ES2851384T3

ES2851384T3 - Composiciones y métodos para mejorar la producción de lechuga

Info

Publication number: ES2851384T3
Application number: ES14868520T
Authority: ES
Inventors: Rachel Didonato Floro; Justin Lee; Gregg Bogosian; Doug Bryant
Original assignee: NewLeaf Symbiotics Inc
Current assignee: NewLeaf Symbiotics Inc
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2021-09-06
Anticipated expiration: 2034-12-04
Also published as: US20190116803A1; US12016338B2; UA121377C2; EP4289274A3; US20210186026A1; BR122019022021B1; US20250160334A1; EP4289274A2; US10212939B2; EP3797595B1; EP3076792A1; AU2014360414B2; AU2018250519B2; BR112016012870A2; CA2932891A1; US20160302425A1; UA129990C2; US10945441B2; US20240407370A1; AU2014360414A1

Abstract

Una metilobacteria aislada NLS0089 (NRRL B-50933).

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para mejorar la producción de lechuga

Antecedentes

Se encuentran ampliamente compuestos orgánicos de un carbono tal como metano y metanol en la naturaleza, y se utilizan como fuentes de carbono por bacterias clasificadas como metanótrofos y metilótrofos. Las bacterias metanotróficas incluyen especies de los géneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum y Methylocella (Lidstrom, 2006). Los metanótrofos poseen la enzima monooxigenasa, que incorpora un átomo de oxígeno de O2 en metano, formando metanol. Todos los metanótrofos son utilizadores de un carbono obligados que no pueden usar compuestos que contengan enlaces carbono-carbono. Los metilótrofos, por otro lado, también pueden utilizar compuestos orgánicos más complejos, tales como ácidos orgánicos, alcoholes superiores, glúcidos y similares. Por tanto, las bacterias metilotróficas son metilótrofos facultativos. Las bacterias metilotróficas incluyen especies de los géneros Methylobacterium, Hyphomicrobium, Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Aminobacter, Methylorhabdus, Methylopila, Methylosulfonomonas, Marinosulfonomonas, Paracoccus, Xanthobacter, Ancylobacter (también conocida como Microcyclus), Thiobacillus, Rhodopseudomonas, Rhodobacter, Acetobacter, Bacillus, Mycobacterium, Arthobacter y Nocardia (Lidstrom, 2006).

La mayoría de las bacterias metilotróficas del género Methylobacterium tienen pigmentación rosa. Se denominan convencionalmente bacterias PPFM, que son metilótrofos facultativos con pigmentación rosa. Green (2005, 2006) identificó doce especies validadas del género Methylobacterium, específicamente M. aminovorans, M. chloromethanicum, M. dichloromethanicum, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. organophilum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. rhodinum, M. thiocyanatum y M. zatmanii. Sin embargo, M. nidulans es una metilobacteria fijadora de nitrógeno que no es una PPFm (Sy et al., 2001). Las metilobacterias son de naturaleza ubicua, encontrándose en el suelo, el polvo, el agua potable, sedimentos y superficies foliares, así como entornos industriales y clínicos (Green, 2006).

La publicación internacional WO200060052 divulga un método de alteración del metabolismo vegetal tratando las semillas de la planta con una metilobacteria mutante seleccionada por sus capacidades de alteración de la planta.

Abanda-Nkpwatt et al. (J. Exper. Botany, 57(15):4025-4032, 2006) describen un aislado de Methylobacterium extorquens de fresa con efectos promotores del crecimiento en tomate (L. exculentum), fresa (F. vesca), tabaco (N. tabacum) y mostaza (S. alba).

Jeounghyun Ryu et al. informan sobre los efectos del tratamiento de las semillas con CBMB20 y CBMB110 en la longitud de la raíz de tomate y pimiento rojo.

Compendio

La invención se refiere a la siguiente materia en cuestión indicada en las reivindicaciones:

1. Una metilobacteria NLS0089 aislada (NRRL B-50933).

2. Una composición que comprende: (i) la metilobacteria aislada de 1; y (ii) un adyuvante, excipiente agrícolamente aceptable o combinación de los mismos.

3. La composición de 2, en la que la metilobacteria aislada está a un valor cuantitativo de al menos 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 5 x 108 *unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro.

4. Uso de la composición de 2 para tratar una planta, una parte de la planta o propágulo de una planta.

5. El uso de 4, en el que la parte de la planta es una hoja, tallo, flor, raíz, semilla, fruto, tubérculo o coleóptilo.

6. Una composición que comprende: (a) (i) una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma; o (ii) una emulsión con metilobacteria que ha crecido en la misma; en la que la metilobacteria es la metilobacteria aislada de 1; y (b) un excipiente, adyuvante agrícolamente aceptable o combinación de los mismos.

7. La composición de 6, en la que la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma tiene un valor cuantitativo de metilobacteria de al menos 5 x 108 UFC/g a al menos 1 x 1014 UFC/g.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, en la que la composición está adaptada para su uso en el tratamiento de una planta o semilla.

9. La composición de 2 o 6, en la que la composición es un producto esencialmente seco que tiene un 5 % o menos de contenido de agua.

10. La composición de 2, en la que la composición comprende además un plaguicida.

11. La composición de 10, en la que el plaguicida es un insecticida, un fungicida, un nematicida o un bactericida.

12. La composición de 2, en la que la composición comprende además un microrganismo distinto de metilobacteria, en la que dicho microorganismo es bioplaguicida o proporciona algún otro beneficio cuando se aplica a una planta o parte de la planta.

13. La composición de 12, en la que el microrganismo es Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp. o Trichoderma sp.

14. La composición de 2, en la que el adyuvante agrícolamente aceptable potencia la eficacia del producto o la facilidad de aplicación del producto.

15. Una planta, parte de la planta o semilla que se recubre o recubre parcialmente con la composición de 2.

En la presente memoria, se divulgan composiciones que comprenden metilobacteria cepa NLS0089. En determinados aspectos de la divulgación, la composición se usa para tratar una semilla de lechuga.

En la presente memoria se divulgan composiciones que comprenden: (i) una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma o (ii) una emulsión con metilobacteria que ha crecido en la misma; en la que dicha metilobacteria es NLS0089 (NRRL B-50933) y un adyuvante, excipiente agrícolamente aceptable o combinación de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma tiene un valor cuantitativo de metilobacteria de al menos aproximadamente 5 x 108 UFC/g a al menos aproximadamente 1 x 1014 UFC/g.

También se divulga una metilobacteria NLS0089 aislada (NRRL B-50933).

También se divulgan composiciones que comprenden: (i) una metilobacteria NLS0089 aislada (NRRL B-50933) y (ii) un adyuvante, excipiente agrícolamente aceptable o combinación de los mismos.

También se divulgan plantas, partes de plantas y semillas de plantas que se recubren o recubren parcialmente con cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente. En determinados aspectos de la divulgación, una planta de lechuga, parte de la planta o semilla de la planta se recubre o recubre parcialmente con las composiciones mencionadas anteriormente.

Descripción

Definiciones

Como se usa en la presente memoria, las frases "adherido a ello" y "adherente" se refieren a metilobacterias que se asocian con una sustancia sólida por crecer, o haber crecido, sobre una sustancia sólida.

Como se usa en la presente memoria, la frase "adyuvante agrícolamente aceptable" se refiere a una sustancia que potencia el rendimiento de un agente activo en una composición para el tratamiento de plantas y/o partes de plantas. En determinadas composiciones, un agente activo puede comprender un monocultivo o cocultivo de metilobacteria.

Como se usa en la presente memoria, la frase "excipiente agrícolamente aceptable" se refiere a una sustancia esencialmente inerte que puede usarse como diluyente y/o vehículo para un agente dado en una composición para el tratamiento de plantas y/o partes de plantas. En determinadas composiciones, un agente activo puede comprender un monocultivo o cocultivo de metilobacteria.

Como se usa en la presente memoria, el término "metilobacteria" se refiere a bacterias que son metilótrofos facultativos del género Methylobacterium. El término metilobacteria, como se usa en el presente documento, por tanto, no abarca especies de los géneros Methylobacter, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylococcus, Methylosinus, Methylocystis, Methylosphaera, Methylocaldum y Methylocella, que son metanótrofos obligados.

Como se usa en la presente memoria, la frase "cocultivo de metilobacterias" se refiere a un cultivo de metilobacterias que comprende al menos dos cepas de metilobacterias o al menos dos especies de metilobacterias.

Como se usa en la presente memoria, la frase "microorganismo contaminante" se refiere a microorganismos en un cultivo, caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición que no se identificaron antes de la introducción en el cultivo, caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición.

Como se usa en la presente memoria, la frase "derivados de los mismos", cuando se usa en el contexto de un aislado de metilobacteria, se refiere a cualquier cepa que se obtiene del aislado de metilobacteria. Los derivados de un aislado de metilobacteria incluyen, aunque sin limitación, variantes de la cepa obtenidas por selección, variantes de la cepa seleccionadas por mutagénesis y selección, y una cepa transformada genéticamente obtenida del aislado de metilobacteria.

Como se usa en la presente memoria, el término "emulsión" se refiere a una mezcla coloidal de dos líquidos inmiscibles en la que un líquido es la fase continua y el otro líquido es la fase dispersada. En determinados aspectos de la divulgación, la fase continua es un líquido acuoso y la fase dispersada es líquida, es decir, no miscible, o parcialmente miscible, en el líquido acuoso.

Como se usa en la presente memoria, la frase "esencialmente libre de microorganismos contaminantes" se refiere a un cultivo, caldo de fermentación, producto de fermentación o composición donde al menos aproximadamente un 95 % de los microorganismos presentes por cantidad o tipo en el cultivo, caldo de fermentación, producto de fermentación o composición son la metilobacteria deseada u otros microorganismos deseados de identidad predeterminada.

Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancia sólida inanimada" se refiere a una sustancia que es insoluble o parcialmente soluble en agua o soluciones acuosas y que no es viva o que no es parte de un organismo todavía vivo del que se obtuvo.

Como se usa en la presente memoria, la frase "monocultivo de metilobacteria" se refiere a un cultivo de metilobacteria que consiste en una única cepa de metilobacteria.

Como se usa en la presente memoria, el término "péptido" se refiere a cualquier polipéptido de 50 residuos aminoacídicos o menos.

Como se usa en la presente memoria, el término "lechuga" se refiere a plantas de Lactuca sp. Las plantas de Lactuca sp. incluyen, aunque sin limitación, las especies Lactuca biennis, Lactuca canadensis, Lactuca floridana, Lactuca graminifolia, Lactuca hirsuta, Lactuca indica, Lactuca ludoviciana, Lactuca saligna, Lactuca sativa, Lactuca serriola, Lactuca terrae-novae, Lactuca virosa y Lactuca X morssii.

Como se usa en la presente memoria, el término "proteína" se refiere a cualquier polipéptido que tenga 51 o más residuos aminoacídicos.

Como se usa en la presente memoria, un "plaguicida" se refiere a un agente que es insecticida, fungicida, nematicida, bactericida o cualquier combinación de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, la frase "agente bacteriostático" se refiere a agentes que inhiben el crecimiento de bacterias, pero no destruyen las bacterias.

Como se usa en la presente memoria, la frase "plaguicida que no inhibe sustancialmente el crecimiento de dicha metilobacteria" se refiere a cualquier plaguicida que cuando se proporciona en una composición que comprende un producto de fermentación que comprende una sustancia sólida en la que se adhiere un monocultivo o cocultivo de metilobacteria a la misma, produce no más de un 50 % de inhibición del crecimiento de metilobacteria cuando la composición se aplica a una planta o parte de la planta en comparación con una composición que carece del plaguicida. En determinados aspectos de la divulgación, el plaguicida produce no más de un 40 %, 20 %, 10 %, 5 % o 1 % de inhibición del crecimiento de metilobacteria cuando la composición se aplica a una planta o parte de la planta en comparación con una composición que carece del plaguicida.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "bacterias PPFM" se refiere, sin limitación, a especies bacterianas del género Methylobacterium distintas de M. nodulans.

Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancia sólida" se refiere a una sustancia que es insoluble o parcialmente soluble en agua o soluciones acuosas.

