ES2844189T3 - Tratamiento y prevención de lesiones remotas por isquemia-reperfusión - Google Patents

Abstract

Un inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso en el tratamiento y/o prevención de lesión por isquemia-reperfusión (IRI) remota, que comprende administrar el inhibidor del sistema de activación por contacto a un individuo, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es un C1INH, en el que el C1INH es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NÚM.:1.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento y prevención de lesiones remotas por isquemia-reperfusión

Antecedentes de la invención

El establecimiento de un ambiente libre de sangre es un requisito previo en la cirugía reconstructiva y ortopédica, que se consigue habitualmente mediante la aplicación de un torniquete. La privación de sangre y oxígeno, denominada isquemia, conduce a cambios moleculares y estructurales dependientes del tiempo del tejido afectado. Las cascadas inflamatorias complejas, como el complemento, coagulación, así como el sistema plasmático calicreína-quinina, luego se activan cuando se restablece el flujo sanguíneo, lo que lleva a una lesión por isquemia/reperfusión (IRI). La IRI inducida por torniquete se manifiesta en formación de edema, pérdida de viabilidad muscular y apoptosis, lo que afecta significativamente el resultado de las intervenciones quirúrgicas. Además, se sabe que el iRi induce una respuesta inflamatoria tanto local como sistémica que produce daños en tejidos y órganos remotos, un fenómeno que es bien conocido en las clínicas. A la fecha, no existen agentes disponibles en las clínicas para tratamiento de las respuestas inflamatorias locales y sistémicas tras la IRI (1).

Se ha demostrado que el inhibidor de esterasa C1, inhibidor del complemento natural (C1INH) inhibe las tres vías del complemento (clásica, lectina así como la vía alternativa), el sistema de coagulación y el sistema calicreínaquinina (2-4). El C1INH derivado del plasma es usado con éxito en las clínicas para tratamiento de pacientes con deficiencia de C1INH que padecen angioedema hereditario (AEH) (2). Varios estudios en animales han demostrado un potencial terapéutico de C1INH derivado de plasma en IRI local, a saber, trasplante de órganos sólidos, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, IRI hepático e intestinal (4). Dos estudios diferentes demostraron un efecto terapéutico potencial de C1INH derivado de plasma sobre el IRI del músculo esquelético local, que atribuyen el efecto al sistema del complemento (5,6). Un estudio que usa ratones transgénicos que sobreexpresan C1INH humano con niveles plasmáticos elevados "suprafisiológicamente" mostró una reducción del daño de órganos remotos en el pulmón y el músculo esquelético en un modelo de IRI del torso inferior (7). Sin embargo, en este modelo C1INH se expresó constitutivamente, incluso durante el desarrollo embrionario, lo que puede llevar a cambios en la fisiología y reactividad fisiopatológica. Hasta ahora, no se ha demostrado ningún efecto del C1INH derivado de plasma sobre el daño a tejidos u órganos remotos inducido por IRI. Sorprendentemente, usando un modelo animal de rata de IRI de extremidades traseras con aplicación de torniquete, los inventores pudieron demostrar un efecto terapéutico de C1INH derivado de plasma no sólo en el daño local sino también en tejidos y órganos remotos. Por ejemplo, ha sido observada una reducción significativa del edema pulmonar. C1INH cumple un papel importante en la inhibición del sistema de activación por contacto, y su efecto sobre el daño de tejidos y órganos remotos indica un papel fisiopatológico importante de los componentes de este sistema no solo en el daño local de tejidos y órganos, sino también en el daño remoto observado durante el IRI. Los resultados indican que las sustancias que se dirigen al sistema de activación por contacto, tal como C1INH, mejoran o incluso previenen el daño de tejidos y órganos remotos.

Sumario de la invención

La presente divulgación que comprende la invención se refiere inter alia al tópico definido en los siguientes puntos [1] a [32].

[1] . Un inhibidor de sistema de activación de contacto, a saber un inhibidor de esterasa C1 (C1INH), para uso en el tratamiento y/o prevención de lesión por isquemia-reperfusión (IRI) remota, que comprende administrar el inhibidor de sistema de activación de contacto a un individuo.

[2] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [1], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto es un C1INH, preferentemente C1INH humano, más preferentemente C1INH derivado de plasma humano o C1INH recombinante humano.

[3]

[4] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados precedentes, en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto es administrado por vía parenteral al individuo.

[5] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados precedentes, en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto es administrado por vía intravenosa, intraarterial o subcutánea al individuo.

[6] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados precedentes, en el que el sistema de activación por contacto es C1INH y en el que la dosis del C1INH, administrado al individuo es de 1 a 5000 lU/kg de peso corporal, preferentemente de 1 a 1000 lU/kg de peso corporal, más preferentemente de 10 a 500 lU/kg de peso corporal.

[7] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [6], en el que la dosis del C1INH, administrado al individuo es de 10 a 250 lU/kg de peso corporal, preferentemente de 20 a 100 lU/kg de peso corporal.

[8]

[9] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados precedentes, en el que el individuo es un paciente que es un paciente que se va a someter o se ha sometido a una intervención quirúrgica.

[10] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [9], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el C1INH, es administrado al paciente dentro de 7 días, preferentemente dentro de 6 días, más preferentemente dentro de 5 días, incluso más preferentemente dentro de 4 días antes del inicio de la intervención quirúrgica o inicio de la reperfusión. Más preferentemente es una administración dentro de 72 horas, preferentemente dentro de 48 horas, más preferentemente dentro de 24 horas, más preferentemente dentro de 12 horas, incluso más preferentemente dentro de 6 horas antes del inicio de la intervención quirúrgica o inicio de la reperfusión.

[11] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [9] o apartado [10], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el C1INH, es administrado al paciente durante la intervención quirúrgica.

[12] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados [9] a [11], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el C1INH, es administrado al paciente después de la terminación de la intervención quirúrgica o después del inicio de la reperfusión.

[13] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [12], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el C1INH, es administrado al paciente dentro de 72 horas, preferentemente dentro de 48 horas, más preferentemente dentro de 24 horas, más preferentemente dentro de 12 horas, incluso más preferentemente dentro de 6 horas o con máxima preferencia directamente después de la terminación de la intervención quirúrgica o inicio de la reperfusión.

[14] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados [9] a [13], en el que la intervención quirúrgica es cirugía reconstructiva o cirugía de trauma.

[15] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados [9] a [13], en el que la intervención quirúrgica es cirugía ortopédica.

[16] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [15], en el que la cirugía ortopédica se selecciona del grupo que consiste en cirugía de rodilla, cirugía de hombro y cirugía de mano.

[17] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados [9] a [13], en el que la intervención quirúrgica es trasplante.

[18] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [17], en el que el trasplante es un trasplante de órganos, tejidos o células, preferentemente de riñón, hígado, pulmón, intestino, páncreas, corazón, extremidades (por ejemplo, mano), piel o células del islote de páncreas.

[19] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados [9] a [13], en el que la intervención quirúrgica es cirugía vascular o cirugía para tratar lesiones por shock/aplastamiento.

[20] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados [9] a [13], en el que la intervención quirúrgica es inserción de un dispositivo, preferentemente un catéter, para administrar una sustancia farmacológicamente activa, tal como una sustancia trombolítica o un vasodilatador, al individuo, o la inyección de una sustancia farmacológicamente activa, tal como una sustancia trombolítica o vasodilatador, o la inserción de un dispositivo para la extracción mecánica de un obstrucción vascular parcial.

[21] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [20], en el que el individuo ha sufrido un infarto de miocardio, un accidente cerebrovascular, trombosis, preferentemente trombosis venosa profunda o eventos trombóticos en superficies extrañas tales como stents, tromboembolismo, embolismo pulmonar, isquemia crónica por aterosclerosis, preferentemente isquemia crónica de extremidades debida a aterosclerosis periférica, u otra vascularización completa u obstrucción parcial.

[22] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [1] a [8], en el que la IRI remota se debe a la mejora en el flujo sanguíneo alterado en el individuo que es espontáneo o inducido por medios diferentes de la intervención quirúrgica.

[23] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [22], en el que la administración es anterior a la reperfusión, por ejemplo, profilácticamente, o la administración es lo antes posible después de que ocurre la reperfusión.

[24] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con cualquiera de los apartados precedentes, en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto es C1INH humano aislado de plasma humano.

[25] Un procedimiento de tratamiento y/o prevención de lesiones remotas por isquemia-reperfusión (IRI), que comprende administrar a un individuo una dosis efectiva de un inhibidor de sistema de activación de contacto.

[26] Un procedimiento de prevención de una lesión por isquemia-reperfusión (IRI) en un paciente que se va a someter o se ha sometido a una intervención quirúrgica, que comprende administrar al paciente una dosis efectiva de un inhibidor de sistema de activación de contacto antes de y/o durante y/o después de la intervención quirúrgica, o antes de y/o después del inicio de la reperfusión, en el que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) afecta un órgano, extremidades o tejido remoto del sitio de cirugía y/o isquemia inicial.

