ES2863674T3 - Métodos para detectar AAV - Google Patents

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Lin Liu
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Abstract

Un método para determinar el serotipo de una partícula de virus adenoasociado (AAV) que comprende a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), y c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV; en donde la combinación específica de las masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo de AAV, opcionalmente en donde, las masas calculadas de VP1, VP2 y VP3 se comparan con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 de uno o más serotipos de AAV.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos para detectar AAV
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos para serotipificar y/o determinar la heterogeneidad de una partícula vírica (p. ej., una partícula de virus adenoasociado (AAV, por sus siglas en inglés)) al usar determinación de masa, p. ej., al emplear cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS, por sus siglas en inglés) o cromatografía de líquidos/espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS, por sus siglas en inglés). En algunos aspectos, la presente descripción se refiere a métodos para mejorar la estabilidad de partículas de AAV.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La caracterización completa de las proteínas de la cápside vírica de vectores víricos (p. ej., vectores de AAV), incluida su secuencia y modificaciones postraducción, se desea en la investigación y el desarrollo de terapia génica dado que las proteínas de la cápside vírica (VP, por sus siglas en inglés) son esenciales para la infectividad vírica. Los productos de vector vírico tales como productos de virus adenoasociado recombinantes (rAAV, por sus siglas en inglés) se identifican típicamente al usar herramientas moleculares dirigidas al transgén de ácido nucleico. Estos métodos pueden incluir reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) dirigida a secuencias específicas del transgén y técnicas de polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP, por sus siglas en inglés). A medida que las tecnologías de rAAV evolucionan, muchos centros están comenzando a investigar múltiples serotipos de la cápside de AAV que codifican su transgén terapéutico en un esfuerzo por mejorar el tropismo de tejido dirigido.
Los métodos de identificación molecular tradicionales identifican productos que contienen transgenes únicos, pero son incapaces de diferenciar aquellos que tienen serotipos de cápside de AAV que difieren. En la actualidad, la mayoría de las pruebas de identidad de serotipo de AAV se basan en patrones de bandas de SDS-PAGE, un ELISA basado en anticuerpo o un ensayo de transferencia Western. Sin embargo, los patrones de bandas y anticuerpos no son suficientemente específicos para diferenciar diferentes serotipos de AAV. Se ha señalado a Gel-LC/MS/MS como un método de identificación de serotipo de cápside. Sin embargo, este método implica múltiples etapas que incluyen SDS-PAGE, digestión en gel y LC/MS/MS y, por lo tanto, requiere múltiples días para el análisis mientras proporcionar una cobertura de secuencia limitada. Los métodos para identificar vectores tales como vectores de rAAV son de interés para los vectores de terapia génica (ver, p. ej., la Pub. PGestadounidense núm. US20110275529). Por lo tanto, sería útil contar con métodos mejorados para caracterizar partículas víricas. BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Al usar rAAV como ejemplo, se describe en la presente memoria el uso de LC/MS como una herramienta analítica para identificar específicamente diferentes serotipos de cápside vírica (p. ej., serotipos de cápside de rAAV). Como parte de la caracterización vírica, se puede usar LC/MS para ampliar los métodos de identificación molecular. Esta combinación analítica puede satisfacer los requisitos reglamentarios al diferenciar tanto la identidad del transgén terapéutico del producto como la identidad del serotipo de la cápside. Este método se puede usar, p. ej., como una prueba de identidad de serotipo de AAV o para monitorizar la heterogeneidad de la proteína de la cápside vírica en el desarrollo de terapia génica con AAV recombinante. También se puede usar para confirmar secuencias de VP en la investigación de la genomanipulación de la cápside. Además, esta técnica se puede usar para estudiar el impacto de las modificaciones postraducción, tales como acetilación en el extremo N de proteínas de la cápside vírica, sobre la potencia de transfección y el tráfico proteico intracelular.
Los métodos descritos en la presente memoria también se pueden usar para diseñar partículas de AAV para mayor estabilidad y/o eficacia de transducción mejorada; por ejemplo, al alterar el residuo aminoacídico en la posición 2 de VP1 y/o VP3 de la cápside de AAV de manera que el aminoácido en la posición 2 se acetile en mayor medida en comparación con una cápside de AAV natural. En algunas realizaciones, los métodos se pueden usar para diseñar partículas de AAV con eficacia de transducción reducida; por ejemplo, al alterar el residuo aminoacídico en la posición 2 de VP1 y/o VP3 de la cápside de AAV de manera que el aminoácido en la posición 2 se desacetile en mayor o menor medida en comparación con una cápside de AAV natural.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar el serotipo de una partícula vírica que comprende a) desnaturalizar la partícula vírica, b) someter la partícula vírica desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), y c) determinar las masas de una o más proteínas de la cápside de la partícula vírica; en donde la combinación específica de masas de la una o más proteínas de la cápside es indicativa del serotipo del virus. En algunas realizaciones, las masas calculadas de la una o más proteínas de la cápside se comparan con las masas teóricas de la una o más proteínas de la cápside de uno o más serotipos de virus.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar la heterogeneidad de una partícula vírica que comprende a) desnaturalizar la partícula vírica, b) someter la partícula vírica desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/Ms/MS), y c) determinar las masas de una o más proteínas de la cápside de la partícula vírica, y d) comparar las masas de la etapa c) con las masas teóricas de la una o más proteínas de la cápside del serotipo del virus; en donde un desvío de una o más de las masas de la una o más proteínas de la cápside son indicativos de la heterogeneidad de la cápside vírica. En algunas realizaciones, la heterogeneidad comprende uno o más de serotipos mixtos, variantes de cápside, sustituciones de aminoácidos de la cápside, cápsides truncadas o cápsides modificadas.
En algunas realizaciones de los aspectos anteriores, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de líquidos con interacción hidrófila o cromatografía de intercambio catiónico. En algunas realizaciones, la partícula vírica comprende un vector vírico que codifica un transgén heterólogo.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para determinar el serotipo de una partícula vírica que comprende a) desnaturalizar la partícula vírica, b) someter la partícula vírica desnaturalizada a reducción y/o alquilación, c) someter la partícula vírica desnaturalizada a digestión para generar fragmentos de una o más proteínas de la cápside de la partícula vírica, d) someter los fragmentos de la una o más proteínas de la cápside a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS), y e) determinar las masas de fragmentos de la una o más proteínas de la cápside de la partícula vírica; en donde la combinación específica de masas de fragmentos de la una o más proteínas de la cápside son indicativas del serotipo vírico. En algunas realizaciones, las masas calculadas de los fragmentos de la una o más proteínas de la cápside se comparan con las masas teóricas de fragmentos de la una o más proteínas de la cápside de uno o más serotipos víricos.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para determinar la heterogeneidad de un serotipo de una partícula vírica que comprende a) desnaturalizar la partícula vírica, b) someter la partícula vírica desnaturalizada a reducción y/o alquilación, c) someter la partícula vírica desnaturalizada a digestión para generar fragmentos de una o más proteínas de la cápside de la partícula vírica, d) someter los fragmentos de la una o más proteínas de la cápside a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS), e) determinar las masas de fragmentos de la una o más proteínas de la cápside de la partícula vírica y f) comparar las masas de la etapa e) con las masas teóricas de fragmentos de la una o más proteínas de la cápside del serotipo vírico; en donde un desvío de una o más de las masas de la una o más proteínas de la cápside son indicativos de la heterogeneidad de la cápside vírica. En algunas realizaciones, la heterogeneidad comprende uno o más de serotipos mixtos, variantes de cápside, sustituciones de aminoácidos de la cápside, cápsides truncadas o cápsides modificadas. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de líquidos con interacción hidrófila o cromatografía de intercambio catiónico. Como se muestra en la presente memoria, los métodos se pueden llevar a cabo en ausencia de una etapa de separación en gel (p. ej., electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE, por sus siglas en inglés)).
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula vírica comprende un vector vírico que codifica un transgén heterólogo. En algunas realizaciones, la partícula vírica pertenece a una familia vírica seleccionada del grupo que consiste en Adenoviridae, Parvoviridae, Retroviridae, Baculoviridae y Herpesviridae. En algunas realizaciones, la partícula vírica pertenece a un género vírico seleccionado del grupo que consiste en Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus, Siadenovirus, Ambidensovirus, Brevidensovirus, Hepandensovirus, Iteradensovirus, Penstyldensovirus, Amdoparvovirus, Aveparvovirus, Bocaparvovirus, Copiparvovirus, Dependoparvovirus, Erythroparvovirus, Protoparvovirus, Tetraparvovirus, Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Gammaretrovirus, Lentivirus, Spumavirus, Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Deltabaculovirus, Gammabaculovirus, Iltovirus, Mardivirus, Simplexvirus, Varicellovirus, Cytomegalovirus, Muromegalovirus, Proboscivirus, Roseolovirus, Lymphocryptovirus, Macavirus, Percavirus y Rhadinovirus.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar el serotipo de una partícula de virus adenoasociado (AAV) que comprende a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), y c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV; en donde la combinación específica de masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo del AAV. En algunas realizaciones, las masas calculadas de la VP1, VP2 y VP3 se comparan con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 de uno o más serotipos de AAV.
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV que comprende a) desnaturalizar la partícula vírica de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS), c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV, y d) comparar las masas de la etapa c) con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 del serotipo de AAV; en donde un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 o VP3 son indicativos de la heterogeneidad de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, la heterogeneidad comprende uno o más de serotipos mixtos, variantes de cápside, sustituciones de aminoácidos de la cápside, cápsides truncadas o cápsides modificadas.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de AAV se desnaturaliza con ácido acético, clorhidrato de guanidina y/o un disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de líquidos con interacción hidrófila o cromatografía de intercambio catiónico. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos de fase inversa es una cromatografía inversa con C4 o C8. En algunas realizaciones, la cromatografía usa una fase móvil A que comprende ácido fórmico en agua. En algunas realizaciones, la fase móvil A comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico. En algunas realizaciones, la cromatografía comprende una fase móvil B que comprende ácido fórmico en acetonitrilo. En algunas realizaciones, la fase móvil B comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico. En algunas realizaciones, la proporción de fase móvil B en la cromatografía aumenta con el tiempo. En algunas realizaciones, la proporción de fase móvil B en la cromatografía aumenta de manera escalonada. En algunas realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 38 %. En algunas realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % en aproximadamente 6 minutos, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % en aproximadamente 10 minutos y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 38 % en aproximadamente 40 minutos. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de rendimiento ultra alto (UPLC, por sus siglas en inglés).
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la espectrometría de masas comprende un voltaje capilar de aproximadamente 3,5 kV. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas comprende un voltaje de cono de muestreo de aproximadamente 45 V. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas comprende calibración asistida. En algunas realizaciones, se usa yoduro de sodio como material calibrador.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, el extremo N de VP1 y/o VP3 está acetilado. En algunas realizaciones, la partícula de AAV es una partícula de AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende una cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de AAV LK03, una cápside de AAV2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino o una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1). En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina. En algunas realizaciones, las masas de VP1, VP2 y VP3 se comparan con las masas teóricas de una o más de cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de AAV LK03, una cápside de AAV2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino o una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1), una cápside de AAV2HBKO, una cápside de AAVPHP.B o una cápside de AAVPHP.eB.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula vírica comprende una ITR de AAV1, una ITR de AAV2, una ITR de AAV3, una ITR de AAV4, una ITR de AAV5, una ITR de AAV6, una ITR de AAV7, una ITR de AAV8, una ITR de AAVrh8, una ITR de AAV9, una ITR de AAV10, una ITR de AAVrh10, una ITR de AAV11 o una ITR de AAV12. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para determinar el serotipo de una partícula de virus adenoasociado (AAV) que comprende a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a reducción y/o alquilación, c) someter la partícula de AAV desnaturalizada a digestión para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de a Av , d) someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS), y e) determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV; en donde la combinación específica de masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo del AAV. En algunas realizaciones, las masas calculadas de los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 se comparan con las masas teóricas de fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de uno o más serotipos de AAV.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para determinar la heterogeneidad de un serotipo de una partícula de AAV que comprende a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a reducción y/o alquilación, c) someter la partícula de AAV desnaturalizada a digestión para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de a Av , d) someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS), e) determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV y, f) comparar las masas de la etapa e) con las masas teóricas de los fragmentos de VP1, VP2 o VP3 del serotipo de AAV; en donde un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativas de la heterogeneidad de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, la heterogeneidad comprende uno o más de serotipos mixtos, variantes de cápside, sustituciones de aminoácidos de la cápside, cápsides truncadas o cápsides modificadas. En algunas realizaciones, la reducción es al someter la partícula de AAV a ditiotreitol, betamercaptoetanol o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, la alquilación es al someter la partícula de AAV a ácido yodoacético, yodoacetamida o 4-vinilpiridina. En algunas realizaciones, la digestión es una digestión enzimática o una digestión química. En algunas realizaciones, la digestión enzimática es una digestión por endopeptidasa. En algunas realizaciones, la digestión enzimática es una digestión por tripsina, una digestión por LysC, una digestión por Asp-N o una digestión por Glu-C. En algunas realizaciones, la digestión química es digestión con bromuro de cianógeno o una digestión ácida. En algunas realizaciones, la partícula de AAV se desnaturaliza con ácido acético, clorhidrato de guanidina y/o un disolvente orgánico.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de líquidos con interacción hidrófila o cromatografía de intercambio catiónico. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos de fase inversa es una cromatografía inversa con C18. En algunas realizaciones, la cromatografía usa una fase móvil A que comprende ácido fórmico en agua. En algunas realizaciones, la fase móvil A comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico. En algunas realizaciones, la cromatografía comprende una fase móvil B que comprende ácido fórmico en acetonitrilo. En algunas realizaciones, la fase móvil B comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico. En algunas realizaciones, la proporción de fase móvil B en la cromatografía aumenta con el tiempo. En algunas realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 2 % a aproximadamente 60 %. En algunas realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 2 % a aproximadamente 60 % en aproximadamente 121 minutos. En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de rendimiento alto (HPLC, por sus siglas en inglés).
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la espectrometría de masas comprende un voltaje capilar de aproximadamente 3,5 kV. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas comprende un voltaje de cono de muestreo de aproximadamente 45 V. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas comprende calibración asistida. En algunas realizaciones, se usa yoduro de sodio como material calibrador.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, el extremo N de VP1 y/o VP3 está acetilado. En algunas realizaciones, la partícula de AAV es una partícula de AAV recombinante (rAAV). En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende una cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de AAV LK03, una cápside de AAV2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino o una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1). En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina. En algunas realizaciones, las masas de VP1, VP2 y VP3 se comparan con las masas teóricas de una o más de cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de AAV LK03, una cápside de AAV2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino o una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1).
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula vírica comprende una ITR de AAV1, una ITR de AAV2, una ITR de AAV3, una ITR de AAV4, una ITR de AAV5, una ITR de AAV6, una ITR de AAV7, una ITR de AAV8, una ITR de AAVrh8, una ITR de AAV9, una ITR de AAV10, una ITR de AAVrh10, una ITR de AAV11 o una ITR de AAV12. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona una partícula de AAV recombinante (rAAV) que comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la sustitución da como resultado una mayor frecuencia de acetilación del extremo N o una menor frecuencia de acetilación del extremo N. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP3; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 se sustituye con Ser, Asp o Glu.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, AAV murino, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B o AAVPHP.eB. En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende, además, una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una o más ITR de AAV. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una ITR de AAV1, una iTr de AAV2, una ITR de AAV3, una ITR de AAV4, una ITR de AAV5, una ITR de AAV6, una ITR de AAV7, una ITR de AAV8, una ITR de AAVrh8, una ITR de AAV9, una ITR de AAV10, una ITR de AAVrh10, una ITR de AAV11 o una ITR de AAV12. En algunas realizaciones, la cápside de AAV y las ITR de AAV derivan del mismo serotipo. En algunas realizaciones, la cápside de AAV y las ITR de AAV derivan de diferentes serotipos. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo flanqueado por una o más ITR de AAV.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, el vector de rAAV es un vector autocomplementario. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el transgén y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complemento del transgén, en donde la primera secuencia de ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia de ácido nucleico a lo largo de gran parte o toda su longitud. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están enlazadas mediante una ITR de AAV mutada, en donde la ITR de AAV mutada comprende una eliminación de la región D y comprende una mutación de la secuencia de resolución terminal.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de rAAV se produce al transfectar una célula hospedante con ácido nucleico que codifica el vector de rAAV y ácido nucleico que codifica funciones rep y cap de AAV, y al proporcionar ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al transfectar la célula hospedante con ácido nucleico que codifica las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al infectar la célula hospedante con un virus auxiliar de AAV que proporciona las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, el virus auxiliar de AAV es un adenovirus, un virus del herpes simple o un baculovirus. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produce por medio de una célula productora de AAV que comprende ácido nucleico que codifica el vector de rAAV y ácido nucleico que codifica funciones rep y cap de AAV, y al proporcionar ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, la célula productora de AAV comprende ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al infectar las células productoras de AAV con un virus auxiliar de AAV que proporciona las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, el virus auxiliar de AAV es un adenovirus, un virus del herpes simple o un baculovirus. En algunas realizaciones, las funciones cap de AAV proporcionan una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3, en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende la partícula de rAAV como se describe en la presente memoria. En algunos aspectos, la descripción proporciona un kit que comprende la partícula de rAAV o la composición farmacéutica como se describen en la presente memoria. En algunos aspectos, la descripción proporciona un artículo de fabricación que comprende la partícula de rAAV o la composición farmacéutica como se describen en la presente memoria.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una proteína de la cápside de AAV que comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de una proteína de la cápside de AAV original; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV original. En algunas realizaciones, la sustitución da como resultado una mayor frecuencia de acetilación del extremo N o una menor frecuencia de acetilación del extremo N. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV es VP1 o VP3. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV se sustituye con Ser, Asp o Glu. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido da como resultado una menor desamidación de la cápside de AAV.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, AAV murino, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B o AAVPHP.eB. En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende, además, una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar la estabilidad de una partícula de rAAV que comprende sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de una VP1 y/o VP3 original; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 altera la acetilación del extremo N de VP1 y/o VP3, en comparación con el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar el ensamblaje de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 o una VP1 y/o VP3 original; en donde la sustitución de aminoácido en la posición 2 altera la acetilación del extremo N de VP1 y/o VP3, en comparación con el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar la transducción de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 o una VP1 y/o VP3 original; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 altera la acetilación del extremo N de VP1 y/o VP3, en comparación con el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido da como resultado una mayor frecuencia de acetilación del extremo N o una menor frecuencia de acetilación del extremo N. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 se sustituye. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP3 se sustituye. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 se sustituye con Ser, Asp o Glu. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para reducir la transducción de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3; en donde el aminoácido sustituido en la posición 2 altera la acetilación del extremo N de VP1 y/o VP3, en comparación con el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, AAV murino, rAAV2/HBoV1, AAV2HBKO, AAVPHP.B o AAVPHP.eB. En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende, además, una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una o más ITR de AAV. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una ITR de AAV1, una iTr de AAV2, una ITR de AAV3, una ITR de AAV4, una ITR de AAV5, una ITR de AAV6, una ITR de AAV7, una ITR de AAV8, una ITR de AAVrh8, una ITR de AAV9, una ITR de AAV10, una ITR de AAVrh10, una ITR de AAV11 o una ITR de AAV12. En algunas realizaciones, la cápside de AAV y las ITR de AAV derivan del mismo serotipo. En algunas realizaciones, la cápside de AAV y las ITR de AAV derivan de diferentes serotipos. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo flanqueado por una o más ITR de AAV.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, el vector de rAAV es un vector autocomplementario. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el transgén y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complemento del transgén, en donde la primera secuencia de ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia de ácido nucleico a lo largo de gran parte o toda su longitud. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están enlazadas mediante una ITR de AAV mutada, en donde la ITR de AAV mutada comprende una eliminación de la región D y comprende una mutación de la secuencia de resolución terminal.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de rAAV se produce al transfectar una célula hospedante con ácido nucleico que codifica el vector de rAAV y ácido nucleico que codifica funciones rep y cap de AAV, y al proporcionar ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al transfectar la célula hospedante con ácido nucleico que codifica las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al infectar la célula hospedante con un virus auxiliar de AAV que proporciona las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, el virus auxiliar de AAV es un adenovirus, un virus del herpes simple o un baculovirus. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produce por medio de una célula productora de AAV que comprende ácido nucleico que codifica el vector de rAAV y ácido nucleico que codifica funciones rep y cap de AAV, y al proporcionar ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, la célula productora de AAV comprende ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al infectar las células productoras de AAV con un virus auxiliar de AAV que proporciona las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, el virus auxiliar de AAV es un adenovirus, un virus del herpes simple o un baculovirus. En algunas realizaciones, las funciones cap de AAV proporcionan una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3, en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una partícula de AAV recombinante (rAAV) que comprende una o más sustituciones de aminoácido en el residuo aminoacídico A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716 de VP1 o VP3 de una partícula original, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la una o más sustituciones de aminoácido alteran la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la una o más sustitución de aminoácido es en el residuo aminoacídico A35, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3 y altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido comprende una sustitución con Asp en N57 de VP1, N382 de VP3, N511 de VP3 o N715 de VP3; y da como resultado una mayor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido comprenden una sustitución N57K o N57Q y da como resultado una menor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la una o más sustitución de aminoácido comprenden una sustitución con Asp en A35 de VP1 y da como resultado una mayor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido es en G58 de VP1, G383 de VP3, G512 de VP3 o G716 de VP3 y da como resultado una menor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, el G58 de VP1 se sustituye con Asp. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV es una partícula de AAV1 o una partícula de AAV2.
En algunos aspectos, la descripción proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden partículas de AAV que comprenden una o más sustituciones de aminoácido en el residuo aminoacídico A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716 de VP1 o VP3, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunos aspectos, la descripción proporciona kits que comprenden partículas de AAV o composiciones que comprenden partículas de AAV en donde las partículas de AAV comprenden una o más sustituciones de aminoácido en el residuo aminoacídico A35, N57, G58, N382, G383, N511, g 512, N715 o G716 de VP1 o VP3, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunos aspectos, la descripción proporciona artículos de fabricación que comprenden partículas de AAV o composiciones que comprenden partículas de AAV en donde las partículas de AAV comprenden una o más sustituciones de aminoácido en el residuo aminoacídico A35, N57, g 58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716 de VP1 o VP3, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunos aspectos, la descripción proporciona una proteína de la cápside de AAV que comprende una sustitución de aminoácido de una proteína de la cápside de AAV original; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación de la cápside en comparación con la proteína de la cápside de AAV original.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar la estabilidad de una partícula de rAAV que comprende sustituir uno o más residuos aminoacídicos, en donde el uno o más residuos aminoacídicos es A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar el ensamblaje de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir uno o más residuos aminoacídicos, en donde el uno o más residuos aminoacídicos es A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar la transducción de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir uno o más residuos aminoacídicos, en donde el uno o más residuos aminoacídicos es A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido es en A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, el residuo Ala original en la posición 35 de VP1 se sustituye con Asp. En algunas realizaciones, el residuo Gly original en la posición 58 de VP1 se sustituye con Asn. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV es una partícula de AAV1 o una partícula de AAV2.
En algunas realizaciones, la descripción proporciona un método para mejorar la estabilidad, ensamblaje y/o eficacia de transducción de una partícula de rAAV que comprende sustituir uno o más residuos aminoacídicos, en donde el uno o más residuos aminoacídicos es A35, N57, G58, N382, G383, N511, G512, N715 o G716, la numeración de residuos se basa en VP1 de AAV2; en donde la sustitución de aminoácido altera la desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original como se describió anteriormente, en donde la partícula de AAV comprende una cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, AAV murino o rAAV2/HBoV1. En algunas realizaciones, la cápside de a Av comprende, además, una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende un vector de rAAV. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una o más ITR de AAV. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una ITR de AAV1, una iTr de AAV2, una ITR de AAV3, una ITR de AAV4, una ITR de AAV5, una ITR de AAV6, una ITR de AAV7, una ITR de AAV8, una ITR de AAVrh8, una ITR de AAV9, una ITR de AAV10, una ITR de AAVrh10, una ITR de AAV11 o una ITR de AAV12. En algunas realizaciones, la cápside de AAV y las ITR de AAV derivan del mismo serotipo. En algunas realizaciones, la cápside de AAV y las ITR de AAV derivan de diferentes serotipos. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo flanqueado por una o más ITR de AAV.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, el vector de rAAV es un vector autocomplementario. En algunas realizaciones, el vector de rAAV comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el transgén y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complemento del transgén, en donde la primera secuencia de ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia de ácido nucleico a lo largo de gran parte o toda su longitud. En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están enlazadas mediante una ITR de AAV mutada, en donde la ITR de AAV mutada comprende una eliminación de la región D y comprende una mutación de la secuencia de resolución terminal.
