o una porción funcional de IL-2.

[13] Una célula NK de acuerdo con una cualquiera de [1] a [5] o una composición de acuerdo con [11] o [12] para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un individuo que lo necesita administrando al individuo la célula NK o la composición.

[14] Una célula NK o composición para su uso de acuerdo con [13] en donde el método de tratamiento también comprende administrar IL-2 al individuo, preferentemente a una dosis baja de aproximadamente 1 millón de UI/m2 o menos.

[15] Una célula NK o composición para su uso de acuerdo con [13] o [14], en donde el método de tratamiento también comprende administrar uno o más anticuerpos dirigidos contra uno o más antígenos tumorales.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1A-1C: Diseño y expresión de construcciones de IL-15. 1A. Representación esquemática de las construcciones de IL-15 de tipo silvestre y unidas a membrana ("wtlL15" y "mblL15") utilizadas en este estudio. 1B. Expresión de IL-15 de la superficie de células NK transducidas con mblL15. las células NK expandidas se transdujeron con wtlL15, mblL15 o con un vector que contenía GFP solo ("Simulada"). Los gráficos de puntos de citometría de flujo ilustran la expresión de GFP e IL-15, detectada por un anticuerpo anti-IL15 (R&D Systems) y un anticuerpo secundario anti-ratón de cabra conjugado con ficoeritrina (Southern Biotechnology Associates). Se muestra el porcentaje de células (> 98 % de células NK CD56+ CD3-) en cada cuadrante. 1C. Secreción de IL-15 por células NK transducidas con wtlL15. las células NK de 3 donantes diferentes se probaron por triplicado. Las barras indican una media de 6 DT de las mediciones de ELISA realizadas en los sobrenadantes recogidos después de 24 y 48 horas de cultivo sin IL-2. No se detectó IL-15 en los sobrenadantes de células transducidas de forma simulada. Fig. 2A-2C: Supervivencia y expansión de células NK que expresan IL-15 in vitro. 2A. Porcentaje de recuperación de células NK en comparación con las células de entrada después de cultivos paralelos de 7 días sin IL-2 para células transducidas de forma simulada y mblL15 de 15 donantes (panel izquierdo) y células transducidos mblL15 o wtlL15 de 9 donantes (panel derecho). Las barras horizontales indican el valor mediano. Se muestran los resultados de las pruebas t pareadas. Los resultados de los cultivos con IL-2 (10 y 100 UI/ml) se muestran en la Fig. S1 complementaria. 2B. Supervivencia y expansión de células NK transducidas de forma simulada y con mblL15 de 6 donantes con dosis bajas de IL-2 (10 UI/ml). 2C. Expansión y supervivencia a largo plazo de células NK de un donante transducido con mblL15, wtlL15 o cultivados con transducciones simuladas sin IL-2 o IL-2 en dosis baja (los resultados con 100 UI/ml de IL2 se muestran en la Fig. 6). Se muestra el porcentaje de recuperación de células NK en los días de cultivo indicados.

Fig. 3A-3C: Supervivencia y expansión de células NK que expresan mb-IL15 in vivo. 3A. Número absoluto de células CD45+ humanas en sangre periférica de ratones inyectados con células NK transducidas de forma simulada o con mblL15 con o sin IL-2 (16 ratones en total) 7 y 11 días después de la infusión (P = 0,004 sin IL-2, P = 0,021 con IL-2 el día 7; P = 0,044 y 0,026 el día 11). 3B. Los gráficos de puntos de citometría de flujo ilustran la presencia de células NK CD45+ GFP+ humanas en sangre periférica de ratones sin (arriba) y con tratamiento con IL-2 (abajo). Se muestran los porcentajes de células CD45+ humanas con o sin expresión de GFP. 3C. Porcentaje de células CD45+ humanas en diversos tejidos de ratones inyectados con células NK transducidas de forma simulada o con mblL15 con o sin IL-2 recogidos 11 días después de la inyección. En conjunto, los porcentajes de células CD45+ humanas fueron significativamente más altos con mblL15 (P < 0,001 sin iL-2, P = 0,002 con IL-2).

Fig. 4A-4C: Propiedades de las células NK que expresan mblL15. 4A. Proporción relativa de células GFP+ antes y después de 7 días de cultivo entre las poblaciones de células NK transducidas con mblL15 o transducidos de forma simulada. Se muestran los resultados con células NK de 13 donantes; P < 0,001 para mblL15, no significativo para simulada. 4B. Características inmunofenotípicas de las células NK transducidas con mblL15. El análisis de marcadores celulares por citometría de flujo se realizó en células NK cultivadas durante 48 horas sin IL-2. Todos los resultados se resumen en la tabla. 4C. Se cultivaron células NK transducidas de forma simulada y con mblL15 durante 48 horas sin IL-2 y los lisados celulares se analizaron mediante micromatriz de anticuerpos Kinex (Kinexus). De 809 anticuerpos antifosfoproteínicos analizados, se muestran aquellos cuyas señales tenían una relación Z> 0,5 y un % de intervalo de error < 100. Las barras indican el cambio de señal porcentual en las células NK que expresan mblL15 en comparación con la intensidad normalizada en las células NK transducidas de forma simulada.

Fig. 5A-5D: Capacidad antitumoral de las células NK que expresan mblL15. 5A. Resultados de los ensayos de citotoxicidad de 24 horas con células NK transducidas con mblL15 y de forma simulada de 9 donantes contra las líneas celulares Nalm-6, U937, K562, Daudi, SK-BR-3 y ES8 en una relación E:T de 1:4 y 1:1 (15 experimentos en cada relación; P < 0,001 para ambos). Los resultados obtenidos con líneas celulares individuales en ensayos de citotoxicidad de 4 horas y 24 horas se muestran en la Fig. 7. 5B. las células NK que expresan mblL15 tienen una mayor liberación de gránulos líticos en presencia de células diana. Porcentaje de células NK CD107a+ después de ensayos de citotoxicidad de 4 horas a E:T de 1:1. Se muestran los resultados con células NK de 3 donantes frente a 2 líneas celulares (P = 0,007). 5C. Las células NK que expresan mblL15 ejercen actividad antitumoral in vivo. Se inyectaron i.p. ratones NOD-SCID-IL2RGnull con 1 x 104 células U937 marcadas con luciferasa. En 3 ratones, no se dio tratamiento ("sin NK"), mientras que 4 ratones recibieron células NK transducidas de forma simulada (1 x 107 i.p.) los días 3 y 7, y otros 4 ratones recibieron células NK transducidas con mblL15 con la misma dosis y programa. Se muestran los resultados de la obtención de imágenes in vivo del crecimiento tumoral (imágenes ventrales). 5D. Comparaciones de supervivencia global de ratones en los diferentes grupos de tratamiento. Los ratones se sacrificaron cuando la bioluminiscencia alcanzó 1 x 1011 fotones/segundo. Se muestran los valores de P para la prueba de rango logarítmico de las 3 curvas y para las comparaciones entre cada una de las 2 curvas. Fig. 6A-6C: Supervivencia y expansión de células NK que expresan IL-15 in vitro. 6A. La expansión de las células NK que expresan mblL15 en ausencia de IL-2 se suprime mediante un anticuerpo neutralizante anti-IL-15. Los símbolos muestran la media (6 DT; n = 3) de la recuperación de células NK durante el cultivo en comparación con las células de entrada en experimentos con células NK transducidas con mblL15. 6B. Porcentaje de recuperación de células NK en comparación con las células de entrada después de cultivos paralelos de 7 días con dosis bajas (10 UI/ml) y altas (100 UI/ml) de IL-2 para células transducidas de forma simulada, con mblL15 y con wtlL15 de 6 donantes. Las barras horizontales indican el valor mediano. Se muestran los resultados de las pruebas t pareadas. 6C. Expansión y supervivencia a largo plazo de células NK de un donante transducido con mblL15 o con wtlL15 y cultivados con 100 UI/ml de IL2. Se muestra el porcentaje de recuperación de células NK en los días de cultivo indicados.

Fig. 7A-7B: Capacidad antitumoral de las células NK que expresan mblL15. Se muestran los resultados de los ensayos de citotoxicidad de 4 horas (7A) y 24 horas (7b ) con células NK transducidas con mblL15 y de forma simulada contra las líneas celulares Nalm-6, U937, K562, Daudi, SK-BR-3 y ES8 con una relación E:T de 1:4, 1:2 y 1:1. Cada símbolo indica una citotoxicidad media de 6 DT en experimentos con células NK de 3 donantes diferentes para U937, K562, ES8 y 2 donantes para Nalm-6, Daudi y SK-BR-3, todos realizados por triplicado (P < 0,001 para todos los experimentos).

Fig. 8A-8C: Capacidad antitumoral de las células NK que expresan mblL15. Se inyectaron i.p. ratones NOD-SCID-IL2RGnull con 1 x 105 células ES8 marcadas con luciferasa. En 7 ratones, no se dio tratamiento ("sin NK"), mientras que 11 ratones recibieron células NK transducidas de forma simulada (1 x 107 i.p.) el día 3 y otros 12 ratones recibieron células NK transducidas con mblL15 con la misma dosis y programa. 8A. Resultados de obtención de imágenes in vivo del crecimiento tumoral. Se muestran imágenes ventrales de los 4 ratones con la señal tumoral más alta en cada grupo. 8B. Resultados de obtención de imágenes in vivo del crecimiento tumoral. Cada símbolo corresponde a una medición de bioluminiscencia (fotón/segundo día relativo 3 mediciones en cada ratón). 8C. Comparaciones de supervivencia global de ratones en los diferentes grupos de tratamiento. Los ratones se sacrificaron cuando la bioluminiscencia alcanzó 1 x 1010 fotones/segundo. Se muestran los valores de P para la prueba de rango logarítmico de las 3 curvas y para las comparaciones entre cada una de las 2 curvas. La Fig. 9 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de IL-15 unida a la membrana.

