ES2859496T3 - Producto y proceso de inmunoensayo - Google Patents

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Phillip Clark
Kurt E Greenizen
Ryan A Amara
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Abstract

Un dispositivo que comprende un soporte (2) y un portador (10) para el soporte, a) teniendo el soporte (2) una porción superior y una porción inferior, teniendo cada porción superior e inferior un borde exterior, una superficie superior y una superficie inferior y un espesor entre las superficies superior e inferior, teniendo la porción superior una abertura hacia el interior del borde exterior, en donde un distribuidor de flujo (46) cubre la abertura cuando dicho soporte (2) está cerrado, comprendiendo el soporte (2): i) una montura (40) con un borde perimetral configurado para soportar una membrana de transferencia de proteínas (45), estando dicha montura fabricada con plástico o papel; ii) siendo un distribuidor de flujo (46) una membrana fijada a dicha montura (40) y sobre la cual se puede colocar dicha membrana de transferencia de proteínas (45); iii) un soporte poroso (47) que es una malla no tejida de polipropileno unida a dicha montura (40) a lo largo de un borde, y una hoja de papel laminada a dicha malla de polipropileno, en donde el soporte poroso (47) permite el acceso al soporte (2) para que un usuario del dispositivo añada la membrana de transferencia de proteínas (45) al soporte (2) cuando el soporte (2) está abierto, de tal manera que dicha membrana de transferencia de proteínas (45) quedaría intercalada entre el distribuidor de flujo (46) y el soporte poroso (47) cuando dicho soporte (2) está cerrado; y b) comprendiendo el portador (10) para el soporte (2) una placa superior (12) y una placa inferior (13), teniendo cada una un ancho y una longitud, una superficie superior e inferior y un espesor entre las superficies superior e inferior, un borde exterior y al menos una abertura, siendo las placas de una longitud y una anchura mayores que la longitud y la anchura del soporte (2), teniendo la placa superior (12) del portador (10) una abertura con sustancialmente la misma anchura y longitud que la abertura de la porción superior del soporte (2), teniendo la superficie inferior de la placa superior (12) y la superficie superior de la placa inferior (13), cada una, uno o más sellos alineados entre sí cuando las dos placas están adyacentes entre sí y estando los sellos dispuestos sobre cada superficie en un ancho y largo mayores que los de la abertura de la placa superior (12), pero inferiores a las dimensiones exteriores del soporte (2), al menos una de las placas tiene un sello adicional formado adyacente al borde exterior de la placa y hacia fuera del sello de esa placa.

Description

DESCRIPCIÓN
Producto y proceso de inmunoensayo
Las realizaciones divulgadas en el presente documento se refieren a un dispositivo para la detección y posicionamiento de sustancias que están contenidas en una membrana de transferencia. Más particularmente, se refiere a un dispositivo adecuado para la aplicación de reactivos, soluciones de lavado y químicas de detección en una membrana de transferencia para conseguir rápidamente esta detección mediante el uso de vacío o presión positiva.
Antecedentes
El uso de electroforesis en gel es actualmente la técnica omnipresente para la separación de materiales biológicos. Los materiales no biológicos también se pueden separar utilizando geles u otros soportes cromatográficos, pero el alcance del esfuerzo con respecto a los biológicos es mayor. Las aplicaciones habituales incluyen la separación de fragmentos de ácido nucleico de diversos tamaños, bien en el contexto de determinación de secuencias; en la detección de polimorfismos; o en la verificación de tamaños en otros contextos. También se realiza con frecuencia la separación de proteínas, glucoproteínas, fragmentos de proteína y la aplicación de separaciones en gel como verificación de homogeneidad o pureza, identificación de modificaciones postraduccionales y confirmación del peso molecular.
En todos estos procedimientos, se aplican muestras mixtas de entidades biológicas en geles electroforéticos y los componentes se separan mediante la aplicación de un campo eléctrico a través del gel. Independientemente de la forma en la que se elabore el gel, el patrón resultante de migración de las sustancias contenidas en la muestra debe detectarse de alguna manera.
