RS61621B1 - Postupak i sredstvo za međusobno razlikovanje virusnih i bakterijskih infekcija - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na oblast testova koji se izvode na istom mestu na kome i lečenje, takozvanih point of care testova (POC) za razlikovanje virusnih i bakterijskih infekcija. Konkretnije, pronalazak se tiče imunološkog testa koji vrlo brzo pravi razliku između virusnih i/ili bakterijskih infekcija.

Stanje tehnike

[0002] Visoka temperatura je uobičajen razlog pedijatrijskih poseta urgentnim centrima, kako u porodičnoj praksi, tako i u pedijatrijskim orddinacijama. Ovo je najčešće u vezi ili sa respiratornom infekcijom ili sa gastroenteritisom. Velika učestalost temperature kod dece i preventivna primena suvišnih antibiotika su razlog da se razviju brzi skrining testovi za biomarkere koji ukazuju na virusnu i/ili bakterijsku infekciju.

[0003] Do teške upale pluća stečene u zajednici dovode baterijske infekcije u oko 60% slučajeva, pri čemu je prijem u jedinice intenzivne nege (ICU) neophodan za oko 10% pacijenata. Preostalih 40% su u vezi sa respiratornim virusima. Najveći broj respiratornih infekcija je povezan sa faringitisom, od čega 40% izazivaju virusi, a 25-50% beta hemolitički streptokokus grupe A. Ove druge dovode do akutnog bronhiolitisa i upale pluća.

[0004] Oko 80% svih antimikrobnih lekova prepiše se u okviru primarne nege, a i do 80% od njih zbog indikacija u vezi sa respiratornim traktom. Infekcije respiratornog trakta su velikoj meri najčešći uzrok kašlja u okviru primarne nege. Antibiotici širokog spektra često se prepisuju zbog kašlja, uključujući akutni bronhitis, a u mnogim od tih slučajeva pacijenti od toga imaju samo minorne koristi, ako je uopšte imaju, pri čemu mogu da se jave nus-pojave i da se pospeši rezistencija na antibiotike. Faktori zbog kojih lekari preuranjeno osećaju potrebu da daju antibiotike, uključuju odsustvo adekvatnog dijagnostičkog markera za bakterijske infekcije, zabrinutost u vezi sa nemogućnošću praćenja pacijenta, i manjak vremena.

[0005] Brzo razlikovanje virusnih od bakterijskih infekcija i dalje predstavlja teškoću. U poslednje vreme su identifikovani brojni novi dijagnostički markeri. Nekoliko od ovih markera daju nadu da se virusne infekcije mogu razlikovati od bakterijskih. Ovi proteini uključuju Mx GTPaze i C-reaktivni protein (CRP).

[0006] Homologi proteini Mx su članovi superfamilije GTPaza velike molekulske težine. U skladu sa tim, ekspresija ovih GTPaza je povećana interferonima (IFN) tipa I alfa/beta ili tipa II. Mx GTPaze se eksprimiraju isključivo u ćelijama koje su tretirane IFN alfa/beta, ali ne i IFN gama. Interferoni tipa I igraju važne uloge u urođenim imunskim odgovorima i imaju imunomodulišuće, antiproliferativne i antivirusne funkcije.

[0007] Naše studije su pokazale da Mx-homologi humani proteini imaju sledeće prednosti: 1) Mx-homologi humani proteini se kod ljudi eksprimiraju uglavnom unutar ćelija. Unutarćelijskim bojenjem postaju vidljivi u najvećem broju ćelijskih odeljaka [16]. 2) Mx homologi proteini se indukuju na dozno-zavisan način [6]. 3) Mx-homologe humane proteine specifično indukuju interferoni tipa I, ali ne i IFN-gama, IL-I, TNF alfa, ili bilo koji od drugih citokin uslovljenih bakterijskom infekcijom [8,12]. 4) Mx-homologi humani proteini mogu da se detektuju znatno duže u poređenju sa interferonom tipa I u perifernoj cirkulaciji [6]. Stoga ovi proteini predstavljaju marker za identifikaciju virusnih bolesti [7,14,15]. Pored toga, ovi proteini mogu da se koriste kao markeri kojima se identifikuje da li je INF lečenje kod pacijenata koji se leče interferonima tipa I uspešno ili nije [5,9,10,11]. U starijim studijama, ove proteine smo detektovali putem Western blotinga nakon SDS-PAGE.12 Ali za ovaj postupak je potrebno više od dva dana. Zbog toga smo ustanovili ELISA test, kako bi ovi proteini mogli da se detektuju u roku od dva dana [13].

[0008] Na osnovu činjenica i pretpostavki da interferoni tipa I ostaju u okviru normalnih nivoa kod pacijenata sa bakterijskim infekcijama, ekspresija Mx-homologih proteina u perifernoj krvi je senzitivan i specifičan marker za virusnu infekciju. Slično tome, beleži se da najveći broj virusnih infekcija izaziva niske koncentracije odgovora akutne faze i C-reaktivnog proteina (CRP), kao i niske nivoe prokalcitonina (PCT) i batericidnih proteina/proteina koji povećavaju propustljivost (BPI). Zbog toga će se ovi proteini koristiti za razlikovanje bolesti virusnog porekla od bolesti sa bakterijskom etiologijom. Usled toga što se koncentracija CRP u plazmi rapidno povećava nakon stimulacije i rapidno opada, sa kratkim polu-životom, CRP može da bude veoma korisno oruđe za dijagnostifikovanje i praćenje infekcija i inflamatornih bolesti. U Skandinaviji, point of care CRP testiranje predstavlja deo rutinske evaluacije pacijenata sa respiratornim infekcijama u opštoj praksi, i pokazalo se da je njegova upotreba isplativa. Smatra se da je u opštoj praksi CRP ima vrednost prilikom dijagnostifikovanja bakterijskih oboljenja i u parcijalnom razlikovanju bakterijskih i virusnih infekcija. Često se uočava da je dijagnostička vrednost za CRP superiornija od stope sedimentacije eritrocita (ESR) i superiornija ili ista kao i broj belih krvnih zrnaca (WBC). Nedostatak ovog point of care testiranja je dugo vreme potrebno za detekciju. Za ove testove je potrebno između minimalno 30 minuta i 2 sata.

