ES2853732T3 - Método de producción de un monómero para una molécula de ácido nucleico monocatenario - Google Patents
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Abstract
Un método de producción de un compuesto representado por la fórmula (3): **(Ver fórmula)** o un enantiómero del mismo, que comprende: hacer reaccionar un compuesto representado por la fórmula (1): **(Ver fórmula)** o un enantiómero del mismo con ácido 6-hidroxihexanoico en un disolvente en presencia de un aditivo seleccionado del grupo constituido por 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, (hidroxiimino)cianoacetato etílico, carbonato N,N'-disuccinimidílico, N-hidroxiftalimida, N-hidroxipiperidina, 3- hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina e imida de ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico, y un agente de condensación y, a continuación, mezclar la mezcla de reacción resultante, agua y una base seleccionada del grupo constituido por hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino, un compuesto de amidina bicíclica, alcóxido de metal alcalino e hidróxido de amonio cuaternario para producir un compuesto representado por la fórmula (2): **(Ver fórmula)** o un enantiómero del mismo; y hacer reaccionar el compuesto representado por la fórmula (2), obtenido en la etapa de producción, o un enantiómero del mismo, con 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita en un disolvente en presencia de un activador de acoplamiento para obtener el compuesto representado por la fórmula (3) o un enantiómero del mismo, en donde el activador de acoplamiento es un activador de acoplamiento usado para la síntesis de oligonucleótidos mediante un método de fosforoamidato.
Description
DESCRIPCIÓN
Método de producción de un monómero para una molécula de ácido nucleico monocatenario
Campo técnico
La presente invención versa sobre un método de producción de un monómero usado para producir una molécula de ácido nucleico monocatenario capaz de suprimir la expresión de un gen diana.
Técnica anterior
El documento US2012/0035246 da a conocer un método de producción de una molécula de ácido nucleico monocatenario capaz de suprimir la expresión de un gen diana y, como monómero usado para su producción, la producción de un compuesto representado por la fórmula (3)
(denominado en lo sucesivo compuesto (3)) y su enantiómero se describe en el Ejemplo A3.
Sin embargo, cuando se usa el compuesto (3) obtenido por el método descrito en el documento US2012/0035246, el rendimiento de la molécula de ácido nucleico monocatenario no es necesariamente suficiente.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un método de producción del compuesto (3) capaz de producir la molécula de ácido nucleico monocatenario con alto rendimiento.
La presente invención es como sigue.
[1] Un método de producción de un compuesto (3) o un enantiómero del mismo, que comprende: hacer reaccionar un compuesto representado por la fórmula (1):
(denominado en lo sucesivo compuesto (1)) o un enantiómero del mismo con ácido 6-hidroxihexanoico en un disolvente en presencia de un aditivo seleccionado del grupo constituido por 1-hidroxibenzotriazol, 1 -hidroxi-7-azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, (hidroxiimino)cianoacetato etílico, carbonato N,N'-disuccinimidílico, N-hidroxiftalimida, N-hidroxipiperidina, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina e imida de ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico, y un agente de condensación, y mezclar a continuación la mezcla de reacción resultante, agua y una base seleccionada del grupo constituido por hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino, un compuesto de amidina bicíclica, alcóxido de metal alcalino e hidróxido de amonio cuaternario para producir un compuesto representado por la fórmula (2):
(denominado en lo sucesivo compuesto (2)) o un enantiómero del mismo; y
hacer reaccionar el compuesto representado por la fórmula (2), obtenido en la etapa de producción, o un enantiómero del mismo, con 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita en un disolvente en presencia de un activador de acoplamiento para obtener el compuesto (3) o un enantiómero del mismo, en donde el activador de acoplamiento es un activador de acoplamiento usado para la síntesis de oligonucleótidos mediante un método de fosforoamidato.
[2] El método de producción según [1] en donde la base es un hidróxido de metal alcalino.
[3] El método de producción según [1] o [2] en donde el agente de condensación es clorhidrato de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, N,N'-diisopropilcarbodiimida, 1,1-carbonildiimidazol, trímero cíclico de anhídrido 1-propilfosfónico o 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina.
[4] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [3] en donde el aditivo es 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, (hidroxiimino)cianoacetato etílico o carbonato N,N'-disuccinimidílico.
