ES2862190T3

ES2862190T3 - Método y sistema para robar rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana

Info

Publication number: ES2862190T3
Application number: ES18183741T
Authority: ES
Inventors: Pawel Debski; Piotr Garstecki
Original assignee: Bacteromic Sp Z O O; Bacteromic Sp zoo
Current assignee: Bacteromic Sp Z O O; Bacteromic Sp zoo
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN112424370A; CN112424370B; US11891648B2; WO2020016200A1; DK3597768T3; PL3597768T3; EP3597768A1; US20210254126A1; EP3597768B1

Abstract

Un método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo en una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo, caracterizado por que el método AST comprende o consiste en las siguientes etapas: a) Proporcionar un inóculo de microorganismo y diluir el inóculo en un medio adecuado para AST de dilución de caldo, b) Proporcionar un portador que comprende uno o más compartimentos adecuados para AST de dilución de caldo, en donde los o al menos parte de los compartimentos comprenden respectivamente un único agente antimicrobiano o una combinación de agentes antimicrobianos, c) Dispensar una muestra del medio que contiene el inóculo diluido de la etapa a) en los o al menos parte de los compartimentos del portador de la etapa b) de tal manera que el uno o más compartimentos inoculados del portador comprendan los ensayos de prueba respectivos, d) Incubar el portador de la etapa c) que comprende el respectivo uno o más ensayos de prueba, e) Medir, durante la etapa de incubación d), al menos n veces para cada uno de los uno o más ensayos de prueba con una frecuencia f constante o inconstante una señal derivada de una propiedad física o química del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido, y leer los valores correspondientes {xi} en tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n y en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones, f) Estimar una o más pendientes de tendencias lineales α en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {xi} y {xj}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo δtij entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {xi}, pero al menos 13 o más valores de lectura {xi} a tiempos de registro correspondientes {ti} se usan para la distribución y g) Determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos como una función de una o más pendientes de tendencias lineales α.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y sistema para robar rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana

Campo técnico:

La presente invención se refiere a métodos y sistemas para probar rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana, en donde la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa de un microorganismo inoculado contra un agente antimicrobiano o una combinación de agentes antimicrobianos se determina como una función de una o más pendientes de tendencias a lineales de valores de lecturas.

Antecedentes de la técnica:

En microbiología clínica, la investigación fenotípica mediante cultivo líquido es un estándar de oro para evaluar la resistencia de las muestras de, en particular, microorganismos bacterianos o fúngicos a uno o más antimicrobianos. Un método se refiere a la Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana (AST, por sus siglas en inglés), que, por ejemplo, implica incubar uno o más aislados de los microorganismos respectivamente en medio líquido en presencia de uno o una combinación de dos o más antimicrobianos y evaluar si se produce el crecimiento de la población aislada respectiva.

La Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana permite la determinación cualitativa de si el aislado del microorganismo es SUSCEPTIBLE (S), INTERMEDIO (I) o RESISTENTE (R) con respecto a los antimicrobianos usados:

Por lo tanto la categoría SUSCEPTIBLE indica que el antimicrobiano/la combinación de antimicrobianos puede ser una elección apropiada para tratar la infección provocada por el microorganismo probado y la resistencia bacteriana/fúngica es ausente o a un nivel clínicamente insignificante.

La categoría INTERMEDIO indica que las poblaciones aisladas probadas del microorganismo son "moderadamente susceptibles" al antimicrobiano probado, por lo que esta categoría sirve como una zona amortiguada entre SUSCEPTIBLE y RESISTENTE. Los antimicrobianos que caen en esta categoría pueden indicarse todavía en el caso de que puedan concentrarse en el foco de la infección (por ejemplo, quinolonas y p-lactama en orina) o cuando puede usarse una dosificación más alta de lo normal del antimicrobiano (por ejemplo, p-lactama) debido a su baja toxicidad. El agente antimicrobiano puede todavía ser eficaz contra el aislado probado pero las velocidades de respuesta pueden ser menores que para aislados susceptibles.

La categoría RESISTENTE indica que el aislado probado es resistente al antimicrobiano respectivo, lo que significa que el microorganismo bacteriano o fúngico no parece inhibirse por las concentraciones habitualmente logrables del agente antimicrobiano probado con pautas de dosificación normales. Por lo tanto, los antimicrobianos de esta categoría no son una elección apropiada para tratar la infección provocada por el aislado bacteriano o fúngico probado.

Alternativamente, el Tipo silvestre (TS) o no Tipo silvestre (NTS) pueden usarse para categorizar la susceptibilidad del microorganismo. En consecuencia, un aislado de microorganismo puede definirse como TS para una especie en ausencia de mecanismos de resistencia fenotípicamente detectable adquirida o mutacional al agente antimicrobiano en cuestión. Esto significa a su vez, que un aislado de microorganismo puede definirse como NTS para una especie en presencia de mecanismos de resistencia fenotípicamente detectable adquirida o mutacional al agente antimicrobiano en cuestión.

Además, el método de Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana permite una evaluación cuantitativa determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) de un antimicrobiano para el aislado particular, por lo que se lleva a cabo un ensayo de dilución antimicrobiana en agar, dentro de tubos de cultivo o dentro de placas de microtitulación. Cuando se determina la CMI dentro de los tubos de cultivo o las placas de microtitulación, las diluciones en serie de un único antimicrobiano o una combinación de dos o más antimicrobianos se inoculan en el pocillo o el tubo a lo largo de un inóculo convencional de un microorganismo de muestra. El crecimiento en presencia de la concentración antimicrobiana respectiva se mide usando turbidez. La concentración mínima inhibitoria se refiere a la dilución más alta o la concentración más baja de antimicrobiano que inhibe completamente el crecimiento del aislado. Cuando se usa el método CMI en agar, por ejemplo, se aplica al agar una tira de difusión inoculada que contiene un gradiente de concentración de antimicrobiano de tal manera que el gradiente se transfiere desde la tira hacia el agar. Después de la incubación durante la noche o más larga, se forma una zona elíptica de inhibición centrada alrededor de la tira. El valor de CMI puede leerse en el punto en que el borde de la elipse intersecta con la tira de CMI. El valor de CMI resultante puede interpretarse después usando patrones tales como los proporcionados por el European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing (EUCAST) o el Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI).

En vista de las amenazas que poseen las infecciones, posiblemente letales, provocadas por microorganismos resistentes a antimicrobianos y el aumento de la diseminación en todo el mundo de la resistencia bacteriana a antibióticos, se desea en aumento la rápida detección de tales especies resistentes y la determinación de concentraciones mínimas inhibitorias. El documento WO96/12819 desvela un método para aumentar los efectos bactericidas y bacteriostáticos de los agentes antimicrobianos.

Aunque los ensayos fenotípicos de la resistencia antimicrobiana son muy fiables, muchos de ellos también consumen mucho tiempo, ya que la tasa de proliferación de los microorganismos en particular se ralentiza cuando se ha inoculado un aislado del microorganismo en el nuevo medio de cultivo, que puede observarse como la denominada fase estacionaria del crecimiento bacteriano en cultivo en lotes. En esta fase los métodos de medición convencionales usados para enumerar los microorganismos rinden una relación de señal a ruido inaceptablemente baja. La técnica anterior de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana, sin embargo, determina si un aislado del microorganismo prolifera o no en un ambiente particular solo en las fases tardías de crecimiento, por ejemplo, en la fase exponencial o logarítmica. Por lo tanto, el tiempo mínimo para la Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana depende de las fases exponenciales o logarítmicas del microorganismo. De acuerdo con la FDA, para bacterias de crecimiento rápido, las pruebas con tiempos de incubación menores de 16 horas se denominan que emplean "incubación a corto plazo", sin embargo, se requieren tiempos de incubación habituales de 16 a 20 h (con alguna excepción), de tal manera que los resultados globales de la Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana toman hasta días y semanas. En vista de que la evaluación cualitativa y cuantitativa de AST es a veces crítica en tiempo para infecciones que amenazan la vida, sería deseable acortar el tiempo para la obtención de los resultados cualitativos y cuantitativos de AST.

Una manera de acelerar el tiempo para proporcionar resultados cualitativos y/o cuantitativos de la AST es usando cultivo de placas de microtitulación, tal como en placas de microtitulación de 96 o 384 pocillos, que permite aplicar simultáneamente múltiples condiciones diferentes, tales como la presencia o ausencia de antimicrobianos específicos o diferentes concentraciones de los mismos a la muestra de microorganismo. El crecimiento potencial, es decir, la multiplicación del microorganismo, tiene lugar en los pocillos de las placas de microtitulación y se evalúa ópticamente mediante los ojos o bien se evalúa por medición con máquina de las propiedades físicas o químicas que dependen directamente del crecimiento de los microorganismos.

Otro intento de acelerar la detección y cuantificación de la resistencia antimicrobiana es la automatización del cultivo. Algunos ejemplos de sistemas de Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana automatizados son VITEK y Phoenix (ofrecidos por bioMerieux y Becton Dickinson, respectivamente), que toman ventaja de chips microfluidos dedicados, o MicroScan y Sensititre, manejando ambos placas de microtitulación de 96 pocillos.

Además, la técnica anterior enseña a monitorizar apropiadamente el cultivo microbiano para acortar el tiempo necesario para la detección de su crecimiento. Estos métodos requieren la medición de propiedades físicas o químicas específicas del cultivo, habitualmente en condiciones especiales. A modo de ejemplo, el color de un medio de cultivo (documento US 6.265.182 B1), inactivación de fluorescencia con el uso de un compuesto químico particular (documento US 6.165.741 B1), impedancia eléctrica de sub-volúmenes de muestra pequeños (documento US 6.649.402 B2) o presión parcial de oxígeno (documento EP 0 128 527 A2) son propiedades, que proporcionan monitorizar la información sobre el crecimiento de los microorganismos. La desventaja principal de estas soluciones es un requisito de un ajuste experimental específico para las mediciones. Además, los métodos anteriormente mencionados no permiten llevar a cabo el ensayo muy rápido (por ejemplo con el uso del documento US 6.265.182 B1 la prueba de susceptibilidad de antibióticos toma de 4 a 6 horas).

Por otro lado el progreso significativo en las técnicas de microfluidos proporciona una vía para pruebas AST muy rápidas. En el artículo Antibiotic susceptibility testing in less tan 30 min using direct single-cell imaging (O. Baltekin et al., PNAS 22 de agosto de 2017, 114 (34), 9170-9175) dicho método se describe, donde las bacterias únicas pueden atraparse en canales microfluidos, tratarse con diferentes medios (es decir, con antibiótico o sin él) y después observarse por medio de microscopía de contraste de fase. La influencia de un antibiótico en una muestra también puede detectarse rápidamente de acuerdo con el método desvelado en Rapid pathogen-specific phenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMP quantification in clinical samples (Schoepp et al., Sci. Transl. Med. 9, eaal3693 (2017)). Allí, se hace una comparación entre la muestra expuesta a un antibiótico y la referencia basándose en un resultado del ensayo cuantitativo basado en amplificación isotérmica de ácidos nucleicos. Ambos métodos de técnica de microfluidos dan parámetros impresionantes de un ensayo, pero requieren también equipo muy sofisticado.

En conclusión, las soluciones del estado de la técnica se caracterizan por los siguientes problemas:

• La prueba de susceptibilidad antimicrobiana convencional es, en vista de la etapa de incubación para llevar a cabo el crecimiento de la muestra de microorganismo aislado, muy lenta.

• Las mediciones basadas en la impedancia/color/inactivación de fluorescencia requieren un ajuste experimental específico.

• La nueva técnica de microfluidos descrita por Baltekin et al. observa bacterias únicas, por lo tanto escala hacia abajo el sistema observado y también requiere un ajuste específico y rutinas de laboratorio.

• La nueva técnica de microfluidos descrita por Schoepp et al. también requiere el uso de rutinas de laboratorio específicas (amplificación LAMP).