[0009] Razlikovanje nekih sistemskih virusnih i bakterijskih infekcija može da bude teško u kliničkim uslovima. U slučaju ozbljnih infekcija kao što su upale pluća ili kada posledica izostanka dijagnoze može da dovede do ozbiljnih komplikacija, kao što je slučaj sa streptokokama u grlu, gaje se bakterijske kulture. Kulture je često teško dobiti. Virusne kulture se, na žalost, ne gaje rutinski zbog toga što je potrebno mnogo vremena da se dobiju rezultati. Novi PCR paneli za skrining virusa su korisni ali su skupi i ne obezbeđuju informaciju na mestu lečenja, zato što se rezultati mogu dobiti tek posle 24 sata. Dakle, i dalje postoji potreba za jednostavnim dijagnostičkim testom koji se lako koristi i pomoću koga u kratkom roku može da se postigne razlikovanje virusnih od bakterijskih infekcija!

[0010] WO2010/033963 prikazuje imunološki test sa poprečnim protokom, za detekciju i razlikovanje virusnih i bakterijskih infekcija. Bakterijski marker je CRP a virusni marker je Mx A-protein. Ovaj test se u Evropi može naći na tržištu pod registrovanim imenom FebriDx®. However, prema jednoj studiji, FebriDx® ima tačnost od samo 63%, odnosno 84% za identifikaciju bakterijskih, odnosno virusnih infekcija. Dakle, i dalje postoji potreba za brzim dijagnostičkim testom koji se sprovodi na mestu lečenja, sa ciljem da se obavi tačnije razlikovanje bakterijskih i virusnih infekcija kod pacijenata.

Kratak opis pronalaska

[0011] Problem prema predmetnom pronalasku je da se obezbedi poboljšan i precizniji i specifičniji dijagnostički test za pouzdano razlikovanje, u kratkom roku, bakterijskih i virusnih infekcija kod pacijenta. Ovaj problem je rešen predmetom ovog pronalaska.

[0012] Prema pronalasku, obezbeđeno je sredstvo za point-of-care (POC) imunološki test koje sadrži:

a. zonu za primenu uzorka, i

b. zonu detekcije sa prvim reagensom za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za Mx-B-protein (Mx-B), i

drugi reagens za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za C-reaktivni protein ili prokalcitonin (CRP/PCT), i

gde je sredstvo konfigurisano tako da detektuje Mx-B i CRP/PCT u uzorku dobijenom od subjekta, u cilju razlikovanja bakterijske infekcije od virusne.

[0013] Prema dodatnom primeru izvođenja pronalaska, obezbeđeno je sredstvo za point-of-care (POC) imunološki test koje sadrži:

a. zonu za primenu uzorka, i

b. zonu detekcije sa prvim reagensom za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za Mx-B-protein (Mx-B), i drugi reagens za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za C-reaktivni protein, i treći reagens za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za proalcitotin (PCT) i/ili četvrti reagens za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za baktericidni protein/protein koji povećava permeabilnost BPI, i

gde je sredstvo konfigurisano tako da detektuje Mx-B i CRP/PCT u uzorku dobijenom od subjekta, u cilju razlikovanja bakterijske infekcije od virusne.

[0014] Jedan primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na ovde opisano sredstvo koje dodatno sadrži treći reagens za detekciju koje ima afinitet za vezivanje za BPI.

[0015] Jedan primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, pri čemu su navedeni reagensi za detekciju izabrani od sintetičkih molekula, nukleotida, nukleinskih kiselina, aptamera, peptida, proteina, enzima i antitela.

[0016] Jedan primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, pri čemu su navedeni reagensi za detekciju obeleženi markerom koji ima mogućnost da se detektuje.

[0017] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, pri čemu je navedeni marker koji ima mogućnost da se detektuje izabran od enzimskog obeleživača, fluorescentnog obeleživača, radioobeleživača, čestičnog obeleživača, obojene čestice lateksa, obojene plastične čestice, obojene fosforne čestice i fluorescentne čestice.

[0018] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, koji dodatno sadrži prozor testa konfigurisan tako da dozvoljava posmatranje rezultata testa.

[0019] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, pri čemu su reagensi za detekciju hemijski konjugovani sa markerom koji ima mogućnost da se detektuje, tako da se obrazuje trajan, ireverzibilan kompleks reagensa i markera.

[0020] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, pri čemu je marker koji ima mogućnost da se detektuje i koji je konjugovan sa reagensom za detekciju, tako konfigurisan da bude vidljiv za korisnika kada je uzorak pozitivan za Mx-B i/ili CRP i/ili PCT i/ili BPI.

[0021] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo kao što je ovde opisano, pri čemu je sredstvo konfigurisano tako da kvalitativno i/ili kvantitatino meri prisustvo Mx-B i/ili CRP i/ili PCT i/ili BPI u uzorcima ljudske krvi.

[0022] Jedan primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na postupak za razlikovanje bakterijskih i virusnih infekcija kod subjekta, koji sadrži korake

a. obezbeđivanja uzorka koji se dobija od navedenog subjekta,

b. obezbeđivanja test sistema kao što je ovde opisan

c. primene uzorka na test sistem,

d. posmatranja odsustva ili prisustva kompleksa reagensa i markera koji može da se detektuje, kako bi se utvrdilo da li uzorak sadrži Mx-B i/ili CRP i/ili PCT i/ili BPI, i e. određivanja statusa infekcije kod pacijenta.

