ES2851973T3 - Compuesto de glicosaminoglicano y su método de preparación, así como su aplicación - Google Patents

Compuesto de glicosaminoglicano y su método de preparación, así como su aplicación Download PDF

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Abstract

Un compuesto que consiste en un conjugado de un glicosaminoglicano y de un principio activo, en el que el principio activo se conjuga mediante un grupo funcional con un grupo carboxílico del glicosaminoglicano o una sal del mismo para formar una conjugación covalente, y el principio activo se selecciona del grupo que consiste en fexofenadina, succinato de budesonida y succinato de prednisolona.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto de glicosaminoglicano y su método de preparación, así como su aplicación
REFERENCIA CRUZADA
Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos con número de serie 61/871,352, presentada el 29 de agosto de 2013.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere a un compuesto que consiste en un conjugado de glicosaminoglicano con un fármaco de conformidad con las reivindicaciones.
2. Descripción de las técnicas anteriores
La matriz extracelular (MEC) es un conjunto dinámico de moléculas que interactúan y regulan las funciones e interacciones celulares en respuesta a la estimulación. Una clase de macromoléculas de la matriz extracelular, los glicosaminoglicanos, son moléculas que se sabe que están implicadas en una amplia gama de procesos biológicos, tanto normales como anormales, como la migración celular, la diferenciación, la proliferación, la respuesta inmunitaria y la organización del citoesqueleto.
Los glicosaminoglicanos (GAG) son cadenas no ramificadas compuestas por unidades de disacáridos que se repiten. Estas unidades de disacáridos contienen siempre un amino azúcar (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), que en la mayoría de los casos está sulfatado, y el segundo azúcar suele ser un ácido urónico (glucurónico o idurónico). Los glicosaminoglicanos están muy cargados negativamente debido a la presencia de grupos carboxilo o sulfato en la mayoría de sus residuos de azúcar. Como tales, son fuertemente hidrofílicos. Los glicosaminoglicanos tienden a adoptar conformaciones muy extendidas y forman matrices que llenan el espacio y que son resistentes a las fuerzas de compresión. Se han distinguido cuatro grupos principales de glicosaminoglicanos por sus residuos de azúcar, el tipo de enlace entre estos residuos y el número y la ubicación de los grupos de sulfato. Entre ellos se encuentran: (1) el hialuronano, (2) el condroitín sulfato y el dermatán sulfato, (3) el heparán sulfato y la heparina, y (4) el queratán sulfato.
El hialuronano (también llamado ácido hialurónico o hialuronato o HA) es el más simple de los glicosaminoglicanos. Está formado por una secuencia regular repetida de unidades de disacáridos no sulfatados, concretamente N-acetilglucosamina y ácido glucurónico. Su peso molecular puede oscilar desde los 400 daltons (el disacárido) hasta más de millones de daltons. Se encuentra en cantidades variables en todos los tejidos, como la piel, el cartílago y el ojo, y en la mayoría, si no en todos, los fluidos de los animales adultos. Es especialmente abundante en los embriones en etapas muy tempranas. En el cartílago articular, el HA puede formar un gran agregado que es importante para la función del cartílago. Además, la motilidad celular y la adhesión de células inmunitarias están mediadas por el receptor de la superficie celular RHAMM (Receptor para la motilidad mediado por hialuronano) y el CD44.
El HA se sintetiza directamente en la membrana interna de la superficie de la célula con el polímero en crecimiento que se extrae a través de la membrana hacia el exterior de la célula a medida que se sintetiza. La síntesis está mediada por una sola enzima proteica, la hialuronano sintetasa (HAS). En cambio, otros glicosaminoglicanos se sintetizan dentro de la célula en el aparato de Golgi, posiblemente en asociación con alguna proteína central, y luego se liberan por exocitosis. La degradación del HA en los tejidos de los vertebrados in vivo está mediada por la hialuronidasa y las exoglucosidasas que eliminan los azúcares secuencialmente. Las hialuronidasas de tipo mamífero tienen tanto actividades hidrolíticas como transglicosidasas y pueden degradar el HA y la condroitina. En el tejido conectivo, el agua de hidratación asociada al HA crea espacios entre los tejidos, creando así un entorno propicio para el movimiento y la proliferación celular. El HA desempeña un papel clave en los fenómenos biológicos asociados a la motilidad celular, incluyendo el desarrollo rápido, la regeneración, la reparación, la embriogénesis, el desarrollo embriológico, la curación de heridas, la angiogénesis y la tumorigénesis.
El CD44 (también conocido como Pgp-1, Hermes-3, HCAM, ECMR III) es una glicoproteína ampliamente expresada con un peso molecular de 85 a 90 kDa. El CD44 es un importante receptor de la superficie celular para el glicosaminoglicano, el ácido hialurónico (HA). El CD44 se une específicamente a1HA, aunque también se pueden reconocer ciertos proteoglicanos que contienen condroitina-sulfato. El CD44 desempeña un papel en varias funciones celulares y fisiológicas, como la adhesión y la migración sobre el HA, la degradación de1HA y la metástasis tumoral. También se ha demostrado que el CD44 desempeña un papel en la unión a la matriz extracelular, la migración celular, la activación de linfocitos, la localización de linfocitos y la proliferación de células musculares lisas bronquiales (Gunthert et al., 1991, A new variant of glycoprotein CD44 confers metastatic potential to rat carcinoma cells, 5;65(1): 13-24). El receptor CD44 muestra un complejo patrón de empalme alternativo en su región variable del dominio extracelular. El CD44 parece ser un receptor leucocitario especialmente importante para el HA y, por tanto, puede tener un papel en la patogénesis del asma. Además, los niveles de HA, que aumentaron durante el asma experimental en los ratones de control, se atenuaron notablemente en los ratones tratados con anticuerpos, lo que apoya un papel del CD44 en el metabolismo del HA (específicamente en la descomposición del HA de alto peso molecular en formas proinflamatorias de bajo peso molecular). Esto puede ser especialmente importante porque los oligosacáridos derivados de1HA pueden unirse y activar el receptor tipo Toll. Es evidente que el aspecto más impresionante de los resultados es la profunda magnitud de los efectos beneficiosos del tratamiento anti-CD44.
Las interacciones HA-CD44 pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo, la inflamación, el reclutamiento y la activación de células T, la inflamación pulmonar, así como el crecimiento y la metástasis de tumores.
Los ratones con una eliminación dirigida del CD44 estándar y de todas las isoformas se desarrollan normalmente. Los estudios han sugerido un papel importante para el CD44 en estados inflamatorios como la artritis reumatoide y la extravasación de células T a los sitios de inflamación del tejido. El CD44 puede tener un papel importante en el reclutamiento de células inflamatorias en la inflamación de las vías respiratorias inducida por alérgenos en ratones. Se ha sugerido que el CD44 desempeña un papel crítico en la regulación de la inflamación crónica, lo que sugiere que el CD44 puede tener un papel crítico en la regulación de la activación de los macrófagos independientemente de las interacciones con el HA (Dianhua Jiang, Hyaluronan in Tissue Injury and Repair, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2007;23:435-61).
La capacidad de controlar las respuestas inflamatorias e inmunitarias es fundamental para la terapia de un amplio espectro de enfermedades. El CD44 favorece la adhesión de los linfocitos activados al endotelio y a las células musculares lisas. Además, la ligadura del CD44 induce la activación de las células inflamatorias y vasculares. E1HA, el principal ligando del CD44, aumenta en las lesiones ateroscleróticas de los ratones deficientes en apoE y las formas proinflamatorias de bajo peso molecular del HA estimulan la expresión de la VCAM-1 (molécula de adhesión celular vascular-1) y la proliferación de las células musculares lisas aórticas primarias cultivadas, mientras que las formas de alto peso molecular del HA inhiben la proliferación de las células musculares lisas. La Gal-9 (Galectina-9) puede reducir la HRB (hiperreactividad bronquial), así como la inflamación de las vías respiratorias asociada al Th2. Además, la administración de la Gal-9, así como de un anticuerpo monoclonal anti-CD44, inhibió la filtración de células Th2 de sangre periférica en las vías respiratorias. Curiosamente, la Gal-9 se unió directamente a la molécula de adhesión CD44 e inhibió las interacciones con el HA. En consonancia con el concepto de que las interacciones CD44-HA median la migración de las células T hacia el pulmón, la Gal-9 bloqueó la adhesión dependiente del CD44 de las células T del ratón BW5147 al HA. Se llegó a la conclusión de que la Gal-9 inhibe la inflamación alérgica de las vías respiratorias y la HRB modulando el reconocimiento de los leucocitos dependientes de CD44 de la matriz extracelular (Shigeki Katoh, et al., Galectin-9 Inhibits CD44-Hyaluronan Interaction and Suppresses a Murine Model of Allergic Asthma, American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, 2007 Jul 1;176(1):27-35).