Para realizar esta detección, el soporte de gel suele ponerse en contacto con una membrana de transferencia hacia la que se transfieren las sustancias en el mismo patrón en el que aparecieron sobre el gel. A continuación, se detectan las "manchas", como mínimo, bloqueando la membrana con una solución de proteína o detergente para reducir la unión no específica (que de lo contrario genera un alto nivel de ruido y un bajo nivel de detección). Los inhibidores habituales incluyen caseína, albúmina de suero bovino (BSA), leche desnatada en polvo (en general, aproximadamente el 1-5 %) en una solución salina tamponada con Tris con tensioactivo TWEEN® (solución TBS-T) o solución salina tamponada con fosfato con tensioactivo TWEEN® (solución PBS-T). Después, la entidad biológica se incuba sobre la membrana con un anticuerpo específico para el antígeno. A continuación, la membrana se lava a fondo para eliminar cualquier contaminante, proteínas o anticuerpos bloqueantes libres y similares. Luego, la membrana se trata e incuba con un anticuerpo secundario conjugado con una enzima, radioisótopo, fluorfluor o biotina específico para el anticuerpo primario. Después, la membrana se lava de nuevo a fondo para eliminar cualquier anticuerpo secundario libre. Luego se aplica un reactivo de detección, generalmente un material cromogénico, quimioluminiscente, fluorescente, radiológico o marcado con estreptavidina, que se une a o es un sustrato de la enzima-conjugado. Por último, se utiliza el dispositivo de detección apropiado para determinar la presencia, ausencia, posición, cantidad, etc. de la entidad biológica. Las últimas seis etapas duran generalmente de 3-6 horas a toda la noche, dependiendo de la velocidad de reacción entre los reactivos seleccionados, la membrana y la entidad biológica. El proceso requiere múltiples períodos de incubación de la membrana sobre una plataforma de mezcla basculante u otra adecuada. Es un proceso largo que no gusta a la mayoría de los investigadores y que consume (desperdicia) una gran cantidad de reactivos.
Algunos investigadores han sugerido el uso de la acción capilar de un material absorbente, tal como el papel de filtro, colocado debajo de la membrana para extraer los fluidos restantes a través de la membrana y mejorar la velocidad del proceso, especialmente las etapas de lavado.
El documento US 5.155.049 menciona un sistema llamado cámara de hibridación Hybrid-Ease™ comercializado por Hoefer Scientific Instruments. Esta cámara comprende dos rejillas entre las que se intercala la membrana. Las placas de rejilla se ajustan a presión en su posición alrededor de la membrana y las jeringas se encajan en el espacio abierto creado por las rejillas. Se utiliza una jeringa para aplicar los reactivos y el lavado, y la otra para retirar el exceso. El sistema requiere grandes volúmenes de líquido para poder funcionar, su empleo es complejo y sigue tardando bastante tiempo. También menciona que, en algunos ensayos particulares, tal como los ensayos ELISA, en pocillos de pequeño volumen (tal como una placa de 96 micropocillos), otros han utilizado el vacío para extraer líquidos a través de una membrana en una etapa de lavado. Sin embargo, descartan este esfuerzo ya que solo está disponible en aplicaciones de pequeño volumen y sigue sin ser controlable. En cambio, sugieren que el mejor método es usar una prensa manual que tiene la membrana sobre la parte superior de un papel de filtro y una capa de cubierta y presionar la intercalación de la membrana entre dos placas para exprimir el líquido a través de la membrana y que pase al papel.
En el documento USSN 60/732.994, presentado el 3 de noviembre de 2005, se sugiere que se utilice un dispositivo formado por varias capas que incluyen una capa de soporte porosa debajo de una o más capas de membrana de transferencia, un distribuidor de flujo por encima de la(s) membrana(s) de transferencia y un pocillo sobre el distribuidor de flujo para contener el líquido en el área deseada y permitir volúmenes iniciales más bajos de tal líquido. Preferentemente, el distribuidor de flujo es una membrana porosa de no fijación o de baja afinidad.
En los documentos de EE.UU. en trámite con n.° de serie 11/582.727 y 11/582.599 (publicados como US 2007/098601 A1) presentados el 18 de octubre de 2006, se divulgó un dispositivo en el que podría encajar un soporte con un orientador de flujo y un soporte poroso podría encajar en un aparato colector para procesar los diversos fluidos y detectar la entidad biológica. El colector tiene una cubierta con o sin pocillo y una abertura central en línea con una abertura central del soporte. Si bien es útil, tiene limitaciones que impiden su uso y aceptación universal.
Está claro que se requiere un dispositivo más eficaz para detectar los materiales o entidades biológicas sobre las membranas de transferencia. Las realizaciones divulgadas en el presente documento permiten una detección más eficaz y eficiente de entidades biológicas en una membrana de transferencia.
Sumario
La invención se refiere a un dispositivo según lo definido en la reivindicación independiente 1. Los aspectos preferentes del dispositivo se definen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una vista despiezada de un portador de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 2 es una vista en perspectiva de un portador en una posición abierta de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 3 es una vista en perspectiva de un portador en una posición cerrada de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 4 es una vista en perspectiva, mostrada en sección transversal, de un portador de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 4A es una vista en perspectiva, mostrada en sección transversal, de un portador con una válvula de paraguas de acuerdo con ciertas realizaciones;
La FIG. 5 es una vista en perspectiva de un soporte de membrana de transferencia, que incluye una membrana de transferencia de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 5A es una vista en perspectiva de un soporte de membrana de transferencia, que muestra un distribuidor de flujo de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 5B es una vista en perspectiva, vista desde la parte inferior, de un soporte de membrana de transferencia de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 6 es una vista en perspectiva de un portador en una posición abierta, que incluye el soporte de la FIG. 5, de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 7 es una vista despiezada en perspectiva de la parte inferior del portador de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 8 es una vista en perspectiva de la parte inferior del portador con la cubierta en su lugar, de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 9 es una vista en perspectiva de un colector de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 9A es una vista en perspectiva de un colector con un recipiente de recogida de acuerdo con ciertas realizaciones;
la FIG. 10 es una vista despiezada en perspectiva de un colector, que incluye portadores, de acuerdo con ciertas realizaciones; y
la FIG. 10A es una vista en perspectiva de un colector, soporte y portador de acuerdo con ciertas realizaciones.
