ES2851798T3 - Método y dispositivo para discriminar entre infecciones virales y bacterianas - Google Patents
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Abstract
Un dispositivo de ensayo en el punto de atención (POC) que comprende a. Una zona de aplicación de muestra, y b. Una zona de detección con un primer reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína Mx-B (Mx-B) y un segundo reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína C reactiva o procalcitonina (PCR/PCT), y c. En donde el dispositivo está configurado para detectar Mx-B y PCR/PCT en una muestra de un sujeto para discriminar entre infección bacteriana y viral.
Description
DESCRIPCIÓN
Método y dispositivo para discriminar entre infecciones virales y bacterianas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de los ensayos en el punto de atención (POC, por sus siglas en inglés) para discriminar entre infecciones virales y bacterianas. Más particularmente, atañe a un inmunoensayo que distingue rápidamente entre infecciones virales y/o bacterianas.
Antecedentes de la técnica
La fiebre es una causa común de visitas infantiles a los centros de atención de urgencia, tanto para consultorios de medicina familiar como pediátricos. Más comúnmente, esto se relaciona o a una infección respiratoria o gastroenteritis. La alta incidencia de fiebre en los niños y la administración preventiva de antibióticos innecesarios es motivo para desarrollar un ensayo de detección rápida de los biomarcadores que indican infección viral y/o bacteriana.
La neumonía severa adquirida en la comunidad es causada por infecciones bacterianas en alrededor del 60% de los casos, que requiere el ingreso a una unidad de cuidados intensivos (UCI) para alrededor del 10% de los pacientes. El 40% restante está relacionado con virus respiratorios. La mayoría de las infecciones respiratorias están relacionadas con faringitis, de las cuales el 40% son causadas por virus y el 25-50% por estreptococos beta-hemolíticos del grupo A. Las últimas causas son la bronquiolitis aguda y la neumonía.
Aproximadamente el 80% de todos los antimicrobianos se prescriben en atención primaria y hasta el 80% de estos son para indicaciones del tracto respiratorio. Las infecciones del tracto respiratorio son de lejos, la causa más común de tos en la atención primaria. A menudo se prescriben antibióticos de amplio espectro para la tos, incluida la bronquitis aguda, y muchas de estas prescripciones solo beneficiarán a los pacientes marginalmente, si es que lo hacen, y pueden causar efectos secundarios y promover la resistencia a los antibióticos. Los factores que instan a los médicos a administrar antibióticos incluyen la ausencia de un marcador diagnóstico adecuado de infecciones bacterianas, la preocupación por la falta de seguimiento del paciente y la presión del tiempo.
Todavía es un desafío diferenciar rápidamente las infecciones virales de las bacterianas. Más recientemente, se han identificado muchos marcadores de diagnóstico nuevos. Varios de estos marcadores son muy prometedores para diferenciar las infecciones virales de las bacterianas. Tales proteínas incluyen las Mx-GTPasas y la proteína C reactiva (PCR).
Las proteínas homólogas a Mx son miembros de la superfamilia de GTPasas de alto peso molecular. En consecuencia, estas GTPasas están reguladas positivamente por interferones de tipo I alfa/beta o de tipo II (IFN). Las Mx GTPasas se expresan exclusivamente en células tratadas con IFN alfa/beta pero no con IFN gamma. Los interferones de tipo I desempeñan papeles importantes en las respuestas inmunes innatas y tienen funciones inmunomoduladoras, antiproliferativas y antivirales.
Estudios propios han demostrado que las proteínas humanas homólogas a Mx tienen las siguientes ventajas: 1) Las proteínas humanas homólogas a Mx en seres humanos se expresan sobre todo de forma intracelular. Pueden ser visibles mediante tinción intracelular en la mayoría de los compartimentos celulares [16]. 2) Las proteínas homólogas a Mx se inducen de una manera dependiente de la dosis [6]. 3) Las proteínas humanas homólogas a Mx son inducidas específicamente por interferones de tipo I, no por FN-gamma, IL-I, TNF-alfa o cualquiera de las otras citocinas por infección bacteriana [8,12]. 4) Las proteínas humanas homólogas a Mx son mucho más detectables en comparación con el interferón tipo I en el sistema sanguíneo periférico [6]. Por lo tanto, estas proteínas son marcadores para identificar enfermedades virales [7, 14, 15]. Además, estas proteínas podrían usarse como un marcador para identificar a los pacientes tratados con interferones de tipo I si los tratamientos con IFN son exitosos o no [5,9,10,11]. En los primeros estudios detectamos estas proteínas mediante Western Blot después de SDS-PAGE.12Pero este procedimiento necesita más de dos días. Por lo tanto, establecimos un ELISA para detectar estas proteínas en dos días [13].
Basado en estos hechos y en la suposición de que los interferones de tipo I permanecen dentro de los niveles normales en pacientes con infecciones bacterianas, la expresión de la proteína homóloga a Mx en sangre periférica es un marcador sensible y específico de infección viral.