En algunas realizaciones de los aspectos y realizaciones anteriores, la partícula de rAAV se produce al transfectar una célula hospedante con ácido nucleico que codifica el vector de rAAV y ácido nucleico que codifica funciones rep y cap de AAV, y al proporcionar ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al transfectar la célula hospedante con ácido nucleico que codifica las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al infectar la célula hospedante con un virus auxiliar de AAV que proporciona las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, el virus auxiliar de AAV es un adenovirus, un virus del herpes simple o un baculovirus. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produce por medio de una célula productora de AAV que comprende ácido nucleico que codifica el vector de rAAV y ácido nucleico que codifica funciones rep y cap de AAV, y al proporcionar ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, la célula productora de AAV comprende ácido nucleico que codifica funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan al infectar las células productoras de AAV con un virus auxiliar de AAV que proporciona las funciones auxiliares de AAV. En algunas realizaciones, el virus auxiliar de AAV es un adenovirus, un virus del herpes simple o un baculovirus. En algunas realizaciones, las funciones cap de AAV proporcionan una sustitución de aminoácido de VP1 y/o VP3, en donde la sustitución de aminoácido modula la desamidación de la cápside en comparación con la partícula de AAV original.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A-D proporcionan cromatogramas de ion totales de LC/MS de VP de AAV2. La Figura 1A: columna de 10 cm de longitud BEH C4 con gradiente al 1,7 %/min, la Figura 1B: columna de 10 cm de longitud BEH C4 con gradiente al 0,5 %/min, la Figura 1C: columna de 15 cm de longitud BEH C4 con gradiente al 0,5 %/min, la Figura 1D: columna de 15 cm de longitud BEH C8 con gradiente al 0,5 %/min.
Las Figuras 2A y B proporcionan espectros de masa deconvoluidos a partir de la Figura 1D pico 1 (Figura 2A) y la Figura 1D pico 2 (Figura 2B).
La Figura 3 proporciona la cobertura de secuencia de VP1 de AAV2 (SEQ ID NO:3): verde, péptidos trípticos, azul, péptidos de Lys-C, rosa, péptidos de Asp-N.
Las Figuras 4A-4C proporciona espectros de MS/MS de péptidos del extremo N de VP de AAV2. La Figura 4A: péptido tríptico del extremo N de VP1 A(Ac)ADGYLPDWLEDTLSEGIR (SEQ ID NO: 4), Figura 4B péptido de Asp-N en el extremo N de VP2 APGKKRPVEHSPVEP (SEQ ID NO: 15). La Figura 4C: péptido derivado de Asp-N en el extremo N de VP-3 A(Ac)TGSGAPM (SEQ ID NO: 5).
La Figura 5 proporciona la alineación de secuencia de 13 serotipos de AAV letras negras/fondo blanco: no similar; letras azules/fondo azul: conservadora; letras negras/fondo verde: bloque de similar; letras rojas/fondo amarillo: idénticas; letras verdes/fondo blanco: débilmente similar. AAVRh10 (SEQ ID NO: 17); AAV10 (SEQ ID NO: 18); AAV8 (SEQ ID NO: 19); AAV7 (SEQ ID NO: 20); AAV1 (SEQ ID NO: 21); AAV6 (SEQ ID NO: 22); AAV2 (SEQ ID NO: 23); AAV3 (SEQ ID NO: 24); AAV11 (SEQ ID NO: 25); AAV12 (SEQ ID NO: 26); AAV4 (SEQ ID NO: 27); AAV5 (SEQ ID NO: 28); AAV9 (SEQ ID NO: 29); Consenso (SEQ ID NO: 30).
Las Figuras 6A y 6B muestran los resultados de análisis de LC/MS/MS que comparan el porcentaje de desamidación en partículas de AAV1 y AAV2 producidas mediante los métodos TTx y PCL. El péptido T9 YLGPFNGLDK (SEQ ID NO: 9) se usó para monitorizar el posible sitio de desamidación N57 en AAV1 y Aa V2.
Las Figuras 7A y 7B muestran los resultados de análisis de LC/MS/MS que comparan el porcentaje de desamidación en partículas de AAV1 y AAV2 producidas mediante los métodos TTx y PCL. Los péptidos T49 YNLNGR (SEQ ID NO: 11) y YHLNGR (SEQ ID No : 12) se usaron para monitorizar el posible sitio de desamidación N511 en Aa V1 y AAV2, respectivamente.
Las Figuras 8A y 8B muestran los resultados de análisis de LC/MS/MS que comparan el porcentaje de desamidación en partículas de AAV1 y AAV2 producidas mediante los métodos TTx y PCL. Los péptidos T67 SANVDFTVDNNGLYTEPR (SEQ ID NO: 13) y SVNVDFTVDTNGVYSEPR (SEQ ID NO: 14) se usaron para monitorizar el posible sitio de desamidación N715 en AAV1 y AAV2, respectivamente.
La Figura 9 muestra los resultados del análisis de gel proteico SYPRO de la producción y relación VP1:VP2:VP3 de variantes mutantes desacetiladas de AAV5.
La Figura 10 ilustra un ensayo de transducción in vitro para evaluar la eficacia de transducción de variantes desacetiladas de AAV5.
La Figura 11 muestra la eficacia de ingreso celular de las variantes desacetiladas de AAV5 indicadas o AAV5 no modificada original, según se mide mediante copias en genoma del vector/pg de proteína. Se usaron tres líneas celulares: 293, HeLa y HuH7.
La Figura 12 muestra la expresión de eGFP (según se mide mediante ELISA) por células transducidas con las variantes desacetiladas de AAV5 indicadas en comparación con la transducción con AAV5 no modificada original. Se usaron tres líneas celulares: 293, HeLa y HuH7.
La Figura 13 proporciona la alineación de secuencia de 13 serotipos de AAV, se destaca el sitio de desamidación N57G58 conservado y el residuo A35 en AAV2. AAVRh10 (SEQ ID NO: 31); AAV10 (SEQ ID NO: 31); AAV8 (SEQ ID NO: 32); AAV7 (SEQ ID NO: 33); AAV1 (SEQ ID NO: 31); AAV6 (SEQ ID NO: 31); AAV2 (SEQ ID NO: 34); AAV3 (SEQ ID NO: 35); AAV11 (SEQ ID NO: 31); AAV12 (SEQ ID NO: 36); AAV4 (SEQ ID NO: 37); AAV5 (SEQ ID NO: 38); AAV9 (SEQ ID NO: 39); Consenso (SEQ ID NO: 40).
La Figura 14 muestra un gel proteico de las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3 de las partículas AAV1 o AAV2 producidas mediante el método PCL o TTx. *destaca la proteína VP1 (tVP1) truncada.
La Figura 15 muestra los resultados del análisis de LC/MS de la desamidación de los mutantes de AAV2 indicados, en comparación con cápsides de AAV2 testigo.
La Figura 16 muestra los resultados del análisis de gel proteico SYPRO de la producción y relación VP1:VP2:VP3 de variantes mutantes de desamidación de AAV2.
La Figura 17 ilustra un ensayo de transducción in vitro para evaluar la eficacia de transducción de variantes de desamidación de AAV2.
La Figura 18 muestra la eficacia de ingreso celular de las variantes de desamidación de AAV2 indicadas o AAV2 no modificada original, según se mide mediante copias en genoma del vector/pg de proteína. Se usaron tres líneas celulares: 293, HeLa y HuH7.
La Figura 19 muestra la expresión de eGFP (según se mide mediante ELISA) por células transducidas con las variantes de desamidación de AAV2 indicadas en comparación con la transducción de AAV2 no modificada original. Se usaron tres líneas celulares: 293, HeLa y HuH7.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En algunos aspectos, la invención proporciona un método para determinar el serotipo de una partícula(s) de virus adenoasociado (AAV) que comprende: a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) inyectar la partícula de AAV desnaturalizada para cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), y c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV; en donde la combinación específica de masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo del AAV.
En otros aspectos, la invención proporciona un método para determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV que comprende: a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) inyectar la partícula de AAV desnaturalizada para cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS) y c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV, y comparar las masas de la etapa c) con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 del serotipo de AAV; en donde un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 o VP3 son indicativos de la heterogeneidad de la cápside de AAV.
En otros aspectos, la descripción proporciona un método para determinar el serotipo de una partícula de virus adenoasociado (AAV) que comprende a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a reducción y/o alquilación, c) inyectar la partícula de AAV desnaturalizada para digestión para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de AAV, d) someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS), y e) determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV; en donde la combinación específica de masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo del AAV.
En otros aspectos, la descripción proporciona un método para determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV de un serotipo que comprende: a) desnaturalizar la partícula de AAV, b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a reducción y/o alquilación, c) inyectar la partícula de AAV desnaturalizada para digestión para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de AAV, d) someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS), e) determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV y, f) comparar las masas de la etapa e) con las masas teóricas de los fragmentos de VP1, VP2 o VP3 del serotipo de AAV; en donde un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativas de la heterogeneidad de la cápside de AAV.
En algunos aspectos, la descripción proporciona una partícula de AAV recombinante (rAAV) que comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original.
En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar el ensamblaje de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3; en donde el aminoácido sustituido en la posición 2 se N-acetila en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original. En algunos aspectos, la descripción proporciona un método para mejorar la transducción de partículas de rAAV en una célula que comprende sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3; en donde el aminoácido sustituido en la posición 2 se N-acetila en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original.
I. Técnicasgenerales
Los expertosen la técnicaentiendengeneralmente y empleancomúnmente las técnicas y procedimientosdescritos o mencionadosen la presentememoria al usarmetodologíaconvencional, talcomo, porejemplo, las metodologíasampliamenteutilizadasdescritasen Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6a ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., Ir L Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
II. Definiciones
Un "vector", según se usa en la presente memoria, se refiere a un plásmido o virus recombinante que comprende un ácido nucleico que se va a suministrar a una célula hospedante, ya sea in vitro o in vivo.
El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", según se usa en la presente memoria, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Por lo tanto, este término incluye, pero no se limita a, ADN o ARN monocatenario, bicatenario o multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN, o un polímero que comprende bases purina y pirimidina, u otras bases nucleotídicas naturales, química o bioquímicamente modificadas, no naturales o derivadas. La cadena principal del ácido nucleico puede comprender azúcares y grupos fosfato (como se pueden encontrar típicamente en ARN o ADN), o azúcar o grupos fosfato modificados o sustituidos. Alternativamente, la cadena principal del ácido nucleico puede comprender un polímero de subunidades sintéticas tales como fosforamidatos y, por lo tanto, puede ser un oligodesoxinucleósido fosforamidato (P-NH2) o un oligómero mixto de fosforamidato- fosfodiéster. Además, se puede obtener un ácido nucleico bicatenario a partir del producto polinucleotídico monocatenario de síntesis química, ya sea al sintetizar la cadena complementaria y aparear las cadenas en condiciones apropiadas, o al sintetizar la cadena complementaria de novo con el uso de una ADN polimerasa con un cebador apropiado.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable para hacer referencia a un polímero de residuos aminoacídicos, y no se limitan a una longitud mínima. Dichos polímeros de residuos aminoacídicos pueden contener residuos aminoacídicos natural o no naturales, e incluyen, pero no se limitan a, péptidos, oligopéptido, dímeros, trímeros y multímeros de residuos aminoacídicos. La definición abarca tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de estas. Los términos también incluyen modificaciones después de la traducción del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, sialilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, a los efectos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a la secuencia natural, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida a un sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospedantes que producen las proteínas o errores debido a amplificación por PCR.
Un "vector vírico recombinante" se refiere a un vector polinucleotídico recombinante que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico de origen no vírico). En el caso de vectores de AAV recombinantes, el ácido nucleico recombinante está flanqueado por al menos una, p. ej., dos, secuencias de repetición terminal (ITR, por sus siglas en inglés) invertidas.
Un "vector de AAV recombinante" (vector de rAAV) se refiere a un vector polinucleotídico que comprende una o más secuencias heterólogas (es decir, secuencia de ácido nucleico de origen distinto de AAV) que están flanqueada por al menos una, p. ej., dos secuencias de repetición terminal (ITR) invertidas de AAV. Dichos vectores de rAAV se pueden replicar y empaquetar en partículas víricas infecciosas cuando están presentes en una célula hospedante que se ha infectado con un virus auxiliar adecuado (o que expresa funciones auxiliares adecuadas) y que expresa productos de los genes rep y cap de AAV (es decir, proteínas Rep y Cap de AAV). Cuando un vector de rAAV se incorpora en un polinucleótido más grande (p. ej., en un cromosoma o en otro vector tal como un plásmido usado para clonación o transfección), se puede hacer referencia al vector de rAAV como un "pro-vector" que se puede "rescatar" mediante replicación y encapsidación en presencia de funciones de empaquetamiento de AAV y funciones auxiliares adecuadas. Un vector rAAV puede estar en cualquiera de varias formas, que incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cromosomas artificiales lineales, formando complejo con lípidos, encapsulado dentro de liposomas, y, en realizaciones, encapsidado en una partícula vírica, particularmente, una partícula de AAV. Un vector de rAAV se puede empaquetar en una cápside de virus AAV para generar una "partícula vírica adenoasociada recombinante (partícula de rAAV)".
Un “virus rAAV” o “partícula vírica de rAAV” se refiere a una partícula vírica compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV y un genoma de vector de rAAV encapsidado.
Una "partícula de AAV original" y "proteína de la cápside de AAV original", según se usa en la presente memoria en el contexto de comparar la N-acetilación y/o desamidación, se refiere a una partícula o proteína de la cápside de AAV en la que se introducen modificaciones de aminoácidos para modular la N-acetilación y/o desamidación (p. ej., una partícula/proteína de la cápside de AAV que es igual o similar a la partícula/cápside de AAV de la presente invención pero no comprende las mutaciones que modulan/alteran la N-acetilación y/o desamidación como se describe en la presente memoria). En algunas realizaciones, la partícula de AAV original es una partícula de AAV recombinante que comprende genoma de AAV recombinante. En algunas realizaciones, la partícula de la cápside de AAV o proteína de la cápside de AAV original comprende sustituciones de aminoácido que afectan otros aspectos de la partícula de AAV. Por ejemplo, la partícula de AAV original puede comprender sustituciones de aminoácidos que afectan la unión de AAV a su receptor, tales como las que afectan la unión de AAV2 a proteoglicano de heparina sulfato (p. ej., una partícula HBKO de AAV2). Una partícula de HBKO de AAV2 se puede mutar para introducir sustituciones de aminoácidos que modulan la N-acetilación y/o desamidación. Dicha partícula de AAV mutada después se puede comprar con la de HBKO de AAV2 original en aspectos de la invención como se describen en la presente memoria. Una proteína de la cápside de AAV original puede incluir una proteína de la cápside VP1, una proteína de la cápside VP2 o una proteína de la cápside VP3 original.
Según se usa en la presente memoria, el término "modular" o "alterar" en referencia a una molécula original significa cambiar un rasgo de la molécula original. Por ejemplo, una partícula de AAV con N-acetilación alterada puede mostrar una N-acetilación mayor o menor en comparación con la partícula de AAV original y una partícula de AAV con desamidación alterada puede mostrar desamidación mayor o menor en comparación con la partícula de AAV original.
“Heterológo/a” significa derivado de una entidad genotípicamente distinta del resto de la entidad con la cual se está comparando o en cual se introduce o incorpora. Por ejemplo, un ácido nucleico introducido mediante técnicas de manipulación genética en un tipo celular diferente es un ácido nucleico heterólogo (y, cuando se expresa, puede codificar un polipéptido heterólogo). De manera similar, una secuencia celular (p. ej., un gen o porción de este) que se incorpora en un vector vírico es una secuencia de nucleótidos heteróloga con respecto al vector.
El término "transgén" se refiere a un ácido nucleico que se introduce en una célula y es capaz de transcribirse en ARN y, opcionalmente, traducirse y/o expresarse en condiciones apropiadas. En aspectos, confiere una propiedad deseada a una célula en la cual se introdujo o conduce de cualquier otra manera a un resultado terapéutico o de diagnóstico deseado. En otro aspecto, se puede transcribir en una molécula que media la interferencia por ARN, tal como ARNip.
Los términos "partículas de genoma (gp)", "equivalentes de genoma" o "copias de genoma", según se usan en referencia a un valor cuantitativo vírico, hacen referencia al número de viriones que contienen el genoma de ADN de AAV recombinante, independientemente de la infectividad o funcionalidad. El número de partículas de genoma en una preparación de vector particular se puede medir mediante procedimientos tales como los descritos en los Ejemplos en la presente memoria o, por ejemplo, en Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
Los términos "unidad de infección (ui)", "partícula infecciosa" o "unidad de replicación", según se usan en referencia a un valor cuantitativo vírico, hacen referencia al número de partículas de vector de AAV recombinante infecciosas y competentes para replicación, según se mide mediante el ensayo de centro infeccioso, también conocido como ensayo de centro de replicación, como se describe, por ejemplo, en McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.
El término "unidad de transducción (ut)", según se usa en referencia a un valor cuantitativo vírico, se refiere al número de partículas de vector de AAV recombinante infecciosas que causan la producción de un producto de transgén funcional, según se mide en ensayos funcionales tales como los descritos en los Ejemplos en la presente memoria o, por ejemplo, en Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; o en Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensayo LFU).
Una secuencia de "repetición terminal invertida" o "ITR" es un término entendido en la técnica y se refiere a secuencias relativamente cortas que se encuentran en los extremos de los genomas víricos que están en orientación opuesta.
Una secuencia de "repetición terminal invertida de AAV (ITR)", un término entendido en la técnica, es una secuencia de aproximadamente 145 nucleótidos que está presente en ambos extremos del genoma de AAV monocatenario natural. Los 125 nucleótidos más hacia el exterior de la ITR pueden estar presentes en cualquiera de dos orientaciones alternativas, que conducen a la heterogeneidad entre diferentes genomas de AAV y entre los dos extremos de un único genoma de AAV. Los 125 nucleótidos más hacia el exterior también contienen varias regiones más cortas de autocomplementariedad (designadas regiones A, A', B, B', C, C' y D), que permiten que se produzca el apareamiento de bases intracatenario dentro de esta porción de la ITR.
Una "secuencia de resolución terminal" o "trs" es una secuencia en la región D de la ITR de AAV que se escinde mediante proteínas rep de AAV durante la replicación del ADN vírico. Una secuencia de resolución terminal mutante es insensible a la escisión por proteínas rep de AAV. "Funciones auxiliares de AAV" hace referencia a funciones que permiten que una célula hospedante replique y empaquete el AAV. Las funciones auxiliares de AAV se pueden proporcionar de diversas formas, que incluyen, pero no se limitan a, virus auxiliar o genes de virus auxiliar que ayudan en la replicación y empaquetamiento de AAV. Se conocen otras funciones auxiliares de AAV en la técnica tales como agentes genotóxicos.
"Funciones auxiliares de AAV" hace referencia a funciones que permiten que una célula hospedante replique y empaquete el AAV. Las funciones auxiliares de AAV se pueden proporcionar de diversas formas, que incluyen, pero no se limitan a, virus auxiliar o genes de virus auxiliar que ayudan en la replicación y empaquetamiento de AAV. Se conocen otras funciones auxiliares de AAV en la técnica tales como agentes genotóxicos.
Un "virus auxiliar" para AAV se refiere a un virus que permite que una célula hospedante replique y empaquete el AAV (que es un parvovirus defectuoso). Se han identificado varios virus auxiliares, incluidos adenovirus, virus del herpes, virus de la viruela tales como variolovacuna, y baculovirus. Los adenovirus abarcan varios subgrupos diferentes, aunque el Adenovirus tipo 5 del subgrupo C (Ad5) es el más usado comúnmente. Se conocen numerosos adenovirus de origen humano, no humano y mamífero y están disponibles en depósitos tales como ATCC. Los virus de la familia herpes, que también están disponibles en depósitos tales como ATCC, incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), virus de Epstein-Barr (EBV, por sus siglas en inglés), citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) y virus de la seudorrabia (PRV, por sus siglas en inglés). Los baculovirus disponibles en depósitos incluyen el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica.
"Porcentaje (%) de identidad secuencial" con respecto a un polipéptido o secuencia de ácido nucleico de referencia se define como el porcentaje de residuos aminoacídicos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoacídicos o nucleótidos en el polipéptido o secuencia de ácido nucleico de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad secuencial, y sin considerar ninguna de las sustituciones conservadoras como parte de la identidad secuencial. La alineación a los efectos de determinar el porcentaje de identidad secuencial de aminoácidos o ácido nucleico se pueden lograr de varias maneras que están dentro de las habilidades en la técnica, por ejemplo, al usar programas informáticos disponibles públicamente, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1, e incluido el programa informático BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Un posible programa de alineación es ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima a lo largo de la longitud completa de las secuencias que se van a comparar. A los efectos de la presente memoria, el % de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A dada para, con respecto, o contra una secuencia de aminoácidos B dada (que alternativamente se puede formular como una secuencia de aminoácidos A dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de aminoácidos para, con respecto, o contra una secuencia de aminoácidos B dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y, donde X es el número de residuos aminoacídicos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias en la alineación del programa de A y B, y donde Y es el número total residuos aminoacídicos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencia de aminoácidos entre A y B no será igual al % de identidad de secuencia de aminoácidos entre B y A. A los efectos de la presente memoria, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico de una secuencia de aminoácidos C dada para, con respecto, o contra una secuencia de ácido nucleico D dada (que alternativamente se puede formular como una secuencia de ácido nucleico C dada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencia de ácido nucleico para, con respecto, o contra una secuencia de ácido nucleico D dada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción W/Z, donde W es el número de nucleótidos puntuados como coincidencias idénticas por el programa de alineación de secuencias en dicha alineación del programa de C y D, y donde Z es el número total nucleótidos en D. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de identidad de secuencia de ácido nucleico entre C y D no será igual al % de identidad de secuencia de ácido nucleico entre D y C. Una molécula "aislada" (p. ej., ácido nucleico o proteína) o célula significa que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural.
"Espectrometría de masas" se refiere a la técnica de química analítica para identificar una cantidad y/o tipo de un compuesto (p. ej., un polipéptido) al medir la relación entre masa y carga y la abundancia de iones en fase gaseosa. El término "espectrometría de masas" se puede usar de manera intercambiable en la presente memoria.
"Heterogeneidad" cuando se usa en referencia a una cápside de AAV se refiere a una cápside de AAV caracterizada porque se observa que uno o más polipéptidos de la cápside se desvían de una masa de referencia de un polipéptido de VP1, VP2 y/o VP3, o fragmento de este. Una masa de referencia puede incluir, sin limitación, una masa teórica, prevista o esperada de un polipéptido de VP1, VP2 y/o VP3, p. ej., de un serotipo de AAV conocido. Por ejemplo, se puede decir que una cápside de AAV exhibe heterogeneidad si demuestra una o más de las siguientes propiedades (sin limitación): un serotipo mixto, una cápside variante, una sustitución de aminoácido de cápside, una cápside truncada o una cápside modificada.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente memoria incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a dicho valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción en referencia a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X".
Según se usa en la presente memoria, la forma singular de los artículos "un", "una" y "el/la" incluye referencias plurales, a menos que se indique de cualquier otra manera.
Se entenderá que aspectos y realizaciones de la invención descritos en la presente memoria incluyen aspectos y realizaciones "que comprende/n", "que consiste/n" y/o "consiste/n esencialmente en".