La Fig. 10 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de IL-15 humana (Secuencia de referencia de NCBI: NM_000585.4).

Fig. 11A-11C: mblL15 estimula las células NK mediante presentación en cis. 11A. Las células NK92 se transdujeron con mblL15 (izquierda) o con wtlL15 (derecha) en un vector que contenía GFP, se clasificaron para obtener 100 % de células GFP+ y se cultivaron conjuntamente con células NK92 no transducidas en una relación de 1:1. Se muestra el porcentaje de recuperación celular (6 DT; n = 3) después del cultivo para células GFP+ y GFP-, en relación con el número de células al comienzo del cultivo. 11B. Las células NK92 que expresan mblL15 o no transducidas se cultivaron conjuntamente con células K562 ("K") transducidos con mblL15 o no transducidas en una relación de 1:2 en las combinaciones mostradas. Las células K562 se marcaron con PKH26 (Sigma) y se trataron con conservante de células Streck (Streck, Omaha, NE) para prevenir la división celular antes del cultivo. Se muestra el porcentaje de recuperación de células NK92 (6 DT; n = 3) después del cultivo, en relación con el número de células al comienzo del cultivo. 11C. Proliferación de células NK92 que expresan mblL15 en comparación con la de células NK92 no transducidas en presencia de concentraciones crecientes de IL-15 exógena. Los cultivos se realizaron en ausencia de IL-2 (izquierda) o con IL-2 a 10 UI/ml (centro) o 100 UI/ml (derecha). Se muestra el porcentaje de recuperación celular (6 DT; n = 3) después del cultivo en relación con el número de células al comienzo del cultivo.

Fig. 12A-12C). Expresión y función de KIR en linfocitos K con mb15. 12A. Subconjuntos de células NK definidos por su expresión de KIR antes de la transducción y después de la transducción simulada o con mb15. Los gráficos de puntos de citometría de flujo muestran los resultados de la tinción con anticuerpos anti-KIR en células CD56+ CD3- de 2 donantes. Se muestran los porcentajes de células KIR+. 12B. Resultados de la expresión de CD107a en subconjuntos CD158a positivos y CD158a negativos después de un cultivo de 4 horas con células 721.221 o las mismas células que expresan HLA de Cw6 de unión a CD158a. Se muestran las medias (6 DT) de 4 experimentos independientes con células NK de 3 donantes (** P < 0,0001; *P = 0,0002). 12C. Resultados de la secreción de IFNy en los mismos experimentos mostrados en 12B (** P < 0,0001).

Fig. 13A y 13B: Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) de células NK que expresan mblL15. Resultados de ensayos de ADCC de 4 horas con células NK transducidas con mblL15 y de forma simulada contra (13A) Daudi y (13B) SK-BR-3 en presencia de Rituximab o Trastuzumab, respectivamente; se utilizó como control IgG a la misma concentración de los anticuerpos inmunoterapéuticos (1 mg/ml). Cada símbolo indica una citotoxicidad media de 6 DT en experimentos con células NK de cada donante por triplicado. En presencia de anticuerpos inmunoterapéuticos, las células NK con mblL15 ejercieron una ADCC significativamente más alta que las células transducidas de forma simulada (P < 0,001 para cualquiera de los donantes en las pruebas con Daudi o SK-BR-3). La citotoxicidad por las células NK con mblL15 sin anticuerpo también fue significativamente mayor (P < 0,001 para cualquier donante en las pruebas con Daudi o SK-BR-3).

Descripción detallada de la invención

La actividad antileucémica bien establecida de los linfocitos citolíticos naturales (NK) indica un potencial terapéutico para las infusiones de células NK. La supervivencia de las células NK y, por lo tanto, la citotoxicidad requiere apoyo de citocinas. En el presente documento se describen experimentos que investigan si la expresión de interleucina-15 (IL-15) en forma no secretora, unida a la membrana podría mantener el crecimiento de las células NK. El gen de la IL15 humana se unió al que codifica el domino transmembrana de CD8a ("mblL15"). Después de la transducción retrovírica, las células n K humanas expresaron mblL-15 en la superficie celular pero la secreción de IL-15 fue insignificante. La supervivencia y expansión de las células NK con mblL15 sin IL-2 fueron considerablemente superiores a las de las células transducidas de forma simulada (después de un cultivo de 7 días, P < 0,0001, n = 15), y a las de las células NK que secretan IL-15 no unida a la membrana (P = 0,025, n=9); las células NK con mbIL15 fueron detectables hasta durante 2 meses. En ratones inmunodeficientes, las células NK con mbIL15 se expandieron sin IL-2, y fueron detectables en todos los tejidos examinados (excepto el cerebro) en números mucho mayores que las células NK transducidas de forma simulada (P < 0,001). La expansión in vitro e in vivo aumentó adicionalmente con IL-2. El mecanismo principal de estimulación de mblL15 fue autocrino; activó la señalización de IL-15 y la señalización antiapoptótica. La citotoxicidad contra las líneas celulares de leucemia, linfoma y de tumores sólidos fue sistemáticamente mayor con células NK con mbIL15. La mediana de la citotoxicidad a las 24 horas a E:T de 1:4 fue del 71 % frente al 22 % con células transducidas de forma simulada; en E:T de 1:1, fue del 99 % frente al 54 % (P < 0,0001). El aumento de la capacidad antitumoral también fue evidente en ratones inmunodeficientes injertados con células de leucemia (U937) o sarcoma (ES8). Por tanto, mblL15 confirió un crecimiento independiente a las células NK y potenció su capacidad antitumoral. La infusión de células NK con mbIL15 permite la terapia con células NK sin los efectos adversos de IL-2.

Por consiguiente, en el presente documento se proporciona una (una o más; una pluralidad) célula que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15), en donde la célula es una célula que responde a la IL-15. Una célula que responde a IL-15 incluye una célula en la que una o más de sus actividades están reguladas por IL-15. Ejemplos de tales células incluyen linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T, células dendríticas y monocitos. La una o más células (p. ej., aisladas) pueden expresar la totalidad o una porción funcional de IL-15 como un polipéptido unido a la membrana, como proteína secretora o como una combinación de los mismos.

En un aspecto, la divulgación está dirigida a un o unos linfocitos citolíticos naturales (NK) que expresan la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15). La una o más células NK (p. ej., aislados) pueden expresar la totalidad o una porción funcional de IL-15 como un polipéptido unido a la membrana, como proteína secretora o como una combinación de los mismos. Específicamente, un primer aspecto de la presente invención proporciona un linfocito citolítico natural (NK) que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15), en donde:

en donde la totalidad o una porción de la proteína transmembrana se selecciona de CD8a, CD4, CD3e, CD3y, CD35, CD3Z, CD28 y CD137;

en donde la célula NK que expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15 muestra una supervivencia y expansión potenciadas en ausencia de IL-2, es capaz de regular la activación y proliferación de células NK y linfocitos T y/o de apoyar el desarrollo de células n K a partir de células madre hematopoyéticas en comparación con una célula NK que no expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15.

Como se usa en el presente documento, los "linfocitos citolíticos naturales" ("células NK") se refieren a un tipo de linfocito citotóxico del sistema inmunitario. Las células NK proporcionan respuestas rápidas a las células infectadas por virus y responden a las células transformadas. Normalmente, las células inmunitarias detectan péptidos de patógenos presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) en la superficie de las células infectadas, desencadenando la liberación de citocinas, causando lisis o apoptosis. Las células NK son exclusivas, sin embargo, ya que tienen la capacidad de reconocer células estresadas independientemente de si los péptidos de patógenos están presentes en las moléculas del MHC. Fueron nombrados "citolíticos naturales" debido a la noción inicial de que no requieren una activación previa para destruir la diana. las células NK son linfocitos granulares grandes (LGL, por sus siglas en inglés) y se sabe que se diferencian y maduran en la médula ósea desde donde después entran a la circulación.

En algunos aspectos, la célula NK es una célula NK de mamífero. Ejemplos de "mammalian" o "mamíferos" incluyen primates (p. ej., seres humanos), cánidos, felinos, roedores, porcinos, rumiantes y similares. Los ejemplos específicos incluyen seres humanos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, conejos, cobayas, ratas y ratones. En un aspecto particular, la célula NK de mamífero es una célula NK humana.

Como se usa en el presente documento, "interleucina-15" ("IL-15") se refiere a una citocina que regula la activación y proliferación de los linfocitos T y NK. Esta citocina y la interleucina 2 comparten muchas actividades biológicas. Se encuentra que se unen a subunidades de receptores comunes y pueden competir por el mismo receptor y, por lo tanto, regular negativamente la actividad de cada uno entre sí. Se muestra que el número de células CD8+ de memoria está controlado por un equilibrio entre IL-15 e IL-2. Esta citocina induce la activación de las cinasas JAK, así como la fosforilación y activación de los activadores de la transcripción STAT3, STAT5 y STAT6 y pueden aumentar la expresión del inhibidor de la apoptosis BCL2L1/BCL-x (L), posiblemente a través de la actividad de activación de la transcripción de STAT6, y así prevenir la apoptosis.

Una "porción funcional" ("porción biológicamente activa") de IL-15 se refiere a una porción de IL-15 que conserva una o más funciones de IL-15 de longitud completa o madura. Tales funciones incluyen la promoción de la supervivencia de las células NK, regulación de la activación y proliferación de células NK y linfocitos T, así como el apoyo del desarrollo de células NK a partir de células madre hematopoyéticas.

