ES2249761T3 - Vectores de adenovirus para terapia genica. - Google Patents
Vectores de adenovirus para terapia genica.Info
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Abstract
LA INVENCION COMPRENDE UNA SERIE DE VECTORES BASADOS DE ADENOVIRUS QUE TIENEN OMISIONES EN LAS REGIONES E1 Y/O E3, Y OPCIONALMENTE INSERCIONES DE LAS SECUENCIAS PBR322 QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA ENVIAR INSERTOS DE ACIDO NUCLEICO EN LAS CELULAS ANFITRIONAS, TEJIDOS Y ORGANISMOS ANFITRIONES QUE PUEDEN ENTONCES EXPRESAR EL INSERTO. LA INVENCION TAMBIEN COMPRENDE EL USO DE ESTOS VECTORES EN LA INTRODUCCION DE GENES EN LAS CELULAS, PARA HACER VACUNAS Y EN LA TERAPIA GENETICA.
Description
Vectores de adenovirus para terapia génica.
Esta invención se refiere a vectores de
adenovirus (Ad) que son útiles para la expresión potenciada de
ácidos nucleicos seleccionados en células infectadas, transfectadas
o transformadas, especialmente células eucariotas mamíferas. Esta
invención generalmente también se refiere a vectores genéticamente
manipulados que codifican sustancias terapéuticas útiles como
vacunas y para terapia génica.
Los adenovirus (Ads) son un grupo de virus
homogéneo relativamente bien caracterizado. Hasta ahora se han
identificado aproximadamente 100 adenovirus diferentes, incluyendo
casi 50 serotipos aislados de humanos.
Los serotipos de Ads más comunes no son
patogénicos, físicamente y genéticamente estables, pueden crecer en
grandes cantidades (son fáciles de obtener reservas concentradas con
10^{11}-10^{12} PFU/ml de virus infeccioso) y
pueden ser fácilmente purificados por centrifugación en gradiente
isopícnico de CsCl. El genoma de Ad se manipula fácilmente por
técnicas de recombinación de DNA, y las proteínas codificadas por
los insertos de DNA foráneo que se expresan en células mamíferas
normalmente se glicosilarán o se fosforilarán apropiadamente a
diferencia de las proteínas recombinantes expresadas en bacterias,
levaduras y algunas células de insecto. Aunque los Ads humanos se
replican más eficientemente en células humanas de origen epitelial,
estos virus infectan al menos algunos genes virales. A diferencia de
los retrovirus, los Ads infectarán, y se expresarán en, células no
replicadas. Así, los vectores basados en Ad pueden ser útiles para
la liberación, expresión de genes y terapia génica.
Los vectores de Ad han sido construidos por la
ligación o la recombinación del DNA viral con secuencias
subgenómicas que contenidas en plásmidos de bacterias. Berkner, K.L.
y Sharp, P.A., 1983, Nucleic Acids Res. 11:
6003-6020; Haj-Ahmad, Y. y Graham,
F.L., 1986, J. Virol. 57: 267274; Stow, N.D., 1981, J.
Virol. 37: 171-180. Este acercamiento tiene
varias desventajas, que incluyen el tiempo y la dificultad técnica
requerida para producir DNA viral, los antecedentes del virus
infeccioso parental que hacen del cribado una labor pesada y, en el
caso de la ligación directa, la disponibilidad limitada de los
sitios de restricción útiles debida al tamaño relativamente grande
del genoma de adenovirus.
Otra estrategia ha sido recombinar dos plásmidos
que juntos contengan secuencias que comprenden el genoma de Ad
entero. Se han desarrollado varios sistemas de plásmidos
condicionalmente defectivos haciendo la construcción de vectores más
simple y la reducción del número de análisis subsiguientes
requeridos para identificar virus recombinantes. McGrory, W.J.,
Bautista, D.S. and Graham f.L., 1988, Virol. 163:
614-617; Ghosh-Choudhury, G.,
HajAhmad, Y., Brinkley, P., Rudy, J. y Graham, F. L., 1986,
Gene 50: 161-171; Mittal, S.K., McDermott, M.R.
Johnson, D.C., Prevec, L. y Graham, F.L., 1993, Virus Res.
28: 67-90.
El genoma representativo de adenovirus 5
("Ad5") utilizado en realizaciones de la presente invención es
un dúplex lineal de 36Kb. Su secuencia ha sido
publicada.(Chroboczek, J., Bieber, F., y Jacrot, B., 1992, The
Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and Its Comparison with
the Genome of Adenovirus Type 2, Virol. 186:
280-285; incorporados por referencia por la
presente). El genoma Ad5 contiene una repetición terminal invertida
("ITR") de 100-150 pares de bases (pb) en cada
extremo del genoma linearizado. Una proteína terminal ("PT") de
55.000 daltons se une covalentemente al extremo 5' de cada cadena.
Se piensa que ambas la TP y las ITRs juegan un papel en la
replicación de DNA viral. McGrory, W. J. et al., 1988,
Virol. 163: 614-617 y
Ghosh-Choudhury, G. et al., 1986, Gene 50:
161-171.) Ad5 ha infectado cada línea celular humana
probada, aunque algunas células, tales como linfocitos, son
relativamente no permisivos.
Cuatro regiones no contiguas del genoma de Ad5 se
transcriben pronto en la infección, antes de la replicación de DNA.
Estas regiones son la región temprana 1 (E1) (alrededor de
1,3-11,2 mu o alrededor de la posición
198-4025 pb de un genoma estanadardizado, incluida
la región potenciadora de E1A; Sussenbach, J. S., 1984, in Ginsburg
(Ed.), THE ADENOVIRUSES, Plenum Press, pp. 35-124)
que está más dividida en las subregiones E1A y E1B; la región
temprana 2 (E2), que codifica las funciones replicativas del DNA del
virus; la región temprana 3 (E3) (alrededor de
75,9-86,0 mU, o 27,275-30,904 pb;
Cladaras, C. y Wold, W.S.M., 1985, Virol. 140:
28-43; y región temprana 4 (E4). ElA está implicado
en las otras regiones tempranas y en regular varias funciones de la
célula huésped. E1B y E4 están implicadas primariamente en concluir
la síntesis proteica de la célula huésped. E3 regula la respuesta
inmune de la célula huésped a la infección del virus. Algunas de
estas funciones de los genes tempranos para "activar" los genes
expresados más tarde que se necesitan para replicar el genoma y
formar partículas virales.
Se han descrito varios vectores Ad. Por ejemplo,
un vector Ad5 se ha construido a partir de un fragmento de DNA de
adenovirus y un plásmido linearizado. Quantin et al., 1992,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584. Se ha
descrito un vector de adenovirus recombinante construido a partir de
un casete de expresión de CTFR y un fragmento de DNA de adenovirus.
Rosenfeld et al., 1992, Cell. 68:143-155.
El virión del Ad tiene la capacidad de empaquetar
hasta el 105-106% de la longitud del genoma tipo
salvaje. Bett, A.J., Prevec, L., and Graham, F.L., 1993, Packaging
Capacity y Stability Human Adenovirus Type 5 Vectors, J. Virol.
67:5911-5921. Genomas más grandes (pej., 108% del
tipo salvaje en tamaño), resultan en la inestabilidad del virus y
tasas pobres de crecimiento. Id. Esta capacidad de empaquetamiento
permite la inserción de sólo aproximadamente 1,8-2,0
Kb de DNA en exceso en el genoma del Ad.
Para empaquetar insertos más grandes, primero es
necesario suprimir porciones del genoma viral. Partes de la región
E1 se pueden suprimir, y los virus que resultan pueden ser
propagados en células 293 humanas. (células 293 contienen y expresan
el E1, complementando mutantes virales que son defectuosos en E1.)
Se pueden insertar ácidos nucleicos foráneos en lugar del E1, en
genomas de Ad5 que contienen deleciones de E1 de hasta 2,9 KB, para
producir vectores independientes de ayudantes condicionales con una
capacidad para insertar de 4,7-4,9 Kb.
Los virus con una deleción en la región E3
también pueden replicarse en células humanas cultivadas tales como
HeLa o KB e infectar y ser expresados en animales incluyendo
humanos. Se ha descrito una deleción de una secuencia E3 de 3,0 Kb,
sin una inserción concomitante. Ranheim, T.S., Shesler, J., Horton,
T.M., Wold, L.J. Gooding, L.R., y Wold, W.S.M., 1993, J. Virol.
67:21592167.
Entre los métodos desarrollados hasta ahora no
hay un procedimiento simple para generar vectores que utilicen ambas
deleciones de E1 y E3. Además, los vectores que utilicen deleciones
de E1 o E3 solamente pueden colocar insertos relativamente pequeños.
Para simplificar la producción y el uso de los vectores de Ad que
pueden tolerar fragmentos más grandes, hemos desarrollado una nueva
metodología basada en una serie de plásmidos bacterianos que
contienen la mayor parte de un genoma viral de Ad.
Un objetivo de esta invención es proporcionar
vectores de Ad5 de clonación y expresión simples, flexibles,
eficientes, con alta capacidad. Por consiguiente, se ha desarrollado
un sistema de vectores nuevo que comprende deleciones expandidas en
ambas E1 y E3 y además las combina en un sistema de vectores simple
que pueden tolerar insertos de más de 8000pb de insertos,
suficientes para colocar la mayoría de los genes que codifican
proteínas a lo largo de los elementos de control para regular la
expresión. La invención proporciona la opción de clonar ácidos
nucleicos foráneos en alguna o en ambas regiones E1 ó E3 y promete
ser la más versátil y fácil para usar tecnología ya desarrollada.
Además, una modificación del sistema permite la construcción de
virus que llevan una región E3 de tipo salvaje, e inserciones,
sustituciones, o mutaciones en la región e1.
Una realización de la presente invención
proporciona un plásmido bacteriano que comprende un genoma de
Adenovirus tipo 5 (Ad5) humano modificado circularizado. La
secuencia nucleotídica del plásmido tiene una deleción en la región
temprana 3' de dicho genoma Ad5, y un segmento de plásmido pBR322
replicable bacterianamente que codifica la resistencia a la
ampicilina sustituida por una secuencia de la región temprana 1A
(E1A) que corresponde, en parte o completamente, a la señal de
empaquetamiento.
Otra realización proporciona un plásmido
bacteriano que comprende aproximadamente 340 pares de base desde el
extremo izquierdo del genoma de Adenovirus tipo 5 las secuencias de
la repetición terminal invertida del extremo izquierdo de dichas
secuencias y las secuencias señal de empaquetamiento de las mismas,
dicho plásmido comprenden también una secuencia de genes eucariótica
de más de alrededor de 8 kilobases foráneas a dicho plásmido y a
dicho genoma viral. La secuencia de adenovirus a partir de
aproximadamente la posición nucleotídica 3540 de la misma hasta
aproximadamente la posición 5790 de la misma está presente en el
lado derecho de dicha secuencia foránea.
Otras realizaciones de la presente invención
incluyen construcciones del genoma de adenovirus que contienen
deleciones en E1 e insertos foráneos de origen eucariótico, usando
alguna combinación de tamaño de la deleción E1 y/o del tamaño del
inserto foráneo que puede ser colocado en el plásmido quedando
todavía operativo. Debido a la gran capacidad de los vectores
proporcionados aquí, múltiples insertos de genes foráneos pueden ser
reemplazados en el sitio de clonación E1. Por ejemplo, dos o más
genes que codifican diferentes antígenos, o genes que codifican
proteínas útiles, se pueden combinar con genes que codifican
marcadores seleccionables químicamente.
Una realización específica de la invención, el
plásmido pBHG10, se puede utilizar para insertar genes foráneos en
cualquiera de las regiones E1 ó E3 del genoma de Ad5. Los genes
insertados en E3 se pueden combinar con una variedad de mutaciones,
deleciones ,o inserciones en E1 por elección apropiada del plásmido
cotransfectado que contiene secuencias del extremo izquierdo
(E1).
Fig. 1 es una representación diagramática de la
estructura y de la construcción del vector pBHG10.
Fig. 2 es una representación diagramática de la
estructura y de la construcción del vector pBHG3.
Fig. 3 es una representación diagramática de
recuperación usando los vectores pBHG.
Fig. 4 es una representación diagramática de la
estructura y de la construcción de la deleción en E1 de 3,2 Kb, y
dos ejemplos (p\DeltaE1sp1A y p\DeltaE1sp1B) de plásmidos que
contienen la dicha deleción.
Fig. 5 ilustra diversos niveles de la proteína IX
sintetizada usando los plásmidos que tienen diferentes deleciones en
E1 con o sin un sitio Ssp1 reintroducido.
Fig. 6 ilustra la estabilidad del calor de los
virus con la deleción en E1 de 3,2 Kb con o sin un sitio Sspl
reintroducido.
Fig. 7 ilustra la construcción y la recuperación
de un inserto de 7,8 Kb usando pBGH10.
Fig. 8 representa la estrategia para la
construcción de un doble recombinante que contiene lacZ en la
deleción de E3 y luciferasa de luciérnaga en la deleción de E1.
Fig. 9 es una representación diagramática de los
plásmidos pABS.6, pABS.7, y pABS.9.
Fig. 10 es una representación diagramática de los
plásmidos lanzaderas pHCMVsplA, pHCMVsplB, pHCMVsp1C, y
pHCMVsplD.
Los vectores Ad recombinantes proporcionados aquí
son significativamente diferentes de las construcciones previamente
descritas en parte porque contienen la deleción más grande posible
de las secuencias de E1 (en 30-40 pb) que se puede
hacer mientras todavía se permite la generación de recombinantes
virales viables. Sorprendentemente, los diferentes elementos
genéticos descritos aquí, cuando se combinan, produjeron una
construcción estable útil para introducir y expresar ácidos
nucleicos foráneos en las células huésped.
Al inicio de estos experimentos, se desconocía
cuán grande podía ser una deleción, o donde podía tener lugar, sin
afectar el crecimiento, la producción y la inefectividad de los
viriones empaquetados. Para la viabilidad viral y la capacidad de
empaquetamiento máxima, las deleciones en la región E1
preferiblemente no deberían afectar la repetición terminal invertida
a la izquierda (ITR; 1-103 pb) o señales de
empaquetamiento (194-358 pb). Hearing, P. y Shenk,
T., 1983, Cell, 33: 695-703; Grable, M. y Hearing,
P., 1992, J. Virol. 64: 2047-2056. Además,
porque la única E1 actualmente disponible que complementa la línea
celular (células 293) no expresa la proteína IX, las deleciones
pueden no extenderse en las secuencias codificantes para este
polipéptido. (Aunque los mutantes de la deleción viral que carecían
el gen de la proteína IX han sido aislados, parece ser que la
proteína es esencial para el empaquetamiento de los genomas
completos en virus funcionales).