[0023] Jedan primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na postupak kao što je ovde opisan, pri čemu

a. prisustvo Mx-B i odsustvo i/ili niska detekcija CRP/PCT/BPI ukazuje na virusnu infekciju,

b. odsustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT/BPI ukazuje na bakterijsku infekciju;

i

c. prisustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT/BPI ukazuje na mešanu infekciju.

[0024] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na postupak kao što je ovde opisan, u kome se dodatno posmatra odsustvo ili prisustvo kompleksa reagensa i markera koji može da se detektuje, kako bi se utvrdilo da li uzorak sadrži CRP/PCT/BPI.

[0025] Jedan primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na postupak kao što je ovde opisan, pri čemu

a. prisustvo Mx-B i odsustvo CRP/PCT i BPI ukazuje na virusnu infekciju,

b. odsustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT i BPI ukazuje na bakterijsku infekciju; i

c. prisustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT i BPI ukazuje na mešanu infekciju.

[0026] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na postupak kao što je ovde opisan, pri čemu uzorak predstavlja uzorak krvi.

[0027] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na postupak kao što je ovde opisan, pri čemu je prisustvo Mx-B, CRP/PCT i/ili BPI vidljivo golim okom.

Kratak opis crteža

[0028]

Sl. 1A prikazuje primer postavke testa koji se sastoji od tri test-trake obložene obeleženim antitelima.

Sl. 1B prikazuje različite slike testa za virusne infekcije, bakterijske infekcije, mešovite infekcije ili sumnjive infekcije.

Sl. 2 prikazuje rezultate za različite virusne i bakterijske patogene.

Opis primera izvođenja

[0029] Predmetni pronalazak obezbeđuje point of care test koji omogućava razlikovanje virusnih i bakterijskih infekcija u kratkom roku. Konkretno, obezbeđeno je point of care dijagnostičko sredstvo koje sadrži test markere i za virusne i za bakterijske infekcije, koje efikasno pomaža lekarima prilikom brzog razlikovanja virusnih i bakterijskih infekcija. Point of care test ima sledeće prednosti:

1.) Ovaj test može radiklano da smanji troškove zdravstvene zaštite tako što ograničava postavljanje pogrešne dijagnoze i posledičnu prekomernu ili pogrešnu upotrebu antibiotika.

2) Efikasnost i sigurnost ovog testa leži u tome što će rezistencija na antibiotike biti smanjena, jer će se antibiotici koristiti samo kada je bakterijska infekcija prisutna.

3) Ovaj test će poboljšati dijagnostički portfolio lekarske ili farmaceutske prakse.

[0030] Predmetni pronalazak time doprinosi pravilnoj upotrebi antibiotika. To znači da se antibiotici koriste samo kada je potrebno, i , ukoliko je potrebno, pravilno.

[0031] Antibiotici se ne bore protiv infekcija koje izazivaju virusi, kao što su prehlade, grip, najveći broj upala grla i bronhitis. Čak je i kod brojnih infekcija sinusa i uha poboljšanje moguće bez antibiotika. Za ove infekcije, umesto toga, najbolja opcija za lečenje može da bude olakšavanje simptoma. Uzimanje antibiotika kod virusnih infekcija, kao što su prehlade, grip, najveći broj upala grla i bronhitis:

- neće izlečiti infekciju;

- neće sprečiti da se drugi ljudi razbole;

- neće pomoći da se Vi ili Vaše dete osećate bolje;

- može da izazove nepotrebne i štetne nus-pojave;

- može da doprinese rezistenciji na antibiotike, što je situacija kada su bakterije u stanju da se opiru dejstvu antibiotika i da nastave da uzrokuju štetu.

[0032] Terapeutska korist kod nepravilno prepisanih antibiotika je pod znakom pitanja, a pacijenti se izlažu potencijalnim komplikacijama lečenja antibioticima. Brzo dobijeni rezultati point of care testa omogućavaju, dakle, tačnu dijagnozu i daju podršku zdravstvenom radniku kada donosi odluku o prepisivanju pravog medikamenta.

[0033] Za point of care test mogu da se primenjuju različita sredstva, npr. sredstvo za imunološki test sa poprečnim protokom ili optički senzorski sistem, koji je dizajniran tako da interaguje sa mobilnim računarskim uređajem, kao što je opisano u WO2016/116181.

[0034] Tako, prema jednom primeru izvođenja predmetnog pronalaska, koristi se sredstvo za analizu uzorka, na primer test traka, kako bi se utvrdilo da li je infekcija bakterijska ili virusna. Test-traka uključuje zonu za primenu uzorka i zonu detekcije. U ovom postupku uzorak se uzima i prebacije na test-traku. Zona detekcije uključuje najmanje jedan reagens specifičan za bakterijski marker i najmanje jedan reagens specifičan za virusni marker.

[0035] U jednom primeru izvođenja, marker za virusnu infekciju je Mx-B, a marker za bakterijsku infekciju je C-reaktivni protein (CRP). Visoki nivoi Mx-B proteina u snažnoj su korelaciji sa sistemskom virusnom infekcijom. Proteini miksovirusa (Mx) koji mogu da se indukuju interferonima, igraju važne uloge i borbi sa širokim spektrom virusnih infekcija. Mxhomologi proteini inhibiraju RNK i DNK viruse.

[0036] Nedavno je utvrđeno da je Mx-B-protein važan protein koji transportuje virusne komponente van ćelije [2]. Na primer, Mx-B protein, ali ne i Mx-A protein, će transportovati i eliminisati HIV-protein [1]. Otuda se u ovom point of care testu koristi Mx-B-protein, pošto on ima samo 63% homologije sa Mx-A proteinom, i stoga predstavlja funkcionalni Mx-protein u okviru familije Mx GTPaza [3]. Pokazano je da Mx-B snažno inhibira virusne infekcije tako što smanjuje nivo integrisane virusne DNK. Osim toga, Mx-B protein se nalazi unutar nukleusa i citoplazme. Za razliku od toga, Mx-A protein se nalazi samo u citoplazmi [4]. Na osnovu novih saznanja, pronalazači su odabrali Mx-B kao pouzdan marker za virusne infekcije.

