ES2846860T3 - Oligodendrocitos funcionales derivados de células madre pluripotentes y métodos de producción y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un método para generar células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) OLIG2+, el método comprende: (a) preparar colonias de células madre pluripotentes humanas (hPSC) al: (i) sembrar las hPSC a baja densidad de 8 000 a 11 000 células/cm2 en una superficie; y (ii) cultivar las hPSC en un cultivo adherente durante 1-2 días, para de esta manera preparar las colonias de hPSC; (b) cultivar las colonias de hPSC hasta la confluencia en un medio que comprende una concentración baja de ácido retinoico (RA) de 10 nM a 250 nM, al menos un inhibidor de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGFβ) seleccionado a partir de SB431542, GW788388, LDN193189, LY2109761, LY2157299, y LY364947, y al menos un inhibidor de la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) seleccionado a partir de LDN193189, DMH1, dorsomorfina, K02288, y Noggin, en donde el primer día de dicho cultivo es el día 0; y (c) cultivar las células confluentes en un medio que comprende 3-cloro-N-[(1r,4r)-4-(metilamino)ciclohexil]-N-[3-(piridin-4-il)bencil]benzo[b]tiofeno-2-carboxamida (Agonista de Smoothened (SAG)) y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM hasta que las células estén sobreconfluentes, en donde las células expresan OLIG2; para de esta manera generar OPC OLIG2+.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligodendrocitos funcionales derivados de células madre pluripotentes y métodos de producción y uso de los mismos

Antecedentes de la invención

Los oligodendrocitos son células del sistema nervioso central presentes en los vertebrados. Ellos producen una vaina de mielina laminada rica en lípidos que envuelve los axones neuronales y crea segmentos definidos de aislamiento eléctrico para maximizar la velocidad de conducción del potencial de acción. La mielina es importante, además, para la integridad y la supervivencia axonal, y se ha demostrado que incluso los pequeños cambios que afectan el metabolismo de los oligodendrocitos pueden conducir a la neurodegeneración. Kassmann, C.M. y otros, Nature Genet. 39:969-976 (2007). El proceso de mielinización es particularmente importante en los seres humanos, ya que el cerebro humano tiene un mayor contenido de neuronas mielinizadas (sustancia blanca) y la mielinización continúa después del nacimiento y durante toda la vida. Bartzokis, G., Adolescent Psychiat. 29:55-96 (2005). Esto sugiere que los oligodendrocitos no solo proporcionan un aislamiento inerte, sino que la mielinización es un proceso dinámico, que afecta la función cognitiva e incluso el comportamiento.

La esclerosis múltiple (EM), la adrenoleucodistrofia, la enfermedad de la desaparición de la sustancia blanca, la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher, y las leucodistrofias son ejemplos de trastornos desmielinizantes o de anomalías en la mielinización. Además, está surgiendo un papel fundamental para los oligodendrocitos en muchos otros trastornos neurológicos y afecciones neurodegenerativas, que incluye la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia. Bernstein, H.G. y otros, Schizophr. Res.

161:4-18 (2015); Behrendt, G. y otros, Glia 61:273-286 (2013); Kang, J. y otros, Ann. Vasc. Surg. 27:487-496 (2013); Fennema-Notestine, C. y otros, Neurology 63:989-995 (2004). Las células progenitoras de oligodendrocitos humanos (OPC) pueden usarse para desarrollar ensayos de mielinización in vitro, para seleccionar compuestos mielinizantes y, en última instancia, podrían convertirse en una fuente para las terapias de sustitución de células autólogas. En particular, la generación de células específicas del paciente a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para la terapia con células autólogas ha surgido recientemente como un concepto prometedor. Wang, S. y otros, Cell Stem Cell 12:252-264 (2013); Goldman, S.A. y otros, Science 338:491-495 (2012).

Los estudios de la biología de los oligodendrocitos humanos y de la mielinización humana se han visto obstaculizados por el acceso limitado a células primarias a partir de biopsias o autopsias. Las células madre pluripotentes (PSC) se han usado en las últimas dos décadas como una fuente alternativa y útil a partir de la cual puede generarse cualquier tipo de célula conveniente. Esto se ha logrado mediante la recapitulación in vitro de las etapas fundamentales del desarrollo embrionario. Irion, S. y otros, Cold Spring Harb. Sym. 73:101-110 (2008). Notablemente, la mayoría de las vías críticas de compromiso del linaje están altamente conservadas entre ratones y humanos y, por lo tanto, los conocimientos obtenidos de la biología del desarrollo del ratón se han aplicado con éxito para producir numerosos tipos de células, que incluyen los oligodendrocitos, a partir de PSC humanas (hPSC). Murry, C.E. y otros, Cell 132:661-680 (2008).

En ratones, los precursores de oligodendrocitos surgen dentro del dominio progenitor de la neurona motora (pMN). Durante el desarrollo embrionario del ratón, las rutas del ácido retinoico (RA) y del erizo sónico (SHH) son críticas para definir el dominio pMN. Este hallazgo se ha explotado en cultivos in vitro para convertir células neuroepiteliales en progenitoras del dominio pMN, que expresan el factor de la transcripción OLIG2. Wichterle, H. y otros, Cell 110:385-397 (2002). El RA a una concentración de 10 pM se ha usado en la mayoría de los métodos para diferenciar las células madre embrionarias humanas (hESC) en oligodendrocitos. Izrael, M. y otros, Mol. Cell. Neurosci. 34:310-323 (2007); Nistor, G. I. y otros, Glia 49:385-396 (2005). El laboratorio de Zhang demostró que SHH es necesario para la inducción de progenitores OLIG2+ NKX2.2+, y para su transición a células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) que expresan SOX10, PDGFRa y finalmente O4. Hu, B.Y. y otros, Development 136:1443-1452 (2009a). La aparición de OPC in vitro se retrasa significativamente en el modelo humano en comparación con el modelo de ratón; hay un período prolongado de 10 semanas entre el máximo de progenitores OLIG2+ y el máximo de OPC en el modelo humano. Hu, B.Y. y otros, Nat. Protoc. 4:1614-1622 (2009b).

Numerosos grupos han diseñado protocolos para diferenciar las PSC en OPC. Numasawa-Kuroiwa, Y. y otros; Stem Cell Rep. 2:648-661 (2014); Stacpoole, S.R. y otros, Stem Cell Rep. 1:437-450 (2013); Wang y otros, (2013); Liu, Y. y otros, Nat. Protoc. 6:640-655 (2011); Sim, F.J. y otros, Nat. Biotechnol. 29:934-941 (2011). Sin embargo, estos protocolos de diferenciación son prolongados e ineficaces; su aplicación práctica está limitada por los tiempos de cultivo requeridos de más de 120 días para obtener las OPC que expresan el antígeno O4. Además, las eficiencias reportadas de células O4+ obtenidas oscilan entre el 4 % y el 47 %. Además, muchos protocolos de diferenciación se han optimizado mediante el uso de solo una o dos líneas de hESC, y su reproducibilidad con líneas de iPSC es controvertida. Alsanie, W. y otros, Stem Cells Devel. 22:2459-2476 (2013).

Por lo tanto, es muy conveniente un protocolo de diferenciación de oligodendrocitos mejorado que genere un gran número de OPC purificadas en un tiempo relativamente corto. Además, este protocolo debe ser reproducible entre diferentes líneas de PSC y debe ser altamente eficiente.

Resumen de la invención

Algunos de los aspectos principales de la presente descripción se resumen más abajo. Los aspectos de la invención para los que se busca protección son como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Se describen aspectos adicionales en las secciones Descripción detallada de la invención, Ejemplos, Figuras y Reivindicaciones de esta descripción. La descripción en cada sección de esta descripción está destinada a leerse junto con las otras secciones. Además, las diversas modalidades descritas en cada sección de esta descripción pueden combinarse de varias formas diferentes, y se pretende que todas estas combinaciones caigan dentro del alcance de la invención.

La presente invención proporciona un protocolo de diferenciación robusto que genera entre un 40 % y un 70 % de OPC O4+ dentro de los 75 días. Douvaras, P. y otros, Stem Cell Rep. 3:250-259 (2014). Además, se proporciona una estrategia para obtener aproximadamente un 30 % de OPC O4+ después de solo 55 días de diferenciación, lo que resulta en una reducción sustancial de los costos. Douvaras, P. y otros, Nat. Protoc. (2015). Cuando se purifica, las células O4+ pueden injertarse y, en estudios de trasplante a corto plazo (16 semanas) en el modelo de ratón shiverer (shi/shi), muestran un potencial de mielinización comparable al de las OPC fetales humanas. Las OPC se purifican mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) en el estadio en el que expresan O4 en lugar de PDGFRa, lo que elimina las células contaminantes y minimiza el potencial tumorigénico. Nuestro protocolo se validó mediante el uso de más de nueve líneas de hPSC, con resultados muy consistentes para cada línea. Por lo tanto, la presente invención proporciona un protocolo altamente reproducible para derivar de manera eficiente OPC y oligodendrocitos maduros a partir de PSC, que incluye las células madre embrionarias (ESC) y las iPSC.

En un aspecto, la invención proporciona un método para generar células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) OLIG2+, el método comprende: (a) preparar colonias de células madre pluripotentes humanas (hPSC) al (i) sembrar hPSC a baja densidad de 8 000 a 11 000 células/cm2 en una superficie; y (ii) cultivar las hPSC en un cultivo adherente durante 1-2 días, de esta manera se preparan las colonias de hPSC; (b) cultivar las colonias de hPSC hasta la confluencia en un medio que comprende una concentración baja de ácido retinoico (RA) de 10 nM a 250 nM, al menos un inhibidor de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGFp) seleccionado a partir de SB431542, GW788388, LDN193189, LY2109761, LY2157299, y LY364947, y al menos un inhibidor de la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) seleccionado a partir de LDN193189, DMH1, dorsomorfina, K02288, y Noggin, en donde el primer día de dicho cultivo es el día 0; y (c) cultivar las células confluentes en un medio que comprende un Agonista Smoothened (SAG; 3-cloro-N-[(1r,4r)-4-(metilamino)ciclohexil]-N-[3-(piridin-4-il)bencil]benzo[b]tiofeno-2-carboxamida) y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM hasta que las células estén sobreconfluentes, en donde las células expresan OLIG2; para de esta manera generar las OPC OLIG2+.

El método de este aspecto puede comprender, además: (d) cultivar agregados celulares tridimensionales de OPC OLIG2+ en suspensión en un medio que comprende SAG y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM durante aproximadamente 8 días; (e) cultivar los agregados celulares en suspensión en un medio que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), y neurotrofina 3 (NT3) durante aproximadamente 10 días; (f) sembrar nuevamente los agregados celulares a una densidad de 2 esferas/cm2; y (g) cultivar los agregados celulares en un cultivo adherente en un medio que comprende (i) ácido ascórbico (AA) o (ii) PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 hasta que las células sean O4+; para de esta manera generar las OPC O4+. Pueden generarse oligodendrocitos maduros mediante el cultivo de las OPC O4+ en ausencia de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 durante aproximadamente tres semanas; para de esta manera generar oligodendrocitos, en donde los oligodendrocitos expresan la proteína básica de mielina (MBP+).

Alternativamente, el método de este aspecto puede comprender, además: (d) desprender las OPC OLIG2+ de la superficie, para de esta manera permitir la formación de agregados celulares tridimensionales; (e) cultivar los agregados celulares en suspensión en un medio que comprende SAG y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM durante aproximadamente 8 días; (f) cultivar los agregados celulares en suspensión en un medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 durante aproximadamente 10 días; (g) sembrar nuevamente los agregados celulares a una densidad de 2 esferas/cm2; (h) cultivar los agregados celulares en un cultivo adherente en un medio que comprende (i) AA o (ii) PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 hasta que las células sean O4+, para de esta manera generar las OPC O4+; y (i) cultivar las OPC O4+ en un medio que comprende AA y que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 hasta que las células son MBP+; para de esta manera generar oligodendrocitos.

