ES2846848T3 - Polisacáridos reducidos y oxidados y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un polisacárido reducido, en donde dicho polisacárido reducido (a) comprende menos de un 2% de aldehídos residuales; o (b) comprende menos de un 3% de aldehídos residuales; en donde dicho polisacárido reducido se produce haciendo reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol, produciendo de este modo un polisacárido oxidado que contiene aldehídos que comprende 0,1% o más de oxidación en una base molar; continuando con una reacción de dicho polisacárido oxidado con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua para reducir los restos de aldehído presentes en el polisacárido oxidado a restos de alcohol y producir dicho polisacárido reducido; en donde dicho agente reductor específico de aldehído soluble en agua no es borohidruro de sodio; y en donde dicho polisacárido se selecciona a partir del grupo que consiste en alginato, agarosa, pululano, escleroglucano, quitosano, elsinano, goma de xantano, manosa, gelano, levano, celulosa, ácido hialurónico, condroitín sulfato A, condroitín sulfato C, condroitín sulfato E y β-d-glucanos; opcionalmente en donde dicho polisacárido es alginato.

Description

DESCRIPCIÓN
Polisacáridos reducidos y oxidados y métodos de uso de los mismos
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad del documento de solicitud provisional de EE.UU. n° 62/246.462, presentado el 26 de octubre del 2015 y del documento de solicitud provisional de EE.UU. n° 62/351.162, presentado el 16 de junio del 2016.
Antecedentes de la invención
Un hidrogel es un gel polimérico que comprende una red de cadenas poliméricas reticuladas. La estructura reticulada de los hidrogeles les permite absorber cantidades importantes de agua. Algunos hidrogeles son muy estirables y elásticos; otros son viscoelásticos. Los hidrogeles se han utilizado para aplicaciones terapéuticas, p. ej., como vehículos para una administración in vivo de agentes terapéuticos, tales como moléculas pequeñas, células y material biológico.
Los hidrogeles se producen comúnmente a partir de polisacáridos, como alginatos. Los polisacáridos se pueden manipular químicamente para modular sus propiedades y las propiedades de los hidrogeles resultantes. Por ejemplo, oxidar un polisacárido haciéndolo reaccionar con un agente oxidante que convierte los alcoholes del polisacárido en aldehidos, aumenta significativamente la biodegradabilidad del hidrogel resultante. Sin embargo, la oxidación de los polisacáridos también está asociada con efectos secundarios indeseables. Por ejemplo, los aldehídos producidos por oxidación pueden reaccionar con grupos amino presentes en proteínas u otras moléculas, causando toxicidad y/o daño in vivo a los agentes terapéuticos (carga) que pueden estar encapsulados mediante hidrogeles producidos a partir de polisacáridos oxidados. Los aldehidos presentes en un polisacárido oxidado también pueden reaccionar con varios restos químicos que pueden estar presentes en las proximidades del polisacárido, tales como reactivos de química clic, dando como resultado su degradación. Por consiguiente, existe una necesidad en la técnica de polisacáridos biodegradables que se puedan usar para preparar hidrogeles que no sean tóxicos, ni reactivos y sean biodegradables. También existe una necesidad en la técnica de polisacáridos que se puedan usar para preparar hidrogeles con un tamaño de poro lo suficientemente pequeño como para encapsular agentes terapéuticos de pesos moleculares bajos. También existe una necesidad en la técnica de polisacáridos que se puedan usar para preparar hidrogeles capaces de encapsular y retener liposomas y entregar los liposomas en una ubicación deseada in vivo.
El documento de solicitud US20040028745 describe una composición que comprende un alginato oxidado que reacciona con peryodato para preparar un gel, por ejemplo, reticulándolo con un agente de reticulación covalente y para la unión a un fármaco o profármaco.
Compendio de la invención
El alcance de la invención está definido por las reivindicaciones.
La presente invención proporciona composiciones que comprenden ciertos polisacáridos reducidos y ciertos polisacáridos altamente oxidados. Se ha descubierto sorprendentemente que esos polisacáridos reducidos y altamente oxidados son particularmente adecuados para producir hidrogeles que se pueden usar para encapsular agentes terapéuticos o de diagnóstico o para encapsular nanopartículas basadas en lípidos. p. ej., liposomas o virosomas, usadas para encapsular agentes terapéuticos o de diagnóstico, para su administración a un sujeto. Los hidrogeles de la invención producidos usando los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados son biodegradables y menos tóxicos y reactivos que los hidrogeles previamente conocidos en la técnica.
Según la reivindicación 1, la presente invención proporciona una composición que comprende un polisacárido reducido, en donde dicho polisacárido reducido (a) comprende menos del 2% de aldehídos residuales; o (b) comprende menos del 3% de aldehídos residuales; en donde dicho polisacárido reducido se produce haciendo reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol, produciendo de este modo un polisacárido oxidado que contiene aldehído que comprende 0,1% o más de oxidación en una base molar; seguido por una reacción de dicho polisacárido oxidado con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua para reducir los restos de aldehído presentes en el polisacárido oxidado a restos de alcohol y producir dicho polisacárido reducido; en donde dicho agente reductor específico de aldehído soluble en agua no es borohidruro de sodio; y en donde dicho polisacárido se selecciona a partir del grupo que consiste en alginato, agarosa, pululano, escleroglucano, quitosano, elsinano, goma de xantano, manosa, gelano, levano, celulosa, ácido hialurónico, condroitín sulfato A, condroitín sulfato C, condroitín sulfato E y p-d-glucanos; opcionalmente en donde dicho polisacárido es alginato.
La presente invención también proporciona un hidrogel que comprende la composición de la invención y un dispositivo implantable o inyectable que comprende el hidrogel.
La presente invención también proporciona una composición de administración de fármacos que comprende una nanopartícula a base de lípidos que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico; y el hidrogel de la invención que encapsula la nanopartícula a base de lípidos.
La presente invención también proporciona un método para producir la composición de la reivindicación 1, en donde el método comprende las etapas de:
hacer reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehído; y hacer reaccionar dicho polisacárido oxidado que contiene aldehído con un agente reductor soluble en agua específico de aldehído, produciendo de este modo dicho polisacárido reducido que comprende menos del 2% de aldehídos residuales; o que comprende menos del 3% de aldehídos residuales; en donde dicho agente reductor específico de aldehído soluble en agua no es tóxico y/o es un reactivo de Green y no es borohidruro de sodio.
En una realización, el polisacárido reducido comprende algoxinol que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000003_0001
algoxinol.
En algunos aspectos, el agente reductor soluble en agua específico de aldehído se selecciona a partir del grupo que consiste en borohidruro de sodio (NaBH4); cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3); gas hidrógeno (H2) en presencia de un catalizador; borazano (H3NBH3); y un complejo de borano. En una realización específica, el agente reductor soluble en agua específico de aldehído es borazano. En otra realización específica, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio.
En algunas realizaciones, la composición comprende además un agente de reticulación fijado al polisacárido reducido. En algunos aspectos, el agente de reticulación es un reactivo de química clic, p. ej., un reactivo de química clic se selecciona a partir del grupo que consiste en azida, dibenzociclooctina (DBCO), transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona una composición que comprende un polisacárido reducido y un agente de reticulación fijado al polisacárido reducido. En algunos aspectos, el polisacárido es un polímero de alginato. En algunas realizaciones, el polisacárido reducido comprende algoxinol que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000003_0002
algoxinol.
En algunas realizaciones, el polisacárido reducido se produce mediante un método que comprende las etapas de hacer reaccionar el polisacárido con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehído; y hacer reaccionar el polisacárido oxidado con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua para producir el polisacárido reducido.
En algunas realizaciones, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio. En algunas realizaciones, el agente reductor específico de aldehído soluble en agua es borazano.
En algunos aspectos, se proporciona una composición que comprende un polisacárido altamente oxidado y un agente reticulante fijado al polisacárido altamente oxidado. En algunas realizaciones, el polisacárido es un polímero de alginato. En algunos aspectos, el polisacárido altamente oxidado comprende algoxalato que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000004_0001
En algunas realizaciones, el polisacárido altamente oxidado se produce mediante un método que comprende las etapas de hacer reaccionar el polisacárido con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehído; y hacer reaccionar el polisacárido oxidado con un segundo agente oxidante que convierte los aldehídos en ácidos carboxílicos para producir dicho polisacárido altamente oxidado.
En un aspecto, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio. En otro aspecto, el segundo agente oxidante es clorito de sodio.
En algunas realizaciones, el agente de reticulación es un reactivo de química clic, p. ej., un reactivo de química clic seleccionado a partir del grupo que consiste en azida, dibenzociclooctina (DBCO), transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona un hidrogel que comprende las composiciones de la invención.
En algunos aspectos, el hidrogel puede comprender además un agente terapéutico, p. ej., seleccionado a partir del grupo que consiste en una célula, una molécula pequeña y un material biológico. En algunas realizaciones, el material biológico se selecciona a partir del grupo que consiste en un péptido, una molécula de ADN, una molécula de ARN y una molécula de PNA. En una realización, el material biológico es un péptido, p. ej., un factor de angiogénesis, p. ej., seleccionado a partir del grupo que consiste en FGF, VEGF, VEGFR, IGF, NRP-1, Ang1, Ang2, PDGF, PDGFR, TGF-p, endoglina, un receptor de TGF-p, MCP-1, integrina, VE-cadherina, CD31, efrina, activador del plasminógeno, inhibidor 1 del activador del plasminógeno, eNOS, COX-2, AC133, ID1, ID3 y HGF. En un aspecto específico, el factor de angiogénesis es VEGF.
En algunas realizaciones, el hidrogel de la invención comprende además una célula, p. ej., una célula de mamífero, tal como una célula madre mesenquimática humana (hMSC).
En algunos aspectos, la presente invención proporciona un hidrogel que comprende una pluralidad de polisacáridos reducidos y/u oxidados reticulados entre sí, en donde el hidrogel comprende un tamaño de malla de aproximadamente 10 nm o menos, por ejemplo, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 9 nm, aproximadamente 8 nm, aproximadamente 7 nm, aproximadamente 6 nm, aproximadamente 5 nm, aproximadamente 4 nm, aproximadamente 3 nm, aproximadamente 2 nm o aproximadamente 1 nm o menos.
En algunas realizaciones, los polisacáridos oxidados son polímeros de alginato altamente oxidados. En algunas realizaciones, los polímeros de alginato altamente oxidados se producen mediante un método que comprende las etapas de hacer reaccionar un alginato con un agente oxidante específico de diol para producir un alginato oxidado que contiene aldehídos; y hacer reaccionar el alginato oxidado que contiene aldehídos con un segundo agente oxidante que convierte los aldehídos en ácidos carboxílicos, produciendo de este modo dichos polímeros de alginato altamente oxidados.
En una realización, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio. En otra realización, el segundo agente oxidante es clorito de sodio.
En algunas realizaciones, los polímeros de alginato oxidados están oxidados aproximadamente un 0,1% 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99%. En algunas realizaciones, los polisacáridos reducidos son polímeros de alginato reducidos. En algunas realizaciones, los polímeros de alginato reducidos se producen mediante un método que comprende las etapas de hacer reaccionar un alginato con un agente oxidante específico de diol para producir un alginato oxidado que contiene aldehídos; y hacer reaccionar el alginato oxidado que contiene aldehídos con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua, produciendo de este modo dichos polímeros de alginato reducido.
En una realización, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio. En otra realización, el agente reductor específico de aldehído soluble en agua es borazano.
En algunos aspectos, el hidrogel de la invención comprende un tamaño de malla promedio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 4 nm, de aproximadamente 7 nm a aproximadamente 3 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 2 nm o de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 0,5 nm.
En algunos aspectos, el hidrogel de la invención comprende además un agente terapéutico o de diagnóstico, p. ej., una célula, una molécula pequeña y un material biológico. En algunos aspectos, el material biológico se selecciona a partir del grupo que consiste en un péptido, una molécula de ADN, una molécula de ARN y una molécula de PNA. En algunas realizaciones, el material biológico es un péptido. En algunas realizaciones, el péptido tiene un peso molecular de 500 kDa o menos, por ejemplo, aproximadamente 450 kDa o menos, aproximadamente 300 kDa o menos, aproximadamente 150 kDa o menos, aproximadamente 100 kDa o menos, aproximadamente 50 kDa o menos, aproximadamente 25 kDa o menos o aproximadamente 10 kDa o menos.
En algunos aspectos, el péptido es un factor de angiogénesis, p. ej., FGF, VEGF, VEGFR, NRP-1, Ang1, Ang2, PDGF, PDGFR, IGF, TGF-p, endoglina, un receptor de TGF-p, MCP-1, integrina, un ligando de integrina, VE-cadherina, CD31, efrina, activador del plasminógeno, inhibidor 1 del activador del plasminógeno, eNOS, COX-2, AC133, ID1, ID3 y HGF. En una realización específica, el factor de angiogénesis es VEGF.
En algunas realizaciones, la célula es una célula de mamífero, p. ej., una célula madre mesenquimática humana (hMSC).
En algunas realizaciones, los polisacáridos comprenden un agente de reticulación fijado a los polisacáridos. En algunos aspectos, el agente de reticulación es un reactivo de química clic, p. ej., azida, dibenzociclooctina, transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona un dispositivo implantable o inyectable que comprende el hidrogel de la invención.
En algunos aspectos, la presente invención también proporciona un método para producir un polisacárido reducido, comprendiendo el método las etapas de hacer reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehído; y hacer reaccionar el polisacárido oxidado que contiene aldehído con un agente reductor soluble en agua específico de aldehído, produciendo de este modo el polisacárido reducido.
En algunas realizaciones, el agente reductor soluble en agua específico de aldehído es borohidruro de sodio (NaBH4); cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3); gas hidrógeno (H2) en presencia de un catalizador, p. ej., un catalizador de níquel (Ni), platino (PI) o paladio (Pd); borazano (H3NBH3); o un complejo de borano, p. ej., un complejo de biscarbonato borano ([(b H3)2CO2]2- • 2Na+), un complejo de borano dimetilamina [(CH3)2NH • BH3]; un complejo de terc-butilamina borano [(CH3)3CNH2 • BH3]; o un complejo de borano-pirimidina. En una realización específica, el agente reductor soluble en agua específico de aldehído es borazano. En otra realización específica, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio.
En algunas realizaciones, el método comprende además hacer reaccionar dicho polisacárido con un agente de reticulación. En algunos aspectos, el reactivo de reticulación es un reactivo de química clic, p. ej., azida, dibenzociclooctina (DBCO), transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos. En una realización específica, el polisacárido es un polímero de alginato. En una realización, el polímero de alginato tiene un peso molecular inferior a 500 kDa. En una realización, el polisacárido reducido comprende algoxinol que tiene la siguiente estructura:
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algoxinol.
En algunos aspectos, la presente invención también proporciona un método para producir un polisacárido altamente oxidado fijado covalentemente a un agente de reticulación, comprendiendo el método las etapas de hacer reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehído; hacer reaccionar el polisacárido oxidado que contiene aldehído con un segundo agente oxidante que convierte los aldehídos en ácidos carboxílicos, produciendo de ese modo el polisacárido altamente oxidado; y hacer reaccionar el polisacárido con un agente de reticulación.
En algunos aspectos, el segundo agente oxidante se selecciona a partir del grupo que consiste en clorito de sodio, bromo, ácido nítrico diluido (NHO3), óxido de plata, un complejo de cobre(II), permanganato de potasio (KMnO4) y peróxido de hidrógeno (H2O2). En una realización específica, el segundo agente oxidante es clorito de sodio.
En algunas realizaciones, el agente de reticulación es un reactivo de química clic, p. ej., azida, dibenzociclooctina (DBCO), transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos.
En algunos aspectos, el polisacárido es un polímero de alginato. En un aspecto, el polímero de alginato tiene un peso molecular de menos de 500 kDa.
En una realización, el polímero altamente oxidado comprende algoxalato que tiene la siguiente estructura:
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La presente invención también proporciona una composición de administración de fármacos que comprende una nanopartícula a base de lípidos que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico; y el hidrogel de la invención que encapsula la nanopartícula a base de lípidos. En una realización, la nanopartícula a base de lípidos es un liposoma o un virosoma.
En algunas realizaciones, la nanopartícula a base de lípidos permanece encapsulada en el hidrogel durante al menos 1 día, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días o al menos 80 días.
En algunos aspectos, el agente terapéutico o de diagnóstico se selecciona a partir del grupo que consiste en una célula, una molécula pequeña y un material biológico. En algunos aspectos, el material biológico se selecciona a partir del grupo que consiste en un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, una vacuna, una molécula de ADN, una molécula de ARN y una molécula de PNA. En algunos aspectos, el agente terapéutico o de diagnóstico se selecciona a partir del grupo que consiste en un adyuvante de STING, un reactivo de CRISPR-Cas 9 y una vesícula subcelular cargada con adyuvante obtenida a partir de células cancerosas rotas. En algunos aspectos, el agente terapéutico o de diagnóstico es una vacuna.
En algunos aspectos, la presente invención también proporciona una composición de administración de fármacos, que comprende una nanopartícula a base de lípidos que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico; y un hidrogel polimérico conjugado por química clic que encapsula la nanopartícula a base de lípidos, en donde el hidrogel polimérico conjugado por química clic comprende un polímero biodegradable; y en donde el polímero no es susceptible de una degradación con una enzima endógena del hospedador. En una realización, la nanopartícula a base de lípidos es un liposoma o un virosoma.
En algunas realizaciones, la composición de administración de fármacos permite una liberación sostenida de nanopartículas intactas basadas en lípidos en una ubicación deseada en el hospedador.
En algunas realizaciones, el polisacárido se selecciona a partir del grupo que consiste en alginato, agarosa, pululano, escleroglucano, quitosano, elsinano, goma de xantano, dextrano, manosa, gelano, levano, celulosa, ácido hialurónico, condroitín sulfato A, condroitín sulfato C, condroitín sulfato E y p-d-glucanos. En una realización específica, el polisacárido es alginato.
En algunos aspectos, el hidrogel polimérico conjugado por química clic se genera mediante el uso de al menos un reactivo de química clic seleccionado a partir del grupo que consiste en azida, dibenzociclooctina, transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, el alginato comprende un grado de sustitución por química clic de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 99%, p. ej., de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,05%, de aproximadamente 0,02% a aproximadamente 0,1%, de aproximadamente 0,05% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 1%, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 80% o de aproximadamente 60% a aproximadamente 99%. En algunos aspectos, el hidrogel de polímero conjugado por química clic comprende alginato que está oxidado de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 99%, por ejemplo, oxidado de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,2% a aproximadamente 1%, de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 25% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 80% o de aproximadamente 75% a aproximadamente 99%.
En algunos aspectos, el hidrogel de alginato conjugado por química clic se ha preparado a partir de alginato presente con una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 99% de p/v, por ejemplo, de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 2% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 80% o de aproximadamente 75% a aproximadamente 99% de p/v. En algunas realizaciones, la nanopartícula a base de lípidos permanece encapsulada en el hidrogel de polímero conjugado por química clic durante al menos 1 día, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días o al menos 80 días.
En algunos aspectos, la presente invención también proporciona una composición de administración de fármacos, que comprende una nanopartícula a base de lípidos que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico; y un hidrogel de alginato que encapsula la nanopartícula a base de lípidos, en donde el hidrogel comprende alginato que comprende aproximadamente el 50% o menos de oxidación sobre una base molar, por ejemplo, aproximadamente el 45% o menos, aproximadamente el 40% o menos, aproximadamente el 35% o menos, aproximadamente el 30% o menos, aproximadamente el 25% o menos, aproximadamente el 20% o menos, aproximadamente el 15% o menos, aproximadamente el 10% o menos, aproximadamente el 5% o menos, aproximadamente el 1% o menos, aproximadamente el 0,5% o menos o aproximadamente el 0,1% o menos. En una realización, la nanopartícula a base de lípidos es un liposoma o un virosoma. En un aspecto, la composición permite una liberación sostenida de la nanopartícula intacta a base de lípidos en una ubicación deseada en un hospedador.
En algunos aspectos, el hidrogel polimérico conjugado por química clic se genera mediante el uso de al menos un reactivo de química clic seleccionado a partir del grupo que consiste en azida, dibenzociclooctina, transcicloocteno, tetrazina y norborneno y variantes de los mismos. En algunos aspectos, el alginato se conjuga con un reactivo de química clic y el alginato comprende un grado de sustitución por química clic de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 90%.
En algunos aspectos, el hidrogel de polímero conjugado por química clic comprende alginato que está oxidado de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 99%.
En algunas realizaciones, el hidrogel de alginato se ha preparado a partir de alginato presente en una concentración de aproximadamente 1% a aproximadamente 80% de p/v. En algunas realizaciones, la nanopartícula a base de lípidos permanece encapsulada en el hidrogel durante al menos 1 día, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días o al menos 80 días. En algunos aspectos, el agente terapéutico o de diagnóstico se selecciona a partir del grupo que consiste en una célula, una molécula pequeña y un material biológico. En algunas realizaciones, el material biológico se selecciona a partir del grupo que consiste en un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, una vacuna, una molécula de ADN, una molécula de ARN y una molécula de PNA. En algunas realizaciones, la molécula de ARN se selecciona a partir del grupo que consiste en un ARNm, un ARNi, un ARNsi, un ARNsh, un microARN, un ARNis, un ARNInc y un ARN antisentido.
En algunos aspectos, el agente terapéutico o de diagnóstico se selecciona a partir del grupo que consiste en un adyuvante de STING, un reactivo de CRISPR-Cas 9 y una vesícula subcelular cargada con adyuvante obtenida a partir de células cancerosas rotas.
En algunas realizaciones, el liposoma es un liposoma catiónico. En algunos aspectos, la ubicación deseada es el citosol de una célula.
En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz del hidrogel, el dispositivo implantable o inyectable o la composición de administración de fármacos de la invención, tratando de este modo a dicho sujeto. En algunos aspectos, el sujeto padece una enfermedad o una afección seleccionada a partir del grupo que consiste en isquemia, un trastorno relacionado con los ojos o un trastorno relacionado con el oído.
En algunas realizaciones, la presente invención también proporciona un método para tratar una isquemia crónica o potenciar el injerto de un tejido trasplantado en un sujeto que lo necesita, en donde el método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz del hidrogel, el dispositivo implantable o inyectable o la composición de administración de fármacos de la invención, tratando de este modo dicha isquemia crónica o mejorando el injerto de dicho tejido trasplantado en dicho sujeto.
En algunos aspectos, el hidrogel o el dispositivo implantable o inyectable o la composición de administración de fármacos se administra localmente, p. ej., en un sitio de isquemia o en el tejido que se va a injertar antes y/o después del trasplante.
En algunos aspectos, el hidrogel o el dispositivo implantable o inyectable o la composición de administración de fármacos comprende un péptido en una dosis que es al menos aproximadamente 10 veces menor, p. ej., aproximadamente 15 veces menor, aproximadamente 20 veces menor, aproximadamente 50 veces menor, que la dosis recomendada para dicho péptido cuando dicho péptido se administra en forma soluble.
En un aspecto específico, el péptido es VEGF e IGF. En una realización, el sujeto es un ser humano.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante la siguiente descripción detallada y los dibujos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1a es un esquema que muestra la conjugación del reactivo de química clic con el alginato no oxidado.
La Figura 1b es un esquema que muestra la conjugación del reactivo de química clic con el alginato oxidado, ilustrando la formación de un enlace imina inestable (hidrolizable), que es perjudicial para una reticulación covalente adicional por química clic.
La Figura 1c es un esquema que muestra la conjugación del reactivo de química clic con alginato altamente oxidado, ilustrando los grupos de ácido carboxílico adicionales producidos que están disponibles para la conjugación por química clic.
La Figura 2a es un gráfico de barras que muestra la pérdida de bioactividad de VEGF, determinada por ELISA, en función de la exposición a alginatos oxidados.
La Figura 2b es una imagen de viales que contienen los alginatos oxidados conjugados con Tz y Nb después de una incubación, ilustrando el cambio aparente en los conjugados por química clic debido a la presencia de aldehídos en los alginatos oxidados.
La Figura 3a es un esquema químico que muestra una oxidación del alginato para producir alginato oxidado que contiene aldehídos reactivos; y una posterior reducción u oxidación selectiva del alginato oxidado para eliminar los aldehídos reactivos.
La Figura 3b es un gráfico de barras que muestra el % de oxidación residual en alginatos oxidados que se han reducido adicionalmente con borazano o borohidruro de sodio, o que se han oxidado adicionalmente con clorito de sodio.
La Figura 4a es un gráfico de barras que muestra el % de cambio en la bioactividad de VEGF medido por ELISA después de 5 días de incubación en EBM, ilustrando la pérdida de bioactividad de VEGF en función de la exposición a alginato oxidado o reducido.
La Figura 4b es un gráfico de barras que muestra el % de cambio en la bioactividad de VEGF medido por ELISA después de 5 días de incubación en una solución de BSA al 1%, ilustrando la pérdida de bioactividad de VEGF en función de la exposición a alginatos oxidados.
La Figura 5a es un panel de dos imágenes de viales que contienen alginatos HighOx conjugados con Tz y Nb el día 0 (panel superior) y alginatos HighOx Sc conjugados con Tz y Nb el día 0 (panel inferior), ilustrando el cambio aparente en los conjugados por química clic debido a la presencia de aldehídos en los alginatos oxidados y una ausencia de cambio en los conjugados que contienen algoxinol y algoxalato.
La Figura 5b es un gráfico de barras que muestra cantidades relativas de Tz presentes en los alginatos HighOx y HighOx SC medidas por RMN, ilustrando el potencial adicional para una conjugación por química clic del alginato que contiene algoxalato a través de los restos de ácido carboxílico adicionales.
La Figura 6a es un espectro UV-Vis de material de alginato HighOx conjugado con Tz con 20-50% de oxidación el día 28 (panel superior) y un espectro UV-Vis de material de alginato HighOx conjugado con Tz tratado con clorito de sodio que contiene 20% y 30% de conjugación el día 14. La Figura 6a ilustra el cambio en el espectro UV-Vis de Tz causado por la reacción de los restos de química clic con aldehídos del alginato presentes en el material de alginato oxidado.
La Figura 6b es un panel de dos imágenes de viales que contienen material de alginato HighOx conjugado con Tz tratado con borazano y materiales de alginato HighOx tratados con clorito de sodio. La Figura 6b ilustra el cambio en el color de la solución de Tz provocado por la reacción de los restos de química clic con aldehídos del alginato presentes en el material de alginato oxidado.
La Figura 6c es un espectro UV-Vis de material de alginato HighOx conjugado con Nb con 20-50% de oxidación el día 28 (panel superior) y un espectro UV-Vis de material de alginato HighOx conjugado con Nb tratado con clorito de sodio, que contiene 20%-50% de conjugación el día 14. La Figura 6c ilustra el cambio en el espectro UV-Vis de Nb causado por la reacción de los restos de química clic con aldehídos del alginato presentes en el material de alginato oxidado.
La Figura 6d es un panel de dos imágenes de viales que contienen material de alginato HighOx conjugado con Nb con 20-50% de oxidación el día 28 (panel superior) y material de alginato HighOx conjugado con Nb tratado con clorito de sodio que contiene 20%-50% de conjugación el día 14 (panel inferior). La Figura 6d ilustra el cambio en el color de la solución de Nb causado por la reacción de los restos de química clic con aldehídos del alginato presentes en el material de alginato oxidado.