[0037] C-reaktivni protein (CRP), protein akutne faze, koga proizvodi jetra kao odgovor na infekciju, predstavlja pouzdan biomarker za bakterijske infekcije. Smatra se da su nivoi CRP kod zdravih osoba manji od 0.5 mg/L, a da su u stanjima infekcije nivoi CRP povišeni.

[0038] Prokalcitonin (PCT) je polipeptidni hormon od 116 amino kiselina. Ovaj protein će uglavnom biti proizveden u C-ćelijama štitne žlezde. Normalno je u krvi prisutan vrlo ograničen nivo PCT. Nasuprot tome, tokom bakterjske infekcije, ovaj protein će biti eksprimiran i u koncentraciji između 0.5 ng/ml i 2 ng/ml. Prednost ovog proteina je to što se detektuje 6 nakon infekcije, dok je najranija vremenska tačka u kojoj se detektuje CRP 12-16 sati kasnije.

[0039] Prema jednom primeru izvođenja pronalaska, predmetni pronalazak se odnosi na brzi skrining test za identifikaciju Mx-B i/ili CRP/PCT/BPI u uzorku pacijenta. Uzorak može da bude, na primer, uzorak periferne krvi, aspirati iz nazofarinksa, suze, spinalna tečnost, i aspirati iz srednjeg uha.

[0040] Baktericidni protein/protein koji povećava permeabilnost (BPI) je pluripotentni protein koji se nalazi u neutrofilima i u tkivu koje verovatno igra centralnu ulogu u odbrani domaćina od Gram-negativnih bakaterija i njihovog endotoksina posredstvom svojih antibiotskih funkcija i funkcija u neutralizaciji i uklanjanju endotoksina. Smatra se da je BPI dodatan biološki marker za poboljšani point of care test sa ciljem da poveća pouzdanost i tačnost testa. Ovaj protein će tokom bakterijske infekcije biti eksprimiran i u koncentraciji između 1 mg/ml i 20 mg/ml.

[0041] Tako se dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi na point of care test za identifikaciju Mx-B, BPI, i/ili CRP/PCT u uzorku pacijenta.

[0042] Prema jednom primeru izvođenja pronalaska, zona detekcije uključuje najmanje jedan reagens koji ima afinitet za vezivanje za virusni marker Mx-B i najmanje jedan reagens koji ima afinitet za vezivanje za bakterijski marker CRP/PCT i, izborno, najmanje jedan reagens koji ima afinitet za vezivanje za BPI tako da se, kada markeri prisutni u uzorku dođu u kontakt sa respektivnim reagensima, obrazuje obeleženi kompleks. Zona detekcije uključuje partnera za vezivanje za bakterijski marker koji se vezuje za prvi obeleženi kompleks i partnera za vezivanje za virusni marker koji se vezuje za drugi obeleženi kompleks. Zatim se analizira prisustvo virusnog markera i/ili bakterijskog markera u uzorku.

[0043] Zona detekcije može da se funkcionalizuje tako što se imobilišu različiti receptorski molekuli koji se specifično vezuju za respektivne markere. Receptorski molekuli mogu da budu izabrani od molekula prirodnog porekla, npr. antitela, fragmenata antitela i sličnih molekula. Receptorski molekuli mogu da budu sintetički proizvedeni molekuli, npr., aptameri. Zona detekcije sadrži najmanje jedan senzorni region, na kome su raspoređeni, u vidu receptora koji reaguju na respektivne markere, antitela ili drugi receptori koji obezbeđuju specifičnost, kao što su aptameri, a koji se specifično vezuju za respektivne markere koje je potrebno detektovati. Na taj način se postiže efikasna, lako primenjiva funkcionalizacija površine senzornog regiona.

[0044] Antitela ili drugi receptori koji obezbeđuju specifičnost, kao što su npr. aptameri, imaju visoku selektivnost detekcije specifičnih analita; oni su, stoga, naročito pogodni za prepoznavanje specifičnih markera bolesti. Što se tiče mogućih receptora, antitela raspoređena na senzorskoj površini ili drugi receptori koji obezbeđuju specifičnost, kao što su aptameri, npr. vezuju analit koji je potrebno detektovati, i, tokom tog procesa dovode do promena svojstava. U nekim primerima izvođenja, aptameri imaju prednost zbog toga što su stabilniji i zbog toga trajno funkcionalni.

[0045] Pošto aptameri i antitela imaju slične primene, brojni postupci za detekciju u kojima se koriste antitela mogu da se razviju u postupke na bazi aptamera. Na primer, najveći broj imunoloških testova za male molekule su kompetitivni testovi koji se oslanjaju na zamenu antitela vezanih za površinu analitom iz rastvora.

[0046] Jedan primer izvođenja sredstva prema predmetnom pronalasku uključuje zonu za primenu uzorka.

[0047] Dodatni primer izvođenja prema pronalasku odnosi se na sredstvo koje dodatno uključuje zonu za reagens. Zona za reagens sadrži najmanje jedan reagens specifičan za virusni bakterijski marker tako da se, kada virusni marker prisutan u uzorku dođe u kontakt sa navedenim reagensom, stvara obeleženi kompleks virusnog reagensa. Dalje, zona za reagens sadrži najmanje jedan reagens specifičan za bakterijski marker tako da se, kada bakterijski marker prisutan u uzorku dođe u kontakt sa navedenim reagensom, stvara obeleženi kompleks bakterijskog reagensa. U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, zona za reagens sadrži jedan reagens specifičan za bakterijski marker CRP/PCT i jedan reagens specifičan za bakterijski marker BPI, tako da se, kada navedeni bakterijski markeri prisutni u uzorku dođu u kontakt sa navedenim reagensima, stvaraju obeleženi kompleksi.

