ES2856844T3 - Inmunoterapia antitumoral combinada - Google Patents

Abstract

Un agonista de TLR9 que es un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, para su uso en un método de tratamiento de un tumor canceroso en un sujeto, en el que el ADN de CpG de clase A se administra en el tumor o junto al mismo; y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra por vía sistémica.

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoterapia antitumoral combinada

Antecedentes de la invención

Muchos científicos han buscado tratar el cáncer activando el sistema inmunológico contra el tumor. Sin embargo, a pesar de los éxitos ocasionales, las respuestas duraderas a la inmunoterapia han sido raras y limitadas a unos pocos tipos de tumores. La comprensión actual de la inmunoterapia del cáncer entre los expertos en la técnica se ha resumido en artículos de revisión recientes, que incluyen, por ejemplo, Chen y Mellman, Immunity 2013 39 (1): 1-10. El ciclo de inducción de respuestas inmunitarias terapéuticas contra tumores se puede dividir en siete pasos distintos (Figura 1):

1. Liberación de antígenos de células cancerosas;

2. Presentación de antígenos de células cancerosas por células presentadoras de antígeno (APC, generalmente en los ganglios linfáticos de drenaje);

3. Cebado y activación de células T;

4. Tráfico de células T CD8+ a tumores;

5. Infiltración de células T CD8+ en tumores;

6. Reconocimiento de células cancerosas por las células T CD8+ que se infiltran; y

7. Matanza de células cancerosas.

La técnica enseña que existen múltiples mediadores negativos y positivos de cada paso de la respuesta antitumoral. El interés de la investigación reciente se ha centrado en comprender y abordar el papel que desempeñan los mediadores negativos en la inhibición de la respuesta inmunitaria antitumoral. Por ejemplo, la interleucina-10 (IL-10) es un factor que puede tener efectos complicados, localmente inmunosupresor en el tumor, pero sistémicamente en realidad puede tener actividad antitumoral (revisado en Vicari y Trinchieri, Immunol. Rev., 2004). Aunque los agonistas del receptor tipo Toll (TLR) como los oligonucleótidos CpG activadores de TLR9 (CpG ODN) tienen efectos inmunoestimuladores que pueden promover respuestas antitumorales, también son conocidos en la técnica por inducir factores inmunosupresores como IL-10 (revisado en Lu, Frontiers Immunol, 2014). La combinación de CpG 1668 de clase B, administrada en el tumor o adyacente al mismo, con anticuerpos que se unen a CTLA-4, PD-1 o ambos, administrada sistémicamente, mejoró la supervivencia a largo plazo en un cáncer de vejiga experimental murino y condujo a un aumento de los niveles de células T reactivas a tumores y números reducidos de Tregs en el sitio del tumor (Mangbo et al., Journal of Immunotherapy, 2010). La técnica no enseña diseños de agonistas de TLR9 que tengan efectos antitumorales mejorados como resultado de inducir cantidades inferiores de producción de IL-10. Sin embargo, esta creciente comprensión reciente del ciclo de la inmunidad tumoral ha aumentado la conciencia de que puede ser posible aumentar la eficacia clínica de la inmunoterapia contra el cáncer mediante el uso de combinaciones de agentes que actúan en diferentes puntos de este ciclo para la inducción de respuestas inmunitarias terapéuticas contra los tumores pero la técnica no proporciona un conocimiento suficientemente profundo de la inmunobiología del cáncer para predecir cuál de las muchas combinaciones posibles diferentes será la preferida.

Otra forma posible de considerar el desarrollo de la respuesta de células T contra el cáncer es el modelo de 3 señales para la inducción de una respuesta de células T, resumido por Kim y Cantor, Cancer Immunol Res 20142: 929-936) y se presenta en la Figura 2. En este modelo, la señal 1 a la célula T proviene de la presentación de antígeno por una APC en el MHC apropiado al receptor de la célula T. La señal 2 es el requisito de una señal coestimuladora a través de la interacción de CD28 en la célula T por B7-1 o B7-2 en la APC (esta señal es antagonizada por CTLA-4 presente en Treg: la eficacia de anticuerpos anti-CTLA-4 en la inmunoterapia del cáncer resulta de su inhibición de esta señal “apagada”). Finalmente, la señal 3 es la modulación de la función de las células T resultante de señales a través de los receptores de citocinas inflamatorias y PD-1. En particular para la inducción de respuestas de células T CD8+ optimas, que se sabe que son críticas para el éxito de la inmunoterapia contra el cáncer, la señalización de IFN tipo I es una señal muy positiva, pero cuando es crónica o prolongada también puede conducir paradójicamente al agotamiento y la falta de respuesta de las células T, lo cual está mediado por la regulación positiva de PD-1. El bloqueo de PD-1 por anticuerpos contra él, o contra su principal ligando que regula la inmunidad antitumoral, PD-L1, restaura por lo tanto la capacidad de la célula T para proliferar y producir citocinas en el microambiente tumoral.

Recientemente ha habido varios éxitos clínicos tempranos con el uso de compuestos “inhibidores del punto de control” (CPI), tal como los anticuerpos, que bloquean los efectos inmunitarios negativos de las moléculas del punto de control como CTLA-4, PD-1 y su ligando, PD-L1. La administración sistémica de anticuerpos anti-CTLA-4 ha dado lugar a respuestas duraderas en ~ 10 % de los pacientes con melanoma y algunos resultados tempranos alentadores en otros tipos de tumores, pero a costa de una alta tasa de efectos adversos, incluida la muerte en algunos pacientes. Los ensayos clínicos en humanos anti-PD-1/PD-L1 también han reportado resultados alentadores, aparentemente con una tasa más baja de toxicidad severa. Sin embargo, los análisis de los pacientes que respondieron han revelado que, en múltiples tipos diferentes de cáncer, las respuestas a la terapia anti-PD-Ll están relativamente restringidas a pacientes con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y un patrón Th1 de expresión génica en el tumor (Powles et al., Nature 2014515: 558; Herbst et al., Nature 2014515: 563; Tumeh et al., Nature 2014515: 568). Es decir, se pueden observar respuestas en algunos pacientes con inmunidad preexistente al tumor, pero es muy poco probable que ocurran en pacientes sin esta. Aparte del melanoma, en el que la inmunidad antitumoral preexistente es relativamente común, los TIL son relativamente poco comunes en la mayoría de los otros tipos de tumores, lo que indica que el CPI puede tener un beneficio limitado en la mayoría de los tipos de cáncer. Por lo tanto, existe la necesidad de mejorar la eficacia de CPI para la terapia del cáncer.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos para promover la activación inmunitaria y reducir la inhibición inmunitaria, por lo tanto, metafóricamente tanto “pisar el acelerador” como “soltar los frenos” del sistema inmunológico, para tratar el cáncer. La invención puede usarse, por ejemplo, para convertir cánceres o tumores “fríos” (resistentes al tratamiento o recurrentes) en cánceres “calientes” susceptibles de tratamiento, incluido el tratamiento con inhibición de puntos de control.

Esta invención proporciona subtipos específicos de CpG ODN con cantidades reducidas de modificaciones de fosforotioato en comparación con el CpG ODN más ampliamente utilizado en la inmunoterapia contra el cáncer en el pasado, como se establece en las reivindicaciones, para la inmunoterapia mejorada del cáncer, incluidos los cánceres que serían poco probables que respondan a cualquiera de estas terapias solas o en otras combinaciones.

Los CpG ODN se unen y estimulan TLR9, un receptor inmunitario innato que se expresa constitutivamente en sólo dos tipos de células inmunitarias humanas: células B, que responden a la estimulación de TLR9 proliferando y secretando inmunoglobulina; y células dendríticas plasmocitoides (pDC), que responden a la estimulación de TLR9 secretando grandes cantidades de IFN de tipo I (IFN-a e IFN-p). La presente invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que la respuesta de IFN-a a CpG ODN es importante para la inmunoterapia tumoral. La presente invención se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que una fuerte respuesta de IFN-a a CpG-ODN es importante para la inmunoterapia tumoral, incluida la inmunoterapia tumoral usando la administración intratumoral de CpG ODN.

El ADN CpG de clase A, tal como se usa en la invención, se caracteriza, al menos en parte, por su propensión a inducir altas cantidades de IFN de tipo I.

Se cree que el IFN de tipo I juega un papel clave en el rechazo de tumores. Por ejemplo, el IFN de tipo I aumenta la supervivencia, la expansión y la diferenciación del efector de las células T CD8+; promueve la maduración de las células dendríticas (DC), la presentación cruzada de antígenos asociados a tumores a las células T CD8 ; se requiere para la vigilancia inmunológica contra tumores inducidos por carcinógenos; y es necesario para el rechazo de tumores implantados. Además, los niveles de ARNm relacionado con IFN de tipo I se correlacionan con los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en metástasis humanas.

Además de inducir niveles más altos de IFN de tipo I que cualquier otra cosa, los ligandos TLR9 que son ADN CpG de clase A también activan pDC e inducen la secreción de cientos de otros genes y factores promotores de Th1; y convierten pDC de un fenotipo inmaduro/promotor de tolerancia en un fenotipo inductor de células T citotóxicos (CTL) activados y maduros.

La presente invención también se basa, al menos en parte, en el hallazgo de que la administración del ADN CpG de clase A en tumores (directa o indirectamente) induce la expresión de moléculas de adhesión en la vasculatura local dentro y alrededor del tumor, y promueve la salida de células T activadas (CD4+ y CD8+) de los capilares al tumor y la región circundante. Algunas de estas células T serán específicas de los antígenos asociados a tumores (TAA) mutados y no mutados. En ausencia de inhibidores de puntos de control y/o XRT, estas células T pueden ser inhibidas por el tumor, pero en combinación, esto crea un efecto antitumoral mucho más poderoso que el que se puede lograr con CpG o los inhibidores de puntos de control o XRT por sí solos.

La presente invención en ciertos aspectos se basa en el uso de clases de CpG ODN distintas de las que se han utilizado históricamente para la inmunoterapia del cáncer. En particular, la presente invención en ciertos aspectos se basa en el uso de clases de alta secreción de IFN-a, la clase A, con cantidades reducidas de modificaciones de fosforotioato (PS) en comparación con los CpG ODN de clase B que se han utilizado ampliamente en el pasado. Los CpG ODN de clase B suelen estar completamente modificados con fosforotioato para aumentar su resistencia a las nucleasas y la magnitud de la activación de las células B. Por el contrario, dado que el objetivo de la presente invención es lograr una respuesta de IFN de tipo I alta, en lugar de la activación de las células B, el ADN CpG de clase A de la presente invención no tiene modificaciones de fosforotioato o solo 1 o 2 modificaciones de fosforotioato en el extremo 5' y de 1 a 4 modificaciones de fosforotioato en el extremo 3'.

Los expertos en la técnica entienden que la CpG intra o peritumoral en pacientes humanos con cáncer activará la APC en los ganglios linfáticos que drenan el tumor, mejorando la etapa 2 del ciclo de inmunidad del cáncer (ver Figura 3). Sin embargo, lo que no entienden bien los expertos en la técnica es que esta vía de administración de ADN CpG de clase A también inducirá TIL y convertirá el microambiente tumoral en un estado más similar a Th1 que es más propicio para la inducción de inmunidad antitumoral clínicamente benéfica. La administración intratumoral de ADN CpG de clase A induce la infiltración de células T en los tumores, incluyendo notablemente la infiltración de células T CD8+. La importancia de esto es que se cree que esta infiltración de células T CD8+ en tumores es el mejor predictor de respuesta al tratamiento con anti-PD-1 o anti-PD-Ll. Debido a que los ensayos clínicos en humanos realizados en el pasado con la administración intratumoral de oligonucleótidos CpG utilizaron ODN de clase B, habría habido una producción local significativa de IL-10 en el tumor que habría inhibido la respuesta inmunitaria antitumoral. La presente invención presenta ADN CpG de clase A, que induce menores cantidades de producción de IL-10 y mayores cantidades de secreción de IFN de tipo I en comparación con los ODN de clase B utilizados en el pasado. Tal ADN CpG de clase A proporcionará una sinergia mejorada en la terapia del cáncer cuando se combina con inhibidores de puntos de control usando los métodos de la invención.

Un aspecto de la invención es un agonista de TLR9 que es un ADN CpG de clase A y un inhibidor de punto de control (CPI) que es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso en un método de tratar un tumor canceroso en un sujeto, en el que el a Dn CpG de clase A se administra en el tumor o junto al mismo y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra sistémicamente.

En ciertas realizaciones, la secuencia del ADN CpG de clase A es GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 82).

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un linfoma o un tumor canceroso de un órgano o tejido seleccionado del grupo que consiste en piel, cabeza y cuello, esófago, estómago, hígado, colon, recto, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, ovario, riñón, vejiga, próstata, tiroides, cerebro, músculos y huesos.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es melanoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es linfoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un cáncer de médula ósea.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un tumor carcinoide.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es neuroblastoma.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 (técnica anterior) es una representación esquemática del ciclo de inmunidad contra el cáncer, que muestra siete pasos. De Chen y Mellman, Immunity 2013.

La Figura 2 es una representación esquemática de las tres señales necesarias para la inducción de inmunidad antitumoral. Cada célula T expresa un TCR único que reconoce un antígeno específico en el contexto de un MHC específico (señal 1). Los correceptores CD4 y CD8 aumentan la sensibilidad del reconocimiento de antígenos por TCR. La expansión óptima de las células T y la adquisición de la función efectora requieren señales transducidas por receptores coestimuladores (señal 2). La interacción CD28-BB7-1/B7-2 emite una señal de activación, mientras que la interacción CTLA-4-B71/B7-2 inhibe la activación de las células T. La señalización a través de CD28 y CTLA-4 también es fundamental para el desarrollo y la función de Treg CD4 determinadas realizaciones. Las señales inflamatorias a menudo inducen una regulación positiva de los receptores de citocinas de superficie y otros receptores, incluido el PD-1 (señal 3). La expresión de PD-1 se asocia con la adquisición de un fenotipo agotado en las células T durante la infección y el cáncer. La interacción PD-1-PD-L1 está implicada en la inhibición de la actividad de Tfr y también se ha implicado en la generación de pTreg. Los datos preclínicos y clínicos con bloqueo de puntos de control utilizando Abs anti-CTLA-4, anti-PD-1 y anti-PD-L1 Abs sugieren que se puede lograr una mayor inmunidad antitumoral mediante los efectos combinados de la actividad mejorada de Teff y el agotamiento o la supresión reducida por Treg CD4. De Kim y Cantor, Cancer Immunol. Res. 20142: 926-936. La Figura 3 es una representación esquemática del ciclo de inmunidad contra el cáncer, que describe las funciones de CpG ODN, CPI y XRT. Adaptado de Chen y Mellman, Immunity 2013.

La Figura 4 es un gráfico que representa la inducción de IFN-a para los oligonucleótidos CpG-A del Grupo 1. PBS, control de solución salina tamponada con fosfato.

La Figura 5 es un gráfico que representa la inducción de IFN-a para oligonucleótidos CpG-A del Grupo 1 seleccionados. PBS, control de solución salina tamponada con fosfato.

La Figura 6 es un gráfico que representa la inducción de IFN-a para los oligonucleótidos CpG-A del Grupo 2. Eje Y, pg/ml IFN-a. PBS, control de solución salina tamponada con fosfato; TE, Tris-EDTA.

La Figura 7 es un gráfico que representa la inducción de interleucina-10 (IL-10) para los oligonucleótidos CpG-A del Grupo 2. Eje Y, pg/ml IL-10. PBS, control de solución salina tamponada con fosfato; TE, Tris-EDTA.

La Figura 8 es un gráfico que representa el efecto de la modificación de la estructura principal de fosforoditioato sobre la inducción de IFN-a por los oligonucleótidos CpG-A del Grupo 3.

La Figura 9 es un gráfico que representa la relación estructura-actividad de la reducción del número de 5' y/o 3' G en el oligonucleótido G10 de CpG-A o el cambio del palíndromo en la inducción de la secreción de IFN-a a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) normales. nAb, nuevo anticuerpo anti-Qb; oAb, antiguo anticuerpo anti-Qb; PBS, control de solución salina tamponada con fosfato.

La Figura 10 es un gráfico que representa la relación estructura-actividad de la reducción del número de 5' y/o 3' G en el oligonucleótido G10 de CpG-A o el cambio del palíndromo en la inducción de la secreción de IP-10 de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) normales. nAb, nuevo anticuerpo anti-Qb; oAb, antiguo anticuerpo anti-Qb; PBS, control de solución salina tamponada con fosfato.

La Figura 11 es un gráfico que muestra la relación estructura-actividad de la reducción del número de 5' y/o 3' G en el oligonucleótido G10 de CpG-A o el cambio del palíndromo en la inducción de la secreción de IL-10 de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) normales. nAb, nuevo anticuerpo anti-Qb; oAb, antiguo anticuerpo anti-Qb; PBS, control de solución salina tamponada con fosfato.

La Figura 12 es un par de gráficos que representan los volúmenes tumorales en ratones portadores de linfoma A20. Todos los ratones se cebaron con una dosis baja (20 |jg) de cmP-001 para inducir anticuerpos anti-Qb de modo que las partículas similares a virus (VLP) se opsonizarán y activarán las DC una vez iniciado el tratamiento. Se inocularon células de linfoma en ambos flancos de los ratones el día 0. A partir del día 7, los tumores de un lado (tratados) de los ratones se inyectaron directamente con CpG (CMP-001) o solución salina, mientras que los tumores del otro lado (sin tratar) no lo fueron. Luego, los ratones también recibieron anti-PD-1 intraperitoneal o solución salina dos veces por semana, como se indica. El gráfico en el Panel A representa los volúmenes tumorales promedio para tumores “no tratados” (distantes). El gráfico del Panel B representa los volúmenes tumorales medios para los tumores “tratados”. N = 10 para cada grupo.

La Figura 13 es un gráfico que muestra las curvas de supervivencia de los ratones en el experimento de la Figura 12.

Descripción detallada de la invención

Se sabe que los ligandos del receptor de tipo Toll (TLR) en general son inductores potenciales de la presentación de antígenos de células cancerosas por APC. Sin embargo, no se sabe previamente qué ligandos de TLR particulares se prefieren, e incluso en el caso de los ligandos de TLR9, no se sabe previamente qué clase de CpG ODN, si es que alguna, se prefiere, ni cuáles son sus dosis y vías de administración preferidas previamente conocido. Casi todos los ensayos clínicos en humanos de CpG ODN en oncología han utilizado ODN de clase B administrados por vía sistémica, mientras que algunos ensayos han explorado la administración intratumoral (que se analiza más adelante).

La invención de oligodesoxinucleótidos CpG (ODN) inmunoestimuladores y las invenciones posteriores de diversas clases y diseños de CpG ODN proporcionaron nuevas oportunidades para la inmunoterapia del cáncer. Sobre la base de datos preclínicos alentadores en modelos de roedores, se han realizado ensayos clínicos humanos de CpG ODN en pacientes oncológicos utilizando la administración sistémica e intratumoral de varios CpG ODN diferentes solos o en combinación con varios regímenes de quimioterapia, vacunas, anticuerpos y radioterapia, pero nuevamente, las respuestas clínicas han sido poco frecuentes y, a pesar de algunos resultados iniciales alentadores de los ensayos clínicos, los ensayos de fase 3 han fracasado hasta ahora (revisado en Krieg, Nucleic Acid Ther. 2012 22 (2): 77-89). Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar enfoques terapéuticos de oligonucleótidos mejorados para aumentar la tasa de éxito de la inmunoterapia contra el cáncer.

Las vacunas tumorales en las que se vacuna a un paciente con cáncer con un antígeno propio no mutado conservado junto con un adyuvante han sido un objetivo de los inmunooncólogos durante muchos años, sin embargo, a pesar de inducir con éxito la inmunidad contra el antígeno seleccionado, han fracasado casi de manera uniforme para suministrar claros beneficios clínicos. Los CpG ODN de clase B han mejorado la inducción de respuestas de células T CD8+ antitumorales en múltiples ensayos clínicos de vacunas contra el cáncer (por ejemplo, Kruit et al., J Clin Oncol 2013; Tarhini et al., J Immunother 2013; Lovgren et al., Cancer Immunol Immunother 2012; Karbach et al., Clin Cancer Res 2011; Karbach et al., Int J Cancer 2010; Speiser et al., JCI 2005, y en un solo ensayo se obtuvo un CpG ODN de clase A sin modificar utilizado como adyuvante de vacuna (Speiser et al., J. Immunother 2010), sin embargo, estos rara vez se han asociado con respuestas clínicas, y un ensayo clínico de fase 3 de este enfoque realizado por GSK (GlaxoSmithKline) utilizando el antígeno tumoral MAGE-3 hasta ahora parece haber sido un fracaso. En particular, cabe señalar que el ensayo clínico de la vacuna que utilizó un CpG ODN de clase A mostró una inducción relativamente débil de una respuesta de CTL que aumentó aproximadamente el doble del valor inicial en solo aproximadamente la mitad de los pacientes, en comparación con un promedio aproximado de respuesta CTL 10 veces mayor en esos m pacientes con melanoma previamente vacunados con CpG ODN de clase B, lo que indica el estado de la técnica. Es posible que el sistema inmunológico no supere fácilmente la autotolerancia a los autoantígenos no mutados hasta un grado suficiente para rechazar un tumor, lo que lleva a muchos expertos en la técnica a buscar formas de inducir la inmunidad tumoral contra antígenos tumorales alternativos mutados. Estudios recientes que utilizan la secuenciación profunda de transcriptomas tumorales han revelado que todos los cánceres contienen un número variable de antígenos mutados únicos, denominados neoantígenos específicos de tumores (Rajasagi et al., Blood 2014 124 (3): 453-462), y los expertos en la técnica han buscado formas de dirigir la respuesta inmunitaria antitumoral contra tales antígenos. Un enfoque que se está siguiendo es sintetizar algunos o todos estos neoantígenos como péptidos y vacunar a un paciente con cáncer con los péptidos antigénicos apropiados para presentarlos en el MHC de clase II en una formulación como una partícula de tipo viral y usando un adyuvante muy fuerte, como un ODN de clase B CpG. Este enfoque sería extremadamente complejo y costoso de desarrollar. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados para inducir respuestas inmunitarias antitumorales contra neoantígenos específicos de tumores.

La presente invención proporciona un enfoque superior al convertir el tumor en sí mismo en una vacuna, debido a la alteración del microambiente del tumor de tal manera que desactive los “frenos” de los inhibidores del punto de control, mientras se induce una fuerte inmunidad mediada por células, utilizando Agonistas de TLR9.

La radioterapia se ha utilizado durante mucho tiempo en el tratamiento del cáncer y actualmente se emplea en el tratamiento de aproximadamente el 60 % de los pacientes con tumores sólidos (revisado en Prasanna et al., J Thoracic Dis.20146 (4): 287 -302). Aunque la radioterapia a menudo puede reducir el tamaño de los tumores, este efecto suele ser paliativo y las respuestas duraderas son extremadamente infrecuentes. Además, la radioterapia generalmente solo es adecuada para tratar una o una pequeña cantidad de lesiones tumorales y, por lo tanto, generalmente no se usa en el tratamiento del cáncer metastásico.

En algunos casos inusuales, la XRT puede conducir a la regresión de masas tumorales distantes como resultado de la inducción de una respuesta inmunitaria específica contra antígenos tumorales presentes no solo en la lesión irradiada, sino también en metástasis distantes. Esto se ha denominado un “efecto abscopal”, y en particular desde un reporte de caso reciente de Postow et al. (N. Engl. J. Med. 2012 366 (10): 925-31), este término ha llegado a utilizarse para incluir otras formas de terapia tumoral localizada además de solo la radioterapia.

Se pueden observar efectos abscopales cuando se administra XRT antes o después de la terapia anti-CTLA-4: por ejemplo, más de la mitad de los 21 pacientes con melanoma tratados con XRT después de la terapia anti-CTLA-4 mostró evidencia de regresiones tumorales distales (Grimaldi et al., Oncoimmunol. 20143: e28780).