La Figura 6e es un espectro de RMN de material de alginato conjugado con Nb que se ha oxidado con peryodato de sodio, mostrando el ensanchamiento de los picos de Nb así como la presencia de picos de aldehído.
La Figura 6f es un espectro de RMN de material de alginato conjugado con Tz que se ha oxidado con peryodato de sodio, mostrando el ensanchamiento de los picos de Nb y la presencia de picos de aldehído.
La Figura 6g es un espectro de RMN de material de alginato conjugado con Nb que se ha oxidado con peryodato de sodio y luego se ha oxidado adicionalmente con clorito de sodio, mostrando la falta de ensanchamiento de los picos de Nb y la ausencia de picos de aldehído.
La Figura 6h es un espectro de RMN de material de alginato conjugado con Tz que se ha oxidado con peryodato de sodio y luego se ha oxidado adicionalmente con clorito de sodio, mostrando la falta de ensanchamiento de los picos de Nb y la ausencia de picos de aldehído.
La Figura 6i es un espectro de FTIR representativo del material de alginato, que demuestra la producción de picos de ácido carboxílico después del tratamiento con clorito de sodio.
La Figura 6j son espectros de UV-Vis para materiales de alginato conjugado con Tz y conjugado con Nb el día 15, mostrando la falta de cambio de color para los alginatos conjugados por química clic que contienen algoxinol y algoxalato.
La Figura 6k es un espectro de RMN para el material de alginato que se ha oxidado con peryodato de sodio y oxidado adicionalmente con clorito de sodio, mostrando la ausencia de picos asociados con aldehído (~ >5,1 ppm). La Figura 7a es un panel de dos gráficos que muestra la degradación de alginato MVG conjugado con Tz y conjugado con Nb (PM inicial de ~250 kDa) con 20% de oxidación (panel izquierdo) y 50% de oxidación (panel derecho), mostrando una hidrólisis de la cadena principal del polímero de alginato como una función del tiempo. La Figura 7b es un panel de cuatro gráficos que muestran la degradación de alginato VLVG (PM inicial de 30 kDa) que contiene 0%-50% de oxidación a 37°C para alginato no procesado (panel superior izquierdo), alginato procesado de forma reductora con borazano (panel superior derecho), alginato procesado de forma reductora con borohidruro de sodio (panel inferior izquierdo) y alginato procesado de forma reductora con borazano (panel inferior derecho)), mostrando una hidrólisis de la cadena principal del polímero de alginato en función del tiempo.
La Figura 7c es una imagen de viales que contienen soluciones con 50% de p/v de materiales MVG y VLVG con 20% de oxidación y VLVG sin oxidar con 50% de p/v a modo de comparación. A diferencia del alginato parental, el material de alginato que contiene algoxinol y algoxalato muestra una mayor solubilidad.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la absorción de UV-Vis a 515 nm de material de alginato conjugado con Tz frente a unos equivalentes de la conjugación.
La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra la viabilidad celular relativa en presencia de alginato oxidado que contiene 0-50% de oxidación después de 2 días de incubación.
La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra los límites superiores de la solubilidad (% de p/v) para alginato no oxidado con un peso molecular de 250 kDa (MVG, barra izquierda); alginato no oxidado con un peso molecular de 30 kDa (VLVG, barra central); y para material VLVG que se había oxidado al 20%, y luego se oxidó adicionalmente usando clorito de sodio y se conjugó por química clic (Tz o Nb, barra derecha). La Figura 10 ilustra que, en contraposición con el alginato no oxidado, el material VLVG oxidado es soluble al menos en un 50% de p/v.
La Figura 11a es un gráfico de barras que muestra el potencial de conjugación logrado para materiales MVG y VLVG usando Tz y Nb.
La Figura 11b es un gráfico que muestra la absorbancia de UV-Vis a 515 nm del material VLVG en función de los equivalentes molares de Tz.
La Figura 12a es un gráfico que muestra el aumento del módulo de almacenamiento (G') frente al tiempo para materiales VLVG con diferentes grados de sustitución y una concentración constante de alginato (% de p/v).
La Figura 12b es un gráfico de barras que muestra el valor máximo (de la Figura 13a) del módulo de almacenamiento (G’) para materiales VLVG con diferentes grados de sustitución y una concentración constante de alginato (% de p/v).
La Figura 12c es un gráfico de barras que muestra el valor del tamaño de malla para materiales VLVG con diferentes grados de sustitución con una concentración constante de alginato (% de p/v), tal y como se obtiene a partir del módulo de almacenamiento máximo (G’) representado en la Figura 13b.
La Figura 12d es un gráfico que muestra el aumento del módulo de almacenamiento (G’) en función del tiempo para el material MVG que se había oxidado hasta un 10% de oxidación, reducido con borazano y luego conjugado con Nb o Tz usando 250 equivalentes molares de Nb y Tz con una concentración de alginato reducido de 5% de p/v, 10% de p/v o 15% de p/v.
La Figura 12e es un gráfico que muestra el aumento del módulo de almacenamiento (G’) en función del tiempo para el material MVG que se había oxidado hasta un 20% de oxidación, reducido con borazano y luego conjugado con Nb o Tz utilizando 250 equivalentes molares de Nb y Tz con una concentración de alginato reducido de 5% de p/v, 10% de p/v, 15% de p/v o 20% de p/v.
La Figura 12f es un gráfico que muestra el aumento del módulo de almacenamiento (G’) en función del tiempo para el material LF 20/40 que se había oxidado hasta un 20% de oxidación, reducido con borazano y luego conjugado con Nb o Tz usando 1000 equivalentes molares de Nb y Tz con una concentración de alginato reducido de 5% de p/v, 10% de p/v, 15% de p/v o 20% de p/v.
La Figura 13a es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos usando materiales VLVG conjugados por química clic con diferentes grados de conjugación por química clic y una concentración constante de alginato (% de p/v).
La Figura 13b es un gráfico que muestra la región sin meseta de la curva en la Figura 14a correspondiente a 2500 equivalentes molares de Nb o Tz y una concentración del 5% de Alg-N y Alg-T durante la formación del hidrogel (2500 eq 5% de VLVG) y el ajuste lineal.
La Figura 13c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de BSA conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos usando materiales VLVG conjugados por química clic con diferentes grados de conjugación por química clic y una concentración constante de alginato (% de p/v).
La Figura 13d es un gráfico que muestra la región sin meseta de la curva en la Figura 14c correspondiente a 2500 equivalentes molares de Nb o Tz y una concentración del 5% de Alg-N y Alg-T durante la formación de hidrogel (2500 eq 5% de VLVG) y el ajuste lineal.
La Figura 13e es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de IgG conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos usando materiales VLVG conjugados por química clic con diferentes grados de conjugación por química clic y una concentración constante de alginato (% de p/v).
La Figura 13f es un gráfico que muestra la región sin meseta de la curva en la Figura 14e correspondiente a 2500 equivalentes molares de Nb o Tz y una concentración del 5% de Alg-N y Alg-T durante la formación del hidrogel (2500 eq 5% de VLVG) y el ajuste lineal.
La Figura 13g es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina, BSA e IgG conjugadas con fluoresceína desde hidrogeles producidos mediante reticulación medicada con Ca2+, mostrando una liberación por ráfagas significativa, si no completa, durante los primeros 1-3 días.
La Figura 14a es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos utilizando alginato LF 20/40 conjugado por química clic con una concentración de 5% de p/v que se había oxidado hasta el 5% o 10% y luego se había procesado de forma reductora con AB.
La Figura 14b es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic con una concentración de 5% de p/v que se habían oxidado hasta el 5% o 10% y luego se habían procesado de forma oxidativa con SC.
La Figura 14c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de IgG conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic con una concentración del 5% de p/v que se habían oxidado hasta el 5% o 10% y luego se habían procesado de forma reductora con AB.
La Figura 14d es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de IgG conjugada con fluoresceína desde hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic con una concentración del 5% de p/v que se habían oxidado hasta el 5% o 10% y luego se habían procesado de forma oxidativa con SC.
La Figura 15a es una serie de fotografías de viales de vidrio que contienen 4% de material MVG conjugado con Nb (vial izquierdo) y Tz (vial derecho) en presencia de glutaraldehído al 2,3%, tomadas después de 0 minutos, 40 minutos, 21,5 horas y 67,5 horas, que muestran un cambio de color significativo que indica una modificación de los restos de química clic.
La Figura 15b es una serie de fotografías de viales de vidrio que contienen agua como control (vial izquierdo) o material MVG al 2% conjugado con DBCO (vial central) o azida (vial derecho), tomadas después de 0 minutos, 40 minutos, 20 horas y 69 horas, que muestran un cambio de color significativo que indica una modificación de los restos de química clic.
La Figura 16a es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas neutros (DOPC: colesterol) desde alginato reticulado con Ca2+ y desde alginato conjugado por química clic no oxidado, durante un período de 50 días en PBS++ (un tampón PBS que contiene iones de Ca2+ y Mg2+).
La Figura 16b es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas neutros (DOPC: colesterol) desde un hidrogel de alginato reticulado con Ca2+, un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado y un hidrogel de gelatina por química clic en PBS++ (un tampón PBS que contiene iones de Ca2+ y Mg2+). La Figura 16c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas neutros (DOPC: colesterol) durante el período de 28 días desde hidrogeles de alginato reticulado con Ca2+ y desde hidrogeles de alginato conjugados por química clic no oxidados, preparados con una concentración de alginato del 5% de p/v. Los perfiles de liberación de liposomas se midieron in vitro en PBS--, que es un tampón PBS que no contiene iones de Ca2+ o Mg2+, y se demuestra que los geles reticulados por química clic son capaces de retener los liposomas encapsulados (difusión limitada), mientras que los liposomas pueden difundir fuera de los geles reticulados con calcio.
La Figura 16d es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas neutros (DOPC: colesterol) desde hidrogeles de alginato conjugados por química clic no oxidados e hidrogeles de gelatina conjugados por química clic, durante un período de 8 días. Los geles se digirieron con liasa de alginato o colagenasa, respectivamente, el 8° día para mostrar la recuperación y el equilibrio de la masa.
La Figura 17a es una traza de la dispersión de luz dinámica (DLS) del material de reserva de liposomas que se había encapsulado en los geles representados en la Figura 17d.
La Figura 17b es una traza de DLS de un liposoma que se ha liberado desde un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado, digerido con liasa de alginato después de 8 días, como se muestra en la Figura 17d, que muestra una diferencia mínima con el diámetro promedio de los liposomas presentes en la solución madre.
La Figura 17c es una traza de DLS de un liposoma que se había liberado después de 28 días desde un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado, preparado con una concentración de alginato del 5% de p/v en tampón PBS-, que muestra una diferencia mínima con el diámetro promedio de los liposomas presentes en la solución madre.
La Figura 17d es una traza de DLS de un liposoma que se había liberado desde un hidrogel de gelatina conjugado por química clic, digerido con colagenasa después de 8 días.
La Figura 17e es una traza de DLS de un liposoma que se había liberado después de 3 días desde un alginato reticulado con calcio, preparado en tampón PBS--, que muestra que los liposomas liberados son más polidispersos y tienen mayor diámetro que el modelo de los liposomas.
La Figura 17f es una traza de DLS de un liposoma que se había liberado después de 28 días desde un hidrogel reticulado con calcio, preparado con un concentración de alginato del 5% de p/v en tampón PBS--, que muestra que los liposomas liberados son más polidispersos y tienen mayor diámetro que el modelo de liposomas.
La Figura 18 es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas durante 75 días en PBS desde hidrogeles de alginato conjugados por química clic que se habían oxidado hasta un 0%, 5% y 10% de oxidación total y se habían procesado de forma reductora con AB antes de la conjugación por química clic.
La Figura 19a es una imagen de tubos que contienen hidrogeles de alginato que encapsulan liposomas y material sobrenadante el día 0. Para preparar los hidrogeles de alginato, el alginato se oxidó hasta un 20% y luego se redujo posteriormente con borazano. Los geles se incubaron a 37°C en tampón de citrato de sodio (pH 5; dos viales a la izquierda) o borano de sodio (pH 9; dos viales a la derecha).
La Figura 19b es una imagen de tubos que contienen hidrogeles de alginato que encapsulan liposomas y material sobrenadante el día 1. Para preparar los hidrogeles de alginato, el alginato se oxidó hasta un 20% y luego se redujo posteriormente con borazano. Los geles se incubaron a 37°C en tampón de citrato de sodio (pH 5; dos viales a la izquierda) o borano de sodio (pH 9; dos viales a la derecha).
La Figura 19c es una imagen de tubos que contienen hidrogeles de alginato que encapsulan liposomas y material sobrenadante el día 7. Para preparar los hidrogeles de alginato, el alginato se oxidó hasta un 20% y luego se redujo posteriormente con borazano. Los geles se incubaron a 37°C en tampón de citrato de sodio (pH 5; dos viales a la izquierda) o borano de sodio (pH 9; dos viales a la derecha). Las imágenes indican que las muestras con pH 9 se degradaban después de 7 días, mientras que las muestras con pH 5 todavía estaban algo intactas.
La Figura 19d es una imagen de tubos de hidrogeles de alginato que encapsulan liposomas y material sobrenadante el día 14. Para preparar los hidrogeles de alginato, el alginato se oxidó hasta un 20% y luego se redujo posteriormente con borazano. Los geles se incubaron a 37°C en tampón de citrato de sodio (pH 5; dos viales a la izquierda) o borano de sodio (pH 9; dos viales a la derecha). Las imágenes indican que las muestras se degradaron después de 14 días tanto a pH 5 como a pH 9.
La Figura 19e es un gráfico que muestra la liberación basada en una degradación de liposomas neutros (DOPC: colesterol) desde hidrogeles de alginato que se habían producido oxidando el alginato hasta un 20% y reduciéndolo posteriormente con borazano. Las muestras se liberaron en tampón MES pH 6,5 para imitar el microambiente paratumoral.
La Figura 20a es una traza de DLS de un liposoma DOTAP : Hydro Soy PC antes de la extrusión.
La Figura 20b es una traza de DLS de los liposomas DOTAP : Hydro Soy PC después de la extrusión.
La Figura 20c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas catiónicos (Figura 20a) durante un período de 17 días desde hidrogeles de alginato reticulados con Ca2+ y de alginato conjugados por química clic no oxidados. La Figura 21b muestra que los geles reticulados por química clic son capaces de retener los liposomas encapsulados (difusión limitada), mientras que los liposomas pueden difundir fuera de los geles reticulados con calcio.
La Figura 21 a es un gráfico que muestra la liberación de IGF-1 desde hidrogeles de alginato conjugados por química clic preparados usando diversas composiciones de alginato.
La Figura 21b es un gráfico que muestra la liberación de VEGF165 desde hidrogeles de alginato con química clic preparados utilizando diversas composiciones de alginato.
La Figura 22 es un gráfico de barras que muestra las viscosidades relativas de varias soluciones de alginato con diferentes concentraciones de alginato (% de p/v), grados de oxidación y procesamiento con clorito de sodio o borazano. Los datos muestran que la conjugación por química clic con MVG sin oxidación no da como resultado una diferencia sustancial en la viscosidad, mientras que la viscosidad se reduce sustancialmente con una conjugación por química clic con alginato que contiene algoxinol o algoxalato, y es comparable a la del agua (0,890 cPa a 25°C).
Descripción detallada de la invención
I. Polisacáridos reducidos y altamente oxidados de la invención
La presente invención está dirigida a composiciones que comprenden un polisacárido reducido, en las que el polisacárido reducido comprende menos del 2% de aldehídos residuales. La presente invención también está dirigida a composiciones que comprenden un polisacárido reducido, en donde el polisacárido reducido comprende menos del 3% de aldehídos residuales, y en donde el polisacárido se produce haciendo reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol, produciendo de este modo un polisacárido oxidado que comprende 15% o más de oxidación sobre una base molar, seguido de la reacción del polisacárido oxidado con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua para producir el polisacárido reducido.
Los polisacáridos reducidos comprendidos en las composiciones de la invención se pueden usar para preparar hidrogeles. Estos polisacáridos se generan mediante un procedimiento de dos etapas. La primera etapa implica hacer reaccionar un polisacárido, p. ej., un alginato, con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehídos, p. ej., un alginato oxidado que contiene aldehídos. La segunda etapa implica un procesamiento reductor adicional del polisacárido oxidado que contiene aldehídos para producir un polisacárido reducido. El procedimiento de reducción implica reducir los restos de aldehído presentes en el polisacárido oxidado para producir restos de alcohol. En consecuencia, la expresión "polisacáridos reducidos", tal y como se usa en este documento, incluye polisacáridos que comprenden restos de alcohol. En algunas realizaciones, el polisacárido reducido se produce oxidando el polisacárido usando un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido que contiene aldehído; y luego procesando de forma reductora el polisacárido oxidado, p. ej., utilizando un agente reductor específico de aldehído soluble en agua, para producir el polisacárido reducido. En ciertos ejemplos, un polisacárido reducido comprende una subunidad monomérica que tiene un alcohol de anillo abierto que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000013_0001
algoxinol.
El término "polisacárido", tal y como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a cualquier molécula de carbohidrato polimérica compuesta por cadenas de unidades monosacáridas unidas entre sí por enlaces glicosídicos. Por ejemplo, el alginato es un polisacárido que comprende dos subunidades monoméricas diferentes, p-D-manuronato (M) y su epímero en C-5, a-L-guluronato (G), que están unidas (1-4).
Las cadenas de polisacáridos pueden ser lineales o ramificadas. El término "polisacárido" también se entiende que incluye un oligosacárido. El polisacárido puede ser un homopolisacárido que contiene solo unidades monoméricas de un tipo (p. ej., glucosa), o un heteropolisacárido, que contiene unidades de monómero de diferentes tipos (p. ej., glucosa y fructosa). En una realización, el término "polisacárido" se refiere a una molécula de carbohidrato polimérica que contiene un diol, es decir, dos grupos hidroxilo presentes en carbonos adyacentes. Ejemplos no limitantes de polisacáridos que contienen diol incluyen alginato, pululano, escleroglucano, quitosano, elsinano, goma de xantano, dextrano, manosa, gelano, levano, celulosa, ácido hialurónico, condroitín sulfato A, condroitín sulfato C, condroitín sulfato E y p-d-glucanos.
En una realización específica, el polisacárido que contiene diol es un polímero de alginato. Los polímeros de alginato se componen de dos unidades monoméricas diferentes enlazadas (1-4), monómeros de ácido p-D-manurónico (unidades M) y de ácido a L-gulurónico (unidades G), que pueden variar en proporción y distribución secuencial a lo largo de la cadena de polímero. Los polímeros de alginato son sistemas de polielectrolitos que tienen una fuerte afinidad hacia cationes divalentes (p. ej., Ca+2, Mg+2, Ba+2) y forman hidrogeles estables cuando se exponen a esas moléculas. Véase, Martinsen A. et al., Biotech. & Bioeng., 33 (1989) 79-89). Por ejemplo, los hidrogeles de alginato reticulados con calcio son útiles para aplicaciones dentales, apósitos para heridas, trasplante de condrocitos y como matriz para otros tipos de células. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que las unidades G se reticulan preferentemente usando reticulación con calcio, mientras que la reticulación basada en una reacción de química clic es más indiscriminada con respecto a las unidades G o las unidades M (es decir, tanto las unidades G como las M se pueden reticular mediante química clic).
El término "alginato", usado indistintamente con la expresión "polímeros de alginato", incluye alginato no modificado, alginato oxidado (p. ej., que comprende una o varias unidades de monómero de algoxalato) y/o alginato reducido (p. ej., que comprende una o varias unidades de monómero de algoxinol). En algunas realizaciones, el alginato oxidado comprende alginato que comprende uno o varios grupos aldehído, o alginato que comprende uno o varios grupos carboxilato. En otras realizaciones, el alginato oxidado comprende alginato altamente oxidado, por ejemplo, que comprende una o varias unidades de algoxalato. El alginato oxidado también puede comprender un número relativamente pequeño de grupos aldehído (p. ej., menos del 15%, p. ej., 14,%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4%, 0,3%, 0,2%, 0,1% o menos de grupos aldehído o de oxidación sobre una base molar). El término "alginato" o "polímeros de alginato" también puede incluir alginato, p. ej., alginato no modificado, alginato oxidado o alginato reducido, conjugado con al menos un reactivo de química clic como se describe a continuación.
Los polímeros de alginato útiles en el contexto de la presente invención pueden tener un peso molecular promedio de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 500 kDa, p. ej., de aproximadamente 20 kDa a aproximadamente 40 kDa, de aproximadamente 30 kDa a aproximadamente 70 kDa, de aproximadamente 50 kDa a aproximadamente 150 kDa, de aproximadamente 130 kDa a aproximadamente 300 kDa, de aproximadamente 230 kDa a aproximadamente 400 kDa, de aproximadamente 300 kDa a aproximadamente 450 kDa o de aproximadamente 320 kDa a aproximadamente 500 kDa. En un ejemplo, los polímeros de alginato útiles en la presente invención pueden tener un peso molecular promedio de aproximadamente 32 kDa. En otro ejemplo, los polímeros de alginato útiles en la presente invención pueden tener un peso molecular promedio de aproximadamente 265 kDa. En algunas realizaciones, el polímero de alginato tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 1000 kDa, p. ej., menos de aproximadamente 900 kDa, menos de aproximadamente 800 kDa, menos de aproximadamente 700 kDa, menos de aproximadamente 600 kDa, menos de aproximadamente 500 kDa, menos de aproximadamente 400 kDa, menos de aproximadamente 300 kDa, menos de aproximadamente 200 kDa, menos de aproximadamente 100 kDa, menos de aproximadamente 50 kDa, menos de aproximadamente 40 kDa, menos de aproximadamente 30 kDa o menos de aproximadamente 25 kDa. En algunas realizaciones, el polímero de alginato tiene un peso molecular de aproximadamente 1000 kDa, p. ej., aproximadamente 900 kDa, aproximadamente 800 kDa, aproximadamente 700 kDa, aproximadamente 600 kDa, aproximadamente 500 kDa, aproximadamente 400 kDa, aproximadamente 300 kDa, aproximadamente 200 kDa, aproximadamente 100 kDa, aproximadamente 50 kDa, aproximadamente 40 kDa, aproximadamente 30 kDa o aproximadamente 25 kDa. En una realización, el peso molecular de los polímeros de alginato es de aproximadamente 20 kDa.
Figure imgf000014_0001
"GGGGRGDSP" descrita como SEQ ID NO: 12.
Un polisacárido, p. ej., un polisacárido que contiene diol, tal como un alginato, puede reaccionar en la primera etapa con un agente oxidante específico de diol. La expresión "agente oxidante específico de diol" se refiere a un agente oxidante que reacciona específicamente con un resto diol, p. ej., un resto diol presente en un polisacárido, y no oxida otros grupos funcionales, p. ej., alcoholes, que también pueden estar presentes en un polisacárido. Ejemplos no limitantes de agentes oxidantes específicos de diol incluyen peryodato de sodio (NaIO4), ácido peryódico (HIO4), tetraacetato de plomo (PB(OAc)4), paraperyodato de sodio (Na3H2IO6) y peryodato de potasio (KIO4). En una realización específica, el agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio (NaIO4).
El reactivo oxidante específico de diol reacciona con un diol para romper el enlace carbono-carbono y producir dos restos aldehído. En ciertas realizaciones, esa reacción produce polisacáridos oxidados que están oxidados al menos aproximadamente un 0,1%, 0,5%, 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45%, aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100%. También se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados forman parte de esta invención. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, esta reacción puede producir polisacáridos oxidados que están oxidados de aproximadamente 1% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 12% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 30%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 25% a aproximadamente 45%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 45% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 55% a aproximadamente 75%, de aproximadamente 60% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 65% a aproximadamente 80%, de aproximadamente 70% a aproximadamente 90% o de aproximadamente 85% a aproximadamente 100%.
La expresión "polisacárido oxidado", p. ej., "alginato oxidado", tal y como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a un polisacárido que se ha oxidado, p. ej., ha reaccionado con un agente oxidante, tal como un agente oxidante específico de diol. Un polisacárido oxidado, p. ej., un alginato, comprende restos de aldehído que son el resultado de una oxidación del polisacárido. Un polisacárido oxidado puede estar oxidado de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 100%, p. ej., de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 25% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 70%, de aproximadamente 55% a aproximadamente 90% o de aproximadamente 75% a aproximadamente 100%. En algunas realizaciones, el polisacárido oxidado puede estar oxidado menos de aproximadamente un 15%, por ejemplo, oxidado menos de aproximadamente un 14%, menos de aproximadamente un 13%, menos de aproximadamente un 12%, menos de aproximadamente un 11%, menos de aproximadamente un 10%, menos del aproximadamente un 9%, menos de aproximadamente un 8%, menos de aproximadamente en 7%, menos de aproximadamente un 6%, menos de aproximadamente un 5%, menos de aproximadamente un 4%, menos de aproximadamente un 3%, menos de aproximadamente un 2%, menos de aproximadamente un 1%, menos de aproximadamente un 0,9%, menos de aproximadamente un 0,8%, menos de aproximadamente un 0,7%, menos de aproximadamente un 0,6%, menos de aproximadamente un 0,5%, menos de aproximadamente un 0,4%, menos de aproximadamente un 0,3%, menos de aproximadamente un 0,2% o menos de aproximadamente un 0,1%.
La expresión "% de oxidación" o "% oxidado", "nivel de oxidación" o "% de nivel de oxidación", usada indistintamente con la expresión "% de oxidación sobre una base molar", se refiere al % de la fracción molar de subunidades monoméricas en un polisacárido que contiene diol, p. ej, un alginato, cuyo anillo se abre como resultado de una oxidación. En algunos casos, el polisacárido es un polisacárido que contiene diol que se ha sometido a una reacción con un agente oxidante específico de diol, tal como peryodato de sodio. Los métodos que pueden ser útiles para medir el % de oxidación de un polisacárido, son conocidos por un experto en la técnica y pueden incluir, p. ej, qRMN.
Por ejemplo, la expresión "% de oxidación" se puede usar haciendo referencia a un polisacárido que se ha oxidado, p. ej., mediante un agente oxidante específico de diol, y contiene subunidades monoméricas de anillo abierto que comprenden restos de aldehído. Un ejemplo de esa subunidad monomérica, p. ej., en un alginato, se muestra a continuación:
Figure imgf000015_0001
alginato oxidado.
La expresión "% de oxidación" también se puede usar haciendo referencia a un polisacárido que se ha oxidado, p. ej., mediante un agente oxidante específico de diol, y posteriormente se ha reducido, p. ej., mediante un agente reductor específico de aldehído soluble en agua, y contiene subunidades monoméricas de anillo abierto que comprenden restos de alcohol. Un ejemplo de esa subunidad monomérica, p. ej., algoxinol, se muestra a continuación:
Figure imgf000016_0001
La expresión "% de oxidación" también se puede usar haciendo referencia a un polisacárido que se ha oxidado, p. ej., mediante un agente oxidante específico de diol, y posteriormente se ha oxidado adicionalmente, por ejemplo, mediante un segundo agente oxidante, y contiene subunidades monoméricas de anillo abierto que comprenden restos de ácido carboxílico. Un ejemplo de esa subunidad monomérica, p. ej., algoxalato, se muestra a continuación:
Figure imgf000016_0002
La expresión "% de aldehídos", tal y como se usa en este documento, se refiere al % de la fracción molar de aldehídos presentes en las subunidades monoméricas de anillo abierto de un polisacárido, p. ej., un polisacárido que contiene diol, p. ej., un alginato.