[0048] Zona detekcije na sredstvu uključuje partnera za vezivanje virusnog markera koji se vezuje za obeleženi kompleks virusnog reagensa, i partnera za vezivanje bakterijskog markera koji se vezuje za obeleženi kompleks bakterijskog reagensa. Sredstvo bi moglo da bude hromatografska test-traka.

[0049] U poželjnom primeru izvođenja, na prisustvo virusnog markera ili bakterijskog markera ukazuje test-linija koja je vidljiva golim okom. Na prisustvo virusnog markera može da ukazuje prva test-linija dok na prisustvo bakterijskog markera ukazuje druga i/ili treća test-linija. U nekim primerima izvođenja, prva test-linija prikazuje prvu boju kada je pozitivna, a druga testlinija kada je pozitivna prikazuje drugu boju različitu od prve boje, i/ili treća test-linija, kada je pozitivna, prikazuje treću boju, različitu od prve i druge boje. U primerima izvođenja gde se prva, druga i treća test-linija nalaze u istom prostoru na sredstvu za analizu uzorka, obrazovanje različitih boja kada su prva, druga i/ili treća test-linija pozitivne, predstavlja prednost.

[0050] U jednom primeru izvođenja, dve ili tri test-linije su međusobno prostorno razdvojene na sredstvu. U takvom primeru izvođenja, boja može da bude ista, kada su test-linije pozitivne.

[0051] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, uzorak koji se analizira, primenjuje se na nosač. Nosač može da bude napravljen od samo jednog hromatografskog materijala, ili poželjno od nekoliko materijala sa kapilarnom aktivnošću, koji su napravljeni od istih ili različitih materijala i fiksirani za poleđinu nosača. Ovi materijali su međusobno u bliskom kontaktu, tako

1

da obrazuju transportnu putanju duž koje tečnost koju pokreću kapilarne sile teče od zone za primenu, prolazi kroz zonu za reagens i teče ka jednoj ili više zona detekcije.

[0052] Poželjno se uzorak primenjuje direktno na nosač tako što se zona za primenu nosača umoči u uzorak. Alternativno, primena uzorka na nosač može da se izvede uzimanjem uzorka suvim ili navlaženim upijajućim elementom sa koga uzorak može da se prebaci, izborno nakon vlaženja, na zonu za primenu na nosaču. Upijajući element je obično sterilan i može da bude suv ili prethodno obrađen fluidom, pre koraka sakupljanja. Materijali koji su pogodni da budu upijajući elementi prema pronalasku, mogu da uključuju sintetičke materijale, tkane materijale ili vlaknaste mreže.

[0053] U zavisnosti od vrste postupka za detekciju, u zoni za reagens, koja se nalazi između zone za primenu i zone detekcije, prisutni su različiti reagensi. U imunološom sendvič-testu, poželjno je da u zoni za reagens postoji obeleženi, neimobilisani reagens koji je specifičan za virusni i bakterijski marker koji se detektuje. Tako, kada virusni ili bakterijski marker, prisutan u uzorku, dođe u kontakt sa odgovarajućim obeleženim virusnim ili bakterijskim markerom koji je prisutan u zoni za reagens, dolazi do obrazovanja obeleženog kompleksa između markera i odgovarajućeg obeleženog reagensa. Obeleženi kompleks je sa svoje strane u stanju da obrazuje dodatni kompleks sa imobilisanim partnerom za vezivanje sa virusnim ili bakterijskim markerom u zoni detekcije. U kompetitivnom imunološkom testu, zona za reagens poželjno sadrži obeleženi neimobilisani analog markera koji ulazi u kompeticiju sa markerom oko imobilisanog partnera za vezivanje markera, u zoni detekcije. Partneri za vezivanje markera u zoni za reagens i u zoni detekcije, poželjno su monoklonska, poliklonska ili rekombinantna antitela ili fragmenti antitela, koji su u stanju da se specifično vežu za odgovarajući marker.

[0054] Detekcija markera može da se postigne u zoni detekcije. Imobilisani molekul vezuje obeleženi ompleks ili obeleženi analog markera putem imunološke reakcije ili druge reakcije u zoni detekcije, gradeći tako, tokom tog procesa, vidljivu test-liniju u zoni detekcije. Poželjno, obeleživač je obeleživač koji može da se detektuje optički. Obrazovanje kompleksa u zoni detekcije imobiliše obeleživač i test-linija postaje vidljiva golim okom, što označava pozitivan rezultat testa. Pogodni su direktni obeleživači, npr. konkretno, obeleživači sa zlatom koji se golim okom najbolje uočavaju. Osim toga, može da se koristi i sredstvo koje se elektronski očitava (npr. na bazi fotometarskog, akustičnog, impedimetarskog, potenciometarskog i/ili ampermetarskog pretvarača) kako bi se dobili precizniji rezultati i semi-kvantitativna merenja analita. Drugi pogodni obeleživači mogu da budu lateks, fluorofore ili fosforofore.

[0055] U jednom primeru izvođenja, senzitivnost imunoloških testova sa poprečnim protokom koji se vizuelno očitavaju pojačava se tako što se početnom materijalu za konjugaciju dodaje mala količina konjugata fluorecentne boje ili fluoroscentnih zrnaca lateksa. Kada je test-linija iz vidljivog spektra prisutna tako da može da se vidi, rezultat testa se posmatra i beleži.

[0056] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku, reagensi su tako konfigurisani da će vidljiva test-linija koja odgovara prisustvu virusnog markera biti odvojena od test-linija koje odgovaraju prisustvu bakterijskih markera. Na taj način može lako da se utvrdi da li je uzorak sadržao bakterijske ili virusne markere (ili i jedne i druge), jednostavno po tome na kom se mestu u zoni detekcije razvijaju test-linije. U drugom poželjnom primeru izvođenja, reagensi mogu tako da se izberu, da se razvijaju različito obojene test-linije. Odnosno, prisustvo virusnog markera dovešće do razvijanja različito obojene linije u odnosu na liniju koja se razvila usled prisustva bakterijskog markera. Na primer, obeleživač koji odgovara reagensu koji prepoznaje virusni marker može da bude crven, dok obeleživač koji odgovara reagensu koji prepoznaje bakterijske markere može da bude zelen. Obeleživači različitih boja koji mogu da budu povezani sa neimobilisanim reagensima, dobro su poznati. Neki primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, koloidno zlato, koloidni selen, koloidni ugljenik, zrnca lateksa, paramagnetna zrnca, fluorescentna i hemiluminescentna, kao i njihove smeše.