[27] El procedimiento del apartado [25] o [26], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto se selecciona del grupo que consiste en a C1INH,

[28] El procedimiento del apartado [27], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto es un C1INH, preferentemente C1INH humano, más preferentemente C1INH humano derivado de plasma.

[30] El procedimiento de cualquiera de los apartados [25] a [29], en el que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) remota afecta el pulmón, el riñón, el cerebro, el hígado, el corazón, el intestino, el páncreas u otros órganos y extremidades.

[31] El procedimiento de cualquiera de los apartados [25] a [30], en el que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) incluye síndrome de disfunción orgánica múltiple o síndrome de respuesta inflamatoria sistémica.

[32] El inhibidor de sistema de activación de contacto para uso de acuerdo con el apartado [2], en el que el inhibidor de sistema de activación de contacto es un C1INH, preferentemente C1INH humano, y se combina con glicosaminoglicanos sintéticos o naturales tales como por ejemplo, heparina, N-acetilheparina, heparan sulfato, dextran sulfatos, dermatán sulfatos y condroitín sulfatos, y/o combinado con otras sustancias como inmunoglobulinas intravenosas, antitrombina III, alfa1 antitripsina o inhibidor de FXII para mejorar el efecto terapéutico. Estas sustancias se pueden administrar como terapia combinada o politerapia.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: C1INH previene significativamente el edema del músculo esquelético local evaluado por el músculo gastronómico de relación húmedo: seco. A: análisis de relación húmedo: seco. B: Imagen representativa de una extremidad no tratada con C1INH (izquierda) y una extremidad tratada con C1INH (derecha). Cada punto representa el valor de un animal. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnett usando el software GraphPad Prism 5. La significancia estadística entre muestras se indicó de la siguiente manera*, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 2: C1INH previene significativamente el edema de pulmón remoto. Cada punto representa el valor de un animal. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnett usando el software GraphPad Prism 5. La significancia estadística entre las muestras se indicó de la siguiente manera *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 3: Efecto de C1INH sobre la expresión de los receptores de bradiquinina B1R y B2R en pulmones en pulmones analizados por IF. A: Expresión de B1R. B: expresión de B2R. Cada punto representa el valor de un animal. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnetts usando el software GraphPad Prism 5. La significancia estadística entre las muestras se indicó de la siguiente manera *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 4: C1INH previene la deposición de fibrina en el pulmón. Cada punto representa el valor de un animal. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnetts usando el software GraphPad Prism 5. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística entre las muestras se indicó de la siguiente manera *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 5: C1INH reduce la deposición de fibrina en la pierna contralateral. Cada punto representa el valor de un animal. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnetts usando el software GraphPad Prism 5. La significancia estadística entre las muestras se indicó de la siguiente manera *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 6: C1INH inhibe la deposición de C3b y factor B en la extremidad contralateral. Cada punto representa el valor de un animal. A: deposición de C3b. B: deposición de factor B. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnetts usando el software GraphPad Prism 5. La significancia estadística entre las muestras se indicó de la siguiente manera *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Figura 7: Se atenúa la eliminación de heparan sulfato mediante C1INH en la extremidad contralateral. Cada punto representa el valor de un animal. La barra horizontal muestra la media de los diferentes animales. Se muestran los datos de media ± SD. La significancia estadística se determinó mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnetts usando el software GraphPad Prism 5. La significancia estadística entre las muestras se indicó de la siguiente manera *, p < 0,05; **, p < 0,01; ***, p < 0,001.

Descripción detallada

La presente invención se define mediante las reivindicaciones. En un aspecto, la presente invención se refiere a un inhibidor de sistema de activación de contacto, de acuerdo con la reivindicación 1, para uso en el tratamiento y/o prevención de lesión por isquemia-reperfusión (IRI) remota, que comprende administrar el inhibidor de sistema de activación de contacto, a un individuo.

Se entenderá que el término "tratamiento" o "tratar" incluye la curación completa de una afección patológica así como la mejora o alivio de dicha afección.

Se entenderá que el término "prevención" incluye la prevención completa, profilaxis, reducción de la gravedad de una afección patológica, así como la disminución del riesgo del individuo de enfermarse con dicha afección. Este término también se debe entender que incluye el preacondicionamiento de tejido mediante la administración de un inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente un inhibidor de C1INH o FXII, descrito en la presente memoria en una etapa muy temprana (por ejemplo, antes de intervenciones quirúrgicas, antes del diagnóstico completo de IRI remoto) para prevenir el tejido de los daños.

El término "individuo" se refiere a un sujeto humano o animal.

Se considera que la expresión "cantidad efectiva" incluye cualquier cantidad de un agente de acuerdo con la presente divulgación que sea suficiente para producir un resultado terapéutico o profiláctico deseado, especialmente después de la administración a un individuo.

IRI remota o distante

Como se usa en la presente memoria, el término "lesión por isquemia-reperfusión" (IRI) se refiere a una lesión resultante de la restauración del flujo sanguíneo a un área de un tejido u órgano que previamente había experimentado un flujo sanguíneo deficiente debido a un evento isquémico.

Un IRI puede ser causado, por ejemplo, por un evento natural (por ejemplo, la restauración del flujo sanguíneo después de un infarto de miocardio), un trauma o por uno o más procedimientos quirúrgicos u otras intervenciones terapéuticas que restauran el flujo sanguíneo a un tejido u órgano que se ha sometido a un suministro reducido de sangre. Dichos procedimientos quirúrgicos incluyen, por ejemplo, cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria, angioplastia coronaria, cirugía de trasplante de órganos y otros.

La reperfusión de tejidos isquémicos da como resultado una respuesta tanto local como sistémica o remota que, a su vez, puede producir una disfunción microvascular generalizada y una función de barrera tisular alterada. La respuesta inflamatoria incluso puede resultar en el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) o el síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS).

Como se usa en la presente memoria, la frase "IRI remota" o "IRI distante" o "IRI remota o distante", usada indistintamente en la presente memoria, se refiere a procesos fisiopatológicos tal como procesos trombóticos, tromboembólicos y/o inflamatorios que incluyen daño celular, activación del complemento y/o formación de edema, que afecta a un órgano o tejido que es diferente de los órganos y tejidos isquémicos locales que se han reperfundido.

En una realización, la IRI remota o distante afecta al pulmón. La IRI remota o distante de la presente realización puede incluir edema pulmonar, procesos trombóticos en los pulmones, embolismo pulmonar y/o inflamación del tejido pulmonar.

En otra realización, la IRI remota afecta los riñones. La IRI remota de la presente realización puede incluir insuficiencia renal, formación de edema, trombosis, tromboembolismo y/o inflamación del tejido renal.

En otra realización, la IRI remota afecta al sistema cardiovascular. La IRI remota de la presente realización puede incluir aturdimiento miocárdico (disfunción miocárdica que persiste después de la reperfusión a pesar de la ausencia de daño irreversible), trombosis, arritmias por reperfusión y/o inflamación/infarto del tejido miocárdico.

En otra realización, la IRI remota afecta al sistema gastrointestinal, preferentemente al intestino. La IRI remota de la presente realización puede incluir disminución de la función de la barrera intestinal, alteración de la motilidad y absorción del intestino, trombosis, tromboembolismo y/o inflamación del tejido gastrointestinal.

En otra realización, la IRI remota afecta al sistema nervioso central. La IRI remota de la presente realización puede incluir la ruptura de la barrera hematoencefálica, isquemia cerebral silenciosa, accidente cerebrovascular, edema cerebral, aumento de la presión intracraneal y/o inflamación del tejido neuronal.

La IRI remota se puede caracterizar por inflamación, por ejemplo, inflamación sistémica. La inflamación puede afectar, por ejemplo, el pulmón, el sistema gastrointestinal, el sistema cardiovascular, otras extremidades y/o el sistema nervioso central.

La IRI remota puede incluir síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y/o síndrome de disfunción orgánica múltiple (MODS).

El evento isquémico que precede a la IRI remota se puede deber a una cirugía, o a obstrucciones vasculares no causadas por la cirugía.

Intervenciones quirúrgicas

En una realización, la IRI remota se debe a la reperfusión de tejidos y/u órganos isquémicos después de una intervención quirúrgica. La intervención quirúrgica incluye cualquier procedimiento quirúrgico.