La expresión "% de oxidación residual", "nivel de oxidación residual", "% de nivel de oxidación residual", "% de oxidación residual sobre una base molar" o "% de aldehídos residuales" se refiere al % de la fracción molar de aldehídos residuales, es decir, restos de aldehído que permanecen en un polisacárido después de haber reaccionado con un agente oxidante específico de diol y luego se han reducido, p. ej., con un agente reductor soluble en agua específico de aldehído, para producir un polisacárido reducido como se describe a continuación. En algunas realizaciones, el polisacárido reducido, p. ej., el alginato reducido, puede comprender desde aproximadamente un 0,01% a aproximadamente un 3% de aldehídos residuales, p. ej., de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,5% o de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% de aldehídos residuales. Por ejemplo, el polisacárido reducido puede comprender aproximadamente un 2% de aldehídos residuales o aproximadamente un 3% de aldehídos residuales. Esta expresión también se puede referir al % de la fracción molar de aldehídos residuales, es decir, los restos de aldehído que permanecen en un polisacárido después de que ha reaccionado con un agente oxidante específico de diol y luego se oxidan adicionalmente, p. ej., con un segundo agente oxidante, para producir un polisacárido altamente oxidado como se describe a continuación. En algunas realizaciones, el polisacárido altamente oxidado, p. ej., el alginato altamente oxidado, puede comprender de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 3% de aldehídos residuales, p. ej., de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 1,5% o de aproximadamente 1% a aproximadamente 3% de aldehídos residuales. Por ejemplo, el polisacárido altamente oxidado puede comprender aproximadamente un 2% de aldehídos residuales o aproximadamente un 3% de aldehídos residuales.
Una reacción ejemplar entre una unidad monomérica de un polisacárido es la reacción entre alginato y peryodato de sodio, un agente oxidante específico de diol, se ilustra en el Esquema 1:
Figure imgf000017_0001
Un procesamiento reductor adicional de los polisacáridos oxidados que contienen aldehidos en la segunda etapa de los métodos de la invención implica una reacción del polisacárido oxidado que contiene aldehídos con un agente reductor soluble en agua específico de aldehído. La expresión "agente reductor soluble en agua específico de aldehído" se refiere a un agente reductor que oxida específicamente los aldehídos, p. ej., los aldehídos presentes en un polisacárido, como resultado de una oxidación mediante un agente oxidante específico de diol, y los convierte en alcoholes. En determinadas realizaciones, el reactivo soluble en agua específico de aldehído no es tóxico y/o es un reactivo de Green. Ejemplos no limitantes de agentes reductores solubles en agua específicos de aldehído incluyen borohidruro de sodio (NaBH4); cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3); gas hidrógeno (H2) en presencia de un catalizador, p. ej., un catalizador de níquel (Ni), platino (PI) o paladio (Pd); borazano (H3NBH3); o un complejo de borano, p. ej., un complejo de biscarbonato borano ([(BH3)2CO2]2-* 2Na+), un complejo de borano dimetilamina [(CH3)2NH • BH3]; un complejo de borano ferc-butilamina [(CH3)3CNH2 • BH3]; o un complejo de borano-pirimidina. En un ejemplo específico, el agente reductor soluble en agua específico de aldehído es borazano. En una realización, el agente reductor soluble en agua específico de aldehído no es borohidruro de sodio.
En el Esquema 2 se ilustra una reacción ejemplar del ácido glucurónico oxidado, un producto de la reacción ilustrada en el Esquema 1, con borazano, un agente reductor específico de aldehído soluble en agua.
Esquema 2.
Figure imgf000017_0002
alginato oxidado algoxinol
En el contexto de la presente invención, la expresión "aldehido residual" se refiere a los aldehidos que permanecen en un polisacárido reducido después de completar la reducción del polisacárido oxidado, p. ej., alginato oxidado, con un agente reductor soluble en agua específico de aldehído, p. ej., borazano. La cantidad de aldehídos presentes en un polisacárido, p. ej., la cantidad de aldehídos residuales presentes en un polisacárido después de una reducción con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua, puede medirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, la cantidad de aldehídos residuales presentes en un polisacárido puede medirse mediante RMN cuantitativa, en donde la integral de los picos de aldehído del alginato (1,5% de p/v) (> 5,1 ppm) se compara con un patrón interno de ácido dimetilmalónico (2,5 mg/mL), y se puede expresar como el % de aldehídos residuales.
Sorprendentemente, los presentes inventores han descubierto que los agentes reductores específicos de aldehído solubles en agua, p. ej., borazano, son particularmente eficaces para reducir los aldehídos presentes en un polisacárido oxidado, p. ej., un polímero de alginato, y convertirlos en alcoholes. En consecuencia, un polisacárido reducido que se ha obtenido al someter un polisacárido oxidado a un procesamiento reductor adicional mediante una reacción con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua, p. ej., borazano, contiene niveles sorprendentemente bajos de aldehídos residuales. En algunas realizaciones, el polisacárido reducido contiene menos del 2% de aldehídos residuales, p. ej., menos del 1,5%, menos del 1% o menos del 0,5% de aldehídos residuales. En otras realizaciones, el polisacárido reducido contiene menos del 3% de aldehídos residuales, p. ej., menos del 3%, menos del 2,5%, menos del 2%, menos del 1,5%, menos del 1% o menos del 0,5% de aldehídos residuales.
Es deseable tener un nivel bajo de aldehídos en un polisacárido, p. ej., un alginato, utilizado para preparar un hidrogel, porque los aldehidos pueden dañar las proteínas y otras moléculas presentes en las proximidades del polisacárido, aumentando de ese modo la toxicidad del hidrogel. Además, el uso de agentes reductores específicos de aldehído solubles en agua es particularmente ventajoso porque esos reactivos no producen subproductos tóxicos y no necesitan un procesamiento adicional de los materiales polisacáridos. Los agentes reductores específicos de aldehído solubles en agua, p. ej., borazano, tampoco son tóxicos y/o se consideran "reactivos verdes".
La presente invención también utiliza polisacáridos altamente oxidados, p. ej., polímeros de alginato altamente oxidados. Esos polisacáridos altamente oxidados cargados son más solubles en agua que los polisacáridos oxidados, lo que simplifica su manipulación. Los polisacáridos altamente oxidados se pueden preparar en dos etapas. La primera etapa implica hacer reaccionar un polisacárido, p. ej., un polímero de alginato, con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehídos, p. ej., un polímero de alginato oxidado que contiene aldehídos, como se ha descrito anteriormente. La segunda etapa implica un procesamiento oxidativo adicional del polisacárido oxidado que contiene aldehído para producir un polisacárido altamente oxidado. El procesamiento oxidativo adicional del polisacárido oxidado implica convertir los restos de aldehído presentes en el polisacárido oxidado, en restos de ácido carboxílico. En consecuencia, la expresión "polisacárido altamente oxidado", tal y como se usa en este documento, incluye polisacáridos que comprenden al menos uno, p. ej., dos restos de ácido carboxílico adicionales por subunidad monomérica. Por ejemplo, un polisacárido altamente oxidado puede comprender una subunidad monomérica que es un alginato o un algoxalato que contiene ácido carboxílico de anillo abierto, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000018_0001
El procesamiento oxidativo adicional del polisacárido oxidado que contiene aldehído, p. ej., un polímero de alginato, implica una reacción del polisacárido oxidado que contiene aldehído con un segundo agente oxidante. La expresión "segundo agente oxidante", tal y como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a cualquier agente oxidante que convierte específicamente un resto de aldehído en un resto de ácido carboxílico, produciendo de ese modo un polisacárido altamente oxidado. Ejemplos no limitantes de los segundos agentes oxidantes incluyen clorito de sodio; bromo; ácido nítrico diluido (NHO3); óxido de plata, p. ej., reactivo de Tollens ([Ag(NH3)2]+ o AgNO3); complejos de cobre(II), p. ej., reactivo de Fehling (solución de tartrato de cobre (II)) o reactivo de Benedict (solución de citrato de cobre (II)); permanganato de potasio (KMnO4); y peróxido de hidrógeno (H2O2). En una realización específica, el segundo agente oxidante es clorito de sodio.
Una reacción ejemplar de la unidad monomérica oxidada de un polisacárido es la reacción de alginato oxidado, un producto de la reacción ilustrada en el Esquema 1, con clorito de sodio, un segundo agente oxidante, que se ilustra en el Esquema 3.
Figure imgf000018_0002
Se ha descubierto sorprendentemente que tanto los polisacáridos reducidos, p. ej., los polisacáridos reducidos resultantes de la reacción de polisacáridos oxidados con agentes reductores específicos de aldehído solubles en agua (p. ej., borazano), tales como polisacáridos que comprenden algoxinol, así como los polisacáridos altamente oxidados, p. ej., los polisacáridos resultantes de la reacción de polisacáridos oxidados con un segundo agente oxidante, tal como polisacáridos que comprenden algoxalato, son particularmente útiles para preparar hidrogeles. Los hidrogeles preparados a partir de polisacáridos reducidos y altamente oxidados, p. ej., polímeros de alginato reducidos y altamente oxidados, son biodegradables y útiles como vehículos de administración de fármacos.
En algunas realizaciones, la solubilidad de un polisacárido reducido y/o altamente oxidado, p. ej., un alginato reducido y/o altamente oxidado, tal como un alginato que comprende algoxinol y/o algoxalato, es mayor que la solubilidad del alginato sin modificar. La solubilidad de un polisacárido, tal como un polisacárido reducido y/o altamente oxidado, se puede expresar como el % de p/v o en mg/mL, en donde un 1% de p/v es equivalente a 10 mg/mL del polisacárido. Por ejemplo, la solubilidad del polisacárido reducido y/o altamente oxidado puede ser de aproximadamente 10-20% de p/v, 15-30% de p/v, 20-40% de p/v, 30-50% de p/v, 40-65% de p/v, 50-75% de p/v o 60-90% de p/v. Por ejemplo, la solubilidad del polisacárido reducido y/o altamente oxidado de la invención puede ser de aproximadamente 10% de p/v, aproximadamente 15% de p/v, aproximadamente 20% de p/v, aproximadamente 25% de p/v, aproximadamente 30% de p/v, aproximadamente 35% de p/v, aproximadamente 40% de p/v, aproximadamente 45% de p/v, aproximadamente 50% de p/v, aproximadamente 55% de p/v, aproximadamente 60% de p/v, aproximadamente 65% de p/v, aproximadamente 70% de p/v, aproximadamente 75% de p/v, aproximadamente 80% de p/v o aproximadamente 90% de p/v.
En algunas realizaciones, los polisacáridos de la invención son biodegradables. Por ejemplo, el alginato oxidado, reducido y altamente oxidado es biodegradable. Un alginato p. ej., un alginato oxidado, reducido y altamente oxidado, no es susceptible de una degradación con una enzima endógena del hospedador, por ejemplo, una enzima endógena que puede estar presente en un ser humano. Un alginato p. ej., alginato oxidado, reducido y altamente oxidado, se puede degradar químicamente, p. ej., hidrolizar cuando se expone a condiciones ácidas o alcalinas. Las condiciones ácidas comprenden un pH de 6,5 o inferior, mientras que las condiciones alcalinas comprenden un pH de 8 o superior.
II. Polisacáridos de la invención conjugados con reactivos de química clic
Los polisacáridos reducidos y altamente oxidados de la invención, p. ej., alginato, se pueden conjugar con un reactivo de química clic. La expresión "reactivo clic", usada en esta memoria descriptiva de manera intercambiable con la expresión "reactivo de química clic", es un reactivo que puede reaccionar rápida y selectivamente ("química clic") con su reactivo de química clic asociado en condiciones suaves en solución acuosa. Las condiciones suaves incluyen pH neutro, una solución acuosa y temperatura ambiente, con bajas concentraciones de reactivo. Los reactivos de parejas de química clic ejemplares son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, azida y dibenzociclooctina (DBCO), tetrazina y transcicloocteno, y tetrazina y norborneno, con las estructuras ilustradas a continuación.
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En algunas realizaciones, el reactivo de química clic es tetrazina (Tz). Tal y como se usa en este documento, los términos "tetrazina" y "resto de tetrazina" incluyen moléculas que comprenden 1,2,4,5-tetrazina sustituida con un espaciador adecuado para unirse al polímero (p. ej., alquilaminas tales como metilamina o pentilamina), y opcionalmente sustituidas adicionalmente con uno o varios sustituyentes en cualquier posición disponible. Ejemplos de restos de tetrazina adecuados para las composiciones y los métodos de la descripción, incluyen, pero no se limitan a, las estructuras que se muestran a continuación (véase, p. ej., Karver et al., (2011) Bioconjugate Chem. 22: 2263-2270 y el documento WO 2014/065860:
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Uno de los reactivos asociados de la tetrazina es el norborneno (Nb). Tal y como se usa en este documento, los términos "norborneno" y "restos de norborneno" incluyen, pero no se limitan a, grupos de norbornadieno y norborneno que además comprenden un espaciador adecuado para unirse al polisacárido (p. ej., alquilaminas tales como metilamina o pentilamina), y de forma opcional están adicionalmente sustituidos con uno o varios sustituyentes en cualquier posición disponible. Esos restos incluyen, por ejemplo, norbornen-5-metilamina y norbornadienmetilamina.
Los reactivos de química clic generalmente están conjugados con un polisacárido, p. ej., un alginato, a través del resto carboxílico. En un ejemplo específico ilustrado en la Figura 1a, los reactivos de química clic pueden conjugarse con polímeros de alginato a través del resto carboxilato presente en el ácido glucurónico en un alginato. Por consiguiente, una molécula de química clic puede conjugarse con cada glucuronato en un alginato sin procesar. Después de la oxidación del alginato con peryodato de sodio, se generan dos aldehídos por cada glucuronato. Cada resto de aldehído puede conjugarse con un reactivo de química clic a través de un enlace imina (Figura 1b). Esa conjugación de reactivos de química clic con alginatos oxidados es subóptima debido a los aldehídos residuales que permanecen en el alginato después de la conjugación que pueden dar lugar a toxicidad y daño en la carga, así como a una degradación de los reactivos de química clic (véanse también los Ejemplos 1 y 3). Además, los enlaces imina entre los aldehídos y los reactivos de química clic son fácilmente hidrolizables, lo que da lugar a la pérdida de los reactivos de química clic desde el alginato. Como se muestra en la Figura 1c, una oxidación adicional de los aldehídos presentes en los alginatos oxidados convierte a esos aldehídos en ácidos carboxílicos, proporcionando de este modo dos sitios adicionales para una conjugación por química clic.
Se ha descubierto sorprendentemente que ciertos polisacáridos altamente oxidados, p. ej., polímeros de alginato altamente oxidados, son mejores sustratos para una conjugación del reactivo de química clic que los polisacáridos oxidados, porque contienen sitios adicionales disponibles para la conjugación por química clic. También se ha descubierto que los polisacáridos reducidos, p. ej., alginatos reducidos, son más adecuados para la conjugación de reactivos de química clic que los polisacáridos oxidados, porque contienen una menor cantidad de aldehídos que pueden reaccionar con los reactivos de química clic, provocando su degradación.
En algunas realizaciones, el reactivo de química clic conjugado con un polisacárido de la invención, p. ej., un alginato, también puede reaccionar con su reactivo de química clic asociado que, a su vez, está fijado a un resto, conjugando así el resto con el polisacárido. Cualquier resto puede conjugarse con el polisacárido de la invención usando los reactivos de química clic. Ejemplos no limitantes de tales restos incluyen una molécula orgánica pequeña, una molécula inorgánica pequeña; un azúcar; un monosacárido; un disacárido; un trisacárido; un oligosacárido; un polisacárido; un péptido; una proteína, un análogo de péptido, un derivado de péptido; un peptidomimético; un anticuerpo (policlonal o monoclonal); un fragmento de un anticuerpo que se une a antígeno; un ácido nucleico, p. ej., un oligonucleótido, un oligonucleótido antisentido, ARNsi, ARNsh, una ribozima, un aptámero, microARN, pre-microARN, ARNi, ADN plasmídico (p. ej. un ADN plasmídico condensado), un ARN modificado y un análogo o derivado de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el resto es un agente terapéutico.
En otras realizaciones, un reactivo de química clic conjugado con un polisacárido de la invención, p. ej., un alginato, puede funcionar como un agente de reticulación, tal y como se describe en detalle a continuación.
En determinadas realizaciones, un polisacárido de la invención, p. ej., un alginato, puede conjugarse con dos o más reactivos de química clic, que pertenecen a diferentes parejas de química clic. Por ejemplo, en una realización en la que el polisacárido de la invención está conjugado con dos reactivos de química clic que pertenecen a dos parejas de química clic diferentes, un primer reactivo de química clic conjugado con el polisacárido puede ser una azida de la pareja de química clic azida-dibenzociclooctina (azida-DBCO), y un segundo reactivo de química clic conjugado con el polisacárido puede ser tetrazina de la pareja de química clic tetrazina-norborneno. En esos polisacáridos, los dos reactivos de química clic pueden usarse para diferentes funciones. Por ejemplo, el primer reactivo de química clic puede funcionar para promover la reticulación del polisacárido para formar un hidrogel, y el segundo reactivo de reticulación puede funcionar para conjugar un resto con el polisacárido, tal y como se ha descrito anteriormente. En una realización específica, cuando un polisacárido de la invención se conjuga con dos o más reactivos de química clic, los reactivos de química clic conjugados con el polisacárido no reaccionan de forma cruzada, es decir, no reaccionan entre sí, solo reaccionan con sus parejas de química clic.
III. Polisacáridos de la invención conjugados con agentes reticulantes
Los polisacáridos reducidos y altamente oxidados de la invención se pueden conjugar con un agente de reticulación. El agente de reticulación se puede fijar al polisacárido oxidado de forma iónica, covalente o física. En una realización, el agente de reticulación se fija covalente o no covalentemente al polisacárido reducido de la invención, p. ej., un polímero de alginato reducido. En otra realización, el agente reticulante se fija covalente o no covalentemente al polisacárido altamente oxidado de la invención, p. ej., un polímero de alginato altamente oxidado.
La expresión "agente de reticulación", tal y como se usa en esta memoria descriptiva, es cualquier agente que puede efectuar y promover la reticulación del polisacárido en una ubicación específica, p. ej., una ubicación dentro de una célula o un tejido de un sujeto, o que puede promover la reticulación de un polisacárido, p. ej., un polímero de alginato. En determinadas realizaciones, el agente de reticulación se fija al polisacárido, p. ej., a través de un enlace covalente. En determinadas realizaciones, el agente de reticulación solo está acoplado a una cadena del polímero y funciona como un grupo pendiente.
En algunas realizaciones, el agente de reticulación es un reactivo de química clic. Las parejas ejemplares de reactivos de química clic que pueden usarse para reticular el polisacárido de la invención incluyen, pero no se limitan a, azida y dibenzociclooctina (DBCO), tetrazina y trancicloocteno y tetrazina y norborneno, con estructuras como se han ilustrado anteriormente.
El polisacárido reducido y/o altamente oxidado de la invención, modificado con un reactivo de química clic, p. ej., un alginato conjugado con un reactivo de química clic, se puede reticular covalentemente para formar un hidrogel reticulado por química clic, p. ej., un hidrogel de alginato de química clic. La formación de hidrogeles mediante la química clic se describe en Desai et al. (2015) Biomaterials 50: 30-37. Otros han mostrado previamente que la reacción de reticulación es altamente específica, bio-ortogonal y rápida (véanse, p. ej., Devaraj et al. (2008), Bioconjugate Chem. 19(12): 2297-2299; Karver et al. (2011) Bioconjugate Chem. 22(11): 2263-2270; y Alge et al. (2013) Biomacromol. 14(4): 949-953), lo que permite la incorporación de células con una viabilidad elevada después de la encapsulación.
Por ejemplo, para generar un hidrogel a partir de un polisacárido conjugado por química clic de la invención, p. ej., un alginato conjugado por química clic, p. ej., que comprende algoxinol y/o algoxalato, un polisacárido conjugado con un miembro de una pareja de química clic, p. ej., Nb, se puede mezclar con un polisacárido conjugado con el segundo miembro de una pareja de química clic, p. ej., Tz, e incubar en condiciones suaves para generar el hidrogel. Las propiedades de esos hidrogeles, p. ej., la rigidez del hidrogel, el tiempo de gelificación o un tamaño de poro promedio del hidrogel, se pueden modular variando una serie de parámetros que incluyen el grado de conjugación por química clic del polisacárido; el grado de oxidación del polisacárido, es decir, el % de aldehídos residuales presentes en el polisacárido; y la concentración de polisacárido conjugado por química clic durante la formación del hidrogel, p. ej., el % de p/v del material de alginato presente en la solución, inmediatamente antes de la formación del hidrogel.
La expresión "grado de conjugación por química clic", que se puede usar indistintamente con la expresión "grado de sustitución" o "DS", se refiere al número promedio de reactivos de química clic por unidad monomérica de un polisacárido, p. ej., el número promedio de reactivos de química clic por unidad de monómero en un alginato. El grado de sustitución por química clic se puede variar variando el número de equivalentes molares del reactivo de química clic con los moles de monómeros de alginato en la reacción de conjugación por química clic. Por ejemplo, la reacción de conjugación por química clic puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5000 equivalentes molares de un reactivo de química clic, p. ej., aproximadamente 1, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750, aproximadamente 800, aproximadamente 850, aproximadamente 900, aproximadamente 950, aproximadamente 1000, aproximadamente 1200, aproximadamente 1500, aproximadamente 1800, aproximadamente 2000, aproximadamente 2200, aproximadamente 2500, aproximadamente 2800, aproximadamente 3000, aproximadamente 3200, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4200, aproximadamente 4500 o aproximadamente 5000 equivalentes molares del reactivo de química clic. También se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados forman parte de esta invención. Por ejemplo, la reacción de conjugación por química clic puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 50, de aproximadamente 10 a aproximadamente 100, de aproximadamente 150 a aproximadamente 250, de aproximadamente 200 a aproximadamente 500, de aproximadamente 400 a aproximadamente 800, de aproximadamente 700 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1600, de aproximadamente 1500 a aproximadamente 2000, de aproximadamente 1800 a aproximadamente 3500 o de aproximadamente 3200 a aproximadamente 5000 equivalentes molares de un reactivo de química clic.
En algunas realizaciones, el polisacárido de la invención conjugado con un reactivo de química clic comprende un grado de sustitución por química clic que es de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 100%, p. ej., de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,5%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 35%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 40%, de aproximadamente 35% a aproximadamente 50%, de aproximadamente 40% a aproximadamente 60%, de aproximadamente 50% a aproximadamente 75%, de aproximadamente 70% a aproximadamente 90% o de aproximadamente 85% a aproximadamente 100%. Por ejemplo, el polisacárido de la invención conjugado con un reactivo de química clic puede ser aproximadamente el 0,01%, aproximadamente el 0,05%, aproximadamente el 0,1%, aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95% o aproximadamente el 100%.
En algunas realizaciones, la concentración de polisacárido conjugado por química clic durante la formación del hidrogel, por ejemplo, la concentración del material de alginato presente en la solución inmediatamente antes de la formación del hidrogel, puede ser de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 50% de p/v, p. ej., de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 10% de p/v, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5% de p/v, de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% de p/v, de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% de p/v, de aproximadamente 12% a aproximadamente 35% de p/v, de aproximadamente 15% a aproximadamente 25% de p/v, de aproximadamente 20% a aproximadamente 45% de p/v o de aproximadamente 35% a aproximadamente 50% de p/v. Por ejemplo, la concentración del material de alginato presente en la solución inmediatamente antes de la formación del hidrogel puede ser aproximadamente el 0,01%, aproximadamente el 0,05%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45% o aproximadamente el 50%.
La rigidez del hidrogel puede depender del grado de sustitución por química clic y se puede determinar midiendo un módulo elástico (o un módulo de almacenamiento) G’. Por ejemplo, el G’ de un hidrogel de la invención puede variar de aproximadamente 0 a aproximadamente 40000 Pa cuando se mide con 1% de deformación a 1 Hz, p. ej., de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 Pa, de aproximadamente 50 a aproximadamente 300 Pa, de aproximadamente 100 a aproximadamente 450 Pa, de aproximadamente 130 a aproximadamente 600 Pa, de aproximadamente 300 a aproximadamente 450 Pa, de aproximadamente 500 a aproximadamente 900 Pa, de aproximadamente 600 a aproximadamente 1500 Pa, de aproximadamente 1200 a aproximadamente 2000 Pa o aproximadamente 1900 a aproximadamente 40000 Pa. Por ejemplo, el G’ de un hidrogel de la invención cuando se mide con 1% de deformación a 1 Hz, puede ser aproximadamente de 100 Pa, aproximadamente 200 Pa, aproximadamente 500 Pa, aproximadamente 1000 Pa, aproximadamente 1500 Pa, aproximadamente 2000 Pa, aproximadamente 2200 Pa, aproximadamente 2500 Pa o aproximadamente 3000 Pa.
En algunas realizaciones, el agente de reticulación es un péptido, p. ej., un péptido adhesivo celular. En consecuencia, un polisacárido reducido y/o altamente oxidado de la invención, p. ej., un polímero de alginato reducido y/o altamente oxidado, puede estar modificado por un péptido adhesivo celular, p. ej., un componente de la matriz extracelular de las células (ECM). El péptido adhesivo celular puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos arginina-glicina-aspartato (RGD). Los ejemplos incluyen la secuencia de aminoácidos argininaglicina-aspartato-cisteína (RGDC) (SEQ ID NO: 1) y arginina-glicina-aspartato-serina (RGDS) (SEQ ID NO: 2). En otros ejemplos, el péptido adhesivo celular comprende la secuencia de aminoácidos lisina-glutamina-alanina-glicinaaspartato-valina (KQAGDV) (SEQ ID NO: 3) o valina-alanina-prolina-glicina (VAPG) (SEQ ID NO: 4). En algunos ejemplos, el péptido adhesivo celular es CGGGGRGDSP (SEQ ID NO: 5). Se pueden usar otros péptidos adhesivos celulares según la aplicación deseada y serán evidentes para un experto en la técnica.
En algunos casos, el péptido adhesivo celular se une covalentemente al polisacárido reducido y/o altamente oxidado mediante una reacción de tiol-eno, p. ej., a través de la fotoquímica de tiol-eno. Por ejemplo, el péptido adhesivo celular se puede unir covalentemente al polisacárido (p. ej., un polímero de alginato) antes o después de la reticulación del polisacárido para formar un hidrogel. Ese uso de la reacción de tiol-eno para unir covalentemente el péptido adhesivo celular con el polisacárido, es significativamente más rápido y más eficiente que los métodos descritos previamente, tales como los métodos que usan agentes activadores de carboxilo (p. ej., e DC) para acoplar el péptido con el polímero.
IV. Hidrogeles de la invención
Los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados descritos en este documento se pueden usar para preparar hidrogeles para aplicaciones terapéuticas. Los hidrogeles preparados a partir de polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados, p. ej., alginatos reducidos y/o altamente oxidados, son biodegradables y no son tóxicos, en comparación con los hidrogeles preparados a partir de los polisacáridos oxidados, p. ej., alginatos oxidados. En algunas realizaciones, cuando los hidrogeles preparados usando los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados de la invención encapsulan una célula, se observa menos toxicidad celular, en comparación con el hidrogel preparado a partir de los polisacáridos oxidados. En otras realizaciones en las que los hidrogeles producidos a partir de los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados de la invención se utilizan para encapsular un agente terapéutico, p. ej., una proteína, se observa menos daño proteico que en comparación con el hidrogel preparado a partir de polisacáridos oxidados. En realizaciones, en las que los hidrogeles producidos a partir de los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados de la invención se utilizan para encapsular una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, la nanopartícula a base de lípidos se administra intacta en una ubicación deseada dentro de un hospedador.