III. Métodos
Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para determinar el serotipo de una partícula vírica. Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para determinar la heterogeneidad de una partícula vírica. Como se describe más adelante, las masas precisas de VP1, VP2 y VP3 de cada serotipo de AAV son únicas y se pueden usar para identificar o diferenciar serotipos de cápside de AAV. Estos métodos se basan, en parte, en el descubrimiento descrito en la presente memoria de que se puede usar LC/MS directa de diferentes tipos de AAV después de la desnaturalización para monitorizar la secuencia de proteína y las modificaciones después de la traducción con medición de masa precisa a nivel de la proteína intacta. Además, también se pueden identificar y/o monitorizar acetilaciones de los extremos N de VP1 y VP3 en diferentes serotipos de AAV. En función de estos resultados de AAV y la orientación proporcionada en la presente memoria, se contempla que dichos métodos se pueden aplicar sin inconvenientes para crear perfiles de una variedad de virus, p. ej., las familias víricas, subfamilias y géneros de la presente descripción. Los métodos de la presente descripción se pueden usar, p. ej., para crear perfiles de VP para monitorizar las expresiones de VP, modificaciones después de la traducción y truncamientos y para garantizar la uniformidad del producto durante la producción de VLP, para confirmar la mutagénesis dirigida a un sitio o la caracterización estructural para aplicaciones de manipulación de la proteína de la cápside y/o para monitorizar o detectar la heterogeneidad de una partícula o preparación vírica.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen desnaturalizar una partícula vírica. En algunas realizaciones, una partícula vírica tal como una partícula de AAV se puede desnaturalizar al usar detergente, calor, sal elevada o uso de tampón con un pH bajo o alto. En ciertas realizaciones, una partícula de AAV se puede desnaturalizar la usar ácido acético o clorhidrato de guanidina. El experto en la técnica reconocerá que hay disponibles una variedad de métodos útiles para promover y/o monitorizar la desnaturalización de la proteína en la técnica y pueden seleccionar de manera adecuada un método de desnaturalización compatible con la cromatografía de líquidos/espectrometría de masas. Por ejemplo, si se usa desnaturalización por calor, se debe tener cuidado para evitar la precipitación de la proteína y la obstrucción de la columna de fase inversa. De manera similar, la desnaturalización con sal elevada se puede acoplar con una etapa de desalación antes de LC/MS o LC/MS/MS. En otras realizaciones, se usa desnaturalización con pH alto, desnaturalización con pH bajo o desnaturalización al usar disolvente orgánico.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen someter una partícula vírica desnaturalizada de la presente descripción a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS). Como se sabe en la técnica, la LC/MS utiliza cromatografía de líquidos para la separación física de los iones y la espectrometría de masas para la generación de datos de espectros de masa a partir de los iones. Dichos datos de espectros de masa se pueden usar para determinar, p. ej., el peso molecular o estructura, identificación de partículas mediante masa, cantidad, pureza, entre otros. Estos datos pueden representar propiedades de los iones detectados tales como intensidad de la señal (p. ej., abundancia) en el tiempo (p. ej., tiempo de retención) o abundancia relativa con respecto a la relación entre masa y carga.
En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) es cromatografía de líquidos de rendimiento ultra alto (UPLC; el término "cromatografía de líquidos de rendimiento ultra alto" o UHPLC se puede usar de manera intercambiable en la presente memoria). La UPLC se conoce en la técnica como una técnica de LC que se basa en una columna con un tamaño de partícula reducido (p. ej., menor que 2 pm) y velocidad de flujo aumentada para mejorar la resolución, eficacia, capacidad máxima y sensibilidad cromatográfica (ver, p. ej., Plumb, R. et al. (2004) Rapid Commun. Mass Spectrom. 18:2331-2337). En algunas realizaciones, UPLC se refiere al uso de una columna con un tamaño de partícula menor que 2 pm en cromatografía de líquidos. En algunas realizaciones, UPLC se refiere al uso de una velocidad de disolvente lineal alta (p. ej., como se observa cuando funciona a 6000 psi o más) en cromatografía de líquidos. Las máquinas de UPLC ilustrativas están disponibles comercialmente (p. ej., la ACQUITY UPLC® de Waters; Milford, MA).
En algunas realizaciones, la espectrometría de masas (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) puede hace referencia a ionización por electronebulización-espectrometría de masas (ESI-MS). La ESI-MS se conoce en la técnica como una técnica que usa energía eléctrica para analizar iones derivados de una disolución al usar espectrometría de masas (ver, p. ej., Yamashita, M. and Fenn, J.B. (1984) J. Phys. Chem.
88:4451-4459). Las especies iónicas (o especies neutras que se ionizan en disolución o en fase gaseosa) se transfieren de una disolución a una fase gaseosa mediante dispersión en un aerosol de gotículas cargadas, con posterior evaporación del disolvente que reduce el tamaño de las gotículas cargadas y expulsión de iones de la muestra desde las gotículas cargadas a medida que la disolución pasa a través de un capilar pequeño con un voltaje con respecto al suelo (p. ej., la pared de la cámara circundante). En algunas realizaciones, el voltaje del capilar es de aproximadamente 2 kV a aproximadamente 10 kV, o aproximadamente 2,5 kV a aproximadamente 6,0 kV. En ciertas realizaciones, la cromatografía de líquidos (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) usa un voltaje de capilar de aproximadamente 3,5 kV. En algunas realizaciones, el voltaje del capilar varía de aproximadamente 1 kV a aproximadamente 10 kV. En otras realizaciones, la espectrometría de masas (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) puede hace referencia a la desorción por láser/ionización asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés).
En algunas realizaciones, la espectrometría de masas (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) usa un cono y/o separador de muestreo, a través del cual pueden pasar los iones antes de ingresar al analizador. En algunas realizaciones, p. ej., cuando se aplica voltaje al capilar, según se describió anteriormente, el cono de muestra se mantiene a un voltaje más bajo que el voltaje del capilar. En ciertas realizaciones, la cromatografía de líquidos (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) usa un voltaje de cono de muestreo de aproximadamente 45 kV. En algunas realizaciones, el voltaje del cono de muestreo varía de aproximadamente 0 kV a aproximadamente 200 kV.
En algunas realizaciones, la espectrometría de masas (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) usa calibración asistida. La calibración, cuando se usa en referencia a espectrometría de masas, puede incluir la introducción de uno o más compuestos que tienen una masa conocida (p. ej., un estándar) a los efectos de calibrar el instrumento con respecto a la detección de masa (p. ej., mediciones de m/z). En algunas realizaciones, la calibración asistida puede hacer referencia al uso de un programa informático para correlacionar un pico y/o posición de un estándar conocido (p. ej., un material calibrador) con una relación entre masa y carga (m/z) específica. Una vez calibrado, el usuario puede llevar a cabo a continuación la espectrometría de masas con una muestra que tiene uno o más compuestos desconocidos, o compuestos presentes en una concentración desconocida, con un cierto grado de precisión o error, y/o un nivel deseado de reproducibilidad, p. ej., en comparación con una condición experimental previa o conocida. Se conocen varios materiales calibradores en la técnica, incluidos, sin limitación, yoduro de sodio, yoduro de sodio cesio, polietilenglicol y perfluorotributilamina. En ciertas realizaciones, se usa yoduro de sodio como material calibrador. En algunas realizaciones, los materiales calibradores son Glu-1-fibrinopéptido B y péptido de leucina encefalina para bloquear la masa durante el funcionamiento de LC/MS.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen someter una partícula vírica desnaturalizada de la presente descripción o someter fragmentos digeridos de una partícula vírica desnaturalizada de la presente descripción a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas-espectrometría de masas (LC/MS/MS). Como se sabe en la técnica, la LC/MS/MS (el término "cromatografía de líquidos-espectrometría de masas en tándem" se puede usar de manera intercambiable en la presente memoria) utiliza cromatografía de líquidos para la separación física de los iones y la espectrometría de masas para la generación de datos de espectros de masa a partir de los iones, donde la espectrometría de masas usa múltiples fases de separación de masas (p. ej., m/z), típicamente separadas por una etapa de fragmentación. Por ejemplo, los iones de interés dentro de un intervalo de m/z se pueden separar en una primera pasada de MS, fragmentarse y después separarse adicionalmente en función de m/z individuales en una segunda pasada de MS. La fragmentación de iones puede incluir, sin limitación, una técnica tal como la disociación inducida por colisión (CID, por sus siglas en inglés), disociación por colisión con energía alta (HCD, por sus siglas en inglés), disociación con captura de electrones (ECD, por sus siglas en inglés) o disociación con transferencia de electrones (ETD, por sus siglas en inglés).
En algunas realizaciones, los métodos incluyen someter una partícula vírica desnaturalizada de la presente descripción a reducción y/o alquilación. Los medios para reducir la partícula vírica incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con ditiotreitol, p-mercaptoetanol o tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, por sus siglas en inglés). Los medios para alquilar la partícula vírica incluyen, pero no se limitan a, tratar la partícula de AAV con ácido yodoacético, yodoacetamida o 4-vinilpiridina.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen someter una partícula vírica desnaturalizada de la presente descripción a digestión, p. ej., para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de una partícula de AAV. Por ejemplo, una partícula de AAV desnaturalizada se puede someter a digestión para generar fragmentos peptídicos que se pueden analizar, p. ej., al usar LC para separación y MS/MS para el análisis (ver más adelante una descripción más extensa). En algunas realizaciones, la digestión es una digestión enzimática. En algunas realizaciones, la digestión usa digestión química tal como un tratamiento con CNBr de la fragmentación por instrumento (p. ej., descendente). En algunas realizaciones, la digestión usa digestión química tal como digestión con ácido.
En algunas realizaciones, la digestión enzimática es una digestión por endopeptidasa. Una endopeptidasa puede incluir cualquier peptidasa que cataliza la proteólisis de uniones peptídicas de aminoácidos no terminales de un polipéptido. Las endopeptidasas conocidas pueden incluir, sin limitación, tripsina, quimiotripsina, AspN, Glu-C, LysC, pepsina, termolisina, glutamil endopeptidasa, elastasa y neprilisina. En ciertas realizaciones, la digestión enzimática es una digestión por tripsina o una digestión por LysC.
En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos (p. ej., usada en LC/MS como se describe en la presente memoria) es cromatografía de líquidos de fase inversa (los términos "cromatografía de líquidos de fase inversa" o RPLC se puede usar de manera intercambiable en la presente memoria con cromatografía de líquidos de fase inversa). Como se sabe en la técnica, la cromatografía de líquidos de fase inversa puede hacer referencia a una separación cromatográfica que usa una fase estacionaria hidrófoba (p. ej., un soporte o sustrato tal como una columna) para adsorber moléculas hidrófobas en una fase móvil polar. Al disminuir la polaridad de la fase móvil (p. ej., mediante la adición de un disolvente orgánica), se puede lograr una separación en gradiente de moléculas por hidrofobicidad, dado que las moléculas más hidrófobas permanecerán en la columna en concentraciones más altas de disolvente orgánica debido a interacciones hidrófobas más fuertes con la columna. En alguna realización, la separación es mediante electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés), cromatografía de intercambio iónico (IEC, por sus siglas en inglés) tal como cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC, por sus siglas en inglés), cromatografía de líquidos de interacción hidrófila (HILIC, por sus siglas en inglés), pero no se limitan a, LC/MS en línea tal como separación fuera de línea antes de MS; p. ej., puntas, columnas; placas o cartuchos.
Generalmente, se puede acoplar una fase estacionaria adecuada para cromatografía de líquidos de fase inversa (p. ej., un resto hidrófobo) con un soporte que incluye, sin limitación, una columna o resina cargada con partículas o perlas (p. ej., partículas de sílice poroso o poliestireno). Se conoce una variedad de fases estacionarias hidrófobas en la técnica, que incluyen, sin limitación, cadenas alquilo hidrófobas, restos octilo u octadecil sililo, restos ciano y restos amino. En algunas realizaciones, la fase estacionaria puede incluir una cadena alquilo hidrófoba de una longitud particular, tal como C4, C8, o C18. En ciertas realizaciones, la cromatografía de líquidos de fase inversa es una cromatografía inversa con C4 o C8 (p. ej., cromatografía de fase inversa que utiliza una fase estacionaria C4 o C8). Un experto en la técnica puede seleccionar de manera adecuada una fase estacionaria en función de la molécula de interés (p. ej., una partícula de AAV desnaturalizada o fragmento de esta).
Se conoce en la técnica una variedad de fases móviles adecuadas para la cromatografía de líquidos de fase inversa. Según se describió anteriormente, una fase móvil de cromatografía de líquidos de fase inversa puede incluir una mezcla de disolventes orgánicos (p. ej., hidrófobos) y acuosos (p. ej., polares). Al aumentar la proporción de disolvente orgánico aumenta su capacidad para eluir compuestos hidrófobos a partir de la fase estacionaria. La retención y/o selectividad del compuesto se puede alterar, p. ej., al cambiar el tipo o exposición de la fase estacionaria, agregar reactivos polares tales como reactivos de protección de extremo, alterar la temperatura y/o alterar características de la fase móvil tales como la proporción de disolvente orgánico, pH, tampones y el tipo de disolvente orgánico usado. En algunas realizaciones, el componente polar de la fase móvil puede incluir, sin limitación, agua o un tampón acuoso. En algunas realizaciones, el componente polar de la fase móvil puede incluir, sin limitación, acetonitrilo, metanol, etanol, alcohol isopropílico, tetrahidrofurano (THF) y ácido fórmico.
En algunas realizaciones, se pueden usar dos o más fases móviles (p. ej., fase móvil A, fase móvil B, etc.) en un gradiente o proporción de interés. En ciertas realizaciones, la cromatografía usa una fase móvil A que comprende ácido fórmico en agua. En ciertas realizaciones, la fase móvil A comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico. En ciertas realizaciones, la fase móvil A comprende aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 5 % de ácido fórmico. En ciertas realizaciones, la cromatografía usa una fase móvil B que comprende ácido fórmico en acetonitrilo. En ciertas realizaciones, la fase móvil B comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico.
En algunas realizaciones, la proporción de fase móvil B en la cromatografía aumenta con el tiempo. Por ejemplo, la proporción de fase móvil B en la cromatografía puede aumentarse de manera escalonada. En ciertas realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 38 %. En otras realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 2 % a aproximadamente 60 %. En otras realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 2 % a aproximadamente 100 % de aproximadamente 1 min a aproximadamente 200 min. En algunas realizaciones, el resto de la fase móvil es una segunda fase móvil de la presente descripción, p. ej., la fase móvil A. En ciertas realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % en aproximadamente 6 minutos, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % en aproximadamente 10 minutos y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 38 % en aproximadamente 40 minutos. En otras realizaciones, la fase móvil B aumenta de aproximadamente 2 % a aproximadamente 60 % en aproximadamente 121 minutos. Un experto en la técnica puede ajustar de manera adecuada la fase móvil de interés y el tiempo del gradiente usado en función de la separación cromatográfica deseada y/o el analito de interés.
En algunas realizaciones, la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de rendimiento alto (HPLC, por sus siglas en inglés). La HPLC se conoce en la técnica como una forma de cromatografía de líquidos en la que un disolvente líquido que contiene una muestra se presuriza a medida que pasa a través de una columna que contiene fase sólida. Mientras la LC tradicional o de presión baja puede usar la gravedad para pasar la fase móvil a través de la fase sólida, la HPLC usa bombas para aplicar una presión a la fase móvil y típicamente usa una fase sólida con partículas más pequeñas para aumentar la resolución. En algunas realizaciones, la HPLC usa una presión de entre aproximadamente 50 bar y aproximadamente 350 bar. En algunas realizaciones, se puede usar HPLC de fase inversa para concentrar y/o desalar proteínas (p. ej., proteínas de la cápside de AAV) para análisis MS.
En algunas realizaciones, se puede ajustar uno o más parámetros que incluyen, sin limitación, voltaje de fuente, temperatura del capilar, voltaje de ESI (si se usa ESI-MS), energía de CID y la cantidad de eventos de MS/MS, p. ej., en LC/MS/MS según se usa en la presente memoria, en función de los hallazgos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas (p. ej., usada en LC/MS/MS como se describe en la presente memoria) usa un voltaje de fuente (p. ej., voltaje de capilar) de aproximadamente 2,5 kV. En algunas realizaciones, la espectrometría de masas (p. ej., usada en LC/MS/MS como se describe en la presente memoria) usa una temperatura de capilar de aproximadamente 275 °C. En algunas realizaciones, la temperatura del capilar varía de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 400 °C.
Una variedad de analizadores de masa adecuados para LC/MS y/o LC/MS/MS se conocen en la técnica, incluidos, sin limitación, analizador de tiempo de vuelo (TOF, por sus siglas en inglés), filtros de masa cuadrupolo, TOF cuadrupolo (QTOF, por sus siglas en inglés) y trampas de iones (p. ej., un espectrómetro de masas basado en transformada de Fourier o un Orbitrap). En Orbitrap, se usan un electrodo externo similar a un barril con conexión a tierra y un electrodo central similar a un husillo para atrapar iones en trayectorias que rotan elípticamente alrededor del electrodo central con oscilaciones a lo largo del eje central, confinados por el equilibrio de las fuerzas centrífugas y electrostáticas. El uso de dichos instrumentos emplea una operación de transformada de Fourier para convertir una señal de dominio temporal (p. ej., frecuencia) a partir de la detección de corriente de imagen en una medición de masa de alta resolución (p. ej., LC/MS/MS nano). Se pueden encontrar descripciones y detalles adicionales, p. ej., en Scheltema, R.A. et al. (2014) Mol. Cell Proteomics 13:3698-3708; Perry, R.H. et al. (2008) Mass. Spectrom. Rev. 27:661-699; y Scigelova, M. et al. (2011) Mol. Cell Proteomics 10:M111.009431.
Según se describió anteriormente, en algunas realizaciones, la MS incluye LC/MS/MS nano, p. ej., al usar un analizador de masas Orbitrap. En algunas realizaciones, la fuente de iones puede incluir una guía de ion en anillo apilado o lente S. Como se sabe en la técnica, se puede empelar una lente S para centrar el haz de iones al usar radiofrecuencia (RF) y aumentar así la transmisión de iones hacia el instrumento. Esto puede mejorar la sensibilidad (p. ej., para iones de baja intensidad) y/o mejorar el índice de barrido. En ciertas realizaciones, el nivel de RF de la lente S de la espectrometría de masas es aproximadamente 55 %. En ciertas realizaciones, el nivel de RF de la lente S de la espectrometría de masas es aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %.
En algunas realizaciones, se pueden determinar las masas de proteínas de la cápside vírica, p. ej., en función de datos de LC/MS y/o LC/MS/MS. En algunas realizaciones, se pueden determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de una partícula de AAV, o de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV, p. ej., en función de datos de LC/MS y/o LC/MS/MS. Se conocen en la técnica varios métodos para determinar la masa y/o identidad proteica a partir de datos de MS. Por ejemplo, se puede usar obtención de huella de masa peptídica para determinar la secuencia de la proteína en función de datos de MS, o se pueden identificar proteínas en función de datos de MS/MS en relación con uno o más péptidos constituyentes. Cuando se usa MS en tándem, se puede usar barrido de iones del producto para analizar los datos de m/z en relación con uno o más péptidos de una proteína de interés. A continuación, se puede usar un programa informático conocido en la técnica, p. ej., para combinar los picos identificados con los picos de referencia o conocidos, para agrupar picos en envolturas de isotopómero, entre otros. Los valores de masa peptídica se pueden comparar con una base de datos de secuencias peptídicas conocidas. Por ejemplo, se puede usar Mascot para combinar los péptidos observados con péptidos de base de datos teóricas, p. ej., que resultan de la aplicación de un patrón de digestión particular a una base de datos de proteínas in silico. Otro programa informático adecuado puede incluir, sin limitación, Proteome Discoverer, ProteinProspector, X!Tandem, Pepfinder, Bonics o MassLynx™ (Waters). Otro programa informático adecuado para varias etapas del análisis de datos de MS se puede encontrar, p. ej., en www.ms-utils.org/wiki/pmwiki.php/Main/SoftwareList.
En algunas realizaciones, una masa determinada o calculada de la presente descripción (p. ej., la masa determinada o calculada de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de AAV) se puede comparar con una referencia, p. ej., una masa teórica de una VP1, VP2, y/o VP3 de uno o más serotipos de AAV. Una referencia de la presente descripción puede incluir una masa teórica de una VP1, VP2, y/o VP3 de uno o más de cualquiera de los serotipos de AAV descritos en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las masas de VP1, VP2 y/o VP3 se comparan con las masas teóricas de una o más de cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de AAV LK03 (verla patente estadounidense núm. 9.169.299), una cápside de AAV2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de Aa V DJ (verla patente estadounidense núm. 7.588.772), una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino o una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1), una cápside de AAV2HBKO, una cápside de AAVPHP.B o una cápside de AAVPHP.eB. En algunas realizaciones, una masa determinada o calculada de la presente descripción (p. ej., la masa determinada o calculada de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de AAV) se puede comparar con una masa teórica de una VP1, VP2, y/o VP3 del serotipo de AAV correspondiente.
En algunas realizaciones, los métodos de la presente descripción pueden incluir determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV. En algunas realizaciones, un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 y/o VP3 (p. ej., con respecto a una masa de referencia, tal como una masa teórica, prevista o esperada) es indicativo de la heterogeneidad de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, la heterogeneidad puede incluir uno o más de lo siguiente, sin limitación: serotipos mixtos, variantes de cápside, sustituciones de aminoácidos de la cápside, cápsides truncadas o cápsides modificadas.
En algunas realizaciones, el uso de LC/MS y LC/MS/MS como se describen en la presente memoria se puede combinar. En algunas realizaciones, un método para determinar el serotipo de una partícula de AAV puede incluir someter una partícula de AAV desnaturalizada a LC/MS (p. ej., como se describe en la presente memoria) y determinar las masas de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de AAV; así como someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a LC/MS/MS y determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV (la combinación específica de masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo del AAV). En algunas realizaciones, un método para determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV puede incluir someter una partícula de AAV desnaturalizada a LC/MS (p. ej., como se describe en la presente memoria), determinar las masas de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de aAv y comparar estas masas con las masas tóricas de VP1, VP2 y VP3 del serotipo de AAV; así como someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a LC/MS/MS, determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV y comparar estas masas con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 del serotipo de AAV (un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativos de la heterogeneidad de la cápside de AAV).
En algunas realizaciones, una partícula de AAV de la presente descripción se puede estar acetilada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el extremo N de VP1 y/o VP3 está acetilado. Como se describe en mayor detalle más adelante, el aminoácido en la 2a posición con respecto a la metionina inicial (iMet X) de una proteína de la cápside de AAV se puede mutar para determinar su efecto sobre la acetilación del extremo N (Nt-), así como las consecuencias funcionales de afectar la Nt-acetilación sobre el tráfico, la transducción y/o la modificación después de la traducción de la partícula de AAV (p. ej., glicosilación, ubicuitinación, entre otros). En algunas realizaciones, el extremo N de una proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP1 o VP3) puede hace referencia al primer aminoácido después de la metionina inicial, que en algunos casos se puede retirar mediante, p. ej., una Met-aminopeptidasa.
En algunas realizaciones, una partícula de AAV de la presente descripción (p. ej., una partícula de AAV recombinante o de rAAV) comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 conduce a una VP1 y/o VP3 con una frecuencia o proporción de acetilación en el extremo N diferente en comparación con la referencia (p. ej., la partícula de AAV original antes de la sustitución de aminoácido o una partícula de AAV con un residuo aminoacídico 2 diferente de VP1 y/o VP3). En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 de la partícula de AAV original. En ciertas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácido (p. ej., una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 o VP3) que "altera" la acetilación del extremo N produce una frecuencia más alta de acetilación del extremo N o una frecuencia más baja de acetilación del extremo N, p. ej., en comparación con una VP1 o VP3 sin la sustitución, tal como la VP1 o VP3 original. La VP1 y/o VP3 puede pertenecer a cualquiera de los serotipos de AAV ilustrativos descritos en la presente memoria, incluidas variantes o híbridos de estos (p. ej., con mutación de tirosina o mutaciones de unión a heparina). Los ensayos ilustrativos para la acetilación del extremo N incluyen sin limitación espectrometría de masas, etiquetado con isótopo (p. ej., con un grupo acetilo etiquetado con isótopo o precursor de este), transferencia Western con un anticuerpo específico para acetilación, entre otros. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV (p.
ej., VP1 o VP3) se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido da como resultado una menor desamidación de la cápside de AAV.
En algunas realizaciones, una partícula de AAV de la presente descripción se puede estar desamidada. Por ejemplo, en algunas realizaciones, N57 de VP1 y/o N382, N511, y/o N715 de VP3 está desamidado. Como se describe en mayor detalle más adelante, el aminoácido seleccionado de A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3 de una proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP1 o VP3) se puede mutar para determinar su efecto sobre la desamidación, así como las consecuencias funcionales de afectar la desamidación sobre el tráfico, la transducción y/o la modificación después de la traducción de la partícula de AAV (p. ej., glicosilación, ubicuitinación, entre otros).