[5] El método de producción según uno cualquiera de [1] a [4] en donde el activador de acoplamiento es sal diisopropilaminotetrazol, 1H-tetrazol, 5-(etiltio)-1H-tetrazol, 5-(benciltio)-1H-tetrazol o 4,5-dicianoimidazol.
Modo de realización de la invención
Puede obtenerse un compuesto (1) usado en el método de producción de la presente invención mediante el método descrito en el documento US2012/0035246. Más específicamente, el compuesto (1) puede ser obtenido en el Ejemplo de referencia 4 descrito posteriormente.
Se describirá un proceso de producción de un compuesto (2) haciendo reaccionar un compuesto (1) con ácido 6-hidroxihexanoico en un disolvente en presencia de un aditivo seleccionado del grupo constituido por 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, (hidroxiimino)cianoacetato etílico, carbonato N,N'-disuccinimidílico, N-hidroxiftalimida, N-hidroxipiperidina, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina e imida de ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico, y un agente de condensación, y mezclando a continuación la mezcla de reacción resultante, agua, y una base seleccionada del grupo constituido por hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino, un compuesto de amidina bicíclica, alcóxido de metal alcalino, e hidróxido de amonio cuaternario.
Como disolvente se usa un disolvente inerte a la reacción de condensación por deshidratación, y ejemplos del mismo incluyen hidrocarburos halogenados tales como diclorometano y cloroformo, hidrocarburos aromáticos tales como tolueno y xileno, éteres tales como tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, metil ter-butil éter, ciclopentil metil éter, 1,4-dioxano y éter dietílico, cetonas tales como acetona, 2-butanona y metil-isobutil cetona, ésteres tales como acetato metílico y acetato etílico, amidas tales como dimetilformamida, dimetilacetamida, y N-metil pirrolidona, ureas tales como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona y N,N'-dimetilpropilenourea, nitrilos tales como acetonitrilo y propionitrilo, y compuestos que contienen sulfuro, tales como dimetilsulfóxido y sulfolano. La cantidad del disolvente que ha de usarse es generalmente de 0,5 a 100 veces en peso del compuesto (1).
Como agente de condensación, se usa un agente de condensación usado para la reacción de condensación por deshidratación, y ejemplos del mismo incluyen clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, N,N'-diisopropilcarbodiimida, 1,1-carbonildiimidazol, trímero cíclico de anhídrido 1-propilfosfónico y 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina.
Para la reacción, por 1 mol del compuesto (1), el aditivo se usa generalmente en una relación de 0,1 moles a 20 moles, y el agente de condensación se usa generalmente en una relación de 1 mol a 10 moles.
Para la reacción puede añadirse una amina terciaria. Ejemplos de la amina terciaria incluyen trietilamina y diisopropiletilamina. La cantidad de la amina terciaria que ha de añadirse es generalmente de 0,1 a 30 moles por 1 mol del compuesto (1).
Cuando se usa un disolvente que tiene una temperatura de ebullición de 70 °C o más, la temperatura de reacción
suele estar en el intervalo de 10 °C a 70 °C, y cuando se usa un disolvente que tiene una temperatura de ebullición de menos de 70 °C, la temperatura de reacción suele estar en el intervalo de 10 °C a la temperatura de reflujo del disolvente.
El tiempo de reacción suele estar entre 0,5 hora y 150 horas.
Después de la reacción, cuando el disolvente se mezcla con agua y una base, el disolvente suele eliminarse por destilación para realizar la concentración. Puede añadirse otro disolvente al residuo obtenido por destilación del disolvente y luego mezclar con agua y una base.
En caso de usar éteres, amidas, ureas o nitrilos como disolvente, la mezcla de reacción resultante, tal cual o después de concentrarla por eliminación del disolvente por destilación, se mezcla con agua y una base seleccionada del grupo constituido por hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino, compuesto de amidina bicíclica, alcóxido de metal alcalino e hidróxido de amonio cuaternario. En caso de usar hidrocarburos halogenados, hidrocarburos aromáticos, ésteres, cetonas o compuestos que contienen azufre como disolvente, un residuo concentrado por eliminación del disolvente por destinación de la mezcla de reacción resultante se diluye con éteres, amidas, ureas o nitrilos y, a continuación, se mezcla con agua y una base seleccionada del grupo constituido por hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino, compuesto de amidina bicíclica, alcóxido de metal alcalino e hidróxido de amonio cuaternario.