Los hidrogeles de la invención se pueden usar para preparar una forma de dosificación que comprende un agente terapéutico o de diagnóstico encapsulado por los hidrogeles de la invención. Los hidrogeles de la invención también se pueden usar para preparar un dispositivo implantable que puede comprender un agente terapéutico o de diagnóstico. Los hidrogeles de la invención también se pueden usar para preparar una composición de administración de fármacos que comprende una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico y el hidrogel de la invención que encapsula la nanopartícula a base de lípidos.
Actualmente se ha descubierto que los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados de la invención son útiles para preparar hidrogeles en los que un tamaño de malla promedio, medido como un diámetro promedio de los poros, varía dentro de un intervalo relativamente amplio. Por ejemplo, los hidrogeles preparados usando los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados de la invención pueden tener poros con un diámetro promedio que varía de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 500 nm, p. ej., de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 0,5 nm a aproximadamente 5 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 25 nm a aproximadamente 80 nm, de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 250 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 350 nm, de aproximadamente 250 nm a aproximadamente 400 nm o de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 500 nm. En algunas realizaciones, los hidrogeles de la invención pueden tener poros con un diámetro promedio de aproximadamente 0,5 nm, aproximadamente 1 nm, aproximadamente 5 nm, aproximadamente 10 nm, aproximadamente 15 nm, aproximadamente 20 nm, aproximadamente 25 nm, aproximadamente 30 nm, aproximadamente 35 nm, aproximadamente 40 nm, aproximadamente 45 nm, aproximadamente 50 nm, aproximadamente 55 nm, aproximadamente 60 nm, aproximadamente 65 nm, aproximadamente 70 nm, aproximadamente 75 nm, aproximadamente 80 nm, aproximadamente 85 nm, aproximadamente 90 nm, aproximadamente 95 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 250 nm, aproximadamente 300 nm, aproximadamente 350 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 450 nm o aproximadamente 500 nm. Se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados también forman parte de esta invención.
En un ejemplo, los hidrogeles de la invención tienen un tamaño de poro promedio sorprendentemente pequeño, p. ej., un diámetro promedio de aproximadamente 10 nm o menos. En algunas realizaciones, el diámetro del poro en un hidrogel de la invención es aproximadamente 10,00 nm o menos, aproximadamente 9,5 nm o menos, aproximadamente 9,0 nm o menos, aproximadamente 8,5 nm o menos, aproximadamente 8,0 nm o menos, aproximadamente 7,5 nm o menos, aproximadamente 7,0 nm o menos, aproximadamente 6,5 nm o menos, aproximadamente 6,0 nm o menos, aproximadamente 5,5 nm o menos, aproximadamente 5,0 nm o menos, aproximadamente 4,5 nm o
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menos, aproximadamente 4,0 nm o menos, aproximadamente 3,5 nm o menos, aproximadamente 3,0 nm o menos, aproximadamente 2,5 nm o menos, aproximadamente 2,0 nm o menos, aproximadamente 1,5 nm o menos o aproximadamente 1 nm o menos. Por ejemplo, el hidrogel de la invención puede comprender poros que tienen un diámetro promedio de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 4 nm, de aproximadamente 7 nm a aproximadamente 3 nm, de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 1 nm, de aproximadamente 4 nm a aproximadamente 2 nm o de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 0,5 nm. Se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados también forman parte de esta invención.
Por consiguiente, los hidrogeles de la invención se pueden usar para encapsular un agente terapéutico o de diagnóstico, o para encapsular una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma que comprende un agente terapéutico o de diagnóstico, de bajo peso molecular. Por ejemplo, los hidrogeles de la invención se pueden usar para encapsular agentes terapéuticos o de diagnóstico, o una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, que encapsula los agentes terapéuticos o de diagnóstico, p. ej., polipéptidos, que tienen un peso molecular de 1000 kDa o menos, p. ej., 950 kDa o menos, 900 kDa o menos, 850 kDa o menos, 800 kDa o menos, 750 kDa o menos, 700 kDa o menos, 650 kDa o menos, 600 kDa o menos, 550 kDa o menos, 500 kDa o menos, 450 kDa o menos, 400 kDa o menos, 350 kDa o menos, 300 kDa o menos, 250 kDa o menos, 200 kDa o menos, 150 kDa o menos, 100 kDa o menos, 90 kDa o menos, 80 kDa o menos, 70 kDa o menos, 60 kDa o menos, 50 kDa o menos, 40 kDa o menos, 30 kDa o menos, 20 kDa o menos, 10 kDa o menos, 8 kDa o menos, 6 kDa o menos, 4 kDa o menos, 2 kDa o menos, 1 kDa o menos, 0,8 kDa o menos, 0,6 kDa o menos, 0,4 kDa o menos, 0,2 kDa o menos o 0,1 kDa o menos.
En algunas realizaciones, un agente terapéutico o de diagnóstico que puede estar encapsulado por el hidrogel de la invención, o por una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, encapsulado por el hidrogel de la invención, no difunde a través de los poros del hidrogel porque los poros del hidrogel son suficientemente pequeños, en comparación con el tamaño del agente terapéutico. Por consiguiente, la liberación del agente terapéutico desde el hidrogel se produce gradualmente tras la biodegradación del hidrogel dentro de un sujeto. Esto proporciona una liberación sostenida del agente terapéutico o de diagnóstico, o una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, que encapsula el agente terapéutico o de diagnóstico, en el sujeto, por ejemplo, un ser humano.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "agente terapéutico o de diagnóstico" que está encapsulado por los hidrogeles de la invención, incluye cualquier agente que se pueda usar para tratar, prevenir o diagnosticar un trastorno en un sujeto que lo necesite. Un agente terapéutico o de diagnóstico puede ser una célula, p. ej., una célula de mamífero, tal como una célula madre mesenquimática humana (hMSC), una molécula pequeña o un material biológico. El material biológico puede ser un péptido, una proteína, una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de PNA, un anticuerpo o una vacuna. Los agentes terapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los que se encuentran en Harrison's Principies of Infernal Medicine, l3 a edición, compiladores T.R. Harrison et al. McGraw-Hill N.Y., NY; Physicians' Desk Reference, 50a edición, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.; Pharmacological Basis of Therapeutics, 8a edición, Goodman and Gilman, 1990; United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990; edición actual de Goodman and Oilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics; y una edición actual de The Merck Index.
En algunas realizaciones, un agente terapéutico o de diagnóstico encapsulado por el hidrogel de la invención, o por una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, encapsulado por el hidrogel de la invención, puede comprender un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en una molécula orgánica pequeña, una molécula inorgánica pequeña; un azúcar; un monosacárido; un disacárido; un trisacárido; un oligosacárido; un polisacárido; un péptido; una proteína; un análogo de péptido; un derivado peptídico; un peptidomimético; un anticuerpo (policlonal o monoclonal); un fragmento de un anticuerpo que se une a antígeno; un ácido nucleico, p. ej., un oligonucleótido, un oligonucleótido antisentido, ARNsi, ARNsh, una ribozima, un aptámero, microARN, premicroARN, ARNi, ADN plasmídico (p. ej. un ADN plasmídico condensado), ARN modificado, un análogo o derivado de ácido nucleico; un extracto elaborado a partir de materiales biológicos como bacterias, plantas, hongos o células animales; tejidos animales; composiciones naturales o sintéticas; y cualquier combinación de los mismos. El ácido nucleico puede comprender uno o varios nucleótidos no naturales. El péptido o la proteína pueden comprender uno o varios aminoácidos no naturales.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "molécula pequeña" puede referirse a un compuesto que es "similar a un producto natural", sin embargo, la expresión "molécula pequeña" no se limita a compuestos "similares a un producto natural". Más bien, una molécula pequeña se caracteriza típicamente por que contiene varios enlaces carbono-carbono y tiene un peso molecular de menos de 5000 Dalton (5 kD), preferiblemente menos de 3 kD, aún más preferiblemente menos de 2 kD y lo más preferiblemente menos de 1 kD. En algunos casos, se prefiere que una molécula pequeña tenga una masa molecular igual o inferior a 700 Dalton.
Tal y como se usa en este documento, el término "péptido" se usa en su sentido más amplio para referirse a compuestos que contienen aminoácidos, equivalentes de aminoácidos u otros grupos no amino, mientras que aún conservan la actividad funcional deseada de un péptido. Los equivalentes de péptidos pueden diferir de los péptidos convencionales por la sustitución de uno o varios aminoácidos por ácidos orgánicos relacionados (tales como PABA), aminoácidos o similares, o la sustitución o modificación de cadenas laterales o grupos funcionales. Los péptidos pueden ser lineales o cíclicos. Un péptido se puede modificar para incluir uno o varios de D-aminoácidos, beta-aminoácidos, aminoácidos modificados químicamente, aminoácidos no proteogénicos naturales, aminoácidos raros y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica por ser características de un aminoácido.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "ácido nucleico" u "oligonucleótido" significa al menos dos nucleótidos, que incluyen análogos o derivados de los mismos, que están unidos covalentemente entre sí. Los oligonucleótidos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, ARNsi monocatenarios y bicatenarios y otros reactivos de interferencia de ARN (agentes de ARNi o agentes de iARN), ARNsh (ARNs de horquilla corta), oligonucleótidos antisentido, aptámeros, ribozimas y microARN (miARN). Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. El ácido nucleico puede ser ADN, ARN o un híbrido, en donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos, y cualquier combinación de uracilo, adenina, timina, citosina y guanina. Una molécula de ARN se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en un ARNm, un ARNi, un ARNsi, un ARNsh, un microARN, un ARNis, un ARNInc y un ARN antisentido.
El ácido nucleico también puede incluir uno o varios nucleótidos no naturales. Por ejemplo, el ácido nucleico puede comprender una o varias modificaciones de ácido nucleico conocidas en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden comprender una o varias modificaciones de la cadena principal, p. ej., fosforamida (Beaucage et al., Tefrahedron 49(10): 1925 (1993) y referencias en el mismo; Letsinger, J. Org. Chem. 35: 3800 (1970)), fosforotioato, fosforoditioato, enlaces O-metilfoforoamidita (véase, Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), o enlaces de péptido y ácido nucleico (véase, Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 (1992); Meier et al., Chem. Inf. Ed. Engl. 31:1008 (1992); y Nielsen, Nafure, 365: 566 (1993). Los ácidos nucleicos también pueden incluir modificaciones de bases nucleicas y/o restos de azúcar de nucleótidos.
Ejemplos de modificaciones de un azúcar en el resto de azúcar incluyen reemplazar 2'-OH con halógenos (p. ej., flúor), O-metilo, O-metoxietilo, NH2, SH y S-metilo.
En algunas realizaciones, la expresión "agente terapéutico o de diagnóstico" comprende material biológico, por ejemplo, un material de matriz extracelular tal como fibronectina, vitronectina y laminina; citocinas; un factor de crecimiento; un factor de diferenciación, un ácido nucleico; una proteína; un péptido; un anticuerpo o un fragmento del mismo o una porción del mismo que se une a antígeno, o una célula.
Los factores de crecimiento y las citocinas adecuadas que se pueden incorporar en los hidrogeles de la invención incluyen, pero no se limitan a, factor de células madre (SCF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor 1 derivado de células estromales, factor de acero, VEGF, TGFp, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoyetinas (Ang), factor de crecimiento epidérmico (EGF), bFGF, HNF, NGF, proteína morfogénica ósea (BMP), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), interleucina (IL)-3, IL-1 a, IL-1 p, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 e IL-13, factores estimulantes de colonias, trombopoyetina, eritropoyetina, ligando de fit3 y factor de necrosis tumoral a (TNFa). Otros ejemplos se describen en Dijke et al., "Growth Factors for Wound Healing'', Bio/Technology, 7:793-798 (1989); Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF, compiladores, Clinicians' Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4a ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85; Ziegler T.R., Pierce, G.F., y Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlag.
Ejemplos de agentes terapéuticos o de diagnóstico que se pueden incorporar en los hidrogeles de la invención, o incorporar en las nanopartículas a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, encapsular en los hidrogeles de la invención, incluyen, pero no se limitan a, fármacos analgésicos narcóticos; sales de oro; corticosteroides; hormonas; fármacos antipalúdicos; derivados de indol; productos farmacéuticos para el tratamiento de la artritis; antibióticos que incluyen tetraciclinas, penicilina, estreptomicina y aureomicina; fármacos antihelmínticos y contra el moquillo canino, aplicados a animales domésticos y a ganado de gran tamaño, tales como, por ejemplo, fenotiazina; fármacos a base de azufre, como sulfioxazol; fármacos antitumorales; productos farmacéuticos que supervisan las adicciones, tales como agentes que controlan la adicción al alcohol y agentes que controlan la adicción al tabaco; antagonistas de la adicción a las drogas, tales como metadona; fármacos para controlar el peso; fármacos para el control de la glándula tiroides; analgésicos; fármacos que controlan las hormonas de fertilización o anticoncepción; anfetaminas; fármacos antihipertensivos; agentes antiinflamatorios; antitusivos; sedantes relajantes neuromusculares; fármacos antiepilépticos; antidepresivos; fármacos antidisrítmicos; fármacos vasodilatadores; diuréticos antihipertensivos; agentes antidiabéticos; anticoagulantes; agentes antituberculosis; agentes antipsicóticos; hormonas y péptidos. Se entiende que la lista anterior no está completa y simplemente representa la amplia diversificación de agentes terapéuticos que pueden incluirse en las composiciones. En algunas realizaciones, el agente terapéutico es mitoxantrona, péptido, anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo que se une a antígeno, proteína (p. ej. VEGF) o ADN plasmídico.
Los expertos en la técnica reconocerán muchos otros agentes terapéuticos o de diagnóstico que pueden incorporarse en los hidrogeles de la invención, o en nanopartículas basadas en lípidos, p. ej., liposomas o virosomas, encapsulados por los hidrogeles de la invención. Los ejemplos incluyen un radiosensibilizador, un esteroide, una xantina, un broncodilatador agonista de beta-2, un agente antiinflamatorio, un agente analgésico, un antagonista de calcio, un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina, un betabloqueante, un alfa-agonista activo centralmente, un alfa-1-antagonista, un agente anticolinérgico/antiespasmódico, un análogo de vasopresina, un agente antiarrítmico, un agente antiparkinsoniano, un agente antiangina/antihipertensivo, un agente anticoagulante, un agente antiplaquetario, un sedante, un agente ansiolítico, un agente peptídico, un agente biopolimérico, un agente antineoplásico, un laxante, un agente antidiarreico, un agente antimicrobiano, un agente antifúngico, una vacuna, una proteína o un ácido nucleico. En un aspecto adicional, el agente farmacéuticamente activo puede ser cumarina, albúmina, esteroides tales como betametasona, dexametasona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona, budesonida, hidrocortisona y derivados de hidrocortisona farmacéuticamente aceptables; xantinas tales como teofilina y doxofilina; broncodilatadores agonistas de beta-2 tales como salbutamol, fenterol, clenbuterol, bambuterol, salmeterol, fenoterol; agentes antiinflamatorios, incluyendo agentes antiinflamatorios antiasmáticos, agentes antiinflamatorios antiartritis y agentes antiinflamatorios no esteroideos, cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, sulfuros, mesalamina, budesonida, salazopirina, diclofenaco, sales de diclofenaco farmacéuticamente aceptables, nimesulida, naproxeno, acetaminofeno, ibuprofeno, ketoprofeno y piroxicam; agentes analgésicos como salicilatos; bloqueadores de los canales de calcio tales como nifedipina, amlodipina y nicardipina; inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina tales como captopril, clorohidrato de benazepril, fosinopril sódico, trandolapril, ramipril, lisinopril, enalapril, clorohidrato de quinapril y clorohidrato de moexipril; beta bloqueantes (es decir, agentes bloqueadores de beta adrenérgicos) tales como clorohidrato de sotalol, maleato de timolol, clorohidrato de esmolol, carteolol, clorohidrato de propanolol, clorohidrato de betaxolol, sulfato de penbutolol, tartrato de metoprolol, succinato de metoprolol, clorohidrato de acebutolol, atenolol, pindolol y fumarato de bisoprolol; agonistas de alfa-2 centralmente activos tales como clonidina; antagonistas de alfa-1 tales como doxazosina y prazosina; agentes anticolinérgicos/antiespasmódicos tales como clorohidrato de diciclomina, bromohidrato de escopolamina, glicopirrolato, bromuro de clidinio, flavoxato y oxibutinina; análogos de vasopresina tales como vasopresina y desmopresina; agentes antiarrítmicos tales como quinidina, lidocaína, clorohidrato de tocainida, clorohidrato de mexiletina, digoxina, clorohidrato de verapamilo, clorohidrato de propafenona, acetato de flecainida, clorohidrato de procainamida, clorohidrato de moricizina y fosfato de disopiramida; agentes antiparkinsonianos, tales como dopamina, L-Dopa/Carbidopa, selegilina, dihidroergocriptina, pergolida, lisurida, apomorfina y bromocriptina; agentes antiangina y agentes antihipertensivos tales como mononitrato de isosorbida, dinitrato de isosorbida, propranolol, atenolol y verapamilo; agentes anticoagulantes y antiplaquetarios tales como cumadina, warfarina, ácido acetilsalicílico y ticlopidina; sedantes como benzodiazapinas y barbitúricos; agentes ansiolíticos tales como lorazepam, bromazepam y diazepam; agentes peptídicos y biopoliméricos tales como calcitonina, leuprolida y otros agonistas de LHRH, hirudina, ciclosporina, insulina, somatostatina, protirelina, interferón, desmopresina, somatotropina, timopentina, pidotimod, eritropoyetina, interleucinas, melatonina, granulocito/macrófago-CSF, y heparina; agentes antineoplásicos tales como etopósido, fosfato de etopósido, ciclofosfamida, metotrexato, 5-fluorouracilo, vincristina, doxorrubicina, cisplatino, hidroxiurea, leucovorina cálcica, tamoxifeno, flutamida, asparaginasa, altretamina, mitotano y clorhidrato de procarbazina; laxantes tales como concentrado de sen, casantranol, bisacodilo y picosulfato de sodio; agentes antidiarreicos tales como clorhidrato de difenoxina, clorhidrato de loperamida, furazolidona, clorhidrato de difenoxilato y microorganismos; vacunas tales como vacunas bacterianas y víricas; agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas y macrólidos, agentes antifúngicos tales como derivados imidazólicos y triazólicos; y ácidos nucleicos tales como secuencias de ADN que codifican proteínas biológicas y oligonucleótidos antisentido. Los agentes anticancerígenos incluyen agentes alquilantes, agentes de platino, antimetabolitos, inhibidores de topoisomerasa, antibióticos antitumorales, agentes antimitóticos, inhibidores de aromatasa, inhibidores de timidilato sintasa, antagonistas de ADN, inhibidores de farnesiltransferasa, inhibidores de la bomba, inhibidores de histona acetiltransferasa, inhibidores de metaloproteinasa, inhibidores de ribonucleósido reductasa, agonistas/antagonistas de TNF alfa, antagonistas del receptor de endotelina A, agonistas del receptor del ácido retinoico, inmunomoduladores, agentes hormonales y antihormonales, agentes fotodinámicos e inhibidores de tirosina cinasa. Los antibióticos incluyen aminoglucósidos (p. ej., gentamicina, tobramicina, netilmicina, estreptomicina, amikacina, neomicina), bacitracina, corbapenémicos (p. ej., imipenem/cislastatina), cefalosporinas, colistina, metenamina, monobactamas (p. ej., aztreonam), penicilinas (p. ej., penicilina G, penicilina V, meticilina, natcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, piperacilina, mezlocilina, azlocilina), polimixina B, quinolonas y vancomicina; y agentes bacteriostáticos tales como cloranfenicol, clindanyan, macrólidos (p. ej., eritromicina, azitromicina, claritromicina), lincomyan, nitrofurantoína, sulfonamidas, tetraciclinas (p. ej., tetraciclina, doxiciclina, minociclina, demeclociclina) y trimetoprima. También se incluyen metronidazol, fluoroquinolonas y ritampina.
Los inhibidores de enzimas son unas sustancias que inhiben una reacción enzimática. Ejemplos de inhibidores de enzimas incluyen cloruro de edrofonio, N-metil-fisostigmina, bromuro de neostigmina, sulfato de fisostigmina, tacrina, 1-hidroxi maleato de tacrina, yodotubercidina, p-bromotetramisol, clorohidrato de 10-(alfa-dietilaminopropionil)-fenotiazina, cloruro de calmidazolio, hemicolinio-3,3,5-dinitrocatecol, inhibidor I de diacilglicerol cinasa, inhibidor II de diacilglicerol cinasa, 3-fenil-propargilamina, acetato de N-monometil-L-arginina, carbidopa, 3-hidroxi-bencil-hidrazina, hidralazina, clorogilina, deprenilo, hidroxilamina, fosfato de iproniazida, 6-MeO-tetrahidro-9H-pirido-indol, nialamida, pargilina, quinacrina, semicarbazida, tranilcipromina, clorohidrato de 2,2-difenil-valerato de N,N-dietilaminoetilo, 3-isobutil-1-metil-xantina, papaverina, indometacind, clorohidrato de 2-ciclooctil-2-hidroxietilamina, 2,3-dicloro-ametilbencilamina (DCMB), clorohidrato de 8,9-dicloro-2,3,4,5-tetrahidro-1H-2-benzazepina, p-amino-glutetimida, tartrato de p-amino-glutetimida, 3-yodo-tirosina, alfa-metil-tirosina, acetazolamida, diclorofenamida, 6-hidroxi-2-benzotiazol-sulfonamida y alopurinol.
Las antihistaminas incluyen pirilamina, clorofeniramina y tetrahidrazolina, entre otras.
Los agentes antiinflamatorios incluyen corticoesteroides, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (p. ej., aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindac, tolmetina, ibuprofeno, piroxicam y fenamatos), acetaminofeno, fenacetina, sales de oro, cloroquina, D-penicilamina, metotrexato de colchicina, alopurinol, probenecida y sulfinpirazona.
Los agentes relajantes musculares incluyen mefenesina, metocarbomal, clorohidrato de ciclobenzaprina, clorohidrato de trihexilfenidilo, levodopa/carbidopa y biperidén.
Los antiespasmódicos incluyen atropina, escopolamina, oxifenonio y papaverina.
Los analgésicos incluyen aspirina, fenilbutazona, indometacina, sulindac, tolmetic, ibuprofeno, piroxicam, fenamatos, acetaminofeno, fenacetina, sulfato de morfina, sulfato de codeína, meperidina, nalorfina, opioides (p. ej., sulfato de codeína, citrato de fentanilo, bitartrato de hidrocodona, loperamida, sulfato de morfina, noscapina, norcodeina, normorfina, tebaína, nor-binaltorfimina, buprenorfina, cloronaltrexamina, funaltrexamiona, nalbufina, nalorfina, naloxona, naloxonazina, naltrexona y naltrindol), procaína, lidocaína, tetracaína y dibucaína.
Los agentes oftálmicos incluyen fluoresceína sódica, rosa de Bengala, metacolina, adrenalina, cocaína, atropina, alfa-quimotripsina, hialuronidasa, betaxalol, pilocarpina, timolol, sales de timolol, y sus combinaciones.
Las prostaglandinas están reconocidas en la técnica y son una clase de ácidos hidroxi grasos de cadena larga relacionados químicamente entre sí, que se presentan en la naturaleza, los cuales tienen una diversidad de efectos biológicos.
Los agentes antidepresivos son unas sustancias capaces de prevenir o aliviar una depresión. Ejemplos de agentes antidepresivos incluyen imipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, desipramina, amoxapina, doxepina, maprotilina, tranilcipromina, fenelzina e isocarboxazida.
Los factores tróficos son unos factores cuya presencia continuada mejora la viabilidad o longevidad de una célula. Los factores tróficos incluyen, sin ninguna limitación, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGP), proteína activadora de neutrófilos, proteína quimioatrayente de monocitos, proteína inflamatoria de macrófagos, factor plaquetario, proteína básica plaquetaria y actividad estimuladora del crecimiento de melanomas; factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante (alfa), factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas, factor de crecimiento similar a insulina, factor neurotrófico del crecimiento derivado de la glía, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento de hueso/inductor de cartílago (alfa y beta), proteínas morfogéneticas óseas, interleucinas (p. ej., inhibidores de interleucinas o receptores de interleucinas, incluyendo desde la interleucina 1 hasta la interleucina 10), interferones (p. ej., interferones alfa, beta y gamma), factores hematopoyéticos, incluyendo eritropoyetina, factor estimulador de colonias de granulocitos, factor estimulador de colonias de macrófagos y factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, factores de necrosis tumoral, factores de crecimiento transformante (beta), incluyendo beta-1, beta-2, beta-3, inhibina y activina.
Las hormonas incluyen estrógenos (p. ej., estradiol, estrona, estriol, dietilestibestrol, quinestrol, clorotrianiseno, etinil estradiol, mestranol), antiestrógenos (p. ej., clomifeno, tamoxifeno), progestinas (p. ej., medroxiprogesterona, noretindrona, hidroxiprogesterona, norgestrel), antiprogestinas (mifepristona), andrógenos (p. ej., cipionato de testosterone, fluoximesterona, danazol, testolactona), antiandrógenos (p. ej., acetato de ciproterona, flutamida), hormonas tiroideas (p. ej., triyodotironina, tiroxina, propiltiouracilo, metimazol y yodixoda), y hormonas de la pituitaria (p. ej., corticotropina, sumutotropina, oxitocina y vasopresina). Las hormonas se emplean corrientemente en una terapia por reemplazo hormonal y/o para finalidades del control de partos. Las hormonas esteroides tales como la prednisona, se usan también como agentes inmunosupresores y antiinflamatorios.
El agente terapéutico o de diagnóstico puede ser una proteína osteogénica. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el agente terapéutico o de diagnóstico se selecciona a partir de la familia de proteínas conocida como superfamilia de proteínas de factores de crecimiento transformantes beta (TGF-p), que incluye las activinas, las inhibinas y las proteínas morfogenéticas óseas (BMPs). Lo más preferiblemente, el agente activo incluye al menos una proteína seleccionada a partir de la subclase de proteínas conocidas generalmente como BMPs, que se ha descrito que tienen actividad osteogénica y otras actividades de tipo de crecimiento y diferenciación. Estas BMPs incluyen las proteínas BMP BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP5, BMP-6 y BMP-7, descritas por ejemplo en los documentos de patente de EE.UU. n25.108.922; 5.013.649; 5.116.738; 5.106.748; 5.187.076; y 5.141.905; BMP-8, descrita en el documento de publicación PCT WO91/18098; y BMP-9, descrita en el documento de publicación PCT WO93/00432, BMP-10, descrita en el documento de solicitud PCT WO94/26893; BMP-11, descrita en el documento de solicitud PCT WO94/26892, o BMP-12 o BMP-13, descritas en el documento de solicitud PCT WO 95/16035; BMP-14; BMP-15, descritas en el documento de patente de EE.UU. n° 5.635.372; o BMP-16, descrita en el documento de patente de EE.UU. n° 5.965.403. Otras proteínas TGF-p, que pueden usarse incluyen Vgr-2, Jones et al., Mol. Endocrinol. 611961 (1992), y cualquiera de los factores de crecimiento y diferenciación (GDFs), incluyendo los descritos en los documentos de solicitud PCT WO94/15965; WO94/15949; WO95/01801; WO95/01802; WO94/21681; WO94/15966; WO95/10539; WO96/01845; WO96/02559 y otros. También puede ser útil en la invención BIP, descrita en el documento WO94/01557; HP00269, descrita en el documento de publicación de JP número: 7-250688; y BMP-14 (también conocida como MP52, CDMP1 y GDF5), descrita en el documento de solicitud PCT WO93/16099. Los subgrupos de BMPs que se pueden utilizar incluyen BMP-2, BMP-3, BMP-3b, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, BMP-16, BMP-17 y BMP18. También se pueden utilizar otros agentes osteogénicos conocidos en la técnica, tales como teriparatida (FORTEO™), CHRYSALIN®, prostaglandina E2 o proteína LIM, entre otros.
