ES2842306T3 - Anticuerpos anti LAG-3 - Google Patents

Anticuerpos anti LAG-3 Download PDF

Info

Publication number
ES2842306T3
ES2842306T3 ES16759785T ES16759785T ES2842306T3 ES 2842306 T3 ES2842306 T3 ES 2842306T3 ES 16759785 T ES16759785 T ES 16759785T ES 16759785 T ES16759785 T ES 16759785T ES 2842306 T3 ES2842306 T3 ES 2842306T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16759785T
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Triebel
Chrystelle Brignone
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immutep SAS
Original Assignee
Immutep SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1515572.4A external-priority patent/GB201515572D0/en
Priority claimed from GBGB1612437.2A external-priority patent/GB201612437D0/en
Application filed by Immutep SAS filed Critical Immutep SAS
Application granted granted Critical
Publication of ES2842306T3 publication Critical patent/ES2842306T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un anticuerpo aislado agonista anti gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a LAG-3 e inhibe: la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+inducida por antígeno; y/o la activación de células T CD4+ y/o CD8+inducida por antígeno; que comprende: una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 5 y 6; o una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti LAG-3
La presente invención se refiere a anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen al gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3, por las siglas del inglés Lymphocyte-activation gene-3), especialmente anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son agonistas de LAG-3, y al uso de los anticuerpos o fragmentos como medicamentos, en particular, para el tratamiento de afecciones asociadas con la proliferación y/o activación de células T CD4+ y/o CD8+, en particular, trastornos inflamatorios y autoinmunitarios. El gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3) es una proteína de membrana de tipo I homóloga a CD4 con cuatro dominios extracelulares de la superfamilia de Ig. De manera similar a CD4, LAG-3 se oligomeriza en las superficies de células T y se une a moléculas MHC (majorhistocompatibility complex, complejo principal de histocompatibilidad) de clase II, en células presentadoras de antígeno (APC, antigen presenting cells) pero con una afinidad significativamente mayor que la de CD4. LAG-3 se expresa en linfocitos T CD4 positivos y CD8 positivos activados donde se asocia con el complejo CD3-TCR en la superficie celular y regula negativamente la transducción de señales. Como consecuencia, regula negativamente la proliferación, función y homeostasis de las células T. Cuando un TCR específico reconoce el complejo de MHC de clase Il-péptido, las señales intracelulares se transducen en las células T a través del TCR y en las APC a través de las moléculas MHC de clase II. La función reguladora negativa de la señalización de LAG-3 en las células T interviene en respuestas de células T humanas CD4 y CD8 primarias (Magon- Lemaítre, et al., Immunology. Junio de 2005; 115(2): 170-178).
LAG-3 también codifica una variante de corte y empalme alternativa que se traduce en una forma soluble de LAG-3 (sLAG-3). Como molécula soluble, LAG-3 activa a las células presentadoras de antígeno (APC) a través de la señalización del MHC de clase II, lo que hace que aumente in vivo las respuestas de las células T específicas de antígeno (Triebel, Trends Immunol., 2003, 24: 619-622).
En la figura 1 de Huard et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997), se proporciona la secuencia de aminoácidos de la proteína LAG-3 humana y murina. La secuencia de la proteína LAG-3 humana se repite en la figura 1 más adelante (SEQ ID NO: 27). Las secuencias de aminoácidos de los cuatro dominios (D1, D2, D3 y D4) extracelulares de la superfamilia de Ig de la proteína LAG-3 humana se encuentran en los restos de aminoácido: 1­ 149 (D1) (SEQ ID NO:28); 150-239 (D2) (SEQ ID NO:29); 240-330 (D3) (SEQ ID NO:39); y 331-412 (D4) (SEQ ID NO: 51).
Baixeras, et al. (J. Exp. Med., 1992, Vol. 176: 327-337) describen la producción de 17B4, un anticuerpo monoclonal de ratón (isotipo lgG1) contra la proteína LAG-3 humana. Este anticuerpo reconoce un bucle extra de 30 aminoácidos del primer dominio D1 aminoterminal de la proteína LAG-3 humana.
El anticuerpo 17B4 inhibe interacciones de clase LAG-3/MHC y aumenta la proliferación de células T como un antagonista de la señalización de LAG-3 (Huard et al, Eur J Immunol. 1996;26:1180-6). El Acm (anticuerpo monoclonal) 17B4 no tiene actividad agonista, ya que en ausencia de un reactivo reticulante secundario, no tiene la capacidad de inducir la elevación de los niveles de calcio libre intracelular en las células T (Hannier el al., J Immunol.
1998;161:4058-65).
Los agentes capaces de modular las funciones de activación y/o efectoras de las células T CD8-positivas y CD4-positivas, son sumamente deseables. En particular, se sabe que en muchos trastornos autoinmunitarios intervienen células T autorreactivas y autoanticuerpos. Por lo tanto, se necesitan agentes que sean capaces de inhibir o eliminar linfocitos autorreactivos sin comprometer la capacidad del sistema inmunitario para defenderse contra microorganismos patógenos.
Poirier et al (Clinical and Experimental Immunology, 2011, 164: 265-274) describen la evaluación de un anticuerpo de LAG-3 quimérico (A9H12 quimérico) citotóxico. In vivo, el anticuerpo produjo un empobrecimiento de células T activadas con LAG-3+ en los ganglios linfáticos y mostró eficacia en cuanto a la reducción de la inflamación de la piel en un modelo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH, delayed-type hypersensitivity) inducida por tuberculina en babuinos. Los anticuerpos que producen específicamente un empobrecimiento de células T activadas, presentan una estrategia terapéutica prometedora para prevenir y/o tratar trastornos autoinmunitarios. En el documento US2011/070238 se describe una versión quimérica del Acm A9H12 (denominado IMP731) que comprende una región Fc de IgG1 humana y muestra que este anticuerpo quimérico, al igual que su homólogo murino, suprime la DTH en los babuinos. Además, en este documento se explica explícitamente que los anticuerpos que se describen en el mismo, pueden usarse en el tratamiento de rechazo de trasplantes y de enfermedades autoinmunitarias.
Como estrategia alternativa, el solicitante ha apreciado que los agonistas de LAG-3 regularán negativamente la proliferación y/o función de células T sin producir el empobrecimiento de células T, y que dichos agonistas también pueden usarse para tratar trastornos inflamatorios o autoinmunitarios.
El solicitante ha podido producir anticuerpos agonistas monoclonales anti LAG-3. Estos anticuerpos inhiben la proliferación de células T CD4 positivas y CD8 positivas inducida por antígeno. Dichos anticuerpos, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, pueden usarse para el tratamiento de trastornos inmunitarios, en particular, trastornos inflamatorios y autoinmunitarios mediados por células T.
De acuerdo con la invención, se proporciona un anticuerpo anti LAG-3 agonista aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a lAG-3 e inhibe: la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+inducida por antígeno; y/o la activación de células T CD4+ y/o CD8+inducida por antígeno; que comprende:
una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 5 y 6; o una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26.
En particular, el anticuerpo es un anticuerpo agonista monoclonal anti-LAG-3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
El término "LAG-3", que se usa en el presente documento, se refiere al gen-3 de activación de linfocitos. El término "LAG-3" incluye variantes, isoformas, homólogos, ortólogos y parálogos. Por ejemplo, en determinados casos, anticuerpos específicos para una proteína LAG-3 humana, pueden reaccionar en cruzado con una proteína LAG-3 de una especie distinta a la humana. En otras realizaciones, los anticuerpos específicos para una proteína LAG-3 humana, pueden ser completamente específicos para la proteína LAG-3 humana y pueden no presentar especies u otros tipos de reactividad cruzada, o pueden reaccionar en cruzado con la proteína LAG-3 de otras especies determinadas, pero no con la de todas las demás (por ejemplo, pueden reaccionar en cruzado con la proteína LAG-3 de mono pero no con la de ratón). La expresión "LAG-3 humana" se refiere a la secuencia LAG-3 humana, tal como la secuencia de aminoácidos completa de LAG-3 humana que tiene el número de registro de Genbank NP 002277 (SEQ ID NO: 38), o la secuencia de aminoácidos de la proteína LAG-3 humana dada en la figura 1 (SEQ ID NO: 27). la expresión "LAG-3 de ratón" se refiere a la secuencia LAG-3 de ratón, tal como la secuencia de aminoácidos completa de LAG-3 de ratón que tiene el número de registro de Genbank NP_032505. En la técnica, LAG-3 también se conoce, por ejemplo, como CD223. La secuencia de LAG-3 humana puede diferir de LAG-3 humana de número de registro de Genbank NP_002277 por tener, por ejemplo, mutaciones conservadas o mutaciones en regiones no conservadas y la LAG-3 tiene sustancialmente la misma función biológica que la LAG-3 humana de número de registro de Genbank NP_002277. Por ejemplo, una función biológica de LAG-3 humana es tener un epítopo en el dominio extracelular de LAG-3 que se une específicamente por un anticuerpo de la presente divulgación o una función biológica de LAG-3 humana es unirse a moléculas de MHC de Clase II.
La expresión "LAG-3 de mono" pretende abarcar proteínas LAG-3 expresadas por monos del Viejo y del Nuevo Mundo, incluyendo, pero sin limitación, LAG-3 de mono cynomolgus (Macaca fascicularis) y de mono rhesus (Macaca mulatta). Una secuencia de aminoácidos representativa de LAG-3 de mono es la secuencia de aminoácidos de LAG-3 de mono rhesus que también se deposita como número de registro de Genbank XM_001108923. Otra secuencia de aminoácidos representativa de LAG-3 de mono es la secuencia alternativa de mono rhesus del clon pa23-5 como se describe en el documento US 2011/0150892 A1. En comparación con la secuencia depositada en el Genbank, esta secuencia alternativa de rhesus exhibe una sola diferencia de aminoácidos en la posición 419.
Una secuencia de LAG-3 humana particular será generalmente al menos 90 % idéntica, en cuanto a la secuencia de aminoácidos, a la de LAG-3 humana de número de registro de Genbank NP_002277 y contendrá restos de aminoácido que identifiquen como humana la secuencia de aminoácidos cuando se compare con las secuencias de aminoácidos de LAG-3 de otras especies (por ejemplo, una especie murina). En determinados casos, una LAG-3 humana puede ser al menos 95 %, o incluso al menos 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica, en cuanto a la secuencia de aminoácidos, a la LAG-3 de número de registro de Genbank NP_002277. En determinadas realizaciones, una secuencia de LAG-3 humana no presentará más de 10 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de LAG-3 de número de registro de Genbank NP_002277. En determinadas realizaciones, la LAG-3 humana puede presentar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 o 1 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de LAG-3 de número de registro de Genbank NP_002277. El porcentaje de identidad puede determinarse como se describe en el presenta documento.
En el presente documento, los términos "agonístico" y "agonista" se usan indistintamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno. En algunas realizaciones, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD4+ y CD8+ inducida por antígeno. En realizaciones particulares, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno más que la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno.
La Figura 21 ilustra las diferencias entre anticuerpos anti LAG-3 empobrecedores, anticuerpos anti LAG-3 antagonistas, y anticuerpos de la invención (es decir, anticuerpos anti LAG-3 agonistas y anticuerpos que se unen a LAG-3 e inhiben la proliferación o la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno).
Un anticuerpo anti LAG-3 empobrecedor ocasiona el empobrecimiento de células T activadas al unirse a la proteína LAG-3 expresada en la superficie de las células. El empobrecimiento puede producirse por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) o por citotoxicidad dependiente del complemento (c Dc , complement-dependent cytotoxicity). En la ADCC, la región Fc del anticuerpo empobrecedor se une a receptores de Fc (FcyR) en la superficie de células efectoras inmunitarias, tales como células citolíticas naturales y macrófagos, lo que conduce a la lisis de células diana. En la CDC, la región Fc del anticuerpo empobrecedor se une al componente C1q del complemento, y la célula diana se destruye desencadenando la cascada del complemento en la superficie celular. Por tanto, los anticuerpos anti LAG-3 empobrecedores inhiben respuestas inmunitarias mediadas por células T. Se apreciará que los efectos de los anticuerpos anti LAG-3 empobrecedores son duraderos e irreversibles ya que causan la destrucción de células T activadas. Dichos anticuerpos son útiles, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos inflamatorios y autoinmunitarios y para la prevención del rechazo de trasplantes.
Un anticuerpo antagonista anti LAG-3 se une a la proteína LAG-3 en la superficie de células T activadas e impide la interacción de LAG-3 con moléculas del MHC de clase II en la superficie de células presentadoras de antígeno (APC). Esto bloquea la regulación negativa de la transducción de señales que se produce cuando las APC se unen a LAG-3 en células T activadas. En consecuencia, los anticuerpos anti LAG-3 antagonistas impiden la regulación negativa de la proliferación, función y homeostasis de células T normalmente mediada por LAG-3. Dichos anticuerpos son útiles, por ejemplo, para el tratamiento del cáncer y enfermedades infecciosas.
Los anticuerpos de la invención se unen a LAG-3 en la superficie de células T activadas y regulan negativamente la transducción de señales a través del agonismo de LAG-3, ocasionando una regulación negativa de la proliferación y/o activación de células T. Por tanto, los anticuerpos de la invención inhiben respuestas inmunitarias mediadas por células T, en particular, mediante la inhibición de la proliferación y/o la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno. Los efectos de dichos anticuerpos son reversibles, y pueden ser menos duraderos que los efectos de los anticuerpos anti LAG-3 empobrecedores ya que no causan la destrucción de células T activadas. Se apreciará que el período de tiempo durante el cual un anticuerpo de la invención es eficaz dependerá de la semivida en plasma del anticuerpo.
La inhibición de la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido por el experto. Un ejemplo de un método adecuado es medir la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por péptidos antigénicos en presencia del anticuerpo o fragmento, en comparación con la correspondiente proliferación en presencia de un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo. Por ejemplo, en una muestra de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) obtenida de un donante sano, puede haber células T CD4+ y CD8+. La proliferación de las células puede inducirla cualquier péptido antigénico adecuado, tal como un conjunto de péptidos que cubra la secuencia de CMV pp35. La proliferación de las células puede medirse etiquetando las células, por ejemplo, con un colorante de tinción celular fluorescente, tales como éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE, carboxyfluorescein succinimidyl ester). Un ejemplo de un método para determinar la inhibición de la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno, se describe más adelante con más detalle en el Ejemplo 10.
El porcentaje de inhibición de la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ puede determinarse como un porcentaje de inhibición del índice de proliferación (IP), calculado como la suma de: el porcentaje de células T CD4+ y/o CD8+ por debajo de cada pico de división (evaluado por FACS), multiplicado por el número de división, como se describe más adelante con más detalle en el Ejemplo 10.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en comparación con la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno en ausencia del anticuerpo o fragmento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en comparación con la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno en ausencia del anticuerpo o fragmento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de cada una de las células T CD4+ y CD8+ inducida por antígeno, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en comparación con la proliferación de células T CD4+ y CD8+ inducida por antígeno, respectivamente, en ausencia del anticuerpo o fragmento.
En una realización, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno en al menos un 20 % en comparación con la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno en ausencia del anticuerpo o fragmento, e inhibe la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno en al menos un 30 % en comparación con la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno en ausencia del anticuerpo o fragmento.
La inhibición de la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno, por un anticuerpo de la invención, o fragmento del mismo, puede compararse con la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno en presencia de un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, o fragmento del mismo.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, más de lo que el anticuerpo o fragmento inhibe la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno.
De acuerdo con algunas realizaciones, la inhibición de la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno, es dependiente de LAG-3 e independiente de IL-2.
De acuerdo con algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación y la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno.
En particular, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede unirse a LAG-3 e inhibir la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a LAG-3 e inhibe la activación de células T.CD4+ y CD8+ inducida por antígeno.
La inhibición de la activación de células T CD4+ y/o CD8+ puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido por el experto. Un ejemplo de un método adecuado es medir el efecto del anticuerpo, o fragmento, sobre la expresión del marcador de activación de células T CD4+ y/o CD8+ o la secreción del marcador de activación de células T. Por ejemplo, la activación de células T CD8+ puede medirse midiendo la expresión de CD25, como un marcador de activación, en células T CD8+ inducidas por péptidos antigénicos en presencia del anticuerpo o fragmento, en comparación con la correspondiente expresión de CD25 en presencia de un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo. Como alternativa, la activación de células T puede medirse midiendo la secreción de IFN-y en el sobrenadante celular de células T inducida por péptidos antigénicos en presencia del anticuerpo o fragmento, en comparación con la correspondiente secreción en presencia de un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo. Por ejemplo, en una muestra de CMSP obtenida de un donante sano, puede haber células T. La activación de las células puede inducirla cualquier péptido antigénico adecuado, tal como un conjunto de péptidos que cubra la secuencia de CMV pp35. Un ejemplo de un método para determinar la inhibición de la activación de células T inducida por antígeno midiendo la secreción del marcador de activación de células T se describe más adelante con más detalle en el Ejemplo 15. Un ejemplo de un método para determinar la inhibición de la activación de células T CD8+ inducida por antígeno midiendo la expresión del marcador de activación de células T CD8+ se describe más adelante con más detalle en el Ejemplo 16.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %, en comparación con la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno en ausencia del anticuerpo o fragmento.
La inhibición de la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno, mediante un anticuerpo de la invención, o fragmento del mismo, puede compararse con la activación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno en presencia de un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, o fragmento del mismo.
De acuerdo con algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II.
IMP321 (denominada también más adelante "LAG-3Ig") es una proteína de fusión LAG-3Ig humana soluble recombinante. La proteína de fusión se obtiene como un dímero de 200 kDa producido en células de ovario de hámster chino (CHO, Chínese hámster ovary) transfectadas con un plásmido que codifica el dominio extracelular de LAG-3 humana fusionado al Fc de la IgG1 humana. La secuencia de IMP321 se proporciona en la SEQ ID NO: 17 de la solicitud de patente de Estados Unidos N.° 2011/0008331.
La unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II puede determinarse midiendo la unión de un conjugado IMP321-etiqueta (por ejemplo, un conjugado IMP321-Alexa 488) con células Raji (estas son células B positivas al MHC de clase II), por ejemplo, como se describe más adelante en el Ejemplo 8.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II en al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 %, en comparación con la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II en ausencia del anticuerpo o fragmento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II en al menos un 30%, en comparación con la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II en ausencia del anticuerpo o fragmento, donde la relación de la concentración del anticuerpo, o fragmento, con respecto a IMP321 es de 0,1:1.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II en al menos un 80%, en comparación con la unión de IMP321 con células positivas al MHC de clase II en ausencia del anticuerpo o fragmento, donde la relación de la concentración del anticuerpo, o fragmento, con respecto a IMP321 es de 0,3:1 o de 1:1.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de monocitos inducida por IMP321.
IMP321 puede activar células de la línea celular monocítica humana THP-1. La activación de células THP-1 puede determinarse a través del nivel de secreción del ligando 4 de quimiocina (CCL4, chemokine ligand 4, también conocido como proteína 13 inflamatoria de macrófagos, MIP-1p) por las células THP-1. La preincubación de un anticuerpo, o fragmento, de la invención con IMP321 antes de la incubación de la mezcla con células THP-1, puede usarse para determinar si el anticuerpo, o fragmento, inhibe la activación de monocitos inducida por IMP321. Un método para determinar la inhibición de la activación de monocitos inducida por IMP321 se describe más adelante con más detalle en el Ejemplo 9.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de monocitos inducida por IMP321 en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % en comparación con la cantidad de activación de monocitos inducida por IMP321 en ausencia del anticuerpo o fragmento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de monocitos inducida por IMP321 en al menos un 70 % en comparación con la cantidad de activación de monocitos inducida por IMP321 en ausencia del anticuerpo o fragmento, donde la relación de la concentración del anticuerpo, o fragmento, con respecto a IMP321 es de 1:1.
Huard et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 11: 5744-5749, 1997) describen la caracterización del sitio de unión del MHC de clase II en la proteína LAG-3. Muchos de los restos esenciales para la unión de proteínas del MHC de clase II están agrupados en la base de una estructura grande de bucle extra de 30 aminoácidos en el dominio D1 de LAG-3. La secuencia de aminoácidos de la estructura de bucle extra del dominio D1 de la proteína LAG-3 humana es GPPAAAPGHPLAPGPHPAAPSSWGPRPRRY (SEQ ID NO: 40), la secuencia se muestra subrayada en la figura 1. Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede unirse a un epítopo de la proteína LAG-3 humana que se solapa con el sitio de unión del MHC de clase II en lAG-3.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede unirse a un epítopo que se solapa con el bucle extra de 30 aminoácidos del primer dominio D1 aminoterminal de la proteína LAG-3 humana.
En otras realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, no se une a la secuencia de bucle extra de 30 aminoácidos (SEQ ID NO: 40) del primer dominio D1 aminoterminal de la proteína LAG-3 humana.
Un anticuerpo de la invención puede inhibir la unión de LAG-3 con moléculas de MHC de clase II in vivo. En particular, un anticuerpo de la invención puede antagonizar la señal de activación del MHC de clase II en células presentadoras de antígeno (APC). Por tanto, un anticuerpo de la invención puede inhibir la activación de APC inducida por LAG-3, por ejemplo, la activación de células dendríticas, por ejemplo, la activación de monocitos o macrófagos inducida por lAG-3.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la unión de LAG-3 con células positivas al MHC de clase II en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 %, en comparación con la unión de LAG-3 con células positivas al MHC de clase II en ausencia del anticuerpo o fragmento.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la activación de APC inducida por LAG-3 en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % en comparación con la cantidad de activación de APC inducida por LAG-3 en ausencia del anticuerpo o fragmento. Un anticuerpo monoclonal de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, complementarity determining regions) de una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y tres CDR de una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. También se proporciona un anticuerpo anti LAG-3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y tres CDR de una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Las CDR de la región VH del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y las CDR de la región VL del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6.
Las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VH, y las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 5 y 6 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VL. Sin embargo, en una realización preferida, el anticuerpo, o fragmento del mismo, comprende la CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nO: 2 y la CDR-H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y/o la CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 y la CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.
Las CDR de la región VH del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, y las CDR de la región VL del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21,22 y 23, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26.
Las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VH, y las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VL. Sin embargo, en una realización preferida, el anticuerpo, o fragmento del mismo, comprende la CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21, la CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nO: 22 y la CDR-H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23, y/o la CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24, la CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 25 y la CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26.
En algunas realizaciones, las CDR de una región VH de anticuerpo se seleccionan de las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 21, 22 y 23, y las CDR de una región VL de anticuerpo se seleccionan de las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 4, 5, 6, 24, 25 y 26, En algunas realizaciones, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VH de anticuerpo que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH, donde la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21 y/o la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22 y/o la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23. En algunas realizaciones:
la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21 y la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22;
la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21 y la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23;
la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22 y la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; o
la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21, la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22 y la CDR3 Vh tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23.
En algunas realizaciones, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VL de anticuerpo que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL, donde la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24 y/o la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25 y/o la CDR3 VL tiene una secuencia de aminoácidos secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26.
En algunas realizaciones:
la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24 y la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25;
la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24 y la CDR3 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26;
la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25 y la CDR3 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; o
la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24, la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25 y la CDR3 Vl tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26.
En realizaciones particulares, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: una región VH de anticuerpo que comprende: una cDR1 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una CDR2 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; y una CDR3 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una región VL de anticuerpo que comprende: una CDR1 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una CDR2 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25; y una CDR3 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una región VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En una realización preferida, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VH de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y una región VL de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo y/o una región VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica, o que es idéntica, a la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y/o VL del anticuerpo monoclonal anti LAG-3 de ratón 13E2, descrito en el presente documento en los Ejemplos 1, 2 y 3 (secuencia de aminoácidos de VH de 13E2: SEQ ID NO:7; secuencia de aminoácidos de VL de 13E2: SEQ ID NO: 8).
También se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión a LAG-3 con un anticuerpo que comprende una región VH de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y una región VL de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Además, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión a LAG-3 con el anticuerpo monoclonal anti LAG-3 de ratón 13E2.
Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y/o una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
También se proporciona un anticuerpo anti LAG-3, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una, dos o tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y/o una, dos o tres CDR de una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
Las CDR de la región VH del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11, 12 y 13, y las CDR de la región VL del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 14, 15 y 16.
Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11, 12 y 13, y/o una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 14, 15 y 16.
Las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11, 12 y 13 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VH, y las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 14, 15 y 16 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VL. Sin embargo, en una realización preferida, el anticuerpo, o fragmento del mismo, comprende la CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11, la CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nO: 12 y la CDR-H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, y/o la CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, la CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15 y la CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16.
Las CDR de la región VH del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 31, 32 y 33, y las CDR de la región VL del anticuerpo pueden ser las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34, 35 y 36.
Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 31, 32 y 33, y/o una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34, 35 y 36.
Las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 31, 32 y 33 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VH, y las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 34, 35 y 36 pueden estar presentes en cualquier orden en la región VL. Sin embargo, en una realización preferida, el anticuerpo, o fragmento del mismo, comprende la CDR-H1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31, la CDR-H2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID nO: 32 y la CDR-H3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33, y/o la CDR-L1 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34, la CDR-L2 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID No: 35 y la CDR-L3 que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36.
En algunas realizaciones, las CDR de la región VH del anticuerpo se seleccionan de las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 11, 12, 13, 31, 32 y 33, y las CDR de la región VL del anticuerpo se seleccionan de las CDR de la secuencia de aminoácidos de las SeQ ID No: 14, 15, 16, 34, 35 y 36.
En algunas realizaciones, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VH de anticuerpo que comprende una CDR1 VH, una CDR2 VH y una CDR3 VH, donde la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31 y/o la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32 y/o la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33.
En algunas realizaciones:
la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31 y la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32;
la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31 y la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33;
la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32 y la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; o
la CDR1 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31, la CDR2 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32 y la CDR3 VH tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33.
En algunas realizaciones, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VL de anticuerpo que comprende una CDR1 VL, una CDR2 VL y una CDR3 VL, donde la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34 y/o la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35 y/o la CDR3 VL tiene una secuencia de aminoácidos secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36.
En algunas realizaciones:
la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34 y la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35;
la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34 y la CDR3 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36;
la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35 y la CDR3 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; o
la CDR1 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34, la CDR2 VL tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35 y la CDR3 Vl tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36.
En realizaciones particulares, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende: una región VH de anticuerpo que comprende: una CDR1 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31, una CDR2 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32, y una CDR3 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una región Vl de anticuerpo que comprende: una CDR1 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34, una CDR2 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35, y una CDR3 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36.
Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y/o una región VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
En una realización preferida, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VH de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 17, y/o una región VL de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 18.
Un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región VH de anticuerpo y una región VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica, o que es idéntica, a la secuencia de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo monoclonal anti LAG-3 de ratón 34F4, descrito en el presente documento en los Ejemplos 4, 5 y 6 (secuencia de aminoácidos de VH de 34F4: SEQ ID NO:17; secuencia de aminoácidos de VL de 34F4: SEQ ID NO: 18).
También se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión a LAG-3 con un anticuerpo que comprende una región VH de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y una región VL de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Además, se proporciona un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que compite por la unión a LAG-3 con el anticuerpo monoclonal anti LAG-3 de ratón 34F4.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, que difieren de las del anticuerpo 13E2 por una o más modificaciones conservativas, por ejemplo, hasta cinco modificaciones conservativas. En la técnica se entiende que pueden realizarse ciertas modificaciones conservativas de secuencia que no eliminan la unión con el antígeno. Véanse, por ejemplo, Brummell et al. (1993) Biochem 32:1180-8; de Wildt et al. (1997) Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al. (1992) J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell (1993) Biochem. 32:6862-35; Adib-Conquy et al. (1998) Int. Immunol. 10:341-6 y Beers et al. (2000) Clin. Can. Res. 6:2835-43.
Como se usa en el presente documento, la expresión "modificaciones conservativas de secuencia" se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. En un anticuerpo de la invención pueden introducirse modificaciones mediante técnicas convencionales conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservativas de aminoácidos son aquellas en las que el resto de aminoácido se reemplaza por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, usando los ensayos funcionales descritos en el presente documento, uno o más restos de aminoácido dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención, pueden reemplazarse por otros restos de aminoácido de la misma familia de cadenas laterales y el anticuerpo alterado puede someterse a ensayo para determinar la función conservada (es decir, las funciones expuestas anteriormente).
Los anticuerpos de la invención pueden prepararse usando como material de partida un anticuerpo que tenga una o más de las secuencias VH y/o VL de 13E2 para diseñar mediante ingeniería genética un anticuerpo modificado. Un anticuerpo puede diseñarse mediante ingeniería genética modificando uno o más restos en una o en ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo, en una o más regiones CDR y/o en una o más regiones estructurales. De manera adicional o como alternativa, un anticuerpo puede diseñarse mediante ingeniería genética modificando restos en una o más regiones constantes, por ejemplo, para alterar una o más funciones efectoras del anticuerpo.
En determinadas realizaciones, para diseñar mediante ingeniería genética regiones variables de anticuerpos puede usarse injertación de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos diana, predominantemente a través de restos de aminoácido que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y cadena ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDR. Debido a que las secuencias de CDR son las responsables de la mayoría de las interacciones entre antígeno-anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de los anticuerpos específicos de origen natural construyendo vectores de expresión que incluyan secuencias de CDR procedentes del anticuerpo específico de origen natural injertado sobre secuencias estructurales de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véanse, por ejemplo, Riechmann et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033; y las patentes de Estados Unidos N.° 5.225.539; 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370).
De acuerdo con la invención, también se proporciona un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (es decir, las CDR de 13E2). Aunque dichos anticuerpos contienen las secuencias de CDR de VH y VL del anticuerpo monoclonal 13E2, pueden contener secuencias estructurales diferentes.
De manera similar, también se proporciona un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, y/o que comprende la CDR1, CDR2 y CDR3 de una región variable de cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 (es decir, las CDR de 34F4). Aunque dichos anticuerpos contienen las secuencias de CDR de VH y VL del anticuerpo monoclonal 34F4, pueden contener secuencias estructurales diferentes.