Ejemplos del hidróxido de metal alcalino incluyen hidróxido de litio, hidróxido de sodio e hidróxido de potasio.
Ejemplos del carbonato de metal alcalino incluyen carbonato de sodio, carbonato de potasio y carbonato de cesio. Ejemplos del compuesto de amidina bicíclica incluyen diazabicicloundeceno y diazabiciclononeno.
Ejemplos del alcóxido de metal alcalino incluyen metóxido de sodio y ter-butóxido de potasio.
Ejemplos del hidróxido de amonio cuaternario incluyen hidróxido de benciltrimetilamonio, hidróxido de trietilmetilamonio e hidróxido de tributilmetilamonio.
La cantidad de la base que ha de usarse está generalmente entre 0,1 y 10 moles por 1 mol del compuesto (1). La cantidad de agua que ha de usarse está generalmente entre 0,1 y 10 veces en peso del compuesto (1).
El orden de mezcla del compuesto (1), el agua y la base no está limitado, y pueden mezclarse en primer lugar la base y el agua y mezclarlas a continuación con el compuesto (1).
La mezcla suele mantenerse de 0,5 a 150 horas.
Cuando se usa un disolvente que tiene una temperatura de ebullición de 70 °C o más, la mezcla suele mantenerse en el intervalo de 10 °C a 70 °C, y cuando se usa un disolvente que tiene una temperatura de ebullición de menos de 70 °C, la mezcla suele mantenerse en el intervalo de 10 °C a la temperatura de reflujo del disolvente.
Posteriormente, el compuesto (2) puede aislarse por extracción con un disolvente orgánico y concentración.
A continuación se describirá un proceso de obtención de un compuesto (3) haciendo reaccionar el compuesto (2) obtenido con 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita en un disolvente inerte en presencia de un activador de acoplamiento.
Ejemplos del disolvente incluyen hidrocarburos halogenados tales como diclorometano y cloroformo, hidrocarburos aromáticos tales como tolueno y xileno, éteres tales como tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, metil ter-butil éter, ciclopentil metil éter, 1,4-dioxano y éter dietílico, cetonas tales como acetona, 2-butanona y metil-isobutil cetona, ésteres tales como acetato metílico y acetato etílico, amidas tales como dimetilformamida, dimetilacetamida y N-metilpirrolidona, ureas tales como 1,3-dimetil-2-imidazolidinona y N,N'-dimetilpropilenourea, nitrilos tales como acetonitrilo y propionitrilo, y compuestos que contienen azufre tales como dimetilsulfóxido y sulfolano. La cantidad del disolvente que ha de usarse es generalmente de 0,5 a 100 veces en peso del compuesto (2).
Activador de acoplamiento significa un activador de acoplamiento usado para la síntesis de oligonucleótidos mediante un método de fosforamidita y se describe, por ejemplo, en Tetrahedron, 69, 2013, 3615-3637. Ejemplos específicos del activador de acoplamiento incluyen los siguientes (i), (ii) y (iii)
(i) activador de acoplamiento de azol
1H-tetrazol;
activadores de acoplamiento de tetrazol modificados tales como 5-(4-nitrofenil)-1H-tetrazol, 5-(bis-3,5-trifluorometilfenil)-1H-tetrazol, 5-etiltio-1H-tetrazol, 5-benciltio-1H-tetrazol, 5-metiltio-1H-tetrazol y 5-mercapto1H-tetrazol;
activadores de acoplamiento de imidazol tales como 4,5-dicianoimidazol, 2-bromo-4,5-dicianoimidazol, 2-bencil-4,5-dicianoimidazo, y 2-bromo-4,5-dietil-carboxilimidazol;
activadores de acoplamiento de 1-hidroxibenzotriazol tales como 1-hidroxi-benzotriazol, 6-trifluorometil-1 -hidroxi-benzotriazol y 4-nitro-1-hidroxi-benzotriazol;
activador de acoplamiento de 3-nitrotriazol tal como 3-nitrotriazol;
(ii) activador de acoplamiento de complejo salino
activadores de acoplamiento de complejo salino de piridinio tales como clorhidrato de piridina y sal trifluoroacetato de piridina;
activadores de acoplamiento de complejo salino de azolio tales como trifluoroacetato de benzimidazol y trifluoroacetato de N-fenilimidazol;
activador de acoplamiento de complejo salino de sacarina tal como sal sacarina-1-metil imidazol; activadores de acoplamiento de complejo salino de amonio tales como tetrafluoroborato de dialquil(cianometil)amonio y sal diisopropilaminotetrazol;
(iii) otros activadores de acoplamiento usados para la síntesis de ácidos oligonucleicos mediante el método de fosforamidita
activadores de acoplamiento de ácido carboxílico tales como ácido tricloroacético, ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético y ácido 2,4-dinitrobenzoico;
activadores de acoplamiento de ácido de Lewis tales como cloruro de hierro (III), cloruro de aluminio (III), complejo de éter dietílico de trifluoruro de boro, cloruro de circonio (IV) y cloruro de bismuto (III); trimetilclorosilano;
2,4-dinitrofenol.