El CD44 se expresará en enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES), la artritis reumatoide, el síndrome de Sjogren, la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la espondilitis anquilosante, la artritis psoriásica, la psoriasis, la dermatomiositis, la vasculitis y la enfermedad de Behcet. El lupus eritematoso sistémico es una enfermedad autoinmune prototipo que afecta a sistemas multiorgánicos. Las pruebas acumuladas sugieren que el hialuronano y su interacción con su receptor de superficie celular CD44 desempeñan un papel importante en la mediación de los mecanismos patogénicos en el LES (Yung S y Chan TM, 2012, The Role of Hyaluronan and CD44 in the Pathogenesis of Lupus Nephritis, Autoimmune Dis. Volumen 2012 (2012), Article ID 207190, 9 páginas). La artritis reumatoide (AR) es un trastorno autoinmune común que provoca la inflamación de las articulaciones sinoviales de los pacientes. Aunque la AR afecta aproximadamente al 1% de la población y está clasificada como un trastorno autoinmune, el evento o eventos moleculares que inician la evasión de la tolerancia siguen siendo especulativos y no están confirmados (Patrick J. Mott, CD44 Antibodies and Immune Thrombocytopenia in the Amelioration of Murine Inflammatory Arthritis, PLoS One, 2013, 8(6): e65805). Aunque el síndrome de Sjogren (SS) es más común que los trastornos autoinmunes relacionados, como el lupus eritematoso sistémico (LES) y la artritis reumatoide (AR), la investigación científica y médica en el SS se ha retrasado considerablemente. Esto es especialmente cierto en el campo de la genética del SS, donde los esfuerzos hasta la fecha se han basado en gran medida en enfoques de genes candidatos (John A. Ice, Genetics of Sjogren's syndrome in the genome-wide association era, J Autoimmun. 2012 Aug;39(1-2):57-63). La espondilitis anquilosante (EA) es una enfermedad reumática inflamatoria común con predilección por el esqueleto axial, que afecta al 0,2% de la población. Los criterios de diagnóstico actuales se basan en un compuesto de cambios clínicos y radiológicos, con un tiempo medio de diagnóstico de 5 a 10 años (Roman Fischer, 2011, Discovery of Candid Serum Proteomic and Metabolomic Biomarkers in Ankylosing Spondylitis, Mol Cell Proteomics, 2012 Feb;11(2):M111.013904). Los resultados sugieren que los linfocitos T circulantes con CD44 activado son elevados en condiciones de inflamación crónica y que estos pueden representar una subpoblación patogénicamente importante de células circulantes activadas que pueden proporcionar un marcador fiable de la actividad de la enfermedad autoinmune o inflamatoria crónica (Estess P, et al., 1998, Functional activation of lymphocyte CD44 in peripheral blood is a marker of autoimmune disease activity, J Clin Invest. 1998 Sep 15;102(6):1173-82). La enfermedad inflamatoria intestinal (EII), incluida la enfermedad de Crohn (EC) y la colitis ulcerosa (CU), comparte características clínicas e inmunológicas con la psoriasis. Los estudios de asociación de todo el genoma han encontrado genes de susceptibilidad comunes. Sin embargo, los datos epidemiológicos que evalúan la asociación entre la psoriasis, la artritis psoriásica y el riesgo de EII son escasos. El objetivo de esta investigación fue evaluar la asociación entre la psoriasis, la artritis psoriásica, y la EC y CU incidentes entre las mujeres de los Estados Unidos. La psoriasis con artritis psoriásica concomitante se asocia con un mayor riesgo de EC incidente (Wen-Qing Li, 2013, Psoriasis, psoriatic arthritis and increased risk of incident Crohn's disease in US women, Ann Rheum Dis. 2013 Jul;72(7):1200-5). La dermatomiositis (DM) es una enfermedad del tejido conectivo relacionada con la polimiositis (PM) que se caracteriza por la inflamación de los músculos y de la piel. Aunque la DM afecta con mayor frecuencia a la piel y a los músculos, es un trastorno sistémico que también puede afectar a las articulaciones, el esófago, los pulmones y, con menor frecuencia, el corazón. La vasculitis es un grupo de trastornos que destruyen los vasos sanguíneos mediante la inflamación. Tanto las arterias como las venas se ven afectadas. La fisiopatología de la vasculitis no se conoce bien, pero la respuesta inflamatoria resultante se ha descrito de manera general (Henry S. Su, 2012, Vasculitis: Molecular Imaging by Targeting the Inflammatory Enzyme Myeloper-oxidase, Radiology, 2012 Jan;262(1): 181-90). La enfermedad de Behcet (Eb ) es la única vasculitis sistémica que afecta tanto a las arterias como a las venas de cualquier tamaño. Se encuentra con frecuencia en las clínicas de reumatología. Tiene alguna morbilidad grave e incluso resultados fatales en algunos casos (M. B. Owlia, 2012, Behcet's Disease: New Concepts in Cardiovascular Involvements and Future Direction for Treatment, IS- RN Pharmacol, 2012: 760484).
El interferón alfa (IFNa) conjugado con polietilenglicol (PEG) se ha utilizado ampliamente para el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis C (VHC) en forma de inyección una vez a la semana. Sin embargo, el IFNa pegilado tiene una baja eficacia del 39% y un efecto secundario después de inyecciones repetidas, posiblemente debido a la administración inespecífica con pegilación. Por lo tanto, se desarrolló un conjugado de ácido hialurónico-interferón alfa (HA-IFNa) de acción prolongada con un objetivo específico para el tratamiento de la infección por el VHC. El conjugado HA-IFNa se sintetizó mediante una reacción de acoplamiento entre el HA modificado con aldehidos y el grupo N -terminal del IFNa. El contenido de IFNa pudo ser controlado en el rango de 2-9 moléculas por cada cadena de HA con una eficiencia de bioconjugación superior al 95%.
Varios estudios han implicado el CD44 en las interacciones directas entre las bacterias y las células huésped, así como en los eventos de señalización que alteran las células huésped y las hacen más susceptibles a la infección. El streptococcus pyogenes, por ejemplo, se adhiere a las células a través de su cápsula de polisacáridos rica en hialuronano (o pared celular). El HA se une al CD44, lo que a su vez desencadena la fosforilación de tirosina de varias proteínas de la célula huésped, así como la reestructuración del citoesqueleto, provocando la formación de replegamientos y la prolongación de lamelipodios. Como resultado, la adhesión intercelular se afloja debido a la reducción del número de uniones estrechas y de E-cadherina, un proceso que permite la entrada de las bacterias en el tejido subepitelial.
El documento WO94/09811 describe el uso del CD44 en el tratamiento de la inflamación o en la detección de la metástasis del cáncer. Los autores muestran que el CD44 aumenta en condiciones inflamatorias y que los péptidos de CD44 son capaces de inhibir la activación de las células T. No se presentan datos ni reivindicaciones sobre la inhibición de la metástasis por parte del CD44 y no se reivindica el uso del CD44 para inhibir el crecimiento tumoral o la angiogénesis. El documento WO 99/45942 divulga el uso de proteínas y péptidos de unión al HA, incluyendo el CD44, para inhibir el cáncer y las enfermedades dependientes de la angiogénesis. Esta publicación utiliza la metastatina, un fragmento de 38 kDa de la proteína de unión al cartílago, así como un péptido de unión al HA derivado de este fragmento para inhibir la metástasis pulmonar del melanoma B 16 de ratón y del carcinoma pulmonar de Lewis. En el caso del péptido de unión al HA, se ha inhibido el crecimiento del melanoma B16 en el pollo CAM y la migración de células endoteliales sobre HA. En ambas publicaciones, el uso de péptidos de unión al HA está directamente relacionado con su capacidad de unión al ácido hialurónico.
La patente estadounidense con número de publicación 8.192.744 muestra que el dominio de unión al ácido hialurónico CD44 recombinante soluble (CD44HABD) inhibe la angiogénesis in vivo en el pollo y en el ratón y, por tanto, inhibe el crecimiento de tumores humanos de diversos orígenes. La invención divulga las proteínas recombinantes CD44 solubles no glicosiladas como una nueva clase de inhibidores de la angiogénesis basados en la focalización del receptor de la superficie celular vascular.