Dichas secuencias estructurales pueden obtenerse a partir de bases de datos de ADN públicas o de referencias publicadas que incluyan secuencias génicas de la línea germinal del anticuerpo. Por ejemplo, pueden encontrarse secuencias de ADN de línea germinal de genes de la región variable de cadena pesada y ligera humana en la base de datos de secuencias de la línea germinal humana "VBase" (disponible en Internet en www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat et al. (1991), citado anteriormente; Tomlinson et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y en Cox et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; incorporándose el contenido de cada uno de ellos expresamente como referencia en el presente documento. Como ejemplo adicional, en la base de datos de Genbank pueden encontrarse secuencias de ADN de línea germinal de genes de la región variable de cadena pesada y ligera humana. Por ejemplo, las siguientes secuencias de línea germinal de cadena pesada encontradas en el AcMHu HCo7 de ratón, están disponibles en los números de registro de Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como ejemplo adicional, las siguientes secuencias de línea germinal de cadena pesada encontradas en el AcMHu HCol2 de ratón, están disponibles en los números de registro de Genbank adjuntos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678).
Las secuencias proteicas de anticuerpos se comparan con una base de datos de secuencias proteicas compilada usando uno de los métodos de búsqueda de similitud de secuencias denominado Gapped BLAST (Altschul et al. (1997), citado anteriormente), muy conocido por los expertos en la materia.
Las secuencias estructurales preferidas para su uso en los anticuerpos de la invención, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias estructurales de los anticuerpos 13E2 o 34F4.
Las secuencias que muestran una alineación significativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo monoclonal 13E2 incluyen los siguientes genes de la línea germinal: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
Las secuencias que muestran una alineación significativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo monoclonal 13E2 incluyen los siguientes genes de la línea germinal: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02.
Las secuencias que muestran una alineación significativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo monoclonal 34F4 incluyen los siguientes genes de la línea germinal: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
Las secuencias que muestran una alineación significativa con la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo monoclonal 34F4 incluyen los siguientes genes de la línea germinal: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
Las secuencias estructurales de cadena pesada preferidas para su uso en los anticuerpos de la invención, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias estructurales codificadas por el gen V de la línea germinal IGHV8-8*01, IGHV8-11*01 o IGHV8-12*01, especialmente IGHV8-8*01. Las secuencias estructurales de cadena ligera preferidas para su uso en los anticuerpos de la invención, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias estructurales codificadas por el gen V de la línea germinal IGKV6-17*01, IGKV6-25*01 o IGKV6-23*01, especialmente IGKV6-17*01.
Las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de VH y VL, pueden injertarse en regiones estructurales que tengan la misma secuencia que la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal del que procede la secuencia estructural, o las secuencias de CDR pueden injertarse en regiones estructurales que contengan una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en determinados casos, es beneficioso mutar restos dentro de las regiones estructurales para conservar o mejorar la capacidad de unión del anticuerpo con el antígeno (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 y 6.180.370).
Otro tipo de modificación de la región variable es mutar restos de aminoácido en las regiones VH y/o VL de las CDR1, CDR2 y/o CDR3 para mejorar así una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo de interés. Para introducir una o más mutaciones se puede realizar mutagénesis dirigida o mutagénesis mediada por PCR y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en ensayos in vitro o in vivo como se describe en el presente documento y se proporciona en los Ejemplos. Preferentemente (como se ha indicado anteriormente) se introducen modificaciones conservativas. Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pero son, preferentemente, sustituciones. Por otra parte, normalmente en una región CDR, a lo sumo se alteran uno, dos, tres, cuatro o cinco restos. En algunas realizaciones, en total, a lo sumo se alteran uno, dos, tres, cuatro o cinco restos en las seis regiones CDR.
En realizaciones particulares, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
una región VH de anticuerpo que comprende: una CDR1 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una Cd R2 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; y una CDR3 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una región VL de anticuerpo que comprende: una CDR1 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una CDR2 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25; y una CDR3 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; o
una variante de los mismos, en la que a lo sumo se alteran uno, dos, tres, cuatro o cinco restos de aminoácido mediante sustitución, adición o deleción de aminoácidos, en las secuencias de CDR.
En realizaciones particulares, un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
una región VH de anticuerpo que comprende: una CDR1 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31, una Cd R2 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32, y una CDR3 VH con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una región VL de anticuerpo que comprende: una CDR1 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34, una CDR2 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35, y una CDR3 VL con una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; o
una variante de los mismos, en la que a lo sumo se alteran uno, dos, tres, cuatro o cinco restos de aminoácido mediante sustitución, adición o deleción de aminoácidos, en las secuencias de CDR.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 VH que comprende la SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 1; (b) una región CDR2 VH que comprende la SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 2; y (c) una región CDR3 VH que comprende la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 3; y/o una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una región CDR1 VL que comprende la SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 4; (b) una región CDR2 VL que comprende la SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 5; y (c) una región CDR3 VL que comprende la SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 6.
En una realización adicional, se proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 VH que comprende la SEQ ID NO: 11, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 11; (b) una región CDR2 VH que comprende la SEQ ID NO: 12, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 12; y (c) una región CDR3 VH que comprende la SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 13; y/o una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una región CDR1 VL que comprende la SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 14; (b) una región CDR2 VL que comprende la SEQ ID NO: 15, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 15; y (c) una región CDR3 VL que comprende la SEQ ID NO: 16, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 16.
En otra realización, se proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 VH que comprende la SEQ ID NO: 21, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 21; (b) una región CDR2 VH que comprende la SEQ ID NO: 22, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 22; y (c) una región CDR3 VH que comprende la SEQ ID NO: 23, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 23; y/o una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una región CDR1 VL que comprende la SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 24; (b) una región CDR2 VL que comprende la SEQ ID NO: 25, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 25; y (c) una región CDR3 VL que comprende la SEQ ID NO: 26, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 26.
En una realización adicional, se proporciona un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 VH que comprende la SEQ ID NO: 31, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 31; (b) una región CDR2 VH que comprende la SEQ ID NO: 32, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 32; y (c) una región CDR3 VH que comprende la SEQ ID NO: 33, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 33; y/o una región variable de cadena ligera que comprende: (a) una región CDR1 VL que comprende la SEQ ID NO: 34, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 34; (b) una región CDR2 VL que comprende la SEQ ID NO: 35, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 35; y (c) una región CDR3 VL que comprende la SEQ ID NO: 36, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la SEQ ID NO: 36.
Los anticuerpos diseñados de la invención, incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los restos estructurales en VH y/o VL, por ejemplo, para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente, dichas modificaciones estructurales se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque es "retromutar" uno o más restos estructurales en la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener restos estructurales que difieran de los de la secuencia de la línea germinal de la cual procede el anticuerpo. Dichos restos pueden identificarse comparando las secuencias estructurales del anticuerpo con las secuencias de la línea germinal de la cual procede el anticuerpo.
Otro tipo de modificación estructural implica la mutación de uno o más restos en la región estructural, o incluso en una o más regiones CDR, para eliminar epítopos de células T y reducir así la posible inmunogenicidad del anticuerpo. Este planteamiento también se denomina "desinmunización" y se describe con más detalle en la publicación de patente de Estados Unidos n.° 20030153043.
Además, o de forma alternativa a las modificaciones realizadas en las regiones estructurales o CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para que incluyan modificaciones en la región Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la semivida en suero, la fijación del complemento, la unión al receptor de Fc y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (por ejemplo, uno o más residuos químicos pueden conectarse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, para alterar de nuevo una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe más adelante con más detalle. La numeración de restos en la región Fc es la del índice de la UE de Kabat.
En una realización, la región bisagra de CF11 se modifica, de tal manera que el número de restos de cisteína en la región bisagra se altera, por ejemplo, aumenta o disminuye. Este planteamiento se describe con más detalle en la patente de Estados Unidos N.° 5.677.425. El número de restos de cisteína en la región bisagra de CF11 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo, se muta para disminuir la semivida biológica del anticuerpo. Más específicamente, en la región de interfase de dominio CF12-CF13 del fragmento bisagra de Fc, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos, de tal manera que el anticuerpo tiene alterada la unión de la proteína A estafilocócica (SpA, Staphylococcyl protein A) con respecto a la unión de Spa del dominio bisagra de Fc nativo. Este planteamiento se describe con más detalle en la patente de Estados Unidos N.° 6.165.745.
En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su semivida biológica. La clase de IgG es la más estable y tiene una semivida en suero de 20 días, mientras que las IgM y la IgA persisten solo durante 5-8 días (Brekke & Sandlie, 2003, Nature Reviews Drug Discovery 2, 52-62). Son posibles varios planteamientos. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 6.277.375. Como alternativa, para aumentar la semivida biológica, en la región CF11 o CL, el anticuerpo puede alterarse para que contenga un epítopo de unión a un receptor de rescate tomado de dos bucles de un dominio CF12 de una región Fc de una IgG, como se describe en las patentes de Estados Unidos N.° 5.869.046 y 6.121.022.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, debe carecer de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), de manera que el anticuerpo o el fragmento pueda usarse para regular negativamente la proliferación y/o la función de las células T sin producir el empobrecimiento de células T como resultado de la ADCC o de la CDC.
En la ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a receptores de Fc (FcyR) en la superficie de células efectoras inmunitarias, tales como células citolíticas naturales y macrófagos, lo que conduce a la lisis de células diana. En la CDC, la región Fc se une al componente C1q del complemento, y la célula diana se destruye activando la cascada del complemento en la superficie celular. La actividad ADCC y CDC de un anticuerpo depende de su isotipo. Tanto la IgM como la IgG pueden mediar en la fijación del complemento, mientras que solo la IgG puede promover la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Las isoformas de IgG presentan diferentes niveles de CDC y ADCC:
IgG: CDC (hIgG3>hIgG1>hIgG2>hIgG4; mIgG2a>mIgG1);
ADCC (hIgG1>hIgG3>hIgG2>IgG4; mIgG2a>mIgG1)
Por tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una parte Fc de IgG1 de ratón o de IgG4 humana para garantizar que el anticuerpo o fragmento carezca de actividad ADCC y CDC.
La actividad ADCC y CDC de un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede determinarse mediante cualquier método adecuado conocido por el experto. En el documento WO 2008/132601, y más adelante, se describen ejemplos de ensayos adecuados con respecto a la actividad CDC y ADCC.
Un anticuerpo anti-LAG-3 que presente actividad CDC, destruirá sistemáticamente células LAG-3+ en presencia de complemento, en comparación con su control isotípico.
Para analizar la CDC, las células diana que se usan para evaluar un anticuerpo anti-LAG-3 pueden ser de una línea celular transfectada con LAG-3, o células T primarias activadas para inducir la expresión de LAG-3. Por ejemplo, en un posible ensayo para analizar la CDC, las células diana son células CHO LAG-3+ comparadas con células CHO tn (de tipo natural). Ambos tipos de células (es decir, células que expresan LAG-3 y células equivalentes que no expresan LAG-3), se incuban durante 1 hora a 37 °C con el anticuerpo de ensayo anti-LAG-3 o con su anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, y con suero de conejo que contiene complemento activo. Después, se evalúa la viabilidad celular usando 7-Amino-Actinomicina D (7-AAD), un colorante fluorescente que etiqueta las células que han perdido su integridad membranosa, un fenómeno que aparece rápidamente después de la muerte. El porcentaje de células CHO positivas a 7-AAD (es decir, células diana muertas), se determina mediante análisis de citometría de flujo. Un anticuerpo que presenta actividad CDC solo destruirá células LAG-3+ (por ejemplo, células CHO LAG-3+) en presencia de complemento. El título del Ac anti-LAG-3 puede reducirse para determinar la eficacia del anticuerpo en cuanto a activar CDC a una concentración baja de anticuerpo.
También puede realizarse un ensayo de CDC en CMSP estimuladas con el superantígeno SEB. La citotoxicidad del anticuerpo de ensayo se analizó en células T CD4+ auxiliares y citotóxicas CD8+, tanto activadas (en concreto células CD25+/LAG-3+) como no activadas (en concreto células CD25-/LAG-3-). Sólo los linfocitos T CD4+ y CD8+ activados son destruidos específicamente por un anticuerpo que presenta CDC.
Para analizar la ADCC, CMSP se estimulan durante un día con IL-2 para que sirvan como células efectoras y las células que expresan LAG-3 (por ejemplo, células CHO LAG-3+) se etiquetan con el colorante vital CFSE para que sirvan como células diana. En presencia de anticuerpo de ensayo anti-LAG-3, si las células (CMSP) efectoras, pueden destruir un porcentaje significativo de células que expresan LAG-3 (por ejemplo, células CHO LAG-3+), en comparación con un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, el anticuerpo de ensayo presenta ADCC. Este efecto debería aumentar con el número de células efectoras. El título del anticuerpo de ensayo puede reducirse para determinar la eficacia del anticuerpo en cuanto a inducir ADCC a una concentración baja de anticuerpo.
Se puede considerar que un anticuerpo de ensayo anti-LAG-3 no presenta CDC o ADCC cuando destruye menos del doble de células LAG-3+ que un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo en cualquiera de los ensayos descritos anteriormente.
La destrucción de células diana se usa en bioensayos de ADCC clásicos, en los que como células efectores se usan células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de donantes o la subpoblación de células citolíticas naturales (NK, natural killer). Sin embargo, la respuesta de estas células puede variar y pueden producirse lecturas de fondo altas. Un bioensayo indicador de ADCC disponible en Promega, usa una lectura alternativa en un punto anterior en la activación de la ruta de ADCC: la activación de la transcripción génica a través de la ruta de NFAt (factor nuclear de células T activadas, nuclear factor of activated T-cells) en la célula efectora. Además, el bioensayo indicador de ADCC usa células Jurkat diseñadas que expresan de manera estable el receptor de FcYRIIIa, la variante de V158 (alta afinidad) y un elemento de respuesta a NFAT que dirige la expresión de la luciferasa de luciérnaga como células efectoras. La actividad biológica del anticuerpo en ADCC se cuantifica a través de la luciferasa producida como resultado de la activación de la ruta de NFAT; la actividad luciferasa en la célula efectora se cuantifica con lectura de luminiscencia. Usando este ensayo, la señal es alta y el fondo del ensayo es bajo. En el ensayo solo se obtiene una buena respuesta cuando hay células diana con el antígeno de superficie correcto, el anticuerpo específico correcto y células efectoras que expresan FcYRIIIa. Si falta alguno de estos, no hay respuesta.
Al evaluar la actividad ADCC de un anticuerpo usando un bioensayo indicador de ADCC, se puede considerar que el anticuerpo sometido a ensayo no presenta ADCC cuando el aumento de bioluminiscencia medido es menor del doble que el de su anticuerpo de control negativo del mismo isotipo.
En otras realizaciones, la región Fc comprende una secuencia de Fc de IgG4 humana mutante con una mutación S228P que suprime el intercambio de brazo Fab (como se muestra en la Figura 20(A) para el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 que comprende la secuencia de cadena pesada 13E2IgG4mut).
En otras realizaciones, la región Fc comprende una parte C de la cadena kappa de Ig (IgK) humana de tipo natural (13E2IgK) (como se muestra en la figura 20(B) para el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 que comprende la secuencia de cadena ligera 13E2IgK).
La numeración de restos en la región Fc usada para el mutante de Fc de la IgG4 humana descrita anteriormente, es la numeración estándar del índice EU como se describe en Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5a edición - US Department of Health and Human Services, n.° de publicación NIH 91-3242, páginas 662, 680, 689 (1991)).
En otra realización adicional más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de hidratos de carbono pueden llevarse a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación estructurales de la región variable para eliminar así la glicosilación en este sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.714.350 y 6.350.861.
La pegilación es otra modificación de los anticuerpos del presente documento que se contempla en esta divulgación. Un anticuerpo puede pegilarse, por ejemplo, para aumentar la semivida biológica (por ejemplo, en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, se hace reaccionar normalmente con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado aldehido de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos de PEG llegan a conectarse con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se hayan usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono-alcoxi o ariloxi (C1-C10)-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. En la técnica se conocen métodos para pegilar proteínas y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Véanse, por ejemplo, los documentos EP 0154316 y EP 0401 384.
Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.
Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina", incluyen anticuerpos o inmunoglobulinas de cualquier isotipo, fragmentos de anticuerpos que conservan la unión específica con el antígeno, incluyendo, pero sin limitación, fragmentos Fab, Fv, scFv y Fd, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios (Acmc), anticuerpos de un solo dominio (Acd), anticuerpos de cadena pesada de un solo dominio, anticuerpos de cadena ligera de un solo dominio, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multiespecíficos y proteínas de fusión que comprenden una parte de unión a antígeno (también denominada en el presente documento unión antigénica) de un anticuerpo y una proteína que no es un anticuerpo. En el término también se incluyen fragmentos Fab', Fv, F(ab')2 y/u otros fragmentos de anticuerpo que conservan unión específica con el antígeno, y anticuerpos monoclonales. Un anticuerpo puede ser monovalente o bivalente. Un anticuerpo puede ser un monómero de lg, que es una molécula en "forma de Y" que consta de cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras conectadas por enlaces disulfuro. Los anticuerpos pueden etiquetarse de manera detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, con una enzima que genere un producto detectable, con una proteína fluorescente y similares. Adicionalmente, los anticuerpos pueden conjugarse con otros residuos, tales como con miembros de pares de unión específicos, por ejemplo, biotina (miembro del par de unión específico de biotina-avidina), y similares. Los anticuerpos también pueden unirse a un soporte sólido, incluyendo, pero sin limitación, placas o perlas de poliestireno, y similares.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una parte de un anticuerpo intacto, por ejemplo, la unión antigénica o la región variable del anticuerpo intacto. Como ejemplos de fragmentos de anticuerpo se incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)); anticuerpos de dominio (Acd; Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21:484); moléculas de anticuerpo monocatenario; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión a antígeno y un fragmento "Fc" residual, una denominación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación con el antígeno y que sigue teniendo la capacidad de entrecruzarse con el antígeno.
Un "fragmento Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de reconocimiento antigénico y de unión antigénica. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y otro de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En esta configuración es en la que las tres CDR de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de unión antigénica sobre la superficie del dímero Vh-Vl. En su conjunto, las seis CDR confieren al anticuerpo especificidad de unión antigénica. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer al antígeno y unirse al mismo, aunque con una afinidad más baja en comparación con todo el sitio de unión.
El fragmento "Fab" también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab' por la adición de algunos restos en el extremo carboxílico del dominio CH1 de cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. En el presente documento, Fab'-SH es la designación para Fab' en el que uno o más restos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Originalmente, se produjeron fragmentos de anticuerpo F(ab')2 como pares de fragmentos Fab' que tenían cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a una de dos tipos claramente distintas, denominadas kappa y lambda, basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas clases pueden dividirse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2. Las subclases pueden dividirse en tipos, por ejemplo, IgG2a e IgG2b.
Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "sFv" o "scFv", comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, el polipéptido Fv comprende además un enlazador polipeptídico entre los dominios Vh y Vl, lo que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión con el antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994). El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión antigénica, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) conectado a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh-Vl). Usando un enlazador que sea demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se fuerza a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión antigénica. Se describen diacuerpos con más detalle, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y en Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo producido por un grupo de células idénticas, todas ellas producidas a partir de una sola célula por replicación celular repetitiva. Esto es, el clon de células solo produce una única especie de anticuerpo. Aunque un anticuerpo monoclonal puede producirse usando tecnología de producción de hibridomas, también pueden usarse otros métodos de producción conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, anticuerpos procedentes de bibliotecas de presentación de anticuerpos en fagos).
Como se usa en el presente documento, el término "CDR" o la expresión "región determinante de complementariedad", pretenden referirse a los sitios no contiguos de combinación antigénica que se encuentran en la región variable de los polipéptidos de cadena tanto pesada como ligera. Las CDR se han descrito en Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991) (denominado también en el presente documento Kabat 1991); en Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) (denominado también en el presente documento Chothia 1987); y en MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996). Otro sistema es el sistema de numeración International ImMunoGeneTics (IMGT, International ImMunoGeneTics) (Lefranc et al., Nucleic Acids Research 27:209-212 (1999)). Las definiciones incluyen el solapamiento de subconjuntos de restos de aminoácido cuando se comparan entre sí. No obstante, se pretende que la aplicación de cualquiera de las definiciones para hacer referencia a una CDR de un anticuerpo o anticuerpos injertados o variantes de los mismos, esté dentro del alcance del término tal como se define y se usa en el presente documento. Los restos de aminoácido, que abarcan las CDR, como se define en cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen más adelante como comparación en la Tabla 1. Las CDR enumeradas en la Tabla 4 en el Ejemplo 2 y en la Tabla 9 en el Ejemplo 5, se definieron de acuerdo con Lefranc 1999 y Kabat 1991.
T l 1. D fini i n DR
Figure imgf000017_0001
Como se usa en el presente documento, los términos "CDR-L1", "CDR-L2" y "CDR-L3" se refieren, respectivamente, a la primera, segunda y tercera CDR en una región variable de cadena ligera. Como se usa en el presente documento, los términos "CDR-H1", "CDR-H2" y "CDR-H3" se refieren, respectivamente, a la primera, segunda y tercera CDR en una región variable de cadena pesada. Como se usa en el presente documento, los términos "CDR-1", "CDR-2" y "CDR-3" se refieren, respectivamente, a la primera, segunda y tercera CDR de la región variable de cualquiera de las cadenas.
Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno) y se expresa como una constante de disociación (Kd). La afinidad puede ser al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor, o al menos 1000 veces mayor, o más, que la afinidad de un anticuerpo por secuencias de aminoácidos no relacionadas. La afinidad de un anticuerpo por una proteína diana puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 100 nanomolar (nM) a aproximadamente 0,1 nM, de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 picomolar (pM), o de aproximadamente 100 nM a aproximadamente 1 femtomolar (fM) o mayor. Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución. Las expresiones "inmunorreactivo" y "se une preferentemente", se usan indistintamente en el presente documento con respecto a anticuerpos y/o a fragmentos de unión a antígeno.
El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido, por ejemplo, a interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas e iónicas y/o de enlace de hidrógeno, incluyendo interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua. Un anticuerpo de la invención se une específicamente a un epítopo dentro de una proteína LAG-3, particularmente una proteína LAG-3 humana. "Unión específica" se refiere a unión con una afinidad de al menos aproximadamente 5 x 10"7 M o mayor, por ejemplo, 10"7 M, 5 x 10"8M, 10"8M, o mayor. "Unión inespecífica" se refiere a unión con una afinidad de menos de aproximadamente 10"7 M, por ejemplo, unión con una afinidad de 10"6M, 10"5 M, 10"4 M, etc. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo que "se une específicamente a LAG-3 humana", pretende referirse a un anticuerpo que se une a la proteína LAG-3 humana (y posiblemente a una proteína LAG-3 de una o más especies no humanas) pero que no se une sustancialmente a proteínas no LAG-3. Preferentemente, el anticuerpo se une a la proteína LAG-3 humana con "alta afinidad", en concreto, con una Kd de 1x10-7 M o menor, más preferentemente 1x10-1 M o menor, más preferentemente 5x10-9 M o menor, más preferentemente 1x10-9 M o menor.
La expresión "no se une sustancialmente" a una proteína o a células, como se usa en el presente documento, significa que no se une, o que no se une con una alta afinidad, a la proteína o a las células, es decir, que se une a la proteína o a las células con una Kd de 1x10'6M o mayor, más preferentemente de 1x10-5M o mayor, más preferentemente de 1x10-4 M o mayor, más preferentemente de 1x10'3 M o mayor, incluso más preferentemente de 1x10-2 M o mayor.
El término "Kasoc" o "Ka", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kdis" o "Kd", como se usa en el presente documento, pretende referirse a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "Kd" como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de Kd con respecto a Ka. (es decir, Kd/Ka) y se expresa como concentración molar (M).
la expresión "alta afinidad" por un anticuerpo de IgG, se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 1x10-7 M o menor, más preferentemente de 5x10-8 M o menor, incluso más preferentemente de 1x10-8 M o menor, incluso más preferentemente de 5x10-9 M o menor e incluso más preferentemente de 1x10-9 M o menor, por un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" por un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una Kd de 10-6 M o menor, más preferentemente de 10-7 M o menor, incluso más preferentemente de 10-8 M o menor.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a una proteína LAG-3 humana con mayor afinidad (es decir, con una constante de disociación más baja) que la del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 antagonista 17B4 (Baixeras, et al., J. Exp. Med., 1992, Vol. 176: 327-337). El ejemplo 7 más adelante describe los resultados del análisis Biacore de la unión del anticuerpo 17B4 con la proteína LAG-3Ig humana. Los resultados muestran que la constante de disociación de 17B4 de la proteína LAG-3Ig humana fue de 3,69 nM. Por tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente invención se une a una proteína LAG-3 humana (o a una proteína LAG-3Ig humana) con una constante de disociación (Kd) de menos de 3,69 nM, por ejemplo, según lo determinado por análisis de Biacore.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la presente invención se une a una proteína LAG-3 humana (o a un derivado de la misma, tal como una proteína LAG-3Ig humana) con una constante de disociación (Kd) no superior a 3,5 nM, no superior a 2,5 nM, no superior a 2 nM, no superior a 1 nM, no superior a 0,9 nM, no superior a 0,8 nM, no superior a 0,7 nM, no superior a 0,6 nM, no superior a 0,5 nM, no superior a 0,4 nM, no superior a 0,3 nM, no superior a 0,2 nM, no superior a 0,1 nM. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 de la presente divulgación, se une a una proteína LAG-3 humana con una Kd no superior a 90 pM, no superior a 80 pM, no superior a 70 pM, no superior a 60 pM, no superior a 50 pM, no superior a 40 pM, no superior a 30 pM, no superior a 20 pM, no superior a 10 pM, no superior a 9 pM, no superior a 8 pM, no superior a 7 pM, no superior a 6 pM, no superior a 5 pM, no superior a 4 pM, no superior a 3 pM, no superior a 2 pM, o no superior a 1 pM.
El ejemplo 20 más adelante describe los resultados del análisis Biacore de la unión del anticuerpo de IgG4 13E2 quimérico (descrito a continuación) y de IgG4 13E2 humanizado (descrito a continuación), con la proteína LAG-3Ig humana. Los resultados muestran que la constante de disociación del anticuerpo de IgG413E2 quimérico para LAG-3Ig humana fue de 21,9 pM, y la del anticuerpo de IgG413E2 humanizado para LAG-3Ig humana fue de 22,8 pM. En realizaciones particulares, un anticuerpo de la presente invención se une a una proteína LAG-3 humana (o a una proteína LAG-3Ig humana) con una constante de disociación (Kd) no superior a 100 pM, no superior a 90 pM, no superior a 80 pM, no superior a 70 pM, no superior a 60 pM, no superior a 50 pM, no superior a 40 pM, no superior a 30 pM, o no superior a 25 pM, por ejemplo, según lo determinado por análisis de Biacore.
En algunas realizaciones, la afinidad de un anticuerpo de la invención, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % más alto que la afinidad de 17B4 por una proteína LAG-3 humana. En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser al menos 1,5, 2, 2,5, 3 o 3,5 veces la afinidad de 17B4 por una proteína LAG-3 humana.
Un experto en la técnica puede determinar la afinidad de un anticuerpo por una proteína LAG-3 humana, adecuadamente mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando un sistema biodetector, tal como un sistema de Biacore (Murphy et al, Using Biacore to measure the binding kinetics of an antibody-antigen interaction; Curr Protoc Protein Sci. Septiembre de 2006; capítulo 19: unidad 19.14). Por ejemplo, el análisis de Biacore puede usarse para determinar la constante de disociación entre un anticuerpo de la invención y una proteína LAG-3 humana.
La unión a la proteína LAG-3 humana puede evaluarse usando una o más técnicas distintas bien establecidas también en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo se puede someter a ensayo a través de un ensayo de citometría de flujo, en el que el anticuerpo reacciona con una línea celular que expresa la proteína LAG-3 humana, tal células CHO que se han transfectado para expresar la proteína LAG-3 humana en su superficie celular. Otras células adecuadas para su uso en ensayos de citometría de flujo incluyen CMSP estimuladas con SEB o células T CD4+ estimuladas con anti-CD3, que expresan la proteína LAG-3 nativa. Otros ensayos de unión adecuados incluyen ensayos ELISA, por ejemplo, usando una proteína LAG-3 recombinante.
Un anticuerpo de la invención es un anticuerpo aislado. Un anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones, el anticuerpo se purificará (1) a más del 90 %, más del 95 % o más del 98 %, en peso de anticuerpo, determinado por el método de Lowry, por ejemplo, más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos aminoterminal o interna usando un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta la homogeneidad mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis) en condiciones reductoras o no reductoras usando tinción de azul de Coomassie o de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes ya que no estará presente al menos un componente del entorno natural del anticuerpo. En algunos casos, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.
En realizaciones preferidas, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo humanizado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, particularmente, un anticuerpo monoclonal humanizado, o fragmento de unión a antígeno del mismo.
Un anticuerpo humanizado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región estructural de cadena ligera humanizada y/o una región estructural de cadena pesada humanizada.
La expresión "anticuerpo humanizado", como se usa en el presente documento, se refiere a una inmunoglobulina que comprende partes de inmunoglobulinas de diferente origen, donde al menos una parte comprende secuencias de aminoácidos de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender partes procedentes de una inmunoglobulina de origen no humano con la especificidad requerida, como de un ratón, y de secuencias de inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, inmunoglobulina), unidas químicamente entre sí mediante técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparadas como un polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, el ADN que codifica las partes proteicas del anticuerpo quimérico puede expresarse para producir una cadena polipeptídica contigua). Otro ejemplo de una inmunoglobulina humanizada es una inmunoglobulina que contiene una o más cadenas de inmunoglobulina que comprenden una CDR procedente de un anticuerpo de origen no humano y una región estructural procedente de una cadena ligera y/o pesada de origen humano (por ejemplo, anticuerpos injertados con CDR con o sin cambios estructurales). La expresión inmunoglobulina humanizada, también abarca anticuerpos monocatenarios quiméricos o con CDR injertadas. Véanse, por ejemplo, Cabilly et al., patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; Cabilly et al., patente europea N.° 0.125.023 B1; Boss et al., patente de Estados Unidos N.° 4.816.397; Boss et al., patente europea N.° 0.120.694 B1; Neuberger, M. S. et al., documemto WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., patente europea N.° 0.194.276 B1; Winter, patente de Estados Unidos N.° 5.225.539; Winter, patente europea N.° 0.239.400 B1; Padlan, E. A. et al., solicitud de patente europea N.° 0.519.596 A1. Véase también, Ladner et al., patente de Estados Unidos N.° 4.946.778; Huston, patente de Estados Unidos N.° 5.476.786; y Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), en lo que respecta a anticuerpos monocatenarios.