Breve descripción de la invención:

Uno o más de los problemas de la presente invención se soluciona o se solucionan mediante los objetos de las reivindicaciones independientes. Las ventajas (realizaciones preferidas) se exponen en la descripción detallada en lo sucesivo en el presente documento y/o las figuras adjuntas así como en las reivindicaciones dependientes.

En consecuencia, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo en una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo, caracterizado por que el método AST comprende o consiste en las siguientes etapas:

a) Proporcionar un inóculo de microorganismo y diluir el inóculo en un medio adecuado para AST de dilución de caldo,

b) Proporcionar un portador que comprende uno o más compartimentos adecuados para AST de dilución de caldo, en donde los o al menos parte de los compartimentos comprenden respectivamente un único agente antimicrobiano o una combinación de agentes antimicrobianos,

c) Dispensar una muestra del medio que contiene el inóculo diluido de la etapa a) en los o al menos parte de los compartimentos del portador de la etapa b) de tal manera que el uno o más compartimentos inoculados del portador comprendan los ensayos de prueba respectivos,

d) Incubar el portador de la etapa c) que comprende el respectivo uno o más ensayos de prueba,

e) Medir, durante la etapa de incubación d), al menos n veces para cada uno de los uno o más ensayos de prueba con una frecuencia f constante o inconstante una señal derivada de una propiedad física o química del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido, y leer los valores correspondientes {x j en tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n y en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones,

f) Estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {xi} y {xj}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo 6t¡ entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {xi}, pero al menos l3 o más valores de lectura {x j a tiempos de registro correspondientes { t j se usan para la distribución y

g) Determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido para realizar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo, comprendiendo el sistema:

a) un ensamblaje de incubación adaptado para alojar al menos un portador que tiene uno o más compartimentos para recibir una muestra de un inóculo de microorganismo diluido en un medio de crecimiento, en donde los o al menos parte de los compartimentos comprenden respectivamente un único agente antimicrobiano o una combinación de agentes antimicrobianos, de tal manera que cada compartimento inoculado aloja un ensayo de prueba respectivo, en donde el ensamblaje de incubación se configura para proporcionar un ambiente de incubación y/o medición del uno o más ensayos de prueba en el uno o más compartimentos,

b) un ensamblaje de interrogación y lectura que comprende medios de interrogación y medios de medición configurados para interrogar y leer el uno o más ensayos de prueba durante la incubación del uno o más portadores, en donde el ensamblaje de interrogación y lectura facilita i) medir al menos n veces para cada uno del uno o más ensayos de prueba, con una frecuencia f constante o no constante, una señal derivada de una propiedad química o física del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido y ii) leer los valores correspondientes {x j a tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n, en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones y

c) un ensamblaje de computación que comprende uno o más procesadores y una o más instrucciones de almacenamiento de medio leíble por computador que, cuando se ejecuta por el uno o más procesadores, provoca que el uno o más procesadores realicen funciones que comprenden i) recibir del ensamblaje de interrogación y lectura el número n de lecturas, los valores {x j y los tiempos de registro correspondientes {ti} y ii) estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {x j y {xj, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo Stij entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {xj, pero al menos 13 o más valores de lectura {xi} a tiempos de registro correspondientes { t j se usan para la distribución y iii) determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un uso del sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido de la invención para realizar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo en la determinación de la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa de un microorganismo inoculado.

Los aspectos inventivos de la presente invención como se desvelan anteriormente en el presente documento pueden comprender, en caso de que sea razonable para una persona experta en la materia, cualquier combinación posible de las realizaciones de la invención preferidas como se exponen en las reivindicaciones dependientes o se desvelan en la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos:

La Figura 1 muestra una curva de crecimiento ilustrativa de un microorganismo inoculado con muestra en una prueba de susceptibilidad antimicrobiana, donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición.

La Figura 2 muestra el aumento de los valores de señal (valores de lectura) debido al crecimiento de microorganismos como una multiplicidad del ruido de alta frecuencia del medio de medición, en donde los puntos de aumento 1 vez, 2 veces y 3 veces de la señal sobre el ruido de alta frecuencia del medio de medición se indican por las líneas discontinuas 1cr, 2o y 3o.

La Figura 3 muestra el valor de la tendencia lineal a calculada para la curva de crecimiento ilustrativa usando el método de la invención usando todos los valores medidos, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición.

La Figura 4 muestra la incertidumbre relativa (desviación estándar del estimado) de la tendencia a usando el método de la invención calculada con todos los valores medidos, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición.

La Figura 5 muestra el valor de la tendencia lineal a calculada para la curva de crecimiento ilustrativa usando el método de la invención y las últimas 2000 mediciones tomadas, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición.

La Figura 6 muestra la incertidumbre relativa (desviación estándar del estimado) de la tendencia a usando el método de la invención y las últimas 2000 mediciones tomadas, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición.

La Figura 7 muestra una dependencia de una desviación estándar de una pendiente estimada de la tendencia a sobre un número de lecturas.

La Figura 8 muestra una dependencia de una desviación estándar de una pendiente estimada de la tendencia a sobre un ruido de alta frecuencia del dispositivo de medición.

La Figura 9 muestra diez curvas de crecimiento de ensayos de prueba separados de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana usando diferentes concentraciones antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria.

La Figura 10 muestra diez curvas de crecimiento de diez ensayos de prueba separados de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana usando diferentes concentraciones antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria.

La Figura 11 muestra tres curvas de crecimiento de tres ensayos de prueba separados de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana usando diferentes concentraciones antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria.

La Figura 12 muestra la evolución del valor de CMI determinado experimentalmente con el uso de métodos del estado de la técnica.

La Figura 13 muestra la evolución del valor de CMI determinado experimentalmente con el uso de la presente invención.

Descripción detallada de la invención:

Como se describe en detalle a continuación, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que cuando se usa el método, sistema o uso de la invención es posible reducir el tiempo de incubación de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) convencional usando dilución de caldo y/o aumentar la precisión de la determinación cualitativa o cuantitativa de susceptibilidad antimicrobiana. Tales mejoras se logran sin el uso de ajuste experimental y rutinas de laboratorio específicos, como se requiere para las mediciones de la técnica anterior, por ejemplo, mediciones basándose en impedancia, color, inactivación de fluorescencia o las técnicas de microfluidos descritas por Baltekin et al. O Schoepp et al., donde se observa una única bacteria y el sistema observado se escala o bien se usa amplificación LAMP.

La presente invención se basa en la evolución de la distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de valores de lectura dividido por el intervalo de tiempo entre tomar los valores de lectura para 13 o más mediciones de un ensayo de prueba y determinar la susceptibilidad antimicrobiana cualitativa o cuantitativa del microrganismo inoculado.

El método de la invención está implementado por computador, lo que significa que el método de la invención se lleva a cabo mediante el uso de un medio de procesamiento adecuado y opcionalmente un medio de almacenamiento adecuado, por ejemplo, mediante el uso de un ordenador, ordenador portátil, dispositivo inteligente, etc., y en el caso de que el ensamblaje se conecte a internet, el medio de procesamiento adecuado y opcionalmente el medio de almacenamiento pueden proporcionarse por un servidor accesible a internet, en particular una red de servidor en la nube.

De acuerdo con la presente invención, parte o todos de los n valores de lectura {x;}, pero al menos 13 o más, preferentemente 100 o más, más preferentemente 500 o más, incluso más preferentemente 1000 o más valores de lectura {x;} en n tiempos de registro correspondientes {t;} se usan para estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {x;} y {xj}, donde j > ;, dividido por el intervalo de tiempo 5t;j entre la toma de lecturas indexadas ; y j. En otras palabras, para al menos 13 o más, preferentemente 100 o más, más preferentemente 500 o más, incluso más preferentemente 1000 o más valores de lectura {x;} una distribución de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura dividido por el intervalo de tiempo entre la toma de lecturas (frecuencia f) puede calcularse como sigue:

A partir del conjunto de n valores de lectura {x;} (de forma sinónima también denominado lecturas o lecturas {x;}), puede n (n - l)

construirse un conjunto de 2 diferencias normalizadas {ruj} de un par de valores de lectura m¡ = ^{8 ti}lJ donde j > i y 5t;j es la diferencia de tiempo entre tomar las lecturas indexadas i y j. Si las lecturas se toman con frecuencia constante, entonces 5t;j = 5t(j - /), donde 5t es el tiempo promedio entre lecturas consecutivas.

De acuerdo con todos los aspectos de la presente invención la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos se determina como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a.

La determinación de la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado se basa en el descubrimiento de si el crecimiento del microorganismo inoculado se inhibe o no. En consecuencia, la tasa de crecimiento y del microorganismo inoculado en el ensayo de prueba y puede calcularse usando una función de calibrado f(y): y = (f(y))-1 ■ a.

La imprecisión Oy de la estimación de la tasa de crecimiento y es igual

donde o es la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del instrumento.

Esto significa que la precisión de la determinación de susceptibilidad cualitativa o cuantitativa (es decir, la desviación estándar Oa) de una estimación de la tendencia lineal a depende solamente del número de lecturas usado para la distribución de sustracción y la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del medio de medición o. Además es n - - 2 = ( I n 2)

proporcional a v / i lo que significa que la precisión de la determinación de la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de la muestra de microorganismo inoculado aumenta más rápido con el número creciente de lecturas que en los métodos AST habituales de acuerdo con la técnica anterior, por ejemplo, método de mínimos cuadrados, donde 1

un factor de escala es n A

Por lo tanto, de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, el método implementado por computador para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo en una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo comprende o consiste en las siguientes etapas:

e) Medir, durante la etapa de incubación d), al menos n veces para cada uno de los uno o más ensayos de prueba con una frecuencia f constante o inconstante una señal derivada de una propiedad física o química del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido, y leer los valores correspondientes {xi} en tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n y en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones,

f) Estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {x,} y {xj}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo 6t¡ entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {xi}, pero al menos l3 o más valores de lectura {x,} a tiempos de registro correspondientes {ti} se usan para la distribución y

De acuerdo con la presente invención puede probarse la susceptibilidad antimicrobiana de cualquier microorganismo adecuado, preferentemente el microorganismo se selecciona de la lista que consiste en bacterias, por ejemplo, bacterias aerobias o anaerobias incluyendo micobacterias y hongos. De acuerdo con una realización de la presente invención el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias que incluyen bacterias aerobias o bacterias anaerobias.

Con respecto al primer aspecto, el inóculo de microorganismo y las diluciones de caldo adecuadas para el microorganismo respectivo se preparan de acuerdo con métodos convencionales en la técnica, en particular como se describe por EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; http://www.eucast.org.) y CLSI (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 22a Edición; documento CLSI M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standard Institute; 2012). Los respectivos métodos convencionales descritos para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana para bacterias, micobacterias y hongos se incorporan en el presente documento por referencia. De acuerdo con la presente invención el inóculo de microorganismo, que es habitualmente un cultivo durante la noche, o una porción de un cultivo durante la noche, de un microorganismo probado se diluye en un medio de crecimiento adecuado, tal como la dilución de caldo líquido (también denominado también de forma sinónima "medio adecuado para AST de dilución de caldo"). Una muestra de este inóculo diluido (también denominado de forma sinónima "una muestra del medio que contiene el inóculo diluido", "una muestra de dilución de caldo de un inóculo de microorganismo" o "una muestra de un inóculo de microorganismo diluido en un medio de crecimiento") se usa después en la etapa c) del método de la invención. De acuerdo con el ejemplo 1, esta suspensión se diluye además dos veces mezclando con la solución respectiva de antibiótico en caldo. Con respecto a la muestra, el recuento de células de microorganismo en la dilución es determinable. Preferentemente, la densidad del medio de muestra que contiene el inóculo diluido es 5*105 UFC/ml (Unidades Formadoras de Colonias/ml). En particular, cuando se prueban bacterias como microorganismos, el caldo se selecciona de un caldo Mueller-Hinton (caldo MH) de cationes ajustados sin suplementar, que se usa para probar organismos no fastidiosos de acuerdo con la norma ISO 20776-1, 2006, o caldo MH de cationes ajustados suplementado con 5 % de sangre de caballo lisada y p-NAD 20 mg/l (caldo MH-F), que se usa para probar Streptococcus spp. ("incluyendo S. pneumoniae), Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Lsteria monocytogenes, Campylobacter jejuni y coli, Pasteurella multocida, Corynebacterium spp., Aerococcus sanguinicola y urinae, Kingella kingae y varios otros organismos fastidiosos. El caldo MH sin suplementar también puede obtenerse de fuentes comerciales.