De manera similar, se ha informado que la mayoría de las infecciones virales causan pequeñas concentraciones de respuesta de fase aguda y concentraciones bajas de proteína C reactiva (PCR), niveles de procalcitonina (PCT) y la proteína que aumenta la permeabilidad/bactericidad (BPI, por sus siglas en inglés). Por tanto, estas proteínas se usarán para distinguir enfermedades de origen viral de las de etiología bacteriana. Debido a que la concentración plasmática de PCR aumenta rápidamente después de la estimulación y disminuye rápidamente con una vida media corta, la PCR puede ser una herramienta muy útil para diagnosticar y monitorear infecciones y enfermedades inflamatorias. En Escandinavia, el ensayo de PCR en el lugar de atención es parte de la evaluación de rutina de los pacientes con infecciones respiratorias en la práctica general, y su uso ha demostrado ser rentable. En la práctica general, la PCR se considera valiosa en el diagnóstico de enfermedades bacterianas y en la diferenciación parcial entre infecciones bacterianas y virales. A menudo, el valor diagnóstico de la PCR se considera superior al de la velocidad de sedimentación globular (VSG) y superior o igual al del recuento de glóbulos blancos (WBC, por sus siglas
en inglés). La desventaja de este ensayo en el punto de atención es el largo tiempo de detección. Estos ensayos necesitan entre 30 minutos y 2 horas como mínimo.
Clínicamente, puede ser complejo diferenciar determinadas infecciones virales y bacterianas sistémicas. Los cultivos bacterianos generalmente se realizan en casos de infección grave, como neumonía, o cuando la consecuencia de omitir un diagnóstico puede llevar a complicaciones graves, tal como la faringitis estreptocócica. A menudo, los cultivos son difíciles de obtener. Desafortunadamente, los cultivos virales no se realizan de forma rutinaria debido al retraso de tiempo significativo en la recepción de los resultados. Los nuevos paneles de PCR de cribado viral son útiles, pero son costosos y no proporcionan información en el punto de atención, porque los resultados solo se pueden lograr después de 24 horas. Por tanto, sigue existiendo una necesidad de un ensayo de diagnóstico sencilla y fácil de usar que sea capaz de diferenciar las infecciones virales y bacterianas en corto tiempo.
El documento WO2010/033963 describe un inmunoensayo de flujo lateral para la detección y diferenciación entre infecciones virales y bacterianas. El marcador bacteriano es la PCR y el marcador viral es la proteína Mx-A. El ensayo se comercializa en Europa con el nombre comercial FebriDx®. Sin embargo, según un estudio, FebriDx® tiene solo una precisión del 63% y 84% para identificar infecciones bacterianas y virales, respectivamente17. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un ensayo de diagnóstico rápido en el punto de atención para la discriminación más precisa y fiable entre infecciones bacterianas y virales en pacientes.
Compendio de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar un ensayo de diagnóstico mejorado y más preciso y específico para la discriminación fiable de infecciones bacterianas y virales en pacientes en corto tiempo. El objeto se resuelve mediante la materia objeto de la presente invención.
Según la invención, se proporciona un dispositivo de inmunoensayo en el punto de atención (POC) que comprende:
a. Una zona de aplicación de muestra, y
b. Una zona de detección con un primer reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína Mx-B (Mx-B) y un segundo reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína C reactiva o procalcitonina (PCR/PCT), y
en donde el dispositivo está configurado para detectar Mx-B y PCR/PCT en una muestra de un sujeto para discriminar entre infección bacteriana y viral.
Según una realización adicional de la invención, se proporciona un dispositivo de inmunoensayo en el punto de atención (POC) que comprende:
a. Una zona de aplicación de muestra, y
b. Una zona de detección con un primer reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína Mx-B (Mx-B) y un segundo reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína C reactiva (PCR), y un tercer reactivo de detección con afinidad de unión a la procalcitonina (PCT) y/o un cuarto reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína que aumenta la permeabilidad /bactericidad BPI, y
en donde el dispositivo está configurado para detectar Mx-B y PCR/PCT en una muestra de un sujeto para discriminar entre infección bacteriana y viral.
Una realización de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, que comprende además un tercer reactivo de detección con afinidad de unión a BPI.
Una realización de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, en donde dichos reactivos de detección se seleccionan de moléculas sintéticas, nucleótidos, ácidos nucleicos, aptámeros, péptidos, proteínas, enzimas y anticuerpos.
Una realización de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, en donde dichos reactivos de detección están marcados con un marcador detectable.
Una realización adicional de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, en donde el marcador detectable se selecciona de un marcador enzimático, marcador fluorescente, marcador radiactivo, marcador de partículas, partículas de látex coloreadas, partículas de plástico coloreadas, partículas de fósforo coloreadas y partículas fluorescentes.
Una realización adicional de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, que comprende además una ventana de ensayo configurada para permitir la observación de los resultados del ensayo.
Una realización adicional de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, en donde los reactivos de detección se conjugan químicamente al marcador detectable para formar un complejo de reactivomarcador permanente e irreversible.