Para la reacción, por 1 mol del compuesto (2), generalmente se usa 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita en una relación de 1 mol a 10 moles, y el activador de acoplamiento generalmente se usa en una relación de 0,1 mol a 10 moles.
Cuando se usa un disolvente que tiene una temperatura de ebullición de 70 °C o más, la temperatura de reacción suele estar en el intervalo de 10 °C a 70 °C, y cuando se usa un disolvente que tiene una temperatura de ebullición de menos de 70 °C, la temperatura de reacción suele estar en el intervalo de 10 °C a la temperatura de reflujo del disolvente. El tiempo de reacción suele estar entre 0,5 hora y 150 horas.
Después de la finalización de la reacción, se concentra una capa orgánica después de lavar con agua de bicarbonato de sodio saturado o similar, con lo que el compuesto (3) puede aislarse.
El compuesto (3) obtenido puede purificarse mediante cromatografía o similar.
Puede producirse una molécula de ácido nucleico monocatenario usando el compuesto (3) basado en el método de fosforamidita.
El método de producción del compuesto (3) puede ser aplicado a un enantiómero del compuesto (3). Un enantiómero del compuesto (1) como material de partida puede prepararse fácilmente a partir de materias primas disponibles comercialmente de la misma manera que el compuesto (1). El enantiómero del compuesto (3) también es útil, como se describe en el documento US2012/0035246.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se mezclaron 16,94 mmol (8,28 g) del compuesto (1), 20,33 mmol (3,90 g) de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 40,62 mmol (6,22 g) de 1-hidroxibenzotriazol, 61,00 mmol (8,50 ml) de trietilamina, y diclorometano anhidro (160 ml). Se añadieron, además, 20,0 mmol (2,64 g) de ácido 6-hidroxihexanoico a la mezcla resultante a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno, seguido por agitación a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con 800 ml de diclorometano y se lavó tres veces con 1000 ml de salmuera saturada. La capa orgánica resultante se secó sobre sulfato de sodio y, a continuación, se eliminó el disolvente por destilación a presión reducida para obtener 10,40 g de residuo.
Se mezclaron 5,20 g del residuo obtenido, 10,4 ml de tetrahidrofurano y 5,2 ml de agua; se añadieron a los mismos 17,25 mmol (0,72 g) de hidróxido de litio monohidratado, y la mezcla se agitó de 40 °C a 50 °C durante 6 horas. Se dejó que la mezcla resultante enfriase a temperatura ambiente; a continuación, se añadieron 26 ml de tolueno y 52 ml de agua, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La capa orgánica recogida por separación se lavó dos veces con agua de bicarbonato de sodio (una mezcla de 2,76 g de carbonato ácido de sodio y 52 ml de agua), y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se disolvió en 31,2 ml de acetonitrilo, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida para obtener el compuesto (2) (pureza:
93 %, rendimiento: 85 %).