[0057] Slika 1 prikazuje hromatografsku test-traku sa test-linijom koja odgovara prisustvu virusnog markera, sa drugom, zasebnom test-linijom koja detektuje prisustvo bakterijskog markera i sa trećom, zasebnom test-linijom koja detektuje prisustvo drugog bakterijskog markera. Uzorak se primenjuje na zonu za primenu na test-traci. Kao što je prikazano na Slici 1, uzorak zatim prolazi kroz zonu za reagens koja sadrži najmanje jednog obeleženog virusnog partnera za vezivanje i najmanje jednog obeleženog bakterijskog partnera za vezivanje. Obeleženi virusni partner za vezivanje vezuje se za virusni marker od interesa tako da obrazuje konjugat, koji je sa svoje strane u stanju da se specifično veže za drugi specifični reagens ili za drugog partnera za vezivanje u zoni detekcije. Obeleženi bakterijski partner za vezivanje vezuje se za bakterijski marker od interesa tako da obrazuje konjugat, koji je sa svoje strane u stanju da se specifično veže za drugi specifični reagens ili za drugog partnera za vezivanje u zoni detekcije.

[0058] Test-traka takođe uključuje zonu detekcije koja sadrži najmanje jedan prvi odeljak za detekciju virusnog markera, npr. test-liniju, koja uključuje imobilisanog specifičnog partnera za vezivanje, koji je komplementaran kompleksu sa virusnim reagensom koga obrazuju virusni marker i njegov obeleženi partner za vezivanje. Tako na test-liniji, partneri za vezivanje iz zone detekcije hvataju obeležene virusne partnere za vezivanje iz zone za reagens, zajedno sa njihovim vezanim virusnim markerima. Usled ovog lokalizovanja virusnog markera sa njegovim obeleženim partnerima za vezivanje, nastaje indikacija u vidu test-linije. Na test-liniji se prisustvo virusnog markera utvrđuje kvalitativnim i/ili kvantitativnim očitavanjem indikacije u vidu test-linije koja nastaje usled akumulacije obeleženih partnera za vezivanje.

[0059] Zona detekcije takođe uključuje najmanje jedan odeljak za detekciju najmanje jednog bakterijskog markera, npr. test-liniju, koja uključuje imobilisanog specifičnog partnera za vezivanje, koji je komplementaran kompleksu sa bakterijskim reagensom koga obrazuju bakterijskim marker i njegov obeleženi partner za vezivanje. Tako na test-liniji, partneri za vezivanje iz zone detekcije hvataju obeležene bakterijske partnere za vezivanje iz zone za reagens, zajedno sa njihovim vezanim bakterijskim markerima. Usled ovog lokalizovanja bakterijskog markera sa njegovim obeleženim partnerima za vezivanje, nastaje indikacija u vidu test-linije. Na test-liniji se prisustvo bakterijskog markera utvrđuje kvalitativnim i/ili kvantitativnim očitavanjem indikacije u vidu test-linije koja nastaje usled akumulacije obeleženih partnera za vezivanje.

[0060] U jednom primeru izvođenja prema pronalasku zona detekcije može da sadrži dodatnu test-liniju za detekciju drugog bakterijskog markera.

[0061] Jedan primer point of care testa za razlikovanje virusne i bakterijske infekcije je prikazan na Slici 1. Kao što je prethodno u tekstu razmatrano, Mx-B je dijagnostički marker za virusnu infekciju, dok su CRP i BPI dijagnostički markeri za bakterijsku infekciju. Pozitivan rezultat za Mx-B protein, sa negativnim rezultatom za CRP/PCT i BPI protein ukazuje na virusnu infekciju. Pozitivan rezultat za CRP/PCT i BPI sa negativnim rezultatom za Mx-B protein ukazuje na bakterijsku infekciju. Slabo pozitivan rezultat za Mx-B, CRP/PCT i BPI ukazuje na infekciju i bakterijom i virusom (koinfekcija). Negativan rezultat za Mx-B, CRP/PCT i BPI ukazuje na odsustvo bakterijske ili virusne infekcije. Premda se u ovom primeru razmatraju konkretne boje linija, u duhu predmetnog pronalaska je i to da druge boje ili iste boje na različitim lokacijama na test-traci ukazuju na virusne ili bakterijske markere.

[0062] Kada se koristi razvijanje različito obojenih linija, linije mogu, ali ne moraju, da budu razdvojene prostorom. U ovom drugom slučaju, obeleživači se biraju tako da boja koja se uočava kada su oba marker prisutna bude drugačija od boja koje se uočavaju kada su prisutni pojedinačni markeri. Na primer, crvena linija može da ukazuje na prisustvo virusnog markera; plava linija može da ukazuje na prisustvo bakterijskog markera; a ljubičasta linija (kombinovano crvena i plava) na prisustvo i jednog i drugog markera.

[0063] U drugom primeru izvođenja, test-traka takođe može da uključuje kontrolni odeljak koji ukazuje na funkcionalnost test-traka. Ukoliko je prisutan, kontrolni odeljak može da bude dizajniran tako da prenosi signal korisniku da je sredstvo funkcionisalo. Na primer, kontrolni odeljak može da sadrži reagens (npr., antitelo) koji će se vezati za obeležene reagense iz zone za

1

reagens. Kao dodatna alternativa, kontrolni odeljak bi mogao da sadrži imobilisane virusne i bakterijske markere koji će reagovati sa viškom obeleženog reagensa iz zone za reagens. Kontrolni odeljak može da se nalazi uzvodno ili nizvodno od zone detekcije. Indikator pozitivne kontrole saopštava korisniku da je uzorak propušten do potrebne udaljenosti kroz sredstvo za testiranje.