En las realizaciones del plásmido pBHG de la
invención, las secuencias de pBR322 se sustituyen por secuencias Ad5
a partir de la posición 188 a 1339, que incluyen la señal de
empaquetamiento, potenciador de E1A, promotor y la mayoría de
secuencias codificantes de las proteínas de ElA. El inserto pBR322
no solamente tiene una resistencia a la ampicilina, sino que también
permite que la familia pBHG de vectores se replique en células en
donde pBR322 puede ser replicado.
Algunas realizaciones de la invención aquí
contienen una deleción de la región E1 entre un sitio Ssp I en 339pb
y un sitio Afl en 3533pb. Puesto que el sitio Sspl puede ser
esencial para la expresión de la proteína IX, fue reintroducido como
oligonucleótido sintético que colocó el sitio Sspl más cerca de la
proteína IX TATA box que en el caso del gen de tipo salvaje (wt) de
la proteína IX.
Todos los términos técnicos y científicos usados
aquí, a menos que se defina lo contrario, generalmente pretenden
tener el mismo significado como lo entiende comúnmente un entendido
de la materia. Varios de los términos usados aquí no pretenden ser
limitantes, aunque el uso común pueda sugerir lo contrario. Por
ejemplo, el término "expresión de" ó "expresar" un ácido
nucleico foráneo, gen cDNA se usan aquí para abarcar la replicación
de un ácido nucleico, la transcripción de DNA y/o la traducción de
RNA en la proteína, en células o en sistemas libres de proteínas
tales como gérmenes de trigo o reticulocitos de conejo; y "ácido
nucleico" intercambiablemente con gen, cDNAs, RNA, u otros
oligonucleótidos que codifican productos génicos. El término
"foráneo" indica que el ácido nucleico no se encuentra en la
naturaleza idénticamente asociados con el mismo vector o célula
huésped, pero más que la asociación precisa entre dicho ácido
nucleico y el vector o célula huésped que se crea por ingeniería
genética. Los términos "recombinante" y "recombinación"
generalmente se refieren a las reorganizaciones del material
genético que se contemplan por los inventores, y que son el
resultado de la manipulación experimental.
"Vector" denota una construcción de ácido
nucleico manipulado genéticamente capaz de ser modificado por
técnicas de recombinación genética para incorporar alguna secuencia
de ácidos nucleicos foráneos deseada, que puede ser usada de una
manera para introducir dicha secuencia en una célula huésped,
replicarla, clonarla, y/o expresar dicha secuencia de ácidos
nucleicos, en donde dicho vector comprende toda la información
necesaria de la secuencia para capacitar al vector a ser replicado
en células huésped, y/o para capacitar la secuencia de ácidos
nucleicos a ser expresadas, y/o para capacitar la recombinación que
se produce, y/o para capacitar que el vector se empaquete en
partículas virales. Esta recitación de las propiedades de un vector
no significa que sea exhaustivo.
Los vectores, que opcionalmente contienen un
ácido nucleico foráneo, pueden ser "introducidos" en una célula
huésped, tejido u organismo de acuerdo con técnicas conocidas, tales
como transformación, transfección usando DNA precipitado con fosfato
cálcico, electroporación, pistolas génicas, transfección con un
virus recombinante o fagómido, infección con una partícula viral
inefectiva, inyección en tejidos o microinyección del DNA en células
o similares. Los dos huéspedes procarióticos y eucarióticos pueden
ser empleados, los cuales pueden incluir bacterias, levaduras,
plantas y animales, incluyendo células humanas.
Un vector "soporta la expresión de las
secuencias codificantes contenidas por el vector" cuando sirve
como vehículo para la introducción de un gen en una célula huésped,
cuando las secuencias presentes en el vector permiten al vector y
las regiones codificantes que contiene replicarse y ser mantenidas
en una célula sin ser degradados, y cuando las secuencias presentes
en el vector permiten a las secuencias codificantes a ser
transcritas, recombinadas, o integradas en el genoma de la célula
huésped.
Una vez un gen estructural cDNA o marco de
lectura abierto dado, se ha introducido en el huésped apropiado, el
huésped puede crecer para expresar dicho gen estructural, cDNA o
marco de lectura abierto. Donde el ácido nucleico exógeno se expresa
en un huésped que no reconoce las regiones regulatorias donde tienen
lugar naturalmente la transcripción y la traducción de los ácidos
nucleicos, una variedad de regiones regulatorias transcripcionales
pueden ser insertadas corriente arriba y corriente debajo de la
región codificante, algunas de las cuales son externadamente
inducibles. Las regiones regulatorias trasncripcionales ilustrativas
o promotores para el uso en bacterias incluyen el promotor
\beta-gal, promotores lambda derecha e izquierda,
promotores trp y lac, promotor de la función
trp-lac, y también el promotor del bacteriófago
lambda P_{L} junto con el operador del bacteriófago lambda O_{L}
y el represor sensible a temperatura CI857, por ejemplo, para
proporcionar la expresión sensible a temperatura de un gen
estructural. La regulación del promotor se consigue a través de la
interacción entre el represor y el operador. Para el uso en la
levadura, las regiones o promotores regulatorios transcripcionales
ilustrativos incluyen promotores de enzimas glicolíticos, tales como
promotores ADH-I y -II, el promotor GPK, y el
promotor PGI, el promotor TRP, etc.; para el uso en células de
mamíferos, elementos de control transcripcional incluyen promotores
SV40 tempranos y tardíos , promotores tardíos mayores de adenovirus,
etc.; Otras secuencias regulatorias útiles en células eucariotas
pueden incluir, por ejemplo, la secuencia potenciadora de
citomegalovirus, que se puede fusionar a una secuencia promotora tal
como el promotor SV40 para formar un promotor quimérico, o puede ser
insertada en otro lugar en el vehículo de expresión, preferiblemente
cerca de las proximidades de secuencia promotora. Donde el promotor
es inducible, se pueden emplear condiciones permisivas (por ejemplo,
cambio de temperatura, consumición, o exceso de un producto
metabólico o nutriente, o similares).
Cuando se desee, la expresión de los genes
estructurales puede ser amplificada por ejemplo, ligando en tándem
un ácido nucleico para un marcador genético amplificable dominante
5' ó 3' al gen estructural y el crecimiento de las células huésped
bajo condiciones selectivas. Un ejemplo de un ácido nucleico
amplificable es el gen para la dihidrofolato reductasa, la expresión
del cual puede ser incrementada en células que presentan resistencia
al metotrexato, un antagonista del folato.
Los vehículos de expresión usados o
proporcionados aquí puede ser incluidos en un sistema de replicación
para el mantenimiento episomal en un huésped celular apropiado,
pueden ser proporcionados sin un sistema de replicación, o pueden
pasar a integrarse en el genoma huésped.
Mientras se contempla una amplia variedad de
células huésped, ciertas realizaciones requieren que la célula
huésped exprese las secuencias E1 que no están o están inactivados
en el vector. Mientras la línea celular humana 293 es la célula
huésped preferida, la invención también contempla otras líneas
celulares capaces de complementar el vector que tiene una deleción
en E1. "Complementar" o "complementado por" denota que la
línea de células huésped codifica y /o expresa funciones que son
necesarias para generar partículas viables que desaparecen del
vector o han sido inactivadas en el vector.
Es importante reconocer que la presente invención
no se limita al uso de tales células como se usan aquí. Pueden
usarse células de diferentes especies (humanos, ratones, etc.) o
diferentes tejidos (epitelio de mama, colon, tejido neuronal,
linfocitos, etc.).
"Modificación" de un ácido nucleico incluye
todas las alteraciones moleculares de una secuencia de ácidos
nucleicos que cambian su capacidad de realizar una función indicada,
incluyendo específicamente deleciones, inserciones, modificaciones
químicas, y similares. Las inserciones y deleciones se pueden hacer
de varias maneras conocidas por aquellos entendidos en la materia,
incluyendo el corte enzimático de la secuencia completa seguido de
la modificación y ligación de fragmentos concretos, o mutagénesis de
sitio dirigida, especialmente por mutagénesis
"loop-out" del tipo descrito por Kramer et
al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456.
"Fragmento" se refiere a un ácido nucleico
aislado derivado de una secuencia de referencia por escisión o
deleción de uno o más nucléotidos a cualquier posición de la
secuencia de referencia usando técnicas recombinantes conocidas, o
insertando un nucleótido predeterminado o secuencia de nucleótidos
en cualquier posición predeterminada en la secuencia de referencia
usando técnicas recombinantes conocidas, o sustituyendo un
nucleótido predeterminado o secuencia de nucleótidos para un
nucleótido determinado o secuencia de nucleótidos en la secuencia de
referencia usando técnicas recombinantes conocidas. No se pretende
que la invención se limite al uso de las secuencias de ácidos
nucleicos de cualquier especie o género particular, sino que esta
invención se puede llevar a cabo usando ácidos nucleicos de una
variedad de fuentes. Se contempla que cualquier ácido nucleico de
alguna fuente pueda ser insertado en el vector, con o sin elementos
de control.
"Terapia génica" comprende la corrección de
defectos genéticos así como la distribución y expresión de ácidos
nucleicos en un tratamiento de término corto de una enfermedad o
condición patológica.
Referente a tampones particulares, el medio,
reactivos, células, condiciones de cultivo y similares, o a algunas
subclases de los mismos, no pretenden ser limitantes, sino que
deberían mostrarse para incluir todos los materiales relacionados
que un entendido en la materia reconocería como de interés o valor
en el contexto particular en que se presenta la discusión. Por
ejemplo, con frecuencia es posible sustituir un sistema tampón o
medio de cultivo por otro, etc., tal que una manera diferente pero
conocida se usa para conseguir los mismos objetivos que aquéllos a
los que se dirige el uso de un método sugerido, material o
composición.
La presente invención no se limita al uso de
todos los descubrimientos descritos o realizaciones explícitamente
descritas aquí. Aunque de hecho se puede preferir la combinación de
ellos, no es necesario para la invención que todos los aspectos se
usen simultáneamente.
Los ácidos nucleicos aislados de esta invención
se pueden usar para generar polipéptidos modificados, cada uno
teniendo al menos una característica del polipéptido nativo. Estos
incluyen subfragmentos, mutantes por eliminación, mutantes
procesados, o mutantes por sustitución, polipéptidos que tienen la
misma estructura secundaria como la región de unión del polipéptido
nativo, y combinaciones de los mismos. Tales péptidos modificados
pueden llevar la funcionalidad del péptido de "tipo salvaje", o
pueden tener una funcionalidad modificada o externamente regulable.
Tales polipéptidos modificados pueden tener utilidad considerable en
la presente invención, como serían apreciados por aquellos
entendidos en la materia.
"Tipo salvaje", mutantes, y polipéptidos
análogos y composiciones de los mismos se pueden usar para hacer
anticuerpos, que puede encontrar uso en resultados de análisis de
los ensayos descritos como parte de esta invención. Los anticuerpos
pueden ser preparados de maneras convencionales, usando el
polipéptido sujeto como un inmunógeno e inyectando el polipéptido en
un huésped mamífero, p.ej., ratón, vaca, cabra, oveja, conejo, etc.,
particularmente con un adyuvante, p.ej., adyuvante de Freund
completo, gel de hidróxido de aluminio, o similares. El huésped
entonces puede sangrarse y la sangre puede emplearse para el
aislamiento de anticuerpos policlonales, o los linfocitos de sangre
periférica (células B) se pueden fusionar con una célula apropiada
de mieloma para producir anticuerpos específicos para los compuestos
sujetos.
Todas las publicaciones mencionadas aquí se
incorporan por referencia.
Los enzimas usados para las manipulaciones de DNA
recombinante fueron comprados a Boehringer-Mannheim,
Inc. (Laval, Quebec, Canada), New England Biolabs (Beverly, MA) o
Bethesda Research Laboratories (Burlington, Ontario, Canada) y se
usaron de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Los
plásmidos se construyeron usando protocolos estándares. Sambrook,
J., E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, MOLECULAR CLONING: A
LABORATORY MANUAL, 2^{nd} Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y. Se usó electroporación para transformar la cepa
DH5 de E. coli (supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96
thi-1 relAl) con plásmidos nuevamente construidos.
Dower, W. J., J. F. Miller, y C. W. Ragsdale, 1988, High efficiency
transformation of E. coli by high voltage electroporation,
Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145. El DNA
plasmídico se preparó por el método de la lisis alcalina y se
purificó por centrifugación de gradiente de densidad de bromuro de
etidio-CsCl. Birnboim, H.C., y J. Doly, 1978, A
rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7:
1513-1523.
Los medios de cultivo celulares y los reactivos
se obtuvieron de los laboratorios GIBCO (Gran Island, NY). Se
titularon los vectores de adenovirus (Ad) y se introdujeron en
células 293 que constitutivamente expresan el 11% izquierdo del
genoma de Ad5, comprendiendo la región E1. Graham, F.L., J. Smiley,
W.C. Russell, y R. Nairn, 1977, Characteristics of a human cell line
transformed by DNA from human adenovirus type 5, J. Gen.
Virol. 36:59-72. Las células 293 fueron
cultivadas en monocapa en medio esencial mínimo F-11
complementado con 100 unidades de penicilina/ml, 100 \mug de
estreptomicina/ml, 2,5 \mug de amfotericina/ml y con suero bovino
de recién nacido 10% para el mantenimiento celular o suero de
caballo al 5% para la infección viral. Las células KB que crecieron
en cultivo Spinner se mantuvieron en medio modificado de Joklik
complementado con antibióticos como anteriormente y con suero de
caballo al 10%.
Las curvas de crecimiento de un paso de células
KB crecieron hasta una densidad de 2x10^{5} células/ml, se
centrifugaron y se resuspendieron en 1/10 parte del volumen del
medio original y se añadió virus (20 PFU/célula) y se dejó adsorber
durante 1h a 37ºC con agitación. Las células volvieron al volumen
original usando medio 50% fresco y 50% original. A varios tiempos de
post-infección se tomaron alícuotas de 4 ml, se
añadieron 0,5 ml de glicerol y las muestras se guardaron a -70ºC
para ensayos de virus infecciosos por titulación de placa.
Los virus recombinantes se aislaron por
cotransfección con células 293 con los plásmidos adecuados. Graham,
F.L., y A.J. Van der Eb, 1973, A new technique for the assay of
infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virol., 52:
456-467. Tras 8-10 días las placas
fueron aisladas, se expandieron y el DNA viral se analizó por
digestión de enzimas de restricción como se ha descrito
anteriormente. Graham, F.L. y L. Prevec, 1991, Manipulation of
Adenovirus Vectors, en E.J. Murry (ed.) METHODS IN MOLECULAR
BIOLOGY, Vol. 7: GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, The Humana
Press Inc., Clifton, N.J., p. 109-128. Los virus
candidatos fueron purificados una vez por placa, y para los estudios
de estabilidad, los vectores fueron pasados empezando con medios de
células infectadas para análisis de DNA viral tras la primera
purificación de placas. Las monocapas semiconfluentes de células 293
en discos de 60mm se infectaron con 0,5 ml de medio de cada pasaje
previo (aproximadamente 40 PFU/célula), se dejó que el virus
adsorbiera durante media hora y luego se reemplazó el medio. Las
células y el medio se cultivaron cuando el efecto citopático se
completó, normalmente a los 2-3 días posteriores a
la infección.
