ES2856874T3 - Método de análisis simultáneo para múltiples dianas usando múltiples nanoetiquetas metálicas - Google Patents

Método de análisis simultáneo para múltiples dianas usando múltiples nanoetiquetas metálicas Download PDF

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Abstract

Un método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas, que comprende: (i) preparar una plataforma de análisis a la que se une un primer anticuerpo, que se une específicamente a una diana; (ii) hacer reaccionar la plataforma de análisis que comprende el primer anticuerpo con una muestra que comprende una pluralidad de dianas y de ese modo formar una plataforma de análisis a la que se unen los materiales diana; (iii) hacer reaccionar un segundo anticuerpo, que se une específicamente a una diana, con la plataforma de análisis en la que se unen el primer anticuerpo y las dianas; y (iv) realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo, en donde: la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende una pluralidad de tipos de anticuerpos; la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es una nanopartícula de sílice, que comprende un núcleo que comprende metal y sílice que recubre la superficie del núcleo; la diana es al menos dos seleccionadas del grupo que consiste en el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV); y la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales, en donde la nanopartícula de sílice comprende Au cuando la diana a analizar es el HBV, la nanopartícula de sílice comprende Gd cuando la diana a analizar es el HIV, y la nanopartícula de sílice comprende Eu cuando el objetivo a analizar es el HCV.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de análisis simultáneo para múltiples dianas usando múltiples nanoetiquetas metálicas
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para el análisis simultáneo de una diana utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas y, más particularmente, a un método para el análisis simultáneo de una diana utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas, en el que el método permite la convergencia de una tecnología de nanopartículas basada en una reacción antígeno-anticuerpo, que es una respuesta inmune biológica convencional, y diagnostica simultáneamente una pluralidad de materiales diana utilizando una pluralidad de reacciones antígenoanticuerpo y una pluralidad de nanoetiquetas metálicas, mejorando así el efecto diagnóstico.
Técnica relacionada
Los principales virus patógenos, por ejemplo, el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), que se transmiten a través de la sangre o los fluidos corporales, son factores de pronóstico muy importantes en el manejo de la sangre para transfusiones.
Actualmente, el diagnóstico de infección de estos patógenos se realiza principalmente mediante un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), que puede detectar la presencia del antígeno de superficie de1HBV (HBsAg) o anticuerpos contra el HCV y el HIV en la sangre y determinar así la presencia de la infección por virus. Sin embargo, ELISA presenta el problema de que la precisión del ensayo es baja durante el período de latencia hasta que se forma el anticuerpo después de la infección por el virus, mientras se encuentra en un estado de infección por virus con diferentes actividades inmunes o inactividad inmune de la persona infectada.
Para superar las limitaciones de ELISA, un método que se ha desarrollado durante los últimos años es una prueba de ácido nucleico (NAT) que detecta directamente un material genético de un virus que consiste en DNA o RNA. La prueba de ácido nucleico es un método de diagnóstico para analizar la presencia/ausencia de un virus con mayor sensibilidad en comparación con el inmunoensayo enzimático, utilizando un cebador oligo con especificidad de secuencia de nucleótidos para el ácido nucleico viral. Se esperaba que la prueba de ácido nucleico se utilizara de manera apropiada para detectar virus patógenos que se transmiten a través de la sangre en los campos de cuestiones asociadas con la sangre, tal como la transfusión de sangre o cuestiones biofarmacéuticas. Sin embargo, es difícil utilizar la prueba de ácido nucleico como método de prueba de rutina para manipular una gran cantidad de muestras debido al problema de los costos que incurren en el curso de la introducción y utilización del método de prueba.
Además, existe un método llamado ''multiplex NAT " que se utiliza como un método para detectar simultáneamente varios tipos de virus. El multiplex NAT tiene el efecto de reducir el tiempo y el esfuerzo de inspección hasta cierto punto si se introduce. Sin embargo, el método tiene dificultades porque la sensibilidad puede degradarse a menos que se justifique la optimización de las condiciones de reacción y que exista el riesgo de falsos positivos o falsos negativos, y también existen dificultades en términos de costos de inspección para utilizar el método como método de prueba de rutina para manipular una gran cantidad de muestras. Zhang et al (2015. Spectrochimica Acta, 106, 20-27.) describe un método para el análisis simultáneo de analitos diana (a saber, CEA y AFP) mediante espectrometría de masas acoplada inductivamente. Los autores utilizan anticuerpos unidos a nanopartículas de sílice que contienen Au y Ag.
