ES2849950T3

ES2849950T3 - Análogos de péptidos GLP-1 lipidados resistentes a proteasas

Info

Publication number: ES2849950T3
Application number: ES16732248T
Authority: ES
Inventors: Jefferson Revell; Maria Bednarek
Original assignee: MedImmune Ltd
Current assignee: MedImmune Ltd
Priority date: 2015-06-10
Filing date: 2016-06-09
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2036-06-09
Also published as: NI201700156A; TWI726889B; KR20180016441A; MX389407B; IL255978B; CA2988841C; SG10201911837SA; TN2017000519A1; NZ738909A; AU2016277449A1; CN108271373A; PE20180659A1; EP3307769A1; CL2017003144A1; MX2017015482A; CN108271373B; DOP2017000287A; MY185816A; CO2017012675A2; JP6811190B2

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos: **(Ver secuencia)** en donde X13 es un residuo K modificado con lípidos, y X25 es un residuo K modificado con lípidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos de péptidos GLP-1 lipidados resistentes a proteasas

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUD RELACIONADAS

Esta solicitud invoca prioridad bajo 35 U.S.C. § 119 de la Solicitud Provisional de Patente de los EEUU N° Acta: 62/173,631, presentada el 10 de junio, 2015, y la Solicitud Provisional de Patente de los EEUU N° Acta: 62/343,390, presentada el 31 de mayo, 2016.

REFERENCIA AL LISTADO DE SECUENCIAS PRESENTADO POR VÍA ELECTRÓNICA

El contenido de la lista de secuencias presentada por vía electrónica en el archivo de texto ASCII (nombre: ORPEP-101WO1_SL.txt; Tamaño: 424,418 bytes; y Fecha de creación: 7 de junio de 2016) está presentado con la solicitud.

ANTECEDENTES

La presente divulgación proporciona péptidos resistentes a proteasas, métodos de preparación de tales péptidos, así como composiciones que comprenden péptidos resistentes a proteasas y métodos de tratamiento que utilizan tales péptidos. En la presente se describe la modificación de aminoácidos con lípidos en determinadas posiciones en la secuencia peptídica.

El desarrollo de agentes terapéuticos de péptidos de acción prolongada se ve obstaculizado por factores tales como una vida media en plasma corta y una pobre biodisponibilidad oral, en gran medida como resultado de la susceptibilidad natural de los péptidos a una degradación enzimática. La mayoría de las funciones proteolíticas son necesarias, incluyendo regular procesos biomoleculares esenciales tales como desactivar acontecimientos de señalización de péptidos en superficies celulares, o la descomposición gástrica de proteínas y péptidos durante la digestión. Por tanto, la actividad de las proteasas responsables no puede inhibirse simplemente sin provocar, en muchos casos, otras alteraciones metabólicas.

Por tanto, con el fin de superar la degradación es deseable aumentar la resistencia enzimática de un péptido de interés. En general, se utilizan dos métodos para aumentar la resistencia enzimática: las modificaciones específicas de la secuencia, por ejemplo, las que afectan la estructura primaria del propio péptido; y las modificaciones efectivas en general, por ejemplo, aquellas que alteran determinadas características fisicoquímicas globales del péptido. Dichas modificaciones, introducidas estratégicamente, pueden reducir los efectos de los procesos fisiológicos naturales que de lo contrario eliminarían o inactivarían un péptido cuya acción sea deseable, por ejemplo, por degradación enzimática y/o depuración por ultrafiltración renal.

Las modificaciones de secuencia específicas incluyen incorporación de aminoácidos no habituales resistentes a una proteólisis, o modificaciones más comprometidas que incluyen ciclación entre funciones de cadenas laterales naturales, por ejemplo, formación de disulfuros (Cys-Cys) o lactamización (Lys-Glu o Lys-Asp). Las modificaciones adicionales incluyen ciclación entre sustitutos de aminoácidos no naturales dentro de la estructura principal del péptido, por ejemplo, encadenamiento por metátesis de olefinas.

Las modificaciones globales incluyen procesos tales como lipidación de péptidos, por ejemplo, palmitoilación y/o PEGilación. La palmitoilación tiene el efecto de crear un reservorio de péptidos en la circulación que se asocia de manera reversible con la albúmina abundante de forma natural en el suero sanguíneo. El péptido asociado con albúmina escapa de forma eficaz de la ultrafiltración renal ya que el tamaño del complejo asociado es mayor que el punto de corte de filtración glomerular. A medida que el péptido se disocia de la superficie de la albúmina, está libre de nuevo para interaccionar con receptores endógenos. La pegilación tiene el efecto de proteger físicamente el péptido frente a la proteolisis e imparte hidrofilicidad significativa que, tras la hidratación, aumenta enormemente el radio hidrodinámico de la molécula terapéutica para superar el aclaramiento renal.

Si bien es posible aplicar ampliamente estas tecnologías a los péptidos terapéuticos en general, y hasta un cierto punto pueden extender la vida media en la circulación, aún persiste la necesidad de métodos para aumentar la estabilidad de péptidos y proteínas a una degradación enzimática, en particular a la luz del deseo de producir péptidos adecuados para una administración oral.

Green et al., “Degradation, receptor binding, insulin secreting and antihyperglycaemic actions of palmitate-derivatised native and ala8-substituted GLP-1 analogues”, Biological Chemistry, Walter de Gruyter GMBH & Co., vol. 385, n.° 2, 2004, páginas 169-177, describe una sustitución de aminoácidos con K-lipidación específica para producir análogos de GLP-1 resistentes a DPP-IV mejorados.

COMPENDIO

La presente invención provee un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos H Aib E G S (a-MeF) T S D V (a-MeS) S X13 L E G E A A (a-MeK) E (a-MeF) I A X25 V V E G G, donde X13 es un residuo K modificado con lípidos y X25 es un residuo K modificado con lípidos.

La presente divulgación provee un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos: H X2 E G S X6 T S D V X11 X12 X13 L E G E A A X20 E X22 I X24 X25 V V X28 G G (SEQ ID NO: 2) en .donde X2 es A o Aib, X6 es F o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X11 es S o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X12 es S o un residuo K modificado con lípidos, X13 es Y o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X20 es un residuo K modificado con lípidos, K, o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X22 es F o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X24 es A o un residuo K modificado con lípidos; X25 es W o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, y X28 es K, E o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, en donde el polipéptido solo está lipidado en uno de X12, X20 o X24.

En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2 comprende una amida C-terminal. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2 comprende un ácido C-terminal.

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, X2 es Aib. En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, el residuo K modificado con lípidos se selecciona del grupo que consiste en: K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato), K(£-yE-palmitoílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo), K(S-YE-lauroílo), K(S-YE-YE-lauroílo), K(S-YE-YE-YE-lauroílo), K(£-Ahxlauroílo), K(S-Ahx-Ahx-lauroílo), K(S-Ahx-Ahx-Ahx-lauroílo), K(S-(PEG)2-lauroílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-lauroílo), K(£-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-lauroílo), K(S-YE-l2-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(S-YE-YE-l2-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(£-yE-yE-yE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(S-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(S-Ahx-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(S-Ahx-Ahx-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(£-(PEG)²-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(S-(PEG)²-(PEG)²-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), k (s-(PEG)²-(PEG)²-(PEG^-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo), K(S-YE-estearoílo), K(S-YE-YE-estearoílo), K(S-YE-YE-YE-estearoílo), K(S-Ahx-estearoílo), K(£-Ahx-Ahx-estearoílo), K(S-Ahx-Ahx-Ahx-estearoílo), K(£-(PEG)2-estearoílo), K(£-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo), K(£-(PeG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo), K(S-YE-estearato), K(S-YE-YE-estearato), K(S-YE-YE-YE-estearato), K(S-Ahx-estearato), K(£-Ahx-Ahx-estearato), K(S-Ahx-Ahx-Ahx-estearato), K(£-(pEG)2-estearato), K(£-(PEG)2-(PEG)2-estearato), K(£-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearato) y cualquier combinación de los mismos. En determinadas formas de realización, el residuo K modificado con lípidos es K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato).

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, X6 es a-MeF, X11 es a-MeS, X13 es a-MeF, X22 es a-MeF, X25 es a-MeF, X28 es a-MeK o cualquier combinación de los mismos. En determinadas formas de realización, X2 es Aib, x 6 es a-MeF, X11 es a-MeS, X13 es a-MeF, X20 es K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato), X22 es a-MeF, X25 es a-MeF, y X28 es a-MeK (SEQ ID N°: 3). En determinadas formas de realización, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 48, SEQ ID N°: 60 o SEQ ID N°: 68.

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, el polipéptido es sustancialmente resistente a una degradación proteolítica. En determinadas formas de realización, el polipéptido es sustancialmente resistente a una degradación con DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. En determinadas formas de realización, el polipéptido conserva por lo menos sustancialmente la misma potencia del receptor que un polipéptido correspondiente no lipidado. En determinadas formas de realización, el polipéptido conserva por lo menos sustancialmente la misma selectividad por el receptor que un polipéptido correspondiente no lipidado. En determinadas formas de realización, el polipéptido presenta una mayor potencia del receptor con respecto a un polipéptido correspondiente no lipidado.

La presente divulgación también provee un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos: H X2 E G X5 X6 T S D X10 X11 X12 X13 X14 E G X17 A A X20 E X22 I X24 X25 X26 V X28 G X30 (SEQ ID NO: 4); en donde X2 es A o Aib, X5 es T o S, X6 es F o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X10 es V o un residuo K modificado con lípidos, X11 es S o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X12 es S o un residuo K modificado con lípidos, X13 es Y, F o un residuo K modificado con lípidos, X14 es L o un residuo K modificado con lípidos, X17 es Q o E, X20 es K, E o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X22 es F, norleucina, tirosina metiléster o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo, X24 es A o un residuo K modificado con lípidos, X25 es W, F o un residuo K modificado con lípidos, X26 es L, V o un residuo K modificado con lípidos, X28 es K o E y X30 es R o G, en donde el polipéptido comprende dos residuos K modificados con lípidos, y en donde uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con residuos de lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con residuos de lípidos. En determinadas formas de realización: X6 es F, a-MeF, a-MeS, o a-MeK; X11 es S a-MeF, a-MeS, o a-MeK; y X20 es K, E, a-MeF, a-MeS o a-MeK.

En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4 comprende una amida C-terminal. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4 comprende un ácido C-terminal.

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4, X2 es Aib. En determinadas formas de realización, los dos residuos K modificados con lípidos son iguales o diferentes, y se seleccionan del grupo que consiste en: K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato), K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo), K(£-(PEG)2-(PEG)2-yE-palmitoílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-yE-estearato) y cualquier combinación de los mismos. En determinadas formas de realización, los dos residuos K modificados con lípidos son ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo), ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato), ambos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo), ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo), ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo) o ambos K(£-(p EG)2-(PEG)2-YE-estearato).

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4, X10 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X12 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X13 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X24 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X25 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X26 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos.

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4: X6 es a-MeF, X11 es a-MeS, X20 es a-MeK, X6 es a-MeF y Xl1 es a-MeS, X6 es a-MeF y X20 es a-MeK, X11 es a-MeS, y X20 es a-MeK o X6 es a-MeF, X11 es a-MeS y X20 es a-MeK. En determinadas formas de realización, X13 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos. En determinadas formas de realización, X5 es S. En determinadas formas de realización, X17 es E, X28 es E y X30 es G. En determinadas formas de realización, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 263; SEQ ID NO: 269; SEQ ID NO: 405; SEQ ID NO: 408; SEQ ID NO: 409; o SEQ ID NO: 410.

La presente divulgación también provee un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos: H (Aib) E G S (a-MeF) T S D X10 X11 X12 X13 X14 E X16 X17 X18 A (a-MeK) X21 F I X24 X25 X26 V E G G (SEQ ID NO: 487), en donde X10 es V o un residuo K modificado con lípidos; X11 es S o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo; X12 es S o un residuo K modificado con lípidos; X13 es Y o un residuo K modificado con lípidos; X14 es L o un residuo K modificado con lípidos; X16 es G o un residuo K modificado con lípidos; X17 es E o un residuo K modificado con lípidos; X18 es A o un residuo K modificado con lípidos; X21 es E o un residuo K modificado con lípidos; X24 es A o un residuo K modificado con lípidos; X25 es F o un residuo K modificado con lípidos; X26 es V o un residuo K modificado con lípidos; y en donde el polipéptido comprende tres residuos K modificados con lípidos, y en donde uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X16, X17, X18 o X21 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos.

En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 487 comprende una amida C-terminal. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 487 comprende un ácido C-terminal.

En determinadas formas de realización, los residuos K modificados con lípidos se pueden unir a una variedad de lípidos o unidades de lípidos tales como cualquiera de los que se describen en la presente. En determinadas formas de realización , los ejemplos incluyen aquellos que se seleccionan del grupo que consiste en: K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo); K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); K(£-(PEG)2-(PEG)2-yE-estearoílo); K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); y cualquier combinación de los mismos. En otras formas de realización, las modificaciones con lípidos de los residuos K pueden ser iguales o diferentes. En determinadas formas de realización, son iguales. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, por lo menos tres residuos K modificados con lípidos pueden ser todos K(£-(PEG)2-(pEG)2-YE-lauroílo); pueden ser todos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); pueden ser todos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); pueden ser todos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); pueden ser todos K(£-(PEG)2-(PEG)2-yE-estearoílo); o pueden ser todos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato). En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 487: todos los residuos modificados pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo); todos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); todos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); todos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); todos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo); o todos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato).