Como se usa en la presente memoria, la frase "fase sólida que puede suspenderse en la misma" se refiere a una sustancia sólida que puede distribuirse por todo un líquido por agitación.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "no regenerable" se refiere a una parte de planta o producto vegetal procesado que no puede regenerarse en una planta completa.

Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancialmente toda la fase sólida se suspende en la fase líquida" se refiere a un medio en el que al menos un 95 %, 98 % o 99 % de la una o más sustancias sólidas que comprenden la fase sólida se distribuyen por todo el líquido por agitación.

Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancialmente toda la fase sólida no se suspende en la fase líquida" se refiere a un medio en el que al menos un 5 %, 2 % o 1 % del sólido está en una forma de partículas que se distribuye por todo el medio por agitación.

Como se usa en la presente memoria, la frase "microorganismo residente" se refiere a bacterias, hongos o levaduras residentes.

Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancia que promueve el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla" se refiere a una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y combinaciones de las mismas.

Composiciones que contienen metilobacteria reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, métodos de su uso y métodos de preparación

En este documento se divulgan composiciones que comprenden metilobacteria que están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, métodos de uso de las composiciones para mejorar la producción de lechuga y métodos de preparación de las composiciones. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, la composición comprende una sustancia sólida en la que un monocultivo o cocultivo de metilobacteria se adhiere a la misma. En determinados aspectos de la divulgación donde la metilobacteria se adhiere a una sustancia sólida, la composición comprende un coloide formado por la sustancia sólida en la que un monocultivo o cultivo de metilobacteria se adhiere a la misma y un líquido. En determinados aspectos de la divulgación, el coloide es un gel. En determinados aspectos de la descripción de determinadas composiciones mencionadas anteriormente, la composición es una emulsión que no contiene una sustancia sólida.

Se divulgan composiciones que comprenden una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, la metilobacteria adherente puede estar a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 5 x 108 UFC/g a al menos aproximadamente 5 x 1013 UFC/g o aproximadamente 1 x 1014 UFC/g y la composición está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla.

En determinados aspectos de la divulgación, las composiciones que contienen metilobacteria divulgadas o usadas en este documento se reducen de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes cuando una o más de esas sustancias están ausentes o están esencialmente ausentes. En determinados aspectos de la divulgación, la composición se reduce de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes cuando esas sustancias están presentes a un porcentaje de no más de aproximadamente un 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,2 % o 0,1 % de la masa total, masa/volumen total o volumen total de la composición. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que promueve el crecimiento de microorganismos residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio y combinaciones de las mismas. Las fuentes de carbono incluyen, aunque sin limitación, alcoholes, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, lípidos, ácidos grasos y similares. Los alcoholes que se reducen incluyen, aunque sin limitación, metanol, etanol, glicerol y similares. Las fuentes de nitrógeno incluyen, aunque sin limitación, amoniaco y diversos compuestos que contienen grupos amino que pueden metabolizarse por los microorganismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que se reduce es una fuente de dos o más de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre y una fuente de magnesio. por ejemplo, la composición que se reduce de aminoácidos o péptidos y carece de otras fuentes de carbono o nitrógeno está reducida tanto para una fuente de carbono como para una fuente de nitrógeno. En determinados aspectos de la divulgación, la composición comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable.

Los microorganismos residentes en la planta o semilla incluyen, aunque sin limitación, bacterias, hongos y levaduras. Las sustancias que promueven el crecimiento de dichos microorganismos pueden identificarse por métodos que incluyen, aunque sin limitación, ensayar la superficie de la planta o semilla para la cantidad o número de microorganismos presentes antes de la exposición de la planta o semilla a la sustancia (o a una composición que tiene la sustancia), exponer la planta o semilla ensayada a la sustancia o composición en paralelo con una composición de control que carece de la sustancia, y después volver a ensayar la superficie de la planta o semilla para la cantidad o número de microorganismos presentes después de un intervalo de tiempo adecuado y en condiciones adecuadas de temperatura para permitir el crecimiento de los microorganismos residentes. Los ensayos para los números de microorganismos incluyen, aunque sin limitación, determinaciones de las unidades formadoras de colonias por una cantidad de planta o semilla expuesta a la sustancia y el control.

Sin intención de limitarse a teoría alguna, se cree que las composiciones que contienen metilobacteria divulgadas o usadas en este documento que están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes pueden producir resultados superiores en comparación con otras composiciones que tienen dichas sustancias cuando se aplican a plantas, partes de plantas o semillas. Se cree que dichos resultados superiores incluyen, aunque sin limitación, mejora de la producción de la planta, resistencia a patógenos, resistencia a insectos, maduración de los frutos y similares. Sin intención de limitarse a teoría alguna, se cree que las composiciones que contienen metilobacteria que están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de los microorganismos residentes permiten una colonización más eficaz y/o amplia de la planta, parte de la misma o semilla porque se reduce uno o más del espacio o los nutrientes por los microorganismos residentes.

También se divulgan en este documento métodos para mejorar la producción de lechuga, que comprenden aplicar cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente o metilobacterias divulgadas en este documento a una planta de lechuga, parte de planta de lechuga o semilla de lechuga y, opcionalmente, hacer crecer la planta y/o recoger las hojas o semillas de la planta o una planta que ha crecido a partir de la semilla. En determinados aspectos de la divulgación, la composición recubre o recubre parcialmente la planta de lechuga, parte de la planta o semilla. La planta de lechuga tratada o planta que ha crecido a partir de la semilla muestra una tasa aumentada de crecimiento de las raíces, una tasa aumentada de crecimiento de las hojas, producción aumentada de semillas, un tiempo de ciclo disminuido (desde la siembra de la semilla hasta la producción de semillas) y/o biomasa total aumentada en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar, obteniendo de ese modo producción de lechuga mejorada. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % de aumento en la tasa de crecimiento de raíces, tasa de crecimiento de hojas, producción de semillas y/o biomasa total aumentada en la planta de lechuga, parte de la planta de lechuga o una planta de lechuga derivada de la misma en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona aproximadamente un 5 % o un 10 % a aproximadamente un 15 %, 20 %, 25%, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 % o 70 % de aumento en la tasa de crecimiento de raíces, tasa de crecimiento de hojas, producción de semillas y/o biomasa total aumentada en la planta, parte de la planta una planta derivada de la misma en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 30 % o 40 % de disminución en el tiempo de ciclo en la planta de lechuga tratada o una planta de lechuga que ha crecido a partir de una semilla tratada en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la aplicación de la composición proporciona aproximadamente un 5 % o 10 % a aproximadamente un 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 % de disminución en el tiempo de ciclo en la planta de lechuga tratada o una planta de lechuga que ha crecido a partir de una semilla tratada en comparación con una planta de lechuga de control sin tratar o planta de lechuga de control que ha crecido a partir de una semilla sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, la parte de la planta de lechuga es una hoja, un tallo, una flor, una raíz, un tubérculo o una semilla. En determinados aspectos de la divulgación, el método comprende además las etapas de hacer crecer la planta y/o la etapa de recoger al menos una parte de la planta seleccionada del grupo que consiste en una hoja, un tallo, una flor, una raíz, un tubérculo o una semilla de la planta de lechuga o parte de la planta. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, los métodos comprenden además obtener un alimento procesado o composición de pienso a partir de la planta o parte de la planta. En determinados aspectos de la divulgación, la composición de alimento procesado comprende hojas de lechuga troceadas o cortadas.

También se divulgan métodos de preparación de una composición de tratamiento de planta de lechuga o semilla de la planta que comprende metilobacteria y está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. Dichos métodos comprenden (i) hacer crecer un monocultivo o cocultivo de metilobacteria en medio que comprende una fase acuosa, una fase líquida y una fase sólida, o una emulsión, obteniendo de ese modo un medio que contiene metilobacteria; (ii) separar la metilobacteria de al menos otra parte del medio que contiene metilobacteria; y (iii) reconstituir la metilobacteria en una matriz que carece de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. En determinados aspectos de la divulgación, la etapa de separación se logra por centrifugación, filtración o sedimentación del medio que contiene metilobacteria y eliminación del exceso de líquido o emulsión del mismo. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que promueve el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo y combinaciones de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación, la matriz es un líquido, una emulsión o uno o más sólidos, y comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable. Aún en determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias se hacen crecer en medio que comprende una fase líquida y una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma. La sustancia sólida se separa de la fase líquida del medio que contiene metilobacteria, y la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma se reconstituye en la matriz mencionada anteriormente. En determinados aspectos de los métodos, la especie de metilobacteria se selecciona del grupo que consiste en M. aminovorans, M. extorquens, M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. radiotolerans, M. rhodesianum, M. nodulans, M. phyllosphaerae, M thiocyanatum y M. oryzae. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria no es M. radiotolerans o M. oryzae. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria es adherente a una sustancia sólida. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria se adhiere a la sustancia sólida, se combina con un líquido para formar una composición que es un coloide. En determinados aspectos de los métodos, el coloide es un gel. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria adherida a la sustancia sólida se proporciona cultivando la metilobacteria en presencia de la sustancia sólida. En determinados aspectos de los métodos, la composición comprende una emulsión. En determinados aspectos de los métodos, la metilobacteria se proporciona cultivando la metilobacteria en una emulsión.

Los métodos donde se cultivan metilobacterias en medio bifásico que comprende una fase líquida y una sustancia sólida se ha descubierto que aumentan significativamente el rendimiento resultante de metilobacteria con respecto a métodos donde se cultivan metilobacterias en medio líquido en solitario. En determinados aspectos de la divulgación, los métodos pueden comprender hacer crecer la metilobacteria en medio líquido con una sustancia sólida en partículas que puede suspenderse en el líquido por agitación en condiciones que proporcionan el crecimiento de metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación donde se usan sustancias sólidas en partículas, al menos sustancialmente toda la fase sólida, por tanto, puede suspenderse en la fase líquida tras agitación. Dichas sustancias sólidas en partículas pueden comprender materiales que son de aproximadamente 1 milímetro o menos de longitud o diámetro. En determinados aspectos de la divulgación, el grado de agitación es suficiente para proporcionar distribución uniforme de la sustancia sólida en partículas en la fase líquida y/o niveles óptimos de aireación del cultivo. Sin embargo, en otros aspectos divulgados en este documento, al menos sustancialmente toda la fase sólida no se suspende en la fase líquida, o partes de la fase sólida se suspenden en la fase líquida y partes de la fase sólida no se suspenden en la fase líquida. Pueden usarse sustancias sólidas que no estén en partículas en determinados medios bifásicos donde la fase sólida no se suspende en la fase líquida. Dichas sustancias sólidas que no están en partículas incluyen, aunque sin limitación, materiales que son mayores de aproximadamente 1 milímetro de longitud o diámetro. Dichas sustancias sólidas en partículas y que no están en partículas también incluyen, aunque sin limitación, materiales que son porosos, fibrosos o configurados de otro modo para proporcionar áreas superficiales aumentadas para el crecimiento adherente de la metilobacteria. Los medios bifásicos donde se suspenden partes de la fase sólida en la fase líquida y partes de la fase sólida no se suspenden en la fase líquida pueden comprender una mezcla de sustancias sólidas en partículas y que no están en partículas. Dichas sustancias sólidas en partículas y que no están en partículas usadas en cualquiera de los medios bifásicos mencionados anteriormente también incluyen, aunque sin limitación, materiales que son porosos, fibrosos o configurados de otro modo para proporcionar áreas superficiales aumentadas para el crecimiento adherente de la metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación, el medio comprende un coloide formado por una fase sólida y una líquida. Un coloide que comprende un sólido y un líquido puede formarse previamente y añadirse a medio líquido o puede formarse en medio que contiene un sólido y un líquido. Los coloides que comprenden un sólido y un líquido pueden formarse sometiendo determinadas sustancias sólidas a un cambio químico o térmico. En determinados aspectos de la divulgación, el coloide es un gel. En determinados aspectos de la divulgación, la fase líquida del medio es una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, la emulsión comprende un líquido acuoso y un líquido que no es miscible, o solo parcialmente miscible, en el líquido acuoso. Los líquidos que no son miscibles, o solo parcialmente miscibles en agua incluyen, aunque sin limitación, cualquiera de los siguientes: (1) líquidos que tienen una miscibilidad en agua que es igual a o menor que la de pentanol, hexanol o heptanol a 25 °C; (2) líquidos que comprenden un alcohol, un aldehído, una cetona, un ácido graso, un fosfolípido o cualquier combinación de los mismos; (3) alcoholes seleccionados del grupo que consiste en alcoholes alifáticos que contienen al menos 5 carbonos y esteroles; (4) un aceite animal, aceite microbiano, aceite sintético, aceite vegetal o combinación de los mismos; y/o (5) un aceite vegetal que se selecciona del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, cacahuete, girasol, oliva, linaza, coco, palma, colza, semilla de sésamo, cártamo y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, el líquido inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender al menos aproximadamente un 0,02 % a aproximadamente un 20 % de la fase líquida por masa. En determinados aspectos de la divulgación, los métodos pueden comprender obtener un medio de cultivo bifásico que comprende el líquido, el sólido y metilobacteria e incubar el cultivo en condiciones que proporcionan el crecimiento de metilobacteria. Los medios de cultivo bifásico que comprenden el líquido, el sólido y metilobacteria pueden obtenerse por una diversidad de métodos que incluyen, aunque sin limitación, cualquiera de: (a) inocular un medio bifásico que comprende el líquido y la sustancia sólida con metilobacteria; (b) inocular la sustancia sólida con metilobacteria y después introducir la sustancia sólida que comprende metilobacteria en el medio líquido; (c) inocular la sustancia sólida con metilobacteria, incubar la metilobacteria en la sustancia sólida y después introducir la sustancia sólida que comprende metilobacteria en el medio líquido; o (d) cualquier combinación de (a), (b) o (c). Se divulgan métodos y composiciones para hacer crecer metilobacteria en medio bifásico que comprende un líquido y un sólido en la solicitud de patente de Estados Unidos del mismo cesionario que la presente n.° 13/907 161, presentada el 31 de mayo de 2013, y en la solicitud de patente internacional del mismo cesionario que la presente PCT/US13/43722, presentada el 31 de mayo de 2013.