El agente terapéutico o de diagnóstico, p. ej, una proteína o un péptido, puede producirse de forma recombinante o se puede purificar a partir de una composición proteica. El agente activo, si es un TGF-p tal como una BMP u otra proteína dimérica, puede ser homodimérico o puede ser heterodimérico con otras BMPs (p. ej., un heterodímero compuesto por un monómero cada uno de BMP-2 y BMP-6) o con otros miembros de la superfamilia TGF-p, tales como activinas, inhibinas y TGF-p1 (p. ej., un heterodímero compuesto por un monómero, cada uno de una BMP y un miembro relacionado de la superfamilia TGF-p). Ejemplos de tales proteínas heterodiméricas se describen, por ejemplo, en el documento de solicitud de patente PCT publicada WO 93/09229.
El agente terapéutico o de diagnóstico puede referirse además a agentes adicionales tales como las proteínas Hedgehog, Frazzled, Cordina, Nogina, Cerberus y Foliestatina. Estas familias de proteínas se describen en general en Sasai et al., (1994) Cell 791779-790 (Cordina); documento de publicación de patente PCT WO94/05800 (Nogina); y Fukui et al., Devel. Biol. 159: 1-31 (1993) (Foliestatina). Las proteínas Hedgehog se describen en los documentos WO96/16668; WO96/17924; y WO95/18856. La familia de proteínas Frazzled es una familia de proteínas recientemente descubierta con alta homología con el dominio de unión extracelular de la familia de proteínas receptoras conocida como Frizzled. La familia de genes y proteínas Frizzled se describe en Wang et al., Biol. Chem.
271: 44684476 (1996). El agente activo también puede incluir otros receptores solubles, tales como los receptores solubles truncados descritos en el documento de publicación de patente PCT WO95/07982. A partir de las enseñanzas del documento WO95/07982, un experto en la técnica reconocerá que se pueden preparar receptores solubles truncados para numerosas proteínas receptoras distintas.
Los hidrogeles de la invención pueden comprender células. Las células susceptibles de estar encapsuladas en los hidrogeles de la invención incluyen, pero no se limitan a, células madre (células madre embrionarias, células madre mesenquimáticas, células madre obtenidas a partir de la médula ósea y células madre hematopoyéticas), células progenitoras de condrocitos, células progenitoras pancreáticas, mioblastos, fibroblastos, queratinocitos, células neuronales, células gliales, astrocitos, preadipocitos, adipocitos, células endoteliales vasculares, células madre foliculares pilosas, células progenitoras endoteliales, células mesenquimáticas, células madre neurales y células progenitoras de músculo liso.
En algunas realizaciones, la célula es una célula modificada genéticamente. Una célula puede modificarse genéticamente para expresar y secretar un compuesto deseado, p. ej., un agente bioactivo, un factor de crecimiento, un factor de diferenciación, citocinas y similares. Los métodos para modificar genéticamente las células para que expresen y secreten compuestos de interés, son conocidos en la técnica y de fácil adaptación para un experto en la técnica.
También se pueden utilizar células diferenciadas que se han reprogramado en células madre. Por ejemplo, las células de la piel humana reprogramadas en células madre embrionarias mediante la transducción de Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4 (Junying Yu, et. al., Science, 2007, 318:1917-1920 y Takahashi K. et. al., Cell, 2007, 131:1-12).
Las células útiles para incorporarlas en la composición pueden provenir de cualquier fuente, p. ej., un mamífero. Por ejemplo, la célula puede ser de un ser humano, una rata o un ratón. Las células humanas incluyen, pero no se limitan a, miocitos cardíacos humanos-adultos (HCMa), fibroblastos dérmicos humanos-fetales (HDF-f), queratinocitos epidérmicos humanos (HEK), células madre mesenquimáticas humanas-médula ósea, células madre mesenquimáticas umbilicales humanas, células de la vaina de la raíz interna folicular del cabello humano, células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) y células del músculo liso de la vena umbilical humana (HUVSMC), células progenitoras endoteliales humanas, mioblastos humanos, células endoteliales capilares humanas y células madre neurales humanas.
Los ejemplos de células de rata y ratón incluyen, pero no se limitan a, RN-h (neuronas de rata-del hipocampo), RN-c (neuronas de rata-corticales), Ra (astrocitos de rata), células ganglionares de la raíz dorsal de rata, células neuroprogenitoras de rata, células madre embrionarias de ratón (mESC), células precursoras neurales de ratón, células progenitoras pancreáticas de ratón, células mesenquimáticas de ratón y células endodérmicas de ratón. En algunas realizaciones, se pueden usar líneas celulares de cultivo de tejidos en los hidrogeles descritos en este documento. Ejemplos de líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, células C166 (saco vitelino de ratón del día 12 embrionario), línea celular de glioma C6, HL1 (línea celular del músculo cardíaco), AML12 (hepatocitos no transformadores), células HeLa (línea celular de cáncer de cuello uterino) y células de ovario de hámster chino (células CHO).
Un experto en la materia puede localizar, aislar y expandir tales células. Además, los principios básicos de un cultivo celular y los métodos de localización, aislamiento y expansión y preparación de células para modificar genéticamente un tejido, se describen en "Culture of Cells for Tissue Engineering" compilador(es): Gordana Vunjak-Novakovic, R. Ian Freshney, 2006 John Wiley & Sons, Inc., y Heath C. A., Trends in Biotechnology, 2000, 18: 17-19. En una realización, el material biológico puede ser un péptido, p. ej., un péptido que tiene un peso molecular de 250 kDa o menos. En una realización adicional, el péptido es un factor de angiogénesis, p. ej., FGF, VEGF, VEGFR, IGF, NRP-1, Ang1, Ang2, PDGF, PDGFR, TGF-p, endoglina, un receptor de TGF-p, Mc P-1, integrina, un ligando de integrina (p. ej., un péptido RGD), VE-cadherina, CD31, efrina, activador del plasminógeno, inhibidor 1 del activador del plasminógeno, eNOS, COX-2, AC133, ID1 o ID3. En una realización específica, el péptido encapsulado en los hidrogeles de la presente invención es VEGF.
Los materiales biológicos, tales como polinucleótidos, polipéptidos u otros agentes (p. ej., antígenos) se purifican y/o se aíslan. Específicamente, tal y como se usa en este documento, una molécula "aislada" o "purificada" de ácido nucleico, polinucleótido, polipéptido o proteína está sustancialmente exenta de otro material celular o de medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Los compuestos purificados tienen al menos un 60% en peso (peso seco) del compuesto de interés. Las preparaciones de la presente invención también pueden tener al menos un 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 99% en peso del compuesto de interés. Por ejemplo, un compuesto purificado es uno que tiene al menos aproximadamente un 90%, aproximadamente un 91%, aproximadamente un 92%, aproximadamente un 93%, aproximadamente un 94%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 98%, aproximadamente un 99% o aproximadamente un 100% (p/p) del compuesto deseado en peso. La pureza se mide mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, mediante análisis por cromatografía en columna, cromatografía en capa fina o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Un polinucleótido purificado o aislado (ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN)) está exento de los genes o secuencias que lo flanquean en su estado natural. Purificado también define un grado de esterilidad que es seguro para la administración a un sujeto humano, p. ej., que carece de agentes infecciosos o tóxicos.
De manera similar, por "sustancialmente puro" se entiende que un nucleótido, un polipéptido u otro compuesto, se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Normalmente, los nucleótidos y los polipéptidos son sustancialmente puros cuando están al menos un 60%, aproximadamente un 70%, aproximadamente un 80%, aproximadamente un 90%, aproximadamente un 95%, aproximadamente un 99% o incluso un 100%, en peso, exentos de proteínas y de moléculas orgánicas de origen natural con las están asociados de forma natural. Los ejemplos incluyen compuestos sintetizados, compuestos recombinantes (p. ej., péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) o compuestos purificados, tales como los purificados mediante procedimientos estándar que incluyen métodos cromatográficos.
Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico, cuya estructura no es idéntica a la de ningún ácido nucleico de origen natural, ni a la de ningún fragmento de un ácido nucleico genómico de origen natural que incluye más de tres genes distintos. La expresión incluye, por ejemplo: (a) un ADN que forma parte de una molécula de ADN genómico natural, pero que no está flanqueado por las dos secuencias de ácido nucleico que flanquean esa parte de la molécula en el genoma del organismo en el que se encuentra de forma natural; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de una manera tal que la molécula resultante no es idéntica a ningún vector o ADN genómico de origen natural; (c) una molécula distinta, tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que forma parte de un hibridogén, es decir, un gen que codifica una proteína de fusión. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de acuerdo con la presente descripción incluyen además moléculas producidas sintéticamente, así como cualquier ácido nucleico que haya sido alterado químicamente y/o que tenga las estructuras principales modificadas.
El agente terapéutico o de diagnóstico que se puede encapsular en el hidrogel de la invención o en un liposoma encapsulado en el hidrogel de la invención, puede ser un adyuvante de STING, un reactivo de CRISPR-Cas 9 y una vesícula subcelular cargada con adyuvante obtenida a partir de células cancerígenas rotas.
En una realización, el agente terapéutico o de diagnóstico también puede ser una vacuna.
Los polímeros (p. ej., polímeros de alginato) del hidrogel puede estar reticulados en aproximadamente un 1-90%, p. ej., reticulados al menos aproximadamente un 1%, aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60% o aproximadamente un 70%. También se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados forman parte de esta invención. Por ejemplo, los polímeros del hidrogel pueden estar reticulados de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 10%, de aproximadamente un 7% a aproximadamente un 15%, de aproximadamente un 12% a aproximadamente un 20%, de aproximadamente un 15% a aproximadamente un 30%, de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 40%, de aproximadamente un 30% a aproximadamente un 50%, de aproximadamente un 45% a aproximadamente un 65% o de aproximadamente un 50% a aproximadamente un 90%. La expresión "reticulado en un %", utilizada indistintamente con la expresión "densidad de la reticulación", se refiere al número de moles de restos de química clic conjugados, por moles de monómeros de alginato que han reaccionado entre sí.
El polímero (p. ej., alginato) puede estar oxidado (p. ej., altamente oxidado), reducido o una mezcla de los mismos. Por ejemplo, un hidrogel de la invención puede comprender una mezcla de polímeros polisacáridos, p. ej., polímeros de alginato, que comprenden algoxinol y algoxalato. En algunos casos, los polímeros oxidados o los polímeros parcialmente oxidados son biodegradables. Por ejemplo, los hidrogeles que comprenden alginato oxidado o parcialmente oxidado, son biodegradables.
Agente terapéutico o de diagnóstico o una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico, se libera desde el hidrogel de la invención por medio de una liberación sostenida, p. ej., con una tasa constante durante un número determinado de horas, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 horas; o días, p. ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 días; o semanas, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 semanas; o meses, p. ej., 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses. Cuando un agente terapéutico o de diagnóstico o una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico, se libera desde el hidrogel de la invención con una tasa constante, la cantidad del agente terapéutico o de diagnóstico o la cantidad de nanopartícula a base de lípidos liberada desde el hidrogel en un período de tiempo dado, es aproximadamente la misma, p. ej., desde aproximadamente 0% a aproximadamente 20%, de la cantidad del agente terapéutico o de diagnóstico o la nanopartícula a base de lípidos liberada desde el hidrogel durante el período de tiempo inmediatamente anterior o inmediatamente posterior al período de tiempo dado.
La tasa de liberación del agente terapéutico o de diagnóstico o de la nanopartícula a base de lípidos que encapsula el agente terapéutico o de diagnóstico, se puede modular cambiando uno o varios parámetros durante la preparación del hidrogel. Esos parámetros incluyen, pero no se limitan a, el grado de sustitución por química clic; el % de oxidación de los polisacáridos; la concentración del polisacárido conjugado por química clic durante la reacción de reticulación (gelificación); o el pH del entorno circundante.
El grado de sustitución por química clic se puede modular variando el número de equivalentes molares del reactivo de química clic en la reacción de conjugación por química clic con el polisacárido oxidado y reducido o altamente oxidado, p. ej., algoxinol o algoxalato. Por ejemplo, se puede aumentar el número de moléculas de química clic conjugadas con un polisacárido de la invención, aumentando el número de equivalentes molares del reactivo de química clic en la reacción de conjugación por química clic. En otro ejemplo, se puede disminuir el número de moléculas de química clic conjugadas con un polisacárido de la invención disminuyendo el número de equivalentes molares del reactivo de química clic en la reacción de conjugación por química clic. En una realización, la reacción de conjugación por química clic puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 2000 equivalentes molares de un reactivo de química clic, p. ej., aproximadamente 1, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 300, aproximadamente 350, aproximadamente 400, aproximadamente 450, aproximadamente 500, aproximadamente 550, aproximadamente 600, aproximadamente 650, aproximadamente 700, aproximadamente 750, aproximadamente 800, aproximadamente 850, aproximadamente 900, aproximadamente 950 o aproximadamente 1000 equivalentes molares del reactivo de química clic. También se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados forman parte de esta invención. Por ejemplo, la reacción de conjugación por química clic puede comprender de aproximadamente 1 a aproximadamente 5, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 50, de aproximadamente 40 a aproximadamente 150, de aproximadamente 100 a aproximadamente 400, de aproximadamente 300 a aproximadamente 500, de aproximadamente 400 a aproximadamente 1000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 o de aproximadamente 1500 a aproximadamente 2000 equivalentes molares del reactivo de química clic.
En una realización, el polisacárido, p. ej., el polisacárido oxidado y reducido o uno altamente oxidado, p. ej., que comprende algoxinol o algoxalato, puede comprender un grado de sustitución por química clic que es de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 90%, p. ej., aproximadamente 0,01%, aproximadamente 0,05%, aproximadamente 0,1%, aproximadamente 0,5%, aproximadamente 1%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 25%, aproximadamente 30%, aproximadamente 35%, aproximadamente 40%, aproximadamente 45% o aproximadamente 90%. También se entiende que los intervalos intermedios de los valores enumerados forman parte de esta invención. Por ejemplo, el polisacárido puede estar sustituido por química clic de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,05%, de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 1%, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5%, de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, de aproximadamente 10% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 15% a aproximadamente 25%, de aproximadamente 20% a aproximadamente 35%, de aproximadamente 30% a aproximadamente 40% o de aproximadamente 35% a aproximadamente 50%.
También se puede modular el número de moléculas de química clic conjugadas con un polisacárido de la invención, modulando el % de oxidación del polisacárido. Por ejemplo, un % de oxidación más elevado del polisacárido antes de su reducción, p. ej., con borazano, o antes de su oxidación adicional, p. ej., con clorito de sodio, puede crear restos de aldehído adicionales, que, tras su conversión en restos de alcohol después de una reducción, o en restos de ácido carboxílico tras una oxidación adicional, pueden servir como sitios para una conjugación del reactivo de química clic.
Modular el grado de sustitución por química clic del polisacárido de la invención puede permitir modular el tiempo de gelificación, o el tiempo que tarda el polisacárido conjugado por química clic en reticularse y producir un hidrogel. Por ejemplo, un mayor grado de sustitución por química clic puede dar lugar a tiempos de gelificación más cortos.
Modular el grado de sustitución por química clic también permite modular la densidad de la reticulación y el diámetro promedio de los poros en el hidrogel resultante, es decir, el tamaño de malla del hidrogel resultante. Por ejemplo, un mayor grado de sustitución por química clic puede conducir a un diámetro de poro promedio más pequeño, o a un menor tamaño de malla del hidrogel, lo que puede conducir a una menor tasa de liberación del agente terapéutico o de diagnóstico o de una nanopartícula a base de lípidos. p. ej., un liposoma o un virosoma, que comprende el agente terapéutico o de diagnóstico. Un mayor grado de sustitución por química clic también puede conducir a una retención más prolongada de las nanopartículas basadas en lípidos que comprenden el agente terapéutico o de diagnóstico en el hidrogel.
En otro ejemplo más, se puede variar la concentración del polisacárido de la invención durante la reacción de reticulación. Por ejemplo, una concentración más alta de un polisacárido, por ejemplo, un polisacárido conjugado por química clic, en la reacción de conjugación por química clic, puede conducir a un tamaño de malla más pequeño del hidrogel resultante, lo que puede, a su vez, causar una disminución de la tasa de liberación del agente terapéutico o del agente de diagnóstico o de una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, que comprende el agente terapéutico o de diagnóstico del hidrogel de la invención. Un mayor grado de sustitución por química clic también puede conducir a una retención más prolongada de las nanopartículas basadas en lípidos que comprenden el agente terapéutico o de diagnóstico en el hidrogel. En algunas realizaciones, la concentración de polisacárido conjugado por química clic durante la formación de hidrogel, p. ej., la concentración del material de alginato presente en la solución inmediatamente antes de la formación del hidrogel, puede ser de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 50% de p/v, p. ej., de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 10% de p/v, de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 5% de p/v, de aproximadamente 1% a aproximadamente 15% de p/v, de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% de p/v, de aproximadamente 12% a aproximadamente 35% de p/v, de aproximadamente 15% a aproximadamente 25% de p/v, de aproximadamente 20% a aproximadamente 45% de p/v o de aproximadamente 35% a aproximadamente 50% de p/v.
Los hidrogeles de la presente invención, p. ej., los hidrogeles que comprenden alginato, tales como los hidrogeles que comprenden algoxinol y/o algoxalato, no se degradan con las enzimas endógenas presentes en un hospedador o en un sujeto, p. ej., un ser humano. Los hidrogeles de la invención se pueden degradar químicamente, p. ej., hidrolizar cuando se exponen a condiciones ácidas o alcalinas. Las condiciones ácidas comprenden un pH de 6,5 o inferior, mientras que las condiciones alcalinas comprenden un pH de 8 o superior. Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que la tasa de degradación química de los hidrogeles de la invención depende del pH. Por ejemplo, la tasa de degradación química de los hidrogeles de la invención a pH 2 es más alta que a pH 6, y la tasa de degradación química de los hidrogeles de la invención a pH 8 es más alta que a pH 12.
Cuando el hidrogel de la invención se expone a condiciones ácidas o alcalinas, la carga comprendida en el hidrogel, p. ej., un agente terapéutico o de diagnóstico, o una nanopartícula a base de lípidos, p. ej., un liposoma o un virosoma, que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico, se libera desde el hidrogel con una tasa más elevada que en comparación con su tasa de liberación a pH neutro, p. ej., un pH de 7,4. Por ejemplo, debido a que el entorno intratumoral se puede caracterizar por un pH ácido de 6,5 o inferior, la tasa de liberación de la carga desde los hidrogeles de la invención se puede incrementar en el entorno intratumoral, permitiendo de ese modo una liberación sostenida y dirigida de los agentes anticancerígenos.
V. Nanopartículas a base de lípidos encapsuladas en los hidrogeles de la invención
La presente invención también proporciona una composición de administración de fármacos que comprende una nanopartícula a base de lípidos que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico y un hidrogel de la invención que encapsula el liposoma. La expresión "nanopartícula a base de lípidos", tal y como se usa en este documento, se refiere a cualquier nanopartícula que comprende lípidos y que se puede usar para la administración de un agente terapéutico o de diagnóstico a un sujeto. En una realización, la nanopartícula a base de lípidos es un liposoma. En otra realización, la nanopartícula a base de lípidos es un virosoma.
Puede ser deseable administrar un agente terapéutico o de diagnóstico en un liposoma porque los liposomas pueden proporcionar protección a esos agentes frente a una degradación enzimática sistémica, o pueden usarse para imitar células presentadoras de antígeno (APCs). Sin embargo, existen retos asociados con la administración de fármacos liposómicos. Por ejemplo, la composición de un liposoma puede tener un gran efecto sobre la eficacia de la carga, la eficacia del agente terapéutico o de diagnóstico encapsulado por el liposoma y la toxicidad sistémica del agente terapéutico o de diagnóstico encapsulado por el liposoma. Por consiguiente, existe la necesidad de una administración localizada y sostenida de un fármaco liposómico que pueda reducir la toxicidad sistémica y proporcionar una localización de las cargas de fármaco en los tejidos diana. Sin embargo, las composiciones de administración de liposomas disponibles en la actualidad no pueden retener cargas liposómicas, y la liberación de las cargas liposómicas se produce en horas o días. Las composiciones actualmente disponibles en la técnica tampoco pueden administrar liposomas intactos en ubicaciones diana, p. ej., en los casos en los que se requieren liposomas intactos para que las cargas atraviesen la membrana celular para una liberación citosólica.
Se ha descubierto sorprendentemente que los polisacáridos reducidos y/o altamente oxidados de la invención, p. ej., polisacáridos que comprenden algoxinol y/o algoxalato, p. ej., preparados usando un método descrito en este documento, son particularmente útiles para preparar hidrogeles que pueden usarse para encapsular liposomas. Específicamente, se ha descubierto sorprendentemente que los hidrogeles de la invención, p. ej., los hidrogeles preparados a partir de alginato que comprenden algoxinol y/o algoxalato conjugado con reactivos de química clic, pueden retener liposomas intactos durante un largo período de tiempo y pueden entregar los liposomas intactos en una ubicación deseada en un sujeto, p. ej., en el citosol de una célula.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "liposoma intacto" incluye un liposoma que conserva su tamaño, p. ej., el diámetro promedio, mientras que está encapsulado en un hidrogel, o mientras que está en el proceso de ser entregado en una ubicación deseada dentro de un hospedador o un sujeto, p. ej., un ser humano. Un liposoma intacto es aquel que imita el aporte terapéutico y no se fusiona con otros liposomas para generar liposomas polidispersos de mayor tamaño. p. ej., con un diámetro promedio mayor, ni se fragmenta en liposomas o micelas más pequeños.
El liposoma se puede entregar en una ubicación deseada, p. ej., en el citosol de una célula, en una forma intacta después de que el hidrogel que encapsula el liposoma se degrada dentro de un hospedador, p. ej., un sujeto, tal como un ser humano. En un ejemplo, el hidrogel comprende alginato, p. ej., algoxinol o algoxalato, que no se puede degradar con una enzima endógena del hospedador. Dado que el alginato, p. ej., algoxinol o algoxalato, no se puede degradar con una enzima endógena del hospedador, un hidrogel que comprende alginato es capaz de retener un liposoma durante un período de tiempo prolongado. Por ejemplo, un liposoma de la invención puede permanecer encapsulado en el hidrogel durante al menos 5 días, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días o al menos 80 días.
Un liposoma que permanece intacto durante la entrega en una ubicación deseada dentro de un hospedador o un sujeto, es un liposoma que conserva su tamaño promedio, p. ej., un diámetro promedio, durante la entrega. Por ejemplo, el diámetro promedio de un liposoma intacto que ha sido encapsulado en un hidrogel de la invención está dentro de aproximadamente el 50%, p. ej., aproximadamente el 49%, aproximadamente el 48%, aproximadamente el 47%, aproximadamente el 46%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 44%, aproximadamente el 43%, aproximadamente el 42%, aproximadamente el 41%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 39%, aproximadamente el 38%, aproximadamente el 37%, aproximadamente el 36%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 34%, aproximadamente el 33%, aproximadamente el 32%, aproximadamente el 31%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 29%, aproximadamente el 28%, aproximadamente el 27%, aproximadamente el 26%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 24%, aproximadamente el 23%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1%, del diámetro promedio del mismo liposoma antes de la encapsulación, o dentro de aproximadamente el 25%, p. ej., aproximadamente el 24%, aproximadamente el 23%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1%, del diámetro promedio de un modelo. El modelo puede ser un liposoma preparado de la misma manera que el liposoma usado para encapsular dentro de un hidrogel. El tamaño de un liposoma puede medirse mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, mediante dispersión de luz dinámica (DLS).
Un liposoma útil en el contexto de la presente invención puede ser cualquier liposoma conocido en la técnica que se puede emplear para administrar un agente terapéutico o de diagnóstico. Por ejemplo, el liposoma puede ser un liposoma neutro, p. ej., un liposoma que comprende lípidos no cargados (Niosoma). Ejemplos de tales lípidos incluyen, pero no se limitan a, 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y colesterol (CHOL). El liposoma también puede ser un liposoma cargado, p. ej., un liposoma catiónico o aniónico que comprende, p. ej., lípidos cargados positivamente o cargados negativamente. Ejemplos no limitantes de lípidos cargados positivamente incluyen metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) y fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Hydro Soy PC). Ejemplos no limitantes de lípidos cargados negativamente incluyen 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (DOPG). En algunas realizaciones, el liposoma útil en el contexto de la presente invención es un liposoma terapéutico o un liposoma de diagnóstico, p. ej., un liposoma que comprende un agente terapéutico o de diagnóstico tal y como se ha descrito anteriormente.
Un virosoma es un mecanismo de administración de fármacos o vacunas que consiste en una vesícula con membrana fosfolipídica unilamelar (ya sea monocapa o bicapa) que incorpora proteínas obtenidas a partir de un virus para permitir que los virosomas se fusionen con las células diana. Los virosomas no pueden replicarse, pero son vesículas puras, activas mediante fusión. Un virosoma útil en el contexto de la presente invención puede ser cualquier virosoma conocido en la técnica que se puede emplear para administrar cualquier proteína obtenida a partir de un virus. En algunas realizaciones, el virosoma puede comprender una proteína obtenida a partir de un virus de la influenza, p. ej., hemaglutinina o neuraminidasa. En algunas realizaciones, un virosoma es un virosoma terapéutico o de diagnóstico, p. ej., un virosoma que comprende un agente terapéutico o de diagnóstico como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, un virosoma comprende una vacuna.
VI. Composiciones farmacéuticas de la invención
Para la administración a un sujeto, los hidrogeles de la invención se pueden proporcionar en composiciones farmacéuticamente aceptables (p. ej., estériles). Por consiguiente, otro aspecto descrito en el presente documento, es una composición farmacéutica que comprende un hidrogel y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esas composiciones farmacéuticamente aceptables comprenden un hidrogel formulado junto con uno o varios vehículos (aditivos) y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Tal y como se describe en detalle a continuación, las composiciones farmacéuticas de la presente descripción se pueden formular específicamente para una administración en forma sólida o líquida, incluyendo las adaptadas para lo siguiente: (1) administración oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), pastillas, grageas, cápsulas, píldoras, comprimidos (p. ej., los destinados a una absorción bucal, sublingual y/o sistémica), bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación en la lengua; (2) administración parenteral, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa (p. ej., bolo o infusión) o inyección epidural como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; (3) aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o un parche de liberación controlada o un aerosol aplicado sobre la piel; (4) por vía intravaginal o intrarrectal, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; por vía (5) sublingual; (6) ocular; (7) transdérmica; (8) transmucosa; o (9) por vía nasal. Además, los compuestos se pueden implantar en un paciente o inyectar usando un sistema de administración de fármacos. Véase, por ejemplo, Urquhart et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984); Lewis, compilador "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, Nueva York, 1981); documentos de patente de EE.UU. n23.773.919; y 353.270.960.