[0064] Mx homologe takođe je bilo moguće detektovati u oko 10% bakterijskih infekcija povezanih sa povišenom temperaturom. Da bi se povećala pouzdanost testa, granična vrednost za Mx-B protein se podešava tako da bude u opsegu od 0.01 - 0.05 U/10,000 leukocita, a poželjno iznosi 0.025 U/10,000 leukocita. Za CRP, granična vrednost se podešava tako da bude u opsegu od 5 - 100 mg/L, ili u opsegu od 25 -75 mg/L, ili iznosi 40 mg/L. Za PCT, granična vrednost se podešava tako da bude u opsegu od 0.5 ng/ml do > 2 ng/ml. Granična vrednost za BPI se podešava tako da bude u opsegu od 1 mg/ml do > 10 mg/ml.

Primeri

[0065] Primeri koji slede su izloženi kako bi pomogli u razumevanju pronalaska, ali nije predviđeno, i ne bi trebalo da se shvate tako da ograničavaju obim pronalaska na bilo koji način. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih metoda. Te metode su dobro poznate stručnjacima u oblasti.

Primer 1 – Opis testa

[0066] Point of Care test se izvodi pomoću sredstva sa poprečnim protokom. Pogodni reagensi neophodni za svaki test već su uključeni u kasetu.

Korak A: Zahvaljujući adhezivnoj sili kap krvi (approx.0.005 ml - 0.010 ml) se prenosi iz kasete u sredstvo.

Korak B: Pre svega, ćelije u kapi krvi se liziraju sa pribl. 0.001 ml pufera za liziranje koji se sastoji od (20% NP-40, 100 mM Tris-HCL, ph 7.2, 0.05 natrijum azida).

Korak C: Lizirana krv se usmerava iznad dve test trake i tako inkubira.

Korak D: Rastvor antitela 1 protiv Mx-B vezuje moguće prisutan Mx-B protein u krvi. Ovo antitelo je već konjugovano sa obeleženim markerom.

Korak D: Vezani Mx-B protein će biti usmeren preko drugog nosačkog rastvora u kome se nalazi drugo antitelo protiv Mx-B. Drugo antitelo će vezati samo već vezani Mx-B protein sa prvim antitelom.

Korak E: Posle ispiranja nosačkog rastvora prvo obeleženo i vezano antitelo postaje vidljivo u obliku obojene reakcije na traci.

Korak F: Detekcija CRP/PCT/BPI obavlja se na način opisan u koracima A do E, dok se na drugoj test traci koriste jedno antitelo protiv CRP/PCT i jedno antitelo protiv BPI.

Primer 2 – Postupak testiranja

[0067] U dve različite ambulante su kod pacijenata nepoznatog porekla testirani Mx-A protein, Mx-B protein, CRP/PCT i BPI iz pune krvi. Svi pacijenti su potpisali izjavu o pristanku prema Helsinškom sporazumu, da su njihovi podaci namenjeni samo istraživanjima. 113/5000. Nakon toga je anamneza nastavljena tokom ispitivanja i određeno je poreklo infekcije. Tako je bilo moguće razlikovanje 120 virusnih infekcija i 50 bakterijskih infekcija. Rezultat ovog ispitivanja je dokumentovan na SL. 2. Uz pomoć Mx B proteina, detektovano je 92% virusnih infekcija. Nasuprot tome, samo 77% identičnih virusnih bolesti je detektovano kada je korišćen Mx-A protein. Uz pomoć proteina za određivanje CRP/PCT/BPI, spektar za detekciju bakterijskih bolesti povećan je na 90%. Da su mereni samo CRP i PCT protein, bilo bi detektovano samo 80% bakterijskih bolesti. Tako kombinacija Mx-B proteina kao markera za virusne bolesti i CRP/PCT/BPI za bakterijske bolesti dovodi do senzitivnosti i specifičnosti detekcije od preko 90%.

Primer 3 – Rezultati

[0068] Opis rezultata za virusnu infekciju: Da bi se pokazalo da bojena reakcija funkcioniše, obe test trake na levoj strani su kontrole. Srednja traka gore se boji, traka ispod ostaje bezbojna. Obe trake na desnoj strani ostaju bezbojne.

[0069] Opis rezultata za bakterijsku infekciju: Obe trake u sredini ostaju bezbojne, traka gore takođe, ali se i desna traka dole boji.

[0070] Opis rezultata za mešanu infekciju: Srednja traka gore se boji, kao i traka ispod.

Reference:

[0071]

[1] Haller, O., Dynamins are forever Mx-B inhibits HIV-1. Cell Host Microbe. 2013 Oct 16;14(4):371-3.

[2] Wei W., et al., Accumulation of Mx-B/Mx2-resistant HIV-1 Capsid Variants During Expansion of the HIV-1 Epidemic in human populations. EBioMedicine.2016 Jun; 8: 230-236.

1

[3] Melen, K,. et al., Human Mx-B protein, an interferon- alpha inducible GTPase, contains a nuclear targeting signal and is localized in the heterochromatin-region beneath the nuclear envelope. J Biol Chem. 1996 Sep 20;271(38):23478-86.

[4] Gao, S., et al., Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like Mx-A. Nature. 2010 May 27;465(7297):502-6.

[5] Wussow, P.v., et al., Humoral response to recombinant IFN-α 2b in patients receiving recombinant IFN-α therapy. J Interferon Res.1989 Sep;9 Suppl 1:S25-31

[6] Jakschies, D., et al., Emergence and decay of the human MX homolog in mononuclear cells from cancer patients during and after IFN-α therapy. J Biol Response Mod.1990 Jun;9(3):30512.