Las monocapas semiconfluentes de células 293 en
discos de 60 mm se infectaron con virus de pasajes para analizarlas
y a las 24 h de la infección se eliminó el medio y se reemplazó con
1 ml de medio 199 libre de fosfato que contenía suero de caballo al
5% y 25 nCi/ml de ácido ^{32}P-ortofosfórico
(adquirido de DuPont de Nemours & Co. Inc., Wilmington, DE).
Tras incubar las células infectadas durante 6 h más, se cultivaron
las células y se extrajo el DNA. El DNA viral se digirió entonces
con enzimas de restricción adecuados. Luego se hizo una
electroforesis a través de geles de agarosa al 1% y se secó los
geles. Las bandas de DNA se visualizaron por autoradiografía.
Los adenovirus portan una secuencia que actúa en
cis en la región E1 que es esencial para la encapsidación de las
moléculas de DNA viral. Cuando esta señal que actúa en cis,
localizada entre 194 y 358pb en Ad5, es borrada, los genomas virales
no pueden empaquetarse, pero todavía se esperaría que replicaran su
DNA en las células transfectadas. Esto, el hecho de que el DNA Ad
pueda circularizarse en las células infectadas y que la
cotransfección a células mamíferas de dos plásmidos con secuencias
que se solapen pueda generar un virus infeccioso con una buena
eficacia, nos llevó a pensar la estrategia que se define a
continuación.
El primer paso relacionado con la construcción de
Ad5PaCI, un virus que contiene el genoma Ad5 entero con la
eliminación de las secuencias E3 desde 28133 a 30818pb. Ad5PaCI fue
fabricado por cotransfección de células 293 con dos plásmidos:
pFG173; y pAB14PaCI, un pAB14 modificado (Bett, A..J., L. Prevec, y
Gram., F.L., 1993, J. Virol. 67: 5911-5921),
donde el sitio de unión PaCI está sustituido en el lugar de 2,69 kb
de E3. (Fig. 1A). Luego, el DNA viral purificado de Ad5PaCI se
digirió con CLAI y XbaI y se cotransfectó en células 293 con otro
plásmido, pWH3 (Bautista, D.S., y Gram., F.L., 1989, Gene 82:
201-208), para proporcionar el virus AdBHG (Fig.
1B). pWH3 es un plásmido que contiene secuencias Ad5 del extremo
izquierdo, con una inserción del plásmido pBR322 modificado en pb
1339, diseñada de forma que las señales de empaquetamiento puedan
eliminarse en una fase posterior.
El siguiente paso comprendía la generación de un
plásmido bacteriano que contenga el genoma de AdBHG entero y la
subsiguiente identificación de clones infecciosos. Se infectó
células de riñón de cría de ratón (BRK) con AdBHG bajo condiciones
antes indicadas para tener como resultado la generación de genomas
Ad5 circulares. Graham. F.L., 1984, EMBO J. 3:
2917-2922; Ruben, M. Bacchetti, S. y Gram., F.L.,
1983, Nature 301: 172-174. A las 48 horas
después de la infección, se extrajo el DNA a partir de células de
RCR infectadas y se usó para transformar la cepa de E. coli
HMS 174 para dotarlas de resistencia a la ampicilina (Ap^{r}) y a
la tetraciclina (Tet^{r}). A partir de dos experimentos se obtuvo
un total de 104 colonias. Las preparaciones de plásmido a pequeña
escala se cribaron por digestión con HindII y BamHI/SmaI y
electroforesis de gel. Los resultados del análisis de restricción
revelaron que los plásmidos diferían en la cantidad de genoma viral
que contenían. Se cree que esto era debido, por lo menos en parte, a
la formación de un palíndromo de 206 pb cuando las repeticiones
terminales invertidas (ITR) del genoma Ad5 se unen cabeza con cola
(la unión).
A partir de los análisis de restricción se
seleccionó cuatro candidatos de plásmido que parecieron tener un
genoma AdBHG completo con las regiones de unión intactas. Los cuatro
plásmidos resultaron infecciosos en ensayos de infecciosidad en los
que se transfectó células 293 con 5 ó 10 \mug de DNA plásmido (los
datos no se muestran).
Las uniones ITR en cada clon infeccioso se
secuenciaron y analizaron. El número de nucleótidos que faltan del
punto medio del palíndromo en cada clon varió desde tan poco como
4pb (1 pb de la RTI derecha y 3 pb de la izquierda) hasta tanto como
19 pb (1 pb de la RTI derecha y 18 pb de la izquierda). Para el
trabajo posterior escogimos los clones que carecían de 19pb de la
unión y les llamamos pBHG9.
El pBHG10 se generó eliminando las señales de
empaquetamiento en pBHG9. Esto se consiguió por digestión parcial y
religación de BamHI (Fig. 1B). El cribado para pBHG10 se facilitó
por el hecho de que la eliminación de las señales de empaquetamiento
también daba como resultado la eliminación del gen Tet^{r}.
El pBHG10 contiene secuencias de DNA Ad5 de pb 19
(final genómico izquierdo) a pb 188; pb 1339 a 28133; y pb 3818 a
35934 (final genómico derecho). Las terminaciones izquierda y
derecha de los genomas Ad5 están unidas covalentemente. Un segmeno
del plásmido pBR322, que representa los nucleótidos
375-1/4361-2064 del genoma pBR322,
que incluye el origen pBR322 de replicación y el gen de resistencia
a la ampicilina pBR322, está presente entre pb 188 y 1339 de Ad5
para permitir la propagación de pBHG10 en células huésped como E.
coli. Un sitio del enzima de restricción PacI, único en este
plásmido, está presente entre pb 28133 y 30818 de Ad5 para permitir
la inserción de genes externos. Puesto que la señal de
empaquetamiento se borra, el pBHG10 por sí mismo no proporciona
partículas virales infecciosas. Las
co-transfecciones de pBHG10 con plásmidos
"ayudantes" que contienen las secuencias de la terminación
izquierda de Ad5, incluyendo la señal de empaquetamiento,
proporciona mediante la recombinación en la célula huésped, vectores
virales infecciosos con una eficacia comparable a la obtenida usando
pJM17^{1}.
Puesto que para algunas aplicaciones puede
resultar deseable generar vectores Ad con secuencias E3 de Ad5
salvajes, se reintrodujo secuencias E3 salvajes en pBHG10 (Fig. 2).
El primer paso incluía la construcción de un plásmido que portara
secuencias E3 flanqueando un gen para la resistencia a kanamicina
(Kn^{r}) para simplificar la inserción en un pBHG10. El plásmido
Ap^{r} pFG23 (McKinnon, R.D., Bacchetti, S. y Gram., F.L., 1982,
Gene 19:33-42) fue digerido con XbaI, que
corta en la posición 28592 en las secuencias Ad5 (no existe rotura
en 30470 pb debida a una metilación Dam en la cepa de E. coli
utilizada) y se ligó a pKN30 digerido por XbaI (Lee, F., 1982, PH.D.
Thesis, McMaster University, Hamilton, Notario, Canada), generando
pFG23AK (Ap^{r} y Kn^{r}) (Fig. 2ª). Para eliminar las
secuencias y el gen Ap^{r}, se digirió con AflII y se ligó,
generando pFG23K.
El siguiente paso comprendía la inserción de las
secuencias E3 de nuevo en pBHG10 en la correcta orientación (Fig.
2B). El pBHG10 fue digerido con SpeI, que corta sólo en 75,4 mu en
las secuencias Ad5, y se ligó con pFG23K que había sido linealizado
con SpeI, generando pBHG10A, que ahora contiene la secuencia E3
salvaje deseada en tándem con la región E3 previa que contiene la
eliminación de 2,69kb. Para eliminar secuencias repetidas, se
digirió parcialmente el pBHG10A con NdeI y se religó, generando
pBHG10B. En el paso final, el segmento Kn^{r} fue eliminado de
pBHG10B por una digestión parcial con XbaI y se religó, generando
pBHGE3. Excepto por la presencia de una región E3 salvaje, el pBHGE3
es idéntico a pBHG10, y es igualmente eficiente para la generación
de vectores Ad con sustitución de E1 por cotransfección.
Nuestro análisis de las secuencias en la región
E3 de Ad5 nos llevó a creer que podía ser posible expandir la
eliminación de 2,69 kb presente en pBHG10 a 3,13kb. Utilizando la
técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y siguiendo
una estrategia muy parecida a la descrita anteriormente para la
construcción de pBHGE3 (Fig. 2), creamos una extracción de E3 3,13
kb y la introdujimos en pBHG10. El plásmido resultante pBHG11 es
idéntico a pBHG10 excepto por el trozo eliminado E3 expandido que
suprime las secuencias de 27865 a 30995 pb. Igual que el pBHG10, el
pBHG11 contiene un sitio de la enzima de restricción PacI en lugar
de las secuencias E3 eliminadas para permitir la inserción de genes
externos.
Se diseñaron los plásmidos pBHG10, pBHG11 y
pBHGE3 de forma que comprendieran todas las secuencias Ad5
esenciales necesarias para producir virus infecciosos tras la
transfección de células 293 excepto por la señal de empaquetamiento
(194-358 pb) necesaria para encapsidar el DNA viral
en partículas virales. Para generar vectores virales infecciosos
pBHG10, pBHG11, pBHGE3 o derivados que porten una inserción en E3
deben cotransfectarse en células 293 con un segundo plásmido que
contenga secuencias virales de terminación izquierda (E1) incluyendo
la señal de empaquetamiento, como se ilustra en la Figura 3. Para
maximizar la capacidad del sistema de vector BHG necesitábamos un
plásmido con la mayor eliminación de E1 posible para
cotransfecciones con los plásmidos
BHG.
BHG.
Nuestro análisis de las secuencias E1 reveló que
la eliminación de aproximadamente 3,2kb podía crearse suprimiendo
las secuencias entre un sitio Ssp I en 339pb y un sitio Afl II en
3533 pb (Fig. 4). Esta eliminación no interfiere con la ITR
(1-103 pb), la señal de empaquetamiento del núcleo
esencial (194-358 pb) o las secuencias codificadoras
para proteína Ix, pero sí elimina el sitio de unión sp1
(3525-3530 pb) del promotor de la proteína IX.
Mientras que esta eliminación E1 de 3,2kb no interfiere con la
región potenciadota de E1, no elimina el elemento de empaquetamiento
más cercano al 3' terminal. La eliminación de este elemento tiene
poco efecto o nulo sobre el empaquetamiento.
\newpage
Puesto que el sitio de unión sp1 se cree que es
esencial para la expresión de la proteína IX, (Babiss, L.E. y Vales,
L.D., 1991, J. Virol. 65:598-605) se
reintrodujo como un oligonucleótido sintético que posicionó el sitio
sp1 1pb más cerca del TATA box de la proteína IX (Fig. 4).
Para evaluar el efecto de la eliminación de 3,2kb
y la reintroducción del sitio de unión sp1, se examinó la expresión
de la proteína IX por inmunoprecipitación. Se infectaron células 293
a 10PFU/célula con virus que contenían o bien ninguna eliminación en
E1 (Ad5 salvaje), o una eliminación de 2,3kb extendiéndose dentro
del gen de la proteína IX (d1313), o la eliminación de 3,2kb
descrita anteriormente (d170-3), o la eliminación de
3,2kb que contiene el HCMV (AdHCMV2), o los promotores de
\beta-actina (Ad\betaAct2) en la orientación
antiparalela de E1, o la eliminación de 3,2kb que contiene el HCMV
(AdHCMVsp1), o los promotores de \beta-Actina
(Ad\betaActsp1) con el sitio de unión sp1 reintroducido. Tras ser
etiquetados todos los extractos celulares con
[^{35}S]-metionina, se cultivaron, se
inmunoprecipitaron las muestras con anticuerpos de proteína IX Ad2 y
se hizo pasar por un gel PAGE SDS 12%. Los resultados (Fig. 5)
indican que los niveles variables de proteína IX se expresaron en
función de las secuencias corriente arriba del gen de la proteína IX
pero con el sitio sp1 presente se produjo una reducción de a lo sumo
25% en comparación con Ad5 salvaje.
Como se sabe que la proteína IX afecta la
estabilidad al calor de las partículas virales, examinamos la
estabilidad al calor de Ad5 salvaje en comparación con d1313,
dl70-3, AdHCMV2, Ad\betaAct2, AdHCMVsp1 y
Ad\betaActsp1. Se titularon ciertas cantidades de estos virus
antes y después de una incubación a 45ºC durante 1 y 2 horas. De los
seis mutantes virales estudiados, sólo d1313 difería
significativamente en estabilidad al calor respecto al salvaje (Fig.
6). Incluso Ad\betaAct2, que produce sólo el 16% de los niveles
salvajes de proteína IX (Fig. 5) fue tan resistente a la
inactivación por calor como el virus salvaje. Esto indica que la
proteína IX es posiblemente fabricada en exceso durante la infección
vírica. También se observó que los virus que contenían la
eliminación de E1 3,2kb se replicaron en células 293 hasta las
mismas titulaciones finales que los Ad5 salvajes (datos no
mostrados).
Con la verificación de que las características de
crecimiento y estabilidad de los virus no se vieron afectadas con la
eliminación de E1 3,2kb, se decidió incorporar esta eliminación en
los plásmidos p\DeltaE1sp1A y p\DeltaE1sp1B para usarlos en
cotransfecciones con los plásmidos BHG (Fig. 4). Estos plásmidos
contienen varios sitios de restricción para facilitar la inserción
de genes externos.
La invención también incluye un vector que
comprende un fragmento o fragmentos de plásmido pBR322 que cuenta
tanto con resistencia a la ampicilina y el origen de replicación
pBR322 (que permite que dicho vector sea replicado en células donde
el pBR322 es capaz de ser replicado), y una inserción entre la
región 4 (E4) temprana y la repetición de la terminación invertida
derecha, y una eliminación de secuencias E1 de la posición 188 a o
cerca de la secuencia AflII en la posición 3533, y sitios de
clonación para la inserción de un ácido nucleico externo.
Para evaluar la capacidad de los plásmidos BHG
para generar vectores virales infecciosos, se realizó
cotransfecciones con varios plásmidos de terminación izquierda y se
encontró que la eficiencia del rescate era comparable a la obtenida
con pJM17 (no se muestran los datos).