Tal y como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de un criterio médico bien fundado, son adecuados para el uso en contacto con tejidos de seres humanos y animales sin producir una excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable. Además, para una administración animal (p. ej., a un ser humano), se entenderá que las composiciones deben cumplir con las pautas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza requeridas por la “FDA Office of Biological Standards”.
Tal y como se usa en este documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, un diluyente, un excipiente, un coadyuvante para la preparación (p. ej., lubricante, talco de magnesio, estearato de calcio o zinc, o ácido estérico), o un material que encapsula un disolvente, implicado en ser el vehículo o el transporte del compuesto objeto desde un órgano o una parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol (PEG); (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes tamponadores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua exenta de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones con pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; (22) agentes de carga, tales como polipéptidos y aminoácidos (23) componente del suero, tal como albúmina de suero, HDL y LDL; (22) alcoholes C2-C12, tales como etanol; y (23) otras sustancias compatibles no tóxicas, empleadas en formulaciones farmacéuticas. Agentes humectantes, agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes desintegrantes, aglutinantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes perfumantes, inhibidores de proteasas, plastificantes, emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes que aumentan la viscosidad, agentes formadores de películas, agentes solubilizantes, tensioactivos, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la formulación. Los términos y expresiones tales como "excipiente", "vehículo", "vehículo farmacéuticamente aceptable" o similares, se usan indistintamente en el presente documento.
El hidrogel de la invención que comprende el agente terapéutico se puede administrar en un locus a un sujeto in vivo. Loci in vivo a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, el sitio de una herida, trauma o enfermedad. El hidrogel se puede entregar al locus in vivo, por ejemplo, implantando las composiciones en un sujeto. Los hidrogeles que se van a implantar, es decir, los dispositivos implantables, pueden incluir adicionalmente uno o varios aditivos. Los aditivos pueden ser polímeros de resolución (biodegradables), manitol, azúcar de almidón, inositol, sorbitol, glucosa, lactosa, sacarosa, cloruro de sodio, cloruro de calcio, aminoácidos, cloruro de magnesio, ácido cítrico, ácido acético, ácido hidroxilbutanodioico, ácido fosfórico, ácido glucurónico, ácido glucónico, polisorbitol, acetato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio, estearato de zinc, estearato de aluminio, estearato de magnesio, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido de sodio, polivinilpirrolidonas, polietilenglicoles, carboximetilcelulosas, metilcelulosas, almidón o sus mezclas.
El dispositivo implantable puede tener prácticamente cualquier forma regular o irregular que incluye, pero no se limita a, una forma esferoide, cúbica, poliédrica, prismática, cilíndrica, de varilla, de disco u otra forma geométrica. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el implante tiene forma cilíndrica de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mm de diámetro y de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 cm de longitud. Preferiblemente, su diámetro es de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mm y la longitud de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 cm.
En algunas realizaciones, el dispositivo implantable tiene forma esférica. Cuando el dispositivo implantable tiene forma esférica, su diámetro puede oscilar entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 50 mm de diámetro. En algunas realizaciones, el diámetro de un implante esférico es de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mm. Preferiblemente, el diámetro es de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 mm.
En algunas realizaciones, el hidrogel de la presente invención se puede usar para preparar un dispositivo de administración de fármacos o un depósito de fármacos. El dispositivo de administración de fármacos también puede ser biodegradable y recargable. Se describen dispositivos de administración de fármacos biodegradables recargables, p. ej., en los documentos PCT/US2015/024540 y de solicitud de EE.UU. n° 14/878.578. Los dispositivos de administración de fármacos biodegradables recargables comprenden un resto de reconocimiento de una diana, capaz de interaccionar con una diana conjugada con una recarga de fármaco.
En algunas realizaciones, el hidrogel de la invención usado para preparar un dispositivo de administración de fármaco biodegradable recargable, puede comprender un polisacárido conjugado con al menos dos reactivos de química clic que pertenecen a dos parejas de química clic diferentes, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el polisacárido puede comprender un primer reactivo de química clic que funciona como un resto de reconocimiento de una diana para el dispositivo de liberación del fármaco, al reaccionar con su pareja de química clic conjugada con la recarga del fármaco. El polisacárido también puede comprender un segundo reactivo de química clic que funciona como un agente de reticulación, tal y como se ha descrito anteriormente, o que funciona para conjugar un resto, p. ej., un agente terapéutico, con el polisacárido. En una realización, el primer reactivo de química clic y el segundo reactivo de química clic no reaccionan de forma cruzada, es decir, no reaccionan entre sí, solo reaccionan con sus parejas de química clic.
En otras realizaciones, el hidrogel de la invención se puede usar para preparar una recarga de fármaco para el dispositivo de administración de fármaco biodegradable recargable, tal y como se ha descrito anteriormente. El hidrogel usado para preparar la recarga del fármaco puede comprender un polisacárido conjugado con al menos dos reactivos de química clic, como se ha descrito anteriormente, en donde al menos un reactivo de química clic puede funcionar como una diana al reaccionar con su pareja de química clic conjugada con el dispositivo de administración del fármaco.
VII. Métodos de tratamiento que emplean hidrogeles de la invención
La presente invención también se refiere a métodos para tratar a un sujeto que lo necesite. Los métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un hidrogel, una forma de dosificación, una composición farmacéutica o un dispositivo implantable de administración de fármacos de la invención.
Tal y como se usa en este documento, el término "administrar" se refiere a la ubicación de una composición en un sujeto mediante un método o una ruta que da como resultado la ubicación al menos parcial de la composición en un sitio deseado, de manera que se produce el efecto deseado. Un compuesto o una composición descritos en el presente documento se puede administrar por cualquier vía apropiada conocida en la técnica que incluye, pero no se limita a, vías orales o parenterales, incluyendo una administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, aérea (aerosol), pulmonar, nasal, rectal y tópica (incluyendo bucal y sublingual).
Los modos de administración ejemplares incluyen, pero no se limitan a, inyección, infusión, instilación, inhalación o ingestión. “Inyección” incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal e intraespinal. En realizaciones preferidas, las composiciones se administran mediante infusión o inyección intravenosa.
La administración también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para una administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se utilizan agentes penetrantes apropiados para que la barrera se pueda permear. Esos agentes penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para una administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para una administración transdérmica, los compuestos se formulan en forma de pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
En algunas realizaciones, la administración incluye implantar en un sujeto una composición, p. ej., un hidrogel, descrito en este documento.
La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", tal y como se usa en este documento, significa la cantidad de un compuesto, un material o una composición que comprende un compuesto descrito en este documento que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado en al menos una subpoblación de células en un sujeto, con una relación beneficio/riesgo razonable, aplicable a cualquier tratamiento médico. Por tanto, "cantidad terapéuticamente eficaz" significa la cantidad que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar ese tratamiento de la enfermedad.
La determinación de una cantidad eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica. Generalmente, la cantidad eficaz real puede variar con el compuesto específico, el uso o la técnica de aplicación, el efecto deseado, la duración del efecto y los efectos secundarios, el historial del sujeto, la edad, el estado, el sexo, así como la gravedad y el tipo de la afección médica del sujeto y la administración de otros agentes farmacéuticamente activos. Por consiguiente, una dosis eficaz del compuesto descrito en este documento, es una cantidad suficiente para producir al menos algún efecto terapéutico deseado en un sujeto.
Los datos obtenidos a partir de los ensayos con cultivos celulares y los estudios en animales, se pueden usar para formular un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de ese intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de uso o de administración utilizada.
La dosis eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos con cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración del agente terapéutico que consigue la mitad de una inhibición máxima de los síntomas) según se determina en cultivos celulares. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Los efectos de cualquier dosificación particular se pueden controlar mediante un bioensayo adecuado.
Generalmente, el término "tratamiento" o "tratar" se define como la aplicación o la administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o la administración de un agente terapéutico a un tejido aislado o a una línea celular de un paciente, teniendo dicho paciente una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición a una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición a la enfermedad. Por tanto, el tratamiento puede incluir suprimir, inhibir, prevenir, tratar o una combinación de los mismos. Tratar se refiere, entre otros, a aumentar el tiempo hasta una progresión sostenida, acelerar una remisión, inducir una remisión, aumentar una remisión, acelerar una recuperación, aumentar una eficacia o disminuir una resistencia a terapias alternativas, o una combinación de las mismas. "Suprimir" o "inhibir", se refiere, entre otros, a retrasar la aparición de síntomas, prevenir la recaída en una enfermedad, disminuir el número o la frecuencia de episodios de recaída, aumentar la latencia entre los episodios sintomáticos, reducir la gravedad de los síntomas, reducir la gravedad de un episodio agudo, reducir el número de síntomas, reducir la incidencia de síntomas relacionados con la enfermedad, reducir la latencia de los síntomas, mejorar los síntomas, reducir los síntomas secundarios, reducir las infecciones secundarias, prolongar la supervivencia del paciente o una combinación de los mismos. En una realización, los síntomas son primarios, mientras que en otra realización, los síntomas son secundarios. "Primario" se refiere a un síntoma que es el resultado directo de un trastorno, por ejemplo, diabetes, mientras que secundario se refiere a un síntoma que se deriva de una causa primaria o es consecuencia de la misma. Los síntomas pueden ser cualquier manifestación de una enfermedad o un estado patológico.
En consecuencia, tal como se usa en este documento, el término "tratamiento" o "tratar" incluye cualquier administración de un compuesto descrito en este documento e incluye: (i) prevenir que la enfermedad aparezca en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no la experimenta o no muestra la patología o sintomatología de la enfermedad; (ii) inhibir la enfermedad en un sujeto que está experimentando o mostrando la patología o sintomatología de la enfermedad (es decir, detener un desarrollo adicional de la patología y/o sintomatología); o (iii) mejorar la enfermedad en un sujeto que está experimentando o mostrando la patología o sintomatología de la enfermedad (es decir, revertir la patología y/o sintomatología).
Por "tratamiento", "prevención" o "mejora" de una enfermedad o trastorno se entiende retrasar o prevenir la aparición de esa enfermedad o trastorno, revertir, aliviar, mejorar, inhibir, ralentizar o detener la progresión, el agravamiento o el deterioro de la progresión o gravedad de una afección asociada con esa enfermedad o trastorno. En una realización, los síntomas de una enfermedad o trastorno se alivian en al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 20%, al menos un 30%, al menos un 40% o al menos un 50%.
La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar el trastorno. Aliviar uno o varios síntomas del trastorno indica que el compuesto confiere un beneficio clínico. Se puede aplicar cualquiera de los métodos terapéuticos descritos anteriormente a cualquier sujeto adecuado, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos y, lo más preferiblemente, seres humanos.
Tal y como se usa en este documento, el término "sujeto" incluye cualquier sujeto que se puede beneficiar de la administración de un hidrogel o un dispositivo implantable de administración de fármacos de la invención. El término "sujeto" incluye animales, p. ej., vertebrados, anfibios, peces, mamíferos, animales no humanos, incluyendo los seres humanos y los primates, tales como chimpancés, monos y similares. En una realización de la invención, el sujeto es un ser humano.
El término "sujeto" también incluye ganado productivo, por ejemplo, vacas, ovejas, cabras, caballos, cerdos, burros, camellos, búfalos, conejos, pollos, pavos, patos, gansos y abejas; y animales domésticos, por ejemplo, perros, gatos, pájaros enjaulados y peces de acuario, y también los denominados animales de laboratorio, por ejemplo, hámsteres, cobayas, ratas y ratones.
En una realización, la presente invención proporciona un método para tratar trastornos relacionados con el oído. El método comprende administrar a un sujeto que lo necesita un hidrogel o una forma de dosificación para tratar trastornos relacionados con el oído, tales como la otitis. Esas formas de dosificación se administran en un canal auditivo externo de un sujeto que lo necesita. Las formas de dosificación pueden comprender una variedad de agentes terapéuticos, p. ej., al menos un antibiótico. Los dispositivos para la administración de fármacos para entregar agentes terapéuticos en el oído se describen, por ejemplo, en el documento US 2014/0107423.
En otra realización, la presente invención también proporciona un hidrogel o una forma de dosificación para tratar trastornos relacionados con los ojos. El método comprende administrar en el ojo de un sujeto que lo necesit, un hidrogel o una forma de dosificación de la invención. El hidrogel o una forma de dosificación de la invención puede comprender al menos un agente terapéutico. Ejemplos no limitantes de los agentes terapéuticos que se pueden usar en una forma de dosificación oftálmica incluyen, p. ej., antibióticos, corticoides, anestésicos locales, descongestionantes, antiflogísticos no esteroideos, virostáticos, agentes antisépticos, cortisona, principios activos antialérgicos, análogos de prostaglandinas, principios activos procedentes de la clase de principios activos antihistamínicos y corticosteroides, principios activos antialérgicos, derivados de ácido pantoténico, antiinflamatorios no esteroideos, vascoconstrictores y/o principios activos anti-glaucoma, en una concentración farmacéuticamente eficaz. Las formas de dosificación adecuadas para la administración en el ojo, se describen, p. ej., en el documento US 20150139973.
La presente invención también proporciona métodos para tratar la isquemia crónica en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un hidrogel, una forma de dosificación o un dispositivo implantable de la invención. En una realización, el hidrogel, la forma de dosificación o un dispositivo implantable de la invención comprende VEGF.
Se ha encontrado previamente que la administración local de VEGF en el sitio de una isquemia, puede aumentar la semivida de VEGF en el cuerpo de un sujeto y reducir los efectos secundarios relacionados con el tratamiento. Por consiguiente, en una realización, el hidrogel, la forma de dosificación o el dispositivo implantable se administra localmente en el sitio de una isquemia. En algunas realizaciones, el hidrogel, la forma de dosificación o el dispositivo implantable se administran en el tejido que se va a injertar antes y/o después del trasplante.
La presente invención también proporciona métodos para regenerar un tejido en un sujeto que lo necesita. El método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un hidrogel, una forma de dosificación o un dispositivo implantable de la invención que además comprende una célula. Por ejemplo, la célula puede ser una célula de mamífero y el tejido puede ser un tejido de mamífero. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es del mismo tipo que el tejido que se va a regenerar. En otras realizaciones, la célula de mamífero es una célula madre. Realizaciones de los métodos proporcionados en este documento incluyen poner en contacto un tejido de mamífero con un hidrogel, una forma de dosificación o un dispositivo implantable de la invención que además comprende una célula.
En otro ejemplo, un método para regenerar un tejido en un sujeto comprende proporcionar un hidrogel, una forma de dosificación o un dispositivo implantable descrito en este documento, en donde el hidrogel comprende una célula inmovilizada dentro del hidrogel (es decir, la célula permanece dentro del hidrogel durante un período de tiempo prolongado sin salir del hidrogel). El método incluye poner en contacto un tejido con el hidrogel, en donde la célula se inmoviliza dentro del hidrogel. En algunas realizaciones, la célula es una célula de la progenie. En algunas realizaciones, el hidrogel permanece estable y no permite la infiltración de la célula hospedadora.
En una realización, los hidrogeles descritos en este documento son útiles como barrera inmunoprotectora, p. ej., para el trasplante de islotes pancreáticos. En algunos casos, el trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento para la diabetes, p. ej., la diabetes de tipo I. Las células trasplantadas, tales como los islotes, se pueden destruir mediante reacciones inmunes y los hidrogeles de la invención son capaces de encapsular células, tales como las de los islotes, antes de la implantación/inyección del hidrogel. De esta manera, los hidrogeles sirven como una barrera inmunoprotectora en un sujeto y minimizan el rechazo inmunológico de las células y tejidos trasplantados.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Los aldehídos presentes en los alginatos pueden reaccionar con proteínas de la carga y reactivos de química clic.
Los alginatos de alto y bajo peso molecular se oxidaron mediante una reacción con peryodato de sodio. Para ello, se disolvió alginato con un PM de ~265 kDa (MVG o Protanol LF 20/40, FMC Technologies; I-1G o I-8, Kimica Corp.) y un PM de ~32 kDa (VLVG, FMC Technologies) en ddH2O con una concentración de 1% de p/v. Se añadió peryodato de sodio (Sigma-Aldrich) a la solución en una cantidad que se basaba en la relación porcentual molar con los moles de monómero de alginato. A continuación, se dejó reaccionar la solución durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente. Se añadió cloruro de sodio a la solución hasta una concentración de 0,3 M, y el producto oxidado se purificó mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o se dializó utilizando un tubo de diálisis con MWCO de 12-14 kDa (Spectrum Labs) durante la noche, con cambios intensos de agua frente a un gradiente salino decreciente desde 150 mM a 0 mM de NaCl en diH2O.
Los alginatos oxidados que contenían 0%-50% de aldehidos se incubaron con VEGF. El cambio porcentual en VEGF soluble, no desnaturalizado (2% de p/v de alginato, 4 mcg/ml de VEGF) se midió 5 días después de la incubación mediante ELISA (R&D Systems n° de Cat. DVE00). Como se muestra en la Figura 2a, un aumento en el % de aldehidos se correlaciona directamente con el % de cambio en VEGF, con alginatos que contenían 50% de aldehidos dando como resultado un 50% de cambio en VEGF. Los datos demuestran que los aldehidos incubados con alginatos oxidados pueden reaccionar con VEGF.
También se conjugaron alginatos oxidados que contenían 20%-50% de aldehidos con reactivos de química clic, tetrazina (Tz) y norborneno (Nb). Los alginatos oxidados mostraron cambios de color significativos después de una resuspensión a temperatura ambiente, lo que indicaba una dependencia para la degradación de la concentración de aldehido. En la Figura 2b se muestra una imagen de viales que contienen los alginatos oxidados conjugados con Tz y Nb después de la resuspensión. Se muestran de izquierda a derecha:
- alginato con 20% de aldehidos conjugados con Tz;
- alginato con 20% de aldehidos conjugados con Nb;
- alginato con 30% de aldehidos conjugados con Tz;
- alginato con 30% de aldehidos conjugados con Nb;
- alginato con 40% de aldehidos conjugados con Tz;
- alginato con 40% de aldehidos conjugados con Nb;
- alginato con 50% de aldehidos conjugados con Tz;
- alginato con 50% de aldehidos conjugados con Nb.
Los datos demuestran que los aldehidos también pueden reaccionar con reactivos de química clic para formar iminas y productos coloreados de una manera que depende de la concentración de aldehido. Esos cambios de color representan cambios no deseados en los restos de química clic. Las iminas se pueden hidrolizar de nuevo a aldehidos en condiciones ácidas.
Ejemplo 2. Reducción de los aldehidos de alginato
La finalidad de este experimento era determinar el contenido de aldehidos residuales en alginatos oxidados que habían reaccionado con borohidruro de sodio (NaBFU), borazano (BH3NH3) y clorito de sodio (NaClÜ2). Tal y como se ilustra en la Figura 3a, tanto el borohidruro de sodio como el borazano reaccionan con los aldehidos presentes en los alginatos para formar alcoholes, mientras que el clorito de sodio reacciona con los aldehidos para formar ácidos carboxilicos.
El alginato se oxidó con peryodato de sodio, de modo que contenía entre 5 y 50% de aldehidos residuales. Después, el alginato oxidado reaccionó con borohidruro de sodio, borazano y clorito de sodio, y se cuantificó el % de aldehidos residuales usando qRMN después de cada reacción.
La oxidación del alginato con peryodato de sodio se llevó a cabo usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Para reducir el alginato oxidado con borohidruro de sodio, la solución de alginato se trató con borohidruro de sodio (SB, Sigma-Aldrich), con una relación molar de SB a monómeros oxidados de alginato de >1,5:1. Se dejó que la reacción prosiguiera durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió cloruro de sodio a la solución para alcanzar una concentración de 0,3 M, y el producto tratado con SB se purificó mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o se dializó utilizando un tubo de diálisis con MWCO de 12-14 kDa (Spectrum Labs) durante la noche, con cambios de agua intensos frente a un gradiente salino decreciente de 150 mM a 0 mM de NaCl en diH2O. La solución que contenia alginato reducido a continuación se congeló y se liofilizó hasta sequedad.
Para reducir el alginato oxidado con borazano, la solución de alginato se trató con un complejo de borazano (AB) (Sigma-Aldrich), con una relación molar de AB a aldehidos de alginato de >1,5:1. Se dejó que la reacción prosiguiera durante la noche a temperatura ambiente. Se añadió cloruro de sodio a la solución para alcanzar una concentración de 0,3 M, y el producto tratado con AB se purificó mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o se dializó utilizando un tubo de diálisis con MWCO de 12-14 kDa (Spectrum Labs) durante la noche, con cambios de agua intensos frente a un gradiente salino decreciente de 150 mM a 0 mM de NaCl en diH2O. La solución que contenía alginato reducido se congeló y se liofilizó después hasta sequedad.
Para oxidar adicionalmente el alginato oxidado, la solución de alginato se trató con clorito de sodio (SC), con una relación molar de SC a aldehidos de alginato de >1,5:1. Antes de la adición de clorito de sodio, se añadió dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) a la solución con una relación molar de DMSO a clorito de sodio de 5:1 y se mezcló hasta que la solución se volvió homogénea. Se dejó que la reacción prosiguiera durante la noche a temperatura ambiente. Luego se añadió cloruro de sodio a la solución para alcanzar una concentración de 0,3 M, y el producto tratado con SC se purificó mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o se dializó usando un tubo de diálisis con MWCO de 12-14 kDa (Spectrum Labs) durante la noche, con cambios de agua intensos frente a un gradiente salino decreciente de 150 mM a 0 mM de NaCl en diH2O. La solución que contenía el alginato altamente oxidado se congeló y se liofilizó después hasta sequedad.
La Figura 3b es un gráfico de barras que muestra el % de oxidación residual en los alginatos oxidados que se habían reducido adicionalmente con borazano o borohidruro de sodio, o que se habían oxidado adicionalmente con clorito de sodio. Los datos indican que el borazano es superior al borohidruro de sodio en su capacidad para reducir los aldehídos y produce alginato que contiene el nivel más bajo de aldehídos residuales. Este efecto es particularmente evidente para los alginatos con niveles más altos de oxidación. Los datos también indican que la oxidación de los aldehídos con clorito de sodio no se completa en las "condiciones de reacción iniciales con DMSO" (1:1 de agua:DMSO). Los aldehídos residuales se pueden eliminar cambiando las condiciones de la reacción a 33:1 de agua:DMSO, como se muestra en la Figura 6k.
Ejemplo 3. El procesamiento reductor de alginatos oxidados reduce el efecto de los aldehídos sobre las proteínas de la carga
El objetivo de este experimento era evaluar el efecto de los aldehídos presentes en el alginato oxidado sobre la actividad biológica de VEGF. Con este fin, los alginatos se oxidaron mediante una reacción con peryodato de sodio para producir alginatos oxidados que contenían 0%-50% de aldehídos. Los alginatos oxidados reaccionaron luego con borohidruro de sodio (NaBH4), borazano (BH3NH3) y clorito de sodio (NaClO2). Los diferentes alginatos se incubaron con VEGF a 37°C en PBS que contenía BSA al 1%, con una concentración de alginato de 20 mg/ml y una concentración de VEGF de 4 gg/ml. El cambio porcentual en VEGF soluble, no desnaturalizado (2% de p/v de alginato, 4 mcg/mL de VEGF) se midió 5 días después de la incubación en medio de cultivo celular EBM o en una solución que contenía BSA al 1%, mediante ELISA (R&D Systems n° de cat. DVE00).
Los datos se muestran en las Figuras 4a y 4b. La Figura 4a muestra el % de cambio en VEGF medido después de 5 días de incubación en EBM. Los datos indican que para los alginatos oxidados que no se han procesado adicionalmente, el % de cambio en VEGF se correlaciona directamente con el porcentaje de aldehídos contenidos en el alginato (véanse las primeras 7 barras desde la izquierda, marcadas como "0", "1", "5", "10", "15", "25" y "50"). El % de cambio en VEGF alcanza el 100% para los alginatos que contienen 25% y 50% de aldehídos. Los datos también indican que el % de cambio en VEGF se reduce significativamente para los alginatos oxidados que han reaccionado con borazano (véanse las barras marcadas como "AB5", "AB10", "AB15", "AB25" y "AB50"), con el mayor % de cambio de aproximadamente 60% en VEGF, observado para el alginato que contiene 15% de aldehídos. Una reducción con borohidruro de sodio no es muy eficaz para proteger el VEGF, con el % de cambio más alto en VEGF observado para cada material de alginato estudiado (véanse las barras marcadas como "SB5", "SB10", "SB15", "SB25" y "SB50"). La oxidación con clorito de sodio daba lugar a un % de cambio significativo medido para todas las muestras estudiadas (véanse las barras marcadas como "SC5", "SC10", "SC15", "SC25" y "SC50"), debido a los aldehídos residuales mantenidos por la ineficacia de la reacción en el tiempo (condiciones iniciales de reacción con DMSO).
La Figura 4b muestra el % de cambio en VEGF medido después de 5 días de incubación en una solución de BSA al 1%. Los datos indican que el % de cambio en VEGF puede alcanzar más del 30% para los materiales de alginato oxidado que no se han procesado adicionalmente (véanse las primeras 7 barras desde la izquierda, marcadas como "0% de Ox", "1% de Ox", "5% de Ox", "10% de Ox", "15% de Ox", "25% de Ox" y "50% de Ox"). Un procesamiento reductor con borazano (véanse las barras marcadas como "AB5", "AB10", "AB15", "AB25" y "AB50") o borohidruro de sodio (véanse las barras marcadas como "SC5", "SC10", "SC15", "SC25" y "SC50") reducían el % de cambio en VEGF, siendo el borohidruro de sodio más eficaz que el borazano. El procesamiento oxidativo con clorito de sodio (condiciones de reacción iniciales con DMSO) daba lugar a un aumento en el % de cambio en VEGF (véanse las barras marcadas como "SC5", "SC10", "SC15", "SC25" y "SC50"), en comparación con los controles.
Los datos mostrados en las Figuras 4a y 4b indican que existen diferencias en la capacidad de los alginatos procesados de diversas formas para proteger la carga proteica.
Ejemplo 4. El grado de sustitución del reactivo de química clic aumenta para los alginatos oxidados después de la reacción con clorito de sodio
La finalidad de este experimento era determinar si el grado de conjugación del reactivo de química clic con un reactivo de química clic se puede incrementar después de una reacción de los alginatos oxidados con clorito de sodio. Como se muestra en la Figura 1a, los reactivos de química clic se pueden conjugar típicamente con alginatos a través del resto carboxilato presente en el ácido glucurónico en un alginato, dando como resultado una molécula de química clic por monómero de alginato. Después de la oxidación del alginato con peryodato de sodio, se generan dos reactivos de aldehído por cada monómero de alginato, que también se pueden conjugar con un reactivo de química clic a través de un enlace imina (Figura 1b). Esta conjugación de los reactivos de química clic con alginatos oxidados es subóptima debido a los aldehídos residuales que permanecen en el alginato después de la conjugación que pueden dar lugar a una toxicidad y daño a la carga, así como una degradación de los reactivos de química clic (véanse los Ejemplos 1 y 3). Además, los enlaces ¡mina entre los aldehidos y los reactivos de química clic son fácilmente hidrolizables, lo que da lugar a una pérdida de reactivos de química clic desde el alginato. Sin embargo, como se muestra en la Figura 1c, una oxidación adicional de los aldehidos presentes en los alginatos oxidados, convierte esos aldehidos en ácidos carboxilicos y proporciona dos sitios adicionales para la conjugación por química clic.