Otro ejemplo de la descripción es un método para generar oligodendrocitos, el método comprende: (a) cultivar PSC en un cultivo adherente como una monocapa en un medio que comprende una baja concentración de RA, (i) con inhibición dual de SMAD desde el día 0 al día 8, y (ii) con SHH o un agonista de Smoothened desde el día 8 al día 12, para producir células OLIG2+; (b) enriquecimiento de células OLIG2+ mediante el cultivo de las células de la etapa (a) en suspensión (i) desde el día 12 al día 20 en un medio que comprende SHH o un agonista de Suavizado y una concentración baja de RA, y (ii) desde el día 20 al día 30 en un medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3; (c) cultivar las células de la etapa (b) en un cultivo adherente en un medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 desde el día 30 al día 75 para producir OPC O4+; y (d) cultivar las OPC O4+ en cultivo adherente en un medio que comprende AA y que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 desde el día 75 hasta el día 95; para de esta manera generar oligodendrocitos.

Un caso adicional de la descripción es un método para generar oligodendrocitos, el método comprende: (a) cultivar las PSC en un cultivo adherente como una monocapa en un medio que comprende una baja concentración de RA, (i) con inhibición dual de SMAD desde el día 0 al día 8, y (ii) con SHH o un agonista de Smoothened desde el día 8 al día 12, para producir células OLIG2+; (b) enriquecimiento de células OLIG2+ mediante el cultivo de las células de la etapa (a) en suspensión (i) desde el día 12 al día 20 en un medio que comprende SHH o un agonista de Suavizado y una concentración baja de RA, y (ii) desde el día 20 al día 30 en un medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3; y (c) cultivar las células de la etapa (b) en un cultivo adherente en un medio que comprende AA y que carece de PDGf , HGF, IGF-1 y NT3 desde el día 30 al día 60; para de esta manera generar oligodendrocitos.

Además, se proporciona un método para identificar un compuesto que promueve la mielinización, el método comprende: (a) generar un oligodendrocito mediante un método de la invención; (b) poner en contacto el oligodendrocito con un compuesto candidato; y (c) determinar si el compuesto candidato promueve la mielinización de neuronas.

Además, en la presente descripción se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno neurológico en un sujeto, el método comprende: (a) generar oligodendrocitos mediante un método de la invención; y (b) administrar al sujeto una cantidad eficaz de oligodendrocitos, en donde los oligodendrocitos promueven la mielinogénesis en el sistema nervioso del sujeto; tratando de esta manera la enfermedad neurológica en el sujeto.

La descripción abarca, además, células progenitoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos producidos mediante los métodos de la invención, y mamíferos no humanos que los comprenden.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un desarrollo cronológico de la diferenciación de oligodendrocitos siguiendo la Opción A (Figura 1A) y la Opción B (Figura 1B). Los triángulos representan los momentos recomendados para evaluar la expresión de marcadores específicos de la etapa a través de la inmunofluorescencia. SB: SB431542; LDN: LDN193189; SAG: Agonista de Smoothened; T3: triyodotironina; RA: ácido retinoico todo trans; PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas; HGF: factor de crecimiento de hepatocitos; IGF-I: factor de crecimiento similar a la insulina 1; NT3: neurotrofina 3; AA: ácido ascórbico.

La Figura 2 muestra el requisito de RA y SHH para derivar células progenitoras OLIG2+. La Figura 2A muestra imágenes en vivo y cuantificación por citometría de flujo de células OLIG2-GFP en el día 14 de diferenciación en diferentes condiciones para RA y SHH. El RA a una concentración de 100 nM desde el día 0 resulta en el mayor rendimiento de células GFP+. La Figura 2B muestra una comparación entre la adición de SHH o SAG en el día 8 con respecto a la mejor condición de RA, a través de imágenes en vivo y análisis por FACS. Negativo: referencia línea hESC RUES1. La Figura 2C muestra el perfil de expresión génica temporal de PAX6, OLIG2 y NKX2.2 en condiciones óptimas de RA y SHH. Las barras de error son SEM (N=3). Se obtienen resultados comparables mediante el uso de células RUES1 de referencia y la línea indicadora OLIG2-GFP. La Figura 2D muestra una evaluación de la formación de esferas para células no clasificadas, células clasificadas GFP+ o células GFP'. Solo las células GFP+ forman esferas, lo que proporciona enriquecimiento a la población GFP+.

La Figura 3 muestra los requisitos de inhibición dual de SHH y SMAD para los progenitores OLIG2+. La Figura 3A muestra los niveles de ARNm para OLIG2, PTCH1 y SHH en el día 14 de la diferenciación entre cultivos con RA desde d0 y SHH/SAG desde d8, en comparación con las células que se expusieron solo a RA desde d0. Los niveles endógenos de SHH son más altos en las muestras que no se expusieron a SHH/SAG. Las barras de error son SEM (N=3). La Figura 3B muestra análisis por FACS para las células O4+ en el día 75 de la diferenciación entre las células que se expusieron a RA solamente, o RA y SAG, en los primeros 12 días de la diferenciación. Una disminución del 56 % en la población O4+ se observó en las células que no recibieron SAG en las etapas iniciales de la diferenciación. Control Negativo: Solo anticuerpo secundario conjugado con APC. La Figura 3C muestra imágenes en vivo y análisis por FACS en el día 14 de la diferenciación bajo diferentes inhibidores de SMAD. Una población sustancial de células GFP+ está presente sólo bajo la inhibición dual de las proteínas SMAD, lo que indica un efecto sinérgico entre RA y la inhibición dual de SMAd . DSi: Inhibición dual de SMAD; SB: SB431542; LDN: LDN189193.

La Figura 4 muestra la generación de oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes humanas. La Figura 4A muestra un diagrama del protocolo de diferenciación de hPSC a oligodendrocitos maduros. Las Figuras 4B-4M son las etapas secuenciales de la diferenciación in vitro de oligodendrocitos de las células RUES1 de referencia que muestra: células madres neurales PAX6+ en el día 8 (B), contraste de fase de estructura de múltiples capas en el día 12 (C), pre-OPC OLIG2+NKX2.2+ en el día 18 (D), OPC tempranos SOX10+OLIG2+ (E), imagen in vivo de OPC tardíos O4+ (F), imagen recortada de células O4+ para resaltar los procesos ramificados (G), OPC O4+ que expresan conjuntamente OLIG2 (H), OPC O4+ que expresan conjuntamente SOX10 (I), OPC O4+ clasificados que expresan conjuntamente SOX10 y NG2 (J), oligodendrocitos diferenciados terminalmente MBP+ a bajo (K), y alto (x64) aumento (L), células MAP2+ y GFAP+ en los cultivos de oligodendrocitos (M). PSC: célula madre pluripotente; NSC: célula madre neural; OPC: célula progenitora de oligodendrocito; OL: oligodendrocito; pO/L: poli-L-ornitina/Laminina.

La Figura 5 muestra oligodendrocitos proliferativos y otros tipos de células neurales. La Figura 5A muestra tinción de inmunofluorescencia representativa en el d50 de la diferenciación para OLIG2, SOX10 y Ki67. Existe una localización conjunta casi completa entre OLIG2 y SOX10. La Figura 5B muestra la cuantificación temporal de células Ki67+ que muestran el porcentaje de progenitores OLIG2+y SOX10+ que proliferan entre el d30 y el d50 de la diferenciación. Las barras de error son SEM (N=2). La Figura 5C muestra una imagen de inmunofluorescencia de un cultivo en el d73 que muestra un alto número de células O4+, pero casi ninguna célula expresa conjuntamente Ki67. La Figura 5D muestra el porcentaje de células O4+ que expresan conjuntamente MBP 4 semanas después de la eliminación del factor de crecimiento (Medio Glial). La barra de error es SEM (N=4). La Figura 5E muestra el porcentaje de neuronas MAP2+ y astrocitos GFAP+ con respecto al número total de células en tres experimentos independientes en los d78 - d88 de la diferenciación. Las barras de error son SEM (N=3).

La Figura 6 muestra imágenes de O4 en vivo el día 53 (Figuras 6A, 6D), día 63 (Figuras 6B, 6E), y día 73 (Figuras 6C, 6F) de la diferenciación siguiendo el protocolo de la Opción B. Las Figuras 6A-6C muestran campos representativos a bajo aumento; el número de células O4+ aumenta con el tiempo. Las Figuras 6D-6F muestran imágenes de mayor aumento de las Figuras 6A-6C, respectivamente, para resaltar la morfología de las células. La Figura 6G muestra ejemplos representativos de las frecuencias de células O4+ calculadas por citometría de flujo en diferentes momentos mediante el uso del protocolo de la Opción B ("rápido") (día 55, día 63 y día 75) y el protocolo de la Opción A ("original"). Barras de escala: 500 pm (6A-6C); 200 pm (6D-6F).

La Figura 7 muestra las etapas fundamentales de la diferenciación de hPSC a oligodendrocitos. La Figura 7A muestra células madre neurales PAX6+ en el día 8 de la diferenciación (PAX6, verde; los núcleos se tiñeron con DAPI, azul). La Figura 7B muestra la morfología típica del cultivo el día 12, que representa las estructuras tridimensionales. La Figura 7C muestra la expresión de OLIG2 y NKX2.2 en el día 12 como se muestra mediante análisis inmunofluorescente (OLIG2, verde; NKX2.2, rojo; los núcleos se tiñeron con DAPI, azul). La Figura 7D muestra la selección de las esferas: las flechas indican las esferas buenas, que son de forma redonda, de color dorado/marrón, con núcleo más oscuro y con un diámetro entre 300 pm y 800 pm. El signo de exclamación indica un par de esferas unidas que pueden dividirse en esferas individuales mediante un pipeteo suave. Los agregados que deben evitarse son pequeños y transparentes (puntas de flecha) o muy grandes y de forma irregular, generalmente derivados por digestión mecánica (estrella). La Figura 7E muestra tinción inmunofluorescente de células progenitoras el día 56, que expresan conjuntamente NKX2.2 (verde), SOX10 (rojo) y OLIG2 (azul). La Figura 7F muestra tinción en vivo de O4 (verde) que muestra la morfología altamente ramificada de las células. La Figura 7G muestra oligodendrocitos MBP+(rojo) al final de la diferenciación (los núcleos se tiñeron con DAPI, azul). La Figura 7H muestra la morfología de oligodendrocitos MBP+(rojo) a mayor aumento (64x). Las células MAP2+(verde) y GFAP+ (azules) también están presentes en el cultivo. La Figura 7I muestra que las células O4+ purificadas 24 horas después de la clasificación aún retienen la morfología ramificada típica. Barras de escala: 500 pm (Figuras 7A, 7B, 7G); 200 pm (Figuras 7C, 7E, 7F, 7I); 1 mm (Figura 7D).