La expresión "anticuerpo quimérico" pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de la región variable proceden de una especie y las secuencias de la región constante proceden de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable proceden de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante proceden de un anticuerpo humano. La secuencia de aminoácidos de la región variable puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la especie de la que procede (por ejemplo, secuencia de ratón), o puede ser al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a esa secuencia de la región variable. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la región variable de un anticuerpo quimérico de la invención puede comprender una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la región variable de la especie de la que procede.
De manera similar, la secuencia de aminoácidos de la región constante puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región constante de la especie de la que procede (por ejemplo, secuencia humana), o puede ser al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región constante. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la región constante de un anticuerpo quimérico de la invención puede comprender una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la región constante de la especie de la que procede.
Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos de la región bisagra Fc de un anticuerpo quimérico se puede mutar para disminuir la semivida biológica del anticuerpo, o la secuencia de aminoácidos de la región Fc se puede mutar para aumentar la semivida biológica del anticuerpo quimérico.
Por ejemplo, en algunas realizaciones de anticuerpos quiméricos de la invención, la secuencia de la región variable de la cadena pesada comprende, o procede de un anticuerpo de ratón, y la secuencia de la región constante de la cadena pesada comprende, o procede de la secuencia Fc de IgG4. En otras realizaciones, la secuencia de la región variable de la cadena ligera comprende, o procede de un anticuerpo de ratón, y la secuencia de la región constante de la cadena ligera comprende, o procede de la secuencia C de la cadena kappa de Ig (IgK) humana.
En otras realizaciones, la región Fc comprende una secuencia de Fc de IgG4 humana mutante con una mutación S228P que suprime el intercambio de brazo Fab (como se muestra en la Figura 20(A) para el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 que comprende la secuencia de cadena pesada 13E2IgG4mut).
En otras realizaciones, la región Fc comprende una parte C de la cadena kappa de lg (IgK) humana de tipo natural (13E2IgK) (como se muestra en la figura 20(B) para el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 que comprende la secuencia de cadena ligera 13E2IgK).
La numeración de restos en la región Fc usada para el mutante de Fc de la IgG4 humana descrita anteriormente, es la numeración estándar del índice EU como se describe en Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5a edición - US Department of Health and Human Services, n.° de publicación NIH 91-3242, páginas 662, 680, 689 (1991)).
Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando ácidos nucleicos sintéticos y/o recombinantes para preparar genes (por ejemplo, ADNc) que codifiquen la cadena humanizada deseada. Por ejemplo, pueden construirse secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifiquen regiones variables humanizadas usando métodos de mutagénesis por PCR, para alterar secuencias de ADN que codifiquen una cadena humana o humanizada, tal como un molde de ADN de una región variable previamente humanizada (véase, por ejemplo, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); y Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101: 297­ 302 (1991)). Utilizando estos u otros métodos adecuados, también pueden producirse fácilmente variantes. Por ejemplo, se pueden mutagenizar regiones variables clonadas y se pueden seleccionar secuencias que codifiquen variantes con la especificidad deseada (por ejemplo, de una fagoteca; véase, por ejemplo, Krebber et al., patente de Estados Unidos N.° 5.514.548; Hoogenboom et al., documento WO 93/06213, publicado el 1 de abril de 1993)).
Como se usa en el presente documento, el término "estructural", cuando se usa en referencia a una región variable de anticuerpo, pretende significar todos los restos de aminoácido fuera de las regiones CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Una estructura de región variable es generalmente una secuencia de aminoácidos discontinua de entre aproximadamente 100 a 120 aminoácidos de longitud, pero tiene por objeto hacer referencia sólo a los aminoácidos que están fuera de las CDR. Como se usa en el presente documento, la expresión "región estructural" pretende significar cada dominio de la estructura que está separado por las CDR.
La humanización de una o más regiones estructurales reduce el riesgo de que el anticuerpo suscite una respuesta de anticuerpos humanos antiratón (HAMA, por las siglas del inglés human-anti-mouse-antibody) en seres humanos. Para controlar una respuesta de HAMA en un paciente particular o durante ensayos clínicos, pueden realizarse métodos de determinación de una respuesta inmunitaria reconocidos en la técnica. Los pacientes a los que se les administran anticuerpos humanizados pueden recibir una evaluación de inmunogenicidad al principio y durante la administración de la terapia. La respuesta de HAMA se mide, por ejemplo, detectando anticuerpos contra el reactivo terapéutico humanizado, en muestras de suero del paciente, usando un método conocido por un experto en la materia, incluyendo la tecnología de resonancia de plasmón superficial (BIACORE) y/o análisis de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) en fase sólida. En muchos casos, un anticuerpo humanizado de la invención no suscita sustancialmente una respuesta de HAMA en un sujeto humano.
Basándose en su posible influencia sobre la conformación de CDR y/o unión antigénica, para la sustitución se seleccionan determinados aminoácidos de los restos estructurales de la región variable humana. La yuxtaposición fortuita de regiones CDR murinas con la región estructural variable humana, puede dar como resultado restricciones conformacionales fortuitas, que, a menos que se corrijan mediante la sustitución de determinados restos de aminoácido, conducen a una pérdida de afinidad de unión.
La selección de restos de aminoácido para la sustitución puede determinarse, en parte, mediante un modelo informático. En la técnica se conocen herramientas y programas informáticos para producir imágenes tridimensionales de moléculas de inmunoglobulina. En general, los modelos moleculares se producen a partir de estructuras resueltas de cadenas de inmunoglobulina o dominios de las mismas. Las cadenas a modelar se comparan en cuanto a la similitud de la secuencia de aminoácidos con cadenas o dominios de estructuras tridimensionales resueltas, y las cadenas o los dominios que muestran la mayor similitud de secuencia se seleccionan como puntos de partida para la construcción del modelo molecular. Para el modelado, se seleccionan cadenas o dominios que comparten una identidad de secuencia de al menos 50 %, por ejemplo, para el modelado se seleccionan cadenas o dominios que comparten una identidad de secuencia de al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 % o mayor. Las estructuras de partida resueltas se modifican para permitir diferencias entre los aminoácidos reales en las cadenas o dominios de inmunoglobulina que se modelan y los de la estructura de partida. Las estructuras modificadas se ensamblan después en una inmunoglobulina compuesta. Por último, el modelo se refina minimizando la energía y verificando que todos los átomos se encuentren a distancias adecuadas entre sí y que las longitudes y ángulos de los enlaces se encuentren dentro de los límites químicamente aceptables.
Las regiones CDR y estructurales pueden ser como las definidas por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991). En Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901 (1987); Nature 342:878 (1989) y J. Mol. Biol. 186: 651 (1989) (denominados en conjunto "Chothia") se ha propuesto una definición estructural alternativa. Cuando los restos estructurales, como los definidos por Kabat, anteriormente citado, constituyen restos de bucle estructural como los definidos por Chothia, anteriormente citado, los aminoácidos presentes en el anticuerpo de ratón pueden seleccionarse para su sustitución en el anticuerpo humanizado. Los restos que son "adyacentes a una región CDR" incluyen restos de aminoácido en posiciones inmediatamente adyacentes a una o más de las CDR en la secuencia primaria de la cadena de inmunoglobulina humanizada, por ejemplo, en posiciones inmediatamente adyacentes a una CDR como la define Kabat, o una CDR como la define Chothia (véase, por ejemplo, Chothia y Lesk JMB 196:901 (1987)). Es particularmente probable que estos aminoácidos interactúen con los aminoácidos de las CDR y, si se escogen del aceptador, distorsionen las CDR del donante y reduzcan la afinidad. Por otra parte, los aminoácidos adyacentes pueden interactuar directamente con el antígeno (Amit et al., Science, 233: 747 (1986)) y seleccionar estos aminoácidos del donante puede ser deseable para mantener todos los contactos del antígeno que proporcionen afinidad en el anticuerpo original. Como alternativa, las regiones CDR y estructurales pueden ser como las definidas por MacCallum et al., o Lefranc et al. (citados anteriormente - véase la Tabla 1).
En algunos casos, una estructura Vh o Vl humanizada es una estructura consenso humanizada. Una estructura consenso humanizada puede representar el resto de aminoácido que se produce más comúnmente en una selección de secuencias estructurales Vl o Vh de inmunoglobulina humana.
En algunas realizaciones, un anticuerpo de la invención, o fragmento del mismo, comprende una o más regiones estructurales (FR, del inglés framework regions) humanizadas. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio comprende una región variable de cadena ligera que comprende una, dos, tres o cuatro FR de cadena ligera que se han humanizado. En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio comprende una región variable de cadena ligera que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una CDR-L1 como se expone en el presente documento; una FR2 de cadena
ligera humanizada; una CDR-L2 como se expone en el presente documento; una FR3 de cadena ligera humanizada;
una CDR-L3 como se expone en el presente documento; y una FR4 de cadena ligera humanizada. En algunas
realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 son: SEQ ID NO: 1, SEQ
ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena ligera que
comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1; una FR2 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; una FR3 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 son: SEQ ID NO:
4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena ligera que
comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; una FR2 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; una FR3 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 son: SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena ligera que
comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24; una FR2 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25; una FR3 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se seleccionan
de: SEQ ID NO: 4 y 24 (CDR-L1); SEQ ID NO: 5 y 25 (CDR-L2); y SEQ ID NO: 6 y 26 (CDR-L3).
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena ligera que
comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una FR2 de cadena
ligera humanizada; una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y
25; una FR3 de cadena ligera humanizada; una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos
seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 son: SEQ ID NO:
11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena ligera que
comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11; una FR2 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12; una FR3 de cadena ligera humanizada; una
CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 son: SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende, en orden desde
el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una CDR-L1 que comprende la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14; una FR2 de cadena ligera humanizada; una CDR-L2 que c secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15; una FR3 de cadena ligera humanizada; una CDR-L3 que c secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 son: SEQ ID NO:
34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36.
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende, en orden desde
el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una CDR-L1 que comprende la
secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 34; una FR2 de cadena ligera humanizada; una CDR-L2 que c secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 35; una FR3 de cadena ligera humanizada; una CDR-L3 que c secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 se seleccionan de: SEQ ID NO: 14 y 34 (CDR-L1); SEQ ID NO: 15 y 35 (CDR-L2); y SEQ ID NO: 16 y 36 (CDR-L3).
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena ligera que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena ligera humanizada; una CDR-L1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34; una FR2 de cadena ligera humanizada; una CDR-L2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35; una FR3 de cadena ligera humanizada; una CDR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; y una FR4 de cadena ligera humanizada.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio comprende una región variable de cadena pesada que comprende una, dos, tres o cuatro FR de cadena pesada que se han humanizado. En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio comprende una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 como se expone en el presente documento; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 como se expone en el presente documento; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 como se expone en el presente documento; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En algunas realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 son: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 son: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 son: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23.
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 22; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 23; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 se seleccionan de: SEQ ID NO: 1 y 21 (CDR-H1); SEQ ID NO: 2 y 22 (CDR-H2); y SEQ ID NO: 3 y 23 (CDR-H3).
Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 son: SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 16; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 son: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 son: SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33.
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 31; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 32; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 33; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
En otras realizaciones, las respectivas secuencias de aminoácidos de CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 se seleccionan de: SEQ ID NO: 11 y 31 (CDR-H1); SEQ ID NO: 12 y 32 (CDR-H2); y SEQ ID NO: 13 y 33 (CDR-H3).
Por ejemplo, un anticuerpo puede comprender una región variable de cadena pesada que comprende, en orden desde el extremo amínico al extremo carboxílico: una FR1 de cadena pesada humanizada; una CDR-H1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31; una FR2 de cadena pesada humanizada; una CDR-H2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32; una FR3 de cadena pesada humanizada; una CDR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una FR4 de cadena pesada humanizada.
Como ejemplos de secuencias estructurales humanizadas adecuadas se incluyen:
Variante 1 de VH (VH1)
VH1 FR1: QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO:52);
VH1 FR2: WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO:53);
VH1 FR3: RLTISKDTSKSQVILNMTNMDPVDTATYYC (SEQ ID NO:54); y
VH1 FR4: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:55);
Variante 2 de VH (VH?)
VH2 FR1: QITLKESGPALVKPTQTLTLTCSFS (SEQ ID NO:56);
VH2 FR2: WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO:57);
VH2 FR3: RLTISKDTSKNQWLTMANMDPVDTATYYC (SEQ ID NO:58);
VH2 FR4: WGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:59);
Variante 3 de VH (VH3)
VH3 FR1: QITLKETGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO:60);
VH3 FR2: WIRQPPGKALEWVT (SEQ ID NO:61);
VH3 FR3: RVTIRKDTSKNQVALTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO:62);
VH3 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:63);
Variante 4 de VH (VH4)
VH4 FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO:64);
VH4 FR2: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO:65);
VH4 FR3: RLSITKDTSKNQWLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO:66);
VH4 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67);
Variante 1 de VL (VL1)
VL1 FR1: DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO:68);
VL1 FR2: WYQQKPGQPPKLLIY (SEQ ID NO:69);
VL1 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO:70); y
VL1 FR4: FGQGTKLEIK (SEQ ID NO:71)
Variante 2 de VL (VL2)
VL2 FR1: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:72);
VL2 FR2: WYQQKPGQAPKLLIF (SEQ ID NO:73);
VL2 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTLSSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:74); y
VL2 FR4: FGQGTKVEIK (SEQ ID NO:75)
Variante 3 de VL (VL3)
VL3 FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:76);
VL3 FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO:77);
VL3 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:78); y
VL3 FR4: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO:79)
Variante 4 de VL (VL4)
VL4 FR1: EIVLTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO:80);
VL4 FR2: WYQQKAGQSPKLLIY (SEQ ID NO:81);
VL4 FR3: GVPDRFSGSGSGTDFTLTIDSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO:82); y
VL4 FR4: FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:83)
Las secuencias de las regiones variables de las variantes 1-4 de VH y de las variantes 1-4 de VL humanizadas, se muestran alineadas con la secuencia correspondiente del anticuerpo 13E2 original de ratón en la Figura 22. Las secuencias de CDR se resaltan en gris. Los cambios en las secuencias estructurales humanizadas de las variantes, en comparación con la secuencia original de ratón, se muestran subrayados y en negrita. Los restos cambiados en la secuencia humanizada de cada variante también se exponen en las Tablas 26 (secuencias de cadena pesada) y 27 (secuencias de cadena ligera) en el Ejemplo 18.
En algunas realizaciones, un anticuerpo humanizado de la invención (o fragmento de unión a antígeno del mismo) comprende una cadena pesada humanizada que comprende cualquiera de las sustituciones de aminoácidos representadas para VH1, VH2, VH3 o VH4 en la Tabla 26 y/o una cadena ligera humanizada que comprende cualquiera de las sustituciones de aminoácidos representadas para VL1, VL2, VL3 o VL4 en la Tabla 27.
Un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo (en particular, un anticuerpo humanizado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo), puede comprender cualquiera de las secuencias estructurales humanizadas anteriores (SEQ ID NO: 52-83), o cualquier combinación de las secuencias estructurales humanizadas anteriores (SEQ ID NO: 52-83).
En algunas realizaciones, la región estructural de cadena pesada humanizada puede comprender una secuencia de aminoácidos de: cualquiera de las SEQ ID NO: 52, 53, 54 o 55; cualquiera de las SEQ ID NO: 56, 57, 58 o 59; cualquiera de las SEQ ID NO: 60, 61, 62 o 63; o cualquiera de las SEQ iD NO: 64, 65, 66 o 67.
En realizaciones particulares, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo (en particular, un anticuerpo humanizado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo), puede comprender:
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 52; una FR2 VH de SEQ ID NO: 53; una FR3 VH de SEQ ID NO: 54; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 55;
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 56; una FR2 VH de SEQ ID NO: 57; una FR3 VH de SEQ ID NO: 58; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 59;
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 60; una FR2 VH de SEQ ID NO: 61; una FR3 VH de SEQ ID NO: 62; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 63; o
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 64; una FR2 VH de SEQ ID NO: 65; una FR3 VH de SEQ ID NO: 66; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 67.
De manera alternativa o adicional, en algunas realizaciones, la región estructural de cadena ligera humanizada puede comprender una secuencia de aminoácidos de: cualquiera de las SEQ ID NO: 68, 69, 70 o 71; cualquiera de las SEQ ID NO: 72, 73, 74 o 75; cualquiera de las SEQ ID NO: 76, 77, 78 o 79; o cualquiera de las SEQ ID NO: 80, 81, 82 u 83.
En realizaciones particulares, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo (en particular, un anticuerpo humanizado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo), puede comprender:
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 68; una FR2 VL de SEQ ID NO: 69; una FR3 VL de SEQ ID NO: 70; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 71;
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 72; una FR2 VL de SEQ ID NO: 73; una FR3 VL de SEQ ID NO: 74; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 75;
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 76; una FR2 VL de SEQ ID NO: 77; una FR3 VL de SEQ ID NO: 78; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 79; o
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 80; una FR2 VL de SEQ ID NO: 81; una FR3 VL de SEQ ID NO: 82; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 83.
En realizaciones particulares, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo (en particular, un anticuerpo humanizado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo), puede comprender cualquiera de las siguientes combinaciones de secuencias estructurales humanizadas:
VH1 FR1-FR4; y VL, FR1-FR4;
VH1 FR1-FR4; y VL2 FR1-FR4;
VH1 FR1-FR4; y VL3 FR1-FR4;
VH1 FR1-FR4; y VL4 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; y VL1 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; y VL2 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; y VL3 FR1-FR4;
VH2 FR1-FR4; y VL4 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; y VL1 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; y VL2 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; y VL3 FR1-FR4;
VH3 FR1-FR4; y VL4 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; y VL1 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; y VL2 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; y VL3 FR1-FR4;
VH4 FR1-FR4; y VL4 FR1-FR4.
En una realización particular, un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo (en particular, un anticuerpo humanizado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo), comprende las siguientes secuencias estructurales humanizadas:
VH4 FR1: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO:64);
VH4 FR2: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO:65);
VH4 FR3: RLSITKDTSKNQVVLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO:66); y
VH4 FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67); y
VL3 FR1: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:76);
VL3 FR2: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO:77);
VL3 FR3: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:78); y
VL3 FR4: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO:79)
En realizaciones particulares, un anticuerpo aislado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VH de anticuerpo que comprende:
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 y 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 3 y 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; o
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.
En una realización particular, un anticuerpo aislado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84. Como alternativa o adicionalmente, en realizaciones particulares, un anticuerpo aislado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VL de anticuerpo que comprende:
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 4 y 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 5 y 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 6 y 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; o
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.
En una realización particular, un anticuerpo aislado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.
En una realización particular adicional, un anticuerpo aislado de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84, y una cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85.
En otras realizaciones, un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VH de anticuerpo que comprende:
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 11 y 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 12 y 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 13 y 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; o
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.
Como alternativa o adicionalmente, en realizaciones particulares, un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende una región VL de anticuerpo que comprende:
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73;
una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35;
una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77;
una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77;
una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 14 y 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 81; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 15 y 35;
una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 16 y 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO: 83;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81;
una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; o
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81;
una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 36; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.
En algunos casos, un anticuerpo objeto de estudio comprende una región constante de una inmunoglobulina (por ejemplo, una región Fc). En algunas realizaciones, la región Fc, si la hay, es una región Fc humana. Si hay regiones constantes, el anticuerpo puede contener regiones constantes de cadena tanto ligera como pesada. Como regiones constantes de cadena pesada adecuadas se incluyen regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y c H4.
Un ejemplo de una región Fc de cadena pesada adecuada es una Fc de IgG4 de isotipo humano. Las regiones constantes de cadena ligera pueden ser lambda o kappa. Un anticuerpo objeto de estudio (por ejemplo, un anticuerpo humanizado objeto de estudio) puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo. Los anticuerpos pueden expresarse como tetrámeros que contienen dos cadenas ligeras y dos pesadas, como cadenas pesadas, cadenas ligeras distintas, como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, o como anticuerpos monocatenarios en los que los dominios variables de cadena pesada y ligera están ligados a través de un espaciador.
En algunos casos, la región de cadena pesada es del isotipo IgG4. En algunas de estas realizaciones, la región de bisagra comprende una sustitución S241P. Véase, por ejemplo, Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105. En algunas de estas realizaciones, la región de bisagra comprende una sustitución L236E (o L235E, usando la numeración EU; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, MD, Publicación NIH N.° 91-3242). Véanse, por ejemplo, Reddy et al. (2000) J.
Immunol. 164:1925; y Klechevsky et al. (2010) Blood 116:1685. En algunas de estas realizaciones, la región de bisagra comprende una sustitución S241P y una sustitución L236E.
La secuencia de aminoácidos de la región constante puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región constante de la especie de la que procede (por ejemplo, secuencia humana), o puede ser al menos 60 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región constante. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la región constante de un anticuerpo de la invención puede comprender una o más deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez deleciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos) en comparación con la secuencia de aminoácidos de la región constante de la especie de la que procede.
Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos de la región bisagra Fc de un anticuerpo de la invención se puede mutar para disminuir la semivida biológica del anticuerpo, o la secuencia de aminoácidos de la región Fc se puede mutar para aumentar la semivida biológica del anticuerpo.
Debe garantizarse que un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, carece de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), de modo que el anticuerpo, o fragmento, pueda usarse para regular negativamente la proliferación y/o la función de células T sin producir el empobrecimiento de células T como resultado de la ADCC o de la CDC.
Por ejemplo, en algunas realizaciones, la región Fc comprende una secuencia Fc de IgG4 humana de tipo natural. En otras realizaciones, la región Fc comprende una secuencia de Fc de IgG4 humana mutante con una mutación S228P que suprime el intercambio de brazo Fab (como se muestra en la Figura 20(A) para el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 que comprende la secuencia de cadena pesada 13E2IgG4mut).
En otras realizaciones, la región Fc comprende una parte C de la cadena kappa de Ig (IgK) humana de tipo natural (13E2IgK) (como se muestra en la figura 20(B) para el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 que comprende la secuencia de cadena ligera 13E2IgK).
La numeración de restos en la región Fc usada para el mutante de Fc de la IgG4 humana descrita anteriormente, es la numeración estándar del índice EU como se describe en Kabat (Kabat, E.A. et al., Sequences of proteins of immunological interest. 5a edición - US Department of Health and Human Services, n.° de publicación NIH 91-3242, páginas 662, 680, 689 (1991)).
Un anticuerpo objeto de estudio puede comprender un grupo tiol libre (-SH) en el extremo carboxílico, donde el grupo tiol libre puede usarse para conectar el anticuerpo a un segundo polipéptido (por ejemplo, otro anticuerpo, incluyendo un anticuerpo objeto de estudio), un armazón, un transportador, etc.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio comprende uno o más aminoácidos de origen no natural. En algunas realizaciones, el aminoácido no codificado de manera natural comprende un grupo carbonilo, un grupo acetilo, un grupo aminooxi, un grupo hidracina, un grupo hidracida, un grupo semicarbacida, un grupo azida o un grupo alquino. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 7.632.924 para aminoácidos de origen no natural adecuados. La inclusión de un aminoácido de origen no natural puede proporcionar un ligamiento con un polímero, un segundo polipéptido, un armazón, etc. Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio ligado a un polímero soluble en agua se puede preparar haciendo reaccionar con el anticuerpo un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG) que comprenda un grupo carbonilo, donde el anticuerpo comprende un aminoácido no codificado de manera natural que comprende un aminooxi, hidracina, grupo hidracida o semicarbacida. Como ejemplo adicional, un anticuerpo objeto de estudio ligado a un polímero soluble en agua puede prepararse haciendo reaccionar un anticuerpo objeto de estudio que comprenda un aminoácido que contenga alquino con un polímero soluble en agua (por ejemplo, PEG) que comprenda un resto azida; en algunas realizaciones, el grupo azida o alquino se liga a la molécula de PEG a través de un ligamiento amida. Un "aminoácido no codificado de manera natural" se refiere a un aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina o selenocisteína. Otras expresiones que pueden usarse como sinónimo de la expresión "aminoácido no codificado de manera natural" son "aminoácido no natural", aminoácido que no es natural", "aminoácido de origen no natural", y versiones de las mismas con y sin guiones de diversas formas. La expresión "aminoácido no codificado de manera natural" también incluye, pero sin limitación, aminoácidos que se producen por modificación (por ejemplo, modificaciones postraduccionales) de un aminoácido codificado de manera natural (incluidos, pero sin limitación, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína), pero que no se incorporan de manera natural a una cadena polipeptídica en crecimiento mediante el complejo de traducción. Como ejemplos de dichos aminoácidos de origen no natural se incluyen, pero sin limitación, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-L-treonina y O-fosfotirosina.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se liga (por ejemplo, se liga de manera covalente) a un polímero (por ejemplo, a un polímero distinto de un polipéptido). Como polímeros adecuados se incluyen, por ejemplo, polímeros biocompatibles y polímeros biocompatibles solubles en agua. Como polímeros adecuados se incluyen polímeros sintéticos y polímeros de origen natural. Como polímeros adecuados se incluyen, por ejemplo, polímeros de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, sustituidos o no sustituidos, o polisacáridos ramificados o no ramificados, por ejemplo, un homo o heteropolisacárido. Como polímeros adecuados se incluyen, por ejemplo, copolímero de etileno alcohol vinílico (comúnmente conocido con el nombre genérico EVOH o con el nombre comercial EVAL); polibutilmetacrilato; poli(hidroxivalerato); poli(ácido L-láctico); policaprolactona; poli(lactida-co-glicólido); poli(hidroxibutirato); poli(hidroxibutirato-co-valerato); polidioxanona; poliortoéster; polianhídrido; poli(ácido glicólico); poli(ácido D, L-láctico); poli(ácido glicólico-cotrimetilen carbonato); polifosfoéster; polifosfoéster uretano; poli(aminoácidos); cianoacrilatos; poli(trimetilen carbonato); poli(iminocarbonato); copoli(éter-ésteres) (por ejemplo, copolímeros de poli(óxido de etileno)-poli ácido láctico) (PEO/PLA)); oxalatos de polialquileno; polifosfacenos; biomoléculas, tales como fibrina, fibrinógeno, celulosa, almidón, colágeno y ácido hialurónico; poliuretanos; siliconas; poliésteres; poliolefinas; copolímeros de poliisobutileno y etileno-alfaolefina; polímeros y copolímeros acrílicos; polímeros y copolímeros de haluro de vinilo, tales como poli(cloruro de vinilo); éteres de polivinilo, tales como polivinilmetiléter; haluros de polivinilideno, tales como fluoruro de polivinilideno y cloruro de polivinilideno; poliacrilonitrilo; polivinil cetonas; aromáticos de polivinilo, tales como poliestireno; ésteres de polivinilo, tales como acetato de polivinilo; copolímeros de monómeros de vinilo entre sí y olefinas, tales como copolímeros de etileno-metacrilato de metilo, copolímeros de acrilonitrilo-estireno, resinas ABS y copolímeros de etileno-acetato de vinilo; poliamidas, tales como Nailon 66 y policaprolactama; resinas alquídicas; policarbonatos; polioximetilenos; poliimidas; poliéteres; resinas epoxi; poliuretanos; rayón; rayóntriacetato; celulosa; acetato de celulosa; butirato de celulosa; butirato de acetato de celulosa; celofán; nitrato de celulosa; propionato de celulosa; éteres de celulosa; teflón amorfo; poli(etilenglicol); y carboximetilcelulosa.
Los polímeros sintéticos adecuados incluyen poli(etilenglicol) de cadena lineal o ramificada sustituido y no sustituido, poli(propilenglicol) poli(alcohol vinílico) y derivados de los mismos, por ejemplo, poli(etilenglicol) sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) y derivados del mismo. Como polímeros de origen natural adecuados se incluyen, por ejemplo, albúmina, amilosa, dextrano, glucógeno, y derivados de los mismos.
Los polímeros adecuados pueden tener un peso molecular promedio en un intervalo de 500 Da a 50.000 Da, por ejemplo, de 5.000 Da a 40.000 Da o de 25.000 a 40.000 Da. Por ejemplo, en algunas realizaciones, cuando un anticuerpo objeto de estudio comprende un polímero de poli(etilenglicol) (PEG) o metoxipoli(etilenglicol), el polímero de PEG o metoxipoli(etilenglicol) puede tener un peso molecular en un intervalo de aproximadamente 0,5 kiloDalton (kDa) a 1 kDa, de aproximadamente 1 kDa a 5 kDa, de 5 kDa a 10 kDa, de 10 kDa a 25 kDa, de 25 kDa a 40 kDa o de 40 kDa a 60 kDa.
Como se ha indicado anteriormente, en algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se liga de manera covalente a un polímero sintético no peptídico. En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se liga de manera covalente a un polímero de PEG. En algunas realizaciones, un multímero de scFv objeto de estudio se liga de manera covalente a un polímero de PEG. Véase, por ejemplo, Albrecht et al. (2006) J. Immunol. Methods 310:100. En la técnica se conocen bien métodos y reactivos adecuados para la PEGilación de una proteína y se pueden encontrar, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5.849.860. El PEG adecuado para la conjugación con una proteína es generalmente soluble en agua a temperatura ambiente y tiene la fórmula general R(O-CH2-CH2)nO-R, donde R es hidrógeno o un grupo protector tal como un grupo alquilo o alcanol, y donde n es un número entero de 1 a 1.000. Cuando R es un grupo protector, este tiene generalmente de 1 a 8 carbonos.