I. Definiciones

A menos que se defina lo contrario en el documento actual, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente tendrán los significados que entienden comúnmente los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán plurales y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en este documento son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica.

Los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica y como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Tales referencias incluyen, por ejemplo, Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002) y Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como se logran correctamente en la técnica o como se describe en el documento actual. Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio, química analítica, química orgánica sintética y química farmacéutica y médica descritas en el presente documento son las bien conocidas y utilizadas comúnmente en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica, y tratamiento de pacientes.

Como se usa en este documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con él en esta sección.

Los artículos “un” y “una” se utilizan en este documento para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Como se usa en este documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Véase Immunology - A Synthesis (2a edición, E. S. Golub y D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)).

La notación convencional se usa en este documento para representar secuencias de polipéptidos: el extremo izquierdo de una secuencia de polipéptidos es el extremo amino; el extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo carboxilo.

Una “sustitución de aminoácidos conservadora” es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye por otro residuo de aminoácido que tiene un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución conservadora de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o el grado de similitud se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307 - 31 (1994).

Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen 1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifático: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservadores preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.

Alternativamente, un reemplazo conservador es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250 divulgada en Gonnet et al., Science 256: 1443-45 (1992). Un reemplazo “moderadamente conservador” es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica de PAM250.

Las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteínas y (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos que comprenden sustituciones, deleciones y/o inserciones pueden incluir diversas muteínas de una secuencia distinta de la secuencia peptídica de origen natural. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de uno o múltiples aminoácidos (preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservadoras) en la secuencia de origen natural (preferiblemente en la porción del polipéptido fuera del(los) dominio(s) que forman contactos intermoleculares). Una sustitución conservadora de aminoácidos no debería cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia original (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que se produce en la secuencia original ni a interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia original). Ejemplos de estructuras polipeptídicas secundarias y terciarias reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al., Nature 354: 105 (1991).

La similitud de secuencia para polipéptidos, y de manera similar la identidad de secuencia para polipéptidos, se mide típicamente usando software de análisis de secuencia. El software de análisis de proteínas hace coincidir secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas las sustituciones conservadoras de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas como “Gap” y “Bestfit” que se pueden utilizar con parámetros predeterminados para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo salvaje y una muteína del mismo. Ver, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también se pueden comparar usando FASTA usando parámetros predeterminados o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de búsqueda y consulta (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de organismos diferentes es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros predeterminados. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res.

25: 3389 -402 (1997).

Un “anticuerpo” intacto comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Véase, en general, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Cada cadena pesada está comprendida por una región variable de cadena pesada (HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada (Ch). La región constante de la cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida por una región variable de cadena ligera (LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está comprendida por un dominio, Cl. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl se compone de tres CDR y cuatro FR, disponible desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987); Chothia et al., Nature 342: 878 - 883 (1989).

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.

El término “anticuerpo” puede incluir porciones de unión a antígeno de un anticuerpo intacto que retienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno del anticuerpo intacto, por ejemplo, PD-1. Las porciones de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o escisión enzimática mediante química de anticuerpos intactos.

Los ejemplos de porciones de unión a antígeno incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consta de los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; (ii) un fragmento F (ab')² , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios Vh y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios Vl y Vh de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un anticuerpo de dominio único (“dAb”), que consiste de un dominio Vh como se describe en Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vh y Vl, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permita fabricarse como una única cadena de proteína en la que las regiones Vh y Vl se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. Science 242: 423­ 426 (1988); y Huston et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). Los dichos anticuerpos de cadena sencilla se incluyen por referencia al término “anticuerpo”.

Un “anticuerpo biespecífico” tiene dos especificidades de unión diferentes, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No.

5,922,845 y la patente de EE.UU. No. 5,837,243; Zeilder J. Immunol. 163: 1246 - 1252 (1999); Somasundaram Hum. Antibodies 9: 47 - 54 (1999); Keler Cancer Res. 57: 4008 - 4014 (1997). Por ejemplo, la invención proporciona anticuerpos biespecíficos que tienen un sitio de unión para un antígeno de superficie celular, tal como PD-1 humano, y un segundo sitio de unión para un receptor Fc en la superficie de una célula efectora. La invención también proporciona anticuerpos multiespecíficos, que tienen al menos tres sitios de unión.

En la presente invención se contemplan anticuerpos biespecíficos que se unen a cualquier PD-1 ya un inhibidor de punto de control diferente. Por ejemplo, los diferentes CPI pueden seleccionarse del grupo que consiste en PD-L1, CTLA-4, TIM3 y LAG3. Así, por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a PD-1 y PD-L1, PD-1 y CTLA-4, PD-1 y TIM3, PD-1 y LAG3. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a PD-1 y PD-L1, PD-1 y CTLA-4, PD-1 y TIM3, o PD-1 y LAG3. En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a PD-1 y PD-L1, o PD-1 y CTLA-4. En determinadas formas de realización, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a PD-1 y PD-L1.

El término “anticuerpos biespecíficos” incluye además “diacuerpos”. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que los dominios Vh y Vl se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Pollak et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)).

Los términos “anticuerpo humano” o “anticuerpo de secuencia humana”, como se usan indistintamente en el presente documento, incluyen anticuerpos que tienen regiones variables y constantes (si están presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos de secuencia humana de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término “anticuerpo humano”, como se usa en este documento, no pretende incluir anticuerpos “quiméricos” en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias estructurales humanas (es decir, anticuerpos “humanizados” o PRIMATIZED™).

El término “anticuerpo quimérico” como se usa en este documento significa un anticuerpo que comprende regiones de dos o más anticuerpos diferentes. Por ejemplo, en una realización, una o más de las c Dr se derivan de un anticuerpo anti-PD-1 humano. En otra realización, todas las CDR se derivan de un anticuerpo anti-PD-1 humano. En otra realización, las CDR de más de un anticuerpo anti-PD-1 humano se combinan en un anticuerpo humano quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-PD-1 humano, una CDR2 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-PD-1 humano y una CDR3 de la cadena ligera de un tercer anticuerpo anti-PD-1 humano; y de manera similar, las CDR de la cadena pesada pueden derivarse de uno o más de otros anticuerpos anti-PD-1. Además, las regiones marco pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-PD-1 o de uno o más seres humanos diferentes.

Además, como se discutió anteriormente en el presente documento, el anticuerpo quimérico incluye un anticuerpo que comprende una porción derivada de las secuencias de la línea germinal de más de una especie.

El término “competir”, como se usa en este documento con respecto a un anticuerpo, significa que un primer anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, compite por la unión con un segundo anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, donde la unión del primer anticuerpo con su epítopo análogo disminuye detectablemente en presencia del segundo anticuerpo en comparación con la unión del primer anticuerpo en ausencia del segundo anticuerpo. La alternativa, en la que la unión del segundo anticuerpo a su epítopo está también detectablemente disminuida en la presencia del primer anticuerpo, puede, pero no tiene que ser el caso. Es decir, un primer anticuerpo puede inhibir la unión de un segundo anticuerpo a su epítopo sin que ese segundo anticuerpo inhiba la unión del primer anticuerpo a su epítopo respectivo. Sin embargo, cuando cada anticuerpo inhibe de forma detectable la unión del otro anticuerpo con su epítopo o ligando análogo, ya sea en el mismo, mayor o menor grado, se dice que los anticuerpos “compiten de manera cruzada” entre sí por la unión de su(s) epítopo(s) respectivo(s). Por ejemplo, los anticuerpos de competencia cruzada pueden unirse al epítopo, o porción del epítopo, al que se unen los anticuerpos de la invención. La presente invención abarca tanto los anticuerpos que compiten como los que compiten de manera cruzada. Independientemente del mecanismo por el cual se produce dicha competencia o competencia cruzada (por ejemplo, impedimento estérico, cambio conformacional o unión a un epítopo común, o porción del mismo, y similares), el experto en la materia lo agradecería, dependiendo de las enseñanzas proporcionadas en este documento, que dichos anticuerpos de competencia y/o competencia cruzada están incluidos y pueden ser útiles para los métodos divulgados en este documento.

El término “epítopo” incluye cualquier determinante de proteína capaz de unirse específicamente a un receptor de inmunoglobulina o células T. Los determinantes epitópicos normalmente consiste en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específica. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al anterior pero no al posterior se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes.

Por la frase “se une específicamente”, como se usa en este documento, se entiende un compuesto, por ejemplo, una proteína, un ácido nucleico, un anticuerpo y similares, que reconoce y se une a una molécula específica, pero que no reconoce sustancialmente o se une a otras moléculas en una muestra. Por ejemplo, la frase “se une específicamente” puede caracterizar un anticuerpo o un inhibidor peptídico que reconoce y se une a un ligando análogo (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1 que se une con su antígeno análogo, PD-1) en una muestra, pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas de la muestra. Por lo tanto, en las condiciones de ensayo designadas, el resto de unión especificado (por ejemplo, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo) se une preferentemente a una molécula diana particular y no se une en una cantidad significativa a otros componentes presentes en una muestra de prueba. Se puede usar una variedad de formatos de ensayo para seleccionar un anticuerpo que se una específicamente a una molécula de interés. Por ejemplo, se utilizan inmunoensayo ELISA en fase sólida, inmunoprecipitación, BIAcore y análisis de transferencia Western para identificar un anticuerpo que reacciona específicamente con p D-1. Por lo general, una reacción específica o selectiva será al menos dos veces la señal de fondo o ruido y más típicamente más de 10 veces el fondo, incluso más específicamente, se dice que un anticuerpo “se une específicamente” a un antígeno cuando la constante de disociación de equilibrio (Kd) es < 1 pM, preferiblemente < 100 nM y lo más preferiblemente < 10 nM.

Preferiblemente, un “anticuerpo que se une específicamente a un CPI” es un anticuerpo o fragmento de unión de antígeno del mismo que, además de unirse a su CPI diana, interfiere con la interacción recíproca entre el CPI diana unido y su ligando análogo. Por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a PD-1 preferiblemente es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que, además de unirse a PD-1, interfiere con la interacción recíproca entre PD-1 y su ligando análogo, PD-L1.

El término “Kd” se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

Como se usa en el documento presente, “sustancialmente pura” significa que una especie objeto es la especie predominante presente (es decir, sobre una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición), y preferiblemente una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie objeto (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-1) comprende al menos aproximadamente el 50 por ciento (en base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente el 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más preferiblemente más de aproximadamente el 85 %, 90 %, 95 % y 99 %. Lo más preferiblemente, la especie objeto se purifica hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición mediante métodos de detección convencional) en la que la composición consiste esencialmente de una única especie macromolecular.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz”, como se usa en el documento actual, significa una cantidad que cuando se administra a un mamífero, preferiblemente un ser humano, media una respuesta terapéutica detectable en comparación con la respuesta detectada en ausencia del compuesto. Una respuesta terapéutica, tal como, pero sin limitarse a, inhibición y/o disminución del crecimiento tumoral (incluida la estasis del tamaño del tumor), tamaño del tumor, metástasis y similares, puede evaluarse fácilmente mediante una plétora de métodos reconocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los métodos divulgados en el presente documento.

El experto en la materia comprendería que la cantidad eficaz del compuesto o composición administrada en este documento varía y puede determinarse fácilmente en función de una serie de factores, como la enfermedad o afección que se está tratando, la etapa de la enfermedad, la edad y la salud y el estado físico del mamífero que se está tratando, la gravedad de la enfermedad, el compuesto particular que se administra y similares.

Se pretende que una “cantidad terapéuticamente eficaz” califique la cantidad de un agente requerido para reducir detectablemente hasta cierto punto uno o más de los síntomas de un trastorno neoplásico, que incluyen, pero no se limitan a: 1) reducción en el número de Células cancerígenas; 2) reducción del tamaño del tumor; 3) inhibición (es decir, ralentización hasta cierto punto, preferiblemente parada) de la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos; 4) inhibición (es decir, ralentización hasta cierto punto, preferiblemente parada) de la metástasis tumoral; 5) inhibición, hasta cierto punto, del crecimiento tumoral; 6) aliviar o reducir hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados con el trastorno; y/o 7) aliviar o reducir los efectos secundarios asociados con la administración de agentes anticancerosos.

También se puede definir una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un agonista de TLR9 según una respuesta de biomarcador usando cualquiera de los marcadores sanguíneos o tisulares bien definidos para la activación de TLR9 que son bien conocidos por los expertos en la técnica. El ADN CpG de clase A de la presente invención es muy similar a otros CpG ODN (por ejemplo, de clase B) en su inducción de una citocina de tipo Th1 y una respuesta de quimiocina en el suero, plasma, p Bm C y/o tejidos o biopsias, que se puede medir como se describe por Krieg et al., J. Immunother., 2004 27: 460-471 usando, por ejemplo, ensayos de citoquinas para IP-10, I-TAC, MIG, MIP-1p, MIP- 3p, IL-6, IL-12p40 o IFN-a del suero o plasma recogidos aproximadamente 24 horas después del tratamiento, o también se pueden evaluar mediante ensayos de RT-PCR de PBMC. Una cantidad terapéuticamente eficaz del ADN CpG de clase A que se inyecta por vía intratumoral en un paciente con cáncer aumentará los niveles de IP-10 en suero en 24 horas hasta al menos 100 pg/ml, y preferiblemente entre 100-100,000 pg/ml, y lo más preferentemente entre 1,000 y 10,000 pg/ml.

En contraste con los fármacos de quimioterapia, para los que la dosis se aumenta generalmente a la dosis máxima tolerada (MTD), los fármacos estimulantes inmunitarios como el ADN CpG de clase A de la presente invención funcionan mejor a una dosis biológica óptima (OBD), que generalmente está por debajo del MTD. Las citocinas y quimiocinas séricas ofrecen una medida simple para estimar la dosis biológica óptima. El efecto biológico pretendido del ADN CpG de clase A de la presente invención es convertir el microambiente tumoral (y el de los ganglios linfáticos que drenan) de inmunosupresor --con un nivel bajo de producción de IFN y sin TIL activado-- en un microambiente inmunoactivado que muestra una mayor producción de IFN, especialmente IFN tipo I, y que ahora tiene un TIL aumentado que muestra marcadores de activación como PD-L1, como se refleja por ejemplo en las características de la biopsia tumoral de los pacientes que responden al tratamiento con anti-PD-1 o anti-pD-Ll reportado por Tumeh et. al., Nature 2014 515: 568­ 571; y por Herbst et al., Nature 2014515: 563-567, respectivamente, o adicionalmente por Taube et al., Clin Cancer Res.

2014. Expresado de otra manera, estudios recientes han demostrado que la terapia anti-PD-1 o anti-PD-Ll generalmente solo es efectiva en pacientes que ya tienen TIL y que ya tienen un microambiente tumoral que refleja los efectos del IFN (como la expresión de PD-L1, que es inducido por IFN). Es poco probable que los pacientes que carecen de estas características en una biopsia tumoral previa al tratamiento respondan a la terapia con anti-PD-1 o anti-PD-Ll a menos que también reciban tratamiento con un agente que induzca TIL y una alta producción de IFN tipo I: El ADN CpG de clase A de la presente invención es el agente perfecto para este propósito.

La principal fuente endógena de IFN de tipo I en humanos y otros animales es la célula dendrítica plasmocitoide (pDC). Los pDC producen más del 99 % del IFN tipo I que se producen en respuesta a la infección por patógenos (Siegal et al., Science 1999). Sin embargo, se ha demostrado que muy pocos estímulos definidos molecularmente activan la pDC para secretar niveles elevados de IFN de tipo I. De hecho, hasta la fecha, los CpG ODN de clase A son, con mucho, el estímulo más fuerte para la producción de pDC de IFN de tipo I que se ha reportado en la literatura científica y, sorprendentemente, el ADN CpG de clase A de la presente invención es incluso más eficaz que los conocidos previamente en la técnica.

Ciertos ADN CpG de clase A preferidos inducen cantidades elevadas o grandes de IFN de tipo I. Los ensayos para medir el IFN de tipo I son bien conocidos en la técnica e incluyen el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) in vitro y ensayos basados en células, como se describe en el presente documento. Sin pretender ser limitante, cantidades grandes o elevadas de IFN de tipo I pueden referirse a más de o igual a aproximadamente 1,000 pg/ml de IFN-a medido de acuerdo con dichos ensayos in vitro. En ciertas realizaciones, cantidades grandes o elevadas de IFN de tipo I pueden referirse a más de o igual a aproximadamente 2,000 pg/ml de IFN-a medido de acuerdo con tales ensayos in vitro. En ciertas realizaciones, cantidades grandes o elevadas de IFN de tipo I pueden referirse a más de o igual a aproximadamente 3,000 pg/ml de IFN-a medido de acuerdo con dichos ensayos in vitro. En determinadas formas de realización, cantidades grandes o elevadas de IFN de tipo I pueden referirse a más de o iguales aproximadamente 4,000 pg/ml de IFN-a medido de acuerdo con tales ensayos in vitro. En ciertas realizaciones, cantidades grandes o elevadas de IFN de tipo I pueden referirse a más de o igual a aproximadamente 5,000 pg/ml de IFN-a medido de acuerdo con dichos ensayos in vitro.

En combinación con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, eligiendo entre los diversos compuestos activos y factores de ponderación tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos y modo preferido de administración, puede planificarse un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no cause una toxicidad sustancial y, sin embargo, sea eficaz para tratar el sujeto en particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar según los factores como la enfermedad o afección que se esté tratando, la gravedad de la enfermedad o afección y la salud y el tamaño del sujeto. Un experto en la materia puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de agonista de TLR9 (es decir, ADN CpG de clase A), CPI (es decir, anticuerpos anti-PD-1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) y/u otro(s) agente(s) terapéutico(s) sin necesidad de experimentación indebida.

Por ejemplo, Millward et al., 2013 reportaron de un ensayo clínico en humanos de un CpG ODN de clase B junto con un anticuerpo anti-CTLA-4. El ensayo clínico demostró una forma de combinar un agonista de TLR9 administrado mediante inyección subcutánea con un anticuerpo anti-CTLA-4 administrado sistémicamente que podría usarse en futuros ensayos clínicos de otros CpG ODN y otros inhibidores de puntos de control, pero el ensayo no demostró un beneficio clínico claro significativo de la combinación. Este fallo demuestra la no oviedad de la presente invención. Aunque ha habido publicaciones de CpG ODN de clase A con alta secreción de IFN-a, no fue obvio para los investigadores que llevaron a cabo el ensayo clínico utilizar dicho CpG ODN en lugar del CpG ODN de clase B. No fue obvio administrar el anticuerpo CpG ODN o anti-CTLA-4 localmente en el tumor en lugar de por la ruta sistémica. Como resultado, el enfoque se abandonó una vez finalizado el ensayo. Asimismo, Mangsbo et al. (J. Immunother 2010 33: 225) reportó de la combinación de un CpG ODN de clase B intratumoral con anti-CTLA-4 o anti-PD-1 en modelos de tumores de ratón. Se observaron resultados positivos con las combinaciones, pero de nuevo, no había ninguna guía para realizar tal terapia usando un tipo de CpG ODN que induzca un elevado IFN, tal como la clase A u otros ODN de la presente invención.

Hasta la fecha, parece que los expertos en el campo no se han dado cuenta de la conveniencia y la ventaja de combinar una clase de CpG ODN con alto índice de inducción de IFN junto con una terapia inhibidora de puntos de control. Para que una combinación de agentes tenga una sinergia óptima en la inmunoterapia contra el cáncer, los efectos inmunosupresores de un agente deben revertirse con otro. Por ejemplo, el IFN induce la expresión de PD-L1 en los tumores, lo que suprime la respuesta inmunitaria. Los CpG ODN de alta inducción de IFN de la invención inducen la expresión de PD-L1, pero cuando se usan en combinación con un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-PD-Ll, los posibles efectos inmunosupresores de la PD-L1 son superados por el anticuerpo. Por otro lado, la presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que la combinación de un CpG ODN de clase B intratumoral con un inhibidor del punto de control sistémico será menos que óptimamente sinérgico (o no sinérgico en absoluto) porque la inducción de IL-10 da como resultado efectos inmunosupresores pleiotrópicos que no se revierten con la terapia con inhibidores de puntos de control. Por lo tanto, la presente invención proporciona combinaciones de agentes que juntos proporcionan beneficios inesperados, por ejemplo, sinérgicos, en la inmunoterapia del cáncer.

La cantidad terapéuticamente eficaz de ADN CpG de clase A y anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo, solos o juntos, se puede determinar inicialmente a partir de modelos animales y/o in vitro. También se puede determinar una dosis terapéuticamente eficaz a partir de datos humanos para el CpG ODN específico y/o anticuerpos específicos o para otros compuestos que se sabe que exhiben actividades farmacológicas similares. La dosis aplicada se puede ajustar basándose en la biodisponibilidad relativa y la potencia del compuesto administrado. El ajuste de la dosis para lograr la máxima eficacia en base a los métodos descritos anteriormente y otros métodos que son bien conocidos en la técnica está dentro de las capacidades del experto en la materia.

“Material instructivo”, como se usa ese término en este documento, incluye una publicación, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresión que pueda usarse para comunicar la utilidad del compuesto, combinación y/o composición de la invención en el kit para afectar, aliviar o tratar las diversas enfermedades o trastornos citados en este documento. Opcional o alternativamente, el material instructivo puede describir uno o más métodos para aliviar las enfermedades o trastornos en una célula, un tejido o un mamífero, incluso como se divulga en otra parte del presente documento.

El material instructivo del kit puede, por ejemplo, fijarse a un contenedor que contiene el compuesto y/o composición de la invención o enviarse junto con un contenedor que contiene el compuesto y/o composición. Alternativamente, el material instructivo puede enviarse por separado del contenedor con la intención de que el destinatario utilice el material instructivo y el compuesto de manera cooperativa.

El ADN CpG de clase A y el anticuerpo anti-PD-1 o su fragmento de unión a antígeno de la invención pueden proporcionarse en un dispensador medicinal. Un dispensador medicinal es un paquete que define una pluralidad de compartimentos de almacenamiento de medicamentos, cada compartimento para albergar una unidad individual de medicamento. En una realización, todo un curso de tratamiento medicinal se aloja en una pluralidad de compartimentos de almacenamiento medicinal.

Un paquete que define una pluralidad de compartimentos de almacenamiento de medicamentos puede ser cualquier tipo de paquete o tarjeta farmacéutica desechable que contenga medicamentos en compartimentos individuales. Por ejemplo, el paquete es un paquete blíster construido a partir de una tarjeta, que puede estar hecha de material de papel rígido, una hoja blíster y una hoja de soporte. Tales tarjetas son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Como ejemplo, un dispensador medicinal puede albergar un curso completo de tratamiento medicinal. El dispensador puede incluir la indicación del día para indicar qué día se deben tomar las unidades individuales de medicamento. Estos pueden estar marcados a lo largo de un primer lado del paquete del medicamento. Las indicaciones de dosis también pueden estar marcadas, por ejemplo, a lo largo de un segundo lado del paquete de medicamento perpendicular al primer lado del paquete de medicamento, indicando así el tiempo en el que debe tomarse la unidad individual de medicamento. Las dosis unitarias pueden estar contenidas en el dispensador que es un blíster.

Excepto cuando se indique, los términos “paciente” o “sujeto” se utilizan indistintamente y se refieren a mamíferos como pacientes humanos y primates no humanos, así como a sujetos veterinarios tales como conejos, ratas y ratones, y otros animales. Preferiblemente, “paciente” o “sujeto” se refiere a un ser humano.

En ciertas realizaciones, un sujeto es un ser humano adulto.

En determinadas formas de realización, un sujeto es un niño. En ciertas realizaciones, un sujeto tiene menos de aproximadamente 18 años. En ciertas realizaciones, un sujeto tiene menos de aproximadamente 12 años.