Se mezclaron 7,13 mmol (4,30 g) del compuesto (2) obtenido con acetonitrilo anhidro y se los sometió a deshidratación azeotrópica tres veces a temperatura ambiente. Se añadieron 8,53 mmol (1,46 g) de sal diisopropilaminotetrazol al residuo resultante, se desgasificó a presión reducida, y luego se cargó con gas nitrógeno. Se añadieron 5 ml de acetonitrilo anhidro a la mezcla resultante, y, además, se añadieron 3,5 ml de una solución de acetonitrilo anhidro de 8,56 mmol (2,58 g) de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita. La mezcla se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno durante 2 horas. La mezcla resultante se diluyó con 50 ml de diclorometano, se lavó tres veces con 100 ml de agua de bicarbonato de sodio saturado, y luego se lavó con 100 ml de salmuera saturada. La capa orgánica resultante se secó sobre sulfato de sodio, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo resultante fue sometido a cromatografía en columna usando gel de aminosílice como material de carga (eluyente hexano:acetato etílico=1:3, con un contenido del 0,05 % de piridina), dando el compuesto (3) (rendimiento: 82,4 %).
Ejemplo 2
Se añadieron 2,83 g de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 4,51 g de 1-hidroxibenzotriazol y 4,47 g de trietilamina a una mezcla de 6,00 g del compuesto (1) obtenido mediante el método descrito en el Ejemplo de referencia 4 y 120 ml de cloroformo. Se añadieron 1,95 g de ácido 6-hidroxihexanoico a la mezcla resultante, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con cloroformo y se lavó tres veces con una solución acuosa de cloruro sódico al 5 %. El disolvente de la capa orgánica se eliminó por destilación a presión reducida. Se añadieron al residuo 15 ml de tetrahidrofurano, y, a continuación, se añadió una mezcla de 0,59 g de hidróxido de litio y 7,4 ml de agua. Después de agitar la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 22 horas, se añadió tolueno, y la mezcla se lavó con agua para obtener una capa orgánica. La capa orgánica se lavó tres veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se mezcló con acetonitrilo, y el disolvente se eliminó por destilación de nuevo a presión reducida, obteniendo así 25,80 g del compuesto (2).
Después de añadir 30 ml de acetonitrilo a 20,64 g del compuesto (2) obtenido, se añadieron 2,02 g de sal diisopropilaminotetrazol y 3,55 g de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora en atmósfera de nitrógeno. Después de la finalización de la reacción, la mezcla resultante se diluyó con tolueno y se lavó tres veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %. La capa orgánica resultante se secó sobre sulfato de magnesio, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Una porción del residuo resultante fue sometida a cromatografía en columna usando gel de sílice tratado con trietilamina (eluyente heptano:acetato etílico=50:50), dando el compuesto (3).
Ejemplo 3
Se añadieron 9,42 g de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 15,04 g de 1-hidroxibenzotriazol y 14.91 g de trietilamina a una mezcla de 20,00 g del compuesto (1) y 200 ml de cloroformo. Se añadieron 6,49 g de ácido 6-hidroxihexanoico a la mezcla resultante, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con cloroformo y se lavó tres veces con una solución acuosa de cloruro sódico al 5 %. El disolvente de la capa orgánica se eliminó por destilación a presión reducida para obtener 29.87 g de residuo. Se añadieron 10 ml de acetonitrilo a 4,98 g del residuo, y, a continuación, se añadió una mezcla de 0,55 g de hidróxido de sodio y 5,0 ml de agua. Después de agitar la mezcla resultante a 30 °C durante 18 horas, se añadió tolueno, y la mezcla se lavó con agua para obtener una capa orgánica. La capa orgánica se lavó dos veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %, y, a continuación, el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se mezcló con acetonitrilo, y el disolvente se eliminó por destilación de nuevo a presión reducida, obteniendo así 5,03 g del compuesto (2).
Después de añadir 21 ml de acetonitrilo a 5,03 g del compuesto (2) obtenido, se añadieron 1,40 g de sal diisopropilaminotetrazol y 2,47 g de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con tolueno y se lavó tres veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %. La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Una porción del residuo resultante fue sometida a cromatografía en columna usando gel de sílice tratado con trietilamina (eluyente heptano:acetato etílico:trietilamina=40:60:10), dando el compuesto (3).