En algunas realizaciones, el PEG conjugado con el anticuerpo objeto de estudio es lineal. En algunas realizaciones, el PEG conjugado con el anticuerpo objeto de estudio está ramificado. Derivados de PEG ramificados tales como los descritos en la patente de Estados Unidos N.° 5.643.575, "PEG en estrella" y PEG de varios brazos tales como los descritos en Shearwater Polymers, Inc. catálogo "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998". Los PEG en estrella se describen en la técnica incluyendo, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 6.046.305.
Un anticuerpo objeto de estudio puede glicosilarse, por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede comprender un residuo de carbohidrato o polisacárido ligado de manera covalente. Normalmente, la glicosilación de los anticuerpos está ligada a N o ligada a O. Ligada a N se refiere a la conexión del residuo de carbohidrato con la cadena lateral de un resto de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la conexión enzimática del residuo de carbohidrato con la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un posible sitio de glicosilación. Glicosilación ligada a O se refiere a la conexión de uno de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa con un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a un anticuerpo se realiza convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más restos de serina o treonina en la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación ligados a O). De manera similar, la eliminación de sitios de glicosilación puede realizarse mediante la alteración de aminoácidos dentro de los sitios de glicosilación nativos de un anticuerpo.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio comprenderá una etiqueta "radiopaca", por ejemplo, una etiqueta que pueda visualizarse fácilmente usando, por ejemplo, rayos x. Los expertos en la técnica conocen sobradamente materiales radiopacos. Los materiales radiopacos más comunes incluyen sales de yoduro, bromuro o bario. También se conocen otros materiales radiopacos e incluyen, pero sin limitación, derivados orgánicos de bismuto (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.939.045), multiuretanos radiopacos (véase la patente de Estados Unidos N.° 5.346.981), compuestos de organobismuto (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 5.256.334), complejos multiméricos de bario radiopacos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.° 4.866.132) y similares.
Un anticuerpo objeto de estudio puede ligarse de manera covalente a un segundo residuo (por ejemplo, un lípido, un polipéptido que no sea un anticuerpo objeto de estudio, un polímero sintético, un carbohidrato, y similares) usando, por ejemplo, glutaraldehído, un reticulante homobifuncional o un reticulante heterobifuncional. El glutaraldehído reticula los polipéptidos a través de sus residuos amino. Los reticulantes homobifuncionales (por ejemplo, un imidoéster homobifuncional, un éster de N-hidroxisuccinimidilo (NHS) homobifuncional, o un reticulante reactivo con sulfhidrilo homobifuncional) contienen dos o más residuos reactivos idénticos y pueden usarse en un procedimiento de reacción de una etapa en el que el reticulante se añade a una solución que contiene una mezcla de polipéptidos que se van a ligar. Los ésteres de NHS e imidoésteres homobifuncionales, reticulan polipéptidos que contienen amina. En un pH alcalino suave, los imidoésteres reaccionan solo con aminas primarias para formar imidoamidas, y la carga global de los polipéptidos reticulados no se ve afectada.
Como reticulantes reactivos con sulfhidrilo homobifuncionales se incluyen bismaleimidhexano (BMH), 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (DFDNB) y 1,4-di-(3',2'-piridilditio) propinoamido butano (DPDPB).
Los reticulantes heterobifuncionales tienen dos o más residuos reactivos diferentes (por ejemplo, un residuo reactivo con amina y un residuo reactivo con sulfhidrilo) y se reticulan con uno de los polipéptidos a través del residuo reactivo con amina o sulfhidrilo, y después reaccionan con el otro polipéptido a través del residuo que no reaccionó. Se dispone de múltiples reticulantes heterobifuncionales de haloacetilo, como lo son los reticulantes de piridil disulfuro. Las carbodiimidas son un ejemplo clásico de reactivos reticulantes heterobifuncionales para el acoplamiento de carboxilos con aminas, lo que da como resultado un enlace amida.
Un anticuerpo objeto de estudio puede inmovilizarse sobre un soporte sólido. En la técnica se conocen bien soportes adecuados y comprenden, entre otros, materiales de columna disponibles en el comercio, perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas metálicas coloidales, microplacas y superficies de vidrio y/o silicona, tiras de nitrocelulosa, membranas de nailon, láminas, Duracytes, pocillos de bandejas de reacción (por ejemplo, placas multipocillo), tubos de plástico, etc. Un soporte sólido puede comprender cualquiera de una variedad de sustancias, incluyendo, por ejemplo, vidrio, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, policarbonato, deXtrano, nailon, amilosa, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. Se conocen bien métodos adecuados para inmovilizar un anticuerpo objeto de estudio sobre un soporte sólido e incluyen, pero sin limitación, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Los soportes sólidos pueden ser solubles o insolubles, por ejemplo, en solución acuosa. En algunas realizaciones, un soporte sólido adecuado es generalmente insoluble en una solución acuosa.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio comprenderá una etiqueta detectable. Los marcadores detectables adecuados incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Las etiquetas adecuadas incluyen, pero sin limitación, perlas magnéticas (por ejemplo, Dynabeads™), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isocianato de fluoresceína, Texas Red, rodamina, una p a verde fluoresce 3nte, 12 u5na ro 1t4eína 32 ro J ja fluorescente, una
fluorescente y similares), radio1roteín
etiquetas, (por ejemplo, H, I, 35 S1 p
, C o P), enzimas (por ejempl 1 proteína amarilla o, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, luciferasa, y otras comúnmente usadas en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)), y etiquetas colorimétricas tales como oro coloidal o perlas de color de vidrio o plástico, (por ejemplo, de poliestireno, polipropileno, látex, etc.).
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio comprende un agente de contraste o un radioisótopo, donde el agente de contraste o radioisótopo es uno que es adecuado para su uso en obtención de imágenes, por ejemplo, procedimientos de obtención de imágenes llevados a cabo en seres humanos. Como ejemplos no limitantes de etiquetas se incluyen radioisótopos tales como I (yodo), F (flúor), Tc (tecnecio), In (indio) y Ga (galio), y un agente de contraste tal como gadolinio (Gd), disprosio y hierro. También se dispone de isótopos radiactivos de Gd ( 3Gd) y son adecuados para procedimientos de obtención de imágenes en mamíferos no humanos.
Un anticuerpo objeto de estudio puede etiquetarse usando técnicas estándar. Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio se puede yodar usando cloramina T o 1,3,4,6-tetracloro-3a,6a-difenilglicourilo. Para la fluoración, se añade flúor a un anticuerpo objeto de estudio durante la síntesis mediante una reacción de desplazamiento de iones flúor. Véanse, Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998) y Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(2):209-244 (1999) para una revisión de la síntesis de proteínas con dichos radioisótopos. Un anticuerpo objeto de estudio también puede etiquetarse con un agente de contraste mediante técnicas estándar. Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede etiquetarse con Gd, conjugando quelatos de Gd de bajo peso molecular, tales como Gd ácido dietilentriaminopentaacético (GdDTPA) o Gd ácido tetraazaciclododecanotetraacético (GdDOTA), con el anticuerpo. Véase, Caravan et al., Chem. Rev. 99:2293-2352 (1999) y Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3:11-16 (1985). Un anticuerpo objeto de estudio puede etiquetarse con Gd, por ejemplo, conjugando quelatos de Gdpolilisina con el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Curtet et al., Invest. Radiol., 33(10):752-761 (1998). Como alternativa, un anticuerpo objeto de estudio puede etiquetarse con Gd incubando liposomas polimerizados paramagnéticos que incluyen lípido quelante de Gd con avidina y anticuerpo biotinilado. Véase, por ejemplo, Sipkins et al., Nature Med., 4:623-626 (1998).
Como proteínas fluorescentes adecuadas que pueden ligarse a un anticuerpo objeto de estudio se incluyen, pero sin limitación, una proteína verde fluorescente de Aequoria victoria o un mutante o derivado de la misma, por ejemplo, como se describe en las patentes de Estados Unidos N.° 6.066.476; 6.020.192; 5.985.577; 5.976.796; 5.968.750; 5.968.738; 5.958.713; 5.919.445; 5.874.304; por ejemplo, una GFP (green fluorescent protein, proteína verde fluorescente) potenciada, muchas de dichas GFP están disponibles en el comercio, por ejemplo, de Clontech, Inc.; una proteína roja fluorescente; una proteína amarilla fluorescente; cualquiera de una variedad de proteínas fluorescentes y de color de especies de antozoos, como se describe, por ejemplo, en Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:969-973; y similares.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se conjuga con un agente terapéutico. Cualquiera de los anticuerpos objeto de estudio divulgados en el presente documento puede usarse para formar un conjugado anticuerpo-agente. El agente puede conectarse al extremo amínico (N) de la cadena ligera, al extremo carboxílico (C) de la cadena ligera, al término amínico de la cadena pesada o al término carboxílico de la cadena pesada. En algunas realizaciones, el agente se conecta a la bisagra del anticuerpo o a uno o más sitios del anticuerpo. En el caso de un anticuerpo monocatenario, el agente puede conectarse al extremo amínico o carboxílico del anticuerpo monocatenario. El agente puede conjugarse con el anticuerpo directamente o mediante un enlazador usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. El enlazador puede ser escindible o no escindible. Los expertos en la materia conocen ejemplos de dichos agentes terapéuticos (por ejemplo, para su uso en terapia).
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se ligará (por ejemplo, se ligará de manera covalente o no covalente) a un compañero de fusión, por ejemplo, un ligando; una etiqueta epitópica; un péptido; una proteína que no sea un anticuerpo; y similares. Como compañeros de fusión adecuados se incluyen péptidos y polipéptidos que confieren estabilidad mejorada in vivo (por ejemplo, semivida en suero mejorada); facilitan la purificación, por ejemplo, (His)n, por ejemplo, 6His, y similares; proporcionan la secreción de la proteína de fusión de una célula; proporcionan una etiqueta epitópica, por ejemplo, GST, hemaglutinina (HA; por ejemplo, YPYDVPDYA; SEQ ID NO:41), FLAG (por ejemplo, DYKDDDDK; SEQ ID NO: 42), c-myc (por ejemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 43) y similares; proporcionan una señal detectable, por ejemplo, una enzima que genera un producto detectable (por ejemplo, p-galactosidasa, luciferasa) o una proteína que de por sí es detectable, por ejemplo, una proteína verde fluorescente, una proteína roja fluorescente, una proteína amarilla fluorescente, etc.; proporciona multimerización, por ejemplo, un dominio de multimerización tal como una parte Fc de una inmunoglobulina; y similares.
La fusión también puede incluir un dominio de afinidad, incluyendo secuencias peptídicas que pueden interactuar con un compañero de unión, por ejemplo, tal como uno inmovilizado sobre un soporte sólido, útil para identificación o purificación. Aminoácidos individuales consecutivos, tales como histidina, cuando se fusionan con una proteína, pueden usarse para la purificación en una sola etapa de la proteína de fusión mediante unión de alta afinidad a una columna de resina, tal como níquel sefarosa. Como dominios de afinidad ilustrativos se incluyen His5 (HHHHH) (SEQ ID NO: 44), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:45), c-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:46), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:42), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO: 47), hemaglutinina, por ejemplo, etiqueta de HA (YPYDVPDYA; SEQ ID NO: 41), glutatión-S-transferasa (GST), tiorredoxina, dominio de unión a celulosa, RYIRS (SEQ ID NO:48), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO: 49), dominio de unión a quitina, péptido S, péptido T7, dominio SH2, etiqueta de ARN en el extremo C, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO: 50), dominios de unión a metales, por ejemplo, dominios de unión a zinc o dominios de unión a calcio, tales como los de proteínas de unión a calcio, por ejemplo, calmodulina, troponina C, calcineurina B, cadena ligera de miosina, recoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurocalcina, hipocalcina, frecuenina, caltractina, subunidad grande de calpaína, proteínas S100, parvalbúmina, calbindina D9K, calbindina D28K y calretinina, inteínas, biotina, estreptavidina, MyoD, secuencias de cremallera de leucina y proteína de unión a maltosa.
Para secuencias de nucleótidos y aminoácidos, el término "idéntico" o "identidad" indica el grado de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de aminoácidos cuando se alinean de manera óptima y se comparan con inserciones o deleciones apropiadas.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones multiplicado por 100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que necesita introducirse para la alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias, puede realizarse usando un algoritmo matemático, como se describe más adelante.
El porcentaje de identidad entre una secuencia de ácido nucleico de consulta y una secuencia de ácido nucleico objeto de estudio, es el valor de "Identidades", expresado como porcentaje, que se calcula mediante el algoritmo BLASTN cuando una secuencia de ácido nucleico objeto de estudio tiene una cobertura de consulta del 100 % con una secuencia de ácido nucleico de consulta después de realizar una alineación BLASTN por pares. Dichas alineaciones BLASTN por pares entre una secuencia de ácido nucleico de consulta y una secuencia de ácido nucleico objeto de estudio, se realizan usando las configuraciones predeterminadas del algoritmo BLASTN disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Institute con el filtro para regiones de baja complejidad desactivado. Cabe destacar que, una secuencia de ácido nucleico de consulta puede describirse mediante una secuencia de ácido nucleico identificada en una o más reivindicaciones del presente documento. El porcentaje de identidad entre una secuencia de aminoácidos de consulta y una secuencia de aminoácidos objeto de estudio es el valor "Identidades", expresado como porcentaje, que se calcula mediante el algoritmo BLASTP cuando una secuencia de aminoácidos objeto de estudio tiene una cobertura de consulta del 100% con una secuencia de aminoácidos de consulta después de realizar una alineación BLASTP por pares. Dichas alineaciones BLASTP por pares entre una secuencia de aminoácidos de consulta y una secuencia de aminoácidos objeto de estudio, se realizan usando las configuraciones predeterminadas del algoritmo BLASTP disponible en el sitio web del National Center for Biotechnology Institute con el filtro para regiones de baja complejidad desactivado. Cabe destacar que, una secuencia de aminoácidos de consulta puede describirse mediante una secuencia de aminoácidos identificada en una o más reivindicaciones del presente documento.
Métodos de producción de un anticuerpo objeto de estudio
Un anticuerpo objeto de estudio puede producirse mediante cualquier método conocido, por ejemplo, métodos sintéticos convencionales de síntesis de proteínas; métodos de ADN recombinante; etc. En algunas realizaciones, el anticuerpo objeto de estudio se produce mediante un método seleccionado del grupo que consiste en producción recombinante y síntesis química.
Cuando un anticuerpo objeto de estudio es un polipéptido monocatenario, este puede sintetizarse usando técnicas estándar de síntesis química de péptidos. Cuando un polipéptido se sintetiza químicamente, la síntesis puede proseguir a través de fase líquida o fase sólida. La síntesis de polipéptidos en fase sólida (SPFS), en la que el aminoácido carboxiterminal de la secuencia se conecta a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia, es un ejemplo de un método adecuado de síntesis química de un anticuerpo objeto de estudio. Para sintetizar un anticuerpo objeto de estudio se dispone de varias formas de SPFS, tales como Fmoc y Boc. Barany y Merrifield describen técnicas de síntesis en fase sólida, Solid-Phase Peptide Synthesis; págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984); y Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 y Camarero JA et al.
2005 Protein Pept Lett. 12:723-8. Resumiendo, perlas porosas pequeñas e insolubles se tratan con unidades funcionales sobre las que se construyen cadenas peptídicas. Después de ciclos repetidos de acoplamiento/desprotección, la amina aminoterminal libre de una fase sólida conectada, se acopla a una sola unidad de aminoácidos protegida con N. Después, esta unidad se desprotege, revelando una nueva amina aminoterminal a la que se puede conectar un aminoácido adicional. El péptido permanece inmovilizado en la fase sólida y se somete a un proceso de filtración antes de separarse.
Para la producción de un anticuerpo objeto de estudio pueden usarse métodos recombinantes estándar. Por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena ligera y pesada, opcionalmente ligados a regiones constantes, se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada se pueden clonar en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina están ligados operativamente a secuencias de control en el vector o vectores de expresión que garantizan la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Las secuencias de control de expresión incluyen, pero sin limitación, promotores (por ejemplo, promotores asociados de manera natural o heterólogos), secuencias señalizadoras, elementos potenciadores, elementos represores y secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de expresión pueden ser sistemas promotores eucariotas en vectores capaces de transformar o transfectar células hospedadoras eucariotas (por ejemplo, células COS o CHO). Una vez que el vector se ha incorporado en el hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para un alto nivel de expresión de las secuencias de nucleótidos y la recogida y purificación de los anticuerpos.
Debido a la degeneración del código, una variedad de secuencias de ácidos nucleicos pueden codificar cada secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina. Las secuencias de ácido nucleico deseadas se pueden producir mediante síntesis de ADN en fase sólida de nuevo o mediante mutagénesis por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) de una variante preparada anteriormente del polinucleótido deseado. La mutagénesis mediada por oligonucleótidos es un ejemplo de un método adecuado para preparar variantes de sustitución, deleción e inserción de ADN del polipéptido diana. Véase Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Resumiendo, el ADN del polipéptido diana se altera hibridando un oligonucleótido que codifica la mutación deseada con un molde de ADN monocatenario. Después de la hibridación, se usa una ADN polimerasa para sintetizar una segunda hebra complementaria completa del molde que incorpora el cebador oligonucleotídico y codifica la alteración seleccionada en el ADN del polipéptido diana.
Normalmente, los vectores de expresión adecuados pueden replicarse en los organismos hospedadores como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del hospedador. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a higromicina, resistencia a tetraciclina, resistencia a kanamicina o resistencia a neomicina) para permitir la detección de las células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
Escherichia coli es un ejemplo de una célula hospedadora procariota que puede usarse para clonar un polinucleótido que codifique un anticuerpo objeto de estudio. Otros hospedadores microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilis, y otras enterobacterias, tales como Salmonela, Serratia, y varias especies de Pseudomonas. En estos hospedadores procariotas, también pueden prepararse vectores de expresión, que normalmente contendrán secuencias de control de expresión compatibles con la célula hospedadora (por ejemplo, un origen de replicación). Además, estará presente cualquier número de una variedad de promotores bien conocidos, tal como el sistema promotor de lactosa, un sistema promotor de triptófano (trp), un sistema promotor de beta-lactamasa, o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores normalmente controlarán la expresión, opcionalmente con una secuencia operadora y tienen secuencias de sitios de unión a ribosomas y similares, para iniciar y completar la transcripción y traducción.
Otros microbios, tales como levaduras, también son útiles para la expresión. Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae) y Pichia son ejemplos de células hospedadoras de levadura adecuadas, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores), un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según se desee. Como promotores típicos se incluyen 3-fosfoglicerato cinasa y otras enzimas glicolíticas. Como promotores de levadura inducibles se incluyen, entre otros, promotores de alcohol deshidrogenasa, isocitocromo C y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.
Además de microorganismos, también pueden usarse células de mamífero (por ejemplo, células de mamífero cultivadas en cultivo celular in vitro) para expresar y producir un anticuerpo anti-LAG-3 de la presente divulgación (por ejemplo, polinucleótidos que codifican un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio). Véase Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Como células hospedadoras de mamífero adecuadas se incluyen líneas de células CHO, varias líneas de células Cos, células HeLa, líneas de células de mieloma y células B transformadas o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tales como un origen de replicación, un promotor y un potenciador (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. Son ejemplos de secuencias de control de expresión adecuadas promotores procedentes de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares. Véase Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). En otros métodos, los anticuerpos de la invención se pueden producir en ratones (véase, por ejemplo, Laffleur et al "Production of human or humanized antibodies in mice", Methods Mol Biol. 2012;901:149-59).
Una vez sintetizados (ya sea por medios químicos o recombinantes), los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligera y pesada individuales, u otras formas de un anticuerpo objeto de estudio (por ejemplo, scFv, etc.) se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar de la técnica, incluida la precipitación con sulfato de amonio, la purificación con columnas de afinidad, cromatografía en columna, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel y similares (véase, en líneas generales, Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Un anticuerpo objeto de estudio puede ser sustancialmente puro, por ejemplo, puede tener una pureza de al menos aproximadamente 80 % a 85 %, de al menos aproximadamente 85 % a 90 %, de al menos aproximadamente 90 % a 95 % o de 98 % a 99 %, o mayor pureza, por ejemplo, carecer de contaminantes tales como restos celulares, macromoléculas distintas de un anticuerpo objeto de estudio, etc.
Moléculas de ácido nucleico, vectores de expresión, y células hospedadoras
La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo antiLAG-3 de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo.
De acuerdo con la invención, también se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 y 10, o una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 y 10.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena pesada que es una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 17. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera que una secuencia de aminoácidos al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 18. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 de SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 23, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 de SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una CDR-H1, una CDR-H2 y una CDR-H3 de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera que comprende una CDR-L1, una CDR-L2 y una CDR-L3 de SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36, respectivamente.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico de la presente divulgación codifica un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada.
Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo objeto de estudio puede ligarse operativamente a uno o más elementos reguladores, tal como un promotor y potenciador, que permiten la expresión de la secuencia de nucleótidos en las células diana deseadas (por ejemplo, una célula que está modificada genéticamente para sintetizar el anticuerpo codificado).
En la técnica se conocen elementos promotores y potenciadores adecuados. Como promotores adecuados para su uso en células hospedadoras procariotas se incluyen, pero sin limitación, un promotor de la ARN polimerasa del bacteriófago T7; un promotor de T3; un promotor de T5; un promotor de lambda P; un promotor trp; un promotor del operón lac; un promotor híbrido, por ejemplo, un promotor híbrido lac/tac, un promotor híbrido tac/trc, un promotor de trp/lac, un promotor de T7/lac; un promotor de trc; un promotor de tac y similares; un promotor de gpt; un promotor de araBAD; promotores regulados in vivo, tales como un promotor de ssaG o un promotor relacionado (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N.° 20040131637), un promotor de pagC (Pulkkinen y Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), un promotor de nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813) y similares (véase, por ejemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; y Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10:888-892); un promotor de sigma70, por ejemplo, un promotor consenso de sigma70 (véanse, por ejemplo, los N.° de registto de GenBank AX798980, AX798961 y AX798183); un promotor de fase estacionaria, por ejemplo, un promotor de dps, un promotor de spv y similares; un promotor procedente de la isla de patogenicidad SPI-2 (véase, por ejemplo, el documento WO96/17951); an promotor de actA (véase, por ejemplo, Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70:1087-1096); un promotor de rpsM (véase, por ejemplo, Valdivia y Falkow (1996). Mol. Microbiol.
22:367); un promotor de tet (véase, por ejemplo, Hillen, W. y Wissmann, A. (1989) En Saenger, W. y Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, Londres, Reino Unido, vol. 10, págs. 143-162); un promotor de SP6 (véase, por ejemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); y similares. Como promotores fuertes adecuados para su uso en procariotas, tales como Escherichia coli, se incluyen, pero sin limitación, Trc, Tac, T5, T7 y PLambda. Como ejemplos no limitantes de operadores para su uso en células hospedadoras bacterianas se incluyen un operador promotor de lactosa (la proteína represora Lacl cambia de conformación cuando entra en contacto con lactosa, impidiendo así que la proteína represora Lacl se una al operador), un operador promotor de triptófano (cuando forma un complejo con triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que se une al operador; en ausencia de triptófano, la proteína represora TrpR tiene una conformación que no se une al operador) y un operador promotor tac (véase, por ejemplo, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25).
En algunas realizaciones, por ejemplo, para la expresión en una célula de levadura, un promotor adecuado es un promotor constitutivo tal como un promotor de ADH1, un promotor de PGK1, un promotor de ENO, un promotor de PYK1 y similares; o un promotor regulable tal como un promotor de GAL1, un promotor de GAL10, un promotor de ADH2, un promotor de PHO5, un promotor de CUP1, un promotor de GAL7, un promotor de MET25, un promotor de MET3, un promotor de CYC1, un promotor de HIS3, un promotor de ADH1, un promotor de PGK, un promotor de GAPDH, un promotor de ADC1, un promotor de TRP1, un promotor de URA3, un promotor de LEU2, un promotor de ENO, un promotor de TP1 y AOX1 (por ejemplo, para uso en Pichia).
Para la expresión en una célula eucariota, como promotores adecuados se incluyen, pero sin limitación, elementos promotores y potenciadores de genes de inmunoglobulina de cadena ligera y/o pesada; el promotor temprano inmediato de citomegalovirus; el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple; los promotores temprano y tardío de SV40; el promotor presente en repeticiones terminales largas de un retrovirus; el promotor de metalotioneína-I de ratón; y varios promotores específicos de tejido conocidos en la técnica.
La selección del vector y promotor apropiados se incluye en las competencias del experto habitual en la técnica. En un vector de expresión y/o un vector de clonación puede haber una molécula de ácido nucleico que codifique un anticuerpo objeto de estudio. La presente divulgación proporciona un vector recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo objeto de estudio en un vector de clonación. La presente divulgación también proporciona una molécula recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo objeto de estudio ligado operativamente a una o más secuencias reguladoras apropiadas en un vector de expresión para garantizar la expresión del anticuerpo codificado. Cuando un anticuerpo objeto de estudio comprende dos polipéptidos distintos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los dos polipéptidos se pueden clonar en el mismo vector o en vectores distintos para formar una o más moléculas recombinantes. Una molécula recombinante puede incluir un marcador de selección, un origen de replicación y otras características que permitan la replicación y/o el mantenimiento de la molécula recombinante.
Los expertos en la técnica conocen una gran cantidad de vectores y promotores adecuados; muchos de ellos disponibles en el comercio para generar una molécula recombinante objeto de estudio. Como ejemplo se proporcionan los siguientes vectores. Bacterianos: pBS, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., Estados UNidos); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 y pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Eucarioytas: pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXr 1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL (Pharmacia).
Los vectores de expresión generalmente tienen sitios de restricción convenientes ubicados cerca de la secuencia promotora para proporcionar la inserción de secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas heterólogas. Puede haber un marcador de selección operativo en el hospedador de expresión. Los vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, vectores víricos. Los ejemplos de vectores víricos incluyen, pero sin limitación, vectores virales basados en: virus variolovacunal; poliovirus; adenovirus (véase, por ejemplo, Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li y Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999; los documentos WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655); virus adenoasociado (véase, por ejemplo, Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:69166921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:28572863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996; Srivastava en el documento WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; y Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; virus del herpes simple; un vector retrovírico (por ejemplo, virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores procedentes de retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de inmunodeficiencia humana (véase, por ejemplo, Miyoshi et al., PNAS 94:1031923, 1997; Takahashi et al., J Virol 73: 78127816, 1999), virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor mamario); y similares.
Como se ha indicado anteriormente, una molécula de ácido nucleico objeto de estudio comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-LAG-3 de la presente divulgación. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico objeto de estudio comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las CDR de cadena pesada y ligera de un anticuerpo 13E2 o 34F4 objeto de estudio. En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico objeto de estudio comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las CDR de cadena pesada y ligera de un anticuerpo objeto de estudio, donde las secuencias que codifican las CDR se intercalan con secuencias de nucleótidos que codifican las FR. En algunas realizaciones, las secuencias de nucleótidos que codifican las FR son secuencias de nucleótidos que codifican FR humanas.
Células hospedadoras
La presente divulgación proporciona células hospedadoras aisladas modificadas genéticamente (por ejemplo, células in vitro) que se modifican genéticamente con una molécula de ácido nucleico objeto de estudio. En algunas realizaciones, una célula hospedadora objeto de estudio, aislada, modificada genéticamente, puede producir un anticuerpo objeto de estudio. Dicha célula se denomina célula recombinante. Una célula recombinante comprende una molécula recombinante que codifica un anticuerpo objeto de estudio.
Las células hospedadoras adecuadas incluyen células hospedadoras eucariotas, tal como una célula de mamífero, una célula hospedadora de insecto, una célula de levadura; y células procariotas, tal como una célula bacteriana. La introducción de un ácido nucleico objeto de estudio en la célula hospedadora puede efectuarse, por ejemplo, por precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por dextrano DEAE, transfección mediada por liposomas, electroporación u otro método conocido.
Las células de mamífero adecuadas incluyen células primarias y líneas celulares inmortalizadas. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de primates no humanos, líneas celulares de roedor (por ejemplo, ratón, rata) y similares. Las líneas celulares de mamíferos adecuadas incluyen, pero sin limitación, células HeLa (por ejemplo, American Type Culture Collection (ATCC) N.° CCL-2), Células CHO (por ejemplo, ATCC N.° CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 (por ejemplo, a Tc C N.° CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC N.°CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RAT1, células L de ratón (ATCC N.°CCLI.3), células de riñón embrionario humano (HEK) (ATCC N.°CRL1573), células HLHepG2 y similares. En algunos casos, las células son células HEK. En algunos casos, las células son células CHO, por ejemplo, células CHO-K1 (ATCC N.°CCL-61), células CHO-M, células CHO-DG44 (ATCC N.° PTA-3356) y similares. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula COS. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula 293. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula CHO.
Las células de levadura adecuadas incluyen, pero sin limitación, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, y similares. En algunas realizaciones, la célula hospedadora pertenece al género Saccharomyces. En algunas realizaciones, la célula hospedadora pertenece al género Pichia.
Las células procariotas adecuadas incluyen, pero sin limitación, cualquiera de una variedad de cepas de laboratorio de Escherichia coli, Bacillus (por ejemplo, B. subtilis), Lactobacillus sp., y similares. Véase, por ejemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; la patente de Estados Unidos N.° 6.447.784; y Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Normalmente, la cepa de laboratorio es una que no es patógena. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es Escherichia coli. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es Bacillus subtilis.