[7] Wussow, P.v., et al., The interferon-induced MX-homologous protein in patients with symptomatic HIV-1-infection. AIDS.1990 Feb;4(2):119-24.

[8] Wussow, P.v., et al., The human MX-homologous protein is specifically induced by type-I IFNs. Eur. J. Immunology. 1990 Sep;20(9), 2015-2019.

[9] Jakschies D., et al., Correlation of the antiproliferative effect and the Mx-homologous protein induction by IFNs in patients with malignant melanoma. J Invest Dermatol. 1990 Dec;95(6 Suppl):238S-241S.

[10] Wussow, P.v., et al., Effective natural interferon-alpha therapy in recombinant interferonalpha-resistant patients with hairy cell leukemia. Blood.1991 Jul 1;78(1):38-43.

[11] Wussow, P.v., et al., Treatment of anti RIFN-α-2 antibody positive CML-patients with natural IFN-α. Br J Haematol.1991 Jun;78(2):210-6

[12] Jakschies, D., et al.,The human IFN-induced Mx-homologous proteins identified by 2D SDS-PAGE is specifically induced by type-I-interferons. (1991). Proc. Int. Meeting on 2-D Electrophoresis London, 16.18.7.1991: 163.

[13] Towbin, H., et al., A whole blood immunoassay for the interferon-inducible human Mxprotein. J Interferon Res. 1992 Apr;12(2):67-74.

[14] Jakschies, D., et al., Strong transient expression of the interferon-induced Mx-A-protein in hepatitis A, but not in acute hepatitis B and C. Hepatology. 1994 Apr;19(4):857-65.

[15] Rump, J.A., et al., Common variable immunodeficiency (CVID) and Mx-A-protein expression in blood leucocytes. Clin Exp Immunol. 1995 Jul;101(1):89-93.

[16] Al-Masri, A., et al., Intracellular staining of Mx proteins in cells from peripheral blood, bone marrow and skin. Mol Pathol.1997 Feb;50(1):9-14.

[17] Self W.H., et al., Diagnostic Accuracy of Febri-Dx: A Rapid Test to Detect Immune Responses to Viral and Bacterial Upper Respiratory Infections. J Clin Med.2017 Oct 7;6(10).

1

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. Sredstvo za point-of-care (POC) test koje sadrži

a. zonu za primenu uzorka, i

b. zonu detekcije sa prvim reagensom za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za Mx-B-protein (Mx-B), i

drugi reagens za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za C-reaktivni protein ili prokalcitonin (CRP/PCT), i

c. gde je sredstvo konfigurisano tako da detektuje Mx-B i CRP/PCT u uzorku dobijenom od subjekta, u cilju razlikovanja bakterijske infekcije od virusne.

2. Sredstvo prema patentnom zahtevu 1, koje dodatno sadrži treći reagens za detekciju koji ima afinitet za vezivanje za BPI.

3. Sredstvo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što su navedeni reagensi za detekciju izabrani od sintetičkih molekula, nukleotida, nukleinskih kiselina, aptamera, peptida, proteina, enzima i antitela.

4. Sredstvo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što su navedeni reagensi za detekciju obeleženi markerom sa mogućnošću da bude detektovan.

5. Sredstvo prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što je marker sa mogućnošću da bude detektovan izabran od enzimskog obeleživača, fluorescentnog obeleživača, radioobeleživača, čestičnog obeleživača, obojene čestice lateksa, obojene plastične čestice, obojene fosforne čestice i fluorescentne čestice.

6. Sredstvo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koji dodatno sadrži prozor testa konfigurisan tako da dozvoljava posmatranje rezultata testa.

7. Sredstvo prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 6, naznačeno time što su reagensi za detekciju hemijski konjugovani sa markerom sa mogućnošću da bude detektovan, tako da se obrazuje trajan, ireverzibilan kompleks reagensa i markera.

8. Sredstvo prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 7, naznačeno time što je marker sa mogućnošću da bude detektovan, konjugovan sa reagensom za detekciju, tako konfigurisan da bude vidljiv za korisnika kada je uzorak pozitivan za Mx-B i/ili CRP i/ili PCT i/ili BPI.

9. Sredstvo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što je sredstvo konfigurisano tako da kvalitativno i/ili kvantitatino meri prisustvo Mx-B i/ili CRP i/ili PCT u uzorcima ljudske krvi.

10. Postupak za razlikovanje bakterijskih i virusnih infekcija kod subjekta, koji sadrži korake

a. obezbeđivanja uzorka koji se dobija od navedenog subjekta,

b. obezbeđivanja test sistem prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9,

c. primene uzorka na test sistem,

d. posmatranja odsustva ili prisustva kompleksa reagensa i markera koji može da se detektuje, kako bi se utvrdilo da li uzorak sadrži Mx-B i/ili CRP i/ili PCT, i, pri čemu e. prisustvo Mx-B i odsustvo i/ili niska detekcija CRP/PCT ukazuje na virusnu infekciju, f. odsustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT ukazuje na bakterijsku infekciju;

g. prisustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT ukazuje na mešanu infekciju; i

h. time se određuje status infekcije kod pacijenta.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, u kome se dodatno posmatra odsustvo ili prisustvo kompleksa reagensa i markera sa mogućnošću da bude detektovan, kako bi se utvrdilo da li uzorak sadrži BPI.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 11 naznačen time što

a. prisustvo Mx-B i odsustvo CRP/PCT i BPI ukazuje na virusnu infekciju,

b. odsustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT i BPI ukazuje na bakterijsku infekciju; i

c. prisustvo Mx-B i prisustvo CRP/PCT i BPI ukazuje na mešanu infekciju.

13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 12, naznačen time što uzorak predstavlja uzorak krvi.

14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 10 do 13, naznačen time što je prisustvo Mx-B, i/ili CRP/PCT vidljivo golim okom.

1