Como apreciarán los expertos en la materia, se conoce en la técnica la secuencia de una variedad de moléculas de IL-15. En un aspecto, la IL-15 es una IL-15 de tipo silvestre. En algunos aspectos, la IL-15 es una IL-15 de mamífero (p. ej., interleucina 15 de Homo sapiens (IL15), variante 3 del transcrito, ARNm, secuencia de referencia del NCBI: Nm_000585.4; interleucina 15 (IL15) de Canis lupus familiaris, ARNm, secuencia de referencia del NCBI: NM_001197188.1; interleucina 15 (IL15) de Felis catus, ARNm, secuencia de referencia del NCBI: NM_001009207.1). Ejemplos de "mammalian" o "mamíferos" incluyen primates (p. ej., seres humanos), cánidos, felinos, roedores, porcinos, rumiantes y similares. Los ejemplos específicos incluyen seres humanos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, conejos, cobayas, ratas y ratones. En un aspecto particular, la IL-15 de mamífero es una IL-15 humana.

La totalidad o una porción funcional de IL-15 puede expresarse por una o más células NK (como un polipéptido unido a la membrana y/o secretado) en una variedad de formas. Por ejemplo, la totalidad o una porción funcional de la IL-15 puede expresarse dentro de la célula NK y secretarse a partir de la célula NK y/o puede unirse (conjugarse; fusionarse) directa o indirectamente (p. ej., enlace iónico, no iónico, covalente) a la superficie (p. ej., en la superficie, o dentro de la membrana, de una célula NK) de la célula NK usando cualquiera de una variedad de enlazadores conocidos en la técnica (Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, Academic Press 1996). En aspectos particulares, la totalidad o una porción funcional de la IL-15 se une con la totalidad o una porción de una proteína transmembrana. En un aspecto, la célula NK expresa una proteína de fusión que comprende la totalidad o una porción de IL-15 fusionada a la totalidad o una porción de una proteína transmembrana. En un aspecto particular, la porción de la proteína transmembrana comprende la totalidad o una porción de un dominio transmembrana de la proteína transmembrana.

Como se usa en el presente documento, una "proteína transmembrana" o "proteína de membrana" es una proteína localizada en y/o dentro de una membrana tal como la bicapa de fosfolípidos de una membrana biológica (p. ej., biomembranas tales como la membrana de una célula). Las proteínas de membrana permiten que la membrana lleve a cabo sus actividades distintivas. El complemento de proteínas fijadas a una membrana varía dependiendo del tipo de célula y la ubicación subcelular. Algunas proteínas se unen solo a la superficie de la membrana, mientras que otros tienen una o más regiones internadas dentro de la membrana y/o dominios en uno o ambos lados de la membrana. Los dominios de proteínas en la superficie de la membrana extracelular generalmente están implicados en la señalización o interacciones célula-célula. Los dominios que se encuentran a lo largo de la cara citosólica de la membrana tienen una amplia gama de funciones, desde anclar proteínas citoesqueléticas a la membrana hasta desencadenar las de vías de señalización intracelular. Los dominios dentro de la membrana, denominados en el presente documento "dominios transmembrana", particularmente aquellos que forman canales y poros, mueven moléculas a través de la membrana. Un "dominio transmembrana", es una estructura de proteína tridimensional que es termodinámicamente estable en una membrana (p. ej., una membrana de una vesícula tal como una célula). Ejemplos de dominios transmembrana incluyen una única hélice alfa, un complejo estable de varias hélices alfa transmembrana, un barril beta transmembrana, una beta-hélice de gramicidina A, o cualquier otra estructura. Las hélices transmembrana suelen tener una longitud de aproximadamente 20 aminoácidos.

Normalmente, las proteínas de membrana se clasifican en dos categorías amplias, integrales (intrínsecas) y periféricas (extrínsecas), en función de la naturaleza de las interacciones membrana-proteína. La mayoría de las biomembranas contienen ambos tipos de proteínas de membrana.

Las proteínas de membrana integrales, también llamadas proteínas intrínsecas, tienen uno o más segmentos que están embebidos en la bicapa de fosfolípidos. Las proteínas de membrana integrales incluyen proteínas transmembrana y proteínas ancladas a lípidos. La mayoría de las proteínas integrales contienen restos con cadenas laterales hidrófobas que interactúan con grupos acilo graso de los fosfolípidos de la membrana, anclando así la proteína a la membrana. La mayoría de las proteínas integrales abarcan la totalidad la bicapa de fosfolípidos. Estas proteínas transmembrana contienen uno o más dominios transmembrana, así como dominios, de cuatro a varios cientos de restos de longitud, extendiéndose en el medio acuoso a cada lado de la bicapa. Normalmente, los dominios transmembrana son uno o más (p. ej., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) hélices a y/o hebras p. Los dominios transmembrana a-helicoidales normalmente están embebidos en las membranas mediante interacciones hidrófobas con el interior lipídico de la bicapa y probablemente también mediante interacciones iónicas con los grupos de cabeza polar de los fosfolípidos (p. ej., glicoforina). La estructura de las hebras p está normalmente en forma de barriles transmembrana (p. ej., porina). Algunas proteínas integrales están ancladas a una de las laminillas de la membrana por ácidos grasos unidos covalentemente. En estas proteínas, el ácido graso unido está embebido en la membrana, pero la cadena polipeptídica no entra en la bicapa de fosfolípidos. Algunas proteínas de la superficie celular están ancladas a la cara exoplasmática de la membrana plasmática por un fosfolípido glucosilado complejo que está unido al extremo C (p. ej., glicosilfosfatidilinositol, fosfatasa alcalina). Algunas proteínas citosólicas están ancladas a la cara citosólica de las membranas por un resto de hidrocarburo unido covalentemente a una cisteína cerca del extremo C (p. ej., grupos prenilo, farnesilo y geranilgeranilo). En otro grupo de proteínas citosólicas ancladas a los lípidos, un grupo acilo graso (p. ej., miristato o palmitato) está unido por un enlace amida al resto de glicina aminoterminal.

Las proteínas de membrana periféricas, o proteínas extrínsecas, no interactúan con el núcleo hidrófobo de la bicapa de fosfolípidos. En su lugar, habitualmente se unen a la membrana indirectamente por interacciones con proteínas integrales de la membrana o directamente por interacciones con grupos de lípidos de cabeza polar. Las proteínas periféricas localizadas en la cara citosólica de la membrana plasmática incluyen las proteínas citoesqueléticas espectrina y actina en los eritrocitos y la enzima proteína cinasa C. Esta enzima viaja entre el citosol y la cara citosólica de la membrana plasmática y desempeña un papel en la transducción de señales. Otras proteínas periféricas, incluyendo determinadas proteínas de la matriz extracelular, se localizan en la superficie externa (exoplasmática) de la membrana plasmática.

Los ejemplos de proteínas transmembrana incluyen un receptor, un ligando, una inmunoglobulina, una glicoforina o una combinación de los mismos. Los ejemplos específicos de proteínas transmembrana incluyen CD8a, CD4, CD3e, CD3y, CD38, CD3Z, CD28, CD137, FceRIy, un receptor de linfocitos T (TCR como TCRa y/o TCRp), un receptor nicotínico de acetilcolina, un receptor GABA, o una combinación de los mismos. Los ejemplos específicos de inmunoglobulinas incluyen IgG, IgA, IgM, IgE, IgD o una combinación de las mismas. Los ejemplos específicos de glicoforina incluyen glicoforina A, glicoforina D o una combinación de las mismas.

Además de estar unido a la totalidad o una porción de una proteína transmembrana, la totalidad o una porción funcional de la IL-15 se puede unir a otros componentes como un péptido señal (p. ej., una secuencia señal de CD8a), una secuencia líder, una señal secretora, un marcador (p. ej., un gen indicador), etc. En un aspecto particular, la totalidad o una porción funcional de IL-15 se fusiona con un péptido señal de CD8a y con la totalidad o una porción de un dominio transmembrana de CD8a.

En otro aspecto, la divulgación está dirigida a un método para producir un linfocito citolítico natural (NK) que exprese la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15). La totalidad o una porción de la IL-15 se puede expresar como un polipéptido unido a la membrana, un polipéptido secretado o como una combinación de los mismos. El método comprende introducir el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 en una o más células NK. En un aspecto, el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 está unido (p. ej., fusionado) a la totalidad o una porción de una proteína transmembrana. Como alternativa, o además, el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 se introduce en la célula NK (p. ej., IL-15 de tipo silvestre). Como será evidente para los expertos en la materia, aspectos en los que el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 y la totalidad o una porción funcional de IL-15 fusionada a la totalidad o una porción de una proteína transmembrana se introduce en la célula NK, se pueden hacer usando un solo ácido nucleico o múltiples (p. ej., separados; dos) ácidos nucleicos. La célula NK se mantiene en condiciones en las que la totalidad o una porción funcional de la IL-15 se expresa como un polipéptido unido a la membrana y/o como un polipéptido secretado, produciendo así una célula Nk que expresa la totalidad o una porción funcional de IL-15 como un polipéptido unido a la membrana y/o como un polipéptido secretado. En un aspecto particular, el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de iL-15 se fusiona con un péptido señal de CD8a y la totalidad o una porción de un dominio transmembrana de CD8a se introduce en la célula n K.

Específicamente, en un segundo aspecto de la presente invención se proporciona un método para producir una célula NK del primer aspecto de la invención, comprendiendo el método:

a) introducir el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 fusionada a la totalidad o a una porción de una proteína transmembrana en la célula NK, en donde la totalidad o una porción de la proteína transmembrana se selecciona de CD8a, CD4, CD3e, CD3y, CD35, CD3Z, CD28 y CD137; y

b) mantener la célula NK en condiciones en las que se expresa la totalidad o una porción funcional de la IL-15,

En un tercer aspecto de la invención, se proporciona una célula NK que se puede obtener mediante un método del segundo aspecto de la invención.