Así pues, el estado de la técnica revela el uso potencial del CD44 para especificar que cualquier efecto depende de la interacción HA-CD44. En consecuencia, toda la utilidad atribuida hasta ahora al conjugado CD44-HA depende directamente de su capacidad para unirse al ácido hialurónico.
Sin embargo, algunos fármacos todavía no se han conjugado con éxito en e1HA y deben llevarse a cabo más experimentos para confirmar la utilidad potencial del HA como portador de un principio activo. En particular, el estado de la técnica no ha demostrado que las interacciones entre el receptor de la superficie celular CD44 y un conjugado de HA con un principio activo puedan explotarse de forma provechosa para una administración específica de dicho principio activo en enfermedades caracterizadas por una sobreexpresión de CD44 obteniendo una mejora terapéutica efectiva de las mismas.
Onishi Hiraku et al., In vivo evaluation of chondroitin sulfate-glycyl-prednisolone for anti-arthritic effectiveness and pharmacokinetic characteristics, International journal of pharmaceutics, 2013, 456(1 ):113-120, divulga un conjugado entre el condroitín sulfato y la glicil-prednisolona para el tratamiento de la artritis reumatoide.
El documento US2004/157810 divulga conjugados de corticosteroides con grupos voluminosos como el ácido hialurónico.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
El propósito de la presente invención es proporcionar un nuevo principio basado en la conjugación de1HA con un principio activo adecuado para la administración de dicho principio activo en enfermedades que sobreexpresan el receptor de superficie celular CD44.
La presente invención, por tanto, proporciona un principio que conjuga el glicosaminoglicano con un fármaco, en el que el fármaco se utiliza para tratar enfermedades de inflamación que están altamente relacionadas con la expresión del CD44.
En un primer aspecto, es un objeto de la invención proporcionar un compuesto que consiste en un conjugado de un glicosaminoglicano y un principio activo, en el que el principio activo se conjuga mediante un grupo funcional a un grupo carboxílico del glicosaminoglicano o una sal del mismo para formar una conjugación covalente, y en el que el principio activo se selecciona de un grupo que consiste en fexofenadina, succinato de budesonida y succinato de prednisolona.
El glicosaminoglicano del conjugado de conformidad con la presente invención es preferentemente ácido hialurónico.
Además, el conjugado de glicosaminoglicanos de conformidad con la presente invención se utiliza preferentemente para tratar enfermedades inflamatorias.
Por lo tanto, en un segundo aspecto es un objeto adicional de la invención proporcionar un compuesto que consiste en un conjugado de un glicosaminoglicano y un principio activo, en el que el principio activo se conjuga por medio de un grupo funcional a un grupo carboxílico del glicosaminoglicano o una sal del mismo para formar una conjugación covalente, y en el que el principio activo se selecciona del grupo que consiste en fexofenadina, succinato de budesonida y succinato de prednisolona para su uso en el tratamiento de la inflamación y para la preparación de composiciones farmacéuticas para dicho tratamiento terapéutico.
También se divulga en el presente documento un método para preparar un compuesto que consiste en un conjugado de un glicosaminoglicano y de un principio activo, en el que el principio activo se conjuga mediante un grupo funcional con un grupo carboxílico del glicosaminoglicano o una sal del mismo para formar una conjugación covalente, y en el que el principio activo se selecciona del grupo que consiste en fexofenadina, succinato de budesonida y succinato de prednisolona.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para describir adecuadamente la presente invención, las referencias a las realizaciones de la misma se ilustran en los dibujos adjuntos. Estos dibujos forman parte de la especificación.
La Fig. 1 muestra la afinidad de los ácidos hialurónicos (HAs) por el índice de fluorescencia en los tejidos normales y lesionados del colon;
La Fig. 2 muestra los resultados de fluorescencia del compuesto de colorante de HA trabajando en la línea celular HCT15 y en la línea celular HT29 con diferente curso de tiempo, donde la Fig 2A representa la línea celular HCT 15 a las 6 horas; la Fig.2B representa la línea celular HCT15 a las 12 horas; la Fig 2C representa la línea celular HT29 a las 6 horas; la Fig.2D representa la línea celular HT29 a las 12 horas.
La Fig. 3 muestra la estructura del conjugado de HA-Celecoxib.
La Fig. 4 muestra el efecto antiinflamatorio del control, el lipopolisacárido (LPS), e1HA, el celecoxib (Cele) y el conjugado HA-Celecoxib (HA-cele) en la línea celular Raw 264.7. El índice de inflamación en este caso es el cambio de porcentaje de la cantidad de prostaglandina E2 (PGE2).
La Fig. 5 muestra la estructura del conjugado HA-ADH-Budesonida.
La Fig. 6 muestra el efecto antiinflamatorio de Control (ctrl), LPS, HA, HA más LPS (HA+LPS), Budesonida (bude.), Budesonida más LPS (bude+LPS), conjugado HA-Budesonida (HA-bude, "HA-bude" significa "HA-ADH-Budesonida") y conjugado HA-Budesonida más LPS (HA-bude+LPS) en la línea celular Raw 264.7. El índice de inflamación en este caso es el cambio de la concentración de nitrito (NO).
La Fig. 7 muestra la estructura del conjugado HA-ADH-Fexofenadina.
La Fig. 8 muestra el efecto antiinflamatorio de Control, LPS, HA, Fexofenadina (Fexo) y el conjugado HA-Fexofenadina (HA-fexo, "HA-fexo" significa "HA-ADH-Fexofenadina") en la línea celular Raw 264.7. El índice de inflamación en este caso es el cambio de porcentaje de la cantidad de prostaglandina E2 (PGE2).
La Fig. 9 muestra la estructura del conjugado HA-ADH-Prednisolona.
La Fig. 10 muestra el efecto antiinflamatorio de Control, LPS, HA, Prednisolona (Pred), y conjugado HA-Prednisolona (HA-pred, "HA-pred" significa "HA- ADH-Prednisolona") en la línea celular Raw 264.7. El índice de inflamación en este caso es el porcentaje de cambio de la cantidad de prostaglandina E2 (PGE2).
La Fig. 11 muestra el efecto del tratamiento de la artritis reumatoide (AR) con el control (vehículo), la prednisolona (Pred), el HA conjugado con prednisolona (HA-ADH-Pred) y el HA. El índice de tratamiento en este caso es el cambio de porcentaje del grosor de la pata (media+SE). Las ratas fueron alimentadas para inducir la AR durante los días que van del D1 al D13, y dosificadas en el día D14. Los datos se calcularon mediante estadísticas no paramétricas, *p<0,05 frente al grupo vehículo; #p<0,05 frente al grupo de la preparación y &p<0,05 frente al grupo del HA.
La Fig. 12 muestra el efecto del tratamiento de la artritis reumatoide (AR) mediante el control (vehículo), la prednisolona (Pred), el HA conjugado con prednisolona (HA-ADH-Pred) y e1HA. El índice de tratamiento en este caso es el cambio de porcentaje de la circunferencia del tobillo (media+SE). Las ratas fueron alimentadas para inducir la AR durante los días que van del D1 al D13, y dosificadas en el día D14. Los datos se calcularon mediante estadísticas no paramétricas, *p<0,05 frente al grupo Vehículo; #p<0,05 frente al grupo Prep y &p<0,05 frente al grupo HA.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS
Otros objetivos, ventajas y características novedosas de la invención se harán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada cuando se tome en conjunto con los dibujos adjuntos.
En general, un fármaco administrado por vía oral o inyectado en el sistema circulatorio debe llegar directamente a su zona de tratamiento objetivo, y por lo tanto el efecto del fármaco en la enfermedad objetivo y en el órgano normal es muy similar porque la concentración y la especificidad no son tan altas en el sitio objetivo, limitado por el perfil de seguridad.
Para mejorar la eficacia de la terapia y combinarla con un buen perfil de seguridad, una estrategia consiste en modificar el fármaco para que sea más selectivo en la zona de la enfermedad mediante el enlace covalente del fármaco con un portador. Se trata de una necesidad especialmente sentida en el campo de la terapia antiinflamatoria, tal y como se ha anticipado anteriormente.
Para ello, el inventor ha concebido la idea de explotar las interacciones entre el ácido hialurónico (HA) y su receptor CD44 para una administración objetivo de la sustancia activa.
La idea de mantener la concentración relativamente más alta del fármaco en el lugar objetivo frente al tejido u órgano normal la ha establecido el inventor tras un estudio y un experimento que se realizó a largo plazo sobre e1HA.