En algunas realizaciones, una partícula de AAV de la presente descripción (p. ej., una partícula de AAV recombinante o de rAAV) comprende una sustitución de aminoácido en uno o más residuos aminoacídicos seleccionados de A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y G716 de VP3. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 conduce a una VP1 y/o VP3 con una frecuencia o proporción de desamidación diferente en comparación con la referencia (p. ej., la partícula de AAV original antes de la sustitución de aminoácido o una partícula de AAV con un residuo aminoacídico 2 correspondiente diferente). En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácido (p. ej., una sustitución de aminoácido en A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3) que "altera" la desamidación resulta en una frecuencia más alta de desamidación o una frecuencia más baja de desamidación, p. ej., en comparación con una VP1 o VP3 sin la sustitución, tal como la VP1 o VP3 original. La VP1 y/o VP3 puede pertenecer a cualquiera de los serotipos de AAV ilustrativos descritos en la presente memoria, incluidas variantes o híbridos de estos (p. ej., con mutación de tirosina o mutaciones de unión a heparina). Los ensayos ilustrativos para la desamidación incluyen, sin limitación, espectrometría de masas, HPLC (ver, p. ej., el kit de detección de isoasparato ISOQUANT® de Promega), entre otros. En algunas realizaciones, n57 de VP1, N382 de VP3, N511 de VP3 y/o N715 de VP3 se sustituye con Asp y la sustitución de aminoácido da como resultado una mayor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En otras realizaciones, la sustitución de aminoácido es en N57K o N57Q y la sustitución de aminoácido da como resultado una menor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En todavía otras realizaciones, G58 de VP1, G383 de VP3, G512 de VP3 y/o G716 de VP3 se sustituye con un aminoácido que no es Gly (p. ej., Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val) y la sustitución de aminoácido da como resultado una menor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En todavía otras realizaciones, A35 de VP1 se sustituye con Asn y da como resultado una mayor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 de una partícula original.
Según se usa en la presente memoria, "N-acetilación" se refiere a un proceso por el cual un grupo acetilo se agrega covalentemente al grupo amino del aminoácido del extremo N de una proteína. Típicamente, las acetiltransferas del extremo N (NAT, por sus siglas en inglés) transfieren un grupo acetilo desde la acetil-coenzima A (Ac-CoA) al grupo a-amino del primer residuo aminoacídico de la proteína.
Según se usa en la presente memoria, la "desamidación" se refiere a una reacción química en la cual un grupo amida funcional en la cadena lateral de asparagina o glutamina se retira o convierte en otro grupo funcional. Por ejemplo, la asparagina se puede convertir en ácido aspártico o ácido isoaspártico. En otros ejemplos, la glutamina se convierte en ácido glutámico o ácido piroglutámico (5-oxoprolina).
En algunas realizaciones, la partícula de AAV se N-acetila en mayor medida en comparación con la proteína de la cápside de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende más de aproximadamente cualquiera de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más de grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende entre aproximadamente cualquiera de 5 %-10 %, 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-25 %, 25 %-30 %, 30 %-35 %, 35 %-40 %, 40 %-55 %, 45 %-50 %, 50 %-55 %, 55 %-60 %, 60 %-65 %, 65 %-70 %, 70 %-75 %, 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 %, 95 %-100 %, 5-25 %, 25-50 %, 50-75 %, 75 %-100 %, 5-50 % o 50 %-100 % más grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende más de aproximadamente cualquiera de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces más grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende entre aproximadamente cualquiera de 2 veces a 3 veces, 3 veces a 4 veces, 4 veces a 5 veces, 5 veces a 10 veces, 10 veces a 25 veces, 25 veces a 50 veces, 50 veces a 100 veces, 100 veces a 500 veces, 500 veces a 1000 veces, 2 veces a 10 veces, 10 veces a 100 veces o 100 veces a 1000 veces más grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original.
En algunas realizaciones, la partícula de AAV se N-acetila en menor medida en comparación con la proteína de la cápside de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende más de aproximadamente cualquiera de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % menos de grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende entre aproximadamente cualquiera de 5 %-10 %, 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-25 %, 25 %-30 %, 30 %-35 %, 35 %-40 %, 40 %-55 %, 45 %-50 %, 50 %-55 %, 55 %-60 %, 60 %-65 %, 65 %-70 %, 70 %-75 %, 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 %, 95 %-100 %, 5-25 %, 25-50 %, 50­ 75 %, 75 %-100 %, 5-50 % o 50 %-100 % menos grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende más de aproximadamente cualquiera de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces menos grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende entre aproximadamente cualquiera de 2 veces a 3 veces, 3 veces a 4 veces, 4 veces a 5 veces, 5 veces a 10 veces, 10 veces a 25 veces, 25 veces a 50 veces, 50 veces a 100 veces, 100 veces a 500 veces, 500 veces a 1000 veces, 2 veces a 10 veces, 10 veces a 100 veces o 100 veces a 1000 veces menos grupos N-acetilo en comparación con una partícula de AAV original.
En algunas realizaciones, la partícula de AAV se desamida en mayor medida en comparación con la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV está más de aproximadamente cualquiera de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % más desamidada en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV está desamidada entre aproximadamente cualquiera de 5 %-10 %, 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-25 %, 25 %-30 %, 30 %-35 %, 35 %-40 %, 40 %-55 %, 45 %-50 %, 50 %-55 %, 55 %-60 %, 60 %-65 %, 65 %-70 %, 70 %-75 %, 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 %, 95 %-100 %, 5-25 %, 25-50 %, 50-75 %, 75 %-100 %, 5-50 % o 50 %-100 % más que una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV se desamida más de aproximadamente cualquiera de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV se desamida entre aproximadamente cualquiera de 2 veces a 3 veces, 3 veces a 4 veces, 4 veces a 5 veces, 5 veces a 10 veces, 10 veces a 25 veces, 25 veces a 50 veces, 50 veces a 100 veces, 100 veces a 500 veces, 500 veces a 1000 veces, 2 veces a 10 veces, 10 veces a 100 veces o 100 veces a 1000 veces más que una partícula de AAV original.
En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV se desamida en menor medida en comparación con la proteína de la cápside de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV está más de aproximadamente cualquiera de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % menos desamidada en comparación con una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV está desamidada entre aproximadamente cualquiera de 5 %-10 %, 10 %-15 %, 15 %-20 %, 20 %-25 %, 25 %-30 %, 30 %-35 %, 35 %-40 %, 40 %-55 %, 45 %-50 %, 50 %-55 %, 55 %-60 %, 60 %-65 %, 65 %-70 %, 70 %-75 %, 75 %-80 %, 80 %-85 %, 85 %-90 %, 90 %-95 %, 95 %-100 %, 5-25 %, 25-50 %, 50-75 %, 75 %-100 %, 5-50 % o 50 %-100 % menos que una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV se desamida más de aproximadamente cualquiera de 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces menos que una partícula de AAV original. En algunas realizaciones, la partícula de AAV se desamida entre aproximadamente cualquiera de 2 veces a 3 veces, 3 veces a 4 veces, 4 veces a 5 veces, 5 veces a 10 veces, 10 veces a 25 veces, 25 veces a 50 veces, 50 veces a 100 veces, 100 veces a 500 veces, 500 veces a 1000 veces, 2 veces a 10 veces, 10 veces a 100 veces o 100 veces a 1000 veces menos que una partícula de AAV original.
La descripción proporciona cualquier combinación de N-acetilación y desamidación. Por ejemplo, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en mayor medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en mayor medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside puede estar N-acetilada en mayor medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en la misma medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en mayor medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en menor medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en la misma medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en mayor medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en la misma medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en la misma medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en la misma medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en menor medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en menor medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en mayor medida que una proteína de la cápside de AAV original, la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en menor medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en la misma medida que una proteína de la cápside de AAV original, o la proteína de la cápside de AAV puede estar N-acetilada en menor medida que una proteína de la cápside de AAV original y desamidada en menor medida que una proteína de la cápside de AAV original.
IV. Vectores
En ciertos aspectos, la descripción se relaciona con partículas víricas, adecuadas para uso en cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria, que pueden comprender vectores de AAV (p. ej., vectores de rAAV) o vectores derivados de otro virus. En algunas realizaciones, la partícula vírica comprende un vector que codifica un ácido nucleico heterólogo, p. ej., un transgén heterólogo. En algunas realizaciones, la partícula de a Av comprende un genoma de vector de AAV que codifica un ácido nucleico heterólogo, p. ej., un transgén heterólogo.
La presente descripción contempla el uso de un genoma vírico recombinante para la introducción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido y/o ácido nucleico terapéutico para empaquetamiento en una partícula vírica de rAAV. El genoma vírico recombinante puede incluir cualquier elemento para establecer la expresión del polipéptido y/o ácido nucleico terapéutico, por ejemplo, un promotor, una ITR de la presente descripción, un elemento de unión a ribosoma, terminador, potenciador, marcador de selección, intrón, señal de polyA y/u origen de replicación.
En algunas modalidades, el ácido nucleico heterólogo codifica un polipéptido terapéutico. Un polipéptido terapéutico puede, p. ej., suministrar un polipéptido y/o actividad enzimática que está ausente o presente en un nivel reducido en una célula u organismo. Alternativamente, un polipéptido terapéutico puede suministrar un polipéptido y/o actividad enzimática que indirectamente contrarresta un desequilibrio en una célula u organismo. Por ejemplo, un polipéptido terapéutico para un trastorno relacionado con la acumulación de un metabolito causada por una deficiencia en una enzima o actividad metabólica puede suministrar un enzima o actividad metabólica faltante, o puede suministrar una enzima o actividad metabólica alternativa que conduce a la reducción del metabolito. Un polipéptido terapéutico también se puede usar para reducir la actividad de un polipéptido (p. ej., uno que está sobreexpresado, activado por una mutación de ganancia funcional o cuya actividad está desregulada de cualquier otra manera) al actuar, p. ej., como un polipéptido dominante negativo.
Los ácidos nucleicos de la descripción pueden codificar polipéptidos que son proteínas intracelulares, ancladas en la membrana celular, que permanecen dentro de la célula o son secretados por la célula transducida con los vectores de la descripción. Para los polipéptidos secretados por la célula que recibe el vector; el polipéptido puede ser soluble (es decir, no acoplado a la célula). Por ejemplo, los polipéptidos solubles carecen de una región transmembranaria y se secretan a partir de la célula. Las técnicas para identificar y retirar secuencias de ácido nucleico que codifican dominios transmembranarios se conocen en la técnica.
Los ácidos nucleicos de la descripción (p. ej., el genoma de vector de AAV) pueden comprender un transgén, un ácido nucleico que codifica una proteína o ARN funcional que modula o trata un trastorno asociado con el SNC. La siguiente es una lista no limitante de genes asociados con trastornos asociados con el SNC: proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de derivación glial (GDNF, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de derivación cerebral (BDNF, por sus siglas en inglés), factor neurotrófico ciliar (CNTF, por sus siglas en inglés), tirosina hidroxilasa (TM, GTP-ciclohidrolasa (GTPCH), aspartoacilasa (ASPA), superóxido dismutasa (SOD1), un antioxidante, un polipéptido antiangiógeno, un polipéptido antiinflamatorio y aminoácido descorboxilasa (AADC). Por ejemplo, un transgén útil en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson codifica TH, que es una enzima limitante de velocidad en la síntesis de dopamina. Un transgén que codifica GTPCII, que genera el cofactor TII tetrahidrobiopterina, también se puede usar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Un transgén que codifica GDNF o BDNF, o AADC, que facilita la conversión de L-Dopa en DA, también se puede usar para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Para el tratamiento de e La , un transgén útil puede codificar: GDNF, BDNF o CNTF. También para el tratamiento de ELA, un transgén útil puede codificar un ARN funcional, p. ej., ARNhc, miARN, que inhibe la expresión de SOD1. Para el tratamiento de la isquimia, un transgén útil puede codificar NAIP o NGF. Un transgén que codifica Beta-glucuronidasa (GUS) puede ser útil para el tratamiento de ciertas enfermedades de almacenamiento lisosómico (p. ej., Mucopolisacaridosis tipo VII (MPS VII)). Un transgén que codifica un gen de activación de profármaco, p. ej., HSV-Timidina cinasa que convierte ganciclovir en un nucleótido tóxico que interrumpe la síntesis del ADN y conduce a la muerte celular, puede ser útil para tratar ciertos cánceres, p. ej., cuando se administra en combinación con el profármaco. Un transgén que codifica un opioide endógeno, tal comop -endorfina puede ser útil para tratar el dolor. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, sin limitación, SOD1; s Od2; Catalasa; Sirtuinas 1, 34, o 5; NRF2; PGC1a; GCL (subunidad catalítica); GCL (subunidad modificadora); adiponectina; glutatión peroxidasa 1; y neuroglobina. Los ejemplos de polipéptidos antiangiógenos incluyen, sin limitación, angiostatina, endostatina, PEDF, un receptor de VeGf soluble y un receptor de PDGF soluble. Los ejemplos de polipéptidos antiinflamatorios incluyen, sin limitación IL-10, IL17R soluble, TNF-R soluble, TNF-R-Ig, un inhibidor de IL-1 y un inhibidor de IL18. Otros ejemplos de transgenes que se pueden usar en los vectores de rAAV de la descripción serán evidentes para el experto en la técnica (ver, p. ej., Costantini L C, et al., Gene Therapy (2000) 7, 93-109).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica un ácido nucleico terapéutico. En algunas realizaciones, un ácido nucleico terapéutico puede incluir, sin limitación, un ARNip, un ARNhc, un iARN, un miARN, un ARN de antisentido, una ribozima o una ADNzima. Como tal, un ácido nucleico terapéutico puede codificar un ARN que cuando se transcribe a partir de los ácidos nucleicos del vector puede tratar un trastorno al interferir en la traducción o transcripción de una proteína anormal o en exceso asociada con un trastorno de la descripción. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la descripción pueden codificar un ARN que trata un trastorno mediante la eliminación o reducción altamente específica de ARNm que codifica las proteínas anormales y/o en exceso. Las secuencias de ARN terapéuticas incluyen iARN, ARN inhibidor pequeño (ARNip), micro ARN (miARN) y/o ribozima (tales como las ribozimas en cabeza de martillo y en horquilla) que pueden tratar trastornos mediante la eliminación o reducción altamente específica de ARNm que codifica las proteínas anormales y/o en exceso.
En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico se usa para tratar un trastorno del SNC. Sin ánimo de estar ceñidos a la teoría, se cree que un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o actividad de un polipéptido cuya ganancia funcional se ha asociado con un trastorno, o para potenciar la expresión y/o actividad de un polipéptido para complementar una deficiencia que se ha asociado con un trastorno (p. ej., una mutación en un gen cuya expresión muestra actividad similar o relacionada). Los ejemplos no limitantes de trastornos de la descripción que se pueden tratar mediante un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico de la descripción (los genes ilustrativos a los que se pueden dirigir o suministrar se proporcionan en paréntesis para cada trastorno) incluyen accidente cerebrovascular (p. ej., caspasa-3, Beclinl, Ask1, PARI, HIF1a, PUMA y/o cualquiera de los genes descritos en Fukuda, A.M. y Badaut, J. (2013) Genes. (Basel) 4:435-456), enfermedad de Huntington (HTT mutante), epilepsia (p. ej., SCN1A, NMDAR, ADK y/o cualquiera de los genes descritos en Boison, D. (2010) Epilepsia 51:1659-1668), enfermedad de Parkinson (alfa-sinucleína), enfermedad de Lou Gehrig (también conocida como esclerosis lateral amiotrófica; SOD1), enfermedad de Alzheimer (tau, proteína precursora amiloide), degeneración corticobasal o CBD (tau), degeneración gangliónica corticobasal o CBGD (tau), demencia frontotemporal o FTD (tau), parálisis supranuclear progresiva o PSP (tau), atrofia miltisistémica o MSA (alfa-sinucleína), cáncer de cerebro (p. ej., un oncogén mutante o sobreexpresado que participa en el cáncer de cerebro) y enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD). Los trastornos de la descripción pueden incluir aquellos que implican grandes áreas de la corteza, p. ej., más de un área funcional de la corteza, más de un lóbulo de la corteza y/o la corteza entera. Otros ejemplos no limitantes de trastornos de la descripción que se pueden tratar mediante un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico de la descripción incluyen lesión por traumatismo cerebral, trastornos de disfunción enzimática, trastornos psiquiátricos (incluidos de síndrome de estrés postraumático), enfermedades neurodegenerativas y trastornos cognitivos (incluidas demencias, autismo y depresión). Los trastornos de disfunción enzimática incluyen, sin limitación, leucodistrofias (incluida la enfermedad de Canavan) y cualquiera de las enfermedades de almacenamiento lisosómico descritas más adelante.
En algunas realizaciones, el polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico se usa para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosómico. Como se sabe comúnmente en la técnica, la enfermedad de almacenamiento lisosómico son trastornos metabólicos hereditarios raros caracterizados por defectos en la función lisosómica. Dichos trastornos a menudo son causados por una deficiencia en una enzima necesaria para el metabolismo adecuado de mucopolisacárido, glicoproteína y/o lípido, lo que conduce a una acumulación patológico de materiales celulares almacenados lisosómicamente. Los ejemplos no limitantes de enfermedades de almacenamiento lisosómico de la descripción que se pueden tratar mediante un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico de la descripción (los genes ilustrativos a los que se puede dirigir o suministrar se proporcionan entre paréntesis para cada trastorno) incluyen enfermedad de Gaucher tipo 2 o tipo 3 (beta-glucosidasa ácida, g Ba ), GM1 gangliosidosis (beta-galactosidasa-1, GLB1), enfermedad de Hunter (iduronato 2-sulfatasa, IDS), enfermedad de Krabbe (galactosilceramidasa, GALC), enfermedad a mannosidosis (a mannosidasa, tal como alfa-D-mannosidasa, MAV2B1), enfermedad p mannosidosis (beta-mannosidasea MANBA), enfermedad de leucodistrofia metacromática (pseudoarilsulfatasa A, ARSA), enfermedad de mucolipidosisII/III (N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, GNPTAB), enfermedad de Niemann-Pick A (esfingomielinasa ácida, ASM), enfermedad de Niemann-Pick C (proteína Niemann-Pick C, VPC1), enfermedad de Pompe (alfa-1,4-glucosidasa ácida, GAA), enfermedad de Sandhoff (subunidad de hexosaminidasa beta, HEXB), enfermedad de Sanfilippo A (N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa, MPS3A), enfermedad de Sanfilippo B (N-alfa-acetilglucosaminidasa, NAGLU), enfermedad de Sanfilippo C (heparina acetil-CoA:alfa-glucosaminidasa N-acetiltransferasa, MPS3C), enfermedad de Sanfilippo D (N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, GNS), enfermedad de Schindler (alfa-N-acetilgalactosaminidasa, NAGA), enfermedad de Sly (beta-glucuronidasa, GUSB), enfermedad de Tay-Sachs (subunidad de hexosaminidasa alfa, HEXA) y enfermedad de Wolman (lipasa ácida lisosómica, LIPA).
Se indican enfermedades de almacenamiento lisosómico adicionales, así como la enzima defectuosa asociada con cada enfermedad, en la Tabla 1 a continuación. En algunas realizaciones, una enfermedad indicada en la tabla a continuación se trata mediante un polipéptido terapéutico o ácido nucleico terapéutico de la descripción que complementa o de cualquier otra manera compensa el defecto enzimático correspondiente.
Tabla 1. Trastornos de almacenamiento lisosómico y enzimas defectuosas asociadas.
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En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo se enlaza funcionalmente a un promotor. Los promotores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), la LTR de RSV, la LTR de MoMLV, el promotor de fosfoglicerato cinasa- 1 (PGK), un promotor del virus del simio 40 (SV40) y un promotor de CK6, un promotor de transtiretina (TTR), un promotores de TK, un promotor sensible a tetraciclina (TRE), un promotor de HBV, un promotor de hAAT, un promotor de LSP, promotores específicos para el hígado quiméricos (LSP), el promotor de E2F, el promotor de telomerasa (hTERT); el potenciador de cytomegalovirus/promotor de beta-actina de pollo/p-globina de conejo (CAG promotor; Niwa et al., Gen, 1991, 108(2): 193-9) y the elongation factor 1 -alfa promotor (EFl-alfa) promotor (Kim et al., Gen, 1990, 91(2):217-23 y Guo et al., Gen Ther., 1996, 3(9):802-10). En algunas realizaciones, el promotor comprende un promotor de pglucuronidasa humano o un potenciador de citomegalovirus enlazado a un promotor de p-actina de pollo (CBA). El promotor puede ser un promotor constitutivo, inducible o repremible. En algunas realizaciones, la invención proporciona un vector recombinante que comprende ácido nucleico que codifica un transgén heterólogo de la presente descripción funcionalmente enlazado a un promotor CBA. Se pueden encontrar promotores ilustrativos y descripciones, p. ej., en Pub. PG estadounidense 20140335054.
Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen, sin limitación, el promotor LTR del virus del sarcoma de Rous retrovírico (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV, el promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [ver, p. ej., Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor de SV40, el promotor de dihidrofolato reductasa, el promotor de 13-actina, el promotor de fosfoglicerol cinasa (PGK) y el promotor de EFla [Invitrogen].
Los promotores inducibles permiten la regulación de la expresión génica y se pueden regular mediante compuestos suministrados exógenamente, factores ambientales tales como temperatura, o la presencia de un estado fisiológico específico, p. ej., fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solo en células replicantes. Los promotores inducibles y sistemas inducibles están disponibles a partir de una variedad de fuentes comerciales que incluyen, sin limitación, Invitrogen, Clontech y Ariad. Muchos otros sistemas se han descrito y se pueden seleccionar sin inconvenientes por el experto en la técnica. Los ejemplos de promotores inducibles regulados por promotores suministrados exógenamente incluyen el promotor de metalotionina de oveja (MT) inducible por zinc, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (MMTV) inducible por dexametasona (Dex), el sistema de promotor de T7 polimerasa (WO 98/10088); el promotor de insecto ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), el sistema reprimible por tetraciclina (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), el sistema inducible por tetraciclina (Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995), ver también Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)), el sistema inducible por RU486 (Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) y Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)) y el sistema inducible por rapamicina (Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)). Otros tipos de promotores inducibles adicionales que pueden ser útiles en este contexto son aquellos regulados mediante un estado fisiológico específico, p. ej., temperatura, fase aguda, un estado de diferenciación particular de la célula, o solo en células replicantes.
En otra realización, se usará el promotor natural o fragmento de este para el transgén. El promotor natural se puede usar cuando se desea que una expresión del transgén imite la expresión natural. El promotor natural se puede usar cuando la expresión del transgén debe regularmente temporalmente o por desarrollo, o de modo específico para el tejido, o en respuesta a estímulos transcripcionales específicos. En una realización adicional, se pueden usar también otros elementos de control de la expresión naturales, tales como elementos potenciadores, sitios de poliadenilación o secuencias consenso de Kozak para imitar la expresión natural
En algunas realizaciones, las secuencias reguladoras imparten capaces de expresión génica específicas para un tejido. En algunos casos, las secuencias reguladoras específicas para un tejido se unen a factores de transcripción específicos para un tejido que inducen la transcripción de manera específica para un tejido. Dichas secuencias reguladoras específicas para un tejido (p. ej., promotores, potenciadores, etc.) se conocen en la técnica.
En algunas realizaciones, el vector comprende un intrón. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el intrón es un intrón quimérico derivado de beta-actina de pollo y beta-globina de conejo. En algunas realizaciones, el intrón es un intrón de virus diminuto de ratones (MVM).
En algunas realizaciones, el vector comprende una secuencia de poliadenilación (poliA). Se conocen numerosos ejemplos de secuencias de poliadenilación en la técnica, tales como una secuencia Poly(A) de hormona de crecimiento bovina (BGH) (ver, p. ej., número de acceso EF592533), una secuencia de poliadenilación SV40 y una secuencia de poliadenilación de HSV TK pA.
V. Partículas víricas y métodos para producir partículas víricas
Ciertos aspectos de la presente descripción se refieren a partículas víricas recombinantes (p. ej., partículas de rAAV).
En función de la orientación proporcionada en la presente memoria, el experto en la técnica puede adaptar de manera adecuada las técnicas de la presente descripción para su uso con una variedad de virus diferentes.
En algunas realizaciones, el virus es de la familia Adenoviridae, que incluye virus sin envoltura típicamente conocidos como adenovirus. En algunas realizaciones, el virus es del género Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus o Siadenovirus.
En algunas realizaciones, el virus es de la familia Parvoviridae, que incluye virus sin envoltura típicamente tales como AAV y Bocaparvovirus. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Densovirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Ambidensovirus, Breviden sovirus, Hepandensovirus, Iteradensovirus o Penstyldensovirus. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Parvovirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Amdoparvovirus, Aveparvovirus, Bocaparvovirus, Copiparvovirus, Dependoparvovirus, Erythroparvovirus, Protoparvovirus o Tetraparvovirus.