Descripción detallada
Pasando primero a la FIG. 1, se muestra un portador 10 de acuerdo con ciertas realizaciones. En la realización mostrada, el portador 10 incluye una tapa 11, una placa superior del portador 12, una placa inferior del portador 13, una cubierta 14 y un nivel de burbuja 15 sobre la placa superior del portador 12. De acuerdo con ciertas realizaciones, el portador 10 sirve para mantener plano el soporte de membrana de filtro y para administrar reactivos tales como anticuerpos, tampón de lavado, etc. en el soporte de membrana de filtro. De acuerdo con ciertas realizaciones, el portador 10 es un dispositivo independiente, separado de una base colectora (tratada a continuación), lo que permite al usuario configurar diversas membranas de filtro al mismo tiempo. De este modo, cada portador 10 puede cargarse selectivamente con soportes de membrana de filtro que contienen membranas de filtro, añadir sus respectivos anticuerpos y, después, incubarlos.
La FIG. 2 muestra una forma de realización del portador 10 en una posición abierta, con la parte inferior de la placa superior 12 mostrada a la izquierda en el dibujo y la parte superior de la placa inferior 13 mostrada a la derecha. En la realización mostrada, la placa superior 12 y la placa inferior 13 están conectadas de forma articulada en 16. Como se muestra en esta realización, la bisagra es una bisagra "viva" que une las dos porciones juntas. Como alternativa, la bisagra se podría fabricar por separado y fijarse mediante adhesivos, uniones térmicas o sujeciones mecánicas.
Otras realizaciones no usan bisagras (no mostradas) y usan pinzas, bandas elásticas o sujeciones de enganche cooperativo, tal como una ranura y un retén, un pasador de ajuste por fricción o elemento similar formado sobre o en las respectivas porciones superior e inferior para mantenerlas juntas durante el uso. Otros medios comparables serán obvios para un experto en la materia y también se pretende incluirlos.
De acuerdo con ciertas realizaciones, la placa superior del portador 12 puede tener uno o más pocillos 22, que se pueden utilizar para contener y/o administrar fluidos de lavado y reactivos durante su uso. El(los) pocillo(s) 22 puede(n) formarse como parte de la superficie superior de la placa superior del portador 12 con paredes verticales 22a, 22b, 22c y 22d (FIG. 1), o como una pieza separada que simplemente se fija o se coloca sobre la parte superior de la placa superior del portador 12. La tapa 11 se puede colocar sobre el portador 10 para cubrir el pocillo 22 y evitar que los anticuerpos y otros fluidos se evaporen durante períodos prolongados de incubación, particularmente durante la incubación nocturna.
La placa inferior del portador 13 incluye un soporte poroso 4 que puede ser un simple tamiz, una rejilla, una rejilla de orientación del flujo o una estructura porosa sinterizada, tal como una membrana POREX® o un filtro microporoso de poro grueso o grande, tal como un papel tejido o no tejido, una tela de polipropileno o polietileno, una estera de vidrio o papel, o un filtro microporoso de 1-10 micrómetros. Tales soportes pueden estar hechos de polímero, vidrio, materiales cerámicos o metálicos, incluyendo pero no limitándose a metales, tales como acero inoxidable o aleación de acero, aluminio y similares, y polímeros tales como polietileno, polipropileno, polisulfona, polietersulfonas, estirenos, náilones y similares. La FIG. 2 muestra un soporte poroso 4 en forma de rejilla de orientación del flujo que incluye una serie de ranuras 72 y aberturas 74. Las aberturas 74 están colocadas hacia dentro desde el perímetro del soporte poroso 4. Las aberturas 74 están en comunicación de fluidos con las ranuras 72, de modo que el fluido se recoge en las ranuras 72 y se dirige a través de las aberturas 74. Las ranuras 72 recogen y administran el fluido gastado en las aberturas 74 que dirigen el fluido a una cámara de residuos o bandeja de recogida (no mostrada). Si el investigador desea recoger uno o más de los fluidos, se puede colocar una bandeja de recogida de manera apropiada para hacerlo. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden usar otros patrones de ranuras o aberturas, ya que el resultado deseado es dirigir los fluidos gastados hacia una abertura o una serie de aberturas que dirigen los fluidos gastados a un destino predeterminado.
Los bordes exteriores del soporte 4 y la placa superior del portador 12 pueden estar hechos de los mismos materiales que el soporte 4. Cuando se utiliza una bisagra integral, debe estar hecha de un material flexible, tal como polietileno, polipropileno, un elastómero o uno de los materiales modificados por impacto, tal como ABS, resina K y similares. Cuando se utilizan una bisagra separada, pinzas, bandas elásticas, película adhesiva u otros medios de sujeción, estos pueden estar hechos de metal, plástico o elastómeros, según proceda.