Como se usa en este documento, “tratar” significa reducir la frecuencia con la que los síntomas de una enfermedad (es decir, crecimiento tumoral y/o metástasis, u otro efecto mediado por el número y/o la actividad de las células inmunitarias, y similares) son experimentados por un paciente. El tratamiento puede ser profiláctico (para prevenir o retrasar el inicio de la enfermedad, o para prevenir la manifestación de síntomas clínicos o subclínicos de la misma) o supresión o alivio terapéutico de los síntomas después de la manifestación de la enfermedad. El término “tratar” incluye la administración de los compuestos o agentes de la presente invención para (i) prevenir o retrasar la aparición de los síntomas, complicaciones o indicaciones bioquímicas de, (ii) aliviar los síntomas y/o (iii) inhibir o detener el desarrollo posterior de la enfermedad, afección o trastorno.

La “terapia de combinación” abarca la administración de un ADN CpG de clase A y un anticuerpo anti-PD-1 o un fragmento de unión a antígeno del mismo como parte de un régimen de tratamiento específico destinado a proporcionar un efecto beneficioso de la coacción de estos agentes terapéuticos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o su fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico o su fragmento de unión a antígeno biespecífico. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero no se limita a, la coacción farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación se lleva a cabo típicamente durante un período de tiempo definido (normalmente minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada). Generalmente, la “terapia de combinación” no pretende abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapia separados que, de manera casual y arbitraria, dan como resultado las combinaciones de la presente invención.

La “terapia de combinación” abarca la administración de estos agentes terapéuticos de manera secuencial, es decir, en la que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea.

La “terapia de combinación” también puede abarcar la administración del ADN CpG de clase A y el anticuerpo anti-PD-1 o su fragmento de unión al antígeno como se describió anteriormente en combinación adicional con terapias no farmacológicas (tales como, pero sin limitarse a, radioterapia (XRT) o cirugía). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o su fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico o su fragmento de unión a antígeno biespecífico. Cuando la terapia de combinación comprende además tratamiento por radiación, el tratamiento por radiación puede realizarse en cualquier momento adecuado siempre que se logre un efecto beneficioso de la coacción de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento por radiación. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento con radiación se retira temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, en días o incluso semanas.

La “terapia de combinación” también puede abarcar la administración del ADN CpG de clase A y el anticuerpo anti-PD-1 o su fragmento de unión al antígeno como se describe anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos (tales como, pero no limitado a un agente antineoplásico adicional y diferente, una vacuna dendrítica u otra vacuna contra el tumor). En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o su fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico o su fragmento de unión a antígeno biespecífico. Sin embargo, en ciertas realizaciones, la “terapia de combinación” excluye específicamente la administración de una vacuna de células dendríticas o antitumoral.

II. ADN CpG

Los oligonucleótidos CpG (ADN CpG; CpG ODN) contienen secuencias específicas que se ha encontrado que provocan una respuesta inmunitaria. Estas secuencias específicas se denominan “motivos inmunoestimuladores”, y los oligonucleótidos que contienen motivos inmunoestimuladores se denominan “moléculas de oligonucleótidos inmunoestimuladoras” y, de forma equivalente, “oligonucleótidos inmunoestimuladores”. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores incluyen al menos un motivo inmunoestimulador y, preferiblemente, ese motivo es un motivo interno. El término “motivo inmunoestimulador interno” se refiere a la posición de la secuencia del motivo dentro de una secuencia de oligonucleótidos que es al menos un nucleótido más largo (en los extremos 5' y 3') que la secuencia motivo.

Los oligonucleótidos CpG incluyen al menos un dinucleótido CpG no metilado. Un oligonucleótido que contiene al menos un dinucleótido CpG no metilado es una molécula de oligonucleótido que contiene una secuencia de dinucleótido citosinaguanina (es decir, “ADN CpG” o ADN que contiene una citosina 5' ligada por un enlace fosfato a una guanina 3') y activa el sistema inmunológico. El oligonucleótido CpG completo puede estar sin metilar o las porciones pueden estar sin metilar, pero al menos la C del 5' CG 3' debe estar sin metilar.

Los CpG ODN tienen generalmente una longitud de aproximadamente 8-100 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los CpG ODN tienen aproximadamente 8-50 nucleótidos de longitud, aproximadamente 8-40 nucleótidos de longitud, aproximadamente 8-30 nucleótidos de longitud, aproximadamente 8-24 nucleótidos de longitud, aproximadamente 8-20 nucleótidos de longitud o aproximadamente 8-16 nucleótidos de longitud.

En 2004, los estudios de relación estructura-actividad de CpG ODN habían definido tres familias con características estructurales y biológicas distintas (Hartmann et al., Eur. J. Immunol. 2003, 33: 1633-1641; Marshall et al., J. Leukocyte Biol. 2003 73: 781-792; Vollmer et al., Eur. J. Immunol. 2004 34: 251-262). Los ODN de clase B típicos tienen una estructura principal completamente de fosforotioato, no forman estructuras de orden superior y son estimuladores fuertes de células B, que inducen niveles relativamente altos de secreción de IL-10, pero inducen relativamente poca actividad de NK o secreción de IFN-a (Krieg, 2002 y Krieg, observaciones no publicadas). Los CpG ODN de clase B inducen efectos contrarreguladores inmunosupresores que incluyen no solo la secreción de IL-10, sino también la expresión de IDO, que puede promover el desarrollo de células Treg in vitro (Moseman et al., J. Immunol. 2004 173 (7): 4433-4442; Chen et al., J. Immunol. 2008 181 (8): 5396-5404). La relevancia de estos datos in vitro para la inmunoterapia tumoral in vivo ha sido incierta y no ha retrasado el desarrollo clínico de los ODN de clase B, pero la presente invención se basa en parte en un nuevo descubrimiento de que estos efectos de los ODN de clase B suprimen las respuestas inmunitarias antitumorales, que pueden evitarse utilizando otras clases de CpG ODN que están diseñadas estructuralmente para no activar la vía NF-Kb que conduce a la secreción de IL-10.

La estructura principal de fosforotioato usada en CpG ODN de clase B tiene múltiples efectos complejos sobre la respuesta inmunitaria resultante en comparación con los observados con un CpG ODN con la misma secuencia, pero sin estructura principal de fosforotioato. Un efecto muy importante de la estructura principal de fosforotioato (PS) es la protección contra la degradación de nucleasas. Los ODN completamente modificados con Ps son casi completamente estables en suero y tejidos durante al menos 24 h, mientras que los ODN sin modificar y sin protección se degradan en unos pocos minutos. En el suero, la principal actividad nucleasa es una exonucleasa 3' contra la cual CpG ODN puede protegerse con solo 1 o unos pocos enlaces PS en el extremo 3' del ODN. Pero en los tejidos también hay exonucleasas 5' así como endonucleasas, y estas pueden degradar el ADN nativo que de otro modo no está protegido. El ADN nativo puede protegerse contra exonucleasas mediante circularización utilizando técnicas bien descritas en la literatura. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos No. 8,017,591; 7,635,468; 7,074,772; 6,849,725; 6,451,593; y 6,451,563; y la Solicitud de Patente Publicada de EE.UU. No. 2003/0125279. Alternativamente o además, el ODN nativo (es decir, no modificado y sin protección) puede formularse en nanopartículas u otras formulaciones bien conocidas en la técnica para bloquear el acceso de nucleasa al ODN.

En general, el ADN CpG nativo (fosfodiéster) activa TLR9 tanto en células B como en pDC. Las células B producen citocinas y comienzan a proliferar (esto se debe principalmente a la activación de NF-KB), pero a menos que se mantenga la estimulación de TLR9, la proliferación suele ser modesta y se produce una estimulación relativamente pequeña de la secreción de Ig y el cambio de clase. Las pDC son activadas por el ADN CpG nativo para secretar IFN tipo I y expresar receptores coestimuladores, pero la magnitud de la estimulación depende críticamente de la forma del ADN. En contraste con estos efectos del ADN CpG nativo, el ADN CpG de fosforotioato de clase B proporciona una señal TLR9 mucho más potente y sostenida para las células B, induciéndolas a proliferar fuertemente y conduciendo a la secreción de Ig y al cambio de clase como se reportó en la literatura. Pero la estructura principal de fosforotioato tiene un efecto muy diferente sobre la respuesta de pDC mediada por TLR9, reduciendo sustancialmente la secreción de IFN (aparentemente mediante la supresión de la señalización mediada por IRF7), pero por lo general sigue proporcionando una fuerte inducción de la expresión de la molécula coestimuladora. Por lo tanto, para la presente invención, el uso de ADN nativo proporcionará normalmente respuestas de IFN de tipo I más altas y será terapéuticamente eficaz siempre que el ADN nativo esté protegido de la degradación. Pueden añadirse de 1 a 3 modificaciones de fosforotioato en los extremos 5' y 3' del ADN nativo para protegerlo de la degradación por nucleasa sin disminuir la respuesta al IFN de tipo I.

Al principio del desarrollo de CpG ODN para inmunoterapia contra el cáncer, los expertos en la técnica generalmente creían que la activación de células B era deseable y, por lo tanto, centraron los esfuerzos de desarrollo en los ODN de clase B. De hecho, quizás la activación de las células B sea deseable para una vacuna antitumoral, con el fin de impulsar la producción de Ab antitumorales, que son bien conocidos en el campo por poder contribuir a la respuesta antitumoral. Algunos ensayos clínicos en humanos tempranos que emplean la administración intratumoral de CpG de clase B dieron pruebas alentadoras de activación de células dendríticas en los ganglios linfáticos que drenan el tumor (por ejemplo, Molenkamp BG et al., Clin Cancer Res.2007 13 (10): 2961-2969). Sin embargo, las respuestas clínicas a esta terapia intratumoral local fueron bastante limitadas, y los estudios de la población total de linfocitos en los ganglios linfáticos de drenaje mostraron un aumento aproximado del doble en la liberación de IL-10 en pacientes tratados con CpG (Tabla 2 en Molenkamp et al.). Teniendo en cuenta los efectos negativos de IL-10 para la inmunoterapia tumoral y la necesidad de CpG ODN mejorados que no induzcan su producción, o que induzcan un nivel más bajo de esta producción, la presente invención proporciona además CpG ODN mejorado con una inducción reducida de IL-10

No obstante, se ha descubierto ahora, de acuerdo con la presente invención, que para la administración intratumoral en particular, la activación de células B con la inducción concomitante de IL-10 e IDO es indeseable y quizás perjudicial. Esto es difícil o imposible de demostrar usando modelos de ratón debido a las diferencias específicas de la especie en la expresión de TLR9 y las diferencias en las respuestas de citocinas. La presente invención se basa en un nuevo análisis de datos previamente publicados y no publicados sobre las respuestas de las células inmunitarias humanas a varios CpG ODN, junto con un nuevo análisis de los efectos inmunitarios y deficiencias de otras inmunoterapias contra el cáncer y XRT.

Para la inmunoterapia contra el cáncer, la IL-10 a veces puede tener efectos positivos (especialmente con la terapia sistémica, ver, por ejemplo, Mumm y Oft, Bioessays 201335 (7): 623-631), pero generalmente se considera que la IL-10 tiene efectos inmunológicos negativos en el microambiente del tumor local, inhibiendo el rechazo inmunológico (revisado en Sato et al., Immunol Res. 2011 51 (2-3): 170-182). Por lo tanto, la presente invención se basa en parte en el descubrimiento de que los CpG ODN de clase B, que inducen niveles elevados de IL-10, no se prefieren para la terapia intratumoral.

La clase B de oligonucleótidos CpG está representada por la fórmula:

5' X¹CGX²3'

en la que X¹ y X² son nucleótidos. En algunas realizaciones, X¹ puede ser adenina, guanina o timina y/o X² puede ser citosina, adenina o timina.

La clase B de oligonucleótidos CpG también está representada por la fórmula:

5' X¹X²CGX³X⁴3'

en la que X¹, X² , X³ y X⁴ son nucleótidos. X² puede ser adenina, guanina o timina. X³ puede ser citosina, adenina o timina.

La clase B de oligonucleótidos CpG también incluye oligonucleótidos representados por al menos la fórmula:

5' N¹X¹X²CGX³X⁴ N²3'

en la que X¹, X², X³ y X⁴ son nucleótidos y N es cualquier nucleótido y N¹ y N² son secuencias de oligonucleótidos compuestas por aproximadamente 0-25 N cada una. X¹X² puede ser un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: GpT, GpG, GpA, ApA, ApT, ApG, CpT, CpA, CpG, TpA, TpT y TpG; y X³X⁴ puede ser un dinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: TpT, ApT, TpG, ApG, CpG, TpC, ApC, CpC, TpA, ApA y CpA.

La clase B de oligonucleótidos CpG se divulga en las solicitudes de patente publicadas PCT WO 96/02555 y WO 98/18810, y la patente de EE.UU. No. 6,194,388 B1 y la patente de EE.UU. 6,239,116 B1, expedida el 27 de febrero de 2001 y el 29 de mayo de 2001, respectivamente.

En contraste con los CpG ODN de clase B, los CpG ODN de clase A son potentes activadores de las células asesinas naturales y la secreción de IFN-a de las células dendríticas plasmocitoides (pDC), pero solo estimulan débilmente las células B e inducen muy poca secreción de IL-10. Los ODN canónicos de clase A contienen motivos polyG en los extremos 5' y/o 3' que son capaces de formar estructuras complejas de orden superior conocidas como tétradas G y una región central de fosfodiéster que contiene uno o más motivos CpG dentro de un palíndromo autocomplementario (revisado en (Krieg, 2006). Por ejemplo, las patentes estadounidenses números 6,949,520 y 7,776,344 muestran que, en ciertas realizaciones preferidas, el CpG ODN de clase A tiene una secuencia correspondiente a cualquiera de los siguientes:

ggGGTCAACGTTGAgggggG (SEQ ID NO: 43);

tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt (SEQ ID NO: 44);

ggggtcgtcgttttgggggg (SEQ ID NO: 45);

tcgtcgttttgtcgttttgggggg (SEQ ID NO: 46);

ggggtcgacgtcgagggggg (SEQ ID NO: 47);

ggggtcatcgatgagggggg (SEQ ID NO: 48);

ggGGGACGATCGTCgggggG (SEQ ID NO: 49);

gggggtcgtacgacgggggg (SEQ ID NO: 50);

ggGGGACGATATCGTCgggggG (SEQ ID NO: 51);

ggGGGACGACGTCGTCgggggG (SEQ ID NO: 52);

ggGGGACGAGCTGCTCgggggG (SEQ ID NO: 53);

ggGGGACGTACGTCgggggG (SEQ ID NO: 54);

ggGGGACGATCGTTGgggggG (SEQ ID NO: 55);

ggGGAACGATCGTCggggG (SEQ ID NO: 56);

ggGGGGACGATCGTCgggggG (SEQ ID NO: 57);

ggGGGACGATCGTCGgggggG (SEQ ID NO: 58);

ggGGGTCATCGATGAgggggG (SEQ ID NO: 59);

ggGGTCGTCGACGAgggggG (SEQ ID NO: 60);

ggGGTCGTTCGAACGAgggggG (SEQ ID NO: 61);

ggGGACGTTCGAACGTgggggG (SEQ ID NO: 62);

ggGGAACGACGTCGTTgggggG (SEQ ID NO: 63);

ggGGAACGTACGTCgggggG (SEQ ID NO: 64);

ggGGAACGTACGTACGTTgggggG (SEQ ID NO: 65);

ggGGTCACCGGTGAgggggG (SEQ ID NO: 66);

ggGGTCGACGTACGTCGAgggggG (SEQ ID NO: 67);

ggGGACCGGTACCGGTgggggG (SEQ ID NO: 68);

ggGTCGACGTCGAgggggG (SEQ ID NO: 69);

ggGGTCGACGTCGagggg (SEQ ID NO: 70);

ggGGAACGTTAACGTTgggggG (SEQ ID NO: 71);

ggGGACGTCGACGTggggG (SEQ ID NO: 72);

ggGGGTCGTTCGTTgggggG (SEQ ID NO: 73);

ggGACGATCGTCGgggggG (SEQ ID NO: 74);

ggGTCGTCGACGAggggggG (SEQ ID NO: 75);

ggTCGTCGACGAGgggggG (SEQ ID NO: 76);

ggGGACGATCGTCGgggggG (SEQ ID NO: 77);

ggGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG (SEQ ID NO: 78); y

ggGGACGACGTCGTGgggggG (SEQ ID NO: 79),

en el que cada letra minúscula representa un nucleótido ligado a su nucleótido adyacente en 3' mediante un enlace fosforotioato (PS); y cada letra mayúscula representa un nucleótido ligado a su nucleótido adyacente 3' (si está presente) por un enlace fosfodiéster (PO), excepto que el nucleótido terminal 3' está representado por una letra mayúscula ya que no tiene nucleótido adyacente 3'.

En ciertas realizaciones más preferidas, el ácido nucleico inmunoestimulador tiene una secuencia correspondiente a

ggGGGACGAGCTCGTCgggggG (SEQ ID NO: 80);

ggGGGACGATCGTCGgggggG (SEQ ID NO: 58);

ggGGACGATCGAACGTgggggG (SEQ ID NO: 81);

ggGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG (SEQ ID NO: 78); o

ggGGACGACGTCGTGgggggG (SEQ ID NO: 79);

en el que cada letra minúscula representa un nucleótido ligado a su nucleótido adyacente 3' mediante un enlace fosforotioato (PS); y cada letra mayúscula representa un nucleótido ligado a su nucleótido adyacente 3' (si está presente) por un enlace fosfodiéster (PO), excepto que el nucleótido terminal 3' está representado por una letra mayúscula ya que no tiene nucleótido adyacente 3'.

En ciertas realizaciones, un CpG ODN de clase A para su uso de acuerdo con los métodos de la presente invención tiene una secuencia proporcionada como: 5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG-3' (SEQ ID NO: 82; también denominada en el presente documento “G10 “). Tales oligonucleótidos y formulaciones del mismo útil de acuerdo con la presente invención se describe en WO 2003/024481; US 2003/0099668; US 2012/0301499; WO 2004/084940; US 7,517,520; US 2010/0098722; WO 2007/068747; US 2007/0184068; US 8,574,564; WO 2007/144150; US 8,541,559; WO 2008/073960; y US 8,586,728.

Los métodos para reducir la cantidad de activación de células B con CpG ODN y aumentar o mantener la cantidad de inducción de IFN-a no son bien conocidos por los expertos en la técnica, pero sin comprometerse con un mecanismo de acción particular subyacente a la invención, ahora se ha descubierto de acuerdo con la invención que la proliferación de células B y la secreción de IL-10 parecen requerir una señal TLR9 más sostenida en comparación con la requerida para inducir a las células dendríticas plasmocitoides (pDC) para secretar IFN-a. Dicha señal TLR9 sostenida es proporcionada por el CpG ODN de clase B en un grado mayor que el CpG ODN de clase A mencionado anteriormente. Además, la duración de la señal TLR9 se puede acortar colocando enlaces de fosfodiéster (PO) en el CpG (diseños “semiblandos”) y o en otras posiciones dentro del ODN. Los CpG ODN “más suaves” con la activación de células B menos sostenida son aquellos con estructuras principales de fosfodiéster completamente, pero se degradan tan rápidamente in vivo que la respuesta de IFN-a también se ve comprometida, a menos que el ODN sea circular (para proteger contra exonucleasas) o se administra en una formulación tal como partículas similares a virus (VLP), nanopartículas (NP), complejos inmunoestimulantes (ISCOM) o similares, que también protege contra las nucleasas.

Las moléculas de oligonucleótidos inmunoestimuladores pueden tener una estructura principal homogénea (por ejemplo, completamente fosfodiéster (PO) o completamente fosforotioato (PS)) o una estructura principal quimérica. Una excepción a esto es el diseño CpG de clase A (y clase A/E) en el que la porción central del ODN que incluye al menos 8 nucleótidos y preferiblemente 10 o más nucleótidos debe ser fosfodiéster para una actividad óptima. Para los propósitos de la presente invención, una estructura principal quimérica se refiere a una estructura principal parcialmente estabilizada, en la que al menos un enlace internucleotídico es fosfodiéster o similar a un fosfodiéster, y en la que al menos un otro enlace internucleotídico es un enlace internucleotídico estabilizado, en la que al menos un fosfodiéster o enlace de tipo fosfodiéster y el al menos un enlace estabilizado son diferentes. Los enlaces estabilizados se colocan preferentemente en los extremos 5 'y 3' del oligonucleótido para proteger los extremos de las exonucleasas: los enlaces fosfodiéster se colocan en el medio y contribuyen a inducir una respuesta de IFN-a más fuerte que se puede lograr fácilmente con PS solo.

Dado que se ha informado que los enlaces boranofosfonato están estabilizados con respecto a los enlaces fosfodiéster, para los fines de la naturaleza quimérica de la estructura principal, los enlaces boranofosfonato pueden clasificarse como de tipo fosfodiéster o como estabilizados, dependiendo del contexto. Por ejemplo, una estructura principal quimérica de acuerdo con la presente invención podría, en una realización, incluir al menos un enlace fosfodiéster (fosfodiéster o similar a fosfodiéster) y al menos un enlace boranofosfonato (estabilizado). En otra realización, una estructura principal quimérica según la presente invención podría incluir enlaces boranofosfonato (fosfodiéster o similar a fosfodiéster) y fosforotioato (estabilizado). Un “enlace internucleotídico estabilizado” significará un enlace internucleotídico que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante una exo o endonucleasa), en comparación con un enlace internucleotídico fosfodiéster. Los enlaces internucleotídicos estabilizados preferidos incluyen, sin limitación, fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato y metilfosforotioato. Otros enlaces internucleotídicos estabilizados incluyen, sin limitación, enlaces de tipo péptido, alquilo, desfosfo y otros como se describió anteriormente.

Las estructuras principales modificadas tales como fosforotioatos se pueden sintetizar utilizando técnicas automatizadas que emplean químicas de fosforamidato o H-fosfonato. Se pueden preparar fosfonatos de arilo y alquilo, por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 4,469,863; y alquilfosfotriésteres (en los que la fracción de oxígeno cargada está alquilada), por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 5,023,243 y Patente Europea No. 092,574, se pueden preparar mediante síntesis automatizada en fase sólida utilizando reactivos disponibles comercialmente. Se han descrito métodos para realizar otras modificaciones y sustituciones de la estructura principal del ADN. Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. También se conocen métodos para preparar oligonucleótidos quiméricos. Por ejemplo, las patentes concedidas a Uhlmann et al. han descrito dichas técnicas, que incluyen, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 7,566,703, 7,795,235, 8,283,328, y 8,304,396.

Se puede sintetizar ODN modificado con estructura principal mixta utilizando un sintetizador de ADN disponible comercialmente y química de fosforamidita estándar. F. E. Eckstein, “Oligonucleotides and Analogues--A Practical Approach”, IRL Press, Oxford, UK, 1991; y M. D. Matteucci and M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 21, 719 (1980). Después del acoplamiento, los enlaces de fosforotioato (PS) se introducen mediante sulfuración utilizando el reactivo de Beaucage ((R. P. Iyer, W. Egan, J. B. Regan and S. L. Beaucage, J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990)) (0.075 M en acetonitrilo) o disulfuro de fenil acetilo (PADS) seguido de terminación de cadena con anhídrido acético, 2,6-lutidina en tetrahidrofurano (1:1:8; v:v:v) y N-metilimidazol (16 % en tetrahidrofurano). Esta etapa de terminación de cadena se realiza después de la reacción de sulfuración para minimizar la formación de enlaces de fosfodiéster (PO) no deseados en las posiciones en las que se debería ubicar un enlace de fosforotioato. En el caso de la introducción de un enlace de fosfodiéster, por ejemplo, en un dinucleótido CpG, el fósforo III intermedio se oxida mediante tratamiento con una solución de yodo en agua/piridina. Después de la escisión del soporte sólido y la desprotección final mediante tratamiento con amoníaco concentrado (15 horas a 50 °C), los ODN se analizan por HPLC sobre una columna Gen-Pak Fax (Millipore-Waters) utilizando un gradiente de NaCl (por ejemplo, tampón A: NaH²PO⁴ 10 mM en acetonitrilo/agua = 1:4/v:v pH 6.8; tampón B: NaH²PO⁴10 mM, NaCl 1.5 M en acetonitrilo/agua = 1:4/v:v; 5 a 60 % de B en 30 minutos a 1 ml/min) o mediante electroforesis capilar en gel. El ODN se puede purificar mediante HPLC o mediante FPLC sobre una columna Source High Performance (Amersham Pharmacia). Las fracciones homogéneas de HPLC se combinan y desalan mediante una columna C18 o mediante ultrafiltración. El ODN se analizó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF para confirmar la masa calculada.