En otro aspecto más, la divulgación está dirigida a un método para potenciar la expansión y/o supervivencia de las células NK (p. ej., in vitro, ex vivo, y/o in vivo). El método comprende introducir el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15. El ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción de la IL-15 (p. ej., IL-15 de tipo silvestre) y/o que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 fusionada a la totalidad o una porción de una proteína transmembrana puede introducirse en la célula NK. Por tanto, la célula NK puede expresar la totalidad o una porción funcional de IL-15 como un polipéptido unido a la membrana, un polipéptido secretado o como una combinación de los mismos. Las células NK se mantienen en condiciones en las que la totalidad o una porción de la IL-15 se expresan como un polipéptido unido a la membrana, un polipéptido secretado o como una combinación de los mismos y en las que proliferan las células NK. En un aspecto particular, el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 se fusiona con un péptido señal de CD8a y la totalidad o una porción de un dominio transmembrana de CD8a se introduce en la célula n K. En algunos aspectos, el método puede comprender además poner en contacto las células NK que comprenden IL-15 unida a la membrana y/o IL-15 secretada con IL-2. En algunos aspectos, la concentración de lL-2 es de aproximadamente 10 Ul/ml a aproximadamente 1000 Ul/ml. En otros aspectos, la concentración de IL-2 es de aproximadamente 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640, 660, 680, 700, 720, 740, 760, 780, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980 Ul/ml.

Como será evidente para los expertos en la materia, se puede utilizar una variedad de métodos para introducir un ácido nucleico (p. ej., transfección, transducción y/o sistema de transposones) que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 como polipéptido transmembrana y/o como polipéptido secretado en una célula NK. Ejemplos de tales métodos incluyen métodos basados en sustancias químicas (p. ej., que implican el uso de fosfato de calcio; compuestos orgánicos altamente ramificados (p. ej., dendrímeros); liposomas (lipofección); y/o polímeros catiónicos (p. ej., DEAE dextrano; polietilenimina)), métodos no basados en sustancias químicas (p. ej., electroporación; compresión celular; sonoporación; transfección óptica; impalefección; suministro hidrodinámico), métodos basados en partículas (p. ej., pistola de genes; magnetofección; bombardeo de partículas), métodos basados en vectores (p. ej., vectores que incluyen vectores víricos tal como el vector retrovírico, vectores lentivíricos, vectores adenovíricos, etc.), nucleotransfección, métodos basados en transposones (p. ej., Bella Durmiente, PiggyBAC, etc.) y/o transfección de ARN.

También es evidente para los expertos en la materia que se puede usar una variedad de métodos para mantener las células NK en condiciones en las que (i) la totalidad o una porción funcional de la IL-15 se exprese como un polipéptido unido a la membrana y/o como un polipéptido y/o (ii) las células NK que comprenden IL-15 unida a la membrana /yo IL-15 secretada proliferen. Por ejemplo, las células NK se pueden cultivar y/o mantener a una temperatura y una mezcla de gases adecuadas (p. ej., de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 37 °C, CO2 a aproximadamente el 5 % en una incubadora de células). Las condiciones de cultivo pueden variar ampliamente y la variación de las condiciones para un tipo celular particular puede dar como resultado diferentes fenotipos. Además de la temperatura y la mezcla de gases, un factor comúnmente variado en los sistemas de cultivo es el medio de crecimiento celular. Las recetas de medios de cultivo pueden variar en pH, concentración de glucosa, factores de crecimiento y en la presencia de otros nutrientes. Los factores de crecimiento utilizados para complementar los medios con frecuencia proceden del suero de sangre animal, tal como suero fetal bovino (FBS), suero de ternera bovino, suero equino, suero porcino y/o lisado de plaquetas humanas (hPL, por sus siglas en inglés). Otros factores considerados para mantener las células incluyen la densidad de la placa (número de células por volumen de medio de cultivo) y el crecimiento de las células en suspensión o cultivos adherentes.

Los métodos pueden comprender además aislar o separar una o más células NK producidas por los métodos proporcionados en el presente documento, Además, los métodos pueden comprender además cultivar la una o más células NK. En algunos aspectos, se produce una línea de células NK.

La divulgación también abarca un (uno o más) linfocitos citolíticos naturales (NK) o línea celular de linfocitos citolíticos naturales producidos por los métodos descritos en el presente documento, y composiciones que comprenden las células NK proporcionadas en el presente documento. En un aspecto particular, la composición es una composición farmacéutica que comprende una o más de las células o líneas celulares NK proporcionadas en el presente documento. La composición farmacéutica puede comprender además la totalidad o una porción funcional de IL-2 (p. ej., la totalidad o una porción funcional de una (una o más) proteína IL-2; ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-2). Específicamente, la presente invención proporciona, en un cuarto aspecto de la invención, una composición que comprende una célula NK del primer o tercer aspecto de la invención. En una realización del cuarto aspecto de la invención, la composición es una composición farmacéutica que además comprende la totalidad o una porción funcional de IL-2.

Como se usa en el presente documento, "IL-2" se refiere a un miembro de una familia de citocinas que también incluye IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. IL-2 señaliza a través de un complejo receptor que consiste en tres cadenas, llamadas alfa, beta y gamma. La cadena gamma es compartida por todos los miembros de esta familia de receptores de citocinas. IL-2, que es similar a IL-15, facilita la producción de inmunoglobulinas producidas por los linfocitos B e induce la diferenciación y proliferación de las células NK. Las principales diferencias entre IL-2 e IL-15 se encuentran en las respuestas inmunitarias adaptativas. Por ejemplo, IL-2 es necesaria para la inmunidad adaptativa a patógenos extraños, ya que es la base para el desarrollo de la memoria inmunológica. Por otro lado, IL-15 es necesaria para mantener respuestas de linfocitos T altamente específicas al apoyar la supervivencia de los linfocitos T CD8 de memoria.

En otro aspecto, la divulgación está dirigida a un método para tratar una enfermedad y/o afección que implica la terapia con células NK en un individuo que lo necesita, que comprende administrar al individuo un linfocito citolítico natural (NK) que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL -15). En aspectos particulares, las células NK expresan la totalidad o una porción funcional de IL-15 como un polipéptido unido a la membrana y/o como un polipéptido secretado. Como se conoce en la técnica, las enfermedades y/o afecciones que implican la terapia con células NK incluyen deficiencias de células NK, cáncer, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas y similares.

En un aspecto particular, la divulgación está dirigida a un método de tratamiento de cáncer (p. ej., un tumor) en un individuo que lo necesita, que comprende administrar al individuo un linfocito citolítico natural (NK) que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15). La totalidad o una porción funcional de iL-15 se puede expresar como un polipéptido unido a la membrana y/o como un polipéptido secretado. Un quinto aspecto de la presente invención proporciona una célula NK de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un individuo que lo necesita administrando al individuo la célula NK o la composición.

El método puede comprender además administrar uno o más anticuerpos, fragmentos antigénicos y/o fusiones de los mismos específicos de cáncer (p. ej., tumor). Por ejemplo, el método puede comprender además administrar uno o más anticuerpos dirigidos contra uno o más antígenos tumorales. Como apreciarán los expertos en la materia, el uno o más anticuerpos puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo multivalente (p. ej., bivalente, trivalente), un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, etc. y combinaciones de los mismos. También se conocen en la técnica una variedad de fragmentos antigénicos y/o fusiones e incluyen Fab', F(ab')2, fragmento variable monocatenario (scFv), scFv multivalente (p. ej., di-scFv, tri-scFv), anticuerpo de dominio único (nanocuerpo) y etc.

En algunos aspectos, el cáncer es una leucemia (p. ej., leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; leucemia mielógena crónica, leucemia linfocítica crónica), un síndrome mielodisplásico, un linfoma (p. ej., linfoma no de Hodgkin de linfocitos B, linfoma de Hodgkin, linfoma linfoblástico de linfocitos T, linfoma anaplásico de células grandes), un tumor sólido (p. ej., un cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gástrico, cáncer de colon, carcinoma hepatocelular, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, glioma de alto grado), un sarcoma (p. ej., sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, sarcoma de tejido blando no rabdomiosarcoma, osteosarcoma).

El método de tratamiento de cáncer puede comprender además administrar IL-2 (la totalidad o una porción funcional de la proteína IL-2; ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-2) al individuo. En un aspecto, la IL-2 es IL-2 de mamífero, tales como IL-2 humana. En un aspecto particular, se administra al individuo una dosis baja de IL-2. Como se usa en el presente documento, una "dosis baja" de IL-12 se refiere a una dosis de IL-2 de aproximadamente 1 millón de UI/m2 o menos (p. ej., aproximadamente 800.000 UI/m2; 600.000 UI/m2; 400.000 UI/m2; 200.000 UI/m2; 100.000 UI/m2; 80.000 UI/m2; 60.000 UI/m2; 40.000 UI/m2; 20.000 UI/m2; 10.000 UI/m2; 8.000 UI/m2; 6.000 UI/m2; 4.000 UI/m2; 2.000 UI/m2; 1.000 UI/m2; 800 UI/m2; 600 UI/m2; 400 UI/m2; 200 UI/m2; 100 UI/m2). En cambio, una dosis normal de IL-2 es de aproximadamente 1 millón de UI/m2 a aproximadamente 5 millones de UI/m2.

El uno o más linfocitos citolíticos naturales (NK) que expresan la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15) (p. ej., compuesto terapéutico; composición farmacéutica) se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz (es decir, una cantidad que es suficiente para tratar el cáncer, tal como mejorar los síntomas asociados con el cáncer, prevenir o retrasar la aparición del cáncer, también disminuir la gravedad o frecuencia de los síntomas del cáncer y/o prevenir, retrasar o superar la metástasis del cáncer). La cantidad que será terapéuticamente eficaz en el tratamiento de un individuo particular dependerá de los síntomas y la gravedad de la afección (p. ej., cáncer) y puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. Además, se pueden emplear de manera opcional ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad del cáncer y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelos in vitro o animales.