De acuerdo con ciertas realizaciones, un primer sello de brida 30A se coloca sobre la parte inferior de la placa superior del portador 12, como se muestra, de forma cooperativa con un segundo sello de brida 30B colocado en torno al soporte poroso 4 sobre la placa inferior del portador 13, y mantiene un sistema estanco a los fluidos cuando las placas superior e inferior están en la posición cerrada con el soporte de membrana de filtro enganchado. De este modo, los sellos de brida 30A y 30B están colocados de manera que, cuando la placa superior del portador 12 se rota con respecto a la placa inferior del portador 13 hasta una posición cerrada, los dos sellos se registran o se alinean entre sí para sellar el portador. En determinadas realizaciones, cada sello de brida 30A, 30B está hecho preferentemente de un elastómero flexible, tal como silicona o elastómero termoplástico (TPE), y tiene forma de V, siendo una pata de la V más corta que la otra. El extremo largo de cada sello de brida en forma de V se asienta en un rebaje respectivo de las placas superior e inferior del portador (FIG. 4). La pata corta de cada sello en forma de V es una característica elevada y fácilmente deformable. En la posición cerrada y sellada del portador, las patas más cortas de la V sobre la placa superior del portador entrarán en contacto con la superficie superior del soporte de membrana de filtro. La pata más corta de la V sobre la placa inferior del portador entrará en contacto con la parte inferior del soporte de membrana de filtro y se desviará, como se ve mejor en la FIG. 4. La geometría angulada del sello ejerce una fuerza para tirar de o estirar el soporte 2 cuando se desvía, que "tamborilea" la membrana y la mantiene plana. Una membrana plana evita las deformidades que pueden crear picos y valles sobre la superficie de la membrana que acumula el volumen de anticuerpo, lo que a su vez deriva en áreas de la membrana de transferencia con más o menos exposición a los anticuerpos, generando resultados pobres e inconsistentes. Este sello evita fugas y permite (por ejemplo, durante la noche) incubación a largo plazo. El diseño del sello también permite un mecanismo de sellado de fuerza reducida y la fuerza de sujeción baja requerida para el portador 10. Esto ayuda a mantener la planitud del soporte y la membrana de transferencia. Un cierre liberable 35 u otro mecanismo de bloqueo bloquea el portador en la posición cerrada (FIG. 3). De acuerdo con ciertas realizaciones, se puede utilizar un solo sello de brida, preferentemente el sello de brida 30B de la placa inferior. El sello de brida inferior 30B funciona para estirar el soporte de membrana de filtro. Una vez estirado, la interfaz está diseñada para que la parte superior e inferior del portador aprieten el soporte de membrana de filtro en su lugar. Los sellos de brida exteriores 300A, 300B también se muestran en la FIG. 4.
Las FIGS. 5, 5A y 5B muestran un soporte 2 de acuerdo con ciertas realizaciones. El soporte 2 incluye una montura 40 que tiene un borde perimetral configurado para soportar una membrana de transferencia de proteínas 45. En el contexto de la invención reivindicada, la montura 40 está fabricada con plástico o papel. En determinadas realizaciones, el material de la montura 40 puede ser biorresina, HIPS, papel o, en otras configuraciones que no se encuentran dentro del alcance de la invención reivindicada, cartón o cualquier otro material rígido adecuado que pueda soportar la membrana y mantenerla plana. En el contexto de la invención reivindicada, un distribuidor de flujo 46, tal como una membrana GVPP, se lamina o se fija de otro modo a la montura y sobre él se puede colocar la membrana de transferencia 45. El distribuidor de flujo 46 está fijado a la montura y la membrana de transferencia está intercalada entre el distribuidor de flujo 46 y el soporte poroso 47 cuando el soporte de membrana de filtro está cerrado. El soporte poroso 47 sobre el soporte de membrana de filtro está soportado y en contacto con el soporte poroso 4 de la placa inferior del portador. El distribuidor de flujo 46 funciona para distribuir uniformemente la solución de bloqueo y los anticuerpos sobre la membrana de transferencia. También regula el flujo de estas soluciones cuando se aplica vacío. El soporte 2 también incluye un soporte poroso 47, a saber, una pieza de malla no tejida de polipropileno unida a la montura a lo largo de un borde, que permite que el usuario acceda fácilmente para añadir la membrana de transferencia y que soporta la membrana de transferencia y la protege de los daños por la fuerza del vacío. El soporte 47 es poroso para permitir el libre flujo de líquidos a través del soporte de membrana de filtro 2. En la figura 6 se muestra el soporte 2 correctamente posicionado en el portador 10.