Composiciones
La presente divulgación proporciona una composición que comprende un anticuerpo objeto de estudio. Una composición de anticuerpo objeto de estudio puede comprender, además de un anticuerpo objeto de estudio, uno o más de: una sal, por ejemplo, NaCl, MgCh, KCl, MgSO4, etc.; un agente tamponador, por ejemplo, un tampón de fosfato, un tampón de citrato, un tampón de Tris, ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-etanosulfónico) (HEPES), ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), sal sódica del ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido N-tris[hidroximetil]metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), etc.; un agente solubilizante; un detergente, por ejemplo, un detergente no iónico tal como Tween-20, etc.; un inhibidor de proteasa; glicerol; y similares.
Composiciones farmacéuticas
La presente divulgación proporciona composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo objeto de estudio. En general, una composición farmacéutica, también denominada en el presente documento formulación, comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo objeto de estudio. Una "cantidad eficaz" significa una dosis suficiente para producir un resultado deseado, por ejemplo, la reducción de un síntoma adverso asociado a un trastorno inmunitario, la mejora de un síntoma de un trastorno inmunitario, la ralentización de la progresión de un trastorno inmunitario, etc. En general, el resultado deseado es al menos una reducción de un síntoma de un trastorno inmunitario, en comparación con un control.
Formulaciones
En los métodos objeto de estudio, se puede administrar un anticuerpo objeto de estudio al hospedador usando cualquier medio conveniente capaz de producir el efecto terapéutico o diagnóstico deseado. Por tanto, el agente puede incorporarse en una variedad de formulaciones para su administración terapéutica. Más particularmente, un anticuerpo objeto de estudio puede formularse en composiciones farmacéuticas mediante combinación con vehículos, diluyentes u otros excipientes apropiados, farmacéuticamente aceptables y pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles. En algunas realizaciones, una composición farmacéutica comprende un anticuerpo objeto de estudio y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En formas de dosificación farmacéutica, un anticuerpo objeto de estudio puede administrarse en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también puede usarse solo o en una asociación apropiada, así como en combinación, con otros compuestos farmacéuticamente activos. Los siguientes métodos y excipientes son meramente ilustrativos y no son limitantes de ninguna manera.
Para preparaciones orales, un anticuerpo objeto de estudio puede usarse solo o en combinación con aditivos apropiados para fabricar comprimidos, polvos, gránulos o cápsulas, por ejemplo, con aditivos convencionales, tales como lactosa, manitol, almidón de maíz o almidón de patata; con aglutinantes, tales como celulosa cristalina, derivados de celulosa, goma arábiga, almidón de maíz o gelatinas; con disgregantes, tales como almidón de maíz, almidón de patata o carboximetilcelulosa sódica; con lubricantes, tales como talco o estearato de magnesio; y si se desea, con diluyentes, agentes tamponantes, agentes humectantes, conservantes y aromatizantes.
Un anticuerpo objeto de estudio puede formularse en preparaciones para inyección disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo en un disolvente acuoso o no acuoso, tal como aceites vegetales u otros similares, propilenglicol, glicéridos sintéticos de ácido alifático, ésteres orgánicos inyectables (por ejemplo, oleato de etilo), ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de líquidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer), y similares. Adicionalmente, dependiendo del uso previsto de la composición farmacéutica, la composición farmacéutica de la presente divulgación puede comprender agentes adicionales tales como dopamina o psicofármacos.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo objeto de estudio se preparan mezclando un anticuerpo objeto de estudio que tenga un grado de pureza deseado, con transportadores, otros excipientes, estabilizadores, tensioactivos, tampones y/o agentes de tonicidad opcionales fisiológicamente aceptables. Los transportadores, otros excipientes y/o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluido ácido ascórbico, glutatión, cisteína, metionina y ácido cítrico; conservantes (tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-cloro-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio, o combinaciones de los mismos); aminoácidos tales como arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, prolina y combinaciones de los mismos; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como gelatina o albúmina de suero; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como trehalosa, sacarosa, lactosa, glucosa, manosa, maltosa, galactosa, fructosa, sorbosa, rafinosa, glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina y ácido neuramínico; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Brij Pluronics, Tritón-X o polietilenglicol (PEG).
La composición farmacéutica puede estar en forma líquida, en forma liofilizada o en forma líquida reconstituida a partir de una forma liofilizada, donde la preparación liofilizada se reconstituirá con una solución estéril antes de la administración. El procedimiento estándar para reconstituir una composición liofilizada es volver a añadir un volumen de agua pura (normalmente equivalente al volumen eliminado durante la liofilización); sin embargo, se pueden usar soluciones que comprenden agentes antibacterianos para la producción de composiciones farmacéuticas para administración parenteral; véase también Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
Las concentraciones de anticuerpo ilustrativas en una composición farmacéutica objeto de estudio, pueden variar de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml o de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml o de aproximadamente 150 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml.
Se puede preparar una formulación acuosa del anticuerpo en una solución tamponada con pH, por ejemplo, a un pH que varíe de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, o de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, o de manera alternativa a un pH de aproximadamente 5,5. Como ejemplos de tampones que son adecuados para un pH dentro de este intervalo se incluyen los tampones de fosfato, histidina, citrato, succinato, acetato y otros tampones de ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la tonicidad deseados de la formulación.
Para modular la tonicidad de la formulación puede incluirse un agente de tonicidad en la formulación de anticuerpo. Los agentes de tonicidad ilustrativos incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina y cualquier componente del grupo de aminoácidos, azúcares así como combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la formulación acuosa es isotónica, aunque pueden ser adecuadas soluciones hipertónicas o hipotónicas. El término "isotónico" indica una solución que tiene la misma tonicidad que alguna otra solución con la que se compara, tal como una solución salina fisiológica o suero. Los agentes de tonicidad se pueden usar en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 350 mM, por ejemplo, preferentemente, en una cantidad de 100 nM a 350 nM.
También se puede añadir un tensioactivo a la formulación de anticuerpo para reducir la agregación del anticuerpo formulado y/o minimizar la formación de partículas en la formulación y/o reducir la adsorción. Como tensioactivos ilustrativos se incluyen ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán (Tween), éteres de alquilo de polioxietileno (Brij), éteres de alquilfenilpolioxietileno (Tritón-X), copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic) y dodecilsulfato sódico (SDS). Son ejemplos de ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán adecuados, polisorbato 20, (comercializado con la marca registrada Tween 20™) y polisorbato 80 (comercializado con la marca registrada Tween 80™). Son ejemplos de copolímeros de polietileno-polipropileno adecuados los comercializados con las marcas registradas Pluronic® F68 o Poloxamer 188™. Son ejemplos de éteres de alquilo de polioxietileno adecuados los comercializados con la marca registrada Brij™. Las concentraciones ilustrativas pueden variar de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 1 % p/v.
Durante el proceso de liofilización también se puede añadir un lioprotector para proteger el principio activo lábil (por ejemplo, una proteína) frente a condiciones desestabilizadoras. Por ejemplo, como lioprotectores conocidos se incluyen azúcares (incluidos glucosa y sacarosa); polioles (incluidos manitol, sorbitol y glicerol); y aminoácidos (incluidos alanina, glicina y ácido glutámico). Se pueden incluir lioprotectores en una cantidad de aproximadamente 10 mM a 500 nM.
En algunas realizaciones, una formulación objeto de estudio incluye un anticuerpo objeto de estudio y uno o más de los agentes identificados anteriormente (por ejemplo, un tensioactivo, un tampón, un estabilizador, un agente de tonicidad) y carece esencialmente de uno o más conservantes, tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-cloro-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio y combinaciones de los mismos. En otras realizaciones, en la formulación se incluye un conservante, por ejemplo, a concentraciones que varían de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 2 % (p/v).
Por ejemplo, una formulación objeto de estudio puede ser una formulación líquida o liofilizada adecuada para la administración parenteral y puede comprender: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 1 % de al menos un tensioactivo; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de un tampón; opcionalmente de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM de un estabilizador; y de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 305 mM de un agente de tonicidad; y tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0.
Como ejemplo adicional, una formulación parenteral objeto de estudio es una formulación líquida o liofilizada que comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,04 % p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5.
Como ejemplo adicional, una formulación parenteral objeto de estudio comprende una formulación liofilizada que comprende: 1) 15 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,04 % p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 2) 75 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,04 % p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5, o 3) 75 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y sacarosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 4) 75 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,04 % p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 5) 75 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5. Como ejemplo adicional, una formulación parenteral objeto de estudio es una formulación líquida que comprende: 1) 7,5 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02% p/v; L-histidina 120 mM; y 250 125 mM de sacarosa; y tiene un pH de 5,5; o 2) 37,5 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 10 mM; y sacarosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 3) 37,5 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,01 % p/v; L-histidina 10 mM; y sacarosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 4) 37,5 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 10 mM; trehalosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 5) 37,5 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,01 % p/v; L-histidina 10 mM; y trehalosa 125 mM; y tiene un pH de 5,5; o 6) 5 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 7) 75 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y manitol 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 8) 75 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02% p/v; L histidina 20 mM; y cloruro de sodio 140 mM; y tiene un pH de 5,5, o 9) 150 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y trehalosa 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 10) 150 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y manitol 250 mM; y tiene un pH de 5,5; o 11) 150 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,02 % p/v; L-histidina 20 mM; y cloruro de sodio 140 mM; y tiene un pH de 5,5; o 12) 10 mg/ml de un anticuerpo objeto de estudio; Tween 20 al 0,01 % p/v; L-histidina 20 mM; y cloruro de sodio 40 mM; y tiene un pH de 5,5.
Un anticuerpo objeto de estudio puede usarse en una formulación de aerosol para administrar mediante inhalación. Un anticuerpo objeto de estudio puede formularse en propulsores aceptables presurizados tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares. Las formulaciones en aerosol, tales como formulaciones nasales en aerosol, incluyen soluciones acuosas purificadas u otras soluciones del agente activo con agentes conservantes y agentes isotónicos. Dichas formulaciones se ajustan a un pH y a un estado isotónico compatibles con las membranas mucosas nasales.
Adicionalmente, un anticuerpo objeto de estudio puede prepararse en supositorios mezclándolo con una variedad de bases tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Un anticuerpo objeto de estudio puede administrarse por vía rectal a través de un supositorio. El supositorio puede incluir vehículos tales como manteca de cacao, carboceras y polietilenglicoles, que se funden a la temperatura corporal, pero se solidifican a temperatura ambiente.
Se pueden proporcionar formas de dosificación unitarias para administración oral o rectal, tales como jarabes, elixires y suspensiones, donde cada unidad de dosificación, por ejemplo, cucharadita, cucharada, comprimido o supositorio, contiene una cantidad predeterminada de la composición. De manera similar, las formas de dosificación unitaria para inyección o administración intravenosa pueden comprender un anticuerpo objeto de estudio en una composición tal como una solución en agua estéril, solución salina normal u otro transportador farmacéuticamente aceptable.
La expresión "forma de dosificación unitaria", como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas, adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y animales, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-LAG-3 de la presente divulgación, calculada en una cantidad suficiente para producir el efecto deseado en asociación con un diluyente, transportador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las especificaciones para un anticuerpo objeto de estudio pueden depender del anticuerpo particular empleado y del efecto a lograr, y de la farmacodinámica asociada con cada anticuerpo en el hospedador.
Otros modos de administración también encontrarán uso con un método de la presente divulgación. Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio se puede formular en supositorios y, en algunos casos, en composiciones en aerosol e intranasales. En el caso de los supositorios, la composición vehículo incluirá aglutinantes y transportadores tradicionales tales como, polialquilenglicoles o triglicéridos. Dichos supositorios se pueden formar a partir de mezclas que contengan el principio activo en el intervalo de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10% (p/p), por ejemplo, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 2 %.
Las formulaciones intranasales incluirán normalmente vehículos que no causen irritación de la mucosa nasal ni alteren significativamente la función ciliar. Pueden emplearse diluyentes tales como agua, solución salina acuosa u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales también pueden contener conservantes tales como, pero sin limitación, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Para potenciar la absorción del anticuerpo objeto de estudio a través de la mucosa nasal puede haber un tensioactivo.
Un anticuerpo objeto de estudio puede administrarse como una formulación inyectable. Normalmente, las composiciones inyectables se preparan como soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse o el anticuerpo encapsularse en vehículos liposómicos.
Los vehículos excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, el vehículo puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponadores de pH. Los expertos en la materia conocen métodos reales para la preparación de dichas formas de dosificación o serán obvios para los mismos. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 17.a edición, 1985. En cualquier caso, la composición o formulación a administrar, contendrá una cantidad adecuada de un anticuerpo objeto de estudio para lograr el estado deseado en el sujeto que se está tratando.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como vehículos, adyuvantes, transportadores o diluyentes, están fácilmente disponibles para el público. Por otra parte, sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ajustadores y tamponadores de pH, agentes ajustadores de tonicidad, estabilizadores, agentes humectantes y similares, están fácilmente disponibles para el público.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se formula en una formulación de liberación controlada. Las preparaciones de liberación sostenida se pueden preparar usando métodos bien conocidos en la técnica. Como ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo en el que las matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Como ejemplos de matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, hidrogeles, polilactidas, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. La posible pérdida de actividad biológica y los posibles cambios en la inmunogenicidad de los anticuerpos comprendidos en las preparaciones de liberación sostenida pueden impedirse usando aditivos apropiados, controlando el contenido de humedad y desarrollando composiciones de matriz polimérica específicas.
La liberación controlada dentro del alcance de la presente divulgación puede entenderse como una cualquiera de diversas formas de dosificación de liberación mantenida. Para los fines de la presente divulgación, los siguientes términos pueden considerarse que son sustancialmente equivalentes a la liberación controlada: liberación continua, liberación controlada, liberación diferida, liberación en depósito, mantenida, liberación gradual, liberación inmediata, liberación de larga duración, liberación programada, liberación prolongada, liberación proporcionada, liberación persistente, liberación de acción prolongada, retardada, lenta, liberación espaciada, liberación sostenida, liberación de recubrimiento temporal, medicamentos de acción diferida, acción mantenida, acción estratificada temporal, acción larga, acción prolongada, acción repetida, acción lenta, acción sostenida y acción prolongada. Se pueden encontrar exposiciones adicionales sobre estos términos en Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.).
Las diversas tecnologías de liberación controlada cubren un espectro muy amplio de formas farmacéuticas. Las tecnologías de liberación controlada incluyen, pero sin limitación, sistemas físicos y químicos.
Los sistemas físicos incluyen, pero sin limitación, sistemas de depósito con membranas de control de velocidad, tales como microencapsulación, macroencapsulación y sistemas de membrana; sistemas de depósito sin membranas de control de velocidad, tales como fibras huecas, triacetato de celulosa ultramicroporosa y espumas y sustratos poliméricos porosos; sistemas monolíticos, incluyendo aquellos sistemas físicamente disueltos en matrices no porosas, poliméricas o elastoméricas (por ejemplo, no erosionables, erosionables, entrada de agentes ambientales y degradables), y materiales físicamente dispersos en matrices no porosas, poliméricas o elastoméricas (por ejemplo, no erosionables, erosionables entrada de agentes ambientales y degradables); estructuras laminadas, incluyendo capas de depósito químicamente similares o diferentes a las capas de control externas; y otros métodos físicos, tales como bombas osmóticas o adsorción en resinas de intercambio iónico.
Los sistemas químicos incluyen, pero sin limitación, erosión química de matrices poliméricas (por ejemplo, erosión heterogénea u homogénea), o erosión biológica de una matriz polimérica (por ejemplo, heterogénea u homogénea). Se puede encontrar un análisis adicional de las categorías de sistemas de liberación controlada en Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Methods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.).
Existen diversas formulaciones de fármacos de liberación controlada que se desarrollan para la administración oral. Éstas incluyen, pero sin limitación, sistemas de suministro gastrointestinal controlados por presión osmótica; sistemas de suministro gastrointestinal controlados por presión hidrodinámica; sistemas de suministro gastrointestinal controlados por infiltración de membrana, que incluyen dispositivos de suministro gastrointestinal controlados por infiltración de membrana microporosa; dispositivos de suministro gastrointestinal de liberación controlada dirigidos al intestino resistente a fluidos gástricos; sistemas de suministro gastrointestinal controlados por difusión en gel; y sistemas de suministro gastrointestinal controlados por intercambio iónico, que incluyen fármacos catiónicos y aniónicos. Se puede encontrar información adicional sobre los sistemas de suministro de fármacos de liberación controlada en Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.).
Dosificaciones
La dosificación adecuada puede determinarla un médico tratante u otro personal sanitario cualificado, basándose en varios factores clínicos. Como se sabe bien en el campo de la medicina, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, la superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo del paciente, el tiempo y la vía de administración, la salud general, y otros fármacos que se administran al mismo tiempo. Un anticuerpo objeto de estudio se puede administrar en cantidades de 1 ng/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal por dosis, por ejemplo de 0,001 a 10, de 0,01 a 10, de 0,1 a 10, de 1 a 10, de 0,001 a 1, de 0,01 a 1, de 0,1 a 1, de 0,05 a 5, de 0,05 a 0,5 o de 0,5 a 5 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, se contemplan dosis por debajo o por encima de este intervalo ilustrativo, especialmente teniendo en cuenta los factores mencionados anteriormente. Si el régimen es una infusión continua, puede estar en el intervalo de 1 |jg a 10 mg/kg de peso corporal por minuto.
En algunas realizaciones, una dosis de un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio está en el intervalo de 0,001 jg a 100 mg, por ejemplo de 0,001 jg a 10 mg, de 0,001 jg a 1 mg, de 0,001 jg a 0,1 mg, de 0,01 jg a 10 mg, de 0,1 jg a 10 mg, de 0,1 jg a 1 mg, o de 0,1 jg a 0,1 mg, o de 0,01 a 100 mg, de 0,01 a 10 mg, de 0,01 a 1 mg, de 0,01 a 0,1 mg, de 0,1 a 100 mg, de 0,1 a 10 mg, de 0,1 a 1 mg.
En algunas realizaciones, la dosificación puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a 5 mg/kg (por ejemplo, de 0,02 a 5 mg/kg, de 0,25 a 5 mg/kg, de 0,5 a 5 mg/kg, de 0,75 a 5 mg/kg, de 1 a 5 mg/kg, de 2 a 5 mg/kg, etc.) de peso corporal. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,1, 1 0 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 0,01-10 mg/kg, o de al menos 0,1 mg/kg.
En realizaciones particulares, una dosis de un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o un fragmento del mismo, es de hasta 0,5 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, en el intervalo de 0,0001 a 0,5 mg/kg, de 0,001 a 0,5 mg/kg, de 0,01 a 0,5 mg/kg, de 0,1 a 0,5 mg/kg, de 0,0001 a 0,1 mg/kg, de 0,001 a 0,1 mg/kg, de 0,01 a 0,1 mg/kg de peso corporal.
En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio se administra en una cantidad que proporciona una concentración máxima en suero de aproximadamente 0,001 pg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, por ejemplo, de 0,0001 pg/ml a 1 pg/ml, de 0,001 pg/ml a 1 pg/ml, de 0,001 pg/ml a 0,1 pg/ml, de 0,01 a 1, o de 0,01 a 0,1 pg/ml, o de aproximadamente 0,005 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml, o de aproximadamente 0,1 pg/ml a aproximadamente 1 pg/ml, o de aproximadamente 1 pg/ml a aproximadamente 2,5 pg/ml, de aproximadamente 2,5 pg/ml a aproximadamente 5 pg/ml, de aproximadamente 5 pg/ml a aproximadamente 7,5 pg/ml, de aproximadamente 7,5 pg/ml a aproximadamente 10 pg/ml, de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 25 pg/ml, de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 50 pg/ml, de aproximadamente 50 pg/ml a aproximadamente 100 pg/ml, de aproximadamente 100 pg/ml a aproximadamente 250 pg/ml, de aproximadamente 250 pg/ml a aproximadamente 500 pg/ml, de aproximadamente 500 pg/ml a aproximadamente 750 pg/ml, o de aproximadamente 750 pg/ml a aproximadamente 1000 pg/ml. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio se administra en una cantidad que proporciona una concentración máxima en suero superior a 1 mg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, o de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml. En otras realizaciones, un anticuerpo anti-LAG-3 de la invención, o un fragmento del mismo, se administra en una cantidad que proporciona una concentración máxima en suero de hasta 1 pg/ml, por ejemplo en el intervalo de 0,0001 pg/ml a 1 pg/ml, de 0,001 pg/ml a 1 pg/ml, de 0,01 pg/ml a 1 pg/ml, de 0,1 a 1 pg/ml, de 0,0001 pg/ml a 0,1 pg/ml, de 0,001 pg/ml a 0,1 pg/ml, o de 0,01 pg/ml a 0,1 pg/ml. De forma adecuada, dicha administración es mediante inyección subcutánea.
A los individuos se les pueden administrar dichas dosis diariamente, en días alternativos, semanalmente o de acuerdo con cualquier otra pauta determinada mediante análisis empírico. Un tratamiento ilustrativo implica la administración en múltiples dosificaciones durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, de al menos seis meses. Los regímenes de tratamiento ilustrativos adicionales implican la administración una vez cada dos semanas 0 una vez al mes o una vez cada 3 a 6 meses.
Como pautas posológicas ilustrativas se incluyen de 0,01 a 1 mg/kg, de 0,01 a 0,1 mg/kg, de 0,1 a 1 mg/kg, de 1 a 10 mg/kg o 15 mg/kg en días consecutivos, de 0,02 a 20 mg/kg, por ejemplo, 0,2 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, o 20 mg/kg en días alternos, o de 0,1 a 100 mg/kg, por ejemplo, 1 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg o 60 mg/kg semanalmente. En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso, la dosificación de cada anticuerpo administrado se encuentra dentro de los intervalos indicados. El progreso puede monitorizarse mediante evaluaciones periódicas.
El número de células T CD4+ y/o CD8+ que expresan LAG-3 en un sujeto es relativamente bajo. Se espera que una sola administración de un anticuerpo de la invención (en particular, un anticuerpo de la invención que tiene una semivida en suero de al menos dos semanas y que carece de actividad CDC y ADCC significativa, tal como un anticuerpo de isotipo IgG humano (que carece de actividad CDC y ADCC), o un anticuerpo que comprende una o más mutaciones que reducen o suprimen la actividad CDC y ADCC) puede ser eficaz para inhibir la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+ inducida por antígeno durante al menos varias semanas. En vista de esto, un régimen de tratamiento adecuado puede comprender la administración de un anticuerpo de la invención (por ejemplo, de 0,01 a 1 mg/kg del anticuerpo) una vez cada cuatro, seis, ocho o diez semanas, o una vez cada dos o tres meses. Dicho tratamiento puede proporcionarse durante un período de tiempo de al menos seis meses, o de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco años o durante más tiempo, por ejemplo, durante el transcurso de una enfermedad que se trata mediante la administración, o durante toda la vida del sujeto.
Los expertos apreciarán fácilmente que los niveles de las dosis y las pautas de administración pueden variar en función del anticuerpo específico, de la gravedad de los síntomas y de la susceptibilidad del sujeto a los efectos secundarios. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente las dosificaciones y las pautas de administración preferidas de un determinado compuesto a través de diversos medios.
Vías de administración
Un anticuerpo objeto de estudio se administra a un individuo usando cualquier método y vía disponible que sea adecuado para la administración de fármacos, incluyendo métodos in vivo y ex vivo, así como vías de administración sistémicas y localizadas.
Las vías de administración convencionales y farmacéuticamente aceptables incluyen suministro intranasal, intramuscular, intratraqueal, intratecal, intracraneal, subcutáneo, intradérmico, tópico, intravenoso, intraperitoneal, intraarterial (por ejemplo, a través de la arteria carótida), espinal o cerebral, rectal, nasal, oral y otras vías de administración enterales y parenterales. Si se desea, las vías de administración se pueden combinar o ajustar dependiendo del anticuerpo y/o del efecto deseado. Una composición de anticuerpo objeto de estudio puede administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía oral. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía inhalatoria. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía intranasal. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía local. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía intracraneal. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, una composición de anticuerpo objeto de estudio se administra por vía intratecal.
Un anticuerpo de la presente divulgación se puede administrar a un hospedador usando cualquier método y vía convencional disponible adecuado para el suministro de fármacos convencionales, incluyendo vías sistémicas o localizadas. En general, las vías de administración contempladas por la invención incluyen, pero no se limitan necesariamente, a las vías enteral, parenteral o inhalatoria.
Las vías de administración parenteral distintas de la administración por inhalación incluyen, pero no se limitan necesariamente, a las vías tópica, transdérmica, subcutánea, intramuscular, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal, intratecal e intravenosa, es decir, cualquier vía de administración que no sea a través del tubo digestivo. La administración parenteral puede llevarse a cabo para efectuar el suministro sistémico o local de un anticuerpo objeto de estudio. Cuando se desee un suministro sistémico, la administración normalmente implica la administración tópica o mucosa invasiva o absorbida por vía sistémica de preparaciones farmacéuticas.
También se puede suministrar un anticuerpo objeto de estudio al sujeto mediante administración enteral. Las vías de administración enteral incluyen, pero no se limitan necesariamente, al suministro oral y rectal (por ejemplo, usando un supositorio).
Por "tratamiento" se entiende al menos una mejoría de los síntomas asociados con la dolencia que aflige al hospedador, donde mejoría se usa en un sentido amplio para referirse al menos a una reducción en la magnitud de un parámetro, por ejemplo, un síntoma, asociado con la dolencia que se está tratando, tal como un trastorno inmunitario. Como tal, tratamiento también incluye situaciones en las que la dolencia, o al menos los síntomas asociados con ella, se inhiba por completo, por ejemplo, impidiendo que suceda, o se detenga, por ejemplo, finalice, de tal manera que el hospedador ya no padezca la dolencia, o al menos los síntomas que la caractericen.
En algunas realizaciones, un anticuerpo objeto de estudio se administra mediante inyección y/o suministro, por ejemplo, en un lugar en una arteria cerebral o directamente en tejido cerebral. Un anticuerpo objeto de estudio también se puede administrar directamente en un lugar específico, por ejemplo, mediante suministro biolístico en el lugar específico.
Una variedad de hospedadores (donde el término "hospedador" se usa indistintamente en el presente documento con los términos "sujeto", "individuo", y "paciente"), puede tratarse de acuerdo con los métodos objeto de estudio. Generalmente, dichos hospedadores son "mamíferos" o pertenecen a la clase "Mammalia", donde estos términos se usan ampliamente para describir organismos que están dentro de la clase Mammalia, incluyendo los órdenes de carnívoros (por ejemplo, gatos), herbívoros (por ejemplo, ganado bovino, caballos y ovejas), omnívoros (por ejemplo, perros, cabras y cerdos), roedores (por ejemplo, ratones, cobayas y ratas) y primates (por ejemplo, seres humanos, chimpancés y monos). En algunas realizaciones, el hospedador es un individuo que tiene un sistema de complemento, tal como un mamífero, un pez o un invertebrado. En algunas realizaciones, el hospedador es un mamífero, un pez o un invertebrado, un animal de compañía, un animal agrícola, un animal de trabajo, un animal de zoológico o un animal de laboratorio, que contiene un sistema de complemento. En algunas realizaciones, el hospedador es un ser humano.
Las realizaciones incluyen composiciones que comprenden un recipiente adecuado para que contenga una composición que comprenda un anticuerpo anti-LAG-3 objeto de estudio, para su administración a un individuo. Por ejemplo, un anticuerpo objeto de estudio puede disponerse en un recipiente adecuado para que contenga una composición farmacéutica. El recipiente puede ser, por ejemplo, un frasco (por ejemplo, con un dispositivo de cierre, tal como un tapón), un envase blíster (que puede contener, por ejemplo, una o más dosis por blíster), un vial, envases flexibles (por ejemplo, bolsas Mylar o bolsas de plástico herméticas), una ampolla (para dosis únicas en solución), un gotero, una jeringa, una película delgada, un tubo y similares. En algunas realizaciones, un recipiente, tal como un recipiente estéril, comprende una composición farmacéutica objeto de estudio. En algunas realizaciones, el recipiente es un frasco o una jeringa. En algunas realizaciones, el recipiente es un frasco. En algunas realizaciones, el recipiente es una jeringa.
Se proporcionan kits con dosis unitarias de un anticuerpo objeto de estudio, por ejemplo, en dosis orales o inyectables. En dichos kits, además de los recipientes que contienen las dosis unitarias, habrá un prospecto informativo que describirá el uso y los beneficios relacionados del anticuerpo en el tratamiento de la dolencia de interés. Los compuestos preferidos y las dosis unitarias preferidas son como se han descrito anteriormente en el presente documento.
Métodos de tratamiento
De acuerdo con la invención, también se proporciona un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención, para su uso como un medicamento.
Un anticuerpo, fragmento o composición de la presente invención, puede utilizarse en cualquier terapia en la que se desee aumentar los efectos de LAG-3 en el sujeto.
El término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. La expresión "animal no humano" incluye a todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos.
El anticuerpo, fragmento o composición, se puede utilizar en cualquier terapia en la que se desee regular negativamente la proliferación y/o función de las células T.
De acuerdo con la invención, también se proporciona un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado con la proliferación o actividad de células T CD4+ y/o c D8+ en un sujeto, o un trastorno asociado con una disminución de la expresión y/o actividad de LAG-3 en un sujeto.
De acuerdo con la invención, también se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con la proliferación o actividad de células T CD4+ y/o CD8+ en un sujeto, o un trastorno asociado con una disminución de la expresión y/o actividad de LAG-3 en un sujeto.
Se proporciona además un método para tratar un trastorno asociado con la proliferación o actividad de células T CD4+ y/o CD8+ en un sujeto, o un trastorno asociado con una disminución de la expresión y/o actividad de LAG-3 en un sujeto, que comprende administrar, a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención.
El trastorno asociado con la proliferación o actividad de células T CD4+ y/o CD8+ pueden ser un trastorno inmunitario, en particular, un trastorno inmunitario mediado por células T, tal como una enfermedad inflamatoria o un trastorno autoinmunitario.
El anticuerpo, fragmento o composición puede usarse para reducir el proceso inflamatorio o para impedir el proceso inflamatorio. En una realización se proporciona una reducción in vivo de la proliferación o activación de células T, en particular las implicadas en respuestas inmunitarias inflamatorias inapropiadas, por ejemplo, reclutadas cerca/en la ubicación de dicha respuesta.