A pesar de las ventajas y desventajas de varios métodos para el diagnóstico de virus como se describió anteriormente, la tecnología utilizada principalmente en el diagnóstico clínico en la actualidad para detectar virus es ELISA basada en la reacción antígeno-anticuerpo. Aunque el método ELISA se usa comúnmente porque el funcionamiento de la máquina de medición es simple y la muestra se puede procesar rápidamente, el ensayo presenta muchos problemas, ya que los tipos de cromógenos o fósforos utilizables son limitados, existe una dificultad en el etiquetado, la reactividad de las enzimas relacionadas con el desarrollo del color, y en el caso de la fluorescencia, existen varias limitaciones para las mediciones debido al fotoblanqueo, enfriamiento, etc. En particular, es aún más en el campo de aplicaciones donde se requieren mediciones cuantitativas.
En consecuencia, existe la necesidad de desarrollar una nueva tecnología que permita la medición y cuantificación precisas, así como la cuantificación de materiales diana, tales como varios tipos de proteínas en diversas matrices. Para este propósito, se conoce un método que puede detectar incluso unas pequeñas trazas de virus utilizando nanoetiquetas metálicas en lugar de fósforos u otros compuestos cromogénicos en el método ELISA convencional y midiendo la masa del metal.
Sin embargo, convencionalmente, el método que usa una nanoetiqueta metálica presenta el problema de que es difícil detectar simultáneamente una pluralidad de dianas debido a que incluye solo un tipo de metal.
Compendio de la invención
Para resolver los problemas de las tecnologías convencionales, un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo método de análisis que permita el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de anticuerpos.
La presente invención, con el fin de resolver los objetivos anteriores, proporciona un método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas, que incluye:
(i) preparar una plataforma de análisis a la que se une un primer anticuerpo, que se une específicamente a una diana;
(ii) hacer reaccionar la plataforma de análisis que incluye el primer anticuerpo con una muestra que contiene una pluralidad de dianas y de ese modo formar una plataforma de análisis a la que se unen los materiales diana;
(iii) hacer reaccionar un segundo anticuerpo, que se une específicamente a una diana, con la plataforma de análisis en la que se unen el primer anticuerpo y las dianas; y
(iv) realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo,
dónde: la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende una pluralidad de tipos de anticuerpos; la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es una nanopartícula de sílice, que comprende un núcleo que comprende metal y sílice que recubre la superficie del núcleo; la diana es al menos dos seleccionadas del grupo que consiste en el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV); y la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales, en donde la nanopartícula de sílice comprende Au cuando la diana a analizar es HBV, la nanopartícula de sílice comprende Gd cuando la diana a analizar es HIV, y la nanopartícula de sílice comprende Eu cuando la diana a analizar es HCV.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, las moléculas diana a analizar son virus.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es una nanopartícula de sílice que contiene un núcleo que contiene metal y sílice que recubre la superficie del núcleo, o una placa a la que se unen una pluralidad de tipos de los primeros anticuerpos. En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, el caso de nanopartículas de sílice donde la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es nanopartícula de sílice que contiene un núcleo que contiene metal y sílice que recubre la superficie del núcleo se ilustra en la Figura 1. Un caso de nanopartículas de sílice en el que la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es una placa a la que se unen una pluralidad de tipos de los primeros anticuerpos se ilustra en la Figura 2.
En el método para el análisis simultáneo de dianas utilizando una pluralidad de nano-etiquetas metálicas de la presente invención, cada una de las nanopartículas de sílice puede caracterizarse por contener un solo tipo de metal, y la plataforma de análisis a la que se une el anticuerpo se caracteriza por contener al menos dos tipos de nanopartículas de sílice con diferentes tipos de metales. El método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención se caracteriza por que el método puede diversificar los tipos de dianas según el tipo del primer anticuerpo mediante el análisis por la unión de un tipo diferente del primer anticuerpo a una pluralidad de nanopartículas de sílice con diferentes tipos de metales, y el método también permite un análisis simultáneo de dos tipos diferentes de metales cuando el análisis cuantitativo se realiza después utilizando una espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) variando los tipos de los metales contenidos en las nanopartículas de sílice.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo se caracteriza por comprender al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales, en donde la nanopartícula de sílice comprende Au cuando la diana a analizar es el HBV, la nanopartícula de sílice comprende Gd cuando la diana a analizar es el HIV y la nanopartícula de sílice comprende Eu cuando la diana a analizar es e1HCV.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, para la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo, se selecciona un metal apropiado dependiendo de la diana que se va a analizar. Específicamente, las nanopartículas de sílice que contienen Au son deseables cuando la diana a analizar es el HBV en la sangre; la nanopartícula de sílice que contiene Gd es deseable cuando la diana a analizar es el HIV en la sangre; y la nanopartícula de sílice que contiene Eu es deseable cuando la diana a analizar es el HCV en la sangre; y es posible que al menos dos de estas nanopartículas de sílice se utilicen simultáneamente.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, el primer anticuerpo puede caracterizarse por ser un anticuerpo monoclonal.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nano-etiquetas metálicas de la presente invención, es posible que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo que se van a utilizar sean los mismos.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, es posible que el primer anticuerpo sea un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo sea un anticuerpo policlonal.