También se ha descubierto que métodos donde se cultiva metilobacteria en medio que comprende una emulsión aumentan significativamente el rendimiento resultante de metilobacteria con respecto a métodos donde se cultiva metilobacteria en medio líquido en solitario. En determinados aspectos de la divulgación, los métodos para preparar las composiciones divulgadas en este documento pueden comprender hacer crecer el agente de metilobacteria en una emulsión en condiciones que proporcionan el crecimiento de metilobacteria. Los medios que comprenden la emulsión y metilobacteria pueden obtenerse por una diversidad de métodos que incluyen, aunque sin limitación, cualquiera de: (a) inocular un medio que comprende la emulsión con metilobacteria; (b) inocular el líquido acuoso con metilobacteria, introducir el líquido no acuoso y mezclar para formar una emulsión; (c) inocular el líquido acuoso con metilobacteria, introducir el líquido no acuoso y mezclar para formar una emulsión; o (d) cualquier combinación de (a), (b) o (c). En determinados aspectos de la divulgación, la emulsión comprende un líquido acuoso y un líquido que no es miscible, o solo parcialmente miscible, en el líquido acuoso. Los líquidos no acuosos que no son miscibles, o solo parcialmente miscibles en agua incluyen, aunque sin limitación, cualquiera de los siguientes: (1) líquidos que tienen una miscibilidad en agua que es igual a o menor que la de n-pentanol, n-hexanol o n-heptanol a 25 °C; (2) líquidos que comprenden un alcohol, un aldehído, una cetona, un ácido graso, un fosfolípido o cualquier combinación de los mismos; (3) alcoholes seleccionados del grupo que consiste en alcoholes alifáticos que contienen al menos 5, 6 o 7 carbonos y esteroles; (4) un aceite animal, aceite microbiano, aceite sintético, aceite vegetal o combinación de los mismos; y/o (5) un aceite vegetal que seleccionado del grupo que consiste en maíz, soja, algodón, cacahuete, girasol, oliva, linaza, coco, palma, colza, semilla de sésamo, cártamo y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, el líquido no acuoso inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender al menos aproximadamente un 0,02 % a aproximadamente un 20 % de la emulsión por masa. En determinados aspectos de la divulgación, el líquido no acuoso inmiscible o parcialmente inmiscible puede comprender cualquiera de al menos aproximadamente un 0,05 %, 0,1 %, 0,5 % o 1 % a aproximadamente un 3 %, 5 %, 10 % o 20 % de la emulsión por masa. Se divulgan métodos y composiciones para hacer crecer metilobacteria en medio que comprende una emulsión en la solicitud de patente internacional del mismo cesionario que la presente PCT/US2014/040218, presentada el 30 de mayo de 2014.

En determinados aspectos de la divulgación, el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composiciones que comprenden una especie de metilobacteria puede comprender además uno o más microorganismos introducidos de identidad predeterminada distintos de metilobacteria. Otros microorganismos que pueden añadirse incluyen, aunque sin limitación, microorganismos que son bioplaguicidas o proporcionan algún otro beneficio cuando se aplican a una planta o parte de la planta. Los microorganismos bioplaguicidas o beneficiosos de otro modo, por tanto, incluyen, aunque sin limitación, diversos Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp., y Trichoderma sp. Los bioplaguicidas microbianos pueden ser una batería, hongo, virus o protozoo. Los microorganismos bioplaguicidas particularmente útiles incluyen diversas cepas de Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilis, Pseudomonas syringae, Trichoderma harzianum, Trichoderma virens, y Streptomyces lydicus. Otros microorganismos que se añaden pueden ser aislados genomanipulados o de origen natural que están disponibles como cultivos puros. En determinados aspectos de la divulgación, se prevé que el microorganismo bacteriano o fúngico pueda proporcionarse en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición en forma de una espora.

En determinados aspectos de la divulgación, el medio de cultivo líquido se prepara a partir de componentes baratos y fácilmente disponibles incluyendo, aunque sin limitación, sales inorgánicas tales como fosfato de potasio, sulfato de magnesio y similares, fuentes de carbono tales como glicerol, metanol, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido succínico y similares y mezclas de aminoácidos tales como peptona, triptona y similares. Los medios líquidos ejemplares que pueden usarse incluyen, aunque sin limitación, medio de sales minerales de amonio (AMS) (Whittenbury et al., 1970), medio de cultivo mínimo Vogel-Bonner (VB) (Vogel y Bonner, 1956), y caldo LB ("caldo Luria-Bertani").

En general, la sustancia sólida usadas en los métodos y composiciones que proporcionan el crecimiento eficaz de metilobacteria puede ser cualquier sustancia sólida adecuada que sea insoluble o sola parcialmente soluble en agua o soluciones acuosas. Dichas sustancias sólidas adecuadas también son no bactericidas o no bacteriostáticas con respecto a metilobacteria cuando las sustancias sólidas se proporcionan en el medio de cultivo líquido. En determinados aspectos de la divulgación, dichas sustancias sólidas adecuadas también son sustancias sólidas que se obtienen fácilmente en forma estéril o se vuelven fácilmente estériles. Las sustancias sólidas usadas en la presente memoria pueden esterilizarse por cualquier método que proporcione la eliminación de microorganismos contaminantes y, por tanto, incluyen, aunque sin limitación, métodos tales como empleo de autoclaves, irradiación, tratamiento químico y cualquier combinación de los mismos. Estas sustancias sólidas incluyen sustancias naturales de origen animal, vegetal, microbiano, fúngico o mineral, sustancias fabricadas por el hombre o combinaciones de sustancias naturales y fabricadas por el hombre. En ciertos aspectos de la divulgación, las sustancias sólidas son sustancias sólidas inanimadas. Las sustancias sólidas inanimadas de origen animal, vegetal, microbiano o fúngico pueden obtenerse de animales, plantas, microbios u hongos que no son viables (es decir, ya no viven) o que se han vuelto inviables. Por tanto, los caparazones de diatomeas son sustancias sólidas inanimadas cuando se han eliminado las algas diatomeas previamente asociadas o se han vuelto de otro modo inviables. Como los caparazones de diatomeas son sustancias sólidas inanimadas, no se consideran organismos fotosintéticos o microrganismos fotosintéticos. En determinados aspectos de la divulgación, las sustancias sólidas incluyen, aunque sin limitación, arena, sedimento, tierra, arcilla, ceniza, carbón vegetal, tierra infusoria y otros minerales similares, vidrio molido o microesferas de vidrio, materiales cerámicos molidos, microesferas cerámicas, bentonita, caolín, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de cuarzo, montmorilonita y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser un polímero o microesferas poliméricas. Los polímeros que pueden usarse como sustancia sólida incluyen, aunque sin limitación, diversos polisacáridos tales como polímeros celulósicos y polímeros quitinosos que son insolubles o solo parcialmente solubles en agua o soluciones acuosas, agar (es decir, galactanos) y combinaciones de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser un cristal salino insoluble o solo parcialmente soluble. Los cristales salinos que pueden usarse incluyen, aunque sin limitación, carbonatos, cromatos, sulfitos, fosfatos, hidróxidos, óxidos y sulfuros insolubles o solo parcialmente solubles. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana o espora microbiana, en la que la célula microbiana o espora microbiana no es un microorganismo fotosintético. En determinados aspectos de la divulgación, la célula microbiana o espora microbiana no es un microorganismo fotosintético, donde el microorganismo fotosintético se selecciona del grupo que consiste en algas, cianobacterias, diatomeas, Botryococcus braunii, Chlorella, Dunaliella tertiolecta, Gracilaria, Pleurochrysis carterae, Sargassum, y Ulva. En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica inactivada (es decir, inviable). En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una célula microbiana, célula fúngica, espora microbiana o espora fúngica quiescente (es decir, viable, pero sin división activa). En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser desechos celulares de origen microbiano. En otros aspectos más de la divulgación, la sustancia sólida puede ser materia en partículas de cualquier parte de una planta. Las partes plantas que pueden usarse para obtener la sustancia sólida incluyen, aunque sin limitación, olotes, cáscaras, vainas, hojas, raíces, flores, tallos, cortezas, semillas y combinaciones de los mismos. También pueden usarse productos obtenidos de partes de plantas procesadas incluyen, aunque sin limitación, bagazo, salvado de trigo, sémola de soja, masa de semillas trituradas, rastrojo y similares. Dichas partes de plantas, plantas procesadas y/o partes de plantas procesadas pueden molerse para obtener el material sólido en una forma de partículas que pueda usarse. En determinados aspectos de la divulgación, puede usarse madera o un producto de madera incluyendo, aunque sin limitación, pulpa de madera, serrín, virutas y similares. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una materia en partículas de uno o más animales incluyendo, aunque sin limitación, harina de hueso, gelatina, caparazones molidos o pulverizados, pelo, cuero macerado y similares.

En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida se proporciona en una forma de partículas que proporcionan la distribución de la sustancia sólida en el medio de cultivo. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede está compuesta de partículas de aproximadamente 2 micrómetros a aproximadamente 1000 micrómetros de longitud promedio o diámetro promedio. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede está compuesta de partículas de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 1000 micrómetros de longitud promedio o diámetro promedio. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida es una partícula de aproximadamente 1,2, 4, 10, 20 o 40 micrómetros a cualquiera de aproximadamente 100, 200, 500, 750 o 1000 micrómetros de longitud promedio o diámetro promedio. Las características deseables de partículas usadas en los métodos y composiciones divulgados en la presente memoria incluyen humectabilidad de modo que las partículas pueden suspenderse por todo el medio tras agitación.