Una realización adicional de la invención se refiere a lo que se describe en este documento, en donde el marcador detectable conjugado al reactivo de detección está configurado para que sea visible a un usuario cuando la muestra es positiva para Mx-B y/o PCR y/o PCT y/o BPI y.
Una realización adicional de la invención se refiere al dispositivo como se describe en la presente memoria, en donde el dispositivo está configurado para/o PCT y/o BPI en muestras de sangre humana.
Una realización de la invención se refiere a un método para discriminar entre infección bacteriana y viral en un sujeto, que comprende las etapas de:
a. Proporcionar una muestra obtenida de dicho sujeto,
b. Proporcionar el sistema de ensayo como se describe la presente memoria,
c. Aplicar la muestra al sistema de ensayo,
d. Observar la ausencia o presencia del complejo de reactivo-marcador detectable para determinar si la muestra contiene Mx-B y/o PCR y/o PCT y/o BPI, y
e. Determinar el estado de infección del paciente.
Una realización de la invención se refiere al método como se describe en la presente memoria, en donde a. La presencia de Mx-B y la ausencia y/o baja detección de PCR/PCT/BPI es indicativa para una infección viral, b. La ausencia de Mx-B y la presencia de PCR/ PCT/BPI es indicativa para una infección bacteriana; y
c. La presencia de Mx-B y la presencia de PCR/PCT/BPI es indicativa para una infección mixta.
Una realización adicional de la invención se refiere al método como se describe en la presente memoria, que observa además la ausencia o presencia del complejo de reactivo-marcador detectable para determinar si la muestra contiene PCR/PCT/BPI.
Una realización de la invención se refiere al método como se describe en la presente memoria, en donde a. La presencia de Mx-B y la ausencia de PCR/PCT y BPI es indicativa para una infección viral,
b. La ausencia de Mx-B y la presencia de PCR/PCT y BPI es indicativa para una infección bacteriana; y c. La presencia de Mx-B y la presencia de PCR/ PCT y BPI es indicativa para una infección mixta.
Una realización adicional de la invención se refiere al método descrito en la presente memoria, en donde la muestra es una muestra de sangre.
Una realización adicional de la invención se refiere al método como se describe en la presente memoria, en donde la presencia de Mx-B, PCR/PCT y/o BPI es visible a simple vista.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1A representa una etapa de ensayo ejemplar que consta de tres tiras de ensayo recubiertas con anticuerpos marcados.
La Fig. 1B representa las diferentes imágenes de ensayo para infecciones virales, infecciones bacterianas, infecciones mixtas o infección dudosa.
La Fig. 2 muestra los resultados para diferentes patógenos virales y bacterianos.
Descripción de las realizaciones
La presente invención proporciona un ensayo en el punto de atención que es capaz de diferenciar infecciones virales y bacterianas en corto tiempo. Específicamente, se proporciona un dispositivo de diagnóstico en el punto de atención que comprende marcadores de ensayo para infecciones tanto víricas como bacterianas que ayudan eficazmente al médico en la diferenciación rápida de infecciones víricas y bacterianas. El ensayo en el punto de atención tiene las siguientes ventajas:
1) Este ensayo puede reducir drásticamente los costes sanitarios limitando los diagnósticos erróneos y, en consecuencia, el uso excesivo e inadecuado de los antibióticos.
2) La eficacia y garantía de este ensayo es que se reducirá la resistencia a los antibióticos, porque los antibióticos se usarán solo cuando esté presente una infección bacteriana.
3) Este ensayo aumentará la cartera de diagnósticos de consultorios médicos y farmacéuticos.
Por tanto, la presente invención contribuye al uso apropiado de antibióticos. Esto significa usar antibióticos solo cuando sea necesario y, si es necesario, usarlos correctamente.
Los antibióticos no combaten las infecciones causadas por virus como los resfriados, la gripe, la mayoría de los dolores de garganta y la bronquitis. Incluso muchas infecciones de los senos nasales y del oído pueden mejorar sin antibióticos. En cambio, el alivio de los síntomas podría ser la mejor opción de tratamiento para estas infecciones. Tomar antibióticos para infecciones virales, tal como resfriados, gripe, la mayoría de los dolores de garganta y bronquitis:
- no curará la infección;
- no evitará que otras personas se enfermen;
- no le ayudará a usted ni a su hijo a sentirse mejor;
- puede causar efectos secundarios innecesarios y dañinos; y
- puede contribuir a la resistencia a los antibióticos, que es cuando las bacterias son capaces de resistir los efectos de un antibiótico y continúan causando daño.
Los antibióticos prescritos incorrectamente tienen un beneficio terapéutico cuestionable y exponen a los pacientes a posibles complicaciones de la terapia con antibióticos. El resultado rápido obtenido del ensayo en el punto de atención permite así un diagnóstico correcto y apoya al médico en su decisión para prescribir la medicación correcta.
Para el ensayo en el punto de atención pueden ser aplicables diferentes dispositivos, p. ej., dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral o un sistema de sensor óptico, que está diseñado para interactuar con un dispositivo de computadora móvil como se describe en el documento WO2016/116181.