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4 ó 487, el polipéptido es sustancialmente resistente a una degradación proteolítica. En determinadas formas de realización, el péptido sintético es sustancialmente resistente a una degradación con DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. En determinadas formas de realización, el polipéptido, que comprende dos residuos K modificados con lípidos, conserva por lo menos sustancialmente la misma potencia del receptor que un péptido correspondiente no lipidado. En determinadas formas de realización, el polipéptido, que comprende dos residuos K modificados con lípidos, conserva por lo menos sustancialmente la misma selectividad del receptor que un péptido correspondiente no lipidado. En determinadas formas de realización, el polipéptido, que comprende dos residuos K modificados con lípidos, presenta una mayor potencia del receptor con respecto a un polipéptido correspondiente no lipidado.

En la presente se proveen péptidos lipidados que se pueden unir al receptor GLP-1 humano con una EC50 en el ensayo con AMPc menor que 5000 pM, menor que 2500 pM, menor que 1000 pM, menor que 900 pM, menor que 800 pM, menor que 700 pM, menor que 600 pM, menor que 500 pM, menor que 400 pM, menor que 300 pM, menor que 200 pM, menor que 100 pM, menor que 50 pM, menor que 25 pM, menor que 20 pM, menor que 15 pM, menor que 10 pM, menor que 5 pM, menor que 4 pM, menor que 3 pM o menor que 2 pM.

La divulgación también provee polinucleótidos aislados que codifican cualquiera de los polipéptidos lipidados que se describen en la presente. Determinadas formas de realización proveen vectores que comprenden dichos polinucleótidos. Determinadas formas de realización proveen células huésped que comprenden dichos nucleótidos o vectores.

Determinadas formas de realización proveen métodos para elaborar un polipéptido lipidado descrito en la presente. En determinadas formas de realización, el método comprende cultivar una célula huésped en condiciones que permiten la expresión del péptido, y recuperar el péptido.

Determinadas formas de realización proveen composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido lipidado como se describe con detalle en otra parte en la presente. En determinadas formas de realización, se describe un kit que comprende dicha composición.

Determinadas formas de realización proveen métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición causada o caracterizada por hipoglucemia o una liberación de insulina deficiente. Dichos métodos comprenden administrar a un sujeto que necesita del tratamiento una cantidad eficaz de un polipéptido lipidado descrito con detalle en otra parte en la presente o una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido. En determinadas formas de realización, la enfermedad o condición es diabetes. En determinadas formas de realización, la enfermedad o condición es diabetes tipo 2. En determinadas formas de realización, la administración además mejora el control glucémico, provee control del peso corporal, mejora la función y masa de células p, reduce el índice de secreción de ácido gástrico y de vaciado gástrico o cualquier combinación de los mismos. En determinadas formas de realización, el polipéptido o la composición farmacéutica se administra por vía oral o mediante inyección. En determinadas formas de realización, el polipéptido, o la composición farmacéutica, se administra por vía oral. En determinadas formas de realización, la inyección se administra por vía subcutánea o por vía intravenosa. En determinadas formas de realización, el péptido, o la composición farmacéutica, se administra una vez por día. En determinadas formas de realización, los métodos de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición comprenden además administrar una o más terapias adicionales. En determinadas formas de realización, la terapia adicional comprende monitoreo del azúcar en sangre, modificaciones de la dieta, ejercicio, insulina, una tiazolidindiona, una sulfonilurea, una incretina, metformina, una glibúrida, un inhibidor de la dipeptidilo peptidasa 4, un secuestrante de ácidos biliares o cualquier combinación de los mismos. En determinadas formas de realización, el sujeto tratado es un ser humano.

DESCRIPCIONES BREVES DE LOS DIBUJOS

En la Figura 1 se muestran lípidos, unidades de lípidos y conectores representativos para formar los polipéptidos lipidados que se divulgan en la presente.

En la Figura 2 se muestra el porcentaje de péptido remanente de 100 |jg de péptido hidrolizado por 100 |jg/ml de neprilisina a pH 8.3.

En la Figura 3 se muestra el porcentaje de péptido remanente de 100 jg de péptido hidrolizado por 200 jg/ml de pepsina, HCl 100 mM a pH 2.

En la Figura 4 se muestra el porcentaje de péptido remanente de 100 jg de péptido hidrolizado por 150 jg/ml de tripsina a pH 8.1.

En la Figura 5 se muestra el porcentaje de péptido remanente de 100 jg de péptido hidrolizado por 100 jg/ml de quimotripsina a pH 8.

En la Figura 6 se muestra el porcentaje de péptido remanente de 1000 jg de péptido hidrolizado por 100 jg/ml de SIF/Pancreatin® fresco a pH 6.8.

En la Figura 7 se muestran los valores promedio de una corrida por triplicado del porcentaje de péptido remanente de 1000 |jg de péptido hidrolizado por 100 |jg/ml de SIF/Pancreatin® fresco (con enteroquinasa) a pH 6.8.

En la Figura 8 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 3 y la SEQ ID N°: 17.

En la Figura 9 se muestra la Figura 9 muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 48 y la SEQ ID N°: 60.

En la Figura 10 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 68 y la SEQ ID N°: 252.

En la Figura 11 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 263 y la SEQ ID N°: 269.

En la Figura 12 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 405 y la SEQ ID N°: 406.

En la Figura 13 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 407 y la SEQ ID N°: 408.

En la Figura 14 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 409 y la SEQ ID N°: 410.

En la Figura 15 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 488 y la SEQ ID N°: 489.

En la Figura 16 se muestra la estructura química, la fórmula química y el peso molecular para la SEQ ID N°: 490 (liraglutida) y la SEQ ID N°: 491 (semaglutida)

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se podrá apreciar que las implementaciones particulares que se muestran y describen en la presente son ejemplos y no se pretende que limiten el alcance de la solicitud en modo alguno.

Cualquier conflicto entre cualquier referencia citada en la presente y el contenido específico de esta memoria descriptiva deberá resolverse a favor de esta última. Del mismo modo, cualquier conflicto entre una definición de un término o expresión según se interpreta en el arte y una definición del término o expresión según se indica específicamente en esta memoria descriptiva deberá resolverse a favor de esta última.

Las formas del singular "un", "uno/a" y "el/la", tal como se utilizan en esta memoria descriptiva, también abarcan específicamente las formas en plural de los términos a los cuales hacen referencia, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. El término “aproximadamente” se utiliza en la presente con referencia a una forma aproximada, en la región de, más o menos, o alrededor de. Cuando el término “aproximadamente” se utiliza conjuntamente con un rango numérico, modifica al rango extendiendo sus límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término “aproximadamente” se utiliza en la presente para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado con una varianza de un 20%.

Además, “y/o” cuando se usa en esta memoria debe tomarse como la descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. De este modo, se pretende que el término "y/o", según se utiliza en una frase tal como "A y/o B" del presente documento, incluya "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). De modo similar, el término "y/o", según se utiliza en una frase tal como "A, B y/o C", pretende incluir cada uno de los siguientes aspectos: A, B y C; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Se entiende que siempre que se describan aspectos en la presente con el lenguaje "que comprende", también se proporcionan aspectos por lo demás análogos en términos de "que consiste en" y/o "que consiste esencialmente en".

Los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado conocido habitualmente por un especialista en el arte al cual pertenece la presente solicitud, a menos que se defina de otro modo. En la presente se hace referencia a varias metodologías y materiales conocidos por los expertos en el arte. Las obras de referencia convencionales que exponen los principios generales de la síntesis peptídica incluyen W. C. Chan y P. D. White., “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach", Oxford University Press, Oxford (2004).

Las unidades, los prefijos y los símbolos se indican con su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxilo. Los encabezados que se proporcionan en la presente no son limitaciones de los diversos aspectos de la divulgación, que pueden considerarse por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más detalladamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

Los términos "polipéptido", "péptido", "proteína" y "fragmento de una proteína" se utilizan indistintamente en la presente para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros aminoacídicos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros aminoacídicos que se producen de forma natural y polímeros aminoacídicos que no se producen de forma natural.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de forma similar a los aminoácidos naturales. Aminoácidos que se producen de forma natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Los análogos de aminoácidos hacen referencia a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de forma natural, por ejemplo, un carbono alfa que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxílico, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfonio de metionina. Tales análogos pueden tener grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido que se produce de forma natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de forma similar a un aminoácido que se produce de forma natural. Los términos “aminoácido” y “residuo de aminoácido” se usan de manera indistinta a toda la extensión de la presente.

Los términos "fragmento”, "análogo”, "derivado” o "variante", cuando se refieren a los péptidos lipidados provistos en la presente, incluyen cualquier péptido que retiene por lo menos alguna actividad de un correspondiente péptido nativo, por ejemplo, GLP-1. Según se usa en la presente, el término "análogo del péptido GLP-1 lipidado" se refiere, por ejemplo, a un péptido sintético que comprende uno o más aminoácidos lipidados, por ejemplo, para volver al péptido resistente a proteasas, conservando al mismo tiempo por lo menos algunas de las actividades GLP-1 de un péptido GLP-1 nativo. Las modificaciones químicas dirigidas a mejorar la estabilidad metabólica de péptidos pueden comprender una manipulación química adicional después de la síntesis de la cadena peptídica principal. Los ejemplos de manipulaciones incluyen lactamización, cierre de puentes disulfuro, lipidación y/o PEGilación.

Los términos "" y "aminoácido lipidado" se usan indistintamente en la presente, y se refieren a un aminoácido, típicamente una lisina o cisteína, que está unido a una unidad de lípidos. Los términos "polipéptido lipidado”, "lipoproteína” y semejantes se refieren a un péptido o polipéptido que incluye uno o más aminoácidos modificados por lípidos. La Figura 1 ilustra varios ejemplos representativos de lípidos, unidades de lípidos y conectores.

Los términos "composición” o "composición farmacéutica” se refieren a composiciones que contienen un péptido o polipéptido provisto en la presente junto, por ejemplo, con vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables para su administración a un sujeto que necesita del tratamiento.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a composiciones que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuadas para entrar en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin una toxicidad excesiva u otras complicaciones, proporcionadas con una relación beneficio/riesgo razonable.

Una "cantidad eficaz" es la cantidad de un péptido o polipéptido provisto en la presente, cuya administración a un sujeto, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para un tratamiento.

El término "sujeto" se refiere a cualquier sujeto, en particular un sujeto de mamífero, que necesita tratamiento con un péptido o polipéptido provisto en la presente. Los sujetos mamíferos incluyen, pero en un sentido no taxativo, seres humanos, perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, osos, vacas, simios, monos, orangutanes y chimpancés y así sucesivamente. En una forma de realización, el sujeto es un sujeto humano.

En la presente se proveen composiciones y métodos dirigidos a las inconveniencias enzimáticas naturales de los péptidos. Al lipidar residuos de aminoácidos seleccionados, se proveen péptidos con una mayor resistencia a la degradación enzimática, al tiempo que se conserva sustancialmente la misma potencia y selectividad, o aún mayores, del receptor que un péptido de tipo salvaje.

Péptidos que presentan resistencia a proteasas

Esta divulgación provee péptidos lipidados con una mayor resistencia a proteasas y una mayor potencia. Las mejoras en la resistencia a proteasas y la potencia se pueden asociar con la posición de la lipidación en el péptido. La lipidación puede incluir una lipidación carboxilo o amino terminal, o una lipidación de la cadena principal. En determinadas formas de realización, la modificación es en un residuo de aminoácido de la cadena principal. En determinadas formas de realización, las mejoras en la resistencia a proteasas y una mayor potencia se asocian con la posición selectiva y estratégica de la lipidación de uno o más residuos de aminoácidos de la cadena principal. Los métodos para preparar péptidos con aminoácidos modificados por lípidos son conocidos en el arte.

En determinadas formas de realización, se provee un péptido lipidado que comprende por lo menos un residuo de aminoácido lipidado. En determinadas formas de realización, el péptido lipidado comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos lipidados. En determinadas formas de realización, el péptido lipidado solo contiene un residuo de aminoácido lipidado. Según se usa en la presente, un péptido con un lípido o una unidad de lípido unido al mismo se conoce como un péptido monolipidado. En otras formas de realización, el péptido lipidado contiene dos residuos de aminoácidos lipidados. Según se usa en la presente, un péptido con dos lípidos o unidades de lípidos unidos al mismo se conoce como un péptido bilipidado.

En determinadas formas de realización, el péptido lipidado es un péptido sintético. Véase la Solicitud de Patente Internacional N°: PCT/EP2014/077240, publicada como WO2015/086686A2. En determinadas formas de realización, el péptido sintético lipidado comprende por lo menos una sustitución de un residuo de aminoácido nativo por un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo. En otras formas de realización, un péptido sintético lipidado comprende por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más sustituciones de residuos de aminoácidos nativos por aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo.

Según se describe en la presente, un “péptido sintético” se refiere a un polímero de residuos de aminoácidos que se ha generado mediante acoplamiento químico de un grupo carboxilo o extremo C-terminal de un aminoácido a un grupo amino o extremo W-terminal de otro. La síntesis química de péptidos típicamente comienza en el extremoC-terminal del péptido y termina en el extremo W-terminal. Hay varios métodos para generar péptidos sintéticos que son bien conocidos en el arte.

Según se describe en la presente, el término “aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo” se refiere a aminoácidos en los que el primer átomo de carbono (alfa) del aminoácido incluye un sustituyente de grupo metilo (CH3) unido al carbono alfa. Los aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo incluyen cualquiera de los veinte aminoácidos naturales que incluyen una funcionalización tal.

Según se describe en toda la presente, los aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo pueden reemplazar cualquier aminoácido nativo en un péptido. El término aminoácido "nativo" se refiere a uno de los 20 aminoácidos estándar que existe en las proteínas generadas biológicamente.