En determinadas realizaciones, el soporte 2 se puede hacer laminando un adhesivo sensible a la presión en la parte posterior de una malla de polipropileno, de tal modo que, después de añadir la membrana de transferencia en el soporte, el usuario quita una tira de refuerzo para exponer el adhesivo sensible a la presión y, a continuación, sella la malla al distribuidor de flujo (por ejemplo, a la membrana GVPP) para crear una envoltura sellada. Para quitar la membrana de transferencia, se pueden incluir perforaciones y cremalleras para abrir la envoltura.
En el contexto de la invención reivindicada, se lamina un papel fino patapar®, papel encerado u otra hoja delgada de material de papel en un lado de la malla de polipropileno. Cuando el soporte se humedece con agua (como se requiere en el proceso), el refuerzo de papel húmedo se adhiere a la membrana GVPP, creando un sello temporal. Una vez finalizado el proceso, la membrana de transferencia es fácil de quitar sin tener que rasgar nada ni manipular adhesivos pegajosos. A continuación, se desecha el soporte, ya que después de que se seque el soporte de papel, este se riza y el soporte se vuelve inutilizable.
Las FIGS. 7 y 8 ilustran la parte inferior de la placa inferior del portador 13. En la FIG. 7 se puede observar la pluralidad de aberturas 74 del soporte poroso 4. La cubierta 14 se utiliza para cubrir las aberturas y evitar la fuga de anticuerpos durante la incubación, en particular, cuando se incuban durante largos períodos de tiempo, tal como durante la noche, como se ve en la FIG. 8. De acuerdo con ciertas realizaciones, las aberturas 74 están rodeadas por un anillo anular elevado 49 y la cubierta 14 tiene una ranura anular correspondiente 60 (FIG. 4), configurada para acoplarse con el anillo anular 49 y, por lo tanto, la cubierta puede presionarse sobre el anillo para asegurarlo a la placa del portador 13.
Como alternativa, la cubierta 14 se puede eliminar y se puede usar una válvula de paraguas 144 para retener el líquido durante la incubación, tal y como se muestra en la FIG. 4A. Cuando se activa el vacío, la válvula se abre y el líquido se drena. Preferentemente, la válvula está hecha de EPDM (monómero de etileno propileno dieno) debido a su rigidez y capacidad para cerrarse a presión rápidamente cuando se desactiva el vacío. Esto ayuda a prevenir la contrapresión y el atrapamiento de aire, lo cual (con las válvulas de silicona) estaba haciendo que el soporte de membrana de filtro se arqueara y condujera a una acumulación perjudicial del anticuerpo. La acumulación del anticuerpo (cobertura no uniforme) deriva en una señal no uniforme en la lectura de transferencia final: las áreas cercanas al aire atrapado tendrán una señal débil (tenue) y las áreas con anticuerpo acumulado tendrán una señal fuerte (negrita).
Tal y como se muestra en las FIGS. 9 y 10, de acuerdo con ciertas realizaciones, el colector 8 es un colector de vacío que se puede conectar a una fuente de vacío adecuada (no mostrada). El colector 8 puede incluir un dispositivo de recogida de residuos (no mostrado), tal como un receptáculo, colocado en el colector (no mostrado) para recoger el líquido extraído a través del portador 10.
De acuerdo con ciertas realizaciones, el colector 8 tiene una base 42, que tiene un drenaje y una superficie de soporte 44 sobre la que se colocan uno o más portadores 10. La superficie de soporte 44 incluye uno o más pocillos o regiones de recepción de portadores 55A, 55B (dos mostradas en la FIG. 9) que pueden incluir una pluralidad de nervaduras verticales 56 que reciben la parte inferior de la placa inferior del portador 13 para sujetar el portador 10 de una manera estable en el colector 8. También se muestran los respectivos controles opcionales 62 para gestionar y supervisar el colector 8 y el proceso. El dispositivo se puede utilizar con manipuladores de líquidos automatizados y elementos similares, si se desea. Cuando el colector 8 se subdivide en uno o más pocillos o regiones de recepción de portadores, el colector puede procesar más de un soporte para ejecutar portadores paralelos con diferentes membranas de transferencia o subpartes de una membrana de transferencia, procesándose normalmente cada membrana con al menos un reactivo diferente. El colector 8 puede tener una fuente de presión común o cada región de recepción de portadores de la estación puede controlarse por presión individualmente.
En otra realización, el colector tiene pies niveladores que, cuando se utilizan junto con uno o más indicadores de nivel de una realización del portador, permiten nivelar el colector y el portador en un plano horizontal. En una realización, el colector tiene una serie de pies que pueden ajustarse en una dirección vertical para nivelar el colector en relación con el (los) indicador(es) de nivel sobre el portador cuando el portador está fijado al colector. En otra realización adicional, la serie de pies tiene un tomillo que encaja en una porción roscada de la parte inferior del colector para permitir que los pies se eleven o bajen individualmente en dirección vertical.