El compuesto terapéutico se puede suministrar en una composición (p. ej., una composición farmacéutica), como se describe anteriormente, o por sí mismo. Pueden administrarse sistémicamente o pueden dirigirse a un tejido particular. Los compuestos terapéuticos se pueden producir por diversos medios, incluyendo síntesis química; producción recombinante; producción in vivo (p. ej., un animal transgénico, tal como la Patente de Estados Unidos N.° 4.873.316 de Meade et al.), por ejemplo, y puede aislarse usando medios convencionales tal como los descritos en el presente documento. También se puede utilizar una combinación de cualquiera de los métodos de tratamiento anteriores.

Los compuestos para su uso en los métodos descritos en el presente documento se pueden formular con un transportador o excipiente fisiológicamente aceptable para preparar una composición farmacéutica. El transportador y la composición pueden ser estériles. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

Los transportadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitación, agua, soluciones salinas (p. ej., NaCl), solución salina, solución salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite esencial, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas pueden, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, sustancias saborizantes y/o aromáticas y similares que no reaccionan perjudicialmente con los compuestos activos.

La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. La composición también se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y transportadores convencionales, tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir transportadores convencionales, tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

Los métodos de introducción de estas composiciones incluyen, pero sin limitación, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, tópico, oral e intranasal. Otros métodos de introducción adecuados también pueden incluir la terapia génica (como se describe a continuación), dispositivos recargables o biodegradables, dispositivos de aceleración de partículas ("pistolas de genes") y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también se pueden administrar como parte de una terapia de combinación con otros compuestos.

La composición puede formularse de acuerdo con procedimientos habituales en forma de una composición farmacéutica adaptada para su administración a seres humanos. Por ejemplo, las composiciones para administración intravenosa normalmente son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecillo que indica la cantidad de compuesto activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede dispensarse con una botella para infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril, suero salino o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o suero salino de tal forma que puedan mezclarse los ingredientes antes de la administración.

Para aplicación tópica, pueden emplearse formas no pulverizables, de viscosas a semisólidas o sólidas que comprenden un transportador compatible con la aplicación tópica y que tiene una viscosidad dinámica preferentemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, pero sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, enemas, lociones, soles, linimentos, bálsamos, aerosoles, etc., que están, si se desea, esterilizados o mezclados con agentes auxiliares, p. ej., conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales para influir en la presión osmótica, etc.

Los compuestos descritos en el presente documento se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como las derivadas de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres tales como las derivadas de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, hierro, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

En otros aspectos más, la divulgación está dirigida a composiciones farmacéuticas que comprenden una o más células NK que expresan la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15) como un polipéptido unido a la membrana. En la presente invención, la composición farmacéutica comprende una o más células NK del primer o tercer aspecto de la invención. La divulgación también está dirigida a composiciones (p. ej., composiciones farmacéuticas) para su uso como medicamento en terapia. Por ejemplo, los agentes identificados en el presente documento se pueden usar en el tratamiento de cáncer. Además, los agentes identificados en el presente documento pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.

Como se usa en el presente documento, un "individuo" se refiere a un animal y, en un aspecto particular, un mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen primates, un canino, un felino, un roedor y similares. Los ejemplos específicos incluyen seres humanos, perros, gatos, caballos, vacas, ovejas, cabras, conejos, cobayas, ratas y ratones. La expresión "individuo que lo necesita" se refiere a un individuo que necesita tratamiento o profilaxis de acuerdo con lo determine un investigador, veterinario, médico u otro profesional clínico. En una realización, un individuo que lo necesita es un mamífero, tal como un ser humano.

Una (una o más) célula NK "aislada", "sustancialmente pura" o "sustancialmente pura y aislada", como se usa en el presente documento, es una que está separada (sustancialmente aislada con respecto a) del entorno celular complejo en donde se produce de forma natural o del medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. En algunos casos, el material aislado formará parte de una composición (p. ej., un extracto bruto que contiene otras sustancias), sistema tampón o mezcla de reactivos. En otras circunstancias, el material se puede purificar hasta la homogeneidad esencial, por ejemplo, como se determina mediante electroforesis en gel de agarosa o cromatografía en columna, tal como HPLc . Preferentemente, una célula NK comprende al menos aproximadamente el 50 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % (sobre una base molar) de la todas las especies macromoleculares presentes.

Artículos tales como "un", "uno/a", "el/la", y similares, pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo por el contexto.

La expresión "y/o" como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que significa "uno o ambos" de los elementos unidos de este modo. Múltiples elementos enumerados con "y/o" deberían interpretarse de la misma manera, es decir, "uno o más" de los elementos unidos de este modo. Pueden estar presentes opcionalmente otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la cláusula "y/o". Como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debería entenderse que "o" tiene el mismo significado que "y/o" como se define anteriormente. Por ejemplo, cuando se usa en una lista de elementos, "o" o "y/o" se interpretarán como inclusivos, es decir, la inclusión de al menos uno, pero opcionalmente más de uno, de lista de elementos, y, opcionalmente, elementos adicionales no listados. Solamente términos que indiquen claramente lo contrario, como "solamente uno de" o "exactamente uno de" se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o listado de elementos. Las reivindicaciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes, se emplean en, o de otra manera son relevantes para un producto o proceso dado, a menos que se indique lo contrario. Se proporcionan realizaciones en las que está presente, se emplea o es relevante de otra manera exactamente un miembro del grupo para un producto o proceso dado. Se proporcionan realizaciones en las que están presentes, se emplean o son relevantes de otra manera más de uno o todos los miembros del grupo para un producto o proceso dado. Una cualquiera o más reivindicaciones pueden modificarse para excluir explícitamente cualquier realización, aspecto, rasgo, elemento o característica, o cualquier combinación de los mismos. Una cualquiera o más reivindicaciones pueden modificarse para excluir cualquier agente, composición, cantidad, dosis, vía de administración, tipo celular, diana, marcador celular, antígeno, resto de direccionamiento o combinación de los mismos.

Ejemplos

MATERIALES Y MÉTODOS

Líneas de células tumorales

Las líneas celulares humanas Nalm-6 (leucemia linfoblástica aguda de linaje B), Daudi (linfoma de linfocitos B), K562 y U937 (leucemia mieloide aguda) y SK-BR-3 (carcinoma de mama) se obtuvieron de la American Type Culture Collection, la línea celular de sarcoma de Ewing ES8 procedía del depósito de tejidos del St. Jude Children's Research Hospital. Todas las líneas celulares se transdujeron con un vector retrovírico MSCV-sitio interno de entrada al ribosoma (IRES)-GFP (del St. Jude Vector Development and Production Shared Resource) que contiene el gen de luciferasa de luciérnaga. Las células transducidas se seleccionaron por su expresión de GFP con un MoFlo (Beckman Coulter, Miami, FL) o una FACSAria (BD Biosciences, San José, CA). Se usaron RPMI-1640 (Invitrogen), Carlsbad, CA) complementado con suero fetal bovino al 10 % (FBS, Invitrogen Corp.), Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y antibióticos para mantener todas las líneas celulares. Las líneas celulares se caracterizaron por los proveedores de características de expresión molecular y/o genética; el perfil de marcadores celulares de las líneas celulares de leucemia y linfoma se probó periódicamente mediante citometría de flujo para garantizar que no se habían producido cambios y ES8 se validó mediante identificación genética de ADN en DSMz (Braunschweig, Alemania).

Expansión de células NK humanas

Se obtuvieron muestras de sangre periférica de subproductos descartados de colecciones de plaquetas de donantes adultos sanos. Las células mononucleares se purificaron mediante centrifugación en una etapa de densidad Accu-Prep (Accurate, Westbury, NY) y se lavaron dos veces en RPMI-1640. Para expandir las células NK CD56+ CD3-, se cultivaron conjuntamente células mononucleares de sangre periférica y la línea celular K562-mb15-41 BBL modificada genéticamente, como se describe previamente en Fujisaki et al., Cancer Res, 69(9):4010-4017 (2009); Imai et al., Blood, 106:376-383(2005)). Resumiendo, se cultivaron células mononucleares de sangre periférica con células K562-mb15-41BBL irradiadas con 100 Gy en una relación de 1,5:1 en SCGM (CellGenix, Freiburg, Alemania) que contenía SBF al 10 %, antibióticos y 10 UI/ml de interleucina-2 humana recombinante (IL-2; Roche, Mannheim, Alemania) en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos. El medio de cultivo de tejidos se cambió parcialmente cada 2 días. Tras 7 días de cultivo conjunto, los linfocitos T residuales se eliminaron con Dynabeads CD3 (Invitrogen), dando como resultado una población de células que contenía > 95 % de células NK CD56+ CD3-.

Plásmidos, producción de virus y transducción de genes

El pMSCV-IRES-GFP, pEQ-PAM3(-E) y pRDF se obtuvieron del recurso compartido de desarrollo y producción de vectores de St. Jude. La interleucina-15 (IL-15) con un péptido de señal larga se subclonó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una biblioteca de ADNc de bazo humano (del Dr. G. Neale, St Jude Children's Research Hospital) utilizada como plantilla. El ADNc que codifica el péptido señal de CD8a, el péptido maduro de IL-15 y el dominio transmembrana de CD8a se ensamblaron por corte y empalme mediante extensión solapante por PCR (SOE-PCR) para codificar una forma de IL-15 unida a membrana ("mblL15"); también se probó preparada una forma de IL-15 de tipo silvestre (no unida al dominio transmembrana de CD8a; "wtlL15"). Los casetes de expresión resultantes se subclonaron en sitios EcoRI y Xhol de virus de células madre murinas-sitio interno de entrada al ribosoma-proteína fluorescente verde (MSCV-IRES-GFP).

