JPH09501305A

JPH09501305A - Ｂｍｐ−１０組成物

Info

Publication number: JPH09501305A
Application number: JP6525699A
Authority: JP
Inventors: セレスト，アンソニー・ジェイ; ウォズニー，ジョン・エム
Original assignee: ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-05-12
Filing date: 1994-05-12
Publication date: 1997-02-10
Also published as: OA10192A; BR9406716A; NO954525L; KR960701997A; DE69433742D1; FI955420L; WO1994026893A1; ATE265529T1; FI955420A0; KR100231640B1; EP0698095B1; NO954525D0; DE69433742T2; CA2161807A1; AU6910794A; EP0698095A1; FI955420A7; AU677849B2

Abstract

(57)【要約】精製ＢＭＰ−１０蛋白およびそれらの製造方法を開示する。ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ分子も開示する。該蛋白は、骨および軟骨の欠損の治療および傷の治癒ならびに関連組織の修復に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】ＢＭＰ−１０組成物本発明は、ＢＭＰ−１０と命名された新規なファミリー（family）の精製蛋白、それらをコードしているＤＮＡ分子、およびそれらを得る方法に関する。これらの蛋白を、骨および／または軟骨の形成、および傷の治癒、ならびに組織の修復に使用することができる。さらにこれらの蛋白を、他の骨形態形成蛋白の活性を増大させるために使用することもできる。発明の背景骨または他の組織抽出物中に存在する骨および軟骨誘導活性の原因となる分子の検索により、骨形態形成蛋白（ＢＭＰ）と呼ばれる新規なセットの分子が発見された。ＢＭＰ−１からＢＭＰ−９と命名されたいくつかの蛋白の構造はすでに研究されている。これらの蛋白が骨に存在することに伴うユニークな誘導活性は、それらが骨修復過程の重要な調節剤であり、骨組織の正常な維持に必要である可能性があることを示唆する。これらの過程において役割を果たしている蛋白が存在するか否かを確認する必要がある。本発明は、本発明者らによりＢＭＰ−１０と命名されたかかる蛋白の同定に関する。発明の概要ウシ・ＢＭＰ−１０ウシ・ＢＭＰ−１０のＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。ＢＭＰ−１０蛋白は軟骨、骨またはそれらの組み合わせの形成を誘導する能力を有する。さらにＢＭＰ−１０蛋白を、下記ラット・骨形成分析において軟骨および／または骨形成活性を示す能力により特徴づけてもよい。配列番号：１に示すヌクレオチド７７９から１１０２までのヌクレオチドからなる、成熟ＢＭＰ−１０ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列からなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、配列番号：２に示すアミノ酸１から１０８からなるアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白であって同時産生される蛋白性物質を含まない蛋白を培地から回収し精製することにより、ウシ・ＢＭＰ−１０を製造することができる。哺乳動物細胞における産生のためには、ＤＮＡ配列がさらに、５'末端側の適当なプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列であって成熟ＢＭＰ−１０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の読み取り枠に連結しているＤＮＡ配列からなる。プロペプチドは生のＢＭＰ−１０プロペプチドであってもよく、あるいはＴＧＦ−βスーパーファミリー（super-fami ly）の別の蛋白由来のプロペプチドであってもよい。ヒト・ＢＭＰ−１０は、ウシ・ＢＭＰ−１０と相同的であると考えられる。それゆえ、本発明は、ヒト・ＢＭＰ−１０をコードしている配列、それらの方法により得られるＤＮＡ配列、およびそれらのＤＮＡ配列によりコードされるヒト・蛋白を得る方法を包含する。この方法は、標準的方法を用いてヒト・遺伝子のライブラリーまたは暗号配列もしくはそのフラグメントをスクリーニングするためのプローブを設計することを必要とする。ＤＮＡヒト・ＢＭＰ−１０蛋白（配列番号：３）の一部をコードしているＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列（配列番号：４）を本明細書に示す。これらの配列を用いて、標準的方法により完全なヒト・ＢＭＰ−１０遺伝子または暗号配列を得るためのプローブを設計してもよい。ＢＭＰ−１０のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、次いで、ＢＭＰ−１０蛋白を培地から回収し、精製することにより、ヒト・ＢＭＰ−１０を製造することもできる。精製された発現蛋白は、同時産生される蛋白性物質ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。回収された精製蛋白を、軟骨および／または骨形成活性を示すと考えられる。さらに本発明蛋白を、下記ラット・骨形成分析において軟骨および／または骨の形成活性を示す能力により特徴づけてもよい。本発明のもう１つの態様は、医薬上許容される担体中の治療上有効量のＢＭＰ −１０蛋白を含有する医薬組成物を提供する。本発明ＢＭＰ−１０組成物を軟骨の形成に使用してもよい。さらにこれらの組成物を骨の形成のために使用してもよい。ＢＭＰ−１０組成物を、傷の治癒および組織の修復のために使用してもよい。さらに本発明組成物は、米国特許第５,１０８,９２２、５,０１３,６４９、５,１１６,７３８、５,１０６,７４８、５,１８７,０７６ならびに５,１４１,９０５号に開示のＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６ならびにＢＭＰ−７；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／１８０９８に開示のＢＭＰ−８；およびＰＣＴ公開ＷＯ９３／００４３２に開示のＢＭＰ−９のごとき少なくとも１種の他の治療上有用な薬剤を含有していてもよい。本発明組成物は、ＢＭＰ−１０のほかに、インヒビン−β群の蛋白またはインヒビン−α群の蛋白の他のメンバー、ならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにインスリン様成長因子（ＩＧＦ）を包含する他の治療上有用な薬剤からなっていてもよい。さらに組成物が適当なマトリックス、例えば、組成物を保持し、骨および／または軟骨の成長のための表面を提供するようなマトリックスを含有していてもよい。マトリックスは、骨誘導性蛋白のゆっくりとした放出および／またはその存在のための適切な環境を提供しうるものであってもよい。本発明ＢＭＰ−１０組成物は、多くの骨および／または軟骨の欠損、歯周病ならびに種々の形態の傷の治療に使用することができる。本発明によれば、これらの方法は、かかる骨および／または軟骨形成、傷の治癒あるいは組織の修復を必要とする患者に有効量のＢＭＰ−１０蛋白を投与することを包含する。さらに、これらの方法は、上記共有特許に開示された少なくとも１種の新規ＢＭＰ蛋白と混合された本発明蛋白を投与することを包含する。さらに、これらの方法は、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＩＧＦを包含する他の成長因子とともにＢＭＰ−１０蛋白を投与することを包含する。本発明のさらなる態様は、ＢＭＰ−１０蛋白の発現をコードするＤＮＡ配列である。かかる配列は、配列番号：１または配列番号：１０に示された５'から３' 方向のヌクレオチド配列、遺伝暗号の縮重を除いては配列番号：１または配列番号：１０のＤＮＡ配列と同じＤＮＡ配列であって配列番号：２または配列番号：１１の蛋白をコードしているＤＮＡ配列を包含する。さらに、緊縮条件下で配列番号：１または配列番号：１０のＤＮＡ配列とハイブリダイズし、軟骨および／または骨の形成を誘導する能力を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列も本発明に包含される。好ましいＤＮＡ配列は、緊縮条件下［ティー・マニアティス（ T.Maniatis）ら,モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）（Molecular Cloning(A Laboratory Manual)）,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２年），３８７〜３８９頁参照］でハイブリダイズするＤＮＡ配列である。結局、配列番号：１の配列の対立遺伝子変種または他の変種も、ヌクレオチド変化がペプチド配列の変化をもたらすか否かにかかわらず、その配列がＢＭＰ−１０活性を有する場合には本発明に包含される。本発明のさらなる態様は、作動可能に発現調節配列に連結された上記ＤＮＡ配列からなるベクターを包含する。作動可能に発現調節配列に連結されたＢＭＰ− １０をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された細胞系を適当な培地で培養し、そこからＢＭＰ−１０蛋白を回収し精製する本発明新規ＢＭＰ−１０蛋白製造方法において、これらのベクターを使用することができる。この方法には、多くの知られた真核細胞および原核細胞双方を該ポリペプチド発現のための宿主として使用することができる。ベクターを遺伝子治療に適用してもよい。かかる使用において、インビトロでベクターを患者の細胞中にトランスフェクションさせ、次いで、細胞を患者に再導入することができる。別法として、標的トランスフェクションにより、インビボでベクターを患者に導入してもよい。配列の記載配列番号：１は、クローンλ７ｒ−２０由来のウシ・ＢＭＰ−１０の一部分をコードしているヌクレオチド配列である。配列番号：２は、成熟ウシ・ＢＭＰ−１０ポリペプチドを含むアミノ酸配列である。配列番号：３は、ヒト・ＢＭＰ−１０の部分ヌクレオチド配列である。