Los oligonucleótidos de la invención también pueden incluir otras modificaciones. Estos incluyen análogos de ADN no iónicos, tales como fosfatos de alquilo y arilo (en los que el oxígeno del fosfonato cargado se reemplaza por un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en los que la fracción de oxígeno cargada está alquilada. También se ha mostrado que los oligonucleótidos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o en ambos terminales, son sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasa.

En algunas realizaciones, los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos “blandos” o “semiblandos”. Un oligonucleótido blando es un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura principal parcialmente estabilizada, en la que los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similar a fosfodiéster se producen sólo dentro e inmediatamente adyacentes a al menos un dinucleótido de pirimidina-purina interno (YZ). Preferiblemente, YZ es YG, un dinucleótido de pirimidina-guanosina (YG). El al menos un dinucleótido YZ interno en sí mismo tiene un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster. Un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster que se produce inmediatamente adyacente a al menos un dinucleótido YZ interno puede ser 5', 3' o ambos 5' y 3' con respecto a al menos un dinucleótido YZ interno.

En particular, los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster implican “dinucleótidos internos”. Un dinucleótido interno en general significará cualquier par de nucleótidos adyacentes conectados por un enlace internucleotídico, en el que ninguno de los nucleótidos del par de nucleótidos es un nucleótido terminal, es decir, ninguno de los nucleótidos del par de nucleótidos es un nucleótido que define el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. Por tanto, un oligonucleótido lineal que tiene una longitud de n nucleótidos tiene un total de n-1 dinucleótidos y sólo n-3 dinucleótidos internos. Cada enlace internucleotídico en un dinucleótido interno es un enlace internucleotídico interno. Por tanto, un oligonucleótido lineal que tiene una longitud de n nucleótidos tiene un total de n-1 enlaces internucleotídicos y solo n-3 enlaces internucleotídicos internos. Los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster colocados estratégicamente, por lo tanto, se refieren a enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster colocados entre cualquier par de nucleótidos en la secuencia de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster no se colocan entre los pares de nucleótidos más cercanos al extremo 5' o 3'.

Preferiblemente, un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster que se produce inmediatamente adyacente a al menos un dinucleótido YZ interno es en sí mismo un enlace internucleotídico interno. Por tanto, para una secuencia N¹ YZ N2, en la que N¹ y N² son cada uno, independientemente del otro, cualquier nucleótido individual, el dinucleótido YZ tiene un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster, y además (a) N¹ e Y están ligados por un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N¹ es un nucleótido interno, (b) Z y N2 están ligados por un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N2 es un nucleótido interno, o (c) N¹ e Y están ligados por un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N¹ es un nucleótido interno y Z y N2 están ligados por un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster cuando N2 es un nucleótido interno.

Se considera que los oligonucleótidos blandos de acuerdo con la presente invención son relativamente susceptibles a la escisión por nucleasa en comparación con los oligonucleótidos completamente estabilizados. Sin pretender estar limitado a una teoría o mecanismo particular, se considera que los oligonucleótidos blandos de la invención son susceptibles de escindirse dando como resultado fragmentos con actividad inmunoestimuladora reducida o nula en relación con los oligonucleótidos blandos de longitud completa. Se considera que la incorporación de al menos un enlace internucleotídico sensible a nucleasa, particularmente cerca de la mitad del oligonucleótido, proporciona un “interruptor de apagado” que altera la farmacocinética y la farmacodinamia del oligonucleótido para reducir la duración de la actividad inmunoestimuladora máxima del oligonucleótido. En particular, el enlace sensible a nucleasa puede reducir la magnitud de la inducción de NF-KB mientras aumenta la magnitud de la inducción de IRF3 y/o IRF7. La activación de TLR9 puede conducir a una fuerte activación de una o ambas de la ruta NF-kB (que conduce a la expresión de citocinas tales como IL-6 y la expresión de moléculas coestimuladoras) y las rutas IRF3/7 que conducen a la secreción de IFN-a. En general, parece haber algún antagonismo entre estas rutas. Por ejemplo, el ODN de CpG de clase B activa predominantemente el primero, mientras que el ODN de CpG de clase A activa el último. La fuerte inducción de NF-kB se asocia con oligonucleótidos CpG de clase B y puede conducir a un aumento de la secreción de IL-10. Si bien esto puede ser útil para la oligoterapia sistémica con CpG, no es deseable para la terapia intratumoral. El aumento de la inducción de IRF3/7 proporcionada por el enlace internucleotídico sensible a nucleasa conduce a una gran producción de IFN-a en el microambiente tumoral, lo que mejora las posibilidades de una respuesta inmunitaria antitumoral productiva y terapéutica después de la terapia intratumoral sin aumentar la producción de IL-10 indeseable. Esta semivida reducida de los oligos CpG que contienen enlaces sensibles a nucleasas puede ser de particular valor en tejidos y en aplicaciones clínicas en las que es deseable evitar lesiones relacionadas con la inflamación local crónica o inmunoestimulación, por ejemplo, el riñón, ya que es menos probable que los oligos se acumulen en el tejido en altas concentraciones.

Un oligonucleótido semiblando es un oligonucleótido inmunoestimulador que tiene una estructura principal parcialmente estabilizada, en la que los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster se producen solo dentro de al menos un dinucleótido pirimidina-purina (YZ) interno. Los oligonucleótidos semiblandos generalmente poseen una potencia inmunoestimuladora aumentada en relación con los oligonucleótidos inmunoestimuladores totalmente estabilizados correspondientes. Debido a la mayor potencia de los oligonucleótidos semiblandos, se pueden utilizar oligonucleótidos semiblandos, en algunos casos, a concentraciones efectivas más bajas y tienen dosis efectivas más bajas que los oligonucleótidos inmunoestimuladores completamente estabilizados convencionales para lograr un efecto biológico deseado.

Se considera que las propiedades anteriores de los oligonucleótidos semiblandos generalmente aumentan al aumentar la “dosis” de enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster que implican dinucleótidos YZ internos. Por lo tanto, se considera, por ejemplo, que generalmente para una secuencia de oligonucleótidos dada con cuatro dinucleótidos YZ internos, un oligonucleótido con cuatro enlaces internucleotídicos YZ de fosfodiéster o similares a fosfodiéster internos es más inmunoestimulador que un oligonucleótido con tres enlaces internucleótidos YZ de fosfodiéster o similares a fosfodiéster internos, que a su vez es más inmunoestimulador que un oligonucleótido con dos enlaces internucleotídicos YZ de fosfodiéster o similares a fosfodiéster internos, que a su vez es más inmunoestimulador que un oligonucleótido con un enlace internucleotídico YZ de fosfodiéster o similar a fosfodiéster interno. Es importante destacar que la inclusión de incluso un enlace internucleotídico YZ de fosfodiéster o similar a fosfodiéster interno a menudo puede ser ventajosa sobre ningún enlace internucleotídico YZ de fosfodiéster o similar a fosfodiéster interno. Además del número de enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster, la posición a lo largo de la longitud del oligonucleótido también puede afectar la potencia.

Los oligonucleótidos blandos y semiblandos generalmente incluirán, además de los enlaces internucleotídicos de fosfodiéster o similares a fosfodiéster en posiciones internas preferidas, extremos 5' y 3' que son resistentes a la degradación. Dichos extremos resistentes a la degradación pueden implicar cualquier modificación adecuada que dé como resultado un aumento de la resistencia contra la digestión con exonucleasas sobre los correspondientes extremos no modificados. Por ejemplo, los extremos 5' y 3' se pueden estabilizar mediante la inclusión de al menos una modificación de fosfato de la estructura principal. En una realización preferida, al menos una modificación de fosfato de la estructura principal en cada extremo es independientemente un enlace internucleotídico de fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato o metilfosforotioato. En otra realización, el extremo resistente a la degradación incluye una o más unidades nucleotídicas conectadas por enlaces de péptido o amida en el extremo 3'.

Un enlace internucleotídico de fosfodiéster es el tipo de enlace característico de los oligonucleótidos que se encuentran en la naturaleza. El enlace internucleotídico de fosfodiéster incluye un átomo de fósforo flanqueado por dos átomos de oxígeno puente y unido también por dos átomos de oxígeno adicionales, uno cargado y el otro sin carga. Se prefiere particularmente el enlace internucleotídico de fosfodiéster cuando es importante reducir la vida media del tejido del oligonucleótido o conseguir la inducción más fuerte posible de la secreción de IFN tipo I a partir de pDC.

Un enlace internucleotídico similar a fosfodiéster es un grupo puente que contiene fósforo que es química y/o diastereoméricamente similar al fosfodiéster. Las medidas de similitud con el fosfodiéster incluyen la susceptibilidad a la digestión por nucleasa y la capacidad para activar la ARNasa H. Por tanto, por ejemplo, los oligonucleótidos con fosfodiéster, pero no con fosforotioato, son susceptibles a la digestión con nucleasas, mientras que los oligonucleótidos con fosfodiéster y fosforotioato activan la ARNasa H. En una realización preferida el enlace internucleotídico similar fosfodiéster es el enlace boranofosfato (o, de manera equivalente, boranofosfonato). Patente de Estados Unidos No.

5,177,198; Patente de Estados Unidos No. 5,859,231; Patente de Estados Unidos No. 6,160,109; Patente de Estados Unidos No. 6,207,819; Sergueev at al., (1998) JAm Chem Soc 120:9417-27. En otra realización preferida, el enlace intemudeotídico similar a fosfodiéster es fosforotioato Rp diastereoméricamente puro. Se considera que el fosforotioato de Rp diastereoméricamente puro es más susceptible a la digestión por nucleasas y es mejor para activar la ARNasa H que el fosforotioato de Sp mezclado o diastereoméricamente puro. Los estereoisómeros de oligonucleótidos CpG son el tema de la solicitud PCT publicada WO 00/06588. Cabe señalar que, para los fines de la presente invención, el término “enlace internucleotídico similar a fosfodiéster” excluye específicamente los enlaces internucleotídicos de fosforoditioato y metilfosfonato.

Como se describió anteriormente, los oligonucleótidos blandos y semiblandos de la invención pueden tener enlaces similares a fosfodiéster entre C y G. Un ejemplo de enlace similar a fosfodiéster es un enlace fosforotioato en una conformación Rp. La quiralidad p del oligonucleótido puede tener efectos aparentemente opuestos sobre la actividad inmunitaria de un oligonucleótido CpG, dependiendo del punto de tiempo en el que se mide la actividad. Krieg et al., Oligonucleotides 2003 13(6): 491-499. En un punto de tiempo inicial de 40 minutos, el estereoisómero Rp, pero no el Sp, del oligonucleótido CpG de fosforotioato induce la fosforilación de JNK en las células del bazo de ratón. Por el contrario, cuando se ensaya en un punto de tiempo tardío de 44 h, el estereoisómero Sp pero no el Rp es activo para estimular la proliferación de células del bazo. Esta diferencia en la cinética y bioactividad de los estereoisómeros Rp y Sp no es el resultado de ninguna diferencia en la captación celular, pero es más probable que se deba a dos funciones biológicas opuestas de la p-quiralidad. En primer lugar, la actividad mejorada del estereoisómero Rp en comparación con Sp para estimular las células inmunitarias en puntos de tiempo tempranos indica que el Rp puede ser más eficaz para interactuar con el receptor CpG, TLR9, o inducir las rutas de señalización en dirección descendente. Por otro lado, la degradación más rápida de los oligonucleótidos Rp PS en comparación con el Sp da como resultado una duración mucho más corta de la señalización, por lo que los oligonucleótidos Sp PS parecen ser más activos biológicamente cuando se prueban en puntos de tiempo posteriores, probablemente debido a la mayor resistencia a nucleasa del enlace Sp, que proporcionó una señal más sostenida a través de TLR9 para la proliferación de células B.

Por tanto, los oligonucleótidos pueden ser heterogéneos en la composición de la estructura principal, conteniendo de esta manera cualquier combinación posible de unidades poliméricas unidas entre sí.

El término “oligonucleótido” también abarca oligonucleótidos con sustituciones o modificaciones, tales como en los azúcares. Por ejemplo, incluyen oligonucleótidos que tienen azúcares de estructura principal que están unidos covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 2' y distintos de un grupo fosfato o grupo hidroxi en la posición 5'. Por tanto, los oligonucleótidos modificados pueden incluir un grupo ribosa 2'-O-alquilado. Además, los oligonucleótidos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa o 2'-fluoroarabinosa en lugar de ribosa.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores de la presente invención pueden abarcar diversas modificaciones y sustituciones químicas, en comparación con el ARN y el ADN naturales, que implican un puente internucleotídico de fosfodiéster o una unidad 13-D-ribosa. Los expertos conocen ejemplos de modificaciones químicas y se describen, por ejemplo, en Uhlmann E et al. (1990) Chem Rev 90:543; “Protocols for Oligonucleotides and Analogs” Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke S T et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-129; and Hunziker J et al. (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Un oligonucleótido de acuerdo con la invención puede tener una o más modificaciones, en la que cada modificación se localiza en un puente internucleotídico de fosfodiéster particular y/o en una unidad de p-D-ribosa particular en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencia que está compuesto de ADN o ARN natural.

Por ejemplo, la invención se refiere a un oligonucleótido que puede comprender una o más modificaciones y en el que cada modificación se selecciona independientemente de: a) el reemplazo de un puente internucleotídico de fosfodiéster ubicado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleótido por un puente internucleotídico modificado; b) el reemplazo del puente fosfodiéster ubicado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleótido por un puente defosfo; c) el reemplazo de una unidad de fosfato de azúcar de la estructura principal de fosfato de azúcar por otra unidad; y d) el reemplazo de una unidad de p-D-ribosa por una unidad de azúcar modificada.

Ejemplos más detallados para la modificación química de un oligonucleótido son los siguientes:

Un puente internucleotídico de fosfodiéster ubicado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleótido se puede reemplazar por un puente internucleotídico modificado, en el que el puente internucleotídico modificado se selecciona, por ejemplo, de fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, fosfonato de a-hidroxibencilo, éster de fosfato-(Ci-C²¹)-O-alquilo, fosfato-éster de [arilo (C⁶-C¹²)-(C¹-C²¹)-O-alquilo], puentes de alquilfosfonato (C-i-Ca) y/o arilfosfonato (C⁶-C¹²), (C⁷-C¹²)-a-hidroximetil-arilo (por ejemplo, divulgado en el documento WO 95/01363), en el que el arilo (C⁶-C¹²), arilo (C6-C²⁰) y arilo (C⁶-C¹⁴) están opcionalmente sustituidos con halógeno, alquilo, alcoxi, nitro, ciano, y donde R1 y R2 son, independientemente uno del otro, hidrógeno, alquilo (C¹-C¹⁸), arilo (C⁶-C²⁰), arilo (C⁶-C¹⁴)-alquilo (C¹-C⁸), preferiblemente hidrógeno, alquilo (C¹-C⁸), preferiblemente alquilo (C¹-C⁴) y/o metoxietilo, o R1 y R2 forman, junto con el átomo de nitrógeno que los lleva, un anillo heterocíclico de 5-6 miembros que puede contener adicionalmente un heteroátomo adicional del grupo O, S y N.

El reemplazo de un puente fosfodiéster ubicado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleótido por un puente defosfo (los puentes defosfo se describen, por ejemplo, en Uhlmann E and Peyman A in “Methods in Molecular Biology”, Vol. 20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs”, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, pp. 355 ff), en el que un puente defosfo se selecciona, por ejemplo, del formacetal de puentes defosfo, grupos 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilendimetil-hidrazo, dimetilenosulfona y/o sililo.

Una unidad de fosfato de azúcar (es decir, un puente internucleotídico de p-D-ribosa y fosfodiéster juntos forman una unidad de fosfato de azúcar) de la estructura principal de fosfato de azúcar (es decir, una estructura principal de fosfato de azúcar está compuesta de unidades de fosfato de azúcar) se puede reemplazar por otra unidad, en la que la otra unidad es adecuada, por ejemplo, para construir un oligómero “derivado de morfolino” (como se describe, por ejemplo, en Stirchak EP et al. (1989) Oligonucleotides Res 17: 6129-41), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad de derivado de morfolino; o para construir un oligonucleótido de poliamida (“PNA”; como se describe, por ejemplo, en Nielsen PE et al. (1994) Bioconjug Chem 5: 3-7), es decir, por ejemplo, el reemplazo por una unidad de estructura principal de PNA, por ejemplo, por 2-aminoetilglicina.

Una unidad de 3-ribosa o una unidad de p-D-2'-desoxirribosa se puede reemplazar por una unidad de azúcar modificada, en la que la unidad de azúcar modificada se selecciona, por ejemplo, de p-D-ribosa, a-D-2'-desoxirribosa, L-2'-desoxirribosa, 2'-F-2'-desoxirribosa, 2'-Farabinosa, 2'-O-alquilo (C-i-C6)-ribosa, preferiblemente 2'-O-alquilo (C-i-C6)-ribosa es 2'-O-metilribosa, 2'-O-alquenilo (C²-C⁶)-ribosa, 2'-[O-alquilo (C-i-C6)-O-alquilo (C-i-C6)]-ribosa, 2'-NH2-2'-desoxirribosa, p-D-xilo-furanosa, a-arabinofuranosa, 2,4-didesoxi-p-D-eritro-hexo-piranosa y carbocíclico (descrito, por ejemplo, en Froehler J (1992) J Am Chem Soc 114: 8320) y/o análogos de azúcar de cadena abierta (descritos, por ejemplo, en Vandendriessche et al. (1993) Tetrahedron 49: 7223) y/o análogos de biciclosazúcar (descritos, por ejemplo, en Tarkov M et al. (1993) Helv Chim Acta 76: 481).

En algunas realizaciones, el azúcar es 2'-O-metilribosa, particularmente para uno o ambos nucleótidos unidos por un enlace internucleotídico de fosfodiéster o similar a fosfodiéster.

En las secuencias particulares descritas en el presente documento se define un conjunto de bases modificadas. Por ejemplo, la letra Y se utiliza para referirse a un nucleótido que contiene una citosina o una citosina modificada. Una citosina modificada como se utiliza en el presente documento es un análogo de base de pirimidina de origen natural o no natural de citosina que puede reemplazar esta base sin alterar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las citosinas modificadas incluyen, pero no se limitan a, citosinas 5-sustituidas (por ejemplo, 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-clorocitosina, 5-bromo-citosina, 5-yodo-citosina, 5-hidroxicitosina, 5-hidroximetil-citosina, 5-difluorometil-citosina y 5-alquinilcitosina no sustituida o sustituida), citosinas 6- sustituidas, citosinas sustituidas con N4 (por ejemplo, N4-etil-citosina), 5-aza-citosina, 2-mercapto -citosina, isocitosina, pseudoisocitosina, análogos de citosina con sistemas de anillos condensados (por ejemplo, N,N'-propilen citosina o fenoxazina) y uracilo y sus derivados (por ejemplo, 5-fluorouracilo, 5-bromo-uracilo, 5-bromovinilo-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-hidroxi-uracilo, 5-propinil-uracilo). Algunas de las citosinas preferidas incluyen 5-metil-citosina, 5-fluoro-citosina, 5-hidroxicitosina, 5-hidroximetil-citosina y N4-etil-citosina. En otra realización de la invención, la base de citosina está sustituida por una base universal (por ejemplo, 3-nitropirrol, base P), un sistema de anillo aromático (por ejemplo, fluorobenceno o difluorobenceno) o un átomo de hidrógeno (dSpacer).

La letra Z se utiliza para referirse a guanina o una base de guanina modificada. Una guanina modificada como se utiliza en el presente documento es un análogo de base de purina de origen natural o no natural de guanina que puede reemplazar esta base sin alterar la actividad inmunoestimuladora del oligonucleótido. Las guaninas modificadas incluyen, pero no se limitan a, 7-deazaguanina, guanina 7-deaza-7-sustituida (tal como 7-deaza-7-alquinilguanina (C2-C6)), guanina 7-deaza-8-sustituida, hipoxantina, guaninas sustituidas con N2 (por ejemplo, N2-metil-guanina), 5-amino-3-metil-3H,6H-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2,7-diona, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina, adeninas sustituidas (por ejemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina) guanina 8-sustituida (por ejemplo, 8-hidroxiguanina y 8-bromoguanina) y 6-tioguanina. En otra realización de la invención, la base de guanina está sustituida por una base universal (por ejemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol y base K), un sistema de anillo aromático (por ejemplo, bencimidazol o dicloro-bencimidazol, amida del ácido 1-metil-1H-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) o un átomo de hidrógeno (dSpacer).

Los oligonucleótidos pueden tener uno o más extremos 5' accesibles. Es posible crear oligonucleótidos modificados que tengan dos de dichos extremos 5'. Esto se puede lograr, por ejemplo, al unir dos oligonucleótidos a través de un enlace 3'-3' para generar un oligonucleótido que tenga uno o dos extremos 5' accesibles. El enlace 3'3' puede ser un fosfodiéster, fosforotioato o cualquier otro puente internucleotídico modificado. Los métodos para lograr dichos enlaces se conocen en la técnica. Por ejemplo, dichos enlaces se han descrito en Seliger, H. et al., Oligonucleotide analogs with terminal 3'-3'-and 5'-5'-internucleotidic linkages as antisense inhibitors of viral gene expression, Nucleosides & Nucleotides (1991), 10(1-3), 469-77; y Jiang, et al., Pseudo-cyclic oligonucleotides: in vitro and in vivo properties, Bioorganic & Medicinal Chemistry (1999), 7(12), 2727-2735.

Adicionalmente, los oligonucleótidos ligados 3'3' donde el enlace entre los nucleótidos del terminal 3' no es un fosfodiéster, fosforotioato u otro puente modificado, se pueden preparar utilizando un espaciador adicional, tal como una fracción de fosfato de tri- o tetraetilenglicol (Durand, M. et al, Triple-helix formation by an oligonucleotide containing one (dA)12 and two (dT)12 sequences bridged by two hexaethylene glycol chains, Biochemistry (1992), 31(38), 9197-204, Patente de Estados Unidos No. 5,658,738, y Patente de Estados Unidos No. 5,668,265). Alternativamente, el ligador no nucleotídico se puede derivar de etanodiol, propanodiol o de una unidad de desoxirribosa abásica (dSpacer) (Fontanel, Marie Laurence et al., Sterical recognition by t 4 polynucleotide kinase of non-nucleosidic moieties 5'-attached to oligonucleotides; Oligonucleotides Research (1994), 22(11), 2022-7) utilizando química de fosforamidita estándar. Los ligadores no nucleotídicos se pueden incorporar una o varias veces, o combinarse entre sí, lo que permite ligar cualquier distancia deseable entre los extremos 3' de los dos ODN.

Los oligonucleótidos pueden ser parcialmente resistentes a la degradación (por ejemplo, están estabilizados). Una “molécula de oligonucleótido estabilizada” significará un oligonucleótido que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, mediante una exo o endonucleasa). La estabilización de oligonucleótidos se puede lograr mediante modificaciones de la estructura principal. Los oligonucleótidos que tienen enlaces fosforotioato proporcionan una protección máxima para el oligonucleótido frente a la degradación por exo y endonucleasas intracelulares. Otros oligonucleótidos modificados incluyen oligonucleótidos modificados con fosfodiéster, combinaciones de oligonucleótidos de fosfodiéster y fosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi y combinaciones de los mismos. También se ha mostrado que los oligonucleótidos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en uno o en ambos terminales, son sustancialmente resistentes a la degradación por nucleasa. Los ODN circulares están protegidos contra la degradación de exonucleasas. Por ejemplo, el doble inmunomodulador tallo-bucle Mologen MGN1703 (anteriormente dSLIM-30L1) es un oligonucleótido de estructura principal de fosfodiéster que contiene CpG, en forma de pesa de 116 nucleótidos cerrado covalentemente que tiene la secuencia 5'-AGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCG TTCTTAGGTGGTAACCCCTAGGGGTTACCACCTTCATTGGAAAACGTTCTTCGGG GCGTTCTT-3' (SEQ ID NO:501). Schmidt M et al., Allergy 200661: 56-63; Kapp, K et al., Mol Ther Nucleic Acids 20143: e170.