Los resultados, a partir de los cuales se origina la presente invención, se describen en su totalidad en los ejemplos y se resumen brevemente a continuación.
De hecho, la presente invención encuentra apoyo en el resultado que muestra que los ácidos hialurónicos que tienen diferentes pesos moleculares promedio (PM) tienen un índice de adhesión más alto en el tejido lesionado que en el tejido normal y que el HA con bajo peso molecular promedio tiene un mejor rendimiento que los HA con altos pesos moleculares promedio. En particular, como se muestra en la Fig. 1, al comparar las diferencias entre los HA de tres pesos moleculares promedio adheridos a los tejidos de colon lesionados, el índice de fluorescencia de adhesión de1HA de 350 KDa por los tejidos de colon lesionados fue mayor que el de los HA de los otros dos pesos moleculares promedio (2000 KDa = 2 MDa) y (1000 KDa = 1 MDa). Además, el índice de fluorescencia de adhesión de1HA de 1 MDa por parte de los tejidos del colon, normales o lesionados, fue mayor que el del HA de 2 MDa. Este resultado confirmó que e1HA puede adherirse más específicamente en el lugar de la inflamación, lo que induce al inventor a seguir inventando la presente invención y a verificar si esta característica peculiar de adhesión tisular del ácido hialurónico, supuestamente debida a una interacción del HA con su receptor de superficie celular CD44, puede mantenerse cuando este glicosaminoglicano se conjuga con otros compuestos. Por lo tanto, el inventor conjuga además un fármaco con e1HA para comprobar si e1HA puede utilizarse como vehículo de suministro dirigido para conducir el fármaco hacia el sitio de abundancia de CD44. Tal y como se ha mencionado anteriormente, cuando el CD44 se sobreexpresa durante la situación en la que existe una inflamación, una infección o un cáncer, un fármaco relacionado puede llegar fácilmente y retener una concentración relativamente alta en el sitio objetivo debido a que el ligando HA se adhiere al receptor CD44. Junto con el efecto de adherencia del HA al sitio de inflamación o al sitio de abundancia del CD44, el fármaco conjugado debería agregarse especialmente en la parte específica para mejorar la eficacia de la terapia debido a la mayor concentración relativa del fármaco en el sitio y, por lo tanto, disminuyendo en consecuencia la cantidad del fármaco utilizado con un mejor perfil de seguridad. Para confirmar que el fármaco o el colorante se ha conjugado con éxito con e1HA y confirmar aún más el efecto de fijación del HA, el inventor de la presente invención llevó a cabo un experimento que incluía la conjugación del colorante en el HA (HA-colorante) y el tratamiento con las líneas celulares y los ratones por separado. La Fig. 2A y la Fig. 2B muestran los experimentos con diferentes tiempos de trabajo en la línea celular HCT15 (un adenocarcinoma colorrectal con menos CD44), y la Fig. 2C y la Fig. 2D muestran los experimentos con diferentes tiempos de trabajo en la línea celular HT29 (un adenocarcinoma colorrectal con mucho CD44). Los resultados de HT29 (Fig. 2C y Fig. 2D) muestran que el colorante y el HA se han conjugado con éxito y se han unido a la zona abundante en CD44 de HT29 (Fig. 2C), e incluso entran en las células HT29 (Fig. 2D). Esto significa que la idea de la presente invención es adecuada y eficaz, así como también significa que el fármaco o el colorante pueden conjugarse con el HA y que e1HA conserva su capacidad de unirse a CD44.
Se llevó a cabo la condición de fijación del colorante libre y del colorante HA en las líneas celulares de HT29 y HCT15 de ratones durante 4 semanas. El colorante libre se inyectó en la vena de la cola de los ratones. El resultado mostró que las dos células cancerosas de expresión CD44 diferentes no tenían ninguna diferencia en el resultado de fijación. La proporción del área de adhesión de HT29 es del 50,15%, mientras que la de HCT15 es del 49,86%. Sin embargo, cuando se inyectó el colorante conjugado con HA en la vena de la cola de los ratones, la célula cancerosa HT 29 con mayor expresión de CD44 mostró una concentración significativa de colorante conjugado con HA, pero la HCT15 con menor expresión de CD44 mostró un resultado muy limitado. La proporción del área de fijación de HT29 es del 74,15%, mientras que la de HCT15 es del 25,85%. El resultado puede mostrar que cuando el colorante se conjuga con HA, la concentración del colorante incrementa debido a que el hA se adhiere en el sitio en el que el CD44 abunda.
Las enfermedades altamente relacionadas con el CD44 incluyen el cáncer, la infección y la inflamación. Los patógenos infecciosos incluyen, entre otros, algunos virus, bacterias, hongos, protozoos, parásitos multicelulares y proteínas anormales conocidas como priones. Estos patógenos son la causa de las enfermedades epidémicas, en el sentido de que sin el patógeno no se produce ninguna epidemia infecciosa. En una realización preferida, las enfermedades infecciosas incluyen las infecciones de las vías respiratorias inferiores, el VIH/SIDA, las enfermedades diarreicas, la tuberculosis, la malaria, el sarampión, la tos ferina, el tétanos, la meningitis, la sífilis, la hepatitis B, la sepsis y las enfermedades tropicales. Las anomalías inflamatorias constituyen un amplio grupo de trastornos que subyacen a una gran variedad de enfermedades humanas. En una realización preferida, las enfermedades inflamatorias incluyen el acné vulgar, las enfermedades alérgicas, el asma, las enfermedades autoinmunes, la enfermedad celíaca, la prostatitis crónica, la glomerulonefritis, las hipersensibilidades, las enfermedades inflamatorias del intestino, la enfermedad inflamatoria pélvica, las lesiones por reperfusión, la artritis reumatoide, la sarcoidosis, el rechazo de trasplantes, la vasculitis y la cistitis intersticial.
En la especificación, el término "fármaco" o "compuesto" o "agente" puede comprender un fármaco antiasmático, un fármaco antihistamínico, un fármaco antiinfeccioso, un fármaco antiinflamatorio, un fármaco antialérgico, un fármaco antivírico, un inmunosupresor, un AINE (fármaco antiinflamatorio no esteroideo) y un esteroide. Entre ellos, se prefieren los fármacos antialérgicos, los antiinfecciosos, los antiinflamatorios y los esteroides. La mayoría de los fármacos antialérgicos pueden dividirse en antihistamínicos, antiinflamatorios, descongestionantes y esteroides, como la fexofenadina, la cetirizina, el maleato de clorfeniramina, la pseudoefedrina y la budesonida. La mayoría de los fármacos antiinfecciosos pueden dividirse en medios antiinfecciosos locales que se utilizan externamente en la piel o en las membranas mucosas sin entrar en el torrente sanguíneo y metabolizándose en el hígado; y medios antiinfecciosos sistémicos que se utilizan para tratar las infecciones de órganos internos mediante su administración oral o de forma inyectada. La mayoría de los antiinflamatorios pueden dividirse en antiinflamatorios no esteroideos o AINE, inhibidores de la COX-2 y esteroides.
Algunos ejemplos de fármacos incluyen el fármaco antiasmático, el fármaco antifúngico, el fármaco antihistamínico, el fármaco antiinflamatorio, el fármaco antivírico, el AINE y el esteroide. En el presente documento se divulga la conjugación de un fármaco antiasmático, como el Salbutamol; un AINE, como la Nimesulida, el Celecoxib, el Meloxicam, el Diclofenaco y el Piroxicam; un fármaco antialérgico, como la Fexofenadina; un fármaco antifúngico, como la Anfotericina B; un fármaco antivírico, como la Ribavarina; y un esteroide, como la Budesonida y la Prednisolona, con HA. Además, el inhibidor de la COX-2 incluye el Celecoxib.
El objetivo de la presente invención es unir o conjugar el HA con un fármaco de conformidad con las reivindicaciones, con o sin un enlazador o espaciador, mediante el grupo carboxilo, el grupo hidroxilo o el grupo amino de HA para lograr un efecto de trabajo en un lugar específico y en un momento específico. Por lo tanto, e1HA como vehículo de administración objetivo para llevar el fármaco al sitio específico que tiene abundante CD44 puede producir una mejor eficacia y seguridad del tratamiento.