配列番号：４は、ヒト・ＢＭＰ−１０ポリペプチドに対する部分アミノ酸配列である。配列番号：５および６は、ヒト・ＢＭＰ−１０または他のＢＭＰ−１０蛋白を単離するのに用いるウシ・ＢＭＰ−１０に対するプライマーである。配列番号：７は、ＳＶ４０複製開始点の近傍にＸｈｏＩ認識部位を付加するためにｐＭＴ２ＣＸＭ中に挿入されているＤＮＡ配列である。配列番号：８は、ＤＨＦＲ遺伝子の上流にＸｈｏＩ認識部位を挿入するためにｐＭＴ２１中に挿入されているＤＮＡ配列である。配列番号：９は、ＥＭＣウイルス・リーダー配列の一部からなるＤＮＡ配列である。配列番号：１０は、ｃＤＮＡクローンＨＦＬ−３およびゲノムクローン２０ＧＥＮ.３由来のヌクレオチド１６０から１１０７までの完全なプロペプチドおよびヌクレオチド１１０８から１４３１までの成熟ポリペプチドを含む完全なヒト・ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ配列である。配列番号：１１は、配列番号：１０によりコードされているアミノ酸配列である。発明の詳細な説明ＢＭＰ−１０ＢＭＰ−１０ウシ・ＢＭＰ−１０ヌクレオチド配列（配列番号：１）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：２）を本明細書の配列表に示す。成熟ウシ・ＢＭＰ−１０蛋白の暗号配列はヌクレオチド７７９から開始しヌクレオチド１１０２まで続く。配列番号：１のヌクレオチド１６７から１１０２まで、あるいはヌクレオチド７７９から１１０２までの暗号配列で形質転換された宿主細胞を培養し、次いで、配列番号：２のアミノ酸−２０４から１０８まで、あるいは１から１０８までのアミノ酸配列またはこれらと実質的に相同な配列を有する蛋白を培地から回収し精製することにより、本発明精製ウシ・ＢＭＰ−１０蛋白を製造する。宿主細胞による蛋白の分泌に適するプロペプチドをコードしている暗号配列であって成熟ＢＭＰ−１０蛋白に対する暗号配列の正しい読み取り枠に連結している暗号配列でもって宿主細胞を形質転換してもよい。例えば、米国特許第５,１６８,１５０号には、ＢＭＰ−２以外の哺乳動物蛋白の前駆体部分をコードしているＤＮＡが成熟ＢＭＰ−２部分をコードしているＤＮＡに融合されていることが開示されており、参照によりその開示を本明細書の一部とする。かくして、本発明は、ＢＭＰ−１０以外の蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列であって、ＢＭＰ−１０ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の正しい読み取り枠に連結しているＤＮＡ配列からなるキメラＤＮＡ分子を包含する。「キメラ」なる用語は、プロペプチドがＢＭＰ−１０とは異なるポリペプチド由来であることを意味するために用いられる。ウシ・ＢＭＰ−１０ＤＮＡ配列の全部またはフラグメント、あるいは配列番号：３のヒト・ＢＭＰ−１０配列の一部をプローブとして用いて、本発明ＢＭＰ− １０配列を得る。かくして、ヒト・ＢＭＰ−１０配列は、配列番号：３のヌクレオチド３０から１６７のＤＮＡ配列からなる。このヒト・ＢＭＰ−１０配列の部分配列は、配列番号：１に示すウシ・ＢＭＰ−１０ＤＮＡ配列のヌクレオチド８９９から１０３６によく対応している。ヒト・ＢＭＰ−１０蛋白は、配列番号：４のアミノ酸−１から４６の配列からなる。ＢＭＰ−１０は、ＣＨＯ細胞のごとき哺乳動物細胞により発現された場合、種々のＮ末端を有するＢＭＰ−１０蛋白の不均一な集団として存在すると考えられる。活性種は、配列番号：１のアミノ酸７のシステイン残基から開始するアミノ酸配列からなるか、あるいはＮ末端方向のさらなるアミノ酸配列からなると考えられる。かくして、活性ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド７７９または７９７から１１０２まで、あるいは配列番号：１０のヌクレオチド１１０８または１１２６から１４３１までのヌクレオチド配列からなると考えられる。イー・コリ（E.coli）で発現させることにより、ヒト・ＢＭＰ−１０のＮ末端を実験的に以下のように決定した：［Ｍ］ＮＡＫＧＮＹＸＫＲＴＰＬＹＩＤＦＫＥＩ（Ｘは明確なシグナルが得られないアミノ酸残基であり、その位置のシステイン残基と矛盾しない）。かくして、このＢＭＰ−１０種のＮ末端は、配列番号：１または配列番号：１０のアミノ酸１にあり、ＢＭＰ−１０の該種をコードしているＤＮＡ配列は、配列番号：１のヌクレオチド７７９から１１０２まで、あるいは配列番号：１０のヌクレオチド１１０８から１４３１までからなると思われる。ヒト・アクティビンＷＣ単量体の見かけの分子量は、Ｎｏｖｅｘ１６％トリシンゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１０〜１２ｋｄと決定された。フィンニガン（Finnigan）ＴＳＱ７０００による電子噴霧イオン化質量スペクトル法による単量体の分子量は１２２９２.５である。ヒト・ＢＭＰ−１０蛋白は、０.１％トリフルオロ酢酸中、無色透明溶液として存在する。培地から回収されたＢＭＰ−１０蛋白を、同時産生される他の蛋白性物質および存在する他の汚染物質から単離することにより精製する。例えば、下記ラット・骨形成分析における軟骨および／または骨の形成を誘導する能力により、ＢＭＰ−１０蛋白を特徴づけてもよい。さらに本発明により提供されるＢＭＰ−１０蛋白は、配列番号：１と同様の配列によりコードされているが天然に修飾（例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸変化を引き起こしうるヌクレオチド配列中の対立遺伝子変種）がなされているかまたは人工的に誘導体化されている因子を包含する。例えば、合成ポリペプチドが、配列番号：２のアミノ酸残基の連続した配列のすべてまたは一部分を複製したものであってもよい。これらの配列は、１次、２次または３次構造およびコンホーメーションの特徴を配列番号：２の骨成長因子ポリペプチドと共有することにより、それらに共通した骨成長因子の生物学的特性を有することができる。かくして、天然のＢＭＰ−１０および他のＢＭＰ−１０ポリペプチドの代替物として治療プセスにそれらを使用することができる。本明細書記載のＢＭＰ−１０蛋白の配列に対する他の特別な変異は、グリコシレーション部位の修飾を包含する。これらの修飾は、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシレーション部位を包含する。例えば、グリコシレーションの不存在または部分的にのみ行われたグリコシレーションは、アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位におけるアミノ酸の置換もしくは欠失から生じる。アスパラギン結合型グリコシレーション認識部位は、細胞の適当なグリコシレーション酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかである（通常、Ｘはいかなるアミノ酸であってもよい）。グリコシレーション認識部位における第１または第３のアミノ酸の位置の一方または両方における種々のアミノ酸置換もしくは欠失（および／または第２の位置におけるアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列におけるグリコシレーションを生じさせない。さらに、細菌細胞におけるＢＭＰ−１０蛋白の発現は、グリコシレーション認識部位を変化させずにグリコシレーションされていない蛋白を生じる。さらに本発明は、他の蛋白性物質をコードしているＤＮＡ配列と結合していない、ＢＭＰ−１０蛋白の発現をコードしている新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列は、配列番号：１に示された５'から３'方向への配列、および緊縮条件下、例えば、６５℃における０.１ＸＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ［マニアティス（Maniatis）ら，「モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリー・マニュアル）（Molecular Cloning(A Laboratory Manual)」,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）（１９８２年），３８７〜３８９頁］においてそれらの配列にハイブリダイズし、ＢＭＰ−１１活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。さらにこれらのＤＮＡ配列は、配列番号：３のＤＮＡ配列からなる配列、および緊縮条件下において配列番号：３の配列にハイブリダイズし、ＢＭＰ−１０活性を有する蛋白をコードしている配列を包含する。同様に、配列番号：１の配列によりコードされるＢＭＰ−１０蛋白あるいは配列番号：２のアミノ酸配列からなるＢＭＰ−１０蛋白をコードするＤＮＡ配列であるが、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変異（特異的な集団における天然に生じる塩基の変化であってアミノ酸の変化を生じることも生じないこともある）によりコドン配列が異なるＤＮＡ配列も、本明細書記載の新規因子をコードする。活性、半減期もしくはコードされているポリペプチドの産生を増強するための、点突然変異または誘発された修飾（挿入、欠失および置換）により引き起こされる配列番号：１または配列番号：３のＤＮＡ配列における変化も、本発明に包含される。本発明の別の態様は、ＢＭＰ−１０蛋白の新規製造方法を提供する。本発明方法は、既知調節配列の調節下に置かれた本発明ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された宿主細胞を培養し、ＢＭＰ−１０蛋白を培地から回収し精製する。精製蛋白は、同時産生される他の蛋白ならびに他の汚染物質を実質的に含まない。適当な細胞または細胞系は、チャイニーズハムスター・卵巣細胞（ＣＨＯ）のごとき哺乳動物細胞であってもよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の生産ならびに精製方法は当該分野において知られている。例えば、ゲシング（Gething）およびサムブルック（Sam brook）,ネイチャー（Nature）,第２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）、あるいは、カウフマン（Kaufman）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell．Biol.）,第５巻（７）：１７５０〜１７５９頁（１９８５年）もしくはホウリー（Howley）ら,米国特許第４,４１９,４４６号参照。付記した実施例に記載した別の適当な哺乳動物細胞系は、サル・ＣＯＳ−１細胞系である。哺乳動物細胞ＣＶ−１も適当でありうる。細菌細胞も適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）は、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。ビー・ズブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomo nas）、他の枯草菌類等の種々の株も、この方法に使用することができる。当業者に知られた多くの酵母細胞も、本発明ポリペプチドの発現用宿主細胞として利用できる。さらに、所望ならば、昆虫細胞を本発明方法における宿主細胞として使用することもできる。例えば、ミラー（Miller）ら,ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineering）,第８巻：２７７〜２９８頁（プレナム・プレス（Plenim Press）１９８６年）およびその中で引用されている文献参照。本発明の別の態様は、これらの新規ＢＭＰ−１０ポリペプチドの発現方法に用いるベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、本発明の新規因子コードしている上記の新規ＤＮＡ配列の全体を含むものである。さらに、ベクターは、ＢＭＰ−１１蛋白配列の発現を可能にする適当な発現調節配列を含む。また、上記修飾配列を含むベクターも、本発明の具体例である。さらに、配列番号：１の配列またはＢＭＰ−１０蛋白をコードしている他の配列を操作して、ＢＭＰ−１０をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、それらを他のＢＭＰ蛋白もしくはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコードしている配列に置換することにより成熟ＢＭＰ−１１を発現するようにすることもできよう。かくして、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー由来のプロペプチドをコードしておりＢＭＰ−１０ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の正しい読み取り枠に連結されたキメラＤＮＡ分子を包含する。ベクターを細胞系の形質転換方法に使用することができ、該ベクターは選択された宿主細胞において本発明ＤＮＡ配列の複製および発現を指令しうる、作動するように本発明配列に連結されている選択された調節配列を有している。かかるベクターのための調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができる。かかる選択は通常行われることであり、本発明の一部分を形成することはない。骨が正常に形成されない環境における軟骨および／または骨の形成を誘導する本発明蛋白は、ヒトおよび他の哺乳動物における骨折および軟骨の損傷の治癒に適用される。ＢＭＰ−１０蛋白を用いるかかる標品は、閉鎖性ならびに解放性の骨折の減少および人工関節の定着の改善にも予防的に使用することができる。骨形成性薬剤により誘導されるデノボ骨形成は、先天性の、外傷、あるいは腫瘍学的切除術により誘発される脳顔面頭蓋の欠損に対して貢献し、さらに美容整形手術にも有用である。ＢＭＰ−１０蛋白を歯周病の治療、およびその他の歯の治療工程に使用してもよい。かかる薬剤は、骨形成細胞を引き寄せるための環境を提供し、骨形成細胞の増殖を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導することができる。本発明ＢＭＰ−１０ポリペプチドは骨粗鬆症に治療においても有用でありうる。種々の骨原性、軟骨融合性および骨誘導性因子が記載されている。その議論については、例えば、欧州特許出願第１４８,１５５号および第１６９,０１６号参照。本発明蛋白を傷の治癒および関連組織の修復にも使用することができる。傷のタイプは、熱傷、切り傷、潰瘍を包含するが、これらに限定しない（傷の治癒および関連組織の治療の議論については、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８４／０１１０６参照）。本発明のさらなる態様は、骨折の治療ならびに軟骨の修復および／または骨の欠損もしくは歯周病に関連した他の症状の治療のための方法および組成物である。さらに本発明は、傷の治癒および組織修復のための方法および組成物からなる。かかる組成物は、医薬上許容される賦形剤、担体もしくはマトリックスと混合された治療上有効量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１０蛋白からなる。本発明ＢＭＰ−１０蛋白は、他の関連蛋白および成長因子と協同して、あるいはおそらく相乗的に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物は、上記共有特許に開示された治療量の少なくとも１種のＢＭＰ蛋白もしくは成長因子を伴った、治療量の少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−１０蛋白からなる。かかる混合物は、個々の分子または異なる部分よりなるヘテロ分子からなっていてもよい。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−１０蛋白サブユニットおよび上記「ＢＭＰ」蛋白のうちの１種に由来するサブユニットよりなるジスルフィド結合した二量体からなっていてもよい。かくして、本発明は、一方のサブユニットが少なくとも配列番号：２のアミノ酸１からアミノ酸１０８までのアミノ酸配列からなり、もう一方のサブユニットがＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８ならびにＢＭＰ−９からなる群より選択される骨形態形成蛋白に関するアミノ酸配列からなるヘテロ二量体である精製ＢＭＰ−１０ポリペプチドを包含する。さらなる具体例はＢＭＰ−１０部分のヘテロ二量体からなっていてもよい。さらに、ＢＭＰ−１０蛋白を、骨および／または軟骨の欠損、傷、もしくは問題となっている組織の治療に有益な他の薬剤と混合してもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、ならびにｋ−線維芽細胞成長因子、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ／ＤＩＡ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−II）を包含する。これらの薬剤の部分も、本発明組成物に使用することができる。ｐＨ、等張性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製および処方は当該分野の範囲内である。さらに、本発明治療組成物は、ＢＭＰおよびＴＧＦ蛋白が種特異性を欠くことから、獣医学にも適用価値がある。特に、人以外には家畜およびサラブレッドのウマが、本発明ＢＭＰ−１０での治療に関する望ましい患者である。本発明治療方法は、組成物を、局所的に、全身的に、あるいは移植もしくはデバイスのように部分的に投与することを包含する。もちろん、本発明に使用する治療組成物は、投与する場合にはパイロジェンがなく、生理学的に許容される形態である。さらに、望ましくは、組成物を、骨、軟骨または組織の損傷部位に送達するためにカプセル封入するか、あるいは粘度のある形態として注射する。傷の治癒および組織の修復には局所投与が適当であろう。上記組成物中に所望により含有されていてもよい、ＢＭＰ−１０蛋白以外の治療上有用な薬剤を、本発明方法において、本発明ＢＭＰ組成物と同時または逐次的に、ＢＭＰ−１０組成物に変えて、あるいは付加的に投与してもよい。好ましくは、骨、軟骨または他の結合組織の形成のためには、組成物は、損傷を受けて修復を必要とする組織の部位にＢＭＰ−１０または他のＢＭＰ蛋白を送達し、骨および軟骨の発達のための構造を提供し、最適には体内に再吸収されうるマトリックスを含有する。該マトリックスが、ＢＭＰ−１０および／または他の骨誘導蛋白の遅延した放出、ならびに細胞の浸潤のための正しい構造および適切な環境を提供するものであってもよい。かかるマトリックスは、他の移植される医療用具に使用する材料から作られる。マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容上の外観および界面の特性に基づく。ＢＭＰ−１０組成物のそれそれの適用により適切な処方が決定されるであろう。組成物に有用なマトリックスは生分解性であり、化学的に知られている硫酸カルシウム、リン酸三石灰、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物であってもよい。他の有用な材料は生分解性であり、骨、鍵または皮膚コラーゲンのごとき生物学的に十分に知られているものである。さらなるマトリックスは純粋蛋白または細胞外マトリックス成分からなる。他の有用なマトリックスは非生分解性で、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミン酸、または他のセラミックスのごとき化学的に知られているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイト、またはコラーゲンおよびリン酸三石灰のごとき、上記タイプの材料のいずれかの混合物からなっていてもよい。例えば、カルシウム−アルミン酸−リン酸のような組成物中においてバイオセラミックスを変更してもよく、さらにその孔サイズ、粒子形態および生分解性を変化させてもよい。ＢＭＰ−１０蛋白の作用を変化させる種々の因子、例えば、形成が望まれる骨の重量、骨損傷部位、損傷した骨の状態、傷のサイズ、損傷を受けた組織のタイプ、患者の年齢、性別ならびに食事、感染があればその程度、投与期間、および他の臨床的因子を意志が考慮することにより、投与規則が決定されよう。再構成に用いるマトリックスのタイプおよび組成物中のＢＭＰ蛋白のタイプに応じて用量を変更してもよい。ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様成長因子Ｉ）のごとき他の知られた因子を最終組成物に添加することも、投薬を有効にする可能性がある。骨の成長および／または修復を定期的に評価することにより、進行をモニターすることができる。