Por tanto, según una realización de la presente invención, se usa un dispositivo de análisis de muestras, por ejemplo una tira de ensayo, para determinar si una infección es bacteriana o viral. La tira de ensayo incluye una zona de aplicación de muestra y una zona de detección. En este método, se recoge una muestra y se transfiere a la tira de ensayo. La zona de detección incluye al menos un reactivo específico para un marcador bacteriano y al menos un reactivo específico para un marcador viral.
En una realización, el marcador de infección viral es Mx-B y el marcador de infección bacteriana es la proteína C reactiva (PCR). Niveles altos de proteína Mx-B están fuertemente correlacionados con la infección viral sistémica. Las proteínas mixovirus (Mx) inducibles por interferón desempeñan papeles importantes en la lucha contra una amplia gama de infecciones víricas. Las proteínas homólogas Mx inhiben los virus de ARN y ADN.
Recientemente se encontró que la proteína Mx-B es la proteína importante que transporta los componentes virales fuera de la célula [2]. Por ejemplo, la proteína del VIH será transportada y eliminada por la proteína Mx-B, y no por la proteína Mx-A [1]. Por lo tanto, este ensayo en el punto de atención usa la proteína Mx-B, porque tiene solo un 63% de homología con la proteína Mx-A y, por lo tanto, es la proteína Mx funcional dentro de la familia de las Mx GTPasas [3]. Se demostró que Mx-B inhibe fuertemente las infecciones virales reduciendo el nivel de ADN viral integrado. Además, la proteína Mx-B se ubica dentro del núcleo y el citoplasma. Por el contrario, la proteína Mx-A solo se ubica en el citoplasma [4]. Basado en los nuevos descubrimientos, los inventores seleccionan Mx-B como un marcador fiable de infecciones virales.
La proteína C reactiva (PCR), una proteína de fase aguda producida por el hígado en respuesta a una infección, es un biomarcador fiable para las infecciones bacterianas. Los niveles de PCR en individuos sanos se consideran menores que 0,5 mg/l y los niveles de PCR están elevados en condiciones infecciosas.
La procalcitonina (PCT) es una hormona polipeptídica con 116 aminoácidos. Esta proteína será producida principalmente por las células C de la glándula tiroides. Normalmente, existe un nivel muy límite de PCT en la sangre. Por el contrario, durante una infección bacteriana, esta proteína se expresará y se encontrará entre 0,5 ng/ml y 2 ng/ml. La ventaja de esta proteína es que se detectará después de 6 horas de infección, mientras que la PCR se detectará en el punto de tiempo más temprano de 12-16 horas.
Según una realización de la invención, la presente invención se refiere a un ensayo de detección rápida para identificar Mx-B y/o PCR/PCT/BPI en una muestra de paciente. La muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre periférica, aspirados nasofaríngeos, lágrimas, líquido cefalorraquídeo y aspirados del oído medio.
La proteína que aumenta la permeabilidad/bactericidad (BPI) es una proteína pluripotente ubicada en los neutrófilos y el tejido que probablemente desempeña un papel fundamental en la defensa del huésped contra las bacterias gramnegativas y su endotoxina por medio de sus funciones de neutralización y eliminación de endotoxinas y antibióticos. La BPI se considera como el marcador biológico adicional para el ensayo en el punto de atención mejorada para mejorar la fiabilidad y precisión del ensayo. Durante una infección bacteriana, esta proteína se expresará y se encontrará entre 1 pg/ml y 20 pg/ml.
Por tanto, una realización adicional de la invención se refiere al ensayo en el punto de atención para identificar Mx-B, BPI y/o PCR/PCT en una muestra de paciente.
Según una realización de la invención la zona de detección incluye al menos un reactivo con afinidad de unión al marcador viral Mx-B y al menos un reactivo con afinidad de unión al marcador bacteriano PCR/PCT y opcionalmente al menos un reactivo con afinidad de unión a BPI tal que, cuando los marcadores presentes en la muestra entran en contacto con los reactivos respectivos, se forma un complejo marcado. La zona de detección incluye un compañero de unión de marcador bacteriano que se une al primer complejo marcado y un compañero de unión de marcador viral que se une al segundo complejo marcado. Luego, la muestra se analiza para la presencia del marcador viral y/o el marcador bacteriano.
La zona de detección puede funcionalizarse inmovilizando diversas moléculas receptoras que se unen específicamente a los marcadores respectivos. Las moléculas receptoras pueden seleccionarse de origen natural, p. ej. anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o similares. Las moléculas receptoras pueden ser moléculas producidas sintéticamente, p. ej., aptámeros. La zona de detección comprende al menos una región sensora, en la que, como receptores para detectar los respectivos marcadores, se disponen anticuerpos u otros receptores que dan especificidad, tales como aptámeros, que se unen específicamente a los respectivos marcadores a detectar. Por tanto, se consigue una funcionalización eficaz y fácil de aplicar de la superficie de la zona del sensor.