Tal y como se utiliza aquí, en general, el término "enlazador" o "espaciador" significa una fracción orgánica que conecta dos partes de un compuesto. Los enlazadores comprenden típicamente un enlace directo o un átomo como el oxígeno o el azufre, una unidad como SS, NH, C(O), C(O)NH, SO, SO2 , SO2NH o una cadena de átomos, como alquilo sustituido o no sustituido donde uno o más metilenos pueden ser interrumpidos o terminados por O, S, S(O), SO2 , NH, NH2 , C(O). El término "enlazador" o "espaciador" de la presente invención podría estar ausente y denota cualquier compuesto químico presente entre el fármaco y el HA que se podría eliminar químicamente, enzimáticamente o que podría descomponerse espontáneamente; también contiene al menos otro grupo útil para enlazar el fármaco, por ejemplo, aminos, tioles, otros grupos carboxilo, etc. El enlazador o espaciador puede ser un polipéptido, un péptido o un lípido.
Los enlazadores o espaciadores adecuados son, por ejemplo, el ácido adípico dihidrazida (ADH), los ácidos dicarboxílicos C2-C20 lineales o ramificados, alifáticos, aromáticos o aralifáticos, los aminoácidos y los péptidos.
El papel del enlazador, cuando está presente, consiste en crear un brazo o un espaciador entre el ácido hialurónico y el fármaco. El enlazador une, por un lado, el HA a través del enlace con la amida, el grupo carboxilo, el grupo hidroxilo o el grupo amino y, por otro lado, el fármaco a través de cualquier posible enlace de tipo covalente.
Cuando el enlazador o espaciador es un ácido dicarboxílico, el grupo carboxílico que forma el enlace éster con el fármaco puede ser el grupo hidroxilo del compuesto. Cuando el enlazador o espaciador es una dihidrazida, el grupo amino que forma el enlace amida con el HA puede ser el grupo carboxílico libre de1HA. Los enlazadores o espaciadores preferidos son: el ácido succínico con el fármaco y el ácido adípico dihidrazida con el AH.
La presente invención proporciona un compuesto que consiste en un conjugado de un glicosaminoglicano, preferentemente ácido hialurónico, y un principio activo, en el que el principio activo se conjuga mediante un grupo funcional a un grupo carboxílico del glicosaminoglicano o una sal del mismo para formar una conjugación covalente, y en el que el principio activo consiste en fexofenadina, succinato de budesonida o succinato de prednisolona.
En una realización preferida de la presente invención, la conjugación covalente entre uno de los grupos funcionales carboxilo del HA y del principio activo es una conjugación directa mediante un enlace éster.
En el caso de la conjugación indirecta mediante un enlazador, dichos enlazadores se seleccionan entre una dihidrazida, un ácido adípico dihidrazida, un polipéptido, un péptido, un lípido, un aminoácido o un ácido dicarboxílico C2-C20 lineal o ramificado, alifático, aromático o aralifático.
El HA preferido para la conjugación tiene un peso molecular promedio en el rango comprendido entre 5 kDa y 2000 kDa y la conjugación implica al menos el 40% del grupo carboxilo del HA.
Con el fin de tratar la inflamación aguda o crónica, donde la inflamación aguda o crónica la induce o provoca una infección, una lesión, una enfermedad autoinmune, o una alergia y la enfermedad autoinmune que incluye la artritis reumatoide, la forma de realización preferida de la formulación o forma de dosificación de la presente invención incluye un excipiente y/o diluyente para formular una forma de dosificación de administración para uso oral o del sistema de circulación. La realización más preferida de la forma de dosificación oral se selecciona del grupo que consiste en una forma de dosificación sólida, que incluye una solución, pero no se limita a una suspensión, que incluye un comprimido, pero no se limita a un comprimido de liberación controlada, y que incluye una cápsula, pero no se limita a una cápsula con recubrimiento entérico. La forma de administración sistémica o del sistema de circulación más preferida se selecciona del grupo que consiste en intravenosa (IV), intramuscular (IM) y subcutánea (SC).
Los siguientes ejemplos se dan con el fin de ilustrar varias realizaciones de la invención y no pretenden limitar la presente invención de ninguna manera.
EJEMPLO
EJEMPLO 1: La adhesión de HA en el tejido del colon (sistema de imágenes IVIS-visión 3)
Procedimiento:
1. Se añadieron 0,25 g de polvo de hialuronato sódico de alto peso molecular (HHA; PM: 2 MDa; Freda) y 0,25 g de polvo de hialuronato sódico de bajo peso molecular (LHA; PM: 0,35 MDa; Freda) en 50 ml de tampón PBS (solución salina tamponada con fosfato), respectivamente, para formar una solución al 0,5%, y luego se agitó durante 6 horas hasta que el polvo se disolvió totalmente. Se añadieron 0,25 g de hialuronato sódico de peso molecular promedio (MHA; PM: 1 MDa; Freda) en 50 ml de tampón PBS, y se agitó durante 6 horas hasta que el polvo se disolvió totalmente y estuvo listo para usarse en los siguientes pasos.
2. El HA fluorescente (HA-f) se preparó mediante (1) 0,39 g de ácido libre MES (ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico, Calbiochem) y se disolvió en 100 ml de agua dd. (2) Solución A: se disolvieron 65 mg de polvo de fluroresceinamina, (isómero I, Fluka) en 9 ml de solución de EtOH al 95% y, a continuación, se agitó durante 10 minutos bajo una condición en la que la luz estaba prohibida. (3) Solución B: se disolvieron 359 mg de polvo de EDC (clorhidrato de N-(3-dimetilamino propil)-N-etil carbodiimida, Sigma) en 9 ml de tampón MES y, a continuación, se agitó durante 10 minutos. (4) Solución C: se disolvieron 216 mg de polvo de NHS (N-hidroxisuccinimida, Sigma) en 9 ml de tampón MES y se agitó durante 10 minutos. (5) Se echaron lentamente gota a gota 3 ml de solución A en 50 ml de solución de HA al 0,5% y luego se agitó durante 10 minutos bajo una condición en la que la luz estaba prohibida. (6) Se echaron gota a gota de forma separada 3 ml de solución B y 5 ml de solución C en la solución de la etapa (5) y luego se agitó durante 10 minutos bajo una condición en la que la luz estaba prohibida. (7) Se añadió lentamente tampón MES 0,02 M a la solución de la etapa (6) hasta que el volumen alcanzó los 100 ml y, a continuación, se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente bajo una condición en la que la luz estaba prohibida. (8) El producto después de la reacción se vertió en un tubo de diálisis (PM: de 12000 a aproximadamente 14000) en 5 L de agua dd como solución de diálisis y luego se agitó durante 5 días a 4°C bajo una condición en la que la luz estaba prohibida con la solución de diálisis que se cambiaba cada 12 horas hasta que la solución de diálisis no tuviera fluorescencia. (9) El líquido después de la diálisis se distribuyó en tubos de centrífuga de plástico de 50 c.c. y luego se reservaron en el frigorífico a -20°C durante la noche, seguido de un secado en una máquina de liofilización bajo una condición en la que la luz estaba prohibida. (10) El polvo de HA-f seco se reservó en el frigorífico a -20°C. (11) Se añadieron lentamente 50 mg de polvo de HA-f en 10 ml de tampón PBS y, a continuación, se agitó durante 6 horas hasta que el polvo se disolvió totalmente.
3. El tejido del colon de la rata SD (rata Sprague Dawley) de 7-8 semanas de edad se cortó con escalpelo y después se lavó con tampón PBS, para luego cortarlo en 3-4 cm de longitud y sumergirlo finalmente en tampón PBS.
4. El tejido de colon lesionado se preparó cepillando con un cepillo de dientes 20 veces en sentido longitudinal y, a continuación, se puso en remojo en tampón PBS.
5. Los tejidos normales y lesionados del colon se colocaron en una placa de 12 pocillos y, a continuación, se añadió 1 ml de solución de HA-f al 0,5% en cada pocillo y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. La solución de HA-f sobrante se succionó por puntas 2 horas después, y luego se puso en remojo en tampón PBS durante 10 minutos, seguido de la eliminación del tampón PBS repetidamente durante 3 veces.
6. El tejido de colon limpio se colocó en una placa de 12 pocillos con el tejido de revestimiento hacia arriba y luego se colocó en el puerto (“dock”) del IVIS (sistema de imágenes in vivo, XENOGEN). El parámetro por defecto se configuró como GFP (proteína verde fluorescente) mientras que la excitación fue de 465 nm y la emisión fue de 500 nm y luego la imagen fue capturada por el sistema informático.
7. Todos los valores se calculan como media de n observaciones. El índice histológico se analizó mediante la prueba t de Student.