La Figura 8 muestra la generación y caracterización de líneas de PPMS iPSC. La Figura 8A muestra la reprogramación de ARNm/miARN de líneas de PPMS, que muestra fibroblastos representativos de piel en el día 7, colonias similares a iPSC evidentes en el día 12, y colonias TRA-1-60+ en el día 15 de la reprogramación. La Figura 8B muestra la inmunofluorescencia de PPMS-iPSC 102 para marcadores de pluripotencia. La Figura 8C muestra la inmunofluorescencia después de la diferenciación espontánea in vitro a través de cuerpos embrioides para el marcador endodérmico AFP, el marcador mesodérmico aSMA y el marcador ectodérmico pIII-tubulina. Los núcleos se tiñeron con DAPI. La Figura 8D muestra secciones teñidas con H&E de la formación de teratoma in vivo después de la inyección de PPMS iPSC en ratones inmunodeficientes, que muestra las estructuras representativas de tejido glandular (endodermo), cartílago (mesodermo) y epitelio pigmentado (ectodermo). La Figura 8E muestra la expresión génica de pluripotencia de PPMS-iPSC indiferenciadas y fibroblastos parentales, con relación a una línea de hESC de referencia. El gen ANPEP es específico de los fibroblastos. La Figura 8F muestra el análisis citogenético; todas las líneas PPMS-iPSC muestran un cariotipo normal.

La Figura 9 muestra la caracterización de la formación de teratomas en líneas iPSC. Imágenes representativas del endodermo (Figura 9A), ectodermo (Figura 9B), y mesodermo (Figura 9C) de la formación de teratomas in vivo después del trasplante de células de la línea 102 de iPSC en un ratón inmunodeficiente.

La Figura 10 muestra que las PPMS-iPSC generan OPC y oligodendrocitos maduros in vitro. Las Figuras 10A-10I son etapas secuenciales dela diferenciación de oligodendrocitos in vitro de PPMS iPSC que muestra: células PAX6+ en el día 8 (A), estructuras de múltiples capas en contraste de fase en el día 12 (B), células OLIG2+ y NKX2.2+ en el día 12 (C), OPC tempranos SOX10+OLIG2+ (D), imagen en vivo de OPC tardíos O4+ en el día 73 (E), imagen recortada de células O4+ para resaltar los procesos ramificados (F), oligodendrocitos diferenciados terminalmente MBP+ a bajo (G), y alto (x64) aumento (H), células MAP2+ en los cultivos de oligodendrocitos (I). La Figura 10J muestra la cuantificación de células O4+ después de 75 días de diferenciación a partir de RUES1 y PPMS iPSC mediante análisis por FACS. Los portales de salida se basan en el Ab-APC secundario solo para la tinción con O4 y el control de isotipo conjugado con PE para la tinción con PDGFRa (Negativo). La frecuencia de las células totales O4+ (O4 & +) se muestra entre paréntesis.

La Figura 11 muestra la caracterización de las células antes del trasplante para los estudios in vivo. La Figura 11A muestra gráficos de FACS que muestran marcadores de pluripotencia en una línea iPSC cultivada en MEF, y la carencia de los mismos marcadores en las células en el d81 de la diferenciación. La Figura 11B es un gráfico que muestra el portal de salida más estricto usado para clasificar las células O4+ antes del aislamiento y criopreservación para los trasplantes in vivo. La Figura 11C muestra una imagen de campo claro de células O4+ clasificadas sembradas después de la criopreservación, durante el período de recuperación de 48 horas. La Figura 11D muestra la tinción de O4 en vivo en OPC clasificadas, que muestra la retención de O4 y la morfología ramificada adecuada.

La Figura 12 muestra que las OPC derivadas de PPMS se injertan y se diferencian en oligodendrocitos mielinogénicos in vivo. La Figura 12A muestra las OPC O4+ derivadas de PPMS iPSC humanas trasplantadas en ratones shiverer/rag2 neonatales. A las 16 semanas, las células humanas mostraron un injerto denso en el cuerpo calloso (hNA, rojo). Un gran número se había diferenciado como oligodendrocitos que expresan MBP (verde) y se distribuyeron de manera difusa por todo el cuerpo calloso. La Figura 12B es una imagen confocal que muestra la localización conjunta de los axones del ratón (neurofilamento; NF, rojo) y oligodendrocitos MBP+ humanos (verde). La Figura 12c y La Figura 12D muestran micrografías electrónicas de axones mielinizados que exhiben la mielina compacta característica con líneas densas principales alternas (puntas de flecha) e intraperíodos. La Figura 12E muestra que las células humanas trasplantadas retuvieron las características del progenitor con ~ 80 % de células hNA que expresan OLIG2 (verde; 16 semanas). La Figura 12F muestra que a las 16 semanas, las células NG2 individuales habían comenzado a migrar hacia la corteza cerebral suprayacente. La Figura 12G muestra que las OPC clasificadas como O4 derivadas de iPSC demostraron una bipotencialidad limitada in vivo: solo unos pocos astrocitos GFAP+ se encontraron en las proximidades del ventrículo lateral.

La Figura 13 muestra información demográfica de pacientes con MS e individuos sanos a partir de los que se han derivado las líneas de iPSC.

La Figura 14 muestra la reprogramación de fibroblastos de piel a iPSC. La Figura 14A muestra que los fibroblastos con cambios aparentes en su morfología son visibles en el d3 de la reprogramación. La Figura 14B muestra la eficiencia de transfección en el d7, evaluada mediante el uso de ARNm de nGFP. La Figura 14C muestra colonias de tipo iPSC en el d12. La Figura 14D muestra un clon de iPSC expandido en condiciones libres de células alimentadoras.

La Figura 15 muestra la caracterización de líneas iPSC mediante el uso del análisis de nanocadenas para pluripotencia. La Figura 15A muestra el análisis de nanocadenas de 3 líneas de hESC de referencia, 2 líneas de fibroblastos, y 5 líneas de iPSC derivadas de pacientes con MS o controles sanos; Las líneas iPSC son indistinguibles de las líneas hESC de referencia. La Figura 15B muestra que la diferenciación espontánea del cuerpo embrioide in vitro da lugar a células de todas las capas germinales. De izquierda a derecha: células endodérmicas AFP+, células ectodérmicas Tuji1+, células mesodérmicas aSMA+.

La Figura 16 muestra un enfoque para comprender la esclerosis múltiple.

Descripción detallada de la invención

Desarrollamos un protocolo de diferenciación robusto, rápido y reproducible para generar oligodendrocitos humanos a partir de PSC mediante el uso de un medio químicamente definido rico en factores de crecimiento. Nuestro protocolo imita la diferenciación de oligodendrocitos durante el desarrollo. En 8 días, las PSC se diferencian en células madre neurales PAX6+, que dan lugar a progenitores OLIG2+ el día 12. Las células OLIG2+ se comprometen con el linaje de oligodendrocitos mediante la expresión conjunta de NKX2.2 alrededor del día 18, y después se diferencian en OPC tempranas mediante la regulación positiva de SOX10 y PDGFRa alrededor del día 40. Las OPC tardías que expresan el antígeno glicolípido sulfatado reconocido por el anticuerpo O4 (O4+) aparecen alrededor del día 50, y alcanzan el 40-70 % de la población celular a los 75 días de la diferenciación. Las células progenitoras de oligodendrocitos O4+ pueden aislarse mediante clasificación celular para estudios de mielinización, o pueden diferenciarse terminalmente a oligodendrocitos maduros MBP+. El desarrollo cronológico de nuestro protocolo de diferenciación de oligodendrocitos se muestra en La Figura 1.

Las vías de señalización que manipulamos para generar oligodendrocitos se seleccionaron en base al conocimiento obtenido de los estudios del desarrollo embrionario de la médula espinal de roedores. Hu y otros (2009a). In vitro, La señalización de RA y SHH imitan el entorno pMN, lo que induce la diferenciación de las PSC a células progenitoras OLIG2. En nuestros cultivos, la señalización de SHH se activa a través de un agonista de Smoothened en lugar de la proteína SHH recombinante humana. Encontramos que la combinación de la señalización de RA y SHH con inhibición de activina/nodal/TGFp (a través de SB431542) y la inhibición de BMP4 (a través de LDN193189), generó el mayor rendimiento de progenitores OLIG2+. Debido a la acción sinérgica de SB431542 y LDN193189, más del 70 % de las células expresan OLIG2 el día 12. Esta es una diferencia clave entre nuestro protocolo y el de Wang y otros (2013). La inhibición tanto de la señalización de activina/nodal/TGFp como de la señalización de BMP también se denomina "inhibición dual de SMAD."

Hay varias otras diferencias importantes entre nuestros métodos y los protocolos publicados anteriormente. Por ejemplo, comenzamos la inducción neural con la inhibición dual de SMAD en cultivos adherentes, en oposición a los de suspensión. Wang y otros (2013); Hu y otros (2009b); Nistor y otros (2005). Mediante el uso de este enfoque, comenzamos con solo 10 000 células/cm2 en el día 0 y, sin embargo, logramos una gran expansión de los progenitores neurales y, en última instancia, una generación abundante de OPC. Además, la concentración óptima de Ra en nuestras manos se encuentra alrededor de 100 nM, que es cien veces menor que la concentración usada por otros grupos. Gil, J.E. y otros, FEBS Letters 583:561-567 (2009); Izrael y otros (2007); Nistor y otros (2005). Además, la inducción con RA solo, sin SHH exógena, generó, sorprendentemente, una gran población de células OLIG2+. Confirmamos que un agonista de Smoothened es una sustitución eficaz de SHH y de hecho mostró una eficacia superior en nuestras manos (Stacpoole y otros 2013). Además, nuestra descripción, notablemente, es la primera en mostrar la inducción de OLIG2 mediante RA en ausencia de la señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF). Se conoce que la combinación de señalización de RA y FGF promueve la expresión de OLIG2 durante el desarrollo del pollo y se ha usado para la diferenciación in vitro de las ESC y las iPSC humanas. Pouya, A. y otros, PLoS One 6:e27925 (2011); Nistor y otros (2005); Novitch, B.G. y otros, Neuron 40:81-95 (2003). Un estudio reciente sugirió que el FGF básico (bFGF) es esencial para la especificación de oligodendrocitos de origen del prosencéfalo ventral, mientras que inhibe la diferenciación neuronal durante la especificación de oligodendrocitos de la médula espinal. Stacpoole y otros (2013). No obstante, hemos logrado un alto rendimiento de OPC en ausencia de cualquier FGF exógeno durante nuestra diferenciación in vitro. Finalmente, la transición de cultivos adherentes a cultivos en suspensión de esferas celulares en el día 12 demostró ser una etapa crítica para enriquecer la población de células OLIG2+ y para restringir la diferenciación de nuestros cultivos al linaje de oligodendrocitos.

Proporcionamos, además, la primera evidencia de que los oligodendrocitos mielinizantes pueden derivarse mediante la reprogramación de fibroblastos de la piel de pacientes con PPMS. El único informe anterior sobre iPSC derivadas de Ms mostró que los oligodendrocitos podían diferenciarse in vitro a partir de una línea iPSC integradora, reprogramada retroviralmente de un único paciente con RRMS de 35 años. Song, B., y otros, Stem Cell Res. 8:259-273 (2012). Demostramos la mielinización in vivo por las OPC derivadas de 4 líneas de iPSC sin integración, de pacientes con PPMS de ambos sexos y de 50-62 años. Por lo tanto, la presente descripción difiere del trabajo reciente que usa las OPC derivadas de iPSC en que nuestras líneas de iPSC se derivan de pacientes con PPMS. Además, las células usadas para los trasplantes in vivo se han clasificado mediante el uso del marcador O4 de OPC tardía, para restringir al máximo el potencial de diferenciación. A pesar de estas diferencias, las OPC O4+ derivadas de PPMS clasificadas exhibieron una eficiencia de injerto similar, una fracción mitótica similar y una proporción similar de axones envueltos en el huésped al mismo tiempo que generaban menos astrocitos GFAP+ en comparación con las OPC derivadas de iPSC no clasificadas, informadas anteriormente. En conjunto, nuestros datos muestran que las OPC derivadas de PPMS funcionaron in vivo al menos tan eficientemente como las células sanas derivadas de iPSC (Wang y otros, 2013), y establecen que nuestros protocolos de derivación de iPSC e inducción de OPC pueden generar oligodendrocitos mielinogénicos a partir de una muestra de un único paciente, que pueden usarse en terapias de sustitución de células autólogas para la MS.