La sustitución se refiere al reemplazo de un aminoácido nativo, por ejemplo, con un aminoácido alfa-funcionalizado. Durante la síntesis química de un péptido sintético, el aminoácido nativo puede reemplazarse fácilmente mediante un aminoácido funcionalizado en alfa.

Los péptidos sintéticos que se describen en la presente pueden ser de cualquier longitud, por ejemplo, de cualquier número de aminoácidos de longitud, por ejemplo, entre aproximadamente 5 aminoácidos y aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 10 aminoácidos y aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 20 aminoácidos y aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, entre aproximadamente 30 aminoácidos y aproximadamente 75 aminoácidos de longitud o de aproximadamente 20 aminoácidos, aproximadamente 30 aminoácidos, aproximadamente 40 aminoácidos, aproximadamente 50 aminoácidos, aproximadamente 60 aminoácidos, aproximadamente 70 aminoácidos, aproximadamente 80 aminoácidos, aproximadamente 90 aminoácidos o aproximadamente 100 aminoácidos de longitud.

Determinados péptidos sintéticos lipidados descritos en la presente contienen uno o más aminoácidos alfa-funcionalizados que reemplazan aminoácidos nativos, en tanto conservan por lo menos sustancialmente la misma potencia del receptor, o mayor, que el correspondiente péptido sintético que no comprende las sustituciones. Las mejoras en la resistencia a proteasas y la potencia se pueden asociar con la posición selectiva y estratégica de la lipidación y de los aminoácidos sustituidos por aminoácidos alfa-funcionalizados en el péptido. En determinadas formas de realización, los péptidos sintéticos que conservan por lo menos sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor, o mayores, contienen dos o más aminoácidos alfa-funcionalizados que sustituyen a los aminoácidos nativos. En algunas formas de realización, los péptidos sintéticos que conservan por lo menos sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor, o mayores, contienen tres cuatro, cinco, seis o más aminoácidos alfa-funcionalizados que sustituyen a los aminoácidos nativos.

El término “potencia” del receptor se refiere a la inversa de la mitad (50%) de la concentración máxima eficaz (EC50) del péptido. La CE50 se refiere a la concentración de péptido que induce a una respuesta biológica a la mitad entre la respuesta de línea base y la respuesta máxima, tras un tiempo de exposición específico, para una diana seleccionada del péptido. Por tanto, los péptidos que muestran un valor pequeño para CE50 tienen una potencia de receptor alta correspondiente, mientras que los péptidos que muestran un valor grande para CE50 tienen una potencia de receptor baja correspondiente - cuanto más péptido se requiere para inducir una respuesta relacionada con un receptor, menos potente es el péptido para ese receptor.

En el arte se conocen métodos para determinar la potencia y la EC50 del receptor y convenientemente comprenden determinar la estimulación de una o más respuestas celulares del receptor. Por ejemplo, se generan líneas celulares adecuadas que expresan receptor de GLP-1 (GLP-1R), receptor de glucagón (GCGR) o receptor de péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (polipéptido inhibidor gástrico)(GIPR) mediante métodos convencionales. Activación peptídica de esos diversos receptores da como resultado la producción posterior de un segundo mensajero AMPc que puede medirse en un ensayo de actividad funcional. A partir de estas mediciones, se determinan fácilmente valores de CE50.

Según se describe en toda la presente, los péptidos lipidados que comprenden uno o más, por ejemplo, uno o dos, lípidos o unidades de lípidos unidos y sustitución de aminoácidos nativos por aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo pueden conservar "sustancialmente la misma" potencia del receptor, o mayor, en comparación con un péptido correspondiente que no comprende los lípidos o unidades de lípidos o los aminoácidos no naturales. Según se usa en la presente, "sustancialmente la misma" con referencia a la potencia del receptor, significa que el péptido lipidado puede presentar, por ejemplo, al menos aproximadamente 75% de la potencia del receptor, cuando el péptido lipidado se compara con la potencia del receptor de un péptido correspondiente que no está lipidado o que está no está lipidado y que tiene modificaciones de aminoácidos diferentes y/o de menos aminoácidos, u otra secuencia de comparación adecuada (por ejemplo, un control). En otras formas de realización, un péptido lipidado provisto en la presente puede presentar, por ejemplo, aproximadamente 80% de la potencia del receptor, aproximadamente 85% de la potencia del receptor, aproximadamente 90% de la potencia del receptor, aproximadamente 91% de la potencia del receptor, aproximadamente 92% de la potencia del receptor, aproximadamente 93% de la potencia del receptor, aproximadamente 94% de la potencia del receptor, aproximadamente 95% de la potencia del receptor, aproximadamente 96% de la potencia del receptor, aproximadamente 97% de la potencia del receptor, aproximadamente 98% de la potencia del receptor, aproximadamente 99% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.1% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.2% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.3% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.4% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.5% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.6% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.7% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.8% de la potencia del receptor, aproximadamente 99.9% de la potencia del receptor o aproximadamente 100% de la potencia del receptor, cuando el péptido lipidado se compara con la potencia del receptor de un péptido correspondiente que no está lipidado o que no está lipidado y que tiene una modificación de aminoácidos diferentes y/o de menos aminoácidos, u otra secuencia de comparación adecuada (por ejemplo, un control). Según se usa en la presente, el término "mayor" con referencia a la potencia del receptor, significa que el péptido lipidado presenta una mayor potencia del receptor que es mayor que la potencia del receptor de un péptido correspondiente que no está lipidado o que no está lipidado y que tiene modificaciones de aminoácidos diferentes y/o de menos aminoácidos, u otra secuencia de comparación adecuada (por ejemplo, un control). En determinadas formas de realización, una mayor potencia del receptor se refiere, por ejemplo, a un 1% más de potencia del receptor, 2% más de potencia del receptor, 3% más de potencia del receptor, 4% más de potencia del receptor, 5% más de potencia del receptor, 6% más de potencia del receptor, 7% más de potencia del receptor, 8% más de potencia del receptor, 9% más de potencia del receptor, 10% más de potencia del receptor. En determinadas formas de realización, una mayor potencia del receptor se refiere, por ejemplo, a entre 1% y 10% más de potencia del receptor, entre 1 % y 20% más de potencia del receptor, entre 1% y 30% más de potencia del receptor, entre 1% y 40% más de potencia del receptor, entre 1% y 50% más de potencia del receptor, entre 5% y 10% más de potencia del receptor, entre 5% y 20% más de potencia del receptor, entre 5% y 30% más de potencia del receptor, entre 5% y 40% más de potencia del receptor, entre 5% y 50% más de potencia del receptor, entre 10 y 50% más de potencia del receptor, entre 20 y 50% más de potencia del receptor, entre 30 y 50% más de potencia del receptor, entre 40% y 50% más de potencia del receptor o entre 50% y 100% más de potencia del receptor.

Según se describe en toda la presente, un péptido lipidado provisto en la presente que comprende uno o más, por ejemplo, uno o dos, lípidos o unidades de lípidos unidos y la sustitución de aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo en lugar de aminoácidos nativos también puede conservar por lo menos "sustancialmente la misma selectividad" que un péptido correspondiente que no comprende al lípido o unidad de lípido o aminoácidos no naturales u otra secuencia de comparación adecuada (por ejemplo, un control), como se describe en la presente. Según se usa en la presente, la “selectividad” se refiere a la capacidad de un péptido para unirse a su blanco (por ejemplo, el agonista al que está diseñado para unirse) en tanto no se une a otras proteínas no blanco. Un péptido lipidado provisto en la presente puede presentar "sustancialmente la misma selectividad" y por ende presentar, por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 75% de la selectividad cuando los péptidos lipidados se comparan con la selectividad de péptidos que no comprenden al lípido o la unidad de lípido, u otra secuencia de comparación adecuada (por ejemplo, un control), como se describe en la presente. Por ejemplo, un péptido lipidado provisto en la presente puede presentar aproximadamente 80% de la selectividad, aproximadamente 85% de la selectividad, aproximadamente 90% de la selectividad, aproximadamente 91 % de la selectividad, aproximadamente 92% de la selectividad, aproximadamente 93% de la selectividad, aproximadamente 94% de la selectividad, aproximadamente 95% de la selectividad, aproximadamente 96% de la selectividad, aproximadamente 97% de la selectividad, aproximadamente 98% la selectividad, aproximadamente 99% de la selectividad, aproximadamente 99.1% de la selectividad, aproximadamente 99.2% de la selectividad, aproximadamente 99.3% de la selectividad, aproximadamente 99.4% de la selectividad, aproximadamente 99.5% de la selectividad, aproximadamente 99.6% de la selectividad, aproximadamente 99.7% de la selectividad, aproximadamente 99.8% de la selectividad, aproximadamente 99.9% de la selectividad, o aproximadamente 100% de la selectividad, cuando el péptido lipidado se compara con la selectividad de un péptido correspondiente que no comprende al lípido o la unidad de lípido, u otra secuencia de comparación adecuada (por ejemplo, un control), como se describe en la presente. En determinadas formas de realización, la incorporación selectiva y estratégica de lipidación y/o de aminoácidos con alfa-metilo en análogos de GLP-1 aumenta la potencia del receptor de GLP-1 y por lo tanto, aumenta la selectividad por este receptor.

En determinadas formas de realización, un péptido lipidado provisto en la presente también puede comprender uno o más aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo correspondientes a los aminoácidos nativos que sustituyen en una correspondiente proteína de tipo salvaje. Por ejemplo, el aminoácido en la secuencia peptídica original, de tipo salvaje se puede sustituir con un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo que tiene la misma cadena lateral, por ejemplo, Phe, Trp, Tyr, Ser, Arg, Ala, Val, Leu, His o Lys, se puede sustituir con a-MePhe, a-MeTrp, a-MeTyr, a-MeSer, a-MeArg, a-MeAla (Aib), a-MeVal, a-MeLeu, a-MeHis o a-MeLys, respectivamente.

En determinadas formas de realización, un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo en un péptido lipidado provisto en la presente puede corresponder a la misma clase que los aminoácidos nativos sustituidos. Por ejemplo, los aminoácidos alifáticos nativos se pueden sustituir con aminoácidos alifáticos funcionalizados con alfa-metilo; los aminoácidos con hidroxilo nativos se pueden sustituir con aminoácidos con hidroxilo funcionalizados con alfa-metilo; los aminoácidos que contienen azufre nativos se pueden sustituir con aminoácidos que contienen azufre funcionalizados con alfa-metilo; los aminoácidos cíclicos nativos se pueden sustituir con aminoácidos cíclicos funcionalizados con alfa-metilo; los aminoácidos aromáticos nativos se pueden sustituir con aminoácidos aromático funcionalizados con alfa-metilo; los aminoácidos básicos nativos se pueden sustituir con aminoácidos básicos funcionalizados con alfa-metilo; y/o los aminoácidos ácidos nativos se pueden sustituir con aminoácidos ácidos funcionalizados con alfa-metilo.

En formas de realización adicionales, un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo en un péptido lipidado provisto en la presente no corresponde a los aminoácidos nativos sustituidos.

Las fuentes comerciales de aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo incluyen, por ejemplo, Bachem AG, Suiza.

En determinadas formas de realización, por lo menos un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo en un péptido sintético lipidado descrito en la presente es alfa-metilfenilalanina.

En determinadas formas de realización, los aminoácidos sustituidos funcionalizados con alfa-metilo se seleccionan de histidina funcionalizada con alfa-metilo, alanina funcionalizada con alfa-metilo, isoleucina funcionalizada con alfa-metilo, arginina funcionalizada con alfa-metilo, leucina funcionalizada con alfa-metilo, asparagina funcionalizada con alfa-metilo, lisina funcionalizada con alfa-metilo, ácido aspártico funcionalizado con alfa-metilo, metionina funcionalizada con alfa-metilo, cisteína funcionalizada con alfa-metilo, fenilalanina funcionalizada con alfa-metilo, ácido glutámico funcionalizado con alfametilo, treonina funcionalizada con alfa-metilo, glutamina funcionalizada con alfa-metilo, triptofano funcionalizado con alfametilo, glicina funcionalizada con alfa-metilo, valina funcionalizada con alfa-metilo, ornitina funcionalizada con alfa-metilo, prolina funcionalizada con alfa-metilo, selenocisteína funcionalizada con alfa-metilo, serina funcionalizada con alfa-metilo y tirosina funcionalizada con alfa-metilo.

En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica.

Según se usa en la presente, la “degradación proteolítica” significa la degradación de péptidos para dar péptidos más pequeños o incluso aminoácidos, generalmente causada por la hidrólisis de un enlace peptídico mediante enzimas.

Los péptidos lipidados que son "sustancialmente resistentes" a una degradación proteolítica pueden permanecer, por ejemplo, al menos aproximadamente 50% intactos después de la exposición a una enzima en las condiciones donde dicha enzima generalmente es activa (por ejemplo, condiciones de pH, temperatura y otras condiciones ambientales adecuadas) por un período de tiempo definido. Los péptidos sintéticos proporcionados en la presente son sustancialmente resistentes a la degradación proteolítica durante un periodo de al menos 4 horas, al menos 8 horas, al menos 12 horas, al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, al menos 72 horas, al menos 96 horas, al menos 120 horas, al menos 144 horas, al menos 168 horas, al menos 192 horas, al menos 216 horas, al menos 240 horas, o entre aproximadamente 36 horas y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 48 horas y 240 horas, entre aproximadamente 72 horas y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 96 horas y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 120 horas y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 144 horas y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 168 horas y aproximadamente 240 horas, entre aproximadamente 192 horas y aproximadamente 240 horas o entre aproximadamente 216 horas y aproximadamente 240 horas. En determinadas formas de realización, al menos aproximadamente el 60% de los péptidos sintéticos permanecen intactos tras la exposición a una enzima en condiciones en las que la enzima generalmente es activa por un periodo de tiempo definido, por ejemplo, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, al menos aproximadamente el 99%, al menos aproximadamente el 99.1%, al menos aproximadamente el 99.2%, al menos aproximadamente el 99.3% , al menos aproximadamente el 99.4%, al menos aproximadamente el 99.5%, al menos aproximadamente el 99.6% , al menos aproximadamente el 99.7%, al menos aproximadamente el 99.8%, al menos aproximadamente el 99.9% o al menos aproximadamente el 100% de los péptidos sintéticos permanecen intactos tras la exposición a una enzima en condiciones en las que la enzima generalmente es activa por un periodo de tiempo definido.