En algunas realizaciones, el virus es de la familia Retroviridae, que incluye virus con envoltura incluidos lentivirus. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Orthoretrovirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Alpharetrovirus, Betaretrovirus, Deltaretrovirus, Epsilonretrovirus, Gammaretrovirus o Lentivirus. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Spumaretrovirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Spumavirus.
En algunas realizaciones, el virus es de la familia Baculoviridae, que incluye virus con envoltura incluidos alfabaculovirus. En algunas realizaciones, el virus es del género Alphabaculovirus, Betabaculovirus, Deltabaculovirus o Gammabaculovirus.
En algunas realizaciones, el virus es de la familia Herpesviridae, que incluye virus con envoltura tales como los virus simples HSV-1 y HSV-2. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Alphaherpesvirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Iltovirus, Mardivirus, Simplexvirus o Varicellovirus. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Betaherpesvirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Cytomegalovirus, Muromegalovirus, Proboscivirus o Roseolovirus. En algunas realizaciones, el virus es de la subfamilia Gammaherpesvirinae. En algunas realizaciones, el virus es del género Lymphocryptovirus, Macavirus, Percavirus o Rhadinovirus.
En algunas realizaciones, el virus es un virus AAV. En una partícula de AAV, un ácido nucleico está encapsidado en la partícula de AAV. La partícula de AAV también comprende proteínas de la cápside. En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende un ácido nucleico heterólogo y/o uno o más de los siguientes componentes, funcionalmente enlazados en la dirección de la transcripción, secuencias de control que incluyen secuencias de iniciación y terminación de la transcripción que forman así un casete de expresión.
En algunas realizaciones, la partícula vírica comprende una secuencia de ITR de AAV. Por ejemplo, un casete de expresión puede estar flanqueado en el extremo hacia 5' y hacia 3' por al menos una secuencia de ITR de AAV funcional. Se entiende por "secuencias de ITR de AAV funcionales" que las secuencias de ITR funcionan como está previsto para el rescate, replicación y empaquetamiento del virión de AAV. Ver Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40; y Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16. Para poner en práctica algunos aspectos de la invención, los vectores recombinantes comprenden al menos todas las secuencias de AAV esenciales para la encapsidación y las estructuras físicas para la infección por el rAAV. Las ITR de AAV para uso en los vectores de la invención no necesitan tener una secuencia de nucleótidos natural (p. ej., como se describe en Kotin, Hum. Gen Ther., 1994, 5:793-801) y se pueden alterar mediante la inserción, eliminación o sustitución de nucleótidos o las ITR de AAV se pueden derivar de cualquiera de varios serotipos de AAV. En la actualidad, se conocen más de 40 serotipos de AAV y se siguen identificado nuevos serotipos y variantes de serotipos existentes. Ver Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; y Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. El uso de cualquier serotipo de AAV se considera dentro del alcance de la presente invención. En algunas realizaciones, un vector de rAAV es un vector derivado de un serotipo de AAV que incluye, sin limitación, ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV DJ, AAV DJ8, un AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón o similares. En algunas realizaciones, el ácido nucleico en el AAV (p. ej., un vector de rAAV) comprende una ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV DJ, AAV DJ8, ITR de un AAV de cabra, AAV bovino o AAV de ratón o similares. En algunas realizaciones, la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo flanqueado por una o más ITR de AAV.
En algunas realizaciones, una partícula de rAAV comprende una proteína de encapsulación seleccionada de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (p. ej., una cápside de AAV6 natural o una cápside de AAV6 variante tal como ShH10, como se describe en la Pub. PG estadounidense 2012/0164106), AAV7, a Av 8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (p. ej., una cápside de AAV9 natural o una cápside de AAV9 modificada como se describe en la Pub. PG estadounidense 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, un mutante de cápside de tirosina, un mutante de cápside de unión a heparina, una cápside de AAV2R471A, una cápside de AAVAAV2/2-7m8, una cápside de AAV LK03, una cápside de AAV DJ (p. ej., una cápside de AAV-DJ/8, una cápside de AAV-DJ/9 o cualesquiera otras de las cápsides descritas en la Pub. PG estadounidense 2012/0066783), una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV de cabra, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino, una cápside de AAV de ratón, una cápside de rAAv2/HBoV1, una cápside de AAV2HBKO, una cápside de AAVPHP.B o una cápside de AAVPHP.eB, o una cápside de AAV descrita en la patente estadounidense Núm. 8.283.151 o Publicación internacional núm. WO/2003/042397. En realizaciones adicionales, una partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo de AAV de Clades A-F.
Ciertos aspectos de la presente descripción se relacionan con una proteína de la cápside de AAV (p. ej., un rAAV) que comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación en el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV original. Como se describe en la presente memoria, el aminoácido en la 2a posición con respecto a la metionina inicial (iMet X) de una proteína de la cápside de AAV se puede examinar para determinar los efectos sobre la acetilación del extremo N, el tráfico, la transducción y/u otra(s) modificación(es) después de la traducción (p. ej., glicosilación, ubicuitinación, entre otros). Cualquier ensayo descrito en la presente memoria para examinar la acetilación o una consecuencia funcional de esta en relación con partículas de AAV se puede usar para evaluar la acetilación del extremo N. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP1 o VP3) se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido da como resultado una menor desamidación de la cápside de AAV.
Otros aspectos de la presente descripción se relacionan con una proteína de la cápside de AAV (p. ej., un rAAV) que comprende una sustitución de aminoácido que altera la desamidación. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácido (p. ej., una sustitución de aminoácido en A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de Vp3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3) que "altera" la desamidación resulta en una frecuencia más alta de desamidación o una frecuencia más baja de desamidación, p. ej., en comparación con una VP1 o VP3 sin la sustitución, tal como la VP1 o VP3 original. Como se describe en la presente memoria, se puede examinar un posible sitio de desamidación de una proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP1 o VP3) para determinar los efectos sobre la desamidación, el tráfico, la transducción y/u otra(s) modificación(es) después de la traducción (p. ej., glicosilación, ubicuitinación, entre otros). Cualquier ensayo descrito en la presente memoria para examinar la desamidación o una consecuencia funcional de esta en relación con partículas de AAV se puede usar para evaluar la desamidación.
Se describen varios sitios de desamidación posibles en la presente memoria. En algunas realizaciones, una sustitución de aminoácido que altera la desamidación se selecciona de A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3. Por ejemplo, en algunas realizaciones, N57 de VP1, N382 de VP3, N511 de VP3 y/o N715 de VP3 se sustituye con Asp y la sustitución de aminoácido da como resultado una mayor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En otras realizaciones, la sustitución de aminoácido es en N57K o N57Q y la sustitución de aminoácido da como resultado una menor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En todavía otras realizaciones, G58 de VP1, G383 de VP3, G512 de VP3 y/o G716 de VP3 se sustituye con un aminoácido que no es Gly (p. ej., Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Glu, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr o Val) y la sustitución de aminoácido da como resultado una menor frecuencia de desamidación en comparación con la desamidación de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original.
En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV es VP1, VP2 o VP3. La partícula de AAV puede comprender cualquiera de los serotipos de cápside de AAV ilustrativos descritos en la presente memoria tales como AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, AAV murino o rAAV2/HBoV1. La proteína de la cápside de AAV puede comprender, además, cualesquiera de las mutaciones de proteína de la cápside descritas en la presente memoria, tales como mutaciones de unión a tirosina y/o heparina.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para mejorar la estabilidad de una partícula de rAAV. En algunas realizaciones, los métodos incluyen sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3, p. ej., como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sustituye el residuo aminoacídico 2 de VP1. En otras realizaciones, se sustituye el residuo aminoacídico 2 de VP3. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición 2 se N-acetila en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original, p. ej., como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 mejora la estabilidad de una partícula de rAAV al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, la estabilidad de una partícula de rAAV con un aminoácido sustituido en la posición 2 se puede comparar con una cápside de AAV natural u original, p. ej., del mismo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 mejora la estabilidad de una partícula de rAAV en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, p. ej., en comparación con la estabilidad de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural. La estabilidad de la partícula de AAV se puede medir al usar varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, fluorescencia diferencial de barrido (DSF), calorimetría diferencial de barrido (DSC), otros ensayos de desnaturalización térmica, susceptibilidad a proteólisis, obtención de imágenes o análisis estructural para observar la desnaturalización (p. ej., al usar microscopía de electrones), eficacia de transducción u otro ensayo funcional con composiciones de partícula de AAV mantenidas durante un intervalo de tiempo designado a una temperatura particular (p. ej., temperatura ambiente, o 4 °C, para estabilidad térmica) o tratadas a un pH particular (p. ej., estabilidad en pH), y similares.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para mejorar el ensamblaje de una partícula de rAAV. En algunas realizaciones, los métodos incluyen sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3, p. ej., como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sustituye el residuo aminoacídico 2 de VP1. En otras realizaciones, se sustituye el residuo aminoacídico 2 de VP3. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición 2 se N-acetila en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original, p. ej., como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 mejora el ensamblaje de una partícula de rAAV al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, el ensamblaje de una partícula de rAAV con un aminoácido sustituido en la posición 2 se puede comparar con una cápside de AAV natural u original, p. ej., del mismo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 mejora el ensamblaje de una partícula de rAAV en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, p. ej., en comparación con el ensamblaje de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural. El ensamblaje de la partícula de AAV se puede medir al usar varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen sin limitación, medir la cantidad y/o velocidad de producción de partícula, cuantificar la producción de cápside (p. ej., después de la purificación al usar cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria), someter a ensayo la producción de vectores completos con respecto a cápsides vacías, medir la eficacia de transducción, obtención de imágenes o análisis estructural para observar la formación de partículas (p. ej., al usar microscopía de electrones), producción de proteínas de la cápside de AAV (p. ej., según ensayo por transferencia Western), y similares.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para mejorar la transducción de una partícula de rAAV. En algunas realizaciones, los métodos incluyen sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3, p. ej., como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sustituye el residuo aminoacídico 2 de VP1. En otras realizaciones, se sustituye el residuo aminoacídico 2 de VP3. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido en la posición 2 se N-acetila en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 original, p. ej., como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 mejora la transducción de una partícula de rAAV al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, la transducción de una partícula de rAAV con un aminoácido sustituido en la posición 2 se puede comparar con una cápside de AAV natural u original, p. ej., del mismo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 mejora la transducción de una partícula de rAAV en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, p. ej., en comparación con la transducción de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural. La transducción de la partícula de AAV se puede medir al usar varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, los ensayos de eficacia de transducción descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para reducir la transducción de una partícula de rAAV; por ejemplo, al sustituir el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para mejorar la estabilidad de una partícula de rAAV. En algunas realizaciones, los métodos incluyen sustituir un aminoácido de VP1 y/o VP3 que altera la desamidación, p. ej., como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sustituye A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido se desamida en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico de VP1 y/o VP3 original, p. ej., como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, sustituir A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 mejora la estabilidad de una partícula de rAAV al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, la estabilidad de una partícula de rAAV con un A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3 sustituido se puede comprar con una cápside de AAV natural u original, p. ej., del mismo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustituir A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 mejora la estabilidad de una partícula de rAAV en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % c aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, p. ej., en comparación con la estabilidad de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural. La estabilidad de la partícula de AAV se puede medir al usar varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, fluorescencia diferencial de barrido (DSF), calorimetría diferencial de barrido (DSC), otros ensayos de desnaturalización térmica, susceptibilidad a proteólisis, obtención de imágenes o análisis estructural para observar la desnaturalización (p. ej., al usar microscopía de electrones), eficacia de transducción u otro ensayo funcional con composiciones de partícula de AAV mantenidas durante un intervalo de tiempo designado a una temperatura particular (p. ej., temperatura ambiente, o 4 °C, para estabilidad térmica) o tratadas a un pH particular (p. ej., estabilidad en pH), y similares.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para mejorar el ensamblaje de una partícula de rAAV. En algunas realizaciones, los métodos incluyen sustituir un aminoácido de VP1 y/o VP3 que altera la desamidación, p. ej., como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sustituye A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido se desamida en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico de VP1 y/o VP3 original, p. ej., como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, sustituir A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 mejora el ensamblaje de una partícula de rAAV al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, la estabilidad de una partícula de rAAV con un A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3 sustituido se puede comprar con una cápside de AAV natural u original, p. ej., del mismo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustituir A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 mejora el ensamblaje de una partícula de rAAV en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, p. ej., en comparación con el ensamblaje de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural. El ensamblaje de la partícula de AAV se puede medir al usar varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen sin limitación, medir la cantidad y/o velocidad de producción de partícula, cuantificar la producción de cápside (p. ej., después de la purificación al usar cualquiera de los métodos descritos en la presente memoria), someter a ensayo la producción de vectores completos con respecto a cápsides vacías, medir la eficacia de transducción, obtención de imágenes o análisis estructural para observar la formación de partículas (p. ej., al usar microscopía de electrones), producción de proteínas de la cápside de AAV (p. ej., según ensayo por transferencia Western), y similares.
Otros aspectos de la presente descripción se refieren a métodos para mejorar la transducción de una partícula de rAAV. En algunas realizaciones, los métodos incluyen sustituir un aminoácido de VP1 y/o VP3 que altera la desamidación, p. ej., como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se sustituye A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3. En algunas realizaciones, el aminoácido sustituido se desamida en una frecuencia más alta que el residuo aminoacídico de VP1 y/o VP3 original, p. ej., como se describe en la presente memoria. En algunas realizaciones, sustituir A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 mejora la transducción de una partícula de rAAV al menos aproximadamente 5 %, al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 15 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 35 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 45 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 55 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 65 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 100 %. En algunas realizaciones, la estabilidad de una partícula de rAAV con un A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 o G716 de VP3 sustituido se puede comprar con una cápside de AAV natural u original, p. ej., del mismo serotipo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, sustituir A35 de VP1, N57 de VP1, G58 de VP1, N382 de VP3, G383 de VP3, N511 de VP3, G512 de VP3, N715 de VP3 y/o G716 de VP3 mejora la transducción de una partícula de rAAV en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % c aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, p. ej., en comparación con la transducción de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural. La transducción de la partícula de AAV se puede medir al usar varios ensayos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, los ensayos de eficacia de transducción descritos en la presente memoria.
En algunos aspectos, la invención proporciona partículas víricas que comprenden un genoma que se autocomplementa recombinante (p. ej., un vector de rAAV autocomplementario o que se autocomplementa). Las partículas víricas de AAV con genomas de vector que se autocomplementan y métodos de uso de genomas de AAV que se autocomplementan se describen en las patentes estadounidenses núms.
6.596.535; 7.125.717; 7.465.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; y 8.361.457; y Wang Z., et al., (2003) Gen Ther 10:2105-2111. Un rAAV que comprende un genoma que se autocomplementa rápidamente formará una molécula de ADN bicatenario en virtud de sus secuencias que parcialmente se complementan (p. ej., cadenas codificantes y no codificantes que se complementan de un ácido nucleico heterólogo). En algunas realizaciones, el vector comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un ácido nucleico heterólogo y una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un complemento del ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico puede formar pares de bases intracatenarios con la segunda secuencia de ácido nucleico a lo largo de gran parte o toda su longitud.
En algunas realizaciones, la primera secuencia de ácido nucleico heteróloga y una segunda secuencia de ácido nucleico heteróloga se enlazan mediante una ITR mutada (p. ej., la ITR derecha). En algunas realizaciones, la ITR comprende la secuencia polinucleotídica 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCC GGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO:8). La ITR mutada comprende una eliminación de la región D que comprende la secuencia de resolución terminal. Como resultado, al replicar un genoma vírico de AAV, las proteínas rep no escindirán el genoma vírico en las ITR mutadas y como tal, un genoma vírico recombinante que comprende lo siguiente en el orden de 5' a 3' se empaquetará en una cápside vírica: una ITR de AAV, la primera secuencia polinucleotídica heterólogo que incluye secuencias reguladoras, la ITR de AAV mutada, el segundo polinucleótido heterólogo en orientación inversa al primer polinucleótido heterólogo y una tercera ITR de AAV.
Se usan diferentes serotipos de AAV para optimizar la transducción de células diana particulares o para dirigirse a tipos de células específicos en un tejido diana particular (p. ej., un tejido enfermo). Una partícula de rAAV puede comprender proteínas víricas y ácidos nucleicos víricos del mismo serotipo o un serotipo mixto. Por ejemplo, una partícula de rAAV puede comprender una o más ITR y cápside derivada del mismo serotipo de AAV, o una partícula de rAAV puede contener una o más ITR derivadas de un serotipo de AAV diferente que la cápside de la partícula de rAAV.
En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende una mutación, p. ej., la cápside comprende una proteína de la cápside mutante. En algunas realizaciones, la mutación es una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina. En algunas realizaciones, una proteína de la cápside mutante mantiene la capacidad de formar una cápside de AAV. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV comprende una cápside mutante para tirosina de AAV2 o AAV5 (ver, p. ej., Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105(22):7827-7832), tal como una mutación en Y444 o Y730 (numeración según AAV2). En realizaciones adicionales, la partícula de rAAV comprende proteínas de la cápside de un serotipo de AAV de Clades A-F (Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381).
En algunas realizaciones, una proteína de la cápside comprende una o más sustituciones de aminoácido en una o más posiciones que interactúan con un proteoglicano de heparina sulfato o en una o más posiciones correspondientes a los aminoácidos 484, 487, 527, 532, 585 o 588, numeración basada en la numeración para VP1 de AAV2. Se sabe en la técnica que el proteoglucano de heparán sulfato (HSPG) actúa como el receptor celular para partículas de AAV2 (Summerford, C. and Samulski, R.J. (1998) J. Virol. 72(2): 1438-45). La unión entre una partícula de AAV2 y HSPG en la membrana celular sirve para acoplar la partícula a la célula. Otras proteínas de superficie celular tales como el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y avp5 integrina taérto ipueden facilitar la infección celular. Después de la unión, una partícula de AAV2 puede ingresar a la célula a través de mecanismos que incluyen endocitosis mediada por receptor a través de hoyos recubiertos con clatrina. Una partícula de AAV2 se puede liberar a partir de una vesícula endocítica tras la acidificación endosómica. Esto permite que la partícula de AAV2 se desplace hacia la región perinuclear y después al núcleo celular. Las partículas AAV3 también son conocidos por unirse a heparina (Rabinowitz, J.E., et al. (2002) J. Virol. 76(2):791-801).
Se sabe que la unión entre proteínas de la cápside de AAV2 y HSPG se produce a través de interacciones electrostáticas entre los residuos de la proteína de la cápside de AAV2 básicos y los residuos de glicosaminoglicano con carga negativa (Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081). Los residuos específicos de la cápside que participan en estas interacciones incluyen R484, R487, K527, K532, R585 y R588. Se ha mostrado que las mutaciones en estos residuos reducen la unión de AAV2 a células Hela y la propia heparina (Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006; Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081; WO 2004/027019 A2, la patente estadounidense núm. 7.629.322). Además, sin ánimo de ceñirse a la teoría, se cree que la(s) sustitución(es) de aminoácidos en uno o más de los residuos correspondientes a los aminoácidos 484, 487, 527, 532, 585 o 588, numeración basada en la numeración para VP1 de AAV2 puede(n) modular las propiedades de transducción de los tipos de cápside de AAV que no se unen a HSPG, o puede(n) modular las propiedades de transducción de tipos de cápside de AAV independientemente de su capacidad para unirse a HSPg . En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido comprende una sustitución en la posición R484, R487, K527, K532, R585 y/o R588 de VP1, VP2 y/o VP3, numeración basada en VP1 de AAV2.
En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido reducen la unión de la partícula de rAAV al proteoglucano de heparina sulfato en aproximadamente al menos 10 %, aproximadamente al menos 25 %, aproximadamente al menos 50 %, aproximadamente al menos 75 %, o aproximadamente al menos 100 %. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido reducen la unión de la partícula de rAAV al proteoglucano de heparina sulfato en aproximadamente al menos 10 %, aproximadamente al menos 15 %, aproximadamente al menos 20 %, aproximadamente al menos 25 %, aproximadamente al menos 30 %, aproximadamente al menos 35 %, aproximadamente al menos 40 %, aproximadamente al menos 45 %, aproximadamente al menos 50 %, aproximadamente al menos 55 %, aproximadamente al menos 60 %, aproximadamente al menos 65 %, aproximadamente al menos 70 %, aproximadamente al menos 75 %, aproximadamente al menos 80 %, aproximadamente al menos 85 %, aproximadamente al menos 90 %, aproximadamente al menos 95 % o aproximadamente al menos 100 % (en comparación con la unión a una partícula de rAAV que comprende una cápside natural). En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido reducen la unión de la partícula de rAAV al proteoglucano de heparina sulfato en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % o aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, (en comparación con la unión de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural). En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido da como resultado una unión no detectable de la partícula de rAAV al proteoglucano de heparina sulfato en comparación con una partícula de rAAV natural. Los medios para medir la unión de partículas de AAV a HSPG se conocen en la técnica; p. ej., la unión a medios de cromatografía con heparina sulfato o la unión a una célula conocida por expresar HSPG en su superficie. Por ejemplo, ver Opie, SR et al., (2003) J. Virol. 77:6995-7006 y Kern, A et al., (2003) J. Virol. 77:11072-11081. En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido mejoran la eficacia de transducción de la partícula de rAAV a una célula (p. ej., una célula en el ojo o SNC) en aproximadamente al menos 10 %, aproximadamente al menos 15 %, aproximadamente al menos 20 %, aproximadamente al menos 25 %, aproximadamente al menos 30 %, aproximadamente al menos 35 %, aproximadamente al menos 40 % aproximadamente al menos 45 %, aproximadamente al menos 50 %, aproximadamente al menos 55 % aproximadamente al menos 60 %, aproximadamente al menos 65 %, aproximadamente al menos 70 % aproximadamente al menos 75 %, aproximadamente al menos 80 %, aproximadamente al menos 85 % aproximadamente al menos 90 %, aproximadamente al menos 95 % o aproximadamente al menos 100 % (en comparación con la eficacia de transducción de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural). En algunas realizaciones, la una o más sustituciones de aminoácido mejoran la eficacia de transducción de la partícula de rAAV a una célula (p. ej., una célula en el ojo o SNC) en uno cualquiera de aproximadamente 10 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 90 % a aproximadamente 100 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 80 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 70 % a aproximadamente 80 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 60 % a aproximadamente 70 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 50 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 40 %, aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 %, o aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, (en comparación con la eficacia de transducción de una partícula de rAAV que comprende una cápside natural). Los medios para medir la eficacia de transducción de partículas de AAV a una célula (p. ej., una célula en cultivo o parte de un tejido) se conocen en la técnica. Por ejemplo, se puede infectar una población de células (p. ej., en cultivo o parte de un tejido) con una concentración de partículas de rAAV que contienen un vector que, cuando se expresa en las células, produce un indicador que se puede someter a ensayo (p. ej., fluorescencia de GFP, producción de sFLT, etc.).
Proteínas de la cápside de AA V
En algunos aspectos, la invención proporciona una proteína de la cápside de AAV que comprende una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2; en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV original. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside de AAV es VP1 o VP3. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP1 o VP3) se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido da como resultado una menor desamidación de la proteína de la cápside de AAV. Los ejemplos no limitantes de proteínas de la cápside de AAV de la invención incluyen VP1 y/o VP3 de cualquiera de los siguientes serotipos de a Av : cápside de serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, ÁÁV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV LK03, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV DJ8, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV caprino, AAV1/AAV2 quimérico, AAV bovino, AAV murino o rAAV2/HBoV1. En algunas realizaciones, la cápside de AAV comprende, además, una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina.