Los anticuerpos u otros receptores que dan especificidad tales como p. ej. los aptámeros tienen una alta selectividad para detectar analitos específicos; por lo tanto, son particularmente adecuados para reconocer marcadores de enfermedades específicas. En relación con los posibles receptores, los anticuerpos dispuestos en la superficie del sensor u otros receptores que dan especificidad tales como aptámeros p. ej., se unen al analito a detectar y, en el proceso, llevan a un cambio en las propiedades. En algunas realizaciones, los aptámeros son ventajosos porque son más estables y, por lo tanto, funcionales permanentemente.
Como los aptámeros comparten aplicaciones similares a los anticuerpos, numerosos métodos de detección que aprovechan los anticuerpos se pueden desarrollar en métodos basados en aptámeros. Por ejemplo, la mayoría de los inmunoensayos para moléculas pequeñas son ensayos competitivos que se basan en el reemplazo de anticuerpos unidos a la superficie por el analito en disolución.
Una realización de un dispositivo de la presente invención incluye una zona de aplicación de muestra.
Una realización adicional de la invención se refiere al dispositivo que incluye adicionalmente una zona de reactivo. La zona de reactivo comprende al menos un reactivo específico para el marcador bacteriano viral tal que, cuando un marcador viral presente en la muestra contacta con dicho reactivo, se forma un complejo de reactivo viral marcado. Además, la zona de reactivo comprende al menos un reactivo específico del marcador bacteriano tal que, cuando un marcador bacteriano presente en la muestra entra en contacto con dicho reactivo, se forma un complejo de reactivo bacteriano marcado. En una realización de la invención, la zona de reactivo comprende un reactivo específico para el marcador bacteriano PCR/PCT y un reactivo específico para el marcador bacteriano BPI, tal que, cuando dichos marcadores bacterianos presentes en la muestra entran en contacto con dichos reactivos, se forman complejos marcados.
La zona de detección en el dispositivo incluye un compañero de unión de marcador viral que se une al complejo de reactivo viral marcado y un compañero de unión de marcador bacteriano que se une al complejo de reactivo bacteriano marcado. El dispositivo podría ser una tira de ensayo de cromatografía.
En una realización preferida, la presencia del marcador viral o del marcador bacteriano se indica mediante una línea de ensayo visible a simple vista. La presencia del marcador viral puede indicarse mediante una primera línea de ensayo, mientras que la presencia del marcador bacteriano se indica mediante una segunda y/o tercera línea de ensayo. En algunas realizaciones, la primera línea de ensayo muestra un primer color cuando es positiva y la segunda línea de ensayo muestra un segundo color diferente del primer color cuando es positiva, y/o la tercera línea de ensayo muestra un tercer color diferente del primer y segundo color cuando es positiva. En realizaciones donde la primera, la segunda y la tercera línea de ensayo están ubicadas en el mismo espacio en el dispositivo de análisis de muestras, es ventajoso tener diferentes colores formados cuando la primera, la segunda y/o la tercera línea de ensayo son positivas.
En una realización, las dos o tres líneas de ensayo están separadas espacialmente una de la otra en el dispositivo. En tal realización, el color puede ser el mismo cuando las líneas de ensayo son positivas.
En una realización de la invención, la muestra a analizar se aplica a un portador. El portador puede estar hecho de un solo material cromatográfico, o preferiblemente varios materiales activos capilares hechos del mismo o diferentes materiales y fijados sobre un soporte del portador. Estos materiales están en estrecho contacto entre sí para formar una ruta de transporte a lo largo de la cual un líquido impulsado por fuerzas capilares fluye desde una zona de aplicación, pasando la zona de reactivo, hacia una o más zonas de detección y.
Preferiblemente, la muestra se aplica directamente al portador sumergiendo la zona de aplicación del portador en la muestra. Alternativamente, la aplicación de la muestra al portador se puede llevar a cabo recogiendo la muestra con un elemento de limpieza seco o humedecido desde el cual la muestra se puede transferir, opcionalmente después de
humedecer, a la zona de aplicación del portador. Generalmente, el elemento de limpieza es estéril y puede secarse o pretratarse con un líquido antes del paso de recolección. Los materiales adecuados para limpiar elementos según la invención pueden comprender materiales sintéticos, telas tejidas o bandas fibrosas.
Dependiendo del tipo de método de detección, están presentes diferentes reactivos en la zona de reactivos, que se ubican entre la zona de aplicación y la zona de detección. En un inmunoensayo tipo sándwich, se prefiere tener un reactivo marcado, no inmovilizado en la zona del reactivo que sea específico del marcador viral y bacteriano que se va a detectar. Por tanto, cuando un marcador viral o bacteriano presente en la muestra contacta con el correspondiente reactivo viral o bacteriano marcado presente en la zona de reactivo, se forma un complejo marcado entre el marcador y el correspondiente reactivo marcado. El complejo marcado, a su vez, es capaz de formar un complejo adicional con un compañero de unión de marcador viral o bacteriano inmovilizado en la zona de detección. En un inmunoensayo competitivo, la zona de reactivo contiene preferiblemente un análogo de marcador no inmovilizado marcado que compite con el marcador por el compañero de unión de marcador inmovilizado en la zona de detección. Los compañeros de unión de marcador en la zona de reactivo y en la zona de detección son preferiblemente anticuerpos monoclonales, policlonales o recombinantes o fragmentos de anticuerpos capaces de unirse específicamente al marcador correspondiente.