Un ejemplo particular de la descripción es un método para generar OPC OLIG2+ mediante la preparación previa de las colonias de PSC. Las PSC se siembran (sembrar en placas) a baja densidad y se cultivan en un cultivo adherente durante aproximadamente 1-2 días. "Baja densidad" significa alrededor de 8000 a aproximadamente de 11000 células/cm2. Las células se siembran preferentemente a aproximadamente 9500 a aproximadamente 10500 células/cm2, con mayor preferencia a aproximadamente 10000 células/cm2. Después de 1-2 días, las PSC forman colonias, que, preferentemente, tienen un diámetro de aproximadamente 75 pm a aproximadamente 300 pm, con mayor preferencia de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 250 pm de diámetro.

El término "PSC" tiene su significado habitual en la técnica, es decir, células autorreplicantes que tienen la capacidad de convertirse en células del endodermo, ectodermo y mesodermo. Las PSC descritas en la presente descripción son hPSC. Las hPSC incluyen ESC e iPSC, preferentemente hESC y hiPSC. Las PSC pueden sembrarse en una superficie que comprende una matriz, tal como un gel o una matriz de membrana basal. Una matriz, preferentemente, es la mezcla de proteínas secretada por las células de sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), que se venden con nombres comerciales que incluyen MATRIGEL®, CULTREX®, y GELTREX®. Otras matrices adecuadas incluyen, sin limitación, colágeno, fibronectina, gelatina, laminina, poli-lisina, vitronectina y combinaciones de estas.

El medio en el que se cultivan las PSC comprende, preferentemente, un inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (ROCK), por ejemplo, GSK269962, GSK429286, H-1152, HA-1077, RKI-1447, tiazovivina, Y-27632 o derivados de estos.

Las colonias de PSC se cultivan después en una monocapa hasta la confluencia en un medio que comprende una baja concentración de RA, al menos un inhibidor de la señalización de TGFp, y al menos un inhibidor de la señalización de BMP, en donde el primer día de cultivo en este medio es el día 0. Una "baja concentración de RA" es de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 250 nM. La concentración de RA es, preferentemente, aproximadamente 10 nM a aproximadamente 100 nM, o aproximadamente 25 nM a aproximadamente 100 nM, o aproximadamente 20 nM, 30 nM, 40 nM, 50 nM, 60 nM, 70 nM, 80 nM, 90 nM, y preferentemente, aproximadamente 100 nM o menos. Los inhibidores de la señalización de TGFp descritos en la presente descripción son GW788388, LDN193189, LY2109761, LY2157299, LY364947, y SB431542. Los inhibidores de la señalización de BMP descritos en la presente descripción son DMH1, dorsomorfina, K02288, Noggin, y LDN193189.

Las células alcanzan la confluencia y expresan PAX6 aproximadamente en el día 8, momento en el que las células confluentes se cultivan en un medio que comprende SAG y una concentración baja de RA de 10 nM a 250 nM. Los agonistas de Smoothened incluyen, por ejemplo, SAG y purmorfamina. La SHH puede ser SHH humana recombinante. Preferentemente, el medio carece de SHH. La transición de las PSC a progenitores OLIG2+ se asocia con una proliferación masiva que hace que los cultivos se vuelvan sobreconfluentes, lo que resulta en que las células formen estructuras tridimensionales, idealmente aproximadamente en el día 12. "Sobreconfluente" significa que las células comienzan a acumularse unas sobre otras, de manera que no todas las células están en contacto completo con la superficie del cultivo, y algunas células no están en contacto con la superficie del cultivo absolutamente, sino que solo están en contacto con otras células. Preferentemente, al menos aproximadamente el 50 %, 60 % o 70 % de las células sobreconfluentes son OLIG2+ aproximadamente en el día 12.

51 las células OLIG2+ van a diferenciarse posteriormente a células O4+, las células sobreconfluentes se desprenden de la superficie del cultivo, lo que permite la formación de agregados o esferas celulares. Las células OLIG2- no forman agregados, por lo que este proceso enriquece la población OLIG2+ y las células OLIG2- se eliminan gradualmente durante los cambios de medios posteriores. Para los propósitos de la presente invención, los términos "agregado" y "esfera" se usan indistintamente y se refieren a una estructura tridimensional multicelular, preferentemente, pero no necesariamente, de al menos aproximadamente 100 células.

El desprendimiento puede realizarse mecánicamente, con un raspador de células u otro implemento adecuado, o químicamente. El desprendimiento químico puede lograrse mediante el uso de una enzima proteolítica, por ejemplo, colagenasa, tripsina, proteinasa similar a la tripsina, enzimas recombinantes, tales como las que se venden con el nombre comercial TRYPLE®, enzimas de origen natural, tales como las que se venden con el nombre comercial ACCUTASE®, y combinaciones de estas. El desprendimiento químico puede realizarse, además, mediante el uso de un quelante, tal como EDTA, o un compuesto tal como la urea. El levantamiento o desprendimiento mecánico ofrece la ventaja de una muerte celular mínima, sin embargo, produce agregados de tamaño variable, por lo que las esferas adecuadas deben seleccionarse mediante un proceso de recolección manual. Las buenas esferas se definen como aquellas que tienen una forma redonda, de color dorado/marrón, con un núcleo más oscuro y con un diámetro entre aproximadamente 300 pm y aproximadamente 800 pm. El desprendimiento de las células mediante el uso de métodos químicos, tales como la digestión enzimática, produce, predominantemente, esferas que son apropiadas para un cultivo posterior. Por lo tanto, no se requiere de la recolección manual de esferas y las etapas de separación pueden adaptarse para la automatización y usarse en estudios de alto rendimiento. Sin embargo, la digestión enzimática aumenta la muerte celular, lo que resulta en un menor número de esferas.

Además, proporcionamos un método para generar OPC O4+ a partir de OPC OLIG2+. Los agregados tridimensionales de OPC OLIG2+ se cultivan en suspensión en un medio que comprende SAG y una concentración baja de RA de 10 nM a 250 nM durante aproximadamente 8 días. Las OPC OLIG2+ pueden generarse mediante un método de la invención, por ejemplo, como se describió anteriormente, o mediante otros métodos conocidos en la técnica. Después de aproximadamente 8 días en el medio que comprende SAG y RA, el medio se cambia a uno que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, y, opcionalmente, insulina (preferentemente de aproximadamente 10 pg/mL a aproximadamente 50 pg/mL, con mayor preferencia aproximadamente 25 pg/mL), T3 (preferentemente aproximadamente 20 ng/mL a aproximadamente 100 ng/mL, con mayor preferencia aproximadamente 60 ng/mL), biotina (preferentemente aproximadamente 50 ng/mL a aproximadamente 150 ng/mL, con mayor preferencia aproximadamente 100 ng/mL) y/o AMPc (preferentemente aproximadamente 100 nM a aproximadamente 5 pM, con mayor preferencia aproximadamente 1 pM). El medio, preferentemente, carece de bFGF y factor de crecimiento epidérmico (EGF). Si se generan células OLIG2+ mediante el método de la invención, el cultivo en suspensión comienza, preferentemente, aproximadamente en el día 12, y el cultivo en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, preferentemente, comienza aproximadamente en el día 20.

Después de aproximadamente 10 días en suspensión en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, los agregados celulares se siembran en un cultivo adherente a una densidad de aproximadamente 2 esferas/cm2. (Esto es preferentemente aproximadamente en el día 30, cuando el método comenzó el día 0 con PSC cultivadas en un medio que comprende RA, al menos un inhibidor de la señalización de TGFp y al menos un inhibidor de la señalización de BMP). La superficie sobre la que se siembran y se cultivan los agregados celulares puede comprender una proteína de matriz extracelular (por ejemplo, colágeno, fibronectina, laminina) y/o un poliaminoácido cargado positivamente (por ejemplo, poliarginina, polilisina, poliornitina). Preferentemente, la superficie comprende laminina y/o poliornitina.

Después de sembrar los agregados celulares, puede continuarse con el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 (Opción A), o puede usarse un medio que comprende AA y que carece de factores de crecimiento (por ejemplo, PDGF, HGF, IGF-1, NT3, bFGF y/o ^eG^f ) (Opción B). El medio que comprende AA puede comprender opcionalmente insulina, T3, biotina y/o AMPc. Las células cultivadas en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 son óptimamente O4+ aproximadamente 45 días después de sembrarlas en placa. Preferentemente, al menos aproximadamente el 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, u 80 % de estas células son O4+ aproximadamente 45 días después de sembrarlas en placa (día 75). Las células cultivadas en el medio que comprende AA son óptimamente O4+ aproximadamente 25 días después de sembrarlas en placa. Preferentemente, al menos aproximadamente el 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, o 40 % de estas células son O4+ aproximadamente 25 días después de sembrarlas en placa (día 55). Preferentemente, al menos aproximadamente 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, o 60 % de estas células son O4+ aproximadamente 33 días después de sembrarlas en placa (día 63). Preferentemente, al menos aproximadamente el 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, o 75% de estas células son O4+ aproximadamente 45 días después de sembrarlas en placa (día 75).

Pueden generarse oligodendrocitos maduros que expresan la proteína básica de mielina mediante el cultivo de las OPC O4+ en ausencia de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 durante aproximadamente tres semanas, hasta que las células sean MBP+. Preferentemente, al menos aproximadamente 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, o 45 % de las OPC O4+ son MBP+ después de aproximadamente 20 días en cultivo en el medio que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3. Esto ocurre aproximadamente el día 95 para las células de la "Opción A" y aproximadamente el día 60 para las células de la "Opción B". El cultivo de células de la "opción B" hasta al menos aproximadamente el día 75 resulta en una mayor eficacia de las células que expresan MBP+.

La descripción abarca, además, OPC, oligodendrocitos y células productoras de mielina generadas por los métodos de la invención, y mamíferos no humanos que las comprenden, preferentemente ratones y/o ratas. Una célula productora de mielina es cualquier célula que produce mielina, que incluye, pero no se limita a los oligodendrocitos. En algunos casos, las células productoras de mielina se diferencian a partir de las PSC y, en tales casos, las PSC pueden ser iPSC. Las iPSC pueden derivarse de una célula somática de un sujeto. En un caso, el sujeto tiene una enfermedad o trastorno desmielinizante o anomalías en la mielinización.

En un caso, la descripción proporciona un método para generar iPSC virales y libres de integración a partir de pacientes con MS, particularmente PPMS. Nuestro protocolo de diferenciación puede usarse para la diferenciación eficiente de tales iPSC a OPC y oligodendrocitos funcionales, como se demostró mediante la mielinización in vivo en el ratón shiverer.

La descripción proporciona, además, un sistema modelo para una enfermedad neurológica, preferentemente una enfermedad o trastorno desmielinizante o anomalías en la mielinización. En un caso, el sistema modelo comprende una célula productora de mielina diferenciada a partir de una iPSC derivada de un sujeto que tiene una afección desmielinizante o anomalía en la mielinización. El sistema modelo puede comprender, además, un mamífero no humano en el que se ha trasplantado la célula productora de mielina. En un caso, el mamífero no humano es un ratón o una rata. Los sistemas modelos proporcionados por la descripción pueden usarse para estudiar enfermedades o trastornos desmielinizantes o anomalías en la mielinización, que incluye la comprensión de los mecanismos subyacentes y la definición de dianas terapéuticas.