En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida se proporciona en el medio como un coloide, en el que la fase continua es un líquido y la fase dispersada es el sólido. Sólidos adecuados que pueden usarse para formar coloides en medios líquidos usados para hacer crecer metilobacteria incluyen, aunque sin limitación, diversos sólidos que se denominan hidrocoloides. Dichos hidrocoloides usados en los medios, métodos y composiciones divulgados en la presente memoria pueden ser polímeros hidrófilos de origen vegetal, animal, microbiano o sintético. Los polímeros hidrocoloides usados en los métodos pueden contener muchos grupos hidroxilo y/o pueden ser polielectrolitos. Los polímeros hidrocoloides usados en las composiciones y métodos divulgados en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, agar, alginato, arabinoxilano, carragenina, carboximetilcelulosa, celulosa, curdlano, gelatina, gellan, p-glucano, goma guar, goma arábiga, goma garrofín, pectina, almidón, goma xantana y mezcla de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación, el coloide usado en los medios, métodos y composiciones divulgados en la presente memoria pueden comprender un polímero hidrocoloide y una o más proteínas.

En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida puede ser una sustancia sólida que proporciona el crecimiento adherente de metilobacteria sobre la sustancia sólida. Las metilobacterias que se adhieren a una sustancia sólida son metilobacterias que no pueden eliminarse sustancialmente lavando simplemente la sustancia sólida con las metilobacterias adherentes con medio de crecimiento mientras que las metilobacterias no adherentes pueden eliminarse sustancialmente lavando la sustancia sólida con medio de crecimiento líquido. En este contexto, "eliminar sustancialmente" significa que al menos aproximadamente un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 % u 80 % de las metilobacterias presentes se eliminan cuando la sustancia sólida se lava con tres volúmenes de medio de crecimiento líquido. Dicho lavado puede lograrse por una diversidad de métodos incluyendo, aunque sin limitación, decantación de líquido de una fase sólida lavada o pase de líquido a través de una fase sólida en un filtro que permite el flujo a través de las bacterias en el líquido. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes que se asocian con el sólido pueden incluir metilobacterias que se adhieren directamente al sólido y/o metilobacterias que se adhieren indirectamente al a la sustancia sólida. Las metilobacterias que se adhieren indirectamente a la sustancia sólida incluyen, aunque sin limitación, metilobacterias que se adhieren a otras metilobacterias o a otro microorganismo que se adhiere a la sustancia sólida, metilobacterias que se adhieren a la sustancia sólida adhiriéndose a otra sustancia que está adherida a la sustancia sólida y similares. En determinados aspectos de la divulgación, al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o 99,9 % de las metilobacterias en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composiciones son metilobacterias que se adhieren a la sustancia sólida. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/20 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/5 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados o de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/ micrómetro cuadrado. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/20 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/5 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado o de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/micrómetro cuadrado. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias adherentes pueden estar presentes sobre la superficie de la sustancia sólida en el caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición a una densidad de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/20 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/ 2 micrómetros cuadrados, de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/10 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados o de al menos aproximadamente 1 metilobacteria/5 micrómetros cuadrados a aproximadamente 1 metilobacteria/2 micrómetros cuadrados. Los caldos de fermentación bifásicos divulgados en la presente memoria pueden comprender una fase líquida que contiene metilobacterias no adherentes. En determinados aspectos de la divulgación, los valores cuantitativos de metilobacterias no adherentes en la fase líquida pueden ser menores de aproximadamente 100000, 10000 o 1000 UFC/ml.

Los métodos de cultivo bifásico divulgados pueden producir caldos de fermentación con metilobacterias a un valor cuantitativo de más de aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, un valor cuantitativo de más de aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un valor cuantitativo de más de aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en la presente memoria pueden comprender metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en la presente memoria pueden comprender metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en la presente memoria comprenderán metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, los caldos de fermentación divulgados en la presente memoria comprenderán metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 4 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro.

Las sustancias sólidas con metilobacterias adherentes pueden obtenerse como productos de fermentación y pueden usarse para diversas composiciones útiles para tratar plantas o partes de plantas para mejorar la producción de la planta, la resistencia a insectos de plantas, resistencia a enfermedades fúngicas de plantas y/o para mejorar la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, la composición comprende metilobacterias y está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes. Las composiciones divulgadas en la presente memoria que comprenden metilobacterias, sustancias sólidas con metilobacterias que han crecido en las mismas o que comprenden emulsiones con metilobacterias que han crecido en las mismas pueden usarse para tratar plantas o partes de plantas. Por tanto, se divulgan plantas, partes de plantas y, en particular, semillas de plantas que se han recubierto al menos parcialmente o se han recubierto con los productos de caldo de fermentación o composiciones que comprenden metilobacterias También se divulgan productos vegetales procesados que contienen los productos de caldo de fermentación o composiciones con metilobacterias o metilobacterias adherentes. Las sustancias sólidas con metilobacterias adherentes pueden usarse para tratar diversas composiciones que son particularmente útiles para tratar semillas de plantas. Por tanto, se divulgan semillas que se han recubierto al menos parcialmente con los productos de caldo de fermentación o composiciones. También se divulgan productos de semillas procesados incluyendo, aunque sin limitación, sémola, harina, pienso y copos que contienen los productos de caldo de fermentación o composiciones divulgadas en la presente memoria. En determinados aspectos de la divulgación, el producto vegetal procesado no será regenerable (es decir, no podrá desarrollarse en una planta). En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida usada en el producto de fermentación o composición que recubre al menos parcialmente la planta, parte de la planta o semilla de la planta o que está contenido en la planta, parte de la planta o producto de semilla procesado comprende una sustancia sólida y metilobacterias asociadas o adherentes que pueden identificarse fácilmente comparando una planta, parte de planta, semilla de planta o producto procesado de las mismas tratado y sin tratar. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de planta o una semilla incluye, aunque sin limitación, recubrir al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 99,5 % del área superficial de la planta, parte de planta o semilla de planta.

También se divulgan en la presente memoria métodos de preparación de una composición de tratamiento de plantas o semillas de las plantas que comprenden metilobacterias y está reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. Dichos métodos pueden comprender (i) hacer crecer un monocultivo o cocultivo de metilobacteria en medio que comprende: (a) una fase acuosa; (b) una fase líquida y una fase sólida; o (c) una emulsión, obteniendo de ese modo un medio que contiene metilobacterias; (ii) separar las metilobacterias de al menos otra parte del medio que contiene metilobacterias; y (iii) reconstituir las metilobacterias en una matriz que carece de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla. En determinados aspectos de la divulgación, la etapa de separación se logra por centrifugación, filtración o sedimentación del medio que contiene metilobacteria y eliminación del exceso de líquido o emulsión del mismo. En determinados aspectos de la divulgación donde las metilobacterias se hacen crecer en presencia de una sustancia sólida, la separación proporcionará una fracción que contiene metilobacterias con crecimiento adherente a la sustancia sólida y algunas metilobacterias no adherentes que pueden reconstituirse en la matriz. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia que promueve el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla se selecciona del grupo que consiste en una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio y combinaciones de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación, la matriz es un líquido, una emulsión o uno o más sólidos, y comprende un adyuvante y/o excipiente agrícolamente aceptable. En determinados aspectos de la divulgación, las metilobacterias se hacen crecer en medio que comprende una fase líquida y una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma. La sustancia sólida se separa de la fase líquida del medio que contiene metilobacteria, y la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma se reconstituye en la matriz mencionada anteriormente. En determinados aspectos de la divulgación, la matriz puede ser un líquido que incluye, aunque sin limitación, agua y tampón acuoso reducido de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, o una solución acuosa reducida de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla.

En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria que mejora la producción de lechuga puede identificarse ensayando la especie de metilobacteria candidata recién aislada para la presencia de secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria ejemplar divulgada en la presente memoria que mejora la producción de lechuga y que está ausente de la especie de metilobacteria divulgada en la presente memoria que no mejora la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria ejemplar NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y NLS0068 divulgados en la presente memoria que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes de uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la presente memoria que no mejoran la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria ejemplar NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065 y/o NLS0068 divulgados en la presente memoria que mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos de semillas, pero están ausentes de uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la presente memoria que no mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos de semillas En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria ejemplar NLS0020, NLS0017, NLS0042 y NLS0068 divulgados en la presente memoria que mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos foliares, pero están ausentes de uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la presente memoria que no mejoran la producción de lechuga cuando se aplican como tratamientos foliares. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en dos o más de los aislados de la especie de metilobacteria ejemplar NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y NLS0068 divulgados en la presente memoria que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes de dos o más de los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la presente memoria que no mejoran la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas que están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga también están presentes en uno o más de los aislados de la especie de metilobacteria ejemplar NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y/o NLS0068 divulgados en la presente memoria que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes de todos los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la presente memoria que no mejoran la producción de lechuga. En determinados aspectos de la divulgación, las secuencias de ácido nucleico polimórficas están presentes en la especie de metilobacteria identificada que mejora la producción de lechuga están presentes en todos los aislados de la especie de metilobacteria ejemplar NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y NLS0068 divulgados en la presente memoria que mejoran la producción de lechuga, pero están ausentes en todos los aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la presente memoria que no mejoran la producción de lechuga. Dichos polimorfismos de ácido nucleico que se producen en la especie de metilobacteria que mejora la producción de lechuga pueden incluir, aunque sin limitación, polimorfismos mononucleotídicos, RFLP, AFLP y/u otras variaciones de ADN tales como secuencias repetitivas, secuencias de inserción, transposones e islas genómicas que se producen como resultado de inserciones, eliminaciones y sustituciones (indeles) en el genoma bacteriano, que incluye tanto el ADN cromosómico como cualquier elemento de ácido nucleico extracromosómico que pueda estar presente en la especie de metilobacteria que mejora la producción de lechuga. Dichos elementos de ácido nucleico extracromosómicos incluyen, aunque sin limitación, plásmidos, ADN o ARN de bacteriófago y similares. Los métodos usados para identificar dichos polimorfismos nucleotídicos incluyen, aunque sin limitación, técnicas de prolongación de una sola base (SBE), hibridación específica de alelo (ASH), detección por PCR instantánea (es decir, TaqMan™; patentes de Estados Unidos n.° 5804375; 5538848; 5487972 y 5210015), combinaciones de ASH y RT-PCR (sistemas de detección KASP™, LGC Genomics, Middlesex, R.U.) y técnicas de secuenciación profunda (solicitud de patente de Estados Unidos n.220120264632).

También se divulgan en la presente memoria composiciones, métodos de preparación de las composiciones y métodos de uso de las composiciones para mejorar la producción de lechuga donde las composiciones o métodos comprenden o usan cualquiera de los siguientes aislados de la especie de metilobacteria divulgados en la siguiente tabla 1 o derivados de los aislados. En determinados aspectos de la divulgación, dichos derivados pueden incluir variantes, aunque sin limitación, variantes de los aislados obtenidos por selección, variantes de los aislados seleccionados por mutagénesis y selección y aislados transformados genéticamente obtenidos de los aislados.

Tabla 1. Aislados de la especie de metilobacteria

Las solicitudes de patente del mismo cesionario que la presente que divulgan usos específicos adicionales de las cepas de metilobacteria de la tabla 1: (1) aumentar de la producción de maíz (documento US 61/911780, presentado el 4/12/2013; y la solicitud internacional que reivindica el beneficio del mismo presentada el 4/12/2014); (2) aumentar de la producción de soja (documento US 61/911698, presentado el 4/12/2013; y la solicitud internacional que reivindica el beneficio del mismo presentada el 4/12/2014); (3) mejorar el crecimiento de tomates (documento US 61/954390, presentado el 17/3/2014; y la solicitud internacional que reivindica el beneficio del mismo presentada el 4/12/2014); (4) mejorar la maduración de los frutos (documento US 61/911577, presentado el 4/12/2013; y la solicitud internacional que reivindica el beneficio del mismo presentada el 4/12/2014); (5) proporcionar resistencia a enfermedades fúngicas (documento US 62/045950, presentado el 4/9/2014; documento US 62/013,464 , presentado el 17/6/2014) .