Las posibles aplicaciones de acuerdo con esta invención incluyen prevenir la IRI remota mediante la administración del inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, junto con la reparación quirúrgica de la aorta torácica, suprarrenal o abdominal debido a una enfermedad aneurismática, pero también en conjunto con aquellos procedimientos quirúrgicos que inducen o requieren una oclusión transitoria o una derivación del suministro de sangre visceral durante y/o después de un trasplante de órganos importantes, que incluye hígado, riñón, intestino delgado, extremidades y páncreas. También se incluye la prevención de IRI remota junto con procedimientos quirúrgicos que producen la reducción o prevención transitoria del flujo sanguíneo, que incluye resecciones quirúrgicas hepáticas y biliares, pancreatectomía total o parcial, gastrectomía total y parcial, esofagectomía, cirugía colorrectal, cirugía vascular para enfermedad vascular mesentérica o insuflación abdominal durante procedimientos quirúrgicos laparoscópicos. Las aplicaciones adicionales incluyen contusiones o penetrantes que producen la interrupción del flujo sanguíneo a los órganos viscerales, que incluyen los que surgen de heridas por arma blanca o de heridas penetrantes o traumatismos abdominales cerrados secundarios a un accidente automovilístico. Otras aplicaciones incluyen lesiones por aplastamiento, por ejemplo, después de un desastre natural. Las aplicaciones adicionales incluyen la inserción de un dispositivo para la administración de sustancias farmacológicamente activas, tales como agentes trombolíticos o vasodilatadores y/o para la eliminación mecánica de obstrucciones completas o parciales, y la inyección de fármacos farmacológicos sustancias activas tales como agentes trombolíticos o vasodilatadores después de la aparición de un trastorno trombótico o tromboembólico inicial u otro trastorno inductor de isquemia que incluye, pero sin limitación, accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, trombosis venosa profunda, aterosclerosis o eventos trombóticos en superficies extrañas.

Preferentemente, la intervención quirúrgica es seleccionada del grupo que consiste en cirugía ortopédica, cirugía vascular, cirugía cardíaca, procedimientos dirigidos por catéter, cirugía de cáncer y cirugía traumática. La cirugía ortopédica se selecciona preferentemente del grupo que consiste en cirugía de rodilla, cirugía de mano, cirugía de hombro, huesos largos en trauma, reemplazo de cadera y cirugía de espalda.

La cirugía vascular se puede deber a reparaciones y/o accidentes, por ejemplo aneurismas aórticos, etc.

En una realización, la cirugía es una cirugía traumática, por ejemplo debido a accidentes automovilísticos, lesiones por fracturas y lesiones por aplastamiento en general, incluido un traumatismo importante con hipovolemia.

En una realización específica, la intervención quirúrgica es el trasplante, preferentemente de un órgano.

Obstrucciones vasculares no causadas por cirugía

Otras aplicaciones preferentes incluyen enfermedades o procedimientos que producen hipotensión sistémica que interrumpe o disminuye el flujo de sangre a los órganos viscerales, que incluyen el choque hemorrágico debido a la pérdida de sangre, el shock cardiogénico debido a un infarto de miocardio o insuficiencia cardíaca, choque neurogénico, choque nefrogénico, o anafilaxia.

La IRI remota se puede deber a una mejora en el flujo sanguíneo después de la isquemia debido a una hipoperfusión que conduce a una isquemia periférica con o sin isquemia de órganos.

La IRI remota también se puede deber a una mejora en el flujo sanguíneo después de procesos trombóticos o tromboembólicos iniciales dentro de un órgano o tejido primario, por ejemplo, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio.

En una realización, la IRI remota se debe a la mejora en el flujo sanguíneo después de un evento de isquemia crónica tal como isquemia crónica de extremidades debido a aterosclerosis periférica.

Inhibidores de sistema de activación de contacto

El término "inhibidor de sistema de activación de contacto" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier compuesto capaz de inhibir el sistema de activación de contacto. El inhibidor de sistema de activación de contacto es seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor de esterasa C1 (C1INH), un inhibidor del factor XII (FXII) y un inhibidor de calicreína. Estos inhibidores tienen la ventaja de que actúan temprano en la vía del sistema de activación por contacto e interactúan en múltiples puntos del sistema de activación por contacto. Por el contrario, los inhibidores de bradiquinina, tales como los antagonistas del receptor de bradiquinina, actúan en el punto distal del sistema y el punto principal de intervención es el nivel de formación de edema (véase Souza et al (10)).

Inhibidores de esterasa C1

El inhibidor de la esterasa C1 (C1INH) del plasma humano es un polipéptido monocatenario glicosilado de 478 residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de C1INH humana se muestra en SEQ ID NÚM.: 1. La concentración plasmática promedio es de aproximadamente 240 pg/ml. Los sinónimos de C1INH son inhibidor de Cl-esterasa, a2-neuramino-glicoproteína, inhibidor de C1s e inactivador de C1.

Una unidad internacional (UI) de C1INH se define por comparación con un inhibidor de C1 estándar internacional de la OMS, plasma. El 1er estándar internacional actual es el código NIBSC: 08/262, la potencia asignada de esta preparación es de 0,89 UI/ampolla.

Como se usa en la presente memoria, el término "C1INH", el término "C1INH" se refiere a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NÚM.: 1. Para los fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se refiere al porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias. El grado de identidad de una secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NÚM.: 1 se determina mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos en cuestión y la SEQ ID NÚM.: 1 usando el programa "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) con los siguientes parámetros: Matriz BLOSUM62; Penalizaciones de apertura de brecha 11 y extensión de brecha 1 gap x_dropoff50; valor esperado 10,0 tamaño de palabras 3; Filtro: ninguno. De acuerdo con la presente invención, la comparación de secuencias cubre al menos 400 aminoácidos, preferentemente al menos 425 aminoácidos, más preferentemente al menos 450 aminoácidos y con máxima preferencia al menos 475 aminoácidos.

El C1INH preferentemente tiene actividad inhibidora C1 que se puede ensayar como se describe en Drouet et al. (1988, Clin Chim Acta. 174:121-30). Más preferentemente, el C1INH es un C1INH humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NÚM.:1 (véase también UniProt P05155).

En una realización, el C1INH ha sido aislado de plasma humano o animal, preferentemente de plasma humano. De acuerdo con la presente realización, el C1INH se glicosila preferentemente como el C1INH humano nativo.

En otra realización, el C1INH humano o animal es obtenido a partir de células huésped transfectadas que expresan el C1INH. Dicho C1INH "producido de forma recombinante" puede ser preparado mediante cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, puede estar preparado en una célula u organismo huésped recombinante que ha sido transfectado con ADN que codifica el C1INH.

El C1INH adecuado para su uso en la invención puede ser obtenido a partir de un medio de cultivo acondicionado por células modificadas que secretan la proteína y purificarse mediante procedimientos estándar.

La proteína o polipéptido puede ser obtenido mediante técnicas recombinantes usando ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido C1INH. Los procedimientos generales de biología molecular se describen, por ejemplo, por Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 2d ed., 1989, y por Ausubel et al., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, New York (1987). Las secuencias apropiadas se pueden obtener usando técnicas estándares a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc. Se pueden usar técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Véase, por ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis et al., (Ed.), Academic Press, New York, N.Y. Las bibliotecas se construyen a partir de ácido nucleico extraído de células apropiadas. Se pueden encontrar secuencias de genes útiles, por ejemplo, en varias bases de datos de secuencias, por ejemplo, GenBank para ácido nucleico y Swiss-Prot para proteína.

Pueden ser usados procedimientos estándar para producir líneas celulares transformadas de procariotas, mamíferos, levaduras o insectos que expresan grandes cantidades del polipéptido. Los ejemplos de líneas celulares de mamíferos incluyen células c OS-7, células L de ratón y células CHO. Véase Sambrook (1989), supra y Ausubel et al., 1987, supra.

Pueden ser usados diversos vectores de expresión para expresar ADN que codifica C1INH. Se pueden usar vectores convencionales usados para la expresión de proteínas recombinantes en células procariotas o eucariotas.

El C1INH puede ser producido en forma soluble, tal como un producto secretado de células de levadura, insectos o mamíferos transformadas o transfectadas. A continuación, los péptidos luego se pueden purificar mediante procedimientos estándares que se conocen en la técnica. Por ejemplo, las etapas de purificación podrían incluir precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, electroforesis, cromatografía de afinidad y similares. Véase Methods in Enzymology Purification Principles and Practices 50 (Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Alternativamente, el C1INH puede ser producido en forma insoluble, tal como agregados o cuerpos de inclusión. El C1INH en tal forma es purificado mediante procedimientos estándares que son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de etapas de purificación incluyen separar los cuerpos de inclusión de las células huésped disgregadas por centrifugación y luego solubilizar los cuerpos de inclusión con un agente caotrópico y un agente reductor de modo que el péptido asuma una conformación biológicamente activa.

Las secuencias de nucleótidos usadas para transfectar las células huésped se pueden modificar usando técnicas estándares para producir C1INH o fragmentos de las mismas con una variedad de propiedades deseadas. Tal C1INH modificado puede variar de las secuencias de origen natural en el nivel de la estructura primaria, por ejemplo, por inserciones, sustituciones, supresiones y fusiones de aminoácidos. Estas modificaciones se pueden usar en varias combinaciones para producir la cadena de proteína modificada final. Las variantes de la secuencia de aminoácidos se pueden preparar con varios objetivos en mente, que incluyen aumentar o disminuir la vida media sérica, facilitar la purificación o preparación, mejorar la eficacia terapéutica y disminuir la gravedad o aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico. Las variantes de la secuencia de aminoácidos usualmente son variantes predeterminadas que no se encuentran en la naturaleza, aunque otras pueden ser variantes postraduccionales. Tales variantes se pueden usar en esta invención siempre que retengan la actividad biológica de C1INH. El C1INH de acuerdo con esta invención incluye las moléculas C1INH descritas en los documentos WO2007/073186 y US 8.071.532 B2.