Producción de partículas de AA V
Se conocen numerosos métodos en la técnica para la producción de vectores de rAAV, incluida la transfección, producción de línea celular estable y sistemas de producción de virus híbrido infeccioso que incluyen híbridos de adenovirus-AAV, híbridos de virus del herpes-AAV (Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789) e híbridos de baculovirus-AAV (Urabe, M. et al., (2002) Human Gene Therapy 13(16):1935-1943; Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet. 20(R1): R2-R6). Los cultivos de productos de rAAV para la producción de partículas víricas de rAAV requieren todos; 1) células hospedantes adecuadas, 2) función de virus auxiliar adecuada, 3) genes rep y cap de AAV y productos génicos; 4) un ácido nucleico (tal como un ácido nucleico terapéutico) flanqueado por al menos una secuencia de ITR de AAV (p. ej., un genoma de AAV que codifica GNPTAB); y 5) medios y componentes de medios adecuados para respaldar la producción de rAAV. En algunas realizaciones, la célula hospedante adecuada es una célula hospedante de primate. En algunas realizaciones, la célula hospedante adecuada es líneas celulares derivadas de seres humanos tales como células HeLa, A549, 293 o Perc.6. En algunas realizaciones, la función de virus auxiliar adecuado se proporciona mediante un adenovirus (tal como adenovirus sensible a temperatura), virus del herpes (HSV), baculovirus natural o muíante o una construcción plasmídica que proporciona funciones auxiliares. En algunas realizaciones, los productos génicos de rep y cap de AAV pueden ser de cualquier serotipo de AAV. En general, pero no de manera obligatoria, el producto génico de rep de AAV es del mismo serotipo que las ITR del genoma del vector de rAAV, siempre que los productos génicos de rep puedan funcionar para replicar y empaquetar el genoma de rAAV. Se pueden usar medios adecuados conocidos en la técnica para la producción de vectores de rAAV. Estos medios incluyen, sin limitación, medios producidos por Hyclone Laboratories y JRH incluido medio Eagle modificado (MEM), medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), formulaciones a medida tales como las descritas en la patente estadounidense núm. 6.566.118, y medios Sf-900 II SFM como se describe en la patente estadounidense núm. 6.723.551, particularmente con respecto a formulaciones de medios a medida para uso en la producción de vectores de AAV recombinantes. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan mediante un adenovirus o HSV. En algunas realizaciones, las funciones auxiliares de AAV se proporcionan mediante un baculovirus y la célula hospedante es una célula de insecto (p. ej., células Spodoptera frugiperda (Sf9)). En algunas realizaciones, las funciones cap de AAV proporcionan una sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3, en donde la sustitución de aminoácido en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 altera la acetilación del extremo N en comparación con la acetilación del extremo N en el residuo aminoacídico 2 de VP1 y/o VP3 de la partícula de AAV original. En algunas realizaciones, el residuo aminoacídico 2 de la proteína de la cápside de AAV (p. ej., VP1 o VP3) se sustituye con Cys, Ser, Thr, Val, Gly, Asn, Asp, Glu, Ile; Leu, Phe, Gln, Lys, Met, Pro o Tyr. En algunas realizaciones, la sustitución de aminoácido da como resultado una menor desamidación de la cápside de AAV.
Un método para producir partículas de rAAV es el método de triple transfección. En palabras breves, un plásmido que contiene un gen rep y un gen de la cápside, junto con un plásmido adenovírico auxiliar se puede transfectar (p. ej., al usar el método de fosfato cálcico) en una línea celular (p. ej., células HEK-293) y el virus se puede recoger y opcionalmente purificar. Como tal, en algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produce mediante transfección triple de un ácido nucleico que codifica el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones de virus auxiliares de AAV en una célula hospedante, en donde la transfección de los ácidos nucleicos en las células hospedantes genera una célula hospedante capaz de producir partículas de rAAV.
En algunas realizaciones, las partículas de rAAV se pueden producir mediante un método de línea celular productora (ver Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269; la Pub. PG estadounidense Núm. US2004/0224411; y Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299). En breves palabras, una línea celular (p. ej., una línea celular HeLa, 293, A549 o Perc.6) se puede transfectar establemente con un plásmido que contiene un gen rep, un gen de cápside y un genoma de vector que comprende una secuencia de ácido nucleico heteróloga promotora (p. ej., GNPTAB). Las líneas celulares se pueden cribar para seleccionar un clon líder para la producción de rAAV, que después se puede expandir a un biorreactor de producción e infectar con un virus auxiliar (p. ej., un adenovirus o HSV) para iniciar la producción de rAAV. El virus posteriormente se puede recoger, el adenovirus se puede inactivar (p. ej., con calor) y/o retirar y se pueden purificar las partículas de rAAV. Como tal, en algunas realizaciones, la partícula de rAAV se produjo mediante una línea celular productora que comprende uno o más de ácido nucleico que codifica el vector de rAAV, un ácido nucleico que codifica rep y cap de AAV y un ácido nucleico que codifica funciones de virus auxiliar de AAV. Como se describe en la presente memoria, el método de línea celular productora puede ser ventajoso para la producción de partículas de rAAV con un genoma de gran tamaño, en comparación con el método de transfección triple.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica genes rep y cap de AAV y/o el genoma de rAAV se mantienen establemente en la línea celular productora En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica genes rep y cap de AAV y/o el genoma de rAAV se introduce en uno o más plásmidos en una línea celular para generar una línea celular productora. En algunas realizaciones, el rep de AAV, el cap de AAV y el genoma de rAAV se introducen en una célula en el mismo plásmido. En otras realizaciones, el rep de AAV, el cap de AAV y el genoma de rAAV se introducen en una célula diferentes plásmidos. En algunas realizaciones, una línea celular transfectada establemente con un plásmido mantiene el plásmido durante múltiples pasajes de la línea celular (p. ej., 5, 10, 20, 30, 40, 50 o más de 50 pasajes de la célula). Por ejemplo, el(los) plásmido(s) se puede(n) replicar a medida que la célula se replica o el(los) plásmido(s) puede(n) integrarse en el genoma de la célula. Se ha identificado una variedad de secuencias que permiten que un plásmido se replique de manera autónoma en una célula (p. ej., una célula humana) (ver, p. ej., Krysan, P.J. et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033). En algunas realizaciones, el(los plásmido(s) pueden contener un marcador seleccionable (p. ej., un marcador de resistencia a antibiótico) que permite la selección de células que mantienen el plásmido. Dichos marcadores seleccionable que se usan comúnmente en células de mamífero incluyen, sin limitación, blasticidina, G418, higromicina B, zeocina, puromicina y derivados de estos. Los métodos para introducir ácidos nucleicos en una célula se conocen en la técnica e incluyen, sin limitación, transducción vírica, transfección catiónica (p. ej., al usar un polímero catiónico tal como DEAE-dextrano o un lípido catiónico tal como lipofectamina), transfección por fosfato cálcico, microinjección, bombardeo de partículas, electroporación y transfección de nanopartículas (para más detalles, ver p. ej., Kim, T.K. y Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica genes rep y cap de AAV y/o el genoma de rAAV se integran establemente en el genoma de la línea celular productora. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica genes rep y cap de AAV y/o el genoma de rAAV se introduce en uno o más plásmidos en una línea celular para generar una línea celular productora. En algunas realizaciones, el rep de AAV, el cap de AAV y el genoma de rAAV se introducen en una célula en el mismo plásmido. En otras realizaciones, el rep de AAV, el cap de AAV y el genoma de rAAV se introducen en una célula diferentes plásmidos. En algunas realizaciones, el(los) plásmido(s) pueden contener un marcador seleccionable (p. ej., un marcador de resistencia a antibiótico) que permite la selección de células que mantienen el plásmido. Los métodos para la integración estable de ácidos nucleicos en una variedad de líneas celulares hospedantes se conocen en la técnica. Por ejemplo, se puede usar selección repetida (p. ej., a través del uso de un marcador seleccionable) para seleccionar células que tienen integrado un ácido nucleico que contiene un marcador seleccionable (y genes cap y rep de AAV y/o un genoma de rAAV). En otras realizaciones, los ácidos nucleicos se pueden integrar de manera específica para un sitio en una línea celular para generar una línea celular productora Se conocen varios sistemas de recombinación específicos para un sitio en la técnica, tales como FLP/FRT (ver, p. ej., O'Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355), Cre/loxP (ver, p. ej., Sauer, B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170) y phi C31-att (ver, p. ej., Groth, A.C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000).
En algunas realizaciones, la línea celular productora se deriva de una línea celular de primate (p. ej., una línea celular de primate no humana, tal como una línea celular Vero o FRhL-2). En algunas realizaciones, la línea celular se deriva de una línea celular humana. En algunas realizaciones, la línea celular productora se deriva de células HeLa, 293, A549 o PERC.6® (Crucell). Por ejemplo, antes de la introducción y/o mantenimiento/integración estable del ácido nucleico que codifica genes rep y cap de AAV y/o el genoma de rAAV de gran tamaño en una línea celular para generar una línea celular productora, la línea celular es una línea celular de HeLa, 293, A549 o PERC.6® (Crucell) o un derivado de esta.
En algunas realizaciones, la línea celular productora se adapta para crecimiento en suspensión. Como se sabe en la técnica, las células dependientes de anclaje típicamente no son capaces de crecen en suspensión sin un sustrato, tal como perlas microportadoras. Adaptar una línea celular para que crezca en suspensión puede incluir, por ejemplo, hacer que la línea celular crezca en un cultivo en agitación con una paleta de agitación, al usar un medio de cultivo que carece de iones de calcio y magnesio para evitar la aglomeración (y, opcionalmente, un agente antiespuma), al usar un recipiente de cultivo recubierto con un compuesto siliconizante y seleccionar las células en el cultivo (en lugar de en grandes aglomerados o en los lateral del recipiente) en cada pasaje. Para acceder a una descripción adicional, ver, p. ej., el documento preguntas frecuentes de ATCC (disponible en el sitio web en atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line% 20to%20suspension-40.aspx) y las referencias mencionadas en este.
Los medios de cultivo para la producción de AAV adecuados de la presente invención se pueden complementar suero o proteínas recombinantes derivadas de suero en un nivel de 0,5 %-20 % (v/v o p/v). Alternativamente, como se sabe en la técnica, se pueden producir vectores de AAV en condiciones libres de suero que también se pueden denominar medios sin productos derivados de animales. El experto en la técnica puede apreciar que los medios comerciales o a medida diseñados para respaldar la producción de vectores de AAV también se pueden complementar con uno o más componentes de cultivo celular conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, glucosa, vitaminas, aminoácidos y o factores de crecimiento, para aumentar el valor cuantitativo de AAV en los cultivos de producción.
Los cultivos de producción de AAV se pueden hacer crecer en una variedad de condiciones (en un amplio intervalo de temperatura, durante una extensión de tiempo variable, y similares) adecuadas para la célula hospedante particular que se utiliza. Como se sabe en la técnica, los cultivos de producción de AAV incluyen cultivos dependientes de acoplamiento que se pueden cultivar en recipientes dependientes de acoplamiento adecuados tales como, por ejemplo, frascos con rodillo, filtros de fibra hueca, microportadores y biorreactores de lecho cargado o lecho fluidizado. Los cultivos de producción de vector de AAV también pueden incluir células hospedantes adaptadas a suspensión tales como células HeLa, 293 y SF-9 que se pueden cultivar en una variedad de modos que incluyen, por ejemplo, matraces con agitación, biorreactores de tanque con agitación y sistemas descartables tales como el sistema de bolsa Wave.
Las partículas de vector de AAV de la invención se pueden recoger a partir de los cultivos de producción de AAV mediante la lisis de las células hospedantes del cultivo de producción o al recoger los medios agotados del cultivo de producción, siempre que las células se cultiven en condiciones conocidas en la técnica para causar la liberación de partículas de AAV en los medios desde las células intactas, como se describe más completamente en la patente estadounidense núm. 6.566.118). Los métodos adecuados para lisar células se conocen también en la técnica e incluyen, por ejemplo, múltiples ciclos de congelamiento/descongelamiento, sonicación, microfluidización y tratamiento con sustancias químicas, tales como detergentes y/o proteasas.
En una realización adicional, las partículas de AAV están purificadas. El término "purificado/a", según se usa en la presente memoria, incluye una preparación de partículas de AAV desprovistas de al menos algunos de los otros componentes que también pueden estar presentes donde las partículas de AAV se producen naturalmente o se preparan inicialmente. Por lo tanto, por ejemplo, se pueden preparar partículas de AAV aisladas al usar una técnica de purificación para enriquecerlas a partir de una mezcla fuente, tal como un lisado de cultivo o sobrenadante de cultivo de producción. El enriquecimiento se puede medir en una variedad de modos, tales como, por ejemplo, mediante la proporción de partículas resistentes a DNasa (DRP) o copias de genoma (gc) presentes en una disolución, o mediante la infectividad, o se puede medir en relación con una segunda sustancia, potencialmente interferente presente en la mezcla fuente, tal como contaminantes, incluidos contaminantes de cultivo de producción o contaminantes dentro del proceso, que incluyen virus auxiliar, componentes de los medios y similares.
En algunas realizaciones, el cultivo de producción de AAV recogido se aclara para retirar los restos de la célula hospedante. En algunas realizaciones, el cultivo de profundidad recogido se aclara mediante filtración a través de una serie de filtración de profundidad que incluyen, por ejemplo, un filtro de grado DOHC Millipore Millistak+ HC Pod, un filtro de grado A1HC Millipore Millistak+ HC Pod y un filtro de membrana hidrófila de 0,2 pm Filter Opticap XL1O Millipore Express SHC. El aclaramiento también se puede lograr mediante una variedad de técnicas estándar distintas conocidas en la técnica, tales como, centrifugación o filtración a través de filtro de acetato de celulosa de 0,2 pm o un tamaño de poro mayor conocido en la técnica.
En algunas realizaciones, el cultivo de producción de AAV recogido se trata adicionalmente con Benzonase® para digerir cualquier ADN de alto peso molecular presente en el cultivo de producción. En algunas realizaciones, la digestión por Benzonase® se lleva a cabo en condiciones estándares conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, una concentración final de 1-2,5 unidades/ml de Benzonase® a una temperatura que varía de ambiente a 37 °C durante un período de 30 minutos a varias horas.
Las partículas de AAV se pueden aislar o purificar al usar una o más de las siguientes etapas de purificación: centrifugación en equilibrio; filtración con intercambio aniónica con flujo de paso; filtración con flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) para concentrar las partículas de AAV; captura de AAV mediante cromatografía con apatita; inactivación térmica de virus auxiliar; captura de AAV mediante cromatografía de interacción hidrófoba; intercambio de amortiguador mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés); nanofiltración; y captura de AAV mediante cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico o cromatografía de afinidad. Estas etapas se pueden usar solas, en varias combinaciones o en diferentes órdenes. En algunas realizaciones, el método comprende todas las etapas en el orden como se describe más adelante. Los métodos para purificar partículas de AAV se encuentran, por ejemplo, en Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; las patentes estadounidenses números 6.989.264 y 8.137.948; y WO 2010/148143.
Composiciones farmacéuticas
En algunas realizaciones, una partícula de AAV de la presente descripción (p. ej., una partícula de rAAV) está en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden ser adecuadas para cualquier modo de administración descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende partículas de rAAV modificadas para mejorar la estabilidad y/o mejorar la eficacia de transducción de partículas de rAAV; por ejemplo, para uso en la sustitución del residuo aminoacídico en la posición 2 de VP1 y/o VP3 para mejorar la acetilación de proteínas de la cápside de rAAV. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende partículas de rAAV modificadas para modular la estabilidad y/o la eficacia de transducción de partículas de rAAV (p. ej., aumentar la estabilidad y/o eficacia de transducción o disminuir la estabilidad y/o eficacia de transducción); por ejemplo, para uso en la sustitución de residuos aminoacídicos que modulan la desamidación (p. ej., aumentar la desamidación o disminuir la desamidación).
En algunas realizaciones, la partícula de rAAV está en una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable. Como se sabe en la técnica, los excipientes farmacéuticamente aceptables son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz y se pueden suministrar como disoluciones o suspensiones líquidas, como emulsiones, o como formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes del uso. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, sustancias tampón de pH y tampones. Dichos excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico adecuado para el suministro directo al ojo que se pueda administrar sin toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sorbitol, cualquiera de los diversos compuestos TWEEN y líquidos tales como agua, disolución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables en ellas, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Una exhaustiva descripción de excipientes farmacéuticamente aceptables se encuentra disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991). En algunas realizaciones, la composición farmacéutica que comprende una partícula de rAAV descrita en la presente memoria y un vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuada para administración a seres humanos. Dichos vehículos se conocen en la técnica (ver, p. ej., Remington'sPharmaceuticalSciences, 15aedición, págs. 1035-1038 y 1570-1580).
Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceite, incluidos los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tal como aceite de maní, aceite de frijol de soja, aceite mineral y similares. También se pueden emplear disoluciones salinas y dextrosa acuosa, disoluciones de polietilenglicol (PEG) y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para disoluciones inyectables. La composición farmacéutica puede comprender, además, ingredientes adicionales, por ejemplo, conservantes, tampones, agentes de tonicidad, antioxidantes y estabilizadores, agentes humectantes o aclarantes no iónicos, agentes para aumentar la viscosidad y similares. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden envasar en dosificaciones unitarias simples o en formas multidosificación. Las composiciones generalmente se formulan como una disolución estéril y sustancialmente isotónica.
Kits y artículos de fabricación
La presente descripción también proporciona kits o artículos de fabricación que comprenden cualquiera de las partículas de rAAV y/o composiciones farmacéuticas de la presente descripción. Los kits o artículos de fabricación pueden comprenden cualquiera de las partículas de rAAV o composiciones de partícula de rAAV de la descripción. En algunas realizaciones, los kits se usan para mejorar la estabilidad y/o mejorar la eficacia de transducción de partículas de rAAV; por ejemplo, para uso en la sustitución del residuo aminoacídico en la posición 2 de VP1 y/o VP3 para mejorar la acetilación de proteínas de la cápside de rAAV. En algunas realizaciones, los kits se usan para modular la estabilidad y/o la eficacia de transducción de partículas de rAAV (p. ej., aumentar la estabilidad y/o eficacia de transducción o disminuir la estabilidad y/o eficacia de transducción); por ejemplo, para uso en la sustitución de residuos aminoacídicos que modulan la desamidación (p. ej., aumentar la desamidación o disminuir la desamidación).
En algunas realizaciones, los kits o artículos de fabricación incluyen, además, instrucciones para la administración de una composición de partículas de rAAV. Los kits o artículos de fabricación descritos en la presente memoria pueden incluir, además, otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos del envase con instrucciones para llevar a cabo cualesquiera de los métodos descritos en la presente memoria. Los materiales de envasado adecuados también pueden incluir y pueden ser cualesquiera materiales de envasado conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, viales (tales como viales comunitarios), recipientes, ampollas, frascos, tarros, envases flexibles (p. ej., bolsas de plástico o Mylar selladas) y similares. Estos artículos de fabricación se pueden esterilizar y/o sellar adicionalmente.
En algunas realizaciones, los kits o artículos de fabricación contienen, además, uno o más de los tampones y/o excipientes farmacéuticamente aceptables descritos en la presente memoria (p. ej., como se describe en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991). En algunas realizaciones, los kits o artículos de fabricación incluyen uno o más excipientes, vehículos, disoluciones y/o ingredientes adicionales farmacéuticamente aceptables descritos en la presente memoria. Los kits o artículos de fabricación descritos en la presente memoria se pueden envasar en dosificaciones unitarias simples o en formas multidosificación. El contenido de los kits o artículos de fabricación generalmente se formula como estéril y se puede liofilizar o proporcionar como una disolución sustancialmente isotónica.
EJEMPLOS
La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Se entenderá que los ejemplos y realizaciones descritos en la presente memoria se proporcionan solamente con fines ilustrativos y que se sugerirán diversas modificaciones o cambios en virtud de estos a los expertos en la técnica.
Ejemplo 1:LC/MS directa y LC/MS/MS para la caracterización completa de la proteína de la cápside vírica de AAV recombinante
Los virus adenoasociados recombinantes (rAAV) se han convertido en populares vectores de terapia génica debido a su naturaleza no patógena, capacidad de infectar células divisibles y no divisibles y expresión génica a largo plazo. En la actualidad, se usan terapias génicas basada en AAV en ensayos clínicos para numerosas dianas de enfermedad, tales como distrofia muscular, hemofilia, enfermedad de Parkinson, amaurosis congénita de Leber y degeneración macular.
El AAV es un parvovirus pequeño y sin envoltura con un genoma de ADN monocatenario encapsulado en una cubierta icosaédrica. Cada cápside incluye sesenta copias de tres proteínas de la cápside vírica VP1 (87kDa), VP2 (73kDa) y VP3 (62 kDa) en una relación de aproximadamente 1:1:10. Las tres proteínas de la cápside vírica se expresan a partir del mismo marco de lectura abierto al usar empalme alternativo y un codón de iniciación atípico y, por lo tanto, tienen secuencias superpuestas. VP1 tiene — 137 residuos aminoacídicos adicionales en el extremo N en comparación con VP3, mientras que VP2 tiene —65 residuos aminoacídicos adicional en el extremo N en comparación con VP3. Se han aislado al menos 13 serotipos de AAV y — 150 secuencias génicas a partir de tejidos de primates humanos y no humanos; los serotipos de AAV difieren en la secuencia de aminoácidos de las proteínas de la cápside vírica y sus correspondientes receptores y correceptores celulares para el direccionamiento.
La cápside de AAV, además de proteger el genoma en su interior, tiene una función importante en mediar la unión a receptores, el escape del virus del endosoma y el transporte del ADN vírico al núcleo en el ciclo de infección vírica y, por lo tanto, impacta directamente sobre la infectividad vírica. Se ha mostrado que el extremo N de VP1 contienen un dominio de fosfolipasa PLA2 (a.a. 52-97) que es esencial en el escape endosómico del virus [1-3]. Los extremos N de VP1 y VP2 también contienen tres aglomeraciones de aminoácidos básicos como señales de localización nuclear. Estas secuencias están altamente conservadas entre los diferentes serotipos de AAV. Se ha mostrado que las mutaciones de estos aminoácidos reducen o eliminan la infectividad completamente [4]. Además, cada serotipo de AAV tiene receptores y correceptores específicos para secuencia correspondientes. Por ejemplo, se identificó al proteoglucano de heparina sulfato como un receptor importante de AAV2 y se han identificados varios otros correceptores, incluidos aVp5 integrina, el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 1 y el receptor de multiplicación de hepatocitos [5-8]. El análisis de la mutación de las proteínas de la cápside de AAV2 ha identificado un grupo de aminoácidos básicos (arginina484, 487, 585 y lisina532) como un motivo de unión a heparina que contribuye a la unión a heparina y célula HeLa [9]. El dominio NGR en AAV2 se identificó como un dominio de unión a integrina a5p1 que es esencial para el ingreso vírico a la célula [10]. En resumen, las secuencias de proteína de la cápside vírica son importantes en el direccionamiento y tráfico celular en el ciclo de infección vírico. Dado que diferentes condiciones de producción pueden causar diferentes niveles de expresión de las proteínas de la cápside vírica, modificaciones después de la traducción y truncamientos, las proteínas de la cápside vírica se deben caracterizar y monitorizar para garantizar la uniformidad del producto en los programas de desarrollo de terapia génica.
Tradicionalmente, se ha usado SDS-PAGE para caracterizar a las proteínas de la cápside vírica de AAV, que proporciona información sobre el peso molecular tal como 87 kDa, 73kDa y 62 kDa. No se obtuvo ninguna información secuencial a partir de secuenciación de Edman, posiblemente debido a los extremos N bloqueados de las proteínas de la cápside vírica, excepto VP2. Aunque se han resuelto las estructuras de rayos X de múltiples AAV, solo se observó la secuencia de la región VP3 en las estructuras cristalinas. Todavía faltaban quince residuos aminoacídicos del extremo N de VP3 en las estructuras de rayos X, posiblemente debido a su irregularidad intrínseca [11-13]. Es posible que la falta de información de las regiones del extremo N de VP1 y VP2 en las estructuras atómicas pueda deberse a la baja estequiometría de VP1 y VP2 en la cápside. Además, los extremos N de VP1 y VP2 están escondidos dentro de la cápside y no son accesibles para los anticuerpos en estado natural según se informa en parte de la literatura [3, 14, 15]. Convencionalmente, se usó un método Gel-LC/MS (SDS-PAGE, digestión tríptica en gel y LC/MS/MS) en la caracterización de las VP [16-18]. Sin embargo, los extremos N de VP1, VP2 y VP3 no se han confirmado al usar esta estrategia, dado que este método no logró obtener el 100 % de cobertura de secuencia de las VP debido a la recuperación limitada del péptido a partir del gel.