Se pueden usar diversos métodos en las realizaciones divulgadas en el presente documento. El factor clave es que todos ellos dependen de una filtración activada por vacío o presión positiva de los líquidos para acceder a la gran área de superficie interior de la membrana, permitiendo la interacción 3D de todas las moléculas en toda la profundidad, en lugar de solo la interacción 2D en la superficie, como sucedía en el pasado. Donde se usa presión positiva, la base podría ser una cámara cerrada que podría contener el portador, y la tapa 11 se convertiría en un colector de presión para aplicar presión en el pocillo 22 del portador.
El método más simple es usar las realizaciones divulgadas en el presente documento para realizar uno o más ciclos de lavado. Normalmente, cada ciclo de lavado comprende una o más etapas de lavado. Generalmente, se utilizan de 2-5 etapas por ciclo.
Otro método es utilizar las realizaciones divulgadas en el presente documento en cada etapa en la que es necesario mover líquido a través de la membrana de transferencia, tal como después de la incubación de los anticuerpos o en las etapas de lavado.
En todos estos procesos, se puede utilizar cualquier fuerza motriz adecuada para mover el(los) líquido(s) a través del dispositivo y hacia el interior del colector. Esto puede variar según las membranas seleccionadas para la transferencia y el colector utilizado, la velocidad de filtración deseada y el suministro de vacío o presión positiva a disposición del investigador.
Generalmente, el vacío disponible puede variar entre 100 y 760 mmHg (133 milibares y 1013 milibares). También se pueden utilizar válvulas, limitadores de presión y similares para mantener el vacío dentro de los rangos permitidos para las membranas usadas. Un colector de vacío preferido de una realización utiliza un vacío de aproximadamente 100 mmHg. Otros colectores de vacío adecuados incluyen, sin limitarse a, los colectores de vacío MULTISCREEN™ y MULTISCREEN™hts disponibles en Millipore Corporation of Billerica, Massachusetts, EE. UU.
Generalmente, la presión positiva es suministrada por una línea de aire a presiones que oscilan entre aproximadamente 13.789,5 Pa (2 psi) y aproximadamente 103.421,3 Pa (15 psi). También se pueden utilizar válvulas, limitadores de presión y similares para mantener la presión dentro de los rangos permitidos para las membranas usadas. Tales sistemas de presión incluyen, pero no se limitan a, dispositivos de celda agitada Amicon® disponibles en Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts, EE. UU., y unidades de filtración de presión positiva disponibles en Caliper Life Sciences de Hopkinton, Massachusetts, EE. UU.
Para usar un dispositivo de acuerdo con las realizaciones divulgadas en el presente documento, simplemente se coge un soporte, se abre y se coloca(n) la(s) membrana(s) de transferencia sobre una de las superficies, de tal modo que la superficie inferior de la membrana de transferencia esté adyacente al soporte poroso y la superficie superior de la membrana de transferencia esté adyacente al distribuidor de flujo cuando el dispositivo se cierre alrededor de la(s) membrana(s) para que no haya burbujas de aire entre la membrana de filtro y el distribuidor de flujo. Las burbujas entre estas dos superficies pueden generar áreas sin flujo. A continuación, se coloca el soporte de membrana de filtro dentro del portador, que luego se cierra de forma segura con el mecanismo de cierre. El dispositivo se coloca sobre o en un colector que tiene un suministro de presión (vacío o presión positiva). Preferentemente, la(s) membrana(s) de transferencia se han humedecido previamente. La presión (vacío o presión positiva) se activa y un líquido, tal como un líquido de lavado o un reactivo, se coloca en el pocillo de un portador. La presión continúa hasta que el líquido se mueve a través del dispositivo y la(s) membrana(s). Entonces se desactiva la presión.
Cuando se utiliza más de una membrana de transferencia, se pueden colocar en serie una encima de la otra y, en una etapa del proceso, se puede mover fácilmente el líquido suficiente que contenga los mismos reactivos deseados a través de las múltiples capas. Generalmente, cuando se usa más de una capa, se prefiere que se usen entre 2 y 10 capas, preferentemente entre 2 y 5 capas a la vez.
El líquido se puede añadir con el suministro de presión desactivado o el suministro activado solo brevemente para que el líquido ingrese en la(s) membrana(s) y se deja incubar (tal como puede ser necesario con los anticuerpos primarios o secundarios). A continuación, se activa la presión para eliminar el líquido y/o sustituirlo por otro utilizado seguidamente. Preferentemente, durante el lavado, se deja el vacío y se añaden seguidamente los lavados restantes.
De manera opcional, si se desea, se puede colocar un recipiente de recogida 70 debajo del dispositivo (FIG. 9A), preferentemente en el propio colector o corriente adelante, tal como una bandeja de recogida de anticuerpos. Luego, puede usarse para recoger uno o más reactivos libres que pueden ser costosos y que pueden recogerse y reciclarse para su uso en ensayos futuros. El recipiente también se puede subdividir en múltiples cámaras que están alineadas y en comunicación de fluidos con la porción respectiva de la membrana de transferencia.