La descripción proporciona, además, métodos para tratar y/o prevenir una enfermedad o trastorno neurológico en un sujeto mediante la generación de OPC u oligodendrocitos de acuerdo con un método de la invención; y administrar una cantidad eficaz de células al sujeto. Una vez trasplantados, los oligodendrocitos u OPC que se han diferenciado en oligodendrocitos in vivo, promueven la mielinogénesis en el sistema nervioso del sujeto. Por lo tanto, la descripción proporciona un uso de las OPC u oligodendrocitos de la descripción en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o trastorno neurológico en un sujeto. La enfermedad o trastorno neurológico puede ser una enfermedad desmielinizante o anomalías en la mielinización, o una enfermedad neurodegenerativa. La enfermedad o trastorno neurológico puede afectar el sistema nervioso central, el sistema nervioso periférico, o ambos. En algunos casos, la enfermedad desmielinizante o anomalía en la mielinización es una enfermedad desmielinizante inflamatoria (tal como esclerosis múltiple, neuritis óptica, enfermedad de Devic, encefalomielitis diseminada aguda y mielitis transversa), desmielinización viral, desmielinización causada por trastornos metabólicos adquiridos, leucodistrofias (que incluye enfermedades hipomielinizantes, tales como la enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher y la paraplejia espástica hereditaria), trastornos de la producción de proteínas proteolipídicas ligados al cromosoma X, desmielinizaciones metabólicas y trastornos del almacenamiento lisosómico (tales como la leucodistrofia metacromática-MLD, enfermedades de Tay-Sachs, Sandhoff y Krabbe), enfermedad de la desaparición de la sustancia blanca, y leucomalacia periventricular. La MS y particularmente la PPMS también son afecciones que pueden tratarse o prevenirse mediante los métodos de la descripción. En un caso preferido, las OPC u oligodendrocitos generados por un método de la descripción se derivan de las iPSC generadas a partir de una célula somática del sujeto.

Además de su potencial para el trasplante de células autólogas, la tecnología iPSC está emergiendo como una herramienta para desarrollar nuevos fármacos y conocer mejor la patogénesis de la enfermedad. Han, S.S.W. y otros, Neuron. 70:626-644 (2011). Los métodos y células de la descripción ayudarán al desarrollo de los tamizajes de alto rendimiento in vitro para los compuestos que promueven la mielinización. Lee, S. y otros, Nat Protoc. 8:771 -782 (2013). Con ese fin, proporcionamos un método para identificar un compuesto que promueve la mielinización, el método que comprende generar células productoras de mielina mediante un método de la invención; poner en contacto la célula productora de mielina con un compuesto candidato; y determinar si el compuesto candidato promueve la mielinización de neuronas. En un caso, el compuesto es un agente terapéutico candidato para el tratamiento de una enfermedad o trastorno neurológico, tal como una afección desmielinizante o anomalía de la mielinización, y el método incluye determinar si el agente terapéutico candidato tiene un efecto beneficioso sobre la mielinización de neuronas, en donde tal efecto beneficioso es indicativo de un agente terapéutico candidato para tratar una enfermedad o trastorno desmielinizante o anomalía de la desmielinización. El efecto beneficioso puede ser, por ejemplo, prevención de la desmielinización de neuronas, reducción de la desmielinización de neuronas, aumento de la conductancia de neuronas y/o mielinización mejorada de neuronas. Preferentemente, el método se realiza en un formato de alto rendimiento.

Las células, sistemas y métodos de la descripción pueden ser útiles, además, para estudiar enfermedades neurológicas. En particular, las líneas PPMS ^ípS^c descritas en la presente proporcionan un nuevo recurso para investigar el proceso de neurodegeneración, particularmente en la MS (Figura 16).

Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Los términos "un" (o "una"), así como también los términos "uno o más", y "al menos uno" pueden usarse indistintamente.

Además, "y/o" debe tomarse como descripción específica de cada uno de los dos componentes o características que se especifican con o sin el otro. Por lo tanto, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A y/o B" pretende incluir A y B, A o B, A (solo), y B (solo). Igualmente, el término "y/o" como se usa en una frase tal como "A, B, y/o C" pretende incluir A, B y C; A, B o C; A o B; A o C; B o C; A y B; A y C; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Por ejemplo, El Diccionario de Biología Celular y Molecular (5ta ed. JM Lackie ed., 2013), el Diccionario Oxford de Bioquímica y Biología Molecular (2da ed. R. Cammack y otros eds., 2008), y El Diccionario Conciso de Biomedicina y Biología Molecular, P-S. Juo, (2da ed. 2002) puede proporcionar a un experto las definiciones generales de algunos términos usados en la presente descripción.

Las unidades, prefijos y símbolos se denotan en sus formas aceptadas del Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. Los encabezamientos proporcionados en la presente descripción no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la invención, que pueden tenerse mediante referencia a la descripción como un todo. En consecuencia, los términos definidos inmediatamente más abajo se definen más completamente como referencia a la descripción en su totalidad.

Dondequiera que se describan las modalidades con el lenguaje "que comprende", se incluyen las modalidades de cualquier otra manera análogas descritas en términos de "que consiste de" y/o "que consiste esencialmente de". Por "sujeto" o "individuo" o "paciente" se entiende cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que es conveniente un diagnóstico, pronóstico o terapia. Los sujetos mamíferos incluyen humanos, animales domésticos, animales de granja, animales deportivos, y animales de zoológicos, que incluyen, por ejemplo, humanos, primates no humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, cerdos, etcétera.

Los términos tales como "que trata" o "tratamiento" o "tratar" o "alivio" o "aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curen, ralenticen, disminuyan los síntomas de, y/o detengan la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado. Por lo tanto, aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos que ya padecen el trastorno. En determinados casos, un sujeto se "trata" con éxito por una enfermedad o trastorno neurológico, particularmente una enfermedad o trastorno desmielinizante o anomalía de la mielinización, de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción si el paciente muestra, por ejemplo, alivio o eliminación total, parcial o transitorio de los síntomas asociados con la enfermedad o trastorno.

"Prevenir" o "prevención" se refiere a medidas profilácticas o preventivas que previenen y/o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico dirigido. Por lo tanto, aquellos que necesitan prevención incluyen aquellos propensos o susceptibles a la enfermedad o trastorno. En determinados casos, una enfermedad o trastorno neurológico, particularmente una enfermedad o trastorno desmielinizante o anomalía de la mielinización, se previene exitosamente de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente descripción si el paciente desarrolla, de forma transitoria o permanente, por ejemplo, pocos o menos síntomas graves asociados con la enfermedad o trastorno, o una aparición tardía de síntomas asociados con la enfermedad o trastorno, que un paciente que no ha estado sujeto a los métodos de la descripción.

La invención se describirá en más detalle en los siguientes Ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo de Referencia 1. Diferenciación de oligodendrocitos a partir de líneas hESC de referencia

Usamos una línea indicadora hESC de referencia con sustitución génica de OLIG2-GFP (Liu y otros, 2011) para rastrear los progenitores OLIG2+ mediante imágenes fluorescentes en vivo. Primero, inducimos células PAX6+ mediante el uso de la inhibición dual de la señalización de SMAD en cultivos adherentes. Chambers, S.M. y otros, NatBiotechnol. 27:275-80 (2009). A continuación, para imitar el entorno de la médula espinal embrionaria, aplicamos diferentes concentraciones de RA y/o SHH en varios momentos y cuantificamos la expresión de OLIG2-GFP mediante citometría de flujo (Figura 2A). La aplicación de RA 100 nM desde el inicio de la inducción generó el 40,6 % de progenitores OLIG2+, mientras que la adición de SHH a 100 ng/mL a partir del día 8 aumentó el rendimiento al 57,7 % (Figura 2B). Curiosamente, las células sin SHH exógena durante los primeros 12 días, mostraron una regulación positiva del ARNm de SHH (Figura 3A) y se diferenciaron a células O4+, aunque con menor eficiencia en comparación con las células tratadas con SHH (Figura 3B).

Después sustituimos la proteína SHH humana recombinante con SAG, lo que aumentó el rendimiento aún más al 70,1 % de progenitores OLIG2+ (Figura 2B). En el día 12, las células se desprendieron y se colocaron en placas de baja adherencia para promover su agregación en esferas. El número mínimo de células necesarias para formar una esfera era de al menos 100 células, y notamos que la mayoría de las células en las esferas eran GFP+. Para investigar esto más a fondo, clasificamos cultivos del día 12 para GFP, y observamos que solo las células GFP+ formaron agregados (Figura 2C). Esto sugiere que la etapa de agregación por sí sola proporciona un enriquecimiento para la población OLIG2+.

A continuación, validamos las etapas iniciales hacia la generación de progenitores OLIG2+ mediante la diferenciación de una segunda línea de referencia de hESC (RUES 1), y mediante la comparación de los niveles de transcripción de PAX6, OLIG2, y NKX2.2 mediante qRT-PCR. La regulación positiva de estos factores de transcripción siguió un patrón temporal similar al de la línea OLIG2-GFP, con inducción de PAX6 alrededor del día 7, OLIG2 alcanzó la expresión máxima alrededor del día 13, y niveles sostenidamente altos de NKX2.2 después del día 10 (Figura 2D). Con base en estos resultados, usamos la línea RUES1 de referencia no modificada genéticamente para desarrollar las siguientes etapas del protocolo, a partir de progenitores OLIG2+ a oligodendrocitos maduros MBP+ (Figura 4A). Las células PAX6+ surgieron el día 7, y para el día 12 se organizaron en estructuras de múltiples capas (Figuras 4B, 4C). A partir del día 12 hasta el día 30, las células se cultivaron como esferas y después se sembraron en placas recubiertas con poli-L-ornitina/laminina (pO/L) durante el resto del protocolo.

Para promover la maduración hacia el estadio O4+, se añadieron PDGF-AA, HGF, IGF1, y NT3 al medio de cultivo desde el día 20 en adelante. Los progenitores OLIG2+ regularon positivamente NKX2.2, después SOX10, y finalmente maduraron a OPC tardías identificadas por tinción en vivo de O4, y por sus procesos altamente ramificados (Figuras 4D-4G). Las OPC O4+que expresan OLIG2, SOX10 y NG2 (Figuras 4H-4j ), aparecieron tan tempranamente como en el día 50 y sus números aumentaron drásticamente alrededor del día 75. Durante la diferenciación, el 40-50 % de las células progenitoras fueron proliferativas, como indica la tinción con Ki67. Sin embargo, las células O4+ altamente ramificadas no se dividieron in vitro (Figuras 5A-5C). Adicionalmente, 34 ± 4 % de las OPC O4+ se diferenciaron en oligodendrocitos maduros MBP+ después de retirar el factor de crecimiento del medio durante al menos dos semanas (Figuras 4K-4L, Figura 5D). Estos cultivos, además, consistieron en otros tipos de células, específicamente, 15 ± 2 % de astrocitos GFAP+ y 20 ± 2% de neuronas MAP2+ del total de células respectivamente (Figura 4M, Figura 5E).

Además, usamos una estrategia alternativa para generar aproximadamente un 30 % de células O4+ después de solo 55 días de cultivo, lo que reduce significativamente la duración y los costos de la diferenciación. Los mitógenos PDGF, NT3, IGF-1 y ^hG^f se retiraron del medio tan temprano como en el día 30, cuando se sembraron las esferas seleccionadas. Esto resultó en la aparición de células O4+ en el día 55. Se continuaron los cultivos para aumentar la frecuencia de células O4+ a niveles comparables al del protocolo más largo (Figura 6).