Resultado: Se cuantificó el índice de fluorescencia y se dispuso como en la Fig. 1. El índice de fluorescencia del tejido de colon normal se definió como 1. Los ensayos de los demás tejidos de colon se calibraron con el valor definido. El resultado mostró que los HA con el mismo PM promedio se adhirieron en los tejidos de colon lesionados con un índice de fluorescencia obviamente mayor que en los tejidos de colon normales (P<0,01). Al comparar la diferencia entre los HA de tres pesos moleculares promedio diferentes adheridos en los tejidos de colon lesionados, el índice de fluorescencia de la adhesión del HA de 350 KDa por parte de los tejidos de colon lesionados fue obviamente mayor que el de los HA de los otros dos pesos moleculares promedio (2 MDa y 1 MDa). Además, el índice de fluorescencia de la adhesión de1HA de 1 MDa por parte de los tejidos de colon lesionados o incluso normales fue mayor que el de1HA de 2 MDa.
EJEMPLO 2: Proceso de conjugación HA-colorante e imagen in vitro HA-colorante (ejemplo comparativo)
Todo el siguiente proceso de conjugación HA-colorante debe mantenerse en la oscuridad. La síntesis de HA-ADH
1. El HA (0,34 MDa, 50 mg) se disolvió en agua para obtener una concentración de 4 mg/ml.
2. Se añadió a la solución un exceso de 5 veces (114,8 mg) de HAD.
3. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 4,75 con la adición de HCl 0,1 N.
4. A continuación, se añadió 1 equiv. (25,1 mg) de EDC en forma sólida. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo en 4,75 con la adición de HCl 0,1 N.
5. Después de 15 minutos de reacción, la reacción se enfrió con la adición de NaOH 0,1 N para ajustar el pH de la mezcla de reacción a 7,0.
6. La mezcla de reacción se transfirió entonces a un tubo de diálisis pretratado (corte PM 3500) y se dializó exhaustivamente contra 100 mM NaCl, luego 25% EtOH /agua 4 ciclos y finalmente agua. A continuación, la solución se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,2 mm, se ultracongeló y se liofilizó.
7. El grado de sustitución del HAD se midió por 1 H NMR.
La síntesis de HA-ADH-FITC
1. Se disolvieron 88 mg de HA-ADH (DS=36%) en 35 ml de agua.
2. Se disolvieron 9,5 mg de FITC en 10 ml de Dm SO.
3. Se mezcló la solución de HA-ADH y la solución de FITC.
4. Después de agitarla 48 h a temperatura ambiente, la solución se dializó 3 días con NaCl 0,3 M y agua pura alternativamente utilizando la bolsa de diálisis PMCO 12000-14000.
5. La solución, a continuación, se liofilizó 2 días.
6. Finalmente se determinó el grado de sustitución mediante el espectro UV.
Imagen in vitro del colorante HA
(1) Se sembraron 1x105 células HT29 y células HCT15 (carcinoma de colon humano, una célula CD44 positiva) en un portaobjetos de un microscopio en una placa de 3,5 cm.
(2) Se añadieron las concentraciones de colorante indicadas, 1 |iM de colorante-HA (HA: 0,34 MDa) en las células durante el tiempo indicado respectivamente.
(3) Tras la incubación, las células se lavaron con PBS y, a continuación, se fijaron en formaldehído al 3,7%.
(4) La observación de la interacción entre el colorante-HA y las células se realizó mediante microscopía confocal.
Resultado: La vista fluorescente puede mostrar el sitio de unión y la cantidad de colorante en HCT15 (Fig.2A y Fig.2B) y HT29 (Fig.2C y Fig.2D). Los resultados revelan que el colorante se ha conjugado con éxito con e1HA y que el HA aumenta la concentración de colorante-HA en el sitio abundante de CD44 en HT29, mientras que HT29 tiene una fluorescencia más fuerte que se encuentra con CD44 más abundante que el que HCT15 tiene. Incluso se demostró que el colorante-HA puede entrar en las células (Fig.2D). El colorante-HA se acumuló tras un tratamiento de 6 horas y se internalizó tras un tratamiento de 12 horas en HT29 (más CD44). Este fenómeno no se observó en HCT15 (menos c D44) después de un tratamiento de 6 horas o de 12 horas de colorante-HA.
EJEMPLO 3: Síntesis del conjugado HA-Celecoxib (ejemplo comparativo)
Procedimiento
1. Se disolvieron 100 mg de HA (10K-700KDa) en 25 ml de agua DD.
2. Se añadió hidróxido de tetrabutilamonio (TBA-OH) 0,8 eq en la solución de HA y se agitó durante 16 horas.
3. Se secó la solución y se obtuvo el sólido blanco HA-TBA.
4. Se disolvieron 40 mg de HA-TBA en 1 ml de agua DD y luego se añadieron 30 mg de EDC y 18 mg de polvo de NHS a la solución y se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos.
5. Se disolvieron 4 mg de Celecoxib en 2 ml de solución de dimetilsulfóxido (DMSO).
6. Esta mezcla (HA-TBA, EDC, NHS y Celecoxib) se agitó a temperatura ambiente durante 72 horas.
7. La mezcla se dializó durante 1 día contra que una proporción de DMSO y agua DD es de 2 a 1 utilizando una bolsa de dializado (PMCO: de 1200 a aproximadamente 1400) y se cambió la solución tres veces.
8. A continuación, la mezcla se dializó durante 2 días contra NaCl 0,3 M utilizando una bolsa de dializado (PMCO: de 1200 a aproximadamente 1400) y se cambió la solución dos veces al día.
9. El polvo de HA-Celecoxib se obtuvo por deshidratación mediante liofilización a partir de la solución de HA-Celecoxib.
Resultado: La Fig. 3 muestra la estructura del conjugado HA-Celecoxib.
EJEMPLO 4: Efectos antiinflamatorios in vitro de HA-Celecoxib en células RAW 264.7 (ejemplo comparativo)
Procedimiento
1. Las células RAW 264.7 (1 x 106 células/pocillo, 1000 |iL) se incubaron en una placa de cultivo de 24 pocillos en presencia de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas.
2. El medio se cambió a DMEM que contenía 10% de FBS, y las células se trataron con varias concentraciones de compuestos (100 nM de Celecoxib, HA-Celecoxib (igual a 100 nM de Celecoxib), y 4,9 |ig/ml de HA) durante 4 horas, seguidas de un tratamiento con 1 |ig/mL de lipopolisacárido (LPS) durante 24 h.
3. Se recogieron los medios celulares y se utilizaron para medir la PGE2.
4. Las placas Nunc-Immuno de 96 pocillos se recubrieron con un anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-ratón IgG.
5. Se añadieron alícuotas de medios celulares a la placa inmunológica con el anticuerpo monoclonal primario PGE2 y un trazador PGE2-acetilcolinesterasa durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad.
6. Al día siguiente, se aspiraron los pocillos y se lavaron con 100 mL de tampón de lavado (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) cinco veces.
7. Se añadieron 200 |iL de reactivo de Elman en cada pocillo y se incubaron entre 60 y 90 minutos a temperatura ambiente y sin luz directa.
8. Se utilizó una suave rotación/agitación para disminuir el tiempo necesario para el desarrollo del color.
9. La absorbencia se leyó a 412 nm.
10. La concentración de PGE2 de cada muestra se calculó a partir de una curva estándar de PGE2.
11. El porcentaje de la cantidad de PGE2 fue en función del nivel de PGE2 de cada muestra dividido por el del grupo de control que fue tratado con LPS, y a continuación se multiplicó este valor por 100.
12. La cantidad real de PGE2 se estimó en 1370 ng/ml para el grupo de control que fue tratado con LPS.
Resultado: Tal y como se muestra en la Fig. 4, la inflamación se indujo con éxito por LPS, ya que el índice es la cantidad de PGE2. El grupo en el que solo se encuentra el fármaco (Celecoxib) tiene un efecto de tratamiento; sin embargo, cuando el HA se conjuga con Celecoxib (HA-cele), tiene un mejor efecto de tratamiento que el fármaco solo.
EJEMPLO 5: Síntesis del conjugado HA-ADH-Budesonida
Procedimiento
Síntesis de HA-ADH:
1. El HA (50 mg) se disolvió en agua para obtener una concentración de 4 mg/ml.
2. Se añadió a la solución un exceso de 5 veces (114,8 mg) de ADH.
3. El pH de la mezcla de reacción se ajustó a 4,75 con la adición de 0,1 NHCl.
4. A continuación, se añadió 1 equiv. (25,1 mg) de EDC en forma sólida. El pH de la mezcla de reacción se mantuvo en 4,75 con la adición de HCI 0,1 N.