Ejemplo 4
Se añadieron 9,42 g de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 15,04 g de 1-hidroxibenzotriazol y 14.91 g de trietilamina a una mezcla de 20,00 g del compuesto (1) y 200 ml de cloroformo. Se añadieron 6,49 g de ácido 6-hidroxihexanoico a la mezcla resultante, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con cloroformo y se lavó tres veces con una solución acuosa de cloruro sódico al 5 %. El disolvente de la capa orgánica se eliminó por destilación a presión reducida para obtener 29.87 g de residuo. Se añadieron 10 ml de tetrahidrofurano a 4,98 g del residuo, y, a continuación, se añadió una mezcla de 2,08 g de diazabicicloundeceno y 1,0 ml de agua. Después de agitar la mezcla resultante a 50 °C durante
1872 horas, se añadió tolueno, y la mezcla se lavó con agua para obtener una capa orgánica. La capa orgánica se lavó dos veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se mezcló con acetonitrilo, y el disolvente se eliminó por destilación de nuevo a presión reducida, obteniendo así 8,78 g del compuesto (2).
Después de añadir 21 ml de acetonitrilo a 5,03 g del compuesto (2) obtenido, se añadieron 1,40 g de sal diisopropilaminotetrazol y 2,47 g de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con tolueno y se lavó tres veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %. La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Una porción del residuo resultante fue sometida a cromatografía en columna usando gel de sílice tratado con trietilamina (eluyente heptano:acetato etílico:trietilamina=40:60:10), dando el compuesto (3).
Ejemplo 5
Se añadieron 9,42 g de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 15,04 g de 1-hidroxibenzotriazol y 14.91 g de trietilamina a una mezcla de 20,00 g del compuesto (1) y 200 ml de cloroformo. Se añadieron 6,49 g de ácido 6-hidroxihexanoico a la mezcla resultante, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con cloroformo y se lavó tres veces con una solución acuosa de cloruro sódico al 5 %. El disolvente de la capa orgánica se eliminó por destilación a presión reducida para obtener 29,87 g de residuo. Se añadieron 10 ml de tetrahidrofurano a 4,98 g del residuo, y, a continuación, se añadió una mezcla de 1,53 g de ter-butóxido de potasio y 5,0 ml de agua. Después de agitar la mezcla resultante a 30 °C durante 22 horas, se añadió tolueno, y la mezcla se lavó con agua para obtener una capa orgánica. La capa orgánica se lavó dos veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se mezcló con acetonitrilo, y el disolvente se eliminó por destilación de nuevo a presión reducida, obteniendo así 4,78 g del compuesto (2).
Después de añadir 21 ml de acetonitrilo a 4,78 g del compuesto (2) obtenido, se añadieron 1,40 g de sal diisopropilaminotetrazol y 2,47 g de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas en atmósfera de nitrógeno. Después de la finalización de la reacción, la mezcla resultante se diluyó con tolueno y se lavó tres veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %. La capa orgánica resultante se secó sobre sulfato de magnesio, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Una porción del residuo resultante fue sometida a cromatografía en columna usando gel de sílice tratado con trietilamina (eluyente heptano:acetato etílico:trietilamina=40:60:10), dando el compuesto (3).
Ejemplo 6
Se añadieron 9,42 g de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 15,04 g de 1-hidroxibenzotriazol y 14.91 g de trietilamina a una mezcla de 20,00 g del compuesto (1) y 200 ml de cloroformo. Se añadieron 6,49 g de ácido 6-hidroxihexanoico a la mezcla resultante, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con cloroformo y se lavó tres veces con una solución acuosa de cloruro sódico al 5 %. El disolvente de la capa orgánica resultante se eliminó por destilación a presión reducida para obtener 29,87 g de residuo. Se añadieron 10 ml de tetrahidrofurano a 4,98 g del residuo, y, a continuación, se añadió una mezcla de 5,70 g de una solución acuosa de hidróxido de benciltrimetilamonio (40 % en peso) y 1,6 ml de agua. Después de agitar la mezcla resultante a 30 °C durante 6 horas, se añadió tolueno, y la mezcla se lavó con agua para obtener una capa orgánica. La capa orgánica se lavó dos veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. El residuo se mezcló con acetonitrilo, y el disolvente se eliminó por destilación de nuevo a presión reducida, obteniendo así 10,21 g del compuesto (2).
Después de añadir 21 ml de acetonitrilo a 10,21 g del compuesto (2) obtenido, se añadieron 1,40 g de sal diisopropilaminotetrazol y 2,47 g de 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se diluyó con tolueno y se lavó tres veces con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %. La capa orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, y el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Una porción del residuo resultante fue sometida a cromatografía en columna usando gel de sílice tratado con trietilamina (eluyente heptano:acetato etílico:trietilamina=40:60:10), dando el compuesto (3).