Como se muestra en la Tabla 1, las eficiencias de O4 variaron de 28 % a 80 % con nueve líneas de PSC diferentes, y el promedio fue superior al 60 % en cuatro líneas. Las células se tiñeron con anticuerpo contra O4 y se analizaron mediante citometría de flujo. Se evaluaron una línea de referencia de hESC (RUES1) y ocho líneas de hiPSC. Se realizaron réplicas técnicas mediante el uso de diferentes lotes de cada línea, en diferentes pases. Los resultados se expresan, además, como porcentajes medios ± SEM.

Tabla 1. Porcentajes de OPC O4+ Después ~75 días de Diferenciación

En ambas estrategias, la retirada de los mitógenos impulsa la diferenciación terminal de OPC a oligodendrocitos que expresan MBP, aunque las células MBP+ no se alinean con las fibras de axón en estas condiciones de cultivo (Figuras 7G, 7H). Para estudios de mielinización, las OPC O4+ pueden purificarse mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y trasplantarse in vivo. Las células O4+ pueden, además, criopreservarse inmediatamente después de la clasificación y descongelarse 24-48 horas antes del trasplante.

Como se describió anteriormente, en diversos estadios del protocolo, en los cultivos se verificó la expresión de marcadores apropiados mediante qRT-PCR o inmunofluorescencia. Cuando se realiza el análisis inmunofluorescente de los cultivos el día 8 para PAX6 (Figura 7A) y el día 12 para OLIG2 y NKX2.2 (Figura 7C), las frecuencias deben ser superiores al 90 % para las células PAX6+, 70 % para las células OLIG2+, y 30 % para las células OLIG2+/NKX2.2+. Para el día 40-50, SOX10 debe expresarse y debe localizarse conjuntamente con OLIG2 y NKX2.2 (Figura 7E). Desde el día 50 al 75, puede realizarse una tinción en vivo de O4 para detectar la aparición de células O4+ y su expansión (Figuras 6A-6F, Figura 7F). En el desarrollo humano, las OPC se caracterizan por la expresión de PDGFRa y NG2, seguida de la expresión de O4. Jakovcevski, I. y otros, Front Neuroanat. 3:5 (2009). En nuestras condiciones de cultivo, para el día 75, la mayoría de las células O4+ han perdido PDGFRa, pero retuvieron la expresión de NG2. En este estadio, no observamos ninguna célula pluripotente residual en cultivo. Finalmente, las células O4+ pueden aislarse a través de FACS o diferenciarse más a oligodendrocitos MBP+(Figuras 7G, 7H). Además, existen otros tipos de células en cultivos del día 75, aunque en porcentajes más bajos. Generalmente encontramos células GFAP+ en aproximadamente el 15 % de la población celular total y aproximadamente el 20 % de células pMI-tubulina+ (Figura 7H). Después de la última etapa de diferenciación, cuando las células se cultivan en Medio Glial durante 2 semanas, aproximadamente el 35 % de las células O4+ deben además expresar MBP.

Ejemplo 2. Diferenciación de Oligodendrocitos a partir de líneas PPMS-iPSC

Para demostrar que nuestro protocolo puede aplicarse a las líneas de iPSC, obtuvimos biopsias de piel de cuatro pacientes con PPMS. Se establecieron cultivos de fibroblastos a partir de las biopsias, y se generaron iPSC mediante el uso de transfecciones diarias con un coctel de ARNm modificados (Warren y otros, Cell Stem Cell.

7:618-30 (2010)), junto con un conjunto de miARN para mejorar la eficiencia de reprogramación de las líneas más refractarias (Stemgent). Desde el día 12 al día 15 de reprogramación, las colonias TRA-1-60+ (Figura 8A) se identificaron mediante tinción en vivo, se escogieron, se expandieron y se caracterizaron mediante inmunofluorescencia para marcadores de pluripotencia (Figura 8B).

El perfil de expresión para siete genes de pluripotencia confirmó que las cuatro líneas de iPSC exhibían un perfil comparable a una línea de hESC de referencia y divergente de los fibroblastos parentales (Figura 8C). Todas las líneas de iPSC mostraron un cariotipo normal (Figura 8D) y fueron capaces de diferenciarse en tipos de células de las tres capas germinales, tanto in vitro, mediante la diferenciación espontánea del cuerpo embrioide (Figura 8E), como in vivo mediante ensayo de teratoma (Figura 8F; Figura 9).

A continuación, evaluamos si el protocolo era reproducible con nuestras líneas PPMS-iPSC. Se encontró que todas las líneas iPSC evaluadas funcionan de manera similar a la línea RUES1 (Figuras 10A-10I). El protocolo fue muy reproducible y altamente eficiente, calculado por la frecuencia de clasificación de OPC O4+, con hasta un 70 % de células de referencia RUES1 O4+, y 43,6 % - 62,1 % de las líneas PPMS iPSC. Adicionalmente, encontramos que la fracción O4+ contiene una subpoblación de células doble positivas con PDGFRa (Figura 10J). Las células O4+ podrían purificarse fácilmente mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), congelarse y descongelarse, sin perder su morfología (Figura 11D).

Ejemplo 3. Axón Mielinizado de Cerebro de Ratón por OPC Tardías Derivadas de PPMS

Para verificar que las OPC obtenidas a través de nuestro protocolo eran funcionalmente mielinogénicas, inyectamos células O4+ purificadas por FACS al día 75 (105células/animal) en el prosencéfalo de ratones shiverer neonatales inmunodeprimidos (Figura 11A). A las células inyectadas se les eliminaron cualquier contaminante de iPSC, como se demuestra mediante el análisis de citometría de flujo de los marcadores de pluripotencia SSEA4 y TRA-1-60 (Figura 11B). Sin embargo, purificamos nuestros cultivos antes del trasplante in vivo para retener el potencial de traducción con respecto a los estudios clínicos. Las células se congelaron, se descongelaron y se dejaron recuperar durante 24-48 horas antes del trasplante (Figura 11C). Los animales se sacrificaron a las 12-16 semanas, momento en el que las células humanas hNA+ estaban distribuidas por todo el cuerpo calloso y la sustancia blanca del prosencéfalo. La densidad de células hNA+ en el cuerpo calloso a las 12 semanas fue de 34 400 ± 3 090 células/mm3, y a las 16 semanas, el número de células humanas se había duplicado aproximadamente desde las 12 semanas. No observamos la presencia de conglomerados de células o tumorigénesis manifiesta, y la fracción proliferativa de las células hNA+ injertadas fue del 17 % a las 12 semanas y disminuyó a solo un 8 % de Ki67+ a las 16 semanas cuando solo el 5 % de las células eran PCNA+. Es importante destacar que más del 80 % de las células hNA+ en el cuerpo calloso expresaron conjuntamente la proteína OLIG2, lo que sugiere que las células injertadas estaban restringidas al linaje de oligodendrocitos (Figura 12E). Además, los oligodendrocitos humanos MBP se encontraron injertados difusamente en todo el cuerpo calloso a las 12 y 16 semanas (Figura 12A). A las 16 semanas, el 31 ± 3 % de los axones del ratón huésped estaban envainados dentro del cuerpo calloso injertado del ratón (Figura 12B).

La microscopía electrónica de transmisión en el cuerpo calloso de 16 semanas reveló mielina compacta madura con la presencia de líneas principales alternas densas e intraperíodos (Figuras 12C, 12D); mientras que los ratones shiverer/rag2 sin inyectar poseían mielina fina y ligeramente envuelta. Igualmente, el grosor de la envoltura de mielina, evaluado mediante la medición de la relación g, reflejó una restauración de la mielina normal en numerosos axones del cuerpo calloso.

A las 12 semanas, las células hNA trasplantadas permanecieron como OPC NG2+ en el cuerpo calloso (Figura 12E), y a las 16 semanas comenzaron a migrar a la corteza cerebral suprayacente (FIG. 12F). Muy pocas células clasificadas con O4 experimentaron la diferenciación como astrocitos hGFAP+ y la mayoría de las células hGFAP+ se localizaron en la SVZ y alrededor de los ventrículos (Figura 12G), lo que sugiere que el entorno local puede inducir la diferenciación astrocítica en estas regiones. De manera similar, las células que expresan hNESTIN rara vez se encontraron en el cuerpo calloso e igualmente se concentraron en la SVZ. Es importante destacar que las neuronas pNI-tubulina+ no se detectaron en ninguno de los animales injertados. Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que las células clasificadas con O4 derivadas de PPMS eran capaces de la diferenciación en oligodendrocitos maduros in vivo y la formación de mielina compacta densa que se asemeja a la mielina normal en el cerebro.

Ejemplo 4. Procedimientos Experimentales Detallados para los Ejemplos 1-3

Líneas celulares

Se usaron tres líneas de referencia de hESC y 4 líneas de hiPSC. La línea de referencia RUES1 y la línea de referencia HUES 45 son líneas de hESC aprobadas por el NIH; La línea indicadora OLIG2-GFP se deriva de la línea de referencia BG01 hESC (Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en Houston). En nuestro laboratorio se derivaron cuatro líneas de iPSC a partir de biopsias de piel de pacientes con PPMS mediante el método ARNm/miARN (Stemgent).

Condiciones de cultivo de hPSC

Las líneas de referencia hESC y hiPSC se cultivaron y se expandieron con medio HUESM (HUman Embryonic Stem Medium) y 10 ng/mL de bFGF (Stemcell Technologies) sobre una capa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF). Para la diferenciación en oligodendrocitos, las células se adaptaron a los cultivos en placas recubiertas con MATRIGEL® y medio mTeSR1 (Stemcell Technologies). El H^u E^s M está compuesto por Knockout-DMEM, suero Knock-out al 20 %, glutamax 2 mM, NEAA 0,1 mM, 1X P/S y p-mercaptoetanol 0,1 mM, todos adquiridos de Life Technologies (Grand Island, NY). En todos los estadios de diferenciación, las células se cultivaron en incubadoras al 5 % de CO².

Protocolo de Diferenciación Detallado

Las PSC se sembraron en MATRIGEL® (BD Biosciences; San José, CA) a una densidad de 10x103células/cm2 en medio mTeSR1 (Stemcell Technologies; Vancouver, BC, Canadá) que contiene inhibidor de ROCK 10 pM, Y-27632 (Stemgent; Cambridge, MA) durante 24 horas. Esta densidad de hPSC sembradas se optimizó para proporcionar un pocillo confluente el día 8 y estructuras de múltiples capas el día 12 de la diferenciación. Esta configuración no requiere una expansión significativa de PSC, ya que solo un pocillo (80 % de confluencia) de una placa de 6 pocillos contiene suficientes células para diferenciar y aislar al menos 2x106 oligodendrocitos. Las células se incubaron durante 1-2 días, hasta que las colonias de hPSC alcanzaron un diámetro de 100-250 pm.

En el día de la inducción de la diferenciación (día 0), el medio se cambió a Medio de Inducción Neural, que es Medio Personalizado mTeSR (Stemcell Technologies) que contiene las moléculas pequeñas SB431542 10pM (Stemgent) y LDN193189 250nM (Stemgent), así como también RA todo trans 100nM (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). El Medio Personalizado mTeSR tiene la misma composición que el medio mTeSR-1 disponible comercialmente, pero sin los cinco factores que mantienen la pluripotencia, específicamente, cloruro de litio, GABA, ácido pipecólico, bFGF, y TGFpl (Stemcell Technologies). En lugar de Medio Personalizado mTeSR, también podríamos usar DMEM/F12 con la adición de aproximadamente 25 pg/mL de insulina. Los cambios de medio se realizaron diariamente hasta el día 8, con RA fresco, SB431542 y LDN193189 añadidos al medio todos los días.