La detección del marcador se puede lograr en la zona de detección. La molécula inmovilizada se une al complejo marcado o al marcador análogo marcado mediante una reacción inmune u otra reacción en la zona de detección, creando así una línea de ensayo visible en la zona de detección durante el proceso. Preferiblemente, el marcador es un marcador detectable ópticamente. Que forma un complejo en la zona de detección que inmoviliza el marcador y la línea de ensayo se vuelve visible a simple vista, lo que indica un resultado positivo del ensayo. Son adecuados los marcadores directos, p. ej. particularmente marcadores de oro que se reconocen mejor a simple vista. Adicionalmente, se puede usar un dispositivo de lectura electrónica (p. ej., sobre la base de un transductor fotométrico, acústico, impedimétrico, potenciométrico y/o amperométrico) para obtener resultados más precisos y una semicuantificación del analito. Otros marcadores adecuados pueden ser látex, fluoróforos o fosforóforos.
En una realización, la sensibilidad de los ensayos de inmunoensayo de flujo lateral leídos visualmente se mejora añadiendo al material conjugado inicial una pequeña cantidad de tinte fluorescente o conjugados de perlas de látex fluorescentes. Cuando la línea de ensayo del espectro visible está visiblemente presente, el resultado del ensayo se observa y se registra.
En una realización de la invención, los reactivos se configuran tal que la línea de ensayo visible correspondiente a la presencia del marcador viral estará separada de las líneas de ensayo correspondientes a la presencia de los marcadores bacterianos. Por lo tanto, se puede determinar fácilmente si la muestra contenía marcadores bacterianos o virales (o ambos) simplemente por la ubicación del desarrollo de las líneas del ensayo en la zona de detección. En otra realización preferida, los reactivos se pueden elegir tal que se desarrollen líneas de ensayo de colores diferentes. Es decir, la presencia de un marcador viral provocará el desarrollo de una línea coloreada diferente que aquella desarrollada por la presencia de un marcador bacteriano. Por ejemplo, el marcador correspondiente al reactivo que reconoce el marcador viral puede ser roja, mientras que el marcador correspondiente al reactivo que reconoce los marcadores bacterianos puede ser verde. Son bien conocidos los marcadores de diferentes colores que se pueden unir a los reactivos no inmovilizados. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, oro coloidal, selenio coloidal, carbono coloidal, perlas de látex, perlas paramagnéticas, fluorescentes y quimioluminiscentes y mezclas de los mismos.
La Figura 1 muestra una tira de ensayo de cromatografía con una línea de ensayo que corresponde a la presencia de un marcador viral, una segunda línea de ensayo separada que detecta la presencia de un primer marcador bacteriano y una tercera línea de ensayo separada que detecta la presencia de un segundo marcador bacteriano. La muestra se aplica a la zona de aplicación de la tira de ensayo. Como se muestra en la Figura 1, la muestra pasa luego una zona de reactivo que contiene al menos un compañero de unión viral marcado y al menos un compañero de unión bacteriano marcado. El compañero de unión viral marcado es capaz de unirse específicamente a un marcador viral de interés para formar un conjugado que a su vez es capaz de unirse específicamente a otro reactivo específico o compañero de unión en la zona de detección. El compañero de unión bacteriano marcado es capaz de unirse específicamente a un marcador bacteriano de interés para formar un conjugado que a su vez es capaz de unirse específicamente a otro reactivo específico o compañero de unión en la zona de detección.
La tira de ensayo también incluye una zona de detección que contiene al menos una primera sección para la detección de un marcador viral, p. ej., una línea de ensayo, que incluye un compañero de unión específico inmovilizado, complementario al complejo de reactivo viral formado por el marcador viral y su compañero de unión marcado. Por tanto, en la línea de ensayo, los compañeros de unión de la zona de detección atrapan a los compañeros de unión virales marcados de la zona de reactivo junto con sus marcadores virales unidos. Esta localización del marcador viral con sus compañeros de unión marcados da lugar a una indicación en la línea de ensayo. En la línea de ensayo, la presencia del marcador viral se determina mediante una lectura cualitativa y/o cuantitativa de la indicación de la línea de ensayo resultante de la acumulación de compañeros de unión marcados.
La zona de detección también incluye al menos la sección para la detección de al menos un marcador bacteriano, p. ej. una línea de ensayo, que incluye un compañero de unión específico inmovilizado, complementario al complejo de reactivo bacteriano formado por el marcador bacteriano y su compañero de unión marcado. Por tanto, en la línea de
ensayo, los compañeros de unión de la zona de detección atrapan a los compañeros de unión bacterianos marcados de la zona de reactivo junto con sus marcadores bacterianos unidos. Esta localización del marcador bacteriano con sus compañeros de unión marcados da lugar a una indicación en la línea de ensayo. En la línea de ensayo, la presencia del marcador bacteriano se determina mediante una lectura cualitativa y/o cuantitativa de la indicación de la línea de ensayo resultante de la acumulación de compañeros de unión marcados.