Los péptidos lipidados provistos en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por una o más enzimas presentes en el cuerpo de un mamífero, por ejemplo, el cuerpo humano. Por ejemplo, los péptidos lipidados pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por una o más de dipeptidil peptidasa-IV (DPP-IV), neprilisina, a-quimotripsina, plasmina, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y pepsina. En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados pueden ser resistentes a una degradación proteolítica por dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, o preferiblemente todas las enzimas enumeradas. Los péptidos lipidados descritos en la presente también pueden ser sustancialmente resistentes a la degradación proteolítica por otras enzimas conocidas en el arte. En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por enzimas digestivas (gástricas) y/o por enzimas presentes en sangre/suero.

En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por DPP-lV y neprilisina. En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por pepsina, tripsina, a-quimotripsina y elastasa. En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por plasmin, trombina y calicreína. En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por pepsina, tripsina y a-quimotripsina. En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica por pepsina y tripsina, etc.

Según se describe en la presente, inclusive en varias formas de realización provistas aquí, la lipidación de residuos de aminoácidos y/o la sustitución por aminoácidos alfa-funcionalizados de los aminoácidos nativos se puede efectuar en residuos de aminoácidos nativos que se encuentran en sitios susceptibles a un clivaje proteolítico. Es decir, se determina que los residuos de aminoácidos que se sustituyen se encuentran en sitios donde las enzimas proteolíticas son activas en el clivaje de enlaces peptídicos en los péptidos nativos. En el arte se conocen bien métodos para determinar sitios de escisión proteolítica y se describen en la presente.

Se puede preparar cualquier clase de péptido de acuerdo con los métodos provistos en la presente para obtener péptidos lipidados con las características indicadas.

En ejemplos de formas de realización, los péptidos lipidados pueden ser péptidos de la clase de las incretinas. Los ejemplos de péptidos sintéticos de la clase de las incretinas que pueden prepararse tal como se describe en la presente incluyen, pero en un sentido no taxativo, péptidos de tipo glucagón 1 (GLP-1), un péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GIP), un péptido exenatida más glucagón, secretinas, tenomodulina, oxintomodulina, insulina o un péptido intestinal vasoactivo (VIP).

Se pueden preparar clases de péptidos adicionales como se describe en la presente.

En determinadas formas de realización, el péptido lipidado descrito en la presente deriva de la secuencia de GLP-1 y en la presente se denomina análogo del péptido GLP-1 lipidado.

En el arte se conocen bien secuencias de péptidos nativos (naturales) de los diversos péptidos y clases de péptidos descritos en la presente que pueden prepararse para producir péptidos sintéticos con las características mencionadas.

La secuencia de aminoácidos nativa de GLP-1 (7-36) es conocida en el arte, como se muestra a continuación: HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR (SEQ ID NO: 1).

En determinadas formas de realización, se proveen análogos del péptido GLP-1 lipidados que comprenden por lo menos un aminoácido modificado con residuos de lípidos, tal como los que se muestran en la Tabla 1. En determinadas formas de realización, el análogo del péptido GLP-1 lipidado solo contiene un aminoácido modificado con residuos de lípidos. Los análogos del péptido GLP-1 monolipidados que se divulgan en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el péptido monolipidado es sustancialmente resistente a una degradación por DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. Los análogos del péptido GLP-1 monolipidados que se divulgan en la presente pueden conservar sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor, o mayores, que un correspondiente péptido GLP-1 no lipidado o un análogo del péptido GLP-1.

En determinadas formas de realización, el péptido monolipidado está lipidado solo en un residuo K (lisina) o solo en un residuo C (cisteína). Por lo tanto, determinadas formas de realización proveen un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos:

H X2 E G S X6 T S D V X11 X12 X13 L E G E A A X20 E X22 I X24 X25 V V X28 G G (SEQ ID NO: 2);

en donde X2 es A o Aib;

X6 es F o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X11 es S o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X12 es S, un residuo K modificado con lípidos o un residuo C modificado con lípidos;

X13 es Y o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X20 es un residuo K modificado con lípidos, un residuo C modificado con lípidos, K o un aminoácido funcionalizado con alfametilo;

X22 es F o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X24 es A, un residuo K modificado con lípidos o un residuo C modificado con lípidos;

X25 es W o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo; y

X28 es K, E o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo,

en donde el polipéptido solo está lipidado en uno de X12, X20 o X24.

En determinadas formas de realización, un péptido monolipidado comprende una o más sustituciones con ácido aminoisobutírico (Aib). En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2: X2 es Aib.

El residuo K lipidado o C lipidado se puede unir a una variedad de lípidos o unidades de lípidos tales como cualquiera de los que se describen en la presente. Los ejemplos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste en: K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); K(S-YE-palmitoílo); K(S-(pEG)2-(PEG)2-YE-estearato); K(YE-palmitoílo); K(£-(PEG)2-(PEG)2-(pEG)2-estearoílo); K(S-YE-lauroílo); K(S-YE-YE-lauroílo); K(S-YE-YE-YE-lauroílo); K(S-Ahx-lauroílo); K(s-Ahx-Ahx-lauroílo); K(£-Ahx-Ahx-Ahxlauroílo); K(S-(PEG)2-lauroílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-lauroílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-lauroílo); K(£-yE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-YE-YE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-YE-YE-YE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-Ahx-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-Ahx-Ahx-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-(PEG)²-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-(PEG)²-(PEG)²-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(£-(PEG)²-(PEG)²-(PEG)²-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-YE-estearoílo); K(£-yE-yE-estearoílo); K(£-YE-YE-YE-estearoílo); K(S-Ahx-estearoílo); K(S-Ahx-Ahx-estearoílo); K(£-Ahx-Ahx-Ahx-estearoílo); K(£-(PEG)2-estearoílo); K(£-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo); K(£-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo); K(£-YE-estearato); K(£-yE-yE-estearato); K(£-YE-YE-YE-estearato); K(£-Ahx-estearato); K(£-Ahx-Ahx-estearato); K(£-Ahx-Ahx-Ahx-estearato); K(£-(PeG)2-estearato); K(£-(PEG)2-(PEG)2-estearato); K(£-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearato) y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, en determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2: X20 es K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato).

En determinadas formas de realización, el aminoácido funcionalizado con alfa-metilo es a-MeF, a-MeS o a-MeK. En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2: X6 es a-MeF; X11 es a-MeS; X13 es a-MeF; X22 es a-MeF; X25 es a-MeF; y/o X28 es a-MeK. En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2: X6 es a-MeF; X11 es a-MeS; X13 es a-MeF; X22 es a-MeF; X25 es a-MeF; y X28 es a-MeK. En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2: X2 es Aib; X6 es a-MeF; X11 es a-MeS; X13 es a-MeF; X20 es K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); X22 es a-MeF; X25 es a-MeF; y X28 es a-MeK (SEQ ID N°: 3; Tabla 1).

En determinadas formas de realización, el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 48 (Tabla 1), SEQ ID N°: 60 (Tabla 1) o SEQ ID N°: 68 (Tabla 1).

En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, 3, 48, 60 ó 68 es sustancialmente resistente a una degradación proteolítica. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el péptido es sustancialmente resistente a una degradación por DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, 3, 48, 60 ó 68 conserva por lo menos sustancialmente la misma potencia del receptor o presenta una mayor potencia del receptor en comparación con un correspondiente péptido no lipidado. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 2, 3, 48, 60 ó 68 conserva por lo menos sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor o presenta una mayor potencia y selectividad del receptor en comparación con un correspondiente péptido no lipidado.

TABLA 1: Secuencias de péptidos sustituidos y monolipidados

En determinadas formas de realización, se proveen análogos del péptido GLP-1 lipidados que comprenden por lo menos dos aminoácidos modificados con residuos de lípidos, tal como los que se muestran en la Tabla 2. En determinadas formas de realización, los análogos del péptido GLP-1 lipidados contienen dos residuos de aminoácidos lipidados. Los análogos del péptido GLP-1 bilipidados que se divulgan en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el péptido bilipidado es sustancialmente resistente a una degradación por DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. Los análogos del péptido GLP-1 bilipidados que se divulgan en la presente pueden conservar sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor, o mayores, que un correspondiente péptido GLP-1 no lipidado o un análogo del péptido GLP-1. Un péptido bilipidado es un péptido modificado con lípidos en dos residuos de aminoácidos. En determinadas formas de realización, esto puede ser en dos residuos K (lisina), en dos residuos C (cisteína) o en un residuo K y un residuo C en el mismo péptido. En determinadas formas de realización, hay dos residuos K modificados con lípidos. Por lo tanto, determinadas formas de realización proveen un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos:

H X2 E G X5 X6 T S D X10 X11 X12 X13 X14 E G X17 A A X20 E X22 I X24 X25 X26

V X28 G X30 (SEQ ID NO: 4);

en donde X2 es A o Aib;

X5 es T o S;

X6 es F o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X10 es V o un residuo K modificado con lípidos;

X11 es S o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X12 es S o un residuo K modificado con lípidos;

X13 es Y, F o un residuo K modificado con lípidos;

X14 es L o un residuo K modificado con lípidos;

X17 es Q o E;

X20 es K, E o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X22 es F, norleucina, tirosina metiléster o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X24 es A o un residuo K modificado con lípidos;

X25 es W, F o un residuo K modificado con lípidos;

X26 es L, V o un residuo K modificado con lípidos;

X28 es K o E; y

X30 es R o G,

en donde el polipéptido comprende dos residuos K modificados con lípidos, y en donde uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos.

En determinadas formas de realización, un péptido bilipidado comprende una o más sustituciones con ácido aminoisobutírico (Aib). En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4: X2 es Aib. En determinadas formas de realización, un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo es uno de a-MeF, a-MeS o a-MeK.

Los residuos K modificados con lípidos se pueden unir a una variedad de lípidos o unidades de lípidos tales como cualquiera de los que se describen en la presente. Como ejemplo incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste en: K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); y cualquier combinación de los mismos. Las modificaciones con lípidos de los residuos K pueden ser iguales o diferentes. En determinadas formas de realización, son iguales. Por consiguiente, en determinadas formas de realización, por lo menos dos residuos K modificados con lípidos pueden ser ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo); pueden ser ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); pueden ser ambos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); pueden ser ambos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); pueden ser ambos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo); o pueden ser ambos K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato). En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4: donde ambos residuos modificados pueden ser K(£-(p Eg )2-(PEG)2-YE-lauroílo); ambos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); ambos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-yE-miristoílo); ambos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); ambos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo); o ambos pueden ser K(£-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato).

En determinadas formas de realización, la modificación con lípidos de aminoácidos de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4 tiene lugar en dos regiones distintas: un aminoácido en la posición X10, X12, X13 o X14 que es un residuo K modificado con lípidos y otro aminoácido en la posición X24, X25 o X26 que es un residuo K modificado con lípidos. Por ende, en determinadas formas de realización:

X10 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos;

X12 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos;

X13 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos;

X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos;

X24 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos;

X25 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos; o

X26 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos.

El número, la posición y la identidad de un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo en un polipéptido bilipidado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4 pueden variar. En determinadas formas de realización, la posición X6 es a-MeF; X11 es a-MeS; X20 es a-MeK; y/o X22 es a-MeF. En determinadas formas de realización, X6 es a-MeF. En determinadas formas de realización, X6 es a-MeF y X11 es a-MeS. En determinadas formas de realización, X6 es a-MeF y X20 es a-MeK. En determinadas formas de realización, X6 es a-MeF, X11 es a-MeS, X20 es a-MeK y X22 es a-MeF.

En determinadas formas de realización, el número, la posición y la identidad de un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo en un polipéptido bilipidado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4 pueden variar junto con la posición de los residuos de aminoácidos modificados con lípidos. En determinadas formas de realización donde X13 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos, X6 es a-MeF y X11 es a MeS. En determinadas formas de realización donde X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, x 25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos, X6 es a-MeF y X11 es a-MeS.

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos derivada de GLP-1 de la SEQ ID N°: 4, se puede sustituir uno o más aminoácidos de la secuencia GLP-1 de tipo salvaje con otro aminoácido natural. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el residuo T de tipo salvaje en la posición X5 está sustituido con S. En determinadas formas de realización, los residuos de tipo salvaje Q, K y R en las posiciones X17, X28 y X30, respectivamente, se pueden sustituir con E, E y G, respectivamente.

En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4; el péptido comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 252 (Tabla 2); SEQ ID N°: 263 (Tabla 2); SEQ ID N°: 269 (Tabla 2); SEQ ID N°: 405 (Tabla 2); SEQ ID N°: 408 (Tabla 2); SEQ ID N°: 409 (Tabla 2); o SEQ ID N°: 410 (Tabla 2).