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, puede usarse cualquier portador adecuado que comprende uno o más compartimentos adecuados para AST de dilución de caldo, en donde los o al menos parte de los compartimentos comprenden respectivamente un agente antimicrobiano único o una combinación de agentes antimicrobianos. El portador también facilita generalmente la medición de las propiedades en la etapa e) del primer aspecto de la invención así como evita la contaminación cruzada entre los ensayos de prueba. Un portador tal puede seleccionarse del grupo que consiste en una placa de microtitulación, tubo, por ejemplo, tubo Eppendorf, placa Petri o chip de microfluidos. El portador representa preferentemente una placa de microtitulación o un chip de microfluidos, ya que pueden incubarse simultáneamente múltiples ensayos de prueba. Puede aún preferirse un chip de microfluidos como portador de acuerdo con todos los aspectos de la invención, ya que puede alojar igual a o más de 100 compartimentos de incubación, preferentemente igual a o más de 128 compartimentos de incubación, más preferentemente igual a o más de 320 compartimentos de incubación, incluso más preferentemente igual a o más de 640 compartimentos de incubación y más preferentemente igual a o más de 1280 compartimentos de incubación. El compartimento (de incubación) de un chip de microfluidos puede denominarse también de forma sinónima un segmento de incubación o pocillo de incubación. El portador a usar por la presente invención también puede comprender medios para facilitar la incubación, tales como medios de ajuste de temperatura y/o medios para el intercambio de gases. Unos chips de microfluidos muy preferidos adecuados para la presente invención se describen en particular en las solicitudes de palente polacas PL 425106 y PL 425107 (ambos en nombre de Bacteromic sp. z.o.o., también el presente solicitante) y el contenido que concierne al chip de microfluidos de ambas solicitudes PL 425106 y PL 425107 se incorpora en el presente documento por referencia.

El uno o más compartimentos del portador a usarse de forma inventiva respectivamente comprenden un único agente antimicrobiano o una combinación de dos, tres, cuatro o más agentes antimicrobianos y opcionalmente excipientes adicionales según sea necesario. El agente antimicrobiano (denominado también de forma sinónima un "antimicrobiano") o la combinación de agentes antimicrobianos puede seleccionarse del grupo de agentes que inhiben el crecimiento de bacterias, en particular micobacterias, y/u hongos. En particular el agente antimicrobiano o la combinación de agentes antimicrobianos puede comprender un agente bacteriostático, un agente bactericida, un agente fungistático o un agente fungicida. El agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos y opcionalmente los excipientes adicionales se dispensan en los compartimentos respectivos del portador por medios adecuados, en donde la concentración final del agente o agentes antimicrobianos en el compartimento respectivo debe conocerse o ser determinable. En particular, en caso de que se use una placa de microtitulación o un chip de microfluidos, el agente antimicrobiano único o la combinación de dos o más agentes antimicrobianos y excipientes adicionales opcionales se colocan, por ejemplo, moteando en los compartimentos respectivos (pocillos de la placa de microtitulación o compartimentos/segmentos/pocillos de incubación de un chip de microfluidos). En el caso de que el agente antimicrobiano se mezcle con el microorganismo inoculado en la relación de dilución 1:1, entonces la concentración del agente antimicrobiano en el compartimento respectivo debe ser dos veces tan alta como la concentración diana. Por ejemplo, porciones iguales (es decir, 100 |jl o 50 |jl) de la dilución de caldo inoculado y la dilución de agente antimicrobiano se mezclan en un pocillo de una placa de multititulación (por ejemplo, Microplaca Corning® de 96 pocillos CellBIND®, https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls3340, Placas de cultivo celular de fondo plano Corning™ Costar™, https://www.fishersci.com/shop/products/costar-cell-culture-plates-17/0720090) que permiten la medición de propiedades ópticas de la muestra. Preferentemente se preparan 3 repeticiones para cada ensayo de prueba. Cuando se usan otras relaciones de mezcla, necesita usarse la concentración de agente antimicrobiano respectiva. En el caso de que deba determinarse una determinación cuantitativa de susceptibilidad antimicrobiana, en particular la concentración inhibitoria mínima, con la presente invención, dos o más compartimentos del portador comprenden diferentes concentraciones del agente antimicrobiano único o la combinación de antimicrobianos. Preferentemente, se usa la serie de diferentes concentraciones de acuerdo con las directrices proporcionadas por EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; http://www.eucast.org.) y CLSI (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 22a Edición; documento CLSI M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standard Institute; 2012).

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, una muestra del medio que contiene el inóculo diluido de la etapa a) se dispensa en los o al menos parte de los compartimentos del portador de la etapa b) de tal manera que el uno o más compartimentos inoculados del portador comprenden los ensayos de prueba respectivos. La etapa de dispensación puede llevarse a cabo de acuerdo con cualquier método adecuado de acuerdo con el estado de la técnica, en particular que comprende medios de dispensación para dispensación manual o automatizada. La dispensación también puede facilitarse por un chip de microfluidos, en donde el chip de microfluidos comprende un depósito que aloja la muestra de caldo inoculado, en donde el depósito se conecta con el uno o más compartimentos. El uno o más compartimentos (compartimentos/segmentos/pocillos de incubación) pueden cargarse con una cantidad adecuada del caldo inoculado colocando el chip de microfluidos con el reservorio cargado en una cámara de carga y aumentar la presión en la misma de tal manera que la dilución del caldo inoculado se presione en el uno o más compartimentos. Un chip de microfluidos adecuado se desvela en las solicitudes de patente polacas PL 425106 y PL 425107.

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, el vehículo que comprende el uno o más ensayos de prueba respectivos se incuba generalmente usando un ensamblaje de incubación adecuado. El ensamblaje de incubación también desvelado con respecto al segundo aspecto de la presente invención se configura para proporcionar una incubación y/o ambiente de medición adecuados para los ensayos de prueba del uno o más portadores contenidos en los mismos. En el contexto de la presente invención, la expresión "ambiente de incubación adecuado" significa que se proporcionan las condiciones óptimas para el crecimiento del microorganismo, por ejemplo, temperatura en el intervalo de 30 a 40 °C, preferentemente 35 a 37 °C, intercambio de gases, en particular oxígeno para microorganismos aerobios, etc. El ambiente de incubación adecuado puede proporcionarse por el ensamblaje de incubación y/o el portador, tales como un chip de microfluidos, preferentemente el chip de microfluidos descrito en el documento PL 425107. En el contexto de la presente invención la expresión "ambiente de medición adecuado" significa que el ensamblaje de incubación y el portador permiten interrogar el uno o más ensayos de prueba comprendidos en el compartimento o compartimentos del portador y medir la propiedad/señal esencialmente monotónica correlacionada. En el caso de que se mida la intensidad de luz (luz dispersada, fluorescencia), el ensamblaje de incubación se separa preferentemente de la luz no emitida por los ensayos de prueba, es decir, en otras palabras, el ensayo de prueba se mantiene en oscuridad.

Durante la incubación del portador inoculado en la etapa d) del método del primer aspecto de la presente invención, se mide una señal derivada de una propiedad química o física del microorganismo inoculado en el uno o más ensayos de prueba al menos n veces para cada ensayo de prueba, con una frecuencia f constante o inconstante, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido, y se leen n valores correspondientes {xi} y se registran en tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n y en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones. En el contexto de la presente solicitud la expresión "la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido" significa que una propiedad química o física medida subyacente que exhibe la señal sigue una función esencialmente monotónica con respecto al número de microorganismos en el ensayo de prueba medido, por lo que el ruido de alta frecuencia del instrumento de medición puede desviar la señal de la función monotónica. La etapa de medición puede llevarse a cabo mediante el uso de un ensamblaje de interrogación y lectura que comprende medios de interrogación y medios de medición configurados para interrogar y leer el uno o más ensayos de prueba durante la incubación del uno o más vehículos. La señal derivada de una propiedad química o física del microorganismo inoculado puede seleccionarse preferentemente de intensidad de luz, por ejemplo, fluorescencia o luz dispersada; densidad óptica, absorbancia, turbidez, reflexión de luz u otras propiedades ópticas; conductividad, capacitancia u otras propiedades eléctricas; presiones parciales de gases implicados en el metabolismo del microorganismo, viscosidad o captación de nutrientes, más preferentemente la intensidad de la luz dispersada cuando pasa a través del compartimento de incubación o la intensidad de fluorescencia emitida desde una muestra de microorganismo adecuadamente excitada, en particular en el caso de que la muestra de microorganismo comprenda resazurina, ya que los microorganismos que metabolizan activamente producen resorufina como un producto de reducción de la resazurina, que emite fluorescencia después de haberse excitado adecuadamente.

La frecuencia f y, por lo tanto, el intervalo de tiempo entre dos mediciones consecutivas es preferentemente 1 mHz o más, más preferentemente f está en el intervalo de 10 mHz a 10 Hz, incluso más preferentemente en el intervalo de 100 mHz a 1 Hz. Para aliviar los cálculos subyacentes, la frecuencia f es preferentemente constante entre todos los n tiempos de registro {ti}.

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, parte o todos de los n valores de lectura {xi}, pero al menos 13 o más valores de lectura {x,j en tiempos de registro correspondientes {t,j se usan para estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {xi} y {xj}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo Stj entre la toma de lecturas indexadas i y j. En otras palabras, para al menos 13 o más valores de lectura {x,} una distribución de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura dividido por el intervalo de tiempo entre la toma de lecturas (relacionado con la frecuencia f) puede prepararse como sigue:

Como ya se ha indicado anteriormente, a partir del conjunto de n valores de lectura {x,}, puede construirse un conjunto n (n - l ) X j- x i

--------- 51 • 5

de 2 diferencias normalizadas {ruj} de pares de valores de lectura n¡¡ = lJ donde j > i y 6ti¡ es la diferencia de tiempo entre tomar las lecturas indexadas / y j. Si las lecturas se toman con frecuencia constante, entonces 6t¡j = 6t(J - i), donde 5t es el tiempo promedio entre lecturas consecutivas. Puede calcularse la diferencia promedio ^ de

todas las diferencias normalizadas La diferencia promedio ^ es igual al estimado á de la

pendiente de la serie de lecturas a. V ~ a - La imprecisión Cade la estimación de oes igual a

donde a es la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del instrumento.

Si las lecturas se registran con una frecuencia constante, el tiempo de registro de la ia lectura x¡ se da por ti = T0 St ■ i, donde St es el tiempo promedio entre el registro de dos lecturas consecutivas, las fórmulas pueden derivarse matemáticamente como sigue:

Si el aumento de la cantidad registrada es pequeño, puede aproximarse estrechamente por una función lineal. Por lo tanto cada lectura puede aproximarse como una suma de ruido de alta frecuencia Gaussiana (es decir, la frecuencia i

del ruido fruido es más alta que la frecuencia de las lecturas que se toman fiectum = St) a partir del ajuste experimental, la tendencia lineal y una función que describe el fondo del medio de cultivo ffondo.