例えば、Ｘ−線、組織形態学的測定、およびテトラサイクリン標識により、進行をモニターすることができる。以下の実施例は、ウシ・ＢＭＰ−１０蛋白の回収ならびに特徴付け、およびヒトならびに他のＢＭＰ−１０蛋白を回収するためのウシ・ＢＭＰ−１０蛋白の使用、さらにヒト・蛋白を得ることならびに組み換え法による該蛋白の発現における本発明の実施を説明する。実施例１ウシ・ＢＭＰ−１０ベクターλＥＭＢＬ３中に構築されたウシ・ゲノムライブラリーの８００,０００個の組み換え体を、プレート１枚あたり８０００個の組み換えハクテリオファージプラークの密度で、１００枚のプレートに撒く。これらのプレートから組み換えバクテリオファージのプラークをニトロセルロースでレプリカし、増幅する。ヌクレオチド１０８１からヌクレオチド１４０３に対応するヒト・ＢＭＰ− ７のフラグメント（米国特許第５,１４１,９０５号の図４）を、ファインベルグ（Feinberg）ら［アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１３２巻：６〜１３頁（１９８３年）］のランダムプライミング方法により³²Ｐ標識し、標準的なハイブリダイゼーション緩衝液（ＳＨＢ）（５ｘＳＳＣ,０.１７０ＳＤＳ,５ｘデンハーツ,１００μｇ／ｍｌサケ・精子ＤＮＡ）中の１セットのフィルターに、６０℃において２ないし３日間ハイブリダイズさせる。緊縮性を減じた条件で（４ｘＳＳＣ,０.１％ＳＤＳ,６０℃）、フィルターを洗浄する。多数の陽性のハイブリダイズしている組み換え体が見られる。５２個の陽性のハイブリダイズしている組み換えバクテリオファージプラークを選択し、２次スクリーニングに用いる。これら５２枚のプレートから組み換え体のプラークをニトロセルロースでレプリカし、増幅する。１セットのニトロセルロースフィルターを上記ヒト・ＢＭＰ−７ＤＮＡプローブにハイブリダイズさせ、緊縮性を減じた同じ条件で洗浄する。他のセットのフィルターを、ＳＨＢ中、６５℃において、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ −７プローブの混合物とハイブリダイズさせ、６５℃において０.１ｘＳＳＣ,０ .１％ＳＤＳで洗浄する（緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件）。混合プローブは、相対的に等量の、ヒト・ＢＭＰ−５配列のヌクレオチド１４５２から２０６０まで（米国特許第５,１０６,７４８号の図４）からなる³²Ｐ標識したＤＮＡフラグメント、ヒト・ＢＭＰ−６配列のヌクレオチド１３９５から１６９８まで（米国特許第５,１８７,０７６号の図４）からなる³²Ｐ標識したＤＮＡフラグメント、およびヒト・ＢＭＰ−７配列のヌクレオチド１０８１から１４０３まで（米国特許第５,１４１,９０５号の図４）からなる³²Ｐ標識したＤＮＡフラグメントからなる。ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７のＤＮＡフラグメントを、ランダムプライミング法により³²Ｐ標識し、１分間あたりのカウント数（ｃｐｍｓ）が同じである各プローブを混合し、５２枚の２次プレートの他のセットのニトロセルロースフィルターを入れたＳＨＢに添加する。緊縮性を減じた条件下でヒト・ＢＭＰ−７プローブにハイブリダイズ陽性であり、高い緊縮性の条件下においては混合されたＢＭＰ−５／６／７プローブに弱くハイブリダイズするかまたはハイブリダイズしない１４個の組み換え体をさらなる分析のために選択する。これらのハイブリダイゼーション特性を示す１４個すべての組み換え体をプラーク精製し、それぞれからバクテリオファージＤＮＡを調製する。上記ハイブリダイゼーション特性を示す１４個の組み換え体のうちの１個のハイブリダイズ陽性の領域を、λ７ｒ−２０と命名し、０.５ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII制限フラグメントに配置する。このフラグメントをプラスミドベクター（ｐＧＥＭ−３）中にサブクローン化し、ＤＮＡ配列分析を行う。クローンλ７ｒ−２０の部分ＤＮＡ配列（配列番号：１）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：２）を配列表に示す。１９９３年４月２３日にバクテリオファージλ７ｒ−２０をＡＴＣＣに寄託し、受託番号ＡＴＣＣ７５４５２を得た。この寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に要求に合致するものである。このλ７ｒ−２０クローンは、少なくとも本発明ウシ・ＢＭＰ−１０蛋白の一部をコードしている。クローンλ７ｒ−２０のヌクレオチド配列は、配列番号：１のヌクレオチド１６５〜１１０２により定義される少なくとも９３８ｂｐの読み取り枠を有している（ヌクレオチド１６５〜１６６はイントロンにより分断されたコドンの終わりの部分の３分の２である）。読み取り枠は、ＢＭＰ−１０蛋白の少なくとも３１２個のアミノ酸をコードしている。コードされている３１２個のアミノ酸のＢＭＰ−１０蛋白は、成熟ウシ・ＢＭＰ−１０蛋白の全長（配列番号：２のアミノ酸１から１０８）、ならびに１次翻訳産物のプロペプチド領域のＣ末端部分（配列番号：２のアミノ酸−２０４から−１）を含んでいる。１６５から１１０２までのＢＭＰ−１０暗号配列のすぐ先にある認められているスプライス受容配列および１０１から１０３の位置の読み取り枠中の停止コドンは、ヌクレオチド１６５の５'方向におけるイントロン配列の存在を示唆する。ＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白に関する知識によると、ＢＭＰ−１０前駆体ポリペプチドは、認められている蛋白分解的プロセッシング配列ＡＲＧ−Ｘ−Ｘ −ＡＲＧと一致した多塩基性配列ＡＲＧ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧにおいて開裂されると予想される。ＢＭＰ−１０前駆体ポリペプチドの開裂は、位置１のアミノ酸ＡＳＮから始まる１０８個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じると考えられる。ＢＭＰ−１０の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシング［ジェントリー（Gentry）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Moll.& Cell.Biol.）,第８巻：４１６２頁（１９８８年）；デリンク（Derynck）ら,ネイチャー（Nature）,第３１６巻：７０１頁（１９８５年）］と同様の様式での、二量体化およびＮ末端領域の除去を包含すると考えられる。それゆえ、ＢＭＰ−１０の成熟活性種は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなり、各サブユニットはアミノ酸１ないし１０８からなり、その予想分子量は約１２,０００ダルトンであると考えられる。さらなる活性種は、アミノ酸７ないし１０８からなり、そのことにより、１番目の保存されたシステイン残基を含むと考えられる。蛋白のＴＧＦ−βの他のメンバーと同様に、ＢＭＰ −１０蛋白のカルボキシ末端領域は、アミノ末端領域より保存性が高い配列を示す。ＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の対応する領域に対するＢＭＰ−１０蛋白のシステインに富むＣ末端ドメイン（アミノ酸７ないし１０８）のアミノ酸同一性は以下のとおり：ＢＭＰ−２,５６％；ＢＭＰ−３,３９％；ＢＭＰ−４,５４％；ＢＭＰ−５,４８％；ＢＭＰ−６,４８％；ＢＭＰ−７,４７％；ＢＭＰ−８, ４６％；ＢＭＰ−９,６７％；Ｖｇ１,５０％；ＧＤＦ−１,４０％；ＴＧＦ−β １,３７％；ＴＧＦ−β２,３７％；ＴＧＦ−β３,３７％；インヒビンβ（Ｂ）, ３６％；インヒビンβ（Ａ）,３９％。実施例２ヒト・ＢＭＰ−１０ウシおよびヒトの骨誘導因子の遺伝子は有意に相同的であると考えられ、それゆえ、ウシ・暗号配列またはその一部を、ヒト・ゲノムライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いるか、あるいは類似のヒト・蛋白を合成するヒト・細胞系または組織を同定するためのプローブとして用いる。ストラタジーン（Stratagene）カタログ番号９４４２０１のごときヒト・ゲノムライブラリーをかかるプローブでスクリーニングし、陽性と推定されるものを単離し、ＤＮＡ配列を得ることができる。この組み換え体がヒト・ＢＭＰ−１０の一部をコードしているという証拠は、ウシ／ヒト・蛋白および遺伝子構造の相同性による。ヒト・ＢＭＰ−１０分子の一部をコードしているＤＮＡを含む組み換えバクテリオファージが得られたならば、ヒト・暗号配列をプローブとして用いて、ＢＭＰ−１０ｍＲＮＡを合成するヒト・細胞系または組織を同定することができる。別法として、ウシ・ＢＭＰ−１０の暗号配列をプローブとして用いてかかるヒト・細胞系または組織を同定することもできる。簡単に説明すると、選択された細胞または組織を源としてＲＮＡを抽出し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動してニトロセルロースに移すか、あるいはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接スポットする。次いで、ニトロセルロースを、ウシまたはヒト・ＢＭＰ−１０の暗号配列由来のプローブとハイブリダイズさせる。別法として、ウシ・ＢＭＰ−１０暗号配列を用いて、特異的増幅反応を行うのに用いられるプライマー間に位置する領域に位置するＢＭＰ−１０暗号配列の一部を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ウシおよびヒトのＢＭＰ−１０配列は、ｍＲＮＡ由来の対応するヒト・ＢＭＰ−１０をコードしている配列、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ鋳型を特異的に増幅することを可能にするであろう。上記方法の１つにより可能性のある源が確認された場合、オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立された方法により（トール（Toole）ら,上記）、λｇｔ１０または当業者に知られた他のλバクテリオファージベクター、例えば、λ ＺＡＰ中にクローン化する。増幅反応に指向される上記オリゴヌクレオチドプライマーを、すでに確立されたヒト・ｃＤＮＡまたはλバクテリオファージベクター中にクローン化されているゲノムライブラリーに対して直接用いることも可能である。