En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4, 252, 263, 269, 405, 408, 409 ó 410 es sustancialmente resistente a una degradación proteolítica. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el péptido es sustancialmente resistente a una degradación por DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID N°: 4, 252, 263, 269, 405, 408, 409 ó 410 conserva por lo menos sustancialmente la misma potencia del receptor en comparación con un correspondiente péptido no lipidado. En determinadas formas de realización, un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 4, 252, 263, 269, 405, 408, 409 ó 410 conserva por lo menos sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor en comparación con un correspondiente péptido no lipidado.

TABLA 2: Secuencias de péptidos bilipidados

En determinadas formas de realización, se proveen análogos del péptido GLP-1 lipidados que comprenden por lo menos tres aminoácidos modificados con residuos de lípidos, tal como los que se muestran en la Tabla 3. En determinadas formas de realización, los análogos del péptido GLP-1 lipidados contienen tres residuos de aminoácidos lipidados. Los análogos del péptido GLP-1 trilipidados que se divulgan en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica. Por ejemplo, en determinadas formas de realización, el péptido trilipidado es sustancialmente resistente a una degradación por DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y/o pepsina. Los análogos del péptido GLP-1 trilipidados que se divulgan en la presente pueden conservar sustancialmente la misma potencia y selectividad del receptor, o mayores, que un correspondiente péptido GLP-1 no lipidado o un análogo del péptido GLP-1.

Un péptido trilipidado es un péptido modificado con lípidos en tres residuos de aminoácidos. En determinadas formas de realización, esto puede ser en tres residuos K (lisina), en tres residuos C (cisteína) o en un residuo K, un residuo C y un tercer residuo K o C en el mismo péptido. En determinadas formas de realización, hay tres residuos K modificados con lípidos. Por lo tanto, determinadas formas de realización proveen un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos:

H (Aib) E G S (a-MeF) T S D X10 X11 X12 X13 X14 E X16 X17 X18 A (a-MeK) X21 F I X24 X25 X26 V E G G (SEQ ID NO: 487);

en donde X10 es V o un residuo K modificado con lípidos;

X11 es S o un aminoácido funcionalizado con alfa-metilo;

X12 es S o un residuo K modificado con lípidos;

X13 es Y o un residuo K modificado con lípidos;

X14 es L o un residuo K modificado con lípidos;

X16 es G o un residuo K modificado con lípidos;

X17 es E o un residuo K modificado con lípidos;

X18 es A o un residuo K modificado con lípidos;

X21 es E o un residuo K modificado con lípidos;

X24 es A o un residuo K modificado con lípidos;

X25 es F o un residuo K modificado con lípidos;

X26 es V o un residuo K modificado con lípidos; y

en donde el polipéptido comprende tres residuos K modificados con lípidos, y en donde uno de X10, X12, X13 o X14 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X16, X17, X18 o X21 es un residuo K modificado con lípidos y uno de X24, X25 o X26 es un residuo K modificado con lípidos.

Los residuos K modificados con lípidos se pueden unir a una variedad de lípidos o unidades de lípidos tales como cualquiera de los que se describen en la presente. Como ejemplo incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste en: K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); y cualquier combinación de los mismos. Las modificaciones con lípidos de los residuos K pueden ser iguales o diferentes. En determinadas formas de realización, son iguales. Por lo tanto, en determinadas formas de realización, por lo menos tres residuos K modificados con lípidos pueden ser todos K(S-(PEG)2-(pEG)2-YE-lauroílo); pueden ser todos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); pueden ser todos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); pueden ser todos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); pueden ser todos K(S-(PEG)2-(PEG)2-yE-estearoílo); o pueden ser todos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato). En determinadas formas de realización de un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 487: todos los residuos modificados pueden ser K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo); todos pueden ser K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitato); todos pueden ser K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo); todos pueden ser K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo); todos pueden ser K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo); o todos pueden ser K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato).

TABLA 3: Secuencias de péptidos trilipidados

El extremo C-terminal de un péptido en general es ya sea un ácido carboxílico libre o una amida libre. Por lo tanto, en determinados aspectos, cualquiera de los péptidos de las Tablas 1, 2 y 3 pueden tener ya sea un ácido C-terminal o una amida C-terminal. En determinados aspectos, cualquiera de los péptidos de las T ablas 1,2 y 3 comprende un ácido C-terminal. En determinados aspectos, cualquiera de los péptidos de las Tablas 1,2 y 3 comprende una amida C-terminal.

Los conectores usados en varios polipéptidos provistos en la presente pueden facilitar la formación de una estructura. En algunos aspectos, un conector polipeptídico puede comprender 1-50 aminoácidos, 1-25 aminoácidos, 25-50 aminoácidos o 30-50 aminoácidos. En general, los conectores más largos se correlacionan con una mayor actividad (más flexible), pero también disminuye la estabilidad ya que el péptido se vuelve más expuesto. Los conectores pueden comprender, por ejemplo, residuos (Gly-Ser)n, donde n es un número entero entre por lo menos uno y hasta, por ejemplo, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 o más, opcionalmente con algunos residuos Glu o Lys dispersos en toda la extensión para aumentar la solubilidad. Como alternativa, algunos conectores no comprenden ningún residuo serina, por ejemplo, cuando el conector es sometido a una glicosilación O-ligada. En algunos aspectos, los conectores pueden contener residuos cisteína, por ejemplo, si se emplea dimerización de conectores para llevar dos o más polipéptidos agonistas a una configuración dimérica. En algunos aspectos, un polipéptido agonista puede comprender por lo menos uno, dos, tres, cuatro o más conectores. La longitud y la secuencia de aminoácidos de un conector pueden seleccionarse y optimizarse fácilmente.

Métodos de preparación de péptidos lipidados

Si bien se conocen varios métodos para unir lípidos y unidades de lípidos a péptidos, en la presente se provee por lo menos un método representativo para preparar péptidos lipidados.

En determinadas formas de realización, los péptidos lipidados se pueden preparar como carboxamidas C-terminales, tal como sobre una resina NovaSyn® TGR. En determinadas formas de realización, se pueden acoplar aminoácidos (tanto naturales como no naturales) a temperatura ambiente, tal como usando HCTU/DIPEA en NMP, protección de una funcionalidad residual con una solución de anhídrido acético y piridina. En dichos métodos, se puede desbloquear el grupo N-Fmoc usando piperidina en DMF (20% v/v) a temperatura ambiente y el residuo C-terminal se incorpora como la forma protegida con N-Boc, por ejemplo Boc-His(Trt)-OH o Boc-Tyr(tBu)-OH o un equivalente del mismo. Se puede incorporar Fmoc-Lys(Mmt)-OH en una o más posiciones de lipidación del esqueleto del péptido durante en ensamblaje automático y una vez completado se pueden eliminar los grupos protectores Mmt manual y selectivamente mediante tratamiento de la resina de síntesis con 1% de TFA, 2% de TIPS, DCM (10 x 1 minuto, 20.0 ml/g). La resina ácida se puede neutralizar, tal como con 5% de DIPEA/NMP, y las funciones amino de la lisina se pueden acilar, PEGilar o lipidar, según necesidad, antes del clivaje del péptido.

Los péptidos crudos se pueden clivar del soporte de resina mediante tratamiento con un cóctel de clivaje adecuado. En determinadas formas de realización, el cóctel consiste en TFA (95% v/v), TIPS (2.5% v/v) y agua (2.5% v/v) con agitación (3 x 1 hora a temperatura ambiente). Las alícuotas de clivaje se pueden combinar, concentrar mediante evaporación rotatoria y precipitar por adición de éter dietílico frío, con aislamiento de los sólidos mediante centrifugación. Los péptidos crudos se pueden secar bajo flujo de nitrógeno seco, reconstituir en una solución amortiguadora acuosa adecuada y filtrar antes de la purificación cromatográfica.

Se pueden disolver los péptidos monolipidados crudos en una solución de ácido acético/acetonitrile/agua (1:5:50 v/v) y luego se pueden filtrar. Los filtrados crudos se pueden someter a cromatografía, tal como sobre una fase estacionaria Agilent Polaris C8-A (21.2 x 250 mm, 5 micrones), eluída con un gradiente de solvente lineal de 10-70%, 15-80% o 20-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 minutos usando un sistema de bombas binario Varian SD-1 PrepStar, con monitoreo por absorción UV a 210 nm. Después, las fracciones que contienen péptidos se pueden agrupar, congelar (hielo seco/acetona) y liofilizar.

Los péptidos bilipidados crudos se pueden disolver, tal como en solución de bicarbonato de amonio 0.1 M (1:5 acetonitrilo/agua v/v, pH 8.0) y filtrar. Los filtrados crudos se pueden someter a cromatografía, tal como sobre una fase estacionaria Waters X-Bridge C18 (19.0 x 250 mm, 5 micrones), eluída con un gradiente de solvente lineal de 20-90% de B contra A durante 30 minutos usando un sistema de bombas binario Varian SD-1 PrepStar, con monitoreo por absorción UV a 210 nm. (A = bicarbonato de amonio 0.1 M en agua, B = bicarbonato de amonio 0.1 M en agua/acetonitrilo 1:2). Después, las fracciones que contienen péptidos se pueden agrupar, congelar (hielo seco/acetona) y liofilizar.

La secuencia del péptido puede ser una secuencia de un análogo GLP-1 como las que se divulgan en las Tablas 1 y 2. El lípido o la unidad de lípido puede ser cualquiera de los que se divulgan en la presente, inclusive, pero en un sentido no taxativo: K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); K(S-YE-palmitoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearato); K(YE-palmitoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo); K(S-YE-lauroílo); K(S-YE-YE-lauroílo); K(S-YE-YE-YE-lauroílo); K(S-Ahx-lauroílo); K(S-Ahx-Ahxlauroílo); K(S-Ahx-Ahx-Ahx-lauroílo); K(S-(PEG)2-lauroílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-lauroílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-lauroílo); K(S-YE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-YE-YE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-yE-yE-yE-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-Ahx-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-Ahx-Ahx-Ahx-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-(PEG)2-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-(PEG)2-(PeG)2-(PEG)2-12-(4-carboxifenoxi)dodecanoílo); K(S-YE-estearoíio); K(S-yE-yE-estearoílo); K(S-YE-YE-YE-estearoílo); K(S-Ahx-estearoílo); K(S-Ahx-Ahx-estearoílo); K(S-Ahx-Ahx-Ahx-estearoílo); K(S-(PEG)2-estearoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo); K(S-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearoílo); K(S-YE-estearato); K(S-yE-yE-estearato); K(S-YE-YE-YE-estearato); K(S-Ahx-estearato); K(S-Ahx-Ahx-estearato); K(S-Ahx-Ahx-Ahx-estearato); K(S-(PeG)2-estearato); K(S-(PEG)2-(PEG)2-estearato); K(S-(PEG)2-(PEG)2-(PEG)2-estearato) y cualquier combinación de los mismos.

Métodos de preparación de péptidos sintéticos

También se proveen métodos para preparar péptidos sintéticos.

En algunas formas de realización, los métodos preferiblemente comprenden identificar por lo menos un residuo de aminoácido nativo en el péptido para la sustitución. En otras formas de realización, los métodos comprenden de manera adecuada identificar al menos dos residuos de aminoácidos nativos en el péptido para sustitución. Luego se pueden sustituir residuos de aminoácidos nativos identificados por los aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo.

Según se describe en toda la presente, los péptidos sintéticos preparados mediante los métodos provistos en la presente preferiblemente conservan sustancialmente la misma potencia, o mayor, del receptor y en algunos casos la selectividad que un péptido correspondiente sintético que no comprende las sustituciones. Además, los péptidos sintéticos preparados según los métodos descritos en la presente también pueden ser sustancialmente resistentes a la degradación proteolítica.

Preferiblemente, en los métodos proporcionados en la presente, los aminoácidos sustituidos funcionalizados con alfa-metilo corresponden a los residuos de aminoácidos nativos sustituidos y en formas de realización adicionales, los aminoácidos sustituidos funcionalizados con alfa-metilo corresponden a la misma clase que los residuos de aminoácidos nativos sustituidos.

En otras formas de realización, los aminoácidos sustituidos funcionalizados con alfa-metilo pueden ser fenilalanina alfa-metilo. En formas de realización a modo de ejemplo, se sustituyen aminoácidos nativos correspondientes por alfa-metil-fenilalanina, aunque en formas de realización adicionales de los métodos, no es necesario que la alfa-metil-fenilalanina corresponda a los mismos aminoácidos nativos para los que se produce la sustitución.

En determinadas formas de realización, los péptidos sintéticos preparados de acuerdo con los métodos que se describen en la presente pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación con una o más de DPP-IV, neprilisina, a-quimotripsina, plasmin, trombina, calicreína, tripsina, elastasa y pepsina.

En las formas de realización, los péptidos sintéticos se pueden preparar como carboxamidas C-terminales sobre una resina NOVASYN® TGR. Los aminoácidos (tanto naturales como no naturales) preferiblemente se pueden acoplar a temperatura ambiente usando HCTU/DIPEA en NMP, con protección de la funcionalidad residual con una solución de anhídrido acético y piridina. Se desbloquea Fmoc de manera adecuada utilizando piperidina en DMF a temperatura ambiente.

Según se describe en la presente, la identificación de al menos un residuo de aminoácido nativo en el péptido para la sustitución comprende preferiblemente aminoácidos en sitios susceptibles de clivaje enzimático. En el arte se conocen bien métodos a modo de ejemplo de identificación de aminoácidos en sitios susceptibles de escisión enzimática. En determinadas formas de realización, los métodos de identificación de aminoácidos en sitios susceptibles al clivaje enzimático preferiblemente comprenden exponer un péptido natural (por ejemplo, un péptido de tipo salvaje) a una enzima individual en condiciones en las que la enzima es activa (por ejemplo, pH adecuado, condiciones de la solución amortiguadora, temperatura, etc.) por un tiempo predeterminado y medir los productos de degradación enzimática del péptido. Los métodos a modo de ejemplo para medir los productos de degradación enzimática incluyen, por ejemplo, cromatografía líquida de fase inversa - espectrometría de masas.