En la presente memoria también se divulgan especies de metilobacteria que proporcionan producción mejorada de lechuga donde las especies de metilobacteria tienen cualquiera de: (i) al menos un gen que codifica al menos una proteína que es ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125; o (ii) al menos un gen que codifica al menos una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia de la tabla 7. Una especie de metilobacteria tiene al menos un gen que es ortólogo a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1 -5125, o a la SEQ ID NO correspondiente de una proteína de referencia de la tabla 7, cuando un cromosoma y/o cualquier ADN extracromosómico en esa especie de metilobacteria contienen un gen que codifica una proteína que tiene al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia por toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-5125. La especie de metilobacteria puede tener también al menos dos, tres, cuatro, seis, ocho, 10, 15 o 20 genes que codifican proteínas que son ortólogas a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 o que codifican proteínas que son ortólogas a la correspondiente SEQ ID NO de una proteína de referencia de la tabla 7. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria puede contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de 13, 14, 23, 27, 28, 30, 40, 43, 44, 51, 52, 57, 76, 85, 127, 197, 198, 199, 1094, 1100, 1106, 1114,1116, 1117, 1120, 1180, 2180, 2190, 2463, 2467, 2468, 2471,2510, 2515, 2676, 2971,3357, 3370, 3372, 3394, 3427, 3429, 3430, 3950, 3952, 3968, 3987, 3996, 4004, 4006 y/o 4067 de la tabla 7. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria puede contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, 14, 23, 1094, 1100, 1106, 2467, 2468, 3357, 3370 y/o 3968 de la tabla 7. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria puede contener al menos un gen que codifica una proteína que es ortóloga a una proteína de referencia que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1100, 1116, 2471, 2971 y/o 3950 de la tabla 7. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 1094 incluyen, aunque sin limitación, las proteínas ortólogas identificadas como reguladores transcripcionales que se divulgan en la tabla 7. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 23 incluyen, aunque sin limitación, las proteínas ortólogas identificadas como proteínas de la familia XRE de reguladores transcripcionales que se divulgan en la tabla 7. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 1100 incluyen, aunque sin limitación, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, 1110, 2179, 2484 y 3367 que son similares a proteínas identificadas como proteínas del tipo de transportador ABC. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 1116 incluyen, aunque sin limitación, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, 1116, 2182 y 2521 que son similares a proteínas identificadas como transportador de múltiples fármacos MatE. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 2471 incluyen, aunque sin limitación, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 2471, 3356 y 3958 que son similares a proteínas identificadas como proteínas ACR de bomba de descarga de arsenito. Ejemplos de proteínas que son ortólogas a SEQ ID NO: 2971 incluyen, aunque sin limitación, proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 250, 1309, 2263 y 2971 que son similares a proteínas identificadas como miembros de los reguladores transcripcionales de la familia LysR. En determinados aspectos de la divulgación, la especie de metilobacteria tiene al menos un gen que es ortólogo a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos una de SEQ ID NO: 1-5125 o a la correspondiente SEQ ID NO de una proteína de referencia de la tabla 7, con la condición de que el gen no se encuentre en M. extorquens AM1, M. extorquens PA1 o M. extorquens ME4. También se divulgan composiciones que comprenden cualquiera de las especies de metilobacteria mencionadas anteriormente y un excipiente, adyuvante o combinación de los mismos agrícolamente aceptable junto con semillas u hojas de lechuga que se recubren al menos parcialmente con dichas composiciones y métodos de uso de dichas composiciones como tratamientos de semillas o foliares para mejorar la producción de lechuga.

Puede determinarse que una especie de metilobacteria contiene un gen que codifica una proteína que ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 por una diversidad de técnicas diferentes. En determinados aspectos de la divulgación, puede determinarse que una especie de metilobacteria contiene un gen que codifica una proteína que ortóloga a una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 ensamblando una secuencia genómica electrónica completa que comprende las secuencias de ADN cromosómicas y extracromosómicas presentes en esa especie de metilobacteria con un ordenador y programa informático asociado, y determinando si alguno de los marcos abiertos de lectura (ORF) presentes en esa secuencia de ADN codifica una proteína que tenga el porcentaje de identidad de secuencia mencionado anteriormente. En dichos aspectos de la divulgación, el ORF puede identificarse realizando una traducción de seis vías de la secuencia ensamblada electrónicamente y consultando lo traducido con una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 o la correspondiente SEQ ID NO: de una proteína de referencia de la tabla 7. En otros aspectos de la divulgación, la presencia o ausencia de una secuencia dada dentro de una especie de metilobacteria, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-5125 o la correspondiente SEQ ID NO: de una proteína de referencia de la tabla 7 puede determinarse por una técnica de análisis de ácidos nucleicos o análisis de proteínas. Ejemplos de secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de SEQ ID NO:1-5125 incluyen, aunque sin limitación, SEQ ID NO: 5126-10250, respectivamente. Dichos análisis de ácido nucleico incluyen, aunque sin limitación, técnicas basadas en hibridación de ácidos nucleicos, reacciones en cadena de la polimerasa, espectroscopia de masas, detección basada en nanoporos, combinaciones de las mismas y similares. Las técnicas de análisis de proteínas incluyen, aunque sin limitación, inmunodetección, espectroscopia de masas, combinaciones de las mismas y similares.

Las composiciones divulgadas en la presente memoria que son útiles para tratar plantas de lechuga o partes de plantas que comprenden metilobacterias y/o están reducidas de sustancias que promueven el crecimiento de bacterias residentes en una planta o semilla, contienen una sustancia sólida con metilobacterias adherentes que han crecido en la misma o que comprenden emulsiones con metilobacterias que han crecido en la misma, también pueden comprender además un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable. Una adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable típicamente es un ingrediente que no provoca fitotoxicidad excesiva u otros efectos adversos cuando se expone a una planta o parte de planta. En determinados aspectos de la divulgación, la sustancia sólida por sí misma puede ser un adyuvante agrícolamente aceptables o un excipiente agrícolamente aceptable, siempre que no sea bactericida o bacteriostático para la metilobacteria. En otros aspectos de la divulgación, la composición comprende además al menos uno de un adyuvante agrícolamente aceptable o un excipiente agrícolamente aceptable. Cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente también puede comprender además un plaguicida. Los plaguicidas usados en la composición incluyen, aunque sin limitación, un insecticida, un fungicida, un nematicida y un bactericida. En ciertos aspectos de la divulgación, el plaguicida usado en la composición es un plaguicida que no inhibe sustancialmente el crecimiento de la metilobacteria. Como las metilobacterias son bacterias gramnegativas, los bactericidas adecuados usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, bactericidas que muestran actividad contra bacterias grampositivas, pero no contra bacterias gramnegativas. Las composiciones divulgadas en la presente memoria también pueden comprender un agente bacteriostático que no inhiba sustancialmente el crecimiento de la metilobacteria. Los agentes bacteriostáticos adecuados para su uso en composiciones divulgadas en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, los que muestran actividad contra bacterias grampositivas, pero no contra bacterias gramnegativas. Cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente también puede ser un producto esencialmente seco (es decir, que tiene aproximadamente un 5 % o menos de contenido de agua), una mezcla de la composición con una emulsión o una suspensión. Cualquiera de las composiciones divulgadas en la presente memoria puede usarse para recubrir o recubrir parcialmente una planta, parte de la planta o semilla de la planta. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de planta o una semilla incluye, aunque sin limitación, recubrir al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 99,5 % del área superficial de la planta, parte de planta o semilla de planta.

Los adyuvantes agrícolamente aceptables usados en las composiciones que comprenden metilobacterias incluyen, aunque sin limitación, componentes que potencian la eficacia del producto y/o productos que potencian la facilidad de aplicación del producto. Los adyuvantes que potencian la eficacia del producto pueden incluir diversos empapadores/esparcidores promueven la adhesión en y propagación de la composición sobre partes de plantas, adhesivos que promueven la adhesión a la parte de la planta, penetrantes que pueden promover el contacto del agente activo con tejidos interiores, expansores que aumentan la semivida del agente activo inhibiendo la degradación ambiental y humectantes que aumentan la densidad o tiempo de secado de las composiciones pulverizadas. Los empapadores/esparcidores usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, tensioactivos no iónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos catiónicos, tensioactivos anfóteros, tensioactivos de organosilicato y/o tensioactivos acidificados. Los adhesivos usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, sustancias basadas en látex, terpeno/pinoleno y sustancias basadas en pirrolidona. Los penetrantes pueden incluir aceite de vaselina, aceite vegetal, aceite vegetal esterificado, tensioactivos de oraganosilicato y tensioactivos acidificados. Los diluyentes usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, sulfato de amonio o sustancias basadas en menteno. Los humectantes usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, glicerol, propilenglicol y dietilglicol. Los adyuvantes que mejoran la facilidad de aplicación del producto incluyen, aunque sin limitación, agentes acidificantes/tamponantes, agentes antiespumantes/desespumantes, agentes de compatibilidad, agentes reductores del arrastre, tintes y acondicionadores del agua. Los agentes antiespumantes/desespumantes usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, dimetopolisiloxano. Los agentes de compatibilidad usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, sulfato de amonio. Los agentes reductores del arrastre usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, poliacrilamidas y polisacáridos. Los acondicionadores del agua usados en las composiciones pueden incluir, aunque sin limitación, sulfato de amonio.

También se divulgan en la presente memoria métodos de tratamiento de plantas y/o partes de plantas con los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación y composiciones que comprenden metilobacterias. Las plantas tratadas y partes de plantas tratadas obtenidas de las mismas incluyen, aunque sin limitación, una planta de pimiento, tomate, mora o plátano. Las partes de plantas que se tratan incluyen, aunque sin limitación, hojas, tallos, flores, raíces, semillas, frutos, tubérculos, coleóptilos y similares. Las semillas u otros propágulos de cualquiera de las plantas mencionadas anteriormente pueden tratarse con los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y/o composiciones divulgados en la presente memoria.

En determinados aspectos de la divulgación, las plantas y/o partes de plantas se tratan aplicando los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones que comprenden metilobacterias como una pulverización. Dichas aplicaciones de pulverización incluyen, aunque sin limitación, tratamientos de una sola parte de la planta o cualquier combinación de partes de la planta. La pulverización puede conseguirse con cualquier dispositivo que distribuya los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones a la planta y/o parte o partes de la planta. Los dispositivos de pulverización útiles incluyen un pulverizador de varilla, un pulverizador manual o de mochila, fumigadores de cultivos (es decir, fumigación aérea) y similares. También pueden usarse dispositivos de pulverización y/o métodos que proporcionan aplicación de los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones a una de la superficie adaxial y/o superficie abaxial o ambas. También se divulgan en la presente memoria plantas y/o partes de planta que se recubren al menos parcialmente con cualquiera de un caldo de fermentación bifásico, un producto de caldo de fermentación, producto de fermentación o composiciones que comprenden una sustancia sólida con metilobacterias adheridas a la misma. También se divulgan en la presente memoria productos vegetales procesados que comprenden una sustancia sólida con metilobacterias adheridas a la misma. Cualquiera de las composiciones divulgadas en la presente memoria puede usarse para recubrir o recubrir parcialmente una planta, parte de la planta o semilla de la planta. El recubrimiento parcial de una planta, una parte de planta o una semilla incluye, aunque sin limitación, recubrir al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 99,5 % del área superficial de la planta, parte de planta o semilla de planta