El uso de pBHGE3, pBHG10 ó pBHG11 combinados con
la eliminación de 3,2 kb en E1 debería permitir rescatar los
insertos de aproximadamente 5,2, 7,9 y 8,3 kb respectivamente en
vectores virales. Para estudiar la capacidad del sistema BHG
construimos un inserto de 7,8 kb que consiste en el gen lacZ
dirigido por el promotor temprano-inmediato del
citomegalovirus humano y el gen gB de virus herpes simplex de tipo 1
(HSV-1) dirigido por el promotor SV40 en la
eliminación E1 de 3,2 kb (Fig. 7). Después de la cotransfección de
discos de 20-60 mm de células 293, 10 con 5 \mug
de pBHG10 y de pHlacZgBR y la otra mitad con 10 \mug de cada uno,
se obtuvo una placa. Ésta se aisló, expandió y analizó por
restricción con HindIII y se encontró que seguía el patrón de
restricción esperado. Se vio que el AdHlacZgBR designado aislado
expresaba tanto lacZ como HSV-1 gB a niveles
comparables a los obtenidos con vectores que contenían insertos
individuales de estos genes (no se muestran los datos).
Un vector lanzadera, pABS.4, se usó en la
construcción de un doble recombinante que contenía lacZ en la
eliminación de E3 y luciferasa de luciérnaga en la eliminación E1.
La construcción de este vector además ilustra el uso de los vectores
lanzadera así como los dobles recombinantes.
La estrategia para la construcción de este vector
se presenta en la Fig. 8. Primero se insertó el gen lacZ con la
señal poli A SV40 entre los sitios SalI y XvaI en la región de
clonación de pABS.4, generando pABSLacZ. Fig. 8A. En el siguiente
paso se digirió pABSLacZ con PacI y BstBI generando un fragmento que
contenía el gen LacZ y el gen de resistencia a la kanamicina
(Kan^{r}). Este fragmento se insertó luego entre los sitios PacI y
BstBI de pAdBHG.28, en la orientación paralela E3, generando
pAdBHGLacZK. Puesto que se usó doble selección antibiótica, el
cribado para el plásmido deseado que contiene el inserto LacZ era
trivial. Finalmente se digirió el pAdBHGLacZK en SwaI para eliminar
el gen Kan^{1} generando pAdBHGLacZ. Los pAdBHGLacZ se cultivan y
se usan para cotransfecciones con pCA15, un plásmido que contiene
secuencias de terminación izquierda Ad5 con luciferasa de luciérnaga
bajo el control del promotor del gen
inmediato-temprano de citomegalovirus humano (HCMV)
en lugar de la mayoría de E1. Fig. 8B. Los pAdBHGLacZ pueden usarse
en cotransfecciones con virtualmente cualquier construcción derivada
de E1 para fabricar vectores con una variedad de combinaciones de
lacZ en E3 e insertos de genes exteriores o mutaciones en E1.
Desarrollamos vectores lanzadera pABS.6, pABS.7 y
pABS.9 para simplificar la introducción de insertos en la supresión
de E3 en plásmidos pAdBHG. Fig. 9. Se usan para facilitar la
transferencia de genes exteriores en el conjunto pAdBHG de plásmidos
de la siguiente manera: las secuencias de genes se insertan en o
bien pABS.7 ó pABS.9 usando los sitios de clonación SphI, PstI,
SalI, BamHI, CPU, SacI, o EcoRI. El plásmido lanzadera es entonces
cortado con una o dos combinaciones de XvaI, PacI o BstBI y el
fragmento que contiene Kan se inserta en el plásmido pAdBHG
Amp^{r} usando la doble resistencia Amp+Kan para seleccionar los
transformantes bacterianos que llevan el plásmido deseado.
Posteriormente, el gen Kan^{r} se elimina por digestión con ClaI o
SwaI y ligación. Finamente el plásmido es "rescatado" en
vectores virales Ad infecciosos por cotransfección de células 293
con un plásmido adecuado que contenga secuencias E1.
Se han fabricado varios plásmidos lanzadera que
pueden usarse para cotransfecciones con vectores del conjunto pGBH.
Un plásmido lanzadera E1 que tenga una señal de empaquetamiento
insertada entre la región 4 temprana (E4) y la repetición terminal
invertida (RTI) derecha es específicamente parte de la materia
objeto de la presente
invención.
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Plásmido | Secuencia | Eliminación | Sitios de clonación |
| reguladora | neta | ||
| PXCJL1 | - - - - - | 2,88 kb | X-B-Xh-S-C |
| PXCJL2 | - - - - - | 2,88 kb | C-S-Xh-B-X |
| P\DeltaE1sp1A | - - - - - | 3,19 kb | C-B-Xh-X-EV-E-H-S-Bg |
| p\DeltaE1sp1B | - - - - - | 3,19 kb | C-S-H-E-EV-X-Xh-B-Bg |
| pHCMVsp1A | HCMV (L) | 2,81 kb | C-B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pHCMVsp1B | HCMV (L) | 2,81 kb | C-S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pHCMVsp1C | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | C-B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pHCMVsp1D | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | C-S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pCA3 | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pCA4 | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pCA13 | HCMV(L)/SV40pA | 2,66 kb | S-H-E-EV-X-Xh-B |
| pCA14 | HCMV(L)/SV40pA | 2.66 kb | B-Xh-X-EV-E-H-S |
| pBActsp1A | \betaActina(L) | 1,74 kb | C-B-X-EV-E-H-S |
| pBActsp1B | \betaActina(L) | 1,74 kb | C-S-H-E-EV-X-B |
| pCA1 | \betaActina(L)/SV40pA | 1,58 kb | S-H-E-EV-X-B |
| pCA2 | \betaActina(L)/SV40pA | 1,58 kb | B-X-EV-E-H-S |
| pMLPsp1A | MLP(R) | 2,23 kb | B-X-EV-E-H-S-Bg |
| X: XbaI, B: BamHI, Xh: XhOI, S: SalI, C: ClaI, EV: EcoRV, E: EcoRI, H: HindIII, Bg: Bg1II |
\newpage
Los métodos experimentales descritos hasta ahora
no tienen carácter limitante. Aquéllos expertos en la materia
apreciarán que puede usarse una gran variedad de métodos para
introducir vectores en las células de tejidos diana (por ejemplo,
los tumores de hígado pueden tratarse inoculando el hígado afectado
por la vena porta con vectores del tipo descrito y/o reivindicados
aquí y con las solicitudes progenitoras). Además, la invención
contempla el uso de vectores que contienen ácidos nucleicos externos
que codifican para moléculas que pueden ser útiles para tratar
enfermedades como RNA antisentido, factores de crecimiento tisular
como GM-CSF, moléculas que inician la
diferenciación, moléculas que inducen la apoptosis, etc. Finalmente,
una persona experta en la materia apreciará que los métodos de esta
invención pueden usarse para tratar otros animales diferentes a
ratones y humanos.
Claims (32)
1. Un sistema de vectores que comprende:
- (a)
- un primer plásmido con genoma de adenovirus modificado que contiene
- (i)
- una modificación dentro de la región temprana 1 (E1) de dicho genoma que elimina la señal de empaquetamiento en dicho genoma;
- y
- (ii)
- un fragmento o fragmentos de plásmido bacteriano que codifica para una resistencia antibiótica e incluye el origen de replicación del plásmido y otras secuencias necesarias para permitir que el vector sea replicado en células donde el plásmido bacteriano es capaz de ser replicado;
- y
- (b)
- un segundo plásmido que sirve como plásmido lanzadera E1, que comprende:
- (i)
- un fragmento o fragmentos de plásmido bacteriano que codifica para la resistencia antibiótica e incluye el origen de replicación del plásmido y otras secuencias necesarias para permitir que el vector sea replicado en células donde el plásmido bacteriano es capaz de ser replicado
- y
- (ii)
- una secuencia derivada de una región E1 Ad
- (c)
- donde dicho primer y segundo plásmido son capaces de recombinar para producir un genoma de adenovirus modificado recombinante capaz de ser empaquetado en partículas virales.
2. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde el segundo plásmido además comprende un ácido nucleico
exterior empalmado dentro de dicha secuencia derivada de una región
E1 Ad y donde dicho genoma de adenovirus modificado recombinante
producido por recombinación de dichos primer y segundo plásmido
contiene dicho ácido nucleico exterior.
3. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde el genoma de adenovirus modificado del primer plásmido
derivado del genoma de adenovirus 5 (Ad5).
4. El sistema de vectores de la reivindicación 1,
donde dicha modificación en E1 es una eliminación que comprende la
región E1A.
5. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde la modificación en E1 es una eliminación que incluye los
nucleótidos 188 a 1339.
6. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde la modificación en E1 es una eliminación que incluye los
nucleótidos 188 y el sitio Af1II en la posición 3533.
7. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde un sitio sp1 en la posición 3525 que se eliminó dicho primer
plásmido se reintroduce en el segundo plásmido insertando un
oligonucleótido sintético que incluye un sitio sp1.
8. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido además comprende la eliminación dentro
de la región temprana 3 (E3), donde dicha eliminación E3 no inhibe
la expresión de secuencias necesaria para la replicación viral, el
empaquetamiento, la viabilidad o la infecciosidad.
9. El sistema de vectores de la reivindicación 8
donde la eliminación E3 incluye las posiciones
27865-30995 del genoma Ad5.
10. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido adicionalmente comprende un fragmento o
fragmentos de plásmido bacteriano pBR322 que codifica para una
resistencia a ampicilina, y también un origen de replicación pBR322
que capacita al primer plásmido para ser replicado en células donde
el pBR322 es capaz de ser replicado.
11. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho fragmento o fragmentos de plásmido de acuerdo con la
reivindicación 1(a)(ii) se inserta en la localización
señalada del grupo de localizaciones compuesto por: una
localización entre la región temprana 4 (E4) y la repetición
terminal invertida (RTI) derecha; una localización dentro de la
región temprana 4; y una localización donde las secuencias
incluidas en E4 son eliminadas y sustituidas con dicho fragmento o
fragmentos de plásmido.
12. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido comprende además sitios de clonación
para la inserción de una secuencia de ácido nucleico.
13. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde dicho primer plásmido comprende un fragmento o fragmentos de
plásmido bacteriano pBR322 que codifica para una resistencia a la
ampicilina y también un origen de replicación pBR322 que capacita
al vector para ser replicado en células donde pBR322 es capaz de
ser replicado, donde dicho vector es además modificado para contener
un inserto entre la región temprana 4 (E4) y la repetición terminal
invertida derecha, vector que además tiene la eliminación de
secuencias E1 de la posición 188 hasta la secuencia AfII en la
posición 3533 o cerca, donde dicho vector no tiene un sitio de
clonación par ala inserción de un ácido nucleico exterior.
14. Un plásmido que contiene secuencias de DNA
Ad5 de adenovirus de pb 19 (terminación genómica izquierda) a pb
188; pb 1339 a 28133 y pb 30818 a pb 35934 (terminación genómica
derecha) donde las terminaciones genómicas izquierda y derecha de
las secuencias Ad5 están unidas covalentemente. También contiene un
fragmento de plásmido pBR322 que compuesto por los nucleótidos
375-1/4361-2064 insertados entre pb
188 y pb 1339 de Ad5 y un sitio de restricción PacI
localizado entre pb 28133 y pb 30818 de Ad5.
15. Un plásmido que contiene secuencias de DNA
Ad5 de adenovirus de pb 19 (terminación genómica izquierda) a pb
188; pb 1339 a 28133 y pb 30818 a pb 35934 (terminación genómica
derecha) donde las terminaciones genómicas izquierda y derecha de
las secuencias Ad5 están unidas covalentemente. También contiene un
fragmento de plásmido pBR322 compuesto por los nucleótidos
375-1/4361-2064 insertados entre pb
188 y pb 1339 de Ad5.
16. Un plásmido que contiene secuencias de DNA
Ad5 de adenovirus desde pb 19 (terminación genómica izquierda) a pb
188; pb 1339 a 27865; y de pb 30995 a pb 35934 (terminación
genómica derecha) donde las terminaciones genómicas izquierda y
derecha de las secuencias Ad5 están unidas covalentemente. También
contiene un fragmento de plásmido pBR322 compuesto por los
nucleótidos 375-1/4361-2064
insertados entre pb 188 y pb 1339 de Ad5 y un sitio de restricción
PacI localizado entre pb 27865 y pb 30995 deAd5.
17. El sistema de vectores de la reivindicación 1
donde el segundo plásmido es un plásmido lanzadera E1 que contiene
dicha secuencia derivada de la región E1 de Ad5, incluyendo una
señal de empaquetamiento.
18. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde un ácido nucleico externo que comprende un marco de
lectura abierto se inserta en dicho plásmido lanzadera E1.
19. El sistema de vectores de la reivindicación
18, donde las secuencias que regulan la expresión de dicho marco de
lectura abierto son además insertadas en dicho plásmido lanzadera
E1.
20. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende la eliminación de la
secuencia derivada de la región E1 para el fragmento de
aproximadamente 3,19kb entre el sitio SspI y 339 pb y un sitio
AflII a 3533pb. Dicho plásmido comprende además un sitio de unión
sp1 específico y sitios de clonación para la inserción de un ácido
nucleico externo dentro de la supresión de E1.
21. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende la eliminación de la
secuencia derivada de la región E1 y también comprende un promotor
HCMV localizado dentro de la supresión de E1 y los sitios de
clonación para la inserción de un ácido nucleico externo localizado
de forma adyacente a dicho promotor HCMV dentro de la eliminación
de E1.
22. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende la eliminación de la
secuencia derivada de la región E1 y también comprende un promotor
HCMV y una señal de poliadenilación SV40, ambos localizados dentro
de la eliminación de E1 y sitios de clonación para la inserción de
un ácido nucleico externo localizado entre el promotor HCMV y la
señal de poliadenilación Sv40.
23. El sistema de vectores de la reivindicación
17, donde dicho plásmido lanzadera E1 comprende una eliminación de
aproximadamente 2,88 kb en la secuencia derivada de la región E1 Ad5
y que además comprende sitios de clonación para la inserción de un
ácido nucleico externo localizado dentro de la eliminación de
E1.
24. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera de E1 comprende la eliminación en
la secuencia derivada de la región E1 de Ad5 y que además comprende
un promotor de \beta actina y una señal de poliadenilación SV40,
ambos localizados dentro de la eliminación de E1 y sitios de
clonación para la inserción de un ácido nucleico exterior localizado
entre el promotor de \beta actina y la señal de poliadenilación
SV40.
25. El sistema de vectores de la reivindicación
17 donde dicho plásmido lanzadera comprende una señal de
empaquetamiento insertada entre la región temprana 4 (E4) y la
repetición terminal invertida (ITR) derecha.