Matemáticamente, si la variabilidad del fondo del medio de cultivo es insignificante, es decir, ffondo(t) ~ C = const., cada lectura puede describirse con la siguiente suma: x¡ = N(0,o) + a ■ (To 5t ■ i) + C, tendencia lineal en los datos y por lo tanto la medición del crecimiento de microorganismos en cultivo, o es la desviación estándar del ruido de alta frecuencia, 5t es el intervalo de tiempo entre lecturas consecutivas, To es el tiempo de inicio del experimento, i es el número de lectura y C es una constante que describe el fondo del medio de cultivo. El símbolo N(p,o) se usa para denotar la distribución normal (o Gaussiana o de Gauss o de Laplace-Gauss), donde y es la media de la distribución, o es la desviación estándar de la distribución y o2 es la varianza de la distribución. Por lo tanto, cada lectura puede tratarse como una variable aleatoria con valor medio a ■ (To i ■ 5t) + C y la desviación estándar o

X~N(a ■ (To 5t ■ i) + C, o).

El resultado de la sustracción de una lectura de otra es también una variable aleatoria. Cada lectura puede verse como una suma de un valor de señal verdadero ("media") y una desviación que viene por ejemplo de un ruido de alta frecuencia del ajuste experimental. Por lo tanto para el resultado de tal sustracción la media es igual a la diferencia de las medias de las lecturas y la desviación estándar es igual a V2a (Bennett Eisenberg y Rosemary Sullivan, Why is the Sum of Independent Normal Random Variables Normal, Math. Magazine, 2008, Vol. 81, p 362-366). Por lo tanto el resultado de la sustracción se da por la ecuación x¡ - x¡ = N(0,a) a ■ j ■ 5 t - N(0,a) a ■ i ■ 5t= N(0, V2a) aQt(j -i), (xj - x¡)~ N(a ■ 5t ■ { j- ¡ ) , V2CT).

El resultado de una sustracción de dos lecturas indexadas por i y j = i k normalizado por la diferencia de tiempo entre

^{m N(0,cr)+a-(i k ySt-N (0 ,<7)-a-i-St Ar ( n \Í2 o \}

Vk — ------------------ Ti---------------------— ¿V I U, “ — ) ~r , CC m el registro de las lecturas t j- t ¡= 6 t( j- i) = dtkse da después por Stk v 5tkJ

y es una variable aleatoria.

La suma de los resultados de todas las sustracciones nk de un conjunto de n lecturas, para un valor fijado de k, se da

por la si uiente ecuación:

y es también una variable aleatoria

La suma de los resultados de todas las sustracciones r¡k de un conjunto entero de n lecturas para todos los valores de

k se da por la si uiente ecuación. E ÍS X E r. í % ) = H S K C " - « ■ % ) , y es una variable aleatoria

n (n - l)

Por lo tanto, la sustracción normalizada promedio de dos cualquiera de un conjunto de n lecturas (que hace 2 sustracciones tiene la si uiente distribución: p(q) =

y n - l ( n k

La seri ¡ee ¿jA:=1 V ^k 2 , , puede reescribirse como una suma de dos series. n L k = i fe2-¿/c=i k y su límite superior puede

TLTÍ r icji. aproximarse por 6 para n grandes (para n = 13, el resultado de la aproximación es v 6

para n > 15 la diferencia es menor que el 10 % y para n > 33, la diferencia es menor del 5 %) de acuerdo con la

hipótesis de Riemann (problema de Basel). También, para un n mayor, el límite superior del término n (n - i) puede

aproximarse por

Finalmente, la distribución de la sustracción normalizada promedio es igual a

. Por lo tanto, calcular la sustracción normalizada promedio proporciona el estimado de la tendencia lineal a con una desviación estándar

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos se determina como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a.

La susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado se basa en el descubrimiento de si el crecimiento del microorganismo inoculado se inhibe o no. En consecuencia, la tasa de crecimiento y del microorganismo inoculado en el ensayo de prueba y puede calcularse usando una función de calibrado f(y): y = (f(y))-1 ■ a.

Preferentemente, el valor de la Concentración Mínima Inhibitoria puede determinarse como:

i. El cruce de la línea tangente a la tasa de crecimiento frente a la dependencia de la concentración de antibiótico en el punto de la pendiente más alta (Chorianopoulos, N.G., Lambert, R.J.W., Skandamis, P.N., Evergetis, E.T., Haroutounian, S.A. y Nychas, G.-J.E. (2006), A newly developed assay to study the minimum inhibitory concentration of Satureja spinosa essential oil. Journal of Applied Microbiology, 100: 778-786. doi: 10.1111/j.1365-2672.2006.02827.x; Lambert, R.J.W. y Pearson, J. (2000), Susceptibility testing: accurate and reproducible minimum inhibitory concentration (MIC) and non-inhibitory concentration (NIC) values. Journal of Applied Microbiology, 88: 784-790. doi:10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x; Lambert, R.J.W. y Lambert, R. (2003), A model for the efficacy of combined inhibitors. Journal of Applied Microbiology, 95: 734-743. doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02039.x).

ii. La concentración de antibiótico más baja examinada a la cual la tasa de crecimiento (tendencia lineal en datos) es menor que un umbral dado.

La imprecisión Oy de la estimación de la tasa de crecimiento y es igual a Oy = |f(y)|-1 Oa =

Esto significa que la precisión de la determinación de susceptibilidad cualitativa o cuantitativa, es decir, la desviación estándar Oa de una estimación de la tendencia lineal a depende solamente del número de lecturas usado para la distribución de diferencia de sustracción y la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del medio de medición

, n - - 2 = ( i n ~ 2 - ] \3 , „

o. Ademas es proporcional a V / _ lo que significa que la precisión de la determinación de la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de la muestra de microorganismo inoculado aumenta más rápido con el número creciente de lecturas que en los métodos AST habituales de acuerdo con la técnica anterior, por ejemplo, método de mínimos i

cuadrados, donde un factor de escala es n 2.

Los aspectos de la presente invención también se aplican a situaciones donde las lecturas no se registran con una frecuencia constante. Un ejemplo de tomar lecturas con frecuencia no constante es el caso donde las lecturas se distribuyen entre un número M de conjuntos. El conjunto se define como un subconjunto de las lecturas totales que son consecutivas y los valores de intervalos de tiempo entre tomar lecturas consecutivas que pertenecen al mismo conjunto tienen la misma distribución. Cada conjunto comprende un número M¡ de lecturas, donde - n es el número total de lecturas en todos los conjuntos. El intervalo de tiempo promedio entre tomar las lecturas consecutivas que pertenecen al conjunto /-ésimo se da como da como 5t¡. El tiempo para tomar la primera lectura del conjunto i-ésimo se da como Ti. Por lo tanto, el tiempo t/j para tomar la lectura j-ésima del conjunto /-ésimo se da por t/j = To Ti + 5ti ■ j.

En este caso, las fórmulas para el estimado a de la pendiente de la serie de lecturas a: 7? = ^ y la imprecisión oa puede derivarse matemáticamente como sigue:

del ruido fruido es más alta que la frecuencia de las lecturas que se toman fiectura = 5 t para i e< l ;M >) a partir del ajuste experimental, la tendencia lineal y una función que describe el fondo del medio de cultivo ffondo.

Matemáticamente, si la variabilidad del fondo del medio de cultivo es insignificante, es decir, ffondo(t) ~ C = const., cada lectura puede describirse con la siguiente suma: xij = N(0,o) a ■ (T0 Ti + 5ti ■ j) + C, donde a es la pendiente de la tendencia lineal en los datos y por lo tanto la medición del crecimiento de microorganismos en cultivo, o es la desviación estándar del ruido de alta frecuencia, i es el índice del conjunto al que pertenece la lectura, j es el número de lectura dentro del conjunto (por lo tanto xij representa la j-ésima lectura del i-ésimo conjunto), 5ti es el intervalo de tiempo entre lecturas consecutivas que pertenecen al i-ésimo conjunto, T0 es el tiempo de inicio del experimento, Ti es el tiempo de inicio para tomar lecturas que pertenecen al i-ésimo conjunto y C es una constante que describe el fondo del medio de cultivo. El símbolo N(y,o) se usa para denotar la distribución normal (o Gaussiana o de Gauss o de Laplace-Gauss), donde y es la media de la distribución, o es la desviación estándar de la distribución y o2 es la varianza de la distribución. Por lo tanto, cada lectura puede tratarse como una variable aleatoria con valor medio a ■ (To Ti + 5t¡ ■ j) + C y la desviación estándar o. Xj~N(a ■ (To Ti + 5t¡ ■ j) + C, o).

El resultado de la sustracción de una lectura de otra es también una variable aleatoria. Cada lectura puede verse como una suma de un valor de señal verdadero ("media") y una desviación que viene por ejemplo de un ruido de alta frecuencia del ajuste experimental. Por lo tanto para el resultado de tal sustracción la media es igual a la diferencia de las medias de las lecturas y la desviación estándar es igual a V2cr (Bennett Eisenberg y Rosemary Sullivan, Why is the Sum of Independent Normal Random Variables Normal, Math. Magazine, 2008, Vol. 81, p 362-366). Por lo tanto el resultado de la sustracción se da por la ecuación x¡j - x¡¡' = N(0,o) a ■ {To + T¡ + 5t¡ j) + C - N(0,o) - a ■ {To + Tr + 5tr j ' ) - C = N(0, V2a) a(Ti - Tr 5t¡ ■ j - 6tr ■ /), (x¡j - x/y)~ N(a(T¡ - Tr 5t¡ ■ j - 6fr ■ /), V2a).

Si dos lecturas pertenecen al mismo conjunto, indexadas i, es decir, i' = i, el resultado de una sustracción de dos lecturas indexadas por j y j ' = j + k normalizado por la diferencia de tiempo entre el registro de las lecturas j - tij = 5ti(j' N (0 ,a )+ a -( j+ k )-S ti-N (0 ,a )-a - j-S t i

^{n j ij} ~ ? 1 i( j+ k )ij ~ Vik ~

- j) = 5t¡k se da después por Stik
y es una V ík~N

variable aleatoria. V Stik)

La suma de los resultados de todas las sustracciones r¡¡k de un conjunto de m¡ lecturas que pertenecen al /'-ésimo

conjunto, para un valor fijado de k, se da por la siguiente ecuación: ^= 1 ^ ik ~ ^m¿ - K ) ' y es también una variable

aleatoria

La suma de los resultados de todas las sustracciones r¡¡k de todas las mi lecturas del /'-ésimo conjunto para todos los

valores de k se da por la siguiente ecuac -iióAnn:- E * i í 1(s r= T 'í ’to ) = - k ) - mk) y es una variable aleatoria

Por lo tanto, la suma de todas las sustracciones r¡¡k para todos los pares de lecturas que pertenecen a la misma

que pertenecen a la i-ésima biblioteca es constante para cualquier/, es decir v ¿e<i;M>m ¿ = m , y el intervalo de tiempo 5t¡ entre tomar las lecturas consecutivas que pertenecen a la /-ésima biblioteca es constante para cualquier /, es decir esta distribución puede simplificarse a.

Si dos lecturas pertenecen a diferentes conjuntos, indexadas i e i', el resultado de una sustracción de dos lecturas indexadas por j (es decir, la j-ésima lectura en el i-ésimo conjunto) y j ' (es decir, la j'-ésima lectura en el /-ésimo conjunto) normalizado por la diferencia de tiempo entre el registro de las lecturas f/y - t¡j= Tr - T¡ + 5tr ■ j = A Tr + 5tr ■ j '

se da después por

y es una variable

aleatoria.