Reducción de la proliferación o activación de células T, como se emplea en el presente documento, puede ser una reducción del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más por ciento en comparación con antes del tratamiento o sin tratamiento.
Ventajosamente, el tratamiento con un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención, puede permitir una reducción en la proliferación o activación de células T, sin reducir el nivel general de células T del paciente (células T inactivadas). Esto puede dar como resultado escasos efectos secundarios e impedir el empobrecimiento de células T en el paciente.
El trastorno inmunitario, puede seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, asma, EPOC, enfermedad pélvica inflamatoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, celiaquía, colecistopatía, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, ictus, diabetes de tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis, uveítis autoinmunitaria, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico, mediados por el sistema inmunitario, tal como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, alveolitis fibrosante, enfermedad de Graves, nefropatía de lgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunitarios, pancreatitis, traumatismo (cirugía), enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplante, cardiopatía, incluyendo enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio y aterosclerosis, coagulación intravascular, osteoclasia, osteoporosis, artrosis, periodontitis e hipoclorhidria, o infecundidad relacionada con la ausencia de tolerancia materno fetal.
Un anticuerpo, fragmento o composición de la invención, puede usarse en cualquier terapia en la que se desee inhibir la unión de LAG-3 con moléculas de MHC de clase II, para antagonizar la señal de activación del MHC de clase II en células presentadoras de antígeno (APC), o para inhibir la activación de APC inducida por LAG-3.
De acuerdo con la invención, también se proporciona un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de un trastorno asociado a la activación de las APC en un sujeto.
De acuerdo con la invención, también se proporciona el uso de un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado a la activación de las APC en un sujeto.
También se proporciona un método de tratamiento de un trastorno asociado con la activación de las APC en un sujeto, que comprende administrar, a un sujeto que necesite dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención, o fragmento de unión a antígeno del mismo, o una composición farmacéutica de la invención.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratando", "tratar" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a evitar completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a curar parcial o completamente una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) evitar que la enfermedad se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que aún no se le ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocando la regresión de la enfermedad.
Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador" y "paciente", usados indistintamente en el presente documento, incluyen cualquier animal humano o no humano. La expresión "animal no humano" incluye a todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles, aunque se prefieren los mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un anticuerpo anti-LAG-3 que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento de la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del anticuerpo anti-LAG-3, de la enfermedad y de su gravedad y de la edad, peso, etc., del sujeto que se va a tratar.
Todas las publicaciones que se mencionan en el presente documento se incorporan por referencia en el mismo para divulgar y describir los métodos y/o los materiales en relación con los que se citan las publicaciones.
Ahora se describen realizaciones de la invención, como ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos adjuntos en los que:
la figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:27) de la proteína LAG-3 humana madura. Los cuatro dominios extracelulares de la superfamilia de Ig están en los restos de aminoácido: 1-149 (D1); 150-239 (D2); 240-330 (D3); y 331-412 (D4). La secuencia de aminoácidos de la estructura de bucle extra del dominio D1 de la proteína LAG-3 humana se muestra subrayada en negrita (SEQ ID NO:40);
La figura 2 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vh del anticuerpo monoclonal 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio Vh del anticuerpo monoclonal 13E2 alineado con una secuencia de ácido nucleico codificante;
La figura 4 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vl del anticuerpo monoclonal 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
La figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio Vl del anticuerpo monoclonal 13E2 alineado con una secuencia de ácido nucleico codificante;
La figura 6 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vh del anticuerpo monoclonal 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio Vh del anticuerpo monoclonal 34F4 alineado con una secuencia de ácido nucleico codificante;
La figura 8 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vl del anticuerpo monoclonal 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003));
La figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos del dominio Vl del anticuerpo monoclonal 34F4 alineado con una secuencia de ácido nucleico codificante;
La Figura 10 muestra las alineaciones BLAST de la línea germinal V-D-J superior de la secuencia de nucleótidos que codifica la región Vh del anticuerpo monoclonal 13E2;
La Figura 11 muestra las alineaciones BLAST de la línea germinal V-J superior de la secuencia de nucleótidos que codifica la región Vl del anticuerpo monoclonal 13E2;
La Figura 12 muestra las alineaciones BLAST de la línea germinal V-D-J superior de la secuencia de nucleótidos que codifica la región Vh del anticuerpo monoclonal 34F4;
La Figura 13 muestra las alineaciones BLAST de la línea germinal V-J superior de la secuencia de nucleótidos que codifica la región Vl del anticuerpo monoclonal 34F4;
La Figura 14 muestra los resultados de la unión de diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 agonistas 13E2 y 34F4, y del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 antagonista 17B4, con células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con LAG-3, comparados con un anticuerpo de control de isotipo (mIgG1); La Figura 15 muestra los resultados de la unión de diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 agonistas 13E2 y 34F4, y del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 antagonista 17B4, con células primarias CD4+ y CD8+ primarias (CMSP estimuladas con SEB), comparados con un anticuerpo de control de isotipo (mlgG1), de un donante sano (donante 1);
La Figura 16A muestra los resultados de la inhibición de la unión de IMP321 (LAG-3Ig, 1 pg/ml) con células B positivas al MHC de clase II, mediante diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 agonistas 13E2 y 34F4, y del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 antagonista 17B4, comparados con un anticuerpo de control de isotipo (mlgG1). La Figura 16B muestra los resultados de la inhibición de la activación de células THP-1 mediante IMP321 (20 ng/ml) en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 agonistas 13E2 y 34F4, y del anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 antagonista 17B4, comparados con un anticuerpo de control de isotipo (mlgG1);
La Figura 17(A) ilustra los perfiles de proliferación inducidos por CMV de células T CD8+ de un donante en presencia de mlgG1, 17B4, 13E2 o 34F4, analizados por citometría de flujo y la estrategia de selección usada para el ensayo descrito en el Ejemplo 10. La Figura 17(B) muestra los resultados de un ensayo de inhibición de proliferación de células T CD8+ por los anticuerpos 13E2, 34F4 y 17B4, comparados con el anticuerpo de control de isotipo (mlgG1) del mismo donante. También se muestra la proliferación en el punto de partida (No estim); La Figura 18 muestra los resultados de un ensayo de inhibición de proliferación de células T CD4+ o CD8+ por los anticuerpos 13E2 o 34F4, comparados con el anticuerpo de control de isotipo (mlgG1), en varios donantes diferentes;
La figura 19 muestra el efecto de diferentes concentraciones de anticuerpos monoclonales anti-LAG-3 agonistas 13E2 y 34F4 sobre la proliferación de células T CD8+;
La figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de un anticuerpo quimérico 13E2-Fc IgG4 humano (en la figura, a la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 13E2-Fc IgG4 humano quimérico se la denomina 13E2IgG4mut), y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de un anticuerpo quimérico 13E2-IgK humano (en la figura, a la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 13E2-IgK humano quimérico se la denomina 13E2IgK);
La Figura 21 ilustra los diferentes efectos sobre las células T de anticuerpos empobrecedores, antagonistas y agonistas anti-LAG-3;
La Figura 22 muestra una alineación de las regiones variables de las variantes 1-4 de VH humanizadas (VH1, VH2, VH3 y VH4), y una alineación de las regiones variables de las variantes 1-4 de VL humanizadas (VL1, VL2, VL3 y VL4), con la secuencia correspondiente del anticuerpo monoclonal, original de ratón 13E2 (13E2 VH y 13E2 VL, respectivamente). Las secuencias de CDR se resaltan en gris. Los cambios en las secuencias estructurales humanizadas de las variantes, comparados con la secuencia original de ratón, se muestran subrayados y en negrita;
La figura 23 muestra la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de un anticuerpo 13E2-Fc IgG4 humano humanizado (IMP761) alineado con la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de 13E2-Fc IgG4 humano quimérico (13E2IgG4mut) del anticuerpo Quim13E2IgG4. La región Vh se muestra en negrita y la región Fc se muestra resaltada. Los restos de aminoácido de la secuencia de IMP761 humanizada que difieren de los restos correspondientes de la secuencia 13E2IgG4mut quimérica, se muestran subrayados con una sola línea. Las secuencias de CDR (basadas en la identificación de secuencias de CDR de IMGT/Kabat combinada) se muestran subrayadas con dos líneas;
La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de un anticuerpo 13E2-IgK humano humanizado (IMP761) alineada con la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de 13E2-IgK humano quimérico (13E2IgK) del anticuerpo Quim13E2IgG4. La región Vl se muestra en negrita y la región IgK se muestra resaltada. Los restos de aminoácido de la secuencia de IMP761 humanizada que difieren de los restos correspondientes de la secuencia 13E2IgK quimérica, se muestran subrayados con una sola línea. Las secuencias de CDR (basadas en la identificación de secuencias de CDR de IMGT/Kabat combinada), se muestran subrayadas con dos líneas;
La figura 25 muestra los resultados de un ensayo para comprobar la unión del anticuerpo quimérico 13E2-Fc IgG4 humano (Quim13E2IgG4) e IMP761 con células CHO-LAG-3+;
La Figura 26 muestra los resultados de un ensayo para comprobar el efecto de IMP761 y Quim13E2IgG4 sobre: (a) la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno; y (b) la expresión de CD25 en células T CD8+;
La Figura 27 muestra el efecto de IMP761 y Quim13E2IgG4 sobre la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno, y la expresión de CD25, como un gráfico de: (a) el porcentaje de inhibición de la proliferación de células T CD8+; y (b) el porcentaje de inhibición de la expresión de CD25 dentro de células T c D8+, comparado con un control del mismo isotipo;
La Figura 28 muestra el efecto de diferentes concentraciones de IMP761 y Quim13E2IgG4 sobre la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno;
La Figura 29 muestra los resultados de los ensayos de ADCC para determinar si IMP761 tiene actividad citotóxica frente a células que expresan LAG-3, usando: un bioensayo indicador de ADCC disponible en Promega (a); y un ensayo de ADCC usando CMSP estimuladas con IL-2 como células efectoras - los resultados se representan gráficamente como el porcentaje de: células T CD4+ y CD8+ (b); o células T CD4+ LAG-3+ y CD8+ LAG-3+ (c) en la población de CMSP;
La Figura 30 muestra los resultados de los ensayos de CDC usando complemento de conejo para determinar si IMP761 tiene actividad citotóxica frente a células que expresan LAG-3 - los resultados se representan como el porcentaje de: (a) células T CD4+ y CD8+; o (b) células T CD4+ LAG-3+ y CD8+ LAG-3+, en la población de CMSP; y
La Figura 31 muestra los resultados de un ensayo para determinar si IMP761 tiene actividad citotóxica frente a células que expresan LAG-3 después de cultivar con el anticuerpo, durante 3 días, CMSP estimuladas con antígeno. Los resultados se representan gráficamente como: (a) el porcentaje de células T CD4+ y CD8+ en la población de CMSP; y (b) el porcentaje de células LAG-3+ en la subpoblación de células T CD4+ y CD8+.
Ejemplo 1
Generación del anticuerpo monoclonal anti-LAG-313E2
Para generar anticuerpos anti-LAG-3, se inmunizaron 15 ratones Balb/c (denominados ratones números 1-15 a continuación) de acuerdo con el protocolo de inmunización descrito más adelante.
Se inmunizaron trece ratones, cada uno de ellos con inyecciones subcutáneas (s.c.) de 100 |jg de IMP321 (LAG-3Ig), lote S017/LC1/041011 de calidad clínica (denominado "LC1" más adelante): 3 veces (ratón n.° 12); 4 veces (ratón n.° 9); 5 veces (ratones n.° 5 y n.° 14); o 6 veces (ratones n.° 3 y N.° 11) el día 0, el día 15, el día 30, el día 50, el día 67 y el día 108. Los ratones n.° 1, 2, 4, 8, 10, 13 y 15 se inmunizaron hasta 4 veces más. En paralelo, dos ratones (ratón n.° 6 y ratón n.° 7), usados como controles, se inmunizaron con 10 jg de LC1 en adyuvante completo de Freund (CFA, Complete Freund's Adjuvant) una vez el día 0, y con la misma dosis de antígeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA, Incomplete Freund's Adjuvant) el día 15, día 30, día 50, día 67 y día 108.
Doce días después de la 6a inmunización, se extrajo suero de los ratones n.° 1, 2, 3, 4, 8, 10, 11, 13 y 15 (los ratones n.° 5, 9, 12 y 14 ya se habían sacrificado) y se analizó en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando como antígeno revestido D1-D4 de LAG-3, el anticuerpo monoclonal murino anti-LAG-3 17B4 purificado como referencia, y como anticuerpo secundario marcado una Ig de cabra anti-ratón conjugada con HRP, para determinar la concentración de anticuerpos anti-LAG-3 presentes en el suero. Los resultados se muestran más adelante en la Tabla 2:
T l 2
Figure imgf000051_0001
Después de seis inmunizaciones, sorprendentemente, el suero de varios ratones (incluido el del ratón n.° 3) produjo mejores resultados que los del suero de los dos ratones de control positivo (n.° 6 y 7), aunque estos ratones se inmunizaron con IMP321 en ausencia de CFA o IFA como adyuvante. Esta técnica poco convencional (es decir, inmunización con IMP321 en PBS, sin usar CFA o IFA como adyuvante) también dio buenos resultados en comparación con otros experimentos que usaron células CHO que expresaban LAG-3 en IFA (datos no mostrados). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que esto puede deberse a que la propia IMP321 es un adyuvante, es decir, desencadena directamente la activación y maduración de células dendríticas.
Se evaluó la capacidad de las mismas muestras de suero para inhibir la unión de IMP321 con su ligando, el MHC de clase II, expresado en células B Raji. Durante 30 min., diez microlitros de una solución de 10|jg/ml de IMP321 conjugada con Alexa-Fluor488, se preincubaron con y sin 5 j l del suero recogido de cada ratón o suero intacto a 4 °C. Después, se añadieron células Raji a un volumen final de 50 j l y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. La fluorescencia unida a las células se analizó mediante citometría de flujo.
El ratón n.° 3 se seleccionó ya que su suero mostró un título alto (423 jg/ml) en el ensayo ELISA de suero D1-D4 (Tabla 1), y una gran capacidad para inhibir la unión de IMP321 con células B Raji positivas al MHC de clase II.
Doce días después de la sexta inmunización, el ratón n.° 3 recibió un refuerzo intravenoso (i.v.) con 10 jg de proteína recombinante D1-D4 LAG-3 (sin cola Fc) (producida en células CHO y purificada). Tres días después de la inyección i.v. de refuerzo, el ratón n.° 3 se sacrificó y se extirpó el bazo. Los esplenocitos se extrajeron exprimiendo los trozos de bazo con un émbolo de goma de jeringa de 5 ml en una placa de Petri que contenía DMEM sin suero completo. Los esplenocitos y las células de mieloma Sp2/0 (cultivadas en RPMI 1640 FCS al 10 % Glutamina 2 mM P/S al 0,5 %) se lavaron en medio sin suero. Los dos tipos de células se mezclaron entre sí en una relación de 5:1 de esplenocitos:mieloma, y después se sedimentaron por centrifugación. El agente de fusión (PEG-1500, solución de polietilenglicol al 50 % p/v en PBS, Roche 10783641001, 1 ml por 108 células) se calentó previamente a 37 °C y se añadió gota a gota al sedimento celular. Las células se resuspendieron muy suavemente y se diluyeron duplicando el volumen después de 90 segundos. Las células se diluyeron adicionalmente a intervalos regulares hasta una dilución final de 1 a 15 durante aproximadamente 5 minutos. A continuación, las células se centrifugaron y se resuspendieron en medio que contenía FBS al 10 % y se incubaron durante aproximadamente una hora a 37 °C. Después, las células (10.000 células/pocillo) se sembraron en 46 placas de 96 pocillos en RPMI completo que contenía 10% de Ultralow Ig FBS (Gibco 16250), HAT al 2% (Gibco 21060) y se complementaron con Bm Condimed H1 al 10 % (un complemento al medio de cultivo para dar soporte al crecimiento de hibridomas de células B después de la fusión y durante la clonación, Roche 11088947001) y se cultivaron hasta la exploración.
La exploración se realizó mediante citometría utilizando células CHO, con LAG-3 expresada en la membrana, para analizar la capacidad de unión de los anticuerpos presentes en los sobrenadantes de los hidridomas en crecimiento, revelados con una Ig de cabra-anti-ratón conjugada con FITC. Los hibridomas positivos se expandieron y se volvieron a explorar en células CHO LAG-3+ y en células CHO de tipo natural. De esta fusión, se exploraron un total de 632 pocillos mediante análisis FACS en células CHO que expresaban LAG-3 (un rendimiento del 14 %). Se descubrió que 4 clones de hibridoma expresaban de manera estable el anticuerpo anti-LAG-3, incluyendo 13E2. A continuación, el hibridoma se subclonó mediante dilución limitante.
T l
Figure imgf000052_0002
Ejemplo 2
Secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo 13E2
Secuencia de aminoácidos de Vh:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDIKR
YNPDLRSRLTISKDTSSSQIFLKIASVDTADTATYYCARIVEGSYSSSYFDVWGAGTTVTVS
S (SEQ ID NO:7).
La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada (Vh) del anticuerpo 13E2. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), según lo determinado por el sistema de numeración del IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), se muestran subrayadas. Las CDR, según lo determinado por el sistema de numeración de Kabat, se muestran en negrita.
La figura 2 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vh del anticuerpo monoclonal 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Los círculos con sombra (restos n.° 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100) son restos hidrófobos (no polares) en las estructuras 1-3 en sitios que son hidrófobos en la mayoría de los anticuerpos. Los cuadrados son restos clave al principio y al final de cada CDR. En la estructura, los restos de aminoácido n.° 23, 41, 89, 104, 118, son aminoácidos conservados estructuralmente; Secuencia de aminoácidos de Vi :
DIVMTQPHKFMSTSVEDRVTITCKASQDVIFDVAWYQQKPGQSPKLLIYSASSRVSGVPD
RFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPYTFGGGTTLEIK (SEQ ID NO:8).
La SEQ ID NO: 8 es la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (Vl) del anticuerpo 13E2. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), según lo determinado por el sistema de numeración del IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), se muestran subrayadas. Las CDR, según lo determinado por el sistema de numeración de Kabat, se muestran en negrita.
T l 4. n i DR VH VL 1 E2
Figure imgf000052_0001
La figura 4 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vl del anticuerpo monoclonal 13E2 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Los círculos con sombra (restos n.°4, 11, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71, 76, 87, 89, 91, 94, 96, 100, 101) son restos hidrófobos (no polares) en las estructuras 1-3 en sitios que son hidrófobos en la mayoría de los anticuerpos. Los cuadrados son restos clave al principio y al final de cada CDR. En la estructura, los restos de aminoácido n.°23, 41, 89, 104, 118, son aminoácidos conservados estructuralmente.
Ejemplo 3
Secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios variables del anticuerpo 13E2
La secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo monoclonal 13E2 se muestra en la figura 3 y más adelante:
CAGGTT ACTCT GAAAGAGT CTGGCCCTGGGAT ATTGCAGCCCT CCCAG ACCCT CAGT
CTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTCTAGGCTGGAT
TCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGACACACATTTGGTGGGATGATAT
CAAGCGCT AT AACCCAGACCT GAGG AGCCGACT GACT AT CT CCAAGGAT ACCT CCAG
CAGCCAG ATTTTCCT CAAG AT CG CCAGTGT GG ACACTGCAG AT ACTGCCACAT ATTAC
TGTGCTCGAAT AGT GGAGGGTT CAT ACAGT AGT AGTT ACTT CGAT GT CT GGGGCGCAG
GGACCACGGTCACCGTCTCCTCAG (SEQ ID NO: 9).
La alineación de ácido nucleico mediante BLAST, muestra que la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo monoclonal 13E2, tiene una identidad significativa con la secuencia de los siguientes genes de la línea germinal: IGHV8-8*01, IGHV8-11*01, IGHV8-12*01, IGHD2-12*01, IGHD1-1*01, IGHJ1*01, IGHJ1*02, IGHJ1*03.
La Figura 10 muestra una alineación de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo 13E2, con la de su emparejamiento génico de la línea germinal superior. La Figura 10 muestra que una parte que comprende los nucleótidos 1-301 de la región VH de 13E2 (que abarca las regiones estructurales FR1, FR2 y FR3 de cadena pesada) tiene una identidad de secuencia de ácido nucleico del 92,7 % con la secuencia de ácido nucleico del gen V IGHV8-8*01.
T l . R m n lin i n nr VH 1 E2 I HV - * 1
Figure imgf000053_0001
La secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo monoclonal 13E2 se muestra en la figura 5 y más adelante:
GACATTGTGATGACCCAGCCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTGGAAGACAGGGTCA
CCAT CACCT G CAAG GCC AGT CAGG AT GT G ATTTTTG AT GT AGCCT GGT AT CAACAG AA
ACCAG G ACAAT CT CCT AAATT ACT G ATTT ACT CG GC AT CCTCCCG GGT CAGTGG AGT C
CCT G ATCG CTT C ACT G G C AGT G G ATCTG G G ACG G ATTT CACTTT C ACCAT C AGT AGTG
T GCAGGCT G AAG ACCTGGCAGTTT ATT ACT GT CAG CAACACT AT AGTACT CCGT ACAC
GTTCGGAGGGGGGACCACGCTGGAAATAAAAC (SEQ ID NO: 10).
La alineación de ácido nucleico mediante BLAST, muestra que la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo monoclonal 13E2, tiene una identidad significativa con la secuencia de los siguientes genes de la línea germinal: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ2*01, IGKJ2*03, IGKJ2*02. La Figura 11 muestra una alineación de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo 13E2, con la de su emparejamiento génico de la línea germinal superior. La Figura 11 muestra que una parte que comprende los nucleótidos 1-284 de la región VL de 13E2 (que abarca las regiones estructurales FR1, FR2 y FR3 de cadena ligera) tiene una identidad de secuencia de ácido nucleico del 94,7 % con la secuencia de ácido nucleico del gen V IGKV6-17*01.
T l . R m n lin i n nr VL 1 E2 I KV -17* 1
Figure imgf000054_0001
Ejemplo 4
Generación del anticuerpo monoclonal anti-LAG-334F4
Se inmunizaron 4 ratones Balb/c (denominados ratones n.°1-4 a continuación), cada uno de ellos con cuatro (ratones n.° 2 y 4) o cinco (ratones n.° 1 y 3) inyecciones s.c. de 100 ^g de IMP321 (LAG-3Ig), lote S017/LC1/041011 de calidad clínica (denominado "LC1" más adelante), el día 0, día 14, día 28, día 43 y día 70. Se inmunizó otro ratón Balb/c (denominado ratón n.° 5 más adelante) con tres inyecciones s.c. de D1-D4 LAG-3.
Dos semanas después de la tercera inyección, el suero de cada ratón se sometió a ensayo ELISA (como se describe en el Ejemplo 1) para determinar el contenido de anticuerpos anti-LAG-3. Los resultados se presentan en la Tabla 7 más adelante:
T l 7
Figure imgf000054_0002
La capacidad del suero de cada ratón para inhibir la unión de IMP321 con las células B Raji, se determinó mediante análisis FACS (como se describe en el Ejemplo 1).
Como puede observarse a partir de la Tabla 7, los títulos de anticuerpos fueron bajos en todos los ratones. Ninguno de los sueros inhibió la unión de IMP321 con células B Raji positivas al MHC de clase II después de tres inmunizaciones. Para comprobar los títulos en suero y la capacidad de inhibición no se realizaron otras extracciones de sangre. El proceso de inmunización continuó y el ratón n.° 3, que recibió cinco inyecciones s.c. de LC1, se reforzó con 10 |jg de D1-D4 LAG-3 i.v. el día 92.
Tres días después de la inyección i.v. de refuerzo, 73 millones de esplenocitos del ratón n.° 3 se fusionaron con 15 millones de células de mieloma Sp2/0 siguiendo el mismo procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Los pocillos de 40 placas de 96 pocillos se sembraron con aproximadamente 25.500 células por pocillo, y después se cultivaron complementando el medio de cultivo con BM Condimed H1 al 10 %. Se exploraron 2.256 pocillos mediante análisis FACS en células CHO que expresaban LAG-3 (un rendimiento del 59 %). Se seleccionaron dos hibridomas anti-LAG-3 estables, incluido 34F4 (véase la Tabla 8 más adelante).
T l
Figure imgf000055_0001
Ejemplo 5
Secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo 34F4
Secuencia de aminoácidos de Vh:
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDVK
RYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTATYYCARIEGDTYYDYYFDYWGQGVTLT
VSS (SEQ ID N O : 1 7 ) .
La SEQ ID NO: 17 es la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada (Vh) del anticuerpo 34F4. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), según lo determinado por el sistema de numeración del IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), se muestran subrayadas. Las CDR, según lo determinado por el sistema de numeración de Kabat, se muestran en negrita.
La figura 6 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vh del anticuerpo monoclonal 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Los círculos con sombra (restos n.° 4, 12, 13, 19, 21, 23, 25, 41, 50, 52, 53, 71, 76, 78, 87, 89, 91, 94, 100) son restos hidrófobos (no polares) en las estructuras 1-3 en sitios que son hidrófobos en la mayoría de los anticuerpos. Los cuadrados son restos clave al principio y al final de cada CDR. En la estructura, los restos de aminoácido n.° 23, 41, 89, 104, 118, son aminoácidos conservados estructuralmente. Secuencia de aminoácidos de Vi :
DIVMTQSHKLMSTSVGDGLSITCKASQDVSIAWWYQQKPGQSPKLLIYSASFRYTGVPD
RFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSIPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:18).
La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (Vl) del anticuerpo 34F4. Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), según lo determinado por el sistema de numeración del IMGT (Lefranc, M.-P. et al., Nucleic Acids Research, 27, 209-212 (1999)), se muestran subrayadas. Las CDR, según lo determinado por el sistema de numeración de Kabat, se muestran en negrita.
T l = . n i = = DRVHxVL. 4F4
Figure imgf000056_0001
La figura 8 muestra una representación gráfica de los bucles de CDR Vl del anticuerpo monoclonal 34F4 (Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)). Los círculos con sombra (restos n.° 4, 11, 19, 21, 23, 25, 40, 41, 52, 53, 54, 71,76, 87, 89, 91,94, 96, 100, 101) son restos hidrófobos (no polares) en las estructuras 1-3 en sitios que son hidrófobos en la mayoría de los anticuerpos. Los cuadrados son restos clave al principio y al final de cada CDR. En la estructura, los restos de aminoácido n.°23, 41, 89, 104, 118, son aminoácidos conservados estructuralmente.
Ejemplo 6
Secuencia de ácido nucleico que codifica los dominios variables del anticuerpo 34F4
La secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo monoclonal 34F4 se muestra en la figura 7 y más adelante:
CAG GTT ACT CT G AAAG AGT CTG G CCCTG G G AT ATT G C AG CCCT CCC AG ACCCT C AGT
CT GACTT GTT CTTT CTCT GGGTTTTCACT GAACACTT CT GGT ATGGGT GT AGGCT GGAT
TCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGACACACATTTGGTGGGATGATGT
CAAGCGCTATAATCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGC
AG CCAGGT ATTCCT CAAG AT CGCCAGTGT GG ACACT GCAG AT ACTGCCACAT ACT ACT
GTGCTCGAATAGAGGGGGATACTTACTACGACTATTACTTTGACTACTGGGGCCAAGG
CGTCACTCTCACAGTCTCCTCAG (SEQ ID NO: 19).
La alineación de ácido nucleico mediante BLAST, muestra que la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo monoclonal 34F4, tiene una identidad significativa con la secuencia de los siguientes genes de la línea germinal: IGHV8-8*01, IGHV8-12*01, IGHV8-11*01, IGHD1-1*01, IGHD1-2*01, IGHD2-3*01, IGHJ2*01, IGHJ2*02, IGHJ2*03.
La Figura 12 muestra una alineación de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VH del anticuerpo 34F4, con la de su emparejamiento génico de la línea germinal superior. La Figura 12 muestra que una parte que comprende los nucleótidos 1-301 de la región VH de 34F4 (que abarca las regiones estructurales FR1, FR2 y FR3 de cadena pesada), tiene una identidad de secuencia de ácido nucleico del 94,4 % con la secuencia de ácido nucleico del gen V |GhV8-8*01.
T l 1. R m n lin i n nr VH 4F4 I HV - * 1
Figure imgf000056_0002
continuación
Figure imgf000057_0001
La secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo monoclonal 34F4 se muestra en la figura 9 y más adelante:
G ACATT GT GAT G ACCCAGT CT CACAAACT CAT GT CCACAT CAGTTGG AG ACGGGCT CA
G CAT C ACCTG CAAGGCC AGT C AGG AT GTG AG CATT G CTGTAGTCTG GTAT CAAC AG AA
ACCAG G AC AAT CT CCT AAACT G CT G ATTT ACTCG G C ATCCTT CCG GTACACT GG AGT C
CCTG ATCG CTT CACT G G CAGTG G ATCT G GG ACG G ATTT C ACTTT C ACCAT CAG CAGTG
T G C AGG CT G AAG ACCT G G C AGTTTATT ACT GT C AG CAACATT AT AGTATT CCGTGG AC
GTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAC (SEQ ID NO: 20).
La alineación de ácido nucleico mediante BLAST, muestra que la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo monoclonal 34F4, tiene una identidad significativa con la secuencia de los siguientes genes de la línea germinal: IGKV6-17*01, IGKV6-25*01, IGKV6-23*01, IGKJ1*01, IGKJ1*02, IGKJ2*01.
La Figura 13 muestra una alineación de la secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio VL del anticuerpo 34F4, con la de su emparejamiento génico de la línea germinal superior. La Figura 13 muestra que una parte que comprende los nucleótidos 1-284 de la región VL de 34F4 (que abarca las regiones estructurales FR1 FR2 y FR3 de cadena ligera) tiene una identidad de secuencia de ácido nucleico del 94,7 % con la secuencia de ácido nucleico del gen V IGKV6-17*01.