Para generar retrovirus pseudotipificados RD144, se transfectaron 3,0x106células 293T utilizando ADN de X-tremeGENE 9 (Roche, Mannheim, Alemania), mantenidas en placas de cultivo de tejidos de 10 cm durante 18 h, con 3,5 mg de ADNc que codifica construcciones de mblL15, 3,5 mg de pEQ-PAM3(-E) y 3 mg de pRDF. Después de reemplazar el medio con RPMI-1640 con FBS al 10 % y antibióticos a las 24 horas, el medio acondicionado que contenía retrovirus se recogió a las 36-96 horas y se añadió a tubos de polipropileno recubiertos con RetroNectin (Takara, Otsu, Japón), los cuales se centrifugaron a 1400 g durante 10 min y se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante 4 horas. Después de la centrifugación adicional y eliminación del sobrenadante, las células NK expandidas (0,5-1 x 106) se añadieron a los tubos y se dejaron a 37 °C durante 12 horas; estas etapas se repitieron hasta 6 veces durante 2-3 días. Después, las células se mantuvieron en RPMI-1640 con FBS, antibióticos y 100 UI/ml de IL-2. Las células transducidas se sometieron a ensayo 3-29 días después de la transducción.

La expresión de superficie de mblL-15 se analizó mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-IL-15 humana (R&D, Minneapolis, MN) y anti-IgG1 de ratón de cabra conjugado con ficoeritrina (Southern Biotech, Birmingham, AL). La tinción de anticuerpos se detectó con un citómetro de flujo Fortessa (Becton Dickinson). Los niveles de IL-15 en los sobrenadantes de cultivo se midieron con el inmunoensayo Quantikine (R&D).

Análisis funcional de células NK in vitro

Para estimar la supervivencia y el crecimiento de las células NK in vitro, las células NK transducidas (1 x 106 células/ml) se resuspendieron en RPMI-1640 con FBS al 10 % y antibióticos, se colocaron en los pocillos de una placa de 24 o 96 pocillos (Costar, Corning, NY) y se cultivaron sin o con IL-2 (10-100 UI/ml). Se determinó el número de células GFP+ viables con un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson), después de teñir con yoduro de propidio. En algunos experimentos, las células se incubaron durante 10 minutos con un anticuerpo anti-IL-15 neutralizante (R&D) o un anticuerpo no reactivo de isotipo coincidente antes del cultivo.

La inmunofenotipificación de células NK se realizó utilizando los anticuerpos enumerados en la Tabla, se visualizó con un citómetro de flujo Fortessa y se analizó mediante el software Diva (Becton Dickinson) y FlowJo (TreeStar, Ashland, OR). Para el análisis de fosfoproteínas, las células NK transducidas de forma simulada y con mblL15 (1 x 107) se cultivaron sin IL-2 durante 48 horas. Los lisados celulares se prepararon usando un tampón de lisis que contenía ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico 20 mM, EGTA 2 mM, EDTA 5 mM, fluoruro de sodio 30 mM, p-glicerofosfato 60 mM, pirofosfato de sodio 20 mM, ortovanadato sódico 1 mM, Triton X-100 al 1 %, cóctel completo de mini inhibidores de proteasas (Roche, Mannheim, Alemania) y ditiotreitol 1 mM. Tras la sonicación, los lisados se congelaron a -80 °C y se enviaron en hielo seco a Kinexus (Vancouver, CA) para el análisis de micromatriz de anticuerpos Kinex.

Para ensayos de citotoxicidad, las células diana marcadas con luciferasa y las células NK (cultivadas sin IL-2 durante 48 horas) se sembraron en placas de visualización negras de fondo plano de 96 pocillos (Corning) a varias relaciones efector:diana (E:T, por sus siglas en inglés) y se cultivaron durante 4 o 24 horas. Las líneas celulares adherentes se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante 4 horas antes de añadir células NK para permitir la fijación celular. Para ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, se añadieron Rituximab (Rituxan, Roche; Mannheim, Alemania), Trastuzumab (Herceptin, Roche) o IgG humana purificada (R&D Systems, Minneapolis, MN) (todos a 1 mg/ml) antes que las células NK. Al final de los cultivos, se añadió después, un volumen igual de reactivo de luciferasa Bright-Glo (Promega, Madison, Wl) a cada pocillo de prueba, y después de 5 minutos, se midió la luminiscencia utilizando un lector de placas y se analizó con el software Gen52.00 (ambos de BioTek, Tucson, AZ). En cada placa, la viabilidad de las células diana se calculó usando la señal luminiscente de los pocillos que contenían únicamente células diana. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Para medir la liberación de gránulos líticos, las células NK (cultivadas durante 48 horas sin IL-2) se cultivaron conjuntamente con células K562, U937 o células 721.221 y su variante que expresa Cw6 durante 4 horas. Se añadió anticuerpo anti-CD107a conjugado con PE o PE-Cy7 (BD Biosciences) al comienzo de los cultivos y GolgiStop (0,15 ml; BD Biosciences) 1 hora después. El porcentaje de células NK CD107a+ se determinó mediante citometría de flujo.

Expansión y citotoxicidad de células NK en ratones inmunodeficientes

Para probar la expansión de células NK in vivo, se inyectaron células NK humanas transducidos con mblL15 o transducidas de forma simulada (6-9 x 106 células por ratón) en la vena de la cola de ratones NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmlWj1/SzJ (NOD/scid IL2RGnull) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). En algunos ratones, se inyectaron 20000 UI de IL-2 por vía intraperitoneal (i.p.) 3 veces por semana. En los días 7 y 11, las células sanguíneas se contaron con un contador de células (Beckman Coulter); las células CD45+ humanas y de ratón se enumeraron mediante citometría de flujo después de tratar las células con solución de lisis de sangre de glóbulos rojos (Invitrogen) y teñirlas con un anticuerpo anti-CD45 humano de ratón conjugado con aloficocianina y un anticuerpo anti-CD45 de ratón de rata conjugado con ficoeritrina (ambos de BD Biosciences). Después del sacrificio, las células NK humanas en la médula ósea, hígado, bazo, riñón, pulmón y cerebro se enumeraron como anteriormente. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el National University of Singapore Institutional Animal Care and Use Committee.

Para probar la destrucción de células tumorales en ratones, se prepararon dos modelos de xenoinjerto. En el primero, se inyectaron ip células U937 que expresan luciferasa en ratones NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtmlWj|/SzJ (NOD/scid IL2RGnull) (1 x 104 células por ratón). Tres días más tarde, se inyectaron i.p. células NK transducidas con el vector MSCV que contenía bien GFP solo o mblL15 (1 x 107 células por ratón); la inyección de células NK se repitió el día 7. Como control, un grupo de ratones recibió medio de cultivo de tejidos en lugar de células NK. En el segundo modelo, se injertaron ratones con células ES8 (i.p.; 1 x 105 células por ratón), seguido de 1 inyección de células NK el día 3 como se indica anteriormente. El injerto y la progresión del tumor se evaluó utilizando un sistema Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, Ma ), con formación de imágenes comenzando 5 minutos después de la inyección i.p. de una solución acuosa de sal de potasio de D-luciferina (3 mg/ratón). Los fotones emitidos por las células de expresión de luciferasa se cuantificaron usando el programa de software Living Image 4.3.1.

RESULTADOS

Diseño de construcciones de IL-15 y expresión en células NK

Como se describe en el presente documento, se expresaron dos formas del gen IL15 en células NK humanas: una forma unida a la membrana, resultante de una construcción en la que el gen de IL15 humano se unió al gen que codifica el dominio transmembrana de CD8a ("mblL15"), y una forma no modificada de tipo silvestre ("wtlL15"). Ambas construcciones se insertaron en un vector retrovírico MCSV que contenía GFP (Fig. 1A), que se utilizó para transducir las células NK en proliferación obtenidas después de cultivar células mononucleadas de sangre periférica con la línea celular estimulante K562-mb15-41BBL.28 Al final de los cultivos, antes de la transducción retrovírica, los linfocitos T residuales se agotaron con perlas inmunomagnéticas anti-CD3 dando como resultado células CD56+ CD3- puras > 95 %. La mediana de la expresión de GFP fue del 71 % (23 % -97 %, n = 60) con la construcción que contenía mblL15, y 69 % (intervalo, 20 % - 91 %, n = 25) con la que contenía wtlL15. Las células NK de los mismos donantes también transducidos con un vector que contenía solo GFP tenían una mediana de la expresión de GFP del 84 % (53 % -98 %, n = 60) (Fig. 1B).

Después de la transducción con mblL15, IL-15 se expresó en la membrana de las células NK: el 40 % -63 % (mediana, 52; n = 7) de las células NK GFP+ tenían IL-15 detectada por un anticuerpo anti-IL15 (Fig. 1B). Por el contrario, no se detectó IL-15 en células transducidos con wtlL15 (n = 4) o células NK transducidas de forma simulada (n = 7). La producción de IL-15 soluble por las células NK transducidas se determinó probando los sobrenadantes recogidos después de 24 y 48 horas de cultivo. Como se muestra en la Fig. 1C, las células que expresaban wtlL15 secretaron cantidades sustanciales de IL-15 mientras que esto fue mínimo en las células NK con mbIL15 e indetectable en las células NK transducidas de forma simulada.

Las células NK que expresan IL-15 tienen capacidad autónoma de supervivencia y expansión 1

Para determinar si la expresión de IL-15 podría reemplazar a IL-2 exógena para mantener la supervivencia de las células NK, se transdujeron células NK de 15 donantes con la construcción con mblL15 y se cultivaron en ausencia de IL-2; después, se compararon los números de células después del cultivo con los de cultivos paralelos con células NK transducidas de forma simulada. Como se muestra en la Fig. 2A, la expresión de mblL-15 aumentó drásticamente la supervivencia de las células NK: después de 7 días de cultivo, la mediana de la recuperación celular fue del 85 %, mientras que prácticamente no se detectó ninguna célula NK transducida de forma simulada viable (< 1 %; P < 0,0001 por prueba t pareada). El efecto de mblL15 disminuyó significativamente si se añadía un anticuerpo neutralizante anti-IL-15 a los cultivos (Fig. 6A-6B). En 9 de los 15 donantes, la recuperación de las células NK con mblL15 también se comparó con la de las células NK que expresaban wtlL15: fue significativamente mayor con el primero (mediana, 85 % frente a 56 %, P = 0,026; Fig. 2A).