La suma ¿jj = i rl i ' j ,ij qe los resultados de todas las sustracciones r¡¡jij de todas las m¡ lecturas que pertenecen al /-ésimo conjunto de la /-ésima lectura que pertenece al /'-ésimo conjunto, también es una variable aleatoria

y m i' y m í „

La suma de los resultados de todas las sustracciones qrjy de todas las mi lecturas que pertenecen al i-ésimo conjunto de todas las mr lecturas que pertenecen al i'-ésimo conunto del i-ésimo conjunto, también es una

variable aleatoria

En algunas aplicaciones prácticas, es particularmente ventajoso si los intervalos de tiempo A7> = 7r - Ti entre el inicio de la recogida de las lecturas de conjuntos consecutivos son más grandes que el tiempo 5ti ■ mi para tomar todas las lecturas que pertenecen a un único conjunto, es decir, A7¡¡' >> 5ti ■ mi.

En este caso, la suma A7> 5tr ■ j ' - 5ti ■ j puede aproximarse estrechamente con A7>, por lo tanto la suma j '= 1 i " 1 de los resultados de todas las sustracciones A7/yvy de todas las mi lecturas que pertenecen al i-é simo conjunto de todas las mr lecturas que pertenecen al i ’-é simo conjunto del i-é simo conjunto, también puede describirse

como: Si los intervalos de tiempo A T entre conjuntos conse ícutivos son constantes, es decir, o ci ualquier A T¡(¡+1) = A T, la suma es igual:

La suma anterior abarca todas las sustracciones normalizadas de lecturas que pertenecen a un conjunto indexado i de las lecturas que pertenecen a un conjunto indexado /', donde i1 /'. Por lo tanto, la suma de todas las sustracciones y M y i ' - l y mi' ym¡ de lecturas de otro conjunto para todos los pares de diferentes conjuntos se da por ^¡'=2^1=1 ^ y '= i^ /= i a i ¿j . Aquí se asume que cuanto más alto es el índice / del conjunto, comprende lecturas más tardías (es decir, v í '>í7V > Ti). La suma de todas las sustracciones de lecturas de un conjunto de lecturas de otro conjunto para todos los pares de diferentes conjuntos es una variable aleatoria dada por la siguiente distribución

lecturas que pertenecen a la /-ésima biblioteca es constante para cualquier/, es decir, v i€<i;Af>m¿ = y la diferencia de índices /' e / se reemplaza por / = /' - /, esta distribución puede simplificarse a

. Como se demostró ^,antes, esto puede

simplificarse además a om n M

-- A--T-- \ , 3

Habiendo calculado la suma de todas las sustracciones de todos los pares de lecturas que pertenecen a diferentes bibliotecas y la suma de todas las sustracciones de todos los pares de lecturas que pertenecen a la misma biblioteca, n (n -1)

es posible calcular la suma de las sustracciones normalizadas de todos los pares de lecturas 2 del total de n lecturas.

La suma de todas las sustracciones de todos los pares de lecturas es igual a:

Es también la suma de variables aleatorias, por lo tanto es también una variable aleatoria:

n (n - l ) Por lo tanto, la sustracción normalizada promedio de cualesquiera dos de una de n lecturas (que hace 2 sustracciones tiene la siguiente distribución:

Por lo tanto, calcular la sustracción normalizada promedio proporciona el estimado de la tendencia lineal a con una

desviación estándar

La imprecisión a¡j de la estimación de la tasa de crecimiento ¡j es igual a a¡j = |f\y)\A ■ aa =

3 n(n ^{i )}s t ^{2 a t 2 ^}donde a ^{e s |a}desviación estándar del ruido de alta frecuencia del instrumento. Esto significa que la precisión de la determinación de susceptibilidad cualitativa o cuantitativa (es decir, la desviación estándar Oa de una estimación de la tendencia lineal a) depende solamente del número y la distribución de lecturas usados para la distribución de sustracción y la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del medio de medición O.

Otro ejemplo de tomar lecturas con frecuencia no constante es el caso donde el tiempo para tomar cada lectura se determina por función inyectiva arbitraria del número de lectura. Por lo tanto, el tiempo para tomar la i-ésima lectura se da por t/ = To + f(i).

En este caso, las fórmulas para el estimado á de la pendiente de la serie de lecturas a: ’H = a y la imprecisión Oa puede derivarse matemáticamente como sigue:

Si el aumento de la cantidad registrada es pequeño, puede aproximarse estrechamente por una función lineal. Por lo tanto cada lectura puede aproximarse como una suma de ruido de alta frecuencia Gaussiana (es decir, la frecuencia del ruido fruido es más alta que la frecuencia más alta de las lecturas que se toman fiectummáx = para i e < 1; n > ) a partir del ajuste experimental, la tendencia lineal y una función que describe el fondo del medio de cultivo ffondo. Matemáticamente, si la variabilidad del fondo del medio de cultivo es insignificante, es decir, ffondo(t) « C = const., cada lectura puede describirse con la siguiente suma: x/ = N(0,o) a ■ (To f(i)) + C, donde a es la pendiente de la tendencia lineal en los datos y por lo tanto la medición del crecimiento de microorganismos en cultivo, o es la desviación estándar del ruido de alta frecuencia, i es el índice de la lectura, To es el tiempo de inicio del experimento, f(i) es el tiempo de inicio para tomar la lectura y C es una constante que describe el fondo del medio de cultivo. El símbolo N(p,o) se usa para denotar la distribución normal (o Gaussiana o de Gauss o de Laplace-Gauss), donde y es la media de la distribución, o es la desviación estándar de la distribución y O2 es la varianza de la distribución. Por lo tanto, cada lectura puede tratarse como una variable aleatoria con valor medio a ■ (To f(i)) + C y la desviación estándar o x~N(a ■ ((To f(i)) C,o).

El resultado de la sustracción de una lectura de otra es también una variable aleatoria. Cada lectura puede verse como una suma de un valor de señal verdadero ("media") y una desviación que viene por ejemplo de un ruido de alta frecuencia del ajuste experimental. Por lo tanto para el resultado de tal sustracción su media es igual a la diferencia de las medias de las lecturas y la desviación estándar es igual a V2<r (Bennett Eisenberg y Rosemary Sullivan, Why is the Sum of Independent Normal Random Variables Normal, Math. Magazine, 2008, Vol. 81, p 362-366). Por lo tanto el resultado de la sustracción se da por la ecuación x¡ -x ¡ = N(0,d) a ■ f(j)~ N(0,a) - a ■ f(¡) = N(0, V2cr) a(f(j) _ /(/))_ (Xj - xi)~N(a ■ (fíj) - f(i)), V2<7).

El resultado de una sustracción de dos lecturas indexadas por i y j normalizado por la diferencia de tiempo entre el registro de las lecturas tj - ti = fíj) - f(¡) se da después por lJ
y r]i ~N (a ,—° ^ . )

es una variable aleatoria: 11 ^ ’ /0 ')-/(0 /.

Por lo tanto, la sustracción normalizada promedio de cualesquiera dos de un conjunto de n lecturas que hace

P W = ¿ r } N

sustracciones) tiene la siguiente distribución: V

Finalmente, la distribución de la diferencia normalizada promedio de una sustracción es igual a 2V20-p (r¡)~ N [ a, y n

' n ( n —1) ¿ji= 2 ¿-‘ i= i '

(/O ) /(O) / por |o tanto, la desviación estándar del estimado de la tendencia lineal a proporcionado del cálculo de la diferencia normalizada promedio de la sustracción depende de la función arbitraria

(definida por el usuario) f(i) de tomar la /-ésima lectura y es igual a

Si la función f(i) es también una variable aleatoria, por ejemplo, f(i) = To 5t ■ i N(0,ot), es decir, el intervalo de tiempo L f = f(i + 1) - f(i) entre la toma de lecturas consecutivas es una variable aleatoria con un valor esperado constante (promedio) 6t y desviación estándar oí: Af~N(6t,oi), el resultado de una sustracción de dos lecturas indexadas por i y j normalizado por la diferencia de tiempo entre el registro de las lecturas f, - t¡ = f{¡) - f(i) = ¿\f(j - i) ~N(5t ■ (j -(Bennett Eisenberg y Rosemary Sullivan, Why is the Sum of Independent Normal Random Variables Normal, Math. Magazine, 2008, Vol. 81, p 362-366) se da entonces por

En las aplicaciones prácticas de la invención presentada, el aumento de señal durante el tiempo total del experimento es comparable con el valor o de la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del medio de medición. También,

£t

en aplicaciones prácticas, la dispersión relativa St de los valores de intervalos de tiempo entre tomar lecturas consecutivas es menos del 100 %. Por lo tanto, el valor promedio del producto aot es n veces menor que el valor o de la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del medio de medición, donde n es el número de lecturas. Ya que el número n preferido de lecturas es mayor que 12, el aumento de la desviación estándar del resultado de una sustracción de dos lecturas es menos del 1 %.

Por lo tanto, la distribución de la diferencia normalizada promedio de una sustracción de dos lecturas en el caso del intervalo de tiempo aleatorio entre tomar lecturas consecutivas puede aproximarse estrechamente por la distribución de la diferencia normalizada promedio de la sustracción de dos lecturas en el caso de un intervalo de tiempo constante,

es decir, puede aproximarse por

. Por lo tanto, calcular la diferencia normalizada promedio de

la sustracción proporciona el estimado de la tendencia lineal a con una desviación estándar de

La imprecisión o¡j de la estimación de la tasa de crecimiento p es igual a o¡j= |f(y)|'

Esto significa que la precisión de la determinación de susceptibilidad cualitativa o cuantitativa (es decir, la desviación estándar Oa de una estimación de la tendencia lineal a) depende solamente del número de lecturas usado para la distribución de la diferencia de la sustracción la desviación estándar del ruido de alta frecuencia del medio de

susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de la muestra de microorganismo inoculado aumenta más rápido con el número creciente de lecturas que en los métodos AST habituales de acuerdo con la técnica anterior, por ejemplo,

1

método de mínimos cuadrados, donde un factor de escala es n 2.

Los aspectos de la presente invención son en particular ventajosos, ya que el método y sistema de la invención facilitan tomar al menos parte de las n mediciones en una fase de crecimiento de microorganismos, en donde los cambios de un valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición. En consecuencia, el método inventivo permite la determinación de la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa de los microorganismos más pronto que las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de la técnica anterior. En particular se prefiere el método inventivo, en donde las mediciones en la etapa e) se toman en una fase de crecimiento de microorganismos, en donde el aumento en la señal medida debido al crecimiento de microorganismos es igual a o menos de 3 veces del ruido de alta frecuencia del medio de medición, preferentemente igual a o menos de 2 veces del ruido de alta frecuencia del medio de medición, más preferentemente igual a o menos de 1 vez del ruido de alta frecuencia del medio de medición. En consecuencia, las mediciones pueden tomarse durante el tiempo de incubación completo como se expone en las directrices respectivas de EUCAST y CLSI, pero de acuerdo con realizaciones preferidas, las mediciones también pueden tomarse durante menos del tiempo de incubación habitual (para bacterias aproximadamente 16 horas), es decir el tiempo de crecimiento de microorganismos, en donde el aumento en la señal medida debido al crecimiento de microorganismos es igual a o menos de 3 veces del ruido de alta frecuencia del medio de medición, preferentemente igual a o menos de 2 veces del ruido de alta frecuencia del medio de medición, más preferentemente igual a o menos de 1 vez del ruido de alta frecuencia del medio de medición.

De acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, una o más pendientes de tendencias lineales a pueden estimarse preferentemente con una desviación estándar predeterminada Oa calculando el número mínimo de n lecturas como una función de una desviación estándar o de un ruido de alta frecuencia del medio de medición y un intervalo de tiempo 5t entre lecturas consecutivas.

Para calcular el número mínimo de n lecturas, debe conocerse la desviación estándar o del ruido de alta frecuencia del instrumento y el intervalo de tiempo 5t entre las lecturas consecutivas.

El cálculo puede empezar con la determinación de la desviación estándar máxima permitible Oa del estimado de la tendencia a proporcionado por el análisis del ajuste de n lecturas.