Para el día 8, las células deberían ser confluentes y la expresión de PAX6 debería estar en su punto máximo (Figura 7A). El día 8, el medio se cambió a Medio N² que contiene RA 100 nM, SAG 1 pM (EMD Millipore; Billerica, MA) o rhSHH 100 ng/mL (R&D Systems; Minneapolis, Mn ), se cambió diariamente, con RA y SAG frescos añadidos al medio todos los días.

Para el día 12, las células sobreconfluentes se estaban apilando y las estructuras 3D eran claramente visibles, (Figura 7B); este es un punto de control importante antes de proceder con la diferenciación. Las células expresaron OLIG2 y NKX2.2 (Figura 7C). El día 12, las células adherentes se desprendieron mecánica o enzimáticamente para permitir la formación de las esferas. Formación de esferas enriquecida para progenitores OLIG2+. Solo las células OLIG2+ se agregaron en las esferas, mientras que las células OLIG2' permanecieron como células individuales. Obtuvimos el mayor número de esferas, y finalmente de células O4+, mediante el uso de dispersión mecánica de la monocapa. Obtuvimos esferas más uniformes, en menor número, mediante el uso de la dispersión enzimática de la monocapa. Para el desprendimiento mecánico, las células se desprendieron mediante el uso de un levantador de células, rompiendo la monocapa de células en pequeños grupos de manera que los nutrientes pudieran llegar a todas las células dentro del agregado. Los pocillos se inspeccionaron bajo el microscopio para garantizar que no quedaran células adheridas. Para la digestión enzimática, se añadió ACCUTASE® (1 mL/ 2 mL de medio DMEM/F12) a los pocillos para disociar el cultivo en una suspensión unicelular.

Los agregados se sembraron nuevamente en placas de adherencia ultra baja en Medio N²B²⁷ que contiene 1 pM SAG, y se cambió cada dos días. El día 20, el medio se cambió a Medio PDGF y se realizaron 2/3 cambios de medio cada dos días. Durante los cambios de medio, se usó un pipeteado suave para separar los agregados que se adhirieron entre sí. El día 30, las esferas se sembraron en placas recubiertas con bromhidrato de poli-L-ornitina (50 pg/mL; Sigma-Aldrich) y Laminina (20 pg/mL; Life Technologies) a una densidad de 2 esferas/cm2 (aproximadamente 20 esferas por pocillo en una placa de 6 pocillos). Esta densidad se optimizó para permitir que las células migren fuera de la esfera, proliferen y se extiendan a toda la placa al final del protocolo sin necesidad de pasarlas. Usamos una pipeta p200 para escoger los agregados que fueran redondos, dorados/marrones con un centro oscuro, que tienen un diámetro entre 300 y 800 pm (Figura 7D). Evitamos las esferas que eran completamente transparentes, ya que no se diferencian en oligodendrocitos.

En este estadio, las esferas sembradas se cultivaron en un medio que contenía mitógenos (Opción A) o en un medio sin mitógenos (Opción B). La opción A se optimizó para obtener el mayor rendimiento de células O4+, mientras que la Opción B se desarrolló para proporcionar una versión más corta y menos costosa del protocolo.

Opción A

Las esferas se sembraron en placas de pO/L, como se describió anteriormente, en Medio PDGF el día 30, se cambió 2/3 del Medio PDGF cada dos días hasta el día 75 de la diferenciación. La aparición de células O4+ se evaluó mediante tinción en vivo de O4 desde el día 55 en adelante (Figura. 6). En el día 75, las OPC O4+ podrían aislarse mediante FACS (Figura 7I). Alternativamente, para la diferenciación terminal de oligodendrocitos (Figuras 7G, 7H), las células se cultivaron en Medio Glial desde el día 75, se cambió 2/3 del medio cada 3 días durante dos semanas.

Opción B

Las esferas se sembraron en placas de pO/L, como se describió anteriormente, en Medio Glial el día 30, se cambió 2/3 del Medio Glial cada dos días hasta el día 55 de la diferenciación. En el día 55, las células O4+ se visualizaron mediante tinción de O4 en vivo (Figuras 6A-F, Figura 7F) o se aislaron mediante FACS (Figura 6G). En el día 75, las OPC O4+ podrían aislarse mediante FACS. Alternativamente, los cultivos se mantuvieron en Medio Glial hasta el día 75 para aumentar la eficiencia de las células O4+ (Figura 6). Observamos células MBP+ a partir de aproximadamente el día 60.

Para los protocolos de la Opción A y la Opción B, los agregados en el día 30, y las células al final de la diferenciación podrían criopreservarse con una viabilidad > 70. La viabilidad de los agregados se basa en el número de esferas descongeladas que se vuelven a adherir a las placas recubiertas con pO/L después de la descongelación. Las células clasificadas O4+ pueden congelarse inmediatamente después de la clasificación. La viabilidad esperada después de la descongelación de las células clasificadas O4+ es 70 - 80 %.

La Tabla 2 proporciona una lista de composiciones de medios usadas en el protocolo.

Tabla 2. Composición Detallada de los Medios de Cultivo

Derivación de Fibroblastos de la Piel a partir de Biopsias en Sacabocados

Se obtuvieron biopsias de piel de pacientes con MS e individuos sanos (Figura 13). Cuatro pacientes no identificados en el Centro de Investigación de Esclerosis Múltiple Tisch de Nueva York se diagnosticaron con PPMS de acuerdo con los criterios de diagnóstico estándar. Sus biopsias se obtuvieron tras la aprobación de la junta de revisión institucional (BRANY) y el consentimiento informado. Todos los pacientes son Caucásicos. Los pacientes 102 y 107 son hombres, de 56 y 61 años, respectivamente; los pacientes 104 y 109 son mujeres, de 62 y 50 años, respectivamente.

Se recolectaron biopsias de piel de 3 mm en Medio de Recolección de Biopsia, que consiste en RPMI 1460 (Life Technologies) y 1X Antibiótico-Antimicótico (Life Technologies). Las biopsias se cortaron en piezas más pequeñas (<1 mm) y se sembraron en una placa de 35 mm tratada con TC durante 5 minutos para que se secasen y finalmente se incubaron en Medio de Placas para Biopsias, compuesto por Knockout DMEM, GLUTAMAX™ 2 mM, NEAA 0,1 mM, p-Mercaptoetanol 0,1 mM, suero bovino fetal al 10 % (FBS), penicilina-estreptomicina 1X (P/S; todos de Life Technologies) y Nucleósidos al 1 % (EMD Millipore), durante 5 días o hasta que los primeros fibroblastos crecieron fuera de la biopsia. Alternativamente, las biopsias se digirieron con Colagenasa 1A 1000 U/mL (Sigma-Aldrich) durante 1,5 horas a 37 °C, se lavaron, se recolectaron y se sembraron en placas de 35 mm recubiertas con gelatina al 1 % en Medio de Placa de Biopsia durante 5 días. Después, los fibroblastos se expandieron en Medio de Cultivo, que consiste en DMEM (Life Technologies), GLUTAMAX™ 2 mM, NEAA 0,1 mM, p-mercaptoetanol 0,1 mM, FBS 10 % y 1X P/S, el medio se cambió cada dos días.

Reprogramación de Fibroblastos de la Piel

Los fibroblastos de la piel en los pases 3 a 5 se reprogramaron mediante el uso del kit de ARNm/miARN Stemgent, que resultó en la generación de iPSC humanas libres de integración y libres de virus, a través de ARN modificados para OCT4, SOX2, KLF4, cMYC y LIN28 (Figura 14). Se descubrió que la adición de un grupo específico de miARN aumenta la eficiencia de la reprogramación (Stemgent). Brevemente, los fibroblastos se sembraron en placas de 6 o 12 pocillos recubiertas con Matrigel a una densidad de 5,5x103células/cm2 en medio de cultivo. Al día siguiente, el medio se sustituyó con medio de reprogramación Pluriton acondicionado con NuFF que contiene B18R. Las células se transfectaron durante 11 días consecutivos mediante el uso de STEMFECT™ de la siguiente manera: día 0 miARN solamente, del día 1 al día 3 solamente coctel de ARNm, d4 coctel de miARN más ARNm, del día 5 al día 11 solamente coctel de ARNm. Después del día 11, se escogieron las colonias visibles teñidas positivamente en vivo para TRA-1-60 y se volvieron a sembrar sobre MEF con medio HLTESM.

Ensayo de Teratoma

Los experimentos se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de Columbia (IACUC).

Las colonias de iPSC se disociaron mediante el uso de Colagenasa (Sigma-Aldrich) durante 15 minutos a 37 °C, se lavaron, se recolectaron, y se suspendieron nuevamente en 200 pl de HUESM. Después, las células se mezclaron con 200 pl de Matrigel™ (BD Biosciences) en hielo, y se inyectaron por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes (Jackson Laboratory; Bar Harbor, ME). Se permitió que los teratomas crecieran durante 9-12 semanas, se aislaron mediante disección y se fijaron en PFA al 4 % durante la noche a 4 °C. Los tejidos fijados se incluyeron en parafina, se seccionaron con un espesor de 10 pm, y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Diferenciación Espontánea in vitro

Las iPSC se disociaron con ACCUTASE® (Life Technologies) durante 5 minutos a 37 °C y se sembraron en placas de 6 pocillos de adherencia ultra baja en HUESM sin bFGF, el medio se cambió cada dos días. Después de 3 semanas de cultivo, los cuerpos embrioides (EB) se sembraron sobre placas tratadas con TC recubiertas de gelatina al 1 % durante otras 2 semanas. Los EB y su crecimiento se fijaron en PFA al 4 % durante 8 minutos a RT y se inmunotiñeron para los marcadores apropiados.

Aislamiento de ARN y qRT-PCR

El aislamiento de ARN se realizó mediante el uso de RNeasy Plus Mini Kit con QIAshredder (Qiagen; Hilden, Alemania). Brevemente, las células se sedimentaron, se lavaron con PBS, y se suspendieron nuevamente en tampón de lisis. Después, las muestras se almacenaron a -80 °C hasta que se procesaron posteriormente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se eluyó en 30 pl de ddH²Ü libre de ARNasa y se cuantificó con un espectrofotómetro NanoDrop 8000 (Thermo Scientific; Somerset, NJ).

Para el qRT-PCR, el ADNc se sintetizó mediante el uso del Sistema de Transcripción Inversa GoScript™ (Promega; Madison, WI) con 0,5 pg de RNA y cebadores aleatorios. Después, se cargaron 20 ng de ADNc en una placa de reacción de 96 pocillos junto con 10 pl de Mezcla Maestra de qPCR GoTaq® y 1 pl de cada cebador (10 nM) en una reacción de 20 pl y la placa se corrió en el sistema de qPCR Stratagene Mx300P (Agilent Technologies; Santa Clara, CA). La Tabla 3 enumera las secuencias de los cebadores.

Tabla 3. Secuencias de Cebadores usados para qRT-PCR

Análisis de Nanocadenas para Pluripotencia

Se aisló el ARN de iPSC indiferenciadas y de hESC HUES45 como se describió anteriormente. Se cargó ARN (100 ng/muestra) para la hibridación con el Conjunto de Códigos Indicadores y el Conjunto de Sonda de Captura específicos (NanoString Technologies; Seattle, WA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se normalizaron con respecto a los siguientes genes de expresión constitutiva: ACTB, POLR2A, ALAS1. Los datos se expresaron como las veces de cambio con respecto a la expresión de la línea hESC (HUES45=1). Ver Figura 15.

Cariotipado

Todas las líneas de iPSC se sometieron a análisis citogenético mediante Cell Line Genetics para confirmar un cariotipo normal.