En experimentos paralelos, se determinaron los efectos de mantenimiento de la expresión de IL15 en presencia de IL-2 exógena. Cuando los cultivos contenían 10 UI/ml de IL-2, la recuperación a los 7 días de células NK que expresaban bien mblL15 o wtlL15 permaneció significativamente más alta que la de las células transducidas de forma simulada; en estas condiciones, no se observaron diferencias significativas entre las 2 formas de IL15 (Fig. 6A-6B). Solo cuando la IL-2 exógena estaba presente en una concentración alta (100 UI/ml), la recuperación a los 7 días de células NK transducidas de forma simulada coincidió con la de células NK transducidas con IL15 (Fig. 6A).

En experimentos con células NK expandidas de 6 de los 9 donantes, se determinó la capacidad de mblL15 para apoyar la supervivencia de las células NK más allá de los 7 días con una dosis baja de IL-2 (10 UI/ml). El día 14, el número de células NK con mblL15 se mantuvo o aumentó en 4 de los 6 cultivos; en 2 de estas células se había expandido adicionalmente el día 21. Solo 2 de los 6 cultivos con células NK transducidas de forma simulada de los mismos donantes habían mantenido el número de células los días 14 y 21, y no se observó crecimiento celular; la mediana de la recuperación celular el día 21 fue del 205 % para las células NK con mblL15 y del 80 % para las células NK transducidas de forma simulada. Por tanto, incluso en presencia de dosis bajas de IL-2, la expresión mblL15 confirió una ventaja considerable de supervivencia y crecimiento.

En cultivos de células NK de un donante, se observó una recuperación celular particularmente alta el día 7 cuando se expresó IL15 (261 % con mblL15 y 161 % con wtlL15 en ausencia de IL-2; 266 % y 188 % con 10 UI/ml de IL-2). Estos cultivos se controlaron durante 2 meses y se observaron mejoras notables en la expansión y la supervivencia celular provocadas por la expresión de mblL15 (Fig. 2C). Incluso en ausencia de IL-2, las células NK con mblL-15 continuaron sobreviviendo hasta el día 21 y todavía eran detectables 75 días después del inicio del cultivo, mientras que las células transducidas de forma simulada se habían vuelto indetectables el día 7 y las células NK transducidas con wtlL15 el día 42. En presencia de IL-2 a baja concentración (10 UI/ml), el número de células NK que expresan mblL15 fue idéntico al originalmente sembrado 2 meses después del inicio de los cultivos, mientras que las células NK transducidas de forma simulada y transducidas con wtlL15 viables habían disminuido mucho antes. Como se muestra en la Fig. 6B complementaria, cuando se añadió IL-2 al cultivo en una dosis alta (100 UI/ml), las células NK transducidas bien con mblL155 o con wtlL15 tuvieron un perfil de persistencia similar, ambos tipos de células sobreviven más tiempo que las células NK transducidas de forma simulada incluso en estas condiciones.

Expansión y localización de células NK con mblL15 in vivo

Los experimentos realizados in vitro indicaron que la expresión de IL15 mejoró la supervivencia y expansión de las células NK y que mblL15 produjo una mejor estimulación en general. A continuación, se determinó si la expresión de mblL15 sostendría la expansión de las células NK humanas en ratones NOD/scid IL2RGnull. Se transdujeron células NK activadas de 4 donantes con mblL15 (52 % -74 % GFP positivo) y se inyectaron en 4 ratones (un ratón por donante); Se inyectaron 4 ratones de control con células NK transducidas de forma simulada de los mismos donantes. Las células NK que expresaban mblL15 se expandieron mucho más que las células NK transducidas de forma simulada: 7 días después de la inyección, la mediana del número de células NK con mblL15/ml de sangre fue 44,5 (intervalo, 42-60) frente a 6,5 (0-12) con células NK transducidas de forma simulada (P = 0,004) (Fig. 3A). Se realizaron experimentos paralelos con las mismas células, esta vez también administrando 20.000 UI de IL-2 humana i.p. cada 2 días (Fig. 3A). En estas condiciones, las células NK con mblL15 se expandieron aún más (mediana de células NK/ml, 101; intervalo, 60-167), mientras que las células transducidas de forma simulada permanecieron bajas (mediana, 18; intervalo, 6-20; P = 0,021).

El día 11 después de la inyección, las células NK con mblL15 comprendían 168,5 células/ml (intervalo, 94-355) de células mononucleadas de sangre periférica en ausencia de IL-2 y 382 células/ml (151-710) cuando también se administraba IL-2 (Fig. 3A, B). Por el contrario, en ratones inyectados con células NK transducidas de forma simulada, las células CD45 humanas eran prácticamente indetectables sin IL-2, y estaban presentes en niveles bajos cuando también se inyectaba IL-2 (mediana, 27; intervalo 9-207; P = 0,026). Las células CD45+ humanas también expresaron CD56 y carecían de CD3 (no mostrado). Cabe destacar que, la proporción de GFP+ había aumentado de 66,5 % ± 9,9 % antes de la inyección a 93,8 % ± 4,4 % el día 7 y 94,8 % ± 3,4 % el día 11 (P < 0,01 para ambas comparaciones).

Después del sacrificio el día 11, se examinó en 3 de los 4 ratones la presencia de células CD45+ humanas en diversos tejidos. Si se expresaba mblL15, se detectaban cantidades considerables de células NK humanas en la médula ósea, hígado, bazo, riñón y pulmón; en todos los tejidos, los números fueron notablemente más altos que los observados con células transducidas de forma simulada (Fig. 3C): el porcentaje medio (6 DT) de células CD45+ que expresan mblL15 fue de 1,2 % ± 1,5 % sin IL-2 y 3,0% ± 4,3% con iL-2, en comparación con 0,04 % ± 0,09 % y 0,4 % ± 0,6 % con células transducidas de forma simulada (P < 0,001 y P = 0,002, respectivamente). La única excepción fue el cerebro, donde no se pudieron detectar ni las células NK transducidas con mblL15 ni las transducidas de forma simulada.

Mecanismos de estimulación de mblL15

Para determinar si mblL15 estimulaba predominantemente células en trans (IL-15 presentada en una célula NK que estimula una célula vecina (un mecanismo que se indicó que se produce fisiológicamente)) o en cis (por unión directa de mblL15 a receptores expresados en la misma célula), las proporciones de células NK GFP+ y GFP- en los cultivos se evaluaron después de 7 días de cultivo. Si el mecanismo en trans fuera predominante, la relación entre las células NK GFP+ y GFP- debería permanecer sin alterar durante el cultivo; si cis fuera predominante, la proporción de células GFP+ debería aumentar. La fig. 4A muestra los resultados de dicho análisis: el porcentaje de células GFP+ entre las células NK examinadas después de 7 días de cultivo sin IL-2 aumentaba sistemáticamente si se expresaba mblL15, mientras que no lo hizo en cultivos con células transducidas de forma simulada: las células GFP+ constituyeron el 95,9 % ± 3,3 % de la población celular total frente al 57,5 % ± 18,6 % el día 7 (P < 0,0001), en comparación con el 71,2 % ± 19,0 % frente al 80,5 % ± 17,1 % el día 0. Por tanto, el mecanismo predominante de estimulación por mblL-15 expresada en células NK es autocrino.

Las células que expresan mblL15 esencialmente conservaron el inmunofenotipo de las células NK activadas. Sin embargo, cuando se examinó 2 días después de la abstinencia de IL-2 en comparación con células NK transducidas de forma simulada, las células NK con mblL15 expresaron niveles moderadamente más altos de los receptores de activación NKG2D, NKp44 (CD336) y NKp30 (CD337) así como de CD16 y CD56, mientras que la expresión de NKp46 (CD335) disminuyó y la de otras moléculas, tal como DNAM-1 (CD226), permaneció sin cambios (Fig. 4B; la tabla). T ambién se determinaron las vías de transducción de señales activadas por la expresión de mblL15. Como se muestra en la Fig. 4C, en comparación con las células NK transducidas de forma simulada, las células NK con mblL-15 tenían varias moléculas altamente fosforadas. Estas incluían moléculas que se sabe que se fosforilan en respuesta a la señalización de IL-15, tal como los factores de transcripción STAT1, STAT3 y STAT5, las cinasas src, Erk1/2 y Mek1. De manera destacable, se observaron una marcada fosforilación de Bad, así como la fosforilación de Caspasa 7 y 9, indicativo en conjunto de un efecto antiapoptótico. Otras moléculas altamente fosforiladas en las células NK con mblL15 cuyo papel en la señalización de iL-15 no está claro incluyeron CDK6 y RafA.