かかる場合、ヒト・ＢＭＰ−１０蛋白の一部をコードしている特異的に増幅されたＤＮＡ産物を生じるライブラリーを、ＢＭＰ−１０をコードしている増幅されたＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて直接スクリーニングすることができよう。ウシ・ＢＭＰ−１０ゲノムクローンλ７ｒ−２０のＤＮＡ配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ヒト・ＢＭＰ−１０をコードしている配列の特異的増幅を可能にすると考えられる。配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド８７６から８９８までに基づいて以下のヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。プライマーＡの最初の９個のヌクレオチド（下線）は、本発明ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために用いられる制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩの認識配列（よって、この配列は配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来ではない）を含む。配列番号：１に示すＤＮＡ配列のヌクレオチド１０６０から１０８７までに基づいて以下のヌクレオチドプライマーを設計し、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。プライマーＢの最初の９個のヌクレオチド（下線）は、本発明ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ配列を特異的に増幅する操作を容易にするために用いられる制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列（よって、この配列は配列番号：１に示すＤＮＡ配列由来ではない）を含む。上記プライマーにおける標準的なヌクレオチドのシンボルは以下のとおり：Ａ ,アデノシン；Ｃ,シトシン；Ｇ,グアニン；およびＴ,チミン。上記プライマーＡおよびＢを、ヒト・ゲノムＤＮＡ由来の特定のヌクレオチドの増幅を行うためのプライマーとして使用する。ヒト・ゲノムＤＮＡ（源：末梢血リンパ球）を１００℃で５分間変性させ、次いで、２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）,１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.３,５０ｍＭＫＣｌ,１.５ｍＭＭｇＣｌ₂,０.００１％ゼラチン,１.２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ,１００ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマーＡおよび１００ｐＭのオリゴヌクレオチドプライマーＢを含有する反応混合物を添加する前に氷で冷却する。次いで、この反応混合物を以下の様式の温度循環に供する：９４℃で３分、５０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを１回、次いで、９４℃ で１分、５０℃で１分、７２℃で１分のサイクルを３９回。製造者の指示する条件下のプロトコールによるＤＮＡ精製樹脂を使用することにより、この反応により特異的に増幅されたＤＮＡを、増幅を開始するために用いた過剰のオリゴヌクレオチドプライマーＡおよびＢから分離する。得られたＤＮＡ生成物を制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、フェノール抽出し、次いで、クロロホルム抽出する。緩衝液交換およびＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ制限的消化により生じたＤＮＡの小フラグメントの除去を、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８.０、１ｍＭＥＤＴＡで消化ＤＮＡ生成物を希釈し、次いで、セントリコン（centricon）^TM３０マイクロコンセントレーター（mic roconcentrator）（マサチューセッツ州ビバリー（Beverly）のダブリュ・アール・グレイス・アンド・カンパニー（W.R.Grace & Co.）,製品番号４２０９）により遠心分離を行うことにより行う。得られたＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ消化され増幅されたＤＮＡ生成物をプラスミドベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のポリリンカー領域のＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限部位間にサブクローン化する。得られたサブクローンのＤＮＡ配列分析は、特異的に増幅されたＤＮＡ配列は本発明ヒト・ＢＭＰ−１０蛋白の一部をコードしていることを示す。この特異的に増幅されたＤＮＡフラグメントのＤＮＡ配列（配列番号：３）および誘導されるアミノ酸配列（配列番号：４）を配列表に示す。この配列のヌクレオチド１から２９までは、オリゴヌクレオチドプライマーＡの一部からなり、ヌクレオチド１６８から１９７までは特異的増幅反応を行うために用いたオリゴヌクレオチドプライマーＢの一部からなる。増幅反応の開始におけるオリゴヌクレオチドプライマーＡおよびＢ（ウシ・ＢＭＰ−１０配列に基づいて設計）の機能により、それらは、ヒト・ＢＭＰ−１０をコードしている実際の配列に正確には一致せず、それゆえ、上記アミノ酸配列の派生物に翻訳されない。ヒト・ゲノムＤＮＡ鋳型から特異的に増幅された配列番号：３のヌクレオチド３０から１６７までのヌクレオチド由来のＤＮＡ配列またはその一部をブローブとして用いて、当業者に知られた標準的ハイブリダイゼーション／スクリーニング法により、さらなるヒト・ＢＭＰ−１０をヒト・ゲノムまたはヒト・ｃＤＮＡライブラリーから同定することができる。全長のヒト・ＢＭＰ−１０全長のヒト・ＢＭＰ−１０ＤＮＡ配列（配列番号：１０）およびコードされるアミノ酸配列（配列番号：１１）を配列表に記載する。ベクターλｇｔ１０中に構築されたヒト・胎児の肝臓のｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（Clonetech）社製,カタログ番号ＨＬ１０６４ａ）の１００万個の組み換え体を、プレートあたり２４０００個の組み換えバクテリオファージプラークの密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージのプラークのニトロセルロースでのレプリカをこれらのプレートから作成する。配列番号：３のオリゴヌクレオチド８５ないし１１４に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブを自動ＤＮＡ合成装置により合成する。このオリゴヌクレオチドプローブをγ³²Ｐ−ＡＴＰで放射性標識し、ＳＨＢ中、６５℃においてニトロセルロースのレプリカの両方のセットにハイブリダイズさせる。１１個の陽性のハイブリダイズしている組み換え体が見られる。陽性のハイブリダイスしている組み換え体の１つをＨＦＬ−３と命名し、プラーク精製する。精製ＨＦＬ−３のｃＤＮＡクローンのバクテリオファージのプレートストックを調製し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。このｃＤＮＡクローンのバクテリオファージストックを、ブダペスト条約の要請に基づき、アメリカ合衆国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣと命名された。クローンＨＦＬ−３のＤＮＡ配列の一部を配列番号：１０に示す。ベクターλＦＩＸ中の構築されたヒト・ゲノムライブラリー（ストラタジーン社製,カタログ番号９４４２０１）の１００万個の組み換え体を、プレートあたり２００００個の組み換えバクテリオファージのプラークの密度で５０枚のプレートに撒く。組み換えバクテリオファージプラークのニトロセルロースでのレプリカをこれらのプレートから作成する。配列番号：１０のヌクレオチド３５５〜３８４に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、ＤＮＡ合成装置により合成する。このオリゴヌクレオチドプローブをγ³²Ｐ−ＡＴＰで放射性標識し、ＳＨＢ中、６５℃において、ニトロセルロースのレプリカの両方のセットにハイブリダイズさせる。６個の陽性のハイブリダズしている組み換え体が見られる。陽性のハイブリダイスしている組み換え体の１つを２０ＧＥＮ.３と命名し、プラーク精製する。精製２０ＧＥＮ.３ゲノムクローンのバクテリオファージのプラークストックを調製し、バクテリオファージＤＮＡを単離する。このゲノムクローンのバクテリオファージストックは、ブダペスト条約の要請に基づき米国メリーランド洲ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣと命名されている。クローン２０ＧＥＮ.３のＤＮＡ配列の一部を配列番号：１０に示す。ゲノムクローン２０ＧＥＮ.３のＤＮＡ配列の一部を、ｃＤＮＡクローンＨＦＬ−３のＤＮＡ配列の一部と同一であると決定した。配列番号：１０のこの重複配列（ヌクレオチド２１９〜３１６）の伸長部分を、ＢＭＰ−１０蛋白配列の部分暗号配列を編集するための基礎として用いた。この配列は配列番号：１０に存在し、ヌクレオチド１から２１８まではすべてゲノムクローン２０ＧＥＮ.３に含まれるＤＮＡ配列由来であり、ヌクレオチド３１７から１５８４まではすべてｃＤＮＡクローンＨＦＬ−３に含まれるＤＮＡ配列由来であるが、ヌクレオチド２１９から３１６までは２０ＧＥＮ.３およびＨＦＬ−３の両方に存在すると決定された。配列番号：１０は、少なくとも４２４個のアミノ酸のヒト・ＢＭＰ−１０前駆体蛋白を示唆する。他のＢＭＰおよびＴＧＦ−βファミリーの他の蛋白の関する知識に基づけば、前駆体ポリペプチドは、提案され認められている蛋白分解的プロセッシング配列ＡＲＧ−Ｘ− Ｘ −ＡＲＧと一致した多塩基性配列ＡＲＧ−ＩＬＥ−ＡＲＧ−ＡＲＧ（配列番号：１１のアミノ酸−４〜−１）において開裂されるであろうと予測される。この位置でのヒト・ＢＭＰ−１０前駆体ポリペプチドの開裂は、配列番号：１１の位置１におけるアミノ酸ＡＳＮから始まる１０８個のアミノ酸の成熟ペプチドを生じるであろう。