El valor oa determina la imprecisión de la evaluación de la una o más tendencias lineales a, que es igual a la primera dx

derivada de las lecturas con respecto al tiempo dt.

Esto determina indirectamente el comportamiento del sistema físico o biológico. La relación entre el valor x de lectura (es decir, la propiedad física o química de la muestra tales como propiedades de dispersión/transmisión de luz, absorbancia, densidad óptica, turbidez, viscosidad, presión, cantidades eléctricas etc.) y el parámetro real de interés y (es decir, densidad del cultivo bacteriano, concentración de analito, número de microorganismos, etc.) se da por la dx función de calibrado biyectiva f: x = f{y). El parámetro a, siendo la pendiente de la serie de lecturas, es igual a dt, por dy lo tanto también está relacionado con la primera derivada del parámetro de interés con respecto al tiempo dt (es decir, dx _ dx_ dy_ dx _ dx _ . dy

la tasa de crecimiento y) con la siguiente ecuación: dt dv dt donde dt ’ dv y dt ~ ^ . Puede reescribirse como: a = f(y ) ■ y. Si f(y) es una función lineal, la relación entre a y y se reduce a un escalado lineal sencillo.

La desviación estándar máxima permitible Oa puede calcularse a partir de la desviación estándar máxima permitible Oy solicitada del estimado de la tasa de crecimiento y: Oa = |f'(y)| ■ Oy.

Conociendo la función de calibrado x = f(y) y habiendo determinado la desviación estándar máxima permitible Oy y Oa, uno puede transformar una fórmula para una desviación estándar de a derivada en la subsección anterior y calcular el valor mínimo de n usando la siguiente ecuación:

donde n > 12, o > 0, Oa > 0, Oy > 0 y f'(y) ± 0.

El valor de n determina el número mínimo de lecturas que ha de tomarse para evaluar la tasa de crecimiento y con la desviación estándar máxima permitible solicitada Oy. Son realizaciones del número mínimo n de lecturas 13 o más lecturas, 100 o más, 1.000 o más lecturas, 5.000 o más lecturas, 10.000 o más lecturas o 100.000 o más lecturas. Cuantas más lecturas se toma, más puede aumentar la frecuencia, es decir, el intervalo de tiempo entre dos lecturas consecutivas puede reducirse y de esta manera, el tiempo de medición global puede mantenerse bajo, preferentemente en un intervalo de 4 horas o por debajo. Adicionalmente, la precisión puede aumentarse usando el aumento del número n de lecturas y la frecuencia f.

La precisión del método inventivo puede aumentarse adicionalmente usando dos o más compartimentos, preferentemente 100 o más, más preferentemente 1000 o más compartimentos que comprenden el mismo ensayo de prueba. Con respecto a esto puede usarse más de un portador secuencial o simultáneamente, preferentemente de forma simultánea para el método inventivo. Después una o más pendientes de tendencias lineales a en la etapa e) del método inventivo se estiman promediando la distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de valores de lectura {xi} y {xj} donde j > i dividido por el intervalo de tiempo 6t¡ entre tomar las lecturas indexadas i y j de los respectivos ensayos de prueba, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {Xi}, pero al menos 13 o más de los valores de lectura {x} en tiempos de registro correspondientes {t,j se usan para la distribución. En un caso, por ejemplo, el portador comprende 10 concentraciones diferentes de un agente antimicrobiano o una combinación de agentes antimicrobianos, que los 1/10° compartimentos del uno o más portadores pueden comprender el mismo ensayo de prueba.

Las realizaciones anteriormente mencionadas del primer aspecto de la presente invención pueden combinarse a través. En particular, las diferentes realizaciones preferidas del primer aspecto de la presente invención pueden combinarse entre sí.

Todas las realizaciones anteriormente mencionadas incluyendo la combinación de realizaciones preferidas con respecto al primer aspecto de la presente invención pueden usarse también para el segundo aspecto de la invención.

El segundo aspecto de la presente invención se refiere a un sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido para realizar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo, comprendiendo el sistema:

a) un ensamblaje de incubación adaptado para alojar al menos un portador que tiene uno o más compartimentos para recibir una muestra de un inóculo de microorganismo diluido en medio de crecimiento, en donde los o al menos parte de los compartimentos comprenden respectivamente un único agente antimicrobiano o una combinación de agentes antimicrobianos, de tal manera que cada compartimento aloja un ensayo de prueba respectivo, en donde el ensamblaje de incubación se configura para proporcionar un ambiente de incubación y/o medición del uno o más ensayos de prueba en el uno o más compartimentos,

b) un ensamblaje de interrogación y lectura que comprende medios de interrogación y medios de medición configurados para interrogar y leer el uno o más ensayos de prueba durante la incubación del uno o más portadores, en donde el ensamblaje de interrogación y lectura facilita i) medir al menos n veces para cada uno del uno o más ensayos de prueba, con una frecuencia f constante o no constante, una señal derivada de una propiedad química o física del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido y ii) leer los valores correspondientes {x} a tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n y en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones y

c) un ensamblaje de computación que comprende uno o más procesadores y una o más instrucciones de almacenamiento de medio leíble por computador que, cuando se ejecuta por el uno o más procesadores, provoca que el uno o más procesadores realicen funciones que comprenden i) recibir del ensamblaje de interrogación y lectura el número n de lecturas, los valores {x} y los tiempos de registro correspondientes {ti} y ii) estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {x} y {x,}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo Stij entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {x}, pero al menos 13 o más valores de lectura {xi} a tiempos de registro correspondientes {ti} se usan para la distribución y iii) determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a.

Como ya se ha desvelado con respecto al primer aspecto de la presente invención el ensamblaje de incubación puede adaptarse para comprender más de un portador simultáneamente, preferentemente 10 o más, o 100 o más. Esto puede facilitarse con medios adecuados presentados por la técnica anterior, tales como un ensamblaje en nido adaptado para alojar al menos un portador, preferentemente 10 o más, o 100 o más portadores teniendo uno o más compartimentos respectivamente. En el caso de portadores múltiples, el portador puede ser preferentemente un chip de microfluidos, más preferentemente un chip de microfluidos descrito en las solicitudes de patente polacas PL 425106 y PL 425107.

Como ya se ha desvelado con respecto al primer aspecto de la presente invención, el ensamblaje de incubación se configura para proporcionar un ambiente de incubación y/o de medición adecuado para los ensayos de prueba del uno o más portadores contenidos en el mismo. En el contexto de la presente invención, la expresión "ambiente de incubación adecuado" significa que se proporcionan las condiciones óptimas para el crecimiento del microorganismo, por ejemplo, temperatura en el intervalo de 30 a 40 °C, preferentemente 35 a 37 °C, intercambio de gases, en particular oxígeno para microorganismos aerobios, etc. El ambiente de incubación adecuado puede proporcionarse por el ensamblaje de incubación y/o el portador, tales como un chip de microfluidos, preferentemente el chip de microfluidos como se describe en el documento PL 425107. En el contexto de la presente invención la expresión "ambiente de medición adecuado" significa que el ensamblaje de incubación y el portador permiten interrogar el uno o más ensayos de prueba comprendidos en el compartimento o compartimentos del portador y medir la propiedad/señal esencialmente monotónica correlacionada. En el caso de que se mida la intensidad de luz (luz dispersada, fluorescencia), el ensamblaje de incubación se separa preferentemente de la luz no emitida por los ensayos de prueba, es decir, en otras palabras, el ensayo de prueba se mantiene en oscuridad.

De acuerdo con una realización del segundo aspecto de la presente invención, el ensamblaje de interrogación y lectura comprende medios de interrogación y medios de medición configurados para interrogar y leer el uno o más ensayos de prueba durante la incubación del uno o más vehículos. En particular, el ensamblaje de interrogación y lectura puede comprender preferentemente un ensamblaje óptico, que se configura para interrogar y leer al menos uno de intensidad de luz, por ejemplo, fluorescencia o luz dispersada; densidad óptica, absorbancia, turbidez, reflexión de luz u otras propiedades ópticas; conductividad, capacitancia u otras propiedades eléctricas; presiones parciales de gases implicados en el metabolismo del microorganismo, viscosidad o captación de nutrientes del ensayo de prueba durante la incubación.

El ensamblaje de interrogación y lectura facilita i) medir al menos n veces para cada uno del uno o más ensayos de prueba, con una frecuencia f constante o no constante, una señal derivada de una propiedad química o física del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido y ii) leer los valores correspondientes {x,} a tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n, en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones.

Las Tablas 1, 2 y 3 muestran el número mínimo de lecturas requeridas para proporcionar la evaluación de la una o más pendientes de tendencias lineales con la resolución solicitada, definida como la relación de la desviación estándar del estimado de la tendencia lineal multiplicado por el tiempo total del experimento al ruido de alta frecuencia del sistema de medición. La dicha resolución puede lograrse preferentemente con el 95 % de confianza (Tabla 1), el 90 % de confianza (Tabla 2) y el 70 % de confianza (Tabla 3). Las tablas muestran los valores de frecuencias constantes preferidas de señales requeridas para proporcionar la evaluación de la tendencia con la solución requerida en el tiempo dado del experimento.

Tabla 1:

La tabla 1 muestra el número mínimo nmín de lecturas requeridas para evaluar la tendencia lineal en los datos con una resolución dada con el 95 % de confianza (k = 3). Las frecuencias de las lecturas tomadas para tiempos preferidos de los experimentos también se dan.

Tabla 2:

La Tabla 2 muestra el número mínimo nmín de lecturas requeridas para evaluar la tendencia lineal en los datos con una resolución dada con el 90 % de confianza (k = 2). Las frecuencias de las lecturas tomadas para tiempos preferidos de los experimentos también se dan.

Tabla 3:

La Tabla 3 muestra el número mínimo nmín de lecturas requeridas para evaluar la tendencia lineal en los datos con una resolución dada con el 70 % de confianza (k = 1). Las frecuencias de las lecturas tomadas para tiempos preferidos de los experimentos también se dan.

La función de analizar se ha discutido en detalle con respecto al primer aspecto de la presente invención, cuyas realizaciones que incluyen la combinación de realizaciones preferidas también se aplican al segundo aspecto de la presente invención.

Adicionalmente, el sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido del segundo aspecto de la presente invención comprende un ensamblaje de computación. Este ensamblaje de computación comprende uno o más procesadores y una o más instrucciones de almacenamiento de medio leíble por computador que, cuando se ejecuta por el uno o más procesadores, provoca que el uno o más procesadores realicen funciones que comprenden i) recibir del ensamblaje de interrogación y lectura el número n de lecturas, los valores {x¡} y los tiempos de registro correspondientes {ti} y ii) estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {Xi} y {x/}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo 5t¡j entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {x¡}, pero al menos 13 o más valores de lectura {x¡} a tiempos de registro correspondientes {t¡} se usan para la distribución y iii) determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a

El medio de computación puede proporcionarse, por ejemplo, por un ordenador, un ordenador portátil, un dispositivo inteligente o, en el caso de que el ensamblaje se conecte a internet, mediante un servidor accesible a internet, en particular una red de computación de la nube basada en internet.

De nuevo, la función de analizar se ha discutido en detalle con respecto al primer aspecto de la presente invención, cuyas realizaciones que incluyen la combinación de realizaciones preferidas también se aplican al segundo aspecto de la presente invención.

De acuerdo con una realización del segundo aspecto de la presente invención, el ensamblaje de computación se configura además para realizar funciones de estimación y determinación después de cada 10 mediciones, preferentemente después de cada 5 mediciones, más preferentemente después de cada medición única. Cuanto más rápido se llevan a cabo las funciones de estimación y determinación, más rápido se proporcionan los resultados, en particular pueden proporcionarse en tiempo real. Sin embargo, con las funciones de estimación y determinación crecientes, por ejemplo, después de cada medición única, se aumenta la capacidad de procesamiento y en consecuencia necesita usarse un dispositivo de procesamiento adecuado para el sistema inventivo.