26. Un método in vitro para la
introducción y la expresión de un ácido nucleico externo en una
célula huésped, comprendiendo:
\newpage
- (a)
- introducción de:
- (i)
- un primer plásmido que incluye genoma de adenovirus modificado que comprende una modificación dentro de la región 1 temprana (E1) de dicho genoma que elimina la señal de empaquetamiento en dicho genoma;
- y
- (ii)
- un plásmido lanzadera que contiene una secuencia derivada de una región E1 Ad, incluyendo una señal de encapsidación y una secuencia de ácido nucleico insertada, en una célula huésped que expresa funciones codificadas por la secuencia E1 que han sido suprimidas del primer plásmido;
- (b)
- aislamiento de un genoma viral recombinante donde el primer plásmido ha sido recombinado con el plásmido lanzadera E1 para proporcionar un genoma viral modificado recombinante que contiene la señal de encapsidación y la secuencia de ácidos nucleicos insertada del plásmido lanzadera E1 y elementos del primer plásmido excluyendo las modificaciones dentro de E1,
- (c)
- introducción de dicho genoma viral modificado recombinante dentro de una célula huésped, y
- (d)
- expresión de las secuencias codificantes contenidas en dicho genoma viral recombinante modificado.
27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26
donde dicho primer plásmido comprende además un fragmento o
fragmentos de un plásmido bacteriano que codifica para una
resistencia antibiótica e incluye el origen de replicación del
plásmido y otras secuencias necesarias para permitir que el vector
sea replicado en las células donde le plásmido es capaz de ser
replicado.
28. Un método de acuerdo con la reivindicación 26
ó la reivindicación 27 donde en dicho plásmido lanzadera E1 se
inserta también una secuencia de ácidos nucleicos que contiene un
marco de lectura abierto.
29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28
donde dentro de dicho plásmido lanzadera se inserta además
secuencias que regulan la expresión de dicho marco de lectura
abierto.
30. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 26 a la 29, donde dicho genoma viral
recombinante se empaqueta en una partícula viral recombinante que es
capaz de infectar células que pueden ser infectadas por el
adenovirus del que deriva originariamente el genoma de adenovirus
modificado.
31. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 26 a la 30 donde dicho genoma de adenovirus
modificado deriva originariamente del adenovirus 5.
32. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones de la 26 a la 31 donde dicho vector que contiene la
eliminación de E1 es introducida en las células huésped mencionadas
junto con una partícula adenoviral que tienen la región E1 intacta,
donde dicha partícula adenoviral que tiene la región E1 intacta es
capaz de complementar la replicación de dicho vector que contiene la
eliminación de E1.
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Families Citing this family (385)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5919676A (en) * | 1993-06-24 | 1999-07-06 | Advec, Inc. | Adenoviral vector system comprising Cre-loxP recombination |
| ATE336587T1 (de) * | 1994-06-10 | 2006-09-15 | Genvec Inc | Adenoviren-vektor systeme und zelllinien |
| US5851806A (en) * | 1994-06-10 | 1998-12-22 | Genvec, Inc. | Complementary adenoviral systems and cell lines |
| DE69531387T2 (de) * | 1994-08-16 | 2004-04-22 | Crucell Holland B.V. | Von Adenovirus abgeleitete rekombinante Vektoren, für Gentherapie |
| FR2725213B1 (fr) * | 1994-10-04 | 1996-11-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Vecteurs viraux et utilisation en therapie genique |
| DE69534166T2 (de) * | 1994-10-28 | 2006-03-09 | Trustees Of The University Of Pennsylvania | Rekombinanter adenovirus und methoden zu dessen verwendung |
| US5856152A (en) * | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
| FR2727867B1 (fr) * | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| FR2730504B1 (fr) | 1995-02-13 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de genomes d'adenovirus recombinants |
| US6752987B1 (en) | 1995-02-28 | 2004-06-22 | The Regents Of The University Of California | Adenovirus encoding human adenylylcyclase (AC) VI |
| EA001616B1 (ru) * | 1995-02-28 | 2001-06-25 | Зе Риджентс Оф Зи Юнивесити Оф Кэлифоньэ | Способ лечения болезни сердца, способ лечения недостаточности периферических сосудов и способ ограничения доставки и экспрессии трансгенной конструкции в определенном органе или структуре |
| US5756283A (en) * | 1995-06-05 | 1998-05-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method for improved production of recombinant adeno-associated viruses for gene therapy |
| US6019978A (en) | 1995-06-05 | 2000-02-01 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier |
| US6281010B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Adenovirus gene therapy vehicle and cell line |
| US5698202A (en) * | 1995-06-05 | 1997-12-16 | The Wistar Institute Of Anatomy & Biology | Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a rabies vaccine carrier |
| US6265212B1 (en) | 1995-06-15 | 2001-07-24 | Introgene B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| US6783980B2 (en) | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| IL160406A0 (en) | 1995-06-15 | 2004-07-25 | Crucell Holland Bv | A cell harbouring nucleic acid encoding adenoritus e1a and e1b gene products |
| US6254862B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-07-03 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
| US6197293B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-03-06 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing androgen receptor and methods of use thereof |
| US7011976B1 (en) | 1997-03-03 | 2006-03-14 | Calydon, Inc. | Adenovirus vectors specific for cells expressing alpha-fetoprotein and methods of use thereof |
| JP2000500017A (ja) * | 1995-11-17 | 2000-01-11 | ウォルフガンク−エム フランツ | 遺伝子治療核酸構造体、その製造と心臓疾患治療へのその利用 |
| JP2001520511A (ja) * | 1995-12-08 | 2001-10-30 | ザ ユーナヴァーサティ オブ アラバマ アト バーミングハム リサーチ ファンデーション | 向標的性アデノウイルス・ベクター |
| US6132989A (en) * | 1996-06-03 | 2000-10-17 | University Of Washington | Methods and compositions for enhanced stability of non-adenoviral DNA |
| US7232899B2 (en) | 1996-09-25 | 2007-06-19 | The Scripps Research Institute | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| WO1998032860A1 (en) * | 1997-01-28 | 1998-07-30 | Baxter International Inc. | Methods for highly efficient generation of adenoviral vectors |
| US6251677B1 (en) | 1997-08-25 | 2001-06-26 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| CA2671261A1 (en) | 1997-11-06 | 1999-05-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. | Neisserial antigens |
| EP1047784B2 (en) | 1998-01-14 | 2015-03-18 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neissera meningitidis antigens |
| SG117417A1 (en) | 1998-02-06 | 2005-12-29 | Collateral Therpeutics Inc | Variants of the angiogenic factor vascular endothelial cell growth factor: vegf |
| US6670188B1 (en) | 1998-04-24 | 2003-12-30 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| EP2261338A3 (en) | 1998-05-01 | 2012-01-04 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| EP1141357A1 (en) * | 1999-01-14 | 2001-10-10 | Novartis AG | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use |
| US7625859B1 (en) | 2000-02-16 | 2009-12-01 | Oregon Health & Science University | HER-2 binding antagonists |
| US6387368B1 (en) | 1999-02-08 | 2002-05-14 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV virus and methods of use thereof |
| CA2366914C (en) | 1999-03-05 | 2010-05-11 | Merck & Co., Inc. | Enhanced system for construction of adenovirus vectors |
| WO2000066741A2 (en) | 1999-04-30 | 2000-11-09 | Chiron S.P.A. | Conserved neisserial antigens |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| JP2004508801A (ja) | 1999-10-29 | 2004-03-25 | カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | ナイセリア抗原性ペプチド |
| EP2163626A1 (en) | 1999-11-18 | 2010-03-17 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Human FGF-21 gene and gene expression products |
| EP1255822A2 (en) | 1999-12-27 | 2002-11-13 | The Regents Of The University Of California | Modified adenylylcyclase type vi useful in gene therapy for congestive heart failure |
| PT2289545T (pt) | 2000-01-17 | 2016-09-06 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacina de omv suplementada contra meningococos |
| EP1854476A3 (en) | 2000-02-09 | 2008-05-07 | Bas Medical, Inc. | Use of relaxin to treat diseases related to vasoconstriction |
| WO2001066595A2 (en) | 2000-03-08 | 2001-09-13 | Chiron Corporation | Human fgf-23 gene and gene expression products |
| WO2003057926A1 (en) | 2002-01-08 | 2003-07-17 | Chiron Corporation | Gene products differentially expressed in cancerous breast cells and their methods of use |
| US7700359B2 (en) | 2000-06-02 | 2010-04-20 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Gene products differentially expressed in cancerous cells |
| ES2305087T3 (es) | 2000-06-15 | 2008-11-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Polinucleotidos relacionados con el cancer de colon. |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| CA2881568C (en) | 2000-10-27 | 2019-09-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a & b |
| JP2004535765A (ja) | 2000-12-07 | 2004-12-02 | カイロン コーポレイション | 前立腺癌においてアップレギュレートされた内因性レトロウイルス |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| WO2002081639A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene brcc2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO2002081641A2 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-17 | Georgetown University | Gene scc-112 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| AU2002258728A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | Georgetown University | Gene brcc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| WO2003039491A2 (en) | 2001-11-09 | 2003-05-15 | Georgetown University | Novel isoforms of vascular endothelial cell growth inhibitor |
| RU2331435C2 (ru) | 2001-12-12 | 2008-08-20 | Чирон Срл. | Иммунизация против chlamydia trachomatis |
| US20030158112A1 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-21 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Selective induction of apoptosis to treat ocular disease |
| AU2003218162B2 (en) | 2002-03-15 | 2009-10-29 | The Curators Of The University Of Missouri | Mutants of the P4 protein of nontypable haemophilus influenzae with reduced enzymatic activity |
| EP2093233A1 (en) | 2002-03-21 | 2009-08-26 | Sagres Discovery, Inc. | Novel compositions and methods in cancer |
| US7244565B2 (en) | 2002-04-10 | 2007-07-17 | Georgetown University | Gene shinc-3 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US7138512B2 (en) | 2002-04-10 | 2006-11-21 | Georgetown University | Gene SHINC-2 and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US8518694B2 (en) | 2002-06-13 | 2013-08-27 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Nucleic acid vector comprising a promoter and a sequence encoding a polypeptide from the endogenous retrovirus PCAV |
| WO2005000194A2 (en) | 2002-10-08 | 2005-01-06 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating post-surgical pain by administering an anti-nerve growth factor antagonist antibody and compositions containing the same |
| ZA200502612B (en) | 2002-10-08 | 2007-07-25 | Rinat Neuroscience Corp | Methods for treating post-surgical pain by administering a nerve crowth factor antagonist and compositions containing the same |
| UA80447C2 (en) | 2002-10-08 | 2007-09-25 | Methods for treating pain by administering nerve growth factor antagonist and opioid analgesic | |
| US9498530B2 (en) | 2002-12-24 | 2016-11-22 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating osteoarthritis pain by administering a nerve growth factor antagonist and compositions containing the same |
| US7569364B2 (en) | 2002-12-24 | 2009-08-04 | Pfizer Inc. | Anti-NGF antibodies and methods using same |
| DK2270048T3 (en) | 2002-12-24 | 2016-01-18 | Rinat Neuroscience Corp | Anti-NGF antibodies and methods for their use |
| US7767387B2 (en) | 2003-06-13 | 2010-08-03 | Sagres Discovery, Inc. | Therapeutic targets in cancer |
| US20040170982A1 (en) | 2003-02-14 | 2004-09-02 | Morris David W. | Novel therapeutic targets in cancer |
| JP2007524362A (ja) | 2003-02-14 | 2007-08-30 | サイグレス ディスカバリー， インコーポレイテッド | 癌における治療ｇｐｃｒ標的 |
| BRPI0407375A (pt) | 2003-02-19 | 2006-02-07 | Rinat Neuroscience Corp | Métodos para tratar dor por meio da administração de um antagonista do fator de crescimento neural e u nsaid e composições contendo os mesmos |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| EP2353389B1 (en) | 2003-04-21 | 2015-11-04 | Epeius Biotechnologies Corporation | Compositions for treating disorders |
| US20070178066A1 (en) | 2003-04-21 | 2007-08-02 | Hall Frederick L | Pathotropic targeted gene delivery system for cancer and other disorders |
| WO2005054438A2 (en) | 2003-12-01 | 2005-06-16 | Invitrogen Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| AP2006003670A0 (en) | 2003-12-23 | 2006-06-30 | Rinat Neuroscience Corp | Agonist anti-TRKC antibodies and methods using same |
| JP4792390B2 (ja) | 2004-03-29 | 2011-10-12 | 株式会社ガルファーマ | 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途 |
| EP3372614B1 (en) | 2004-04-07 | 2022-06-08 | Rinat Neuroscience Corp. | Methods for treating bone cancer pain by administering a nerve growth factor antagonist |
| AU2005327194B2 (en) | 2004-07-09 | 2010-09-09 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Soluble forms of Hendra and Nipah virus G glycoprotein |
| US20060024677A1 (en) | 2004-07-20 | 2006-02-02 | Morris David W | Novel therapeutic targets in cancer |