Efectos de mblL-15 sobre la citotoxicidad antitumoral de células NK in vitro e in vivo

Las mejoras en la supervivencia y la proliferación de las células NK provocadas por la expresión de mblL15 indicaron que probablemente también aumentaría la destrucción de células tumorales mediada por NK. Esta noción se probó en primer lugar comparando la citotoxicidad de las células tumorales ejercida por las células NK con mbIL15 con la de las células NK transducidas de forma simulada de los mismos donantes. Se realizaron experimentos con células NK de 9 donantes dirigidas a las líneas celulares de leucemia Nalm-6 (leucemia linfoblástica aguda de linaje B), U937 y K562 (leucemia mieloide aguda), así como Daudi (linfoma de linfocitos B), SKBR3 (carcinoma de mama) y ES8 (sarcoma de Ewing) en diferentes relaciones E: T y duraciones de cultivos conjuntos, para un total de 90 experimentos. La Fig. 5A muestra los resultados de los ensayos de 24 horas: la mediana de la citotoxicidad fue del 22 % con células NK transducidas de forma simulada a E:T de 1:4 y del 54 % a E:T de 1:1; con células NK con mblL15, fue del 71 % y 99 %, respectivamente (P < 0,0001). Los resultados con líneas celulares individuales se muestran en las Fig. 7A-7B. Aunque el aumento de la citotoxicidad podría estar relacionado con el aumento de la supervivencia de las células NK en cultivo, también se observó una mayor liberación de gránulos líticos por las células NK con mbIL15, de acuerdo con lo revelado por la tinción de CD107a después del cultivo con células K562 o U937, (P = 0,0067; Fig. 5B).

La ganancia en citotoxicidad in vitro asociada con la expresión de mblL15 se reflejó en experimentos con ratones NOD/scid IL2RGnull injertados con células tumorales humanas. En un conjunto de experimentos, se inyectaron ratones con la línea celular de leucemia mieloide aguda humana (LMA) U937 y después se trataron con células NK bien transducidas con mblL15 o transducidas de forma simulada. Como se muestra en la Fig. 5C y 5D, los ratones que recibieron células NK transducidas con mblL15 tuvieron un crecimiento tumoral más lento y una supervivencia significativamente más larga que los ratones no tratados y que los tratados con células NK transducidas de forma simulada (P = 0,014, prueba de rango logarítmico para la tendencia). Las células también se probaron en un segundo modelo de xenoinjerto en el que se inyectaron ratones NOD/scid IL2RGnull con la línea celular de sarcoma de Ewing ES8, que tiene una tasa de crecimiento mucho más lenta, y los ratones se trataron con una inyección de células NK. Como se muestra en las Fig. 8A-8C complementarias, el resultado de los ratones tratados con células NK con mblL15 (n = 12) fue superior al de las células NK transducidas de forma simulada (n = 11) y al de los ratones no tratados (n = 7): la mediana de supervivencia fue de 162, 49 y 21 días, respectivamente (P = 0,005).

ANÁLISIS

Entre los factores que determinan el éxito de la terapia de cáncer basada en células NK, tal vez el más fundamental es que las células NK permanecen en cantidades suficientes para lograr una relación E:T que probablemente produzca citorreducción tumoral. En el presente documento se demuestra que la expresión de una forma de IL-15 unida a la membrana en células NK humanas apoyaba su expansión autónoma y su supervivencia extendida en ausencia de IL-2. Las células NK que expresan mblL15 podrían mantenerse in vitro hasta durante 2 meses sin IL-2 exógena. Las células NK que expresan mblL15 podrían expandirse en ratones inmunodeficientes e infiltrarse en múltiples tejidos donde podrían encontrarse en números mucho mayores que las células transducidas de forma simulada. La expansión de las células NK con mblL-15 se incrementó aún más por una concentración baja de IL-2 tanto in vitro como in vivo. La expresión de mblL15 no afectó la capacidad citotóxica de las células NK. De hecho, en modelos de xenoinjerto, las células NK con mblL15 ejercieron una actividad anticancerosa que era más potente que la de las células transducidas de forma simulada, indicando que este enfoque podría mejorar la capacidad antitumoral de las infusiones de células NK al tiempo que evita los efectos secundarios de la administración de IL-2.

Los hallazgos de este documento muestran que la expresión ectópica de IL-15 en células NK humanas provocó un efecto de promoción de la supervivencia más fuerte cuando la IL-15 se presentaba en una forma unida a la membrana que en una forma secretada. De manera destacable, sin embargo, mblL15 expresada en células NK estimula preferentemente en cis en lugar de en trans cuando otras células presentan IL-15. Es decir, mblL15 parece comprometer preferentemente los receptores de IL-15 en las mismas células, dando como resultado la estimulación autocrina. Este mecanismo explica el patrón de expresión de IL-15 que se observó sistemáticamente cuando las células NK transducidas con mblL15 se marcaron con un anticuerpo anti-IL-15, mostrando una proporción sustancial de células con fuerte expresión de GFP pero que aparentemente carecen de IL-15 (Fig. 1B). Se plantea la hipótesis de que en estas células, la IL-15 se expresa pero no es accesible al anticuerpo porque está unida a su receptor y/o internalizada. La capacidad de mblL15 para promover la viabilidad de las células NK probablemente explica el aumento de la citotoxicidad ejercida por estas células, particularmente en ensayos de 24 horas in vitro e in vivo. Sin embargo, la superioridad de las células NK con mbIL15 también fue clara en ensayos a corto plazo (4 horas) y estas células también liberaron más gránulos líticos de acuerdo con la prueba de CD107a. Por lo tanto, es probable que la expresión de mblL15 aumente la citotoxicidad de las células NK por otros medios, posiblemente potenciando su estado de activación.

La administración clínica de células NK generalmente se basa en IL-2 para apoyar su supervivencia y expansión in vivo. Los múltiples efectos secundarios relacionados con la administración de IL-2, sin embargo, son potencialmente graves y con frecuencia hacen que la administración de esta citocina sea mal tolerada. Detener la administración de IL-2 o reducir su dosis puede dar como resultado una disminución de la expansión de las células NK y un efecto antitumoral ineficaz, que puede inhibirse adicionalmente mediante la estimulación de los linfocitos T reguladores. Con este fin, sustituir IL-2 con IL-15 es potencialmente atractivo, pero la formulación clínica de IL-15 aún se está probando. Aunque en general fue bien tolerado cuando se administró a macacos rhesus, se observaron efectos adversos en algunos animales, incluyendo diarrea, emesis, pérdida de peso, neutropenia transitoria, aumento de transaminasas e hiponatremia. Además de la expansión de los linfocitos T y NK, se ha observado la expansión de los linfocitos T reguladores. A diferencia de las células NK transducidas con wtlL15, las transducidas con mblL15 liberaron una cantidad extremadamente pequeña de IL-15 en el sobrenadante. Por tanto, cualquier posible efecto secundario que pueda estar causado por la interacción de IL-15 con células distintas de las células NK debe minimizarse mediante este enfoque. Cabe destacar que, la exposición prolongada de linfocitos granulares grandes murinos a IL-15 conduce a su crecimiento leucémico. Esto plantea un posible problema de seguridad para la administración de IL-15 en pacientes y también para el uso de células NK que expresan IL-15, particularmente si dichas células se administraron a pacientes con bajo riesgo de recaída. En los experimentos descritos en el presente documento, sin embargo, las células NK que expresaban mblL15 generalmente sobrevivieron durante períodos mucho más cortos que el año o más indicado para los clones de linfocitos T que expresan IL-15 soluble. Por otra parte, no se observó expansión persistente de NK en ratones inmunodeficientes, con un seguimiento superior a los 9 meses.

Existe una evidencia clínica considerable que apoya el potencial anticanceroso de las células NK. Las células NK también desempeñan un papel crítico en la mediación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en pacientes tratados con anticuerpos monoclonales. Por tanto, la infusión de células NK probablemente sea beneficiosa en múltiples entornos. La expansión de células NK humanas en grandes cantidades ex vivo es factible; se han establecido métodos consistentes a gran escala para este propósito y se están utilizando en ensayos clínicos. También es posible la modificación genética de las células NK por transducción retrovírica o electroporación. Por lo tanto, la traducción del enfoque descrito en el presente documento en condiciones de grado clínico es realista y está garantizada por la expansión y citotoxicidad superiores de las células NK con mbIL15.

Tabla Ex resión de marcadores de su erficie en células NK transducidas de forma simulada con mblL151

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un linfocito citolítico natural (NK) que expresa la totalidad o una porción funcional de interleucina-15 (IL-15), en donde:

2. La célula NK de la reivindicación 1, en donde la proteína transmembrana comprende un dominio transmembrana de CD8a.

3. Una célula NK de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la totalidad o una porción funcional de IL-15 se fusiona con un péptido señal de CD8a y un dominio transmembrana de CD8a.

4. Una célula NK de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la IL-15, o porción funcional de la misma, es la variante 3 del transcrito de IL-15 de mamíferos o una porción funcional de la misma.

5. Una célula NK de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el dominio transmembrana de CD8a está codificado por un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 1 o en donde la IL-15 secretada está codificada por un ácido nucleico que comprende un péptido señal de CD8a.

6. Un método para producir una célula NK de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el método:

a) introducir el ácido nucleico que codifica la totalidad o una porción funcional de IL-15 fusionada a la totalidad o a una porción de una proteína transmembrana en la célula NK, en donde la totalidad o una porción de la proteína transmembrana se selecciona de CD8a, CD4, CD3e, CD3y, CD38, CD3Z, CD28 y CD137; y

7. El método de la reivindicación 6 en donde el ácido nucleico se introduce en la célula NK mediante la transducción de la célula NK con un vector.

8. El método de la reivindicación 7 en donde el vector es un vector vírico, preferentemente un vector retrovírico.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende además poner en contacto las células NK con IL-2.

10. Un linfocito citolítico natural (NK) que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.

11. Una composición que comprende la célula NK de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o de la reivindicación 10.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la composición es una composición farmacéutica que además comprende la totalidad o una porción funcional de IL-2.

13. La célula NK de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 para su uso en un método de tratamiento de cáncer en un individuo que lo necesita administrando al individuo la célula NK o la composición.

14. Una célula NK o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 en donde el método de tratamiento también comprende administrar iL-2 al individuo, preferentemente a una dosis baja de aproximadamente 1 millón de UI/m2 o menos.

15. Una célula NK o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 13 o 14 en donde el método de tratamiento también comprende además administrar uno o más anticuerpos dirigidos contra uno o más antígenos tumorales.