La expresión en las células huésped puede dar como resultado un C1INH con una estructura de carbohidratos modificada (en comparación con el C1INH derivado del plasma). El C1INH se puede modificar en comparación con el C1INH derivado de plasma en uno o más de los siguientes aspectos: eliminación de un resto de carbohidrato (de una variante natural o variante expresada de forma recombinante de la glicoproteína), preferentemente la eliminación de ácido siálico y/o galactosa a partir de una cadena de carbohidratos unida a N y/o la eliminación de una cadena de carbohidratos que produce la exposición de residuos de manosa, galactosa, N-acetilglucosamina y/o fucosa. Además, se prevén modificaciones de C1INH para aumentar su vida media plasmática, por ejemplo, una fusión con restos que prolongan la vida media tal como albúmina, región Fc de inmunoglobulina, o modificación química tal como pegilación o hesilación de C1INH.

Inhibidores del factor XII

La abreviatura "FXII", como se usa en la presente solicitud, se refiere a uno o ambos de Factor XII (FXII) y Factor XII activado (FXIIa). Por tanto, el término "inhibidor de FXII" incluye inhibidores de FXII y FXIIa o ambos. Además, los anticuerpos anti-FXII incluyen anticuerpos que se unen e inhiben uno o ambos de FXII y FXIIa. El término "inhibidor de FXII" también pretende incluir un inhibidor de FXII que está unido a un polipéptido que extiende la vida media. El inhibidor de FXII puede ser unido directamente al polipéptido que extiende la vida media, o se puede unir mediante un ligador, preferentemente un ligador escindible.

En algunas realizaciones, el inhibidor de FXII es un inhibidor directo de FXII. El término inhibidor "directo" significa un inhibidor que actúa a través del contacto (por ejemplo, unión) con FXII (o FXIIa). Por el contrario, un inhibidor indirecto puede actuar sin ponerse en contacto con la proteína FXII (o FXIIa); por ejemplo, se puede usar un ARN antisentido para disminuir la expresión del gen FXII o una molécula puede inhibir los efectos del FXIIa mediante interacciones directas con compañeros de reacción directos del FXIIa corriente abajo como factor XI, pero no interactúa directamente con la proteína FXII. Por tanto, un inhibidor indirecto, en contraste con un inhibidor directo, actúa corriente arriba o corriente abajo de la proteína FXII. A continuación se presentan algunos ejemplos de inhibidores directos. Los inhibidores de FXII son generalmente inhibidores no endógenos; es decir, no son inhibidores que se producen naturalmente en el cuerpo humano o animal.

A. Infestina-4

En una realización, la solicitud proporciona un inhibidor de FXII que comprende el dominio 4 de Infestina, Infestina-4. En una realización, un inhibidor de FXII comprende una variante de Infestina-4. En otra realización, los inhibidores de FXII comprenden el dominio 4 de Infestina y, opcionalmente, los dominios 1, 2 y/o 3 de Infestina; es sabido que estas proteínas son potentes inhibidores de FXII (véase el documento WO 2008/098720; véase también FEBS Lett.

512-516, 2004). Se proporciona la secuencia polipeptídica de tipo silvestre de Infestina-4 (SEQ ID NÚM.: 2). Como se usa en la presente memoria, el término "variante" se refiere a un polipéptido con una mutación de aminoácido, en el que una "mutación" se define como una sustitución, una supresión o una adición, a la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, en el que tales cambios no alteran la capacidad funcional del polipéptido para inhibir FXII. El término "variante" incluye fragmentos de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre o mutada. A continuación se proporcionan más ejemplos de tales variantes.

En una realización, una variante de Infestina-4 comprende los aminoácidos de extremo N-terminal 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos fuera de los aminoácidos de extremo N-terminal que producen diferencias de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, o seis residuos de cisteína conservados y una homología de al menos 70% con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. Los aminoácidos de extremo N-terminal 2-13 de la secuencia de Infestina-4 pueden ser importantes para la unión a FXII basada en el análisis de los datos estructurales de un inhibidor relacionado Rhodnius prolixus (PDB: 1 TSO) que se une a la trombina y el análisis de unión SPINK-1 a quimotripsina, que comparten una característica común de acumulación de sitios de contacto en la región N-terminal. Por lo tanto, en una realización, una variante de Infestina-4 comprende la región N-terminal conservada de los aminoácidos 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos fuera de estos aminoácidos de extremo N-terminal conservados que producen diferencias de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. Una mutación puede ser una sustitución, una supresión o una adición. Como se usa en la presente memoria, el término "fuera de dichos aminoácidos de extremo N-terminal" se refiere a cualquier aminoácido a lo largo de la cadena polipeptídica de la variante que no sea el tramo contiguo de aminoácidos que comprende la secuencia VRNPCACFRNYV, es decir, los aminoácidos 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En otra realización, una variante de Infestina-4 comprende seis residuos de cisteína conservados y tiene una homología de al menos un 70% con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En una realización, los seis residuos de cisteína conservados son aminoácidos en las posiciones 6, 8, 16, 27, 31 y 48 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En una realización, la variante comprende la cisteína conservada final. En otras realizaciones, las posiciones exactas de los residuos de cisteína, y las posiciones relativas entre sí, pueden cambiar desde las posiciones 6, 8, 16, 27, 31 y 48 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre debido a inserciones o supresiones en la variante de Infestina-4. Sin embargo, en estas realizaciones, una variante de Infestina-4 comprende las seis cisteínas y puede compartir 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de homología con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre.

En realizaciones, una variante de Infestina-4 se caracteriza porque inhibe FXII. La actividad funcional de la inhibición del FXII se puede evaluar, por ejemplo, mediante la caracterización in vitro y/o in vivo, que incluye ensayos directos para probar la inhibición de la actividad de la enzima FXII, tiempo de coagulación prolongado, es decir, tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) o procedimientos in vivo que evalúan la coagulación. Otros ejemplos de variantes de Infestina-4 son mutantes SPINK-1, que se describen a continuación.

B. Mutantes SPINK-1

Una realización implica inhibidores de FXII para uso terapéutico en seres humanos. Puede ser empleada una proteína humana con alta similitud con Infestina-4. Por ejemplo, la proteína humana con la mayor similitud con Infestina-4 es SPINK-1, un inhibidor de serina proteasa tipo Kazal expresado en el páncreas (también conocido como inhibidor de tripsina secretora pancreática, PSTI). La familia de inhibidores de serina proteasa tipo Kazal es una de las numerosas familias de inhibidores de serina proteasa. Se han descrito muchas proteínas de diferentes especies (Laskowski M and Kato I, 49 Ann. Rev. Biochem. 593-626, 1980). Sobre la base de la secuencia de SPINK-1 tipo silvestre, se pueden generar diferentes variantes para aumentar la homología de la secuencia de SPINK-1 con Infestina-4. La frase "homología aumentada con Infestina-4" se refiere al proceso mediante el cual se realizan mutaciones de aminoácidos en SPINK-1 para acercar la secuencia de SPINK-1 a la secuencia de Infestina-4.

En una realización, SPINK-1 está mutada para comprender los aminoácidos de extremo N-terminal 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre; se proporciona la secuencia polipeptídica y se denomina K1. Como se describió anteriormente, se considera que la porción N-terminal de la secuencia de Infestina-4 es importante para la función inhibidora de FXII.

Por lo tanto, en una realización, una variante de SPINK-1 mutada también comprende los aminoácidos de extremo N-terminal 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre, y al menos una y hasta cinco mutaciones de aminoácidos fuera de dicho aminoácidos de extremo N-terminal que producen diferencias con la secuencia de SPINK-1 de tipo silvestre y que aumentan la homología de la variante con la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. En otra realización, una variante de SPINK-1 mutada comprende seis residuos de cisteína conservados y tiene una homología de al menos 70% con la secuencia de SPINK-1 de tipo silvestre. Una mutación puede ser una sustitución, una supresión o una adición. Como se definió anteriormente, el término "fuera de dichos aminoácidos de extremo N-terminal" se refiere a cualquier aminoácido a lo largo de la cadena polipeptídica de la variante que no sea el tramo contiguo de aminoácidos que comprende la secuencia VRNPCAc Fr NYV, es decir, aminoácidos 2-13 de la secuencia de Infestina-4 de tipo silvestre. El término "variante" incluye fragmentos de dicha secuencia SPINK-1 mutada. En una realización, los seis residuos de cisteína conservados pueden ser aminoácidos en las posiciones 9, 16, 24, 35, 38 y 56 de la secuencia SPINK-1 de tipo silvestre. En una realización, la variante comprende la cisteína conservada final. En otra realización, las posiciones exactas de las cisteínas, y las posiciones relativas entre sí, pueden cambiar desde las posiciones 9, 16, 24, 35, 38 y 56 de la secuencia de SPINK-1 de tipo silvestre debido a inserciones o supresiones en la variante de SPINK-1. No obstante, en estas realizaciones, una variante de SPINK-1 comprende las seis cisteínas. En las realizaciones, una variante de SPINK-1 también se caracteriza porque inhibe FXII. Otras variantes de SPINK se describen en el documento EP 2497489A1.