De manera adicional o como alternativa, se puede colocar en la vía de flujo corriente adelante, debajo del soporte, una matriz absorbente que sea capaz de unir de forma reversible uno o más reactivos libres que son costosos. La matriz tiene preferentemente la forma de un monolito, tal como una almohadilla, un tapón o una hoja de papel, que se coloca de modo que todo el líquido que pasa a través de la membrana de transferencia y el soporte atraviese la matriz. A continuación, este se puede eliminar o eluir el reactivo o, si se desea, se puede hacer que los reactivos unidos se eluyan in situ después de finalizar la prueba de la membrana de transferencia.
También se pueden usar otros procesos con el dispositivo de las realizaciones divulgadas en el presente documento.
La membrana contiene, en sus intersticios, una o más sustancias que deben detectarse. Generalmente, estas sustancias están presentes en los intersticios ya sea por haber sido transferidas desde un soporte sólido para electroforesis o cromatografía o por aplicación directa, generalmente para detectar la presencia, ausencia o cantidad de un tipo particular de material, tal como un anticuerpo o proteína específica, es decir, un ensayo de inmunotransferencia por puntos como el descrito anteriormente. No obstante, la definición de membrana no se limita a estos casos, pero se aplica en cualquier caso en donde una membrana contenga en sus intersticios una o más sustancias que deban detectarse. Incluidas en los tipos de membranas previstas para su uso en las realizaciones divulgadas en el presente documento están las membranas comúnmente utilizadas para transferir los geles de electroforesis como nitrocelulosa; nailon; o diversas otras membranas poliméricas, tal como el fluoruro de polivinilideno (PVDF), vendido como membranas IMMOBILON™ por Millipore Corporation de Billerica, Massachusetts, EE. UU.
Pueden utilizarse varios materiales para replicar los resultados de los geles de electroforesis realizados sobre diversas muestras como se entiende en la técnica. Más comúnmente, las muestras contienen sustancias biológicas tales como proteínas individuales, anticuerpos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, carbohidratos complejos y similares, pero la aplicación de la técnica no se limita a estas sustancias. La técnica es aplicable a cualquier membrana que contenga en su interior una sustancia que deba detectarse, independientemente de la composición química de la membrana o de las sustancias diana.
Cuando se emplean membranas que representan réplicas de resultados electroforéticos, la transferencia de las sustancias que deben detectarse desde el gel a la membrana se puede realizar utilizando membranas que contienen tampón de transferencia, mediante electroelución o por transferencia en seco de los geles. Las técnicas para estas transferencias se conocen bien en la técnica y no forman parte de las realizaciones descritas en el presente documento.
El líquido que se va a suministrar puede contener reactivos de detección o simplemente se puede proporcionar como un lavado. La naturaleza del reactivo de detección depende, por supuesto, de la sustancia que deba detectarse. Normalmente, las proteínas se detectan mediante reacciones inmunológicas entre el antígeno y el anticuerpo o porciones inmunorreactivas de estos; normalmente, la presencia de fragmentos de ácido nucleico se detecta mediante sondas de oligonucleótidos adecuadas. Las sustancias de detección responsables de la reacción inmediata o específica con la sustancia que debe detectarse podrán complementarse adicionalmente, si fuese necesario, con una etiqueta y puede ser necesaria una multiplicidad de aplicaciones de los reactivos de detección: por ejemplo, un protocolo puede incluir la detección de un antígeno mediante el suministro de un anticuerpo marcado con una enzima, por ejemplo, comúnmente, peroxidasa de rábano picante, y luego esta unión se detecta mediante el suministro de sustrato para esta enzima. Al aplicar el reactivo, es posible utilizar, aunque no preferentemente, solo una matriz donante presionada positivamente para exponer este componente de la membrana durante un período definido.
Es más conveniente realizar el método de las realizaciones divulgadas en el presente documento a temperatura ambiente, pero también se pueden usar temperaturas elevadas y más bajas. Esto se puede lograr calentando el dispositivo, su entorno circundante (como en una caja de calor o una caja de enfriamiento) o los líquidos utilizados en el sistema.