Se informó sobre el análisis directo al usar MALDI-TOF MS para varias proteínas de la cápside de virus incluido el virus del mosaico del tabaco U2 después de la disociación con ácido orgánico [19]. El mapeo peptídico directo después de intercambio de amida hidrógeno y la espectrometría de masas se ha usado para estudiar los cambios estructurales inducidos por el pH en la cápside del virus del mosaico del bromo (BMV) [20]. Dado que los AAV son virus sin envoltura que contiene solo proteínas de la cápside y genoma, las cápsides de AAV se podrían analizar directamente mediante RP-LC/MS de las proteínas y LC/MS/MS del mapeo peptídico para lograr un 100 % de cobertura de secuencia después de la disociación de la cápside sin separación por SDS-PAGE. Los fragmentos de ADN podrían eluirse en el volumen vacío y, por lo tanto, no tendrían interferencia sobre la detección de la proteína/péptido mediante LC/MS. Para investigar estos métodos, se usó LC/MS directa de diferentes tipos de AAV después de la desnaturalización para monitorizar la secuencia de proteína y las modificaciones después de la traducción de las proteínas de la cápside de AAV. Como se describe en la presente memoria, los extremos N de VP1, VP2 y VP3 de AAV se han confirmado mediante espectrometría de masas. Las acetilaciones de los extremos N de VP1 y VP3 también se identificaron en los diferentes serotipos de AAV. El mapeo peptídico mediante LC/MS/MS directo de AAV también se ha desarrollado para proporcionar cobertura de secuencia de VP1, VP2 y VP3 y confirmar la acetilación de los extremos N de VP1 y VP3.
Métodos
Materiales y reactivos
Se adquirieron ditiotreitol (DTT), 4-vinilpiridina, ácido fórmico ultra puro, ácido acético, guanidina-HCl, Tris-HCl y Tris base de Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Se adquirieron filtros Amicon ultra-4 de Millipore (Billerica, MA). Se adquirió tripsina de grado de secuenciación porcina de Promega (Milwaukee, WI). Se adquirieron endoproteinasa Lys-C y Asp-N de Roche (Alemania). Se adquirieron casetes Slide-A-Lyzer con 10.000 MWCo de Pierce (Rockford, IL).
Producción y purificación del vector
Se produjeron vectores de AAV al usar el método de transfección triple transitoria como se describió anteriormente (Xiao, 1998 núm. 123). En breves palabras, se transfectaron células HEK293 al usar polietilenimina, PEI y una relación 1:1:1 de tres plásmidos (vector de ITR, rep/cap de AAV y plásmido auxiliar Ad). El plásmido de vector contiene el genoma de vector CBA-EGFP y las secuencias de ITR de AAV2. La expresión de EGFP se impulsa mediante el promotor híbrido de beta actina de pollo potenciador de CMV (CBA) como se describió (Miyazaki, 1989 núm. 124) (Niwa, 1991 núm. 125). Los auxiliares de rep / cap de AAV contenían secuencias rep de AAV2 y secuencias de cápside específicas para el serotipo con la nomenclatura, rep2 / cap2, rep2 / cap5, rep2 /cap7 etc. El auxiliar pAd usado fue pHelper (Stratagene/Agilent Technologies, Santa Clara, cA). La purificación de AAV se llevó a cabo según lo describieron Qu et al. (2007, J. Virol. Methods 140:183-192).
Análisis de proteína intacta mediante LC/MS
Los viriones de AAV se concentraron con un filtro Amicon ultra-4 (10kDa MWCO) y se desnaturalizaron con ácido acético al 10 % y posteriormente se sometieron a análisis directo en un instrumento Acquity UPLC -Xevo® QTOF MS (Waters, Milford, MA). Las separaciones se llevaron a cabo con una columna UPLC Be H C4 o C8 (1,7 pm, 2,1 mm i.d.) a una velocidad de flujo de 0,25 ml/min. La fase móvil A fue ácido fórmico al 0,1 % en agua, mientras que la fase móvil B fue ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El gradiente final fue el siguiente: de 10 % de B a 20 % de B durante 6 minutos, de 20 % de B a 30 % de B en 10 min, después de 30 % a 38 % de B durante 40 minutos. Para la MS, el voltaje del capilar y el voltaje del cono de muestreo se fijaron en 3,5 kV y 45 V, respectivamente. Los espectros de masa se adquirieron en el modo de sensibilidad con un intervalo de m/z de 500-4000. La calibración asistida con yoduro de sodio como material calibrador se llevó a cabo para la calibración de masa. Se usó el programa informático MaxEnt1 en Masslynx para la deconvolución de la proteína.
Digestiones enzimáticas de VP de AAV2
Los viriones de AAV2 concentrados se desnaturalizaron con 6 M Guanidina-HCl, 0,1 M Tris a pH 8,5. Las proteínas se redujeron con 30 mM de DTT a 55 °C durante 1 hora en la oscuridad y se alquilaron con 4-vinilpiridina al 0,07 % a temperatura ambiente durante 2 horas. Las reacciones se inactivaron mediante la adición de 1M DTT. Las muestras se dializaron con casetes Slide-A-Lyzer (10.000 MWCO) contra 25 mM de tampón Tris a pH 8,5 durante ~18 horas. Después de la diálisis, las muestras se dividieron en tres alícuotas. Cada alícuota se digirió con tripsina en una relación 1:25 o Lys-C at 1:50 o Asp-N en 1:100 enzima:proteína (p/p) durante 18 horas a 37 °C, respectivamente. Mapeo peptídico mediante LC/MS/MS
Se llevó a cabo nano LC/MS/MS al usar un sistema NanoAcquity HPLC (Waters, Milford, MA) junto con espectrómetro de masas Orbitrap Velos (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA) al usar una columna nanoLC cargada internamente (75 pm x10mm) con Magic C18 con material de carga (5 pm, Bruker, Billerica, MA) a una velocidad de flujo de 300 nl/min. Las fases móviles A y B fueron ácido fórmico al 0,1 % en agua y acetonitrilo, respectivamente. El gradiente fue de 2 % de B a 60 % de B en 121 min.
Los parámetros fuente para velos fueron los siguientes: voltaje de fuente: 2,5 kv, temperatura de capilar 275 °C; nivel de RF de la lente S: 55 %. Los datos se adquirieron al usar el método dependiente de los diez datos superiores con ms precisa a resolución de 60.000 y 10 MS/Ms en trampa de iones. Se usó Mascot para la búsqueda en la base de datos con respecto a secuencias de proteína de la cápside vírica de AAV2. Se usaron tolerancia de MS de 10 ppm y tolerancia de ms/ms de 0,8 Da para la búsqueda en la base de datos.
Mapeo peptídico mediante UPLC/MS/MS
Los digeridos proteicos también se analizaron mediante UPLC/MS/MS en Acquity UPLC-Xevo qTOF MS. Se usó una columna BEH300 C18 (2,1 x 150 mm) para la separación en las fases móviles con gradiente de ácido fórmico al 0,1 % en agua/acetonitrilo a una velocidad de flujo de 0,25 ml/min. Los espectros de masa se adquirieron en el modo de MSe positivo en el intervalo de masa de 200-2000.
Resultados
Método de desnaturalización de AAV
Los AAV se pueden desnaturalizar a través de varios métodos al usar detergente, calor, sal elevada o tampón con pH bajos o altos. La desnaturalización por calor puede conducir a la precipitación de la proteína y, en consecuencia, las columnas de fase inversa se obstruyen fácilmente y sobrepresurizan. La desnaturalización con sal elevada requiere una etapa de desalación adicional antes del análisis por LC/MS. Se usó desnaturalización con ácido acético al 10 % para el análisis de proteína intacta mediante LC/MS, ya que posibilita obtener un espectro de masa limpio. Para el mapeo peptídico, se puede usar RapiGest al 0,1 % o 6 M Guanidina HCI como el reactivo desnaturalizante. Desarrollo del método de análisis de proteína intacta
El análisis de proteína intacta inicial de AAV2 se llevó a cabo al usar una columna UPLC BEH C4 con gradiente rápido. En esta condición, solo se observó un único pico en el cromatograma de iones total, con una masa correspondiente a VP3 (FiguralA). Sin ánimo de ceñirnos a la teórica, se cree que la ausencia de VP1 y VP2 se debe posiblemente a la baja estequiometría de VP1 y VP2 o la supresión de las señales de VP1 y VP2 por VP3 si todas las VP se coeluyen. Se ha intentado aumentar la longitud de la inyección o columna, usar un gradiente más superficial y usar columnas alternativas para detectar VP1 y VP2. Una mayor carga (1,7 pg) con un gradiente más superficial de 0,5 % de B/min dio como resultado un pico secundario hacia la izquierda (FiguralB). El aumento en la longitud de la columna de 10 cm a 15 cm no mejoró la separación del pico secundario (FiguralC). Sin embargo, el pico secundario se separó adicionalmente del pico principal al usar una columna BEH C8, que mejoró las intensidades de señal observadas (FiguraID).
En consecuencia, se obtuvieron las masas de VP1 y VP2 en este pico secundario con las intensidades de señal que se muestra en la Figura2A. Las masas de VP1 y VP3 corresponde a los a.a. 2-735(acetilación) y los a.a. 204-735(acetilación), respectivamente (Figuras2A y 2B). No se observó acetilación en VP2 (a.a.139-735). Además, se observó un pico menor con una masa más pequeña que VP3, con una masa correspondiente a la secuencia de aminoácidos 212-735 con una acetilación (Figura2B). Estos datos están en consonancia con las secuencias de ADN dado que VP3 contiene dos codones de iniciación ATG en AAV2: ATGGCTACAGGCAGTGGCGCACCAATGGCAGAC (SEQ ID NO:1), que da como resultado dos posibles extremos N (subrayados): MATGSGAPMAD (SEQ ID NO:2). Los residuos metionina del extremo N no estaban presentes en VP1 y VP3 según se midió mediante el análisis de proteína intacta. La acetilación de VP1 y VP3 no es un artefacto inducido por el método (la desnaturalización de AAV mediante ácido acético al 10 %) dado que acetilación de VP1 y VP3 también se observa en una preparación de AAV al usar un método de desnaturalización alternativo sin ácido acético. Los datos de la proteína intacta también confirmaron que no había glicosilación presente en las proteínas de la cápside vírica, aunque hay varias secuencias consenso enlazadas a N presentes [16].
Mapeo peptídico mediante LC/MS/MS
Para confirmar adicionalmente los extremos N y la acetilación observada en el análisis de proteína intacta, se llevó a cabo un mapeo peptídico al usar múltiples enzimas y se analizó al usar múltiples instrumentos. Se han evaluado varios métodos de preparación de la muestra, incluidos métodos de desnaturalización y etapas de desalación. El método de digestión final, incluida la desnaturalización con 6M guanidina HCl, la reducción y alquilación con 4-vinilpiridina y la diálisis al usar slide-A-lyzer con posterior digestión enzimática, creó un mapeo peptídico limpio con bajas modificaciones artificiales durante el proceso de digestión. Se evaluó un mínimo de 5 pg de material de partida, lo que proporcionó una cobertura de secuencia completa al usar LC/MS/MS y UPLC/MS/MS.
La búsqueda con Mascot de digeridos trípticos a partir de nano LC/MS/MS sola proporcionó 78 % de cobertura de secuencia con un corte de puntuación de iones 13 como se muestra en la Figura3. Los dos péptidos trípticos grandes faltantes, T27 y T38 (recuadrados) de nano LC/MS/MS se encontraron en LC/MS en Xevo TOF MS con la columna BEH C18 (Figura3). Además, la mayoría de las secuencias peptídicas de T27 y T38 se confirmaron adicionalmente mediante nano LC/MS/MS de digeridos por Asp-N como se muestra en cursiva en la Figura3. Los péptidos de extremo N y extremo C completos se cubrieron mediante los digeridos por Lys-C como se subraya en la Figura3. Por lo tanto, se logró un 100 % de cobertura de secuencia de VP1 a través de digestiones con múltiples enzimas y dos métodos de LC/MS/MS.
La LC/MS/MS confirmó los extremos N y C de VP1, VP2 y VP3 y la acetilación del extremo N de VP1 y VP3 observada en el análisis de proteína intacta. Las Figuras4A-4C muestran los espectros de MS/MS del péptido tríptico del extremo N de VP1 A(Ac)ADGYLPDWLEDTLSEGIR (SEQ ID NO:4) (Figura4A), el péptido derivado por Asp-N del extremo N de VP2 (APGKKRPVEHSPVEP) (SEQ ID NO: 15) (Figura4B) y el péptido por Asp-N del extremo N de VP3 A(Ac)TGSGAPM (SEQ ID NO:5) (Figura 4C). La MS/MS confirmó la ubicación de la acetilación en los residuos alanina del extremo N de los péptidos de VP1 y VP3. La presencia de iones y18 e y 17 no modificados y todos los iones b detectados con desplazamiento de masa 42Da en la Figura4A indica que la modificación de 42 da está ubicada en el extremo N de VP1. De manera similar, la presencia de iones y3 a y8 no modificados en la Figura4C confirmó la ubicación de la acetilación en el residuo alanina del extremo N.
Comparación de los extremo N de VP de AAV
Además de AAV2, también se han analizado AAV1, AAV5, AAV7, AAV9 y AAV Rh10 mediante el análisis de proteína intacta. Las masas teóricas y previstas de VP en AAV se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2: Masa teórica frente a masa experimental para VP de AAV
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Los extremos N, así como sus modificaciones después de la traducción, están altamente conservados entre los serotipos de AAV analizados, aunque se informa que AAV5 es la secuencia de serotipo de AAV más diversa, como se muestra en las alineaciones de secuencia en la Figura5. En 11 de 13 serotipos de AAV, los extremos N de VP1 comparten una secuencia de 13 residuo aminoacídico idénticos (MAADGYLPDWLED (SEQ ID NO:6) mientras que los 13 serotipos de AAV tienen secuencia de extremo N TAP... en VP2 idénticas (Figura5). LC/MS de AAV2 indicó que falta T en VP2 a nivel de la proteína. Los extremos N de VP3 son los más diversos entre las tres proteínas de la cápside vírica, con 8 de 13 serotipos de AAV que comparten una secuencia de extremo N MA... De manera similar a a AV2, AAV1 y AAV Rh10 también tienen dos codones de iniciación ATG, donde el primero es el predominantemente de extremo N en función del análisis de proteína intacta mediante LC/MS. De manera interesante, aunque AAV7 tiene dos posibles codones de iniciación (GTGGCTGCAGGCGGTGGCGCACCAATGGCAGACAATAAC...) (SEQ ID NO:7), el segundo codón de iniciación (ATG) fue favorable en función del análisis de proteína intacta: el VP3' con 213(ac)-737 fue un pico predominante, mientras que VP3 con 203(ac)-737 fue un pico menor.
Conclusiones
Aplicaciones del análisis de proteína intacta mediante LC/MS y el mapeo peptídico mediante LC/MS/MS de VP de AAV en la investigación y el desarrollo de terapia génica
Estos resultados demuestran que se comprobó que LC/MS directa de diferentes tipos de AAV después de la desnaturalización es un modo simple y eficaz para monitorizar la secuencia de proteína y las modificaciones después de la traducción con medición de masa precisa a nivel de la proteína intacta. Se confirmaron los extremos N de VP1, VP2 y VP3 de AAV mediante espectrometría de masas. Las acetilaciones de los extremos N de VP1 y VP3 también se identificaron en diferentes serotipos de AAV. Se desarrolló el mapeo peptídico mediante LC/MS/MS directa de AAV y proporcionó un 100 % de cobertura de secuencia de VP1, VP2 y VP3 y confirmó la acetilación de los extremos N de las VP. Las masas teóricas de las secuencias previstas de 13 serotipos de AAV en función de la alineación de secuencias y el análisis de proteína intacta de varios serotipos de AAV se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Secuencias y masas previstas
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Las masas precisas de VP1, VP2 y VP3 de cada serotipo son únicas y, por lo tanto, se puede usar análisis de proteína intacta como una prueba de identidad para diferenciar serotipos de cápside de AAV. Las Tablas 4-6 muestran las diferencias de masa de las VP entre 13 serotipos de AAV comunes. En fuente normal se muestran las masas delta mayores que 10, las masas delta menores que 10 están en negrita.
Tabla 4: Diferencias de masa de VP1 entre 13 isotipos de AAV
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Tabla 5: Diferencias de masa de VP2 entre 13 isotipos de AAV
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Tabla 6: Diferencias de masa de VP3 entre 13 isotipos de AAV
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No se observan masas a 10 Da de las tres VP entre dos isotipos. Aunque VP2 y VP3 tienen solo una diferencia de 2 Da entre AAV1 y AAV6, la diferencia de masa de VP1 entre AAV1 y AAV6 es 36, significativa suficiente para poder distinguirla mediante una medición de masa precisa. Por lo tanto, la medición de proteína intacta de VP1, VP2 y VP3 es altamente específica como prueba de identidad.
Estos resultados demuestran que el análisis de proteína intacta y LC/MS/MS se pueden usar para crear perfiles de VP para monitorizar las expresiones de VP, modificaciones después de la traducción y truncamiento y para garantizar la uniformidad del producto durante la producción de v Lp . Estos dos análisis también se pueden usar para confirmar la mutagénesis directa a un sitio o la caracterización estructural para aplicaciones de manipulación de la proteína de la cápside.
Ejemplo 2:La función de la acetilación del extremo N de las proteínas de la cápside de AAV
Las modificaciones químicas de proteínas celulares son un medio común de controlar sus funciones (Arnesen, T. (2006) Virology 353(2): 283-293). La acetilación del extremo N (Nt-acetilación), que implica la transferencia de un grupo acetilo desde una acetil coenzima A al grupo a-amino del primer residuo aminoacídico de una proteína (Brown, J.L. and Roberts, W.K. (1976) J. Biol Chem 251: 1009-1014; Arnesen, T. et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106: 8157-8162), está entre las más abundantes de las modificaciones proteicas. A diferencia de la mayoría de las otras modificaciones proteicas, la Nt-acetilación es irreversible; se produce principalmente durante la síntesis de la proteína, catalizada por acetiltransferasas de extremo N (NAT) asociadas con ribosomas (Gautschi, M. et al. (2003) Mol Cell Biol 23: 7403-7414; Pestana, A. and Pitot, H.C. (1975) Biochemistry 14: 1404-1412; Polevoda, B. et al. (2003) J Biol Chem 278: 30686-97). Existen varias NAT distintas en eucariotas -NatA-NatF- cada una compuesta por una o más subunidades y cada una acetilando un subgrupo específico de extremos N, dependiendo de la secuencia de aminoácidos de los primeros pocos aminoácidos (Jornvall, H. (1975) J Theor Biol 55: 1-12; Persson, B. et al. (1985) Eur J Biochem 152: 523-527).
Los datos experimentales indican que las proteínas con extremos N acetilados son más estable in vivo que las proteínas no acetiladas; es decir, la Nt-acetilación protege a las proteínas de la degradación (Hershko, A. et al. (1984) Proc Natl Acad Sci U S A 81: 7021-7025). Una explicación para esto podría ser el descubrimiento en 2004 de que otra modificación en el extremo N, la ubicuitinación, que implica el acoplamiento directo de la proteína ubiquitina pequeña al residuo aminoacídico del extremo N, promueve la posterior degradación de la proteína (Ben Saadon, R. et al. (2004) J Biol Chem 279: 41414-41421). A la inversa, las señales de Nt-acetilación también pueden ser parte de un mecanismo de control de calidad para degradar las proteínas no plegadas o plegadas incorrectamente y para regular las estequiometrías proteicas in vivo (Hwang, C.S. et al. (2010) Science 327: 973-977).
Un análisis sistemático del procesamiento previsto en el extremo N de proteínas citosólicas, frente a las destinadas a separar hacia la vía secretora, revela que las proteínas citosólicas están profundamente polarizadas en favor del procesamiento, pero hay una polarización igual y opuesta en contra de dicha modificación para proteínas secretoras (Forte, G.M.A. et al. (2011) PLoS Biology, 4 de mayo de 2011 Tomo 9). Las mutaciones en las secuencias señal secretoras que llevan a la acetilación da como resultado una separación incorrecta hacia el citosol de una manera que es dependiente de la maquinaria de procesamiento en el extremo N. Por consiguiente, la acetilación del extremo N representa una etapa de determinación precoz en la separación celulares de polipéptidos emergentes que representa una capa adicional de rigurosidad para garantizar que las proteínas destinadas a permanecer en el citosol de hecho residan en el citosol. La célula eucariota comprende varios compartimientos distintos, denominados orgánulos, necesarios para llevar a cabo funciones específicas. Las proteínas en estos compartimientos se sintetizan en el citoplasma y requieren mecanismos de separación complejos para garantizar su suministro al orgánulo apropiado. Las proteínas se modifican mediante acetilación en su extremo amínico en una etapa muy temprana de su síntesis. Existe una profunda diferencia entre la probabilidad de dicha modificación en proteínas citoplasmáticas y en aquellas destinadas a uno de los orgánulos principales, el retículo endoplasmático (ER, por sus siglas en inglés): mientras que las proteínas citoplasmáticas típicamente se acetilan, aquellas destinadas al ER permanecen en gran medida sin modificación. Además, cuando proteínas del ER específicas se manipulan para inducir su acetilación su direccionamiento hacia el ER se inhibió (Forte, G.M.A. et al. (2011) PLoS Biology, 4 de mayo de 2011 T omo 9).
Se ha mostrado que las proteínas contráctiles actina y tropomiosina requieren la Nt-acetilación mediada por NatB para un funcionamiento adecuado, que implica específicamente la unión actina-tropomiosina y la regulación de actomiosina (Coulton, A.T. et al. (2010) J Cell Sci 123: 3235-3243; Polevoda, B. et al. (2003) J Biol Chem 278: 30686-97). Por lo tanto, la Nt acetilación de proteínas de la cápside de AAV tiene importancia en el potencial de transducción de vectores de rAAV. Si los vectores de AAV no logran ingresar al núcleo, en consecuencia, no logran transducir las células. La función de los filamentos de actina y FKBP52 (proteína p52 de unión a FK506) en la translocación de las cápsides de AAV desde el endosoma hacia el núcleo está bien definida (Zhao, W. et al. (2006) Virology 353(2): 283-293). De manera importante, la Nt-acetilación es esencial para el funcionamiento de los filamentos de actina al modular las interacciones proteína-proteína (Coulton, A.T. et al. (2010) J Cell Sci 123: 3235­ 3243; Polevoda, B. et al. (2003) J Biol Chem 278: 30686-97).
Aunque la acetilación del extremo N de proteínas es un fenómeno ampliamente conocido, la significación biológica de la Nt-acetilación en las proteínas de la cápside de AAV no se entiende completamente. Los extremos N previstos de VP1 y VP3 en función de la secuenciación del ADN son ambos metionina y posteriormente alanina. Se ha informado que la extracción de la metionina del extremo N mediante Met-aminopeptidasas frecuentemente conduce a la Nt-acetilación de los residuos alanina, valina, serina, treonina y cisteína resultantes del extremo N y que la acetilación del extremo N actúa como una posible señal de degradación [21]. Se sugirió la ubicuitinación de las proteínas de la cápside vírica como posible señal para el procesamiento de la cápside en el momento del desensamblaje del virión [22]. El vínculo entre la N-acetilación de VP1 y VP3 y la degradación y pérdida de recubrimiento de la cápside vírica antes del ingreso al núcleo se investiga adicionalmente.
Para entender las implicaciones funcionales de la acetilación del extremo N en relación con las proteínas de la cápside de AAV, se usa mutagénesis dirigida a un sitio de los codones de iniciación del extremo N de VP3 para generar mutantes de AAV.
Métodos
Las proteínas de la cápside de AAV se generan con diferentes aminoácidos en la 2da posición con respecto a la metionina inicial (iMet X) para determinar si la Nt-acetilación se inhibe o reduce y, después, se miden las consecuencias funcionales. Se evalúa la capacidad de las proteínas de la cápside de ser trasportadas intracelularmente y/o de adquirir modificaciones después de la traducción tales como glicosilación y, posteriormente, se determina si esta capacidad afecta la infectividad de la partícula de AAV ensamblada. Además, se determina el impacto de la acetilación sobre la ubicuitinación/degradación y direccionamiento al lisosoma, ER, Golgi o membrana nuclear interna.
Por ejemplo, para someter a ensayo el tráfico o direccionamiento, las partículas de AAV con proteínas de la cápside que tienen una 2da posición mutada (p. ej., iMet X) se etiquetan de manera fluorescente y se usan para infectar células (p. ej., células HeLa). Estas partículas de AAV se someten a ensayo para determinar uno o más de: tiempo de captación de la partícula vírica, colocalización de las partículas de AAV con marcadores de compartimiento específicos (p. ej., proteínas de Golgi, ER o lisosómicas u otro marcador), acumulación nuclear (p. ej., como se somete a ensayo mediante la colocalización con un marcador nuclear o manca), y/o la sensibilidad del tráfico a inhibidores específicos del escape endosómico precoz (tales como bafilomicina A o cloruro de amonio), en comparación con partículas de AAV naturales etiquetadas de manera fluorescente usadas para infectar la misma línea celular (ver, p. ej., Bartlett, J.S. et al. (2000) J. Virol. 74:2777-2785 para una descripción de tales ensayos). Para someter a ensayo la infectividad, las partículas de AAV con proteínas de la cápside que tienen una 2da posición mutada (p. ej., iMet X) se usan para infectar células (p. ej., células HeLa) y su eficacia de transducción se compara con partículas de AAV naturales (p. ej., que tienen el mismo serotipo de AAV e infectan al mismo tipo de células).