T l 11. R m n lin i n nr VL 4F4 I KV -17* 1
Figure imgf000057_0002
Ejemplo 7
Unión de los anticuerpos monoclonales 13E2 y 34F4 agonistas con células primarias y transfectadas con LAG-3+, en comparación con la del anticuerpo monoclonal antagonista 17B4
Células CHO transfectadas con LAG-3+ o CMSO estimuladas con SEB de un donante sano, se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, o con un control de isotipo (mIgG1) durante 30 minutos en PBS, BSA al 0,5 %, Azida al 0,1 % a 4 °C. Las células se lavaron y el anticuerpo unido a las células se reveló mediante una Ig (H+L) de cabra anti-F(ab')2 de ratón conjugada con FITC (Coulter). El anticuerpo secundario se eliminó mediante lavado y las células CHO se analizaron directamente mediante citometría de flujo. Las CMSP se fenotiparon usando CD4-PE-Cy7 y CD8-APC-Cy7.
Unión a células CHO LAG-3+
Los resultados se presentan como la intensidad de fluorescencia media (IFM) de células CHO transfectadas con el plásmido que codifica la LAG-3 humana en función de la concentración de anticuerpo. Los resultados se muestran en la Tabla 12 más adelante y en la figura 14.
T l 12. ni n H LA
Figure imgf000058_0002
Basándose en los resultados de la Tabla 12, el valor de CE50 de la unión de cada anticuerpo con células CHO que expresan LAG-3 es: 17B4: 0,7 nM; 13E2: 0,3 nM; 34F4: 0,5 nM.
Los valores medios de CE50 de cuatro experimentos independientes (datos no mostrados) de la unión de cada anticuerpo con células CHO que expresan LAG-3 son: 17B4: 0,7 nM; 13E2 : 0,4 nM; 34F4: 0,5 nM.
La media, de los cuatro experimentos independientes, del valor de CE50 de 13E2 es 2,7 veces la media del valor de CE50 de 17B4.
La media, de los cuatro experimentos independientes, del valor de CE50 de 34F4 es 1,6 veces la media del valor de CE50 de 17B4.
Unión a CMSP estimuladas con SEB
Los resultados se presentan como la intensidad de fluorescencia media en las células CD4+ o CD8+ de CMSP de un donante (Donante 1) estimuladas durante tres días con SEB 0,5 pg/ml en función de la concentración de anticuerpo. Los resultados de la unión con células CD4+ y CD8+, del donante 1, se muestran en la Tabla 13 más adelante y en la figura 15.
T l 1. ni n n D4 D D n n 1
Figure imgf000058_0001
Basándose en los resultados dados en la Tabla 13, el valor de CE50 de la unión de cada anticuerpo con células CD4+ es: 17B4: 0,5 nM; 13E2: 0,1 nM; 34F4: 0,1 nM.
El valor medio de CE50 de tres donantes (datos no mostrados) de la unión de cada anticuerpo con células CD4+ es: 17B4: 0,8 nM; 13E2: 0,2 nM; 34F4: 0,2 nM.
La media de los valores de CE50 de la unión de células CD4+ con 13E2 y 34F4, es tres 3,8 veces la media del valor de CE50 de 17B4.
Basándose en los resultados dados en la Tabla 13, el valor de EC50 de la unión de cada anticuerpo con células CD8+ es: 17B4: 0,7 nM; 13E2: 0,3 nM; 34F4: 0,2 nM.
El valor medio de CE50 de tres donantes (datos no mostrados) de la unión de cada anticuerpo con células CD8+ es: 17B4: 1 nM; 13E2: 0,4 nM; 34F4: 0,5 nM.
La media de los valores de CE50 de la unión de células CD8+ con 13E2 y 34F4 de los tres donantes, es 2,5 veces la media del valor de CE50 de 17B4.
Los resultados muestran que cada uno de los anticuerpos monoclonales 13E2 y 34F4, se une a células CHO que expresan LAG-3+ y a células T CD4+ y a células T CD8+, con mayor afinidad que la de 17B4.
El análisis Biacore con LAG-3Ig en la microplaca y con el anticuerpo 17B4 en el tampón de ejecución, arrojó los siguientes resultados:
ka (1/Ms) 1,09 x 106
kd (1/s) 1,32 x 10'4
KD (M) 1,21 x 10'1Ü
El análisis Biacore con el anticuerpo 17B4 en la microplaca y con LAG-3Ig en el tampón de ejecución, arrojó los siguientes resultados:
ka (1/Ms) 2,22 x 105
kd (1/s) 8,18 x 10-4
KA (1/M) 2,71 x 108
KD (M) 3,69 x 10-9
Ejemplo 8
Inhibición de la unión de IMP321 (LAG-3Ig) con células positivas al MHC de clase II mediante 13E2 y 34F4 La unión de un conjugado de IMP321 (LAG-3Ig-Alexa 488) con células B positivas al MHC de clase II (células Raji) se determinó después de la preincubación del conjugado (1 pg/ml a 4 °C) con un anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 (13E2, 34F4 o 17B4), o con un control de isotipo (mlgG1). El análisis de fluorescencia unida a células, se llevó a cabo usando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, siglas del inglés fluorescence-activated cell sorting).
La intensidad de fluorescencia media (IFM) correspondiente a LAG-3Ig unida a la célula en función de la concentración de anticuerpo se muestra en la Tabla 14 más adelante y en la figura 16A.
T l 14. IFM LA - I -Al x 4
Figure imgf000059_0001
Los resultados muestran que la unión de IMP321 con células Raji se inhibió mediante la preincubación con cada uno de los anticuerpos monoclonales específicos de LAG-3.
Ejemplo 9
Inhibición de la activación de monocitos inducida por IMP321 (LAG-3Ig) mediante 13E2 y 34F4
Durante 5 minutos, la proteína IMP321 (20 ng/ml) se preincubó con anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, 13E2, 34F4 o 17B4, o con un control de isotipo (mIgG1) a 37 °C, antes de la incubación de la mezcla con células THP-1 durante 4 horas a 37 °C. La cantidad de secreción de CCL4 por las células THP-1 se usó para determinar el nivel de activación de monocitos.
La concentración de CCL4 (expresada en pg/ml) en función de la concentración de Ac, se muestra en la Tabla 15 más adelante y en la figura 16B.
T l 1. L r T L41 n l r n n l l ^m n íi THP-1 ml
Figure imgf000060_0003
Los resultados muestran que la activación de monocitos inducida por IMP321 se inhibe mediante la preincubación de IMP321 con el anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 antagonista 17B4, y también mediante la preincubación con los anticuerpos monoclonales agonistas 13E2 y 34F4.
A partir de estos resultados y de los resultados del Ejemplo 8, se llegó a la conclusión de que los anticuerpos monoclonales agonistas 13E2 y 34F4, al igual que el anticuerpo monoclonal antagonista 17B4, interactúan con el sitio de unión del MHC de clase II de LAG-3 o cerca del mismo, como se muestra por su capacidad para bloquear la unión y la actividad de LAG-3Ig (IMP321).
Ejemplo 10
Inhibición de la proliferación de células T mediante 13E2 y 34F4 en comparación con 17B4
CMSP de 3 donantes sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106/ml en RPMI completo FBS al 10 %) se etiquetaron con éster de succinimidil carboxifluoresceína (CFSE) y se incubaron con un conjunto de péptidos que cubría la secuencia de pp35 de CMV en presencia de anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, 13E2, 34F4, 17B4, o de un control de isotipo (mIgG1) (dosis supraóptima, 300 ng/ml para el donante n.° 1 y n.°2, 100 ng/ml para el donante n.° 3). La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 5 la proliferación de células CD4+ o CD8+ basada en CFSE. Los perfiles FACS de las células T CD8+ del donante n.° 1 en presencia de cada anticuerpo diferente, así como la estrategia de selección, se muestran en la figura 17(A). La figura 17(B) muestra el porcentaje de células T CD8+ por debajo de cada pico de división, en función de la división celular, del mismo donante. Los resultados de los 3 donantes se muestran en la Tabla 16 más adelante. También se midió la proliferación inicial sin péptidos antigénicos (No estim) (véase el panel inferior de la figura 17(A) y la Tabla 16). Las células T CD4+ del donante n.° 1 no mostraron ninguna proliferación específica de CMV, por lo que no se incluyeron los resultados de esta población.
Tabla 16. Porcentaje de células T CD4 y CD8 por debajo de cada pico de división División N.° 1 2 3 4 5 6 7
CD8+ de donante n.° 1
mIgG1 0,68 0,54 1,28 2,20 1,50 1,22 0,7
17B4 0,84 1,02 1,81 2,82 2,22 2,10 1,5
13E2 1,02 0,41 0,61 0,67 0,39 0,36 0,3
34F4 1,16 0,68 1,32 1,22 0,66 0,52 0,2
No esti
Figure imgf000060_0002
1,77 0,36 0,33 0,52 0,38 0,13 0,0
Figure imgf000060_0001
continuación
Figure imgf000061_0002
El índice de proliferación (IP) (calculado como la suma de: el porcentaje de células T CD4+ o CD8+ por debajo de cada pico de división, multiplicado por el número de división) se proporciona en la Tabla 17. Este índice enfatiza los porcentajes de las células que han pasado por varias rondas de división. La Tabla 17 también registra el porcentaje de inhibición de cada anticuerpo en comparación con el control de isotipo (mIgG1) basándose en los valores de IP.
Tabla 17. Efecto de los anticuerpos 13E2 y 34F4 sobre la proliferación de células T CD4+ y CD8+ en comparación n 17B4
Figure imgf000061_0001
continuación
Figure imgf000062_0001
Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales 13E2 y 34F4 inhiben constantemente la proliferación de células T CD4+ y CD8+ T inducida por péptidos antigénicos, aunque que el anticuerpo monoclonal 17B4 tiende a tener un escaso efecto positivo a la concentración sometida a ensayo.
Ejemplo 11
Inhibición de la proliferación de células T mediante 13E2 y 34F4
CMSP de 12 donantes sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106/ml en RPMI completo FBS al 10%) se etiquetaron con CFSE y se incubaron con un conjunto de péptidos que cubría la secuencia de pp35 de CMV en presencia de anticuerpo monoclonal antiLAG-3, 13E2, 34F4, o de un control de isotipo (mlgG1).
La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 5 la proliferación de células CD4+ o CD8+ basada en CFSE. El porcentaje de células T CD4+ o CD8+ por debajo de cada pico de división se calculó en función de la división celular, usando la estrategia de selección ilustrada en la figura 17(A). También se midió la proliferación inicial sin péptidos antigénicos (No estim). Las células T CD4+ de los donantes n.° 1, n.° 5 y n.° 12, no presentaron ninguna proliferación específica de CMV, por lo que no se incluyeron los resultados de estas muestras.
El índice de proliferación (IP) (calculado como la suma de: el porcentaje de células T CD4+ o CD8+ por debajo de cada pico de división, multiplicado por el número de división) de cada donante, se proporciona en la Tabla 18, y los resultados se representan gráficamente en la figura 18. La Tabla 18 también registra el porcentaje de inhibición de cada anticuerpo en comparación con el control de isotipo (mIgG1) basándose en los valores de IP.
^
Figure imgf000062_0002
continuación
Figure imgf000063_0001
Los valores medios de estos resultados se exponen en la Tabla 19.
Tabla 19. Efecto de los anticuerpos 13E2 y 34F4 sobre la proliferación de células T CD4+ y CD8+(promedios de n n
Figure imgf000064_0003
Los resultados muestran que los anticuerpos monoclonales anti-LAG-3, 13E2 y 34F4, inhiben la proliferación de células T CD4+ y CD8+ inducida por péptidos antigénicos. Los resultados sugieren que el efecto inhibidor de cada anticuerpo puede ser más pronunciado para células T CD8+ que para células T CD4+. En la mayoría de los donantes sometidos en ensayo, los efectos de los anticuerpos 13E2 y 34F4 fueron muy similares, por lo que los anticuerpos parecen tener una actividad comparable.
Ejemplo 12
Respuesta a la dosis de anticuerpo agonista sobre la proliferación de células T CD8+
CMSP etiquetadas con CFSE, se estimularon con péptido de CMV, como se ha descrito anteriormente, en presencia de diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-LAG-3 agonista, 13E2, 34F4, o de un control de isotipo (mIgG1).
La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 5 la proliferación de células T CD8+ basada en CFSE. El índice de proliferación (calculado como la suma del porcentaje de células T CD8+ por debajo de cada pico de división, multiplicado por el número de división) se proporciona en la Tabla 20.
Tabla 20. Efecto de los anticuerpos 13E2 y 34F4 sobre la proliferación de células T CD8 Anticuerpo (30 ng/ml) Índice
mIgG1 69,9
13E2 26,2
34F4 16,4
Ningun
Figure imgf000064_0002
95,3
Figure imgf000064_0001
En la Tabla 21 más adelante, se registra el índice de proliferación de células T CD8 en función de la concentración de anticuerpo. Los resultados de la Tabla 21 se representan gráficamente en la Figura 19.
Tabl CD8+
Figure imgf000064_0004
Los resultados muestran que una dosis tan baja como 30 ng/ml de anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, 13E2 o 34F4, ocasiona una inhibición máxima de proliferación de células T CD8+. Los resultados también muestran que los efectos de los anticuerpos fueron muy similares.
Ejemplo 13
La inhibición de células T CD8+ mediante 34F4 se invierte mediante preincubación con IMP321
CMSP de 2 donantes, etiquetadas con CFSE, se estimularon con el péptido de CMV, como se ha descrito anteriormente, en presencia de diversas concentraciones de anticuerpo 34F4. La dosis de 1 |jg/ml de 34F4 también se evaluó después de la neutralización con un exceso de 10 veces de IMP321.
La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 5 la proliferación de células T CD8+ basada en CFSE. El porcentaje de inhibición de la proliferación de células T CD8+ se calculó basándose en el porcentaje de células en división que se observa en presencia de anticuerpo 34F4, o de anticuerpo 34F4 e IMP321 (LAG-3Ig), en comparación con un control con o sin IMP321.
Los resultados se muestran en la Tabla 22 más adelante.
Tabla 22. Efecto de IMP321 sobre la inhibición de la proliferación de células T CD8+ mediante el anticuerpo 34F4
Donante n.° 1 Donante n.° 2
Figure imgf000065_0001
Los resultados muestran que la preincubación del anticuerpo 34F4 con IMP321 invierte el efecto inhibidor del anticuerpo 34F4 sobre la proliferación de células T CD8+. Esto muestra que la inhibición de la proliferación de células T CD8+ mediada por 34F4, depende de la unión del anticuerpo 34F4 con LAG-3.
Ejemplo 14
La inhibición de la proliferación de células CD8+ mediante 13E2 y 34F4, no se invierte mediante IL-2 CMSP etiquetadas con CFSE, se estimularon con péptidos de CMV, como se ha descrito anteriormente, en presencia de anticuerpo 13E2 o 34F4, con o sin IL-2.
La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 5 la proliferación de células T CD8+ basada en CFSE. El porcentaje de inhibición de la proliferación de células T CD8+ se calculó basándose en el porcentaje de células en división observado en presencia de anticuerpo 13E2 o 34F4, con o sin IL-2, en comparación con un control de isotipo con o sin IL-2.
Los resultados se muestran en la Tabla 23 más adelante.
Tabla 23. Efecto de IL-2 sobre la inhibición de la proliferación de células T CD8+ mediante los anticuerpos 13E2 y
4F4
Figure imgf000065_0002
Los resultados muestran que la adición de IL-2 exógena no pudo superar el efecto inhibidor del anticuerpo 13E2 o 34F4 sobre la proliferación de células T CD8+. A partir de estos resultados, se llegó a la conclusión de que cada uno de los anticuerpos 13E2 y 34F4, inhibe directamente la señal 1 (respuesta al antígeno de CMV, una ruta dependiente del receptor de células T) pero no la señal 2 (respuesta a IL-2, que es la ayuda de las células CD4) en células T CD8+.
Ejemplo 15
Efecto de 13E2 sobre la secreción del marcador de activación de células T
Las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) incluyen linfocitos (células T, células B y células NK), monocitos y células dendríticas. El IFN-y se secreta predominantemente por células T CD4+ y CD8+ de memoria y efectoras activadas y por células NK tras la activación. Después de volver a estimular con antígeno específico in vitro, se induce la secreción de IFN-y.
CMSP de 4 donantes sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106/ml en RPMI completo FBS al 10 %) se etiquetaron con CFSE y se incubaron con un conjunto de péptidos que cubría la secuencia de pp35 de CMV en presencia de anticuerpo monoclonal anti-LAG-3, 13E2, o de un control de isotipo (mlgG1). La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 2 la liberación de IFN-y en el sobrenadante celular. La concentración de IFN-y y el porcentaje de inhibición de la secreción de IFN-y mediante 13E2, se presenta en la Tabla 24 más adelante.
T l 24
Figure imgf000066_0002
Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal 13E2 inhibió la secreción de IFN-y en cada uno de los donantes sometidos a ensayo. Esto demuestra que el anticuerpo monoclonal 13E2 inhibe la activación de células T. Ejemplo 16
Efecto de 13E2 y 34F4 sobre la expresión del marcador de activación de células T
CMSP de 4 donantes sanos (0,2x106 células/pocillo, a 1x106/ml en RPMI completo FBS al 10 %) se etiquetaron con CFSE y se incubaron con un conjunto de péptidos que cubría la secuencia de pp35 de CMV en presencia de anticuerpo monoclonal anti-LAG-313E2 o 34F4, o de un control de isotipo (mIgGI).
La respuesta de las células T se investigó midiendo el día 5 la expresión de CD25, como un marcador de activación, en células T CD8+. El porcentaje de células T CD8+ que expresan CD25, así como el porcentaje de inhibición de la expresión de CD25 mediante l3E2 o 34F4, se presenta en la Tabla 25 más adelante.
T l 2
Figure imgf000066_0001
continuación
Figure imgf000067_0001
Los resultados muestran que cada anticuerpo monoclonal, 13E2 y 34F4, inhibió significativamente la expresión de CD25 en células T CD8+. Esto demuestra que cada anticuerpo inhibe la activación de células T CD8+.
Ejemplo 17
Secuencias quiméricas del anticuerpo 13E2 humano
Las secuencias de nucleótidos que codifican la región variable murina de las cadenas pesada y ligera de 13E2, se fusionaron con secuencias que codifican la región constante de las cadenas pesada y ligera Kappa de IgG4 humana, respectivamente. Estas secuencias quiméricas sintéticas se subclonaron en un vector de expresión y se expresaron en células CHO cultivadas en suspensión.
La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de un anticuerpo quimérico 13E2-Fc IgG4 humano se muestra más adelante y en la figura 20(A). El anticuerpo comprende el dominio Vh del anticuerpo monoclonal 13E2 de ratón, y una parte Fc de IgG4 humana con una mutación S228P (que suprime el intercambio de brazo Fab) (13E2IgG4mut). En la figura, la región Vh se muestra en negrita y la región Fc se muestra resaltada.
13E2IgG4mut
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGLGWIRQ
PSGKGLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLTISKDTSSSQIFLKIASVDTADTATYYCARIVEG
SYSSSYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVS
WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVES
KYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:30)
La secuencia de aminoácidos de cadena ligera de un anticuerpo quimérico 13E2-IgK humano se muestra más adelante y en la Figura 20(B). El anticuerpo comprende el dominio Vl del anticuerpo monoclonal 13E2, y una parte C de la cadena kappa de Ig (IgK) humana de tipo natural (13E2IgK). En la figura, la región Vl se muestra en negrita y la región IgK se muestra resaltada.
13E2IgK
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQPHKFMSTSVEDRVTITCKASQDVIFDVAWYQQKP
GQSPKLLIYSASSRVSGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQHYSTPYTFGG
GTTLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
NO:37)
Un anticuerpo 13E2 humano quimérico (denominado Quim13E2IgG4) comprende las cadenas pesada y ligera quiméricas: 13E2IgG4mut; y 13E2IgK.
Ejemplo 18
Secuencias del anticuerpo monoclonal 13E2 humanizado (IMP761)
Para la retención óptima de la conformación del bucle de CDR, se usó la identificación combinada de secuencias de CDR de IMGT/Kabat para injertar las CDR de 13E2 murino en estructuras humanas para obtener una versión humanizada de 13E2. Estas secuencias quiméricas sintéticas se subclonaron en un vector de expresión y se expresaron en células CHO cultivadas en suspensión.
Las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 13E2 humanizado (denominado IMP761) se muestran más adelante. Los dominios variables se muestran en negrita, las secuencias de CDR se muestran subrayadas.
Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de IMP761
MGWTLVFLFLLSVTAGVHSQITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGLGWIRQ
PPGKTLEWLTHIWWDDIKRYNPDLRSRLSITKDTSKNQWLTMTNMDPLDTGTYYCARIV
EGSYSSSYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVT
VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID
NO:84)
La alineación de esta secuencia (cadena pesada de IMP761) con la secuencia de cadena pesada quimérica, 13E2IgG4mut, del Ejemplo 17, se muestra en la Figura 23. En la figura, la región VH se muestra en negrita y la región Fc se muestra resaltada. Los restos de aminoácido de la secuencia de IMP761 humanizada que difieren de los restos correspondientes de la secuencia 13E2IgG4mut quimérica, se muestran subrayados con una sola línea. Las secuencias de CDR (basadas en la identificación de secuencias de CDR de IMGT/Kabat combinada), se muestran subrayadas con dos líneas. Los restos cambiados en la secuencia humanizada, también se exponen más adelante en la Tabla 26 (como variante 4 de VH, VH4, así como los restos cambiados en otras tres variantes humanizadas de la secuencia de cadena pesada original de 13E2: variantes 1,2 y 3 de VH, VH1, VH2 y VH3).
T l 2
Figure imgf000068_0001
continuación
Figure imgf000069_0001
Las secuencias estructurales de cadena pesada del anticuerpo humanizado (anticuerpo IMP761) son:
FR1 VH: QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFS (SEQ ID NO:64);
FR2 VH: WIRQPPGKTLEWLT (SEQ ID NO:65);
FR3 VH: RLSITKDTSKNQWLTMTNMDPLDTGTYYC (SEQ ID NO:66); y
FR4 VH: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:67).
Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de IMP761
MVSSAQFLGLLLLCFQGTRCDIVMTQTPSSLSASVGPRVTITCKASQDVIFDVAWYQQRP
GQAPKLLIYSASSRVSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPYTFGQ
GTRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID
NO:85)
La alineación de esta secuencia (cadena ligera de IMP761) con la secuencia de cadena ligera quimérica, 13E2IgK, del Ejemplo 17, se muestra en la Figura 24. En la figura, la región Vl se muestra en negrita y la región IgK se muestra resaltada. Los restos de aminoácido de la secuencia de IMP761 humanizada que difieren de los restos correspondientes de la secuencia 13E2IgK quimérica, se muestran subrayados con una sola línea. Las secuencias de CDR (basadas en la identificación de secuencias de CDR de IMGT/Kabat combinada), se muestran subrayadas con dos líneas. Los restos cambiados en la secuencia humanizada, se exponen más adelante en la Tabla 27 (como variante 3 de VL, VH3, así como los restos cambiados en otras tres variantes humanizadas de la secuencia de cadena ligera original de 13E2: variantes 1,2 y 4 de VL, VL1, VL2 y VL4).
T l 27
Figure imgf000070_0001
Las secuencias estructurales de cadena ligera del anticuerpo humanizado (anticuerpo IMP761) son:
FR1 VL: DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:76);
FR2 VL: WYQQRPGQAPKLLIY (SEQ ID NO:77);
FR3 VL: GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:78); y
FR4 VL: FGQGTRLDIK (SEQ ID NO:79)
Ejemplo 19
Unión del anticuerpo humano 13E2 quimérico (Quim13E2IgG4) y del anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) con células CHO-LAG-3+
Células CHO que expresan LAG-3 en su superficie (0,05 x 106 células/pocillo en PBS, BSA al 0,5 %, azida al 0,1 %), se incubaron con diferentes concentraciones de un anticuerpo humano 13E2 quimérico (denominado Quim13E2IgG4) que comprende las cadenas ligera y pesada quiméricas descritas en el Ejemplo 17 (cadena pesada: 13E2IgG4mut; cadena ligera: 13E2IgK), IMP761 o IgG4 humana (como control negativo del mismo isotipo). Para detectar la presencia de anticuerpos en la superficie de las células CHO-LAG-3+, se usó un anticuerpo secundario de cabra anti-IgG humana conjugado con FITC. La intensidad de fluorescencia media (IFM) de FITC, se determinó después del análisis por citometría de flujo.
Los resultados se muestran en la Tabla 28 más adelante y en la figura 25.
T l 2
Figure imgf000071_0002
Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal humanizado IMP761 se une a células CHO que expresan LAG-3 en su superficie de una manera muy similar a la del anticuerpo quimérico.
Ejemplo 20
Afinidad de unión del anticuerpo humano 13E2 quimérico (Quim13E2IgG4) y del anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) con la proteína LAG-3Ig humana
Se realizó un análisis de resonancia de plasmón superficial Biacore™ usando el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4 (que comprende la cadena pesada quimérica 13E2IgG4mut y la cadena ligera quimérica 13E2IgK, descrito en el Ejemplo 17), o el anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) descrito en el Ejemplo 18, inmovilizado covalentemente en una microplaca detectora C1. El revestimiento se realizó en acetato de sodio 10 mM, pH 5,0, para llegar a 13 ± 1 UR. Después, la proteína LAG-3Ig humana recombinante (IMP321) se pasó sobre los anticuerpos capturados a 6 concentraciones diferentes, que variaban de 0,078 a 2,5 nM, en tampón de análisis (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tween 20 al 0,05 %) a 25°°C, con regeneración en cada ciclo. El análisis se llevó a cabo en Biacore™ T200 y los datos se ajustaron usando el modelo de ajuste cinético global (Langmuir 1:1). Los parámetros cinéticos se registran en la Tabla 29 y representan el promedio de tres ejecuciones.
T l 2
Figure imgf000071_0001
Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal humanizado IMP761 tiene la misma afinidad por la proteína LAG-3Ig humana que la del anticuerpo quimérico. Los dos anticuerpos presentan una velocidad de asociación muy rápida, lo que explica la alta afinidad de los anticuerpos procedentes de 13E2 por LAG-3.
Ejemplo 21
Efecto del anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) sobre la proliferación de células T CD8+ y la expresión de CD25 inducidas por estimulación antigénica
CMSP de donantes sanos (0,2 x 106 células/pocillo, en RPMI completo FBS al 10 %) etiquetadas con CFSE, se incubaron por triplicado con un conjunto de péptidos que cubría la secuencia de pp35 de CMV, con 300 ng/ml de IgG4 humana (control de isotipo), Quim13E2IgG4 o IMP761. La respuesta de las células T se evaluó midiendo la proliferación, evaluada usando un índice de proliferación (calculado como la suma del porcentaje de células T CD8+ por debajo de cada pico de división, multiplicado por el número de división) y la expresión de CD25 el día 5 mediante citometría de flujo. El porcentaje de inhibición de cada anticuerpo, comparado con el control negativo del mismo isotipo (huIgG4), se calculó basándose en los valores del índice de proliferación, o en el porcentaje de células T CD25+ en la población de células T CD8+.
Los resultados se muestran en las Tablas 30 y 31 más adelante, y en las figuras 26 y 27.
T l
Figure imgf000072_0002
T l 1
Figure imgf000072_0001
continuación
Figure imgf000073_0002
Los resultados muestran que el anticuerpo monoclonal humanizado IMP761 tuvo un efecto similar sobre la inhibición de la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno, y sobre la expresión de CD25+, que el anticuerpo quimérico Quim13E2IgG4. Los dos anticuerpos causaron, en promedio, aproximadamente un 60 % de inhibición de la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno y aproximadamente un 45 % de inhibición de células T CD25+ en la población de células T CD8+.
Ejemplo 22
Efecto de diferentes dosis de anticuerpo humano 13E2 quimérico (Quim13E2IgG4) y de anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) sobre la respuesta de células T CD8+
CMSP de donantes sanos (0,2 x 106 células/pocillo, en RPMI completo FBS al 10 %) etiquetadas con CFSE, se incubaron por triplicado con un conjunto de péptidos que cubría la secuencia de pp35 de CMV, con diferentes dosis de Quim13E2IgG4, IMP761 o IgG4 humana (un control negativo del mismo isotipo). La respuesta de las células T se evaluó midiendo el día 5 la proliferación (dilución en CFSE) mediante citometría de flujo. El porcentaje de células T CD8+ de cada número de división se calculó para las diferentes dosis de anticuerpos usadas.
Los resultados se muestran en la Tabla 32 más adelante y en la figura 28.
T l 2
Figure imgf000073_0001
Los resultados muestran que el efecto inhibidor de IMP761 y Quim13E2IgG4 sobre la proliferación de células CD8+ inducida por antígeno, era dependiente de la dosis. En particular, el efecto inhibidor de cada anticuerpo aumenta a medida que la dosis de anticuerpo aumenta de 10 ng/ml a 100 ng/ml. A una dosis de anticuerpo de 300 ng/ml, el efecto inhibidor fue similar al de la dosis de anticuerpo de 100 ng/ml. El efecto inhibidor de IMP761 fue similar al de Quim13E2IgG4 en todas las dosis sometidas a ensayo.
Ejemplo 23
El anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) no posee actividad citotóxica contra células que expresan LAG-3 Se usaron varios tipos de ensayo para confirmar que el anticuerpo 13E2 humanizado (IMP761) no poseía actividad citotóxica contra células que expresan LAG-3.