Los oligonucleótidos inmunoestimuladores también pueden contener uno o más enlaces inusuales entre las fracciones de nucleótidos o análogos de nucleótidos. El enlace internucleosídico habitual es un enlace 3'5'. Se considera que todos los demás enlaces son enlaces internucleosídicos inusuales, tales como enlaces 2'5', 5'5', 3'3', 2'2', 2'3'. La nomenclatura 2' a 5' se elige de acuerdo con el átomo de carbono de la ribosa. Sin embargo, si se emplean fracciones de azúcar no naturales, tales como análogos de azúcar de anillo expandido (por ejemplo, hexanosa, ciclohexeno o piranosa) o análogos de azúcar bi- o tricíclicos, entonces esta nomenclatura cambia de acuerdo con la nomenclatura del monómero. En los análogos de 3'-desoxi-p-D-ribopiranosa (también denominados p-ADN), los mononucleótidos están conectados, por ejemplo, mediante un enlace 4'2'.

Si el oligonucleótido contiene un enlace 3'3', entonces este oligonucleótido puede tener dos extremos 5' no ligados. De manera similar, si el oligonucleótido contiene un enlace 5'5', entonces este oligonucleótido puede tener dos extremos 3' no ligados. La accesibilidad de los extremos no ligados de los nucleótidos puede ser más accesible por sus receptores. Ambos tipos de enlaces inusuales (3'3'- y 5'5') fueron descritos por Ramalho Ortigao et al. (Antisense Research and Development (1992) 2, 129-46), por lo que se informó que los oligonucleótidos que tienen un enlace 3'3' muestran una estabilidad mejorada frente a la escisión por nucleasas.

También se pueden combinar diferentes tipos de enlaces en una molécula, lo que puede conducir a la ramificación del oligómero. Si una parte del oligonucleótido está conectada en el extremo 3' a través de un enlace 3'3' a una segunda parte del oligonucleótido y en el extremo 2' a través de un enlace 2'3' a una tercera parte de la molécula, esto da como resultado, por ejemplo, un oligonucleótido ramificado con tres extremos 5' (3'3'-, 2'3' ramificados).

III. Inhibidores del punto de control

A. PD-1

El receptor de muerte programada 1 (PD-1), también conocido como CD279, es una proteína de membrana de tipo 1 expresada en células T activadas (incluidas células T CD8+), células B y macrófagos. Sus ligandos análogos son PD-L1 y PD-L2, y la unión de PD-1 particularmente por PD-L1 bloquea la “Señal 3” en las células T e inhibe de manera potente el brazo efector de una respuesta inmunitaria adaptativa, por ejemplo, al llevar a la muerte de células T que expresan PD-1.

En humanos, PD-1 es un polipéptido de 268 aminoácidos que tiene una secuencia de aminoácidos publicada como GenBank Accession No. NP_005009. La proteína incluye un dominio IgV extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular que tiene dos sitios de fosforilación.

El Kd para la interacción entre PD-1 y PD-L1 es 770 nM.

En realizaciones preferidas de la invención, el anticuerpo inhibe la unión entre PD-1 y PD-L1. Preferiblemente, el anticuerpo puede inhibir la unión con PD-L1 con una IC⁵⁰ de aproximadamente 100 nM o menos; más preferiblemente, aproximadamente 10 nM o menos, por ejemplo, aproximadamente 5 nM o menos; aún más preferiblemente, aproximadamente 2 nM o menos; o incluso más preferiblemente, por ejemplo, aproximadamente 1 nM o menos.

Adicionalmente, en otra realización, el anticuerpo anti-PD-1 tiene una afinidad de unión para PD-1 que es al menos tan fuerte como la de PD-L1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 tiene una afinidad de unión para PD-1 que es al menos 10 veces más fuerte que la de PD-L1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 tiene una afinidad de unión para PD-1 que es al menos 100 veces más fuerte que la de PD-L1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 tiene una afinidad de unión para PD-1 que es al menos 1,000 veces más fuerte que la de PD-L1.

Los anticuerpos anti-PD-1 son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellos divulgados en la Patente de Estados Unidos No. 6,808,710 otorgada a Wood et al., Patente de Estados Unidos No. 7,488,802 otorgada a Collins et al., y Patente de Estados Unidos No. 8,728,474 otorgada a Honjo et al. Los anticuerpos anti-PD-1 están disponibles comercialmente como pembrolizumab (anteriormente conocido como lambrolizumab y MK-3475, KEYTRUDA®, Merck, Kd 29 pM) y nivolumab (OPDIVO®, Bristol-Myers Squibb, Kd 2.6 nM). Anticuerpos anti-PD-1 adicionales actualmente bajo desarrollo incluyen pidilizumab (CT-011, Cure Tech).

E. Origen de los anticuerpos

Aunque se pueden preferir los anticuerpos anti-PD-1 discutidos previamente en el presente documento, el experto en la técnica, basándose en la divulgación proporcionada en el presente documento, apreciará que la invención abarca una amplia variedad de anticuerpos anti-PD-1 y no se limita a estos anticuerpos particulares. Más particularmente, aunque se prefieren los anticuerpos humanos para uso en humanos, la invención no se limita de ninguna manera a los anticuerpos humanos; más bien, la invención abarca anticuerpos útiles independientemente del origen de la especie e incluye, entre otros, anticuerpos quiméricos humanizados y/o primatizados. También, aunque algunos de los anticuerpos ejemplificados en el presente documento se obtuvieron utilizando un mamífero transgénico, por ejemplo, un ratón que comprende un repertorio inmunitario humano, el experto en la materia, basándose en la divulgación proporcionada en el presente documento, comprenderá que la presente invención no se limita a un anticuerpo producido por este o por cualquier otro método particular. En su lugar, la invención incluye un anticuerpo anti-PD-1 producido por cualquier método, que incluye, pero no se limita a, un método conocido en la técnica (por ejemplo, cribado de bibliotecas de presentación de fagos y similares) o que se desarrollará en el futuro para producir un anticuerpo anti-PD-1 de la invención. Basado en la extensa divulgación proporcionada en el presente documento y en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6,682,736 otorgada a Bedian et al., y la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2002/0088014, un experto en la técnica puede producir e identificar fácilmente un anticuerpo anti-PD-1 útil para el tratamiento del cáncer en combinación con un ODN de CpG de clase A utilizando los nuevos métodos divulgados en el presente documento.

La presente invención abarca anticuerpos humanos producidos utilizando un mamífero no humano transgénico, es decir, XenoMouse ™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) como se divulga en la Patente de Estados Unidos No. 6,682,736, otorgada a Hanson et al.

Otro sistema de ratón transgénico para la producción de anticuerpos “humanos” se denomina “HuMAb-Mouse™” (Medarex, Princeton, N.J.), que contiene el miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (mu y gamma) y ligera kappa humana no reordenada, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de cadenas mu y kappa (Lonberg et al. Nature 368: 856-859 (1994), y Patente de Estados Unidos No. 5,770,429).

Sin embargo, la invención utiliza anticuerpos humanos anti-PD-1 producidos utilizando cualquier mamífero transgénico tal como, pero no limitado a, Kirin TC Mouse™ (Kirin Beer Kabushiki Kaisha, Tokio, Japón) como se describe en, por ejemplo, Tomizuka et al., Proc Natl Acad Sci USA 97:722 (2000); Kuroiwa et al., Nature Biotechnol 18:1086 (2000); Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2004/0120948, otorgada a Mikayama et al.; y e1HuMAb-Mouse™ (Medarex, Princeton, N.J.) y XenoMouse™ (Abgenix, Inc., Fremont, Calif ), supra. Por tanto, la invención abarca el uso de un anticuerpo anti-PD-1 producido utilizando cualquier animal transgénico o no humano.

Más aún, aunque el método preferido para producir un anticuerpo anti-PD-1 humano comprende la generación de los anticuerpos utilizando un mamífero transgénico no humano que comprende un repertorio inmunitario humano, la presente invención no se limita de ninguna manera a este enfoque. Más bien, como apreciaría un experto en la técnica una vez armado con la divulgación proporcionada en el presente documento, la invención abarca utilizar cualquier método para la producción de un anticuerpo humano, o cualquier otro anticuerpo específico para PD-1 producido de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica o se desarrollará en el futuro para la producción de anticuerpos que se unan específicamente a un antígeno de interés

Los anticuerpos humanos se pueden desarrollar mediante métodos que incluyen, pero no se limitan a, el uso de bibliotecas de anticuerpos de presentación en fagos.

En otra realización, los anticuerpos empleados en los métodos de la invención no son completamente humanos, sino “humanizados”. En particular, los anticuerpos de murino o de otras especies se pueden “humanizar” o “primatizar” utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Winter and Harris Immunol. Today 14:43-46 (1993), Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992), y Patente de Estados Unidos No. 4,816,567, otorgada a Cabilly et al., y Mage and Lamoyi en Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. (1987).

Como se apreciará en base a la divulgación proporcionada en el presente documento, los anticuerpos para uso en la invención se pueden obtener de un mamífero no humano transgénico y los hibridomas derivados del mismo, pero también se pueden expresar en estirpes celulares distintas de los hibridomas.

Las estirpes celulares de mamíferos disponibles como anfitriones para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen muchas estirpes celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que incluyen, pero no se limitan a células de ovario de hámster chino (CHO), NS0, células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS) y células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2). También se pueden emplear células procariotas y eucariotas no mamíferas, que incluyen células bacterianas, de levadura, de insectos y vegetales.

Se pueden utilizar varios sistemas de expresión bien conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitarse a, aquellos descritos en, por ejemplo, Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (2002). Estos sistemas de expresión incluyen sistemas basados en dihidrofolato reductasa (DHFR), entre muchos otros. El sistema de expresión de la glutamina sintetasa se discute en su totalidad o en parte en relación con las patentes europeas números EP 0216846, EP 0256055, EP 0323997 y EP 0338841. En una realización, el anticuerpo utilizado se fabrica en células NS0 que utilizan un sistema de glutamina sintetasa (GS-NS0). En otra realización, el anticuerpo se produce en células CHO utilizando un sistema DHFR. Ambos sistemas son bien conocidos en la técnica y se describen, entre otros, en Barnes et al. Biotech & Bioengineering 73: 261-270 (2001), y las referencias citadas en el mismo.

Se puede preferir la mutagénesis dirigida al sitio del dominio CH2 del anticuerpo para eliminar la glicosilación con el fin de prevenir cambios en las funciones de inmunogenicidad, farmacocinética y/o efectoras resultantes de la glicosilación no humana. Además, el anticuerpo se puede desglicosilar mediante métodos enzimáticos (véase, por ejemplo, Thotakura et al. Meth. Enzymol. 138: 350 (1987)) y/o métodos químicos (véase, por ejemplo, Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys.

259: 52 (1987)).

Adicionalmente, la invención abarca el uso de un anticuerpo anti-PD-1 que comprende un patrón de glicosilación alterado. El experto en la materia apreciaría, basándose en la divulgación proporcionada en el presente documento, que se puede modificar un anticuerpo anti-PD-1 para comprender sitios de glicosilación adicionales, menos o diferentes en comparación con el correspondiente anticuerpo inalterado. Dichas modificaciones se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nos. 2003/0207336 y 2003/0157108, y las Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 01/81405 y 00/24893.

Adicionalmente, la invención comprende utilizar un anticuerpo anti-PD-1 independientemente de la glicoforma, si la hubiera, presente en el anticuerpo. Más aún, los métodos para remodelar extensamente la glicoforma presente en una glicoproteína son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 03/031464, WO 98/58964 y WO 99/22764, y Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nos. 2004/0063911, 2004/0132640, 2004/0142856, 2004/0072290 y la Patente de Estados Unidos No. 6,602,684 otorgada a Umana et al.

Adicionalmente, la invención abarca el uso de un anticuerpo anti-PD-1 con cualquier modificación covalente y no covalente conocida en la técnica, que incluye, pero no se limita a, ligar el polipéptido a una de una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida, por ejemplo, en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos Nos. 2003/0207346 y 2004/0132640, y las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; y 4,179,337.

Adicionalmente, la invención abarca el uso de un anticuerpo anti-PD-1, o una porción de unión a antígeno del mismo, una proteína quimérica que comprende, por ejemplo, un polipéptido de albúmina de suero humano o un fragmento del mismo. Ya sea que la proteína quimérica se produzca utilizando métodos recombinantes, por ejemplo, mediante la clonación de un ácido nucleico quimérico que codifica la proteína quimérica, o mediante el enlace químico de las dos porciones de péptidos, el experto en la técnica comprenderá una vez que se cuente con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que dichas proteínas quiméricas son bien conocidas en la técnica y pueden conferir propiedades biológicas deseables tales como, pero sin limitarse a, mayor estabilidad y semivida en suero al anticuerpo de la invención y, por lo tanto, dichas moléculas se incluyen en el presente documento.

Los anticuerpos que se generan para uso en la invención no necesitan poseer inicialmente un isotipo deseado particular. Por el contrario, el anticuerpo tal como se genera puede poseer cualquier isotipo y se puede cambiar de isotipo a partir de entonces utilizando técnicas convencionales. Éstas incluyen técnicas recombinantes directas (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4,816,397), y técnicas de fusión célula-célula (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,916,771).

Se puede cambiar la función efectora de los anticuerpos de la invención al cambiar el isotipo a una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM para diversos usos terapéuticos. Adicionalmente, la dependencia del complemento para la eliminación celular se puede evitar mediante el uso de, por ejemplo, biespecíficos, inmunotoxinas o radiomarcadores.

IV. Inmunoterapia de combinación de ADN CpG e inhibidor de punto de control

La presente invención se refiere a una combinación de inmunoterapia tumoral que comprende la administración local de ODN de CpG de clase A en un tumor canceroso o en sus proximidades, y la administración sistémica de un inhibidor del punto de control, tal como un anticuerpo anti-PD-1, para tratar el cáncer. Se ha informado de un único ensayo clínico en humanos en el que los pacientes fueron tratados con una combinación de ODN de CpG (clase B, dosificado por vía subcutánea hasta 0.15 mg/kg/semana) y un anticuerpo anti-CTLA-4 (Millward M et al., Br. J. Cancer 2013 108(10): 19982004). Este estudio estableció una MTD para una combinación semanal de anti-CTLA-4 intravenoso y CpG subcutáneo durante 12 semanas de terapia en 21 pacientes con melanoma en estadio IV. Aunque los resultados del estudio no se consideraron lo suficientemente alentadores como para justificar el desarrollo continuo de agonistas de TLR9 en oncología (se terminó todo el desarrollo de fármacos inmuno-oncológicos por parte del patrocinador), varios hallazgos interesantes del estudio apoyan la utilidad de la presente invención. En primer lugar, la combinación de un agonista de TLR9 y un inhibidor del punto de control se tolera relativamente bien: no se observó enfermedad autoinmune sistémica y solo tres pacientes desarrollaron toxicidades limitantes de la dosis durante el período inicial preespecificado de 6 semanas, dos de los cuales estaban en el grupo de dosis más alta del anticuerpo anti-CTLA-4. En segundo lugar, no hubo inducción de respuesta de anticuerpos contra el anticuerpo anti-CTLA-4 del régimen de combinación. En tercer lugar, dos pacientes lograron respuestas parciales al tratamiento y varios otros tenían una enfermedad estable inusualmente prolongada.

La combinación de ODN de CpG de clase A que induce altos niveles de IFN y anti-PD-1 es útil para el tratamiento de cánceres primarios y secundarios (es decir, metastásicos). Más específicamente, entre muchas opciones de tratamiento potenciales, la terapia de combinación de ADN CpG de clase A y anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede utilizar para tratar el cáncer. En ciertas realizaciones, el cáncer que se va a tratar es o incluye un tumor canceroso. Un “tumor canceroso” como se utiliza en el presente documento se refiere a una hinchazón anormal o una colección macroscópica de células que comprenden células anormales caracterizadas por su crecimiento o proliferación sin regulación por señales externas normales. En ciertas realizaciones, un tumor canceroso es un carcinoma, sarcoma o adenocarcinoma; a veces se les denomina tumores sólidos. En ciertas realizaciones, un tumor canceroso excluye las neoplasias malignas hematológicas. En ciertas realizaciones, un tumor canceroso incluye determinadas neoplasias hematológicas, por ejemplo, linfomas.

Los cánceres representativos tratables mediante los métodos de la invención incluyen específicamente, sin limitación, cánceres de piel, cabeza y cuello, esófago, estómago, hígado, colon, recto, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, ovario, riñón, vejiga, próstata, tiroides, cerebro, músculos y huesos. También se incluyen específicamente entre los cánceres tratables mediante los métodos de la invención el melanoma, carcinoma de células renales y cáncer de pulmón de células no microcíticas (NSCLC). También se incluyen específicamente entre los cánceres tratables mediante los métodos de la invención el linfoma, cáncer de médula ósea, tumor carcinoide y neuroblastoma.

Aunque en algunas realizaciones se prefieren los cánceres anteriores, la presente invención se refiere al tratamiento de una amplia variedad de trastornos proliferativos de células malignas, que incluyen, pero no se limitan a, sarcoma de Kaposi, sarcoma sinovial, mesotelioma, hepatobiliares (conductos hepáticos y biliares), un tumor cerebral primario o secundario, cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), cáncer de huesos, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intraocular, cáncer de la región anal, cáncer de estómago (gástrico), cáncer gastrointestinal (gástrico, colorrectal y duodenal), cáncer de colon, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de vagina, carcinoma de vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de uretra, cáncer de próstata, cáncer de pene, cáncer de testículos, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o de uréter, carcinoma de pelvis renal, cánceres de páncreas, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), que incluyen tumor primario o secundario del SNC, tumores del eje espinal, glioma de tronco encefálico, glioblastoma, meningioma, mioblastoma, astrocitoma, adenoma pituitario, cáncer adrenocortical, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma, fibrosarcoma, neuroblastoma y retinoblastoma; así como, en algunas realizaciones, linfoma no Hodgkin (LNH, que incluye indolente y agresivo), linfoma de Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, linfomas linfocíticos, linfoma primario del SNC, leucemia mieloide crónica o aguda, leucemia linfocítica crónica o aguda, eritroblastoma y mieloma múltiple; o una combinación de dos o más de los cánceres anteriores.

Los cánceres que se van a tratar pueden ser cánceres recurrentes. Un cáncer refractario, como se utiliza en el presente documento, es un cáncer que es resistente al estándar de atención habitual prescrito. Estos cánceres pueden parecer inicialmente que responden a un tratamiento (y luego reaparecer), o pueden no responder por completo al tratamiento. El estándar de atención habitual variará según el tipo de cáncer y el grado de progresión del sujeto. Puede ser quimioterapia, inmunoterapia, cirugía, radiación o una combinación de las mismas. Los expertos en la técnica conocen estos estándares de cuidado. Por tanto, los sujetos que están siendo tratados de acuerdo con la invención para un cáncer refractario ya pueden haber estado expuestos a otro tratamiento para su cáncer. Alternativamente, si es probable que el cáncer sea refractario (por ejemplo, Dado un análisis de las células cancerosas o la historia del sujeto), entonces es posible que el sujeto no haya estado ya expuesto a otro tratamiento.

En ciertas realizaciones, los cánceres recurrentes incluyen cánceres que son recurrentes al tratamiento con un inhibidor del punto de control. Los cánceres de este tipo a veces se denominan “resfríos”. Los métodos de la presente invención se pueden utilizar para tratar dichos cánceres o tumores “fríos” para convertirlos en cánceres “calientes”, es decir, cánceres o tumores que responden al tratamiento, que incluye el tratamiento con un inhibidor de punto de control, incluso el mismo inhibidor de punto de control.

Ejemplos de cánceres recurrentes incluyen, pero no se limitan a, melanomas, carcinomas de células renales, cáncer de colon, cánceres de hígado (hepático), cáncer de páncreas, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón y leucemias.

El ADN de CpG de clase A y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para uso en un método de tratamiento de un tumor canceroso de la invención en ciertos casos puede ser útil para reemplazar procedimientos quirúrgicos o terapias de fármacos existentes, aunque en otros casos la presente invención es útil para mejorar la eficacia de las terapias existentes para tratar dichas afecciones. De acuerdo con lo anterior, la terapia de combinación se puede utilizar para tratar sujetos que están experimentando o que se someterán a un tratamiento para el cáncer. Por ejemplo, se pueden administrar los agentes a un sujeto en combinación con otra terapia antiproliferativa (por ejemplo, una anticancerígena). Las terapias contra el cáncer adecuadas incluyen procedimientos quirúrgicos para eliminar la masa tumoral, quimioterapia o radiación localizada. La otra terapia antiproliferativa puede administrarse antes, al mismo tiempo o después del tratamiento con la combinación CpG ODN/c Pi de la invención. También puede haber un retraso de varias horas, días y, en algunos casos, semanas entre la administración de los diferentes tratamientos, de modo que la combinación CpG ODN/CPI se puede administrar antes o después del otro tratamiento. La invención contempla adicionalmente el uso de la combinación CpG ODN/CPI en sujetos con cáncer antes y después de la cirugía, radiación o quimioterapia.

En una realización, la invención proporciona un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, produciendo o aumentando una respuesta antitumoral, en la que el ODN de CpG de clase A mejora una respuesta antitumoral por una cantidad de anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo que, por lo demás, es subóptima para inducir el mismo nivel de respuesta antitumoral cuando se utiliza solo. En ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A no se utiliza junto con un anticuerpo anti-PD-1 para provocar una respuesta antitumoral, la administración del ODN de CpG de clase A solo no produce ni aumenta la respuesta antitumoral. En realizaciones alternativas, tanto el ODN de CpG de clase A como el anticuerpo anti-PD-1 pueden provocar una respuesta antitumoral solos y/o cuando se administran en combinación.

En una realización, la invención proporciona un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, produciendo o aumentando un antitumoral, en el que el ODN de CpG de clase A mejora una respuesta antitumoral por una cantidad de anticuerpo que por lo demás es subóptima para inducir el mismo nivel de respuesta antitumoral cuando se utiliza solo. En ciertas realizaciones, cuando el ODN de CpG de clase A no se utiliza junto con un anticuerpo anti-PD-1 para provocar una respuesta antitumoral, la administración de ODN de CpG de clase A solo no produce ni aumenta la respuesta antitumoral. En realizaciones alternativas, tanto el ODN de CpG de clase A como el anticuerpo anti-PD-1 pueden provocar una respuesta antitumoral solos y/o cuando se administran en combinación.

En ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A puede potenciar los efectos del anticuerpo Anti-PD-1 (o viceversa) de forma aditiva. En una realización preferida, el ODN de CpG de clase A potencia los efectos del anticuerpo anti-PD-1 (o viceversa) de una manera sinérgica. En otra realización, el anticuerpo anti-PD-1 potencia el efecto de un ODN de CpG de clase A de forma aditiva. Preferiblemente, los efectos se potencian de manera sinérgica. Por tanto, en ciertas realizaciones, la invención abarca ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para uso en métodos de tratamiento o prevención de enfermedades que proporcionan mejores perfiles terapéuticos de los esperados basados en la administración del ODN de CpG de clase A solo y el anticuerpo anti-PD-1 solo.

En ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A puede potenciar los efectos del anticuerpo anti-PD-1 (o viceversa) de forma aditiva. En una realización preferida, el ODN de CpG de clase A potencia los efectos del anticuerpo anti-PD-1 (o viceversa) de una manera sinérgica. En otra realización, el anticuerpo anti-PD-1 potencia el efecto del ODN de CpG de clase A de una manera aditiva. Preferiblemente, los efectos se potencian de manera sinérgica. Por tanto, en ciertas realizaciones, la invención abarca un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para uso en métodos de tratamiento o prevención de enfermedades que proporcionan mejores perfiles terapéuticos de los esperados basados en la administración de un ODN de CpG de clase A solo y un anticuerpo anti-PD-1 solo.

En ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A se administra con un anticuerpo anti-PD-1 (con o sin otras modalidades tales como radioterapia) como parte de un régimen terapéutico neoadyuvante para lograr un efecto antitumoral que hace posible la cirugía curativa.

En ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A se administra junto con un anticuerpo anti-PD-1 (con o sin otras modalidades tal como radioterapia) después de la resección quirúrgica de un tumor primario o metastásico o en el contexto de una enfermedad mínima residual para prevenir la recurrencia del tumor.

También se abarcan en la invención las terapias de combinación que tienen una potencia aditiva o un efecto terapéutico aditivo al tiempo que reducen o evitan los efectos no deseados o adversos. La invención también abarca combinaciones sinérgicas en las que la eficacia terapéutica es mayor que la aditiva, mientras que los efectos no deseados o adversos se reducen o evitan. En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para uso en los métodos de la invención permiten el tratamiento o la prevención de enfermedades y trastornos en los que el tratamiento se mejora mediante una respuesta antitumoral mejorada utilizando dosis más bajas y/o menos frecuentes de ODN de CpG de clase A y/o anticuerpo anti-PD-1 para reducir la incidencia de efectos no deseados o adversos provocados por la administración de ODN de CpG de clase A solo y/o anti-PD-1 anticuerpo solo, mientras se mantiene o mejora la eficacia del tratamiento, preferiblemente aumentando el cumplimiento del paciente, mejorando la terapia y/o reduciendo los efectos no deseados o adversos.

La invención proporciona un agonista de TLR9 que es un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para uso en un método de tratamiento de un tumor canceroso, en el que el ADN de CpG de clase A se administra en el tumor o junto al mismo; y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra por vía sistémica.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A tiene una secuencia proporcionada como: 5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG- 3' (SEQ ID NO:82).

En ciertas realizaciones el ADN de CpG de clase A es un ADN de CpG circular con una estructura principal nativa, por ejemplo, mgN1703.

En ciertas realizaciones el ADN de CpG de clase A es un ADN de CpG nativo no modificado administrado en una formulación que comprende una nanopartícula, VLP, ISCOM u otro vehículo de suministro resistente a nucleasas. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a TIM3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a LAG3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo que se une específicamente a PD-1 y a PD-L1. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo que se une específicamente a PD-1 y a TIM3. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo que se une específicamente a PD-1 y a LAG3. En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A se administra antes de la administración del anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A y el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo se administran sustancialmente al mismo tiempo.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un linfoma o un tumor canceroso de un tejido seleccionado del grupo que consiste en piel, cabeza y cuello, esófago, estómago, hígado, colon, recto, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, ovario, riñón, vejiga, próstata, tiroides, cerebro, músculos y huesos.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es melanoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es linfoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un cáncer de la médula ósea.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un tumor carcinoide.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es neuroblastoma.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 son para uso en un método que comprende adicionalmente la administración de radioterapia al sujeto, dicha radioterapia inicia antes de la administración del ADN de CpG de clase A.

En ciertas realizaciones, la radioterapia es radioterapia hipofraccionada.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A tiene una secuencia proporcionada como: 5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG- 3' (SEQ ID NO:82).

En ciertas realizaciones el ADN de CpG de clase A es un ADN de CpG circular con una estructura principal nativa, por ejemplo, mgN1703.

En ciertas realizaciones el ADN de CpG de clase A es un ADN de CpG nativo no modificado administrado en una formulación que comprende una nanopartícula, VLP, ISCOM u otro vehículo de suministro resistente a nucleasas. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende (i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende (i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a TIM3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende (i) un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, y (ii) un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a LAG3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo que se une específicamente a PD-1 y a PD-L1.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo que se une específicamente a PD-1 y a TIM3.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 comprende un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno biespecífico del mismo que se une específicamente a PD-1 y a LAG3.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A se administra antes de la administración del anticuerpo anti-PD-1. En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A y el anticuerpo anti-PD-1 se administran sustancialmente al mismo tiempo.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un linfoma o un tumor canceroso de un tejido seleccionado del grupo que consiste en piel, cabeza y cuello, esófago, estómago, hígado, colon, recto, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, ovario, riñón, vejiga, próstata, tiroides, cerebro, músculos y huesos.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es melanoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es linfoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un cáncer de la médula ósea.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un tumor carcinoide.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es neuroblastoma.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A y anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 son para uso en un método que utiliza adicionalmente un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A tiene una secuencia proporcionada como: 5'-GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG- 3' (SEQ ID NO:82).

En ciertas realizaciones el ADN de CpG de clase A es un ADN de CpG circular con una estructura principal nativa, por ejemplo, mgN1703.

En ciertas realizaciones el ADN de CpG de clase A es un ADN de CpG nativo no modificado administrado en una formulación que comprende una nanopartícula, VLP, ISCOM u otro vehículo de suministro resistente a nucleasas. En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A se administra antes de la administración del primer CPI.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A y el anticuerpo anti-PD-1 se administran sustancialmente al mismo tiempo.

En ciertas realizaciones, el ADN de CpG de clase A se administra después de la administración del anticuerpo anti-PD-1.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un linterna o un tumor canceroso de un tejido seleccionado del grupo que consiste en piel, cabeza y cuello, esófago, estómago, hígado, colon, recto, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, ovario, riñón, vejiga, próstata, tiroides, cerebro, músculos y huesos.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es melanoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es linfoma.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un cáncer de la médula ósea.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es un tumor carcinoide.

En ciertas realizaciones, el tumor canceroso es neuroblastoma.

En ciertas realizaciones, el sujeto es un humano.

En ciertas realizaciones, el método incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de radioterapia (XRT). Las dosis estándar de XRT están en el rango de 1.8 a 2.2 Gy/día, pero estudios recientes indican que los efectos inmunitarios de XRT sobre los tumores se pueden incrementar mediante el uso de XRT en dosis de 3-20 Gy/d durante 1­ 3 días. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que los diferentes tumores tienen diferentes niveles de radiosensibilidad y de acuerdo con lo anterior, ajustarán la cantidad e intensidad de la XRT.

En ciertas realizaciones, la radioterapia es radioterapia hipofraccionada.

V. Terapia combinada adicional

Los métodos de la invención se pueden utilizar junto con otras terapias contra el cáncer, que incluyen quimioterapia, otra inmunoterapia, radioterapia, terapia hormonal y similares. Se han desarrollado productos quimioterapéuticos convencionales y agentes antineoplásicos dirigidos en base a la noción simplista de que el cáncer constituye una enfermedad genética o epigenética autónoma de células. Sin embargo, cada vez está más claro que muchos de los fármacos contra el cáncer disponibles que han salvado en conjunto millones de años de vida median en los efectos terapéuticos provocando de novo o reactivando respuestas inmunitarias específicas de tumores preexistentes. La evidencia acumulada indica que la eficacia terapéutica de varios agentes antineoplásicos se basa en su capacidad para influir en la interacción tumor-anfitrión, inclinando la balanza hacia la activación de una respuesta inmunitaria específica para células malignas.

Por ejemplo, la Tabla 1 enumera ciertos agentes anticancerosos aprobados por la FDA cuya eficacia se ve reducida por deficiencias inmunitarias (Zitvogel L. et al., Immunity 201339 (1): 74-88).

Tabla 1

VI. Regímenes de dosificación

Los regímenes de dosificación se pueden ajustar para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de preparación de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Por tanto, el experto en la técnica apreciaría, en base a la divulgación proporcionada en el presente documento, que la dosis y el régimen de dosificación se ajustan de acuerdo con métodos bien conocidos en las técnicas terapéuticas. Es decir, la dosis máxima tolerable se puede establecer fácilmente y también se puede determinar la cantidad eficaz que proporciona un beneficio terapéutico detectable a un paciente, así como los requisitos temporales para administrar cada agente para proporcionar un beneficio terapéutico detectable al paciente. De acuerdo con lo anterior, aunque en el presente documento se ejemplifican ciertos regímenes de dosis y administración, estos ejemplos no limitan en modo alguno la dosis y el régimen de administración que se pueden proporcionar a un paciente en la práctica de la presente invención. Adicionalmente, un experto en la técnica entendería, una vez armado con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, que un beneficio terapéutico, tal como, pero no limitado a, una disminución detectable en el tamaño del tumor y/o metástasis, y un mayor tiempo hasta la recurrencia, entre muchos otros parámetros, se pueden evaluar mediante una amplia variedad de métodos conocidos en la técnica para evaluar la eficacia del tratamiento del cáncer, y estos métodos se abarcan en el presente documento, así como los métodos que se desarrollarán en el futuro.

Se debe observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se va a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Se debe entender adicionalmente que, para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se deben ajustar a lo largo del tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación establecidos en el presente documento son solo de ejemplo y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada. Por ejemplo, las dosis se pueden ajustar en base a los parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos, que pueden incluir efectos clínicos tales como efectos tóxicos y/o valores de laboratorio. Por tanto, la presente invención abarca el incremento de dosis intrapaciente según lo determine el experto en la materia. La determinación de las dosis y regímenes apropiados para la administración del compuesto o compuestos activos es bien conocida en la técnica relevante y el experto en la materia entenderá que está comprendida una vez que se proporcionen las enseñanzas divulgadas en el presente documento.

Dosificación de ODN de CpG

De acuerdo con los métodos de la presente invención, el ODN de CpG de clase A se administra localmente al tumor canceroso, es decir, mediante administración intratumoral o peritumoral. Alternativamente o además, en ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A se administra localmente al tumor canceroso mediante, por ejemplo, inyección o infusión intraperitoneal o instilación intravesicular.

La mayor parte de la técnica anterior con CpG utilizaba administración subcutánea, no intratumoral o peritumoral. La terapia intratumoral en oncología generalmente se prefiere solo para el tratamiento de lesiones primarias, no en la situación de enfermedad metastásica. La razón de esto es que la mayoría de las terapias intratumorales solo tienen un efecto local. En algunos casos inusuales, las terapias intratumorales pueden conducir a la regresión de masas tumorales distantes como resultado de la inducción de una respuesta inmunitaria específica contra antígenos tumorales presentes no solo en la lesión inyectada, sino también en metástasis distantes. En el caso de la radioterapia (XRT), esto se ha denominado “efecto abscopal” como se describió anteriormente. Algunos autores han observado casos en los que los agonistas de TLR han inducido efectos abscopales, que incluyen TLR9 intratumoral (Brody et al, J. Clin. Oncol. 201028 (28): 4324-4332; Kim et al., Blood 2012119 (2): 355-363), pero estas respuestas han sido poco comunes y generalmente de breve duración.

Los efectos inmunitarios de XRT administrados antes de la administración de ODN de CpG interrumpirán los mecanismos inhibidores que normalmente limitan la eficacia de la respuesta inducida por CpG, aumentando el potencial de respuesta clínica. Además, se ha asociado la producción de IFN-a en el tumor con una respuesta mejorada a la XRT y es necesaria para ella (Burnette et al, Cancer Res. 2011 71:2488-2496), lo que proporciona más evidencia del beneficio del uso de CpG de IFN alto intratumoral después de XRT.

En una forma, la presente invención mejora la inducción de respuestas abscopales de XRT al administrar XRT, preferiblemente XRT hipofraccionada (como se describe en Prasanna et al.), a un paciente con cáncer y luego administrar un IFN elevado intratumoral o peritumoral que induce ODN de CpG de clase A en la misma región o drenaje linfático. Las inyecciones peritumorales preferidas se encuentran en el mismo drenaje linfático que el tumor, para facilitar que las mismas APC estén expuestas tanto al Ag tumoral liberado después de la XRT al tumor como al ligando TLR.

Los métodos de suministro intratumoral o peritumoral de ODN de CpG de clase A incluyen no solo inyección directa, sino que también pueden incluir administración tópica intraperitoneal para tumores abdominales tales como ovárico, pancreático, colon o gástrico), intraocular para neoplasias oculares, oral para el cáncer gástrico e intestinal y administración intravesicular para el cáncer de vejiga. También se contempla para la administración intratumoral de ODN de CpG de clase A la administración sistémica utilizando vehículos de administración de tumores tales como aptámeros dirigidos a tumores, conjugados de anticuerpos, nanopartículas, ISCOMS, VLP, vesículas multilaminares, péptidos sensibles al pH y péptidos catiónicos.

Para la administración intratumoral o peritumoral, la dosis de ODN de CpG de clase A es normalmente fija. Las dosis de ODN de CpG de clase A para suministro parenteral (que incluyen intratumoral y peritumoral) para inducir una respuesta inmunitaria cuando se administra ODN de CpG de clase A en combinación con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 normalmente varían de aproximadamente 1 |jg a 100 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se podrían administrar diariamente, semanalmente o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos.

En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 10 jg hasta aproximadamente 100 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 100 jg hasta aproximadamente 100 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 10 mg hasta aproximadamente 100 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos.

En aún otras realizaciones, las dosis de ODN de CpG de clase A para suministro parenteral (que incluye intratumoral y peritumoral) para inducir una respuesta inmunitaria cuando se administra ODN de CpG de clase A en combinación con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 normalmente varían desde 1 jg hasta aproximadamente 50 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal 0 mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 10 jg hasta aproximadamente 50 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 100 jg hasta aproximadamente 50 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 1 mg hasta aproximadamente 50 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 10 mg hasta aproximadamente 50 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos.

En aún otras realizaciones, las dosis de ODN de CpG de clase A para suministro parenteral (que incluye intratumoral y peritumoral) para inducir una respuesta inmunitaria cuando se administra ODN de CpG de clase A en combinación con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, normalmente varían desde 1 jg hasta aproximadamente 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 10 jg hasta aproximadamente 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diariamente, semanalmente, o mensualmente y cualquier otra cantidad de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 100 jg hasta aproximadamente 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 1 mg hasta aproximadamente 10 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos.

En aún otras realizaciones, las dosis de ODN de CpG de clase A para suministro parenteral (que incluye intratumoral y peritumoral) para inducir una respuesta inmunitaria cuando se administra ODN de CpG de clase A en combinación con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, normalmente varían desde 1 |jg hasta aproximadamente 1 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 10 jg hasta aproximadamente 1 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos. En ciertas realizaciones, las dosis de sujetos de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 100 jg hasta aproximadamente 1 mg por administración, que dependiendo de la aplicación se puede dar diaria, semanal o mensualmente y cualquier otro período de tiempo entre ellos.

Para cada una de las dosis fijas descritas anteriormente, en ciertas realizaciones, la dosis se administrará en un volumen menor o igual a aproximadamente 1 ml. En ciertas realizaciones, la dosis se administrará en un volumen de aproximadamente 0.1 ml hasta aproximadamente 1 ml. En otras realizaciones, el volumen de la dosis será de hasta 4 ml, que se utiliza comúnmente para la inyección intratumoral de ciertos virus oncolíticos, tales como talimogén laherparepvec (T-vec).

En ciertas realizaciones de la invención, un sistema de suministro de liberación sostenida, que incluye, por ejemplo, nanopartículas, ISCOMS, VLP y dendrímeros (revisado, por ejemplo, en Gomes Dos Santos AL et al., Curr Pharm Biotechnol. 20056(1): 7-15; Joshi VB et al., AAPS J. 2013 15(1): 85-94; y Arima H et al., Curr Top Med Chem.2014 14(4): 465-77), se puede utilizar para administrar una única dosis terapéutica intratumoral o peritumoral del ODN de CpG de clase A. En ciertas realizaciones de la invención, se puede utilizar un sistema de suministro de liberación sostenida, que incluye, por ejemplo, nanopartículas, ISCOMS, v Lp y dendrímeros, para administrar una única dosis terapéutica intratumoral o peritumoral del ODN de CpG de clase A, sin que se requiere ODN de CpG de clase A adicional.

Como es bien conocido en la técnica, las dosis individuales se incrementan cuando se utiliza un sistema de suministro de liberación sostenida de cualquiera de los tipos bien descritos en la literatura.

En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 500 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1r; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones utilizando una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto x Rt como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 500 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 500 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1.

En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varían desde 0.1 mg hasta aproximadamente 250 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 250 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 250 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 250 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1.

En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 100 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 100 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto x Rt como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1. En ciertas realizaciones que utilizan una única administración de una formulación de liberación sostenida de ODN de CpG de clase A, la dosis del sujeto de ODN de CpG de clase A para suministro intratumoral y peritumoral normalmente varía desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 100 mg por administración, y se da dentro de una semana de XRT; dentro de una semana de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1; o dentro de una semana de tanto XRT como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1.

El efecto clínico deseado de la dosis administrada de ODN CpG de clase A puede seguirse fácilmente usando ensayos y métodos estándar bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las respuestas de los biomarcadores a la estimulación de TLR9 se pueden medir como se describe en otra parte del presente documento.

Dosificación de anticuerpos CPI

Ciertos anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente están aprobados actualmente en los Estados Unidos para dosificación por infusión intravenosa a 2 mg/kg de peso corporal una vez cada tres semanas. Otros anticuerpos anti-PD-1 disponibles comercialmente están aprobados actualmente en los Estados Unidos para la dosificación de infusión intravenosa a 3 mg/kg de peso corporal una vez cada dos semanas.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra, al menos en parte, sistémicamente, por ejemplo, por vía intravenosa.

Dosis ejemplares, no limitantes para una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 administrado sistémicamente de acuerdo con la invención son: al menos aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0.3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 0.5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 4 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal y al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal.

En determinadas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de anticuerpo administrado sistémicamente o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 puede oscilar entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 3 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-lis administrado sistémicamente a una dosis de al menos aproximadamente 0.3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, al menos 10 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, o al menos aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-lis administrado por infusión intravenosa (iv) a una dosis que varía de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 0.3 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 15 mg/kg de peso corporal.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-lis administrado en una formulación intravenosa como una solución acuosa estéril que contiene aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg/ml de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, en un sistema tampón apropiado.

De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra, en parte, localmente al tumor canceroso, es decir, mediante administración intratumoral o peritumoral. En ciertas realizaciones, dicha administración local es por inyección directa, mientras que en otras realizaciones de dicha administración puede ser administración tópica, administración intraperitoneal para tumores abdominales tales como ovario, pancreático, administración intraocular para tumores malignos oculares, administración oral para tumores gástricos y cáncer intestinal y administración intravesicular para el cáncer de vejiga. También se contempla la administración intratumoral de anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la administración sistémica de PD-lis utilizando vehículos de administración tumoral tales como aptámeros, nanopartículas, ISCOMS, VLP y péptidos catiónicos dirigidos a tumores.

Para la administración local, es decir, intratumoral o peritumoral, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se puede administrar ventajosamente a una dosis de aproximadamente 10 veces menor a aproximadamente 20 veces menor que la dosis sistémica recién enumerada anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la dosificación de PD-1 será típicamente menos frecuente que la dosificación de ODN de CpG de clase A. Por ejemplo, el anticuerpo anti-PD-1 se puede administrar aproximadamente una vez cada tres semanas hasta aproximadamente una vez cada tres meses. La invención contempla además específicamente un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la dosificación de PD-1 que es más frecuente que aproximadamente una vez cada tres semanas y menos frecuente que aproximadamente una vez cada tres meses.

La CpG de clase A intratumoral o peritumoral y el anticuerpo sistémico o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 pueden administrarse en el mismo día o en días diferentes.

Además, un protocolo de escalamiento de dosis ejemplar con respecto a ODN de CpG de clase A, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, o ambos, puede usarse para determinar la dosis máxima tolerada (MTD), para evaluar la toxicidad limitante de la dosis (DLT), si la hubiera, asociada con la administración de la terapia de combinación. Por ejemplo, con respecto al aumento de la dosis de anticuerpo anti-PD-1 a una dosis dada de ODN CpG de clase A, dicho protocolo puede comprender la administración de dosis crecientes, tales como, pero no limitadas a aproximadamente 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, o más de 15 mg/kg, o cualquier combinación de los mismos, más preferiblemente, se administran dosis sucesivas de 0.1 mg/kg, 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 6 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg o 20 mg/kg y se evalúa la toxicidad del paciente, si la hubiera, así como la eficacia del tratamiento, entre otros parámetros. Dichos estudios para determinar la toxicidad y eficacia de los regímenes de dosis son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Millward M. et al., Br. J. Cancer 2013108 (10): 1998-2004.

VII. Composiciones farmacéuticas

En ciertas realizaciones, el ODN de CpG de clase A se formula con un marcador, por ejemplo, un marcador o colorante radiopaco, que facilita la visualización de la administración de ODN de CpG de clase A en y/o adyacente al tumor a ser tratado. Alternativamente, el ODN de CpG de clase A se conjuga covalentemente o se marca de otro modo con un compuesto que permite la detección del área de administración. Los ejemplos de dichos marcadores son bien conocidos en la técnica e incluyen tintes fluorescentes, aptámeros, ARN fluorescentes tales como espinaca y sus derivados, puntos cuánticos, oro y otras nanopartículas, anticuerpos, etc.

Los ODN de CpG de clase A pueden administrarse directamente al sujeto o pueden administrarse junto con un complejo de administración de ácido nucleico. Un complejo de administración de ácido nucleico significará una molécula de ácido nucleico asociada con (por ejemplo, unida iónica o covalentemente a, o encapsulada dentro) un medio de direccionamiento (por ejemplo, una molécula que resulta en una unión de mayor afinidad a la célula diana. Ejemplos e complejos de administración de ácido nucleico incluyen oligonucleótidos asociados con un esterol (por ejemplo, colesterol), un lípido (por ejemplo, un lípido catiónico, virosoma o liposoma) o un agente de unión específico de la célula diana (por ejemplo, un ligando reconocido por el receptor específico de la célula diana). Los complejos preferidos pueden ser suficientemente estable in vivo para evitar un desacoplamiento significativo antes de la internalización por la célula diana. Sin embargo, el complejo se puede escindir en condiciones apropiadas dentro de la célula de modo que el ácido nucleico se libere en una forma funcional.

Se han descrito vehículos de administración o dispositivos de administración para administrar oligonucleótidos y/o antígenos a superficies. El ODN de CpG de clase A y/o el antígeno y/u otros agentes terapéuticos pueden administrarse solos (por ejemplo, en solución salina o tampón) o usando cualquier vehículo de administración conocido en la técnica. Por ejemplo, se han descrito los siguientes vehículos de suministro: cocleatos; Emulsomas, ISCOM; Liposomas; Vectores bacterianos vivos (por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus); Vectores virales vivos (por ejemplo, Vaccinia, adenovirus, herpes simple); Microesferas; Vacunas de oligonucleótidos; Polímeros; Anillos de polímero; Proteosomas; Fluoruro de sodio; Plantas transgénicas; Virosomas; Partículas similares a virus y lípidos catiónicos, péptidos u otros vehículos que tienen una interacción de carga con el oligonucleótido polianiónico. Se conocen en la técnica otros vehículos de suministro y se proporcionan algunos ejemplos adicionales a continuación en la discusión de los vectores.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra por vía parenteral (por ejemplo, Intravenosamente) en una solución acuosa mientras que el ODN de CpG de clase A se administra mediante inyección intratumoral o peritumoral. Las formulaciones y formas de dosificación preferidas del CpG ODN de clase A se describen en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. US 2004/0198680. Sin embargo, el experto en la materia comprenderá, basándose en la descripción proporcionada en este documento, que la invención no se limita a estas u otras formulaciones, dosis, vías de administración y similares. Por lo tanto, la siguiente discusión describe varias formulaciones para practicar los métodos de la invención que comprenden la administración de cualquier anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se una específicamente a PD-1 en combinación con un ODN de CpG de clase A, pero la invención no se limita a estos formulaciones, pero comprende cualquier formulación que pueda ser determinada fácilmente por un experto en la técnica una vez armado con las enseñanzas proporcionadas en este documento para su uso en los métodos de la invención.