Inmunotinción e Imágenes

Las células se lavaron 3 veces en PBS-T (PBS que contiene Triton-X100 al 0,1 %) durante 10 minutos, se incubaron durante 2 horas en suero de bloqueo (PBS-T con suero de cabra o burro al 5 %) y se aplicaron los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C (Tabla 4). Al día siguiente, las células se lavaron 3X en PBS-T durante 15 minutos, se incubaron con anticuerpos secundarios durante 2 horas a temperatura ambiente (RT), se lavaron 3X durante 10 minutos en PBS-T, se les aplicó la coloración de contraste con DAPI durante 15 minutos a RT y se lavaron 2X en PBS. Se usaron los anticuerpos secundarios Invitrogen™ Alexa Fluor, anti-ratón generado en cabra o burro, rata, conejo, cabra y pollo 488, 555, 568, y 647 a una dilución 1:500 (Life Technologies).

Las imágenes se adquirieron mediante el uso de un microscopio invertido Olympus IX71, equipado con una cámara digital en blanco y negro Olympus DP30BW para fluorescencia y una cámara digital a color DP72 para la tinción de H&E. Los colores fluorescentes se aplicaron digitalmente mediante el uso del programa informático DP Manager de Olympus o con ImageJ. Para el recuento, se importaron al menos tres campos no superpuestos al ImageJ, se establecieron umbrales y se puntuaron manualmente.

Citometría de flujo

Las células se recolectaron enzimáticamente mediante tratamiento con ACCUTASE® durante 25 minutos a 37 °C para obtener una suspensión de una sola célula. Después, las células se suspendieron en 100 pl de su medio respectivo que contiene la cantidad apropiada del anticuerpo primario o de los anticuerpos conjugados con fluorescencia y se incubaron en hielo durante 30 minutos protegidas de la luz. Cuando se usaron anticuerpos secundarios, los anticuerpos primarios se lavaron con PBS y los anticuerpos secundarios se aplicaron durante 30 minutos en hielo. Las células teñidas o que expresan GFP se lavaron con PBS y se clasificaron inmediatamente en un clasificador de células BD Biosciences ARIA-IIu™ de 5 láser mediante el uso de la boquilla de cerámica de 100 pm y 20 psi. Se usó DAPI para la exclusión de células muertas. Los datos de citometría de flujo se analizaron mediante el uso del programa informático BD FACSDiva™.

Trasplante en Ratones Shiverer (shi/shi) x Rag2-~.

Todos los experimentos que usaron ratones shiverer/rag2 (Universidad de Rochester; Windrem, M.S. y otros, Cell Stem Cell. 2:553-565 (2008)) se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Buffalo (IACUC). Las OPC O4+ clasificadas por FACS que se habían criopreservado previamente se descongelaron y se dejaron recuperar durante 1-2 días antes de la cirugía mediante su siembra sobre placas de pO/L en Medio PDGF. Las células se prepararon para inyección mediante la suspensión de las células a 1 x 105células por pl.

Las inyecciones se realizaron como se describió anteriormente. Sim, F.J. y otros (2011). Las crías se anestesiaron mediante el uso de hipotermia y 5 x 104 células se inyectaron en cada sitio, bilateralmente a una profundidad de 1,1 mm en el cuerpo calloso de las crías de 2-3 días postnatales. Las células se inyectaron a través de pipetas de vidrio estiradas, insertadas directamente a través del cráneo en los presuntos sitios diana. Los animales se sacrificaron y se perfundieron con solución salina seguida de paraformaldehído al 4 % a las 12-16 semanas. Se cortaron secciones coronales criopreservadas de prosencéfalo de ratón (16 pm) y se tomaron muestras cada 160 pm. Sim, F.J. y otros (2011). Se identificaron células humanas con núcleos antihumanos de ratón (hNA) y se marcaron con MBP los oligodendrocitos que expresan la proteína básica de mielina. Los astrocitos humanos y las OPC se tiñeron con anticuerpos específicos humanos contra hGFAP y hNG2, respectivamente. El neurofilamento de ratón (NF) se tiñó con una mezcla 1:1 de SMI311 y SMI312. Se usaron anticuerpos secundarios Invitrogen™ Alexa Fluor anti-ratón generados en cabra 488, 594, y 647 a una dilución 1:500 (Life Technologies). Para la microscopía electrónica de transmisión, el tejido se procesó como se describió anteriormente. Sim, F.J. y otros., Molec. Cell. Neurosci. 20:669-682 (2002). La Tabla 4 proporciona una lista de los anticuerpos primarios usados.

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para generar células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) OLIG2+, el método comprende:

   (a) preparar colonias de células madre pluripotentes humanas (hPSC) al:

   (i) sembrar las hPSC a baja densidad de 8000 a 11000 células/cm2 en una superficie; y (ii) cultivar las hPSC en un cultivo adherente durante 1-2 días, para de esta manera preparar las colonias de hPSC;

   (b) cultivar las colonias de hPSC hasta la confluencia en un medio que comprende una concentración baja de ácido retinoico (RA) de 10 nM a 250 nM, al menos un inhibidor de la señalización del factor de crecimiento transformante beta (TGFp) seleccionado a partir de SB431542, GW788388, LDN193189, LY2109761, LY2157299, y LY364947, y al menos un inhibidor de la señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) seleccionado a partir de LDN193189, DMH1, dorsomorfina, K02288, y Noggin, en donde el primer día de dicho cultivo es el día 0; y

   (c) cultivar las células confluentes en un medio que comprende 3-cloro-N-[(1r,4r)-4-(metilamino)ciclohexil]-N-[3-(piridin-4-il)bencil]benzo[b]tiofeno-2-carboxamida (Agonista de Smoothened (SAG)) y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM hasta que las células estén sobreconfluentes, en donde las células expresan OLIG2;

   para de esta manera generar OPC OLIG2+.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1 que comprende, además:

   (d) cultivar agregados celulares tridimensionales de OPC OLIG2+ en suspensión en un medio que comprende SAG y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM durante aproximadamente 8 días; (e) cultivar los agregados celulares en suspensión en un medio que comprende factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1) y neurotrofina 3 (NT3) durante aproximadamente 10 días;

   (f) sembrar nuevamente los agregados celulares a una densidad de 2 esferas/cm2; y

   (g) cultivar los agregados celulares en un cultivo adherente en un medio que comprende (i) ácido ascórbico (AA) o (ii) PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 hasta que las células sean O4+;

   para de esta manera generar las OPC O4+.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, que comprende, además, cultivar las OPC O4+ en ausencia de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 durante aproximadamente tres semanas; para de esta manera generar los oligodendrocitos, en donde los oligodendrocitos son proteína básica de mielina (MBP)+.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, el método comprende, además:

   (d) desprender las OPC OLIG2+ de la superficie, para de esta manera permitir la formación de agregados celulares tridimensionales;

   (e) cultivar los agregados celulares en suspensión en un medio que comprende SAG y una baja concentración de RA de 10 nM a 250 nM durante aproximadamente 8 días;

   (f) cultivar los agregados celulares en suspensión en un medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 durante aproximadamente 10 días;

   (g) sembrar nuevamente los agregados celulares a una densidad de 2 esferas/cm2;

   (h) cultivar los agregados celulares en un cultivo adherente en un medio que comprende (i) AA o (ii) PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 hasta que las células sean O4+, para de esta manera generar las OPC O4+; y (i) cultivar las OPC O4+ en un medio que comprende a A y que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 hasta que las células sean MBP+;

   para de esta manera generar los oligodendrocitos.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las hPSC son células madre embrionarias.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las hPSC son células madre pluripotentes inducidas (iPSC).
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde las iPSC se derivan de un paciente con esclerosis múltiple.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las hPSC son células humanas.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde la superficie comprende una matriz de membrana basal.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las hPSC se siembran en la superficie a aproximadamente 10000 células/cm2.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las colonias de hPSC tienen un diámetro de aproximadamente 100 pm a aproximadamente 250 pm.
12. 12. El método de conformidad con cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las hPSC se cultivan en un medio que comprende un inhibidor de la proteína quinasa asociada a rho (ROCK).
13. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la concentración de RA es 100 nM.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde el inhibidor de la señalización de TGFp es SB431542.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde el inhibidor de la señalización de BMP es LDN193189.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las células confluentes son PAX6+.
17. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el medio que comprende SAG y RA carece de SHH.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde las células se desprenden de la superficie mecánicamente.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde las células se desprenden de la superficie de forma enzimática.
20. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde la nueva siembra de los agregados celulares se realiza en una superficie que comprende una proteína de matriz extracelular y un poliaminoácido cargado positivamente.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la proteína de la matriz extracelular es laminina.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el poliaminoácido es poliornitina.
23. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en donde (i) el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 comprende, además, insulina, (ii) el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 comprende, además, triyodo-L-tironina (T3), (iii) el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 comprende, además, biotina, (iv) el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 comprende, además, AMPc, (v) el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 carece de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), (vi) el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 carece de factor de crecimiento epidérmico (EGF), (vii) en donde el medio que comprende AA comprende, además, insulina, (viii) el medio que comprende AA comprende, además, T3, (ix) el medio que comprende AA comprende, además, biotina o (x) el medio que comprende AA comprende, además, AMPc.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde dicho cultivo en el medio que comprende SAG y RA comienza el día 8.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde las células están sobreconfluentes el día 12.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicho cultivo en suspensión comienza el día 12.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 4, en donde (i) al menos el 50 % de las células son OLIG2+ el día 12, (ii) al menos el 60 % de las células son OLIG2+ el día 12, o (iii) al menos el 70 % de las células son OLIG2+ el día 12.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 20.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde los agregados celulares se siembran el día 30.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde (i) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA y carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 25 % de las células son O4+ el día 55, (ii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA y carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 30 % de las células son O4+ el día 55, (iii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA y carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 45 % de las células son O4+ el día 63, o (iv) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA y carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 60 % de las células son O4+ el día 75.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA, y en donde (i) al menos 25 % de las células son O4+ después de 25 días de cultivo en el medio que comprende AA, (ii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA, y en donde al menos 30 % de las células son O4+ después de 25 días de cultivo en el medio que comprende AA, (iii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA, y en donde al menos 40 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende AA, (iv) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA, y en donde al menos 50 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende AA, o (v) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende AA, y en donde al menos 60 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende AA.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde (i) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 40 % de las células son O4+ el día 75, (ii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 50 % de las células son O4+ el día 75, (iii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 60 % de las células son O4+ el día 75, o (iv) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3 a partir del día 30, y en donde al menos 70 % de las células son O4+ el día 75.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde (i) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, y en donde al menos 40 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, (ii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, y en donde al menos 50 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, (iii) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, y en donde al menos 60 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, o (iv) los agregados celulares se cultivan en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, y en donde al menos 70 % de las células son O4+ después de 45 días de cultivo en el medio que comprende PDGF, HGF, IGF-1 y NT3.
34. 34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en donde (i) al menos 20 % de las OPC O4+ son MBP+ después de 20 días en cultivo en el medio que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, (ii) al menos 25 % de las OPC O4+ son MBP+ después de 20 días en cultivo en el medio que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, (iii) al menos 30 % de las ^o P^c O4+ son MBP+ después de 20 días en cultivo en el medio que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3, o (iv) al menos 35 % de las OPC O4+ son MBP+ después de 20 días en cultivo en el medio que carece de PDGF, HGF, IGF-1 y NT3.
35. 35. Un método para identificar un compuesto que promueve la mielinización, el método comprende:

    (a) generar un oligodendrocito mediante el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-4;

    (b) poner en contacto el oligodendrocito con un compuesto candidato; y

    (c) determinar si el compuesto candidato promueve la mielinización de neuronas.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, en donde el método es un método de alto rendimiento.