En determinados aspectos de la divulgación, se tratan semillas de lechuga exponiendo las semillas a los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación, productos de fermentación y composiciones que comprenden metilobacterias. Las semillas pueden tratarse con los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación y composiciones divulgadas en la presente memoria por métodos que incluyen, aunque sin limitación, imbibición, recubrimiento, pulverización y similares. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas esterilizadas superficialmente se tratan con una composición que comprende metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación, se tratan semillas no esterilizadas (es decir, semillas que no se han sometido a esterilización superficial) con una composición que comprende metilobacterias que se ha reducido de sustancias que promueven el crecimiento de microorganismos residentes en la semilla. Los tratamientos de semillas pueden lograrse con tratadores de semillas continuos y/o discontinuos. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas recubiertas pueden prepararse suspendiendo las semillas con una composición de recubrimiento que contiene un caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composiciones que comprenden la sustancia sólida con metilobacterias y secando al aire el producto resultante. El secado al aire puede conseguirse a cualquier temperatura que no sea perjudicial para la semilla o las metilobacterias, pero típicamente no será mayor de 30 °C. La proporción de recubrimiento que comprende una sustancia sólida y metilobacterias incluye, aunque sin limitación, un intervalo de un 0,1 a un 25 % en peso de la semilla, de un 0,5 a un 5 % en peso de la semilla y de un 0,5 a un 2,5 % en peso de la semilla. El recubrimiento parcial de una semilla puede incluir, aunque sin limitación, recubrimiento de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o aproximadamente un 99,5 % del área superficial de la semilla. En determinados aspectos de la divulgación, una sustancia sólida usada en el recubrimiento o tratamiento de semillas tendrá metilobacterias adheridas en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, una sustancia sólida usada en el recubrimiento o tratamiento de semillas se asociará con metilobacterias será un caldo de fermentación, producto de caldo de fermentación o composición obtenida por los métodos divulgados en la presente memoria. Diversas composiciones y métodos de tratamiento de semillas para el tratamiento de semillas divulgados en las patentes de Estados Unidos n.° 5106648, 5512069 y 8181 388 pueden adaptarse para su uso con un agente activo que comprende los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación o composiciones divulgadas en la presente memoria. En determinados aspectos de la divulgación, la composición usada para tratar la semilla puede contener excipientes agrícolamente aceptables que incluyen, aunque sin limitación, harinas de madera, arcillas, carbono activado, tierra infusoria, sólidos inorgánicos de grano fino, carbonato de calcio y similares. Las arcillas y los sólidos inorgánicos que pueden usarse con los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación o composiciones divulgados en la presente memoria incluyen, aunque sin limitación, bentonita de calcio, caolín, porcelana, talco, perlita, mica, vermiculita, sílices, polvo de cuarzo, montmorilonita y mezclas de los mismos. Los adyuvantes agrícolamente aceptables que promueven la adhesión a la semilla que pueden usarse incluyen aunque sin limitación, poli(acetatos de vinilo), copolímeros de poli(acetato de vinilo), poli(acetato de vinilo) hidrolizados, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinilo, poli(alcoholes vinílicos), copolímeros de poli(alcohol vinílico), éter polivinil metílico, copolímero de éter polivinil metílico-anhídrido maleico, ceras, polímeros de látex, celulosas incluyendo etilcelulosas y metilcelulosas, hidroximetilcelulosas, hidroxipropilcelulosa, hidroximetilpropilcelulosas, polivinilpirrolidonas, alginatos, dextrinas, maltodextrinas, polisacáridos, grasas, aceites, proteínas, goma karaya, goma jaguar, goma de tragacanto, gomas de polisacárido, mucílago, goma arábiga, goma laca, polímeros y copolímeros de cloruro vinilideno, polímeros y copolímeros de proteína a base de soja, lignosulfonatos, copolímeros acrílicos, almidones, polivinilacrilatos, ceínas, gelatina, carboximetilcelulosa, quitosano, óxido de polietileno, polímeros y copolímeros de acrilamida, acrilato de polihidroxietilo, monómeros de metilacrilamida, alginato, etilcelulosa, poiycloropreno y jarabes o mezclas de los mismos. Otros adyuvantes agrícolamente aceptables útiles que pueden promover el recubrimiento incluyen, aunque sin limitación, polímeros y copolímeros de acetato de vinilo, copolímero de polivinilpirrolidona-acetato de vinilo y ceras solubles en agua. Diversos tensioactivos, dispersantes, agentes antiaglomerantes, agentes de control de la espuma y tintes divulgados en la presente memoria y en la patente de Estados Unidos n.° 8181 388 pueden adaptarse para su uso con un agente activo que comprende los caldos de fermentación, productos de caldo de fermentación o composiciones divulgadas en la presente memoria.

En la presente memoria se divulgan composiciones comprenden metilobacterias que proporcionan producción mejorada de lechuga con respecto a plantas sin tratar que no se han expuesto a las composiciones. En determinados aspectos de la divulgación, pueden tratarse partes de planta incluyendo, aunque sin limitación, una semilla, una hoja, un fruto, un tallo, una raíz, un tubérculo o un coleóptilo con las composiciones divulgadas en la presente memoria para mejorar la producción de lechuga. Los tratamientos o aplicaciones pueden incluir, aunque sin limitación, pulverización, recubrimiento, recubrimiento parcial, inmersión y/o embebido de la planta o partes de la planta con las composiciones divulgadas en la presente memoria. En determinados aspectos de la divulgación, puede sumergirse y/o embeberse una semilla, una hoja, un fruto, un tallo, una raíz, un tubérculo o un coleóptilo con un líquido, semilíquido, emulsión o suspensión de una composición divulgada en la presente memoria. Dicha inmersión o embebido de la semilla puede ser suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga en una planta o parte de planta tratada en comparación con una planta o parte de planta sin tratar. La producción de lechuga mejorada incluye, aunque sin limitación, crecimiento aumentado de las raíces, crecimiento aumentado de las hojas, producción aumentada de semillas y/o biomasa total aumentada con respecto a plantas sin tratar. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas de la planta pueden sumergirse y/o embeberse durante al menos 1,2, 3, 4, 5 o 6 horas. Dicha inmersión y/o embebido puede realizarse, en determinados aspectos de la divulgación, a temperaturas que no son perjudiciales para la semilla de la planta o la metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación, las semillas pueden tratarse a aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 °C o a aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 °C. En determinados aspectos de la divulgación, el embebido y/o inmersión de la semilla puede hacerse con agitación suave.

Las composiciones divulgadas en la presente memoria que comprenden metilobacterias, por lo tanto, se espera que sean útiles en mejorar la producción de lechuga.

En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga, puede ser una composición con metilobacterias a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar mejora de la producción de lechuga puede ser una composición con metilobacterias a un valor cuantitativo de aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficientes para proporcionar mejora de la producción de lechuga, puede ser un producto de caldo de fermentación con un valor cuantitativo de metilobacterias de una fase sólida de ese producto que es de al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de la fase sólida. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar mejora de la producción de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida, en la que se adhiere a la misma un monocultivo o cocultivo de metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar mejora de la producción de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de metilobacterias adheridas a una sustancia sólida, en la misma o que han crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar mejora de la producción de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml 0 al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacterias por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de metilobacterias en la misma o que han crecido en la misma.

En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga puede ser una composición con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro 0 al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga, puede ser una composición con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga puede ser un producto de caldo de fermentación con un valor cuantitativo de especie de metilobacteria de una fase sólida de ese producto que es de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de la fase sólida. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida en la que se adhiere a la misma un monocultivo o cocultivo de especie de metilobacteria. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria adherida a una sustancia sólida en la misma o que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, una cantidad de una composición divulgada en la presente memoria que es suficiente para proporcionar producción mejorada de lechuga puede ser una composición con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacterias por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria en la misma o que ha crecido en la misma.

En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan o usan composiciones con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con una especie de metilobacteria a un valor cuantitativo de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro de un líquido o una emulsión. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan productos de caldo de fermentación con un valor cuantitativo de especie de metilobacteria de una fase sólida de ese producto que es de al menos aproximadamente 1 x 104 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de la fase sólida. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por gramo, al menos aproximadamente 1 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo o al menos aproximadamente 5 x 109 unidades formadoras de colonias por gramo a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1011 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1012 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo, al menos aproximadamente 1 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo o al menos aproximadamente 5 x 1013 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por gramo de partículas en la composición que contiene las partículas que comprenden una sustancia sólida en la que se adhiere a la misma un monocultivo o cocultivo de especie de metilobacterias. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacteria por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria adherida a una sustancia sólida en la misma o que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación, se divulgan composiciones con un valor cuantitativo de metilobacterias de al menos aproximadamente 1 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 5 x 106 unidades formadoras de colonias por ml, al menos aproximadamente 1 x 107 unidades formadoras de colonias por ml o al menos aproximadamente 5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml a al menos aproximadamente 6 x 1010 unidades formadoras de colonias de metilobacterias por ml en una composición que comprende una emulsión en la que se proporciona un monocultivo o cocultivo de una especie de metilobacteria en la misma o que ha crecido en la misma. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, la especie de metilobacteria se selecciona del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0020 (NRRL B-50930), NLS0021 (NRRL B-50939), NLS0037 (NRRL B-50941), NLS0038 (NRRL B-50942), NLS0042 (NRRL B-50932), NLS0046 (NRRL B-50929), NLS0062 (NRRL B-50937), NLS0064 (NRRL B-50938), NLS0065 (NRRL B-50935), NLS0066 (NRRL B-50940), NLS0068 (NRRL B-50934), NLS0069 (NRRL B-50936), NLS0089 (NRRL B-50933) y derivados de las mismas. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, las composiciones pueden comprender además un adyuvante agrícolamente aceptable, un excipiente agrícolamente aceptable o combinación de los mismos. En determinados aspectos de la divulgación de cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente, la especie de metilobacteria se selecciona del grupo que consiste en NLS0017 (NRRL B-50931), NLS0020 (NRRL B-50930), NLS0021 (NRRL B-50939), NLS0037 (NRRL B-50941), NLS0038 (NRRL B-50942), NLS0042 (NRRL B-50932), NLS0046 (NRRL B-50929), NLS0062 (NRRL B-50937), NLS0064 (NRRL B-50938), NLS0065 (NRRL B-50935), NLS0066 (NRRL B-50940), NLS0068 (NRRL B-50934), NLS0069 (NRRL B-50936), NLS0089 (NRRL B-50933), derivados de las mismas; y también comprende un adyuvante, excipiente agrícolamente aceptable o combinación de los mismos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar aspectos de la divulgación.

Ejemplo 1. Cultivo de cepas PPFM en un medio de crecimiento líquido complementado con una sustancia sólida

El medio de crecimiento líquido usado para cultivar los cultivos PPFM fue un medio de sales basales complementado con glicerol, peptona y tierra infusoria. El medio de sales basales usado fue medio con sales minerales de amonio (AMS). El medio AMS contiene, por litro, 700 miligramos de fosfato de potasio dibásico anhidro, 540 miligramos de fosfato de potasio monobásico anhidro, un gramo de sulfato de magnesio heptahidrato, 500 miligramos de cloruro de amonio anhidro y 200 miligramos de cloruro de calcio dihidrato.

El medio basal AMS se preparó a partir de tres soluciones madre, enumeradas a continuación:

solución madre I: para un litro a concentración 50X

fosfato de potasio dibásico anhidro 35 gramos

fosfato de potasio monobásico, anhidro 27 gramos

Solución madre II: para un litro a concentración 50X

sulfato de magnesio heptahidrato 50 gramos

cloruro de amonio, anhidro 25 gramos

Solución madre III: para un litro a concentración 50X

cloruro de calcio dihidrato 10 gramos

Las soluciones madre I, II y III se sometieron a autoclave por separado.

Para preparar un litro de medio AMS líquido con glicerol, peptona y tierra infusoria, se añadió lo siguiente a 920 ml de agua destilada:

20 ml de solución madre I

20 ml de solución madre II

20 ml de solución madre III

20 ml de una solución madre de glicerol al 50 %

10 gramos de peptona

2 gramos de tierra infusoria

La solución resultante con tierra infusoria suspendida se esterilizó por autoclave.

Se pusieron dos litros del medio AMS anterior en un matraz de cuatro litros. Se añadieron dos mililitros de PPFM de cultivo líquido al medio para inocularlo. El matraz entonces se colocó en un agitador incubada establecida a 240 RPM y 30 °C. Los cultivos se hicieron crecer durante seis días y después se almacenaron a 4 °C para uso futuro.

Ejemplo 2. Inoculación de siembra de lechuga "Rex" para identificar PPFM que potencien el crecimiento de raíces y brotes.

Siembra

Se puso un Oasis HorticubeXL™ de 104 celdas (fondo surcado, surco único; Smithers-Oasis North America, Kent, OH, EE. UU.) en una bandeja 1020 sin orificios. Se extrajeron cuatro cubos en el centro de la rejilla para permitir el riego inferior. El Oasis HorticubeXL™ se regó de modo que estuviera completamente saturado, se usó la configuración de lluvia con agua moderada. Se colocó una semilla en cada celda para un total de 100 semillas por grupo.