En una realización de la invención, la zona de detección puede contener una línea de ensayo adicional para detectar un segundo marcador bacteriano.
En la Figura 1 se muestra un ejemplo de un ensayo en el punto de atención para distinguir la infección viral y la bacteriana. Como se discutió anteriormente, Mx-B es un marcador de diagnóstico de infección viral, mientras que PCR y BPI son marcadores de diagnóstico de infección bacteriana. Un resultado positivo para la proteína Mx-B, con un resultado negativo para la proteína PCR/PCT y BPI indica una infección viral. Un resultado positivo para PCR/PCT y BPI con un resultado negativo para la proteína Mx-B indica una infección bacteriana. Un resultado positivo débil para Mx-B, PCR/PCT y BPI indica una infección tanto con una bacteria como con un virus (coinfección). No se indica infección bacteriana o viral por un resultado negativo para Mx-B, PCR/PCT y BPI. Mientras en este ejemplo se analizan líneas de color particulares, otros colores, o los mismos colores en diferentes ubicaciones de la tira de ensayo para indicar marcadores virales o bacterianos, están dentro del espíritu de la presente invención.
Cuando se utiliza el desarrollo de líneas de diferentes colores, las líneas pueden o no estar separadas por espacios. En el último caso, los marcadores se eligen tal que el color que se ve cuando ambos marcadores están presentes es diferente de los colores que se ven cuando están presentes los marcadores individuales. Por ejemplo, la presencia del marcador viral puede indicarse mediante una línea roja; la presencia del marcador bacteriano por una línea azul; y la presencia de ambos por una línea violeta (rojo y azul combinados).
En otra realización, la tira de ensayo también puede incluir una sección de control que indica la funcionalidad de la tira de ensayo. Si está presente, la sección de control puede diseñarse para transmitir una señal al usuario de que el dispositivo ha funcionado. Por ejemplo, la sección de control puede contener un reactivo (p. ej., un anticuerpo) que se unirá a los reactivos marcados de la zona de reactivos. Como una alternativa adicional, la sección de control podría contener marcadores virales y bacterianos inmovilizados que reaccionarán con el exceso de reactivo marcado de la zona de reactivo. La sección de control puede estar ubicada aguas arriba o aguas abajo de la zona de detección. Un indicador de control positivo le dice al usuario que la muestra ha atravesado la distancia requerida a través del dispositivo de ensayo.
También se pudieron detectar homólogos de Mx en aproximadamente el 10% de las infecciones bacterianas asociadas con la fiebre. Para mejorar la fiabilidad del ensayo, el límite de corte de la proteína Mx-B se establece en el intervalo de 0,01-0,05 U/10.000 leucocitos, preferiblemente 0,025 U/10.000 leucocitos. Para la PCR, el límite de corte se establece en el intervalo de 5-100 mg/l, o en el intervalo de 25-75 mg/l, o es de 40 mg/l. Para la PCT, el límite de corte se establece en el intervalo de 0,5 ng/ml a >2 ng/ml. Para la BPI, el límite de corte se establece en el intervalo de 1 pg/ml a >10 pg/ml.
Ejemplos
Los ejemplos que siguen se exponen para ayudar en la comprensión de la invención, pero no pretenden ni deben interpretarse que limitan el alcance de la invención de ninguna manera. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de métodos convencionales. Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Ejemplo 1: Descripción del ensayo
El ensayo en el punto de atención se realiza con un dispositivo de flujo lateral. Los reactivos apropiados necesarios para cada ensayo ya están incluidos en el cartucho.
Etapa A: Debido a la fuerza adhesiva, se transfiere una gota de sangre (aprox. 0,005 ml-0,010 ml) del cartucho al dispositivo.
Etapa B: En primer lugar, las células de la gota de sangre se lisan con aprox. 0,001 ml de tampón de lisis que consta de (NP-40 al 20%, Tris-HCL 100 mM, pH 7,2, azida sódica 0,05).
Etapa C: La sangre lisada se dirige por encima de dos tiras de ensayo y, por lo tanto, se incuba.
Etapa D: La disolución de anticuerpo 1 contra Mx-B se une a la posible proteína Mx-B disponible en la sangre. Este anticuerpo ya está conjugado con un marcador marcado.
Etapa D: La proteína Mx-B unida se dirigirá sobre una segunda disolución portadora, en la que se encuentra un segundo anticuerpo contra Mx-B. Sólo la proteína Mx-B ya unida con el primer anticuerpo marcado se unirá al segundo anticuerpo.
Etapa E: Después de enjuagar la disolución portadora, el primer anticuerpo marcado y unido se hace visible en forma de una reacción de color en la tira.
Etapa F: La detección de PCR/PCT/BPI se realiza como se describe en la etapa A a la etapa E, mientras que un anticuerpo contra PCR/PCT y un anticuerpo contra BPI se usa en la segunda tira de ensayo.