Los anticuerpos empleados en la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, trehalosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo o la porción de anticuerpo.

Los anticuerpos pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica previstos. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las utilizadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el anticuerpo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y el secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

El ODN de CpG de clase A se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, inyección local o infusión en y/o adyacente a un tumor. Como se usa en el presente documento, “en un tumor” o “intratumoral” significa cualquier lugar generalmente dentro de los márgenes de un tumor. Como se usa en este documento, “adyacente a un tumor” o “peritumoral” significa cualquier lugar generalmente dentro de una zona de aproximadamente 2.5 cm de espesor que rodea los márgenes de un tumor. La invención también contempla la inyección o infusión local del CpG ODN de clase A en y/o adyacente a un lecho tumoral después de la resección quirúrgica de un tumor. Puede emplearse una inyección sin aguja, si se desea. En determinadas realizaciones, el ODN de CpG de clase A puede administrarse localmente al pulmón mediante inhalación o lavado broncoalveolar. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, oral, parenteral, mucosal, por inhalación, tópico, bucal, nasal. y rectal. Para ciertas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración preferido es subcutánea, intramuscular, intravenosa o infusión. Puede emplearse una inyección sin aguja, si se desea. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

Se pueden ajustar los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta óptima deseada. Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del anticuerpo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se va a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de preparar tal un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Debe observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección a aliviar, y pueden incluir dosis únicas o múltiples. Debe entenderse además que, para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos se pueden ajustar con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación establecidos en este documento son ejemplares. únicamente y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

En una realización, el anticuerpo se administra en una formulación intravenosa como una solución acuosa estéril que contiene 5 o 10 mg/ml de anticuerpo, con acetato de sodio, polisorbato 80 y cloruro de sodio a un pH que varía de aproximadamente 5 a 6. Preferiblemente, la formulación intravenosa es una solución acuosa estéril que contiene 5 o 10 mg/ml de anticuerpo, con acetato de sodio 20 mM, polisorbato 800.2 mg/ml y cloruro de sodio 140 mM a pH 5.5.

En una realización, parte de la dosis se administra mediante un bolo intravenoso y el resto mediante infusión de la formulación de anticuerpo. Por ejemplo, se puede administrar una inyección intravenosa de 0.01 mg/kg del anticuerpo como un bolo, y el resto de una dosis de anticuerpo predeterminada se puede administrar mediante inyección intravenosa. Puede administrarse una dosis predeterminada del anticuerpo, por ejemplo, durante un período de una hora y media a dos horas a cinco horas.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un vehículo o uno o más de otros ingredientes accesorios, y luego, si es necesario o deseable, dar forma o empaquetar el producto en una unidad deseada de dosis única o múltiple.

Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, empaquetarse o venderse a granel, como una sola dosis unitaria o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se usa en este documento, una “dosis unitaria” es una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad de ingrediente activo es generalmente igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de tal dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosis.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el portador farmacéuticamente aceptable y cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de la invención variarán, dependiendo de la identidad, tamaño y condición del sujeto tratado y dependiendo además de la ruta por la que la composición se va a administrar. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre un 0.1 % y un 100 % (p/p) de ingrediente activo.

Además del ingrediente activo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender además uno o más agentes farmacéuticamente activos adicionales. Los agentes adicionales particularmente contemplados incluyen antieméticos, antidiarreicos, agentes quimioterapéuticos, citocinas y similares.

Las formulaciones de liberación controlada o sostenida de una composición farmacéutica de la invención se pueden preparar usando tecnología convencional.

Como se usa en este documento, “administración parenteral” de una composición farmacéutica incluye cualquier vía de administración caracterizada por la ruptura física de un tejido de un sujeto y la administración de la composición farmacéutica a través de la ruptura en el tejido. Por tanto, la administración parenteral incluye, pero no se limita a, la administración de una composición farmacéutica mediante la inyección de la composición, mediante la aplicación de la composición a través de una incisión quirúrgica, mediante la aplicación de la composición a través de una herida no quirúrgica que penetra en el tejido y similares. En particular, se contempla que la administración parenteral incluya, pero no se limita a, técnicas de infusión dialítica intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracisternal y renal.

Las formulaciones de una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral comprenden el ingrediente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o solución salina isotónica estéril. Tales formulaciones pueden prepararse, empaquetarse o venderse en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las formulaciones inyectables se pueden preparar, envasar o vender en forma de dosificación unitaria, como en ampollas o en recipientes multidosis que contienen un conservante. Las formulaciones para administración parenteral incluyen, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables como se describe a continuación. Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales que incluyen, pero no se limitan a, agentes de suspensión, estabilizantes o dispersantes. En una realización de una formulación para administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (por ejemplo, polvo o granular) para reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida.

Una composición de la presente invención puede administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegen al compuesto contra la liberación rápida, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se describen, por ejemplo, en Sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida y controlada, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1978). Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferiblemente en condiciones GMP.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar o vender en forma de una suspensión o solución acuosa u oleosa inyectable estéril. Esta suspensión o solución puede formularse de acuerdo con la técnica conocida y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes o agentes de suspensión descritos en este documento. Tales formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando un diluyente o disolvente aceptable por vía parenteral no tóxico, tal como agua o 1,3-butanodiol, por ejemplo. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero no se limitan a, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro de sodio y aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones administrables por vía parenteral que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica o como componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble.

Los componentes de ingrediente activo de ODN de CpG de clase A y anticuerpo anti-PD-1 de la invención se pueden administrar a un animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ser humano. La dosis precisa administrada de cada ingrediente activo variará dependiendo de cualquier número de factores, incluidos, entre otros, el tipo de animal y el tipo de enfermedad que se está tratando, la edad del animal y la (s) vía (s) de administración.

Los componentes del ingrediente activo del anticuerpo CpG ODN y anti-PD-1 de clase A de la invención pueden coadministrarse con cualquiera de otros numerosos compuestos (agentes de terapia antihormonal, citocinas, anticuerpos anti-citocina o anticuerpos anti-receptor de citocina, inhibidores de la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) o triptófano 2,3-dioxigenasa (TDO), fármacos quimioterápicos, antibióticos y/o antivirales, entre muchos otros). Alternativamente, tales otros compuestos pueden administrarse una hora, un día, una semana, un mes o incluso más, antes de la combinación de ODN de CpG de clase A - anticuerpo anti-PD-1, o cualquier permutación de la misma. Además, dichos otros compuestos pueden administrarse una hora, un día, una semana o incluso más, después de la administración de radiación, trasplante de células madre o administración de cualquier agente terapéutico (por ejemplo, Citocina, compuesto quimioterapéutico y similares), o cualquier permutación de los mismos. La frecuencia y el régimen de administración serán evidentes para el experto en la materia y dependerán de cualquier número de factores tales como, entre otros, el tipo y la gravedad de la enfermedad que se está tratando, la edad y el estado de salud del animal, la identidad del compuesto o compuestos que se administran, la vía de administración de los diversos compuestos y similares. Se proporcionan varios ejemplos instructivos que demuestran métodos de coadministrar una combinación de ODN CpG de clase A - anticuerpo anti-PD-1 para tratar el cáncer, pero la invención no se limita de ninguna manera a estos ejemplos, que simplemente sirven para ilustrar los métodos abarcados por la invención.

VIII. KITS

Una cantidad terapéuticamente eficaz de CpG ODN de clase A y una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, puede proporcionarse como un kit, junto con materiales de instrucción que describen el uso de la combinación para realizar los métodos de la invención. En determinadas realizaciones, los kits comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de ODN CpG de clase A y una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, junto con materiales de instrucción que describen el uso de la combinación para realizar los métodos de la invención. Aunque a continuación se describen kits ejemplares, el contenido de otros kits útiles será evidente para el experto en la materia a la luz de la presente divulgación. Cada uno de estos kits está incluido dentro de la invención.

Además, el kit puede comprender una amplia plétora de agentes adicionales para el tratamiento del cáncer. Dichos agentes se exponen previamente e incluyen compuestos quimioterapéuticos, vacunas contra el cáncer, agonistas de TLR distintos de ODN de CpG, otros ODN de CpG, inhibidores de tirosina quinasa del receptor (tales como, pero sin limitarse a, SU11248), agentes útiles para tratar el crecimiento celular anormal o cáncer, anticuerpos u otros ligandos que inhiben el crecimiento tumoral al unirse a IGF-1R, un agente quimioterapéutico (taxano, alcaloide vinca, compuesto de platino, antibióticos intercalantes, entre muchos otros), y citocinas, entre muchos otros, así como agentes paliativos para tratar, por ejemplo, cualquier toxicidad que surja durante el tratamiento, tales como, pero sin limitarse a, un antidiarreico, un antiemético y similares.

Habiendo descrito ahora la presente invención en detalle, la misma se entenderá más claramente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen aquí con fines ilustrativos únicamente y no pretenden ser limitantes de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Para lograr una sinergia óptima para una combinación de un CpG ODN y un inhibidor del punto de control (+/- XRT), el CpG ODN debe diseñarse para inducir el nivel máximo de IFN tipo I posible, con el nivel más bajo de IL -10 posibles. De las clases CpG ODN descritas anteriormente, la más cercana a este ideal es la clase A. Para mejorar el ODN de clase A, pueden entenderse en términos de dos componentes semiindependientes: (i) los terminales 5' y 3' del ODN CpG de clase A, y (ii) el palíndromo central. El propósito de los dominios polyG en los terminales 5' y 3' es formar tétradas G que se autoensamblan en nanopartículas, posicionando los palíndromos de una manera favorable para activar t LR9 y proporcionar una multimerización muy fuerte de TLR9 en los endosomas tempranos, lo que lleva a fuerte activación de IRF3/7 (y secreción de IFN-a en dirección descendente de la cadena) sin desencadenar una señal más sostenida que conduciría a la activación de células B y una fuerte producción de IL-10. Las tétradas G formadas por los dominios poliG también pueden ayudar a estabilizar el ODN extracelularmente y mejorar la captación de ODN en las células dendríticas (DC) y otras APC al interactuar con receptores de barrido y otros receptores de la superficie celular que se unen a las tétradas G. Los dominios polyG a menudo tienen uno o unos pocos enlaces PS en los extremos 5' y 3', pero esto no es necesario para la estimulación de alto nivel de la secreción de pDC IFN-a, especialmente si se aumenta la dosis o si el ODN se administra mediante una formulación estabilizadora, como una nanopartícula, VLP, ISCOM o similares. El propósito del palíndromo es formar un dúplex fuera de la célula, estabilizando una estructura que será absorbida eficazmente por la DC objetivo en los endosomas y luego activará TLR9 de manera transitoria para inducir IRF3/7 sin una fuerte activación de NF-kB.

Optimización de los terminales 5' y 3' de ODN de clase A

1. Número de Gs. Los ODN de clase A descritos en la técnica anterior casi siempre contienen 5 o más G consecutivos en ambos extremos, o al menos en un extremo. Sin embargo, esto no es necesario para la actividad de ODN y, de hecho, la inclusión de menos G hace que el ODN sea mucho más fácil de sintetizar y no necesariamente impacta drásticamente la cantidad de IFN-a inducida. De acuerdo con la presente invención, ciertos ODN de clase A preferidos tienen 4 G en uno o ambos extremos, mientras que otros ODN de clase A preferidos tienen más de 6 G, 10 G o más de 10 G en los extremos 5' y 3', o al menos en el extremo 3' de la ODN.

2. Número de enlaces de fosforotioato (PS). Algunos ODN de clase A descritos en la técnica anterior no contienen ningún enlace de fosforotioato, pero normalmente tienen dos enlaces internucleotídicos de fosforotioato en el extremo 5' del ODN y cinco en el extremo 3'. Si bien estos enlaces de fosforotioato estabilizan el ODN contra las nucleasas y aumentan la unión a proteínas y la absorción de la superficie celular hasta cierto punto, también introducen centros quirales y aumentan la complejidad de la fabricación. Ciertos ODN de clase A preferidos de la invención contienen 0, 1 o 2 enlaces PS en el extremo 5' y 2, 3 o 4 enlaces PS en el extremo 3'. En determinadas realizaciones, los ODN de clase A preferidos de la invención contienen 1 o 2 enlaces PS en el extremo 5' y 2, 3 o 4 enlaces PS en el extremo 3'.

3. Quiralidad de los enlaces de fosforotioato (PS). Cuando los ODN de clase A descritos en la técnica anterior tienen enlaces PS, siempre han sido estereoaleatorios. Sin embargo, los dos estereoisómeros tienen efectos inmunes bastante diferentes sobre la señalización de TLR9, como se publicó anteriormente (Krieg AM et al., Oligonucleotide 2003 13 (6): 491-9). El CpG de clase A mejorado puede tener todo R, todo S o quiralidad R y S especificada en cada posición dentro de los dominios polyG. Cuando el CpG ODN contiene cualquier enlace PS, preferiblemente al menos el extremo 3' del CpG ODN tiene un enlace Sp debido a su mayor resistencia a la degradación por nucleasa.

Optimización del palíndromo de CpG ODN de clase A

1. Posicionamiento de nucleótidos de desoxiadenosina. Los palíndromos preferidos contienen al menos una, y preferiblemente dos o más desoxiadenosinas. Estos se ubican preferiblemente en la mitad 5' del palíndromo, con la consecuencia de que las timidinas complementarias se ubican en la mitad 3' de los palíndromos preferidos (excepto que cuando las timidinas son modificadas por un halógeno, como se describe en el punto 3 siguiente, los palíndromos preferidos pueden tener desoxiadenosina o timidina en las regiones 5' o 3' o ambas del palíndromo).

2. Posición de los dinucleótidos CpG. Los palíndromos preferidos contienen al menos un dinucleótido CpG que está precedido por un 5'T y/o al menos un dinucleótido CpG precedido por un 5'A.

3. Modificaciones de nucleósidos de timidina. Hemos definido en la presente invención un nuevo tipo de ODN CpG de clase A, que ahora llamamos ODN CpG de clase A/E, que contiene no solo las características de diseño novedosas enumeradas anteriormente, sino también las modificaciones de uno o más nucleósidos de timidina. descrito anteriormente como ODN de CpG de clase E, como se describe en la patente de EE.UU. No. 8,580,268 y la solicitud publicada de EE.UU. 2014/0163213. Específicamente, los ODN CpG de clase A/E preferidos de la invención contienen un uracilo modificado con halógeno en lugar de una o más de las timidinas en el palíndromo. El uracilo modificado con halógeno es más preferiblemente 5-yodo-2'-desoxiuridina

pero también puede ser 5-bromo-2'-desoxiuridina o 5-cloro-2'-desoxiuridina.

Los ejemplos de ODN de CpG de clase A preferidos son:

ggGGGACGAGCTCGTCgggggG (SEQ ID NO:80);

ggGGGACGATCGTCGgggggG (SEQ ID NO:58);

ggGGACGATCGAACGTgggggG (SEQ ID NO:81);

ggGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG (SEQ ID NO:78); y

ggGGACGACGTCGTGgggggG (SEQ ID NO:79),

donde cada letra minúscula representa un nucleótido unido a su nucleótido adyacente en 3' mediante un enlace fosforotioato (PS); y cada letra mayúscula representa un nucleótido unido a su nucleótido adyacente 3' (si está presente) por un enlace fosfodiéster (PO), excepto que el nucleótido terminal 3' está representado por una letra mayúscula ya que no tiene 3'- nucleótido adyacente.

Los ejemplos de secuencias de ODN de CpG de clase A novedosas preferidas son:

gGGGACGATCGTCGgggG (SEQ ID NO:502);

ggGGTCGACGTACGTCGAggggG (SEQ ID NO:503);

gGGGTCGTCGACGAggggG (SEQ ID NO:504);

ggGGACGAGCTCGTCgggggG (SEQ ID NO:505);

ggGGGACGAGCTCGTCggggG (SEQ ID NO:506);

gGGGACGAGCTCGTCggggG (SEQ ID NO:507);

gGGGACGAGCTCGTCgggG (SEQ ID NO:508);

ggGGACGA TCGTCGgggggG (SEQ ID NO:77);

ggGGGACGA TCGTCGggggG (SEQ ID NO:49);

gGGGACGA TCGTCGggggG (SEQ ID NO:509);

gGGGACGA TCGTCGgggG (SEQ ID NO:502);

gGGGACGA TCGAACGTgggggG (SEQ ID NO:81);

ggGGACGA TCGAACGTggggG (SEQ ID NO:510);

gGGGACGA TCGAACGTggggG (SEQ ID NO:510);

gGGGACGA TCGAACGTgggG (SEQ ID NO:511);

gGGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG (SEQ ID NO:78);

ggGGTCGACGTCGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:512);

gGGGTCGACGTCGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:512);

gGGGTCGACGTCGACGTCGAGgggG (SEQ ID NO:513);

gGGGACGACGTCGTGgggGG (SEQ ID NO:514);

gGGGACGACGTCGTGgggggG (SEQ ID NO:79);

ggGGACGACGTCGTGggggG (SEQ ID NO:514);

gGGGACGACGTCGTGggggG (SEQ ID NO:514);

gGGGACGACGTCGTGgggG (SEQ ID NO:515); y

ggGTCGTCGACGAggggG (SEQ ID NO:516),

donde de nuevo cada letra minúscula representa un nucleótido unido a su nucleótido adyacente en 3' por un enlace fosforotioato (PS); y cada letra mayúscula representa un nucleótido unido a su nucleótido adyacente 3' (si está presente) por un enlace fosfodiéster (PO), excepto que el nucleótido terminal 3' está representado por una letra mayúscula ya que no tiene el nucleótido adyacente 3'-.

Ejemplos de secuencias ODN de CpG de clase A/E novedosas preferidas son:

gGGGACGAICGTCGgggG (SEQ ID NO:1);

gGGGACGAIATCGTCggggG (SEQ ID NO:2);

gGGGACGAGCIGCTCggggG (SEQ ID NO:3);

ggGGICACCGGTGAggggG (SEQ ID NO:4);

ggGGICGACGTACGTCGAggggG (SEQ ID NO:5);

ggGGICGACGIACGTCGAggggG (SEQ ID NO:6);

ggGGICGACGT ACGICGAggggG (SEQ ID NO:7);

ggGGICGACGIACGICGAggggG (SEQ ID NO:8);

ggGGACGICGACGTgggG (SEQ ID NO:9);

ggGGICGACGTCGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:10);

ggGGICGACGICGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:11);

ggGGICGACGTCGACGICGAGggggG (SEQ ID NO:12);

ggGGICGACGICGACGICGAGggggG (SEQ ID NO:13);

gGGGACGACGICGIGgggGG (SEQ ID NO:14);

gGGGICGTCGACGAggggG (SEQ ID NO:15);

gGGGTCGICGACGAggggG (SEQ ID NO:16);

gGGGICGICGACGAggggG (SEQ ID NO:17);

ggGGACGAGCICGTCgggggG (SEQ ID NO:18);

ggGGGACGAGCICGTCggggG (SEQ ID NO:19);

gGGGACGAGCICGTCggggG (SEQ ID NO:20);

gGGGACGAGCICGTCgggG (SEQ ID NO:21);

ggGGACGAICGTCGgggggG (SEQ ID NO:22);

ggGGGACGAICGTCGggggG (SEQ ID NO:23);

gGGGACGAICGTCGggggG (SEQ ID NO:24);

gGGGACGAICGTCGgggG (SEQ ID NO:1);

ggGGACGAICGICGgggggG (SEQ ID NO:25);

ggGGGACGAICGICGggggG (SEQ ID NO:26);

gGGGACGAICGICGggggG (SEQ ID NO:27);

gGGGACGAICGICGgggG (SEQ ID NO:28);

gGGGACGAICGAACGTgggggG (SEQ ID NO:29);

ggGGACGAICGAACGTggggG (SEQ ID NO:30);

gGGGACGAICGAACGTggggG (SEQ ID NO:30);

gGGGACGAICGAACGTgggG (SEQ ID NO:31);

gGGGACGAICGAACGIgggggG (SEQ ID NO:32);

ggGGACGAICGAACGIggggG (SEQ ID NO:33);

gGGGACGAICGAACGIggggG (SEQ ID NO:33);

gGGGACGAICGAACGIgggG (SEQ ID NO:34);

gGGGICGACGTCGACGTCGAGgggggG (SEQ ID NO:35);

ggGGICGACGTCGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:10);

gGGGICGACGTCGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:10);

gGGGICGACGTCGACGTCGAGgggG (SEQ ID NO:36);

gGGGICGACGICGACGTCGAGgggggG (SEQ ID NO:37);

ggGGICGACGICGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:11);

gGGGICGACGICGACGTCGAGggggG (SEQ ID NO:11);

gGGGICGACGICGACGTCGAGgggG (SEQ ID NO:38);

gGGGICGACGTCGACGICGAGgggggG (SEQ ID NO:39);

ggGGICGACGTCGACGICGAGggggG (SEQ ID NO:12);

gGGGICGACGTCGACGICGAGggggG (SEQ ID NO:12);

gGGGICGACGTCGACGICGAGgggG (SEQ ID NO:40);

gGGGICGACGICGACGICGAGgggggG (SEQ ID NO:41);

ggGGICGACGICGACGICGAGggggG (SEQ ID NO:13);

gGGGICGACGICGACGICGAGggggG (SEQ ID NO:13); y

gGGGICGACGICGACGICGAGgggG (SEQ ID NO:42),

donde “ I” representa 5-yodo-2'-desoxiuridina; cada letra minúscula representa un nucleótido unido a su nucleótido adyacente en 3' mediante un enlace fosforotioato (PS); y cada letra mayúscula representa un nucleótido enlazado a su nucleótido adyacente 3'-(si está presente) por un enlace fosfodiéster (PO), excepto que el nucleótido 3'-terminal está representado por una letra mayúscula ya que no tiene el nucleótido adyacente 3'-.

El ODN de CpG de clase A preferido de la presente invención se sintetizará usando métodos estándar bien conocidos en la técnica y descritos anteriormente. La actividad del ODN se evaluará utilizando ensayos in vitro de respuesta a la dosis en células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) para la secreción de IFN-a e IL-10 como se describe en las patentes A-class y Eclass (por ejemplo, Patente de EE. 8,580,268, Fig. 27 para IFN-a y Patente de Estados Unidos No. 7,795,235, Fig. 27 para IL-10). Debido a que los seres humanos muestran variación interindividual en la magnitud de la respuesta de IFN-a a la estimulación de TLR9, se analizarán PBMC de un mínimo de 3 individuos diferentes para todos los ensayos de citocinas, quimiocinas e IFN. Las PBMC recién recolectadas son fuertemente preferidas para la máxima capacidad de respuesta; después de 24 horas, la magnitud de las respuestas in vitro a la ligación de TLR9 será significativamente menor. Los ODN de CpG de clase A se prueban típicamente en PBMC humanas a concentraciones de aproximadamente 0.1 |iM a aproximadamente 10 mM. Los sobrenadantes se recogen después de aproximadamente 24, 48 o 72 horas y se prueban mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) u otro ensayo estándar para la cantidad de IFN-a (generalmente el ensayo solo mide una o más de las muchas isotermas de IFN-a) y/o otras quimiocinas y citocinas inducidas por IFN.

Los ODN de CpG de clase A y clase A/E preferidos de la invención inducirán un promedio superior a 1,000 pg/ml de IFN-a a la concentración más eficaz en el ensayo (la potencia es menos importante en este sentido que eficacia máxima), o más preferiblemente mayor de 3,000 pg/ml de IFN-a y lo más preferiblemente mayor de 10,000 pg/ml de IFN-a; en cualquier caso, los ODN preferidos inducen la producción de al menos más de 10 veces el IFN-a inducido por un ODN CpG de clase B de control positivo. Los sobrenadantes de los mismos experimentos también se analizan para la secreción de IL-10 usando ensayos ELISA similares. Los ODN de clase A o A/E preferidos de la presente invención inducirán menos de 1,000 pg/ml, preferiblemente menos de 300 pg/ml, y lo más preferiblemente menos de 100 pg/ml de secreción de IL-10 en estas condiciones de ensayo.