Las soluciones de péptidos se pueden agregar a soluciones de una proteasa. El péptido y la enzima se pueden coincubar, con preferencia a 37 °C aproximadamente. Se pueden retirar alícuotas de la mezcla incubada de péptido-enzima periódicamente, neutralizar para detener la actividad proteolítica y analizar mediante cromatografía líquida-espectrometría de masa (LC/MS). Los analitos se pueden detectar tanto mediante absorción UV (por ejemplo, a 210 nm) como mediante ionización usando un detector de masas (modo ESI+). Las especies peptídicas (fragmentos) que derivan del clivaje enzimático de los péptidos se pueden analizar después del proceso, y sus masas moleculares se pueden utilizar para identificar la posición precisa del clivaje (en cada caso resaltando el enlace sésil).

En determinadas formas de realización, los métodos que se describen en la presente se pueden utilizar para preparar cualquier clase de péptido que presente las características indicadas.

En determinadas formas de realización, los métodos se pueden usar para preparar péptidos de la clase de las incretinas. Los péptidos sintéticos de la clase de las incretinas que pueden prepararse tal como se describe en la presente incluyen, pero en un sentido no taxativo, un péptido de tipo glucagón 1 (GLP-1), un péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (GlP), un péptido exenatida más glucagón, secretinas, tenomodulina y oxintomodulina.

En otras formas de realización, los métodos se pueden usar para preparar péptidos GLP-1 sintéticos. En otras formas de realización, los métodos se pueden usar para preparar insulina sintética.

En otras formas de realización, se proveen métodos para preparar un péptido proteolíticamente estable. Preferiblemente, tales métodos comprenden exponer un péptido a una o más proteasas, identificar al menos dos residuos de aminoácidos nativos que son sitios susceptibles de escisión proteolítica y sustituir los residuos de aminoácidos identificados por aminoácidos funcionalizados con alfa-metilo.

Según se describe en toda la presente, preferiblemente dichos métodos proveen un péptido sintético que conserva sustancialmente la misma potencia o presenta una mayor potencia del receptor y en algunos casos también la selectividad que un péptido sintético correspondiente que no comprende una o más sustituciones. En formas de realización adicionales, los métodos también proporcionan un péptido sintético que es sustancialmente resistente a la degradación proteolítica.

En aún otras formas de realización, los aminoácidos sustituidos funcionalizados con alfa-metilo se pueden seleccionar entre histidina funcionalizada con alfa-metilo, alanina funcionalizada con alfa-metilo, isoleucina funcionalizada con alfa-metilo, arginina funcionalizada con alfa-metilo, leucina funcionalizada con alfa-metilo, asparagina funcionalizada con alfa-metilo, lisina funcionalizada con alfa-metilo, ácido aspártico funcionalizado con alfa-metilo, metionina funcionalizada con alfa-metilo, cisteína funcionalizada con alfa-metilo, fenilalanina funcionalizada con alfa-metilo, ácido glutámico funcionalizado con alfametilo, treonina funcionalizada con alfa-metilo, glutamina funcionalizada con alfa-metilo, triptofano funcionalizado con alfametilo, glicina funcionalizada con alfa-metilo, valina funcionalizada con alfa-metilo, ornitina funcionalizada con alfa-metilo, prolina funcionalizada con alfa-metilo, selenocisteína funcionalizada con alfa-metilo, serina funcionalizada con alfa-metilo y tirosina funcionalizada con alfa-metilo.

En otras formas de realización, los aminoácidos sustituidos funcionalizados con alfa-metilo pueden ser fenilalanina alfa-metilo y/o lisina alfa-metilo. En ejemplos de formas de realización, los aminoácidos nativos correspondientes se sustituyen por alfametil-fenilalanina y/o alfa-metil-lisina, aunque en formas de realización adicionales de los métodos, no es necesario que la alfa-metil-fenilalanina y/o alfa-metil-lisina correspondan a los mismos aminoácidos nativos donde se produce la sustitución.

Formulaciones que comprenden péptidos lipidados

También se proveen formulaciones (o composiciones farmacéuticas) que comprenden un péptido lipidado descrito en la presente. Preferiblemente, tales formulaciones comprenden un péptido lipidado tal como se describe en la presente y un vehículo. Tales formulaciones se pueden administrar fácilmente en los diferentes métodos descritos a lo largo de todo el documento. En algunas formas de realización, la formulación comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a uno o más materiales no tóxicos que no interfieren con la eficacia de la actividad biológica de los péptidos lipidados. El término “vehículo” denota un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el péptido lipidado para facilitar la aplicación.

Las formulaciones descritas en la presente se pueden formular para una dosificación particular. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima. Puede ser útil formular las composiciones parenterales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y lograr una mayor uniformidad de dosificación. Las formas de dosificación unitarias utilizadas en la presente se refieren a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de un péptido lipidado calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones de las formas de dosificación unitarias están dictadas por, y dependen directamente de, (a) las características únicas del péptido lipidados y el efecto terapéutico particular que se desea alcanzar y (b) las limitaciones inherentes del arte de conformar un péptido lipidado de este tipo.

Las formulaciones descritas en la presente pueden formularse para rutas de administración particulares, tales como una administración oral, nasal, pulmonar, tópica (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones preferiblemente se pueden presentar como formas de dosificación unitarias y se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en el campo farmacéutico. La cantidad de péptidos lipidados que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del sujeto a tratar y el modo de administración particular. La cantidad de péptidos lipidados que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de dosificación individual en general será aquella cantidad de la composición que produzca un efecto terapéutico.

Métodos de tratamiento utilizando péptidos lipidados

En la presente también se proveen métodos de tratamiento de un paciente que comprende administrar un péptido lipidado, por ejemplo, las formulaciones, que se describen en la presente a un sujeto que lo necesita.

Preferiblemente, los, sujetos a los que se les pueden administrar los péptidos lipidados en los diversos métodos que se describen en la presente son mamíferos, tales como, por ejemplo, seres humanos, perros, gatos, primates, ganado vacuno, ovejas, caballos, cerdos, etc.

Los métodos mediante los cuales pueden administrarse los péptidos lipidados al sujeto en cualquiera de los diversos métodos descritos en la presente incluyen, pero en un sentido no taxativo, la administración por vía intravenosa(IV), intratumoral (IT), intralesión (IL), por aerosol, percutánea, oral, endoscópica, tópica, intramuscular (IM), intradérmica (ID), intraocular (IO), intraperitoneal (IP), transdérmica (TD), intranasal (IN), intracerebral (IC), intraórganos (por ejemplo, intrahepática) mediante implantes de liberación lenta o subcutánea, o mediante la administración utilizando una bomba osmótica o mecánica.

Preferiblemente, los péptidos lipidados se pueden administrar tan pronto como sea posible después de un diagnóstico adecuado, por ejemplo, en el transcurso de horas o días.

Según se describe en la presente, los diferentes métodos se llevan a cabo preferentemente en sujetos mamíferos humanos, incluidoss adultos de todas las edades y niños.

En determinadas formas de realización, los métodos de tratamiento comprenden tratar a un sujeto (también denominado paciente en la presente) diagnosticado con diabetes que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido lipidado adecuado descrito en la presente, preferiblemente un péptido GLP-1 lipidado descrito en la presente.

Según se usa en la presente, el término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a la cantidad de un péptido lipidado, o formulación, que es suficiente para reducir la gravedad de una enfermedad o trastorno (o uno o más síntomas del mismo), mejorar uno o más síntomas de tal enfermedad o trastorno, prevenir el avance de tal enfermedad o trastorno provocar, la regresión de tal enfermedad o trastorno, o potenciar o mejorar el/los efecto(s) terapéutico(s) de otra terapia. En algunas formas de realización, la cantidad terapéuticamente eficaz no se puede especificar por adelantado y puede ser determinada por un cuidador, por ejemplo, por un médico u otro profesional sanitario, utilizando varios medios, por ejemplo, la titulación de la dosis.

En las formas de realización, se proveen métodos de tratamiento de un paciente diagnosticado con diabetes que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de insulina lipidada a un paciente.

Según se describe en la presente, en determinadas formas de realización los métodos de administración de los péptidos lipidados o de las formulaciones que se describen en la presente puede comprender un suministro por vía oral. Según se describe en la presente, péptidos lipidados pueden ser sustancialmente resistentes a una degradación proteolítica, por ejemplo, una degradación por las enzimas en el estómago después de una administración oral.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis química y evaluación de los péptidos lipidados resistentes a una proteólisis

1. Introducción

A continuación se proveen ejemplos de métodos para preparar los péptidos resistentes a proteólisis que se describen en la presente.

2. Abreviaturas

Boc, ferc-butiloxicarbonilo; DCM, DIPEA, W,W-diisopropiletilamina; DMF, W,W-dimetilformamida; DMSO, dimetilsulfóxido; EK, enteroquinasa; ESI, ionización por electroatomización; Fmoc, 9-fluoroenilmetiloxicarbonilo; GIP, polipéptido inhibidor gástrico; GLP-1, péptido de tipo glucagón -1; HCTU, hexafluorofosfato de 0-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio; RP-HPLC, cromatografía líquida de alta presión de fase inversa; EC50, concentración eficaz medio (50%) máxima; LC/MS, espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida; MeCN, acetonitrilo; Mmt, 4-metoxitritilo; n Mp , W-metilpirrolidinona; Pbf, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo; PBS, solución amortiguadora salina con fosfato; ‘Bu, butilo terciario; TFA, ácido trifluoroacético; TIS, triisopropilsilano; Tris, tris(hidroximetil)aminometano; Trt, trifenilmetilo; UV, ultravioleta.

3. Sección experimental

3.1. Síntesis de péptidos

3.1.1. Materiales

Se obtuvieron W-a-Fmoc-L-aminoácidos de Bachem AG (Suiza). Los aminoácidos no naturales se obtuvieron de Iris Biotech AG (Alemania), preparados por Pharmaron (China) o Peptech Corporation (EEUU). Se obtuvieron las resinas de síntesis NOVASYN® t Gr (TentaGel Rink) y NOVASYN® TGA (TentaGel Wang) de Novabiochem, Merck Biosciences (Alemania). Los péptidos se prepararon mediante síntesis automatizada (PTI Prelude) usando el protocolo Fmoc/‘Bu. Se incorporaron asparagina (Asn) y glutamina (Gln) como sus derivados de tritilo (Trt) de cadena lateral. Se incorporaron triptófano (Trp) y lisina (Lys) como sus derivados de Boc de cadena lateral. Se incorporaron serina (Ser), treonina (Thr) y tirosina (Tyr) como éteres de ‘Bu de cadena lateral, y aspartato (Asp) y glutamato (Glu) como sus ésteres de 0 ‘Bu de cadena lateral. Se incorporó arginina (Arg) como su derivado Pbf de cadena lateral. Se obtuvieron reactivos de síntesis de Sigma-Aldrich, Dorset, Reino Unido. Se obtuvieron disolventes de Merck, Darmstadt, Alemania en la calidad más alta disponible y se usaron sin purificación adicional.

3.1.2. Síntesis química de péptidos lipidados que contienen aminoácidos con a-metilo

A menos que se defina de otra manera, los péptidos se prepararon como carboxamidas C-terminales sobre una resina NovaSyn® TGR (sustitución inicial de 0.24 mmol/g). Los aminoácidos (tanto naturales como no naturales) se acoplaron a temperatura ambiente usando HCTU/DIPEA en NMP, con protección de la funcionalidad residual con una solución de anhídrido acético y piridina. El grupo W-Fmoc se desbloqueó usando piperidina en DMF (20% v/v) a temperatura ambiente. El residuo C-terminal se incorporó como la forma protegida con N-Boc, por ejemplo Boc-His(Trt)-OH o Boc-Tyr(tBu)-OH o un equivalente. Se puede incorporar Fmoc-L-Lys(Mmt)-OH en una o más posiciones de lipidación del esqueleto del péptido durante en ensamblaje automático y una vez completado se pueden eliminar los grupos protectores Mmt manualmente mediante tratamiento de la resina de síntesis con 1% de TFA, 2% de TIPS, DCM (10 x 1 minuto, 20.0 ml/g). La resina ácida se neutraliza con 5% de DIPEA/NMP, y las funciones amino de la lisina se pueden acilar, PEGilar o lipidar, según necesidad, antes del clivaje del péptido.

3.1.3. Clivaje de los péptidos lipidados

Los péptidos crudos se clivaron del soporte de resina mediante tratamiento con un cóctel que consiste en TFA (95% v/v), TIPS (2.5% v/v), agua (2.5% v/v) con agitación (3 x 1 hora a temperatura ambiente). Las alícuotas de clivaje se combinaron, se concentraron mediante evaporación rotatoria y se precipitaron mediante adición de éter dietílico frío, aislando los sólidos mediante centrifugación. Los péptidos crudos se secaron bajo flujo de nitrógeno seco, se reconstituyeron en una solución amortiguadora adecuada y se filtraron antes de la purificación cromatográfica.

3.1.4. Purificación de péptidos monolipidados crudos

Se disolvieron péptidos monolipidados crudos en una solución de ácido acético/acetonitrilo/agua (1:5:50 v/v) y luego se filtraron. Los filtrados crudos fueron sometidos a cromatografía sobre una fase estacionaria Agilent Polaris C8-A (21.2 x 250 mm, 5 micrones), eluída con un gradiente de solvente lineal de 10-70%, 15-80% o 20-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 minutos usando un sistema de bombas binario Varian SD-1 PrepStar, con monitoreo por absorción UV a 210 nm. Se agruparon las fracciones que contienen péptidos, se congelaron (hielo seco/acetona) y se liofilizaron.