Con el fin de determinar si una oxidación adicional de los alginatos oxidados puede aumentar la conjugación por química clic, el alginato que había reaccionado solo con peryodato de sodio o el alginato oxidado con peryodato de sodio (alginato HighOx) y oxidado adicionalmente con clorito de sodio (alginato que contiene algoxalato) se conjugaron con los reactivos de química clic, tetrazina (Tz) y norborneno (Nb), y se compararon las cantidades relativas conjugadas de tetrazina y norborneno. Para este fin, se oxidó alginato usando peryodato de sodio y SC usando el procedimiento descrito en los Ejemplos 1 y 2. Estos productos se modificaron luego con 1-b¡c¡clo[2.2.1]hept-5-en-2-¡lmetam¡na (Norborneno Metanamina; TCI) o 3-(p-bencilamino)-1,2,4,5-tetrazina. Primero, el alginato tratado con SC se disolvió en tampón agitado que contenía MES 0,1 M, NaCl 0,3 M, pH 6,5 hasta una concentración de 0,5% de p/v. A continuación, se añadieron N-hidroxisuccinimida (NHS; Sigma-Aldrich) y clorhidrato de 1-et¡l-3-(3-d¡met¡lam¡noprop¡l)-carbod¡¡m¡da (EDC; Sigma-Aldrich) con un exceso molar de 5x de los grupos de ácido carboxílico presentes en el alginato. A continuación, se añadió norborneno (Nb) o tetrazina (Tz) en proporciones molares definidas de Nb o Tz para el monómero de alginato, para producir Alg-N o Alg-T, respectivamente. La reacción de acoplamiento se agitó a temperatura ambiente durante la noche y el producto se purificó mediante filtración de flujo tangencial (TFF) o se dializó usando un tubo de diálisis con MWCO de 12-14 kDa (Spectrum Labs) durante la noche, con cambios de agua intensos frente a un gradiente salino decreciente de 150 mM a 0 mM de NaCl en diH2O. Los polímeros de Alg-N y Alg-T purificados se trataron luego con carbón activado, se esterilizaron por filtración (0,22 mm) y se liofilizaron. Esto dio como resultado polímeros de Alg-N o Alg-T purificados con varios grados de sustitución de los grupos de ácido carboxílico disponibles del alginato.
La Figura 5a muestra imágenes de viales que contienen alginatos HighOx conjugados con Tz y Nb el día 0 (panel superior) y alginatos HighOx Sc conjugados con Tz y Nb el día 0 (panel inferior). El material conjugado con Tz y Nz es nominalmente rosa/rojo y ligeramente opaco, respectivamente. La Figura 5b muestra cantidades relativas de Tz presentes en los alginatos HighOx y HighOx SC, medidas por RMN. Los datos indican que hay de 1,4 a 2,3 veces más moléculas de Tz conjugadas con el alginato HighOx SC, que en comparación con el alginato HighOx, para alginatos que contienen 20-50% de oxidación, lo que indica que el alginato que contiene algoxalato tiene un potencial de conjugación ampliado.
Ejemplo 5. Caracterización de los alginatos oxidados conjugados por química clic
La finalidad de este experimento era caracterizar las propiedades del material de alginato HighOx SC conjugado por química clic y compararlas con las propiedades del material de alginato HighOx conjugado por química clic. La estabilidad de ambos materiales de alginato se estudió mediante un análisis espectral con UV-Vis. Los datos de los materiales conjugados con Tz se muestran en las Figuras 6a y 6b. La Figura 6a muestra un espectro UV-Vis de material de alginato HighOx conjugado con Tz con 20-50% de oxidación el día 28 (panel superior) y un espectro UV-Vis de material HighOx SC conjugado con Tz con 20% y 30% de conjugación el día 14. La Figura 6b también muestra imágenes de viales que contienen estos materiales de alginato HighOx y HighOx SC conjugados con Tz. Los datos indican que el material de alginato HighOx conjugado con tetrazina pierde el pico de Tz característico a 515 nm a los 28 días, mientras que ese pico todavía está presente el día 14 en el material de alginato HighOx SC que contiene 20% y 30% de oxidación. Estos datos sugieren que el material conjugado con tetrazina procesado con clorito de sodio muestra una mayor estabilidad en solución.
Los datos para los materiales conjugados con Nb se muestran en las Figuras 6c y 6d. La Figura 6c muestra un espectro UV-Vis de material de alginato HighOx conjugado con Nb con 20-50% de oxidación el día 28 (panel superior) y un espectro UV-Vis de material HighOx SC conjugado con Nb con 20%-50% de conjugación el día 14. La Figura 6d también muestra imágenes de viales que contienen esos materiales de alginato HighOx y HighOx SC conjugados con Nb. Los datos indican que se produce una meseta a 475 nm en el material de alginato HighOx el día 28, mientras que ese pico está ausente en el material de alginato HighOx SC el día 14. El material de alginato HighOx SC también se caracteriza por una absorción reducida a 300 nm. Estos datos sugieren que el material conjugado con norborneno procesado con clorito de sodio muestra una mayor estabilidad en solución.
Los espectros UV-Vis para materiales de alginato HighOx (20% y 50% aldehído), con borazano (AB), borohidruro de sodio (SB) y clorito de sodio (SC), conjugados con Tz y Nb el día 15 (4% de p/v de soluciones almacenadas a temperatura ambiente) se muestran en la Figura 6j. Los espectros indican que después de 15 días se conserva el pico a 515 nm para el material HighOx conjugado con Tz, y que no hay absorción a 300 nm para el materia1HighOx conjugado con Nb. Estos datos indican que una reducción u oxidación adicional de los aldehídos del alginato confiere una mayor estabilidad a los restos conjugados por química clic en solución.
Los materiales HighOx y HighOx SC conjugados con Tz y conjugados con Nb también se analizaron mediante RMN cuantitativa para determinar su contenido en aldehído. La cuantificación del contenido en aldehído se realizó en un aparato Varian de 400 MHz comparando los picos de protones generados mediante peryodato de sodio a > ~5,1 ppm con un patrón interno de ácido dimetilmalónico (DMMA; 6H @1,3 pmm; Sigma-Aldrich). Las muestras se prepararon con 15 mg/mL de alginato y 2,5 mg/mL de DMMA en óxido de deuterio (D2O; Sigma-Aldrich).
Los resultados se muestran en las Figuras 6e, 6f, 6g y 6h. Específicamente, las Figuras 6e y 6f muestran los espectros de RMN de material de alginato HighOx con 50% de oxidación, conjugado con Nb y Tz, respectivamente. Las Figuras 6g y 6h muestran los espectros de RMN de material de alginato HighOx SC con 50% de aldehído, conjugado con Nb y Tz, respectivamente. Los datos indican que hay un aumento del pico significativo en el material de alginato de aldehído HighOx, lo que indica que ese material es más dinámico. Los espectros de RMN para el material de alginato HighOx también contienen picos que indican la presencia de aldehídos residuales. Por el contrario, los espectros de RMN para el material de alginato HighOx SC muestran picos agudos, lo que indica una mayor definición en el material HighOx SC y casi una ausencia de aldehídos residuales. La ausencia de aldehídos residuales en el material de alginato HighOx SC también se confirma mediante el análisis FTIR, en donde el espectro FTIR se muestra en la Figura 6i. En general, los datos indican que el material de alginato HighOx SC conjugado por química clic es menos dinámico, más estable químicamente y contiene solo pequeñas cantidades de aldehídos residuales.
Se evaluaron las condiciones de reacción del alginato oxidado con clorito de sodio. Las condiciones de reacción iniciales utilizadas para generar los datos que se muestran en la Figura 3b, empleaban una mezcla de agua:DMSO 1:1 como disolvente, en donde DMSO se utilizaba como secuestrante del ácido hipocloroso (HOCl), un subproducto. Cambiando el contenido en DMSO en la mezcla a 33:1 de agua:DMSO, la reacción se impulsó más hasta completarse. El espectro de RMN para el material de alginato HighOx SC producido en condiciones óptimas se muestra en la Figura 6k, demostrando que no hay aldehídos residuales significativos en el material con 20% y 50% de oxidación después de procesar adicionalmente los aldehídos con clorito de sodio en esas condiciones.
Ejemplo 6. Gelificación de alginatos oxidados conjugados por química clic
Se investigó el material HighOx y HighOx SC conjugado por química clic con 20-50% de oxidación para determinar la capacidad de formar un hidrogel. Preparaciones con grados complementarios de oxidación (p. ej, 20% de aldehído-TZ y 20% de aldehído-Nb) se prepararon al 10% (p/v), se mezclaron y se dejaron gelificar durante 20 minutos. Las Figuras 8a y 8b demuestran que los materiales oxidados con peryodato, reducidos (AB, SB) y oxidados adicionalmente (SC) se degradan en función del tiempo en solución (por ejemplo, tiempo de residencia en diálisis), lo que limita la formación de un hidrogel. Por tanto, con el fin de potenciar la gelificación, el proceso se ha modificado para reemplazar la diálisis por una filtración de flujo tangencial (TFF) con el fin de minimizar el tiempo de residencia en la solución.
La Figura 8c demuestra que la solubilidad del material HighOx y HighOx SC aumenta en función del % de oxidación y es más alta para el material HighOx SC.
Ejemplo 7. Degradación y solubilidad in vitro de los alginatos oxidados y reducidos
La finalidad de este experimento era investigar la degradación y solubilidad de los alginatos oxidados con y sin conjugación por química clic después de un procesamiento reductor adicional (es decir, reacción con borohidruro de sodio o borazano) o un procesamiento oxidativo (es decir, reducción con clorito de sodio).
Se preparó material de alginato conjugado por química clic (alginato MVG, 280 kDa) haciendo reaccionar el alginato con peryodato de sodio, seguido de una precipitación con tetrahidrofurano (THF). A continuación, el material precipitado se redujo haciéndolo reaccionar con borohidruro de sodio o con borazano, o se oxidó adicionalmente haciéndolo reaccionar con clorito de sodio y se dializó adicionalmente durante 1 día. A continuación, se conjugó con Tz o Nb y se dializó nuevamente durante 1 día.
Se prepararon materiales de alginato de control no conjugados por química clic (alginato VLVG, 30 kDa) haciendo reaccionar el alginato con peryodato de sodio, seguido de una diálisis durante 3 días. A continuación, el material dializado se redujo haciéndolo reaccionar con borohidruro de sodio o con borazano, o se oxidó adicionalmente haciéndolo reaccionar con clorito de sodio y se dializó adicionalmente durante 3 días.
A continuación, los materiales de alginato MVG y VLVG se incubaron a 37°C durante hasta 29 días y se analizaron mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) para determinar el peso molecular promedio del material de alginato. Para ello, se prepararon muestras en PBS con una concentración del material de alginato de 2 mg/mL. A continuación, las muestras se analizaron después usando HPLC Agilent 1260 equipado con columnas G4000PWxl y G5000PWxl en serie. El análisis se realizó empleando inyecciones de 100 pL, con un caudal de 0,5 ml/min, fase móvil de nitrato de sodio 0,1 M (Sigma-Aldrich), con temperaturas de columna y detector a 35°C. Las muestras se compararon con un patrón de PEO calibrado (34 kDa; Agilent Technologies) empleando una detección triple.
Los resultados se muestran en las Figuras 7a y 7b. Específicamente, la Figura 7a muestra la degradación del alginato MVG conjugado con Tz y conjugado con Nb con 20% de oxidación (panel izquierdo) y 50% de oxidación (panel derecho). Los datos indican que los alginatos MVG procesados de forma reductora (AB, SB) y los materiales oxidados adicionalmente (SC), todos muestran degradabilidad.
La Figura 7b muestra una degradación del alginato VLVG que contiene 0%-50% de oxidación a 37°C para alginato no procesado (panel superior izquierdo), alginato procesado por reducción con borazano (panel superior derecho), alginato procesado por reducción con borohidruro de sodio (panel inferior izquierdo) y alginato procesado con clorito de sodio (panel inferior derecho). Los datos indican que los materiales reducidos y oxidados adicionalmente muestran perfiles de degradación similares a los controles de material oxidado con peryodato.
La Figura 7c es una imagen de viales que contienen soluciones al 50% de p/v de materiales MVG (280 kDa) con 20% de oxidación procesados con borazano o clorito de sodio. Se proporciona VLVG sin oxidar (30 kDa) al 50% (p/v) como control. El MVG no oxidado solo es soluble hasta ~ 5% de p/v, mientras que el VLVG no oxidado es soluble hasta ~10% de p/v. Sorprendentemente, esta fotografía muestra que tanto los materiales procesados con borazano como con clorito sódico (que tienen un peso molecular similar al de VLVG, véase la Figura 8a) son fácilmente solubles al 50% de p/v. Los datos indican que los materiales MVG conjugados con Tz y conjugados con Nb que se han oxidado adicionalmente con clorito de sodio son los más solubles.
Ejemplo 8. Límite superior de conjugación por química clic para tetrazina y norborneno
La finalidad de este experimento era determinar el límite superior de la conjugación por química clic para el material VLVG preparado como se ha descrito en el Ejemplo 7. El material MVG, también preparado como se ha descrito en el Ejemplo 7, usa 250 equivalentes molares del material de química clic en la reacción de conjugación para obtener aproximadamente un 5% de grado de sustitución (DS), definido como el número de restos de química clic por unidad de monómero, siendo el límite superior para Tz aproximadamente un 7,5% y para Nb un 20%. En este experimento, el material VLVG no oxidado se hizo reaccionar con diferentes equivalentes de Tz o Nb, y el % de DS se midió mediante qRMN. Los datos se muestran en la siguiente tabla. Los picos de RMN de norborneno se ampliaron significativamente a una equivalencia molar más alta, por lo que se supone que los valores de norborneno están notificados en exceso (OR, del inglés “over reported”).
Figure imgf000041_0002
La conjugación de tetrazina también se midió usando espectrometría UV-Vis, como se muestra en la Figura 8. Los datos indican que el grado de sustitución de la tetrazina es lineal para la reacción con 600-1200 equivalentes de tetrazina. Estos datos indican que se pueden obtener mayores grados de sustitución utilizando alginatos de menor peso molecular y que aún no se ha alcanzado el límite superior. Este experimento se extiende a los materiales reducidos y oxidados adicionalmente para determinar el límite superior de su potencial de conjugación y, por lo tanto, la densidad de reticulación.
Ejemplo 9. Efecto de los aldehídos presentes en el alginato oxidado sobre la viabilidad celular
El objetivo de este experimento era determinar la viabilidad celular relativa en presencia de aldehídos presentes en alginatos oxidados. Para este fin, el alginato se oxidó con peryodato de sodio para generar materiales de alginato que contenían aldehído con 0-50% de oxidación. Posteriormente, se incubaron directamente 10 mg de este material durante 2 días con 5x105 células de leucemia de ratón (ATCC CCL-219, n = 1) en DMEM con suero de caballo al 10%. El número de células viables se cuantificó usando el kit de ensayo de viabilidad y un recuento de células MUSE. Los datos, normalizados al 0% de oxidación, se muestran en la siguiente tabla y también gráficamente en la Figura 9.
Figure imgf000041_0001
Los datos indican que la viabilidad celular no se ve afectada por los aldehidos hasta un 15% de oxidación, y comienza a disminuir rápidamente con 25% y 50% de oxidación.
Ejemplo 10. Solubilidad de los alginatos oxidados
La finalidad de este experimento era comparar la solubilidad del alginato oxidado con conjugación por quimica clic con la solubilidad del alginato no oxidado. La Figura 10 es un gráfico de barras que muestra la solubilidad (% de p/v) para alginato no oxidado con un peso molecular de 250 kDa (MVG); alginato no oxidado con un peso molecular de 30 kDa (VLVG); y alginato (MVG) con peso molecular de 30 kDa (VLVG) que se oxidó hasta el 20%, y luego se oxidó adicionalmente utilizando clorito de sodio y se conjugó por química clic (Tz o Nb) para producir un producto final con un peso molecular de aproximadamente 30 kDa. El material VLVG usado en ese experimento se muestra en el vial 5 de la Figura 7c. El material de alginato procesado con sodio y conjugado por química clic utilizado en ese experimento se muestra en los viales 3 y 4 de la Figura 7c.
Los datos presentados en la Figura 10 indican que el MVG no oxidado solo es soluble hasta ~5% de p/v, VLVG no oxidado es soluble hasta ~10% de p/v; y el alginato procesado con clorito de sodio conjugado por química clic es soluble hasta ~50%. Los datos demuestran que el alginato que contienen algoxalato y, en un grado ligeramente menor, el alginato que contienen algoxalol, se caracteriza por una solubilidad significativamente mayor, en comparación con el alginato no oxidado.
Ejemplo 11. Influencia de la solubilidad del alginato sobre el potencial de reticulación
La finalidad de este experimento era determinar el límite superior de la conjugación de Tz para alginato no oxidado con pesos moleculares de 250 kDa (MVG) y 30 kDa (VLVG). El material MVG es más viscoso y menos soluble que el material VLVG debido a su mayor peso molecular. Este experimento se realizó usando el procedimiento experimental como se describe en el Ejemplo 8.
La Figura 11a es un gráfico de barras que muestra el límite superior de la conjugación de Tz logrado para los materiales MVG y VLVG. Los datos de la Figura 11a demuestran que un material MVG menos soluble se puede conjugar con un máximo de ~500 equivalentes molares de Tz, mientras que el material VLVG más soluble se puede conjugar con un máximo de ~2500 equivalentes molares de Tz. Por consiguiente, el aumento de la solubilidad (debido al menor peso molecular) del material VLVG permite un mayor grado de sustitución por química clic. Ese potencial de conjugación se puede ampliar aún más mediante el uso de alginato que contiene algoxanol y/o algoxalato debido a su viscosidad que es incluso más baja.
La Figura 11b es un gráfico que muestra el grado de sustitución del material VLVG en función de los equivalentes molares de Tz. El material estudiado era VLVG que había reaccionado con 500, 1000, 1500, 2000 y 2500 equivalentes molares de Tz. Se demuestra que el límite superior de conjugación de Tz para el material VLVG se alcanza con ~2500 equivalentes de Tz.
Ejemplo 12. Influencia de la concentración de alginato y del grado de sustitución por química clic sobre la cinética de gelificación de materiales de alginato conjugados por química clic
La finalidad de este experimento era estudiar la cinética de gelificación del material de alginato conjugado por química clic en función de la concentración de alginato, el grado de oxidación y el grado de sustitución por química clic, utilizando mediciones reológicas. Este experimento utilizaba material VLVG no oxidado conjugado con Nb y Tz usando reacciones de conjugación que contenían 500, 1500 y 2500 equivalentes molares de Nb o Tz. Este experimento también utilizaba material MVG que se oxidaba hasta un 10% o 20% de oxidación usando peryodato de sodio, se procesaba de forma reductora con borazano y luego se conjugaba con Nb y Tz, usando 250 equivalentes molares de Nb y Tz en la reacción de conjugación. También se usaba en este experimento material de alginato LF 20/40 que se oxidaba hasta un 20% de oxidación, usando peryodato de sodio, se procesaba de forma reductora con borazano y luego se conjugaba con Nb o Tz usando 1000 equivalentes molares de Nb y Tz en la reacción de conjugación.
La gelificación del material de alginato conjugado por química clic se determinó midiendo el valor del módulo elástico G’ usando mediciones de reología. Para este fin, soluciones de Alg-N y Alg-T con las concentraciones finales deseadas (5%, 10%, 15% o 20% de p/v en PBS) se mezclaron en una proporción de 1:1 y se pipetearon directamente sobre la placa inferior de un reómetro TA Instruments ARG2, equipado con geometría de placa superior plana de 20 mm y un espacio de geometría de 400 micras. Se usó un enfriador de Peltier para controlar la temperatura en los experimentos dependientes de la temperatura, y se colocó una tapa de depósito de agua sobre el gel para evitar que el hidrogel se secara durante la prueba. Las muestras de hidrogel se sometieron a una deformación del 1% a 1 Hz, y se controlaron los módulos de almacenamiento y pérdida (G’ y G”) durante 1 hora. La Figura 12a es un gráfico que muestra el aumento del módulo elástico G’ frente al tiempo para diferentes materiales VLVG estudiados. Estos datos demuestran efectivamente cuánto tiempo tardan en gelificarse los diferentes materiales, con una meseta que indica que se ha logrado un estado similar a un gel. Los datos indican que un grado creciente de sustitución por química clic conduce a una gelificación más rápida.
La Figura 12b es un gráfico de barras que muestra el valor del módulo elástico G’ para diferentes materiales VLVG estudiados. El gráfico de barras que se muestra en negro a la izquierda y está marcado con "2% 1:3 MVG:VLVG" corresponde al material de control, que es una solución de calcio reticulado al 2% de p/v de una mezcla 1:3 de MVG:VLVG.
La Figura 12c es un gráfico de barras que muestra el valor del tamaño de malla para diferentes materiales VLVG estudiados. El gráfico de barras mostrado en negro a la izquierda y está marcado con "2% 1:3 MVG:VLVG" corresponde al material de control, que es una solución de calcio reticulado al 2% de p/v de una mezcla 1:3 de MVG:VLVG.
Los datos mostrados en las Figuras 12b y 12c indican que aumentar el grado de sustitución por química clic conduce a diferentes propiedades reológicas del material, tal y como se manifiesta en el módulo de elasticidad G’ incrementado y en una reducción del tamaño de los poros.
La Figura 12d es un gráfico que muestra el aumento del módulo elástico G’ frente al tiempo para material MVG que se había oxidado hasta un 10% de oxidación, reducido con borazano y luego conjugado con Nb o Tz, usando 250 equivalentes molares de Nb y Tz. Los hidrogeles se produjeron con una concentración de alginato reducido conjugado por química clic de 5% de p/v, 10% de p/v o 15% de p/v. La Figura 12e es un gráfico que muestra el aumento del módulo elástico G’ frente al tiempo para el material MVG que se había oxidado hasta un 20% de oxidación, reducido con borazano y luego conjugado con Nb o Tz usando 250 equivalentes molares de Nb y Tz. Los hidrogeles se habían producido con una concentración de alginato reducido conjugado por química clic de 5% de p/v, 10% de p/v, 15% de p/v o 20% de p/v. La Figura 12f es un gráfico que muestra el aumento del módulo de elasticidad G’ frente al tiempo para el material LF 20/40 que se había oxidado hasta una oxidación del 20%, reducido con borazano y luego conjugado con Nb o Tz usando 1000 equivalentes molares de Nb y Tz. Los hidrogeles se produjeron con una concentración de alginato reducido conjugado por química clic de 5% de p/v, 10% de p/v, 15% de p/v o 20% de p/v.
Los datos de la Figura 12d, la Figura 12e y la Figura 12f indican que el aumento de la concentración del alginato reducido reduce el tiempo de gelificación de los alginatos conjugados por química clic. Los resultados demuestran que es posible modular el proceso de gelificación de los alginatos conjugados por química clic variando el grado de oxidación del alginato, la cantidad relativa de reactivos de química clic y la concentración de alginato en la reacción de conjugación por química clic.
Ejemplo 13. Influencia del grado de sustitución por química clic sobre la tasa de liberación de proteínas
La finalidad de este experimento era investigar la influencia del grado de sustitución por química clic sobre las tasas de liberación de varias proteínas encapsuladas en hidrogeles de alginato por química clic. Este experimento utilizaba material VLVG y MVG no oxidado conjugado con Nb o Tz, producido como se ha descrito en el Ejemplo 11. Específicamente, el material VLVG no oxidado se conjugó con Nb o Tz, con 250, 500, 1000, 1500, 2000 y 2500 equivalentes molares de Nb o Tz para producir alginato conjugado con Nb y Tz (Alg-N y Alg-T). El material MVG no oxidado se conjugó con Nb o Tz con 250 equivalentes molares de Nb o Tz. Este experimento también utilizaba proteínas con diferentes pesos moleculares, tales como insulina (PM de ~3,5 kDa), albúmina de suero bovino (BSA, PM ~67 kDa) e IgG (PM ~150 kDa).
Las curvas de liberación de proteínas se evaluaron encapsulando insulina marcada con fluoresceína (Sigma-Aldrich), albúmina de suero bovino (BSA; Sigma-Aldrich) e inmunoglobulina G humana (IgG; Sigma-Aldrich) en alginato conjugado por química clic. Las muestras se prepararon disolviendo primero por separado los polímeros de Alg-N y Alg-T liofilizados con varios grados de sustitución hasta tener la concentración final deseada (4% y 5% de p/v) en PBS La proteína de interés se añadió y se mezcló con la solución de Alg-N con la relación de proteína:alginato de 1:10 (Alg-N Alg-T, v/v). A continuación, esta solución se mezcló a fondo con la solución de Alg-T y la mezcla se dejó gelificar durante al menos 30 minutos. Las muestras se crearon agregando 1 mL de PBS a cada gel e incubando a 37°C. Las muestras se recogieron en varios puntos de tiempo, reemplazando el material sobrenadante en cada punto de tiempo. El contenido de proteína en el material sobrenadante se cuantificó frente a una curva estándar usando un lector de placas con excitación fluorescente a 492 nm y emisión a 518 nm.
La Figura 13a es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando materiales VLVG conjugados por química clic con diferentes grados de conjugación por química clic. La Figura 13b es un gráfico que muestra la región sin meseta de la curva en la Figura 13a correspondiente a 2500 equivalentes molares de Nb o Tz y una concentración del 5% de Alg-N y Alg-T durante la formación del hidrogel (2500 eq 5% de VLVG) y el ajuste lineal. La Figura 13c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de BSA conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando materiales VLVG conjugados por química clic con diferentes grados de conjugación por química clic. La Figura 13d es un gráfico que muestra la región sin meseta de la curva de la Figura 13c correspondiente a 2500 equivalentes molares de Nb o Tz y una concentración del 5% de Alg-N y Alg-T, durante la formación de hidrogel (2500 eq 5% VLVG) y el ajuste lineal. La Figura 13e es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de IgG conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando materiales VLVG conjugados por química clic con diferentes grados de conjugación por química clic. La Figura 13f es un gráfico que muestra la región sin meseta de la curva en la Figura 13e correspondiente a 2500 equivalentes molares de Nb o Tz y una concentración del 5% de Alg-N y Alg-T, durante la formación del hidrogel (2500 eq 5% VLVG) y el ajuste lineal. La Figura 13g es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina, BSA e IgG conjugadas con fluoresceína, procedentes de hidrogeles producidos por reticulación mediada por Ca2+.
Los datos mostrados en las Figuras 13a-13g demuestran que el perfil de liberación de proteínas desde los hidrogeles de alginato puede estar influenciado por el grado de sustitución por química clic del alginato. Específicamente, los datos muestran que un mayor grado de sustitución por química clic reduce la "ráfaga inicial" de proteínas desde el hidrogel. El uso de alginatos con un mayor grado de sustitución por química clic permite la producción de hidrogeles con un "tamaño de malla" más pequeño, lo que, a su vez, permite lograr tiempos de liberación de proteínas más largos. Por ejemplo, tal y como se observa en las Figuras 13b, 13d y 13f, los alginatos que tienen el grado más alto de sustitución por química clic (2500 equivalentes) producen hidrogeles que proporcionan tasas de liberación de proteínas lineales durante varios días. Por el contrario, los hidrogeles producidos a partir de otros materiales, proporcionan una liberación de proteínas "por ráfagas" que no es lineal, durante horas, no días. Se describen ejemplos de otros materiales, por ejemplo, en KS Anseth, et. al., Biomed. Mater. Res. A, 2009, 90: 720-729; PP Kundu, et. al., Carbohydrate Polymers, 2014, 112: 627-637; T. Bal, et. al., J. Biomed. Mater. Res. Part A, 2014. 102A: 487-495; C. E. Schmidt, et. al. Biomaterials, 2005, 26: 125-135; Y.M. Lee, et. al., Macromol. Research, 2006. 14: 87-93; C.P. Covas, et. al., Mat. Sci. App. 2011. 2: 509-520; W.F. Mieler, et. al., Trans. Am. Ophtalmol. Soc., 2008. 106: 206-214; W.M. Tian, et. al., Controlled Release, 2005. 102: 13-22.