De acuerdo con otra realización preferida del segundo aspecto de la presente invención el ensamblaje de computación se configura además para estimar una o más pendientes de tendencias lineales a con una desviación estándar predeterminada Oa calculando el número mínimo de n lecturas como una función de una desviación estándar a de un ruido de alta frecuencia del medio de medición y un intervalo de tiempo St entre lecturas consecutivas. La estimación ya se ha descrito en detalle con respecto al primer aspecto de la presente invención y todas las realizaciones de la misma que incluyen la combinación de realizaciones preferidas también se aplican al segundo aspecto de la presente invención.

De acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención se desvela el uso del sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido de la invención para realizar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo del segundo aspecto de la presente invención en la determinación de la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa de un microorganismo inoculado. Todas las realizaciones que incluyen la combinación de realizaciones preferidas del primer y el segundo aspectos de la presente invención también se aplican al tercer aspecto de la presente invención.

Además de los aspectos anteriormente desvelados de la presente invención, es decir, el uso del análisis de estimación y determinación de acuerdo con las etapas e) y f) del método del primer aspecto de la presente invención para evaluar el crecimiento de microorganismos, el método de análisis inventivo también puede usarse para monitorizar procesos lentos que progresan esencialmente de forma monotónica que se correlaciona con una propiedad medible (señal), tales como monitorizar i) el progreso de una reacción química (lenta), ii) el desgaste de las piezas en partes mecánicas particulares y iii) eventos raros, tales como partículas de conteo en reacciones nucleares. Una persona experta en la materia será fácilmente capaz de corregir los ambientes respectivos de acuerdo con los otros procesos usados. El método de análisis inventivo que incluye la estimación y determinación como se expone en el primer y el segundo aspectos de la presente invención también puede aplicarse para los otros métodos.

La presente invención se refiere también a métodos y sistemas para probar rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana, en donde la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa de un microorganismo inoculado contra un agente antimicrobiano una combinación de agentes antimicrobianos se determina como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a de valores de lectura. Sin embargo, también puede usare para la evaluación de cualquier aumento en los datos registrados y es particularmente ventajoso si el aumento es lento y el ruido de alta frecuencia del medio de medición es alto. Por ejemplo, la invención puede usarse para facilitar la medición de la tasa de desgaste de las partes mecánicas (Tony L. Schmitz Jason E. Action David L. Burris John C. ZiegertW. Gregory Sawyer, Wear-Rate Uncertainty Analysis, Journal of Tribology, Vol. 126, OOCTUBRE DE 2004, 802-807, DOI: 10.1115/1.1792675, Niklas Axen, Sture Hogmark, Staffan Jacobson, Friction and Wear Measurement Techniques, 2001, http://home.ufam.edu.br/berti/nanomateriais/8403 PDF CH13.pdf), donde la pérdida de volumen y/o peso de una parte o muestra mecánica es baja. Como la disminución es típicamente lineal con el número de ciclos probados, puede evaluarse usando la presente invención. También, la incertidumbre de tal medición es menor que los métodos típicos (es decir, la dispersión del resultado promedio de muchas repeticiones del mismo experimento) gracias al escalado 3

n 2 con el número de lecturas (ciclos probados).

Otra aplicación de la presente invención es la monitorización del progreso de reacciones químicas lentas, incluyendo la oxidación, que provoca un cambio del peso de la muestra, o la monitorización de las reacciones químicas en la fase temprana, es decir la monitorización del progreso de reacciones de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Bartlett, J. M. S.; Stirling, D. (2003). "A Short History of the Polymerase Chain Reaction". PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 226 (2a ed.). pp. 3-6, A. A. Morley. Digital PCR: A brief history. Biomolecular Detection and Quantification, 1(1):1-2, 2014, J. F. Huggett, S. Cowen, C.A. Foy, Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool, Clinical Chemistry, 61 (1), 79-88, 2015) o de la amplificación isotérmica mediada por bucle (Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, HaseT (2000). "Loop-mediated isothermal amplification of DNA". Nucleic Acids Res. 28(12): E63), lo que facilita la detección y la cuantificación de ácidos nucleicos.

La presente invención se describe en lo siguiente en base a las Figuras y realizaciones ejemplares, que meramente sirven como ejemplos y que no deben limitar el alcance del presente derecho protector.

Descripción detallada de las figuras:

La Figura 1 muestra una curva de crecimiento ilustrativa de un microorganismo de muestra en una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (descrita adicionalmente en el Ejemplo Ejecutivo 1), donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición. La curva de crecimiento se midió experimentalmente. La dilución de caldo con microorganismos y antibiótico se incubó en un compartimento de un chip de microfluidos desvelado en las solicitudes de patente polaca PL 425106 y PL 425107 y se expuso a la luz durante la incubación. La intensidad de la luz dispersada se midió por medio de la cámara digital. La intensidad total de la luz dispersada se evaluó integrando la intensidad de luz de los píxeles que corresponden al área del compartimento.

La Figura 2 muestra el aumento de los valores de señal (valores de lectura) debido al crecimiento de microorganismos como una multiplicidad del ruido de alta frecuencia del medio de medición, en donde los puntos de aumento 1 vez, 2 veces y 3 veces de la señal sobre el ruido de alta frecuencia del medio de medición se indican por las líneas discontinuas. Cuanto mayor es el aumento con respecto al ruido de alta frecuencia, más confiadamente puede evaluarse el aumento de la señal.

La Figura 3 muestra el valor de la tendencia lineal a calculada para la curva de crecimiento ilustrativa mostrada en la Figura 1 usando el método de la invención usando todos los valores medidos, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición. La tendencia lineal a se calculó como el valor promedio de la sustracción de dos lecturas (la lectura más temprana se sustrajo de la lectura más posterior) dividido por el intervalo de tiempo entre tomar las dos lecturas, de todos los pares de lecturas registrados desde el comienzo del experimento.

La Figura 4 muestra la incertidumbre relativa (desviación estándar del estimado) de la tendencia a calculada para la curva de crecimiento ilustrativa mostrada en la Figura 1 usando el método de la invención usando todos los valores medidos, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición. La tendencia lineal a se calculó como el valor promedio de la sustracción de dos lecturas (la lectura más temprana se sustrajo de la lectura más posterior) dividido por el intervalo de tiempo entre tomar las dos lecturas, de todos los pares de lecturas registrados desde el comienzo del experimento. La incertidumbre se calculó como la desviación estándar del estimado del valor promedio del producto de sustracción.

La Figura 5 muestra el valor de la tendencia lineal a calculada para la curva de crecimiento ilustrativa mostrada en la Figura 1 usando el método de la invención y las últimas 2000 mediciones tomadas, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición. La tendencia lineal a se calculó como el valor promedio del producto de sustracción de dos lecturas (la lectura más temprana se sustrajo de la lectura más posterior) dividido por el intervalo de tiempo entre tomar las dos lecturas, de todos los pares creados de las últimas 2000 lecturas registradas.

La Figura 6 muestra la incertidumbre relativa (desviación estándar del estimado) de la tendencia a calculada usando el método de la invención y las últimas 2000 mediciones tomadas, en donde una línea discontinua indica el final de la fase de crecimiento en donde los cambios del valor de señal medido debido al crecimiento de la población microbiana son menores que los cambios del valor de señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición. La tendencia lineal a se calculó como el valor promedio del producto de sustracción de dos lecturas (la lectura más temprana se sustrajo de la lectura más posterior) dividido por el intervalo de tiempo entre tomar las dos lecturas, de todos los pares creados de las últimas 2000 lecturas registradas. La incertidumbre se calculó como la desviación estándar del estimado del valor promedio del producto de sustracción (diferencia).

La Figura 7 muestra una dependencia de una desviación estándar de las pendientes estimadas de las tendencias a sobre un número de lecturas. El gráfico se obtuvo por medio de simulaciones de Monte-Carlo, donde cada punto (desviación estándar del estimado) se calculó a partir de 1000 repeticiones de la simulación para las mismas condiciones de entrada de muestra. El comportamiento de la incertidumbre se parece a la fórmula obtenida

analíticamente y escala con el número n de lecturas con la función n 2.

La Figura 8 muestra una dependencia de una desviación estándar de las pendientes estimadas de las tendencias a sobre un ruido de alta frecuencia del dispositivo de medición. El gráfico se obtuvo por medio de simulaciones de Monte-Carlo, donde cada punto (desviación estándar del estimado) se calculó a partir de 1000 repeticiones de la simulación para las mismas condiciones de entrada de muestra. El comportamiento de la incertidumbre se parece a la fórmula obtenida analíticamente y escala linealmente con la desviación estándar del ruido de alta frecuencia a del instrumento.

La Figura 9 muestra diez curvas de crecimiento de ensayos de prueba separados de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana usando diferentes concentraciones antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria. Las curvas de crecimiento se registraron experimentalmente y el procedimiento se describe en el Ejemplo Ejecutivo 1. Las concentraciones de antibiótico, que tiene los símbolos C1 a C10, se describen en la Tabla 4 en el Ejemplo Ejecutivo 1. Debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición, las curvas se solapan al principio (las primeras 4 horas) de la incubación.

La Figura 10 muestra diez curvas de crecimiento de diez ensayos de prueba separados de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana usando diferentes concentraciones antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria. Las curvas de crecimiento se registraron experimentalmente y el procedimiento se describe en el Ejemplo Ejecutivo 1. La escala en el eje de intensidad de luz dispersada se estrechó y en lugar de las señales registradas, se dibujaron las curvas promedio móvil simple (medias de las 200 lecturas previas) para distinguir entre las curvas de crecimiento. Las concentraciones de antibiótico, que tiene los símbolos C1 a C10, se describen en la Tabla 4 en el Ejemplo Ejecutivo 1.

La Figura 11 muestra tres curvas de crecimiento de tres ensayos de prueba separados de una prueba de susceptibilidad antimicrobiana usando diferentes concentraciones antimicrobianas para determinar la concentración mínima inhibitoria. Las curvas de crecimiento se registraron experimentalmente y el procedimiento se describe en el Ejemplo Ejecutivo 1. Las concentraciones de antibiótico, que tiene los símbolos C1 a C10, se describen en la Tabla 4 en el Ejemplo Ejecutivo 1. Debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición, las curvas se solapan.

La Figura 12 muestra la evolución del valor de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) determinado experimentalmente con el uso de métodos del estado de la técnica como se describe en el Ejemplo Ejecutivo 1. El valor de la Concentración Mínima Inhibitoria se satura después de 5 horas de incubación cuando las curvas de crecimiento positivo son claramente distinguibles de las curvas de crecimiento negativo.

La Figura 13 muestra la evolución del valor de CMI determinado experimentalmente con el uso de la presente invención como se describe en el Ejemplo Ejecutivo 1. El valor de la Concentración Mínima Inhibitoria se satura después de 3 horas de incubación cuando las curvas de crecimiento positivo todavía no son claramente distinguibles de las curvas de crecimiento negativo.

Ejemplos

Ejemplo Ejecutivo 1

La presente invención para probar rápidamente la susceptibilidad antimicrobiana se usó para determinar cuantitativamente la Concentración Mínima Inhibitoria de ciprofloxacina. La Prueba de Susceptibilidad Antimicrobiana se preparó para probar el intervalo de concentraciones antibióticas requeridas por las directrices de EUCAST y CLSI (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Routine and extended internal quality control for MIC determination and disk diffusion as recommended by EUCAST. Versión 8.0, 2018; http://www.eucast.org.) (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 22a Edición; documento CLSI M100-S22. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standard Institute; 2012).

La evaluación se ejecutó en las siguientes etapas.