En el método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, la etapa (iv) de realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo puede incluir:
(iv-1) capturar el material diana al que se une el segundo anticuerpo aplicando una fuerza magnética externa; y (iv-2) analizar el material diana capturado al que se une el segundo anticuerpo usando un espectrofotómetro. Es decir, en el caso de utilizar nanopartículas de sílice como plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo, la diana a la que se une el segundo anticuerpo puede separarse mediante el magnetismo de las nanopartículas magnéticas que están conectadas al segundo anticuerpo, y el metal etiquetado de la diana separada al que se une incluso el segundo anticuerpo se somete a análisis cuantitativo para el análisis de la diana.
En el método para el análisis simultáneo de dianas utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas de la presente invención, la etapa (iv-2) de analizar el material diana capturado al que se une el segundo anticuerpo utilizando un espectrofotómetro puede caracterizarse realizando el análisis utilizando una espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o un espectrofotómetro de absorción atómica de horno de grafito. Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1 y 2 muestran diagramas esquemáticos que ilustran un método para el análisis simultáneo de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas, siendo la Figura 1 de la presente invención.
Las Figuras 3 y 4 muestran los resultados del análisis por ICP-MS en la sangre según una realización ejemplar de la presente invención.
Mejor modo de realizar la invención
El método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención incluye:
(i) preparar una plataforma de análisis a la que se une un primer anticuerpo, que se une específicamente a una diana;
(ii) hacer reaccionar la plataforma de análisis que incluye el primer anticuerpo con una muestra que contiene una pluralidad de dianas y de ese modo formar una plataforma de análisis a la que se unen los materiales de la diana; (iii) hacer reaccionar un segundo anticuerpo, que se une específicamente a una diana, con la plataforma de análisis en la que se unen el primer anticuerpo y las dianas; y
(iv) realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo,
en donde: la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende una pluralidad de tipos de anticuerpos; la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es una nanopartícula de sílice, que comprende un núcleo que comprende metal y sílice que recubre la superficie del núcleo; la diana es al menos dos seleccionadas del grupo que consiste en el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV); y la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales, en donde la nanopartícula de sílice comprende Au cuando la diana a analizar es el HBV, la nanopartícula de sílice comprende Gd cuando la diana a analizar es el HIV, y la nanopartícula de sílice comprende Eu cuando la diana a analizar es e1HCV.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo puede ser una nanopartícula de sílice que contiene un núcleo que contiene un metal magnético y una sílice que recubre la superficie del núcleo. La nanopartícula de sílice puede contener un solo tipo de metal; y la plataforma de análisis a la que se une el anticuerpo contiene al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales. La plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales, en donde la nanopartícula de sílice comprende Au cuando la diana a analizar es el HBV, la nanopartícula de sílice comprende Gd cuando la diana a analizar es el HIV, y la nanopartícula de sílice comprende Eu cuando la diana a analizar es e1HCV. El segundo anticuerpo se puede unir a una nanopartícula de sílice, que contiene un núcleo que contiene un metal magnético y una sílice que recubre la superficie del núcleo.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, el segundo anticuerpo puede unirse a una nanopartícula de sílice que contiene un núcleo que contiene un metal magnético y una sílice que recubre la superficie. del núcleo.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, el núcleo de la nanopartícula de sílice unida al segundo anticuerpo puede contener al menos dos metales seleccionados del grupo que consiste en Au, Ag, Pt, Pd, Ir, Rh, Ru, Al, Cu, Te, Bi, Pb, Fe, Ce, Mo, Nb, W, Sb, Sn, V, Mn, Ni, Co, Zn, La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu, Sc, Y y t í.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, el núcleo de la nanopartícula de sílice unida al segundo anticuerpo puede contener Au.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo pueden ser el mismo.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención, el primer anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal.
En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención,
la etapa (iv) de realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo puede incluir:
(iv-1) capturar el material diana al que se une el segundo anticuerpo aplicando una fuerza magnética externa; y (iv-2) analizar el material diana capturado al que se une el segundo anticuerpo utilizando un espectrofotómetro. En el método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas usando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención,
la etapa (iv-2) de analizar el material diana capturado al que se une el segundo anticuerpo usando un espectrofotómetro se puede analizar usando una espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o un espectrofotómetro de absorción atómica de horno de grafito.
Descripción de realizaciones ejemplares
A continuación, se describirá la presente invención con más detalle con referencia a ejemplos.
<Ejemplo de referencia 1> Caso que utiliza una placa como plataforma de análisis que contiene el primer anticuerpo Después de unir un anticuerpo monoclonal anti-p24 humano como primer anticuerpo a una placa, se unió HBsAg como segundo anticuerpo a la placa, y se prepararon nanopartículas de sílice que contenían una partícula de Au utilizando el kit Gold Nanoparticle Conjugation.