Para someter a ensayo la glicosilación, las partículas de AAV con proteínas de la cápside que tienen una 2da posición mutada (p. ej., iMet X) se usan para infectar células (p. ej., células HeLa). Las partículas de AAV de células infectadas se someten a uno o más ensayos que incluyen, sin limitación, detección química de la glicosilación (p. ej., aplicar un kit de detección de digoxigenina (DIG) glucano y/o glicoproteína fluorescente disponible comercialmente a proteínas de la cápside desnaturalizadas y separadas electroforéticamente) y espectrometría de masas (p. ej., FT-ICR MS), en comparación con partículas de AAV naturales usadas para infectar la misma línea celular (ver, p. ej., Murray, S. et al. (2006) J. Virol. 80:6171-6176 para una descripción de tales ensayos).
Para someter a ensayo la ubicuitinación, las partículas de AAV con proteínas de la cápside que tienen una 2da posición mutada se usan para infectar células (p. ej., células HeLa). Las partículas de AAV se inmunoprecipitan a partir de células infectadas con un anticuerpo anti-cápside, después se someten a transferencia Western con un anticuerpo anti-ubiquitina y se comparan con partículas de AAV naturales usadas para infectar células de la misma manera. Las partículas de AAV mutantes también se pueden usar en ensayos de ubicuitinación in vitro en comparación con partículas de AAV naturales (ver, p. ej., Yan, Z. et al. (2002) J. Virol. 76:2043-2053).
Ejemplo 3:La función de la desamidación de proteínas de la cápside de AAV2
El análisis de secuencia de la proteína de la cápside de AAV2 reveló posibles sitios de desamidación, como se subrayan en la siguiente secuencia de aminoácidos:
MAADGYLPDWLEDTL.SF.GIROWWKLKPGPPPPKPAERI]KDDSRGLVLPGYKyEG/>FA,G/.PAGEFTAfFAP
A4AIEPPF41 ’P«2mSGP.YPFIAT;Y/MPAEFQERLKEDTSFGGNLGRAYFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTA
PGKKRPVFJISPVF.PDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATG.SGA
PMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTP WGYFDFNRFIICIIFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEY OLPYVLGSAIIOGCLPPFPADVFMVPOYGYLTLNNGSOAVGRSSFYCLEYFPSOMLRTGNNFTFSYTFEDVP
f h s s y a h s q s l d r l m n p l id q y l y y l s r t n t p s g t t t q s r l q f s q a g a s d ir d q s r n w l p g p c y r q q r v .sk
TSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPOSGVLIFGKOGSEKTNVDIEKVM1T
DEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPTTTDGnFTT
Figure imgf000047_0001
En particular, un posible sitio de desamidación se encuentra en N57/G58 en el dominio fosfolipasa A2 (sitio de unión a Ca++), como se indica en negrita y cursiva en la secuencia anterior. Los siguientes experimentos tuvieron como objetivo explorar si la desamidación en N57 pueden conducir a una potencia reducida y/o truncamiento de AAV2, así como si diferentes métodos de producción de AAV pueden tener diferentes efectos sobre la desamidación. Por ejemplo, el método de línea celular productora (ver Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269; la Pub. PG estadounidense Núm. US2004/0224411; y Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299) puede inducir un nivel más alto de desamidación en N57, en comparación con el método de transfección triple. Según la estructura cristalina de AAV2, N57 no se muestra; sin embargo, N382 y N511 están parcialmente expuestos, y N715 está completamente expuesto.
Métodos
Digestiones enzimáticas de VP de AAV1 y AAV2
Se concentraron 10 |jg de cada material de AAV1-EGFP o AAV2-EGFP (generado a partir de transfección triple, así como el proceso de línea celular productora) al usar filtros Amicon (10 kDa MWCO), se desnaturalizaron con 6 M Guanidina-HCl, 50 mM Tris a pH 8,5. Las proteínas se redujeron con 5 mM de DTT a 60 °C durante 30 minutos en la oscuridad, se alquilaron con 15 mM de yodoacetamida a temperatura ambiente durante 30 minutos y después se intercambió el tampón a 25 mM Tris, pH 7,1 para la digestión al usar microcolumnas Bio-Spin® 6 Tris. Después del intercambio de tampón, las muestras se dividieron en dos alícuotas. Cada alícuota se digirió con tripsina en una relación 1:25 o Asp-N a 1:50 enzima:proteína (p/p) durante 2 horas a 37 °C, respectivamente.
Mapeo peptídico mediante UPLC/MS/MS
Los digeridos proteicos también se analizaron mediante UPLC/MS/MS en Acquity UPLC-Xevo qTOF MS. Se usó una columna BEH300 C18 (2,1 * 150 mm) para la separación en las fases móviles con gradiente de ácido fórmico al 0,1 % en agua/acetonitrilo a una velocidad de flujo de 0,25 ml/min. Los espectros de masa se adquirieron en el modo de resolución MSe positiva en el intervalo de masa de 50-2000.
Determinación de los niveles de desamidación en VP de AAV
Los cromatogramas iónicos extraídos (XIC) de péptidos que contenían sitios NG (T9, T49, y T67 en VP de AA1 y AAV2) y sus correspondientes especies desamidadas se usaron para calcular los niveles de desamidación.
Para comparar los vectores de AAV producidos por los métodos de transfección triple (TTx) y línea celular productora (PCL), se produjo AAV1 o AAV2 identificado con EGFP al usar el método TTx o PCL. Se halló presente VP1 truncada (tVP1) en AAV2-EGFP producido mediante PCL, pero no en el AAV2-EGFP producido por TTx. No se halló que AAV 1-EGFP tuviese tVP1, independientemente del método de producción. También se halló que la potencia in vitro de AAV2 producido por el método PCL estaba reducida, en comparación con AAV2 producido por TTx. Se halló también que las partículas de AAV2 con N57K y N57Q mutantes tenían potencia reducida y unión a Ca++ alterada.
La siguiente tabla proporciona los péptidos trípticos que se analizaron para examinar cada posible sitio de desamidación, así como el residuo correspondiente.
Tabla 7: Péptidos trípticos que contienen sitios NG
Figure imgf000048_0001
Como se muestra en la Tabla 7, el péptido T9 YLGPFNGLDK (SEQ ID NO: 9) se usó para monitorizar N57, el péptido T38 EVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTL NNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLR (SEQ ID NO: 10) se usó para monitorizar N382, los péptidos T49 YNLNGR (SEQ ID NO: 11) y YHLNGR (SEQ ID NO: 12) se usaron para monitorizar N511 en AAV1 o a Av 2 (respectivamente), y los T67 péptidos SANVDFTVDNNGLYTEPR (SEQ ID NO: 13) y SVNVDFTVDTNGVYSEPR (SEQ ID NO: 14) se usaron para monitorizar N715 en AAV1 o AAV2 (respectivamente).
Se usó análisis LC/MS/MS para comparar el porcentaje de desamidación en partículas de AAV1 y AAV2 producidas mediante los métodos TTx y PCL. Los resultados del péptido T9 se muestran en las Figuras6A y 6B. Los resultados del péptido T49 se muestran en las Figuras7A y 7B. Los resultados del péptido T67 se muestran en las Figuras8A y 8B. Estos resultados se resumen en la Tabla 8. El péptido T38 no se detectó debido a su tamaño.
Tabla 8: Resumen de resultados de LC/MS/MS
Figure imgf000048_0002
En particular, el AAV2 producido por PCL mostró un aumento de casi 3 veces en la desamidación en comparación con el AAV2 producido por TTx. Estos resultados sugieren que la desamidación disminuye la potencia de AAV, ya que la potencia in vitro de AAV2 producido por PCL está reducida.
Conclusiones
Tomados juntos, los Ejemplos 1-3 demuestran métodos para analizar proteínas intactas de partículas víricas (p. ej., proteínas de la cápside de AAV) al usar LC/MS. Los pesos moleculares se miden con precisión y estas técnicas también se pueden usar para evaluar los extremos N y/o las modificaciones de las proteínas de la cápside vírica. Además, estos métodos son adaptables como ensayos de identidad de serotipo de la cápside útiles en terapia génica, p. ej., como una plataforma analítica. Estos resultados establecen, además, una correlación entre la estructura de la proteína de la cápside (p. ej., truncamientos, desamidación, etc.) y la potencia, lo que sugiere que se pueden usar mutaciones puntuales en sitios clave para manipular vectores más eficaces.
Ejemplo 4:Dilucidar la función de la acetilación del extremo N de las proteínas de la cápside de AAV Como se describió anteriormente, los extremos N de las proteínas de la cápside de AAV están altamente conservados entre los serotipos (Figura5). Las técnicas descritas en el Ejemplo 1 permiten interrogar la expresión de VP y las modificaciones después de la traducción. A continuación, se examinaron la función y la significación biológica de la acetilación del extremo N de las proteínas de la cápside de AAV.
Resultados
Para dilucidar la posible función de la desacetilación de las proteínas de la cápside de AAV, se evaluaron variantes de desacetilación de AAV5. Se comparó una partícula de AAV5 que expresaba eGFP bajo el promotor CBA (AAV5-CBA-Egfp) con variantes de AAV5 con el aminoácido adyacente a la metionina inicial (iMET) mutado para VP1 y VP3 (deAC-AAV5-CBA-eGFPs). Se eligieron tres aminoácidos que se predijo que tendrían baja probabilidad de acetilación mediante NatA, NatC o NatD para generar las variantes: Gly, Leu y Pro, como se ilustran en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9: Frecuencia de acetilación del extremo N
Figure imgf000049_0001
Se generaron los siguientes mutantes de AAV5 desacetilados (deAC):
S2GVP1 - Ser cambiado a Gly en la posición 2 en AAV5VP1
S2LVP1 - Ser cambiado a Leu en la posición 2 en AAV5VP1
S2PVP1 - Ser cambiado a Pro en la posición 2 en AAV5VP1
S2GVP3 - Ser cambiado a Gly en la posición 2 en AAV5VP3
S2L VP3 - Ser cambiado a Leu en la posición 2 en AAV5VP3
S2P VP3 - Ser cambiado a Pro en la posición 2 en AAV5VP3
S2PVP1/VP3 - Ser cambiado a Pro en la posición 2 en VP1 y VP3 de AAV5
S2GVP1/VP3 - Ser cambiado a Gly en la posición 2 en VP1 y VP3 de AAV5
S2LVP1/VP3 - Ser cambiado a Leu en la posición 2 en VP1 y VP3 de AAV5
Estas variantes se generaron al usar el método TTX según se describió anteriormente. Todas las variantes de AAV5 mostraron buena productividad, con rendimientos mayores que 1013 de VG total. Todas las variantes de AAV5 también mostraron la relación proteica VP1:VP2:VP3 esperada mediante el análisis de gel proteico SYPRO (Figura9). A continuación, se usó LC/MS para confirmar que todas las variantes de AAV5 tenían acetilación disminuida, como se muestra en la Tabla 10.
Figure imgf000051_0001
Estos análisis de LC/MS confirmaron que las variantes de AAV5 estaban desacetiladas. Las variantes S2LVP1, S2LVP3 y S2LVP1/VP3 mostraron todas mayor masa (aumento de 173 a 182) en las proteínas VP1 y VP3, lo que sugiere que cambiar el segundo aminoácido del extremo N a una leucina en VP1 o VP3 altera la proteína, lo que da como resultado un aumento en la masa.
A continuación, las variantes de AAV5 se sometieron a ensayo en un ensayo de transducción in vitro al usar eGFP como gen indicador (Figura10). El ensayo se diseñó para evaluar la transducción mediante variantes mutantes desacetiladas de AAV5 a 106 de multiplicidad de infección (MOI), comparando cada variante con la partícula de AAV5 original, no modificada Se usaron tres líneas celulares: células 293, HuH7 y HeLa. Después de la infección, las células se sometieron a ensayo para determinar el número de copias del genoma del vector (vg/pg de proteína celular) y la expresión de eGFP (mediante ELISA). El número de copias del genoma del vector (vg/pg de proteína) representa la eficacia con la que la variante de AAV5 ingresa a la célula, y eGFP representa la eficacia del tráfico intracelular de la cápside, dado que la expresión del transgén requiere que la cápside/ADN del vector se transporten de manera eficaz al núcleo (Figura10). Los genomas del vector se cuantificaron mediante análisis TaqMan.
La Figura ll muestra que, en función de los análisis del genoma del vector, los vectores mutantes desacetilados de AAV5 infectaron las tres líneas celulares de prueba con niveles similares, pero reducidos, en comparación con las partículas de AAV5 originales, no modificadas. La Figura12 muestra que los vectores mutantes desacetilados de AAV5 dieron todos como resultado una expresión de eGFP reducida en las tres líneas celulares, en comparación con la transducción con AAV5 original no modificado.
Conclusiones
Como se previó, no se observó acetilación en las variantes mutantes con Ser a Pro/Leu/Gly en el extremo N cuando se examinaron mediante LC/MS. Las variantes de AAV5 deAC mostraron una producción de vector contundente y las variantes de AAV5 deAC infectaron a las células en niveles semejantes a AAV5 original. Sin embargo, los niveles de proteína funcional en las células infectadas con las variantes deAC estaban reducidos en gran medida en comparación con el AAV5 original. Estos datos sugieren que el tropismo se ve mínimamente afectado por la falta de desacetilación en el extremo N de VP1/VP3, pero el procesamiento posterior (p. ej., tráfico y/o degradación) se ve significativamente afectado. Dado que las variantes evaluadas demostraron actividad in vitro reducida, un experto en la técnica puede apreciar que se podrían emplear variantes caracterizadas por acetilación reducida o eliminada, inter alia, cuando son deseables niveles de transducción disminuidos.
Ejemplo 5: Evaluación de la desamidación de proteínas de la cápside de AAV
Los Ejemplos 1 y 3 demuestran técnicas que permiten interrogar las modificaciones después de la traducción de proteínas de la cápside de AAV y explorar la función de la desamidación en la cápside de AAV2. El siguiente Ejemplo evaluó si la desamidación reduce la potencia e/o induce el truncamiento de las proteínas de la cápside, y si diferentes procesos de fabricación pueden inducir niveles diferentes de desamidación.
Métodos
Se generaron partículas de AAV y se sometió a ensayo el estado de desamidación como se describe en el Ejemplo 3.
Resultados
Como se describe en el Ejemplo 3, un posible sitio de desamidación se encuentra en N57/G58 en el dominio fosfolipasa A2 (sitio de unión a Ca++) en VP1 de la cápside de AAV2. El motivo N57/G58 está conservado en los serotipos de AAV (Figura13). El Ejemplo 3 mostró que el AAV2 producido por PCL exhibió un aumento de casi 3 veces en la desamidación en comparación con el AAV2 producido por TTx (ver las Figuras6A y 6B y la T abla 8). Al examinar la producción de VP1, VP2 y VP3 mediante geles proteicos, se detectó una proteína VP1 truncada (tVP1) solo en las proteínas de la cápside de AAV2 producidas mediante el método PCL (Figura14).
A continuación, se generó una serie de mutante de desamidación de AAV2. Estos mutantes se dirigieron al residuo Gly en la secuencia NG canónica. También se generaron mutaciones dirigidas al residuo A35 (ver la Figura13), el aminoácido del extremo N para tVP1, como se muestra en la Tabla 11. Los mutantes pAF277 y pAF279 que llevaban múltiples mutaciones no se empaquetaron.
Tabla 11: Mutantes de desamidación
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Las variantes de desamidación se analizaron a continuación mediante LC/MS como se describe en el Ejemplo 3 más atrás. Las variantes AAV2A35N y AAV2G58D tenían desamidación alterada en comparación con el AAV2 original (Figura 15). En particular, el mutante AAV2A35N tuvo mayor desamidación (17,8 %) en comparación con el AAV2 original (5,7 %). La variante AAV2G58D tuvo desamidación reducida (1,1 %) en comparación con el AAV2 original. El análisis de gel proteico SYPRO demostró que los mutantes de desamidación de AAV2 exhibieron la relación VP1:VP2:VP2 correcta (Figura16).
A continuación, las variantes de desamidación de AAV2 se sometieron a ensayo en un ensayo de transducción in vitro al usar eGFP como gen indicador (Figura17). El ensayo se diseñó para evaluar la transducción mediante variantes mutantes de desamidación de AAV2 a 106 de multiplicidad de infección (MOI), comparando cada variante con la partícula de AAV2 original, no modificada Se usaron tres líneas celulares: células 293, HuH7 y HeLa. Después de la infección, las células se sometieron a ensayo para determinar el número de copias del genoma del vector (vg/pg de proteína celular) y la expresión de eGFP (mediante ELISA). El número de copias del genoma del vector (vg/pg de proteína) representa la eficacia con la que la variante de AAV2 ingresa a la célula, y eGFP representa la eficacia del tráfico intracelular de la cápside, dado que la expresión del transgén requiere que la cápside/ADN del vector se transporten de manera eficaz al núcleo (Figura17). Los genomas del vector se cuantificaron mediante análisis TaqMan.
El análisis del genoma del vector indicó que las variantes mutantes de desamidación de AAV2 infectaron a todas las líneas celulares evaluadas en niveles semejantes a los de los vectores de AAV2 originales (Figura18). De manera importante, se halló que la variante AAV2A35N fue más potente que el vector de AAV2 original para la transducción en las tres líneas celulares (Figura19). Se halló que la variante AAV2G58D fue más potente que el vector de AAV2 original en células HuH7 (Figura19).
Conclusiones
En resumen, los vectores mutantes de desamidación de AAV2 infectaron a las células en niveles semejantes a las partículas de AAV2 originales (p. ej., vg/pg de proteína celular semejante). Sin embargo, en función del análisis de los niveles de eGFP en células transducidas, la variante AAV2A35N tuvo una potencia más alta que el AAV2 original en todas las líneas celulares evaluadas y la variante AAV2G58D tuvo una potencia más alta que el AAV2 original en células HuH7 (una línea celular derivada del hígado). Estos resultados sugieren que la mutación A35N puede ser eficaz para aumentar la potencia del vector para transducir muchos tipos de células, y que la mutación G58D también puede ser eficaz para aumentar la potencia en ciertos tipos de células, p. ej., células hepáticas.
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar el serotipo de una partícula de virus adenoasociado (AAV) que comprende a) desnaturalizar la partícula de AAV,
b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas (LC/MS), y c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV;
en donde la combinación específica de las masas de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo de AAV, opcionalmente en donde, las masas calculadas de VP1, VP2 y VP3 se comparan con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 de uno o más serotipos de AAV.
2. Un método para determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV que comprende
a) desnaturalizar la partícula de AAV,
b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a cromatografía de líquidos/espectrometría de masas/espectrometría de masas (LC/MS/MS),
c) determinar las masas de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV, y
d) determinar las masas de la etapa c) con las masas teóricas de VP1, VP2 y VP3 del serotipo de AAV;
en donde un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 o VP3 son indicativas de la heterogeneidad de la cápside de AAV,opcionalmente en donde, la heterogeneidad comprende uno o más de serotipos mixtos, variantes de cápside, sustituciones de aminoácidos de la cápside, cápsides truncadas o cápsides modificadas.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la partícula de AAV se desnaturaliza con ácido acético, clorhidrato de guanidina y/o un disolvente orgánico.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de líquidos con interacción hidrófila o cromatografía de intercambio catiónico.
5. El método de la reivindicación 4, en donde la cromatografía de líquidos de fase inversa es una cromatografía inversa con C4 o C8.
6. El método de la reivindicación 5, en donde la cromatografía usa una fase móvil A que comprende ácido fórmico en agua, opcionalmente en donde la fase móvil A comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico.
7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde la cromatografía comprende una fase móvil B que comprende ácido fórmico en acetonitrilo, opcionalmente en donde la fase móvil B comprende aproximadamente 0,1 % de ácido fórmico.
8. El método de la reivindicación 7, en donde la proporción de fase móvil B en la cromatografía aumenta con el tiempo,
opcionalmente en donde la proporción de fase móvil B en la cromatografía aumenta de manera escalonada y en donde la fase móvil B aumenta de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 38 %, opcionalmente en donde la fase móvil B aumenta de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % en aproximadamente 6 minutos, de aproximadamente 20 % a aproximadamente 30 % en aproximadamente 10 minutos y de aproximadamente 30 % a aproximadamente 38 % en aproximadamente 40 minutos.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la cromatografía de líquidos es cromatografía de líquidos de rendimiento ultra alto (UPLC).
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde la espectrometría de masas comprende: (i) un voltaje de capilar de aproximadamente 3,5 kV;
(ii) un voltaje de cono de muestreo de aproximadamente 45 V; y/o
(iii) calibración asistida, opcionalmente en donde se usa yoduro de sodio como material calibrador.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la extremo N de VP1 y/o VP3 se acetila.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la partícula de AAV:
(i) es una partícula de AAV recombinante (rAAV); y/o
(ii) comprende una cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV12, una cápside de AAV LK03, una cápside de a Av 2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino, una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1), una cápside de AAV2HBKO, una cápside de AAVPHP.B o una cápside de AAvPHP.eB,
opcionalmente en donde la cápside de AAV comprende una mutación de tirosina o una mutación de unión a heparina.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde:
(i) las masas de VP1, VP2 y VP3 se comparan con las masas teóricas de una o más de cápside de AAV1, una cápside de AAV2, una cápside de AAV3, una cápside de AAV4, una cápside de AAV5, una cápside de AAV6, una cápside de AAV7, una cápside de AAV8, una cápside de AAVrh8, una cápside de AAV9, una cápside de AAV10, una cápside de AAVrh10, una cápside de AAV11, una cápside de AAV1 2 , una cápside de AAV LK03, una cápside de AAV2R471A, cápside de AAV2/2-7m8, una cápside de AAV DJ, una cápside de AAV DJ8, una cápside de AAV2 N587A, una cápside de AAV2 E548A, una cápside de AAV2 N708A, una cápside de AAV V708K, una cápside de AAV caprino, una cápside quimérica de AAV1/AAV2, una cápside de AAV bovino, una cápside AAV murino rAAV2/HBoV1 (AAV quimérico /bocavirus humano 1), una cápside de AAV2HBKO, una cápside de AAVPHP.B o una cápside de AAVPHP.eB; y/o
(ii) la partícula vírica comprende una ITR de AAV1, una ITR de AAV2, una ITR de AAV3, una ITR de AAV4, una ITR de AAV5, una ITR de AAV6, una ITR de AAV7, una ITR de AAV8, una ITR de AAVrh8, una ITR de AAV9, una ITR de AAV10, una ITR de AAVrh10, una ITR de AAV11 o una ITR de AAV12.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la partícula de AAV comprende un vector de AAV que codifica un transgén heterólogo.
15. Un método para determinar el serotipo de una partícula de AAV que comprende el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-14 combinado con un método adicional para determinar el serotipo de una partícula de virus adenoasociado (AAV) que comprende:
a) desnaturalizar la partícula de AAV,
b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a reducción y/o alquilación,
c) someter la partícula de AAV desnaturalizada a digestión para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de a Av ,
d) someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a cromatografía de líquidos/espectrometría de masasespectrometría de masas (LC/MS/MS), y
e) determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV;
en donde la combinación específica de las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 son indicativas del serotipo de AAV.
16. Un método para determinar la heterogeneidad de una partícula de AAV que comprende el método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-14 combinado con un método adicional para determinar la heterogeneidad de un serotipo de una partícula de AAV que comprende:
a) desnaturalizar la partícula de AAV,
b) someter la partícula de AAV desnaturalizada a reducción y/o alquilación,
c) someter la partícula de AAV desnaturalizada a digestión para generar fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 de la partícula de a Av ,
d) someter los fragmentos de VP1, VP2 y/o VP3 a cromatografía de líquidos/espectrometría de masasespectrometría de masas (LC/MS/MS),
e) determinar las masas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 de la partícula de AAV, y
f) comparar las masas de la etapa e) con las masas teóricas de fragmentos de VP1, VP2 y VP3 del serotipo de AAV;
en donde un desvío de una o más de las masas de VP1, VP2 o VP3 son indicativas de la heterogeneidad de la cápside de AAV.
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