C. Otros inhibidores de FXII

En una realización, son administrados otros inhibidores de FXII a un paciente que recibe un procedimiento médico. Como se analizó anteriormente, el término inhibidores de FXII incluye inhibidores tanto de FXII como de FXIIa. En el documento WO2006/066878 es propuesto el uso de anticuerpos contra FXII o el uso de inhibidores de FXII. Específicamente, los inhibidores del FXII incluyen antitrombina III (ATIII), inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, aprotinina, inhibidor de proteasa alfa-1, antipaína ([(S)-1-Carboxi-2-feniletil]-Carbamoil-L-Arg-L-Val -Arginal), Z-Pro-Proaldehído-dimetil acetato, DX88 (Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA.; citado en: Williams A and Baird LG, 29 Transfus Apheresis Sci. 255-258, 2003) , leupeptina, inhibidores de prolil oligopeptidasa tal como Fmoc-Ala-Pyr-CN, inhibidor de com-tripsina, mutantes del inhibidor de tripsina pancreática bovina, ecotina, proteína anticoagulante de lenguado de aleta amarilla, inhibidor de tripsina de Cucurbita maxima-V, que incluye isoinhibidores de Curcurbita maxima y Hamadarina (según lo descrito en Isawa H et al 277 J. Biol. Chem.

27651-27658, 2002).

En otras realizaciones adicionales, el inhibidor de FXII es H-D-Pro-Phe-Arg-clorometilcetona (PCK). (Tans et al, Eur. J. Biochem. 1987; 164: 637-42; Kleinschnitz et al, J Exp Med. 2006; 203: 513-8.)

El inhibidor de FXII puede ser, por ejemplo, un análogo del dominio inhibidor de proteasa de Kunitz de la proteína precursora de amiloide que se divulga en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.613.890 en las columnas 4 a 8.

En otra realización, el inhibidor de FXII puede ser un anticuerpo anti-FXII que se une a FXII e inhibe la activación y/o actividad de FXII. Tal anticuerpo se ha descrito, por ejemplo, en el documento WO 2006/066878 y en Ravon et al., 1 Blood 4134-43, 1995.

Otros anticuerpos monoclonales (mAb) para FXII humano incluyen el mAb B7C9 descrito por Pixley et al (J Biol Chem 1987; 262, 10140-45), un mAb descrito por Small et al (Blood 1985; 65: 202-10); los mAb F1 y F3 descritos por Nuijens et al (J. Biol. Chem. 1989; 264: 12941-49); los mAb B6F5, C6B7 y D2E10 contra la cadena liviana de FXII descritos en el documento WO89/11865; un mAb que se une selectivamente a FXIIa-p en FXII descrito en el documento WO90/08835; y el anticuerpo OT-2 anti-FXII descrito en el documento WO91/17258.

En el documento WO 2013/014092 son descritos anticuerpos monoclonales anti-FXII/FXIIa preferidos adicionales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Estos anticuerpos tienen una afinidad de unión más de 2 veces mayor al FXIIa-beta humano que al FXII humano y son capaces de inhibir la actividad amidolítica del FXIIa humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno tiene una o más de las siguientes características: (a) se une al FXII/FXIIa murino; (b) comprende una región variable de cadena pesada (VH) que es más de 85% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NÚM.: 7; (c) comprende una región variable de cadena liviana (vL) que es más de 85% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NÚM.: 8; (d) comprende CDR1 de cadena pesada al menos 80% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NÚM.: 9, y/o CDR2 de cadena pesada al menos 60% idéntica a la SEQ ID NÚM.: 10, y/o CDR3 de cadena pesada al menos 80% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NÚM.: 12; (e) comprende CDR1 de cadena liviana al menos 50% idéntica a la SEQ ID NÚM.: 14, y/o CDR2 de cadena liviana de la SeQ ID NÚM.: 15, y/o CDR3 de cadena liviana con la secuencia A-X¹ -W-X²-X³-X⁴-X⁵-R-X⁶-X⁷ en el que X ¹ puede ser A o S, X⁵ puede ser L o V, las otras X ⁿ pueden ser cualquier aminoácido (SEQ ID NÚM.: 17); (f) se une a FXIIa-beta humano con una Kd mejor que 10^{' 8}M; (g) compite dentro de festina-4, por la unión a FXIIa-beta humano; o (h) es una IgG humana o variante de la misma, preferentemente IgG4 humana o variante de la misma.

En otras realizaciones, el anticuerpo anti-FXII es un anticuerpo IgG que se une a FXII humana y comprende (a) una región VH que comprende CDR1 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NÚM.: 9, CDR2 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NÚM.: 11, and CDR3 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NÚM.: 13; y/o (b) una región VL que comprende CDR1 de cadena liviana como se expone en la SEQ ID NÚM.: 14, CDR2 de cadena liviana como se expone en la SEQ ID NÚM.: 15, and CDR3 de cadena liviana como se expone en la SEQ ID NÚM.: 17. A CDR2 de cadena pesada que comprende SEQ ID NÚM.: 11 comprende la secuencia GIX¹X²X³X⁴X⁵X⁶TVYADSVKG, en la que X¹ es R, N o D, X² es P, V, I, o M; X³ es S, P, o A; X⁴ es G, L, V, o T; X⁵ puede ser cualquier aminoácido, preferentemente X⁵ es G, Y, Q, K, R, N, o M; y X⁶ es T, G, o S. Una CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ iD NÚM.: 13 comprende la secuencia ALPRSGYLXX2X3X4YYYYALDV, en la que X ¹ es I, M o V; X² es S o K; X³ es P, K, T, o H; y X⁴ es H, N, G, o Q. Una CDR3 de cadena liviana que comprende SEQ ID NÚM.: 17 comprende la secuencia AX¹WX²X³X⁴X⁵RX⁶X⁷ , en la que X ¹ es A o S; X² es D, Y, E, T, W, E, o S,; X³ es A, N, I, L, V, P, Q, o E; X⁴ es S, D, P, E, Q, o R; X⁵ es L o V; X⁶ es G, L, o K; y X⁷ es V, A, D, T, M, o G.

En otras realizaciones, el fragmento de unión al antígeno del anticuerpo anti-FXII es un fragmento de un anticuerpo IgG que se une a FXII humano y comprende (a) una región VH que comprende la CDR1 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NÚM.: 9, CDR2 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NÚM.: 10, y CDR3 de cadena pesada como se expone en la SEQ ID NÚM.: 12; y/o (b) una región VL que comprende CDR1 de cadena liviana como se expone en la s Eq ID NÚM.: 14, CDR2 de cadena liviana como se expone en la SEQ ID NÚM.: 15, y CDR3 de cadena liviana como se expone en la SEQ ID NÚM.: 16.

En una realización, el anticuerpo anti-FXII o fragmento de unión al antígeno del mismo es el anticuerpo "3F7" usado en el Ejemplo 3. Las secuencias de las regiones variables y las CDR de 3F7 se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1

En aún otras realizaciones, el anticuerpo anti-FXII o fragmento de unión al antígeno es seleccionado de los anticuerpos madurados por afinidad (con respecto a 3F7) VR115, VR112, VR24, VR110, VR119.

Tabla 2

Como se indicó anteriormente la SEQ ID NÚM.: 11 es una secuencia degenerada. VR119 comprende la SEQ ID NÚM.: 11 en la que X1 es N, X2 es V, X3 es P; X4 es L, X5 es Y; y Xa es G. VR112 comprende la SEQ ID NÚM.: 11 en la que X1 es N, X2 es V, X3 es P, X4 es V, X5 es Q, y X6 es G. VR115 comprende la SeQ ID NÚM.: 11 en la que X1 es D, X2 es I, X3 es P, X4 es T, X5 es K, y X6 es G. VR110 comprende la SEQ ID NÚM.: 11 en la que X1 es D, X2 es M, X3 es P, X4 es T, X5 es K, y Xa es G. VR24 comprende un LCDR1 único: SGSSEMTVHHYVY (SEQ ID NÚM.: 18). En realizaciones que implican CDR de anticuerpos, las CDR se definen de acuerdo con el sistema de numeración KABAT. (Kabat eA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th edn. U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Bethesda, MD.).

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo monoclonal anti-FXII/FXIIa o un fragmento de unión a antígeno del mismo que inhibe FXIIa-alfa en más del 40%, más del 50%, o más del 60%, cuando se usa en una relación molar de FXIIa-alfa a anticuerpo de 1: 0,2. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inhibe FXIIa-alfa en más del 80%, más del 85% o más del 90%, en una relación molar de FXIIa-alfa a anticuerpo de 1: 0,5. En una realización, el anticuerpo logra la inhibición completa de FXIIa-alfa en una relación molar de 1: 0,5. En una realización, el FXIIa-alfa es el FXIIa-alfa humano. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una afinidad por el FXIIa humano que es al menos comparable con el anticuerpo 3F7.