Las membranas de filtro se pueden analizar secuencialmente con múltiples anticuerpos o sondas en el presente dispositivo y procesarse separando de la membrana de filtro los anticuerpos previamente unidos, y después se realizan incubaciones posteriores con anticuerpos u otras sondas específicas de otras proteínas diana. El proceso de separación interrumpe los enlaces antígeno-anticuerpo y disuelve los anticuerpos en el tampón circundante. Por lo general, esto se logra mediante una combinación de detergente y calor o mediante la exposición a un pH alto o bajo. El dispositivo, en combinación con el distribuidor de flujo, permite la separación de las membranas de filtro mediante el método de pH alto o bajo. El sondeo posterior repetido de las membranas de filtro, ya sea directamente (por ejemplo, utilizando el mismo distribuidor de flujo utilizado para la separación) o posteriormente después del almacenamiento, utilizaría el mismo protocolo que el sondeo inicial. Los kits adecuados para la transferencia por separación están disponibles en Chemicon International, Inc con los nombres comerciales ReBlot™ Plus kit (catálogo n.° 2500), ReBlot Plus-Mild solution (catálogo n.° 2502) y ReBlot Plus-Strong solution (catálogo n.° 2504). En la inmunoelectrotransferencia estándar, el antígeno o la diana se transfiere a un soporte de membrana y se sondea con una sonda adecuada, tal como un anticuerpo, proteína (por ejemplo, proteína A) o lectina (proteínas o glucoproteínas que se unen a fracciones de carbohidratos). En algunas aplicaciones, se utiliza un formato inverso (por ejemplo, matriz inversa), en donde el anticuerpo u otras sondas se colocan sobre una membrana u otro soporte (normalmente en formato de matriz) y el antígeno o diana se presenta a los anticuerpos inmovilizados sobre la matriz. La visualización de un evento de unión de la sonda al objetivo se puede lograr marcando los antígenos o las dianas o utilizando un anticuerpo secundario específico para el anticuerpo. Las matrices inversas a menudo emplean mezclas de dianas, por ejemplo, lisados marcados con diferentes colores fluorescentes para permitir el procesamiento en paralelo. También se pueden realizar ensayos inversos con las realizaciones divulgadas en el presente documento.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo que comprende un soporte (2) y un portador (10) para el soporte,
a) teniendo el soporte (2) una porción superior y una porción inferior, teniendo cada porción superior e inferior un borde exterior, una superficie superior y una superficie inferior y un espesor entre las superficies superior e inferior, teniendo la porción superior una abertura hacia el interior del borde exterior, en donde un distribuidor de flujo (46) cubre la abertura cuando dicho soporte (2) está cerrado, comprendiendo el soporte (2): i) una montura (40) con un borde perimetral configurado para soportar una membrana de transferencia de proteínas (45), estando dicha montura fabricada con plástico o papel; ii) siendo un distribuidor de flujo (46) una membrana fijada a dicha montura (40) y sobre la cual se puede colocar dicha membrana de transferencia de proteínas (45); iii) un soporte poroso (47) que es una malla no tejida de polipropileno unida a dicha montura (40) a lo largo de un borde, y una hoja de papel laminada a dicha malla de polipropileno, en donde el soporte poroso (47) permite el acceso al soporte (2) para que un usuario del dispositivo añada la membrana de transferencia de proteínas (45) al soporte (2) cuando el soporte (2) está abierto, de tal manera que dicha membrana de transferencia de proteínas (45) quedaría intercalada entre el distribuidor de flujo (46) y el soporte poroso (47) cuando dicho soporte (2) está cerrado; y
b) comprendiendo el portador (10) para el soporte (2) una placa superior (12) y una placa inferior (13), teniendo cada una un ancho y una longitud, una superficie superior e inferior y un espesor entre las superficies superior e inferior, un borde exterior y al menos una abertura, siendo las placas de una longitud y una anchura mayores que la longitud y la anchura del soporte (2), teniendo la placa superior (12) del portador (10) una abertura con sustancialmente la misma anchura y longitud que la abertura de la porción superior del soporte (2), teniendo la superficie inferior de la placa superior (12) y la superficie superior de la placa inferior (13), cada una, uno o más sellos alineados entre sí cuando las dos placas están adyacentes entre sí y estando los sellos dispuestos sobre cada superficie en un ancho y largo mayores que los de la abertura de la placa superior (12), pero inferiores a las dimensiones exteriores del soporte (2), al menos una de las placas tiene un sello adicional formado adyacente al borde exterior de la placa y hacia fuera del sello de esa placa.
2. El dispositivo de la reivindicación 1, que comprende, además, medios para mantener juntas de forma liberable dichas placas superior e inferior (12, 13).
3. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicho uno o más sellos en la superficie superior de la placa inferior (13) son sellos de brida.
4. El dispositivo de la reivindicación 1 que comprende, además, al menos un nivel que indica el dispositivo fijado a la superficie superior de la placa superior (12).
5. El dispositivo de la reivindicación 1 en donde el portador (10) tiene uno o más pocillos (22) fijados a la superficie superior de la placa superior (12).
6. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde una tapa (11) se coloca sobre la abertura de la placa superior del portador (12).
7. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde una cubierta (14) está sellada de manera liberable a dicha abertura de la placa inferior del portador (13).
8. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde dicha placa inferior del portador (13) tiene una válvula.
9. El dispositivo de la reivindicación 1, en donde el sello en la superficie inferior de la placa superior (12) es un primer sello de brida (30A), el sello en la superficie superior de la placa inferior (13) es un segundo sello de brida (30B), y en donde dicho primer y segundo sellos de brida (30A, 30B) cooperan para sellar las porciones superior e inferior cuando las porciones superior e inferior se juntan.
10. El dispositivo de la reivindicación 9, en donde cada sello de brida (30A, 30B) comprende un miembro en forma de V, siendo una pata de la V más corta que la otra.
11. El dispositivo de la reivindicación 10, en donde cada sello de brida (30A, 30B) está hecho de un elastómero flexible.
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