Ejemplo de referencia 1
Usando el compuesto (3) producido en el Ejemplo 1, se produjo una molécula de ácido nucleico monocatenario (una molécula de ácido nucleico representada por la fórmula (A):
(en donde C significa sal sódica de monofosfato de citidina, A significa sal sódica de monofosfato de adenosina, U significa sal sódica de monofosfato de uridina y G significa sal sódica de monofosfato de guanosina); en lo sucesivo denominada compuesto (A)) descrito en el Ejemplo (B1) del documento US2012/0035246.
La síntesis se llevó a cabo desde el lado 3' hacia el lado 5' usando NTS M-4MX-E (fabricado por Nihon Techno Service Co., Ltd.) como sintetizador de ácido nucleico. Para la síntesis, se usaron la amidita EMM de uridina descrita en el Ejemplo 2 del documento US2012/0035246, la amidita EMM de citidina descrita en el Ejemplo 3, la amidita EMM de adenosina descrita en el Ejemplo 4 y la amidita EMM de guanosina descrita en el Ejemplo 5, se usó vidrio poroso como portador de la fase sólida, se usó una solución de ácido tricloroacético-tolueno de gran pureza como solución de desbloqueo, se usó 5-bencilmercapto-1H-tetrazol como agente de condensación, se usó una solución de yodo como agente oxidante y se usaron una solución de ácido fenoxiacético y una solución de N-metilimidazol como solución protectora.
Como resultado de la síntesis del compuesto (A) dos veces, la DO26o promedio de dos veces fue DO 27,7, y la pureza promedio de dos veces fue del 94,0 %. DO260 representa una absorbancia a UV 260 nm por 10 mm de longitud de recorrido óptico en una solución de 1 ml (pH=7,5). Generalmente, es sabido que 1 DO=40 pg en ARN, por lo que un rendimiento promedio en dos tandas es 1108 pg.
Ejemplo de referencia 2
El compuesto (3) se produjo según las descripciones de (3) y (4) del Ejemplo (A3) del documento US2012/0035246 (rendimiento: 85,5 %). El compuesto (A) se obtuvo a partir del compuesto (3) obtenido, según la descripción del Ejemplo de referencia 1.
Como resultado de la síntesis del compuesto (A) dos veces, la DO260 promedio de dos veces fue DO 17,8, y la pureza promedio de dos veces fue del 93,0 %. Generalmente, es sabido que 1 DO=40 pg en ARN, por lo que un rendimiento promedio en dos tandas es 712 pg.
Como puede verse por los resultados del Ejemplo de referencia 1 y del Ejemplo de referencia 2, usando el compuesto (3) obtenido por el método de producción de la presente invención, en comparación con el caso de uso del compuesto (3) obtenido por el método de producción convencional, el compuesto (A) se obtiene con alto rendimiento.
Ejemplo de referencia 3
Usando el compuesto (3) descrito en el Ejemplo de referencia 2 y el compuesto (3) producido en los Ejemplos 3 a 6, el compuesto (A) se obtuvo según la descripción del Ejemplo de referencia 1. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 1. Como puede verse por los resultados del Ejemplo de referencia 3, usando el compuesto (3) obtenido por el método de producción de la presente invención, en comparación con el caso de uso del compuesto (3) obtenido por el método de producción convencional, el compuesto (A) se obtiene con alto rendimiento.
[Tabla 1]
Ejemplo de referencia 4
Se mezclaron 30,00 g de N-[(9H-fluoren-9-ilmetoxi)carbonil]-L-prolina y 420 ml de acetonitrilo en una vasija de reacción purgada con nitrógeno y se añadieron 32,68 g de 1-hidroxibenzotriazol. Se añadieron 9,51 g de 4-amino-1-butanol a la mezcla resultante; se añadieron gota a gota 210 ml de una solución de acetonitrilo de 22,02 g de diciclohexilcarbodiimida a temperatura ambiente, y, a continuación, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la finalización de la reacción, el precipitado formado fue retirado por filtración, y el disolvente del filtrado resultante fue eliminado por destilación a presión reducida. Se añadió tolueno al residuo y se lavó con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 10 %. Eliminando por destilación a presión reducida el disolvente de la capa orgánica resultante, se obtuvo un compuesto representado por la fórmula (a):
(en donde Fmoc representa un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo).