5. Después de 15 minutos de reacción, la reacción se enfrió con la adición de NaOH 0,1 N para ajustar el pH de la mezcla de reacción a 7,0.
6. La mezcla de reacción se transfirió entonces a un tubo de diálisis pretratado (corte PM 3500) y se dializó exhaustivamente contra 100 mM NaCl, luego 25% EtOH /agua 4 ciclos y finalmente agua. A continuación, la solución se filtró a través de una membrana de acetato de celulosa de 0,2 mm, se ultracongeló y se liofilizó.
7. El grado de sustitución del HAD se midió por 1 H NMR.
Síntesis de HA-ADH-Budesonida:
1. El succinato de HA-ADH-Budesonida se formó por conjugación química del grupo carboxilo del succinato de budesonida con el grupo amina del HA-ADH utilizando EDC y NHS.
2. Se disolvieron 7,4 mg de succinato de budesonida en 1 ml de DMSO y se hicieron reaccionar con 1 ml de agua pura que contenía EDC 14,5 pmol y NHS 14,5 pmol durante 5 minutos.
3. Después de 5 minutos, la solución mezclada se añadió gota a gota en 8 ml de agua: DMSO=1:1(v/v) de cosolvente que contenía 20 mg de HA-ADH.
4. La solución mezclada se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente (a unos 30°C).
5. Después de 24 horas, la solución se dializó 3 días con NaCl 0,3 M y agua pura alternativamente utilizando una bolsa de diálisis MWCO 12000-14000.
6. La solución fue entonces liofilizada 2 días y almacenada a 4°C.
7. Finalmente se determinó el grado de sustitución mediante 1H-NMR.
Resultado: La Fig. 5 muestra la estructura del conjugado HA-ADH-Budesonida.
EJEMPLO 6: Efectos antiinflamatorios in vitro de HA-ADH-Budesonida en células RAW 264.7
Procedimiento
1. Las células RAW 264.7 se suspendieron en medio de cultivo sin rojo de fenol (Gibco-BRL, Viena, Austria) y se ajustaron a 106 células/ml, y se trataron con 10 pM de budesonida, 378pg/ml de HA y HA-ADH-Budesonida (igual a 10 pM de budesonida).
2. Tras el tratamiento con los fármacos durante 4 horas, se añadió 1 pg/mL de LPS al medio durante 24 horas.
3. Las células tratadas solo con el medio sirvieron como grupo de control negativo y las tratadas con LPS (1 pg/mL) como grupo de control positivo.
4. Posteriormente se eliminaron los sobrenadantes del cultivo y se acumuló el óxido nítrico para la medición de la actividad de la iNOS mediante la reacción de Griess.
5. Se añadieron 100 pl de reactivo de Griess (1% de sulfanilamida, 1% de dihidrocloruro de naftilendiamina en 2,5% de ácido fosfórico) a 100 pl de sobrenadante de cultivo y se evaluó el desarrollo del color a 550 nm con un lector de microplacas ELISA (Spec- traMax® M2e Multimode Plate Reader, Molecular Devices, USA).
6. Las curvas estándar se generaron con una dilución en serie de nitrito de sodio disuelto en un medio de cultivo que no contiene rojo de fenol.
Resultado: Como se muestra en la Fig. 6, al comparar con los grupos LPS solo, HA+LPS, bude+LPS, y HA-bude+LPS ("HA-bude" significa "HA-ADH-Budesonida"), los grupos HA+LPS y HA-bude+LPS tienen efecto de tratamiento. El índice de inflamación en este caso es el nitrito.
EJEMPLO 7: Síntesis del conjugado HA-ADH-Fexofenadina
Procedimiento
1. La HA-ADH-Fexofenadina se sintetizó mediante la conjugación química del grupo carboxilo de la Fexofenadina con el grupo amino de HA-ADH utilizando EDC y NHS.
2. Se disolvieron 7,8 mg de Fexofenadina en 1 ml de DMSO y se hicieron reaccionar con 1 ml de agua pura que contenía 73,3 pmol de EDC y 73,9 pmol de NHS durante 5 minutos.
3. Después de 5 minutos, la solución mezclada se añadió gota a gota en 8 ml de agua: DMSO=1:1(v/v) de cosolvente que contenía 20 mg de HA-ADH.
4. La solución mezclada se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente (a unos 30°C).
5. Después de 24 horas, la solución se dializó 3 días con NaCl 0,3 M y agua alternativamente utilizando una bolsa de diálisis de MWCO 12000-14000 en serie.
6. La solución fue entonces liofilizada 2 días y almacenada a 4°C.
7. Finalmente se determinó el grado de sustitución mediante 1H-NMR.
Resultado: La Fig. 7 muestra la estructura del conjugado HA-ADH-Fexofenadina.
EJEMPLO 8: Efectos antiinflamatorios in vitro de HA-ADH-Fexofenadina en células RAW 264.7
Procedimiento
1. Las células RAW 264.7 (1 x 106 células/pocillo, 1000 |iL) se incubaron en una placa de cultivo de 24 pocillos en presencia de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas.
2. El medio se cambió a DMEM que contenía un 10% de FBS, y las células se trataron con varias concentraciones de compuestos (100 |iM de Fexofenadina, HA-ADH-Fexofenadina (igual a 100 |iM de Fexofenadina), y 2,96 mg/ml de HA) durante 4 horas, seguido de un tratamiento con 1 |ig/mL de LPS durante 24 h.
3. Se recogieron los medios celulares y se utilizaron para medir la PGE2.
4. Las placas Nunc-Immuno de 96 pocillos se recubrieron con un anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-ratón IgG.
5. Se añadieron alícuotas de medios celulares a la placa inmunológica con el anticuerpo monoclonal primario PGE2 y un trazador PGE2-acetilcolinesterasa durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad.
6. Al día siguiente, se aspiraron los pocillos y se lavaron con 100 |iL de tampón de lavado cinco veces.
7. Se añadieron 200 |iL de reactivo de Elman en cada pocillo, y se incubaron 60-90 minutos a temperatura ambiente alejados de la luz directa.
8. Se utilizó una suave rotación/agitación para disminuir el tiempo requerido para el desarrollo del color.
9. La absorbencia se leyó a 412 nm.
10. La concentración de PGE2 de cada muestra se calculó a partir de una curva estándar de PGE2.
11. El porcentaje de cantidad de PGE2 fue en función del nivel de PGE2 de cada muestra dividido por el del grupo de control que fue tratado con LPS, y luego se multiplicó este valor por 100.
12. La cantidad real de PGE2 se estimó en 1370 ng/ml para el grupo de control que fue tratado con LPS.
Resultado: Como se muestra en la Fig. 8, el grupo de solo fármaco (Fexofenadina) tiene efecto de tratamiento; sin embargo, cuando se conjuga HA con Fexofenadina (HA-fexo, "HA-fexo" significa "HA-ADH-Fexofenadina"), tiene mejor efecto de tratamiento que el fármaco solo.
EJEMPLO 9: Síntesis del conjugado HA-ADH-Prednisolona
Procedimiento
1. Síntesis del 21-hemiéster de la Prednisolona:
2. Una solución de Prednisolona (1 g; 2,77 mmol) y anhídrido succínico (1,125 g; 12,55 mmol) en piridina (8 mL) se agitó a temperatura ambiente.
3. Después de 24 h, la mezcla de reacción se vertió en una mezcla de hielo (25 g), agua (25 mL) y HCl conc. (10 mL). 4. Los cristales separados se recogieron por filtración, se lavaron con agua, se secaron, se recristalizaron de tolueno y se volvieron a secar durante la noche.
5. El hemiéster preparado se caracterizó por espectroscopia de 1H-RMN.
Síntesis del hemiéster HA-ADH-Prednisolona:
1. SOLUCIÓN 1: Se añadieron EDC 73,3 |imol (14 mg) y NHS 73,9 |imol (8,5 mg) en 1 ml de agua.
2. SOLUCIÓN 2: Se disolvió el hemiéster de Prednisolona 14,5 |imol (6,4 mg) en 1 ml de DMSO.
3. SOLUCIÓN 3: Se disolvieron HA-ADH (D.S= 31%) 20 mg (ADH:14,5 |imol) en 8 ml de cosolvente (agua: DMSO=1:1).
4. Mezclar la SOLUCIÓN 1 y 2, y agitar durante 5 minutos para activar el grupo carbonilo en el hemiéster de la Prednisolona.