Como se discutió anteriormente, un "anticuerpo anti-FXII" incluye anticuerpos que se unen e inhiben uno o ambos de FXII y FXIIa. En una realización, el anticuerpo puede estar en forma de una Ig de longitud completa, Fab, F(ab)² , Fv, scFv u otra forma o variante de los mismos. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo se puede caracterizar porque el isotipo es IgM, IgD, IgA, IgG o IgE, o cualquier subclase de los mismos, tal como IgG1, o variantes de los mismos. El anticuerpo puede ser de una especie de mamífero, que incluye, pero sin limitación ser humano, ratón, rata, conejo, cabra, hámster o mono. El anticuerpo puede estar humanizado o injertado con CDR. El anticuerpo puede estar mutado o modificado para alterar la inmunogenicidad, la vida media o para impartir otras propiedades ventajosas asociadas con un anticuerpo terapéutico. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-FXII que se une a un epítopo en la cadena pesada o cadena ligera de FXII (en el que, "FXII" incluye FXII y FXIIa), tal como un epítopo neutralizante. El anticuerpo puede tener una alta afinidad y/o una alta avidez por unirse a FXII. El anticuerpo se puede conjugar con un polipéptido, ácido nucleico o molécula pequeña.

D. Inhibidores de FXII ligados a restos que extienden la vida media

Polipéptidos

Otro aspecto de la divulgación proporciona inhibidores de FXII unidos a un polipéptido potenciador de la vida media (HLEP). Por ejemplo, en una realización, los inhibidores de FXII están unidos a proteínas que extienden la vida media. Un "polipéptido potenciador de la vida media" aumenta la vida media del inhibidor de FXII in vivo en un paciente o en un animal. Por ejemplo, la albúmina y las inmunoglobulinas y sus fragmentos o derivados se han descrito como polipéptidos potenciadores de la vida media (HLEP). Ballance et al (WO 2001/79271) describieron polipéptidos de fusión de una multitud de polipéptidos terapéuticos diferentes que, cuando se fusionan con albúmina sérica humana, se predice que tienen una vida media funcional aumentada in vivo y una vida útil prolongada. Las realizaciones relacionadas con inhibidores de FXII unidos a polipéptidos potenciadores de la vida media descritas en el documento EP 2497489 A1 se pueden usare de acuerdo con la presente divulgación.

E. Ligadores

En una realización, puede ser introducido un ligador peptídico intermedio entre el polipéptido terapéutico y e1HLEP. En una realización, es introducido un ligador escindible, particularmente si e1HLEP interfiere en la actividad específica del polipéptido terapéutico, por ejemplo, mediante el impedimento estérico. En determinadas realizaciones, el ligador es escindido por enzimas tal como proteasas de coagulación de la vía de coagulación intrínseca, extrínseca o común. Las proteasas de coagulación de la vía intrínseca son proteasas en la vía de activación por contacto, que incluyen, por ejemplo, FXIIa, FXIa o FIXa. En una realización, el ligador es escindido por FXIIa. Las proteasas de la vía extrínseca incluyen proteasas en la vía del factor tisular, por ejemplo, FVIIa. Las proteasas de la vía común incluyen proteasas implicadas en la conversión de fibrinógeno en fibrina, por ejemplo, FXa, FIIa y FXIIIa.

Combinaciones/Kits

Otro aspecto de la invención es la combinación de C1INH con agentes. Preferentemente, el C1INH puede ser administrado en combinación con glicosaminoglicanos sintéticos o naturales, tal como, por ejemplo, heparina, N-acetilheparina, heparan sulfato, dextran sulfatos, dermatan sulfatos y condroitín sulfatos que se sabe que potencian la actividad de C1INH. Además, el C1INH puede ser combinado con otras sustancias que incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas intravenosas, antitrombina III, alfa1 antitripsina o inhibidor de FXII, para mejorar el efecto terapéutico. Estas sustancias se pueden administrar como terapia combinada o politerapia. Por lo tanto, los kits que comprenden C1INH y una o más de las sustancias mencionadas anteriormente, para el uso en la prevención y/o el tratamiento de la IRI remota, que incluyen instrucciones para la administración, también son aspectos de la invención. Por tanto, una realización de la invención es un kit de partes que comprende C1INH y al menos otra sustancia como se enumera anteriormente para el uso simultáneo, separado o secuencial en la prevención y/o tratamiento de una IRI remota.

Administración

El inhibidor de sistema de activación de contacto, descrito en la presente memoria, es administrado preferentemente como parte de una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de sistema de activación de contacto y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede ser administrada fácilmente por vía parenteral tal como, por ejemplo, por aplicación intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intranasal, intrapulmonal, dérmica o subcutánea. La administración parenteral puede ser lograda mediante la incorporación de las composiciones de la presente invención en una solución, emulsión o suspensión.

Preferentemente, la composición que comprende el inhibidor de sistema de activación de contacto es administrado por vía intravenosa, intraarterial o subcutánea mediante inyección en bolo única o múltiple y/o infusión o infusiones continuas durante un cierto período de tiempo.

Alternativamente, la composición farmacéutica puede ser administrada por vía enteral, tal como, por ejemplo, por aplicación oral o rectal.

La dosis de C1INH a administrar al individuo varía de 1 a 5000 IU/kg de peso corporal. Preferentemente, la dosis está dentro del rango de 1 a 2500 IU/kg, más preferentemente de 1 a 500 IU/kg, incluso más preferentemente de 10 a 500 IU/kg de peso corporal. Con máxima preferencia, la dosis varía de 10 IU/kg a 250 IU/kg de peso corporal, o incluso de 20 IU/kg a 100 IU/kg de peso corporal. El experto en la técnica será consciente de la necesidad de ajustar la dosis en función de varios factores, tal como la vía de administración.

El intervalo de dosis de inhibidores de FXII se ajusta de acuerdo con el tipo de inhibidor usado, la vía de administración y otros factores que el experto conocerá bien. La dosis y el intervalo de dosificación son seleccionados preferentemente de modo que la actividad amidolítica de FXIIa sea inhibida completamente durante el período de tratamiento deseado. Por ejemplo, un anticuerpo inhibidor de FXII puede ser administrado en una dosis que oscila de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0,01 a 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 30 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 10 mg/kg. , de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg, de aproximadamente 1 a 5 mg/kg, de aproximadamente 0,1 a 2 mg/kg o de aproximadamente 0,1 a 1 mg/kg. El tratamiento puede comprender administrar una dosis única o múltiples dosis. Si se requieren dosis múltiples, pueden ser administradas diariamente, en días alternos, semanalmente, quincenalmente, mensualmente o bimestralmente o según sea necesario. También puede ser usada una deposición que libere lenta y continuamente el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Una dosis terapéuticamente eficaz puede ser una dosis que inhibe FXIIa en el sujeto en al menos 50%, preferentemente en al menos 60%, 70%, 80%, 90%, más preferentemente en al menos 95%, 99% o incluso 100%.

En el caso de un inhibidor de FXII basado en infestina, por ejemplo, Infestina-4 fusionada con albúmina, la dosis puede estar entre 0,1 y 1000 mg/kg de peso corporal, preferentemente entre 1 y 1000 mg/kg, más preferentemente entre 1 y 500 mg/kg, incluso más preferentemente entre 50 y 500 mg/kg .

Para estos y otros inhibidores de FXII, El experto en la técnica podrá ajustar la dosis según lo requiera el tratamiento y conocerá los factores que influyen en la dosis requerida, tal como la vía de administración, vida media del inhibidor, actividad inhibidora del inhibidor, afinidad por el FXIIa del inhibidor y similares.

Para el tratamiento de IRI remota o distante causada por intervenciones terapéuticas, tal como procedimientos quirúrgicos, es preferente que el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, se administre a un individuo que se somete a tratamiento antes de la intervención quirúrgica (por ejemplo, cirugía de extremidades, cirugía cardíaca, trasplante de órganos, etc.). En un aspecto, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado por tanto al individuo antes del inicio de una intervención quirúrgica.

El inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, puede ser administrado al paciente dentro de una semana, 6 días, 5 días, 4 días, o 72 horas, preferentemente dentro de 48 horas, más preferentemente dentro de 24 horas antes del inicio de la intervención quirúrgica, incluso más preferentemente dentro de 12 horas, con máxima preferencia dentro de 6 horas antes del inicio de la intervención quirúrgica.

Por ejemplo, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, puede ser administrado a un individuo sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 48 horas o aproximadamente 72 horas antes de la intervención quirúrgica. El inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, también se puede administrar a un individuo sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 45 minutos antes de la intervención terapéutica.

Alternativamente, o además, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, puede ser administrado a un individuo sometido a tratamiento en el momento, o durante la intervención quirúrgica. En otra realización, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, por lo tanto es administrado al paciente durante la intervención quirúrgica. Por ejemplo, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, se puede administrar una o más veces durante el curso de una intervención quirúrgica en intervalos (por ejemplo, intervalos de 15 minutos). Alternativamente, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, se puede administrar continuamente a lo largo de la duración de una intervención terapéutica.