Inoculación de semillas de lechuga

Las cepas PPFM a ensayar se hicieron crecer como se describe en el ejemplo 1 en un medio líquido complementado con una sustancia sólida. En la campana biológica, se pipeteó la cantidad deseada de solución de PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar el frasco vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para centrifugar a 3500 RPM durante 15 minutos a 23 °C. Aunque se centrifugaron los tubos, se midió un volumen de agua corriente tibia para llevar el volumen de cada muestra hasta el volumen total.

El líquido se vertió cuidadosamente de cada tubo, teniendo cuidado de mantener el sedimento intacto. Se añadió el volumen apropiado de agua corriente a cada tubo para que coincidiera con su volumen inicial de solución de PPFM. Se usaron PPFM resuspendidas en agua lo más rápido posible.

Se pipetearon 100 microlitros de solución (solución de PPFM para grupos tratados y agua corriente para grupos de control) en la parte superior de cada semilla. Después de cada 3 filas, el tubo se tapó y se agitó para resuspender cualquier PPFM que pudiera haber sedimentado en el fondo. Las puntas de pipeta se cambiaron entre cada grupo para evitar contaminación cruzada. Las marcas se etiquetaron y fecharon para cada bandeja y se colocaron cúpulas transparentes de humedad en la parte superior de la bandeja. La bandeja se colocó en una cámara de crecimiento con ajuste de temperatura a 20° C y 12 horas al día con iluminación de 200 micromoles.

Crecimiento

Después de cinco a seis días, se retiraron las cúpulas tras la germinación de las semillas. Las bandejas se regaron por el fondo solamente y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE. UU.) en cada riego (aproximadamente días alternos).

La reposición diaria de las bandejas se realizó para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de condiciones de luz en la cámara de crecimiento.

Procesamiento

Las bandejas se recolectaron entre dos y tres semanas. Se colocaron cúpulas transparentes de humedad en cada bandeja para evitar la evotranspiración durante el transporte. Las cúpulas se dejaron en su sitio hasta que se procesara la bandeja. Cada planta se cortó directamente por debajo de los cotiledones e inmediatamente se pesó en una balanza analítica.

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de brotes de plántulas de lechuga cuando se trataba una semilla en el momento de la siembra. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de la raíz, los grupos tratados mostraron más crecimiento en el momento de la recolección. Debido a la variación natural de los sistemas biológicos, todos los tamaños de muestras fueron de 98 - 100 plantas como mínimo y cualquier diferencia por debajo del 12 % no se consideró significativa.

Conclusión

Es evidente que las cepas NLS0017, NLS0020, NLS0066, NLS0065 y NLS0089 muestran un aumento en el peso húmedo de plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. Las cepas NLS0069, NLS0037, NLS0038 y NLS0062 mostraron aumentos insignificantes en el peso húmedo en comparación con los controles. También se aprecia junto con un aumento en la biomasa de los brotes un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Tabla 2. Efectos de los tratamientos de las semillas sobre el crecimiento de la lechuga

Ejemplo 3. Aplicación foliar de lechuga "Rex" para observar la manera en que las PPFM afectan al crecimiento de las raíces y los brotes.

Siembra

Se puso un Oasis HorticubeXL de 104 celdas (fondo surcado, surco único) en una bandeja 1020 sin orificios. Se extrajeron cuatro cubos en el centro de la rejilla para permitir el riego inferior. El Oasis se regó de modo que estuviera completamente saturado, se usó la configuración de lluvia con agua moderada. Se colocó una semilla en cada celda para un total de 100 semillas por grupo. Las marcas se etiquetaron y fecharon para cada bandeja y se colocaron cúpulas transparentes de humedad en la parte superior de la bandeja. La bandeja se colocó en una cámara de crecimiento con ajuste de temperatura a 20° C y 12 horas al día con iluminación de 200 micromoles.

Inoculación de plántulas de lechuga

Después de cinco a seis días, se retiraron las cúpulas después de que las semillas hubieran germinado. Las plantas se inocularon en este momento, cuando solo habían germinado los cotiledones. Las cepas PPFM a ensayar se hicieron crecer como se describe en el ejemplo 1 en un medio líquido complementado con una sustancia sólida. Las cepas PPFM a ensayar se hicieron crecer como se describe en el ejemplo 1 en un medio líquido complementado con una sustancia sólida. En la campana biológica, se pipeteó la cantidad deseada de solución de PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar el frasco vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para centrifugar a 3500 RPM durante 15 minutos a 23 °C. Aunque se centrifugaron los tubos, se midió un volumen de agua corriente tibia para llevar el volumen de cada muestra hasta el volumen total.

Se vertieron 100 ml de solución de PPFM (agua corriente para el control) en un pulverizador manual de 1 l Solo™ (Solo™, Newport News, VA, EE. UU.). La bandeja se retiró del grupo para evitar la contaminación cruzada. Se usó la configuración de bruma más fina y se pulverizó un recubrimiento uniforme de solución sobre la parte superior de las plántulas, garantizando una cobertura uniforme por toda la bandeja completa. Esto se repitió para cada grupo usando el tratamiento apropiado.

Crecimiento

Las bandejas se regaron por el fondo solamente y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE. UU.) en cada riego (aproximadamente días alternos). La reposición diaria de las bandejas se realizó para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de condiciones de luz en la cámara de crecimiento. Procesamiento

Las bandejas se recolectaron entre dos y tres semanas. Se colocaron cúpulas transparentes de humedad en cada bandeja para evitar la evotranspiración durante el transporte. Las cúpulas se dejaron en su sitio hasta que se procesara la bandeja. Cada planta se cortó directamente por debajo de los cotiledones e inmediatamente se pesó en una balanza analítica. Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de los brotes de plántulas de lechuga cuando la plántula se trataba en el momento de cotiledón. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de la raíz, de que los grupos tratados mostraban más crecimiento en el momento de la recolección. Debido a la variación natural de los sistemas biológicos, todos los tamaños de las muestras fueron de un 98 - 100 plantas como mínimo y cualquier diferencia por debajo del 12 % no se consideró significativa.

Conclusión

Es evidente que las cepas NLS0042, NLS0017, NLS0020 y NLS0068 muestran un aumento en el peso húmedo de plántulas de lechuga después de aplicación foliar. Las cepas NLS0069, NLS0037, NLS0038 y NLS0062 mostraron aumentos insignificantes en el peso húmedo en comparación con los controles. También se aprecia junto con un aumento en la biomasa de los brotes un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Tabla 3. Efectos de los tratamientos foliares sobre el crecimiento de lechuga

Ejemplo 4. Identificación de polimorfismos de ácido nucleico presentes en metilobacterias que mejoran la producción de lechuga

Se generan colecciones de secuenciación de todo el genoma para la plataforma de secuenciación de alto rendimiento Illumina™ para aislados de especies de metilobacterias proporcionados en la tabla 1 usando kits de preparación de muestras de ADN Illumina TRUSEQ™ o NEXTERA™ (descritos en los sitios de Internet res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_truseq_dna_sample_prep_kits.pdf y res.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_nextera_dna_sample_prep.pdf) usando los métodos descritos por el fabricante. Las colecciones resultantes entonces se someten a pirosecuenciación (Siqueira JF et al. J Oral Microbiol. 2012; 4: 10.3402/jom.v4i0.10743). Los datos sin procesar de secuencias genómicas generadas por pirosecuenciación se someten a ajuste basado en adaptador y calidad para el control de calidad. Se consigue en un ensamblaje de secuencia forzoso de todo el genoma (1) ensamblando los datos que han pasado el control de calidad usando el ensamblador de novo Velvet (2). Para el hallazgo y anotación de genes, se aprovecharon los datos de instrucción de referencia de TIGRFAM (9), Pfam, COG (10) y UniRef100 (11). Los ARNr se identifican con RNAmmer (5), los genes que codifican proteínas se identifican con Glimmer (3) o Maker (6), y los ARNt se identifican con tRNAscan-SE (4). Las funciones génicas se asignan con blastx (7), blastp (7), HMMER (8) e InterProScan frente a bases de datos de proteínas exhaustivas descritas anteriormente (datos de referencia).

La detección de polimorfismos (SNP u otras variaciones de ADN que se producen como resultado de inserciones, eliminaciones y sustituciones (indeles)) en los aislados de especies de metilobacteria de la tabla 1 se realiza con BWA (12) y el paquete Samtools (en Internet en samtools.sourceforge.net/), la variación estructural se define con BreakDancer (en Internet en breakdancer.sourceforge.net/) y CoGE (en Internet en genomevolution.org/CoGe/). Los polimorfismos diagnósticos para metilobacterias que proporcionan producción de lechuga aumentada se identifican por comparaciones de las secuencias de los aislados de metilobacterias ejemplares NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y/o NLS0068 que mejoran la producción de lechuga, pero que están ausentes de uno o más aislados de metilobacterias que no mejoran la producción de lechuga. Los polimorfismos presentes en los aislados de las metilobacterias ejemplares NLS0020, NLS0066, NLS0017, NLS0065, NLS0089, NLS0042 y/o NLS0068 que mejoran la producción de lechuga, pero que están ausentes en aislados de metilobacterias ejemplares que no mejoran la producción de lechuga, se usan entonces para identificar otros aislados de metilobacterias que mejoran la producción de lechuga.

Referencias para el ejemplo 4

1. Miller JR, Koren S, Sutton G (2010) Assembly algorithms for next-generation sequencing data. Genomics 95: 315 327.

2. Zerbino DR, Birney E (2008) Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res 18: 821-829.

3. Delcher AL, Bratke KA, Powers EC, Salzberg SL (2007) Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with Glimmer. Bioinformatics 23: 673-679.

4. Lowe TM, Eddy SR (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res 25: 955-964.

5. Lagesen K, Hallin P, Rodland EA, Staerfeldt HH, Rognes T, et al. (2007) RNAmmer: consistent and rapid annotation of ribosomal Rn A genes. Nucleic Acids Res 35: 3100-3108.

6. Cantarel B, Korf I, Robb S, et al. (2008) MAKER: An easy-to-use annotation pipeline designed for emerging model organism genomes. Genome Research 18: 188-196.

7. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402.

8. Eddy SR (2009) A new generation of homology search tools based on probabilistic inference. Genome Inform 23: 205-211.

9. Haft DH, Selengut JD, White O (2003) The TIGRFAMs database of protein families. Nucleic Acids Res 31: 371-373.

10. Tatusov RL, Fedorova ND, Jackson JD, Jacobs AR, Kiryutin B, et al. (2003) The COG database: an updated version includes eukaryotes. BMC Bioinformatics 4: 41.

11. Suzek BE, Huang H, McGarvey P, Mazumder R, Wu CH (2007) UniRef: comprehensive and non-redundant UniProt reference clusters. Bioinformatics 23: 1282-1288.

12. Li H. y Durbin R. (2009) Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, 25:1754-60.

Ejemplo 5. La inoculación de semillas de lechuga "Flandria" con PPFM aumenta la biomasa de brotes y raíces.

Siembra

Se colocó una plancha de 276 celdas de Oasis HORTICUBES® (corte delgado de 2,54 cm (1 pulgada); Smithers-Oasis North America, Kent, OH, EE. UU.) en una bandeja de malla 1020. La bandeja se dividió a la mitad con un trozo de plástico para permitir dos grupos por bandeja. Los Oasis HORTICUBES® se regaron hasta saturación completa. Se usaron semillas de lechuga Flandria de Rijk Zwaan USA (Salinas, CA, EE. UU.). Se colocó una semilla en cada celda para un total de 132 o 144 semillas por grupo.

Inoculación de semillas de lechuga

Las cepas PPFM a ensayar se hicieron crecer como se describe en el ejemplo 1 en un medio líquido complementado con tierra infusoria a 2 gramos/litro. En el banco de trabajo, se pipeteó la cantidad deseada de solución de PPFM en tubos cónicos (asegurándose de dar vueltas/agitar el frasco vigorosamente antes del pipeteo para suspender las partículas). Se usó una centrífuga para sedimentar las células a 7500 RPM durante 5 minutos a 23 °C. Se desechó el sobrenadante y los sedimentos de PPFM se resuspendieron en un volumen igual de agua.