1. Se preparó la serie de diluciones de antibiótico (ciprofloxacina) en un caldo adecuado (es decir, Caldo Mueller-Hinton II de cationes ajustados); las diluciones fueron el doble (es decir, 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 mg/l) y abarcaban el intervalo de concentraciones de antibiótico indicadas en las directrices: EUCAST y CLSI. Las concentraciones de antibiótico en la serie preparada fueron dos veces tan altas como las concentraciones diana porque se mezclaron posteriormente con la muestra de bacterias (Escherichia coli ATCC 25922) en relación 1:1. Las concentraciones diana del antibiótico se presentan en la Tabla 4 a continuación.

La Tabla 4 muestra las concentraciones de antibiótico (ciprofloxacina) usadas en el experimento. Se preparó la suspensión de microorganismos (bacterias) de la densidad de 106 UFC/ml (Unidades Formadoras de Colonias/ml).

2. Las porciones iguales (es decir, 100 pl) de la suspensión de microorganismos y la dilución seleccionada de antibiótico se mezclaron en un pocillo de una placa de múltiples pocillos (es decir, Microplaca Corning® de 96 pocillos CellBIND®, https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls3340, Placas de cultivo celular de fondo plano Corning™ Costar™, https://www.fishersci.com/shop/products/costar-cell-culture-plates-17/0720090) que permitieron la medición de las propiedades ópticas de la muestra. Para cada concentración de antibiótico, se prepararon 8 repeticiones.

3. La placa se incubó durante 16 h a 35 °C y la intensidad de luz dispersada por los contenidos de cada pocillo se registró durante el progreso del experimento. Las curvas de crecimiento registradas se muestran en las Figuras 9 a 11.

4. Para cada pocillo, se registró una serie de lecturas y después cada serie de lecturas se analizó simultánea e independientemente en las siguientes etapas:

a. Para cada dos valores registrados, se calculó la diferencia de una sustracción del valor más temprano del valor más posterior, dividido por el intervalo de tiempo entre tomar las dos lecturas.

b. El promedio a de las diferencias se estaba calculando durante el progreso del experimento para todos los pares de lecturas registradas. Se calculó en unidades arbitrarias. El promedio calculado era igual a la tendencia lineal en los datos registrados, es decir, la pendiente de la serie de lecturas.

c. Se asumió que el aumento de los valores de señal registrados estaban provocados por el crecimiento de bacterias, por lo tanto, la tasa de crecimiento de las bacterias se asumió ser igual a la pendiente de la serie de lecturas.

d. Los valores calculados de la tendencia lineal en los datos se dieron como la función de concentración de antibiótico.

e. La función se ajustó con la función de Gompertz doble exponencial (Zwietering, M. H.; Jongenburger, I.; Rombout, F. M.; van't Riet, K. (1990), "Modeling of the Bacterial Growth Curve", Applied and Environmental Microbiology, 56 (6): 1875-1881).

f. El valor de la Concentración Mínima Inhibitoria se determinó como: el cruce de la línea tangente a la tasa de crecimiento frente a la dependencia de la concentración de antibiótico en el punto de la pendiente más alta (Chorianopoulos, N.G., Lambert, R.J.W., Skandamis, P.N., Evergetis, E.T., Haroutounian, S.A. y Nychas, G.-J.E. (2006), A newly developed assay to study the minimum inhibitory concentration of Satureja spinosa essential oil. Journal of Applied Microbiology, 100: 778-786. doi:10.1111/j.1365-2672.2006.02827.x; Lambert, R.J.W. y Pearson, J. (2000), Susceptibility testing: accurate and reproducible minimum inhibitory concentration (MIC) and noninhibitory concentration (NIC) values. Journal of Applied Microbiology, 88:784-790. doi:10.1046/j.1365-2672.2000.01017. x; Lambert, R.J.W. y Lambert, R. (2003), A model for the efficacy of combined inhibitors. Journal of Applied Microbiology, 95: 734-743. doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02039.x) y se comparó con el valor de referencia. Los valores calculados de la Concentración Mínima Inhibitoria y su evolución en el tiempo se dan en la Figura 13.

g. Para la referencia, los valores de la Concentración Mínima Inhibitoria se calcularon usando el método del estado de la técnica, es decir, el valor de punto final de la señal registrada. Los últimos valores de la señal registrada también se dan como la función de la concentración de antibiótico para proporcionar la función de referencia.

h. La función de referencia se ajustó con la función de Gompertz doble exponencial (Zwietering, M. H.; Jongenburger, I.; Rombout, F. M.; van't Riet, K. (1990), "Modeling ofthe Bacterial Growth Curve", Applied and Environmental Microbiology, 56 (6): 1875-1881).

i. El valor de la Concentración Mínima Inhibitoria se determinó como: el cruce de la línea tangente a la tasa de crecimiento frente a la dependencia de la concentración de antibiótico en el punto de la pendiente más alta (Chorianopoulos, N.G., Lambert, R.J.W., Skandamis, P.N., Evergetis, E.T., Haroutounian, S.A. y Nychas, G.-J.E. (2006), A newly developed assay to study the minimum inhibitory concentration of Satureja spinosa essential oil. Journal of Applied Microbiology, 100: 778-786. doi:10.1111/j.1365-2672.2006.02827.x; Lambert, R.J.W. y Pearson, J. (2000), Susceptibility testing: accurate and reproducible minimum inhibitory concentration (MIC) and noninhibitory concentration (NIC) values. Journal of Applied Microbiology, 88:784-790. doi:10.1046/j.1365-2672.2000.01017. x; Lambert, R.J.W. y Lambert, R. (2003), A model for the efficacy of combined inhibitors. Journal of Applied Microbiology, 95: 734-743. doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02039.x). Los valores calculados de la Concentración Mínima Inhibitoria se dan en la Figura 12.

Las características individuales del ejemplo ejecutivo anteriormente mencionado pueden combinarse separadamente de forma inventiva con la descripción general de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo en una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo, caracterizado por que el método AST comprende o consiste en las siguientes etapas:

e) Medir, durante la etapa de incubación d), al menos n veces para cada uno de los uno o más ensayos de prueba con una frecuencia f constante o inconstante una señal derivada de una propiedad física o química del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido, y leer los valores correspondientes {x,} en tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n y en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones,

f) Estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {x,} y {xj}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo 6t¡ entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {xi}, pero al menos l3 o más valores de lectura {x,} a tiempos de registro correspondientes {t,} se usan para la distribución y

2. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en la etapa e) la señal derivada de una propiedad física o química del microorganismo inoculado se selecciona de intensidad de luz, por ejemplo, fluorescencia o luz dispersada; densidad óptica, absorbancia, turbidez, reflexión de luz u otras propiedades ópticas; conductividad, capacitancia u otras propiedades eléctricas; presiones parciales de gases implicados en el metabolismo del microorganismo, viscosidad o captación de nutrientes

3. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en bacterias, micobacterias y hongos.

4. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 a 3, en donde la frecuencia f es preferentemente 1 mHz o más, más preferentemente f está en el intervalo de 10 mHz a 10 Hz, incluso más preferentemente en el intervalo de 100 mHz a 1 Hz.

5. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 a 4, en donde las mediciones en la etapa e) se toman al menos parcialmente en una fase de crecimiento de microorganismos, en donde los cambios del valor de la señal medida debido al crecimiento de la población de microorganismos son más pequeños que los cambios del valor de la señal debido al ruido de alta frecuencia del medio de medición.

6. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 a 5, en donde las mediciones en la etapa e) se toman en una fase de crecimiento de microorganismos, en donde el aumento en la señal medida debido al crecimiento de microorganismos es igual a o menos de 3 veces del ruido de alta frecuencia del medio de medición, preferentemente igual a o menos de 2 veces del ruido de alta frecuencia del medio de medición, más preferentemente igual a o menos de 1 vez del ruido de alta frecuencia del medio de medición.

7. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 a 6, en donde una o más pendientes de tendencias lineales a se estima o estiman con una desviación estándar predeterminada Oa calculando el número mínimo de n lecturas como una función de una desviación estándar o de un ruido de alta frecuencia del medio de medición y un intervalo de tiempo 5t entre lecturas consecutivas.

8. El método implementado por computadora para determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa de un inóculo de microorganismo de acuerdo con la reivindicación 1 a 7, en donde dos o más compartimentos, preferentemente 100 0 más compartimentos comprenden el mismo ensayo de prueba y una o más pendientes de tendencias lineales a en la etapa e) se estima o estiman promediando la distribución de la diferencia de la sustracción de constituyentes de un par de valores de lectura {x} y {x,}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo 5t¡j entre tomar las lecturas indexadas 1 y j, de los respectivos ensayos de prueba.

9. Un sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido para realizar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo, comprendiendo el sistema:

b) un ensamblaje de interrogación y lectura que comprende medios de interrogación y medios de medición configurados para interrogar y leer el uno o más ensayos de prueba durante la incubación del uno o más portadores, en donde el ensamblaje de interrogación y lectura facilita i) medir al menos n veces para cada uno del uno o más ensayos de prueba, con una frecuencia f constante o no constante, una señal derivada de una propiedad química o física del microorganismo inoculado, en donde la señal representa una función esencialmente monotónica del número de los microorganismos en el ensayo de prueba medido y ii) leer los valores correspondientes {x} a tiempos de registro correspondientes {ti}, en donde i representa el número de índice de la medición representado por un número entero de 1 a n, en donde n representa un número entero completo de 13 o más mediciones y

c) un ensamblaje de computación que comprende uno o más procesadores y una o más instrucciones de almacenamiento de medio leíble por computador que, cuando se ejecuta por el uno o más procesadores, provoca que el uno o más procesadores realicen funciones que comprenden i) recibir del ensamblaje de interrogación y lectura el número n de lecturas, los valores {x,} y los tiempos de registro correspondientes {ti} y ii) estimar una o más pendientes de tendencias lineales a en datos como una función de distribución de una diferencia de una sustracción de constituyentes de un par de los valores de lectura {x,} y {x,}, donde j > i, dividido por el intervalo de tiempo Stij entre la toma de lecturas indexadas i y j, por lo que parte o todos de los n valores de lectura {xi}, pero al menos 13 o más valores de lectura {x,} a tiempos de registro correspondientes {ti} se usan para la distribución y iii) determinar la susceptibilidad cualitativa o cuantitativa del microorganismo inoculado contra el agente antimicrobiano único o la combinación de agentes antimicrobianos como una función de una o más pendientes de tendencias lineales a.

10. El sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el sistema está configurado para facilitar la prueba múltiple simultánea de los ensayos de prueba en el uno o más, preferentemente 10 o más, más preferentemente 100 o más compartimentos.

11. El sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el ensamblaje de interrogación y lectura comprende un ensamblaje óptico, que está configurado para interrogar y leer al menos uno de intensidad de luz, por ejemplo, fluorescencia o luz dispersada; densidad óptica, absorbancia, turbidez, reflexión de luz u otras propiedades ópticas; conductividad, capacitancia u otras propiedades eléctricas; presiones parciales de gases implicados en el metabolismo del microorganismo, viscosidad o captación de nutrientes del ensayo de prueba durante la incubación.

12. El sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido de acuerdo con la reivindicación 9 a 11, en donde el ensamblaje de computación está configurado además para realizar funciones de estimación y determinación después de cada 10 mediciones, preferentemente después de cada 5 mediciones, más preferentemente después de cada medición única.

13. El sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido de acuerdo con la reivindicación 9 a 12, en donde el ensamblaje de computación está configurado además para estimar una o más pendientes de tendencias lineales a con una desviación estándar predeterminada Oa calculando el número mínimo de n lecturas como una función de una desviación estándar o de un ruido de alta frecuencia del medio de medición y un intervalo de tiempo 5t entre lecturas consecutivas.

14. Un uso del sistema de prueba de susceptibilidad antimicrobiana rápido para realizar una prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) fenotípica usando dilución de caldo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 en la determinación de la susceptibilidad cualitativa y cuantitativa de un microorganismo inoculado.