A continuación, se evaluará el ODN de CpG más preferido seleccionado de estos ensayos in vitro en modelos de tumores de ratón, utilizando sistemas estándar bien conocidos en la técnica. Los ensayos de ratón no se utilizan para seleccionar el ODN más activo que se utilizará en ensayos clínicos en humanos, ya que el orden de rango de los ODN será diferente, como resultado de las diferencias estructurales entre el TLR9 de ratón y humano y las diferencias específicas de especie en los tipos de células que expresan TLR9. Por estas razones, la selección primaria de un CpG ODN candidato principal para llevarlo a cabo en ensayos clínicos en humanos se basará en los resultados de los ensayos in vitro que utilizan células humanas.

Ejemplo 2

Se realizaron experimentos in vitro para examinar los efectos de los cambios en la secuencia palindrómica, el número de 5' y 3' G, el número de enlaces internucleotídicos de fosforotioato 5' y 3' y la sustitución de 5-yodo-2'-desoxiuridina dentro los palíndromos en la secreción de IFN-a por células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC).

Se cultivaron PBMC de un donante humano normal en presencia o ausencia del ODN indicado por triplicado y los resultados se representaron como media /- desviación estándar (DE) en las Figuras 4 y 5, para dos donantes humanos diferentes. Las PBMC se aislaron sobre histopaque-1077 (Sigma) y se sembraron a 1.25 x 106/ml, 220 pl/pocillo en RPMI 1640 (FBS al 10 %, glutamina, Pen/Strep) en una placa de cultivo de tejido con fondo en U de 96 pocillos. Se añadieron ODN a una concentración final de 5, 1 o 0.2 pg/ml (Fig. 4) o a una concentración más baja de 0.5 pg/ml (Fig. 5) y las células se incubaron durante 48 horas. A continuación, las células se centrifugaron y los sobrenadantes se transfirieron a placas nuevas y se congelaron a -20 °C hasta su uso. Los sobrenadantes se descongelaron posteriormente y se utilizaron para un ELISA de IFN-a (IFN-a humano de PBL Verikine) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Tabla 2. Conjunto 1 oligo CpG-A fabricados y probados

# Secuencia ODN IFN-a SEQ ID NO:

1 tcgtcgttttgtcgttttgtcgtT 2006 bajo 44

2 ggGGGACGATCGTCgggggG 2216 2+ 49

3 gGGGACGATCGTCGgggG 2216b 2+ 502

4 ggGGTCGACGTACGTCGAggggG 2301a /- 503

5 gGGGTCGTCGACGAggggG 2329a 3+ 504

6 ggGGACGAGCTCGTCgggggG 2247a 2+ 505

7 ggGGGACGAGCTCGTCggggG 2247b 2+ 517

8 gGGGACGAGCTCGTCggggG 2247c 2+ 507

9 gGGGACGAGCTCGTCgggG 2247d /- 508

10 ggGGACGATCGTCGgggggG 2255a 2+ 77

11 ggGGGACGATCGTCGggggG 2255b 2+ 49

12 gGGGACGATCGTCGggggG 2255c 2+ 509

13 gGGGACGATCGTCGgggG 2255d 2+ 502

14 gGGGTCGACGTCGACGTCGAGgggggG 2334a 2+ 78

15 ggGGTCGACGTCGACGTCGAGggggG 2334b 2+ 512

16 gGGGTCGACGTCGACGTCGAGggggG 2334c 2+ 512

17 gGGGTCGACGTCGACGTCGAGgggG 2334d 1+ 513

18 gGGGACGACGTCGTGgggGG 2336a 3+ 514

19 gGGGACGACGTCGTGgggggG 2336b 3+ 79

20 ggGGACGACGTCGTGggggG 2336c 2+ 514

21 gGGGACGACGTCGTGggggG 2336d 3+ 514

22 gGGGACGACGTCGTGgggG 2336e 3+ 515

# Secuencia ODN IFN-a SEQ ID NO:

23 ggGTCGTCGACGAggggG 2329e 2+ 516

24 gGGGACGAICGTCGgggG 2216a 2+ 1

25 ggGGICGACGTACGTCGAggggG 2301b /- 5

26 ggGGICGACGIACGTCGAggggG 2301c bajo 6

27 ggGGICGACGTACGICGAggggG 2301d bajo 7

28 ggGGICGACGIACGICGAggggG 2301e bajo 8

29 gGGGTCGTCGACGAggggG 2329a 3+ 504

30 gGGGICGTCGACGAggggG 2329b 3+ 15

31 gGGGTCGICGACGAggggG 2329c 3+ 16

32 gGGGICGICGACGAggggG 2329d 3+ 17

33 gGGGACGACGICGIGgggGG 2336b 3+ 518

34 tcgaacgttcgaacgttcgaacgttcgaat SD-101 1+ 519

#1 (ODN 2006) es CpG-B de control

#2 (ODN 2216) es CpG-A de control

#34 (ODN SD-101) es CpG-C de control

##3-23 son oligos clase A novedosos

##24-33 son oligos CpG-A que contienen 5-yodo-2'-desoxiuridina (“ I”)

minúsculas = enlace PS (otras son PO)

Los datos de este conjunto de experimentos sugieren:

Más de cuatro G en el extremo 3' del oligo confieren una buena actividad: compare, por ejemplo, ODN 2247a-c (cinco o más 3'G) con ODN 2247d (con cuatro 4G en 3' final).

Cinco G en el extremo 3' pueden ser inferiores a seis G (comparar ODN 2334d con 5G con ODN 2334a-c con seis o más 3' G).

No importa si hay uno o dos enlaces PS en el extremo 5': compare ODN 2334b (2 PS) con ODN 2334c (1 PS).

Un enlace PS en el extremo 5' parece ser superior a dos PS en el extremo 5' en al menos algunos casos: ODN 2336c es la única versión de 2336 que tiene dos enlaces PS 5' y parece ser más débil para inducción IFN-a que las otras versiones, que tienen un PS.

Siempre que haya al menos cinco G en el extremo 3', tres PS en el extremo 3' parecen ser tan fuertes como cuatro PS: compare ODN 2336a y 2336e (tres PS en el extremo 3') con ODN 2336b y 2336d con cinco o cuatro PS, respectivamente. El palíndromo presente en ODN 2301 es débil (pero aún más fuerte que el CpG-B) independientemente de otros elementos: por lo tanto, no todos los palíndromos funcionan bien.

Una o dos sustituciones de halógeno dentro del palíndromo se toleran bien en CpG-A, pero no aumentan la actividad inductora de IFN-a (por ejemplo, compare ODN 2329a con 2329b, c, d; o ODN 2336a con 2336b; o ODN 2216 a 2216a). Ejemplo 3

Se realizaron experimentos in vitro para examinar los efectos de los cambios en la secuencia palíndromo, el número de enlaces internucleotídicos de fosforotioato 5' y 3', la formulación de un ODN de CpG-A de ADN nativo en una partícula similar a virus (VLP) y la sustitución de azúcares 2-O-metílicos dentro del extremo 3' del ODN de CpG-A sobre la potencia y la secreción máxima de IFN-a por PBMC humanas.

Las condiciones experimentales fueron generalmente como en el Ejemplo 2, excepto que en este caso los ODN indicados se cultivaron con las PBMC por triplicado a las concentraciones de 5 pg/ml (concentración o “conc A” en las Figuras 6 y 7); 1 pg/ml (“conc B” en las Figuras 6 y 7) y 0.5 pg/ml (“conc C”) para todos los ODN excepto para dos muestras:

1. El ODN G10 completamente PO (etiquetado como “CYT003” en Figuras 6 y 7) se cultivó a concentraciones de ODN de 50 mg/ml (“conc A” en las Figuras 6 y 7), 10 mg/ml (“conc B”) y 2 mg/ml (“conc C”); y

2. Las muestras etiquetadas como “CytQbAb” en las Figuras 6 y 7 contenían el ODN G10 empaquetado dentro de una partícula similar a un virus que comprende la proteína del bacteriófago Qb como se describió previamente y en desarrollo clínico patrocinado por Cytos bajo el nombre CYT003 o QbG10 (Beeh et al., J Allergy Clin Immunol 2013; 131: 866-74) junto con un anticuerpo anti-Qb para facilitar la captación de VLP en las células inmunes. El VLP en estas muestras se cultivó como G10 a 50 pg/ml (“conc A” en las Figuras 6 y 7), 10 pg/ml (“conc B”) y 2 pg/ml (“conc C”), pero dado que la dosis se basó en la VLP completa, aunque solo el 20 % de la masa de la VLP comprende G10, la masa real de G10 en cada pocillo fue más cercana a 10 pg/ml (“conc A” en las Figuras 6 y 7), 2 pg/ml (“conc B”) y 0.5 pg/ml (“conc C”).

Tabla 3. Conjunto de 2 oligos CpG-A fabricados y probados

# Secuencia ODN IFN-a SEQ ID NO:

1 ggGGGACGA TCGTCgggggG 2216 2+ 49

2 gGGGACGACGTCGTGgggGG 2336a 3+ 514

3 gGGGACGACGTCGTGggggG 2336al 3+ 514

4 GGGGACGACGTCGTGGGggG 2336a2 1+ 514

5 GGGGACGACGTCGTGGGGGG 2336aPO 1+ 514

6 mGmGmGmGACGACGTCGTGmGmGmGmGmG 2336m1 débil 520

7 GGGGACGACGTCGTGGGGGmG 2336m2 neg 521

8 GGGGACGACGTCGTGGGGGgtT 2336ST 1+ 522

9 ggGGACGACGTCGTGggggG 2336c 2+ 514

10 gGGGACGACGTCGTGgggG 2336e 2+ 515

11 gGGGTCGTCGACGAggggG 2329a 2+ 504

12 GGGGTCGTCGACGAGGggG 2329a1 débil 504

13 GGGGACGACGTCGTGGGGGGmUmU 2336mU neg 523

14 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG G10 3+ 82

#1 (ODN 2216) es CpG-A de control

##2-13 son oligos clase A novedosos

minúsculas = Enlace PS (otros son PO)

mG = 2'-O-metilo G

mT= 2'-O-metilo T

Los datos de este conjunto de experimentos sugieren:

Menos de tres enlaces PS en el extremo 3' y ningún enlace PS en el extremo 5' conduce a una reducción severa en la potencia del CpG-A, pero ninguna reducción aparente en la inducción de IFN-a máxima alcanzable a la concentración más alta de o Dn (compare la inducción de IFN-a muy fuerte por ODN 2336a y 2336a1 (con tres o cuatro enlaces PS en el extremo 3', respectivamente) que era detectable incluso con solo 0.5 pg/ml para el nivel de pico muy similar de inducción de IFN-a por ODN 2336a2, 2336PO y 2336ST con enlace PS 2, 0 o 1, respectivamente.

No existe una ventaja de potencia aparente en tener más de un PS en el extremo 5' y tres PS en el extremo 3' (compare los niveles similares de actividad entre ODN 2336c y 2336e, con una diferencia de un enlace PS en ambos xtremos).

El palíndromo en ODN 2329 (TCGTCGACGA) (SEQ ID NO: 524) parece ser menos potente para la inducción de IFN-a que los palíndromos en ODN 2216 (GACGATCGTC) (SEQ ID NO: 525) o la serie ODN 2336 (ACGACGTCGT) (SEQ ID NO: 526).

El ODN de CpG-A basado en un palíndromo menos potente como el de ODN 2329 puede sufrir una reducción correspondientemente mayor en la potencia si el número de enlaces PS se reduce en los extremos 5' y 3' (comparar ODN 2329a con 2329a1, con nlaces de Ps reducidos).

La sustitución de una o más bases 2'-O-metilo en los extremos 5' y/o 3' del ODN CpG-A conduce a una reducción severa en la potencia y la inducción máxima de IFN-a alcanzable (compare los 2 -ODN O-metil-sustituido 2336m1, 2336m2 y 2336mU a las versiones originales no metiladas de ODN 2336).

La inducción de IFN-a pico más alta observada con cualquiera de los ODN fue del G10 (“CYT003” en la Fig. 6) y del VLP que contenía el G10 (“CytQbAb” en la Fig. 6). Dado que G10 es ADN nativo sin modificaciones de PS en absoluto, esto indica que la modificación de PS no es necesaria para la inducción de IFN-a, siempre que se utilicen concentraciones más altas de ODN de CpG-A o que el ODN esté empaquetado o entregado en tal una forma de protegerlo contra nucleasas, como en una VLP como se usa en este experimento. El empaque de VLP parece aumentar en gran medida la potencia de CpG-A ODN, ya que la respuesta a la dosis del G10 “desnudo” (“CYT003”) es muy similar al G10 empaquetado dentro del VLP, aunque este último contiene solo -20 % de la masa de ODN.

De acuerdo con esta invención, la inducción de IL-10 por el ODN de control CpG-B (“2006”) y CpG-C (“SD-101”) es significativamente mayor que la de cualquiera de los ODN de CpG-A (Figura 7). Esto respalda el uso de CpG-A ODN inyectado intratumoralmente de la invención para inmunoterapia del cáncer, donde la inducción local de IL-10 (por ejemplo, por CpG-B ODN) sería indeseable.

Ejemplo 4

Se realizaron experimentos in vitro para examinar los efectos de los cambios en la estructura principal de ODN de CpG-A en fosforoditioato (PS2) o fosforotioato (PS) en comparación con el ADN nativo (PO) en la potencia y secreción máxima de IFN-a por humano normal PBMC.

Las condiciones experimentales fueron generalmente como en el Ejemplo 2, excepto que en este caso los ODN indicados se cultivaron con las PBMC por triplicado durante 72 horas a concentraciones de 0.5 pg/ml o 5 pg/ml.

Tabla 4. Conjunto de 3 oligos CpG-A fabricados y probados

# Secuencia ODN IFN-a SEQ ID NO:

A G#G#GGGACGATCGTCGGGG#G#G AF185A fuerte 49

B G#G#GGGAGCATGCCTGGGG#G#G AF185B negativo 527

C G#G#GGGAC#GATC#GTCGGGG#G#G AF185C débil 49

D G#G#GGGA#C#GAT#C#GTCGGGG#G#G AF185D neg 49

E G#G#GGG#ACGA#TCGTCGGGG#G#G AF185E débil 49

F G#G#GGGACGAT#CGT#CGGGG#G#G AF185F débil 49

G GGGGGACGATCGTCGGGGGG AF185G débil 49

H G#GGGGACGATCGTCGGGG#G#G AF185H fuerte 49

I GGGGGAC#GATC#GTCGGGGGG AF185I débil 49

# = enlace de internucleótido de fosforoditioato (PS2)

Los datos de este conjunto de experimentos sugieren (Fig. 8):

CpG-A ODN que contiene una o dos modificaciones de PS2 en los extremos 5' y 3' (por ejemplo, ODN AF185A y H) son aproximadamente tan efectivos como extremos PS PO o (G10) (ODN 2216 tiene enlaces PS en los extremos 5' y 3').

La PS2 dentro del palíndromo reduce gravemente la actividad en comparación con la ausencia de PS2 o la PS2 en los extremos dentro de la poliG.

Es posible que los extremos de PS2 puedan resultar superiores a PO o PS in vivo debido al aumento de la unión a proteínas y la resistencia a nucleasas.

Ejemplo 5

Se realizaron experimentos in vitro para examinar los efectos de reducir el número de G en el extremo 5' y/o 3' del ODN G10 CpG-A, o cambiar el palíndromo mientras se mantiene el ADN nativo de la estructura principal.

Las condiciones experimentales fueron generalmente como en el Ejemplo 2, excepto que en este caso los ODN indicados (Tabla 5) se cultivaron con PBMC por duplicado durante 48 horas a la concentración de 2.5 mg/ml.

Tabla 5. Conjunto de 4 oligos CpG-A fabricados y probados

# Secuencia 1234567890 IFN-a SEQ ID NO:

1 Gg g g g g g g a c g a t c g t c g g g g g g g g g g 528

2 GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG + 529

3 GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG + 530

4 GGGGGGGGGGTCGTCGACGAGGGGGGGGGG - 531

5 GGGGGGGGGGACGAGCTCGTCGGGGGGGGGG 532

6 GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG 533

7 GGGGGGGGGGTCGACGTCGACGTCGAGGGGGGG - 534

GGG

8 GGGGGGGGGGACGACGTCGTGGGGGGGGGG - 535

9 GGGGGGGGGGAACGACGTCGTTGGGGGGGGGG - 536

10 GGGGGGGGGGACGACGACGATCGTCGTCGTGGGG - 537

GGGGGG

11 GGGGGGGGGGCACGACGTCGTGGGGGGGGGG - 538

# Secuencia IFN-a SEQ ID NO:

12 GGGGGGGGGGAACGTTCGAACGTTGGGGGGGGG 539

G

13 GGGGGGGGGGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCG - 540

AACGTTGGGGGGGGGG

14 GGGGGGGGGGTTCGAACGTTCGAAGGGGGGGGG 541

G

15 GGGGGGGGGGACGTCGACGTCGGGGGGGGGG 542

16 GGGGGGGGGGTCGACGTCGACGGGGGGGGGG + 543

17 GGGGGGGGGGACGTCGACGTACGTCGACGTGGGG 544

GGGGGG

18 GGGGGGGGGGT ACGAT ATCGT AGGGGGGGGGG - 545

19 GGGGGGGGGGTACGTATACGTAGGGGGGGGGG - 546

20 GGGGGGGGGGACGTCGACGTCGGGGGGGGGG - 542

21 GGGGGGGGGGCAGCATGCTGGGGGGGGGGG - 547

#1 Variante G10: extremo 5' G reducido

#2 Variante G10: extremo 3' G reducido

#3 Variante G10: ambos extremos G reducidos

#4 Palíndromo TCGGTC

#5 Palíndromo GACGAG

#6 Palíndromo GACGA

#7 TCGACGTC

#8 ACGAC

#9 AACGAC

#10 ACGACGACGA (SEQ ID NO:548)

#11 CACGAC

#12 SD-101 palíndromo

#13 SD-101b

#14 TTCGAAC

#15 GACGTC

#16 GTCGAC

#17 ACGTCGACGT (SEQ ID NO:549)

#18 TACGAT CG bajo

#19 TACGCT

#20 GACGTC

#21 Control GC

Los datos de este conjunto de experimentos sugieren:

Reducir el número de G en los extremos 5' y/o 3' de G10 (como en 1-3, Tabla 5) reduce la inducción de la expresión de IFN-a (Fig. 9) sin reducir la inducción IP-10 (Fig. 10).

Casi todos los nuevos palíndromos cuando están flanqueados por 10 G en los extremos 5' y 3' indujeron una secreción de IFN-a e IP-10 que es superior a CpG-B (ODN 2006) pero no necesariamente superior al CpG -C (ODN SD-101) de control.

CpG-B y CpG-C tienen la propiedad indeseable de inducir una mayor secreción de IL-10 que cualquiera de los nuevos ODN de CpGA (Fig. 11).

Ejemplo 6

Se realizaron experimentos in vivo para evaluar la eficacia del tratamiento del linfoma con inmunoterapia tumoral combinada que implica la administración intratumoral de oligonucleótido CpG de clase A y la administración sistémica de inhibidor del punto de control anti-PD-1.

Se cebaron cuarenta ratones hembra BALB/c con cmP001 (CpG-A G10 formulado en VLP) 12.5 |jg el día -14. Este paso de cebado se incluyó con el objetivo de inducir una respuesta de anticuerpo anti-Qb a la VLP de Qb de modo que, con las inyecciones posteriores, la VLP fuera opsonizada y absorbida rápidamente por pDC. A continuación, los ratones preparados se inocularon en cada flanco con 5 x 106 células de linfoma A20 el día 0. A continuación, los ratones se dividieron en cuatro grupos de tratamiento, N = 10 por grupo. Los ratones del Grupo 1 (control negativo) recibieron una inyección de solución salina directamente en el tumor de linfoma en un flanco los días 7, 12 y 15; e inyección de solución salina ip dos veces por semana comenzando el día 7. Los ratones del Grupo 2 (CpG solo) recibieron 100 mg de cmP001 inyectados directamente en el tumor de linfoma en un flanco los días 7, 12 y 15; e inyección de solución salina ip dos veces por semana a partir del día 7. Los ratones del Grupo 3 (CPI solo) recibieron una inyección de solución salina directamente en el tumor de linfoma en un flanco en días 7, 12 y 15; e inyección ip de 175 mg de anticuerpo anti-PD-1 dos veces a la semana comenzando el día 7. Los ratones del Grupo 4 (CpG CPI) recibieron 100 pg de cmP001 inyectados directamente en el tumor de linfoma en un flanco los días 7, 12 y 15; e inyección ip de 175 pg de anticuerpo anti-PD-1 dos veces por semana comenzando el día 7. Se controló el tamaño del tumor (tratado y no tratado (es decir, distante)) y la supervivencia de todos los ratones. Los resultados se muestran en la Tabla 6 y la Fig. 12 y la Fig. 13.

Tabla 6

Como se muestra en la Fig. 12, los tumores tanto tratados como no tratados (distantes) crecieron más lentamente en el Grupo 2 (CpG solo) y el Grupo 3 (CPI solo) que en los controles negativos (Grupo 1). De manera significativa, los tumores tratados y no tratados (distantes) crecieron mucho más lentamente, y en varios casos incluso desaparecieron, en el Grupo 4 (CpG CPI), y este efecto fue claramente sinérgico.

Como se muestra en la Fig. 13, los ratones del Grupo 1 (control negativo) tuvieron una mediana de supervivencia de 15 días después de la inoculación del tumor (“desafío del tumor”); los ratones del Grupo 2 (CpG solo) tuvieron una supervivencia media de 19 días, sin que ningún ratón sobreviviera más allá de aproximadamente el día 60; los ratones del Grupo 3 (CPI solo) tuvieron una supervivencia media de 20.5 días, sin que ningún ratón sobreviviera más allá de aproximadamente el día 60; y los ratones del Grupo 4 (CpG CPI) tuvieron una supervivencia media de 48.5 días y los ratones aún sobrevivieron después de más de 60 días.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un agonista de TLR9 que es un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, para su uso en un método de tratamiento de un tumor canceroso en un sujeto,

en el que el ADN de CpG de clase A se administra en el tumor o junto al mismo; y

el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administra por vía sistémica.

2. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el método comprende además la administración de radioterapia al sujeto, iniciada dicha radioterapia antes de la administración del ADN de CpG de clase A.

3. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, utilizando además un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1.

4. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN de CpG de clase A se administra antes de la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, o sustancialmente al mismo tiempo.

5. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ADN de CpG de clase A y un inhibidor de punto de control adicional (CPI) se administran en el tumor o junto al mismo.

6. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en la reivindicación 5, en el que el CPI adicional comprende un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-L1.

7. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso, como se reivindica en la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en el que el ADN de CpG de clase A se administra antes de la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1, el ADN de CpG de clase A y el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 se administran sustancialmente al mismo tiempo, o el ADN de CpG de clase A se administra después de la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1.

8. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ADN de CpG de clase A tiene la secuencia GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 82).

9. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso, como se reivindica en la reivindicación 8, en el que el ADN de CpG de clase A se formula como una partícula similar a un virus.

10. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tumor canceroso es un linfoma o un tumor canceroso de un tejido u órgano seleccionado del grupo que consiste en piel, cabeza y cuello, esófago, estómago, hígado, colon, recto, páncreas, pulmón, mama, cuello uterino, ovario, riñón, vejiga, próstata, tiroides, cerebro, músculo y hueso, preferiblemente melanoma o linfoma.

11. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el tumor canceroso es resistente a un régimen de tratamiento que comprende la administración del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 sin la administración del ADN de CpG de clase A.

12. Un ADN de CpG de clase A y un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a PD-1 para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el sujeto es un ser humano.