Se pipetearon 100 microlitros de solución (solución de PPFM para grupos tratados y agua corriente para grupos de control) en la parte superior de cada semilla. El tubo se agitó periódicamente para mantener las células PPFM en suspensión. Se colocaron cúpulas transparentes de humedad sobre cada bandeja. Las bandejas se colocaron en un invernadero con ajustes de temperatura de 30 °C durante el día, 28 °C por la noche y con una duración de 16 horas de día obtenida con el uso de luz complementaria si fuera necesario.

Crecimiento

Después de dos a tres días después de la siembra, las semillas habían germinado y se retiraron las cúpulas de humedad. Las bandejas se regaron por la parte superior y se fertilizaron con Jack's™ 15-16-17 (JR PETERS, Inc. Allentown, PA, EE. UU.) en cada riego. La reposición diaria de las bandejas se realizó para evitar los posibles efectos sobre el crecimiento debido a variaciones de condiciones de luz en la cámara de crecimiento.

Procesamiento

Las plántulas de lechuga se recolectaron a los 10 días después de la siembra. Cada planta se cortó directamente por debajo de los cotiledones e inmediatamente se pesó en una balanza analítica.

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de brotes de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de las raíces, y se apreció que los grupos tratados mostraban más crecimiento en el momento de la recolección. La fila exterior de cada grupo no se recolectó para eliminar cualquier efecto de borde en las bandejas.

Conclusión

Es evidente que las cepas PPFM NLS0017, NLS0020, NLS0066 NLS0068 mostraban un aumento reproducible y estadísticamente significativo en el peso húmedo de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se apreció junto con un aumento en la biomasa de los brotes un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Tabla 4. Resultados para la inoculación de semillas de lechuga "Flandria"

Referencias

1. Abanda-Nkpwatt, D., M. Musch, J. Tschiersch, M. Boettner y W. Schwab. 2006. Molecular interaction between Methylobacterium extorquens and seedlings: growth promotion, methanol consumption, and localization of the methanol emission site. J. Exp. Bot. 57: 4025-4032.

2. Broekaert WF, Terras FR, Cammue BP, Vanderleyden J (1990) An automated quantitative assay for fungal growth inhibition. FEMS Microbiology Letters 69: 55-60.

3. Cao, Y-R, Wang, Q., Jin, R-X., Tang, S-K., He, W-X., Lai, H-X, Xu, L-H. y C-L Jiang. 2011. Methylobacterium soli sp. nov. a methanol-utilizing bacterium isolated from the forest soil. Antonie van Leeuwenhoek (2011) 99:629-634.

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Ejemplo 6. La inoculación de semillas de lechuga "Rex" con PPFM aumenta la biomasa de brotes y raíces.

Siembra

Se colocó una plancha de 276 celdas de Oasis HORTICUBES® (corte delgado de 2,54 cm (1 pulgada); Smithers-Oasis North America, Kent, OH, EE. UU.) en una bandeja de malla 1020. La bandeja se dividió a la mitad con un trozo de plástico para permitir dos grupos por bandeja. Los Oasis HORTICUBES® se regaron hasta saturación completa. Se usó semillas de lechuga Rex. Se colocó una semilla en cada celda para un total de 132 o 144 semillas por grupo.

Inoculación de semillas de lechuga

Crecimiento

Procesamiento

Observaciones

Se observó que algunas cepas mostraban repetidamente un aumento en la biomasa de brotes de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se hicieron observaciones visuales de la masa y desarrollo de las raíces, y se apreció que los grupos tratados mostraban más crecimiento en el momento de la recolección. La fila exterior de cada grupo no se recolectó para eliminar cualquier efecto de borde en las bandejas. Los resultados son como se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 5.

Conclusión

Fue evidente que las cepas PPFM NLS0017, NLS0020, NLS21, NLS0037, NLS0038, NLS42, NLS46, NLS62, NLS64, NLS0065, NLS0066, NLS0068 y NLS0089 mostraban un aumento reproducible y estadísticamente significativo en peso húmedo de las plántulas de lechuga después del tratamiento de las semillas. También se apreció junto con un aumento en la biomasa de los brotes un aumento correspondiente en el desarrollo de las raíces.

Ejemplo 7. Ensayos de semillas Flandria

Se trataron semillas de lechuga Flandria con los aislados PPFM indicados esencialmente como se describe en el ejemplo 5 para producir los siguientes resultados.

Table 6

Fue evidente que las cepas PPFM NLS0017, NLS0037, NLS0066, NLS0020, NLS0042, NLS0065, NLS0089, NLS0046, NLS0021, NLS0069, NLS0068, NLS0064, NLS0062 y NLS0038 podían proporcionar una biomasa de lechuga aumentada con respecto a los tratamientos de control.

Ejemplo 8. Identificación de genes ortólogos presentes en especies de metilobacterias que pueden mejorar la producción de lechuga

Las cepas PPFM enumeradas en la tabla 1 se hicieron crecer en medio de agar sólido que comprende sales minerales de amonio (AMS) más glicerol y peptona a 30 °C durante 5 días, esencialmente como se describe en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos del mismo cesionario que la presente n.° US20130324407. Se extrajo el ADN genómico usando el kit de aislamiento de ADN microbiano MO-BIO (Carlsbad, CA) Ultra Clean, y se usó 1 pg de ADN de alta calidad para la preparación de colección Illumina Nextera XT seguido de secuenciación de extremos emparejados Illumina 2x100 en un sistema HiSeq2000. Los datos sin procesar de secuencia genómica de Illumina se sometieron a ajuste basado en adaptador y calidad para el control de calidad. Se consiguió un ensamblaje de secuencia forzosa de todo el genoma ensamblando los datos que han pasado el control de calidad usando el ensamblador de novo SPADES (33). Para el hallazgo y anotación de genes, se aprovecharon los datos de instrucción de referencia de TIGRFAM (9), Pfam, COG (10) y UniRef100 (11). Los ARNr se identificaron con RNAmmer (5), los genes que codifican proteínas se identificaron con Glimmer (3) y Maker (6), y los ARNt se identificaron con tRNAscan-SE (4). Las funciones génicas se asignaron con blastx (7), blastp (7), HMMER (8) e InterProScan frente a bases de datos de proteínas exhaustivas descritas anteriormente (datos de referencia). La detección de polimorfismos (SNP u otras variaciones de ADN que se producen como resultado de inserciones, eliminaciones y sustituciones (indeles)) en los aislados de especies de metilobacteria se realizó con BWA (12) y el paquete Samtools (en Internet en samtools.sourceforge.net/) y Genome Analysis Toolkit (GATK, disponible en el sitio de Internet "broadinstitute.org/gatk/"), la variación estructural se identificó con BreakDancer (en Internet en breakdancer.sourceforge.net/) y CoGE (en Internet en genomevolution.org/CoGe/).

Se predijeron genes que codificaban marcos abiertos de lectura a partir de las secuencias genómicas completas ensambladas de NLS0017, NLS0020, NLS0037, NLS0042, NLS0065, NLS0066, NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 esencialmente como se describe anteriormente. Dentro y entre el genoma se agruparon genes ortólogos usando OrthoMCL (disponible en el sitio de Internet "orthomcl.org/orthomcl/"). Se asignaron supuestas anotaciones funcionales a los productos génicos usando BLASTP (disponible en el sitio de Internet "blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi") frente a la base de datos UniProt (disponible en el sitio de Internet "uniprot.org/"). Los genes presentes en genomas individuales de NLS0017, NLS0020, NLS0037, NLS0042, NLS0065 y NLS0066 que podían mejorar la producción de lechuga (como se muestra en el ejemplo 7), pero que están ausentes en el conjunto completo de genomas de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 que no mejoraban la producción de lechuga (como se muestra en el ejemplo 7) se identificaron en grupos OrthoMCL usando un programa informático personalizado. Las proteínas codificadas encontradas en las metilobacterias NLS0017, NLS0020, NLS0037, NLS0042, NLS0065 y NLS0066 que podían mejorar la producción de lechuga se proporcionan en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 1-5125. Las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de SEQ ID NO: 1-5125 son SEQ ID NO: 5126-10250, respectivamente. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0017, ^{pero ausentes de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 se proporcionan como SEQ ID}nO: ^{1-1086. Las proteínas}codificadas por genes presentes en NLS0020, pero ausentes de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 se proporcionan como SEQ ID NO: 1087-2176. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0037, pero ausentes de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 se proporcionan como SEQ ID NO: 2177-2461. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0042, pero ausentes de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 se proporcionan como SEQ ID NO: 2462-3347. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0065, pero ausentes de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 se proporcionan como SEQ ID NO: 3348-3949. Las proteínas codificadas por genes presentes en NLS0066, pero ausentes de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 se proporcionan como SEQ ID NO: 3950-5125. Los grupos de genes ortólogos que representan genes que codifican proteínas encontradas en los genomas de al menos dos genomas individuales de NLS0017, NLS0020, NLS0037, NLS0042, NLS0065 y/o NLS0066 que podían mejorar la producción de lechuga (como se muestra en el ejemplo 7), pero que están ausentes en el conjunto completo de genomas de NLS0135, NLS0071, NLS0109 y NLS0142 que no mejoraban la producción de lechuga se proporcionan en la tabla 7. En la tabla 7, se proporcionan grupos de genes ortólogos en cada fila, donde la secuencia más larga y el número de identificación de secuencia único asociado se designan como una secuencia de referencia para representar el grupo ortólogo (columna 3 de la tabla 7). El número de identificación del grupo ortólogo se proporciona en la columna 1 de la tabla 7, la identidad génica más cercana basada en comparaciones de bases de datos se proporciona en la columna 2 de la tabla 7 y la secuencia de referencia para cada grupo ortólogo se proporciona en la columna 3 de la tabla 7. Ejemplos de secuencias ortólogas encontradas en NLS0017, NLS0020, NLS0037, NLS0042, NLS0065 y NLS0066 se proporcionan como SEQ ID NO: en la tabla 7, columnas 4, 5, 6, 7, 8 y 9, respectivamente.

Tabla 7. Grupos de genes ortólogos

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una metilobacteria aislada NLS0089 (NRRL B-50933).

2. Una composición que comprende: (i) la metilobacteria aislada de la reivindicación 1; y (ii) un adyuvante, excipiente agrícolamente aceptable o combinación de los mismos.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que la metilobacteria aislada está a un valor cuantitativo de al menos 1 x 104 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 105 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 5 x 106 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 107 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 5 x 108 unidades formadoras de colonias por mililitro, al menos 1 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro o al menos 3 x 1010 unidades formadoras de colonias por mililitro.

4. Uso de la composición de la reivindicación 2 para tratar una planta, una parte de la planta o propágulo de una planta.

5. El uso de la reivindicación 4, en el que la parte de la planta es una hoja, tallo, flor, raíz, semilla, fruto, tubérculo o coleóptilo.

6. Una composición que comprende: (a) (i) una sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma; o (ii) una emulsión con metilobacteria que ha crecido en la misma; en la que la metilobacteria es la metilobacteria aislada de la reivindicación 1; y (b) un excipiente, adyuvante agrícolamente aceptable o combinación de los mismos.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que la sustancia sólida con metilobacteria adherente que ha crecido en la misma tiene un valor cuantitativo de metilobacteria de al menos 5 x 108 UFC/g a al menos 1 x 1014 UFC/g.

9. La composición de la reivindicación 2 o 6, en la que la composición es un producto esencialmente seco que tiene un 5 % o menos de contenido de agua.

10. La composición de la reivindicación 2, en la que la composición comprende además un plaguicida.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que el plaguicida es un insecticida, un fungicida, un nematicida o un bactericida.

12. La composición de la reivindicación 2, en la que la composición comprende además un microrganismo distinto de metilobacteria, en la que dicho microorganismo es bioplaguicida o proporciona algún otro beneficio cuando se aplica a una planta o parte de la planta.

13. La composición de reivindicación 12, en la que el microrganismo es Bacillus sp., Pseudomonas sp., Coniothyrium sp., Pantoea sp., Streptomyces sp. o Trichoderma sp.

14. La composición de la reivindicación 2, en la que el adyuvante agrícolamente aceptable potencia la eficacia del producto o la facilidad de aplicación del producto.

15. Una planta, parte de la planta o semilla que se recubre o recubre parcialmente con la composición de la reivindicación 2.