ヒト・ＢＭＰ−１０の成熟形態へのプロセッシングは、二量体化および関連蛋白ＴＧＦ−βのプロセッシングと類似の様式でのＮ末端領域の除去（エル・イー・ジェントリー（L.E.Gentry）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Molec.& Cell.Biol.）第８巻：４１６２頁（１９８８年）；アール・デリンク（R.Derynck）ら,ネイチャー（Nature）第３１６巻：７０１頁（１９８５年））を包含すると考えられる。ヒト・ＢＭＰ−１０の成熟活性形態は２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなり、各サブユニットは配列番号：１１のアミノ酸１〜１０８からなり推定分子量１２,０００ダルトンであると考えられる。さらなる活性種は配列番号：１１のアミノ酸７〜１０８からなり、そのことにより、１番目の保存されたシステイン残基を有していると考えられる。ＢＭＰ−１０の１つのサブユニットおよびＢＭＰ／ＴＧＦ−βスーパーファミリーの別のメンバーであるもう１つのサブユニットからなるヘテロ二量体も考えられる。当業者に知られたさらなる方法を用いて本発明の他の種のＢＭＰ−１０蛋白を単離することができる。実施例３Ｗ−２０バイオアッセイＡ.Ｗ−２０細胞の説明インジケーター細胞系としてのＷ−２０骨髄基質細胞の使用は、ＢＭＰ蛋白での処理後のこれらの細胞の骨芽細胞への変換に基づく［シース（Thies）ら,ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ミネラル・リサーチ（Journal of Bone and Mi naral Research）,第５巻：３０５頁（１９９０年）；およびシース（Thies）ら ,エンドクリノロジー（Endocrinology）,第１３０巻：１３１８頁（１９９２年）］。詳細には、Ｗ−２０細胞は、マサチューセッツ州ボストンのチルドレンズ・ホスピタル（Children's Hospital）のディー・ナサン（D.Nathan）博士の研究室の研究者により成体マウスから取られたクローン化された骨髄基質細胞系である。ある種のＢＭＰ蛋白でのＷ−２０細胞の処理は、（１）アルカリ性ホスファターゼ産生増加、（２）ＰＴＨにより刺激されるｃＡＭＰの誘導、および（３）細胞によるオステオカルシン（osteocalcin）合成の誘導を引き起こす。（１）および（２）は骨芽細胞の表現形に関連した特徴を示すが、オステオカルシン合成能は成熟骨芽細胞によってのみ示される特性である。さらにそのうえ、現在まで、我々は、ＢＭＰで処理した場合のみ起こるＷ−２０基質細胞の骨芽細胞様への変換を観察してきた。この様式において、ＢＭＰ処理されたＷ−２０細胞により示されるインビトロ活性は、ＢＭＰについて知られているインビボでの骨形成活性と相関がある。新規骨誘導分子のＢＭＰ活性を比較することにおいて有用な２種のインビトロでの分析を以下に説明する。Ｂ.Ｗ−２０アルカリ性ホスファターゼ分析のプロトコールＷ−２０細胞を、９６ウェルの組織培養プレートにウェルあたり２００μｌの培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１００ユニット／ｍｌペニシリン＋１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥ）中１００００個の割合で撒く。９５％空気、５％ＣＯ₂のインキュベーター中３７ ℃において細胞を一晩付着させる。マルチチャンネルピペッターで各ウェルから２００μｌの培地を除去し、１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン−シトレプトマイシンを含有するＤＭＥ中の同体積の試験試料で置換した。試験物質を３系で分析する。試験試料および標準をＷ−２０インジケーター細胞とともに２４時間インキュベーションする。２４時間後、３７℃のインキュベーターからプレートを取り出し、試験培地細胞をから除去する。Ｗ−２０細胞層をウェルあたり２００μｌのカルシウム／マグネシウム不含リン酸緩衝化セイラインで３回洗浄し、これらの洗液を捨てる。ガラス製装置で蒸留された５０μｌの水を各ウェルに添加し、次いで、分析プレートを急速に冷凍するためにドライアイス／エタノール浴に置く。凍結したら、分析プレートをドライアイス／エタノール浴から取り出し、３７℃で融解させる。この工程を２回以上繰り返して全部で３回の凍結融解工程を行う。工程終了後、膜結合アルカリ性ホスファターゼを測定に供する。５０μｌの分析混合物（５０ｍＭグリシン、０.０５％トリトンＸ−１００、４ｍＭＭｇＣｌ₂、５ｍＭリン酸ｐ−ニトロフェノール、ｐＨ＝１０.３）を各分析ウェルに添加し、次いで、分析プレートを、１分間に６０回振盪しながら３７℃で３０分インキュベーションする。３０分間のインキュベーションの終わりに、１００μｌの０.２ＮＮａＯＨを各ウェルに添加し、分析プレートを氷上に置くことにより反応を停止する。各ウェルの分光学的吸光度を４０５ナノメーターの波長において読む。次いで、これらの値を既知標準と比較して各試料のアルカリ性ホスファターゼ活性の評価を行う。例えば、既知量のリン酸ｐ−ニトロフェノールを用いると、吸光度値が得られる。これを表Ｉに示す。既知量のＢＭＰに関する吸光度値を決定し、表IIに示すような単位時間あたり開裂されたリン酸ｐ−ニトロフェノールのμモル数に変換することができる。次いで、これらの値を用いて既知量のＢＭＰ−１０の活性をＢＭＰ−２活性と比較する。Ｃ.オステオカルシンＲＩＡプロトコールＷ−２０細胞を、２４ウェルのマルチウェル組織培養ディッシュの各ウェルに、２ｍｌのＤＭＥ（１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンを含有）中１０⁶個となるように撒く。９５％空気、５％ＣＯ₂中３７℃において細胞を一晩付着させる。翌日、培地を、２ｍｌの全体積中１０％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミンおよび試験物質を含有するＤＭＥに交換する。各試験物質を３系のウェルに入れる。試験物質をＷ−２０細胞とともに合計９６時間（４８時間目に同じ培地で培地交換）インキュベーションする。９６時間のインキュベーションの終わりに、各ウェルから５０μｌの試験培地を取り、マウス・オステオカルシンについてのラジオイムノ分析を用いてオステオカルシン産生について分析を行う。分析の詳細は、マサチューセッツ州０２０７２、スタウトン（Stoughton）、ペイジ・ストリート３７８のバイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレイテッド（Biomedical Techologies Inc.）により製造されたキットに説明がある。分析のための試薬は、製品番号ＢＴ−４３１（マウス・オステオカルシン標準）、ＢＴ−４３２（ヤギ・抗−マウス・オステオカルシン）、ＢＴ−４３１Ｒ（ヨウ素化されたマウス・オステオカルシン）、ＢＴ−４１５（正常ヤギ・血清）およびＢＴ−４１４（ロバ・抗−ヤギＩｇＧ）として見いだされる。ＢＭＰ処理に応答したＷ−２０細胞により合成されたオステオカルシンについてのＲＩＡを、製造者により提供されるプロトコールに記載されたようにして行う。試験試料に関して得られた値をマウス・オステオカルシンの既知標準に関する値と比較し、既知量のＢＭＰ−２での処理に応答してＷ−２０細胞により産生されたオステオカルシン量と比較する。ＢＭＰ−２により誘導されたＷ−２０によるオステオカルシン合成量を表IIIに示す。実施例４ローゼンにより改変されたサムパス−レディ分析（Rosen-Modified Sampath-Red di Assay）サムパスおよびレディ,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ,第８０巻：６５９１〜６５９５頁（１９８３年）記載のラット・骨形成分析の変更バージョンを用いて、骨、軟骨および／または他の結合組織に対するＢＭＰ−１０蛋白の誘導活性を評価する。この変法分析を、本明細書においてはローゼンにより改変されたサムパス− レディ分析と呼ぶ。サムパス−レディ法のエタノール沈殿工程を、分析すべきフラクションの水に対する透析（組成物が溶液の場合）または限界濾過（組成物が懸濁液の場合）に置き換える。次いで、溶液または懸濁液を０.１％ＴＦＡに対して平衡化する。得られた溶液を２０ｍｇのラット・マトリックスに添加する。蛋白処理していない模擬ラット・マトリックス試料は対照として役立つ。この材料を凍結乾燥し、得られた粉末を５番のゼラチンカプセルに封入する。カプセルを、２１〜４９日齢のオスのロング・エバンズ・ラット（Long Evans Rat）の腹胸部の皮下に移植する。各移植物の半分をアルカリ性ホスファターゼ分析に用いる［レディらプロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ,第６９巻：１０６１頁（１９７２年）参照］。各移植物のもう半分を固定し、組織学的分析用に加工する。１μｍのグリコールメタクリラート切片をフォン・コッサ（Von Kossa）および酸性フクシンで染色して、各移植物に見られる誘導された骨および軟骨の形成量について評点をつける。＋１ないし＋５の評点は、新たな骨および／または軟骨細胞およびマトリックスにより占められている移植物の各組織学的切片の面積を示す。評点＋５は、移植物の５０％を上回る部分が移植物中の蛋白の直接的結果として産生された新たな骨および／または軟骨であることを示す。評点＋４、＋３、＋２および＋１はそれそれ、移植物が４０％、３０％、２０％および１０％を上回る新たな軟骨および／または骨を含んでいることを示す。本発明ＢＭＰ−１０蛋白を、この分析における活性に関して評価することができる。実施例５ＢＭＰ−１０の発現ウシ、ヒトまたは他の哺乳動物のＢＭＰ−１０を製造するために、該蛋白をコードしているＤＮＡを適当な発現ベクター中に移し、慣用的な遺伝子工学的方法により哺乳動物細胞または他の好ましい真核細胞宿主もしくは原核細胞宿主中に導入する。生物学的に活性のある組み換え型ヒト・ＢＭＰ−１０の好ましい発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられる。当業者は、配列番号：１または配列番号：１０の配列、もしくはＢＭＰ−１０蛋白をコードしている他のＤＮＡ配列、あるいは他の修飾された配列およびｐＣＤ［オカヤマ（Okayama）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（ Mol.Cell Biol.）,第２巻：１６１〜１７０頁（１９８２年）］、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４［ゴウ（Gough）ら,ＥＭＢＯＪ.,第４巻：６４５〜６５３頁（１９８５年）］ならびにｐＭＴ２ＣＸＭのごとき知られたベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ＣＸＭは、ｐ９１０２３（ｂ）（ウォング（ Wong）ら,サイエンス（Science）第２２８巻：８１０〜８１５頁,１９８５年）の誘導体であるが、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡクローン挿入のためのＸｈｏＩ部位を有することにおいてｐ９１０２３（ｂ）とは異なる。ｐＭＴ２ＣＸＭの機能的エレメントは記載されており（カウフマン,アール・ジェイ（Kaufman,R.J.）,１９８５年,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８２巻：６８９〜６９３頁）、アデノウイルス・ＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含むＳＶ４０・複製開始点、５ 'スプライス部位ならびにアデノウイルス・後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分を含むアデノウイルス・大後期プロモーター、３'スプライス受容部位、ＤＨＦＡ挿入断片、ＳＶ４０・初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびイー・コリ中での増殖に必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる。ｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化によりプラスミドｐＭＴ２ＣＸＭを得る。ｐＭＴ２−ＶＷＦは、受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で米国メリーランド州ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１のＡＴＣＣに寄託されている。ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片が切り出され、連結されてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いられる直鎖状のｐＭＴ２が得られる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。次いで、ループアウト／イン変異誘発［モリナガ（Morinaga）ら,バイオテクノロジー（Biotechnology）第８４巻：６３６頁（１９８４年）］を用いてｐＭＴ２ＣＸＭを構築する。これにより、ｐＭＴ２のＳＶ４０・複製開始点ならびにエンハンサー配列近傍のＨｉｎｄIII部位に対応する塩基１０７５〜１１４５が除去される。さらに、そのヌクレオチド１１４５の位置に以下の配列：を挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を有する。ｐＭＴ２３と命名されたｐＭＴ２ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラスミドｐＭＴ２ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。ｐＭＴ２１由来のｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適する。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦ由来のｐＭＴ２に由来する。上記のごとく、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片が切り出され、連結されてイー・コリＨＢ１０１またはＤＨ−５をアンピシリン耐性へと形質転換するのに用いられる直鎖状のｐＭＴ２が得られる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製することができる。ｐＭＴ２１は、以下の２つの修飾を経てｐＭＴ２から誘導される。最初に、ｃＤＮＡクローニングのためのＧ／Ｃテイリングから伸長した１９個のＧ残基を含む、ＤＨＦＲｃＤＮＡの７６ｂｐの５'非翻訳領域を欠失させる。この工程において、ＸｈｏＩ部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流に以下の配列：を得る。次いで、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａＩでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処理、そしてＣｌａＩリンカー（ＣＡＴＣＧＡＴＧ）への連結により、単一のＣｌａＩ部位を導入する。これにより、２５０ｂｐの断片がアデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から欠失されるが、ＶＡＩＲＮＡ遺伝子の発現または機能は阻害されない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を得るために用いる。ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により、ＥＭＣＶリーダーの一部がｐＭＴ２−ＥＣＡＴ１［エス・ケイ・ジュング（S.K.Jung）ら,ジャーナル・オブ・ウイロロジー（J.Virol）第６３巻：１６５１〜１６６０頁（１９８９年）］から得られ、これは２７５２ｂｐのフラグメントである。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上の電気泳動により精製する。以下の配列を有する５' ＴａｑＩ突出末端および３'ＸｈｏＩ突出末端：を用いて６８ｂｐのアダプターおよびその相補鎖を合成する。この配列は、ヌクレオチド７６３ないし８２７由来のＥＭＣウイルスリーダー配列に合致する。さらにこの配列は、ＥＭＣウイルスリーダー内の位置１０におけるＡＴＧがＡＴＴに変化しており、ＸｈｏＩ部位が後に続いている。ｐＭＴ２１のＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスのＥｃｏＲＩ −ＴａｑＩフラグメント、および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターの３つを連結してベクターｐＥＭＣ２β１を得る。このベクターは、ＳＶ４Ｏ・複製開始点ならびにエンハンサー、アデノウイルス・大後期プロモーター、アデノウイルス・三分節リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小型のハイブリッド介在配列、ＳＶ４０・ポリアデニル化シグナルならびにアデノウイルス・ＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を含み、哺乳動物細胞における高レベルの所望ｃＤＮＡの発現の指令に適当に関連している。ベクターの構築はＢＭＰ−１０のＤＮＡ配列の修飾を包含する。例えば、暗号領域の５'および３'末端上の非暗号ヌクレオチドを除去することにより、ＢＭＰ −１０のＤＮＡを修飾してもよい。欠失された非暗号ヌクレオチドを、発現に有益であることが知られている他の配列で置換してもよく、置換しなくてもよい。これらのベクターを、ＢＭＰ−１０蛋白の発現にとり適当な宿主細胞中に形質転換する。さらに、ＢＭＰ−１０をコードしているプロペプチド配列を欠失させ、他のＢＭＰ蛋白、アクティビン蛋白またはＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバーの完全なプロペプチドをコードしている配列に置き換えることにより成熟ＢＭＰ−１０蛋白を発現させるように、配列番号：１または配列番号：１０の配列、あるいはＢＭＰ−１０蛋白をコードしている他の配列を操作することができよう。当業者は、暗号配列に隣接している哺乳動物の調節配列を除去するかまたは細菌の配列に置き換えて、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用の細菌ベクターを作成することにより、配列番号：１または配列番号：１０の配列を操作することができる。例えば、暗号配列をさらに操作することができる（例えば、他の既知リンカーに連結する、あるいはその非暗号配列を欠失させるかまたは他の既知方法によりそのヌクレオチドを変化させる）。次いで、ティー・タニグチ（T. Taniguchi）ら,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）,第７７巻：５２３０〜５２３３頁（１９８０年）に記載されたような方法を用いて修飾されたＢＭＰ− １０暗号配列を既知細菌ベクター中に挿入することができよう。次いで、この典型的なな細菌ベクターを細菌宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−１０蛋白を発現させる。細菌細胞においてＢＭＰ−１０蛋白を細胞外発現させるための方法については、欧州特許公開ＥＰＡ１７７,３４３参照。昆虫細胞における発現のために、昆虫ベクターの構築を行うための操作を行うことができる［例えば、公開された欧州特許出願第１５５,４７６号記載の方法参照］。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のための酵母の調節配列を用いて、酵母ベクターを構築することもできる［例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ８６／００６３９および欧州特許出願公開ＥＰＡ１２３,２８９号記載の方法参照］。高レベルの本発明ＢＭＰ−１０蛋白を哺乳動物細胞において製造する方法は、異種ＢＭＰ−１０遺伝子の多数のコピーを有する細胞の構築を包含する。異種遺伝子を増幅可能なマーカー、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に連結し、カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp）,ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）,第１５９巻：６０１〜６２９頁（１９８２年）の方法により、メトトレキサート（ＭＸＴ）濃度を上昇させていって増加した遺伝子コピーを有する細胞を該マーカー関して選択できる。