1) Bioensayo indicador de ADCC (Promega, G7015)
En este ensayo, CMSP o células NK donantes primarias se reemplazan por células Jurkat que expresan de manera estable FcYRIIIa humano (el receptor de V158 de alta afinidad) y el elemento sensible a NFAT (Nuclear Factor of Activated Tcells, factor nuclear de células T activadas) que dirige la expresión de un gen indicador de luciferasa. Si un anticuerpo de ensayo tiene actividad ADCC, unirá entre sí una célula diana y el receptor FcYRIIIa de una célula Jurkat. La activación resultante de la ruta de señalización posterior del receptor FcYRIIIa da como resultado la activación de la ruta de NFAT induciendo así la expresión del gen indicador de luciferasa. La actividad de luciferasa se cuantifica mediante lectura de luminiscencia.
Células CHO y Jurkat transfectadas con LAG-3, y CMSP estimuladas con SEB durante 2 días para causar la expresión de LAG-3 (el 55 % de las CMSP eran LÁG-3+), se usaron como células diana para analizar la actividad ADCC de IMP761, en comparación con un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, hIgG4 (mAb recombinante de BioRad). Como control positivó se usó el anticuerpo anti-CD20 y células Raji, proporcionados con el kit de ensayo. El anticuerpo anti-CD20 también se sometió a ensayo en CMSP estimuladas con SEB. Los ensayos se llevaron a cabo, siguiendo las instrucciones del fabricante, usando 75.000 células efectoras con 12.500 células diana. Después de una incubación durante 6 horas a 37 °C, se usó el sistema de ensayo de luciferasa Bio-Glo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para medir la luminiscencia usando un luminómetro PerkinElmer EnVision 2103 (tiempo de integración de 0,5 seg/pocillo).
Los resultados se muestran en la Tabla 33 más adelante y en la figura 29. Los resultados se presentan como el factor de cambio en la unidad relativa de luminiscencia (URL), calculado dividiendo la URL obtenida en presencia del anticuerpo de ensayo (a la concentración máxima recomendada por el fabricante, 3 pg/ml), entre la URL obtenida sin anticuerpo.
Tabla 33
Figure imgf000074_0001
Los resultados muestran que el factor de cambio en URL del anticuerpo IMP761 fue de aproximadamente 1 para cada una de las diferentes células diana sometidas a ensayo, independientemente de si la célula diana expresa o no LAG-3. El factor de cambio en URL obtenido para el anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, hIgG4, fue ligeramente superior y varió de 1,4 a 2,5 veces para las diferentes células diana. El anticuerpo anti-CD20 de control positivo mostró actividad ADCC significativa contra las células Raji (una línea de células B) y contra CMSP estimuladas con SEB, que contienen un pequeño porcentaje de células B.
A partir de estos resultados se llegó a la conclusión de que el anticuerpo IMP761 no tiene ninguna actividad ADCC contra células que expresan LAG-3.
2) Ensayo de ADCC convencional
Este ensayo usa CMSP estimuladas durante un día en medio X-Vivo 10 (Lonza) con 100 UI/ml de IL-2 (Roche) y CMSP etiquetadas con CFSE, estimuladas con SEB durante dos días para permitir la expresión de LAG-3 en células T. El ensayo se llevó a cabo en medio X-Vivo 10 a una relación de célula efectora:diana de 50:1, con dosis altas (3 |jg/ml) de IMP761 o de un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, hIgG4. Después de 4 horas, las mezclas celulares se recogieron y se tiñeron para CD4, CD8, CD25 y LAG-3 usando anticuerpos conjugados con fluorocromo. A continuación, se evaluó la viabilidad celular en cada población de células sanguíneas mediante citometría de flujo, después de la exclusión de las células que parecían positivas para la tinción con 7-aminoactinomicina D (7-AAD), un colorante fluorescente que etiqueta las células que han perdido su integridad membranosa, un fenómeno que aparece rápidamente después de la muerte celular.
Los resultados se muestran en la Tabla 34 y en la figura 29(b) y (c). Los resultados se presentan como el porcentaje de células CD4+ o CD8+ vivas en la población de CMSP (b) y como el porcentaje de células LAG-3+CD4+ o LAG-3+CD8+ vivas en la población de CMSP (c).
Tabla 34
Figure imgf000075_0001
Los resultados muestran que el anticuerpo IMP761 no reduce el porcentaje de células T CD8+ o CD4+ en la población de CMSP, o el porcentaje de células T citotóxicas LAG-3+CD8+ o células T auxiliares LAG-3+CD4+ en la población de CMSP. El anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, hIgG4, causó una ligera reducción en la viabilidad de las células T en la población de CMSP, especialmente de células T activadas que expresan LAG-3. A partir de estos resultados se llegó a la conclusión de que el anticuerpo IMP761 no tiene ninguna actividad ADCC contra células T que expresan LAG-3.
3) Ensayo de CDC
Para analizar la CDC, células estimuladas con SEB, usadas como células diana, se incubaron con 3 jg/ml de IMP761, un anticuerpo de control negativo del mismo isotipo, hIgG4, un anticuerpo de control anti-CD3 positivo a CDC (clon MEM-57, Cerdalane), o un anticuerpo de ratón de control negativo del mismo isotipo, mIgG2a, durante 45 minutos en PBS, BSA al 0,5 %. A continuación, los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante lavado y las células se incubaron durante 1 hora a 37 °C con complemento de conejo diluido en 3 volúmenes en medio RPMI. Las células se tiñeron con respecto a CD4, CD8, CD25 y LAG-3 usando anticuerpos conjugados con fluorocromo. A continuación, se evaluó la viabilidad celular en cada población de células sanguíneas mediante citometría de flujo, después de la exclusión de las células etiquetadas con 7-AAD.
Los resultados se muestran en la Tabla 35 y en la Figura 30. Los resultados se presentan como el porcentaje de células CD4+ o CD8+ vivas en la población de CMSP (a) y como el porcentaje de células LAG-3+CD4+ o LAG-3+CD8+vivas en la población de CMSP (b).
Tabla 35
Figure imgf000075_0002
Los resultados muestran que el anticuerpo IMP761 no reduce el porcentaje de células T CD8+ o CD4+ en la población de CMSP, o el porcentaje de células T citotóxicas LAG-3+CD8+ o células T auxiliares LAG-3+CD4+ en la población de CMSP. Como se esperaba, el anticuerpo de control positivo anti CD3 provocó una disminución en el porcentaje de células T en la población de CMSP y de células T activadas que expresan LAG-3.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado agonista anti gen 3 de activación de linfocitos (LAG-3), o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a LAG-3 e inhibe: la proliferación de células T CD4+ y/o CD8+inducida por antígeno; y/o la activación de células T CD4+ y/o CD8+inducida por antígeno; que comprende:
una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 1, 2 y 3, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de SEQ ID NO: 4, 5 y 6; o una región VH de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 21, 22 y 23, y una región VL de anticuerpo, comprendiendo las CDR secuencias de aminoácido de las SEQ ID NO: 24, 25 y 26.
2. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1, donde: (i) el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD4+ y CD8+ inducida por antígeno; y/o
(ii) el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno más que la proliferación de células T CD4+ inducida por antígeno; y/o
(iii) la inhibición de la proliferación de células T CD8+ inducida por antígeno, es dependiente de LAG-3 e independiente de IL-2.
3. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, el cual: inhibe la unión de LAG-3, o de una proteína de fusión que consiste en el dominio extracelular de LAG-3 humana fusionado al Fc de la IgG1 humana (IMP321), con células positivas al MHC de clase II; y/o
inhibe la activación de células presentadoras de antígeno (APC) inducida por LAG-3, o inhibe la inducción de la activación de monocitos mediante una proteína de fusión que consiste en el dominio extracelular de LAG-3 humana fusionado al Fc de la IgG1 humana (IMP321); y/o
se une a un epítopo de LAG-3 que se solapa con el sitio de unión del MHC de clase II de LAG-3.
4. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende:
una región VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la secuencia de aminoácidos s Eq ID NO: 7, y una región VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8;
una región VH de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, y una región VL de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8;
una región VH de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, y una región VL de anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8; o
una región VH de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7, y una región VL de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8.
5. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que es un anticuerpo monoclonal humanizado, o fragmento de unión a antígeno del mismo.
6. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende una región estructural de cadena ligera humanizada.
7. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 6, donde: la región estructural de cadena ligera humanizada comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 68 a 83.
8. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 7, donde el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 68; una FR2 VL de SEQ ID NO: 69; una FR3 VL de SEQ ID NO: 70; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 71;
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 72; una FR2 VL de SEQ ID NO: 73; una FR3 VL de SEQ ID NO: 74; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 75;
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 76; una FR2 VL de SEQ ID NO: 77; una FR3 VL de SEQ ID NO: 78; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 79; o
una región estructural 1 de VL (FR1 VL) de SEQ ID NO: 80; una FR2 VL de SEQ ID NO: 81; una FR3 VL de SEQ ID NO: 82; y una FR4 VL de SEQ ID NO: 83.
9. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, que comprende una región VL de anticuerpo que comprende:
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71; una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79; o una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79;
una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; o una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.
10. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende una región estructural de cadena pesada humanizada.
11. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 10, donde la región estructural de cadena pesada humanizada comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 52 a 67.
12. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con la reivindicación 11, donde el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, comprende:
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 52; una FR2 VH de SEQ ID NO: 53; una FR3 VH de SEQ ID NO: 54; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 55;
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 56; una FR2 VH de SEQ ID NO: 57; una FR3 VH de SEQ ID NO: 58; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 59;
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 60; una FR2 VH de SEQ ID NO: 61; una FR3 VH de SEQ ID NO: 62; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 63; o
una región estructural 1 de VH (FR1 VH) de SEQ ID NO: 64; una FR2 VH de SEQ ID NO: 65; una FR3 VH de SEQ ID NO: 66; y una FR4 VH de SEQ ID NO: 67.
13. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende una región VH de anticuerpo que comprende:
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 52; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59; una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63;
una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; o una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.
14. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende:
una región VH de anticuerpo que comprende: una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; y una región VL de anticuerpo que comprende: una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una CDR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y una FR4 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79; o
una región VH de anticuerpo que comprende: una FR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; una CDR1 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; una FR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65; una CDR2 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; una FR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; una CDR3 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; y una FR4 VH que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67; y una región VL de anticuerpo que comprende: una FR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO: 76; una CDR1 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; una FR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77; una CDR2 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; una FR3 VL que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; una C D R 3 V L que t ie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de S E Q ID NO: 26; y una FR 4 V L que tie n e una se cu e n c ia de a m in o á c id o s de S E Q ID NO: 79.
15. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, el cual:
es una molécula de anticuerpo quimérico, o fragmento de unión a antígeno del mismo; que comprende opcionalmente la secuencia de aminoácidos de la región variable de un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, y la secuencia de aminoácidos de la región constante humana; y/o
carece de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC); y/o
se une a una proteína lAG-3 humana (o a una proteína LAG-3Ig humana) con una constante de disociación (Kd) no superior a 100 pM, no superior a 90 pM, no superior a 80 pM, no superior a 70 pM, no superior a 60 pM, no superior a 50 pM, no superior a 40 pM, no superior a 30 pM, o no superior a 25 pM, según lo determinado por análisis de Biacore; y/o
no se une a la secuencia de bucle extra de 30 aminoácidos (SEQ ID NO: 40) del primer dominio D1 aminoterminal de la proteína LAG-3 humana.
16. Un ácido nucleico que comprende: una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior; o una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 y 10, o una secuencia de nucleótidos que es al menos 80 % idéntica a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9 y 10 y codifica un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquier reivindicación anterior.
17. Un vector recombinante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 16.
18. Una célula recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 16 o el vector recombinante de la reivindicación 17.
19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, y un transportador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.
20. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, para su uso como un medicamento.
21. Un anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 19, para su uso en el tratamiento de un trastorno inmunitario mediado por células T, donde el trastorno inmunitario mediado por células T, es una enfermedad inflamatoria o un trastorno autoinmunitario; o
donde el trastorno inmunitario mediado por células T se selecciona del grupo que consiste en artritis, artritis reumatoide, asma, EPOC, enfermedad pélvica inflamatoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad intestinal inflamatoria, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, celiaquía, colecistopatía, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, ictus, diabetes de tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis, uveítis autoinmunitaria, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico, mediados por el sistema inmunitario, tal como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmunitaria, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía de lgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunitarios, pancreatitis, traumatismo (cirugía), enfermedad de injerto contra hospedador, rechazo de trasplante, cardiopatía, incluyendo enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio y aterosclerosis, coagulación intravascular, osteoclasia, osteoporosis, artrosis, periodontitis e hipoclorhidria, o infecundidad relacionada con la ausencia de tolerancia materno fetal.
ES16759785T 2015-09-02 2016-09-01 Anticuerpos anti LAG-3 Active ES2842306T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1515572.4A GB201515572D0 (en) 2015-09-02 2015-09-02 Anti-LAG-3 antibodies
GBGB1612437.2A GB201612437D0 (en) 2016-07-18 2016-07-18 Anti-lag-3 antibodies
PCT/EP2016/070664 WO2017037203A1 (en) 2015-09-02 2016-09-01 Anti-LAG-3 Antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2842306T3 true ES2842306T3 (es) 2021-07-13

Family

ID=56852278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16759785T Active ES2842306T3 (es) 2015-09-02 2016-09-01 Anticuerpos anti LAG-3

Country Status (19)

Country Link
US (2) US11680104B2 (es)
EP (2) EP3798234A1 (es)
JP (4) JP7074341B2 (es)
KR (2) KR20250073532A (es)
CN (2) CN117510633A (es)
AU (2) AU2016316730B2 (es)
CA (1) CA2995639A1 (es)
DK (1) DK3344654T3 (es)
ES (1) ES2842306T3 (es)
IL (1) IL257798B2 (es)
MX (2) MX2018002610A (es)
MY (1) MY205096A (es)
PH (1) PH12018500369A1 (es)
PL (1) PL3344654T3 (es)
PT (1) PT3344654T (es)
RU (2) RU2021133819A (es)
SG (1) SG10201913864RA (es)
WO (1) WO2017037203A1 (es)
ZA (1) ZA201801432B (es)

Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
UA117466C2 (uk) 2012-12-13 2018-08-10 Мерк Шарп Енд Доме Корп. СТАБІЛЬНИЙ СКЛАД У ВИГЛЯДІ РОЗЧИНУ АНТИТІЛА ДО IL-23p19
KR20250073532A (ko) * 2015-09-02 2025-05-27 이뮤텝 에스.에이.에스. 항-lag-3 항체
NZ739090A (en) 2015-10-02 2025-06-27 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies specific for pd1 and tim3
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
SG10201912663YA (en) 2016-10-11 2020-03-30 Agenus Inc Anti-lag-3 antibodies and methods of use thereof
RU2761377C2 (ru) 2017-04-03 2021-12-07 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Иммуноконъюгаты антитела к pd-1 с мутантом il-2 или с il-15
TWI690538B (zh) 2017-04-05 2020-04-11 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 特異性結合至pd1至lag3的雙特異性抗體
SI3606954T1 (sl) * 2017-04-05 2022-10-28 F. Hoffmann - La Roche Ag Protitelesa proti LAG3
EP3615572A1 (en) * 2017-04-27 2020-03-04 Tesaro Inc. Antibody agents directed against lymphocyte activation gene-3 (lag-3) and uses thereof
AU2018263868A1 (en) 2017-05-02 2019-12-12 Merck Sharp & Dohme Llc Formulations of anti-LAG3 antibodies and co-formulations of anti-LAG3 antibodies and anti-PD-1 antibodies
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
SMT202300418T1 (it) 2017-05-30 2024-01-10 Bristol Myers Squibb Co Trattamento di tumori positivi per lag-3
EP3630179A2 (en) 2017-05-30 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Compositions comprising an anti-lag-3 antibody or an anti-lag-3 antibody and an anti-pd-1 or anti-pd-l1 antibody
KR20200042937A (ko) * 2017-08-30 2020-04-24 페인스 테라퓨틱스 인코포레이티드 항-lag-3 항체 및 이의 용도
RU2771384C2 (ru) * 2017-12-22 2022-05-04 Цзянсу Хэнжуй Медсин Ко., Лтд. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к lag-3, и ее применение
WO2019129137A1 (zh) * 2017-12-27 2019-07-04 信达生物制药(苏州)有限公司 抗lag-3抗体及其用途
CN109970856B (zh) 2017-12-27 2022-08-23 信达生物制药(苏州)有限公司 抗lag-3抗体及其用途
US11661452B2 (en) 2018-03-20 2023-05-30 WuXi Biologics Ireland Limited Anti-lag-3 antibody polypeptide
US20210077477A1 (en) * 2018-03-27 2021-03-18 Raz Yirmiya Microglia modulators for use in treatment of depression
CN110343178B (zh) * 2018-04-03 2022-07-22 上海开拓者生物医药有限公司 抗人lag-3单克隆抗体及其应用
CN110606892B (zh) * 2018-06-14 2023-09-26 华博生物医药技术（上海）有限公司 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用
CN120842406A (zh) 2018-10-31 2025-10-28 默沙东有限责任公司 抗人pd-1抗体晶体及其使用方法
CN113316458B (zh) 2018-11-07 2024-08-02 默沙东有限责任公司 抗lag3抗体和抗pd-1抗体的共制剂
CN111620949A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 三生国健药业（上海）股份有限公司 结合人lag-3的抗体、其制备方法和用途
GB201906118D0 (en) 2019-05-01 2019-06-12 Immutep S A Anti-LAG-3 binding molecules
GB201906127D0 (en) 2019-05-01 2019-06-12 Immutep S A Assays
SG11202111262XA (en) 2019-05-13 2021-11-29 Regeneron Pharma Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer
EP3984554A4 (en) * 2019-06-11 2023-11-08 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. IMMUNOSUPPRESSANT
CN115666648A (zh) * 2020-04-03 2023-01-31 索伦托药业有限公司 结合lag3的工程化抗体
US11667711B2 (en) 2020-05-27 2023-06-06 Agilent Technologies, Inc. Anti-human LAG-3 antibodies and their use in immunohistochemistry (IHC)
KR20230050389A (ko) 2020-08-13 2023-04-14 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-2를 관심 표적 세포로 재지시하는 방법
WO2022087402A1 (en) 2020-10-23 2022-04-28 Bristol-Myers Squibb Company Lag-3 antagonist therapy for lung cancer
CN116514971B (zh) * 2020-12-10 2023-10-27 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗lag-3的单克隆抗体、其抗原结合片段及其应用
JP2026505276A (ja) 2023-01-31 2026-02-13 ユニバーシティ オブ ロチェスター Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための免疫チェックポイント遮断療法
WO2024192033A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating melanoma
WO2025106736A2 (en) 2023-11-15 2025-05-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of pd-1 inhibitors and lag-3 inhibitors for enhanced efficacy in treating lung cancer
US20250197493A1 (en) 2023-12-13 2025-06-19 Eli Lilly And Company Lag-3 agonist antibodies
WO2025242209A1 (zh) * 2024-05-24 2025-11-27 杭州阿诺生物医药科技有限公司 一种融合多肽及其用途
WO2025247197A1 (zh) * 2024-05-27 2025-12-04 杭州阿诺生物医药科技有限公司 一种多功能融合蛋白
WO2026035866A1 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with a lag-3 inhibitor and a pd-1 inhibitor

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57106673A (en) 1980-12-24 1982-07-02 Chugai Pharmaceut Co Ltd Dibenzo(b,f)(1,4)oxazepin derivative
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4666884A (en) 1984-04-10 1987-05-19 New England Deaconess Hospital Method of inhibiting binding of von Willebrand factor to human platelets and inducing interaction of platelets with vessel walls
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4866132A (en) 1986-04-17 1989-09-12 The Research Foundation Of State University Of New York Novel radiopaque barium polymer complexes, compositions of matter and articles prepared therefrom
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5256334A (en) 1988-09-08 1993-10-26 The Research Foundation Of The State University Of New York Homogeneous radiopaque polymer-organobismuth composites
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5976877A (en) 1990-01-08 1999-11-02 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Proteins produced by human lymphocytes DNA sequence encoding these proteins and their pharmaceutical and biological uses
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
DE69232137T2 (de) 1991-11-25 2002-05-29 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
AU680459B2 (en) 1992-12-03 1997-07-31 Genzyme Corporation Gene therapy for cystic fibrosis
US5346981A (en) 1993-01-13 1994-09-13 Miles Inc. Radiopaque polyurethanes
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
ES2249761T3 (es) 1993-06-24 2006-04-01 Advec Inc. Vectores de adenovirus para terapia genica.
EP1637608B1 (en) 1993-10-25 2009-07-22 CANJI, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
GB9424449D0 (en) 1994-12-02 1995-01-18 Wellcome Found Antibodies
KR20060099543A (ko) 1994-12-09 2006-09-19 임페리얼 컬리지 이노베이션스 리미티드 유전자의 동정
AU4188196A (en) 1994-12-22 1996-07-10 Nissan Chemical Industries Ltd. Organobismuth derivatives and process for producing the same
US5958713A (en) 1995-01-31 1999-09-28 Novo Nordisk A/S Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5747035A (en) 1995-04-14 1998-05-05 Genentech, Inc. Polypeptides with increased half-life for use in treating disorders involving the LFA-1 receptor
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
AU701375B2 (en) 1995-07-21 1999-01-28 Institut Gustave Roussy Methods for detecting, identifying, isolating, and selectively labelling and targeting Th1 lymphocytes by means of the LAG-3 protein
US5968738A (en) 1995-12-06 1999-10-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Two-reporter FACS analysis of mammalian cells using green fluorescent proteins
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6020192A (en) 1996-01-18 2000-02-01 University Of Florida Humanized green fluorescent protein genes and methods
CA2249998A1 (en) 1996-03-27 1997-10-02 Crc For Biopharmaceutical Research Pty. Ltd. The use of antibodies against cd48 for the treatment of t and b cell lymphomas and leukemias
WO1997043316A1 (en) 1996-05-10 1997-11-20 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Physiologically active molecules with extended half-lives and methods of using same
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
TW371617B (en) 1996-10-09 1999-10-11 Of Animal And Plant Health Inspection And Quarantine Council Of Agriculture Executive Yuan Bureau Method to transplant GFP into autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus for inflicting pest in an attempt to detect and flow up it existence and to improve life span against UV
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US7259247B1 (en) 1997-09-23 2007-08-21 Bundersrespublik Deutschaland Letztvertreten Durch Den Direktor Des Robert-Koch-Institutes Anti-human T-cell costimulating polypeptide monoclonal antibodies
AR014621A1 (es) 1997-12-12 2001-03-28 Macromed Inc Un poli (etilenglicol) con forma de estrella, heterofuncional, biocompatible, metodo para su obtencion y metodo para conjugarlo con una proteina
CZ20003099A3 (cs) 1998-02-25 2002-04-17 Lexigen Pharmaceuticals Corporation Zvýąení doby poloviční ľivotnosti cirkulujících fúzních proteinů odvozených od protilátek
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
GB9809839D0 (en) 1998-05-09 1998-07-08 Glaxo Group Ltd Antibody
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US5985577A (en) 1998-10-14 1999-11-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Protein conjugates containing multimers of green fluorescent protein
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP4210454B2 (ja) 2001-03-27 2009-01-21 日本たばこ産業株式会社 炎症性腸疾患治療剤
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Kyowa Kirin Co., Ltd. The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
JP3597140B2 (ja) 2000-05-18 2004-12-02 日本たばこ産業株式会社 副刺激伝達分子ａｉｌｉｍに対するヒトモノクローナル抗体及びその医薬用途
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US6374470B1 (en) 2000-10-06 2002-04-23 Milliken & Company Face plate for spun-like textured yarn
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
GB0105924D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Promoter
US20050089932A1 (en) 2001-04-26 2005-04-28 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
EP2180044A1 (en) 2001-08-03 2010-04-28 GlycArt Biotechnology AG Antibody glycosylation variants having increased anti-body-dependent cellular cytotoxicity
US20080108560A1 (en) 2002-03-05 2008-05-08 Eli Lilly And Company Heterologous G-Csf Fusion Proteins
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
CN1753912B (zh) 2002-12-23 2011-11-02 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
FI1897548T4 (fi) * 2003-02-28 2024-09-03 The Johns Hopkins University T-solujen säätely
CN1845938B (zh) 2003-06-30 2010-05-26 杜门蒂斯有限公司 多肽
WO2005040229A2 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Avidia, Inc. Ldl receptor class a and egf domain monomers and multimers
ES2567634T3 (es) 2004-02-09 2016-04-25 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina
AU2005235718B2 (en) 2004-04-23 2011-09-22 Bundesrepublik Deutschland Letztvertreten Durch Das Robert-Koch-Institut Vertreten Durch Seinen Prasidenten Method for the treatment of T cell mediated conditions by depletion of icos-positive cells in vivo
KR101699142B1 (ko) 2004-06-18 2017-01-23 암브룩스, 인코포레이티드 신규 항원-결합 폴리펩티드 및 이의 용도
JP2008512353A (ja) 2004-07-21 2008-04-24 グライコフィ， インコーポレイテッド 主にＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２グリコフォームを含むイムノグロブリン
CN101027100A (zh) 2004-07-22 2007-08-29 健泰科生物技术公司 治疗干燥综合征的方法
JP4997108B2 (ja) 2005-07-22 2012-08-08 協和発酵キリン株式会社 遺伝子組換え抗体組成物
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
US9244059B2 (en) 2007-04-30 2016-01-26 Immutep Parc Club Orsay Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
EP1987839A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-05 I.N.S.E.R.M. Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale Cytotoxic anti-LAG-3 monoclonal antibody and its use in the treatment or prevention of organ transplant rejection and autoimmune disease
US9585957B2 (en) 2007-09-07 2017-03-07 The Johns Hopkins University Adenosine receptor agonists and antagonists to modulate T cell responses
EP2044949A1 (en) 2007-10-05 2009-04-08 Immutep Use of recombinant lag-3 or the derivatives thereof for eliciting monocyte immune response
AR072999A1 (es) 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
CN102762593B (zh) 2009-07-31 2015-05-20 梅达雷克斯有限责任公司 抗btla的完全人抗体
ES2624835T3 (es) * 2009-08-06 2017-07-17 Immunas Pharma, Inc. Anticuerpos que se unen específicamente a los oligómeros A beta y uso de los mismos
TW201134488A (en) 2010-03-11 2011-10-16 Ucb Pharma Sa PD-1 antibodies
CN103249742B (zh) 2010-09-16 2017-04-12 巴利奥医药股份公司 抗人肿瘤坏死因子1型受体抗体
EP2742953B1 (en) 2011-08-11 2021-09-22 ONO Pharmaceutical Co., Ltd. Therapeutic agent for autoimmune diseases comprising pd-1 agonist
AR091649A1 (es) 2012-07-02 2015-02-18 Bristol Myers Squibb Co Optimizacion de anticuerpos que se fijan al gen de activacion de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
EA037554B1 (ru) * 2013-03-15 2021-04-13 Глаксосмитклайн Интеллекчуал Проперти Дивелопмент Лимитед Анти-lag-3 связывающие белки
US20150259420A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Novartis Ag Antibody molecules to lag-3 and uses thereof
KR20250073532A (ko) * 2015-09-02 2025-05-27 이뮤텝 에스.에이.에스. 항-lag-3 항체

Also Published As

Publication number Publication date
AU2023204589A1 (en) 2023-08-03
US20230272107A1 (en) 2023-08-31
KR102808640B1 (ko) 2025-05-14
US11680104B2 (en) 2023-06-20
BR112018004181A2 (en) 2018-09-25
CN108699145A (zh) 2018-10-23
US20190153112A1 (en) 2019-05-23
DK3344654T3 (da) 2021-01-18
PL3344654T3 (pl) 2021-05-17
HK1256116A1 (en) 2019-09-13
EP3344654B1 (en) 2020-10-21
IL257798B1 (en) 2024-06-01
IL257798A (en) 2018-06-28
RU2018111508A (ru) 2019-10-04
RU2021133819A (ru) 2021-12-10
EP3344654A1 (en) 2018-07-11
NZ740357A (en) 2025-05-30
PH12018500369A1 (en) 2018-09-03
MX2023001226A (es) 2023-03-03
RU2760582C2 (ru) 2021-11-29
JP2018537400A (ja) 2018-12-20
JP7074341B2 (ja) 2022-05-24
ZA201801432B (en) 2019-01-30
KR20250073532A (ko) 2025-05-27
PT3344654T (pt) 2021-01-26
NZ779096A (en) 2025-07-25
EP3798234A1 (en) 2021-03-31
AU2016316730B2 (en) 2023-05-25
WO2017037203A1 (en) 2017-03-09
JP2022137218A (ja) 2022-09-21
JP2024116273A (ja) 2024-08-27
JP2021097706A (ja) 2021-07-01
AU2016316730A1 (en) 2018-03-22
CA2995639A1 (en) 2017-03-09
MY205096A (en) 2024-10-01
KR20180042412A (ko) 2018-04-25
CN117510633A (zh) 2024-02-06
SG10201913864RA (en) 2020-03-30
MX2018002610A (es) 2018-09-27
IL257798B2 (en) 2024-10-01
RU2018111508A3 (es) 2020-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2842306T3 (es) Anticuerpos anti LAG-3
AU2019200448B2 (en) Anti-complement C1s antibodies and uses thereof
KR102478433B1 (ko) 이뮤노글로불린-유사 전사체 3 (ilt3)에 대해 특이적인 항체 및 그의 용도
JP6967528B2 (ja) 抗補体Ｂｂ因子抗体及びその使用
CA3189730A1 (en) Anti-tigit antibody and methods of use thereof
HK40049308A (en) Anti-lag-3 agonistic antibodies
KR20220044946A (ko) 항-b7-h3 항체 및 이의 사용 방법
HK1256116B (en) Anti-lag-3 antibodies
BR122021002581B1 (pt) Anticorpos anti-lag-3, ácido nucleico, vetor recombinante, composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-lag-3 e uso do mesmo
BR112018004181B1 (pt) Anticorpos anti-lag-3, ácido nucleico, vetor recombinante, composição farmacêutica compreendendo o anticorpo anti-lag3 e uso do mesmo
HK40063408A (en) Anti-complement c1s antibodies and uses thereof
OA17139A (en) Antibodies to bradykinin B1 receptor ligands