| MX2007000998A (es) | 2004-07-30 | 2007-07-11 | Rinat Neuroscience Corp | Anticuerpos dirigidos peptido beta-amiloide y procedimientos que usan los mismos. |
| WO2006042177A2 (en) | 2004-10-07 | 2006-04-20 | Argos Therapeutics, Inc. | Mature dendritic cell compositions and methods for culturing same |
| JP2008530245A (ja) | 2005-02-18 | 2008-08-07 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド | 尿路病原性菌株由来の抗原 |
| CA2604844A1 (en) | 2005-04-07 | 2006-10-19 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Cancer-related genes |
| EP1865981A2 (en) | 2005-04-07 | 2007-12-19 | Chiron Corporation | Cacna1e in cancer diagnosis, detection and treatment |
| JP5829372B2 (ja) | 2005-05-02 | 2015-12-09 | ジェンザイム・コーポレーション | 神経代謝性疾患のための遺伝子治療 |
| CA2606490C (en) | 2005-05-02 | 2018-02-06 | Genzyme Corporation | Gene therapy for spinal cord disorders |
| EP1907425B1 (en) | 2005-07-22 | 2014-01-08 | Y's Therapeutics Co., Ltd. | Anti-cd26 antibodies and methods of use thereof |
| EP3069731A1 (en) | 2005-11-14 | 2016-09-21 | Labrys Biologics Inc. | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
| AR059371A1 (es) | 2006-02-08 | 2008-03-26 | Genzyme Corp | Terapia genica para la enfermedad de niemann-pick tipo a |
| CA2652703C (en) | 2006-06-07 | 2018-08-28 | Bioalliance C.V. | Antibodies recognizing a carbohydrate containing epitope on cd-43 and cea expressed on cancer cells and methods using same |
| HUE031156T2 (en) | 2006-06-07 | 2017-06-28 | Genzyme Corp | Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders |
| PT2054431E (pt) | 2006-06-09 | 2011-11-03 | Novartis Ag | Confórmeros de adesinas bacterianas |
| EP2586790A3 (en) | 2006-08-16 | 2013-08-14 | Novartis AG | Immunogens from uropathogenic Escherichia coli |
| EP2066791B1 (en) | 2006-10-03 | 2012-09-12 | Genzyme Corporation | Gene therapy for amyotrophic lateral sclerosis and other spinal cord disorders |
| US20100261640A1 (en) | 2007-04-10 | 2010-10-14 | Branco Luis M | Soluble and membrane anchored forms of lassa virus subunit proteins |
| HUE031655T2 (hu) | 2007-05-11 | 2017-07-28 | Alexion Pharma Inc | Csontot targetáló alkálikus foszfatáz, készletek és eljárások alkalmazásukra |
| EP2154969B1 (en) | 2007-05-16 | 2015-11-18 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Treatment of synucleinopathies |
| ES2635726T3 (es) | 2007-06-06 | 2017-10-04 | Genzyme Corporation | Terapia génica para enfermedades de almacenamiento lisosómico |
| GB0714963D0 (en) | 2007-08-01 | 2007-09-12 | Novartis Ag | Compositions comprising antigens |
| EP2915564B1 (en) | 2007-09-28 | 2020-11-04 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor XA inhibitors and methods of using the same |
| CA2704232C (en) | 2007-11-08 | 2017-05-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Stimulation of anti-tumor immunity using dendritic cell/tumor cell fusions and anti-cd3/cd28 |
| BRPI0822049B1 (pt) | 2007-12-17 | 2021-11-16 | Pfizer Limited | Composiqao farmaceutica compreendendo anticorpo antagonista anti-ngf, kit e uso de um anticorpo antingf |
| HUE026846T2 (en) | 2007-12-18 | 2016-08-29 | Bioalliance Cv | Antibodies to Recognize Carbohydrate-Containing Epitope on CD43 and CEA Expressed on Cancer Cells and Procedures for their Use |
| EP3023502A1 (en) | 2008-04-10 | 2016-05-25 | Cell Signaling Technology, Inc. | Compositions and methods for detecting egfr mutations in cancer |
| WO2009150623A1 (en) | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Pfizer Inc | Treatment of chronic prostatitis |
| TWI516501B (zh) | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Ｐｃｓｋ９拮抗劑類 |
| EP2373338B1 (en) | 2008-12-03 | 2017-02-15 | The Johns Hopkins University | Annexina2 as immunological target |
| WO2010086828A2 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Rinat Neuroscience Corporation | Agonist anti-trkb monoclonal antibodies |
| US8568732B2 (en) | 2009-03-06 | 2013-10-29 | Novartis Ag | Chlamydia antigens |
| CA2756670A1 (en) | 2009-03-26 | 2010-09-30 | The Regents Of The University Of California | Mesenchymal stem cells producing inhibitory rna for disease modification |
| EP3121271B1 (en) | 2009-03-30 | 2019-07-24 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| WO2010118243A2 (en) | 2009-04-08 | 2010-10-14 | Genentech, Inc. | Use of il-27 antagonists to treat lupus |
| EP3263128A3 (en) | 2009-04-14 | 2018-01-24 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Compositions for immunising against staphylococcus aureus |
| WO2010146511A1 (en) | 2009-06-17 | 2010-12-23 | Pfizer Limited | Treatment of overactive bladder |
| US20120283136A1 (en) | 2009-06-24 | 2012-11-08 | The University Of Southern California | Compositions and methods for the rapid biosynthesis and in vivo screening of biologically relevant peptides |
| US10988511B2 (en) | 2009-07-07 | 2021-04-27 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Conserved Escherichia bacterial IG-like domain (group 1) protein (ORF405) immunogens |
| ES2605801T3 (es) | 2009-07-15 | 2017-03-16 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Formulación de dosis unitaria de antídoto para inhibidores del factor Xa para su uso en la prevención de la hemorragia |
| AU2010272243A1 (en) | 2009-07-16 | 2012-03-08 | Novartis Ag | Detoxified Escherichia coli immunogens |
| GB0919690D0 (en) | 2009-11-10 | 2009-12-23 | Guy S And St Thomas S Nhs Foun | compositions for immunising against staphylococcus aureus |
| AR080291A1 (es) | 2010-02-24 | 2012-03-28 | Rinat Neuroscience Corp | Anticuerpos antagonistas anti receptor de il-7 y procedimientos |
| GB201003333D0 (en) | 2010-02-26 | 2010-04-14 | Novartis Ag | Immunogenic proteins and compositions |
| JP5932670B2 (ja) | 2010-03-11 | 2016-06-08 | ライナット ニューロサイエンス コーポレイション | ｐＨ依存性の抗原結合を有する抗体 |
| GB201005625D0 (en) | 2010-04-01 | 2010-05-19 | Novartis Ag | Immunogenic proteins and compositions |
| WO2011133931A1 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Genentech, Inc. | Use of il-27 antagonists for treating inflammatory bowel disease |
| JP5988961B2 (ja) | 2010-04-28 | 2016-09-07 | ザ ジェイ． デヴィッド グラッドストーン インスティテューツ | 心筋細胞を発生させるための方法 |
| MX2012013037A (es) | 2010-05-10 | 2013-07-29 | Univ California | Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas. |
| US20130150256A1 (en) | 2010-06-11 | 2013-06-13 | Jane Synnergren | Novel micrornas for the detection and isolation of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types |
| JP2013533286A (ja) | 2010-07-30 | 2013-08-22 | セントルイス ユニバーシティ | 疼痛を治療する方法 |
| WO2012072769A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | Novartis Ag | Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations |
| WO2012075243A2 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-07 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for targeting sites of neovascular growth |
| US20130071375A1 (en) | 2011-08-22 | 2013-03-21 | Saint Louis University | Compositions and methods for treating inflammation |
| WO2013028527A1 (en) | 2011-08-23 | 2013-02-28 | Indiana University Research And Technology Corporation | Compositions and methods for treating cancer |
| WO2013033636A2 (en) | 2011-09-01 | 2013-03-07 | University Of Southern California | Methods for preparing high throughput peptidomimetics, orally bioavailable drugs and compositions containing same |
| TWI495644B (zh) | 2011-11-11 | 2015-08-11 | Rinat Neuroscience Corp | 營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途 |
| ES2724803T3 (es) | 2011-12-16 | 2019-09-16 | Univ Leland Stanford Junior | Polipéptidos opsinas y métodos de utilización de los mismos |
| US9249224B2 (en) | 2011-12-22 | 2016-02-02 | Rinat Neuroscience Corp. | Human growth hormone receptor antagonist antibodies and methods of use thereof |
| WO2013093693A1 (en) | 2011-12-22 | 2013-06-27 | Rinat Neuroscience Corp. | Staphylococcus aureus specific antibodies and uses thereof |
| AU2013266968B2 (en) | 2012-05-25 | 2017-06-29 | Emmanuelle CHARPENTIER | Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription |
| WO2013184209A1 (en) | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Mif for use in methods of treating subjects with a neurodegenerative disorder |
| EP3539563A1 (en) | 2012-07-19 | 2019-09-18 | Redwood Bioscience, Inc. | Antibody specific for cd22 and methods of use thereof |
| US8603470B1 (en) | 2012-08-07 | 2013-12-10 | National Cheng Kung University | Use of IL-20 antagonists for treating liver diseases |
| NZ630542A (en) | 2012-08-16 | 2017-06-30 | Ipierian Inc | Methods of treating a tauopathy |
| EP3722320A3 (en) | 2012-10-25 | 2020-12-30 | Bioverativ USA Inc. | Anti-complement c1s antibodies and uses thereof |
| DK2914291T3 (da) | 2012-11-02 | 2022-05-16 | Bioverativ Usa Inc | Anti-komplement-c1s-antistoffer og anvendelser deraf |
| AU2013337354A1 (en) | 2012-11-05 | 2015-05-21 | Genzyme Corporation | Compositions and methods for treating proteinopathies |
| CA2890483A1 (en) | 2012-11-09 | 2014-05-15 | Robert ARCH | Platelet-derived growth factor b specific antibodies and compositions and uses thereof |
| WO2014127148A1 (en) | 2013-02-14 | 2014-08-21 | The J. David Gladstone Institutes | Compositions and methods of use thereof for identifying anti-viral agents |
| DK2956175T3 (da) | 2013-02-15 | 2017-11-27 | Univ California | Kimærisk antigenreceptor og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
| AU2014236208B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-07-19 | Genvivo, Inc. | Thymidine kinase diagnostic assay for gene therapy applications |
| AU2014240045A1 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-10 | Dyax Corp. | Anti-plasma kallikrein antibodies |
| US20160039877A1 (en) | 2013-03-15 | 2016-02-11 | Shenzhen Hightide Biopharmaceutical, Ltd. | Compositions and methods of using islet neogenesis peptides and analogs thereof |
| WO2014181229A2 (en) | 2013-05-07 | 2014-11-13 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-glucagon receptor antibodies and methods of use thereof |
| BR112015030356A2 (pt) | 2013-06-10 | 2017-12-05 | Ipierian Inc | métodos de tratamento de uma taupatia |
| CA2916533C (en) | 2013-06-25 | 2022-12-20 | University Of Canberra | Methods and compositions for modulating cancer stem cells |
| WO2015006641A2 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Methods and compositions for interference with dna polymerase and dna synthesis |
| US10208125B2 (en) | 2013-07-15 | 2019-02-19 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Anti-mucin 1 binding agents and uses thereof |
| PL3369435T3 (pl) | 2013-07-18 | 2020-04-30 | Xalud Therapeutics, Inc. | Kompozycja do leczenia choroby zapalnej stawów |
| CA2919790C (en) | 2013-08-02 | 2018-06-19 | Pfizer Inc. | Anti-cxcr4 antibodies and antibody-drug conjugates |
| ES2851724T3 (es) | 2013-09-18 | 2021-09-08 | Epiaxis Therapeutics Pty Ltd | Modulación de células madre |
| US9683998B2 (en) | 2013-11-13 | 2017-06-20 | Pfizer Inc. | Tumor necrosis factor-like ligand 1A specific antibodies and compositions and uses thereof |
| CA2930877A1 (en) | 2013-11-18 | 2015-05-21 | Crispr Therapeutics Ag | Crispr-cas system materials and methods |
| WO2015087187A1 (en) | 2013-12-10 | 2015-06-18 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-sclerostin antibodies |
| EP3835419A1 (en) | 2013-12-12 | 2021-06-16 | The Regents of The University of California | Methods and compositions for modifying a single stranded target nucleic acid |
| WO2015109212A1 (en) | 2014-01-17 | 2015-07-23 | Pfizer Inc. | Anti-il-2 antibodies and compositions and uses thereof |
| AU2015230933B2 (en) | 2014-03-21 | 2020-08-13 | Teva Pharmaceuticals International Gmbh | Antagonist antibodies directed against calcitonin gene-related peptide and methods using same |
| US10428158B2 (en) | 2014-03-27 | 2019-10-01 | Dyax Corp. | Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema |
| WO2015168474A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | President And Fellows Of Harvard College | Fusion proteins for treating cancer and related methods |
| ES2913205T3 (es) | 2014-05-13 | 2022-06-01 | Bioatla Inc | Proteínas biológicas activas condicionalmente |
| WO2015195531A2 (en) | 2014-06-18 | 2015-12-23 | Albert Einstein College Of Medicine, Inc. | Syntac polypeptides and uses thereof |
| US9840553B2 (en) | 2014-06-28 | 2017-12-12 | Kodiak Sciences Inc. | Dual PDGF/VEGF antagonists |
| PT3177640T (pt) | 2014-08-08 | 2020-08-31 | Univ Leland Stanford Junior | Agentes pd-1 de alta afinidade e métodos de utilização |
| CA2958704A1 (en) | 2014-08-25 | 2016-03-03 | University Of Canberra | Compositions for modulating cancer stem cells and uses therefor |
| US11111288B2 (en) | 2014-08-28 | 2021-09-07 | Bioatla, Inc. | Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells |
| DK4074735T3 (da) | 2014-08-28 | 2025-07-14 | Bioatla Inc | Betinget aktive kimæriske antigenreceptorer til modificerede t-celler |
| WO2016036916A1 (en) | 2014-09-03 | 2016-03-10 | Bioatla, Llc | Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts |
| CA2972714A1 (en) | 2014-09-09 | 2016-03-17 | Unum Therapeutics | Chimeric receptors and uses thereof in immune therapy |
| MX389350B (es) | 2014-12-05 | 2025-03-19 | Alexion Pharma Inc | Fosfatasas alcalinas recombinantes y usos de las mismas para el tratamiento de convulsiones. |
| TWI595006B (zh) | 2014-12-09 | 2017-08-11 | 禮納特神經系統科學公司 | 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法 |
| CN107405399B (zh) | 2015-01-02 | 2022-02-08 | 武田药品工业株式会社 | 针对血浆激肽释放酶和因子xii的双特异性抗体 |
| US20180008727A1 (en) | 2015-01-30 | 2018-01-11 | The Regents Of The University Of California | Spinal subpial gene delivery system |
| EP3858992A1 (en) | 2015-03-13 | 2021-08-04 | The Jackson Laboratory | A three-component crispr/cas complex system and uses thereof |
| WO2016160973A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| WO2016160966A1 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating renal cell cancer |