5. Después de 5 minutos, la mezcla se añadió gota a gota (1ml/min) a la SOLUCIÓN 3 bajo agitación.
6. La solución mezclada se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente (a unos 30°C).
7. Después de 24 horas, la solución se dializó 3 días con NaCl 0,3 M / agua pura alternativamente utilizando una bolsa de diálisis de MWCO 12000-14000.
8. La solución fue entonces liofilizada 2 días.
9. Finalmente se determinó el grado de sustitución de HA-ADH-Pred mediante 1H-NMR.
Resultado: La Fig. 9 muestra la estructura del conjugado HA-ADH-Prednisolona.
EJEMPLO 10: Efectos antiinflamatorios in vitro de HA-ADH-Prednisolona en células RAW 264.7
1. Las células RAW 264.7 (1 x 106 células/pocillo, 1000 |iL) fueron incubadas en una placa de cultivo de 24 pocillos en presencia de 5% de CO2 a 37°C durante 24 horas.
2. El medio se cambió a DMEM que contenía un 10% de FBS, y las células se trataron con varias concentraciones de compuestos (86,7 pM de Prednisolona, HA-ADH-Prednisolona (igual a 86,7 pM de Prednisolona), y 70 pg/ml de HA) durante 4 horas, seguido de un tratamiento con 1 pg/mL de LPS durante 24 horas.
3. Se recogieron los medios celulares y se utilizaron para medir la PGE2.
4. Las placas Nunc-Immuno de 96 pocillos se recubrieron con un anticuerpo secundario policlonal de cabra anti-ratón IgG.
5. Se añadieron alícuotas de medios celulares a la placa inmunológica con el anticuerpo monoclonal primario PGE2 y un trazador PGE2-acetilcolinesterasa durante la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad.
6. Al día siguiente, se aspiraron los pocillos y se lavaron con 100 pL de tampón de lavado cinco veces.
7. Se añadieron 200 pL de reactivo de Elman en cada pocillo, y se incubaron 60-90 minutos a temperatura ambiente alejados de la luz directa.
8. Se utilizó una suave rotación/agitación para disminuir el tiempo requerido para el desarrollo del color.
9. La absorbencia se leyó a 412 nm.
10. La concentración de PGE2 de cada muestra se calculó a partir de una curva estándar de PGE2.
11. El porcentaje de cantidad de PGE2 fue en función del nivel de PGE2 de cada muestra dividido por el del grupo de control que fue tratado con LPS, y luego se multiplicó este valor por 100.
12. La cantidad real de PGE2 se estimó en 1370 ng/ml para el grupo de control que fue tratado con LPS.
Resultado: Como se muestra en la Fig. 10, el grupo de solo fármaco (Prednisolona) tiene efecto de tratamiento; sin embargo, cuando se conjuga HA con Prednisolona (HA-pred, "HA-pred" significa "HA-ADH-Prednisolona"), tiene mejor efecto de tratamiento que el fármaco solo.
EJEMPLO 11: Efecto del tratamiento in vivo de la artritis reumatoide (AR) mediante HA-ADH-Prednisolona
Procedimiento
1. Se prepararon 30 ratas macho Sprague Dawley de ocho semanas (BioLASCO Taiwan Co., Ltd.). Las ratas 20 se dividieron en 4 grupos al azar (n=9 para el grupo vehículo y Prednisolona, n=6 para el grupo HA-ADH-Prednisolona y HA). Se colocaron dos ratas por jaula en las instalaciones para roedores del Instituto de Tecnología Animal de Taiwán.
2. Se inyectaron 0,1 mL de CFA (adyuvante completo de Freund, 10 mg/mL, Chondrex Inc.) con 10 mg/mL de micobacterias muertas por calor en forma subcutánea en la almohadilla de la pata de la extremidad posterior derecha.
3. La aguja debe insertarse justo debajo de la piel de la almohadilla de la pata apuntando hacia el tobillo: esto maximiza la administración del adyuvante a los ganglios linfáticos poplíteos de drenaje.
4. La inflamación severa y aguda se observa a los 30 minutos de la inyección, alcanza su punto máximo a los 3 o 4 días, y a menudo persiste durante 20 o 25 días.
5. Las ratas fueron tratadas en el día 14 después de la inducción de la artritis inducida por adyuvante (AIA) mediante la inyección intravenosa de Prednisolona o HA-Prednisolona (ambas de 10 mg/kg), o solución salina como control.
6. Las ratas fueron sacrificadas en el día 20 después del tratamiento y a continuación se aislaron los tejidos.
Medidas de la artritis:
Grosor de la pata y circunferencia del tobillo: El grosor de la pata se determina midiendo el diámetro de la pata con un calibre, como el calibre digimatic Mitutoyo. La circunferencia del tobillo se determina midiendo 2 diámetros perpendiculares, el diámetro latero-lateral (a) y el diámetro anteroposterior (b), con un calibre digital y utilizando la siguiente fórmula:
circunferencia = 2%(^(a2 b2)/2 )
Resultado: Tal y como se muestra en la Fig. 11, la AR ha sido inducida con éxito. Al principio de la fecha de administración del fármaco (día 14), el grupo de solo HA tiene casi la misma tendencia en comparación con el grupo de control (vehículo) en el tipo de índice del cambio de grosor de la pata. El grupo de solo fármaco (Prednisolona) mostró el efecto del tratamiento. Sin embargo, cuando el fármaco se conjugó con el HA (grupo HA-ADH-Pred), el efecto del tratamiento fue incluso mejor que el del fármaco solo, y es estadísticamente significativo. Además, como se muestra en la Fig. 12, el HA solo mejora los síntomas de la AR en este tipo de índice (cambio de la circunferencia del tobillo); sin embargo, cuando el fármaco se conjugó con HA (grupo HA-ADH-Pred), el efecto del tratamiento fue mejor que el del fármaco solo, y es estadísticamente significativo.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que consiste en un conjugado de un glicosaminoglicano y de un principio activo, en el que el principio activo se conjuga mediante un grupo funcional con un grupo carboxílico del glicosaminoglicano o una sal del mismo para formar una conjugación covalente, y el principio activo se selecciona del grupo que consiste en fexofenadina, succinato de budesonida y succinato de prednisolona.
2. El compuesto según la reivindicación número 1, en el que la conjugación covalente es una conjugación directa mediante un enlace éster.
3. El compuesto según la reivindicación número 1, en el que el principio activo se conjuga indirectamente con el grupo carboxílico del glicosaminoglicano a través de un enlazador.
4. El compuesto según la reivindicación número 3, en el que el enlazador se selecciona del grupo formado por un ácido adípico dihidrazida, un polipéptido, un péptido, un lípido, un aminoácido y un ácido dicarboxílico C2-C20, alifático, aromático o aralifático, lineal o ramificado.
5. El compuesto según la reivindicación número 1, en el que el glicosaminoglicano es ácido hialurónico.
6. El compuesto según la reivindicación número 5, en el que el ácido hialurónico tiene un peso molecular promedio comprendido en el rango que oscila entre los 5 kDa y los 2000 kDa.
7. Un compuesto para su uso en el tratamiento de la inflamación aguda o crónica, en el que el compuesto es según la reivindicación número 1.
8. El compuesto para su uso en el tratamiento de una inflamación aguda o crónica según la reivindicación número 7, en el que la inflamación la induce o la provoca una infección, una lesión, una enfermedad autoinmune o una alergia.
9. El compuesto para uso en el tratamiento de una inflamación aguda o crónica según la reivindicación número 8, en el que la enfermedad autoinmune es la artritis reumatoide.
10. Un compuesto formado por un conjugado de un glicosaminoglicano y un principio activo según la reivindicación número 1 para su uso en el tratamiento de una inflamación, en el que se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho compuesto a un sujeto que lo necesita.
11. El compuesto para uso en el tratamiento de una inflamación según la reivindicación número 10, en el que la inflamación la induce o la provoca una infección, una lesión, una enfermedad autoinmune o una alergia.
12. Una composición farmacéutica, que comprende al menos un conjugado de un glicosaminoglicano y un principio activo según la reivindicación número 1 en combinación con al menos un excipiente y/o diluyente.
13. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la inflamación, en la que la composición farmacéutica es según la reivindicación número 12.
14. La composición farmacéutica para uso en el tratamiento de la inflamación según la reivindicación número 13, en la que la inflamación la induce o la provoca una infección, una lesión, una enfermedad autoinmune o una alergia.
15. La composición farmacéutica según la reivindicación número 12, en la que la composición farmacéutica está diseñada para que se administre de manera oral o inyectable.
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