Además, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, puede ser administrado a un individuo sometido a tratamiento después de una intervención quirúrgica. En aún otra realización, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado al paciente después de la terminación de la intervención quirúrgica, preferentemente dentro de un período de 72 horas después de la terminación de la intervención quirúrgica. Por ejemplo, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, puede ser administrado a un sujeto sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 24 horas, o aproximadamente 48 horas después de la intervención quirúrgica. El inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, también puede ser administrado a un sujeto sometido a tratamiento, por ejemplo, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos o aproximadamente 45 minutos después de la intervención quirúrgica. Preferentemente, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado lo antes posible después de la intervención quirúrgica, y el tratamiento se mantiene durante al menos 24 horas, preferentemente al menos 48 horas, más preferentemente al menos 72 horas después de la intervención quirúrgica o más tiempo si es necesario.

En aún otra realización, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado al paciente durante la intervención quirúrgica y después de la terminación de la intervención quirúrgica.

En una realización adicional, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado al paciente antes del inicio de la intervención quirúrgica, durante la intervención quirúrgica y después de la terminación de la intervención quirúrgica.

En una realización adicional, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado al paciente antes del inicio de la intervención quirúrgica y después de la terminación de la intervención quirúrgica, pero no durante la intervención quirúrgica.

En una realización adicional, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado al paciente antes del inicio de la intervención quirúrgica and durante la intervención quirúrgica, pero no después de la terminación de la intervención quirúrgica.

En una realización adicional, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado antes del inicio de la reperfusión. Preferentemente, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado hasta una semana antes de la reperfusión, hasta 6 días, 5 días, 4 días, preferentemente hasta 72 horas, más preferentemente hasta 48 horas, incluso más preferentemente hasta 24 horas, hasta 12 horas, con máxima preferencia hasta 6 horas antes de la reperfusión.

En una realización adicional más, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado después del inicio de la reperfusión. Preferentemente, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INh o FXII, es administrado hasta 72 horas después del inicio de la reperfusión, más preferentemente hasta 48 horas, hasta 12 horas, incluso más preferentemente hasta 6 horas, con máxima preferencia inmediatamente después del inicio de la reperfusión.

En una realización preferente, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado antes del inicio de la reperfusión y después del inicio de la reperfusión. Preferentemente, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado hasta una semana antes de la reperfusión, hasta 6 días, 5 días, 4 días, preferentemente hasta 72 horas, más preferentemente hasta 48 horas, incluso más preferentemente hasta 24 horas, hasta 12 horas, con máxima preferencia hasta 6 horas antes de la reperfusión, y el tratamiento luego se mantiene durante un período después del inicio de la reperfusión, preferentemente al menos durante 72 horas, más preferentemente durante al menos 4 días, incluso más preferentemente durante al menos una semana, con máxima preferencia durante 2 semanas o más si es necesario.

En una realización específica, el inhibidor de sistema de activación de contacto, preferentemente el inhibidor de C1INH o FXII, es administrado al paciente durante menor de 1 mes, preferentemente durante menos de 14 días, más preferentemente durante menos de 7 días, con máxima preferencia durante menos de 48 horas.

Ejemplos

Materiales y procedimientos

Animales y alojamiento

Todos los Experimentos fueron llevados a cabo bajo los términos de la Ley de Protección Animal de Suiza y fueron aprobados por el comité de ética animal del servicio veterinario cantonal (Cantón de Berna, Suiza). Se mantuvieron ratas Wistar macho (tipo salvaje, instalación para animales interna, Universidad de Berna) a razón de tres por jaula en condiciones de alojamiento estándar con comida y agua ad libitum. Los animales fueron alojados en salas controladas de ambiente termoneutral de 20 ± 2 °C y una humedad interior del 45% al 65% en las que se mantuvo un ritmo circadiano de 12/12 h (en función del horario de invierno). Durante el ciclo de luz, los animales fueron expuestos a una intensidad de 200 lux.

Reactivos

C1INH (Berinert®) y el vehículo (10 mg/ml de glicina, 2,9 mg/ml de citrato de sodio y 8,5 mg/ml de cloruro de sodio) fueron proporcionados por CSL Behring AG (Bern, Switzerland). C1INH fue administrado en forma de bolo a través de la vena de la cola usando una cánula I.V. (BD Vasculon Plus) 5 minutos antes de la inducción de isquemia.

El inhibidor de FXIIa rHA-Infestina-4 (Hagedorn et al, 2010, Circulation 121: 1510-1517) es administrado como un bolo a través de la vena de la cola a una dosis de 100 mg/kg 5 minutos antes de la inducción de la isquemia.

Procedimiento quirúrgico

Fueron utilizadas ratas Wistar macho que pesan entre 250 y 350 g para los siguientes experimentos. La inducción de la anestesia fue realizada con isoflurano 2,5% en oxígeno en una cámara de inducción anestésica y luego se mantuvo mediante inhalación de isoflurano 1,5% a través de una máscara nasal. Para evaluar la perfusión de las extremidades, se retiró completamente el pelaje de ambas extremidades traseras con una afeitadora eléctrica. Las ratas se mantuvieron sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal a 37 °C. Aproximadamente, treinta minutos después de la inducción de la anestesia, se indujo isquemia unilateral de la extremidad trasera durante 3 horas. La isquemia se indujo mediante el pinzamiento de la arteria femoral. Por lo tanto, se realizó una incisión en el área de la ingle, se extrajo cuidadosamente el tejido graso y se expusieron los vasos femorales. A continuación, se aisló la arteria femoral de la vena.

Antes de pinzar la arteria fue colocado un torniquete (peso estandarizado de 450 g) debajo de los vasos femorales según lo descrito anteriormente (8). La arteria femoral fue ocluida transitoriamente con dos pinzas microvasculares (B1-V, S&T Switzerland). Inmediatamente, el torniquete fue apretado para bloquear el flujo sanguíneo microvascular. Durante el procedimiento completo la hemodinámica fue controlada (Mouse ox plus, Starlifesciences). Después de 3 horas de isquemia, la extremidad fue reperfundida durante 24 horas, respectivamente. Durante 24 horas, las ratas de reperfusión fueron despertadas y tratadas con analgesia (Buprenorfina, 0,05 mg/kg, Temgesic Reckitt Benckiser (Switzerland AG)). Al final del experimento, se tomaron para análisis el pulmón, así como los músculos gastrocnemios isquémicos y contralaterales.

Evaluación de formación de edema

Para evaluar la formación de edema fueron tomadas dos muestras del músculo gastrocnemio de ambas piernas y pesadas inmediatamente para obtener el peso húmedo. Las muestras de músculo o pulmones fueron secadas durante 24 horas a 80 °C hasta que se pudo lograr un peso constante. En una segunda etapa de pesada fue obtenido el peso seco. Posteriormente, fue calculada la relación de peso húmedo a peso seco y se comparó con la relación de peso húmedo a seco del músculo de control contralateral.

Determinación de componentes de complemento depositados y otras proteínas en tejido de músculo y pulmón

Fue utilizada inmunofluorescencia (IF) para cuantificar la deposición de varios componentes del sistema del complemento, así como fibrina/fibrinógeno, heparan sulfato, receptor de bradiquinina B1 y receptor de bradiquinina B2. Fueron tomadas muestras de tejido del músculo gastrocnemio de ambas piernas y del pulmón, lavadas en PBS, secadas e incrustadas en una matriz (OCT, Tissue tek) sobre hielo seco. Inmediatamente, las muestras fueron almacenadas a -20 °C hasta que las criosecciones fueron cortadas (Cryostat, Leica CM 3050S). Las secciones fueron fijadas con acetona y rehidratadas en TBS. Los anticuerpos primarios fueron incubados durante la noche a 4 °C y los siguientes anticuerpos secundarios fueron incubados durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente, los portaobjetos fueron montados y revestidos. Las fotografías fueron tomadas con el microscopio fluorescente (Leica) y analizadas usando el software Image J.

Medición de citoquina/quimioquina usando la matriz múltiple

Fue utilizado un inmunoensayo múltiple que consiste en perlas magnéticas conjugadas con un anticuerpo de captura específico para una proteína diana para detectar una matriz de citoquinas y quimioquinas (panel Bioplex Pro™ citoquina de ratas Grupo I, BioRad, Hercules, USA). El ensayo fue realizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Brevemente, el plasma fue diluido 1:3 e incubado con perlas magnéticas acopladas a anticuerpos. Una etapa de lavado fue seguida de incubación con anticuerpo de detección biotinilado. Después de la incubación con estreptavidina-ficoeritrina, se midió la concentración de citoquinas/quimioquinas. Se usaron citoquinas/quimioquinas recombinantes para establecer curvas estándares. Las concentraciones de analito fueron calculadas usando el software Bio-Plex Manager 4.0 (Bio-Rad, Hercules, USA).

Evaluación de apoptosis por ensayo TUNEL

La apoptosis fue evaluada mediante el uso de un ensayo de marcación de extremos de muesca dUTP mediado por TdT (TUNEL) (kit de detección de muerte celular in situ, rojo TMR, Roche, Mannheim, Germany). En resumen, fueron fijadas criosecciones de muestras de tejido en acetona durante 5 minutos a temperatura ambiente, fueron lavadas y permeabilizadas con Triton-X-100 0,1% en hielo. Las secciones fueron incubadas con la mezcla de reacción TUNEL durante 1 ha 37 °C en la oscuridad y contrateñidas con DAPI. Después de una etapa de lavado, las secciones fueron montadas, revestidas con cubreobjetos y analizadas con un microscopio fluorescente. Las imágenes de inmunofluorescencia fueron analizadas con la imagen J (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Fue analizada y calculada el área en % cubierta por núcleos positivos a TUNEL en relación con el área cubierta por todos los núcleos teñidos con DAPI.