| US20180085398A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-29 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| US20180071340A1 (en) | 2015-03-30 | 2018-03-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating multiple myeloma |
| HK1248567A1 (zh) | 2015-03-30 | 2018-10-19 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | 治疗急性髓性白血病的组合物和方法 |
| US9758575B2 (en) | 2015-04-06 | 2017-09-12 | Yung Shin Pharmaceutical Industrial Co. Ltd. | Antibodies which specifically bind to canine vascular endothelial growth factor and uses thereof |
| CA2981321A1 (en) | 2015-04-06 | 2016-10-13 | True North Therapeutics, Inc. | Humanized anti-c1s antibodies and methods of use thereof |
| WO2016164371A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Methods for inducing cell division of postmitotic cells |
| TWI703159B (zh) | 2015-04-13 | 2020-09-01 | 美商輝瑞股份有限公司 | Bcma特異性治療性抗體及其用途 |
| CA2985235A1 (en) | 2015-05-07 | 2016-11-10 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease |
| WO2016196655A1 (en) | 2015-06-03 | 2016-12-08 | The Regents Of The University Of California | Cas9 variants and methods of use thereof |
| US11040094B2 (en) | 2015-07-01 | 2021-06-22 | Colleen M. O'Connor | Compositions and methods for treating immunological dysfunction |
| US10287338B2 (en) | 2015-07-10 | 2019-05-14 | Miran NERSISSIAN | Factor VIII protein compositions and methods of treating of hemophilia A |
| AU2016297018B9 (en) | 2015-07-21 | 2022-12-01 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | A monoclonal antibody inhibitor of factor XIIa |
| WO2017015334A1 (en) | 2015-07-21 | 2017-01-26 | Saint Louis University | Compositions and methods for diagnosing and treating endometriosis-related infertility |
| US11066481B2 (en) | 2015-07-23 | 2021-07-20 | The Regents Of The University Of California | Antibodies to coagulation factor XIa and uses thereof |
| WO2017023863A1 (en) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Peptides and antibodies for the removal of biofilms |
| EP3331536A4 (en) | 2015-08-03 | 2019-03-27 | The Regents of The University of California | COMPOSITIONS AND METHODS OF MODULATING THE ABHD2 ACTIVITY |
| KR102438650B1 (ko) | 2015-08-19 | 2022-08-31 | 화이자 인코포레이티드 | 조직 인자 경로 억제제 항체 및 그의 용도 |
| CN117510633A (zh) | 2015-09-02 | 2024-02-06 | 伊缪泰普有限公司 | 抗lag-3抗体 |
| HRP20211081T1 (hr) | 2015-09-15 | 2021-10-15 | Scholar Rock, Inc. | Anti-pro/latentna miostatinska protutijela i njihove uporabe |
| US20190048340A1 (en) | 2015-09-24 | 2019-02-14 | Crispr Therapeutics Ag | Novel family of rna-programmable endonucleases and their uses in genome editing and other applications |
| EP3365027B1 (en) | 2015-10-14 | 2022-03-30 | Research Institute at Nationwide Children's Hospital | Hu specific antibodies and their use in inhibiting biofilm |
| AU2016337525B2 (en) | 2015-10-16 | 2022-01-20 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens |
| CN108289909A (zh) | 2015-10-19 | 2018-07-17 | 巴尔的摩马里兰大学 | 用于产生工程改造的人原代血液树突细胞系的方法 |
| CN115636880A (zh) | 2015-10-23 | 2023-01-24 | 辉瑞有限公司 | 抗il-2抗体及其组合物和用途 |
| WO2017075037A1 (en) | 2015-10-27 | 2017-05-04 | Scholar Rock, Inc. | Primed growth factors and uses thereof |
| CN106699889A (zh) | 2015-11-18 | 2017-05-24 | 礼进生物医药科技（上海）有限公司 | 抗pd-1抗体及其治疗用途 |
| EP3377087A1 (en) | 2015-11-20 | 2018-09-26 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| KR20250057128A (ko) | 2015-12-30 | 2025-04-28 | 코디악 사이언시스 인코포레이티드 | 항체 및 이의 접합체 |
| IL299616A (en) | 2016-01-08 | 2023-03-01 | Univ California | Conditionally active heterodimeric polypeptides and methods of using them |
| CN109219618B (zh) | 2016-01-21 | 2022-08-09 | 辉瑞大药厂 | 针对表皮生长因子受体变体iii和cd3的单特异性和双特异性抗体及其用途 |
| CA3014466A1 (en) | 2016-03-03 | 2017-09-08 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| WO2020047527A2 (en) | 2018-09-02 | 2020-03-05 | F1 Bioventures, Llc | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs |
| US12590321B2 (en) | 2016-03-19 | 2026-03-31 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for genetically modifying and expanding lymphocytes and regulating the activity thereof |
| CU24649B1 (es) | 2016-03-19 | 2023-02-13 | Exuma Biotech Corp | Retrovirus recombinantes incompetentes de replicación para la transducción de linfocitos y expansión regulada de los mismos |
| US11325948B2 (en) | 2016-03-19 | 2022-05-10 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL |
| US11111505B2 (en) | 2016-03-19 | 2021-09-07 | Exuma Biotech, Corp. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
| AU2017241534A1 (en) | 2016-03-28 | 2018-10-04 | The Regents Of The University Of California | Method and composition for treating neuronal hyper-excitability |
| US20190125848A1 (en) | 2016-03-30 | 2019-05-02 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Dendritic cell-extracellular vesicle fusions and methods of using same |
| US11560412B2 (en) | 2016-04-01 | 2023-01-24 | University Of Maryland, Baltimore | Compositions comprising GRIM-19 therapeutics and methods of use |
| EP3452510A4 (en) | 2016-04-04 | 2020-01-15 | Bioverativ USA Inc. | ANTI-COMPLEMENT FACTOR BB ANTIBODIES AND USES THEREOF |
| PL3455261T3 (pl) | 2016-05-13 | 2022-12-12 | Bioatla, Inc. | Przeciwciała anty-ror2, fragmenty przeciwciał, ich immunokoniugaty oraz ich zastosowania |
| CN109689096A (zh) | 2016-05-18 | 2019-04-26 | 阿尔伯特爱因斯坦医学院公司 | 变体pd-l1多肽、t细胞调节性多聚体多肽及其使用方法 |
| WO2017201210A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| CA3030003A1 (en) | 2016-07-08 | 2018-01-11 | F1 Oncology, Inc. | Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof |
| WO2018053035A1 (en) | 2016-09-13 | 2018-03-22 | The Jackson Laboratory | Targeted dna demethylation and methylation |
| WO2018057648A1 (en) | 2016-09-20 | 2018-03-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptide regulators of mitochondrial fusion and methods of use |
| CN110300520B (zh) | 2016-10-12 | 2022-10-04 | 美国比奥维拉迪维股份有限公司 | 抗C1s抗体及其使用方法 |
| WO2018075559A1 (en) | 2016-10-17 | 2018-04-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Signature-based human immunodeficiency virus (hiv) envelope (env) trimer vaccines and methods of using the same |
| US20180119141A1 (en) | 2016-10-28 | 2018-05-03 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr/cas global regulator screening platform |
| US20190269775A1 (en) | 2016-11-14 | 2019-09-05 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| WO2018090028A1 (en) | 2016-11-14 | 2018-05-17 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods of treating cancer |
| US11332713B2 (en) | 2016-11-16 | 2022-05-17 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| ES2973548T3 (es) | 2016-12-22 | 2024-06-20 | Cue Biopharma Inc | Polipéptidos multiméricos moduladores de linfocitos T y métodos para su uso |
| JP7661008B2 (ja) | 2017-01-04 | 2025-04-14 | リサーチ インスティチュート アット ネイションワイド チルドレンズ ホスピタル | バイオフィルム関連障害の処置のための抗体断片 |
| EP3565829A4 (en) | 2017-01-09 | 2021-01-27 | Cue Biopharma, Inc. | T-CELL-MODULATING MULTIMERIC POLYPEPTIDES AND METHOD OF USING THEREOF |
| US20190367876A1 (en) | 2017-01-18 | 2019-12-05 | F1 Oncology, Inc. | Methods of transducing and expanding immune cells and uses thereof |
| JP7280827B2 (ja) | 2017-01-18 | 2023-05-24 | エクスマ バイオテック コーポレイション | Ａｘｌまたはｒｏｒ２に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法 |
| US20190345501A1 (en) | 2017-02-07 | 2019-11-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for rna-guided genetic circuits |
| US20190359678A1 (en) | 2017-02-09 | 2019-11-28 | The Regents Of The University Of California | Chimeric t cell antigen receptors and methods of use thereof |
| KR102879522B1 (ko) | 2017-03-03 | 2025-11-04 | 엑수마 바이오테크, 코포레이션 | 림프구를 형질도입 및 팽창시키고 이들의 활성을 조절하기 위한 방법 및 조성물 |
| CA3054885A1 (en) | 2017-03-03 | 2018-09-07 | Rinat Neuroscience Corp. | Anti-gitr antibodies and methods of use thereof |
| WO2018167621A1 (en) | 2017-03-16 | 2018-09-20 | Pfizer Inc. | Tyrosine prototrophy |
| US11827705B2 (en) | 2017-03-28 | 2023-11-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods to protect transplanted tissue from rejection |
| CA3059938A1 (en) | 2017-04-14 | 2018-10-18 | Kodiak Sciences Inc. | Complement factor d antagonist antibodies and conjugates thereof |
| CA3060573A1 (en) | 2017-04-21 | 2018-10-25 | Baylor College Of Medicine | Oncolytic virotherapy and immunotherapy |
| EP3615570A4 (en) | 2017-04-25 | 2021-02-24 | LBL Biotechnology Inc. | USE OF IL-20 ANTAGONISTS FOR TREATMENT OF EYE DISEASES |
| MY201312A (en) | 2017-06-02 | 2024-02-16 | Pfizer | Antibodies specific for flt3 and their uses |
| GB202209539D0 (en) | 2017-06-13 | 2022-08-10 | Bostongene Corp | Systems and methods for identifying cancer treatments from normalized biomarker scores |
| WO2018232372A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Protelica, Inc. | Fibronectin binding domain chimeric antigen receptors and methods of use thereof |
| WO2019016784A1 (en) | 2017-07-21 | 2019-01-24 | Universidade De Coimbra | ANTI-NUCLEOLIN ANTIBODIES |
| JP2020534352A (ja) | 2017-09-07 | 2020-11-26 | キュー バイオファーマ，インコーポレーテッド | コンジュゲーション部位を有するｔ細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法 |
| CN111315773A (zh) | 2017-09-08 | 2020-06-19 | 马弗里克治疗公司 | 含有Fc区的条件性活化的结合部分 |
| CN111093715A (zh) | 2017-09-18 | 2020-05-01 | 儿童医院医疗中心 | 强绝缘子和其在基因递送中的用途 |
| EP3692370A2 (en) | 2017-10-04 | 2020-08-12 | OPKO Pharmaceuticals, LLC | Articles and methods directed to personalized therapy of cancer |
| JP7369121B2 (ja) | 2017-10-11 | 2023-10-25 | バイオベラティブ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド | 補体活性を誘発する方法 |
| EP3688011A4 (en) | 2017-10-25 | 2021-11-24 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | PEPTIDE COMPOSITIONS AND METHOD FOR THEIR USE |
| CA3080120C (en) | 2017-10-27 | 2023-11-21 | New York University | Anti-galectin-9 antibodies and uses thereof |
| JP2021506251A (ja) | 2017-12-14 | 2021-02-22 | クリスパー セラピューティクス アーゲー | 新規ｒｎａプログラム可能エンドヌクレアーゼ系、ならびにゲノム編集および他の適用におけるその使用 |
| CN111886241A (zh) | 2018-01-09 | 2020-11-03 | 库尔生物制药有限公司 | 多聚体t细胞调节多肽及其使用方法 |
| CN112020518A (zh) | 2018-02-01 | 2020-12-01 | 辉瑞公司 | 靶向cd70的嵌合抗原受体 |
| PE20210708A1 (es) | 2018-02-01 | 2021-04-16 | Pfizer | Anticuerpos especificos para cd70 y sus usos |
| US11667949B2 (en) | 2018-02-15 | 2023-06-06 | The Trustees Of Princeton University | Reporter construct and biosensor for interferon second messenger 2-5A |
| AU2019228381B2 (en) | 2018-02-28 | 2021-12-16 | Pfizer Inc. | IL-15 variants and uses thereof |
| EP3758737A4 (en) | 2018-03-02 | 2022-10-12 | Kodiak Sciences Inc. | IL-6 ANTIBODIES AND FUSION CONSTRUCTS AND CONJUGATES THEREOF |
| US20190284553A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | KSQ Therapeutics, Inc. | Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy |
| CN112040986A (zh) | 2018-03-15 | 2020-12-04 | Ksq治疗公司 | 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法 |
| MA52074A (fr) | 2018-03-19 | 2021-01-27 | Bayer Healthcare Llc | Nouveaux systèmes d'endonucléase à arn programmable et leurs utilisations |
| US11447769B2 (en) | 2018-03-27 | 2022-09-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified immune cells having enhanced function and methods for screening for same |
| CA3095757A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating glioblastomas |
| CA3096202A1 (en) | 2018-04-06 | 2019-10-10 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating egfrviii expressing glioblastomas |
| CN112839671A (zh) | 2018-05-17 | 2021-05-25 | 明尼苏达大学董事会 | 抗药性免疫细胞及其使用方法 |
| CA3100946A1 (en) | 2018-05-22 | 2019-11-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Gene therapy for alzheimer's disease |
| KR102602329B1 (ko) | 2018-05-23 | 2023-11-16 | 화이자 인코포레이티드 | Cd3에 특이적인 항체 및 이의 용도 |
| MX2020012607A (es) | 2018-05-23 | 2021-01-29 | Pfizer | Anticuerpos especificos para gucy2c y sus usos. |
| AU2019299439C1 (en) | 2018-07-03 | 2025-06-26 | Sotio Biotech, Inc. | Chimeric receptors in combination with trans metabolism molecules enhancing glucose import and therapeutic uses thereof |
| CN113039276A (zh) | 2018-07-16 | 2021-06-25 | 密歇根大学董事会 | 核酸酶介导的核酸修饰 |
| US20210309756A1 (en) | 2018-08-09 | 2021-10-07 | Maverick Therapeutics, Inc. | Coexpression and purification method of conditionally activated binding proteins |
| JP7456638B2 (ja) | 2018-08-14 | 2024-03-27 | ソティオ，リミティド ライアビリティ カンパニー | クレブス回路を調節するトランス代謝分子と組み合わせたキメラ抗原受容体ポリペプチド、及び、それらの治療的使用 |
| US12275964B2 (en) | 2018-08-22 | 2025-04-15 | The Regents Of The University Of California | Variant type V CRISPR/Cas effector polypeptides and methods of use thereof |
| CA3110837A1 (en) | 2018-08-28 | 2020-03-05 | Vor Biopharma Inc. | Genetically engineered hematopoietic stem cells and uses thereof |
| JP7450945B2 (ja) | 2018-08-30 | 2024-03-18 | テナヤ セラピューティクス， インコーポレイテッド | ミオカルディンおよびａｓｃｌ１を用いた心細胞リプログラミング |
| CN112771074A (zh) | 2018-10-05 | 2021-05-07 | 国家儿童医院研究所 | 用于酶促破坏细菌生物膜的组合物和方法 |
| JP7603580B2 (ja) | 2018-10-15 | 2024-12-20 | エリクシロン・イミュノセラピューティクス・（ホンコン）・リミテッド | 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に対する抗体及びそれらの使用 |
| WO2020097445A1 (en) | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Inari Agriculture, Inc. | Rna-guided nucleases and dna binding proteins |
| CN113710799B (zh) | 2018-11-28 | 2024-11-12 | 克里斯珀医疗股份公司 | 用于在LNP中使用的编码CAS9的优化mRNA |
| TWI856047B (zh) | 2018-12-19 | 2024-09-21 | 美商信號生物製藥公司 | 多聚體ｔ細胞調節多肽及其使用方法 |
| WO2020132190A1 (en) | 2018-12-21 | 2020-06-25 | Multitude Inc. | Antibodies specific to muc18 |
| US12084500B2 (en) | 2019-01-23 | 2024-09-10 | New York University | Antibodies specific to delta 1 chain of T cell receptor |
| JP2022524337A (ja) | 2019-03-05 | 2022-05-02 | 武田薬品工業株式会社 | 腫瘍抗原を標的とするｆｃ領域及び部分を含有する条件的に活性化された結合タンパク質 |
| EP3935079A4 (en) | 2019-03-06 | 2023-03-22 | Cue Biopharma, Inc. | T-CELL MODULATING ANTIGEN PRESENT POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF |
| JP2022522405A (ja) | 2019-03-06 | 2022-04-19 | キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド | Ｔ細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法 |
| MX2021010559A (es) | 2019-03-07 | 2021-12-15 | Univ California | Polipéptidos efectores de crispr-cas y métodos de uso de estos. |
| SG11202109741VA (en) | 2019-03-12 | 2021-10-28 | Crispr Therapeutics Ag | Novel high fidelity rna-programmable endonuclease systems and uses thereof |
| EP3947700A4 (en) | 2019-04-01 | 2023-01-04 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Adeno-associated virus with engineered capsid |
| JP7716623B2 (ja) | 2019-04-02 | 2025-08-01 | ウィリアム ロバート アラスーン リビング トラスト デイテッド オーガスト 29, 2016 | 排出ポンプ－癌抗原マルチ特異性抗体ならびにそれに関する組成物、試薬、キットおよび方法 |
| JP7686573B6 (ja) | 2019-05-24 | 2025-07-04 | ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド | アルツハイマー病のための遺伝子治療 |
| US12205675B2 (en) | 2019-07-03 | 2025-01-21 | Bostongene Corporation | Techniques for bias correction in sequence data |
| AU2020311897A1 (en) | 2019-07-08 | 2022-02-03 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Antibody compositions for disrupting biofilms |
| EP3997226A1 (en) | 2019-07-11 | 2022-05-18 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Cardiac cell reprogramming with micrornas and other factors |
| EP4003508A1 (en) | 2019-07-31 | 2022-06-01 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Perfusion modulated tumor dose sculpting with single dose radiotherapy |
| US12612657B2 (en) | 2019-08-16 | 2026-04-28 | The Jackson Laboratory | Extrachromosomal DNA labeling |
| WO2021062063A1 (en) | 2019-09-26 | 2021-04-01 | Chan Zuckerberg Biohub, Inc. | Improved variants of tev protease for biotechnological applications |
| WO2021071830A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | University Of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
| CA3157509A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
| WO2021072244A1 (en) | 2019-10-11 | 2021-04-15 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Anti-tn antibodies and uses thereof |
| DK4034170T3 (da) | 2019-10-23 | 2026-03-30 | Cue Biopharma Inc | Tgf-beta-polypeptider |
| EP4060028A4 (en) * | 2019-10-23 | 2023-10-04 | Genenmed Co., Ltd. | ADENOVIRUS PRODUCTION SYSTEM NO LONGER EXPRESSING VIRAL GENES ON THE BASIS OF AUXILIARY PLASMID |
| BR112022010373A2 (pt) | 2019-11-29 | 2022-08-16 | Paros Bio Inc | Terapia genética para doenças neurodegenerativas |
| WO2021113736A1 (en) | 2019-12-05 | 2021-06-10 | Massachusetts Institute Of Technology | Single-domain antibody to chloramphenicol |
| US20230067811A1 (en) | 2020-01-24 | 2023-03-02 | University Of Virginia Patent Foundation | Modulating lymphatic vessels in neurological disease |
| US20230103731A1 (en) | 2020-03-02 | 2023-04-06 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Gene vector control by cardiomyocyte-expressed micrornas |
| CN115811987A (zh) | 2020-03-18 | 2023-03-17 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | 抗神经酰胺抗体 |
| WO2021205325A1 (en) | 2020-04-08 | 2021-10-14 | Pfizer Inc. | Anti-gucy2c antibodies and uses thereof |
| WO2021224850A1 (en) | 2020-05-06 | 2021-11-11 | Crispr Therapeutics Ag | Mask peptides and masked anti-ptk7 antibodies comprising such |
| CN116529267A (zh) | 2020-06-04 | 2023-08-01 | 肯乔克蒂生物技术股份有限公司 | Abcg2外排泵-癌症抗原多特异性抗体及其相关组合物、试剂、试剂盒和方法 |
| US20230235007A1 (en) | 2020-06-15 | 2023-07-27 | Ming-Che Shih | Humanized ace2-fc fusion protein for treatment and prevention of sars-cov-2 infection |
| MX2023000662A (es) | 2020-07-17 | 2023-02-27 | Pfizer | Anticuerpos terapeuticos y sus usos. |
| EP4182353A1 (en) | 2020-07-17 | 2023-05-24 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-idiotypic antibodies against anti-klk2 antibodies |
| CA3190227A1 (en) | 2020-07-30 | 2022-02-03 | Pfizer Inc. | Cells having gene duplications and uses thereof |
| US20230295615A1 (en) | 2020-08-07 | 2023-09-21 | The Jackson Laboratory | Targeted Sequence Insertion Compositions and Methods |
| WO2022051406A1 (en) | 2020-09-03 | 2022-03-10 | Dalan Animal Health, Inc. | Use of vitellogenin for defining and testing novel immunogens in insects |
| US11781156B2 (en) | 2020-10-09 | 2023-10-10 | Tenaya Therapeutics, Inc. | Plakophillin-2 gene therapy methods and compositions |
| BR112023006305A2 (pt) | 2020-10-09 | 2023-05-09 | Tenaya Therapeutics Inc | Métodos e composições de terapia gênica com placofilina-2 |
| US12254961B2 (en) | 2020-12-04 | 2025-03-18 | Bostongene Corporation | Hierarchical machine learning techniques for identifying molecular categories from expression data |
| EP4277933A4 (en) | 2021-01-14 | 2024-12-11 | Senti Biosciences, Inc. | SECRETABLE PAYLOAD REGULATION |
| WO2022187289A1 (en) | 2021-03-01 | 2022-09-09 | Exuma Biotech Corp. | Methods and compositions for the delivery of retroviral particles |
| JP2024517745A (ja) | 2021-04-29 | 2024-04-23 | ボストンジーン コーポレイション | 複合腫瘍組織における腫瘍細胞発現を推定するための機械学習技法 |
| KR20240021211A (ko) | 2021-06-10 | 2024-02-16 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Klk2-gpi 융합 단백질에 대한 핵산 코딩, 재조합 세포 및 이의 용도 |
| EP4101928A1 (en) | 2021-06-11 | 2022-12-14 | Bayer AG | Type v rna programmable endonuclease systems |
| AU2022290382A1 (en) | 2021-06-11 | 2023-11-23 | Bayer Aktiengesellschaft | Type v rna programmable endonuclease systems |
| CA3227875A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Pfizer Inc. | Improved expression vectors and uses thereof |
| EP4722239A2 (en) | 2021-08-20 | 2026-04-08 | Christopher E. Rudd | Compositions and methods for anti-virus chimeric antigen receptor |
| EP4144841A1 (en) | 2021-09-07 | 2023-03-08 | Bayer AG | Novel small rna programmable endonuclease systems with impoved pam specificity and uses thereof |
| WO2023049933A1 (en) | 2021-09-27 | 2023-03-30 | Sotio Biotech Inc. | Chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules that re-direct glucose metabolites out of the glycolysis pathway and therapeutic uses thereof |
| AU2022388928A1 (en) | 2021-11-16 | 2024-05-16 | Sotio Biotech Inc. | Treatment of myxoid/round cell liposarcoma patients |
| EP4433512A4 (en) | 2021-11-19 | 2025-12-31 | Univ Pennsylvania | Genetically modified pan-leukocyte-specific CD45 antigen to facilitate T-lymphocyte therapy |
| MX2024006506A (es) | 2021-11-30 | 2024-08-14 | Sanofi Pasteur Inc | Vacunas basadas en vectores virales de metapneumovirus humano. |
| US20250051471A1 (en) | 2021-12-13 | 2025-02-13 | William Robert Arathoon Living Trust Dated August 29, 2016 | Anti-Abcb1 Antibodies |
| EP4453191A1 (en) | 2021-12-23 | 2024-10-30 | Bayer Aktiengesellschaft | Novel small type v rna programmable endonuclease systems |
| CA3249858A1 (en) | 2022-01-31 | 2023-08-03 | Bostongene Corporation | MACHINE LEARNING TECHNIQUES FOR CYTOMETRY |
| WO2023148598A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Pfizer Inc. | Cysteine prototrophy |
| WO2023159220A1 (en) | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Kenjockety Biotechnology, Inc. | Anti-cd47 antibodies |
| EP4469586A1 (en) | 2022-03-01 | 2024-12-04 | Exuma Biotech Corp. | Viral particles with membrane-bound hyaluronidase |
| CN119403922A (zh) | 2022-06-10 | 2025-02-07 | 拜耳公司 | 新的小型v型rna可编程内切核酸酶系统 |
| EP4299733A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| EP4299739A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-03 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| WO2024005863A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| WO2024005864A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Compositions, systems, and methods for genome editing |
| US20240029884A1 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-25 | Bostongene Corporation | Techniques for detecting homologous recombination deficiency (hrd) |
| WO2024040207A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Sotio Biotech Inc. | Genetically engineered natural killer (nk) cells with chimeric receptor polypeptides in combination with trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof |
| WO2024040208A1 (en) | 2022-08-19 | 2024-02-22 | Sotio Biotech Inc. | Genetically engineered immune cells with chimeric receptor polypeptides in combination with multiple trans metabolism molecules and therapeutic uses thereof |
| WO2024044659A1 (en) | 2022-08-24 | 2024-02-29 | Tectonic Therapeutic, Inc. | Constitutively active g protein-coupled receptor compositions and methods of use thereof |
| WO2024068996A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (C.H.U.V.) | Anti-sars-cov-2 antibodies and use thereof in the treatment of sars-cov-2 infection |
| US20260109972A1 (en) | 2022-11-09 | 2026-04-23 | The Regents Of The University Of California | High-Throughput Discovery of Multi-Partite CRISPR-Based Editors |
| AU2023380182A1 (en) | 2022-11-18 | 2025-07-03 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Compositions for mitophagy induction and uses thereof |
| IL321270A (en) | 2022-12-13 | 2025-08-01 | Bayer Ag | Engineered RNA-type programmable endonucleases and their uses |
| JP2026504479A (ja) | 2023-02-06 | 2026-02-05 | ブルーロック セラピューティクス エルピー | デグロン融合タンパク質並びにその産生及び使用の方法 |
| WO2024178397A2 (en) | 2023-02-24 | 2024-08-29 | Elevatebio Technologies, Inc. | Modified immune effector cells and methods of use |
| JP2026509481A (ja) | 2023-03-15 | 2026-03-19 | 京都府公立大学法人 | ペプチド発現コンストラクトおよびその使用 |
| EP4694916A1 (en) | 2023-04-14 | 2026-02-18 | SOTIO Biotech Inc. | Engineered immune cells for treating cancer in combination with il-2/il-15 receptor ?? agonists |
| WO2024215987A1 (en) | 2023-04-14 | 2024-10-17 | Sotio Biotech Inc. | IMMUNE CELLS FOR TREATING CANCER IN COMBINATION WITH IL-15/IL-15Rα CONJUGATES |
| GB202307563D0 (en) | 2023-05-19 | 2023-07-05 | Univ King Abdullah Sci & Tech | Methods and compositions |
| AU2024277678A1 (en) | 2023-05-25 | 2025-11-27 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Synthetic cancer antigens as targets for treating cancers |
| KR20260033032A (ko) | 2023-06-29 | 2026-03-10 | 디스패치 바이오테라퓨틱스, 인크. | 합성 시토카인 수용체 |
| WO2025030010A1 (en) | 2023-08-01 | 2025-02-06 | Vor Biopharma Inc. | Compositions comprising genetically engineered hematopoietic stem cells and methods of use thereof |
| AU2024324215A1 (en) | 2023-08-11 | 2026-02-26 | Abalytics Oncology, Inc. | Anti-ctla-4 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof |
| WO2025076291A1 (en) | 2023-10-06 | 2025-04-10 | Bluerock Therapeutics Lp | Engineered type v rna programmable endonucleases and their uses |
| US20260120879A1 (en) | 2023-10-31 | 2026-04-30 | Bostongene Corporation | Machine learning technique for identifying ici responders and non-responders |
| WO2025111402A1 (en) | 2023-11-21 | 2025-05-30 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Anti-amyloid beta antibodies and related compositions and methods thereof |
| TW202535949A (zh) | 2023-12-20 | 2025-09-16 | 美商必治妥美雅史谷比公司 | 靶向IL-18受體β(IL-18RB)之抗體及相關方法 |
| US20250253011A1 (en) | 2024-02-02 | 2025-08-07 | Seven Bridges Genomics Inc. | Techniques for improved tumor mutational burden (tmb) determination using a population-specific genomic reference |
| WO2025171383A2 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Engineered cancer antigens and related methods and uses |
| WO2025171388A1 (en) | 2024-02-09 | 2025-08-14 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Engineered cancer antigens with modified domains and related methods and uses |
| WO2025199352A2 (en) | 2024-03-20 | 2025-09-25 | Juno Therapeutics, Inc. | Antibodies specific for solute carrier family 34 member 2 (slc34a2) |
| WO2025240670A2 (en) | 2024-05-15 | 2025-11-20 | Abalytics Oncology, Inc. | Anti-pd-1 antibodies and related binding molecules and methods and uses thereof |
| WO2026006767A1 (en) | 2024-06-28 | 2026-01-02 | Dispatch Biotherapeutics, Inc. | Tethered il-9/il-9r and related engineered cells and methods |
| WO2026069312A1 (en) | 2024-09-24 | 2026-04-02 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Immune cells expressing an inducible therapeutic agent and uses thereof |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2681786A1 (fr) * | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
| FR2688514A1 (fr) * | 1992-03-16 | 1993-09-17 | Centre Nat Rech Scient | Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant. |
| AU1648092A (en) * | 1992-03-19 | 1993-10-21 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Defective recombinant adenoviruses expressing characteristic epstein-barr virus proteins |
| ATE404683T1 (de) * | 1992-09-25 | 2008-08-15 | Aventis Pharma Sa | Adenovirus vektoren für die übertragung fremder gene in zellen des zentralen nervensystems, insbesondere im gehirn |
| EP1024198A3 (en) * | 1992-12-03 | 2002-05-29 | Genzyme Corporation | Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae |
-
1994
- 1994-06-24 EP EP94920351A patent/EP0705344B8/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-24 ES ES94920351T patent/ES2249761T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-24 DE DE69434486T patent/DE69434486T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-24 WO PCT/CA1994/000364 patent/WO1995000655A1/en not_active Ceased
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- 1994-06-24 AU AU71184/94A patent/AU687829B2/en not_active Ceased
- 1994-06-24 JP JP50228595A patent/JP3532566B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-24 AT AT94920351T patent/ATE304604T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0705344B8 (en) | 2006-05-10 |
| JP2002509422A (ja) | 2002-03-26 |
| AU687829B2 (en) | 1998-03-05 |
| CA2166118A1 (en) | 1995-01-05 |
| WO1995000655A1 (en) | 1995-01-05 |
| EP0705344B1 (en) | 2005-09-14 |
| JP3532566B2 (ja) | 2004-05-31 |
| CA2166118C (en) | 2007-04-17 |
| AU7118494A (en) | 1995-01-17 |
| DE69434486D1 (de) | 2006-01-26 |
| DE69434486T2 (de) | 2006-07-06 |
| EP0705344A1 (en) | 1996-04-10 |
| ATE304604T1 (de) | 2005-09-15 |
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