このアプローチを種々の異なる細胞タイプに使用することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈ならびにトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめとする種々の方法により、ＢＭＰ−１０の発現を可能にする他のプラスミドの配列と機能的に連結された本発明ＢＭＰ−１０に対するＤＮＡ配列を含むプラスミドと、ＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３［カウフマン（Kaufman）およびシャープ（Sharp）, モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）,第２巻：１３０４頁（１９８２年）］とを、ＤＨＦＲ欠損細胞ＤＵＫＸ−ＢII中に同時に導入することができる。ＤＨＦＲを発現する形質転換体を、透析されたウシ胎児血清を含むアルファ培地における増殖に関して選択し、次いで、カウフマン（Ka ufman）ら,モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.） ,第５巻：１７５０頁（１９８３年）記載のごとく、ＭＴＸ濃度を増加させていった場合の増殖による増幅について選択を行う。形質転換体を増殖させ、生物学的に活性のあるＢＭＰ−１０の発現を、実施例４記載のローゼンにより改変されたサムパス−レディのラット・骨形成分析によりモニターする。ＢＭＰ−１０の発現はＭＴＸ耐性レベルの増加に伴って増加するはずである。［³⁵Ｓ］メチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動のごとき当該分野で知られた標準的方法を用いて、ＢＭＰ−１０ポリペプチドを特徴づける。同様の方法により他の関連ＢＭＰ−１０蛋白を製造することができる。実施例６発現されたＢＭＰ−１０の生物学的活性上記実施例５において得られた発現されたＢＭＰ−１０蛋白の生物学的活性を測定するために、蛋白を細胞培養物から回収し、同時に産生された他の蛋白性物質ならびに他の汚染物質からＢＭＰ−１０蛋白を単離することにより精製する。実施例４記載のラット・骨形成分析により、精製蛋白を分析してもよい。当業者に知られた標準的方法を用いて精製を行う。銀染色［オウクリー（Oakley）ら,アナリティカル・バイオケミストリー（Ana l.Biochem.）第１０５巻：３６１頁（１９８０年）］で染色されるＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド［レムリ（Laemmli）,ネイチャー（Nature）第２２７巻：６８０頁（１９７０年）］およびイムノブロット［トウビン（Towbin）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第７６巻：４３５０頁（１９７９年）］のごとき標準的方法を用いて蛋白の分析を行う。以上の説明は、本発明の目下好ましい具体例を詳述するものである。その実施において、当業者がこれらの記載を考慮して多くの改変ならびに変法を行うことが想定される。それらの改変ならびに変法は、添付した請求の範囲に包含されると確信する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/51 ＺＮＡ 9281−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｎ 5/10 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＪＣ１２Ｐ 21/02 ＡＤＴ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＮＬ，ＮＯ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＢＭＰ−１０蛋白をコードしている単離ＤＮＡ配列。２．該ＤＮＡが、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド７７９または７９７から１１０２まで；（ｂ）配列番号：１０のヌクレオチド１１０８または１１２６から１４３１まで；および（ｃ）緊縮条件下で（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズし、軟骨および／または骨を形成する能力を示す蛋白をコードしている配列からなる群より選択される請求項１記載のＤＮＡ配列。３．該ＤＮＡが、（ａ）配列番号：２のアミノ酸１から１０８までをコードしているヌクレオチド；（ｂ）配列番号：１１のアミノ酸１から１０８までをコードしているヌクレオチド；および（ｃ）緊縮条件下で（ａ）または（ｂ）にハイブリダイズし、軟骨および／または骨を形成する能力を示す蛋白をコードしている配列からなる群より選択される請求項１記載のＤＮＡ配列。４．請求項１のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。５．請求項２のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。６．請求項３のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。７．軟骨および／または骨の形成を誘導する能力により特徴づけられる蛋白をコードしている配列を有する単離ＤＮＡ分子であって、（ａ）配列番号：１のヌクレオチド７７９から１１０５まで；（ｂ）配列番号：１０のヌクレオチト１１０８から１４３１まで；および（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対する天然に存在する対立遺伝子配列および等価な縮重コドン配列からなる群より選択されるＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子。８．請求項７記載のＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞。９．作動するように発現調節配列に連結された請求項７記載のＤＮＡ分子からなるベクター。１０．請求項９記載のベクターで形質転換された宿主細胞。１１．ＢＭＰ−１０蛋白をコードしている単離ＤＮＡ分子であって、配列番号 :１０のヌクレオチド１６０から１４３１までからなるＤＮＡ分子。１２．ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているＤＮＡ暗号配列からなる単離ＤＮＡ分子であって、配列番号：１０のヌクレオチド１１０８から１４３１までからなり、さらに、適当な５'末端側のプロペプチドをコードしておりＤＮＡ暗号配列の読み取り枠に連結しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子。１３．作動するように発現調節配列に連結された請求項１１記載のＤＮＡ分子からなるベクター。１４．請求項１２のベクターで形質転換された宿主細胞。１５．以下の工程（ａ）、（ｂ）：（ａ）ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているヌクレオチド配列からなる請求項２記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで（ｂ）培地からＢＭＰ−１０蛋白を回収し、精製するからなる精製ＢＭＰ−１０蛋白の製造方法。１６．以下の工程（ａ）、（ｂ）：（ａ）ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているヌクレオチド配列からなる請求項３記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで、（ｂ）培地からＢＭＰ−１０蛋白を回収し、精製するからなる精製ＢＭＰ−１０蛋白の製造方法。１７．以下の工程（ａ）、（ｂ）：（ａ）ＢＭＰ−１０蛋白をコードしているヌクレオチド配列からなる請求項７記載のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し；次いで、（ｂ）培地からＢＭＰ−１０蛋白を回収し、精製するからなる精製ＢＭＰ−１０蛋白の製造方法。１８．配列番号：１１に示すアミノ酸１から１０８までのアミノ酸配列からなる精製ＢＭＰ−１０ポリペプチド１９．ポリペプチドが二量体であって、各サブユニットが少なくとも配列番号 :１１のアミノ酸１から１０８までのアミノ酸配列からなるものである請求項１８記載の精製ＢＭＰ−１０ポリペプチド。２０．１のサブユニットが少なくとも配列番号：１１のアミノ酸１から１０８までのアミノ酸配列からなり、もう１つのサブユニットがＢＭＰ−１、ＢＭＰ− ２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ− ８およびＢＭＰ−９からなる群より選択される請求項１８記載の精製ＢＭＰ−１０ポリペプチド。２１．以下の工程（ａ）、（ｂ）：（ａ）配列番号：１０に示すヌクレオチド１１０８から１４３１までのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子で形質転換された細胞を培養し；次いで、（ｂ）配列番号：１１に示すアミノ酸１から１０８までのアミノ酸配列からなる蛋白を該培地から回収し精製するにより製造される精製ＢＭＰ−１０蛋白。２２．細胞が哺乳動物細胞で、ＤＮＡがさらに配列番号：１０のヌクレオチド１６０から１１０７までからなる、請求項２１記載の精製ＢＭＰ−１０蛋白。２３．軟骨および／または骨の形成を誘導する能力により特徴づけられる精製ＢＭＰ−１０蛋白。２４．医薬上許容される担体と混合された有効量の請求項２３記載のＢＭＰ− １０蛋白からなる医薬組成物。２５．さらに、該組成物を支持し、骨および／または軟骨の成長のための表面を提供するマトリックスからなる請求項２４記載の組成物。２６．該マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸およびリン酸三石灰からなる群より選択される材料からなる請求項２５記載の組成物。２７．骨および／または軟骨の形成を必要とする患者に有効量の請求項２５記載の組成物を投与することを特徴とする、患者における骨および／または軟骨の形成を誘導する方法。２８．蛋白のＴＧＦ−βスーパーファミリー（superfamily）のメンバー由来のプロペプチドをコードしているＤＮＡ配列からなり、ＢＭＰ−１０ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列の正しい読み取り枠に連結しているキメラＤＮＡ分子。