Ejemplo 2: Procedimiento de ensayo
En dos ambulancias diferentes, se ensayaron pacientes de origen desconocido para la proteína Mx-A, la proteína Mx-B, PCR/PCT y BPI de sangre total. Todos los pacientes firmaron una declaración de consentimiento bajo el Acuerdo de Helsinki de que sus datos están destinados únicamente a la investigación. 113/5000. Posteriormente, se continuó con la anamnesis en el curso de las investigaciones y se determinó el origen de la infección. Por tanto, se podrían distinguir 120 infecciones virales y 50 infecciones bacterianas. El resultado de esta investigación se documenta en la FIG. 2. Con la ayuda de la proteína Mx-B, se detectaron el 92% de las infecciones virales. Por el contrario, solo se detectaron el 77% de las enfermedades virales idénticas usando la proteína Mx-A. Con la ayuda de las proteínas de determinación PCR/PCT/BPI, el espectro para la detección de enfermedades bacterianas se incrementó al 90%. Si solo se hubieran medido las proteínas PCR y PCT, solo se habrían detectado el 80% de las enfermedades bacterianas. Por tanto, la combinación de los marcadores de la proteína Mx-B para enfermedades virales y PCR/PCT/BPI para enfermedades bacterianas da como resultado una detección de sensibilidad o especificidad de más del 90%.
Ejemplo 3: Resultados
Descripción de los resultados de una infección viral: para demostrar que la reacción de color está funcionando, las dos tiras de ensayo del lado izquierdo son controles. La tira del medio en los colores superiores, la tira de abajo permanece incolora. Las dos tiras del lado derecho permanecen incoloras.
Descripción de los resultados de una infección bacteriana:
Las dos tiras en el medio permanecen incoloras, la de arriba también pero la tira de la derecha por debajo de los colores.
Descripción de los resultados de una infección mixta: La tira del medio en los colores superiores y también la tira de abajo.
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Claims (14)
1. Un dispositivo de ensayo en el punto de atención (POC) que comprende
a. Una zona de aplicación de muestra, y
b. Una zona de detección con un primer reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína Mx-B (Mx-B) y un segundo reactivo de detección con afinidad de unión a la proteína C reactiva o procalcitonina (PCR/PCT), y c. En donde el dispositivo está configurado para detectar Mx-B y PCR/PCT en una muestra de un sujeto para discriminar entre infección bacteriana y viral.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende además un tercer reactivo de detección con afinidad de unión a BPI.
3. El dispositivo de la reivindicación 1 o 2, en donde dichos reactivos de detección se seleccionan de moléculas sintéticas, nucleótidos, ácidos nucleicos, aptámeros, péptidos, proteínas, enzimas y anticuerpos.
4. El dispositivo de la reivindicación 3, en donde dichos reactivos de detección están marcados con un marcador detectable.
5. El dispositivo de la reivindicación 4, en donde el marcador detectable se selecciona de un marcador enzimático, marcador fluorescente, marcador radiactivo, marcador de partículas, partículas de látex coloreadas, partículas de plástico coloreadas, partículas de fósforo coloreadas y partículas fluorescentes.
6. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una ventana de ensayo configurada para permitir la observación de los resultados del ensayo.
7. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde los reactivos de detección se conjugan químicamente con el marcador detectable para formar un complejo de reactivo-marcador permanente e irreversible.
8. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el marcador detectable conjugado al reactivo de detección está configurado para ser visible para un usuario cuando la muestra es positiva para Mx-B y/o PCR y/o PCT y/o BPI.
9. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el dispositivo está configurado para medir cualitativa y/o cuantitativamente la presencia de Mx-B y/o PCR y/o PCT en muestras de sangre humana.
10. Un método para discriminar entre infección bacteriana y viral en un sujeto, que comprende las etapas de a. Proporcionar una muestra obtenida de dicho sujeto,
b. Proporcionar el sistema de ensayo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,
c. Aplicar la muestra al sistema de ensayo,
d. Observar la ausencia o presencia del complejo de reactivo-marcador detectable para determinar si la muestra contiene Mx-B y/o PCR y/o PCT, y en donde
e. La presencia de Mx-B y la ausencia y/o baja detección de PCR/PCT es indicativa para una infección viral, f. La ausencia de Mx-B y la presencia de PCR/PCT es indicativa para una infección bacteriana;
g. La presencia de Mx-B y la presencia de PCR/PCT es indicativa para una infección mixta; y
h. Determinando así el estado de infección del paciente.
11. El método de la reivindicación 10, que observa además la ausencia o presencia del complejo de reactivo-marcador detectable para determinar si la muestra contiene BPI.
12. El método de la reivindicación 11 en donde
a. La presencia de Mx-B y la ausencia de PCR/PCT y BPI es indicativa para una infección viral,
b. La ausencia de Mx-B y la presencia de PCR/PCT y BPI es indicativa para una infección bacteriana; y c. La presencia de Mx-B y la presencia de PCR/PCT y BPI es indicativa para una infección mixta.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la muestra es una muestra de sangre.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la presencia de Mx-B y/o PCR/PCT es visible a simple vista.
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