Ejemplo 14. Influencia del grado de oxidación del alginato y la concentración de alginato en la tasa de liberación de proteínas
La finalidad de este experimento era investigar la influencia del grado de oxidación del alginato y la concentración de alginato durante el proceso de gelificación sobre las tasas de liberación de varias proteínas encapsuladas en hidrogeles de alginato por química clic. Este experimento utilizaba material de alginato LF 20/40 que inicialmente se había oxidado con peryodato de sodio hasta una oxidación del 5% o 10% como se ha descrito en el Ejemplo 1. Posteriormente, el alginato LF 20/40 oxidado se procesó de forma reductora con borazano (AB) o se oxidó adicionalmente con clorito de sodio (SC), usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. Este material se conjugó a continuación con Nb o Tz usando 2000 equivalentes molares de Nb o Tz y el procedimiento descrito en el Ejemplo 4. Posteriormente, este material se usó para producir hidrogeles y para encapsular insulina o IgG con 5% o 10% de p/v de concentración de alginato. Los perfiles de liberación de proteínas se controlaron como se ha descrito en el Ejemplo 13.
La Figura 14a es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic a una concentración de 5% de p/v, que se oxidó hasta un 5% o 10% y luego se procesó de forma reductora con AB.
La Figura 14b es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de insulina conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic a una concentración de 5% de p/v que se oxidó hasta un 5% o 10% y luego se procesó de forma oxidativa con SC.
La Figura 14c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de IgG conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic a una concentración de 5% de p/v que se oxidó hasta un 5% o 10% y luego se procesó de forma reductora con AB.
La Figura 14d es un gráfico que muestra la liberación acumulada (en microgramos) de IgG conjugada con fluoresceína procedente de hidrogeles producidos usando alginato LF 20/40 conjugado por química clic a una concentración de 5% de p/v que se oxidó hasta un 5% o 10% y luego se procesó de forma oxidativa con SC.
Los datos de las Figuras 14a-14d indican que se puede lograr una modulación de los perfiles de liberación de proteínas variando el grado de oxidación del alginato para el material procesado con AB y SC y la concentración de material de alginato durante el proceso de gelificación.
Ejemplo 15. Efecto de los aldehídos presentes en el alginato oxidado sobre los restos de química clic
El objetivo de este experimento era determinar la estabilidad de los restos de química clic conjugados con alginato en presencia de aldehídos. Para ello, el material MVG no oxidado se conjugó con Nb o Tz en una reacción de conjugación que empleaba 250 equivalentes del material de química clic, y que posteriormente se expuso frente a 2,3% de glutaraldehído. Los viales se observaron durante hasta 69 horas para ver si cambiaban de color. La Figura 15a es una serie de fotografías de viales de vidrio que contienen 4% de material MVG conjugado con Nb (vial izquierdo) y Tz (vial derecho) en presencia de glutaraldehído al 2,3%, tomadas después de 0 minutos, 40 minutos, 21,5 horas y 67,5 horas. La Figura 15b es una serie de fotografías de viales de vidrio que contienen agua como control (vial izquierdo) o material MVG al 2% conjugado con DBCO (vial central) o azida (vial derecho), tomadas después de 0 minutos, 40 minutos, 20 horas y 69 horas. Los datos de la Figura 15a indican que se observa una degradación de Nb y Tz después de 40 minutos de exposición a aldehidos. La degradación de DBCO y azida llevaba más tiempo, pero se podía observar después de 20 horas, como lo muestran los datos de la Figura 15b. Debido a que los aldehídos se generan tras la oxidación del alginato, este experimento demuestra que se esperará que los restos de química clic conjugados con el alginato se degraden después de la oxidación del alginato. Por lo tanto, para mantener la estabilidad del resto de química clic, los aldehídos se deben eliminar de forma reductora, p. ej., mediante reducción con borazano, o mediante eliminación oxidativa, p. ej., utilizando una oxidación adicional con clorito de sodio.
Ejemplo 16. Encapsulación y retención de liposomas mediante hidrogeles de alginato
La finalidad de este experimento era investigar la capacidad de los hidrogeles producidos a partir de alginatos conjugados por química clic, para encapsular liposomas y proporcionar un suministro sostenido y localizado de liposomas intactos in vivo. Este experimento utilizaba liposomas disponibles comercialmente, preparados a partir de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) y colesterol (CHOL), en una proporción de DOPC/CHOL de 55:45 y una concentración total de lípidos de 50 mM. Los liposomas también contenían el colorante fluorescente perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (Dil) a una concentración de 0,5 mM (0,47 mg/ml) y tenían un diámetro promedio de 133 nm. Los liposomas se encapsularon en hidrogeles preparados a partir de material MVG no oxidado mediante reticulación en presencia de CaSO4 y liposomas con una concentración de alginato del 2% o 5% de p/v. Los liposomas también se encapsularon en hidrogeles preparados a partir de material MVG no oxidado que se conjugó con Nb o Tz usando 250 equivalentes molares de Nb o Tz y se dejaron gelificar en presencia de liposomas con una concentración de alginato del 5% de p/v. Finalmente, los liposomas también se encapsularon en hidrogeles preparados a partir de gelatina conjugada por química clic, preparada como se describe en, p. ej., Koshy et al., Advanced Healthcare Materials 2016, vol. 5, número 5, páginas 541-547. Se controló la liberación de liposomas desde los hidrogeles in vitro, midiendo el aumento de la fluorescencia de Dil en el material sobrenadante. El contenido de proteína en el material sobrenadante se cuantificó frente a una curva estándar, utilizando un lector de placas con excitación fluorescente a 550 nm y emisión a 580 nm.
La Figura 16a es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas desde un alginato reticulado con Ca2+ y un alginato conjugado por química clic no oxidado durante un período de 50 días. La Figura 16b es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas desde un hidrogel de alginato reticulado con Ca2+, un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado y un hidrogel de gelatina con química clic. Estos resultados indican que una liberación cuantitativa de liposomas desde el hidrogel de gelatina con química clic se observa después de 30 días. Por el contrario, los hidrogeles de alginato eran más eficaces para retener los liposomas. Específicamente, el hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado conservaba al menos aproximadamente el 95% de la carga de liposomas después de 50 días, mientras que el hidrogel de alginato reticulado con Ca2+ conservaba aproximadamente el 85% de la carga de liposomas después de 40 días. Estos datos demuestran que, entre los hidrogeles estudiados, el hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado es el más eficaz para retener liposomas durante un período de 40 días o más.
La Figura 16c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas durante un período de 28 días desde hidrogeles de alginato reticulado con Ca2+ y desde hidrogeles de alginato conjugados con química clic no oxidados, preparados con una concentración de alginato del 5% de p/v. Los perfiles de liberación de liposomas se midieron in vitro en PBS--, que es un tampón PBS que no contiene ni iones Ca2+ ni Mg2+.
Los datos de la Figura 16c indican que aproximadamente el 60% de la carga de liposomas se libera desde los hidrogeles de alginato reticulado con Ca2+ después de 28 días. La reticulación con calcio del alginato en presencia de liposomas conduce a una heterogeneidad significativa y a un esfuerzo de cizallamiento en los liposomas encapsulados, lo que da lugar a una liberación de liposomas. Por el contrario, el hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado es capaz de retener su carga de liposomas durante al menos 20 días.
La Figura 16d es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas desde hidrogeles de alginato conjugados por química clic no oxidados e hidrogeles de gelatina conjugados por química clic durante un período de 8 días. La adición de una liasa de alginato capaz de digerir el alginato, da como resultado una liberación rápida de los liposomas desde los hidrogeles de alginato conjugados por química clic no oxidados. La adición de una colagenasa capaz de digerir la gelatina da como resultado una liberación rápida de los liposomas desde los hidrogeles de gelatina conjugada por química clic. Se espera que los hidrogeles de gelatina conjugada por química clic se degraden in vivo porque las colagenasas se encuentran in vivo, p. ej., en un cuerpo humano. Por el contrario, las liasas de alginato no se encuentran in vivo, por lo tanto, se espera que los hidrogeles de alginato permanezcan intactos in vivo si no están oxidados. Con la oxidación, la degradación del alginato depende del pH.
Ejemplo 17. Integridad de los liposomas después de una encapsulación
La finalidad de este experimento era evaluar la capacidad de los liposomas para permanecer intactos, por ejemplo, mantener su diámetro después de una encapsulación y ser recuperados desde diferentes hidrogeles. Los hidrogeles estudiados en este experimento incluyen un hidrogel de alginato reticulado con calcio, un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado y un hidrogel de gelatina conjugado por química clic como se ha descrito en el Ejemplo 16. El tamaño de los liposomas se midió mediante dispersión de luz dinámica (DLS).
La Figura 17a es una traza de dispersión de luz dinámica (DLS) de un modelo de liposoma.
La Figura 17b es una traza de DLS de un liposoma que se ha liberado desde un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado, digerido con una liasa de alginato después de 8 días.
La Figura 17c es una traza de DLS de un liposoma que se ha liberado después de 28 días desde un hidrogel de alginato conjugado por química clic no oxidado, preparado con una concentración de alginato del 5% de p/v en tampón PBS--.
La Figura 17d es una traza de DLS de un liposoma que se ha liberado desde un hidrogel de gelatina conjugado por química clic, digerido con una colagenasa después de 8 días.
La Figura 17e es una traza de DLS de un liposoma que se ha liberado después de 3 días desde un alginato reticulado con calcio, preparado en tampón PBS--.
La Figura 17f es una traza de DLS de un liposoma que se ha liberado después de 28 días desde un hidrogel reticulado con calcio, preparado con una concentración de alginato del 5% de p/v en tampón PBS--.
Los datos de las Figuras 17a-17f demuestran que los liposomas liberados desde hidrogeles de gelatina o de alginato conjugado por química clic son de tamaño similar al modelo de liposoma, lo que indica que permanecen intactos después de 28 días. Por el contrario, los liposomas liberados desde los hidrogeles de alginato reticulados con calcio tienen un intervalo de tamaño sustancialmente mayor en comparación con el modelo de liposoma. Esto sugiere que durante el proceso de reticulación con calcio, los liposomas se rompen debido a las grandes fuerzas de cizallamiento y, posteriormente, se someten a confluencia en la solución, lo que da como resultado partículas liposómicas de mayor tamaño. La reticulación con calcio también introduce una heterogeneidad significativa debido a la mala distribución del calcio.
Ejemplo 18. Influencia del grado de oxidación del alginato sobre la capacidad de los hidrogeles de alginato para retener liposomas
La finalidad de este experimento era evaluar la influencia del grado de oxidación del alginato en hidrogeles de alginato sobre su capacidad para retener liposomas encapsulados. Este experimento utilizaba hidrogeles de alginato que se prepararon a partir de material de alginato MVG que se había reticulado con Nb o Tz, usando 250 equivalentes de Nb o Tz en la reacción de conjugación por química clic. Antes de la conjugación por química clic, el alginato se oxidó hasta un 0%, 5% o 10% de oxidación total y luego se procesó de forma reductora con AB usando los procedimientos descritos en los Ejemplos 1 y 2. Los liposomas descritos en el Ejemplo 16 se encapsularon en los hidrogeles, y su liberación se controló in vitro midiendo el aumento de la fluorescencia de Dil en el material sobrenadante durante un período de 75 días.
La Figura 18 es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas durante 75 días desde hidrogeles de alginato conjugados por química clic que se habían oxidado hasta un 0%, 5% y 10% de oxidación total y se habían procesado de forma reductora con AB antes de la conjugación por química clic. Los resultados de la Figura 18 demuestran que la oxidación del alginato hasta un 5% o 10% y la posterior reducción del alginato antes de la conjugación por química clic, permiten la retención de liposomas durante un período de 75 días con una liberación detectable de liposomas, mientras que el alginato no oxidado libera aproximadamente un 3% de liposomas durante 75 días. Por tanto, la oxidación del alginato mejora la retención de liposomas en los hidrogeles de alginato.
Ejemplo 19. Influencia del pH sobre la estabilidad de los hidrogeles de alginato
La finalidad de este experimento era investigar la liberación de la carga liposómica desde hidrogeles de alginato como una función del pH. Debido a que la biodegradación del alginato está mediada de forma ácida o alcalina, se controló la liberación de la carga liposómica desde los hidrogeles de alginato a pH 5 (en tampón citrato de sodio 0,1 M) y pH 9 (en tampón borato de sodio 0,1 M) durante 14 días. Las muestras se prepararon oxidando en primer lugar el alginato MVG hasta una oxidación del 20% y, posteriormente, reduciendo el material con borazano. Después de 7 días, las muestras con pH 9 se degradaban en su mayoría, y después de 14 días, también se encontró que las muestras con pH 5 se habían degradado.
La Figura 19a es una imagen de tubos que contienen hidrogeles con liposomas encapsulados que comprenden MVG oxidado al 20% que se había reducido con borazano, hidrogeles y material sobrenadante el día 0. La Figura 19b es una imagen de tubos que contienen hidrogeles con liposomas encapsulados, preparados usando MVG oxidado al 20% que se había reducido con borazano y material sobrenadante el día 1. La Figura 19c es una imagen de tubos que contienen hidrogeles con liposomas encapsulados, preparados con MVG oxidado al 20%, que se había reducido con borazano y material sobrenadante el día 7. Figura 19d es una imagen de tubos que contienen hidrogeles con liposomas encapsulados, preparados con MVG oxidado al 20%, que se había reducido con borazano y material sobrenadante el día 14. La Figura 19e es un gráfico que muestra la liberación basada en la degradación de liposomas neutros (DOPC: colesterol) desde hidrogeles de alginato que se habían obtenido oxidando el alginato al 20% y reducido posteriormente con borazano. Las muestras se liberaron en tampón MES pH 6,5 para imitar el microambiente paratumoral.
Los resultados de las Figuras 19a-19d demuestran que el alginato se degrada y los liposomas difunden en el material sobrenadante a pH ácido (pH 5) o a pH básico (pH 9), pero no a pH neutro (7). Por consiguiente, la liberación de liposomas desde hidrogeles de alginato por química clic es sensible al pH y permite una liberación de la carga liposómica mediada por la degradación.
Ejemplo 20. Encapsulación y retención de liposomas catiónicos mediante hidrogeles de alginato
Los experimentos anteriores (p. ej., los experimentos descritos en el Ejemplo 16) utilizaban liposomas de DOPC/CHOL que eran neutros. La finalidad de este experimento era analizar la capacidad de los hidrogeles de alginato para encapsular y retener liposomas cargados. p. ej., liposomas catiónicos. Este experimento utilizaba liposomas catiónicos que contenían metilsulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP) y fosfatidilcolina de soja hidrogenada (Hydro Soy PC) con un diámetro promedio de 133 nm. Los liposomas también contenían el colorante fluorescente perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (Dil). Estos liposomas se encapsularon en material de alginato reticulado con calcio y en alginato conjugado por química clic no oxidado que empleaba 250 equivalentes molares de reactivos de química clic en la reacción de conjugación. La liberación de liposomas catiónicos desde los hidrogeles se controló como se ha descrito en el Ejemplo 16.
La Figura 20a es una traza de DLS de un liposoma DOTAP: Hydro Soy PC antes de la extrusión, mientras que la Figura 20b es una traza de DLS del mismo liposoma después de la extrusión. Las Figuras 20a y 20b demuestran que es posible preparar liposomas catiónicos con un tamaño uniforme empleando una extrusión.
La Figura 20c es un gráfico que muestra la liberación acumulada (% de carga) de liposomas catiónicos durante el período de 17 días desde hidrogeles de alginato reticulado con Ca2+ y desde hidrogeles de alginato conjugado por química clic no oxidado. Los resultados en la Figura 20c demuestran que el hidrogel de alginato conjugado por química clic puede encapsular y retener eficazmente liposomas catiónicos durante un período de 17 días. Por el contrario, la liberación de liposomas catiónicos desde el hidrogel de alginato reticulado con calcio es evidente después de solo 2 días.
Ejemplo 21. Perfiles de liberación de proteínas desde hidrogeles de química clic compuestos de algoxinol y algoxalato
El objetivo de este experimento era evaluar diferentes perfiles de liberación de proteínas desde los hidrogeles preparados utilizando diferentes materiales de alginato oxidado y reducido que se habían conjugado por química clic. Las composiciones utilizadas para preparar los hidrogeles de alginato incluían: a) partes iguales de MVG con 10% de p/v que se había oxidado al 50% y posteriormente oxidado con clorito de sodio y se había conjugado con Tz con 2000 equivalentes, y MVG al 10% de p/v que se había oxidado al 10% y posteriormente se había reducido con borazano y se había conjugado con Nb con 2000 equivalentes; b) partes iguales de MVG al 10% de p/v que se había oxidado al 50% y posteriormente reducido con borazano y conjugado con Tz con 250 equivalentes y MVG al 10% de p/v que se había oxidado al 10% y posteriormente reducido con borazano y conjugado con Nb con 250 equivalentes; c) 7 partes de MVG al 10% de p/v que se había oxidado al 10% y posteriormente reducido con borazano y conjugado con Nb con 2000 equivalentes y 3 partes de MVG al 10% de p/v que se había oxidado al 50% y posteriormente reducido con borazano y conjugado con Tz con 2000 equivalentes; y d) 3 partes de MVG y 1 parte de MVG que se había reticulado con sulfato de calcio.
Las curvas de liberación de proteínas se evaluaron encapsulando IGF humano y VEGF humano (R&D Systems) en varios hidrogeles por química clic. Las muestras se prepararon disolviendo primero por separado los polímeros de Alg-N y Alg-T liofilizados con varios grados de sustitución hasta tener la concentración final deseada (p/v) en PBS. Las proteínas se añadieron y se mezclaron con la solución de Alg-N para alcanzar una concentración final de 2 gg/gel (100 gL). La solución de proteína-Alg-N se mezcló a fondo con la solución de Alg-T y se dejó gelificar durante al menos 30 minutos. Las muestras se crearon añadiendo 1 mL de PBS con BSA al 1% a cada gel e incubando a 37°C. Las muestras se recogieron en varios puntos de tiempo, reemplazando el material sobrenadante en cada punto de tiempo. El contenido en proteína del material sobrenadante con VEGF e IGF, se cuantificó con kits de ELISA Quantikine para VEGF e IGF humanos (R&D Systems) utilizando una curva estándar de una matriz de muestra comparable (PBS con 1% p de BSA y PBS con 5% p de Tween 20, respectivamente).
La Figura 21a es un gráfico que muestra la liberación de IGF-1 desde hidrogeles de alginato conjugado por química clic, preparados usando diversas composiciones de alginato. La Figura 21b es un gráfico que muestra la liberación de VEGF165 desde hidrogeles de alginato de química clic preparados utilizando diversas composiciones de alginato. Los datos de las Figuras 21a y 21b muestran la capacidad para modular la liberación por ráfagas de IGF-1 y VEGF165 utilizando los geles de química clic preparados con diferentes composiciones de alginato. Por el contrario, los hidrogeles de alginato reticulados con calcio son incapaces de modular la difusión. Este ejemplo demuestra que es posible modular la liberación de proteínas a través de diversas combinaciones de alginato que contiene algoxinol y algoxalato, el grado de sustitución de alginato, la concentración de alginato y la relación entre Nb y Tz.
Ejemplo 22. Viscosidad de las soluciones de alginato
El objetivo de este experimento era analizar la viscosidad de las soluciones de alginato conjugado por química clic, como una función de la oxidación y/o la reducción del alginato. Para este fin, se evaluó la viscosidad relativa de las soluciones de alginato por química clic, disolviendo primero por separado los polímeros de Alg-N y Alg-T liofilizados hasta tener la concentración final deseada (p/v) en ddH2O. Las soluciones se pipetearon directamente sobre la placa inferior de un reómetro TA Instruments ARG2 equipado con una geometría de placa superior plana de 20 mm y un espacio de geometría de 400 micras. Se utilizó un enfriador Peltier para controlar la temperatura (20°C). Las muestras de alginato se sometieron a deformaciones entre 0,1 y 1 Hz.
La Figura 22 es un gráfico de barras que muestra las viscosidades relativas de diversas soluciones de alginato con diferentes concentraciones de alginato (% de p/v), grados de oxidación y procesamiento con clorito de sodio o borazano. Los datos demuestran que la conjugación por química clic con MVG sin oxidación no da como resultado diferencias sustanciales en la viscosidad, mientras que la viscosidad se reduce sustancialmente con la conjugación por química clic con alginato que contiene algoxinol o algoxalato, y es comparable a la del agua (0,890 cPa a 25°C).

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un polisacárido reducido, en donde dicho polisacárido reducido
(a) comprende menos de un 2% de aldehídos residuales; o
(b) comprende menos de un 3% de aldehídos residuales; en donde dicho polisacárido reducido se produce haciendo reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol, produciendo de este modo un polisacárido oxidado que contiene aldehídos que comprende 0,1% o más de oxidación en una base molar;
continuando con una reacción de dicho polisacárido oxidado con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua para reducir los restos de aldehído presentes en el polisacárido oxidado a restos de alcohol y producir dicho polisacárido reducido;
en donde dicho agente reductor específico de aldehído soluble en agua no es borohidruro de sodio; y
en donde dicho polisacárido se selecciona a partir del grupo que consiste en alginato, agarosa, pululano, escleroglucano, quitosano, elsinano, goma de xantano, manosa, gelano, levano, celulosa, ácido hialurónico, condroitín sulfato A, condroitín sulfato C, condroitín sulfato E y p-d-glucanos; opcionalmente en donde dicho polisacárido es alginato.
2. La composición según la reivindicación 1, en donde dicho polisacárido reducido en (a) se produce haciendo reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol, produciendo de este modo un polisacárido oxidado que contiene aldehídos que comprende 0,1% o más de oxidación en una base molar;
continuando con una reacción de dicho polisacárido oxidado con un agente reductor específico de aldehído soluble en agua para reducir los restos de aldehído presentes en el polisacárido oxidado a restos de alcohol y producir dicho polisacárido reducido;
en donde dicho agente reductor específico de aldehído soluble en agua no es borohidruro de sodio.
3. La composición según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho agente reductor soluble en agua específico de aldehído se selecciona a partir del grupo que consiste en gas hidrógeno (H2) en presencia de un catalizador; borazano (H3NBH3); y un complejo de borano; opcionalmente en donde dicho agente reductor soluble en agua específico de aldehído es borazano.
4. La composición según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio.
5. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho polisacárido reducido comprende algoxinol que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000049_0001
6. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha composición comprende además un agente de reticulación fijado al polisacárido reducido; en donde opcionalmente dicho agente de reticulación es un reactivo de química clic; en donde opcionalmente dicho reactivo de química clic se selecciona a partir del grupo que consiste en azida, dibenzociclooctina (DBCO), transcicloocteno, tetrazina, norborneno, variantes de tetrazina y variantes de norborneno;
en donde las variantes de tetrazina se seleccionan a partir del grupo que consiste en:
Figure imgf000050_0001
en donde las variantes de norborneno se seleccionan a partir del grupo que consiste en norbornen-5-metilamina y norbornadien-metilamina.
7. Un hidrogel que comprende la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
8. El hidrogel según la reivindicación 7, que comprende además un agente terapéutico; en donde opcionalmente dicho agente terapéutico se selecciona a partir del grupo que consiste en una célula, una molécula pequeña y un material biológico.
9. El hidrogel según la reivindicación 8, en donde dicho material biológico se selecciona a partir del grupo que consiste en un péptido, una molécula de ADN, una molécula de ARN y una molécula de PNA; en donde opcionalmente dicho material biológico es un péptido; en donde opcionalmente dicho péptido es un factor de angiogénesis; en donde opcionalmente dicho factor de angiogénesis se selecciona a partir del grupo que consiste en FGF, VEGF, VEGFR, IGF, NRP-1, Ang1, Ang2, PDGF, PDGFR, TGF-p, endoglina, un receptor de TGF-p, MCP-1, integrina, VE-cadherina, CD31, efrina, activador del plasminógeno, inhibidor 1 del activador del plasminógeno, eNOS, COX-2, AC133, ID1, ID3 y HGF; en donde opcionalmente dicho factor de angiogénesis es VEGF.
10. El hidrogel según la reivindicación 8, en donde dicha célula es una célula de mamífero; opcionalmente en donde dicha célula de mamífero es una célula madre mesenquimática humana (hMSC).
11. El hidrogel según la reivindicación 7, que comprende una pluralidad de polisacáridos reducidos reticulados entre sí, en donde dicho hidrogel comprende un tamaño de malla de 10 nm o menos.
12. Un dispositivo implantable o inyectable que comprende el hidrogel según una cualquiera de las reivindicaciones 8-11.
13. Un método para producir la composición según la reivindicación 1, comprendiendo el método las etapas de: hacer reaccionar un polisacárido con un agente oxidante específico de diol para producir un polisacárido oxidado que contiene aldehídos; y
hacer reaccionar dicho polisacárido oxidado que contiene aldehídos con un agente reductor soluble en agua específico de aldehído, produciendo de este modo dicho polisacárido reducido que comprende menos de un 2% de aldehídos residuales; o que comprende menos de un 3% de aldehídos residuales;
en donde dicho agente reductor específico de aldehído soluble en agua no es tóxico y/o es un reactivo de Green y no es borohidruro de sodio.
14. El método según la reivindicación 13, en donde dicho agente reductor soluble en agua específico de aldehído se selecciona a partir del grupo que consiste en gas hidrógeno (H2) en presencia de un catalizador; borazano (H3NBH3); o un complejo de borano; opcionalmente en donde dicho agente reductor soluble en agua específico de aldehído es borazano.
15. El método según la reivindicación 13 o 14, en donde dicho agente oxidante específico de diol es peryodato de sodio.
16. El método según la reivindicación 13, que comprende además hacer reaccionar dicho polisacárido reducido con un agente de reticulación; opcionalmente en donde dicho reactivo de reticulación es un reactivo de química clic.
17. Una composición de administración de fármacos que comprende
una nanopartícula a base de lípidos que encapsula un agente terapéutico o de diagnóstico; y
el hidrogel según una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, que encapsula dicha nanopartícula a base de lípidos.
18. La composición de administración de fármacos según la reivindicación 17, en donde dicha nanopartícula a base de lípidos es un liposoma, opcionalmente un liposoma catiónico, o un virosoma.
19. La composición de administración de fármacos según la reivindicación 17 o 18, en donde la nanopartícula a base de lípidos permanece encapsulada en el hidrogel durante al menos 1 día, al menos 10 días, al menos 15 días, al menos 20 días, al menos 25 días, al menos 30 días, al menos 35 días, al menos 40 días, al menos 45 días, al menos 50 días, al menos 55 días, al menos 60 días, al menos 65 días, al menos 70 días, al menos 75 días o al menos 80 días.
20. El hidrogel según una cualquiera de las reivindicaciones 7-11, el dispositivo implantable o inyectable según la reivindicación 12 o la composición de administración de fármacos según una cualquiera de las reivindicaciones 17­ 19, para uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita; opcionalmente en donde dicho sujeto padece una enfermedad o una afección seleccionada a partir del grupo que consiste en isquemia, un trastorno relacionado con el ojo o un trastorno relacionado con el oído.
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