Se dejó fluir una muestra de sangre a través de la placa para inducir una reacción entre el primer anticuerpo y una diana en la muestra de sangre y las impurezas sin reaccionar se eliminaron mediante lavado. E1HBsAg se unió al resultante y se dejó reaccionar con un segundo anticuerpo que contenía una partícula de Au.
Luego, se separó el conjugado unido al segundo anticuerpo y se recuperó mediante una reacción con ácido nítrico y se midió el peso del conjugado usando un ICP-MS. Los resultados se muestran en la Figura 3.
<Ejemplo 2> Caso que utiliza nanopartículas de sílice como plataforma de análisis que contiene el primer anticuerpo Se sintetizaron, respectivamente, nanopartículas de sílice dopadas con gadolinio, nanopartículas de sílice dopadas con itrio y nanopartículas de sílice dopadas con europio como una plataforma de análisis que contenía el primer anticuerpo.
El anticuerpo monoclonal anti-p24 humano se unió a cada una de las nanopartículas de sílice sintetizadas como un primer anticuerpo y se mezclaron, y de ese modo se preparó una plataforma de análisis que contenía nanopartículas de sílice.
Se prepararon nanopartículas de hierro como nanopartículas magnéticas y se unió a las mismas un anticuerpo monoclonal anti-p24 humano como un segundo anticuerpo.
Las nanopartículas de sílice, en las que se mezclaron nanopartículas de sílice dopadas con gadolinio, nanopartículas de sílice dopadas con itrio y nanopartículas de sílice dopadas con europio, se hicieron reaccionar con una muestra que contenía materiales diana. Después de eliminar los materiales que no reaccionaron, el conjugado unido al segundo anticuerpo se separó y se recuperó mediante una reacción con ácido nítrico, y el peso del resultante se midió mediante ICP-MS. Los resultados se muestran en la Figura 4.
Se confirmó que se puede analizar cuantitativamente una pluralidad de dianas cuando se utiliza un método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas según la presente invención.
Efectos ventajosos de la invención
El método de análisis para un material diana que utiliza nanoetiquetas metálicas según la presente invención fusiona una nanotecnología con una respuesta inmune biológica convencional y, por lo tanto, el método hace posible detectar con precisión incluso una cantidad de traza de virus sin la carga del costo de inspección, en la cuestión de la verificación/diagnóstico de preparaciones de sangre, virus y otras biomedicinas, así como en la cuestión de la gestión de la sangre que trata con una gran cantidad de muestras de sangre.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el análisis simultáneo de una pluralidad de dianas utilizando una pluralidad de nanoetiquetas metálicas, que comprende:
(i) preparar una plataforma de análisis a la que se une un primer anticuerpo, que se une específicamente a una diana;
(ii) hacer reaccionar la plataforma de análisis que comprende el primer anticuerpo con una muestra que comprende una pluralidad de dianas y de ese modo formar una plataforma de análisis a la que se unen los materiales diana; (iii) hacer reaccionar un segundo anticuerpo, que se une específicamente a una diana, con la plataforma de análisis en la que se unen el primer anticuerpo y las dianas; y
(iv) realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo,
en donde:
la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende una pluralidad de tipos de anticuerpos; la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo es una nanopartícula de sílice, que comprende un núcleo que comprende metal y sílice que recubre la superficie del núcleo;
la diana es al menos dos seleccionadas del grupo que consiste en el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV); y
la plataforma de análisis a la que se une el primer anticuerpo comprende al menos dos tipos de nanopartículas de sílice que contienen diferentes tipos de metales, en donde la nanopartícula de sílice comprende Au cuando la diana a analizar es el HBV, la nanopartícula de sílice comprende Gd cuando la diana a analizar es e1HIV, y la nanopartícula de sílice comprende Eu cuando el objetivo a analizar es el HCV.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo anticuerpo se une a una nanopartícula de sílice, que comprende un núcleo que comprende un metal magnético y sílice que recubre la superficie del núcleo.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo son el mismo.
4. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que el primer anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y el segundo anticuerpo es un anticuerpo policlonal.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa (iv) de realizar un análisis cuantitativo del material al que se une el segundo anticuerpo comprende:
(iv-1) capturar el material diana al que se une el segundo anticuerpo aplicando una fuerza magnética externa; y (iv-2) analizar el material diana capturado al que se une el segundo anticuerpo utilizando un espectrofotómetro.
6. El método de la reivindicación 5, en el que la etapa (iv-2) de analizar el material diana capturado al que se une el segundo anticuerpo utilizando un espectrofotómetro es analizar usando una espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) o un espectrofotómetro de absorción atómica de horno de grafito.
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