Análisis estadístico

Los datos son expresados como medias ± SD. La significancia estadística fue determinada mediante un análisis de varianza de una vía con una prueba posterior de Dunnetts usando el software GraphPad Prism 5. Los valores de p <0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados

i) Efecto de C1INH sobre el daño tisular la IRI local

C1INH previno el edema del músculo esquelético inducido por IRI local

Como primera etapa, fue evaluado el efecto terapéutico de C1INH (50 UI/kg) mediante la prevención de la formación de edema local en la extremidad trasera. La precarga sistémica del animal con C1INH derivado de plasma humano previno de manera muy significativa la formación de edema del músculo esquelético (véase Fig. 1A y B). Se esperan resultados similares, es decir, reducción en la formación de edema muscular, usando un inhibidor de FXII, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-FXII o rHA-Infestina-4.

ii) Efectos de C1INH sobre el daño de tejidos y órganos remoto inducido por IRI

C1INH inhibió el daño de órgano remoto mediante la atenuación del edema de pulmón

Fue analizado el efecto de C1INH sobre el daño de órganos y tejidos remotos. C1INH es un inhibidor muy potente del sistema de calicreína-quinina plasmática al interactuar con FXIIa y calicreína. Como se muestra en la Fig. 2, C1INH evitó significativamente la formación de edema según lo analizado por la relación húmedo: seco y, por lo tanto, se conservó la integridad de las células endoteliales en el pulmón.

Efecto de C1INH sobre la expresión de los receptores de bradiquinina en el pulmón y el corazón

La activación del sistema de calicreína-quinina plasmática produce la generación de bradiquinina. Esta molécula es un péptido vasoactivo muy potente que induce vasodilatación y edema. Se ha demostrado que el sistema de calicreínaquinina es un actor crucial de IRI. Un antagonista del receptor de bradiquinina 2 (B2R) ha sido usado con éxito en las clínicas para tratamiento de pacientes con AEH (9). El efecto de C1INH sobre la expresión de B1R y B2R fue analizado mediante IF. Inesperadamente, C1INH inhibió significativamente la regulación al alza inducida por IRI de B1R en tejido pulmonar (véase Fig. 3A) mientras que no se pudo observar inhibición para la expresión de b2r (véase Fig. 3B). Fue observado el mismo efecto en el tejido cardíaco (datos no mostrados).

C1INH inhibió la deposición de fibrina en el pulmón

Además de la inhibición del complemento, C1INH actúa sobre el sistema de coagulación mediante la interacción con FXII y FXI. La activación del sistema de coagulación produce la generación de trombina que escinde el fibrinógeno en fibrina. El tratamiento con C1INH inhibió significativamente la deposición de fibrina en el tejido pulmonar (véase Fig. 4).

C1INH previno el daño de tejido remoto en la extremidad contralateral mediante la prevención de la deposición de fibrina

Como se describió anteriormente, no se pudo detectar la formación de edema en la extremidad contralateral no isquémica. Sorprendentemente, se pudo observar la deposición de fibrina en la pierna contralateral (véase Fig. 5). Como se observó en el pulmón (véase Fig. 4A), se observa una inhibición significativa de la deposición de fibrina en la extremidad no isquémica por C1INH (véase Fig. 5).

La deposición del complemento se inhibió mediante C1INH en la extremidad contralateral, riñón e hígado

Se analizaron las patas isquémicas y no isquémicas contralaterales para la deposición de fragmentos del complemento como marcadores para la activación del complemento. Como se muestra en la Fig. 6A y B, C1INH redujo significativamente la deposición de C3b (vía clásica y de lectina) así como factor B (vía alternativa de activación del complemento) en la pata reperfundida así como en la contralateral. Además, el tratamiento con C1INH provocó una reducción significativa de la deposición de C3b en el riñón y de la deposición de factor B en el hígado.

El tratamiento con C1INH preservó el glicocáliz endotelial en la extremidad contralateral

Las EC saludables están cubiertas por una capa de glicosaminoglicanos tal como, por ejemplo, heparan sulfato (HS), que es crucial para las propiedades anticoagulantes y antiinflamatorias del endotelio. Los HS son liberados rápidamente en condiciones de inflamación y daño tisular (11-14). Inesperadamente, C1INH evitó el desprendimiento de HS en la extremidad contralateral (véase Fig. 7).

Efecto inhibidor de C1INH sobre la citoquina inflamatoria y la red de quimioquina

Las citoquinas, los factores de crecimiento y las quimioquinas se midieron usando tecnología xMAP en plasma con EDTA tomado en el inicio del estudio, es decir, antes de la inducción de isquemia y en el punto final después de 24 h de reperfusión. El análisis reveló que el tratamiento con C1INH redujo significativamente los niveles de IL-1 a, IL-4, IL-7, IL-17A e IL-18 así como IFN-y, MIP-1a, MIP-3a (véase Tabla 3).

Tabla 3

No se pudieron detectar las siguientes citoquinas: IL-1a, IL-2, IL-6, IL-12p70, IL-13, G-CSF. Los datos se expresan como medias ± SD. La significación estadística se determinó mediante la prueba t de Student usando el software GraphPad Prism 5. Los valores de p <0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Efecto del tratamiento con C1INH sobre la apoptosis en pulmón y corteza renal

La apoptosis se evaluó mediante el ensayo TUNEL. Las células del tejido pulmonar de los animales tratados con vehículo mostraron un alto grado de apoptosis (76 ± 21%). En la corteza de los riñones, en las células epiteliales tubulares proximales, también se observó apoptosis en los animales tratados con vehículo (43 ± 25%). En comparación, los animales tratados con C1INH mostraron una reducción significativa en las células apoptóticas (10 ± 12% en pulmón (P <0,0001) y 7 ± 8% en la corteza renal).

iii) Efectos del inhibidor de FXII rHA-Infestina-4 sobre el daño de tejidos y órganos remotos inducidos por IRI El tratamiento con rHA-Infestina-4 como se describió anteriormente también conduce a una reducción significativa del edema pulmonar y potencialmente también reduce la formación de edema en otros tejidos.

Además, se observa una reducción significativa en la deposición de fibrina en el pulmón (y potencialmente también en otros tejidos).

Se observa un efecto de reducción significativo sobre la apoptosis en el pulmón y otros tejidos después del tratamiento con rHA-Infestina-4. rHA-Infestina-4 también lleva a una reducción en la deposición de IgM y componentes del complemento, y potencialmente también muestra un efecto sobre el red inflamatoria de citoquinas y quimioquinas.

Lista de referencias

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Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso en el tratamiento y/o prevención de lesión por isquemia-reperfusión (IRI) remota, que comprende administrar el inhibidor del sistema de activación por contacto a un individuo, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es un C1INH, en el que el C1INH es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NÚM.:1.

2. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es administrado al individuo en forma parenteral.

3. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es administrado al individuo por vía intravenosa, intraarterial, o subcutánea.

4. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la dosis del C1INH administrada al individuo es de 1 a 1000 UI/kg de peso corporal.

5. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el individuo es un paciente que se ha de someter o se ha sometido a una intervención quirúrgica.

6. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es administrado al paciente dentro de las 6 horas antes del inicio de la intervención quirúrgica o del inicio de la reperfusión.

7. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 o reivindicación 6, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es administrado al paciente antes, y/o durante y/o después, de la intervención quirúrgica o antes y/o después del inicio de la reperfusión.

8. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el inhibidor del sistema de activación por contacto es administrado al paciente dentro de las 72 horas después de la terminación de la intervención quirúrgica o del inicio de la reperfusión.

9. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que la intervención quirúrgica es seleccionada del grupo que consiste en (a) cirugía electiva, cirugía reconstructiva, cirugía vascular, cirugía cardíaca, cirugía de trauma, cirugía de aplastamiento o fractura, cirugía de cáncer, cirugía ortopédica, trasplante, cirugía mínimamente invasiva o (b) después de la aparición de un trastorno trombótico o tromboembólico inicial u otro trastorno inductor de isquemia, inserción de un dispositivo para la administración de sustancias farmacológicamente activas tal como agentes trombolíticos o vasodilatadores y/o para la eliminación mecánica de obstrucciones completas o parciales, e inyección de sustancias farmacéuticamente activas tal como agentes trombolíticos o vasodilatadores.

10. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la reperfusión ocurre espontáneamente o un flujo sanguíneo alterado mejora a través de una intervención diferente a una intervención quirúrgica.

11. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) afecta un órgano o tejido remoto del sitio de la cirugía.

12. El inhibidor del sistema de activación por contacto para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) remota afecta órganos como el pulmón, corazón, cerebro, riñón, intestino, páncreas, hígado o extremidades/miembros.