Se añadieron 90 ml de tolueno a la cantidad total del compuesto obtenido representado por la fórmula (a), y se llevó a cabo una operación de deshidratación azeotrópica. Se mezclaron 71,72 g de una solución de tolueno, 91 mg de N,N-dimetil-4-aminopiridina y 50 ml de piridina del compuesto obtenido representado por la fórmula (a); se añadieron 32,64 g de cloruro 4, 4'-dimetoxitritílico de 0 a 5 °C, y, a continuación, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos en atmósfera de nitrógeno. Después de la finalización de la reacción, se añadió metanol, y la mezcla se agitó durante 20 minutos. La mezcla resultante se diluyó con tolueno y se lavó con una solución acuosa de carbonato ácido de sodio al 5 %. Eliminando por destilación a presión reducida el disolvente de la capa orgánica
(en donde Fmoc representa un grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo).
Después de añadir 50 ml de tolueno al compuesto obtenido representado por la fórmula (b), se añadieron gota a gota 59,89 g de piperidina de 0 a 5 °C, y, a continuación, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos en atmósfera de nitrógeno. Después de la finalización de la reacción, el disolvente se eliminó por destilación a presión reducida. Se añadió tolueno al residuo, y se llevó a cabo una operación de deshidratación azeotrópica. El residuo resultante fue sometido a cromatografía en columna en gel de sílice (eluyente acetato etílico:metanol=80:20), dando el compuesto (1).
Aplicabilidad industrial
Según el método de la presente invención, es posible producir el compuesto (3) o un enantiómero del mismo capaz de producir una molécula de ácido nucleico monocatenario capaz de suprimir la expresión de un gen diana con alto rendimiento.
Claims (5)
- REIVINDICACIONES
hacer reaccionar un compuesto representado por la fórmula (1):
o un enantiómero del mismo con ácido 6-hidroxihexanoico en un disolvente en presencia de un aditivo seleccionado del grupo constituido por 1-hidroxibenzotriazol, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, (hidroxiimino)cianoacetato etílico, carbonato N,N'-disuccinimidílico, N-hidroxiftalimida, N-hidroxipiperidina, 3-hidroxi-4-oxo-3,4-dihidro-1,2,3-benzotriazina e imida de ácido N-hidroxi-5-norborneno-2,3-dicarboxílico, y un agente de condensación y, a continuación, mezclar la mezcla de reacción resultante, agua y una base seleccionada del grupo constituido por hidróxido de metal alcalino, carbonato de metal alcalino, un compuesto de amidina bicíclica, alcóxido de metal alcalino e hidróxido de amonio cuaternario para producir un compuesto
hacer reaccionar el compuesto representado por la fórmula (2), obtenido en la etapa de producción, o un enantiómero del mismo, con 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita en un disolvente en presencia de un activador de acoplamiento para obtener el compuesto representado por la fórmula (3) o un enantiómero del mismo, en donde el activador de acoplamiento es un activador de acoplamiento usado para la síntesis de oligonucleótidos mediante un método de fosforoamidato. - 2. El método de producción según la reivindicación 1 en donde la base es un hidróxido de metal alcalino.
- 3. El método de producción según las reivindicaciones 1 o 2 en donde el agente de condensación es clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, N,N'-diciclohexilcarbodiimida, N,N'-diisopropilcarbodiimida, 1,1-carbonildiimidazol, trímero cíclico de anhídrido 1-propilfosfónico o 2-cloro-4,6-dimetoxi-1,3,5-triazina.
- 4. El método de producción según las reivindicaciones 1 o 2 en donde el aditivo es 1-hidroxibenzotriazol, 1 -hidroxi-7 azabenzotriazol, N-hidroxisuccinimida, (hidroxiimino)cianoacetato etílico o carbonato N,N'-disuccinimidílico.
- 5. El método de producción según las reivindicaciones 1 o 2 en donde el activador de acoplamiento es sal diisopropilaminotetrazol, 1H-tetrazol, 5-(etiltio)-1H-tetrazol, 5-(benciltio)-1H-tetrazol o 4,5-dicianoimidazol.
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