3.1.5. Purificación de péptidos bilipidados crudos

Los péptidos bilipidados crudos se disolvieron en solución de bicarbonato de amonio 0.1 M (1:5 acetonitrilo/agua v/v, pH 8.0) y se filtraron. Los filtrados crudos fueron sometidos a cromatografía sobre una fase estacionaria Waters X-Bridge C18 (19.0 x 250 mm, 5 micrones), eluída con un gradiente de solvente lineal de 20-90% de B contra A durante 30 minutos usando un sistema de bombas binario Varian SD-1 PrepStar, con monitoreo por absorción UV a 210 nm. (A = bicarbonato de amonio 0.1 M en agua, B = bicarbonato de amonio 0.1 M en agua/acetonitrilo 1:2). Se agruparon las fracciones que contienen péptidos, se congelaron (hielo seco/acetona) y se liofilizaron.

3.1.6. Análisis y caracterización de los péptidos

Los péptidos purificados se caracterizaron mediante LC/MS simple cuadrupolo usando una plataforma Waters Mass Lynx 3100. Los analitos fueron sometidos a cromatografía con elución sobre una fase estacionaria Waters X-Bridge C18 (4.6 x 100 mm, 3 micrones) usando un gradiente binario lineal del 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 10 minutos a 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente. Los analitos se detectaron tanto mediante absorción UV a 210 nm como mediante ionización usando un detector de masas Waters 3100 (modo ESI+), verificando las masas moleculares contra los valores teóricos calculados. Los espectros analíticos de la RP-HPLC se registraron usando un sistema de gradiente binario Agilent 1260 Infinity. Los analitos fueron sometidos a cromatografía mediante elución sobre una fase estacionaria Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) a 1.5 ml min-1 con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (al 0.1% de TFA v/v) durante 15 minutos a 40 °C.

3.2. Evaluación de la resistencia proteolítica de los péptidos que contienen residuos a-metilo

En la Tabla 3 se enumeran varias proteasas circulatorias y digestivas disponibles comercialmente que pueden contribuir en la inactivación de hormonas peptídicas endógenas, por ejemplo, GLP-1 por hidrólisis en numerosos sitios de ligandos no modificados. Se incubaron varias de estas proteasas con piptidos nativos y con sus contrapartes modificadas que contienen aminoácidos a-metilo en sitios expuestos conocidos como se describe aquv.

Tabla 3: Proteasas purificadas disponibles comercialmente

3.3. Preparación de soluciones madre de péptidos y proteasas

Neprilisina: Se reconstituyeron 10.0 |jg (~10 unidades) de neprilisina recombinante (R&D Systems: 1182-ZNC-010) a 100 |jl (100 jg/ml, ~100 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, NaCI 50 mM, NaHCO350 mM, ajustada a pH 8.3) para dar la solución madre de enzimas. Para la evaluación de los péptidos no lipidados, se incubaron 10 j l (1 jg , ~1 unidad) de solución madre de neprilisina con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~01:33:00. Para la evaluación de los péptidos lipidados, se incubaron 100 j l (10 jg , ~10 unidades) de solución madre de neprilisina con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~01:2.5:00.

Pepsina: La pepsina pancreática porcina liofilizada (Sigma: P7012) se reconstituyó para obtener una solución de 200 jg/ml (~500 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (HCl 0.1 M, pH 2.0) para dar la solución madre de enzimas. Para la evaluación de los péptidos no lipidados, se incubaron 10 j l (2 jg , ~5 unidades) de solución de enzimas con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~01:6:00. Para la evaluación de los péptidos lipidados, se incubaron 100 j l (20 jg , ~50 unidades) de solución de enzimas con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~2:1.

Tripsina: La tripsina pancreática porcina liofilizada (Sigma: T1426) se reconstituyó para obtener una solución de 100 jg/ml (~300 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, CaCh 10 mM, NaCl 150 mM, HCl 1 mM, ajustada a pH 7.8) para dar la solución madre de enzimas. Para la evaluación de los péptidos no lipidados, se incubaron 10 j l (1 jg , ~3 unidades) de solución de enzimas con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~1:11. Para la evaluación de los péptidos lipidados, se incubaron 100 j l (10 jg , ~30 unidades) de solución de enzimas con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~1.2:1.

a-quimotripsina: Se reconstituyen 10.0 jg (~10 unidades) de a-quimotripsina recombinante (R&D Systems: 6907-SE-010) a 100 j l (100 jg/ml, ~100 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, CaCh 10 mM, NaCl 150 mM, HCl 1 mM, ajustada a pH 7.8) para dar la solución madre de enzimas. Para la evaluación de los piptidos no lipidados, se incubaron 10 j l (1 jg , ~1 unidad) de solución madre de a-quimotripsina con 100 j l de la solución de piptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de piptido, ~33 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~1:33. Para la evaluación de los piptidos lipidados, se incubaron 100 j l (10 jg , ~10 unidades) de solución madre de a-quimotripsina con 100 j l de la solución de piptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de piptido, ~25 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~1:2.5.

Elastasa: Se reconstituye 1.0 mg (~5 unidades) de elastasa pancreática porcina liofilizada (Sigma: E7885) a 100 j l (10 mg/ml, ~50 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, NaHCO3) 50 mM y se ajustó a pH 8.1 usando NaOH (0.1 M) para dar la solución madre de enzimas. Para la evaluación de los péptidos no lipidados, se incubaron 20 j l (200 jg , ~1 unidad) de solución madre de elastasa con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~1:33. Para la evaluación de los péptidos lipidados, se incubaron 100 j l (1000 jg , ~5 unidades) de solución madre de elastasa con 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles). Relación de enzima (unidades):péptido (jmoles) ~1:5.

3.4 Procedimientos de proteólisis de los péptidos

3.4.1 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos no lipidados a la neprilisina

Se reconstituyeron 10.0 jg (~10 unidades) de neprilisina recombinante (R&D Systems: 1182-ZNC-010) a 100 j l (100 jg/ml, ~100 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, NaHCO350 mM, ajustada a pH 8.3) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se prepararon a una concentración de 330 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregaron 10 j l (1 jg , ~1 unidad) de solución madre de neprilisina a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles) y la mezcla se coincubó en un baño de agua de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~01:33:00). Se retiraron periódicamente alícuotas de 15 j l (~15 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (15 |jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizaron alícuotas de 20 j l (~10 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm e ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESl+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

3.4.2 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados a la neprilisina

Se reconstituyeron 10.0 jg (~10 unidades) de neprilisina recombinante (R&D Systems: 1182-ZNC-010) a 100 j l (100 jg/ml, ~100 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, NaHCO350 mM, ajustada a pH 8.3) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se prepararon a una concentración de 250 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregaron 100 j l (10 jg , ~10 unidades) de solución madre de neprilisina a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles) y la mezcla se coincubó en un baño de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:2.5). Se retiraron periódicamente alícuotas de 25 j l (~12,5 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (25 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizaron alícuotas de 25 j l (~6 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento. En la Tabla 4 se muestran los resultados de este experimento.

Tabla 4: Porcentaje de péptidos remanentes (AUC en puntos de tiempo específicos por RP-HPLC) tras incubación con neprilisina.

3.4.3 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos no lipidados a la pepsina pancreática porcina La pepsina pancreática porcina liofilizada (Sigma: P7012) se reconstituyó a 200 |jg/ml (~500 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (HCl 1.0 M, pH 2.0) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se prepararon a una concentración de 330 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregaron 10 j l (2 jg , ~5 unidades) de solución madre de pepsina a 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles) y la mezcla se coincubó en un baño de agua de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:6). Se retiraron periódicamente alícuotas de 15 j l (~ 15 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (15 j l) de solución de bicarbonato de amonio 0.1 M en agua/acetonitrilo (1:4, pH 8) para detener la actividad proteolítica. Se analizaron alícuotas de 20 j l (~10 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLc analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento. En la Tabla 5 se muestran los resultados de este experimento.

3.4.4 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados a la pepsina pancreática porcina

La pepsina pancreática porcina liofilizada (Sigma: P7012) se reconstituyó a 200 jg/ml (~500 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (HCl 1.0 M, pH 2.0) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se prepararon a una concentración de 250 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregaron 50 j l (10 jg , ~25 unidades) de solución madre de pepsina a 100 j l de la solución de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles) y la mezcla se coincubó en un baño de agua de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:1. Se retiraron periódicamente alícuotas de 25 j l (~ 17 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (25 j l) de solución de bicarbonato de amonio 0.1 M en agua/acetonitrilo (1:4, pH 8) para detener la actividad proteolítica. Se analizaron alícuotas de 25 j l (~8 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento. En la Tabla 5 se muestran los resultados de este experimento.

Tabla 5: Porcentaje de péptidos intactos remanentes (AUC en puntos de tiempo específicos por RP-HPLC) tras incubación con pepsina.

3.4.5 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos no lipidados a la tripsina pancreática porcina

La tripsina pancreática porcina liofilizada (Sigma: T7409) se reconstituyó a 200 |jg/ml (~300 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, CaCh 10 mM, NaCl 150 mM, HCl 1 mM, se ajustó a pH 7.8) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se prepararon a una concentración de 330 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregaron 10 j l (2 jg , ~3 unidades) de solución madre de tripsina a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles) y la mezcla se coincubó en un baño de agua de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:11). Se retiraron periódicamente alícuotas de 15 j l (~15 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (15 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizaron alícuotas de 20 j l (~10 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris c 8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TfA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento. En la Tabla 6 se muestran los resultados de este experimento.

3.4.6 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados a la tripsina pancreática porcina

La tripsina pancreática porcina liofilizada (Sigma: T7409) se reconstituyó a 200 jg/ml (~300 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, CaCh 10 mM, NaCl 150 mM, HCl 1 mM, se ajustó a pH 7.8) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se prepararon a una concentración de 250 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregaron 50 j l (10 jg, ~15 unidades) de solución madre de tripsina a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles) y la mezcla se coincubó en un baño de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:1.7). Se retiraron periódicamente alícuotas de 25 j l (~17 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (25 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizaron alícuotas de 25 j l (~8 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento. En la Tabla 6 se muestran los resultados de este experimento.

Tabla 6: Porcentaje de péptidos intactos remanentes (AUC en puntos de tiempo específicos por RP-HPLC) tras incubación con tripsina.

3.4.7 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos no lipidados a la a-quimotripsina

Se reconstituyen 10.0 |jg (~10 unidades) de a-quimotripsina recombinante (R&D Systems: 6907-SE-010) a 100 |jl (100 |jg/ml, ~100 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, CaCl²10 mM, NaCI 150 mM, HCl 1 mM, ajustada a pH 7.8) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se preparan a una concentración de 330 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1x (Dulbecco). Se agregan 10 j l (1 jg , ~1 unidad) de solución madre de a-quimotripsina a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jimoles) y la mezcla se coincuba en un baño de agua de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jimoles] ~1:33). Se retiran periódicamente alícuotas de 15 j l (~15 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (15 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizan alícuotas de 20 j l (~10 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HpLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identifican por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permite estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

3.4.8 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados a la a-quimotripsina

Se reconstituyen 10.0 jg (~10 unidades) de a-quimotripsina recombinante (R&D Systems: 6907-SE-010) a 100 j l (100 jg/ml, ~100 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, CaCh 10 mM, NaCl 150 mM, HCl 1 mM, ajustada a pH 7.8) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se preparan a una concentración de 250 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregan 100 j l (10 jg , ~10 unidades) de solución madre de a-quimotripsina a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles) y la mezcla se coincuba en un baño de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:2.5). Se retiran periódicamente alícuotas de 25 j l (~12,5 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (25 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizan alícuotas de 25 j l (~6 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identifican por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1 % de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permite estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

Tabla 7: Porcentaje de péptidos intactos remanentes (AUC en puntos de tiempo específicos por RP-HPLC) tras incubación con a-quimotripsina.

3.4.9 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos no lipidados a la elastasa pancreática porcina

Se reconstituye 1.0 mg (~5 unidades) de elastasa pancreática porcina liofilizada (Sigma: E7885) a 100 |jl (10 mg/ml, ~50 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, NaHCO350 mM) y se ajustó a pH 8.1 usando NaOH (1.0 M) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se preparan a una concentración de 330 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregan 20 j l (200 jg , ~1 unidad) de solución madre de elastasa a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~33 jmoles) y la mezcla se coincuba en un baño de agua de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:33). Se retiran periódicamente alícuotas de 15 j l (~15 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (15 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizan alícuotas de 20 j l (~10 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HpLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identifican por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permite estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

3.4.10 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados a la elastasa pancreática porcina

Se reconstituye 1.0 mg (~5 unidades) de elastasa pancreática porcina liofilizada (Sigma: E7885) a 100 j l (10 mg/ml, ~50 unidades/ml) en solución amortiguadora de ensayo (Tris 50 mM, NaCl 50 mM, NaHCO350 mM) y se ajusta a pH 8.1 usando NaOH (1.0 M) para dar la solución madre de enzimas. Las soluciones madre de péptidos se preparan a una concentración de 250 jM (~1.0 mg/ml) en solución amortiguadora de ensayo, agua pura o PBS 1X (Dulbecco). Se agregan 100 j l (1000 jg , ~5 unidades) de solución madre de elastasa a 100 j l de la solución madre de péptidos (1.0 mg/ml, ~100 jg de péptido, ~25 jmoles) y la mezcla se coincuba en un baño de temperatura regulada a 37 °C por toda la duración del experimento (relación de enzima [unidades]:péptido [jmoles] ~1:5). Se retiran periódicamente alícuotas de 25 j l (~17 jg de péptido inicial) de la mezcla de péptido-enzima (t = 0, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h) y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a un volumen igual (25 jl) de 5% de TFA (v/v) en agua/acetonitrilo 1:1 para detener la actividad proteolítica. Se analizan alícuotas de 25 j l (~8 jg de péptido inicial) mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm y ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESl+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identifican por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) que eluye con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1 % de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permite estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

3.4.11 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados a fluido intestinal simulado en estado de ayunas (FASSIF/Pancreatin®)

Se preparó una suspensión fresca de FASSIF/P (Fluido intestinal simulado en estado de ayunas USP Pancreatin®) de acuerdo con la descripción de Galia, Nicolaides, Horter, Lobenberg, Reppas y Dressman: Pharm. Res. 15 (1998) 698-705.

La preparación resultante es proteolíticamente equivalente a ~375 unidades/ml (375 kU/l) y se usó inmediatamente sin guardar. Los péptidos para la evaluación (1.0 mg, ~250 nmoles) se disolvieron inicialmente en FASSIF sin Pancreatin® (200 |jl) precalentada y a esto se agregó FASSIF/Pancreatin® (100 jl) fresco precalentado para iniciar una digestión potencial. Después de una agitación por vortexeo breve del tubo Eppendorf la mezcla se incubó a 37 °C en un baño de agua con termostato por toda la duración del experimento. Se retiraron periódicamente (t = 0, 5 m, 10 m, 15 m, 30 m, 1 h, 2 h) alícuotas de 25 j l de la mezcla coincubada de péptido-enzima y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a una solución de 10% de TFA en agua/acetonitrilo 1:1 (75 jl) para detener la actividad proteolítica. Las muestras neutralizadas se centrifugaron (7800 RPM, 3 min) para obtener sólidos paletizados y se analizaron alícuotas de 30 j l de la solución de sobrenadante mediante lC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm e ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

Tabla 8: Porcentaje de péptidos intactos remanentes (AUC en puntos de tiempo específicos por RP-HPLC) tras incubación con fluido intestinal simulado en estado de ayunas (FASSIF/P).

3.4.12 Evaluación de la resistencia proteolítica de péptidos mono o bilipidados al fluido intestinal simulado en estado de ayunas (FASSIF/Pancreatin®) después de activación completa del zimógeno con enteroquinasa

Se preparó una suspensión fresca de FASSIF/P (Fluido intestinal simulado en estado de ayunas USP Pancreatin®) de acuerdo con la descripción de Galia, Nicolaides, Horter, Lobenberg, Reppas y Dressman: Pharm. Res. 15 (1998) 698-705. A la preparación resultante se agregó enteroquinasa humana (100 jg/ml) para asegurar la posibilidad de una actividad completa del zimógeno de la mezcla que se usó inmediatamente sin guardar. Los péptidos para la evaluación (1.0 mg, ~250 nmoles) se disolvieron inicialmente en FASSIF sin Pancreatin® (200 jl) precalentada y a esto se agregó FASSIF/Pancreatin® (100 jl) fresco precalentado para iniciar una digestión potencial. Después de una agitación por vortexeo breve del tubo Eppendorf la mezcla se incubó a 37 °C en un baño de agua con termostato por toda la duración del experimento. Se retiraron periódicamente (t = 0, 5 m, 10 m, 15 m, 30 m, 1 h, 2 h) alícuotas de 25 j l de la mezcla coincubada de péptido-enzima y se neutralizaron inmediatamente mediante adición a una solución de 10% de TFA en agua/acetonitrilo 1:1 (75 jl) para detener la actividad proteolítica. Las muestras neutralizadas se centrifugaron (7800 RPM, 3 min) para obtener sólidos paletizados y se analizaron alícuotas de 30 j l de la solución de sobrenadante mediante LC/MS y/o RP-HPLC analítica de la siguiente manera: Método de LC/MS: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante 30 min a razón de 1.5 ml min-1 a temperatura ambiente con detección por absorción UV a 210 nm e ionización usando un detector de masa Waters 3100 (modo ESI+). Los fragmentos de péptidos que derivan de la hidrólisis enzimática se identificaron por el peso molecular, permitiendo ubicar el sitio de clivaje. Método de RP-HPLC analítica: Columna Agilent Polaris C8-A (4.6 x 100 mm, 3 micrones) eluída con un gradiente binario lineal de 10-90% de MeCN (0.1% de TFA v/v) en agua (0.1% de TFA v/v) durante ya sea 10 ó 15 min a razón de 1.5 ml min-1 a 40 °C con detección por absorción UV a 210 nm. La integración manual (AUC) permitió estimar los péptidos intactos remanentes durante el transcurso del experimento.

Tabla 9: Porcentaje de péptidos intactos remanentes (AUC en puntos de tiempo específicos por RP-HPLC) tras incubación con fluido intestinal simulado en estado de ayunas (FASSIF/P) activado con enteroquinasa 100 ^g/ml para asegurar una conversión completa del zimógeno.

4.1 Ensayos con AMPc

Las actividades biológicas/potencias del receptor de los péptidos análogos del GLP-1 lipidado que se describe en la presente se evalúan convenientemente por su actividad biológica, por ejemplo, por estimulación de una o más respuestas celulares del receptor. Se generan líneas celulares estables que expresan receptor de GLP-1 (GLP-1R), receptor de glucagón (GCGR) o receptor de péptido insulinotrópico dependiente de glucosa (polipéptido inhibidor gástrico) (GIPR) humano, de ratón, de rata o de perro en células HEK293 o células CHO mediante métodos convencionales. La activación mediante péptido de estos diversos receptores da como resultado una acumulación posterior de un segundo mensajero AMPc que puede medirse en un ensayo de actividad funcional.

Ensayos con AMPc se condujeron usando "solución amortiguadora de ensayo": Solución amortiguadora de ensayo: BSA al 0.1% (n.° de Sigma A3059) en HBSS (n.° de Sigma H8264) con HEPES 25 mM, pH 7.4 y que contenía IBMX 0.5 mM (n.° de Sigma I7018).

Se usan placas de 384 pocillos de baja unión a proteínas (N° Greiner 781280) para realizar once diluciones en serie de 1 en 5 de las muestras de prueba que se preparan en solución amortiguadora de ensayo. Las diluciones de las muestras se efectuaron por duplicado.

Se descongela rápidamente un criovial congelado de células que expresan el receptor de interés en un baño de agua, se transfiere a solución amortiguadora de ensayo previamente calentado y se centrifuga a 240xg durante 5 minutos. Se resuspenden las células en solución amortiguadora de ensayo a una concentración optimizada dependiente del lote (por ejemplo, células hGCGR a 2x10⁵células/ml, células hGLP-1R y hGIPR a 1x10⁵células/ml).

Se transfiere una réplica de 5 |jl de la placa de dilución a una placa negra de 384 pocillos con fondo en forma de U de pocillos poco profundos (Corning, N° 3676). A esto se le añade una suspensión de células de 5 j l y se incuban las placas a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Los niveles de AMPc se miden usando un kit para AMPc dynamic 2 HTRF disponible comercialmente (Cisbio, N° Cat.

62AM4PEJ), siguiendo el protocolo de dos pasos según las recomendaciones del proveedor. En resumen; se preparan por separado criptato anti-AMPc (fluoróforo donante) y AMPc-d2 (fluoróforo aceptor) mediante dilución de cada uno 1/20 en conjugado y solución amortiguadora de lisis proporcionado en el kit. Se añaden 5 j l de criptato anti-AMPc a todos los pocillos de la placa de ensayo y se añaden 5 j l de AMPc-d2 a todos los pocillos excepto a pocillos de unión no específica (NSB), a los que se añaden conjugado y solución amortiguadora de lisis. Se incuban las placas a temperatura ambiente durante una hora y después se leen en un aparato Envision (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 320 nm y longitudes de onda de emisión de 620 nm y 665 nm. Entonces se determinan valores de CE50 de los péptidos sintéticos determinados en ensayos de AMPc.

En experimentos adicionales para determinar la actividad biológica/potencia del receptor, se cultivan células CHO con expresión recombinante estable de GCGR o del receptor de GLP-1 humano, de ratón o de rata en solución amortiguadora de ensayo igual que antes). Se preparan disoluciones madre de células crioconservadas en 1x medio de congelación de células, DMSO exento de suero (Sigma Aldrich) o bien a 1x10⁷o bien a 2x10⁷/vial y se almacenan a -80°C. Se descongelan rápidamente las células a 37°C y luego se diluyen en solución amortiguadora de ensayo (solución amortiguadora como anteriormente) que contiene albúmina de suero al 4.4, 3.2 y 3.2% para albúmina de suero humana, de rata y de ratón, respectivamente. Se diluyen en serie péptidos en DMSO al 100% y luego se diluyen 100 veces en solución amortiguadora de ensayo como anteriormente que contiene albúmina de suero a la concentración final mencionada. Entonces se transfieren péptidos diluidos a placas negras de ensayo de microtitulación de 384 pocillos poco profundos. Se añaden las células a las placas de ensayo y se incuban durante 30 min a temperatura ambiente. Tras la incubación se detiene el ensayo y se miden los niveles de AMPc usando el kit de ensayo HTRF® dynamic d2 AMPc disponible de CisBio Bioassays, según los lineamientos del proveedor. Se leen las placas en lectores de placas de fluorescencia ENVISION® de Perkin Elmer. Se adquieren albúmina de suero humana y de rata de Sigma Aldrich y albúmina de suero de ratón de Equitech Bio Ltd.

Los datos se transforman en % de delta F como se describe en los lineamientos del proveedor y se analizan mediante ajuste logístico de 4 parámetros para determinar los valores de CE50. Los valores de CE50 determinados dependen tanto de la potencia de los péptidos sometidos a prueba en los receptores de GLP-1 y de glucagón en las líneas celulares recombinantes como de la afinidad del péptido para albúmina de suero, lo cual determina la cantidad de péptido libre. La asociación con albúmina de suero aumenta el valor de CE50 obtenido. La fracción de péptido libre en concentraciones en plasma de albúmina y la CE50 al 0% de albúmina de suero (SA) pueden calcularse basándose en la variación en la generación de AMPc con la concentración de SA. Para comparar el equilibrio de actividades en GLP-1R y GCGR de diferentes péptidos y en diferentes condiciones, estos pueden correlacionarse, donde las EC50 se refieren a las de los péptidos de comparación. En las Tablas 7-10 se muestran los resultados de estos experimentos.

TABLA 7: Actividad de AMPc con péptidos sustituidos y monolipidados

TABLA 8: Actividad de AMPc con péptidos sustituidos y monolipidados, cont.

TABLA 9: Actividad de AMPc con péptidos agonistas bilipidados

TABLA 10: Actividad de AMPc con péptidos agonistas bilipidados, cont.

TABLA 11: Actividad de AMPc con péptidos agonistas trilipidados

TABLA 12: Actividad de AMPc con péptidos agonistas trilipidados, cont.

TABLA 13: Secuencias comparativas adicionales

Los ejemplos de secuencias comparativas se muestran en la Tabla 13. Se pueden consultar secuencias comparativas adicionales en la Solicitud de Patente Internacional N°: PCT/EP2014/077240, publicada como WO2015/086686A2.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos:

H Aib E G S (a-MeF) T S D V (a-MeS) S X 13 L E G E A A (a-MeK) E (a-MeF) IA X25

V V E G G ;

en donde X13 es un residuo K modificado con lípidos, y X25 es un residuo K modificado con lípidos.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el péptido comprende una amida C-terminal.

3. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde los dos residuos K modificados con lípidos son iguales o diferentes, y se seleccionan del grupo que consiste en: K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo), K(S-(PEG)2-(PeG)2-yE-miristoílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo), K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo) y cualquier combinación de los mismos, opcionalmente en donde los dos residuos K modificados con lípidos son ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-lauroílo), ambos K(S-(pEG)2-(PEG)2-YE-miristoílo), ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-palmitoílo) o ambos K(S-(PEG)2-(PEG)2-YE-estearoílo).

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409, or SEQ ID NO: 410.

5. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un vehículo.

6. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o la composición farmacéutica de la reivindicación 5, para su uso en un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o condición causada o caracterizada por hipoglucemia o una liberación de insulina deficiente, en donde una cantidad eficaz del polipéptido o la composición se administra a un sujeto que necesita tratamiento,

opcionalmente en donde la enfermedad o condición es diabetes, opcionalmente en donde la enfermedad o condición es diabetes tipo 2.

7. El polipéptido para su uso o la composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 6, en donde la administración además mejora el control glucémico, provee control del peso corporal, mejora la función y masa de células p, reduce el índice de secreción de ácido gástrico y de vaciado gástrico o cualquier combinación de los mismos.

8. El polipéptido para su uso o la composición farmacéutica para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en donde el polipéptido o la composición farmacéutica se administra por vía oral o mediante inyección,

opcionalmente en donde la inyección se administra por vía subcutánea o por vía intravenosa.

9. El polipéptido para su uso o la composición farmacéutica para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde el péptido o la composición farmacéutica se administra una vez por día.

10. El polipéptido para su uso o la composición farmacéutica para su uso de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde se administran además una o más terapias adicionales,

opcionalmente en donde dicha terapia adicional comprende monitoreo del azúcar en sangre, modificaciones de la dieta, ejercicio, insulina, una tiazolidindiona, una sulfonilurea, una incretina, metformina, una glibúrida, un inhibidor de la dipeptidilo peptidasa 4, un secuestrante de ácidos biliares o cualquier combinación de los mismos.

11. El polipéptido para su uso o la composición farmacéutica para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde el sujeto es un ser humano.